CN117730102A - 异二聚体Fc结构域抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及异二聚体Fc结构域抗体以及与能够与包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的此类抗体特异性结合的抗原结合受体的组合。本发明还涉及用此种抗原结合受体转导的T细胞以及试剂盒，所述试剂盒包括转导的T细胞和包含此类异二聚体Fc结构域的肿瘤靶向抗体。

Description

异二聚体Fc结构域抗体
技术领域
本发明一般地涉及异二聚体Fc结构域抗体以及与能够与包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的此类抗体特异性结合的抗原结合受体的组合。本发明还涉及用此种抗原结合受体转导的T细胞以及试剂盒，所述试剂盒包括转导的T细胞和包含此类异二聚体Fc结构域的肿瘤靶向抗体。
背景技术
过继性T细胞疗法(ACT)是一种使用癌症特异性T细胞的强大治疗方法(Rosenberg和Restifo,Science 348(6230)(2015),62-68)。ACT可以使用天然存在的肿瘤特异性细胞或通过使用T细胞或嵌合抗原受体的基因工程使其具有特异性的T细胞(Rosenberg和Restifo,Science 348(6230)(2015),62-68)。ACT可以成功治疗和诱导缓解甚至患有晚期和其他治疗难治性疾病的患者，诸如急性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤或黑色素瘤(Dudley等人，J Clin Oncol 26(32)(2008),5233-5239；Grupp等人，N Engl J Med 368(16)(2013),1509-1518；Kochenderfer等人，J Clin Oncol.(2015)33(6):540-549,doi:10.1200/JCO.2014.56.2025.Epub 2014年8月25日)。
然而，尽管临床疗效令人印象深刻，但ACT受到治疗相关毒性的限制。ACT中使用的工程化T细胞的特异性以及由此产生的靶向和脱靶效应主要由抗原结合受体中实施的肿瘤靶向抗原结合部分驱动。由于不可耐受的治疗毒性，肿瘤抗原的非排他性表达或表达水平的时间差异可导致严重的副作用或者甚至是ACT的失败。
此外，用于有效裂解肿瘤细胞的肿瘤特异性T细胞的可用性取决于工程化T细胞在体内的长期存活和增殖能力。另一方面，由于不受控制的T细胞应答的持续存在会导致健康组织受损，所以T细胞的体内存活和增殖也可能导致不必要的长期影响(Grupp等人，2013NEngl J Med 368(16):1509-18，Maude等人2014 2014N Engl J Med 371(16):1507-17)。
限制严重的治疗相关毒性和提高ACT安全性的一种方法是通过在免疫突触中引入衔接子分子来限制T细胞的活化和增殖。此类衔接子分子包含小分子双模块开关，例如最近描述的叶酸-FITC开关(Kim等人，J Am Chem Soc 2015；137:2832-2835)。另一种方法包括人工修饰的抗体，所述抗体包含一个标签，用于指导和引导T细胞特异性靶向肿瘤细胞(Ma等人，PNAS 2016；113(4):E450-458，Cao等人Angew Chem 2016；128:1-6，Rogers等人PNAS2016；113(4):E459-468，Tamada等人Clin Cancer Res 2012；18(23):6436-6445)。
然而，现有的方法有几个局限性。依赖于分子开关的免疫突触需要引入额外的元件，这些元件可能会引发免疫应答或导致非特异性脱靶效应。此外，这种多组分***的复杂性可能会限制治疗效果和耐受性。另一方面，在现有治疗性单克隆抗体中引入标签结构可能会影响这些构建体的功效和安全性。此外，添加标签需要额外的修饰和纯化步骤，使此类抗体的生产更加复杂，并进一步需要额外的安全测试。
此外，本发明人早先已经描述了能够以减少的Fc受体结合与突变的结构域特异性结合的抗原结合受体(WO2018/177966)。
仍然需要改进的过继性T细胞疗法，该疗法具有提高癌症患者治疗的安全性和/或功效的潜力。
发明内容
本发明提供了抗体，其包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，并且其中所述第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)。根据本发明的抗体能够高效地募集抗P329G CAR-T细胞用于杀伤。此外，根据本发明的抗体能够高效地募集先天免疫细胞(诸如NK细胞或单核细胞)用于FcgR依赖性ADCC，而不需要非特异***叉活化。
同时募集先天免疫细胞与CAR-T细胞可能尤其有助于通过首先给予抗体并且仅在抗体已经诱导了ADCC介导的抗肿瘤功效和减瘤作用的稍后时间点输注CAR-T细胞来减少不良事件(例如细胞因子释放综合征)。此外，同时募集先天免疫细胞与CAR-T细胞可能尤其帮助通过活化肿瘤微环境中的抗原呈递细胞(诸如表达FcgR的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)来产生二次免疫应答。
因此，提供了一种抗体，其包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，并且其中所述第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)。
在一个方面，Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域。
在一个方面，Fc结构域是人Fc结构域。
在一个方面，所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。
在一个方面，抗体是去岩藻糖基化的。
在一个方面，与天然IgG1 Fc结构域相比，所述异二聚体Fc结构域表现出增加的与Fc受体的结合亲和力和/或增加的效应子功能，特别地，其中所述效应子功能为ADCC。
在一个方面，所述异二聚体Fc结构域包含一个或多个氨基酸突变，所述一个或多个氨基酸突变增加与Fc受体的结合和/或效应子功能，特别地，其中所述效应子功能为ADCC。
在一个方面，所述抗体包含至少一个能够与靶细胞上的抗原特异性结合的抗原结合部分。
在一个方面，靶细胞为癌细胞。
在一个方面，所述抗原选自由以下项组成的组：FAP、CEA、p95HER2、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、EpCAM、IGF-1R、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1(粘蛋白)、GD2、A33-抗原、PSMA、PSCA、转铁蛋白-受体、TNC(腱生蛋白)和CA-IX。
在一个方面，抗原结合部分为scFv、Fab、crossFab或scFab。
在一个方面，抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在一个方面，抗体为多特异性抗体。
进一步提供了编码本文所述的抗体的分离的多核苷酸。
进一步提供了包含本文所述的分离的多核苷酸的宿主细胞。
进一步提供了一种生产抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适合表达所述抗体的条件下培养本文所述的宿主细胞，以及任选地(b)回收所述抗体。
进一步提供了通过本文所述的方法生产的抗体。
进一步提供了一种药物组合物，其包含本文所述的抗体以及药用载体。
进一步提供了本文所述的抗体和转导的T细胞，其用于组合治疗癌症，其中转导的T细胞表达能够与第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
在一个方面，抗原结合受体能够与包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的Fc结构域亚基特异性结合。
在一个方面，抗原结合受体包含：重链可变结构域(VH)，其包含：
(a)RYWMN(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:2)或EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:40)的CDR H2氨基酸序列；
(c)PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)的CDR H3氨基酸序列；
以及轻链可变结构域(VL)，其包含：
(d)RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)GTNKRAP(SEQ ID NO:5)的CDR L2氨基酸序列；以及
(f)ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)的CDR L3氨基酸序列。
在一个方面，抗原结合受体包含
(i)跨膜结构域，其选自由以下项组成的组：CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10或DAP12跨膜结构域或其片段，特别是CD28跨膜结构域或其片段，
(ii)至少一个刺激信号传导结构域，其选自由以下项组成的组：CD3z、FCGR3A和NKG2D的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个刺激信号传导结构域为CD3z细胞内结构域或其片段，和/或
(iii)至少一个共刺激信号传导结构域，其单独地选自由以下项组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10和DAP12的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个共刺激信号传导结构域为CD28细胞内结构域或其片段。
在一个方面，在施用所述抗体之前、同时或之后施用所述转导的T细胞。
进一步提供了一种治疗个体的癌症或延迟其进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗体和转导的T细胞，其中所述抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，其中所述第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)，并且其中所述转导的T细胞表达能够与所述第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
在该方法的一个方面，抗原结合受体能够与包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的Fc结构域亚基特异性结合。
在该方法的一个方面，抗原结合受体包含：重链可变结构域(VH)，其包含：
(a)RYWMN(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:2)或EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:40)的CDR H2氨基酸序列；
(c)PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)的CDR H3氨基酸序列；
以及轻链可变结构域(VL)，其包含：
(d)RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)GTNKRAP(SEQ ID NO:5)的CDR L2氨基酸序列；以及
(f)ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)的CDR L3氨基酸序列。
在该方法的一个方面，抗原结合受体包含：
(i)跨膜结构域，其选自由以下项组成的组：CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10或DAP12跨膜结构域或其片段，特别是CD28跨膜结构域或其片段，
(ii)至少一个刺激信号传导结构域，其选自由以下项组成的组：CD3z、FCGR3A和NKG2D的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个刺激信号传导结构域为CD3z细胞内结构域或其片段，和/或
(iii)至少一个共刺激信号传导结构域，其单独地选自由以下项组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10和DAP12的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个共刺激信号传导结构域为CD28细胞内结构域或其片段。
在一个方面，在施用所述抗体之前、同时或之后施用所述转导的T细胞。
进一步提供了抗体在制造与转导的T细胞组合用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的异聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，其中所述第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)，并且其中所述转导的T细胞表达能够与所述第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
在该用途的一个方面，抗原结合受体能够与包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的Fc结构域亚基特异性结合。
在一个方面，抗原结合受体包含：重链可变结构域(VH)，其包含：
(a)RYWMN(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:2)或EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:40)的CDR H2氨基酸序列；
(c)PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)的CDR H3氨基酸序列；
以及轻链可变结构域(VL)，其包含：
(d)RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)GTNKRAP(SEQ ID NO:5)的CDR L2氨基酸序列；以及
(f)ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)的CDR L3氨基酸序列。
在该用途的一方面，抗原结合受体包含：
(i)跨膜结构域，其选自由以下项组成的组：CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10或DAP12跨膜结构域或其片段，特别是CD28跨膜结构域或其片段，
(ii)至少一个刺激信号传导结构域，其选自由以下项组成的组：CD3z、FCGR3A和NKG2D的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个刺激信号传导结构域为CD3z细胞内结构域或其片段，和/或
(iii)至少一个共刺激信号传导结构域，其单独地选自由以下项组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10和DAP12的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个共刺激信号传导结构域为CD28细胞内结构域或其片段。
在一个方面，在施用所述抗体之前、同时或之后施用所述转导的T细胞。
进一步提供了一种试剂盒，其包括：
(a)抗体，其包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，其中所述第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)；
(b)转导的T细胞，其能够表达与所述第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
进一步提供了一种试剂盒，其包括：
(a)抗体，其包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，其中所述第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)；
(b)分离的多核苷酸，其编码能够与所述第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
进一步提供了一种抗体，其包含实质上如前文参考实例中的任一者或参考附图中的任一者所述的异二聚体Fc结构域和抗原结合受体。
附图说明
图1：具有scFv形式的抗P329G结合部分的第二代嵌合抗原结合受体的示意图。在VH x VL scFv(图1A)取向和VL x VH(图1B)取向。图1C和图1D分别显示了编码图1A和图1B中描绘的抗原结合受体的DNA构建体。
图2：描绘了不同人源化scFv变体的CAR表面表达(图2A)和作为转导对照的相关GFP表达(图2B)
图3：使用不同人源化版本的P329G结合物作为结合部分的抗P329G CAR Jurkat报告T细胞的非特异性信号传导的评估。在存在具有不同Fc变体的抗体或具有P329G Fc变体但没有靶细胞的情况下，使用抗P329G CAR Jurkat-NFAT报告基因测定通过量化CD3下游信号传导的强度来评定活化。描绘的是来自三重复的技术平均值，误差条指示SD。
图4：在具有高(HeLa-FolR1)、中等(Skov3)和低(HT29)靶标表达水平的FolR1+靶细胞存在的情况下，结合对FolR1具有高(16D5)、中等(16D5 W96Y)或低(16D5 G49S/K53A)亲和力的抗体，使用不同人源化版本的P329G结合物的抗P329G CAR Jurkat报告T细胞的活化。使用抗P329G CAR Jurkat-NFAT报告基因测定通过量化CD3下游信号传导的强度来评定活化。描绘的是来自三重复的技术平均值，误差条指示SD。
图5：使用不同人源化版本的P329G结合物作为结合部分的抗P329G CAR JurkatNFAT报告T细胞的活化。在靶向IgG和HeLa(FolR1+)靶细胞的抗FolR1(16D5)P329G IgG1存在的情况下评估报告细胞的活性(图5A)。使用抗P329G CAR Jurkat-NFAT报告基因测定通过量化CD3下游信号传导的强度来评定抗体剂量依赖性活化，并计算曲线下面积(图5B)。描绘的是来自三重复的技术平均值，误差条指示SD。
图6：使用不同人源化版本的P329G结合物作为结合部分的抗P329G CAR JurkatNFAT报告T细胞的活化。在靶向IgG和HeLa(HER2+)靶细胞的抗HER2(帕妥珠单抗)P329GIgG1存在的情况下评估报告细胞的活性(图6A)。使用抗P329G CAR Jurkat-NFAT报告基因测定通过量化CD3下游信号传导的强度来评定抗体剂量依赖性活化，并计算曲线下面积(图6B)。描绘的是来自三重复的技术平均值，误差条指示SD。
图7：描绘了采用杵臼结构技术生成的异二聚体IgG。图7A：根据本发明的IgG型抗体。一条重链包含329位的脯氨酸(根据Kabat编号)，其是该位置处的野生型氨基酸。在另一条重链中存在P329G(根据Eu命名法编号)。已知这种突变会破坏FcγR相互作用。图7B：在另一个实施例中，抗体另外具有改变的糖基化模式。由于表达细胞系，Fc区中的天冬酰胺297存在非岩藻糖基化寡糖(去岩藻糖基化Fc)。这种糖工程化变体与对FcgRIII的结合亲和力增加密切相关。
图8：具有scFv形式的抗P329G结合部分的第二代嵌合抗原结合受体与异二聚体IgG中的P329G突变结合的示意图(图8A)。具有CD16细胞外部分的第二代嵌合抗原结合受体与异二聚体IgG中存在的非岩藻糖基化寡糖结合的示意图(图8B)。
图9：在存在WSUDLCL2 CD20+靶细胞和不同浓度的抗CD20异二聚体IgG1、抗CD20P329G LALA IgG1、抗CD20糖修饰的IgG1或抗CD20野生型IgG1的情况下，用作ADCC报告细胞系的CD16-CAR Jurkat报告T细胞(图9A)和抗P329G CAR Jurkat报告T细胞(图9B)的活化。使用CAR Jurkat-NFAT报告基因测定通过量化CD3下游信号传导的强度来评定活化。描绘的是来自三重复的技术平均值，误差条指示SD。
图10：描绘了在存在抗CD20异二聚体IgG1、抗CD20 P329G LALA IgG1或抗CD20糖修饰的IgG1的情况下通过CD16 CAR T细胞的WSUDLCL2靶细胞裂解。描绘的是技术两重复，误差条指示SD。
图11：描绘了证明在WSUDLCL2(CD20+)和PBMC的共培养物中抗CD20异二聚体IgG1、抗CD20 P329G LALA IgG1、抗CD20去岩藻糖基化IgG1和野生型IgG1诱导ADCC的能力的条形图。值是从技术三重复计算出的，并且误差条指示％SD。
图12：在存在抗CD20异二聚体IgG1、抗CD20 P329G LALA IgG、抗CD20去岩藻糖基化IgG1和野生型IgG1的情况下NK细胞的活化。NK细胞的活化通过CD107a的上调和CD16受体的下调来证明。描绘的是来自三重复的技术平均值，误差条指示SD。
图13：在用抗CD20异二聚体GA101、抗CD20 P329G LALA GA101、抗CD20去岩藻糖基化GA101或抗CD20野生型GA101(野生型Fc)治疗后的供体1(图13A)和供体2(图13B)的全血测定中IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6、IL-8和MCP-1的水平。将新鲜全血与浓度不断升高的不同抗CD20抗体一起孵育。在24h时，汇集来自技术两重复的血清并通过Luminex测量细胞因子的水平。
具体实施方式
定义
除非在下文中另外定义，否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与所述人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些方面，氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。在一些方面，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体：其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。下文描述用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性方法。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变引起抗体对抗原的亲和力的改善。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。
药剂(例如药物组合物)的“有效量”是指能够以必需的剂量在必需的时段内有效地实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢原子、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。在本文中，氨基酸可能用它们众所周知的三字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来表示。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、***和修饰。可以进行取代、缺失、***和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如减少的与Fc受体的结合，或增加的与另一肽的缔合。氨基酸序列缺失和***包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和***。特定的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如Fc区域的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。本文可使用各种名称来指示相同的氨基酸突变。例如，将Fc结构域的329位处的脯氨酸取代为甘氨酸可以表示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体(dAb)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136(2005)。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。具体地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指与抗原决定簇特异性结合的分子。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白及其衍生物，例如其片段，以及抗原结合受体及其衍生物。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个实施例中，抗原结合部分能够将其所附接的实体(例如，表达包含抗原结合部分的抗原结合受体的细胞)引导至靶位点，例如引导至带有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。抗原结合部分包括如本文进一步定义的抗体及其片段。特定的抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区(例如，scFv片段)。在某些实施例中，抗原结合部分可包含如本文进一步定义且在本领域中已知的抗体恒定区。可用的重链恒定区包括以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下两种同种型中的任一种：κ和λ。
在本发明的背景中，术语“抗原结合受体”涉及包含锚定跨膜结构域和包含至少一个抗原结合部分的细胞外结构域的抗原结合分子。抗原结合受体可以由不同来源的多肽部分制成。因此，它也可理解为“融合蛋白”和/或“嵌合蛋白”。通常，融合蛋白是通过两个或多个最初为单独蛋白编码的基因(或优选为cDNA)的结合而产生的蛋白。该融合基因(或融合cDNA)的翻译产生单个多肽，优选地具有源自每个原始蛋白的功能特性。重组融合蛋白通过重组DNA技术人工产生，用于生物学研究或治疗。下文描述了本发明的抗原结合受体的进一步细节。在本发明的背景中，CAR(嵌合抗原受体)理解为包含细胞外部分的抗原结合受体，该细胞外部分包含通过间隔序列与锚定跨膜结构域融合的抗原结合部分，该锚定跨膜结构域本身与细胞内信号传导结构域融合。
“抗原结合位点”是指提供与抗原的相互作用的抗原结合分子的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
术语“抗原结合结构域”是指抗体或抗原结合受体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个免疫球蛋白可变结构域(也称为可变区)提供。具体地，抗原结合结构域包含免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)和免疫球蛋白重链可变结构域(VH)。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中称为抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个特定实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。
根据本发明的“包含异二聚体Fc结构域的抗体”可以具有一个、两个、三个或更多个结合域并且可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。抗体可以是来自单一物种的全长抗体，也可以是嵌合的或人源化的。对于具有两个以上抗原结合结构域的抗体，一些结合结构域可以是相同的和/或具有相同的特异性。
如本文所用，术语“ATD”是指“锚定跨膜结构域”，其定义了能够整合在细胞的细胞膜中的一段多肽。ATM可以与细胞外和/或细胞内多肽结构域融合，其中这些细胞外和/或细胞内多肽结构域会被约束在细胞膜中。在本发明的抗原结合受体的背景下，ATM赋予本发明的抗原结合受体的膜附接和约束。本发明的抗原结合受体包含至少一个ATM和包含抗原结合部分的细胞外结构域。此外，ATM可以与细胞内信号传导结构域融合。
“特异性结合”意为结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，抗原结合部分与不相关蛋白质的结合程度小于该抗原结合部分与抗原的结合程度的约10％，如例如通过SPR所测得的。在某些实施例中，与抗原结合的抗原结合部分或包含该抗原结合部分的抗原结合分子的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
如本文所用，术语“CDR”涉及本领域众所周知的“互补决定区”。CDR是免疫球蛋白、或抗原结合受体的一部分，其确定所述分子的特异性并与特异性配体接触。CDR是分子中最易变的部分，有助于这些分子的抗原结合多样性。每个V结构域中都有三个CDR区CDR1、CDR2和CDR3。CDR-H描述可变重链的CDR区，而CDR-L涉及可变轻链的CDR区。VH表示可变重链，VL表示可变轻链。可如“Kabat”(Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版NIH Publication no.91-3242U.S.Department of Health and Human Services(1991)；Chothia J.Mol.Biol.196(1987),901-917)或“Chothia”(Nature 342(1989),877-883)中所述，确定源自Ig的区域的CDR区。
术语“CD3z”是指T细胞表面糖蛋白CD3ζ链，也称为“T细胞受体T3ζ链”和“CD247”。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，在该抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
术语“嵌合抗原受体”或“嵌合受体”或“CAR”是指由抗原结合部分(例如，单链抗体结构域)的细胞外部分组成的抗原结合受体，该抗原结合部分通过间隔序列与(诸如例如CD3z和CD28的)细胞内信号传导结构域/共信号传导结构域融合。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在某些方面，抗体是IgG1同种型。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
如本申请中所用的术语“源自人源的恒定区”或“人恒定区”表示亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链kappa或lambda区。此类恒定区在现有技术中是众所周知的并且例如，通过以下描述的：Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)(还参见，例如Johnson，G.，和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat，E.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)。除非本文另外规定，否则恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，EU编号***也称为Kabat的EU索引，如在Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。
所谓“交叉”Fab分子(也称为“Crossfab”)，意指以下Fab分子：其中Fab重链和轻链的可变结构域发生交换(即互相替换)，即交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1构成的肽链(VL-CH1，在N末端至C末端方向)，以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL构成的肽链(VH-CL，在N末端至C末端方向)。为清楚起见，在其中Fab轻链的可变结构域和Fab重链的可变结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中称为交叉Fab分子的“重链”。
如本文所用，术语“CSD”是指共刺激信号传导结构域。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
术语“表达盒”是指重组或合成产生的多核苷酸，以及允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白质。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个方面，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链C末端的一个或多个(特别是一个或两个)氨基酸的翻译后裂解。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子所产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的经切割变体。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，EU编号)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含Fc区的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，所述重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，EU编号***)。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，所述重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据EU索引编号)。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，EU编号***也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“融合”是指组分(例如Fab和跨膜结构域)直接地或经由一个或多个肽接头，通过肽键链接。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经将外源核酸引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于该原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
本文所述的“异二聚体”Fc结构域是指由两个不相同的亚基构成的Fc结构域。例如，Fc结构域亚基之一可以包含突变，而另一个Fc结构域亚基不包含该(相同)突变。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。在一个方面，对于VL，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组κI。在一个方面，对于VH，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组III。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。
通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)出现在以下氨基酸残基处的高可变环：26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)和96至101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)出现在以下氨基酸残基处的抗原接触点：27c至36(L1)、46至55(L2)、89至96(L3)、30至35b(H1)、47至58(H2)，以及93至101(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另外指明，否则CDR根据出处同上的Kabat等人所述的方法确定。本领域的技术人员将理解，CDR名称也可以根据出处同上的Chothia所述的方法、出处同上的McCallum所述的方法或者任何其他在科学上接受的命名***来确定。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，个体或受试者是人。
“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些方面，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法确定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链构成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变区)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类型中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
“分离的核酸”是指已从其天然环境的组分中分开的核酸分子。经分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置处。
关于具有与本发明的参考核苷酸序列至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，其是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点的突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可***到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如下文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
“分离的多肽”或变体或其衍生物意指不是处于其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，可以从多肽的天然或自然环境中移出分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或实质上纯化的天然或重组多肽也被认为是出于本发明的目的而分离的。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，“促进缔合的修饰”特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，这在融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合部分)不相同的意义上可能是不同的。在一些实施例中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个特定实施例中，促进缔合的修饰包括对Fc结构域的两个亚基中的每一个的单独氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式存在)之外，包括该群体的个别抗体具有同一性和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”是指不缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物组合物中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N末端至C末端，每条重链均具有可变结构域(VH)，亦称为可变重链结构域或重链可变区，随后为三个恒定重链结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N末端至C末端，每条轻链均具有可变结构域(VL)，亦称为可变轻链结构域或轻链可变区，随后为恒定轻链(CL)结构域。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且出于比对的目的在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。可替代地，可以使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册，并且在WO 2001/007611中有所描述。
除非另外指明，否则出于本文的目的，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序，利用BLOSUM50比较矩阵生成氨基酸序列同一性百分比的值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人，(1997)Genomics 46:24-36创作并且可从www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta.公开获得。可替代地，可以使用可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出比对标头中给出氨基酸同一性百分比。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基构成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，2017年6月12日在线发表，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌和/或警告的信息。
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用该药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分的制剂。
“药用载体”是指药物组合物或制剂中除活性成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一者使用，或与这些术语中的任何一者可互换地使用。术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割，或用非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，而不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。本发明的多肽的大小可以为约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，但它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的；并且不具有确定的三维结构，而是可以采用大量不同构象的多肽则被称为未折叠的。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(messenger RNA，mRNA)、病毒来源的RNA，或质粒DNA(plasmid DNA，pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语核酸分子是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“降低的结合”(例如降低的与Fc受体的结合)是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
术语“调节序列”是指对于实现与其连接的编码序列的表达是必需的DNA序列。这种控制序列的性质根据宿主生物体而不同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，控制序列通常包括启动子、终止子，并且在某些情况下包括增强子、反式激活子或转录因子。术语“控制序列”旨在至少包括表达所必需的所有组分，并且还可以包括其他有利的组分。
如本文所用，术语“单链”是指包含通过肽键线性链接的氨基酸单体的分子。在某些实施例中，抗原结合部分中的一个是单链Fab分子，即其中Fab轻链和Fab重链通过肽接头连接以形成单肽链的Fab分子。在一个具体的此类实施方案中，单链Fab分子中Fab轻链的C末端连接至Fab重链的N末端。在一个优选的实施例中，抗原结合部分是scFv片段。
如本文所用，术语“SSD”是指“刺激信号传导结构域”。
如本文所用，“治疗”(及其语法变体)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或可以在临床病理学过程中执行的临床干预措施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些方面，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文所用，“T细胞活化”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞响应，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。本发明的免疫活化Fc结构域结合分子能够诱导T细胞活化。测量T细胞活化的合适测定法是本文中描述的本领域已知的。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合分子中存在指定数目的抗原结合位点。因此，术语“与抗原单价结合”表示在抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
组合物和方法
在一个方面，本发明部分基于包含异二聚体Fc结构域的抗体。在某些方面，提供了包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的抗体。特别地，本发明提供了在两个Fc结构域亚基之一中包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的抗体。本发明的抗体可用于例如治疗癌症。
同时募集先天免疫细胞与CAR-T细胞可能尤其有助于通过首先给予抗体并且仅在抗体已经诱导了ADCC介导的抗肿瘤功效和减瘤作用的稍后时间点输注CAR-T细胞来减少不良事件(例如细胞因子释放综合征)。此外，同时募集先天免疫细胞与CAR-T细胞可能尤其帮助通过活化肿瘤微环境中的抗原呈递细胞(诸如表达FcgR的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)来产生二次免疫应答。
本文提供的抗体包含异二聚体Fc结构域(例如人IgG1)Fc区，其包含根据EU编号的P329G突变。
P329G突变降低与Fcγ受体的结合和相关的效应子功能。与非突变的Fc结构域相比，包含P329G突变(特别是在两个Fc结构域亚基中)的突变的Fc结构域以降低的或消除的亲和力与Fcγ受体结合。然而，如上文所述，可能需要Fcγ受体介导的受体功能。
根据本发明，提供了抗体，其包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，并且其中第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)。在一个实施例中，Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，Fc结构域是人Fc结构域。
根据本发明的包含异二聚体Fc结构域的抗体包含不同的Fc结构域亚基，因此Fc结构域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高(多特异性，例如双特异性)抗体的产率和纯度，因此将有利的是在(多特异性，例如双特异性)抗体的异二聚体Fc结构域中引入另外的促进所需多肽的缔合的修饰。
因此，在优选的方面，根据本发明的(多特异性，例如双特异性)抗体的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
存在几种对Fc结构域的CH3结构域进行修饰以实施异二聚化的方法，这些方法例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO2013157954、WO 2013096291中详细描述。通常，在所有此类方法中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域都以互补的方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含其的重链)可以不再与其自身同源二聚化，而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域异源二聚化(使得第一和第二CH3结构域异源二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。这些用于实现改善的重链异源二聚化的不同方法被认为是与(多特异性，例如双特异性)抗体中的重-轻链修饰(例如在一个结合臂中进行VH和VL交换/替换并且在CH1/CL界面中引入带有相反电荷的荷电氨基酸的取代)组合的不同替代方案，所述不同替代方案减少重链/轻链错配和Bence Jones型副产物。
在一个具体方面，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰是所谓的“杵臼结构”修饰，其包括Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的“臼”修饰。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个优选的方面，在(多特异性，例如双特异性)抗体的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位在空腔内。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。
突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。
在一个具体方面，在Fc结构域的第一亚基(“杵”亚基)(的CH3结构域)中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替换，并且在Fc结构域的第二亚基(“臼”亚基)(的CH3结构域)中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换。在一个方面，在Fc结构域的第二亚基中，另外地366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换(根据Kabat EU索引编号)。
在又另一个方面，在Fc结构域的第一亚基中，另外地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换)，并且在所述Fc结构域的第二亚基中，另外地，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定所述二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个优选方面，所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一个优选的方面，与CD3结合的抗原结合结构域与(任选地经由与第二抗原(即FolR1)结合的第二抗原结合结构域和/或肽接头)Fc结构域的第一亚基(包含“杵”修饰)融合。不希望受理论束缚，与CD3结合的抗原结合结构域与Fc结构域的含有杵的亚基的融合将(进一步)最小化包含两个与CD3结合的抗原结合结构域的抗体的产生(两个含有杵的多肽的空间位阻)。
用于实施异源二聚化的其他CH3修饰技术被设想为根据本发明的替代方案，并且描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO2013/157954、WO 2013/096291中。
在一个方面，可替代地使用EP 1870459中描述的异源二聚化方法。该方法基于在Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的荷电氨基酸。本发明的(多特异性)抗体的一个特定方面是氨基酸突变R409D；在(Fc结构域的)两个CH3结构域中的一个CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的CH3结构域中的另一个CH3结构域中的E357K(编号根据Kabat EU索引)。
在另一方面，本发明的(多特异性，例如双特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一方面，本发明的(多特异性，例如双特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述(多特异性，例如双特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(所有根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，可替代地使用WO 2013/157953中描述的异源二聚化方法。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(编号根据Kabat EU索引)。在另一个方面，第一CH3结构域包含另外的氨基酸突变L351K。在另一个方面，第二CH3结构域还包含选自由Y349E、Y349D和L368E(特别是L368E)组成的组的氨基酸突变(编号根据Kabat EU索引)。
在一个方面，可替代地使用WO 2012/058768中描述的异源二聚化方法。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一个方面，第二CH3结构域包含在T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸突变，例如选自由以下项组成的组：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K，c)S400E、S400D、S400R或S400K，d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W，e)N390R、N390K或N390D，f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(编号根据Kabat EU索引)。在另一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V、K409F。在另一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一个方面，第二CH3结构域还包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，可替代地使用WO 2011/143545中描述的异源二聚化方法，例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，可替代地使用WO 2011/090762中描述的异源二聚化方法，该异源二聚化方法也使用上述杵臼结构技术。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(编号根据Kabat EU索引)。
在一个方面，(多特异性，例如双特异性)抗体或其Fc结构域为IgG2亚类，并且可替代地使用在WO 2010/129304中描述的异源二聚化方法。
在一个替代的方面，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如在PCT公开WO 2009/089004中所描述的。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。在一个这样的方面，第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸对K392或N392进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，特别是K392D或N392D)，并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，特别是D399K、E356K、D356K或E357K，更特别是D399K和E356K)。在另一个方面，第一CH3结构域还包含用带负电荷的氨基酸对K409或R409进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，特别是K409D或R409D)。在另一个方面，第一CH3结构域进一步或可替代地包含用带负电荷的氨基酸对K439和/或K370进行的氨基酸取代，(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))(所有根据Kabat EU索引编号)。
在又另一个方面，可替代地使用WO 2007/147901中描述的异源二聚化方法。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(根据Kabat EU索引编号)。
在又一方面，可替代地使用WO 2007/110205中描述的异源二聚化方法。
在一个方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(根据Kabat EU索引编号)。
在某些方面，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。糖基化位点向抗体的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而实现。
由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双触角寡糖，该双触角寡糖通常通过N-键合附接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些方面中，可对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
一方面，提供了具有非岩藻糖基化的寡糖的抗体变体，即缺少(直接或间接地)连接在Fc区的岩藻糖的寡糖结构。这样的非岩藻糖基化的寡糖(也称为“去岩藻糖基化”的寡糖)特别是N-连接的寡糖，其缺少在双触角寡糖结构的茎中连接第一GlcNAc的岩藻糖残基。一方面，提供了与天然或亲本抗体相比在Fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以为至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比，如例如WO2006/082515中所述，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，是缺少岩藻糖残基的寡糖的(平均)量相对于与Asn 297连接的所有寡糖(例如复杂、杂合和高甘露糖结构)之和。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于297位上游或下游大约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。在Fc区中具有非岩藻糖基化寡糖比例增加的此类抗体可具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能，特别是改善的ADCC功能。参见例如US 2003/0157108和US 2004/0093621。
能够生产岩藻糖基化减少的抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是在实例11中)，以及敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)，或具有降低或取消的GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性的细胞(参见，例如，US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一方面，抗体变体提供了二等分的寡糖，例如，其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。如上所述，这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如Umana等人,Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara等人,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540,WO 2003/011878。
还提供了在附接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087、WO 1998/58964和WO 1999/22764中。
本文提供的抗体包含Fc结构域(例如人IgG1)Fc区，其包含根据EU编号的P329G突变。在某些方面，一个或多个另外的氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，取代)。
在某些方面，异二聚体抗体变体包含具有增加FcRn结合的一个或多个氨基酸取代的Fc区。在一个实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，突变的Fc结构域表现出增加的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个实施例中，Fc结构域包含增加与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的298、333和/或334位的取代(残基的EU编号)。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的增加。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体已改善FcγR结合(因此可能改善ADCC活性)。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评定目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。替代性地，可使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代性地或附加地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评定补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie，Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929Al)。
描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在一些方面，在Fc区中进行导致改变(即，改善或减少)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642以及Idusogie等人.J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所描述。
具有延长的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合、负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117:587(1976)，以及Kim,J.K.等人,J.Immunol.24:249(1994))的抗体描述于US2005/0014934(Hinton等人)中。那些抗体包含Fc区，该Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(参见，例如美国专利号7,371,826；Dall'Acqua,W.F.等人.J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。
通过定点诱变已经鉴定了对小鼠Fc-小鼠FcRn相互作用至关重要的Fc区残基(参见例如Dall’Acqua,W.F.等人.J.Immunol 169(2002)5171-5180)。相互作用涉及残基I253、H310、H433、N434和H435(残基的EU编号)(Medesan,C.等人,Eur.J.Immunol.26(1996)2533；Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993；Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.24(1994)542)。发现残基I253、H310和H435对于人Fc与鼠FcRn的相互作用至关重要(Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2819)。对人Fc-人FcRn复合物的研究表明，残基I253、S254、H435和Y436对于相互作用至关重要(Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993；Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung,Y.A.等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中已经报道并检查了残基248至259和301至317和376至382和424至437的各种突变体。
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个增加FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的252、和/或254和/或256位的取代(残基的EU编号)。在某些方面，抗体变体包含在位置252、254和256位具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是M252Y、S254T和T256E。有关Fc区变体的其他实例，另外参见：Duncan和Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
如本文报道的抗体的重链的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。在本文报道的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含包括C末端CH3结构域的重链的抗体，包含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，氨基酸位置的EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个方面中，如本文所指定的包含包括C末端CH3结构域的重链的抗体，包含C末端甘氨酸残基(G446，氨基酸位置的EU索引编号)。
抗原结合部分
在一个方面，抗原结合部分为scFv、Fab、crossFab或scFab，特别是Fab片段。木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域(分别为VH和VL)以及轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，术语“Fab片段”是指包括包含VL结构域和CL结构域的轻链以及包含VH结构域和CH1结构域的重链片段的抗体片段。
在进一步的方面，抗原结合部分为单链Fab片段。“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中抗体结构域和接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL。特别地，所述接头是至少30个氨基酸，优选地在32个与50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab片段可以通过经由***半胱氨酸残基(例如，根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)生成链间二硫键，而进一步稳定化。
在另一个方面，抗原结合部分片段为单链可变片段(scFv)。“单链可变片段”或“scFv”是抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合蛋白，是通过接头连接的。特别地，接头是10个至约25个氨基酸的短多肽，并且通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并且引入了接头，但该蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑(Springer-Verlag,New York)，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。
在另一个方面，抗原结合部分为单结构域抗体。“单结构域抗体”是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者抗体的全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些方面，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌)重组产生，如本文所述。
在另一个方面，抗原结合部分为crossFab。“交换型Fab分子”(也称为“crossFab”或“交换型Fab片段”)是指一种Fab分子，其中Fab重链和轻链的可变区或恒定区被交换，即crossFab片段包含由轻链可变区和重链恒定区构成的肽链，以及由重链可变区和轻链恒定区构成的肽链。因此，crossFab片段包含由重链可变区和轻链恒定区构成的多肽(VH-CL)，以及由轻链可变区和重链恒定区构成的多肽(VL-CH1)。为清楚起见，包含重链恒定区的多肽链在本文中称为重链，并且包含轻链恒定区的多肽链在本文中称为crossFab片段的轻链。
靶细胞抗原
本文提供的抗原结合部分对靶细胞表面分子(例如天然存在于肿瘤细胞表面的肿瘤特异性抗原)具有特异性。在本发明的背景中，包含此类抗原结合部分的此类抗体将使本文所述的转导的T细胞与靶细胞(例如肿瘤细胞)物理接触，其中转导的T细胞被活化。本发明的转导的T细胞的活化优先导致如本文所述的靶细胞的裂解。
天然存在于靶(例如肿瘤)细胞表面的靶细胞抗原(例如肿瘤标志物)的实例在下文给出并且包括但不限于FAP(成纤维细胞活化蛋白)、CEA(癌胚抗原)、p95(p95HER2)、BCMA(B细胞成熟抗原)、EpCAM(上皮细胞粘附分子)、MSLN(间皮素)、MCSP(黑色素瘤硫酸软骨素蛋白多糖)、HER-1(人表皮生长因子1)、HER-2(人表皮生长因子2)、HER-3(人表皮生长因子3)、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、叶酸受体1(FOLR1)、人滋养层细胞表面抗原2(Trop-2)癌抗原12-5(CA-12-5)、人白细胞抗原-抗原D相关(HLA-DR)、MUC-1(粘蛋白-1)、A33抗原、PSMA(***特异性膜抗原)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT-3)、PSMA(***特异性膜抗原)、PSCA(***干细胞抗原)、转铁蛋白受体、TNC(腱生蛋白)、碳酸酐酶IX(CA-IX)和/或与人主要组织相容性复合体(MHC)的分子结合的肽。
上述抗原的序列可在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中获得，并且可从http://www.uniprot.org/uniprot/？query＝reviewed％3Ayes检索。这些(蛋白质)序列也与注释的修饰序列有关。本发明还提供其中使用同源序列以及本文提供的简明序列的遗传等位基因变体等的技术和方法。优选地使用本文简明序列的此类变体等。优选地，此类变体是遗传变体。技术人员可以容易地推断出这些数据库条目中的这些(蛋白质)序列的相关编码区，其还可以包括基因组DNA以及mRNA/cDNA的条目。(人)FAP(成纤维细胞活化蛋白)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目Q12884(条目版本168，序列版本5)获得；(人)CEA(癌胚抗原)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目P06731(条目版本171，序列版本3)获得；(人)EpCAM(上皮细胞粘附分子)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目P16422(条目版本117，序列版本2)获得；(人)MSLN(间皮素)的一个或多个序列可以从UniProt条目号Q13421(版本号132；序列版本2)中获得；(人)FMS样酪氨酸激酶3(FLT-3)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目P36888(主要可引用登录号)或Q13414(辅助登录号)(版本号165和序列版本2)获得；(人)MCSP(黑色素瘤硫酸软骨素蛋白多糖)的一个或多个序列可以从UniProt条目号Q6UVK1(版本号118；序列版本2)获得；(人)叶酸受体1(FOLR1)的一个或多个序列可以从UniProt条目号P15328(主要可引用登录号)或Q53EW2(辅助登录号)(版本号153，序列版本3)获得；(人)滋养层细胞表面抗原2(Trop-2)的一个或多个序列可以从UniProt条目号P09758(主要可引用登录号)或Q15658(辅助登录号)(版本号172和序列版本3)获得；(人)PSCA(***干细胞抗原)的一个或多个序列可以从UniProt条目号O43653(主要可引用登录号)或Q6UW92(辅助登录号)(版本号134和序列版本1)获得；(人)HER-1(表皮生长因子受体)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目P00533(条目版本177，序列版本2)获得；(人)HER-2(受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目P04626(条目版本161，序列版本1)获得；(人)HER-3(受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目P21860(条目版本140，序列版本1)获得；(人)CD20(B淋巴细胞抗原CD20)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目P11836(条目版本117，序列版本1)获得；(人)CD22(B淋巴细胞抗原CD22)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目P20273(条目版本135，序列版本2)获得；(人)CD33(B淋巴细胞抗原CD33)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目P20138(条目版本129，序列版本2)获得；(人)CA-12-5(粘蛋白16)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目Q8WXI7(条目版本66，序列版本2)获得；(人)HLA-DR的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目Q29900(条目版本59，序列版本1)获得；(人)MUC-1(粘蛋白-1)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目P15941(条目版本135，序列版本3)获得；(人)A33(细胞表面A33抗原)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目Q99795(条目版本104，序列版本1)获得；(人)PSMA(谷氨酸羧肽酶2)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目Q04609(条目版本133，序列版本1)获得；(人)转铁蛋白受体的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目Q9UP52(条目版本99，序列版本1)和P02786(条目版本152，序列版本2)获得；(人)TNC(腱生蛋白)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目P24821(条目版本141，序列版本3)获得；或(人)CA-IX(碳酸酐酶IX)的一个或多个序列可以从Swiss-Prot数据库条目Q16790(条目版本115，序列版本2)获得。
在一个优选的实施例中，靶细胞抗原选自由以下项组成的组：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、间皮素(MSLN)、CD20、叶酸受体1(FOLR1)和腱生蛋白(TNC)。
可以使用本领域众所周知的方法(诸如免疫哺乳动物免疫***和/或使用重组文库的噬菌体展示)产生能够与上述靶细胞抗原中的任何一种特异性结合的抗原结合部分(诸如scFv、Fab、crossFab或scFab)。
文库衍生的抗原结合部分
在某些方面，本文提供的抗原结合部分衍生自文库。可以通过筛选组合文库中具有一种或多种期望活性的抗原结合部分来分离本发明的抗原结合部分。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人，Nature Reviews16:498-508(2016)中。例如，本领域已知多种方法用于生成噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗原结合部分。此类方法综述于例如Frenzel等人，mAbs 8:1177-1194(2016)；Bazan等人，HumanVaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao等人，Critical Reviewsin Biotechnology 36:276-289(2016)中，以及Hoogenboom等人，Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,2001)中和Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编辑，Human Press,Totowa,NJ,2003)中。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全部集合通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Annual Review of Immunology 12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗原结合部分，而无需构建杂交瘤。或者，可以克隆所有天然组成成分(例如，来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗原结合部分的单一来源，而无需任何免疫，如由Griffiths等人在EMBO Journal 12:725-734(1993)中所描述的。此外，还通过以下方式来合成天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter在Journal of Molecular Biology 227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。
本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗原结合部分的组合文库的方法的其他实施例包括核糖体和mRNA展示，以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人，Methodsin Molecular Biology 503:135-56(2012)和Cherf等人，Methods in Molecular biology1319:155-175(2015)以及Zhao等人，Methods in Molecular Biology 889:73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人，Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes等人，PNAS 94:4937-4942(1997)中。
在本文中从人抗体文库分离出的抗原结合部分或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。
亲和力
在某些方面，本文提供的抗原结合部分的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
一方面，使用表面等离子体共振测定法测量KD。例如，使用或/>(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃下用固定的抗原CM5芯片以～10个响应单位(RU)进行测定。在一个方面，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM醋酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，之后以5μl/分钟的流量进行注射以获得大约10响应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。关于动力学测量，在25℃，以约25μl/min的流速，注射在含有0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中的Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单的一对一Langmuir结合模型(/>Evaluation Software 3.2版)，通过同时拟合缔合与解离感测器图来计算缔合速率(kon)与解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参加例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。若通过上述表面等离子体共振测定得出缔合速率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术测定缔合速率，即如在分光计诸如配备止流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯所测得的，在浓度渐增的抗原存在下，测量在25℃下PBS pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少。
在一种替代方法中，通过放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量KD。在一个方面，采用目的抗体的Fab形式及其抗原进行RIA。例如，通过在一系列未标记的抗原滴定存在下用最小浓度(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原，来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了确定用于测定法的条件，用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕获抗Fab抗体(CappelLabs)包被多孔板(Thermo Scientific)过夜，并且随后在室温(大约23℃)，用在PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白阻断二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释液(例如，遵循在Presta等人，CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体(Fab-12)的评定)混合。然后将目的Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板以在室温下孵育(例如，一小时)。然后去除溶液并用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20/>洗涤该板八次。当板已干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且在TOPCOUNT TMγ计数器(Packard)上对板计数十分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度以用于竞争性结合测定中。
嵌合抗体和人源化抗体
在某些方面，本文提供的异二聚体抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于，例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些方面，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些方面，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
人抗体
在某些方面，本文提供的异二聚体抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M/>技术的美国专利号7,041,870，以及描述/>技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)所述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人抗体还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的可变结构域序列产生。然后可以将此类可变结构域序列与预期的人恒定结构域结合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
多特异性抗体
在某些方面，本文提供的异二聚体抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。“多特异性抗体”是对至少两个不同位点(即，不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利5,731,168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270:26(1997))。多特异性抗体还可以通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电操纵效应(参见例如，WO 2009/089004)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如，美国专利号4,676,980，以及Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用用于避免轻链错配问题的常用轻链技术(参见例如，WO 98/50431)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括例如“章鱼抗体”或者DVD-Ig(参见例如，WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他示例可以在WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2013/026831中找到。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双作用FAb”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体也可以以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中有结构域互换，即通过交换VH/VL结构域(参见例如，WO 2009/080252和WO2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如，WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如，WO2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)1187-1191，以及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。在一方面，多特异性抗体包含交叉Fab片段。术语“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交叉Fab片段”是指其中重链和轻链的可变区或恒定区发生交换的Fab片段。交叉Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区1(CH1)构成的多肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的多肽链。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见例如WO 2016/172485。
多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。
本文还包括的一种特定类型的多特异性抗体是这样的双特异性抗体，该双特异性抗体设计用于同时结合靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的表面抗原和T细胞受体(TCR)复合物的活化不变组分(诸如CD3)，以用于再靶向T细胞以杀伤靶细胞。因此，在某些方面，本文提供的抗体是多特异性抗体，特别是双特异性抗体。
可用于此目的的双特异性抗体形式的示例包括但不限于所谓的“BiTE”(双特异性T细胞接合子)分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合(参见例如，WO 2004/106381、WO2005/061547、WO 2007/042261以及WO 2008/119567；Nagorsen和Exp Cell Res317,1255-1260(2011))；双体抗体(Holliger等人，Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双体抗体(“TandAb”；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293,41-56(1999))；“DART”(双重亲和力再靶向)分子，其基于双体抗体形式但特征是具有用于实现额外稳定化的C-末端二硫桥(Johnson等人，J Mol Biol 399,436-449(2010))，以及所谓的三功能抗体(triomab)，其是全杂交小鼠/大鼠IgG分子(综述于Seimetz等人，Cancer Treat Rev 36,458-467(2010)中)。本文所包含的特定的T细胞双特异性抗体形式描述于以下文献中：WO2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；Bacac等人，Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498。
抗体变体
在某些方面中，设想了本文提供的异二聚体抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改变抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
取代、***和删除性变体
在某些方面，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的感兴趣的位点包括CDR和FR。保守取代在表1中的“优选取代”标题下示出。在表1中的“示例性取代”标题下提供了更实质性的变化，如下面参考氨基酸侧链类别所进一步描述的。可以将氨基酸取代引入目的抗体中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。
表1
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别的成员。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，相对于亲本抗体，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简要地说，对一个或多个CDR残基进行突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
例如，可在CDR中作出改变(例如，取代)，以改善抗体亲和力。此类改变可发生于CDR“热点”中，即由体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或与抗原接触的残基(检测所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建并自二级文库重新选择而实现的亲和力成熟已被例如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中进行描述。在亲和力成熟的某些方面，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任何一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建一个二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR定向方法，其中将若干CDR残基(例如，每次4至6个残基)随机化。参与抗原结合的CDR残基可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定。具体而言，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些方面，取代、***或缺失可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。这样的改变可以例如在CDR中的抗原接触残基的外部。在上文提供的某些变体VH和VL序列中，每个CDR要么保持不变，要么包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。替代性地或附加地，可以使用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴定抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列***包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他***变体包括将抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT(抗体定向酶前药治疗))或多肽融合。
经半胱氨酸工程改造的抗体变体
在某些方面，可能需要产生半胱氨酸工程化改造的抗体，例如THIOMABTM抗体，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。如本文进一步描述的，通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位于抗体的可接近部位处，并且可以用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。半胱氨酸工程化改造的抗体可以如例如在美国专利号7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130或WO 2016040856中所述产生。
抗体衍生物
在某些方面，本文提供的异二聚体抗体可被进一步修饰以包含本领域已知的并且容易获得的附加非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
示例性异二聚体抗体
在一个方面，本发明提供了与CD20结合的异二聚体抗体。在一个方面，提供了与CD20结合的分离的异二聚体抗体。在一个方面，本发明提供了与CD20特异性结合的异二聚体抗体。在一个方面，异二聚体抗CD20抗体是人源化的。在本发明的进一步的方面，根据以上方面中的任一方面的异二聚体抗CD20抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施例中，异二聚体抗CD20抗体包含与SEQ ID NO:129至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列、与SEQ ID NO:130至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列和与SEQ ID NO:131至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在另一个方面，以上示例性异二聚体抗体中的任一种是全长抗体。在一个方面，额外存在C末端甘氨酸(Gly446)。在一个方面，额外存在C末端甘氨酸(Gly446)和C末端赖氨酸(Lys447)。
重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在US 4,816,567中所述。对于这些方法，提供了编码抗体的一种或多种分离的核酸。
在天然抗体或天然抗体片段的情况下，需要两种核酸，一种用于轻链或其片段，一种用于重链或其片段。此类核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或不同的表达载体上。
在具有异源二聚重链的某些双特异性抗体的情况下，需要四种核酸，一种用于第一轻链，一种用于包含第一异单体(heteromonomeric)Fc区多肽的第一重链，一种用于第二轻链，并且一种用于包含第二异单体Fc区多肽的第二重链。四种核酸可包含在一种或多种核酸分子或表达载体中。此类核酸编码构成抗体的第一VL的氨基酸序列和/或构成抗体的包含第一异单体Fc区的第一VH的氨基酸序列和/或构成抗体的第二VL的氨基酸序列和/或构成抗体的包含第二异单体Fc区的第二VH的氨基酸序列(例如抗体的第一轻链和/或第二轻链和/或第一重链和/或第二重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或在不同的表达载体上，通常这些核酸位于两个或三个表达载体上，即一个载体可以包含这些核酸中的多于一种。这些双特异性抗体的示例是CrossMab(参见例如Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191)。例如，该异单体重链中的一条包含所谓的“杵突变(杵mutation)”(T366W，以及任选地S354C或Y349C中的一者)，并且该异单体重链中的另一条包含所谓的“臼突变(hole mutation)”(T366S、L368A和Y407V，以及任选地Y349C或S354C)(参见例如Carter，P.等人，Immunotechnol。2(1996)73)，根据EU索引编号。
在一个方面，提供了编码如在本文所报道的方法中使用的抗体的分离的核酸。
在一方面，提供了一种制备包含异二聚体Fc结构域的抗体的方法，其中该方法包括在适合表达抗体的条件下培养包含如上提供的编码抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
对于包含异二聚体Fc结构域的抗体的重组生产，将编码抗体的核酸(例如，如上所述)分离并***至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，或通过重组方法产生或通过化学合成获得此类核酸。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,在：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.主编，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，第245-254页中，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，该真核微生物包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；以及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293T细胞)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather,J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述)；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。
一方面，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
药物组合物
在其他方面，提供了包含本文提供的任一种抗体的药物组合物，其例如用于以下任一种治疗方法中。一方面，药物组合物包含任一种本文提供的抗体和药用载体。在另一方面，药物组合物包含任一种本文提供的抗体和例如如下所述的至少一种另外的治疗剂。
本文所述的抗体的药物组合物是通过将具有所需纯度的此类抗体与一种或多种任选的药用载体混合(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980))以冻干组合物或水溶液的形式制备的。药用载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，包括但不限于：缓冲剂，诸如组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药用载体还包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Halozyme,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体组合物描述于美国专利号6267958中。水性抗体组合物包括在美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者中的组合物包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文的药物组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编(1980)中。
可以制备用于缓释的药物组合物。缓释制备物的合适实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透性基质，该基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。
用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
治疗方法和施用途径
本文提供的任何异二聚体抗体可用于治疗方法。本发明的异二聚体抗体与能够与本文所述的突变的Fc结构域特异性结合的抗原结合受体组合。
在一个方面，提供了一种用作药物的异二聚体抗体。在进一步的方面，提供了一种用于癌症的异二聚体抗体。在某些方面，提供了一种用于治疗方法中的异二聚体抗体。在某些方面，本发明提供了异二聚体抗体以用于治疗患有癌症的个体的方法中，该方法包括向所述个体施用有效量的所述异二聚体抗体。在一个这样的方面，例如如下所描述的，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的治疗剂)。在进一步的方面，本发明提供了用于治疗癌症，特别是上皮、内皮或间皮起源的癌症和血癌的异二聚体抗体。在某些方面，本发明提供了用于治疗个体中的癌症，特别是上皮、内皮或间皮起源的癌症和血癌的方法中使用的异二聚抗体，该方法包括向个体施用有效量的异二聚抗体以治疗癌症。根据上述方面中的任一者的“个体”优选地是人。
在进一步的方面，本发明提供异二聚体抗体在制备或制造药物中的用途。在一个方面，药物用于治疗癌症。在进一步方面，该药物用于治疗癌症的方法，该方法包含向患有癌症的个体施用有效量的药物。在一个这样的方面，例如如下所描述的，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在进一步的方面，该药物用于治疗癌症，特别是上皮、内皮或间皮起源的癌症和血癌。在进一步的方面，该药物用于治疗个体的癌症，特别是上皮、内皮或间皮起源的癌症和血癌的方法中，该方法包括向个体施用有效量的药物以治疗癌症。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是人。
在进一步的方面，本发明提供了治疗癌症的方法。在一个方面，该方法包括向患有此类癌症的个体施用有效量的异二聚体抗体。在一个这样的方面，如下所描述的，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。
根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是人。
在进一步的方面，本发明提供了包含本文提供的任一种异二聚体抗体的药物组合物，其例如用于以上任何治疗方法中。在一个方面，药物组合物包含本文提供的任一种异二聚体抗体以及药用载体。在另一个方面，药物组合物包含本文提供的任一种异二聚体抗体以及例如如下所述的至少一种另外的治疗剂。
本发明的抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。所述抗体不是必须的，而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾患的制剂共同配制。这些其他制剂的有效量取决于药物组合物中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文该相同的剂量和施用途径使用，或以本文该剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、施用分子用于预防还是治疗目的、患者的病史和对抗体的应答以及主治医师的酌处权。抗体适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。抗体的一种示例性剂量的范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量的抗体)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合以有效治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，该制品可包括(a)第一容器，其中该第一容器中含有包含本发明的抗体的组合物；以及(b)第二容器，该第二容器中含有包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该方面中的制品还可包含包装插页，该包装插页指示该组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地，该制品可进一步包括第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述制品还可包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
与抗原结合受体的组合
根据本发明的异二聚体抗体可以与表达能够与突变的Fc亚基(例如，包含根据EU编号的氨基酸突变P329G)特异性结合的抗原结合受体的细胞组合以用于增加药理学活性(也如以下进一步描述的)。上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中异二聚体抗体和细胞包括在相同或单独的药物组合物中)和单独施用，在单独施用的情况下，本发明的异二聚体抗体的施用可以在施用下文所述的表达抗原结合受体的细胞之前、同时和/或之后进行。
如本文所述，根据本发明的抗体能够高效地募集抗P329G CAR-T细胞以用于杀伤。此外，根据本发明的抗体能够高效地募集先天免疫细胞(诸如NK细胞或单核细胞)用于FcgR依赖性ADCC，而不需要非特异***叉活化。
同时募集先天免疫细胞与CAR-T细胞可能尤其有助于通过首先给予抗体并且仅在抗体已经诱导了ADCC介导的抗肿瘤功效和减瘤作用的稍后时间点输注CAR-T细胞来减少不良事件(例如细胞因子释放综合征)。此外，同时募集先天免疫细胞与CAR-T细胞可能尤其帮助通过活化肿瘤微环境中的抗原呈递细胞(诸如表达FcgR的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)来产生二次免疫应答。
在一个方面，异二聚体抗体的施用和细胞的施用在彼此相距约一个月内，或在约一周、两周或三周内，或在约一天、二天、三天、四天、五天或六天之内进行。在一个方面，在治疗的第1天将异二聚体抗体和细胞施用于患者。
本发明的抗原结合受体包含细胞外结构域，该细胞外结构域包含至少一个能够与突变的Fc结构域特异性结合但不能与亲本非突变的Fc结构域特异性结合的抗原结合部分。在优选的实施例中，抗原结合受体的抗原结合部分是人源化或人抗原结合部分，例如人源化或人scFv。
本发明进一步涉及用本文提供的抗原结合受体转导T细胞，诸如CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD3+T细胞、γδT细胞或自然杀伤(NK)T细胞，优选CD8+T细胞，它们通过本文提供的抗体靶向募集至例如肿瘤。
如所附实例所示，根据本发明的包含锚定跨膜结构域和人源化细胞外结构域的抗原结合受体(SEQ ID NO:7，由SEQ ID NO:20所示的DNA序列编码)被构建成能够特异性结合治疗性抗体(由包含SEQ ID NO:129的重链(包含P329G突变)和SEQ ID NO:130的重链和SEQID NO:131的两条轻链的异二聚体抗CD20抗体表示)。表达VH3VL1-CD8ATD-CD137CSD-CD3zSSD融合蛋白(SEQ ID NO:7，由SEQ ID NO:20所示的DNA序列编码)的转导的T细胞(Jurkat NFAT T细胞)可通过与包含Fc结构域中P329G突变的抗CD20抗体连同CD20阳性肿瘤细胞的共孵育而被强烈活化(参见例如图9B)。此外，令人惊讶的是，通过CD16-CAR活化证明的ADCC效应子功能(参见例如图9A)可以被异二聚体抗CD20抗体强烈活化。
此外，通过结合针对肿瘤抗原的抗体(其中该抗体包含P329G突变以及表达VH3VL1-CD8ATD-CD137CSD-CD3zSSD融合蛋白(SEQ ID NO:7，由SEQ ID NO:20所示的DNA序列编码)的转导的T细胞)***细胞与表达VL1VH3-CD8ATD-CD137CSD-CD3zSSD(SEQ IDNO:31，由SEQ ID NO:33所示的DNA序列编码)的转导的T细胞相比，出乎预料地导致转导的T细胞更强烈的活化。
在VH3VL1-CD8ATD-CD137CSD-CD3zSSD融合蛋白中，VH结构域(VH3)在其C末端通过肽接头与VL结构域(VL1)的N末端融合形成scFv。scFv在其C末端(VL结构域的C末端)通过肽接头融合到锚定跨膜结构域(ATD)。另一方面，VL1VH3-CD8ATD-CD137CSD-CD3zSSD融合蛋白，其VL结构域(VL1)在C末端通过肽接头与VH结构域(VH3)的N末端融合形成scFv。scFv在其C末端(VH结构域的C末端)通过肽接头融合到锚定跨膜结构域(ATD)。不受理论的束缚，观察到与VL1VH3-CD28ATD-CD137CSD-CD3zSSD相比，VH3VL1-CD8ATD-CD137CSD-CD3zSSD融合蛋白导致转导的T细胞更强烈的活化，表明VL结构域与锚定结构域的融合(通过肽接头)导致更有效的抗原结合受体。这是出乎意料和令人惊讶的。
VH结构域VH3与VL结构域VL1的组合，均由本发明人鉴定，是特别有利的，因为这些可变结构域是人源化抗体结构域。不受理论的束缚，人源化抗体结构域是优选的，因为当将包含此类人源化抗体结构域的抗原结合部分应用于人类患者时可以预期较少的副作用(诸如例如较少形成抗药物抗体(ADA))。然而，人源化可导致抗原结合部分(例如，源自非人类来源的部分)的结合丧失。如所附实例所示，人源化VH3和VL1结构域保留与Fc结构域的结合，该Fc结构域包含根据EU编号的氨基酸突变P329G。该结果是出乎意料的，例如通过其他人源化VH和VL结构域未能保留与包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的Fc结构域相当的结合所示。
因此，在本发明的一个优选实施例中，异二聚体抗体与包含人源化抗原结合部分的抗原结合受体组合。
肿瘤特异性抗体(即抗体，其包含异二聚体Fc结构域(例如包含根据EU编号的氨基酸突变P329G))与用抗原结合受体(其包含/由以下组成：包含能够与突变的Fc结构域特异性结合的抗原结合部分的细胞外结构域)转导的T细胞配对，导致T细胞的特异性活化和随后的肿瘤细胞裂解。这种方法比传统的基于T细胞的方法具有显著的安全优势，因为T细胞在没有包含突变的Fc结构域的抗体的情况下是惰性的。因此，本发明提供了通用的治疗平台，其中IgG型抗体用于标志或标记肿瘤细胞作为T细胞的指导，并且其中转导的T细胞通过提供对IgG型抗体的突变的Fc结构域的特异性而特异性靶向肿瘤细胞。在与肿瘤细胞表面上抗体的突变的Fc结构域结合后，本文所述的转导的T细胞被活化，随后肿瘤细胞将被裂解。
抗原结合受体的抗原结合部分
在本发明的说明性实施例中，作为概念证明，提供了人源化抗原结合受体，其能够与包含氨基酸突变P329G的突变的Fc结构域和表达所述抗原结合受体的效应细胞特异性结合。P329G突变降低与Fcγ受体的结合和相关的效应子功能。因此，与非突变的Fc结构域相比，包含P329G突变的突变的Fc结构域以降低的或消除的亲和力与Fcγ受体结合。
在一个实施例中，抗原结合部分能够特异性结合由能够稳定缔合的第一和第二亚基构成的突变的Fc结构域。在一个实施例中，Fc结构域是IgG，特别是IgG1结构域。在一个实施例中，Fc结构域是人Fc结构域。
在一个优选的实施例中，Fc结构域包含P329G突变。
在一个实施例中，抗原结合受体包含含有抗原结合部分的细胞外结构域。在一个实施例中，抗原结合部分能够与包含氨基酸突变P329G(根据EU编号)的Fc结构域特异性结合。
在一个实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)，其包含以下中的至少一种：
(a)RYWMN(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:2)或EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:40)的CDR H2氨基酸序列；以及
(c)PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)的CDR H3氨基酸序列。
在一个实施例中，抗原结合部分包含轻链可变结构域(VL)，其包含以下中的至少一种：
(d)RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)GTNKRAP(SEQ ID NO:5)的CDR L2氨基酸序列；以及
(f)ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)的CDR L3氨基酸序列。
在优选的实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)，其包含：
(a)RYWMN(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:2)或EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:40)的CDR H2氨基酸序列；
(c)PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)的CDR H3氨基酸序列；
以及轻链可变结构域(VL)，其包含：
(d)RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)GTNKRAP(SEQ ID NO:5)的CDR L2氨基酸序列；以及
(f)ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)的CDR L3氨基酸序列。
在优选的实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)，其包含：
(a)RYWMN(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:2)的CDR H2氨基酸序列；
(c)PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)的CDR H3氨基酸序列；
以及轻链可变结构域(VL)，其包含：
(d)RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)GTNKRAP(SEQ ID NO:5)的CDR L2氨基酸序列；以及
(f)ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)的CDR L3氨基酸序列。
在另一个特定的实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)，其包含：
(a)RYWMN(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:40)的CDR H2氨基酸序列；
(c)PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)的CDR H3氨基酸序列；
以及轻链可变结构域(VL)，其包含：
(d)RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)GTNKRAP(SEQ ID NO:5)的CDR L2氨基酸序列；以及
(f)ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)的CDR L3氨基酸序列。
在一个实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)，其包含与选自由以下项组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:44。
在一个实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗原结合部分包含轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，该重链可变结构域(VH)包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变结构域(VL)包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，该重链可变结构域(VH)包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变结构域(VL)包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，该重链可变结构域(VH)包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变结构域(VL)包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个优选的实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，该重链可变结构域(VH)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，该轻链可变结构域(VL)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗原结合部分是scFv或scFab。在一个优选的实施例中，抗原结合部分是scFv。
在一个实施例中，抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH结构域与VL结构域连接，特别是通过肽接头连接。在一个实施例中，VL结构域的C末端连接到VH结构域的N末端，特别是通过肽接头连接。在一个优选的实施例中，VH结构域的C末端连接到VL结构域的N末端，特别是通过肽接头连接。在一个实施例中，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。
在一个实施例中，抗原结合部分是scFv，其是由重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和接头组成的多肽，其中所述可变结构域和所述接头在N末端至C末端方向上具有以下构型之一：a)VH-接头-VL或b)VL-接头-VH。在一个优选的实施例中，scFv具有构型VH-接头-VL。
在一个实施例中，抗原结合部分包含与选自由以下项组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:128。
在一个实施例中，抗原结合部分包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，抗原结合部分包含SEQID NO:10的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗原结合部分包含与SEQ ID NO:126的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，抗原结合部分包含SEQID NO:126的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗原结合部分包含与SEQ ID NO:128的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，抗原结合部分包含SEQID NO:128的氨基酸序列。
包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗原结合部分，诸如本文所述的scFv和scFab片段，可以通过在VH和VL结构域之间引入链间二硫键来进一步稳定化。因此，在一个实施例中，包含在根据本发明的抗原结合受体中的一个或多个scFv片段和/或一个或多个scFab片段通过经由***半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)生成链间二硫键来进一步稳定化。在一个实施例中，提供了以上提供的VH和/或VL序列中的任何一种，其包含至少一个氨基酸被半胱氨酸取代(特别是在根据Kabat编号的可变重链的44位和/或可变轻链的100位)。
锚定跨膜结构域(ATD)
在本发明的背景中，抗原结合受体的锚定跨膜结构域的特征可以在于不具有哺乳动物蛋白酶的切割位点。在本发明的背景中，蛋白酶是指能够水解包含蛋白酶切割位点的跨膜结构域的氨基酸序列的蛋白水解酶。术语蛋白酶包括内肽酶和外肽酶。在本发明的背景中，由CD-命名法特别规定的跨膜蛋白的任何锚定跨膜结构域可用于产生本发明的抗原结合受体。
因此，在本发明的背景中，锚定跨膜结构域可包含鼠/小鼠或优选人跨膜结构域的一部分。这种锚定跨膜结构域的实施例是CD8的跨膜结构域，例如，其具有如文本中SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:24所示的DNA序列编码)。在本发明的背景中，本发明的抗原结合受体的锚定跨膜结构域可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:24所示的DNA序列编码)或由其组成。
在另一个实施例中，文本提供的抗原结合受体可以包含CD28的跨膜结构域，其位于如SEQ ID NO:61所示的人全长CD28蛋白(如由SEQ ID NO:70所示的cDNA编码)的氨基酸153至179、154至179、155至179、156至179、157至179、158至179、159至179、160至179、161至179、162至179、163至179、164至179、165至179、166至179、167至179、168至179、169至179、170至179、171至179、172至179、173至179、174至179、175至179、176至179、177至179或178至179。
可替代地，任何具有跨膜结构域的蛋白，如由CD命名法所提供的，可用作本发明的抗原结合受体蛋白的锚定跨膜结构域。
在一些实施例中，锚定跨膜结构域包含由以下项组成的组的任意一个的跨膜结构域：CD27(SEQ ID NO:59，由SEQ ID NO:58编码)、CD137(SEQ ID NO:67，由SEQ ID NO:66编码)、OX40(SEQ ID NO:71，由SEQ ID NO:70编码)、ICOS(SEQ ID NO:75，由SEQ ID NO:74编码)、DAP10(SEQ ID NO:80，由SEQ ID NO:79编码)、DAP12(SEQ ID NO:83，由SEQ ID NO:82编码)、CD3z(SEQ ID NO:88，由SEQ ID NO:87编码)、FCGR3A(SEQ ID NO:90，由SEQ ID NO:91编码)、NKG2D(SEQ ID NO:94，由SEQ ID NO:95编码)、CD8(SEQ ID NO:123，由SEQ ID NO:124编码)，或其保留将抗原结合受体锚定到膜上的能力的跨膜片段。
人序列在共同发明的背景下可能是有益的，例如因为锚定跨膜结构域的(部分)可能可从细胞外空间进入，并因此进入患者的免疫***。在一个优选的实施例中，锚定跨膜结构域包含人序列。在此类实施例中，锚定跨膜结构域包含由以下项组成的组的任意一个的跨膜结构域：人CD27(SEQ ID NO:57，由SEQ ID NO:56编码)、人CD137(SEQ ID NO:65，由SEQID NO:64编码)、人OX40(SEQ ID NO:69，由SEQ ID NO:68编码)、人ICOS(SEQ ID NO:73，由SEQ ID NO:72编码)、人DAP10(SEQ ID NO:78，由SEQ ID NO:77编码)、人DAP12(SEQ ID NO:81，由SEQ ID NO:80编码)、人CD3z(SEQ ID NO:86，由SEQ ID NO:85编码)、人FCGR3A(SEQID NO:88，由SEQ ID NO:89编码)、人NKG2D(SEQ ID NO:92，由SEQ ID NO:93编码)、人CD8(SEQ ID NO:121，由SEQ ID NO:122编码)，或其保留将抗原结合受体锚定到膜上的能力的跨膜片段。
刺激信号传导结构域(SSD)和共刺激信号传导结构域(CSD)
优选地，抗原结合受体包含至少一个刺激信号传导结构域和/或至少一个共刺激信号传导结构域。因此，本文提供的抗原结合受体优选地包含提供T细胞活化的刺激信号传导结构域。本文提供的抗原结合受体可以包含刺激信号传导结构域，其是鼠/小鼠或人CD3z(人CD3z的UniProt条目为P20963(版本号177，序列号2)；鼠/小鼠CD3z的UniProt条目为P24161(主要可引用登录号)或Q9D3G3(辅助可引用登录号)，版本号143，序列号1)、Fcgr3A(人FCGR3A的UniProt条目为P08637(版本号178，序列号2))或NKG2D(人NKG2D的UniProt条目为P26718(版本号151，序列号1)；鼠/小鼠NKG2D的UniProt条目为O54709(版本号132，序列号2))的片段/多肽部分。
因此，在本文提供的抗原结合受体中包含的刺激信号传导结构域可以是全长CD3z、Fcgr3A或NKG2D的片段/多肽部分。鼠/小鼠全长CD3z或NKG2D的氨基酸序列在本文中示为SEQ ID NO:86(CD3z)、90(Fcgr3A)或94(NKG2D)(鼠/小鼠如由SEQ ID NO:87(CD3z)、91(FCGR3A)或95(NKG2D)所示的DNA序列编码)。人全长CD3z、Fcgr3A或NKG2D的氨基酸序列在本文中示为SEQ ID NO:84(CD3z)、88(FCGR3A)或92(NKG2D)(人如由SEQ ID NO:85(CD3z)、89(FCGR3A)或93(NKG2D)所示的DNA序列编码)。本发明的抗原结合受体可以包含CD3z、Fcgr3A或NKG2D的片段作为刺激结构域，前提条件是包括至少一个信号传导结构域。特别地，只要包含至少一个信号传导动机，CD3z、Fcgr3A或NKG2D的任何部分/片段都适合作为刺激结构域。然而，更优选地，本发明的抗原结合受体包含源自人源的多肽。因此，更优选地，本文提供的抗原结合受体包含如本文显示为SEQ ID NO:84(CD3z)、88(FCGR3A)或92(NKG2D)的氨基酸序列(人如由SEQ ID NO:85(CD3z)、89(FCGR3A)或93(NKG2D)所示的DNA序列编码)。在一个实施例中，本发明的抗原结合受体可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:26所示的DNA序列编码)或由其组成。在其他实施例中，抗原结合受体包含SEQ ID NO:13所示的序列或与SEQ ID NO:13相比具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30个取代、缺失或***并且其特征在于具有刺激信号传导活性的序列。下文以及实例和附图中提供了包含刺激信号传导结构域(SSD)的抗原结合受体的特定构型。可以确定刺激信号传导活性；例如，通过ELISA(IL-2、IFNγ、TNFα)测量的细胞因子释放增加，增殖活性增加(通过增加的细胞数测量)，或通过LDH释放测定测量的裂解活性增加。
此外，本文提供的抗原结合受体优选包含至少一个共刺激信号传导结构域，其为T细胞提供额外的活性。本文提供的抗原结合受体可以包含共刺激信号传导结构域，其是鼠/小鼠或人CD28(人CD28的UniProt条目为P10747(版本号173，序列号1)；鼠/小鼠CD28的UniProt条目为P31041(版本号134，序列号2))、CD137(人CD137的UniProt条目为Q07011(版本号145，序列号1)；鼠/小鼠CD137的UniProt条目为P20334(版本号139，序列号1))、OX40(人OX40的UniProt条目为P23510(版本号138，序列号1)；鼠/小鼠OX40的UniProt条目为P43488(版本号119，序列号1))、ICOS(人ICOS的UniProt条目为Q9Y6W8(版本号126，序列号1)；鼠/小鼠ICOS的UniProt条目为Q9WV40(主要可引用登录号)或Q9JL17(辅助可引用登录号)，版本号102，序列号2)、CD27(人CD27的UniProt条目为P26842(版本号160，序列号2)；鼠/小鼠CD27的UniProt条目为P41272(版本号137，序列号1))、4-1-BB(鼠/小鼠4-1-BB的UniProt条目为P20334(版本号140，序列号1)；人4-1-BB的UniProt条目为Q07011(版本号146，序列号))、DAP10(人DAP10的UniProt条目为Q9UBJ5(版本号25，序列号1)；鼠/小鼠DAP10的UniProt条目为Q9QUJ0(主要可引用登录号)或Q9R1E7(辅助可引用登录号)，版本号101，序列号1)或DAP12(人DAP12的UniProt条目为O43914(版本号146，序列号1)；鼠/小鼠DAP12的UniProt条目为O054885(主要可引用登录号)或Q9R1E7(辅助可引用登录号)，版本号123，序列号1)的片段/多肽部分。在本发明的某些实施例中，本发明的抗原结合受体可以包含本文定义的一个或多个，即1、2、3、4、5、6或7个共刺激信号传导结构域。因此，在本发明的背景中，本发明的抗原结合受体可以包含鼠/小鼠或优选人CD137的片段/多肽部分作为第一共刺激信号传导结构域，并且第二共刺激信号传导结构域选自由鼠/小鼠或优选人CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10和DAP12或其片段组成的组。优选地，本发明的抗原结合受体包含源自人源的共刺激信号传导结构域。因此，更优选地，包含在本发明的抗原结合受体中的一个或多个共刺激信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:25所示的DNA序列编码)或由其组成。
因此，可以任选地包含在本文提供的抗原结合受体中的共刺激信号传导结构域是全长CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10或DAP12的片段/多肽部分。鼠/小鼠全长CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、CD27、DAP10和DAP12的氨基酸序列在本文中示为SEQ ID NO:59(CD27)、63(CD28)、67(CD137)、71(OX40)、75(ICOS)、79(DAP10)或83(DAP12)(鼠/小鼠如由SEQ ID NO:58(CD27)、62(CD28)、66(CD137)、70(OX40)、74(ICOS)、78(DAP10)或82(DAP12)中所示的DNA序列编码)。然而，由于在本发明的背景中，人序列是最优选的，因此可以任选地包含在本文提供的抗原结合受体蛋白中的共刺激信号传导结构域是人全长CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10或DAP12的片段/多肽部分。人全长CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10或DAP12的氨基酸序列在本文中显示为SEQ ID NO:57(CD27)、61(CD28)、65(CD137)、69(OX40)、73(ICOS)、77(DAP10)或81(DAP12)(人如由SEQ ID NO:56(CD27)、60(CD28)、64(CD137)、68(OX40)、72(ICOS)、76(DAP10)或80(DAP12)所示的DNA序列编码)。
在一个优选的实施例中，抗原结合受体包含CD28或其片段作为共刺激信号传导结构域。本文提供的抗原结合受体可以包含CD28的片段作为共刺激信号传导结构域，前提条件是包括至少一个CD28的信号传导结构域。特别地，只要包含CD28的至少一种信号传导动机，则CD28的任何部分/片段均适用于本发明的抗原结合受体。共刺激信号传导结构域PYAP(CD28的AA 208至211)和YMNM(CD28的AA 191至194)对于CD28多肽的功能和上文列举的功能作用是有益的。YMNM结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:96中示出；PYAP结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:97中示出。因此，在本发明的抗原结合受体中，CD28多肽优选地包含的序列源自具有序列YMNM(SEQ ID NO:96)和/或PYAP(SEQ ID NO:97)的CD28多肽的细胞内结构域。在其他实施例中，在本发明的抗原结合受体中，这些结构域中的一个或两个分别突变为FMNM(SEQ ID NO:98)和/或AYAA(SEQ ID NO:99)。这些突变中的任一个都降低了包含抗原结合受体的转导细胞释放细胞因子的能力而不影响其增殖能力，并且可以有利地用于延长活力并因此延长转导细胞的治疗潜力。或者，换句话说，这种非功能性突变优选地增强了体内用本文提供的抗原结合受体转导的细胞的持久性。然而，这些信号传导动机可以存在于本文提供的抗原结合受体的细胞内结构域内的任何位点。
在另一个优选的实施例中，抗原结合受体包含CD137或其片段作为共刺激信号传导结构域。本文提供的抗原结合受体可以包含CD137的片段作为共刺激信号传导结构域，前提条件是包括至少一个CD137的信号传导结构域。特别地，只要包含CD137的至少一种信号传导动机，则CD137的任何部分/片段均适用于本发明的抗原结合受体。在一个优选的实施例中，包含在本发明的抗原结合受体蛋白中的CD137多肽包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:25所示的DNA序列编码)或由其组成。
下文以及实例和附图中提供了包含共刺激信号传导结构域(CSD)的抗原结合受体的特定构型。可以确定共刺激信号传导活性；例如，通过ELISA(IL-2、IFNγ、TNFα)测量的细胞因子释放增加，增殖活性增加(通过增加的细胞数测量)，或通过LDH释放测定测量的裂解活性增加。如上所述，在本发明的一个实施例中，抗原结合受体的共刺激信号传导结构域可源自人CD28和/或CD137基因T细胞活性，定义为本文所述的转导细胞，如转导的T细胞的细胞因子产生、增殖和裂解活性。CD28和/或CD137活性的测量方式可以是ELISA释放细胞因子或细胞因子流式细胞术(诸如干扰素-γ(IFN-□□)或白介素2(IL-2))、T细胞增殖测量例如通过ki67测量、通过流式细胞术进行细胞量化或通过靶细胞实时阻抗测量评定裂解活性(通过使用例如ICELLligence仪器，如在例如Thakur等人，Biosens Bioelectron.35(1)(2012),503-506；Krutzik等人，Methods Mol Biol.699(2011),179-202；Ekkens等人，Infect Immun.75(5)(2007),2291-2296；Ge等人，Proc Natl Acad Sci U S A.99(5)(2002),2983-2988；Düwell等人，Cell Death Differ.21(12)(2014),1825-1837,勘误表：Cell Death Differ.21(12)(2014),161中所述)。
接头和信号肽
此外，本文提供的抗原结合受体可包含至少一个接头(或“间隔物”)。接头通常是长度最多为20个氨基酸的肽。因此，在本发明的背景中，接头的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。例如，本文提供的抗原结合受体可以包含位于包含至少一个能够与突变的Fc结构域特异性结合的抗原结合部分的细胞外结构域、锚定跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和/或刺激信号传导结构域之间的接头。此外，本文提供的抗原结合受体可以包含抗原结合部分中的接头，特别是在抗原结合部分的免疫球蛋白结构域之间(诸如在scFv的VH结构域和VL结构域之间)。此类接头的优点是它们增加了抗原结合受体的不同多肽(即包含至少一个抗原结合部分的细胞外结构域、锚定跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和/或刺激信号传导结构域)独立折叠并按预期运行的可能性。因此，在本发明的背景中，包含至少一个抗原结合部分的细胞外结构域、锚定跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和刺激信号传导结构域可以包含在单链多功能多肽中。单链融合构建体例如可由一种或多种多肽组成，所述一种或多种多肽包含含有至少一个抗原结合部分的一个或多个细胞外结构域、一个或多个锚定跨膜结构域、一个或多个共刺激信号传导结构域和/或一个或多个刺激信号传导结构域。因此，抗原结合部分、锚定跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和刺激信号传导结构域可通过如本文所述的一个或多个相同或不同的肽接头连接。例如，在本文提供的抗原结合受体中，包含至少一个抗原结合部分的细胞外结构域与锚定跨膜结构域之间的接头可以包含如SEQ ID NO:17所示的氨基和氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，抗原结合部分和锚定跨膜结构域之间的接头包含如SEQID NO:19所示的氨基和氨基酸序列或由其组成。因此，锚定跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和/或刺激信号传导结构域可通过肽接头或替代地通过结构域的直接融合而彼此连接。
在优选的实施例中，根据本发明，包含在细胞外结构域中的抗原结合部分是单链可变片段(scFv)，其是抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合蛋白，与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或反之亦然。在一个优选的实施例中，接头连接VL结构域的N末端与VH结构域的C末端。例如，在本文提供的抗原结合受体中，接头可具有如SEQ ID NO:16所示的氨基和氨基酸序列。scFv抗体，例如在Houston,J.S.,Methods in Enzymol 203(1991)46-96)中有所描述。
在一些实施例中，根据本发明，包含在细胞外结构域中的抗原结合部分是“单链Fab片段”或“scFab”，其是由重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是至少30个氨基酸，优选是32个至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。
本文提供的抗原结合受体或其部分可包含信号肽。此类信号肽会将蛋白带到T细胞膜的表面。例如，在本文提供的抗原结合受体中，信号肽可以具有如SEQ ID NO:100所示的氨基和氨基酸序列(如由SEQ ID NO:101所示的DNA序列编码)。
抗原结合受体的特定构型
本文所述的抗原结合受体的组分可以以多种构型彼此融合以生成T细胞活化抗原结合受体。
在一些实施例中，抗原结合受体包含由连接至锚定跨膜结构域的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)构成的细胞外结构域。在优选的实施例中，VH结构域任选地通过肽接头在C末端与VL结构域的N末端融合。在其他实施例中，抗原结合受体进一步包含刺激信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一个特定的此类实施例中，抗原结合受体基本上由VH结构域和VL结构域、锚定跨膜结构域以及任选地由一个或多个肽接头连接的刺激信号传导结构域组成，其中VH结构域在C末端与VL结构域的N末端融合，而VL结构域在C末端与锚定跨膜结构域的N末端融合，其中锚定跨膜结构域在C末端与刺激信号传导结构域的N末端融合。任选地，抗原结合受体进一步包含共刺激信号传导结构域。在一个此类特定实施例中，抗原结合受体基本上由VH结构域和VL结构域、锚定跨膜结构域、以及由一个或多个肽接头连接的刺激信号传导结构域和共刺激信号传导结构域组成，其中VH结构域在C末端与VL结构域的N末端融合，而VL结构域在C末端与锚定跨膜结构域的N末端融合，其中锚定跨膜结构域在C末端与刺激信号传导结构域的N末端融合，其中刺激信号传导结构域在C末端与共刺激信号传导结构域的N末端融合。在一个替代实施例中，共刺激信号传导结构域连接至锚定跨膜结构域而不是刺激信号传导结构域。在一个优选实施例中，抗原结合受体基本上由VH结构域和VL结构域、锚定跨膜结构域、以及由一个或多个肽接头连接的共刺激信号传导结构域和刺激信号传导结构域组成，其中VH结构域在C末端与VL结构域的N末端融合，而VL结构域在C末端与锚定跨膜结构域的N末端融合，其中锚定跨膜结构域在C末端与共刺激信号传导结构域的N末端融合，其中共刺激信号传导结构域在C末端与刺激信号传导结构域的N末端融合。
抗原结合部分、锚定跨膜结构域、刺激信号传导和/或共刺激信号传导结构域可以直接或通过一个或多个肽接头彼此融合，该肽接头包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常是1至10之间的数字，通常是2至4之间。用于连接抗原结合部分和锚定跨膜部分的优选肽接头是根据SEQ ID NO 17的GGGGS(G4S)。用于连接抗原结合部分和锚定跨膜部分的另一个优选的肽接头是根据SEQ ID NO19的KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(CD8茎)。适用于连接可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)的示例性肽接头是根据SEQ ID NO 16的GGGSGGGSGGGSGGGS(G4S)4。
另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在抗原结合部分与锚定跨膜结构域的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
如本文所述，本发明的抗原结合受体包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含至少一个抗原结合部分。具有能够与靶细胞抗原特异性结合的单个抗原结合部分的抗原结合受体是有用的和优选的，特别是在需要高表达抗原结合受体的情况下。在这种情况下，存在超过一个对靶细胞抗原特异的抗原结合部分可能会限制抗原结合受体的表达功效。然而，在其他情况下，具有包含两个或更多个对靶细胞抗原特异的抗原结合部分的抗原结合受体将是有利的，例如为优化靶向靶位点或允许靶细胞抗原交联。
在一个特定的实施例中，抗原结合受体包含一个抗原结合部分，该部分能够特异性结合突变的Fc结构域，特别是IgG1 Fc结构域，其包含P329G突变(根据EU编号)。在一个实施例中，能够与突变的Fc结构域特异性结合但不能与非突变亲本Fc结构域特异性结合的抗原结合部分是scFv。
在一个实施例中，抗原结合部分在scFv片段的C末端与锚定跨膜结构域的N末端融合，任选地通过肽接头融合。在一个实施例中，肽接头包含氨基酸序列KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:19)。在一个实施例中，锚定跨膜结构域为跨膜结构域，该跨膜结构域为选自由以下项组成的组的跨膜结构域：CD8、CD4、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10或DAP12跨膜结构域或其片段。在一个优选的实施例中，锚定跨膜结构域是CD8跨膜结构域或其片段。在特定的实施例中，锚定跨膜结构域包含IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列或由组成。在一个实施例中，抗原结合受体进一步包含共刺激信号传导结构域(CSD)。在一个实施例中，抗原结合受体的锚定跨膜结构域在C末端与共刺激信号传导结构域的N末端融合。在一个实施例中，共刺激信号传导结构域单独地选自由以下项组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10和DAP12的细胞内结构域，或其片段，如前文所述。在一个优选的实施例中，共刺激信号传导结构域是CD28的细胞内结构域或其片段。在一个优选的实施例中，共刺激信号传导结构域包含CD28的细胞内结构域或其保留CD28信号传导的片段。在另一个优选的实施例中，共刺激信号传导结构域包含CD137的细胞内结构域或其保留CD137信号传导的片段。在一个特定的实施例中，共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:12或由其组成。在一个实施例中，抗原结合受体进一步包含刺激信号传导结构域。在一个实施例中，抗原结合受体的共刺激信号传导结构域在C末端与刺激信号传导结构域的N末端融合。在一个实施例中，至少一个刺激信号传导结构域单独地选自由CD3z、FCGR3A和NKG2D组成的组的细胞内结构域或其片段。在一个优选的实施例中，共刺激信号传导结构域是CD3z的细胞内结构域或其保留CD3z信号传导的片段。在一个特定的实施例中，共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:13或由其组成。
在一个实施例中，抗原结合受体与报告蛋白融合，特别是与GFP或其增强类似物融合。在一个实施例中，抗原结合受体在C末端与eGFP(增强型绿色荧光蛋白)的N末端融合，任选地通过本文所述的肽接头。在一个优选的实施例中，肽接头是根据SEQ ID NO:18的GEGRGSLLTCGDVEENPGP(T2A)。
在一个具体实施例中，抗原结合受体包含锚定跨膜结构域和包含至少一个抗原结合部分的细胞外结构域，其中至少一个抗原结合部分是能够与突变的Fc结构域特异性结合但不能与非突变亲本Fc结构域特异性结合的scFv，其中突变的Fc结构域包含P329G突变(根据EU编号)。P329G突变减少了Fcγ受体结合。在一个实施例中，本发明的抗原结合受体包含锚定跨膜结构域(ATD)、共刺激信号传导结构域(CSD)和刺激信号传导结构域(SSD)。在一个此类实施例中，抗原结合受体具有构型scFv-ATD-CSD-SSD。在一个优选的实施例中，抗原结合受体具有构型VH-VL-ATD-CSD-SSD。在一个更具体的此类实施例中，抗原结合受体具有构型VH-接头-VL-接头-ATD-CSD-SSD。
在一个具体实施例中，抗原结合部分是能够与包含P329G突变的突变的Fc结构域特异性结合的scFv，其中抗原结合部分包含至少一个选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的轻链CDR。
在另一个具体实施例中，抗原结合部分是能够与包含P329G突变的突变的Fc结构域特异性结合的scFv，其中抗原结合部分包含至少一个选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:3组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6的轻链CDR。
在一个优选的实施例中，抗原结合部分是能够与包含P329G突变的突变的Fc结构域特异性结合的scFv，其中抗原结合部分包含互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQID NO:1)、CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:2)、CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)、轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ IDNO:4)、CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)和CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ IDNO:6)。
在一个优选的实施例中，抗原结合受体从N末端到C末端依次包含：
(i)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(CDR)1、SEQ IDNO:2的重链CDR 2、SEQ ID NO:3的重链CDR 3，
(ii)肽接头，特别是SEQ ID NO:16的肽接头，
(iii)轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:4的轻链CDR 1、SEQ ID NO:5的轻链CDR 2和SEQ ID NO:6的轻链CDR 3，
(iv)肽接头，特别是SEQ ID NO:19的肽接头，
(v)锚定跨膜结构域，特别是SEQ ID NO:11的锚定跨膜结构域，
(vi)共刺激信号传导结构域，特别是SEQ ID NO:12的共刺激信号传导结构域，和
(vii)刺激信号传导结构域，特别是SEQ ID NO:13的刺激信号传导结构域。
在一个实施例中，抗原结合受体从N末端到C末端依次包含：
(i)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(CDR)1、SEQ IDNO:40的重链CDR 2、SEQ ID NO:3的重链CDR 3，
(ii)肽接头，特别是SEQ ID NO:16的肽接头，
(iii)轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:4的轻链CDR 1、SEQ ID NO:5的轻链CDR 2和SEQ ID NO:6的轻链CDR 3，
(iv)肽接头，特别是SEQ ID NO:19的肽接头，
(v)锚定跨膜结构域，特别是SEQ ID NO:11的锚定跨膜结构域，
(vi)共刺激信号传导结构域，特别是SEQ ID NO:12的共刺激信号传导结构域，和
(vii)刺激信号传导结构域，特别是SEQ ID NO:13的刺激信号传导结构域。
在一个实施例中，抗原结合受体从N末端到C末端依次包含：
(i)重链可变结构域(VH)，
(ii)肽接头，特别是SEQ ID NO:16的肽接头，
(iii)轻链可变结构域(VL)，其与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
其中VH结构域和VL结构域能够形成抗原结合部分，其结合包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的Fc结构域，
(iv)肽接头，特别是SEQ ID NO:19的肽接头，
(v)锚定跨膜结构域，特别是与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的锚定跨膜结构域，
(vi)共刺激信号传导结构域，特别是与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的共刺激信号传导结构域，和
(vii)刺激信号传导结构域，特别是与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的刺激信号传导结构域。
在一个实施例中，抗原结合受体从N末端到C末端依次包含：
(i)重链可变结构域(VH)，其与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)肽接头，特别是SEQ ID NO:16的肽接头，
(iii)轻链可变结构域(VL)，其与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iv)肽接头，特别是SEQ ID NO:19的肽接头，
(v)锚定跨膜结构域，特别是与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的锚定跨膜结构域，
(vi)共刺激信号传导结构域，特别是与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的共刺激信号传导结构域，和
(vii)刺激信号传导结构域，特别是与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的刺激信号传导结构域。
在一个实施例中，抗原结合受体从N末端到C末端依次包含：
(i)重链可变结构域(VH)，其与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)肽接头，特别是SEQ ID NO:16的肽接头，
(iii)轻链可变结构域(VL)，其与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iv)肽接头，特别是SEQ ID NO:19的肽接头，
(v)锚定跨膜结构域，特别是与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的锚定跨膜结构域，
(vi)共刺激信号传导结构域，特别是与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的共刺激信号传导结构域，和
(vii)刺激信号传导结构域，特别是与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的刺激信号传导结构域。
在一个实施例中，抗原结合受体从N末端到C末端依次包含：
(i)重链可变结构域(VH)，其与SEQ ID NO:44的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)肽接头，特别是SEQ ID NO:16的肽接头，
(iii)轻链可变结构域(VL)，其与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iv)肽接头，特别是SEQ ID NO:19的肽接头，
(v)锚定跨膜结构域，特别是与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的锚定跨膜结构域，
(vi)共刺激信号传导结构域，特别是与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的共刺激信号传导结构域，和
(vii)刺激信号传导结构域，特别是与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的刺激信号传导结构域。
在一个实施例中，抗原结合受体包含与以下氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:7。在一个实施例中，抗原结合受体包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:7。
在一个实施例中，抗原结合受体包含与以下氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:125。在一个实施例中，抗原结合受体包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:125。
在一个实施例中，抗原结合受体包含与以下氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:127。在一个实施例中，提供了抗原结合受体，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:127。
在一个实施例中，抗原结合受体与报告蛋白融合，特别是与GFP或其增强类似物融合。在一个实施例中，抗原结合受体在C末端与eGFP(增强型绿色荧光蛋白)的N末端融合，任选地通过本文所述的肽接头。在一个优选的实施例中，肽接头是SEQ ID NO:18的GEGRGSLLTCGDVEENPGP(T2A)。
能够表达抗原结合受体的转导的细胞
本发明的进一步方面是能够表达本文所述的抗原结合受体的转导的T细胞。这些抗原结合受体涉及天然不包含在T细胞中和/或T细胞表面上并且不在正常(非转导)T细胞中或T细胞上(内源性)表达的分子。因此，在T细胞中和/或T细胞上的抗原结合受体是人工引入到T细胞中。在本发明的背景中，所述T细胞，优选CD8+T细胞，可以从如本文定义的待治疗的受试者中分离/获得。因此，人工引入并随后呈递在所述T细胞中和/或所述T细胞表面上的如本文所述的抗原结合受体包含含有一个或多个可接近(体外或体内)(Ig衍生的)免疫球蛋白(优选抗体，特别是抗体的Fc结构域)的抗原结合部分的结构域。在本发明的背景中，这些人工引入的分子在如下文所述的(逆转录病毒、慢病毒或非病毒)转导后呈递于所述T细胞中和/或所述T细胞表面上。因此，在转导之后，根据本发明的T细胞可以被免疫球蛋白(优选地包含如本文所述的Fc结构域中的特定突变的抗体，且在靶细胞存在下)活化。
本发明还涉及表达抗原结合受体的转导的T细胞，所述抗原结合受体由(a)编码本发明的抗原结合受体的一种或多种核酸分子编码。因此，在本发明的背景中，转导细胞可以包含编码本发明的抗原结合受体的核酸分子或表达本发明的抗原结合受体的本发明的载体。
在本发明的背景中，术语“转导的T细胞”涉及基因修饰的T细胞(即其中故意引入了核酸分子的T细胞)。本文提供的转导的T细胞可以包含本发明的载体。优选地，本文提供的转导的T细胞包含编码本发明的抗原结合受体和/或本发明的载体的核酸分子。本发明的转导的T细胞可以是瞬时或稳定表达外源DNA(即已引入T细胞的核酸分子)的T细胞。特别地，可以通过使用逆转录病毒或慢病毒转导将编码本发明的抗原结合受体的核酸分子稳定地整合到T细胞的基因组中。通过使用mRNA转染，可以瞬时表达编码本发明的抗原结合受体的核酸分子。优选地，本文提供的转导的T细胞已经通过病毒载体(例如，逆转录病毒载体或慢病毒载体)在T细胞中引入核酸分子而被遗传修饰。因此，抗原结合受体的表达可以是组成型的，并且抗原结合受体的细胞外结构域可以在细胞表面上检测到。抗原结合受体的该细胞外结构域可包含本文所定义的抗原结合受体的完整细胞外结构域，但也可包含其一部分。所需的最小大小是抗原结合受体中抗原结合部分的抗原结合位点。
在抗原结合受体在诱导型或抑制型启动子的控制下被引入T细胞的情况下，表达也可以是有条件的或可诱导的。这种诱导型或抑制型启动子的实例可以是包含醇脱氢酶I(alcA)基因启动子和反式活化蛋白AlcR的转录***。不同的基于农业酒精的配方用于控制与alcA启动子相连的目标基因的表达。此外，四环素反应启动子***可以在通过四环素存在的情况下活化或抑制基因表达***来起作用。该***的一些元件包括四环素阻遏蛋白(TetR)、四环素操纵子序列(tetO)和四环素反式活化因子融合蛋白(tTA)，后者是TetR与单纯疱疹病毒蛋白16(VP16)活化序列的融合。此外，可以使用类固醇应答启动子、金属调节或发病机制相关(PR)蛋白相关启动子。
取决于所使用的***，表达可以是组成性的或构成性的。本发明的抗原结合受体可以在本文提供的转导的T细胞的表面上表达。抗原结合受体的细胞外部分(即抗原结合受体的细胞外结构域)能够在细胞表面上检测到，而细胞内部分(即一个或多个共刺激信号传导结构域和刺激信号传导结构域)不能在细胞表面上检测到。抗原结合受体的细胞外结构域的检测可以通过使用与该细胞外结构域特异性结合的抗体或细胞外结构域能够结合的突变的Fc结构域来进行。可以使用这些抗体或Fc结构域通过流式细胞术或显微镜检术检测细胞外结构域。
其他细胞也可以用本发明的抗原结合受体转导，从而直接针对靶细胞。这些其他细胞包括但不限于B细胞、自然杀伤(NK)细胞、先天性淋巴样细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞或中性粒细胞。优选地，所述免疫细胞是淋巴细胞。在白细胞表面上触发本发明的抗原结合受体将使细胞与包含异二聚体Fc结构域的抗体一起对靶细胞产生细胞毒性，而不管细胞起源于哪个谱系。与为抗原结合受体选择的刺激信号传导结构域或共刺激信号传导结构域无关，并且不依赖于其他细胞因子的外源供应，都将产生细胞毒性。因此，本发明的转导细胞可以是例如CD4+T细胞、CD8+-T细胞、γδT细胞、自然杀伤(NK)T细胞、自然杀伤(NK)细胞、肿瘤-浸润淋巴细胞(TIL)细胞、骨髓细胞或间充质干细胞。优选地，本文提供的转导细胞是T细胞(例如自体T细胞)，更优选地，转导细胞是CD8+T细胞。因此，在本发明的背景中，转导细胞是CD8+T细胞。进一步，在本发明的背景中，转导细胞是自体T细胞。因此，在本发明的背景中，转导细胞优选是自体CD8+T细胞。除了使用从受试者分离的自体细胞(例如T细胞)外，本发明还包括使用同种异体细胞。因此，在本发明的背景中，转导细胞也可以是同种异体细胞，例如同种异体CD8+T细胞。术语同种异体是指来自不相关的供体个体/受试者的细胞，其是与将由例如本文描述的表达抗原结合受体的转导细胞治疗的个体/受试者相容的人白细胞抗原(HLA)。自体细胞是指如上文所述从待用本文所述的转导细胞治疗的受试者分离/获得的细胞。
本发明的转导细胞可与其他核酸分子例如与编码细胞因子的核酸分子共转导。
本发明还涉及用于产生表达本发明的抗原结合受体的转导的T细胞的方法，包括以下步骤：用本发明的载体转导的T细胞，在允许以下条件下培养转导的T细胞：在所述转导细胞中或表面表达抗原结合受体并回收所述转导的T细胞。
在本发明的背景中，本发明的转导细胞优选通过从受试者(优选人类患者)分离细胞(例如，T细胞，优选CD8+T细胞)来产生。从患者或供体中分离/获得细胞(例如T细胞，优选CD8+T细胞)的方法在本领域和本发明中来自患者或供体的细胞(例如T细胞，优选CD8+T细胞)中是众所周知的，例如可以通过抽血或去除骨髓来分离细胞。在分离/获得细胞作为患者样品后，细胞(例如T细胞)与样品的其他成分分离。从样品中分离细胞(例如T细胞)的几种方法是已知的，包括但不限于，例如用于从患者或供体的外周血样品中获取细胞的白细胞分离术，通过使用FACS细胞分选仪分离/获取细胞。随后培养和扩增分离/获得的细胞T细胞，例如，通过使用抗CD3抗体、通过使用抗CD3和抗CD28单克隆抗体和/或通过使用抗CD3抗体、抗CD28抗体和白介素2(IL-2)(参见，例如，Dudley,Immunother.26(2003),332-342或Dudley,Clin.Oncol.26(2008),5233-5239)。
在随后的步骤中，通过本领域已知的方法人工/遗传修饰/转导细胞(例如T细胞)(参见，例如，Lemoine,J Gene Med 6(2004),374-386)。用于转导细胞(例如T细胞)的方法是本领域已知的并且包括但不限于在其中转导核酸或重组核酸的情况下的例如电穿孔法、磷酸钙法、阳离子脂质法或脂质体法。待转导的核酸可通过使用市售的转染试剂例如Lipofectamine(Invitrogen制造，目录号：11668027)常规且高效地转导。在使用载体的情况下，可以以与上述核酸相同的方式转导该载体，只要该载体是质粒载体(即不是病毒载体的载体)在本发明的背景中，用于转导细胞(例如T细胞)的方法包括逆转录病毒或慢病毒T细胞转导、非病毒载体(如睡美人微环载体)以及mRNA转染。“mRNA转染”是指本领域技术人员熟知的在待转导的细胞中瞬时表达目标蛋白质(如在本例中为本发明的抗原结合受体)的方法。简而言之，可以通过使用电穿孔***(诸如例如Gene Pulser、Bio-Rad)用编码本发明的抗原结合受体的mRNA对细胞进行电穿孔，然后通过如上所述的标准细胞(例如T细胞)培养方案进行培养(参见Zhao等人，Mol Ther.13(1)(2006),151–159)。本发明的转导细胞可以通过慢病毒或最优选逆转录病毒转导产生。
在这种情况下，用于转导细胞的合适的逆转录病毒载体是本领域已知的，诸如SAMEN CMV/SRa(Clay等人，J.Immunol.163(1999),507-513)、LZRS-id3-IHRES(Heemskerk等人，J.Exp.Med.186(1997),1597-1602)、FeLV(Neil等人，Nature 308(1984),814-820)、SAX(Kantoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986),6563-6567)、pDOL(Desiderio,J.Exp.Med.167(1988),372-388)、N2(Kasid等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990),473-477)、LNL6(Tiberghien等人，Blood 84(1994),1333-1341)、pZipNEO(Chen等人，J.Immunol.153(1994),3630-3638)、LASN(Mullen等人，Hum.Gene Ther.7(1996),1123-1129)、pG1XsNa(Taylor等人，J.Exp.Med.184(1996),2031-2036)、LCNX(Sun等人，Hum.GeneTher.8(1997),1041-1048)、SFG(Gallardo等人，Blood 90(1997)和LXSN(Sun等人，Hum.Gene Ther.8(1997),1041-1048)、SFG(Gallardo等人，Blood 90(1997),952-957)、HMB-Hb-Hu(Vieillard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997),11595-11600)、pMV7(Cochlovius等人，Cancer Immunol.Immunother.46(1998),61-66)、pSTITCH(Weitjens等人，Gene Ther 5(1998),1195-1203)、pLZR(Yang等人，Hum.Gene Ther.10(1999),123-132)、pBAG(Wu等人，Hum.Gene Ther.10(1999),977-982)、rKat.43.267bn(Gilham等人，J.Immunother.25(2002),139-151)、pLGSN(Engels等人，Hum.Gene Ther.14(2003),1155-1168)、pMP71(Engels等人，Hum.Gene Ther.14(2003),1155-1168)、pGCSAM(Morgan等人，J.Immunol.171(2003),3287-3295)、pMSGV(Zhao等人，J.Immunol.174(2005),4415-4423)或pMX(de Witte等人，J.Immunol.181(2008),5128-5136)。在本发明的背景中，用于转导细胞(例如T细胞)的合适的慢病毒载体是例如PL-SIN慢病毒载体(Hotta等人，Nat Methods.6(5)(2009),370-376)、p156RRL-sinPPT-CMV-GFP-PRE/NheI(Campeau等人，PLoS One 4(8)(2009),e6529)、pCMVR8.74(Addgene Catalogoue No.:22036)、FUGW(Lois等人，Science295(5556)(2002),868-872、pLVX-EF1(Addgene Catalogue No.:64368)、pLVE(Brunger等人，Proc Natl Acad Sci U S A 111(9)(2014),E798-806)、pCDH1-MCS1-EF1(Hu等人，MolCancer Res.7(11)(2009),1756-1770)、pSLIK(Wang等人，Nat Cell Biol.16(4)(2014),345-356)、pLJM1(Solomon等人，Nat Genet.45(12)(2013),1428-30)、pLX302(Kang等人，Sci Signal.6(287)(2013),rs13)、pHR-IG(Xie等人，J Cereb Blood Flow Metab.33(12)(2013),1875-85)、pRRLSIN(Addgene Catalogoue No.:62053)、pLS(Miyoshi等人，JVirol.72(10)(1998),8150-8157)、pLL3.7(Lazebnik等人，J Biol Chem.283(7)(2008),11078-82)、FRIG(Raissi等人，Mol Cell Neurosci.57(2013),23-32)、pWPT(Ritz-Laser等人，Diabetologia.46(6)(2003),810-821)、pBOB(Marr等人，J Mol Neurosci.22(1-2)(2004),5-11)或pLEX(Addgene Catalogue No.:27976)。
本发明的转导细胞优选在其自然环境之外的受控条件下生长。特别地，术语“培养”是指源自多细胞真核生物(优选来自人类患者)的细胞(例如本发明的一种或多种转导细胞)在体外生长。培养细胞是一种使与其原始组织来源分开的细胞保持活力的实验室技术。在本文中，在允许本发明的抗原结合受体在所述转导细胞中或所述转导细胞上表达的条件下培养本发明的转导细胞。允许表达或转基因(即本发明的抗原结合受体的)的条件是本领域公知的并且包括例如激动性抗CD3抗体和抗CD28抗体和添加细胞因子诸如白介素2(IL-2)、白介素7(IL-7)、白介素12(IL-12)和/或白介素15(IL-15)。在培养的转导细胞(例如CD8+T)中表达本发明的抗原结合受体后，从培养物(即从培养基)中回收(即重新提取)转导细胞。
因此，本发明还包括可通过本发明的方法获得的转导细胞，优选T细胞，特别是表达由本发明的核酸分子编码的抗原结合受体的CD8+T。
核酸分子
本发明的进一步方面是编码本文所述的一种或多种抗原结合受体的核酸和载体。编码抗原结合受体的示例性核酸分子示于SEQ ID NO:20。核酸分子可以在调节序列的控制下。例如，可采用允许诱导表达本发明的抗原结合受体的启动子、转录增强子和/或序列。在本发明的背景中，核酸分子在组成型或诱导型启动子的控制下表达。适合的启动子是例如CMV启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、UBC启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、PGK(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、EF1A启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、CAGG启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、SV40启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、COPIA启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、ACT5C启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、TRE启动子(Qin等人，PLoS One.5(5)(2010),e10611)、Oct3/4启动子(Chang等人，Molecular Therapy9(2004),S367–S367(doi:10.1016/j.ymthe.2004.06.904))或Nanog启动子(Wu等人，CellRes.15(5)(2005),317-24)。因此，本发明还涉及包含本发明中所述的一种或多种核酸分子的一种或多种载体。本文中，术语载体涉及可以在已导入其的细胞中自主复制的环状或线性核酸分子。许多合适的载体是分子生物学领域技术人员已知的，其选择取决于所需的功能，包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和基因工程中常规使用的其他载体。本领域技术人员公知的方法可以用于构建各种质粒和载体；参见，例如，Sambrook等人(引自上文)和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y.(1989),(1994)中描述的技术。可替代地，可以将本发明的多核苷酸和载体重构为脂质体，以递送至靶细胞。如下文进一步详细讨论的，克隆载体用于分离单独的DNA序列。相关序列可以转移到需要特定多肽表达的表达载体中。典型的克隆载体包括pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322、pGA18和pGBT9。典型的表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。
本发明还涉及包含一种或多种核酸分子的一种或多种载体，所述核酸分子是可操作地连接至所述一种或多种核酸分子的调控序列，所述核酸分子编码本文定义的抗原结合受体。在本发明的背景中，载体可以是多顺反子的。此类调节序列(控制元件)是技术人员已知的，并且可包括用于将***序列引入载体的启动子、剪接盒、翻译起始密码子、翻译和***位点。在本发明的背景中，所述核酸分子与所述表达控制序列可操作地链接，以允许在真核或原核细胞中表达。设想所述一种或多种载体是一种或多种表达载体，其包含编码如本文定义的抗原结合受体的一种或多种核酸分子。可操作地链接是指并置，其中所描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。可操作地链接至编码序列的控制序列被连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。在控制序列是启动子的情况下，对于技术人员显而易见的是，优选使用双链核酸。
在本发明的背景中，所述载体是表达载体。表达载体是可用于转化所选细胞并提供编码序列在所选细胞中表达的构建体。一个或多个表达载体可以是例如克隆一个或多个载体、一个或多个二进制载体或一个或多个整合载体。表达包括优选地将核酸分子转录成可翻译的mRNA。确保在原核生物和/或真核细胞中表达的调控元件是本领域技术人员公知的。在真核细胞的情况下，它们通常包含确保转录起始的启动子并且任选地包含确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括，例如，大肠杆菌中的PL、lac、trp或tac启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子(Rous肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。
除了负责转录起始的元件之外，此类调控元件还可以在多核苷酸下游包含转录终止信号，例如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。此外，取决于所使用的表达***，可以将编码能够把多肽引导至细胞区室或将其分泌至培养基中的信号肽的前导序列添加至所述核酸序列的编码序列中，这在本领域中是公知的，另参见例如所附实施例。
前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装在一起，优选地，前导序列能够将翻译的蛋白或其部分的分泌引导到周质空间或细胞外介质中。任选地，异源序列可以编码包含N末端识别肽的抗原结合受体，该N末端识别肽赋予所需特征，例如稳定或简化纯化表达的重组产物，参见同上。在此背景中，合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)、pEF-DHFR、pEF-ADA或pEF-neo(Raum等人，Cancer Immunol Immunother 50(2001),141-150)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
在本发明的背景中，表达控制序列将是在能够转化或转染真核细胞的载体中的真核启动子***，但也可使用原核细胞的控制序列。一旦载体已并入适当的细胞中，则在适用于高水平表达核苷酸序列的条件下维持该细胞并符合需要。其他调节元件可包括转录以及翻译增强子。有利的是，本发明的上述载体包括可选择的和/或可评分的标志物。用于选择转化细胞和例如植物组织和植物的可选择标志物基因是本领域技术人员众所周知的并且包括例如抗代谢物抗性作为选择dhfr(其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Reiss,Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13(1994),143-149))、npt(其赋予对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素的抗性(Herrera-Estrella,EMBO J.2(1983),987-995))和hygro(其赋予对潮霉素的抗性(Marsh,Gene 32(1984),481-485))的基础。已描述了其他可选择基因，即允许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB；允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸的hisD(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988),8047)；甘露糖-6-磷酸异构酶，其允许细胞利用甘露糖(WO 94/20627)和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其将阻力赋予鸟氨酸脱羧酶抑制剂、2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸、DFMO(McConlogue,1987,In:Current Communications in MolecularBiology,Cold Spring Harbor Laboratory ed.)或来自土曲霉的脱氨酶，其赋予对灭瘟素的抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995),2336-2338)。
有用的可标记标志物也是本领域技术人员已知的，并且可商购获得。有利的是，所述标志物为编码荧光素酶(Giacomin,Pl.Sci.116(1996),59-72；Scikantha,J.Bact。178(1996),121)、绿色荧光蛋白(Gerdes,FEBS Lett.389(1996),44-47)或β-葡萄糖醛酸酶(Jefferson,EMBO J.6(1987),3901-3907)的基因。此实施例对于简单快速筛选包含所述载体的细胞、组织和生物体特别有用。
如上所述，所述的一种或多种核酸分子可以单独使用或作为一种或多种载体的一部分在细胞中表达本发明的抗原结合受体，用于例如过继性T细胞疗法，但也用于基因疗法目的。将含有编码本文所述的任何一种抗原结合受体的一个或多个DNA序列的核酸分子或一种或多种载体引入细胞中，该细胞又产生感兴趣的多肽。基于通过离体或体内技术将治疗基因引入细胞的基因疗法是基因转移最重要的应用之一。用于体外或体内基因疗法的方法或基因递送***的合适的载体、方法或基因递送***描述于文献中并且是本领域技术人员已知的；参见，例如，Giordano,Nature Medicine2(1996),534-539；Schaper,Circ.Res.79(1996),911-919；Anderson,Science256(1992),808-813；Verma,Nature 389(1994),239；Isner,Lancet 348(1996),370-374；Muhlhauser,Circ.Res.77(1995),1077-1086；Onodera,Blood 91(1998),30-36；Verma,Gene Ther.5(1998),692-699；Nabel,Ann.N.Y.Acad.Sci.811(1997),289-292；Verzeletti,Hum.Gene Ther.9(1998),2243-51；Wang,Nature Medicine 2(1996),714-716；WO 94/29469；WO 97/00957；US 5,580,859；US5,589,466；或Schaper,Current Opinion in Biotechnology 7(1996),635-640。所述一种或多种核酸分子和一种或多种载体可设计用于直接引入细胞或者经由脂质体或病毒载体(例如腺病毒载体、逆转录病毒载体)引入细胞。在本发明的背景中，所述细胞是T细胞，例如CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD3+T细胞、γδT细胞或自然杀伤(NK)T细胞，优选CD8+T细胞。
根据上文，本发明涉及衍生载体，特别地是在基因工程中常规使用的质粒、粘粒和噬菌体的方法，所述载体包含编码本文所定义的抗原结合受体的多肽序列的核酸分子。在本发明的背景中，所述载体为表达载体和/或基因转移或靶向载体。衍生自病毒，诸如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛***状瘤病毒的表达载体可用于将所述多核苷酸或载体递送至目标细胞群中。
本领域技术人员熟知的方法可用于构建一种或多种重组载体；参见，例如，Sambrook等人(loc cit.),Ausubel(1989,loc cit.)或其他标准教科书中描述的技术。或者，可以将所述核酸分子和载体重构为脂质体，以递送至靶细胞。含有本发明的核酸分子的载体可以通过众所周知的方法转移到宿主细胞中，这取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主；参见Sambrook，同上。所述载体尤其可以是pEF-DHFR、pEF-ADA或pEF-neo。载体pEF-DHFR、pEF-ADA和pEF-neo在本领域中已有描述，例如在Mack等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995),7021-7025和Raum等人Cancer Immunol Immunother 50(2001),141-150。
本发明还提供一种用如本文所述的载体来转导的T细胞。可以通过将上述载体中的至少一种或上述核酸分子中的至少一种引入T细胞或其前体细胞来产生所述T细胞。T细胞中所述至少一种载体或至少一种核酸分子的存在介导编码上述抗原结合受体的基因的表达，该抗原结合受体包含细胞外结构域，该细胞外结构域包含能够与突变的Fc结构域特异性结合的抗原结合部分。本发明的载体可以是多顺反子的。
引入T细胞或其前体细胞中的所述核酸分子或载体可以整合到细胞的基因组中，或者可以在染色体外进行维持。
试剂盒
本发明的进一步方面是试剂盒，其包括或由以下项组成：根据本发明的包含异二聚体Fc结构域的一种/多种抗体、和根据本发明的编码抗原结合受体的一种或多种核酸、和/或用于转导/用所述抗原结合受体转导的细胞(优选地，T细胞)。
因此，提供了一种试剂盒，其包含
(a)抗体，其包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，其中所述
第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)；
(b)转导的T细胞，其能够表达与所述第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
进一步提供了一种试剂盒，其包含
(a)抗体，其包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，其中所述
第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)；
(b)分离的多核苷酸，其编码能够与所述第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
在一个优选的实施例中，本发明的试剂盒包括转导的T细胞、分离的多核苷酸和/或载体以及一种或多种抗体，该抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，并且其中第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)。在具体实施例中，抗体是治疗性抗体，例如如前文所述的肿瘤特异性抗体。肿瘤特异性抗原是本领域已知的并且在前文中有所描述。在本发明的背景中，在施用表达本发明的抗原结合受体的转导的T细胞之前、同时或之后施用抗体。根据本发明的试剂盒包含转导的T细胞或多核苷酸/载体以产生转导的T细胞。在这种情况下，转导的T细胞是通用T细胞，因为它们对给定肿瘤没有特异性，但可以通过使用包含异二聚体Fc结构域的抗体靶向任何肿瘤。本文提供了抗体的实例，该抗体包含含有根据EU编号的氨基酸突变P329G的异二聚体Fc结构域(例如SEQ ID No:129-131)，然而，包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域的任何抗体，其中第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，并且其中第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)。
本发明的试剂盒的部件可以单独地包装在小瓶或瓶子中或组合在容器或多容器单元中。此外，本发明的试剂盒可包含(封闭的)袋细胞孵育***，其中患者细胞，优选如本文所述的T细胞，可以用本发明的一种或多种抗原结合受体转导并在GMP(良好生产规范，如欧盟委员会在http://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/index_en.htm下发布的良好生产规范指南中描述的)条件下孵育。此外，本发明的试剂盒包含(封闭的)袋细胞孵育***，其中分离/获得的患者T细胞可以用本发明的一种或多种抗原结合受体转导并在GMP下孵育。此外，在本发明的背景中，试剂盒还可以包含编码本文所述的一种或多种抗原结合受体的载体。本发明的试剂盒尤其可以有利地用于实施本发明的方法，并且可以用于本文提到的各种应用，例如作为研究工具或医疗工具。试剂盒的制造优选遵循本领域技术人员已知的标准程序。
在这种情况下，可以使用本发明的能够与如上所述的包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的异二聚体Fc结构域特异性结合的抗原结合受体转导患者来源的细胞，优选T细胞。包含能够与突变的异二聚体Fc结构域特异性结合的抗原结合部分的细胞外结构域并不天然存在于T细胞中或T细胞上。因此，用本发明的试剂盒转导的患者来源的细胞将获得与根据本发明的包含异二聚体Fc结构域的抗体特异性结合的能力，并将变得能够通过与所述抗体的相互作用来诱导靶细胞的消除/裂解，其中所述抗体能够与肿瘤细胞表面上天然存在(即内源性表达)的肿瘤特异性抗原结合。如本文所述的抗原结合受体的细胞外结构域的结合活化该T细胞并通过包含异二聚体Fc结构域的抗体使其与肿瘤细胞物理接触。非转导或内源性T细胞(例如CD8+T细胞)不能与包含突变的Fc结构域的抗体的异二聚体Fc结构域结合。表达如本文所述的抗原结合受体的转导的T细胞保持不受不包含如本文所述的Fc结构域中的突变的治疗性抗体的影响。因此，表达如本文所述的抗原结合受体分子的T细胞具有在如本文所述的包含异二聚体Fc结构域的抗体存在下在体内和/或体外裂解靶细胞的能力。对应的靶细胞包括表达表面分子(即天然存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤特异性抗原)的细胞，该表面分子被本文所述的抗体的至少一个、优选两个结合结构域识别。
可以通过本领域已知的方法检测靶细胞的裂解。因此，此类方法尤其包括生理学体外测定。此类生理学测定可以监测细胞死亡，例如通过细胞膜完整性的丧失来监测(例如基于FACS的碘化丙锭测定、台盼蓝流入测定、光度酶释放测定(LDH)、放射51Cr释放测定、荧光铕释放和钙黄绿素AM释放测定)。进一步的测定包括监测细胞活力，例如通过光度法MTT、XTT、WST-1和alamarBlue测定、放射3H-Thd掺入测定、测量细胞***活性的克隆形成测定和测量线粒体跨膜梯度的荧光罗丹明123测定。此外，可以例如通过基于FACS的磷脂酰丝氨酸暴露测定、基于ELISA的TUNEL测试、半胱天冬酶活性测定(基于光度计、荧光计或基于ELISA)或分析变化的细胞形态(收缩、膜起泡)来监测细胞凋亡。
联合疗法
本文提供的分子或构建体(例如，抗体、抗原结合受体、转导的T细胞和试剂盒)在医疗环境中特别有用，特别是用于癌症的治疗。例如，可以用表达根据本发明的抗原结合受体的转导的T细胞连同与肿瘤细胞上的靶抗原结合并包含异二聚体Fc结构域的治疗性抗体***。因此，在某些实施例中，抗体、抗原结合受体、转导的T细胞或试剂盒用于治疗癌症，特别是上皮、内皮或间皮起源的癌症和血癌。
治疗的肿瘤特异性由包含异二聚体Fc结构域和与靶细胞抗原结合的特异性的抗体提供。可以在施用表达本发明的抗原结合受体的转导的T细胞之前、同时或之后施用抗体。在这种情况下，转导的T细胞是通用T细胞，因为它们对给定肿瘤不具有特异性，但可以靶向任何肿瘤，具体取决于根据本发明使用的抗体的特异性。
癌症可以是上皮、内皮或间皮起源的癌症/癌或血癌。在一个实施例中，癌症/癌选自由以下项组成的组：胃肠癌、胰腺癌、胆管细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、口腔癌、胃癌、***、B和T细胞淋巴瘤、骨髓性白血病、卵巢癌、白血病、淋巴性白血病、鼻咽癌、结肠癌、***癌、肾细胞癌、头颈癌、皮肤癌(黑色素瘤)、泌尿生殖道癌(例如睾丸癌、卵巢癌、内皮癌、子***和肾癌)、胆管癌、食道癌、唾液腺癌和甲状腺癌或其他肿瘤性疾病，如血液肿瘤、神经胶质瘤、肉瘤或骨肉瘤。
例如，肿瘤疾病和/或淋巴瘤可以用针对这些一个或多个医学适应症的特定构建体来治疗。例如，胃肠癌、胰腺癌、胆管细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌和/或口腔癌可以用针对(人)EpCAM(作为天然存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤特异性抗原)的抗体进行治疗。
胃肠癌、胰腺癌、胆管细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌和/或口腔癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对HER1，优选人HER1的抗体之前、同时或之后施用。此外，胃肠癌、胰腺癌、胆管细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、胶质母细胞瘤和/或口腔癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对MCSP，优选人MCSP的抗体之前、同时或之后施用。胃肠癌、胰腺癌、胆管细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、胶质母细胞瘤和/或口腔癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对FOLR1，优选人FOLR1的抗体之前、同时或之后施用。胃肠癌、胰腺癌、胆管细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、胶质母细胞瘤和/或口腔癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对Trop-2，优选人Trop-2的抗体之前、同时或之后施用。胃肠癌、胰腺癌、胆管细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、胶质母细胞瘤和/或口腔癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对PSCA，优选人PSCA的抗体之前、同时或之后施用。胃肠癌、胰腺癌、胆管细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、胶质母细胞瘤和/或口腔癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对EGFRvIII，优选人EGFRvIII的抗体之前、同时或之后施用。胃肠癌、胰腺癌、胆管细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、胶质母细胞瘤和/或口腔癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对MSLN，优选人MSLN的抗体之前、同时或之后施用。胃癌、乳腺癌和/或***可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对HER2，优选人HER2的抗体之前、同时或之后施用。胃癌和/或肺癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对HER3，优选人HER3的抗体之前、同时或之后施用。B细胞淋巴瘤和/或T细胞淋巴瘤可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对CD20，优选人CD20的抗体之前、同时或之后施用。B细胞淋巴瘤和/或T细胞淋巴瘤可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对CD22，优选人CD22的抗体之前、同时或之后施用。骨髓性白血病可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对CD33，优选人CD33的抗体之前、同时或之后施用。卵巢癌、肺癌、乳腺癌和/或胃肠癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对CA12-5，优选人CA12-5的抗体之前、同时或之后施用。胃肠癌、白血病和/或鼻咽癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对HLA-DR，优选人HLA-DR的抗体之前、同时或之后施用。结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和/或胰腺癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对MUC-1，优选人MUC-1的抗体之前、同时或之后施用。结肠癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对A33，优选人A33的抗体之前、同时或之后施用。***癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对PSMA，优选人PSMA的抗体之前、同时或之后施用。胃肠癌、胰腺癌、胆管细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌和/或口腔癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对转铁蛋白受体，优选人转铁蛋白受体的抗体之前、同时或之后施用。胰腺癌、肺癌和/或乳腺癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对转铁蛋白受体，优选人转铁蛋白受体的抗体之前、同时或之后施用。肾癌可以用本发明的转导的T细胞治疗，所述转导的T细胞在施用包含异二聚体Fc结构域并针对CA-IX，优选人CA-IX的抗体之前、同时或之后施用。
本发明还涉及治疗疾病、恶性疾病诸如上皮、内皮或间皮来源的癌症和/或血癌的方法。在本发明的背景中，所述受试者是人。
在本发明的背景中，用于治疗疾病的特定方法包括以下步骤：
(a)从受试者中分离T细胞，优选CD8+T细胞；
(b)用本文所述的抗原结合受体转导所述分离的T细胞，优选CD8+T细胞；和
(c)向所述受试者施用转导的T细胞，优选CD8+T细胞。
在本发明的背景中，所述转导的T细胞，优选CD8+T细胞，和/或异二聚体抗体/抗体通过静脉内输注共同施用于所述受试者。
此外，在本发明本发明的背景中，提供了一种治疗疾病的方法，包括以下步骤：
(a)从受试者中分离T细胞，优选CD8+T细胞；
(b)用本文所述的抗原结合受体转导所述分离的T细胞，优选CD8+T细胞；
(c)任选地用T细胞受体共转导所述分离的T细胞，优选CD8+T细胞；
(d)通过抗CD3和抗CD28抗体扩增T细胞，优选CD8+T细胞；和
(e)向所述受试者施用转导的T细胞，优选CD8+T细胞。
上述步骤(d)(指通过抗CD3和/或抗CD28抗体扩增T细胞诸如TIL的步骤)也可以在(刺激)细胞因子诸如白介素2和/或白介素15(IL-15)的存在下进行。在本发明的背景中，上述步骤(d)(指通过抗CD3和/或抗CD28抗体扩增T细胞诸如TIL的步骤)也可以在白介素12(IL-12)、白介素7(IL-7)和/或白介素21(IL-21)的存在下进行。
此外，治疗方法包括施用根据本发明使用的抗体。可以在施用转导的T细胞之前、同时或之后施用所述抗体。在本发明的背景中，转导的T细胞的施用将通过静脉内输注进行。在本发明的背景中，从待治疗的受试者中分离/获得转导的T细胞。
本发明还设想了与其他化合物(例如，能够为免疫效应细胞、细胞增殖或细胞刺激提供活化信号的分子)的共同施用方案。所述分子可以是，例如，T细胞的其他初级活化信号(例如，其他共刺激分子：B7家族、Ox40L、4.1BBL、CD40L、抗CTLA-4、抗PD-1的分子)，或其他细胞因子白介素(例如IL-2)。
如上所述的本发明的组合物还可以是诊断组合物，其进一步任选地包含用于检测的手段和方法。
上述及其他实施例公开并包含于本发明的说明和实例中。关于根据本发明所采用的任一种抗体、细胞、方法、用途和化合物的进一步相关文献，可通过使用例如电子设备等在公共图书馆和数据库中检索。例如，可利用互联网上的公共数据库“Medline”，例如在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html访问。更多数据库和地址，诸如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.tigr.org/、http://www.infobiogen.fr/和http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html，是本领域技术人员已知的，并且也可以使用例如http://www.lycos.com获得。
示例性序列
表2：示例性VH3VL1 P329G-CAR氨基酸序列：
根据Kabat的CDR定义
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表3：示例性VH3 x VL1 P329G-CAR DNA序列：
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表4：示例性VL1VH3 P329G-CAR氨基酸序列：
根据Kabat的CDR定义
表5：示例性VL1VH3 P329G-CAR DNA序列：
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表6：示例性抗P329G抗体
根据Kabat的CDR定义
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表7：P329G IgG1 Fc变体
表8
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表9：示例性VH1VL1 P329G-CAR氨基酸序列：
根据Kabat的CDR定义
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表10：示例性VH2VL1 P329G-CAR氨基酸序列：
根据Kabat的CDR定义
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表11：示例性异二聚体抗体序列：
根据Kabat的CDR定义
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实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中该。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication No.91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
在需要时，通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。在确切的基因序列不可用的情况下，基于最接近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从来源于合适的组织的RNA中分离出基因。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。
在HEK293 EBNA或CHO EBNA细胞中产生IgG样蛋白质
通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞或CHO EBNA细胞，形成抗体和双特异性抗体。对细胞进行离心，然后用经过预热的CD CHO培养基(Thermo Fisher，目录号10743029)代替原培养基。将表达载体在CD CHO培养基中混合，加入PEI(聚乙烯亚胺，Polysciences，Inc，目录号23966-1)，将溶液涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，将细胞(2Mio/ml)与载体/PEI溶液混合，将其转移至烧瓶中，并且置于振荡培养箱中，在5％ CO2的气氛下于37℃孵育3小时。孵育后，加入含有补充剂(占总体积的80％)的Excell培养基(W.Zhou和A.Kantardjieff，Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing，DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。转染后1天，加入补充剂(饲料，占总体积的12％)。7天后，通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用如下所示的标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
在CHO K1细胞中产生IgG样蛋白质
替代地，本文该的抗体和双特异性抗体由Evitria使用其专有的载体***通过常规的(基于非PCR)克隆技术并且使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
IgG样蛋白质的纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，利用蛋白A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH3.0)从经过滤的细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(MilliporeULTRA-15(Art.Nr.:UFC903096)浓缩蛋白质，然后利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
IgG样蛋白质的分析
通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)该的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII或LabChip GX Touch(PerkinElmer)(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。使用在运行缓冲液(200mM KH2PO4，250mM KCl pH 6.2，0.02％ NaN3)中平衡的分析尺寸排阻柱(TSKgelG3000 SW XL或UP-SW3000)在25℃通过HPLC色谱进行聚集含量的确定。
慢病毒上清液的制备和Jurkat-NFAT细胞的转导
使用约80％汇合的Hek293T细胞(ATCC CRL3216)和CAR编码转移载体以及包装载体pCAG-VSVG和psPAX2以2:2:1的摩尔比进行基于Lipofectamine LTXTM的转染(Giry-Laterriere M,等人Methods Mol Biol.2011；737:183-209,Myburgh R,等人Mol TherNucleic Acids.2014)。66h后，收集上清液，以350×g离心5min，并通过0.45μm聚醚砜过滤器过滤，以收获和纯化病毒颗粒。病毒颗粒直接使用或浓缩(Lenti-x-Concentrator,Takara)并用于Jurkat NFAT T细胞的旋转感染(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501，在31℃下以900×g进行2h。
Jurkat NFAT活化试验
Jurkat NFAT活化测定测量人急性淋巴性白血病报告细胞系(GloResponseJurkat NFAT-RE-luc2P,Promega#CS176501)的T细胞活化。这种永生化T细胞系经过基因工程改造，以稳定表达由NFAT应答元件(NFAT-RE)驱动的荧光素酶报告基因。进一步，该细胞系表达具有CD3z信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)构建体。CAR与固定化衔接分子(例如肿瘤抗原结合衔接子分子)的结合导致CAR交联，从而导致T细胞活化和荧光素酶的表达。添加底物后，NFAT活性的细胞变化可以测量为相对光单位(Darowski等人，ProteinEngineering,Design and Selection，第32卷，第5期，2019年5月，第207-218页，https://doi.org/10.1093/protein/gzz027)。通常，在384板(Falcon#353963白色，透明底部)中进行该测定。将比例为1:5的靶细胞(CAR-Jurkat-NFAT细胞)和效应细胞(2000个靶细胞和10000个效应细胞)各10μl接种在RPMI-1640+10％ FCS+1％ Glutamax(生长介质)中，一式三份。进一步，在生长培养基中制备感兴趣的抗体的连续稀释液，以在测定板中获得67nM至0.000067nM的最终浓度，最终总体积为每孔30μl。将384孔板在300g和室温下离心1min，并在37℃和5％ CO2的潮湿气氛中孵育。孵育7h后，添加最终体积20％的ONE-GloTM萤光素酶测定(E6120,Promega)，并将板以350×g离心1min。之后，立即使用Tecan酶标仪测量每s每孔的相对发光单位(RLU)。使用GraphPadPrism版本7拟合浓度-应答曲线并计算EC50值。作为p值，使用GraphPadPrism 7中列出的新英格兰医学杂志(New England Journal ofMedicine)样式。含义*＝P≤0,033；**＝P≤0,002；***＝P≤0,001。
实例1
人源化抗P329G抗体的生成和表征
在HEK细胞中生产亲本和人源化抗P329G抗体，并通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法纯化。所有抗体均以良好质量纯化(表2)。
表2-抗P329G抗体的生化分析。通过分析尺寸排阻色谱法确定单体含量。通过非还原性SDS毛细管电泳确定纯度。
分子 单体[％] 纯度[％]
抗P329G(M-1.7.24)huIgG1 100 85
抗P329G(VH1VL1)huIgG1 100 97
抗P329G(VH2VL1)huIgG1 100 87
抗P329G(VH3VL1)huIgG1 100 97
抗P329G结合物M-1.7.24的亲本和六种人源化变体与人Fc(P329G)的结合
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SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。将抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare 28-9583-25)通过胺偶联直接固定在CM5芯片(GEHealthcare)上。将IgG在50nM下捕获60s。使人Fc(P329G)的两倍稀释系列以30μl/min的速度在配体上方经过，持续240sec，以记录缔合阶段。监测解离阶段持续800s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。在每一次循环后，使用两次10mM甘氨酸pH 2.1注入60sec，使芯片表面再生。通过减去在参比流通池1上获得的应答来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biaeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合而由动力学速率常数得出的。以独立稀释系列三重复进行测量。
分析以下样品与人Fc(P329G)的结合(表3)。
表3：对分析与人Fc(P329G)结合的样品的描述。
人Fc(P329G)通过人IgG1的纤溶酶消化制备，然后通过蛋白A和尺寸排阻色谱法进行亲和纯化。
抗P329G结合物M-1.7.24的亲本和六种人源化变体与人Fc(P329G)的结合
将解离阶段拟合到单曲线以帮助表征解离率。计算结合与捕获应答水平之间的比率。(表4)。
表4：六种人源化变体与人Fc(P329G)结合的结合评定。
抗P329G结合物M-1.7.24的亲本和三种人源化变体与人Fc(P329G)的亲和力
更详细地评定了具有与亲本相似的结合模式的三种人源化变体。表5总结了1:1Langmuir结合的动力学常数。
表5：动力学常数(1:1Langmuir结合)。独立的三重复(同一运行中的独立稀释系列)的平均值和标准偏差(括号中)。
结论
生成了六种人源化变体。其中三种(VH4VL1、VH1VL2、VH1VL3)显示出与亲本M-1.7.24相比降低的与人Fc(P329G)的结合。其他三种人源化变体(VH1VL1、VH2VL1、VH3VL1)具有与亲本结合物非常相似的结合动力学，并且不会因人源化而失去亲和力。
实例2
人源化抗P329G抗原结合受体的制备
为了评定人源化P329G变体的功能，将编码对P329G Fc突变具有特异性的结合物的重链(VH)和轻链(VL)DNA序列的不同可变结构域克隆为单链可变片段(scFv)结合部分，并用作第二代嵌合抗原受体(CAR)中的抗原结合结构域。
P329G结合物的不同人源化变体包含Ig重链可变主结构域(VL)和Ig轻链可变结构域(VL)。VH和VL通过(G4S)4接头连接。scFv抗原结合结构域与锚定跨膜结构域(ATD)CD8a(Uniprot P01732[183-203])融合，后者与细胞内共刺激信号传导结构域(CSD)CD137(Uniprot Q07011AA 214-255)融合，后者转而与刺激信号传导结构域(SSD)CD3ζ(UniprotP20963 AA 52–164)融合。抗P329G CAR的scFv以两个不同的取向VHxVL(图1A)或VLxVH(图1B)构建。VHVL构型的示例性表达构建体(包括GFP报告基因)的图形表示如图1C所示，VLVH构型如图1D所示。
实例3
抗P329G抗原结合受体在Jurkat-NFAT细胞中的表达
不同的人源化抗P329G抗原结合受体被病毒转导到Jurkat(GloResponse JurkatNFAT-RE-luc2P,Promega#CS176501)细胞中。
通过流式细胞术评定抗P329G抗原结合受体表达。收获采用不同人源化抗P329G抗原结合受体的Jurkat细胞，用PBS洗涤并以每孔50,000个细胞接种在96孔平底板中。在黑暗和冰箱(4-8℃)中用不同浓度(500nM-0nM 1:5连续稀释)的在Fc结构域中包含P329G突变的抗体染色45min后，将样品用FACS缓冲液(含2％ FBS、10％0.5M EDTA、pH 8和0.5g/L NaN3的PBS)洗涤3次。然后将样品用2.5μg/mL多克隆抗人IgG Fcγ片段特异性和PE缀合的AffiniPure F(ab')2山羊片段抗体在冰箱中在黑暗中染色30min，并用流式细胞仪(Fortessa BD)进行分析。此外，抗P329G抗原结合受体包含细胞内GFP报告基因(参见图1C)。
与P329G结合物的人源化版本(VH1VL1、VH2VL1和VH3VL1)相比，原始的非人源化结合物在细胞表面显示出较弱的CAR标记(图2A)，尽管GFP表达相当。有趣的是，VL1VH1构建体(参见图1D)在细胞表面显示出高GFP表达但也显示出弱的CAR标记，表明这是对结合物的不利确认。
总体而言，出乎意料的是，VH3VL1版本显示出最高的GFP表达和CAR表面表达。此外，与原始的非人源化P329G抗原结合受体以及有趣地VLVH确认中的构建体(VL1VH3)相比，VHVL确认中的所有测试构建体(VH1VL1、VH2VL1和VH3VL1)在转导到Jurkat T细胞后均显示出增强的GFP信号。
总之，VHVL确认似乎有利于抗原结合受体的表达水平以及对细胞表面的正确靶向。
为了进一步表征人源化抗P329G抗原结合受体的选择性、特异性和安全性，进行了不同的测试。
实例4
在Fc结构域中包含P329G突变的靶向抗体存在下的特异性T细胞活化
为了排除不同人源化抗P329G-scFv变体的非特异性结合，表达包含这些变体的抗原结合受体的Jurkat NFAT细胞在存在CD20阳性WSUDLCL2靶细胞和具有不同的Fc变体(Fc野生型、Fc P329G突变、LALA突变、D246A突变或其组合)的抗CD20(GA101)抗体的情况下评估了它们的活化。如上所述进行CAR-Jurkat NFAT活化测定，并使用抗CD20(GA101)野生型IgG1(图3A)、抗CD20(GA101)P329G LALA IgG1(图3B)、抗CD20(GA101)LALA IgG1(图3D)、抗CD20(GA101)D246A P329G IgG1(图3F)或非特异性DP-47P329G LALA IgG1(图3E)评估非特异性结合的潜力。对于抗CD20(GA101)野生型IgG1(图3A)、抗CD20(GA101)LALA IgG1(图3D)或非特异性DP-47P329G LALA IgG1(图3E)，未检测到非特异性抗P329G CAR活化。
在存在抗CD20(GA101)P329G LALA IgG1(图3B)和抗CD20(GA101)D246A P329GIgG1(图3F)的情况下，可以检测到特异性抗P329G CAR活化。评定的EC50在所有人源化抗P329G变体之间相当，并且与原始结合物的EC50没有差异。
有趣的是，与原始的非人源化结合物和VLVH构象的人源化结合物相比，包含VHVL构象的scFv结合物的抗原结合受体导致Jurkat NFAT T细胞的更强活化。更高的平台(参见例如图3F)可能是由于抗原结合受体的表达水平提高和/或向细胞表面的转运改善，导致更强的活化。此外，构象可能会影响与P329G突变的结合。
为了研究潜在抗原结合结构域聚集的风险，导致T细胞增强的信号传导或非特异性活化，如上所述进行Jurkat NFAT活化测定，而使用的初始抗体浓度升高，连续稀释从100nM的GA101 P329G LALA IgG1开始并且进一步没有接种靶细胞。
如图3C所示，所有测试的人源化P329G变体均未检测到活化，表明在不存在靶细胞的情况下可检测到受体聚集或非特异性活化。
实例5
通过T细胞活化评定不同人源化P329G抗原结合受体变体对表达不同抗原水平的靶细胞的敏感性
为了进一步表征人源化抗P329G抗原结合受体的灵敏度和选择性，如上所述进行Jurkat NFAT活化测定。
对表达不同人源化抗P329G-scFv变体抗原结合受体的Jurkat NFAT报告细胞区分高(HeLa-FolR1)、中等(Skov3)和低(HT29)FolR1阳性靶细胞的能力进行评估。抗P329G结合物的不同变体与构成对FolR1的高(16D5)(图4A、D、G)、中等(16D5 W96Y)(图4B、E、H)或低(16D5G49S/K53A)(图4C、F、I)亲和力的抗体结合，用作Jurkat报告细胞系中的scFv抗原识别支架。高表达的靶细胞HeLa-FolR1，结合高抗FolR116D5(图4A)、中等抗FolR1 16D5 W96Y(图4B)和低亲和力衔接子-IgG抗FolR1 G49S K53A(图4C)显示剂量依赖性活化。中等表达的靶细胞Skov3，结合高抗FolR1 16D5(图4D)、中等抗FolR1 16D5 W96Y(图4E)和低亲和力衔接子-IgG抗FolR1 G49S K53A(图4F)显示剂量依赖性活化。对于低表达的靶细胞HT29，结合不同亲和力结合物抗FolR116D5(图4G)、抗FolR1 16D5 W96Y(图4H)或低亲和力衔接子-IgG抗FolR1 G49S K53A(图4I)，没有检测到信号。进一步，有趣的是，与原始的非人源化结合物和VLVH形式的人源化结合物相比，VHVL形式的抗原结合受体导致Jurkat NFAT T细胞的更高活化。人源化变体VH3VL1scFv结合物导致所有构建体的信号强度最高(图4A-F)。
此外，Jurkat NFAT活化测定是在与抗FolR1 16D5 P329G LALA IgG1(图5)或抗HER2 P329G LALA IgG1(图6)结合使用的HeLa(FolR1+和HER2+)细胞上进行的。两者都证实了VHVL取向优于VLVH取向的发现。人源化变体VH3VL1导致Jurkat NFAT T细胞的最强活化。
实例6
在Fc结构域的一个亚基中包含P329G突变的异二聚体靶向抗体存在下的特异性T细胞活化
通过相应的Jurkat报告T细胞和WSUDLCL2(CD20+)靶细胞的共培养物评定异二聚体抗CD20 IgG(SEQ ID No:129-131)选择性募集抗P329G CAR(SEQ ID NO:7)Jurkat报告T细胞或CD16-CAR Jurkat报告T细胞的能力。如上所述进行CAR-Jurkat NFAT活化测定，并滴定抗CD20(GA101)野生型IgG1、抗CD20(GA101)P329G LALA IgG1、抗CD20(GA101)去岩藻糖基化IgG1和抗CD20(GA101)异二聚体IgG。对于CD16-CAR Jurkat NFAT T细胞，如果使用抗CD20(GA101)野生型IgG1、抗CD20(GA101)去岩藻糖基化IgG1或抗CD20(GA101)异二聚体IgG1，则可以观察到特异性的剂量依赖性活化(图9A)。对于抗P329G CAR Jurkat T细胞，如果使用抗CD20(GA101)P329G LALA IgG1或抗CD20(GA101)异二聚体IgG1，则可以观察到特异性的剂量依赖性活化(图9B)。
实例7
特异性靶细胞通过使用异二聚体IgG1募集的CD16-CAR T细胞裂解
通过相应的Jurkat报告T细胞和WSUDLCL2(CD20+)靶细胞的共培养物评定异二聚体IgG选择性募集CD16-CAR T细胞和诱导肿瘤细胞裂解的能力。如上所述进行CAR-JurkatNFAT活化测定，并滴定抗CD20(GA101)野生型IgG1、抗CD20(GA101)P329G LALA IgG1、抗CD20(GA101)去岩藻糖基化IgG1和抗CD20(GA101)异二聚体IgG。对于CD16-CAR JurkatNFAT T细胞，如果使用抗CD20(GA101)P329G LALA IgG1或抗CD20(GA101)异二聚体IgG1，则可以观察到特异性的剂量依赖性活化(图10A)。对于抗P329G CAR Jurkat T细胞，如果使用抗CD20(GA101)野生型IgG1、抗CD20(GA101)去岩藻糖基化IgG1或抗CD20(GA101)异二聚体IgG1，则可以观察到特异性的剂量依赖性活化(图10B)。
实例8
异二聚体IgG1诱导ADCC的能力
为了评估异二聚体IgG1诱导ADCC的能力，将抗体滴定到来自健康供体的PBMC和WSUDLCLS(CD20+)的共培养物中。在4.5h后测量LDH释放。为了进行测定，使用Histopaque-1077(Sigma)通过密度梯度离心分离PBMC。将50μl/孔(0.625Mio细胞/孔)的分离的PBMC接种到96圆底孔板中。获得WSUDLCL2靶细胞，计数并检查其活力，将0.025Mio细胞/孔以50μl/孔接种到PBMC上。添加不同浓度的抗CD20(GA101)异二聚体IgG1、抗CD20(GA101)去岩藻糖基化、抗CD20(GA101)野生型IgG1或抗CD20(GA101)P329G LALA。将细胞直接用抗CD107a-PE染色，并在培养箱中在37℃、5％ CO2和潮湿气氛下孵育4.5h。在读出前1h，将50μl/孔的4％Triton X-100添加到最大释放孔中(仅靶细胞)。在最终孵育时间之后，将50μl上清液转移到平底TPP板中，并添加根据制造商说明书制备的50μl LDH底物(LDH试剂盒；Roche)。立即在Tecan读数器(490nm-650nm)上测量吸光度10min。
条形图描绘了从技术三重复计算出的平均值。有趣的是，可以表明，异二聚体IgG能够诱导ADCC的程度与去岩藻糖基化IgG1变体相同(图11A和图11B)。
为了评估该测定期间NK细胞的活化，剩余的细胞用于FACS分析。因此，将细胞在PBS中洗涤两次，并以50μl/孔在4℃下在黑暗中染色30min。FACS ab染色混合物400μl CD3-PE/Cy7+400μl CD56-APC+400μl CD16-FITC+18800μl PBS缓冲液+eF 450作为活死染色。在染色之后，用FACS缓冲液洗涤细胞3次。在FACS Fortessa(FACSDiva软件)中获得最终体积为150μl的样品。在存在抗CD20异二聚体IgG1、抗CD20P329G LALA IgG、抗CD20去岩藻糖基化IgG1和野生型IgG1的情况下评定NK细胞的活化。NK细胞的活化可以通过在存在去岩藻糖基化变体、异二聚体变体和野生型变体的情况下CD107a的上调和CD16受体的下调来证明(图12A和图12B)。有趣的是，异二聚体IgG活化NK细胞的程度与去岩藻糖基化IgG1相同。
实例9
抗CD20抗体的不同Fc变体对细胞因子释放和B细胞耗竭的影响。
为了评定抗CD20抗体(GA101)的不同Fc变体(Fc野生型、Fc P329G突变、去岩藻糖基化、或去岩藻糖基化和P329G突变的组合)对B细胞耗竭和细胞因子释放的影响，在新鲜全血中孵育浓度不断升高的不同抗CD20抗体。在24h后，收集血清以用于使用Luminex技术进行细胞因子测量。在48h后，通过流式细胞术测量CD45+细胞中CD19+B细胞的百分比。
对于供体1(图14A)和供体2(图14B)，GE GA101(去岩藻糖基化Fc)和异二聚体GA101(P329G和去岩藻糖基化)的IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8和MCP-1的水平相当，并且高于WT GA101(野生型Fc)和PGLALA GA101(P329GLALA突变)观察到的水平。这表明在细胞因子释放方面，异二聚体GA101和去岩藻糖基化GA101的活性是相当的。此外，去岩藻糖基化GA101和异二聚体GA101的CD45+细胞中CD19+B细胞的百分比相当，并且低于野生型GA101或P329G LALA GA101观察到的百分比(未示出)。与野生型GA101、去岩藻糖基化GA101相比，P329G LALA GA101的CD45+细胞中CD19+B细胞的百分比要高得多。正如预期的，P329G LALA突变导致抗CD20抗体在B细胞耗竭方面低得多的活性。该数据表明，抗CD20抗体的Fc上的去岩藻糖基化和P329G LALA突变的组合导致与单独的去岩藻糖基化相当的活性，并且比野生型GA101优异的活性。
总体而言，该实验表明异二聚体不损害B细胞耗竭和细胞因子释放。此外，与WTGA101(野生型Fc)或PGLALA GA101(Fc P329G,LALA突变)相比，它导致B细胞耗竭和细胞因子释放增加。

Claims (36)

1.一种抗体，其包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，并且其中所述第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述Fc结构域为IgG Fc结构域，特别是IgG1 Fc结构域。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述Fc结构域为人Fc结构域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基进行缔合的修饰。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体是去岩藻糖基化的。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中与天然IgG1 Fc结构域相比，所述异二聚体Fc结构域表现出增加的与Fc受体的结合亲和力和/或增加的效应子功能，特别地，其中所述效应子功能为ADCC。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中所述异二聚体Fc结构域包含一个或多个氨基酸突变，所述一个或多个氨基酸突变增加与Fc受体的结合和/或效应子功能，特别地，其中所述效应子功能为ADCC。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含至少一个能够与靶细胞上的抗原特异性结合的抗原结合部分。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述靶细胞为癌细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗原选自由以下项组成的组：FAP、CEA、p95 HER2、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、EpCAM、IGF-1R、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1(粘蛋白)、GD2、A33-抗原、PSMA、PSCA、转铁蛋白-受体、TNC(腱生蛋白)和CA-IX。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的抗体，其中所述抗原结合部分为scFv、Fab、crossFab或scFab。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体，其为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体，其中所述抗体为多特异性抗体。
14.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至13中任一项所述的抗体。
15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求14所述的分离的多核苷酸。
16.一种生产抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适合表达所述抗体的条件下培养根据权利要求15所述的宿主细胞，以及任选地(b)回收所述抗体。
17.一种抗体，其通过根据权利要求16所述的方法生产。
18.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至13或17中任一项所述的抗体以及药用载体。
19.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体和转导的T细胞，其用于组合治疗癌症，其中所述转导的T细胞表达能够与所述第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
20.根据权利要求19所述使用的抗体和转导的T细胞，其中所述抗原结合受体能够与Fc结构域亚基特异性结合，所述Fc结构域亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G。
21.根据权利要求20所述使用的抗体和转导的T细胞，其中所述抗原结合受体包含：重链可变结构域(VH)，其包含：
(a)RYWMN(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:2)或EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:40)的CDRH2氨基酸序列；
(c)PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)的CDR H3氨基酸序列；
以及轻链可变结构域(VL)，其包含：
(d)RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)GTNKRAP(SEQ ID NO:5)的CDR L2氨基酸序列；以及
(f)ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)的CDR L3氨基酸序列。
22.根据权利要求19至21中任一项所述使用的抗体和转导的T细胞，其中所述抗原结合受体包含
(i)跨膜结构域，其选自由以下项组成的组：CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10或DAP12跨膜结构域或其片段，特别是CD28跨膜结构域或其片段，
(ii)至少一个刺激信号传导结构域，其选自由以下项组成的组：
CD3z、FCGR3A和NKG2D的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个刺激信号传导结构域为CD3z细胞内结构域或其片段，和/或
(iii)至少一个共刺激信号传导结构域，其单独地选自由以下项组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10和DAP12的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个共刺激信号传导结构域为CD28细胞内结构域或其片段。
23.根据权利要求19至22所述使用的抗体和转导的T细胞，其中在施用所述抗体之前、同时或之后施用所述转导的T细胞。
24.一种治疗个体的癌症或延迟其进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗体和转导的T细胞，其中所述抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，其中所述第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)，并且其中所述转导的T细胞表达能够与所述第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗原结合受体能够与包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的Fc结构域亚基特异性结合。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述抗原结合受体包含：重链可变结构域(VH)，其包含：
(g)RYWMN(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(h)EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:2)或EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:40)的CDRH2氨基酸序列；
(i)PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)的CDR H3氨基酸序列；
以及轻链可变结构域(VL)，其包含：
(j)RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(k)GTNKRAP(SEQ ID NO:5)的CDR L2氨基酸序列；以及
(l)ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)的CDR L3氨基酸序列。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述抗原结合受体包含：
(i)跨膜结构域，其选自由以下项组成的组：CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10或DAP12跨膜结构域或其片段，特别是CD28跨膜结构域或其片段，
(ii)至少一个刺激信号传导结构域，其选自由以下项组成的组：
CD3z、FCGR3A和NKG2D的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个刺激信号传导结构域为CD3z细胞内结构域或其片段，和/或
(iii)至少一个共刺激信号传导结构域，其单独地选自由以下项组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10和DAP12的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个共刺激信号传导结构域为CD28细胞内结构域或其片段。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中在施用所述抗体之前、同时或之后施用所述转导的T细胞。
29.抗体在制造与转导的T细胞组合用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的异聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，其中所述第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)，并且其中所述转导的T细胞表达能够与所述第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述抗原结合受体能够与包含根据EU编号的氨基酸突变P329G的Fc结构域亚基特异性结合。
31.根据权利要求29或30所述的用途，其中所述抗原结合受体包含：重链可变结构域(VH)，其包含：
(g)RYWMN(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(h)EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:2)或EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:40)的CDRH2氨基酸序列；
(i)PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)的CDR H3氨基酸序列；
以及轻链可变结构域(VL)，其包含：
(j)RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(k)GTNKRAP(SEQ ID NO:5)的CDR L2氨基酸序列；以及
(l)ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)的CDR L3氨基酸序列。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的用途，其中所述抗原结合受体包含：
(i)跨膜结构域，其选自由以下项组成的组：CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10或DAP12跨膜结构域或其片段，特别是CD28跨膜结构域或其片段，
(ii)至少一个刺激信号传导结构域，其选自由以下项组成的组：
CD3z、FCGR3A和NKG2D的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个刺激信号传导结构域为CD3z细胞内结构域或其片段，和/或
(iii)至少一个共刺激信号传导结构域，其单独地选自由以下项组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10和DAP12的细胞内结构域或其片段，特别地，其中所述至少一个共刺激信号传导结构域为CD28细胞内结构域或其片段。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的用途，其中在施用所述抗体之前、同时或之后施用所述转导的T细胞。
34.一种试剂盒，其包括：
(a)抗体，其包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，其中所述第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)；
(b)转导的T细胞，其能够表达与所述第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
35.一种试剂盒，其包括：
(a)抗体，其包含由第一亚基和第二亚基构成的异二聚体Fc结构域，其中所述第一亚基包含根据EU编号的氨基酸突变P329G，其中所述第二亚基包含根据EU编号的329位的脯氨酸(P)；
(b)分离的多核苷酸，其编码能够与所述第一亚基特异性结合的抗原结合受体。
36.一种抗体，其包含实质上如前文参考实例中的任一者或参考附图中的任一者所述的异二聚体Fc结构域和抗原结合受体。
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