RO120148B1 - Sistem vector şi procedeu de inserţie a unui fragment adn, în genomul celulelor de mamifere - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un sistem vector şi un procedeu de realizare a integrării unui ADN exogen, dorit, într-un anumit situs, în genomul celulelor de mamifere. Sistemul vector conţine o plasmidă marker, o plasmidă ţintă, care cuprinde cel puţin un fragment ADN ce trebuie inserat în genomul celulei gazdă.

Description

Invenția descrie un sistem vector și un procedeu de realizare a integrării unui ADN exogen dorit într-un loc specific din genomul unei celule mamifere. Mai precis, invenția descrie o metodă nouă de identificare a unui situs țintă, activ din punct de vedere al transcrierii (hot spot) în genomul mamifer și de inserare a unui ADN dorit, în acest situs, prin recombinare omoloagă. De asemenea, invenția stipulează, opțional, capacitatea de amplificare genetică a ADN-ului dorit, în acest locus, prin cointegrarea unui markerselectabil, amplificabil, de exemplu, DHFR în combinație cu ADN-ul exogen. Invenția descrie și construirea de noi vectori adecvați, pentru realizarea scopului de mai sus și, mai mult, prevede linii celulare produse prin astfel de metode, încât să conțină un ADN exogen dorit, integrat într-un hot spot țintă.

Tehnologia de exprimare a proteinelor recombinante atât în organisme procariote, cât și eucariote, este bine pusă la punct. Celulele mamifere oferă avantaje semnificative față de bacterii sau drojdii, din punct de vedere al producerii de proteine, fapt ce se datorează capacității lor de a asambla, glicozila și modifica posttranslațional, în mod corect, proteinele exprimate în urma recombinării. Dupătransfecțieîn celulele gazdă, produșii rezultați în urma exprimării recombinante pot fi păstrați ca elemente extracromozomale sau pot fi integrați în genomul celulei gazdă. Generația de linii celulare mamifere transfectate implică, de obicei, al doilea aspect; un construct ADN care codifică o genă de interes împreună cu o genă de rezistență la medicamente (marker selectabil dominant), este introdus în celula gazdă, iar creșterea ulterioară, în prezența medicamentului, permite selecția celulelor care au reușit să integreze ADN-ul exogen. în multe cazuri, gena de interes este legată de un marker selectabil rezistent la medicamente, care poate fi, ulterior, supus amplificării genetice. Gena care codifică dihidrofolat reductaza (DHFR), este cel mai frecvent utilizată în acest scop. Creșterea celulelor în prezență de methotrexat, un inhibitor competitiv al DHFR, conduce la producerea crescută de DHFR, prin amplificarea genei DHFR. Datorită faptului că regiunile ADN care delimitează o genă, sunt de asemenea amplificate, coamplificarea astfel rezultată, a genei linkate de DHFR, în linia celulară transfectată, poate conduce la sporirea producerii de proteină, în felul acesta, realizându-se exprimarea superioară a genei de interes.

în timp ce această încercare s-a dovedit a avea succes, există câteva probleme în legătură cu sistemul, datorită naturii întâmplătoare a rezultatului integrării. Aceste probleme există, deoarece nivelurile de exprimare sunt puternic influențate de efectele mediului genetic local, la nivelul locusului genetic - un fenomen bine documentat în literatură, și denumit, în general, ca efecte de poziție (spre exemplu, a se vedea, Al. Shawi et al., Mol. Cell. Biol., 10:1192-1198 (1990); Yoshimuraetal., Mol. Cell. Biol., 7:1296-1299(1987)). Cum marea majoritate a ADN-ului mamifer se află într-o stare inactivă din punct de vedere transcripțional, metodele de integrare randomizată nu oferă nici un control asupra soartei transcripționale a ADN-ului integrat. în consecință, pot avea loc variații largi în nivelul de exprimare al genelor integrate, în funcție de situsul de integrare. Spre exemplu, integrarea ADN-ului exogen, în regiuni inactive sau silențioase din punct de vedere transcripțional ale genomului, va avea ca rezultat o exprimare slabă sau lipsa exprimării. Din contră, integrarea într-un situs activ din punct de vedere al transcrierii va avea ca rezultat o exprimare superioară.

în consecință, atunci când se urmărește obținerea unui nivel superior de exprimare a genei, așa cum este cazul rezultatului dorit al metodelor de inginerie genetică, este necesar, în general, să se facă screeningul unui număr mare de transfectanți, pentru găsirea unei clone înalt producătoare. în plus, integrarea întâmplătoare (randomizată) a ADN-ului exogen, în genom, poate, în anumite împrejurări, să rupă gene importante din celulă, conducând la apariția unui fenotip modificat. Acești factori pot face ca generarea de linii celulare mamifere stabile, cu un grad ridicat de exprimare, să fie un proces complicat și laborios.

RO 120148 Β1

Recent, laboratorul nostru a descris utilizarea vectorilor ADN conținând markeri 1 selectabili dominanți, deteriorați (alterați) din punct de vedere translațional, în gena mamiferă de exprimare. Aceasta este descrisă în US 08/147696. 3

Acești vectori conțin o genă pentru neomicin fosfotransferază (neo), alterată din punct de vedere translațional, ca marker dominant selectabil, prelucrată artificial, pentru a conține 5 un intron în care este inserată o genă DHFR, împreună cu o genă sau gene de interes. S-a constatat că utilizarea acestor vectori, drept construcți de exprimare, reduce în mod semnifi- 7 cativ numărul total de colonii rezistente la medicamente produse, facilitând astfel procedeul de screening, în legătură cu vectorii mamiferi de exprimare, obișnuiți. Mai mult, un procent 9 semnificativ din clonele obținute prin utilizarea acestui sistem sunt clone cu un grad ridicat de exprimare. Aceste rezultate sunt aparent atribuibile modificărilor făcute markerului neo 11 selectabil. Datorită alterării translaționale a genei neo, celulele transfectate nu vor produce destulă proteină neo, pentru a supraviețui selecției medicamentoase, prin aceasta redu- 13 cându-se numărul total de colonii rezistente la medicament. în plus, un procent mai mare de clone supraviețuitoare va conține vectorul de exprimare integrat în situsurile din genom, în 15 care nivelurile de transcriere bazală sunt ridicate, ceea ce are ca rezultat o supraproducție de neo, permițând astfel celulelor să depășească alterarea genei neo. Concomitent, genele 17 de interes legate de gena neo vor fi supuse unor niveluri ridicate, similare, de transcriere.

Acest avantaj este, de asemenea, confirmat, ca rezultat al intronului artificial creat în gena 19 neo; supraviețuirea este dependentă de sinteza unei gene neo funcționale, care, la rândul ei, este dependentă de corecta și eficienta îmbinare a intronilor neo. Mai mult, aceste criterii 21 sunt mult mai probabil de întâlnit, dacă vectorul ADN s-a integrat într-o regiune care este deja puternic activă din punct de vedere transcripțional. 23

După integrarea vectorului într-o regiune activă din punct de vedere transcripțional, amplificarea genei este realizată prin selecția din punct de vedere al existenței genei DHFR. 25 Prin utilizarea acestui sistem, a fost posibilă obținerea de clone selecționate, utilizând cantități scăzute de methotrexat (50 nM), clone conținând câteva (< 10) copii ale vectorului 27 care secretă niveluri ridicate de proteină (> 55 pg/celulă/zi). Mai mult decât atât, aceasta se poate realiza într-o perioadă relativ scurtă de timp. Cu toate acestea, succesul obținut în 29 amplificare este variabil. Unele situsuri active transcripțional nu pot fi amplificate și, de aceea, frecvența și gradul de amplificare, dintr-un anume situs, nu sunt previzibile. 31 în general, utilizarea acestor vectori alterați translațional reprezintă o îmbunătățire semnificativă față de alte metode de integrare randomizată. Cu toate acestea, așa cum s-a 33 discutat, problema lipsei controlului asupra situsului de integrare rămâne un motiv de îngrijorare semnificativ. 35

Una dintre încercările de depășire a problemelor datorate integrării întâmplătoare este prin modalitățile de țintire a genei, prin care ADN-ul exogen este direcționat spre un 37 locus specific din genomul gazdă. ADN-ul exogen este inserat prin metodele recombinării omoloage, între secvențe de ADN din vectorul de exprimare și secvența omoloagă, cores- 39 punzătoare, din genom. Cu toate acestea, în timp ce acest tip de recombinare are loc cu o frecvență ridicată, în mod natural, la drojdii și la alte organisme fungice, la organismele euca- 41 riote superioare, acest fenomen este extrem de rar. în cazul celulelor mamifere, frecvența recombinării omoloage față de cea neomoloagă (integrare randomizată) este raportată la 43 domeniul 1 /100...1 /5.000 (spre exemplu, a se vedea, Capecchi, Science, 244:1288 -1292 (1989); Morrow and Kucherlapati, Curr. Op. Biotech., 4: 577 - 582 (1993)). 45

Unul dintre cele mai recente articole, care descrie recombinarea omoloagă în celulele mamifere, cuprinde un sistem artificial creat în fibroblastele de șoarece (Thomas et al., Cell, 47

44: 419 - 428 (1986)). A fost creată o linie celulară, conținând o versiune supusă mutației,

RO 120148 Β1 nefuncțională, a genei neo integrată în genomul gazdei și țintită ulterior cu o a doua copie nefuncțională a genei neo conținând o altă mutație. Reconstrucția unei gene neo funcționale ar putea fi realizată doar prin țintirea genei. Recombinanții omologi au fost identificați prin selecția celulelor rezistente G 418 și confirmați prin analiza ADN-ului genomic izolat din clonele rezistente.

A fost semnalată, recent, utilizarea recombinării omoloage, pentru înlocuirea genelor pentru imunoglobulină, catena grea și ușoară, în locusuri (loci) endogene, din celulele secretoare de anticorpi (US 5202238, Fell et al., (1993)). Cu toate acestea, realizarea nu are o largă aplicabilitate, datorită faptului că este limitată la producerea de imunoglobuline în celulele care exprimă endogen imunoglobulinele, spre exemplu, celulele B și celulele mielomatoase. De asemenea, exprimarea este limitată la nivelul unei singure copii a genei, deoarece nu este inclusă coamplificarea după recombinarea omoloagă. Metoda este complicată și prin faptul că sunt necesare două etape separate de integrare, pentru producerea unei imunoglobuline funcționale; una pentru gena pentru catena ușoară, urmată de una pentru gena pentru catena grea.

Un exemplu suplimentar pentru acest tip de sistem a fost descris în celulele NS/O, în care imunoglobulinele recombinante sunt exprimate prin recombinare omoloagă în locusul gamma 2A al imunoglobulinei (Hollis et al., Internațional patent application # PCT/IB 95 (00014)). Nivelurile de exprimare, obținute din acest situs, au fost extrem de ridicate - de ordinul a 20 pg/celulă/zi dintr-un integrant al unei singure copii. Cu toate acestea, ca și în exemplul de mai sus, exprimarea este limitată la acest nivel (de singură copie), deoarece în acest sistem nu este cointegrată o genă amplificabilă. De asemenea, alți cercetători au constatat glicozilarea aberantă a proteinelor recombinante exprimate în celulele NS/O (spre exemplu, a se vedea, Flesher et al., Biotech. and Bioeng., 48: 399 - 407 (1995)), acest fapt determinând limitarea aplicabilității acestei realizări.

Sistemul de recombinare cre-loxP, din bacteriofagul P1, a fost recent adaptat și utilizat ca modalitate de țintire a genei în celulele eucariote. Mai precis, a fost descrisă integrarea la situsul specific al ADN-ului exogen, din genomul celulei ovariene de hamster chinez (CHO = Chinese hamster ovary), utilizând recombinaza ere și o serie de vectori conținând /ox(Fukushigeand Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7905-7909 (1992)). Acest sistem este atractiv prin faptul că prevede exprimarea reproductibilă în aceeași localizare cromozomială. în ciuda acestui fapt, nu s-a făcut nici un efort pentru identificarea unui situs cromozomial, din care exprimarea genei să fie optimă, și ca și în exemplul de mai sus, exprimarea este limitată la niveluri de o singură copie în acest sistem. De asemenea, soluția tehnică de mai sus este complicată și de faptul că, în unele cazuri, este nevoie de a asigura o recombinază funcțională în celula mamiferă pentru exprimarea genei.

A fost descrisă, de asemenea, utilizarea recombinării omoloage între o secvență de ADN introdusă și locusul său cromozomal endogen, în scopul furnizării unei modalități utile de manipulare genetică în celulele mamifere, la fel de bună ca și în celulele de drojdii (a se vedea, spre exemplu, Bradley et al., Meth. Enzymol., 223: 855 - 879 (1993); Capecchi, Science, 244:1288 -1292 (1989); Rothstein et al., Meth. Enzymol., 194: 281 - 301 (1991)). Până în prezent, majoritatea studiilor de țintire a genei mamifere au fost îndreptate spre ruperea genei (knockout) sau spre mutageneză situs-specifică a locilor genei țintă din celule sursă embrionare de șoarece (ES = embryonic stern). Crearea acestor modele knockout de șoarece a permis cercetătorilor să examineze rezultatele specifice structură - funcție și să examineze importanța biologică a unui număr nesfârșit de gene de șoarece. Acest domeniu de cercetare are, de asemenea, implicații importante, în ceea ce privește posibilele aplicații în terapia genetică.

RO 120148 Β1

De asemenea, au fost semnalați recent de către Cell-Tech (Kent, U.K.) vectori care 1 sunt destinați a fi îndreptați spre situsurile active transcripțional din celulele NSO, vectori care nu necesită amplificarea genetică (Peakman et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 5: 65-74 3 (1994)). Cu toate acestea, în aceste celule neamplificate, nu au fost semnalate niveluri de secreție de imunoglobuline care să depășească 20 pg/celulă/zi, în timp ce în celulele CHO 5 amplificate pot fi obținute niveluri ridicate, de ordinul a 100 pg / celulă/zi (Jd.).

Ar fi de dorit elaborarea unui sistem de țintire a genei, care să asigure reproductibili- 7 tatea integrării ADN-ului exogen într-un situs predeterminat, din genomul cunoscut a fi activ transcripțional. De asemenea, ar fi preferabil ca un asemenea sistem de țintire să faciliteze 9 ulterior coamplificarea ADN-ului inserat după integrare. Proiectarea unui asemenea sistem ar permite exprimarea reproductibilă și ridicată a oricărei gene donate de interes, într-o 11 celulă mamiferă și, fără îndoială, ar prezenta un interes semnificativ pentru mulți cercetători.

în prezenta invenție, este descris un sistem nou de vectori de exprimare la mamifere, 13 bazat pe recombinarea omoloagă, având loc între două substrate artificiale conținute în doi vectori diferiți. Mai exact, acest sistem utilizează o combinație de doi vectori mamiferi noi, 15 de exprimare, denumiți astfel: un vector de marcare și un vector de țintire. Sistemul vectorial, conform invenției, constă în aceea că acesta conține cel puțin următoarele: 17 (i) o plasmidă marker, care cuprinde următoarele secvențe:

(a) un prim fragment ADN, care cuprinde o regiune ADN care este heteroloagă cu 19 genomul celulei de mamifer și care, atunci când este integrat în genomul celulei de mamifer, furnizează un situs unic pentru recombinare omoloagă; 21 (b) un al doilea fragment ADN, care cuprinde cel puțin un exon al unei gene care codifică o primă proteină marker selectabil; și 23 (c) un al treilea fragment ADN, care cuprinde o regiune care codifică o a doua proteină marker selectabil, care este diferită de prima proteină marker selectabil și furnizează 25 selecția unei celule de mamifer, care are respectiva plasmidă marker integrată în genom; și (ii) o plasmidă țintă, care cuprinde cel puțin un fragment ADN ce trebuie înlocuit în 27 genomul respectivei celule, și cuprinde în mod suplimentar, următoarele secvențe:

(a) un al patrulea fragment ADN, care cuprinde o regiune care este identică sau pre- 29 zintă o omologie suficientă cu situsul unic pentru recombinare omoloagă din plasmida marker, astfel încât acea regiune de ADN să poată să se recombine cu respectivul ADN din 31 plasmida marker prin recombinare omoloagă;

(b) un al cincilea fragment ADN, care cuprinde exonul sau exonii rămași din gena 33 care codifică prima proteină marker selectabil, care nu sunt prezenți în plasmida marker;

în care cel puțin un exon al unei gene, care codifică o primă proteină marker selec- 35 tabil din plasmida marker și exonul sau exonii rămași din gena care codifică o primă proteină marker selectabil din plasmida țintă, codifică împreună o primă proteină marker selectabil 37 activă.

în esență, vectorul de marcare permite identificarea și marcarea unui situs din 39 genomul mamifer, care este activ transcripțional, adică, un situs la care nivelurile exprimării genei sunt ridicate. Acest situs poate fi privit ca un hot spot în genom. După integrarea 41 vectorului de marcare, sistemul de exprimare a subiectului permite unui alt ADN să fie integrat la acest situs, adică, vectorul de țintire, prin intermediul recombinării omoloage care 43 are locîntre secvențe de ADN comune ambilor vectori. Acest sistem conferă avantaje semnificative față de alte sisteme omoloage de recombinare. 45

Spre deosebire de majoritatea sistemelor omoloage folosite în celulele mamifere, acest sistem nu prezintă nici un fundament. De aceea, celulele care au suferit doar integra- 47 rea randomizată a vectorului, nu supraviețuiesc selecției. Astfel, orice genă de interes

RO 120148 Β1 donată în plasmida țintă este exprimată în cantități mari de la hot spot-ul marcat. în consecință, prezenta metodă de exprimare a genei elimină substanțial sau complet problemele inerente sistemelor de integrare întâmplătoare, discutată în detaliu, mai sus. Mai mult, acest sistem asigură o exprimare reproductibilă și superioară a oricărei proteine recombinante, la același situs activ transcripțional, din genomul mamifer. în plus, amplificarea genei poate fi realizată la acest situs particular, activ transcripțional, prin includerea unui marker amplificabil, dominant, selectabil (de exemplu, DHFR) ca parte a vectorului de marcare.

Unul dintre obiectivele invenției este de a furniza o metodă perfecționată de țintire a unui ADN dorit, într-un situs specific, într-o celulă mamiferă.

Un obiectiv mai specific al prezentei invenții este acela de a furniza o metodă nouă de țintire a unui ADN dorit, într-un situs specific, într-o celulă mamiferă, prin recombinare omoloagă.

Un alt scop specific al prezentei invenții este de a asigura vectori noi pentru realizarea integrării specifice a situsului dintr-un ADN dorit, într-o celulă mamiferă.

încă un obiectiv al invenției este de a furniza linii celulare mamifere noi, care să conțină un ADN dorit, integrat la un situs predeterminat, care să asigure o bună exprimare.

Un obiectiv mult mai specific al prezentei invenții este acela de a furniza o metodă nouă, pentru realizarea integrării situsului specific al unui ADN dorit, într-o celulă ovariană de hamster chinez (CHO = Chinese hamster ovary).

încă un obiectiv mai specific al invenției este de a furniza o metodă nouă de integrare a genelor pentru imunoglobuline sau pentru orice alte gene, în celule mamifere, la situsurile cromozomale predeterminate, care asigură o exprimare superioară.

Un alt obiectiv specific al invenției este de a furniza vectori noi și combinații de vectori adecvate integrării genelor, pentru imunoglobuline, în celule mamifere, la situsuri predeterminate, care să asigure o exprimare superioară.

încă un obiectiv al invenției este acela de a furniza linii celulare mamifere, care să conțină gene pentru imunoglobuline integrate la situsuri predeterminate, care să asigure o exprimare superioară.

Un obiectiv mult mai specific al prezentei invenții este de a furniza o metodă nouă de integrare a genelor, pentru imunoglobulină, în celule CHO care asigură o exprimare superioară, ca și vectori noi și combinații de vectori, care să asigure o asemenea integrare a genelor pentru imunoglobuline în celule CHO.

în plus, un obiectiv specific al prezentei invenții este de a prevedea linii celulare CHO noi, care să conțină gene pentru imunoglobulină, integrate la situsuri predeterminate, care să asigure o exprimare superioară, și care gene au fost amplificate prin selecție cu methotrexat, pentru a secreta cantități chiar mai mari de imunoglobuline funcționale.

Figuri:

- fig. 1 reprezintă o hartă a unei plasmide de marcare, în conformitate cu prezenta invenție, plasmidă denumită Desmond. Plasmida este prezentată în forma circulară (1a), precum și într-o versiune liniarizată utilizată pentru transfecție (1b);

- fig. 2 (a) reprezintă o hartă a unei plasmide de țintire, denumită aici Molly. Molly este prezentată aici, codificând genele pentru imunoglobulină anti-CD20, a cărei exprimare este descrisă în exemplul 1;

- fig. 2 (b) prezintă o versiune liniarizată a lui Molly, după digestie cu enzimele de restricție Kpn1 și Pac1. Această formă liniarizată a fost utilizată pentru transfecție;

- fig. 3 reprezintă alinierea posibilă dintre secvențele Desmond integrate în genomul CHO și secvențele Molly intronice de țintire. Este prezentat, de asemenea, un aranjament posibil al lui Molly integrat în Desmond după recombinarea omoloagă;

RO 120148 Β1

- fig. 4 prezintă o analiză Southern a clonelor Desmond, exprimate într-o singură 1 copie. Probele sunt, după cum urmează:

- linia 1: Marker de mărime pentru ADN de ĂHindlll;3

- linia 2: Clona 10F3 Desmond;

- linia 3: Clona 10C12 Desmond;5

- linia 4: Clona 15C9 Desmond;

- linia 5: Clona 14B5 Desmond;7

- linia 6: Clona 9B2 Desmond;

- fig. 5 prezintă o analiză Northern a clonelor Desmond de copiere unică. Probele 9 sunt, după cum urmează: panoul A: Northern sondate cu CAD și sonde DHFR, așa cum s-a indicat pe figură. Panoul B: Northern duplicat, sondat cu CAD și sonde HisD, așa cum s-a 11 indicat. Probele RNA încărcate în panourile A și B sunt, după cum urmează:

- linia 1: clona 9B2; linia 2: clona 10C12; linia 3: clona 14B5; linia 4: clona 15C9; -13 linia 5: martor RNA din celule CHO transfectate cu o plasmidă conținând HisD și DHFR; ’15

- linia 6: celule CHO netransfectate;

- fig. 6 prezintă o analiză Southern a clonelor rezultate din integrarea omoloagă a lui 17 Molly în Desmond. Probele sunt, după cum urmează:

- linia 1: markeri de mărime ADN din ĂHindlll; - linia 2: 20F4; linia 3: 5F9; linia 4:19

21C7; linia 5: 24G2; linia 6: 25E1; linia 7: 28C9; linia 8: 29F9; linia 9: 39G11; linia 10:42F9;

linia 11: 50G10; linia 12: ADN din plasmida Molly, liniarizat cu Bg1 II (banda superioară) și 21 tăiat cu Bg1 II și cu Kpnl (banda inferioară); linia 13: Desmond netransfectat;

- fig. 7A până la 7G conțin listarea secvenței pentru Desmond;23

- fig. 8A până la 81 conțin listarea secvenței pentru anti-CD20 conținând Molly;

- fig. 9 conține o hartă a plasmidei de țintire, Mandy, prezentată aici codificând ge- 25 nele pentru anti-CD23, a cărei exprimare este descrisă în exemplul 5;

- fig. 10A până la 10N conțin listarea secvenței lui Mandy, conținând genele pentru 27 anti-CD23, așa cum s-a descris în exemplul 5;

Invenția furnizează o metodă nouă pentru integrarea unui ADN exogen dorit, la un 29 situs țintă din genomul unei celule mamifere prin recombinare omoloagă. De asemenea, invenția prevede și vectori noi, pentru realizarea integrării specifice a situsului unui ADN la 31 un situs țintă din genomul unei celule mamifere.

Mai specific, metoda de donare a subiectului asigură integrarea specifică a unui ADN 33 dorit, într-o celulă mamiferă, prin transfecția unei astfel de celule cu o plasmidă marker care conține o secvență unică, străină de genomul celulei mamifere și care asigură un substrat 35 pentru recombinare omoloagă, urmată de transfecția cu o plasmidă țintă conținând o secvență care asigură recombinarea omoloagă cu secvența unică conținută în plasmida marker 37 și cuprinderea ulterioară a unui ADN dorit, care trebuie integrat în celula mamiferă. în mod caracteristic, ADN-ul integrat va codifica o proteină de interes, cum arfio imunoglobulină sau 39 altă glicoproteină mamiferă secretată.

Sistemul de recombinare omoloagă, exemplificat, utilizează gena pentru neomicin 41 fosfotransferază, ca marker selectabil dominant. Acest marker particular a fost utilizat pe baza următoarelor observații, publicate anterior: 43 (i) capacitatea demonstrată de a ținti și reda funcția unei versiuni supuse mutației, a genei pentru neo (citată anterior) și 45 (ii) elaborarea de către noi a unor vectori de exprimare alterați translațional, în care gena pentru neo a fost creată artificial, încât doi exoni cu o genă de interes să fie inserați în 47 intronul care intervine; exonii neo sunt îmbinați corect și traduși in vivo, producând o proteină

RO 120148 Β1 funcțională, prin aceasta conferind rezistență G418, populației celulare rezultante. în această cerere de brevet, gena neo este tăiată în 3 exoni. Cel de-al 3-lea exon al genei neo este prezent pe plasmida marker și se integrează în genomul celulei gazdă prin integrarea plasmidei marker în celulele mamifere. Exonii 1 și 2 sunt prezenți pe plasmida de țintire și sunt separați printr-un intron care interfera, în care cel puțin o genă de interes este donată. Recombinarea omoloagă, a vectorului de țintire cu vectorul de marcare integrat, duce la corecta alipire a tuturor celor 3 exoni ai genei neo și, în felul acesta, la exprimarea unei proteine neo funcționale (așa cum s-a determinat prin selecția coloniilor rezistente G418). Anterior proiectării acestui sistem de exprimare, noi am testat experimental funcționalitatea unui asemenea construct neo, tăiat de 3 ori în celulele mamifere. Rezultatele acestui experiment martor au indicat că toți cei 3 exoni neo au fost alipiți corect și, de aceea, au sugerat fezabilitatea prezentei invenții.

Cu toate acestea, în timp ce prezenta invenție este exemplificată, utilizând gena neo și, mai specific, o genă neo tăiată de 3 ori, metodologia generală ar trebui să fie eficace cu alți markeri selectabili dominanți.

Așa cum s-a discutat mai detaliat, infra, prezenta invenție oferă numeroase avantaje față de metodele convenționale de exprimare a genei, incluzând atât integrarea randomizată, cât și metodele de țintire a genei. în mod specific, prezenta invenție oferă o metodă care permite în mod reproductibil integrarea situs-specifică a unui ADN dorit, într-un domeniu activ transcripțional, dintr-o celulă mamiferă. Mai mult, deoarece prezenta metodă introduce o regiune artificială de omologie, care acționează ca un substrat unic pentru recombinarea omoloagă și inserția unui ADN dorit, eficacitatea prezentei invenții nu necesită ca celula să conțină endogen sau să exprime un ADN specific. Astfel, metoda este aplicabilă, generic, tuturor celulelor mamifere și poate fi utilizată pentru exprimarea oricărui tip de proteină recombinantă.

Utilizarea unui marker selectabil, triplu îmbinat, spre exemplu, constructul neo triplu lipit, garantează că toate coloniile G418 rezistente, produse, vor apare dintr-un proces de recombinare omoloagă (integranții întâmplători nu vor produce o genă neo funcțională și, în consecință, nu vor supraviețui selecției G418). Astfel, prezenta invenție ușurează alegerea procesului omolog dorit. Mai mult, frecvența integrărilor întâmplătoare, suplimentare, dintr-o celulă care a fost supusă unui proces de recombinare omoloagă, pare să fie scăzută.

Pe baza celor de mai sus, este evident că un avantaj semnificativ al invenției este acela că se reduce substanțial numărul de colonii care trebuie supuse screeningului, pentru identificarea clonelor înalt producătoare, adică, a liniilor celulare conținând un ADN dorit, care secretă proteina corespunzătoare, în cantități ridicate. în medie, clonele conținând ADN-ul dorit integrat pot fi identificate prin screeningul a aproximativ 5...20 de colonii (comparativ cu câteva mii care trebuie supuse screeningului, atunci când se utilizează tehnicile standard de integrare randomizată, sau câteva sute atunci când se utilizează vectorii de inserție intronică descriși anterior). în plus, așa cum situsul de integrare a fost preselectat și conține un domeniu activ din punct de vedere transcripțional, toate ADN-urile exogene exprimate la acest situs vor produce în mod comparabil, adică, cantități ridicate din proteina de interes.

Mai mult, prezenta invenție este avantajoasă și datorită faptului că ea permite unei gene amplificabile să fie inserată pe integrarea vectorului de marcare. Astfel, atunci când o genă dorită este țintită la acest situs, prin recombinare omoloagă, invenția expusă face posibil ca exprimarea genei să fie suplimentar sporită prin amplificarea genetică. în această privință, în literatură a fost semnalat faptul că diferitele situsuri genomice au capacități diferite de amplificare a genelor (Meinkoth et al., Mol. Cell. Biol., 7:1415-1424 (1987)). De aceea,

RO 120148 Β1 această tehnică mai este avantajoasă și prin aceea că permite plasarea unei gene dorite, 1 de interes, într-un situs specific, care este atât activ din punct de vedere transcriptional, cât și ușor de amplificat. Așadar, aceasta ar reduce semnificativ timpul necesar izolării unor 3 asemenea producători superiori.

Mai exact, în timp ce metodele convenționale de construcție a liniilor celulare mami- 5 fere, cu capacitate ridicată de exprimare, pot necesita 6...9 luni, prezenta invenție permite ca aceste clone să fie izolate, în medie, după doar aproximativ 3...6 luni. Aceasta se datorea- 7 ză faptului că clonele izolate în mod convențional trebuie să fie, în mod specific, supuse la cel puțin 3 runde de amplificare a genei, pentru rezistența la medicamente, în scopul atingerii 9 unor niveluri satisfăcătoare de exprimare genetică. Cum clonele produse prin omologie sunt generate dintr-un situs preselectat, care este un situs cu exprimare superioară, arfi necesare 11 doar câteva runde de amplificare, înaintea atingerii unui nivel satisfăcător de producție.

Mai mult decât atât, invenția expusă permite selecția reproductibilă a clonelor înalt 13 producătoare, în care vectorul este integrat într-un număr mic de copiere, tipic, într-o singură copie. Acest lucru este avantajos, deoarece mărește stabilitatea clonelor și evită alte efecte 15 secundare adverse, asociate cu un număr ridicat de copii. Așa cum s-a descris mai sus, sistemul de recombinare omoloagă, expus aici, utilizează combinația dintre o plasmidă marker 17 și o plasmidă de țintire, care sunt descrise mai jos.

Plasmida marker, care este utilizată pentru a marca și identifica un hot spot 19 transcripțional, va conține cel puțin următoarele secvențe:

(i) o regiune de ADN care este heteroloagă sau unică față de genomul celulei 21 mamifere, care funcționează ca sursă de omologie, asigură recombinarea omoloagă (cu un

ADN conținut într-o a doua plasmidă țintă). Mai exact, regiunea unică de ADN (i) va conține, 23 în general, un ADN bacterian, viral, de drojdie, sintetic, sau alt ADN care, în mod normal, nu este prezent în genomul celulei mamifere și care nu trebuie să prezinte nici o omologie 25 semnificativă sau o identitate a secvenței cu ADN-ul conținut în genomul celulei mamifere, în esență, această secvență trebuie să fie suficient de diferită față de ADN-ul mamifer, așa 27 încât să nu se recombine semnificativ cu genomul celulei gazdă via recombinare omoloagă. Mărimea unui astfel de ADN unic va fi, în general, de cel puțin 2...10 kilobaze sau mai mare, 29 de preferință, de cel puțin 10 kilobaze, așa cum alți câțiva cercetători au semnalat o frecvență ridicată a recombinării țintite, pe măsură ce mărimea regiunii de omologie crește 31 (Capecchi, Science, 244: 1288 -1292 (1989)).

Limita superioară a mărimii ADN-ului unic, care acționează ca un situs pentru recom- 33 binarea omoloagă cu o secvență din cel de-al doilea vector țintă, este dictată în mare măsură de posibilele constrângeri de stabilitate (dacă ADN-ul este prea mare, el nu poate fi ușor 35 integrat într-un cromozom și apar dificultăți în lucrul cu ADN-uri foarte mari).

(ii) un ADN care include un fragment dintr-un ADN marker selectabil, în mod 37 caracteristic un exon dintr-o genă marker dominantă, selectabilă. Singura trăsătură esențială a acestui ADN este aceea că el nu codifică o proteină marker selectabil funcțională, decât 39 dacă este exprimat în asociere cu o secvență conținută în plasmida țintă. în mod caracteristic, plasmida țintă va conține exonii rămași din gena marker selectabil dominantă (cei care 41 nu sunt conținuți în plasmida de țintire). în esență, un marker selectabil funcțional ar fi produs, doardacă are loc recombinarea omoloagă (ducând la asocierea și exprimarea aces- 43 tei secvențe (i) de ADN marker împreună cu porțiunea(ile) din fragmentul de ADN marker selectabil, care este (sunt) conținută(e) în plasmida țintă). 45

Așa cum s-a menționat, prezenta invenție exemplifică utilizarea genei pentru neomicin fosfotransferază ca marker selectabil dominant, care este tăiată în cei doi vectori. Cu 47 toate acestea, pot fi adecvați și alți markeri selectabili, spre exemplu, gena pentru histidinol

RO 120148 Β1 dehidrogenază, din Salmonella, gena pentru hygromycin fosfotransferază, gena pentru timidin kinază din virusul herpes simplex, gena pentru adenozin dezaminază, gena pentru glutamin sintetază și gena pentru hipoxantin - guanin fosforibozil transferază.

(iii) un ADN care codifică o proteină marker selectabilă, funcțională, care marker selectabil este diferit de markerul ADN (ii) selectabil. Acest marker selectabil asigură succesul selecției celulelor mamifere, în care plasmida marker este integrată cu succes în ADN-ul celular. Mai convenabil, este de dorit ca plasmida marker să conțină 2 astfel de ADN-uri marker selectabili, dominanți, situați la capetele opuse ale vectorului. Acest lucru este avantajos, deoarece permite integrantilor să fie selectați, utilizând agenți de selecție diferiți și, ulterior, permite selecția celulelor care conțin vectorul întreg. în plus, un marker poate fi un marker amplificabil, pentru a facilita amplificarea genei, așa cum s-a discutat anterior. Oricare dintre markerii selectabili dominanți, aflați în (ii), poate fi utilizat la fel de bine ca și alții cunoscuți, în general, în domeniu.

Mai mult, plasmida marker poate, opțional, să mai conțină și un situs de restricție rar pentru endonuclează. Acesta este potențial dezirabil, deoarece poate facilita clivarea. Dacă este prezent, un asemenea situs de restricție rar ar putea fi situat aproape de mijlocul regiunii unice, care acționează ca substrat pentru recombinarea omoloagă. Este de preferat ca această secvență să aibă cel puțin 12 nucleotide. S-a constatat că introducerea unei sciziuni dublu răsucite, printr-o metodologie asemănătoare, crește frecvența recombinării omoloage. (Choulika et al., Mol. Cell. Biol., 15: 1968 -1973 (1995)). Cu toate acestea, prezența unei asemenea secvențe nu este esențială.

Plasmida de țintire va cuprinde cel puțin următoarele secvențe:

(1) aceeași regiune unică de ADN, conținută în plasmida marker, sau una având o omologie suficientă sau identitatea secvenței totodată, încât ADN-ul menționat să fie capabil să se combine via recombinare omoloagă cu regiunea unică (i) din plasmida marker. Tipuri adecvate de ADN-uri au fost descrise mai sus, în descrierea regiunii unice a ADN-ului (1), din plasmida marker.

(2) Exonii rămași din markerul selectabil dominant, dintre care un exon este inclus ca (ii) în plasmida marker prezentată mai sus. Proprietatea esențială a acestui fragment de ADN este aceea că are ca rezultat o proteină marker (selectabilă) funcțională doar dacă integrează plasmida țintă prin recombinare omoloagă (o asemenea recombinare ducând la asocierea acestui ADN cu celălalt fragment din ADN-ul marker selectabil, conținut în plasmida marker) și, ulterior, permite inserția unui ADN exogen dorit. în mod caracteristic, acest ADN va conține exonii rămași ai ADN-ului marker selectabil, care sunt separați printr-un intron. Spre exemplu, acest ADN poate cuprinde primii doi exoni ai genei neo, iar plasmida marker poate conține cel de-al treilea exon.

(3) Plasmida țintă va conține, de asemenea, un ADN dorit, spre exemplu, unul care codifică o polipeptidă dorită, de preferință, inserat în fragmentul de ADN marker selectabil din plasmidă. în mod carcateristic, ADN-ul va fi inserat într-un intron care este cuprins între exonii ADN-ului marker selectabil. Aceasta asigură ca ADN-ul dorit să fie, de asemenea, integrat, dacă are loc recombinarea omoloagă dintre plasmida țintă și plasmida marker. Acest intron poate exista în mod natural sau poate fi obținut prin inginerie genetică, din fragmentul de ADN marker selectabil dominant.

Acest ADN va codifica orice proteină dorită, preferabil una având proprietăți farmaceutice sau alte proprietăți dezirabile. Și mai specific, ADN-ul va codifica o proteină mamiferă, iar în exemplul curent furnizat, o imunoglobulină sau o imunoadezină. Cu toate acestea, invenția nu este în nici un fel limitată la producerea de imunoglobuline.

RO 120148 Β1

Așa cum s-a discutat anterior, metoda de donare expusă este adecvată oricărei 1 celule mamifere, deoarece nu necesită pentru eficacitate prezența unei (unor) secvențe mamifere specifice. în genera), asemenea celule mamifere vor fi acelea utilizate în mod 3 specific pentru exprimarea proteinelor, spre exemplu: celule CHO, celule mielomatoase, celule COS, celule BHK, celule Sp2/0, celule NIH 3T3 și HeLa. în exemplele care urmează, 5 au fost utilizate celule CHO. Avantajele care reies de aici includ disponibilitatea unui mediu de creștere adecvat, capacitatea lor de a crește eficient și la o mare densitate în cultură, 7 precum și capacitatea lor de a exprima proteine mamifere, cum ar fi imunoglobulinele, în formă activă din punct de vedere biologic. 9

Mai mult, celulele CHO au fost alese în mare parte, datorită utilizării anterioare a unor astfel de celule, de către inventatori, pentru exprimarea imunoglobulinelor (utilizând vectori 11 care conțin un marker selectabil dominant, alterat translațional, descriși anterior). Astfel, prezentul laborator are o experiență considerabilă în utilizarea unor astfel de celule pentru 13 exprimare. Cu toate acestea, pe baza exemplelor care urmează, este rezonabil să fie de așteptat obținerea de rezultate similare cu alte celule mamifere. 15 în general, transformarea și transfecția celulelor mamifere, conform prezentei invenții, vor fi realizate în concordanță cu metodele convenționale. Pentru ca invenția să poată fi înțe- 17 leasă mai bine, construcția de vectori exemplari și utilizarea lor în producerea de integranti sunt descrise în exemplele de mai jos. 19

Exemplul 1. Proiectarea și prepararea de vectori ADN din plasmida marker și plasmida de țintire. 21

Plasmida marker desemnată aici ca Desmond a fost asamblată din următoarele elemente ADN: 23 (a) gena pentru dihidrofolat reductaza murinică (DHFR), încorporată într-o casetă de transcriere, conținând promotorul 5 pentru beta globina de șoarece, de la situsul de start 25 pentru DHFR, și semnalul 3 de poliadenilare pentru hormonul de creștere bovin, spre codonul de stopare. Caseta transcripțională a DHFR a fost izolată din TCAE6, un vector de 27 exprimare creat anterior în acest laborator (Newman et al., 1992, Biotechnology, 10: 1455-1460). 29 (b) gena pentru β-galactozidaza din E. coli - disponibilă comercial, obținută de la

Promega, sub forma vectorului martor pSV-p-galactozidază, catalog #E1081. 31 (c) ADN de Baculovirus, disponibil comercial, procurat de la Clontech, sub forma

PBAKPAK8, catalog # 6145-1. 33 (d) Casetă conținând promotorul și elementele de amplificare de la Cytomegalovirus și de la virusul SV40. Caseta a fost generată cu ajutorul tehnicii PCR (reacția de amplificare 35 în lanț), prin utilizarea unui derivat al vectorului de exprimare TCAE8 (Reff et al., Blood, 83.

435 - 445 (1994)). Caseta de amplificare a fost inserată în secvența baculovirusului, care a 37 fost mai întâi modificată prin inserarea unui situs de donare multiplă.

(e) gena pentru GUS (glucuronidaza) de la E. coli, disponibilă comercial, procurată 39 de la Clontech, sub forma pB101, catalog # 6017-1.

(f) gena pentru luciferaza de la licurici, disponibilă comercial, obținută de la Promega, 41 sub forma pGEM-Luc, catalog # E1541.

(g) gena pentru histidinol dehidrogenaza (HisD) de la S. typhimurium. Această genă 43 a fost inițial un cadou (Donahue et al., Gene, 18:47 - 59 (1982)) și a fost ulterior încorporată într-o casetă de transcriere conținând promotorul 5' major pentru beta globina de șoarece 45 spre genă și semnalul 3' de poliadenilare de la SV40.

RO 120148 Β1

Elementele de ADN descrise în a...g au fost combinate într-o plasmida pBR derivată din măduvă osoasă, pentru a produce o porțiune de ADN de 7,7 kb, vecină, denumită în figurile atașate ca omologie. Omologia în acest sens se referă la secvențele de ADN care nu fac parte din genomul mamifer și sunt utilizate pentru a iniția recombinarea omoloagă dintre plasmidele transfectate care împart aceeași omologie cu secvențele de ADN.

(h) gena din TN5 pentru neomicin fosfotransferază (Davis and Smith, Ann. Rev. Micro., 32:469-518(1978)). Gena neo completă a fost subclonată în pBluescriptSK (Sfratagene catalog # 212205), pentru facilitarea manipulării genetice. Apoi, un linker sintetic a fost inserat într-un situs unic Pst1, care se află între codonii pentru aminoacizii 51 și 52 ai genei neo. Acest linker codifică: elementele de ADN necesare pentru crearea unui situs donor artificial de îmbinare; intronul care interfera și situsul acceptor de îmbinare din gena neo, ducând astfel la crearea a doi exoni separați, denumiți aici ca exonii 1 și 2 neo. Exonul 1 neo codifică primii 51 de aminoacizi din proteina neo, în timp ce exonul 2 codifică cei 203 de aminoacizi rămași, plus codonul de stopare din situsul de donare Not1 pentru proteina A a fost, de asemenea, creat în intron.

Exonul 2 neo a fost subdivizat, în continuare, pentru a produce exonii 2 și 3. Acest lucru s-a realizat, după cum urmează: setul A de primeri PCR a fost desemnat să amplifice o regiune de ADN care codifică exonul 1 neo, intronul și primii 111 (2/3) aminoacizi din exonul 2. Primerul 3' PCR a avut ca rezultat introducerea unui nou situs 5' de îmbinare, imediat după a doua nucleotidă din codonul pentru aminoacidul 111 din exonul 2, generându-se astfel un nou exon 2, mai mic. Fragmentul de ADN care codifică acum exonul 1 original, intronul și noul exon 2, a fost apoi subclonat și propagat într-un vector pe bază de pBR. Ceea ce a rămas din exonul 2 original a fost folosit ca matriță pentru o altă rundă de amplificare, care a generat exonul 3. Primerul 5', pentru această rundă de amplificare, a introdus un nou situs acceptor de îmbinare, la catena 5' a exonului 3 nou creat, adică înaintea nucleotidei finale a codonului pentru aminoacidul 111. Exonii 3 rezultanți ai genei neo codifică următoarea informație: exonul 1 - primii 51 de aminoacizi din proteina neo; exonul 2 următorii 111 (2/3) aminoacizi, iar exonul 3 - ultimii 91 (1/3) aminoacizi plus codonul de stopare a traducerii, din gena neo.

Exonul 3 neo a fost încorporat împreună cu elementele de ADN menționate mai sus, în plasmida marcatoare Desmond. Exonii 1 și 2 neo au fost încorporați în plasmida de țintire Molly. Situsul de donare Not1, creat în intronul dintre exonii 1 și 2, a fost utilizat în următoarele etape de donare, pentru inserarea genelor de interes în plasmida de țintire.

A fost generată, de asemenea, o a doua plasmidă de țintire - Mandy. Această plasmidă este aproape identică cu plasmida Molly (au fost modificate câteva situsuri de restricție de pe vector), cu excepția faptului că genele originale HisD și DHFR, conținute în Molly, au fost inactivate. Aceste modificări au fost încorporate, deoarece linia celulară Desmond nu a mai fost cultivată în prezență de Histidinol și, de aceea, nu s-a considerat necesară includerea unei a doua copii a genei HisD. în plus, gena pentru DHFR a fost inactivată pentru siguranța că numai o singură genă pentru DHFR, anume, singura prezentă în situsul marcat cu Desmond, ar putea fi amplificabilă în oricare dintre liniile celulare rezultante. Plasmida Mandy a fost derivată din plasmida Molly, prin următoarele modificări:

(i) Un linker sintetic a fost inserat în mijlocul regiunii de codificare a DHFR. Acest linker a creat un codon de stopare și a deplasat restul regiunii de codificare a DHFR în afara cadrului de citire, fapt ce conferă nefuncționalitate genei.

(ii) O porțiune din gena HisD a fost ștearsă și înlocuită cu un fragment HisD generat prin tehnica PCR, căruia îi lipsesc promotorul și codonul de stopare din genă.

RO 120148 Β1

Fig. 1 reprezintă aranjamentul acestor elemente de ADN din plasmida marker 1 Desmond. Fig. 2 redă aranjamentul acestor elemente în prima plasmida de țintire, Molly. Fig. 3 ilustrează posibilul aranjament din genomul CHO, al diferitelor elemente ADN după 3 țintirea și integrarea ADN-ului plasmidei Molly în celulele CHO marcate cu Desmond. Fig. 9 ilustrează plasmida de țintire Mandy. 5

Construcția plasmidelor de marcare și de țintire, cu ajutorul elementelor de ADN prezentate mai sus, a fost realizată după următoarele tehnici convenționale de donare (a se 7 vedea, spre exemplu, Molecular Clonlng, A Laboratory Manual; J. Sambrook et al., 1987, Cold Spring Harbor Press, și Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., 9 eds., 1987, John Wiley and Sons). Toate plasmidele au fost propagate și păstrate în E. coli XLI blue (Stratagene, Catalog # 200236). Preparate plasmidiale pe scară largă au fost 11 obținute cu ajutorul sistemului Promega Wizard Maxiprep DNA Purification System ®, în conformitate cu indicațiile producătorului. 13

Exemplul 2. Construirea unei linii celulare CHO marcate.

1. Cultură celulară și procedee de transfecție pentru producerea liniei celulare CHO 15 marcate.

ADN-ul plasmidei marker a fost liniarizat prin digestie peste noapte, la 37°C, cu 17 Bst11071. Vectorul liniarizat a fost precipitat cu etanol și resuspendat în TE steril până la o concentrație de 1 mg/ml. Vectorul liniarizat a fost introdus în celule ovariene de hamster 19 chinez, producătoare de DHFR (celule CHO)-celule DG44(Urlaubetal., Som. CellandMol. Gen., 12: 555 - 566 (1986)), prin electroporare, după cum urmează. 21

Celulele din faza de creștere exponențială au fost recoltate prin centrifugare, spălate o dată în SBS (sucrose buffered solution - soluție tampon de sucroză: sucroză 272 mM; 23 fosfat de sodiu 7 mM; pH=7,4; clorură de magneziu 1 mM), răcite pe gheață, apoi resuspendate în SBS până la o concentrație de 10⁷ celule/ml. După o incubare de 15 min, pe gheață, 25 0,4 ml din suspensia celulară au fost amestecați cu 40 pg de ADN liniarizat, într-o cuvă pentru electroporare. Celulele au fost agitate cu ajutorul unui aparat BTX (Electrocell 27 manipulator set, San Diego, CA), la 230 volți, capacitate 400 microfaraday, rezistență 13 ohmi. Celulele agitate au fost amestecate apoi cu 20 ml de mediu de creștere pentru celulele 29

CHO, preîncălzit (CHO-S-SFMII, Gibco / BRL, Catalog # 31033-012) și plasate în plăci de microtitrare cu 96 de godeuri. La 48 h după electroporare, plăcile au fost alimentate cu mediu 31 de selecție (în cazul transfecției cu Desmond, mediul de selecție este CHO-S-SFMII fără hipoxantină sau timidină, suplimentat cu Histidinol 2 mM (catalog Sigma # H6647)). Plăcile 33 au fost menținute în mediul de selecție până la 30 de zile sau până când, în câteva godeuri, s-a observat creșterea celulară. Aceste celule au fost îndepărtate apoi din cele 96 de godeuri 35 și extinse, pentru ultima oară, în baloane rotitoare de 120 ml, unde au fost păstrate în mediul de selecție un timp nedefinit. 37

Exemplul 3. Caracterizarea liniilor celulare CHO marcate.

(a) Analiza de transfer Southern. 39

S-a izolat ADN-ul genomic din toate celulele CHO marcate cu plasmida Desmond, având o creștere stabilă. ADN-ul a fost izolat, utilizând kit-ul de ADN Invitrogen Easy ®, în 41 conformitate cu instrucțiunile producătorulului. ADN-ul genomic a fost, apoi, digerat cu Hindlll peste noapte, la 37°C și supus analizei de transfer Southern, utilizând o sondă marcată cu 43 digoxygenină, generată prin tehnica PCR, sondă specifică genei pentru DHFR. Hibridizările și spălările au fost efectuate cu ajutorul Boehringer Mannheim's DIG easy hyb (catalog # 45

1603 558) și DIG Wash și Block Buffer Set (Catalog # 1585 762), în conformitate cu specificațiile producătorului. Probele de ADN conținând o singură bandă care hibridizează cu sonda 47 DHFR, au fost considerate ca fiind clone Desmond, ce apar dintr-o singură celulă care a

RO 120148 Β1 integrat o singură copie a plasmidei. Aceste clone au fost reținute pentru analiza ulterioară, în afara unui total de 45 de linii celulare rezistente la HisD, izolate, doar 5 au fost integrante ale unei singure copii. Fig. 4 prezintă un Southern blot, conținând toate cele 5 clone Desmond de unică copiere. Numele clonelor sunt date în legenda figurii.

(b) Analiza Northern.

RNA-ul total a fost izolat din toate clonele Desmond cu o singură copie de genă per celulă, utilizând reactivul TRIzol (Gibco/BRL Catalog # 15596 - 026), în conformitate cu specificațiile producătorului. 10...20 pg RNA din fiecare clonă au fost analizați pe geluri duplicat formaldehidă. Petele (blot-urile) rezultate au fost analizate cu sonde de ADN marcate cu digoxygenină, generate prin tehnica PCR, spre (i) mesajul DHFR; (ii) mesajul HisD și (iii) mesajul CAD. CAD este o proteină trifuncțională implicată în biosinteza uridinei (Wahl et al., J. Biol. Chem., 254,17: 8679 -8689 (1979)), care este exprimată la fel în toate tipurile de celule. Ea este utilizată aici drept martor intern, pentru a ajuta încărcarea RNA-ului cantitativ. Hibridizările și spălările au fost efectuate cu ajutorul reactivilor Boehringer Mannheim menționați mai sus. Rezultatele analizei Northern sunt prezentate în fig. 5. Clona Desmond cu o singură copie de genă per celulă, care dezvoltă cele mai ridicate niveluri atât din mesajul His D, cât și din mesajul DHFR, este clona 15C9, prezentată în traseul 4 din ambele panouri ale figurii. Această clonă a fost desemnată ca linia celulară marcată și a fost utilizată în experimentele viitoare de țintire în CHC - exemple ale acesteia fiind prezentate în următoarele secțiuni.

Exemplul 4. Exprimarea anticorpului anti-CD20, în celule CHO marcate cuplasmida Desmond.

C2B8, un anticorp himeră care recunoaște antigenul CD20 de suprafață al celulei B, a fost clonat și exprimat anterior, în laboratorul nostru. (Reff et al., Blood; 83: 434 - 445 (1994)). Un fragment de ADN de 4,1 kb, conținând genele pentru catena grea și cea ușoară a anticorpului C2B8, împreună cu elementele reglatoare necesare (promotorul eucariot și semnalele de poliadenilare), au fost inserate în intronul artificial creat între exonii 1 și 2 ai genei neo, conținut într-un vector de donare derivat din pBR. Acest fragment de ADN de 5 kb, nou generat (conținând exonul 1 neo, C2B8 și exonul 2 neo), a fost excizat și utilizat pentru asamblarea plasmidei Molly de țintire. Celelalte elemente ADN utilizate în construcția plasmidei Molly sunt identice celor utilizate pentru construcția plasmidei de marcare Desmond, identificate anterior. O hartă completă a plasmidei Molly este prezentată în fig. 2.

Vectorul de țintire Molly a fost liniarizat înaintea transfecției prin digestie cu Kpn1 și Raci, precipitat cu etanol și resuspendat în TE steril, până la o concentrație de 1,5 mg/ml. Plasmida liniarizată a fost introdusă în celule marcate cu Desmond aflate în faza exponențială de creștere, în esență, așa după cum s-a descris, cu excepția faptului că 80 pg de ADN s-au utilizat în fiecare electroporare. La 48 h postelectroporare, plăcile cu 96 de godeuri au fost suplimentate cu mediu de selecție - CHO - SSFMII suplimentat cu 400 pg/ml de Geneticin (G418, Catalog Gibco / BRL #10131 - 019). Plăcile au fost menținute în mediul de selecție timp de până la 30 de zile sau până când a început creșterea celulelor în câteva godeuri. S-a presupus că o asemenea creștere ar fi rezultatul expansiunii clonale a unei singure celule rezistente G418. Supernatantele din toate godeurile rezistente G418 au fost analizate din punct de vedere al producerii de C2B8, prin tehnicile standard ELISA, iar toate clonele productive au fost, eventual, extinse în baloane rotitoare de 120 ml și apoi, analizate.

Caracterizarea celulelor țintite secretoare de anticorpi.

în acest experiment, au fost efectuate 50 de electroporări cu plasmida de țintire Molly, fiecare fiind plasată într-o altă placă cu 96 de godeuri. S-a obținut un total de 10 clone secretoare de anticorp anti-CD20, viabile, care au fost extinse în baloane rotitoare de 120 ml, S-a

RO 120148 Β1 izolat ADN-ul genomic din toate clonele, iar ulterior, au fost efectuate analize Southern pen- 1 tru a determina dacă clonele au reprezentat o singură recombinare omoloagă sau dacă în aceleași celule, au avut loc și integrări întâmplătoare. Metodele pentru izolarea și hibridizarea 3 Southern au fost ca cele descrise în secțiunea anterioară. ADN-ul genomic a fost digerat cu EcoRI și sondat cu o sondă marcată cu digoxygenină, sondă generată prin tehnica PCR, 5 spre un segment al regiunii constante a catenei grele a CD20. Rezultatele acestei analize Southern sunt prezentate în fig. 6. Așa cum se poate vedea din figură, 8 din cele 10 clone 7 prezintă o singură bandă care hibridizează cu sonda CD20, indicând faptul că în aceste celule a avut loc o singură recombinare omoloagă. Două din cele 10, anume, clonele 24G2 9 și 28C9, dovedesc prezența unei (unor) benzi suplimentare - indicator al unei integrări întâmplătoare, suplimentare, în altă parte a genomului.11

Noi am examinat nivelurile de exprimare (producere) a anticorpului anti-CD20, în toate cele 10 clone, datele fiind prezentate în tabelul 1, de mai jos.13

Nivelurile de exprimare (producere) sunt raportate ca picograme per celulă per zi (pg/ c/zi), secretate de clonele individuale, și reprezintă nivelurile medii obținute din 3 determinări 15 ELISA separate, pe probe luate din baloanele rotitoare de 120 ml.

Tabelul 117

Nivelul de exprimare a integranților omologi secretori de anti-CD2019

Clona Anti-CD20 (pg Zc/zi)

F4 3,521

E12,4

F9 1,823

39G111,5

C7 1,325

50G100,9

F9 0,827

F90,3

C9* 4,529

G2*2,1 * Aceste clone au conținut suplimentar, copii integrate întâmplător ale anti-CD20. Nivelurile de exprimare31 ale acestor clone reflectă, de aceea, o contribuție de la ambele situsuri: omolog și întâmplător.

După cum se poate observa din aceste date, există o variație în secreția de anticorp, de aproximativ 10 ori între clonele superioare și cele inferioare (din punct de vedere al 35 exprimării). Acest lucru a fost oarecum neprevăzut, deoarece noi am anticipat niveluri similare de exprimare (producție) de la toate clonele, datorită faptului că genele pentru anti- 37 CD20 sunt, toate, integrate în același situs marcat cu Desmond. Cu toate acestea, această gamă observată în exprimare a fost extrem de mică în comparație cu cea semnalată prin 39 utilizarea oricărei metode tradiționale de integrare întâmplătoare sau cu sistemul nostru tradițional de vector alterat. 41

Clona 20 F4, integrantul unic de copiere cel mai productiv, a fost selecționată pentru studiere ulterioară. Tabelul 2 (de mai jos) prezintă datele referitoare la analiza ELISA și a 43 culturii de celule de la cicluri de producție de 7 zile ale acestei clone.

RO 120148 Β1

Tabelul 2

Datele unui ciclu de producție de 7 zile pentru dona 20 F4

Ziua	% viabilitate	viabile/ml (x105)	T x 2 (h)	mg/l	pg/c/zi
1	96	3,4	31	1,3	4,9
2	94	6	29	2,5	3,4
3	94	9,9	33	4,7	3,2
4	90	17,4	30	6.8	3
5	73	14		8,3
6	17	3,5		9,5

Clona 20 F4 a fost însămânțată din diluția 2x10⁵ ml, într-un balon rotativ de 120 ml, în ziua 0. în următoarele 6 zile, s-a făcut numărarea celulelor, dublând timpul calculat și au fost prelevate probe de câte 1 ml de supernatant din balon, care au fost analizate în ceea ce privește secreția de anti-CD20, prin tehnica ELISA.

Pe baza acestor date oferite de tehnica ELISA, această clonă secretă, în medie, 3...5 pg anticorp/celulă/zi. Acesta este același nivel ca și cel obținut de la alte clone de unică copiere, înalt productive, obținute anterior în laboratorul nostru, utilizând vectorii de integrare întâmplătoare, alterați translațional, elaborați anterior. Acest rezultat indică următoarele:

(1) că situsul din genomul CHO, marcat cu vectorul de marcare Desmond, este foarte activ transcripțional și, de aceea, reprezintă un situs excelent, de la care să exprime proteine recombinante, și (2) că țintirea prin mijloacele recombinării omoloage poate fi realizată, utilizând vectorii expuși și are loc cu o frecvență suficient de ridicată, pentru a face din acest sistem o alternativă viabilă și dezirabilă, la metodele de integrare întâmplătoare.

Pentru a demonstra suplimentar eficacitatea acestui sistem, noi am demonstrat, de asemenea, că acest situs este amplificabil, fapt care are ca rezultat chiar niveluri superioare ale exprimării genei și ale secreției proteice. Amplificarea a fost realizată prin plasarea de diluții seriale din celulele 20 F4, plecând de la o densitate de 2,5 x 10⁴ celule/ml, în plăci pentru cultivarea de țesuturi, cu 96 de godeuri, și cultivarea acestor celule în mediu (CHO - SSFMII) suplimentat cu 5; 10; 15 sau 20 nM methotrexat. Clonele secretoare de anticorp au fost supuse screeningului, cu ajutorul tehnicilor standard ELISA, iar clonele cele mai productive au fost extinse și, ulterior, analizate. Un rezumat al acestui experiment de amplificare este prezentat în tabelul 3, de mai jos.

Tabelul 3

Rezumatul amplificării donei 20 F4

nM MTX	Nr. godeuri analizate	Nivelul de exprimare (mg /1) din 96 godeuri)	Nr. godeuri diluate	Nivelul de exprimare (pg/c/zi) din balonul agitat
10	56	3...13	4	10...15
15	27	2...14	3	15...18
20	17	4...11	1	ND

RO 120148 Β1

Amplificarea cu methotrexat, a lui 20 F4, a fost prezentată ca fiind descrisă în prezen- 1 tul text, prin utilizarea concentrațiilor de methotrexat, indicate în tabelul de mai sus. Supernatanții din toate coloniile supraviețuitoare, din cele 96 de godeuri, au fost analizați prin 3 tehnica ELISA, iar domeniul de anti - CD20 exprimat (produs) de către aceste clone este indicat în coloana 3. Pe baza acestor rezultate, clonele cele mai productive au fost extinse 5 în baloane rotative de 120 ml și au fost efectuate câteva teste ELISA pe supernatanții din baloane, pentru a determina nivelurile de exprimare (pg/celulă/zi) semnalate în coloana 5. 7

Datele de aici demonstrează clar că acest situs poate fi amplificat în prezența methotrexatului. S-a constatat că clonele din amplificările cu 10 și cu 15 nM au producții de ordinul 9 a 15...20 pg/celulă/zi.

Tabelul 4

Rezumatul amplificării clonei 20 F4-15 A5 13

nM MTX	Nr. godeuri analizate	Nivelul de exprimare (mg/1) în 96 de godeuri	Nr. godeuri extinse	Nivelul de exprimare (pg/celulă/zi), în balonul rotativ
200	67	23...70	1	50...60
250	86	21...70	4	55...60
300	81	15...75	3	40...50

Amplificările cu methotrexat, ale clonei 20 F4 -15 A5, au fost realizate și analizate, așa cum s-a descris în text. Godeurile cele mai productive, al căror număr este indicat în 23 coloana 4, au fost extinse în baloane de 120 ml, cu agitare. Nivelurile de exprimare a liniilor celulare, derivate din aceste godeuri, au fost înregistrate ca pg/celulă/zi, în coloana 5. 25

O clonă de la 15 nM, denumită 20 F4 -15 A5, a fost selectată ca fiind linia celulară cu cea mai ridicată exprimare. Această clonă provine dintr-o placă cu 96 de godeuri, în care 27 doar 22 de godeuri au crescut și, de aceea, s-a presupus că s-a format dintr-o singură celulă.

O clonă 15 nM, denumită 20 F4 -15 A5, a fost selectată ca linia celulară cu cea mai mare 29 exprimare. Această clonă a provenit dintr-o placă cu 96 de godeuri, din care doar în 22 godeuri s-a înregistrat creștere, și, de aceea, s-a presupus că s-a dezvoltat dintr-o singură 31 celulă. Clona a fost supusă apoi, încă unei runde de amplificare cu methotrexat. Așa cum s-a descris mai sus, diluții seriale ale culturii au fost plasate în plăci cu 96 de godeuri și 33 cultivate în mediu CHO - SS - FMII suplimentat cu 200, 300 sau 400 nM de methotrexat.

Clonele supraviețuitoare au fost supuse screeningului, prin tehnica ELISA, iar câteva clone 35 înalt productive au fost extinse la culturi agitate și, ulterior, analizate. Un rezumat al acestui al doilea experiment de amplificare este prezentat în tabelul 4. 37

Clona cea mai productivă a provenit din amplificarea cu 250 nM methotrexat. Clona

250 nM: 20 F4 -15 A5 - 250 A6 a provenit dintr-o placă cu 96 de godeuri, în care doar go- 39 deuri au crescut și, de aceea, s-a presupus că s-a dezvoltat dintr-o singură celulă. Luate împreună, datele din tabelele 3 și 4 indică cu certitudine că 2 runde de amplificare cu metho- 41 trexat sunt suficiente pentru atingerea nivelurilor de exprimare de 60 pg/celulă/zi - producție care reprezintă realizarea capacității maxime secretoare de imunoglobuline, în celulele 43 mamifere (Reff, Μ. E., Curr. Opin. Biotech., 4: 573 - 576 (1993)). Abilitatea de atingere a acestei capacități secretoare, cu doar două etape de amplificare, sporește, în plus, utilitatea 45 acestui sistem de recombinare omoloagă. în mod tipic, metodele de integrare întâmplătoare

RO 120148 Β1 necesită mai mult de două etape de amplificare, pentru atingerea acestui nivel de exprimare și sunt, în general, mai puțin sigure, în termenii ușurinței amplificării. Astfel, sistemul omolog oferă o metodă mai eficientă și mai rapidă de realizare a unui nivel ridicat de exprimare genetică, în celulele mamifere.

Exemplul 5. Exprimarea (producerea) anticorpului CD23 antiuman, în celule CHO marcate cu plasmida Desmond.

CD23 este un receptor pentru IgE, cu afinitate redusă, care mediază legarea IgE de limfocitele B și T (Sutton, B. J., and Gould, H. J., Nature, 366; 421 - 428 (1993)). Anticorpul 5E8 monoclonal CD23 antiuman este un anticorp monoclonal gamma-1 uman, recent donat și exprimat în laboratorul nostru. Acest anticorp este prezentat în Serial No. 08/803.085, înregistrat în 20 februarie, 1997.

Genele pentru catena grea și cea ușoară ale lui 5E8 au fost donate în vectorul mamifer de exprimare N5KG1 - un derivat al vectorului NEOSPLA (Barnett etal., în Antibody Expression and Engineerinng, Η. Y. Yang and T. Imanaka, eds., pp. 27 - 40 (1995)) și apoi au fost făcute două modificări genelor. Recent, noi am observat o secreție oarecum mai mare de imunoglobulină - cafenele ușoare, comparativ cu catenele grele în alți construcți de exprimare din laborator (Reff et al., 1997, observații nepublicate). într-o încercare de a compensa acest deficit, noi am alterat gena pentru catena grea a 5E8, prin adăugarea unui element mai puternic promotor/amplificator, imediat în aval de situsul de start. în etapele ulterioare, un fragment de ADN de 2,9 kb conținând genele pentru catenele ușoară și grea, modificate, ale 5E8, a fost izolat din vectorul N5KG1 și inserat în vectorul de țintire Mandy. în esență, prepararea plasmidei Molly conținând 5E8 și electroporarea în celule CHO 15C9 Desmond s-au realizat așa cum s-a descris în secțiunea precedentă.

O modificare în protocolul descris anterior a fost făcută asupra tipului de mediu de cultură utilizat. Celulele CHO, marcate cu plasmida Desmond, au fost cultivate în mediu CD-CHO lipsit de proteine (Gibco-BRL, catalog Nr. AS 21206) suplimentat cu 3 mg/l insulină recombinantă (stoc 3 mg/ml, Gibco-BRL, catalog nr. AS22057) și 8 mM L-glutamină (200 mM stoc, Gibco-BRL, catalog nr. 25030 - 081). Ulterior, celulele transfectate au fost selectate în mediul de mai sus, suplimentat cu 400 pg/ml geneticină. în acest experiment, au fost efectuate 20 de electroporări și plasări în plăci cu 96 de godeuri pentru culturi de țesuturi. Celulele au crescut și au secretat anti-CD23, într-un total de 68 de godeuri, toate acestea presupunându-se a fi clone provenind de la o singură celulă G418.12 dintre aceste godeuri au fost trecute în baloane rotitoare de 120 ml, pentru analizarea ulterioară. Noi credem că numărul crescut de clone izolate în acest experiment (68 comparativ cu 10 pentru anti-CD20, așa cum s-a descris în exemplul 4) se datorează unei eficiențe sporite a donării și unei rate crecute a supraviețuirii celulelor crescute în mediu CD-CHO comparativ cu mediul CHO-SS-FMII. Nivelurile de exprimare, pentru acele clone analizate din cultura agitată, au fost cuprinse între 0,5 și 3 pg/celulă/zi, în strânsă concordanță cu nivelurile observate pentru clonele anti - CD20. Clona cu cea mai mare producție de anti-CD 23, desemnată 4 H12, a fost supusă amplificării cu methotrexat, în scopul creșterii nivelurilor sale de exprimare Această amplificare a fost pusă la punct într-o manieră similară celei descrise pentru clona anti - CD20 din exemplul 4. Diluțiile seriale ale celulelor 4 H12 cu creștere exponențială au fost plasate în plăci pentru culturi de țesuturi cu 96 de godeuri și crescute în mediu CD-CHO suplimentat cu 3 mg/l insulină, 8 mM glutamină și 30,35 sau 40 nM methotrexat. Un rezumat al acestui experiment de amplificare este prezentat în tabelul 5.

RO 120148 Β1

Tabelul 5 1

Rezumatul amplificării clonei 2 H12

nM MTX	Nr. godeuri analizate	Nivelul de exprimare (mg/ml) în 96 de godeuri	Nr. godeuri extinse	Nivelul de exprimare (pg/celulă/zi) din balonul rotitor
30	100	6...24	8	10...25
35	64	4...27	2	10...15
40	96	4...20	1	ND

Clona cu cel mai mare nivel de exprimare obținută a fost o clona 30 nM, izolată dintr-o placă pe care celulele au crescut în 22 de godeuri. Această clonă, desemnată 4 H12 9

- 30 G5, a secretat în mod reproductibil 18. .22 pg anticorp/celulă/zi. Aceasta este aceeași gamă de exprimare observată pentru prima amplificare a clonei 20 F4 producătoare de 11 anticorp anti-CD20 (clona 20 F4 -15 A5, care a produs 15...18 pg/celulă/zi, așa cum s-a descris în exemplul 4). Aceste date servesc pentru susținerea suplimentară a observației că 13 amplificarea la acest situs marcat din OHO este reproductibilă și eficientă. în mod curent, se efectuează și o a doua amplificare a acestei linii celulare 30 nM. S-a anticipat că nivelurile 15 de saturație a exprimării ar fi atinse pentru anticorpul anti-CD23, doar în 2 etape de amplificare, așa cum a fost cazul pentru anti-CD 20. 17

Exemplul 6. Exprimarea imunoadezinei, în celule CHO marcate cu plasmida Desmond. 19

CTLA - 4, un membru al superfamiliei Ig, se află pe suprafața limfocitelor T și se presupune că joacă un rol în activarea celulelor-T antigen-specifice (Dariavach et al., Eur. 21 J. Immunoi, 18: 1901 - 1905 (1988); și Linsley et al., J. Exp. Med., 174: 561 - 569 (1991)). în scopul studierii ulterioare a rolului precis al moleculei CTLA-4 în calea de activare, a fost 23 creată o proteină de fuziune, solubilă, conținând domeniul extracelular al CTLA-4 linkat de o formă trunchiată a regiunii constante a lgG1 umane (Linsley et al., (Jd.). Noi am exprimat 25 recent această proteină de fuziune dintre CTLA-4 și Ig, în vectorul de exprimare mamifer BLECH1, un derivat al plasmidei NEOSPLA (Barnett et al., în Antibody Expression and 27 Engineering, Η. Y. Yang and T. Imanaka, eds., pp. 27 - 40 (1995)). Un fragment de 800 pb care codifică CTLA-4 Ig, a fost izolat din acest vector și inserat între situsurile Sacii și Bg1 II 29 din plasmida Molly.

Prepararea CTLA-4 - 4lg - Molly și electroporarea în celulele CHO ale clonei 15C9 31

Desmond au fost realizate așa cum s-a descris în exemplul anterior referitor la anti-CD20. S-au efectuat 20 de electroporări și s-au plasat în plăci de cultură cu 96 de godeuri, așa cum 33 s-a descris anterior. 18 godeuri care au exprimat CTLA-4, au fost izolate din plăcile cu 96 de godeuri și trecute, în continuare, în baloane rotitoare de 120 ml. Mai departe, au fost 35 efectuate analize de transfer Southern asupra ADN-ului genomic izolat din fiecare dintre aceste clone, pentru a determina dacă multe dintre clonele omoloage conțin, în plus, și 37 integranti întâmplători. ADN-ul genomic a fost digerat cu Bg1 II și sondat cu o sondă marcată cu digoxigenină, generată prin tehnica PCR, spre regiunea constantă a IgG 1 umane. Rezul- 39 țațele acestei analize au indicat că 85% din clonele CTLA-4 sunt doar integranti omologi; restulde 15% au conținut și un integrant întâmplător. Acest rezultat coroborează constatările 41 obținute în exprimarea lui anti-CD20 discutată mai sus, unde 80% dintre clone au fost integranti omologi unici. De aceea, putem concluziona că acest sistem de exprimare produce 43 în mod reproductibil integranți omologi unic țintiți, în cel puțin 80% din toate clonele produse.

RO 120148 Β1

Nivelurile de exprimare pentru clonele CTLA4 - Ig omoloage au fost cuprinse între 8 și 12 pg/celulă/zi. Acestea au fost mai mari decât gama raportată pentru clonele anticorpilor anti-CD20 și anti-CD23, discutată mai sus. Cu toate acestea, noi am observat anterior că exprimarea acestei molecule, prin utilizarea sistemului vectorului de inserție intronic, avusese ca rezultat, de asemenea, niveluri de exprimare superioare celor obținute pentru imunoglobuline. în mod obișnuit, noi nu suntem capabili să furnizăm o explicație pentru această observație.

Exemplul 7. Țintirea genei pentru anti-CD20, într-o linie celulară CHO marcată cu un înlocuitor al plasmidei Desmond.

După cum am descris într-o secțiune precedentă, noi am obținut 5 linii celulare CHO marcate cu o singură copie a plasmidei Desmond (a se vedea fig. 4 și 5). în scopul demonstrării faptului că succesul strategiei noastre de țintire nu este datorat vreunei proprietăți unice a clonei 15 C9 Desmond și limitat doar la această clonă, noi am introdus anti-CD20 Molly în clona 9B2 Desmond (linia 6 din fig. 4, linia 1 din fig. 5). Prepararea ADN-ului Molly și electroporarea în Desmond 9B2 au fost exact așa cum s-a descris în exemplul anterior referitor la anti-CD20. Noi am obținut un integrant omolog, din acest experiment. Această clonă a fost trecută într-un balon rotitor de 120 ml, unde a produs, în medie, 1,2 pg anti-CD20/celulă/zi. Aceasta este o exprimare considerabil inferioară celei observate cu Molly țintită în Desmond 15C9. Cu toate acestea, acesta a fost rezultatul anticipat, bazat pe analiza noastră Northern, a clonelor Desmond. După cum se poate vedea în fig. 5, nivelurile de mRNA, din clona 9B2, sunt considerabil mai mici decât cele din clona 15C9, indicând faptul că situsul din această clonă nu este la fel de activ transcripțional ca cel din clona 15C9. De aceea, acest experiment nu demonstrează doar reproductibilitatea sistemului - se presupune că orice situs Desmond marcat poate fi țintit cu Molly - confirmă, de asemenea, datele analizei Northern, cum că situsul din 15 C9 Desmond este cel mai activ din punct de vedere transcripțional.

Din datele anterioare, se poate aprecia că, deși formele specifice ale prezentei invenții au fost descrise aici în scopul ilustrării, pot fi făcute diverse modificări, fără abaterea de la scopul invenției. în consecință, invenția nu este limitată de revendicările anexate.

Claims (67)

1. Revendicări

   1. Sistem vector pentru inserția unui fragment ADN dorit, într-un situs țintă din genomul unei celule de mamifer, caracterizat prin aceea că sistemul vector conține cel puțin următoarele:

   (i) o plasmidă marker, care cuprinde următoarele secvențe:

   (a) un prim fragment ADN, care cuprinde o regiune ADN care este heteroloagă cu genomul celulei de mamifer, și care, atunci când este integrat în genomul celulei de mamifer, furnizează un situs unic, pentru recombinare omoloagă;

   (b) un al doilea fragment ADN, care cuprinde cel puțin un exon al unei gene care codifică o primă proteină marker selectabil; și (c) un al treilea fragment ADN, care cuprinde o regiune care codifică o a doua proteină marker selectabil, care este diferită de prima proteină marker selectabil și furnizează selecția unei celule de mamifer, care are respectiva plasmida marker integrată în genom; și (ii) o plasmida țintă, care cuprinde cel puțin un fragment ADN ce trebuie inserat în genomul respectivei celule, și cuprinde, în mod suplimentar, următoarele secvențe:

   (a) un al patrulea fragment ADN, care cuprinde o regiune care este identică sau prezintă o omologie suficientă cu situsul unic pentru recombinare omoloagă din plasmida marker, astfel încât acea regiune de ADN să poată să se recombine cu respectivul ADN din plasmida marker, prin recombinare omoloagă;

   RO 120148 Β1 (b) un al cincilea fragment ADN, care cuprinde exonul sau exonii rămași din gena 1 care codifică prima proteină marker selectabil, care nu sunt prezenți în plasmida marker;

   în care cel puțin un exon al unei gene, care codifică o primă proteină marker selec- 3 tabil din plasmida marker, și exonul sau exonii rămași, din gena care codifică o primă proteină marker selectabil din plasmida țintă, codifică împreună o primă proteină marker selectabil 5 activă.
2. 2. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, cel puțin un 7 ADN de inserat în genomul respectivei celule codifică o proteină dorită.
3. 3. Sistem vector, conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că proteina dorită 9 este o proteină de mamifer.
4. 4. Sistem vector, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că proteina de ma- 11 mifer este o imunoglobulină.
5. 5. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, cel puțin un 13 ADN de inserat în genomul respectivei celule este inserat adiacent unui exon al respectivului prim marker selectabil, care este conținut în plasmida țintă. 15
6. 6. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că prima proteină marker selectabil este aleasă dintr-un grup, care constă din: neomicin fosfotransferază, 17 histidinol dehidrogenaza, dihidrofolat reductaza, higromicin fosfotransferază, timidin kinaza din virusul herpes simplex, adenozin deaminaza, glutamin sintetaza și hipoxantin-guanin 19 fosforibozil transferaza.
7. 7. Sistem vector, conform revendicării 6, caracterizat prin aceea că, cel puțin un 21 exon al genei care codifică prima proteină marker selectabil din plasmida marker, conține o porțiune a unei gene de neomicin fosfotransferază și exonii rămași din plasmida țintă conțin 23 porțiunile rămase din respectiva genă de neomicin fosfotransferază.
8. 8. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că a doua proteină 25 marker selectabil, care este diferită de prima proteină marker selectabil, este aleasă dintr-un grup, care constă din: neomicin fosfotransferază, histidinol dehidrogenaza, dihidrofolat re- 27 ductaza, higromicin fosfotransferază, timidin kinaza din virusul herpes simplex, adenozin deaminaza, glutamin sintetaza și hipoxantin-guanin fosforibozil transferaza. 29
9. 9. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că plasmida marker sau plasmida țintă cuprinde, în mod suplimentar, un fragment ADN care codifică o a treia 31 proteină marker selectabil, dominantă, care este diferită de prima și a doua proteină marker selectabil. 33
10. 10. Sistem vector, conform revendicării 9, caracterizat prin aceea că expresia fragmentului ADN, care codifică a treia proteină marker selectabil, permite amplificarea respec- 35 tivului fragment ADN, ce trebuie inserat în genomul respectivei celule.
11. 11. Sistem vector, conform revendicării 10, caracterizat prin aceea că a treia protei- 37 nă marker selectabil este dihidrofolat reductaza.
12. 12. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că asigură inserția 39 unui ADN dorit, într-un situs țintă din genomul unei celule de mamifer, aleasă dintr-un grup care constă din: celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), celule mielomatoase, celule 41 renale de pui de hamster, celule COS, celule NSO, celule HeLa și celule NIH3T3.
13. 13. Sistem vector, conform revendicării 12, caracterizat prin aceea că celula de 43 mamifer este o celulă CHO.
14. 14. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că plasmida mar- 45 ker mai conține, în plus, o secvență rară de endonuclează de restricție, care este inserată în regiunea ADN din primul fragment ADN al plasmidei marker, care asigură un situs unic, 47 pentru recombinare omoloagă.

    RO 120148 Β1
15. 15. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că regiunea ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic pentru recombinare omoloagă, este de cel puțin 300 de nucleotide.
16. 16. Sistem vector, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că regiunea ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, are o mărime cuprinsă între circa 300 nucleotide până la 20 kilobaze.
17. 17. Sistem vector, conform revendicării 16, caracterizat prin aceea că regiunea ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, are o mărime cuprinsă între 2 până la 10 kilobaze.
18. 18. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că ADN-ul care codifică prima proteină marker selectabil, este scindat în cel puțin 3 exoni.
19. 19. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că regiunea ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, este un ADN bacterian, un ADN de la insecte, un ADN viral sau un ADN sintetic.
20. 20. Sistem vector, conform revendicării 19, caracterizat prin aceea că regiunea ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, nu conține nici o genă funcțională.
21. 21. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că plasmida marker cuprinde secvența de nucleotide a plasmidei prezentate în fig. 7.
22. 22. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că plasmida țintă cuprinde secvența de nucleotide a plasmidei prezentate în fig. 8, și în care plasmida țintă este opțional lipsită de secvențele de nucleotide care codifică polipeptide de anticorp antiCD20.
23. 23. Sistem vector, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că plasmida țintă cuprinde secvența de nucleotide a plasmidei prezentate în fig. 10, și în care plasmida țintă este opțional lipsită de secvențele de nucleotide care codifică polipeptide de anticorp antiCD23.
24. 24. Procedeu de inserție a unui ADN dorit, într-un situs țintă din genomul unei celule de mamifer, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde următoarele etape:

    (i) transfecția sau transformarea unei celule de mamifer cu o plasmidă marker, care cuprinde următoarele secvențe:

    (a) un prim fragment ADN, care cuprinde o regiune care este heteroloagă cu genomul celulei de mamifer și care, atunci când este integrată în genomul celulei de mamifer, furnizează un situs unic, pentru recombinare omoloagă;

    (b) un al doilea fragment ADN, care cuprinde cel puțin un exon al unei gene care codifică o primă proteină marker selectabil; și (c) un al treilea fragment ADN, care cuprinde o regiune care codifică o a doua proteină marker selectabil, care este diferită de prima proteină marker selectabil și care asigură selecția unei celule de mamifer, care are respectiva plasmida marker integrată în genomul său; și (ii) selecția unei celule care conține plasmida marker integrată în genomul său, prin sortare în funcție de expresia unei proteine marker selectabil, codificată de al treilea fragment ADN;

    (iii) transfecția sau transformarea respectivei celule selectate, cu o plasmida țintă, care cuprinde cel puțin un ADN de inserat în genomul respectivei celule, și mai cuprinde, în plus, următoarele secvențe:

    RO 120148 Β1 (a) un al patrulea fragment ADN, care cuprinde o regiune care este identică sau pre- 1 zintă o omologie suficientă cu situsul unic, pentru recombinare omoloagă din plasmida marker, astfel încât această regiune de ADN să poată să se recombine cu respectivul ADN 3 din plasmida marker, prin recombinare omoloagă; și (b) un al cincilea fragment ADN, care cuprinde exonul sau exonii rămași din gena 5 care codifică prima proteină marker selectabil, care nu sunt prezenți în plasmida marker;

    în care o primă proteină marker selectabil, activă, este produsă, doar dacă cel puțin 7 un exon al unei gene care codifică o primă proteină marker selectabil din plasmida țintă, este exprimat împreună cu exonul sau exonii rămași din gena care codifică o primă proteină 9 marker selectabil, conținută în plasmida marker; și (iv) selecția celulelor care conțin plasmida țintă integrată în situsul unic, pentru 11 recombinare omoloagă, prin sortarea în funcție de expresia primei proteine marker selectabil.
25. 25. Procedeu conform revendicării 24, în care cel puțin un ADN de inserat în genomul 13 respectivei celule codifică o proteină dorită.
26. 26. Procedeu conform revendicării 25, în care proteina dorită este o proteină de 15 mamifer.
27. 27. Procedeu conform revendicării 26, în care proteina de mamifer este o imuno- 17 globulină.
28. 28. Procedeu conform revendicării 24, în care cel puțin un ADN de inserat în genomul 19 respectivei celule este inserat adiacent unui exon al respectivului prim marker selectabil, care este conținut în plasmida țintă. 21
29. 29. Procedeu conform revendicării 24, în care prima proteină marker selectabil este aleasă dintr-un grup, care constă din: neomicin fosfotransferaza, histidinol dehidrogenaza, 23 dihidrofolat reductaza, higromicin fosfotransferaza, timidin kinaza din virusul herpes simplex, adenozin deaminaza, glutamin sintetaza și hipoxantin-guanin fosforibozil transferaza. 25
30. 30. Procedeu conform revendicării 29, în care cel puțin un exon al genei care codifică prima proteină marker selectabil din plasmida marker, conține o porțiune a unei gene de neo- 27 micin fosfotransferază și exonii rămași din plasmida țintă conțin porțiunile rămase din respectiva genă de neomicin fosfotransferază. 29
31. 31. Procedeu conform revendicării 24, care mai cuprinde, în mod suplimentar, determinarea nivelurilor de ARN, pentru al doilea marker selectabil, conținut în al treilea fragment 31 ADN din plasmida marker, înaintea integrării în vectorul țintă.
32. 32. Procedeu conform revendicării 24, în care a doua proteină marker selectabil, care33 este diferită de respectiva prima proteină marker selectabil, este aleasă dintr-un grup, care constă din: neomicin fosfotransferază, histidinol dehidrogenaza, dihidrofolat reductaza, higro-35 micin fosfotransferază, timidin kinaza din virusul herpessimplex, adenozin deaminaza, glutamin sintetaza și hipoxantin-guanin fosforibozil transferaza.37
33. 33. Procedeu conform revendicării 24, în care plasmida marker sau plasmida țintă cuprinde, în mod suplimentar, un ADN care codifică o a treia proteină marker selectabil, care 39 este diferită de prima și a doua proteină marker selectabil.
34. 34. Procedeu conform revendicării 33, în care expresia ADN-ului care codifică a treia41 proteină marker selectabil, permite amplificarea respectivului ADN de inserat în genomul respectivei celule.43
35. 35. Procedeu conform revendicării 34, în care a treia proteină marker selectabil este dihidrofolat reductaza.45
36. 36. Procedeu conform revendicării 24, în care celula de mamifer este aleasă dintr-un grup, care constă din: celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), celule mielomatoase, 47 celule renale de pui de hamster, celule COS, celule NSO, celule HeLa și celule NIH3T3.

    RO 120148 Β1
37. 37. Procedeu conform revendicării 36, în care celula este o celulă CHO.
38. 38. Procedeu conform revendicării 24, în care plasmida marker mai conține, în plus, o secvență rară de endonudează de restricție, care este inserată în regiunea ADN din primul fragment ADN al plasmidei marker, care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă.
39. 39. Procedeu conform revendicării 24, în care regiunea ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, este de cel puțin 300 de nucleotide.
40. 40. Procedeu conform revendicării 39, în care regiunea ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, are o mărime cuprinsă între circa 300 nucleotide până la 20 kilobaze.
41. 41. Procedeu conform revendicării 40, în care regiunea ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, are o mărime cuprinsă între 2 până la 10 kilobaze.
42. 42. Procedeu conform revendicării 24, în care ADN-ul care codifică prima proteină marker selectabil, este scindat în cel puțin 3 exoni.
43. 43. Procedeu conform revendicării 24, în care regiunea ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, este un ADN bacterian, un ADN de la insecte, un ADN viral sau un ADN sintetic.
44. 44. Procedeu conform revendicării 43, în care regiunea ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, nu conține nici o genă funcțională.
45. 45. Procedeu conform revendicării 24, în care plasmida marker cuprinde secvența de nucleotide a plasmidei prezentate în fig. 7.
46. 46. Procedeu conform revendicării 24, în care plasmida țintă cuprinde secvența de nucleotide a plasmidei prezentate în fig. 8, și în care plasmida țintă este opțional lipsită de secvențele de nucleotide care codifică polipeptide de anticorp anti-CD20.
47. 47. Procedeu conform revendicării 24, în care plasmida țintă cuprinde secvența de nucleotide a plasmidei prezentate în fig.10, și în care plasmida țintă este opțional lipsită de secvențele de nucleotide care codifică polipeptide de anticorp anti-CD23.
48. 48. Utilizarea sistemului vector, conform revendicării 1, pentru inserția unui ADN dorit, într-un situs țintă al genomului unei celule de mamifer.
49. 49. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 48, care este caracterizată prin aceea că, cel puțin un ADN de inserat în genomul respectivei celule codifică o proteină dorită.
50. 50. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 49, care este caracterizată prin aceea că proteina este o proteină de mamifer.
51. 51. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 50, care este caracterizată prin aceea că proteina de mamifer este o imunoglobulină.
52. 52. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 48, care este caracterizată prin aceea că, cel puțin un ADN de inserat în genomul respectivei celule este inserat adiacent unui exon al respectivului prim marker selectabil, care este conținut în plasmida țintă.
53. 53. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 48, care este caracterizată prin aceea că prima proteină marker selectabil este aleasă dintr-un grup, care constă din: neomicin fosfotransferaza, histidinol dehidrogenaza, dihidrofolat reductaza, higromicin fosfotransferaza, timidin kinaza din virusul herpes simplex, adenozin deaminaza, glutamin sintetaza și hipoxantin-guanin fosforibozil transferaza.

    RO 120148 Β1
54. 54. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 53, care este caracterizată 1 prin aceea că, cel puțin un exon al genei care codifică prima proteină marker selectabil din plasmida marker, conține o porțiune a unei gene de neomicin fosfotransferaza și exonii 3 rămași din plasmida țintă conțin porțiunile rămase din respectiva genă de neomicin fosfotransferaza. 5
55. 55. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 48, care este caracterizată prin aceea că a doua proteină marker selectabil care este diferită de respectiva primă pro- 7 teină marker selectabil, este aleasă dintr-un grup, care constă din: neomicin fosfotransferaza, histidinol debidrogenaza, dihidrofolat reductaza, higromicin fosfotransferaza, timidin kinaza 9 din virusul herpes simplex, adenozin deaminaza, glutamin sintetaza și hipoxantin-guanin fosforibozil transferaza. 11
56. 56. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 48, care este caracterizată prin aceea că plasmida marker sau plasmida țintă cuprinde, în mod suplimentar, un ADN 13 care codifică o a treia proteină marker selectabil, care este diferită de prima și a doua proteină marker selectabil. 15
57. 57. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 56, care este caracterizată prin aceea că expresia ADN-ului care codifică o a treia proteină marker selectabil, permite 17 amplificarea respectivului ADN de inserat în genomul respectivei celule.
58. 58. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 57, care este caracterizată 19 prin aceea că a treia proteină marker selectabil este dihidrofolat reductaza.
59. 59. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 48, care este caracterizată 21 prin aceea că asigură inserția unui ADN dorit, într-un situs țintă din genomul unei celule de mamifer, aleasă dintr-un grup care constă din: celule ovariene de hamster chinezesc (CHO),23 celule mielomatoase, celule renale de pui de hamster, celule COS, celule NSO, celule HeLa și celule NIH3T3.25
60. 60. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 59, care este caracterizată prin aceea că celula de mamifer este o celulă CHO.27
61. 61. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 48, care este caracterizată prin aceea că plasmida marker mai conține, în plus, o secvență rară de endonuclează de29 restricție, care este inserată în regiunea de ADN din primul fragment ADN al plasmidei marker, care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă.31
62. 62. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 48, care este caracterizată prin aceea că regiunea de ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru 33 recombinare omoloagă, este de cel puțin 300 de nucleotide.
63. 63. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 62, care este caracterizată 35 prin aceea că regiunea de ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, are o mărime cuprinsă între circa 300 nucleotide până la 20 kilo- 37 baze.
64. 64. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 63, care este caracterizată 39 prin aceea că regiunea ADN din primul fragment ADN care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, are o mărime cuprinsă între 2 până la 10 kilobaze. 41
65. 65. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 48, care este caracterizată prin aceea că ADN-ul care codifică prima proteină marker selectabil, este scindatîn cel puțin 43

    3 exoni.
66. 66. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 48, care este caracterizată 45 prin aceea că regiunea de ADN, din primul fragment ADN, care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, este un ADN bacterian, un ADN de la insecte, un ADN viral sau un 47 ADN sintetic.
67. 67. Utilizare a sistemului vector, conform revendicării 66, care este caracterizată 49 prin aceea că regiunea de ADN, din primul fragment ADN, care asigură un situs unic, pentru recombinare omoloagă, nu conține nici o genă funcțională. 51