ES2378767T3 - Molécula de unión humana contra CD1a - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano capaz de unirse específicamente a CD1a humano, caracterizado por que el anticuerpo monoclonal humano comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 8 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N.º: 20.

Description

Molécula de unión humana contra CD1a
Campo de la invención
La invención se refiere a la identificación de moléculas de unión humanas capaces de unirse específicamente a CD1a, a inmunoconjugados que comprenden estas moléculas de unión y a procedimientos de obtención de las moléculas de unión. La invención comprende además el uso de las moléculas de unión humanas en medicina, en concreto para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades neoplásicas e histiocitosis de células de Langerhans.
Antecedentes de la invención
Las moléculas CD1 son una familia de moléculas que se expresan en las superficies de células dendríticas, monocitos y algunos timocitos. Las moléculas CD1 son similares a las moléculas MHC de clase I en cuanto que están implicadas en presentación de antígenos. Hasta el momento se han identificado cinco genes de CD1 en seres humanos: CD1a, CD1b, CD1c, CD1d y CD1e. Los productos de cuatro de estos cinco genes CD1 han sido definidos serológicamente. Se denominan CD1a, CD1b, CD1c y CD1d y se distinguen por cadenas pesadas únicas con pesos moleculares aproximados de 49kDa, 45kDa, 43kDa y 48kDa, respectivamente.
El hecho de que moléculas CD1 sean expresadas por células de leucemia agua y crónica de los linajes pre-B, B, T y no linfoide hace que las CD1a sean en principio un objetivo para detectar o atacar estas enfermedades (Salamone y col. (1990a), Salamone (1990b), Merle-Beral y col. (1989)).
Además, las moléculas CD1a están presentes sobre células de Langerhans (las cuales son las principales células dendríticas presentadoras de antígeno de la piel) (Teunissen (1992)). Esto hace a las CD1a en principio un objetivo para detectar o tratar la histiocitosis de células de Langerhans (LCH), una neoplasia proliferativa clonal con manifestaciones clínicas variables, que van desde lesiones autolimitadas aisladas hasta enfermedad multisistémica que puede poner en peligro la vida.
Las moléculas de unión que se unen específicamente a CD1 pueden ser muy útiles en el diagnóstico y el tratamiento de los trastornos mencionados anteriormente. Se conocen en la técnica varios anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra CD1 (Kelly (1994), Amiot y col. (1986), Furue y col. (1992)). Además, Moulon y col. ((J. Invest. Dermatol. 97:524-528, 1991) han divulgado diferentes anticuerpos monoclonales murinos anti-CD1a que reconocen diferentes epítopos de CD1a sobre la superficie de células de Langerhans. Murray y col. (J. Invest. Dermatol. 114:127-134, 2001) han investigado el potencial de uno de estos anticuerpos murinos anti-CD1a en el diagnóstico y tratamiento de un modelo de histiocitosis de células de Langerhans. Sin embargo, los anticuerpos murinos, en formato desnudo o inmunoconjugado, tienen un uso limitado in vivo debido a los problemas asociados con la administración de anticuerpos murinos a seres humanos, tales como una semivida en suero corta , una incapacidad de desencadenar determinadas funciones efectoras humanas y provocación de una respuesta inmunitaria drástica no deseada contra el anticuerpo murino en un ser humano (la reacción "humana anti-anticuerpo de ratón" (HAMA)) (van Kroonenburgh y Pauweis (1988)).
En general, los intentos de superar los problemas asociados con el uso de anticuerpos totalmente murinos en seres humanos, han implicado modificar genéticamente los anticuerpos para que sean más "de tipo humano". Una Cebadora etapa del procedimiento de humanización fue preparar anticuerpos quiméricos, es decir, anticuerpos en los que las regiones variables de las cadenas de los anticuerpos son de origen murino y las regiones constantes de las cadenas de los anticuerpos son de origen humano. Posteriormente, los dominios entre los dominios variables que especifican la unión al antígeno fueron reemplazados por sus correspondientes humanos, conduciendo a los denominados anticuerpos humanizados. Una desventaja de estos anticuerpos quiméricos y humanizados es que aún retienen algunas secuencias murinas y, por lo tanto, aún provocan una reacción inmunitaria no deseada, especialmente cuando se administran durante periodos de tiempo prolongados.
En vista de su beneficio en tratamientos, existe aún una necesidad de moléculas de unión humanas contra CD1a.
La presente invención proporciona moléculas de unión humanas contra CD1a que pueden usarse en medicina, en concreto para diagnóstico, prevención y/o tratamiento de trastornos asociados con CD1a.
Descripción de las figuras
Figura 1. Aislamiento de monocitos y diferenciación de monocitos en células dendríticas inmaduras (CD) mediante IL-4 y GM-CSF y en DC maduras mediante un cóctel adicional que contiene IL-1�, IL-6, TNF-a, PGE2. En las imágenes de FACS se indica una mezcla de LSP, usada como células sustractoras durante la selección de fagos, y DC cultivadas (en el recuadro), en la que la cantidad de PBL es aproximadamente 10 veces la cantidad de CD.
Figura 2. El análisis por FACS de la unión de un anticuerpo en fago monoclonal representativo (llamado SC02-113) a DC cultivadas inmaduras (arriba, izquierda) y maduras (arriba, derecha) y un transfectante CD1a en células C1R (abajo, derecha), comparado con el control negativo de C1R con transfección simulada (abajo, izquierda).
Figura 3. Unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas llamados CR2113, CR2114, CR2115, CR2116, CR2117 y CR2118 y anticuerpos de ratón anti-CD1a humanas, anticuerpos de ratón anti-CD1b humanas, anticuerpos de ratón anti-CD1c humanas y anticuerpos de ratón anti-CD1d humanas comercialmente disponibles a los transfectantes CR1-CD1a y B16-CD1a y transfectantes simulados de CR1 y B16. La unión significativa de anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas a transfectantes de CD1a comparada con los transfectantes simulados se indica con **. La significancia se ensayó con una prueba de la t no pareada de dos colas (p<0,05).
Figura 4. Unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas llamados CR2113, CR2114, CR2115, CR2116, CR2117 y CR2118 y anticuerpos de ratón anti-CD1a humanas, anticuerpos de ratón anti-CD1b humana, anticuerpos de ratón anti-CD1c humana y anticuerpos de ratón anti-CD1d humana a los transfectantes CR1-CD1b, CR1-CD1c y CR1-CD1d. La unión significativa de anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas a los transfectantes CR1-CD1b, CR1-CD1c o CR1-CD1d comparada con los transfectantes simulados de CR1 se indica con **. La significancia se ensayó con una prueba de la t no pareada de dos colas (p<0,05).
Figura 5. Las Figuras 5A-D muestran curvas de anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas no marcados y marcados con biotina llamados CR2113, CR2114, CR2117 y CR2118 en transfectantes B16-CD1a.
Figura 6. Las Figuras 6A-D muestran curvas de competición para CR2113, CR2114, CR2117 y CR2118 frente a anticuerpos monoclonales humanos anti-CD1a humanas.
Descripción de la invención
A continuación se presentan definiciones de términos/expresiones como se usan en la invención.
Definiciones
Leucemia mieloide aguda
Como se usa en el presente documento, la expresión "leucemia mieloide aguda" se caracteriza por una proliferación descontrolada de células progenitoras de origen mieloide incluyendo, pero sin limitarse a, células progenitoras mieloides, células progenitoras mielomonocíticas, megacarioblastos inmaduros. Los subtipos de leucemia mieloide aguda (AML) incluyen, de acuerdo con la clasificación FAB, FAB-M0, FAB-M1, FAB-M2, FAB-M3, FAB-M4, FAB-M5, FAB-M6 y FAB-M7.
Secuencia de aminoácidos
La expresión "secuencia de aminoácidos" como se usa en el presente documento se refiere a moléculas naturales o sintéticas y a una secuencia de un péptido, oligopéptido, polipéptido o proteína.
Apoptosis
Como se usa en el presente documento, el término "apoptosis" se refiere a cualquier muerte celular, ordenada o controlada que resulta de la compleja cascada de acontecimientos celulares que se producen en etapas específicas de la diferenciación celular y en respuesta a estímulos específicos. La apoptosis se caracteriza y/o está acompañada por uno o más cambios celulares característicos, incluyendo, pero sin limitarse a, condensación del citoplasma, pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación de ADN cromosómico o pérdida de función mitocondrial. La apoptosis puede determinarse y medirse, por ejemplo, mediante ensayos de viabilidad celular, análisis por FACS o electroforesis de ADN, todas las cuales se conocen en la técnica.
Molécula de unión
Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de unión" se refiere a una inmunoglobulina intacta que incluye anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos monoclonales,
o a un dominio de unión a antígeno y/o variable que comprende un fragmento de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta por unirse específicamente al compañero de unión de la inmunoglobulina, p. ej., CD1a. Independientemente de la estructura, el fragmento de unión a antígeno se une con el mismo antígeno que es reconocido por la inmunoglobulina intacta. La expresión "molécula de unión" como se usa en el presente documentoincluye inmunoglobulinas de clases y subclases de anticuerpos intactos. Éstas incluyen IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas pueden además dividirse en subclases (isotipos), p. ej., IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, así como sus fragmentos de unión a antígeno.
Los fragmentos de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios bivalentes, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica, etc. Los fragmentos anteriores pueden producirse sintéticamente o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas o pueden modificarse genéticamente mediante técnicas de ADN recombinante. Los procedimientos de producción son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo en Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Barlow y D, Lane (1988), Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. Una molécula de unión o uno de sus fragmentos de unión a antígeno pueden tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes.
La molécula de unión puede se una molécula de unión desnuda o no conjugada. Una molécula desnuda o no conjugada pretende referirse a una molécula de unión que no está conjugada, unida de forma operativa o asociada físicamente o funcionalmente de otro modo con un marcador o resto efector, tal como, entre otros, una sustancia tóxica, una sustancia radioactiva, un liposoma, una enzima. Se entenderá que las moléculas de unión desnudas o no conjugadas no excluyen a las moléculas de unión que se han estabilizado, multimerizado, humanizado o manipulado de cualquier otra manera, distinta de mediante la unión de un marcador o resto efector. En consecuencia, están incluidas aquí todas las moléculas de unión desnudas o no conjugadas modificadas después de la traducción, incluyendo cuando las modificaciones se realizan en el entorno natural de la célula productora de molécula de unión, mediante una célula productora de molécula de unión recombinante, y son introducidas por acción del hombre tras la preparación de molécula de unión inicial. Naturalmente, la expresión molécula de unión desnuda o no conjugada incluye moléculas de unión que tienen la capacidad de formar asociaciones funcionales con células y/o moléculas efectoras tras la administración al organismo, ya que algunas de esas interacciones son necesarias con el fin de ejercer un efecto biológico.
Muestra biológica
Como se usa en el presente documento, la expresión "muestra biológica" comprende una variedad de tipos de muestra, incluyendo sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tales como especímenes de biopsia o cultivos de tejido, o células derivadas de ellas y su progenie. La expresión incluye también muestras que han sido manipuladas de cualquier modo tras su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento en determinados componentes, tales como proteínas o polinucleótidos. La expresión comprende diversos tipos de muestras clínicas obtenidas a partir de cualquier especie, y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares y lisados celulares.
Leucemia mieloide crónica
La expresión "leucemia mieloide crónica" como se usa en el presente documento se caracteriza por una proliferación descontrolada de células mielopoyéticas en la médula ósea y sitios extramedulares en los que el mieloblasto maligno es capaz de diferenciarse y dar lugar a mielocitos, metamielocitos, células en banda y granulocitos.
Regiones determinantes de la complementariedad (CDR)
La expresión "regiones determinantes de la complementariedad" como se usa en el presente documento significa secuencias dentro de las regiones variables de moléculas de unión, tales como inmunoglobulinas, que generan el sitio de unión a antígeno que es complementario en su forma y distribución de carga al epítopo reconocido en el antígeno. Las regiones CDR pueden ser específicas para epítopos lineales, epítopos discontinuos o epítopos conformacionales de proteínas o fragmentos de proteína, bien como se presentan en la proteína en su conformación nativa o, en algunos casos, como se presentan en las proteínas desnaturalizadas, p. ej., por solubilización en SDS. Los epítopos pueden consistir también en modificaciones postraduccionales de proteínas.
Deleción
El término "deleción" como se usa en el presente documento, denota un cambio en una secuencia, bien de aminoácidos o de nucleótidos, en el que uno o más residuos de aminoácido o nucleótido, respectivamente, están ausentes en comparación con la molécula progenitora, frecuentemente natural.
Secuencia de ácidos nucleicos reguladora de la expresión
La expresión "secuencia de ácidos nucleicos reguladora de la expresión" como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de polinucleótidos necesarias para y/o que afectan a la expresión de una secuencia codificante unida de forma operable en un organismo huésped concreto. Cuando dos secuencias de ácidos nucleicos están unidas de forma operable, estarán normalmente en la misma orientación y también en el mismo marco de lectura. Normalmente serán esencialmente contiguas, a pesar de que puede que no sea necesario. Las secuencias de ácidos nucleicos reguladoras de la expresión, tales como, entre otras, secuencias de iniciación de las transcripción, terminación, promotoras, potenciadoras adecuadas; secuencias represoras o activadoras, señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de ayuste y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (p. ej., sitios de unión a ribosomas); secuencias que potencian la estabilidad de proteínas; y, cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de proteínas, pueden ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que muestre actividad en el organismo huésped elegido y pueden derivar de genes que codifican proteínas, que son, o bien homólogos o bien heterólogos para el organismo huésped.
Variante funcional
La expresión "variante funcional", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de unión que comprende una secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos que está alterada en uno o más nucleótidos y/o aminoácidos en comparación con las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de la molécula de unión progenitora y que sigue siendo capaz de competir por la unión al compañero de unión, p. ej., CD1a, con la molécula de unión progenitora. En otras palabras, las modificaciones en la secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de la molécula de unión progenitora no afectan o alteran significativamente las características de unión de la molécula de unión codificada por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos, es decir, la molécula de unión sigue siendo capaz de reconocer y unir su objetivo. La variante funcional puede tener modificaciones de secuencia conservadoras que incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Estas modificaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR aleatoria.
Las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen, por ejemplo, aquellas en las que el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene propiedades estructurales o químicas similares. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas en beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Además, una variante puede tener sustituciones de aminoácidos no conservadoras, p. ej., reemplazo de un aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene propiedades estructurales o químicas diferentes. Las variaciones secundarias similares pueden incluir también deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Pueden utilizarse programas informáticos bien conocidos en la técnica como guía para determinar qué residuos de aminoácido pueden ser sustituidos, insertados o delecionados sin eliminar la actividad inmunológica.
Una mutación en una secuencia de nucleótidos puede ser una única alteración realizada en un locus (una mutación puntual), tal como mutaciones de transición o transversión, o, alternativamente, pueden insertarse, delecionarse o cambiarse varios nucleótidos en un único locus. Además, pueden realizarse una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de nucleótidos. Las mutaciones pueden realizarse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica.
Huésped
El término "huésped", como se usa en el presente documento, pretende referirse a un organismo o una célula en la que se ha introducido un vector tal como un vector de clonación o un vector de expresión. El organismo o célula puede ser procariota o eucariota. Debería entenderse que este término pretende referirse no sólo al organismo o célula objeto concreto, sino también a la progenie de dicho organismo o célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido, bien a mutación o bien a influencias del entorno, dicha progenie puede no ser, de hecho, idéntica al organismo o célula progenitor, pero se incluye aun así dentro del alcance del término "huésped" como se usa en el presente documento.
Humana(s)
El término "humana(s)", cuando se aplica a moléculas de unión como se definen en el presente documento, se refiere a moléculas de unión que, o bien derivan directamente de un ser humano, o bien se basan en una secuencia humana. Cuando una molécula de unión deriva de o está basada en una secuencia humana y posteriormente se modifica, sigue considerándose humana, como se usa a lo largo de la memoria descriptiva. En otras palabras, el término "humana(s)" cuando se aplica a moléculas de unión pretende incluir moléculas de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana basadas en regiones variables o constantes, presentes o no en un ser humano o un lifocito humano o en una forma modificada. Por tanto, las moléculas de unión humanas pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana, comprender sustituciones y/o deleciones (p. ej., mutaciones introducidas mediante, por ejemplo, mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). "Basado en" como se usa en el presente documento también se refiere a la situación de que una secuencia de ácidos nucleicos puede copiarse exactamente a partir de una plantilla, o con mutaciones secundarias, tal como mediante procedimientos de PCR propensa a error, o fabricarse sintéticamente haciendo coincidir la plantilla exactamente o con modificaciones secundarias. Las moléculas semisintéticas basadas en secuencias humanas también se consideran humanas como se usa en el presente documento.
Inmunoliposoma
El término "inmunoliposoma" se refiere a un liposoma que porta una molécula de unión, como se define en el presente documento, que actúa como un resto diana, permitiendo que el liposoma se una específicamente al compañero de unión de la molécula de unión. El compañero de unión puede estar presente en disolución o puede estar unido a la superficie de una célula.
Inserción
El término "inserción", también conocido como el término "adición", denota un cambio en una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que da como resultado la adición de uno o más residuos de aminoácido o nucleótido, respectivamente, en comparación con la molécula progenitora, frecuentemente natural.
Molécula de unión internalizadora
La expresión "molécula de unión internalizadora" como se usa en el presente documento significa una molécula de unión como se define en el presente documento que es capaz de internalizarse dentro de las células diana a las que se une. En otras palabras, la molécula de unión es incorporada, es decir, transportada desde el exterior (superficie celular) de una célula diana al interior, p. ej., al compartimento endosómico u otro compartimento o al citoplasma de la célula, por las células diana tras la unión al compañero de unión de la molécula de unión.
Aislada(s)
El término "aislada(s)", cuando se aplica a moléculas de unión como se definen en el presente documento, se refiere a moléculas de unión que, sustancialmente, no tienen otras proteínas o polipéptidos, concretamente no tiene otras moléculas de unión que tengan especificidades antigénicas diferentes, y tampoco tienen, sustancialmente, otros compuestos químicos y/o materiales celulares. Por ejemplo, cuando las moléculas de unión se producen por recombinación, preferentemente no tienen, sustancialmente, medio de cultivo, y cuando las moléculas de unión se producen por síntesis química, preferentemente no tienen, sustancialmente, precursores químicos u otros compuestos químicos, es decir, están separadas de los precursores químicos u otros compuestos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. El término "aislada(s)" cuando se aplica a moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas de unión como se definen en el presente documento, pretende referirse a moléculas de ácido nucleico en las que las secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas de unión no tienen, sustancialmente, otras secuencias de nucleótidos, concretamente secuencias de nucleótidos que codifican moléculas de unión que unen compañeros de unión distintos de CD1a. Además, el término "aislada(s)" se refiere a moléculas de ácido nucleico que están sustancialmente separadas de otros componentes celulares que acompañan de forma natural a la molécula de ácido nucleico nativa en su huésped natural, p. ej., ribosomas, polimerasas o secuencias genómicas con las que se asocia naturalmente. Además, las moléculas de ácido nucleido "aisladas", tales como moléculas de ADNc, pueden no tener, sustancialmente, otros materiales celulares o medio de cultivo cuando se producen mediante técnicas recombinantes, o no tener, sustancialmente, precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetizan químicamente.
Histiocitosis de células de Langerhans (LCH)
La expresión "histiocitosis de células de Langerhans (LCH)" se refieren a un trastorno que se caracteriza por la proliferación localizada o generalizada de células de tipo dendrítico, semejantes a las células de Langerhans. Estas células tienen su origen en la médula ósea y normalmente están presentes principalmente en la piel. En la LCH estas células proliferan y pueden afectar o no a muchos otros órganos como, entre otros, huesos, hígado, pulmones y cerebro. La LCH es el más frecuente entre los trastornos histiocíticos. La enfermedad se produce en personas de todas las edades, pero el pico de incidencia es en niños de entre 0 y 4 años de edad. Los síntomas clínicos varían ampliamente desde erupción limitada en la piel o lesiones óseas únicas, que pueden curarse espontáneamente, hasta implicación y disfunción de órganos y vísceras extensiva, que conduce finalmente a la muerte del paciente.
Liposoma
El término "liposoma" como se usa en el presente documento se refiere a una vesícula pequeña delimitada por una capa compuesta por diversos tipos de lípidos, preferentemente lípidos anfipáticos, fosfolípidos y/o tensioactivos y fabricada artificialmente a partir de estas moléculas mediante técnicas conocidas en la técnica tales como sonicación
o retirada del detergente de complejos fosfolípido-detergente. La capa es normalmente una bicapa formada por moléculas que comprenden una parte hidrófoba y una parte hidrófila, en la que las parte hidrófobas se asocian en un medio acuoso para formar una parte interna de la capa, mientras que las partes hidrófilas permanecen en contacto con el medio. La capa rodea e incluye un interior, el cual pueden contener, completamente o parcialmente, una fase acuosa, un sólido, un gel, una fase gaseosa o un fluido no acuoso. Los liposomas son útiles para la adminstración de una o más moléculas tales como moléculas de ácido nucleico, moléculas de unión, proteínas, sustancias tóxicas y otros materiales o compuestos a células tales como células animales mediante fusión de liposomas con la membrana plasmática, un procedimiento denominado también lipofección. Las moléculas pueden estar contenidas en el interior del liposoma, en la capa lipídica o unidas a la superficie exterior de la capa lipídica.
Anticuerpo monoclonal
La expresión "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo monoclonal que muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo concreto. En consecuencia, la expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo que muestra una sola especificidad de unión que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana o derivadas de secuencias totalmente sintéticas o semisintéticas.
Síndrome mielodisplásico
La expresión "síndrome mielodisplásico" como se usa en el presente documento engloba un grupo heterogéneo de trastornos hematopoyéticos clonales estrechamente relacionados que se originan en una célula formadora de sangre tempranas de la médula. Todos los trastornos se caracterizan por una médula ósea con morfología y maduración dañadas (dismielopoyesis) y citopenias de la sangre periférica, que resultan de una producción ineficaz de células sanguíneas. En otras palabras, las células sanguíneas en maduración, frecuentemente mueren en la médula antes de alcanzar la madurez total y entrar en la sangre, contribuyendo a concentraciones bajas de células sanguíneas. En pacientes que padecen síndrome mielodisplásico puede darse también una acumulación de células de la médula muy inmaduras, denominadas blastocitos leucémicos.
Natural
El término "natural" como se usa en el presente documento aplicado a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo que puede aislarse a partir de una fuerte de la naturaleza y que no ha sido modificado por el ser humano en el laboratorio, es natural.
Células neoplásicas
La expresión "células neoplásicas" como se usa en el presente documento se refiere a células que resultan de un nuevo crecimiento autónomo no deseado que no tiene una función fisiológica evidente. Una célula neoplásica incluye además células transformadas y células cancerosas, incluyendo cánceres sanguíneos (benignos y malignos).
Molécula de ácido nucleico
La expresión "molécula de ácido nucleico" como se usa en la presente invención se refiere a una forma polimérica de nucleótidos e incluye hebras, tanto sentido como antisentido, de ARN, ADNc, ADN genómico y formas sintéticas y polímeros mezclados de las anteriores. Un nucleótido se refiere a un ribonucleótido, desoxirribonucleótido o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. La expresión incluye también formas monocatenarias y bicatenarias de ADN. Además, un polinucleótido puede incluir nucleótidos naturales o modificados, o ambos, unidos mediante enlaces de nucleótidos naturales y/o no naturales. Las moléculas de ácido nucleico pueden modificarse químicamente o bioquímicamente o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleótido tales como enlaces no cargados (p. ej., metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos pendientes (p. ej., polipéptidos), intercaladores (p. ej., acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquiladores y enlaces modificados (p. ej., ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). La expresión anterior pretende incluir también cualquier conformación topológica, incluyendo conformaciones monocatenarias, bicatenarias, en dúplex parcial, en tríplex, con forma de horquilla, circulares y cerradas. También están incluidas moléculas sintéticas que imitan a polinucleótidos en su capacidad para unirse a una secuencia designada a través de enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que enlaces peptídicos sustituyen enlaces fosfato en el esqueleto de la molécula. Una referencia a una secuencia de ácidos nucleicos engloba su complemento a no ser que se especifique lo contrario. Por tanto, una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia concreta debería entenderse como que engloba su hebra complementaria, con su secuencia complementaria. La hebra complementaria también es útil, p. ej., para tratamiento antisentido, sondas de hibridación y cebadores de PCR.
Enlazado de forma operable
La expresión "enlazado de forma operable" se refiere a dos o más elementos de secuencia de ácidos nucleicos que están físicamente enlazados y están en una relación funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor está unido de forma operable a una secuencia codificante si el promotor es capaz de iniciar o regular la transcripción o expresión de una secuencia codificante, en cuyo caso la secuencia codificante debería entenderse como que está "bajo el control" del promotor. Generalmente, cuando dos secuencias de ácidos nucleicos están unidas de forma operable, estarán en la misma orientación y normalmente también en el mismo marco de lectura. Normalmente serán esencialmente contiguas, a pesar de que puede que no sea necesario.
Excipiente farmacéuticamente aceptable
Por "excipiente farmacéuticamente aceptable" se quiere decir cualquier sustancia inerte que está combinada con una molécula activa, tal como un fármaco, agente o molécula de unión, para preparar una forma de dosificación adecuada o conveniente. El "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un excipiente que no es tóxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación que comprende el fármaco, agente o molécula de unión.
Que se une específicamente
La expresión "que se une específicamente", como se usa en el presente documento, en referencia a la interacción de una molécula de unión, p. ej., un anticuerpo, y su compañero de unión, p. ej., un antígeno, significa que la interacción depende de la presencia de una estructura concreta, p. ej., un determinante antigénico o epítopo, en el compañero de unión. En otras palabras, el anticuerpo se une o reconoce preferentemente al compañero de unión incluso cuando el compañero de unión está presente en una mezcla de otras moléculas. La unión puede estar mediada por interacciones covalentes o no covalentes o una combinación de ambas.
Sustituciones
Una "sustitución", como se usa en el presente documento, denota el reemplazo de uno o más aminoácidos o nucleótidos por diferentes aminoácidos o nucleótidos, respectivamente.
Cantidad terapéuticamente eficaz
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de la molécula de unión como se define en el presente documento que es eficaz para prevenir y/o tratar un trastorno o enfermedad en los que moléculas de CD1a juegan un papel o están asociadas con ellos, o mejorar una afección asociada con la enfermedad o trastorno.
Tratamiento
El término "tratamiento" se refiere a tratamiento terapéutico, así como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen la enfermedad o trastorno en los que moléculas de CD1a juegan un papel o están asociadas con ellos, así como aquellos en los que ha de evitarse la enfermedad o trastorno.
Vector
El término "vector" denota una molécula de ácido nucleico en la que puede insertarse una segunda molécula de ácido nucleico para la introducción en un huésped donde se duplicará y, en algunos caso, se expresará. En otras palabras, un vector es capaz de portar una segunda molécula de ácido nucleico a la cuál ha sido enlazado. El término "vector", como se usa en el presente documento, contempla tanto vectores de clonación como de expresión. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC) y vectores derivados de bacteriófagos o virus vegetales o animales (incluidos humanos). Los vectores comprenden un origen de replicación reconocido por el huésped propuesto y, en el caso de vectores de expresión, promotores y otras regiones reguladores reconocidas por el huésped. Un vector que contiene una segunda molécula de ácido nucleico puede introducirse en una célula por transformación, transfección o haciendo uso de mecanismos víricos de entrada. Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en un huésped en el que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano). Se pueden integrar otros vectores en el genoma de un huésped tras la introducción en el huésped y, de este modo, se replican junto con el genoma del huésped.
Sumario de la invención
En la presente invención se han identificado y obtenido varias moléculas de unión humanas capaces de unirse a una CD1a humana usando tecnología de presentación de fagos. Además, se han descrito procedimientos para producir estas moléculas de unión humanas y el uso de las moléculas de unión humanas en el diagnóstico, prevención y tratamiento de, entre otros, trastornos y enfermedades neoplásicos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención engloba moléculas de unión humanas capaces de unirse específicamente a CD1a humanas. La moléculas de unión también son capaces de unirse, concretamente unirse específicamente, a un fragmento de CD1a humana, comprendiendo el fragmento al menos el determinante antigénico de CD1a que es reconocido por las moléculas de unión humanas de la invención. Las moléculas de unión humanas capaces de unir específicamente formas naturales truncadas o segregadas, formas variantes naturales (p. ej., formas de ayuste alternativo) y variantes alélicas naturales de CD1a también son parte de la presente invención. Las moléculas de unión de la invención pueden ser capaces también de unirse específicamente a análogos o variantes no naturales de CD1a siempre que las modificaciones no eliminen la unión de las moléculas de unión a las moléculas de CD1a.
Las moléculas de unión humanas de acuerdo con la invención pueden ser moléculas de inmunoglobulina intactas, tales como anticuerpos policlonales o monoclonales, o las moléculas de unión pueden ser fragmentos de unión a antígeno incluyendo, pero sin limitarse a, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios bivalentes, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica a los (poli)péptidos. Las moléculas de unión humanas de la invención pueden usarse en forma no aislada o aislada. Además, las moléculas de unión humanas de la invención pueden usarse solas o en una mezcla que comprende al menos una molécula de unión humana (o una de sus variantes o fragmentos). En otras palabras, las moléculas de unión humanas pueden usarse en combinación, p. ej., como una composición farmacéutica que comprende dos o más moléculas de unión humanas o sus fragmentos. Por ejemplo, pueden combinarse moléculas de unión humanas que tenga actividades diferentes, pero complementarias, en un sólo tratamiento para lograr un efecto terapéutico o diagnóstico deseado, pero, alternativamente, también pueden combinarse moléculas de unión humanas con actividades idénticas en un sólo tratamiento para lograr un efecto terapéutico o diagnóstico deseado. La mezcla puede comprender además al menos otro agente terapéutico. Normalmente, las moléculas de unión humanas de acuerdo con la invención pueden unirse a sus compañeros de unión, es decir, CD1a humanas, con una constante de afinidad (valor de Kd) que es menor de 0,2*10-4 M, 1,0*10-5 M, 1,0*10-6 M, 1,0*10-7 M, preferentemente menor de 1,0*10-8 M, más preferentemente menor de 1,0*10-9 M, más preferentemente menor de 1,0*10-10 M, incluso más preferentemente menor de 1,0*10-11 M y, en particular, menor de 1,0*10-12 M. Las constantes de afinidad pueden variar para isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, la afinidad de unión por un isotipo de IgM se refiere a una afinidad de unión de al menos aproximadamente 1,0*10-7 M. Las constantes de afinidad pueden medirse, por ejemplo, usando resonancia de plasmón superficial, es decir, un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones proteicas dentro de una matriz de biosensores, usando por ejemplo el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia).
Las moléculas de unión humanas de acuerdo con la invención pueden unirse a CD1a humanas en forma soluble o pueden unirse a CD1a humanas enlazadas o unidas a un transportador o sustrato, p. ej., placas de microvaloración, membranas y perlas, etc. Los transportadores o sustratos pueden fabricarse de vidrio, plástico (p. ej., poliestireno), polisacáridos, nailon, nitrocelulosa o teflón, etc. La superficie de tales soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma adecuada. Además, las moléculas de unión humanas pueden unirse a las CD1a humanas en una forma purificada o no purificada. Preferentemente, las moléculas de unión humanas son capaces de unirse específicamente a moléculas de CD1a humanas asociadas con células, tales como células humanas positivas para CD1a o partes de estas células que comprenden CD1a humanas o uno de sus fragmentos.
En una realización de la invención, las moléculas de unión humanas de la invención que permanecen unidas a la superficie tras unirse a CD1a humanas presentes en la superficie de células diana pueden usarse en el formato de moléculas de unión desnudas para apoyar posibles funciones efectoras de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
ADCC se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (p. ej., células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen la denominada porción Fc de moléculas de unión, mientras que estas últimas se unen a una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. CDC se refiere a la capacidad de una molécula para lisar una diana en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia por la unión del Cebador componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula de unión complejada con un antígeno afín. Para distinguir la muerte celular inducida por citotoxicidad celular/mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), puede determinarse la muerte celular in vitro en ausencia de células efectoras del complemento e inmunitarias. El ensayo para evaluar la muerte celular puede realizarse, por ejemplo, usando suero inactivado por calor (es decir, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunitarias. Para determinar si la molécula de unión es capaz de inducir la muerte celular, puede evaluarse la pérdida de integridad de membrana evaluada mediante captación de yoduro de propidio (PI), azul de tripano o 7AAD, con relación a células no tratadas.
Los anticuerpos desnudos de acuerdo con la invención pueden inducir también la apoptosis de células diana de otro modo que mediante ADCC o CDC. Las células diana incluyen, pero no se limitan a, células positivas para CD1a tales como células neoplásicas. Los procedimientos para medir la apoptosis son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, análisis por FACS usando tinción con anexina V, electroforesis de ADN, captación de yoduro de propidio (PI), azul de tripano o 7AAD.
Las moléculas de unión desnudas de acuerdo con la invención también pueden usarse para inhibir o bloquear la unión de otra molécula, tal como un ligando, que se une normalmente de CD1a. De este modo, las moléculas de unión humanas podrían interferir con uno o más procesos posibles corriente abajo que son desencadenados/activados por la unión/interacción de la molécula con CD1a.
Alternativamente, tras la unión a moléculas de CD1a presentes en la superficie de células diana, las moléculas de unión humanas como se definen en el presente documento pueden internalizarse. La internalización de moléculas de unión puede ensayarse por técnicas conocidas que incluyen, pero no se limitan a, rastreo específico de moléculas de unión internalizadas capaces de unir moléculas de CD1a. Las moléculas de unión pueden marcarse con un fluorocromo y puede medirse la internalización mediante citometría de flujo o microscopía de barrido láser confocal.
En el caso de que las moléculas de unión humanas como se definen en la presente invención se internalicen lentamente y, antes de la internalización, permanezcan unidas a las superficie de células diana durante un periodo de tiempo prolongado, pueden ser útiles, de forma similar a las moléculas de unión que no se internalizan en absoluto, en tratamientos que hacen uso de ADCC, CDC, apoptosis o tratamiento con enzimas-profármacos dirigidos por anticuerpos (ADEPT). ADCC, CDC y apoptosis se analizan anteriormente, mientras que ADEPT se analiza a continuación.
Las moléculas de unión humanas de acuerdo con la invención comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 8 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 20.
Se han depositado los plásmidos que comprenden ADN que codifica la cadena pesada o la cadena ligera de anticuerpos IgG1 humanos dirigidos contra CD1a humanas, llamándose dichos anticuerpos 02-113, 02-114, 02-115, 02-116, 02-117 y 02-118. Los plásmidos que comprenden ADN que codifica las cadenas pesadas de IgG1 humanas anti-CD1a se denominaron pgG102-U3C03, pgG102-114C03, pgG102-115C03, pgG102-116C03 , pgG102-117C03 y pgG102-118C03 y se depositaron en la Colección Europea de Cultivos de Células (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 28 de octubre de 2003, bajo los números de acceso 03102801, 03102802, 03102803, 03102804, 03102805 y 03102806, respectivamente. El plásmido que comprende ADN que codifica la cadena ligera de las IgG1 humanas anti-CD1a llamadas 02-113, 02-114, 02-116, 02-117 y 02-118 se denominó pSyn-COS-Vk1 y depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 28 de octubre de 2003, bajo el número de acceso 03102807. El plásmido que comprende ADN que codifica la cadena ligera de la IgG1 humana anti-CD1a llamada 02-115 se denominó pSyn-C04-V13 y se depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 28 de octubre de 2003, bajo el número de acceso 03102808.
Otro aspecto de la invención incluye variantes funcionales de moléculas de unión o sus fragmentos como se definen en el presente documento. Las moléculas se consideran variantes funcionales de una molécula de unión de acuerdo con la invención si las variantes son capaces de competir por unirse específicamente a CD1a humanas, preferentemente compitiendo por el mismo sitio de unión en la CD1a humana, con las moléculas de unión progenitoras. En otras palabras, cuando las variantes funcionales son todavía capaces de unirse a CD1a humanas o una de sus porciones. Las variantes funcionales incluyen, pero no se limitan a, derivados que son sustancialmente similares en la secuencia estructural primaria, pero que contienen, p. ej., modificaciones in vitro o in vivo, químicas y/o bioquímicas, que no se encuentran en la molécula de unión progenitora. Tales modificaciones incluyen, entre otras, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, anclaje covalente de flavina, anclaje covalente de un resto hemo, anclaje covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, anclaje covalente de un lípido o derivado de lípido, anclaje covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gammacarboxilación, glucosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tal como arginilación, ubiquitinación y similares.
Alternativamente, las variantes funcionales pueden ser moléculas de unión como se definen en la presente invención que comprenden una secuencia de aminoácidos que contiene sustituciones, inserciones, deleciones o sus combinaciones de uno o más aminoácidos comparadas con las secuencias de aminoácidos de las moléculas de unión progenitoras. Además, las variantes funcionales pueden comprender truncaciones de la secuencia de aminoácidos en cualquiera de los extremos amino o carboxi o en ambos. Las variantes funcionales de acuerdo con la invención pueden tener las mismas o diferentes afinidades de unión, mayores o menores, comparadas con la molécula de unión progenitora, pero siguen siendo capaces de unirse a moléculas de CD1a humanas presentes, p. ej., en una célula. Por ejemplo, las variantes funcionales de acuerdo con la invención pueden tener afinidades de unión incrementadas o reducidas por CD1a humanas comparadas con las moléculas de unión progenitoras. Preferentemente, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables, incluyendo, pero sin limitarse a, regiones marco, regiones hipervariables, concretamente regiones las CDR3, son modificadas. Generalmente, las regiones de cadena ligera y cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables, que comprenden tres CDR, y regiones más conservadas, las llamadas regiones marco (FR). Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácido de CDR y residuos de aminoácido de bucles hipervariables. Las variantes funcionales que se pretende que estén dentro del alcance de la presente invención tienen al menos de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 99 %, preferentemente al menos de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 99 %, más preferentemente al menos de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 99 %, incluso más preferentemente al menos de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 99 %, lo más preferentemente al menos de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 99 %, en particular al menos de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 99 % y en particular al menos de aproximadamente el 97 % a aproximadamente el 99 % de homología de secuencia de aminoácidos con las moléculas de unión progenitoras como se definen en el presente documento. Pueden usarse algoritmos computacionales tales como, entre otros Gap o Bestfit, conocidos por los expertos en la técnica para alinear de forma óptima secuencias de aminoácidos que se quieren comparar y para definir residuos de aminoácidos similares o idénticos.
Las variantes funcionales pueden obtenerse alterando las moléculas de unión progenitoras o partes de ellas mediante procedimientos de biología molecular generales conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, PCR propensa a error, mutagénesis dirigida por oligonucleótido y mutagénesis dirigida a sitio.
En otro aspecto más, la invención incluye inmunoconjugados, es decir, moléculas que comprenden al menos una molécula de unión humana como se define en el presente documento que comprende al menos un marcador, tal como un resto terapéutico que inhibe o evita la función de células y/o provoca la destrucción de células. También se contemplan en la presente invención mezclas de inmunoconjugados de acuerdo con la invención o mezclas de al menos un inmunoconjugado de acuerdo con la invención y otra molécula, tal como un agente terapéutico u otra molécula de unión o inmunconjugado. En una realización adicional, los inmunoconjugados de la invención pueden comprende más de un marcador. Estos marcadores pueden ser iguales o distintos unos de otros y pueden estar unidos/conjugados de forma no covalente a las moléculas de unión. Los marcadores también pueden estar unidos/conjugados directamente con las moléculas de unión a través de enlaces covalentes, incluyendo, pero sin limitarse a, puentes disulfuro, enlaces electrostáticos, fusión recombinante y enlace conformacional. Alternativamente, los marcadores pueden estar unidos/conjugados con las moléculas de unión mediante uno o más compuestos de enlace. Las técnicas para conjugar marcadores con moléculas de unión son bien conocidas, véase,
p. ej., Arnon y col., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting de Drugs In Cancer Therapy, págs. 243-256 en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (1985), Editado por: Reisfeld y col., A. R. Liss, Inc.; Hellstrom y col., Antibodies For Drug Delivery, págs. 623-653 en Controlled Drug Delivery, 2ª edición (1987), Editado por: Robinson y col., Marcel Dekker, Inc.; Thorpe, Antibody Carriers de Cytotoxic Agents, págs. 475-506 en Cancer Therapy: A Review, en Monoclonal Antibodies ‘'84 : Biological And Clinical Applications (1985), Editado por: Pinchera y col.; Analysis, Results, And Future Prospective de The Therapeutic Use de Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, págs. 303-316 en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (1985), Editado por: Baldwin y col., Academic Press.
Los marcadores de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, sustancias tóxicas, sustancias radioactivas, liposomas, enzimas, secuencias de polinucleótidos, plásmidos, proteínas, péptidos o sus combinaciones. Las sustancias tóxicas incluyen, pero no se limitan a, agentes citotóxicos, tales como toxinas de molécula pequeña o agentes quimioterapéuticos, o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o sus fragmentos. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas tales como altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromoinicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antibióticos macrólidos tales como geldanamicina y maitansina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo; análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofuro, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; restablecedor de ácido fólico tal como el ácido folínico; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; triazenos; epipodofilotoxinas; complejos de coordinación de platino; maitansinoides; y taxoides, tales como paclitaxel y doxetaxel. También se incluyen en la presente invención sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En general, se describen agentes quimioterapéuticos adecuados en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª edición (1990), Editado por: A.R. Gennaro, Mack Publishing Co., Filadelfia y en The Pharmacological Basis de Therapeutics de Goodman y Gilman, 7ª edición (1985), Editado por: A.G. Gilman, L.S. Goodman, T.W. Rail y F. Murad. MacMillan Publishing Co., Nueva York. Agentes terapéuticos adecuados que se encuentran aún en fase experimental son conocidos por expertos en la técnica y pueden ser usados también como sustancias tóxicas en la presente invención.
Ejemplos de toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal incluyen, pero no se limitan a, cadena A de la ricina, cadena A de la modeccina, cadena A de la abrina, cadena A de la endotoxina y exotoxina de Pseudomonas, toxina A de shiga, factor letal del carbunco, cadena A de la difteria, fragmentos activos de la toxina de la difteria que no se unen, enterotoxina A estafilocócica, angiogenina de la ribonucleasa humana, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenes, saporina, alfa-sarcina y sus fragmentos o derivados.
Pueden producirse proteínas de fusión que comprenden toxinas enzimáticamente activas y moléculas de unión del inmunoconjugado de la invención mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como, p. ej., por recombinación construyendo moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas de unión humanas en un marco con secuencias de nucleótidos que codifican la toxina enzimáticamente activa y después expresar las moléculas de ácido nucleico. Alternativamente, pueden producirse proteínas de fusión químicamente conjugando, directamente o indirectamente a través, por ejemplo, de un enlazador, moléculas de unión como se definen en el presente documento con toxinas enzimáticamente activas.
Los inmunoconjugados que comprenden enzimas pueden ser útiles en tratamiento con enzimas-profármacos dirigidos por anticuerpos (ADEPT). En esta técnica las enzimas se conjugan con moléculas de unión. Esta conjugación convierte a las enzimas en profármacos inactivos. Los conjugados de molécula de unión-enzima se administran entonces y se unen al compañero de unión de la molécula de unión. Tras la eliminación de los conjugados de la circulación, se administran los profármacos, que se convierten en fármacos activos por la enzima de los conjugados. Entonces se producirá la captación pasiva de los fármacos activos en las células diana.
También se contemplan dentro de la presente invención moléculas de unión del inmunoconjugado de la invención que están marcadas con radionúclidos. Los radionúclidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, radionúclidos que emiten radiación alfa, tales como, entre otros, 212bismuto, 213bismuto y 211astatina; radionúclidos que emiten radiación beta, tales como, entre otros, 131yodo, 90itrio, 186rodio y 188rodio; y radionúclidos que emiten radiación gamma, tales como, entre otros, 131yodo, 186rodio y 188rodio. Los radionúclidos adecuados incluyen además, pero no se limitan a, radionúclidos que emiten electrones Auger, tales como, entre otros, 123yodo, 124yodo, 125yodo, 129yodo, 131yodo, 111indio, 77bromo y otros halógenos radiomarcados. El experto apreciará que también pueden identificarse otros radionúclidos adecuados como adecuados en la presente invención. La elección de radionúclido dependerá de muchos factores, tales como, p. ej., el tipo de enfermedad que se va a tratar, la etapa de la enfermedad que se va a tratar, el paciente que se va a tratar y similares. Las moléculas de unión pueden unirse a radionúclidos directamente
o indirectamente a través de un agente quelante mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.
En otra realización, las moléculas de unión del inmunoconjugado de la invención pueden conjugarse con liposomas para producir los denominados inmunoliposomas. Un liposoma puede conjugarse con una o más moléculas de unión, siendo las moléculas de unión iguales o diferentes. Existen diversidad de procedimientos disponibles para preparar liposomas. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, sonicación, extrusión, alta presión/homogeneización, microfluidización, diálisis de detergente, fusión de vesículas liposomales pequeñas inducida por calcio y procedimientos de infusión en éter. Los liposomas pueden ser vesículas multilamelares, pero preferentemente los liposomas son vesículas unilamelares tales como vesículas unilamelarespequeñas (200 - 500 Å) o unilamelares grandes (500 - 5000 Å). Tras la preparación, los liposomas que no han sido dimensionados durante la formación pueden dimensionarse mediante procedimientos conocidos en la técnica para lograr un intervalo de tamaños deseado y una distribución relativamente estrecha de tamaños de liposomas. Los procedimientos de carga de fármacos en liposomas son bien conocidos por los expertos en al técnica. Los procedimientos más comunes incluyen la técnica de encapsulación y el procedimiento de carga por potencial transmembrana. En la técnica de encapsulación, los componentes de fármacos y liposomas se disuelven en un disolvente o mezcla de disolventes orgánicos en el que todas las especies sean miscibles y después se concentran para dar una película seca. Después se añade un tampón a la película seca y se forman los liposomas con los fármacos incorporados en las paredes de la vesícula. Este procedimiento se ha descrito con detalle en las patentes de EE. UU. N.º 4.885.172, 5.059.421 y 5.171.578. El procedimiento de carga por potencial transmembrana se ha descrito con detalle en las patentes de EE. UU. N.º 4.885.172, 5.059.421, 5.171.578, 5.316.771 y 5.380.531. Como se entenderá, las técnicas de carga no se limitan a estas dos técnicas de carga generales.
Los fármacos que pueden cargarse en liposomas incluyen, pero no se limitan a, las sustancias tóxicas mencionadas anteriormente. Los liposomas que han cargado fármacos diferentes y liposomas diferentes, habiendo cargado cada liposoma un tipo de fármaco, pueden ser realizaciones alternativas de liposomas que pueden usarse y estas realizaciones se contemplan también, por lo tanto, en la presente invención. Las moléculas de unión humanas de la invención pueden unirse a la superficie de los liposomas o al extremo de polímeros tales como polietilenglicol que se insertan en la superficie de los liposomas usando técnicas de acoplamiento químico convencionales. Una ventaja de los inmunoliposomas es la capacidad para administrar varias decenas de miles de moléculas de fármaco con unas pocas decenas de moléculas de unión por liposoma, dando como resultado proporciones elevadas de fármacomolécula de unión. Tras la unión de los inmunoliposomas a las células diana el fármaco puede, en el caso de moléculas de unión que se internalizan lentamente o no se internalizan en absoluto, liberarse gradualmente desde los inmunoliposomas y ser captado por las células como fármaco libre usando mecanismos de captación estándar o, en el caso de moléculas de unión que se internalizan rápidamente, los inmunoliposomas mismos son captados por las células diana por endocitosis mediada por receptor y los fármacos se liberan gradualmente dentro de las células.
En otra realización más, las moléculas de unión humanas de la invención pueden estar enlazadas a polímeros biodegradables solubles en agua, tales como, por ejemplo, polímeros de hidroxipropilmetacrilamina (HPMA). Los polímeros tienen sustancias tóxicas enlazadas en sitios separados de los polímeros con el uso de espaciadores degradables apropiados para permitir la liberación de las sustancias tóxicas. Los polímeros descritos anteriormente también se denominan inmunopolímeros.
En otro aspecto, las moléculas de unión humanas de la invención pueden conjugarse/unirse con uno o más antígenos. Preferentemente, estos antígenos son antígenos que son reconocidos por el sistema inmunitario de un sujeto al cual se le administra el conjugado de molécula de unión-antígeno. Los antígenos pueden ser idénticos pero también pueden ser diferentes. Los procedimientos de conjugación para unir los antígenos y las moléculas de unión son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el uso de agentes de entrecruzamiento. Las moléculas de unión humanas se unirán a las células que comprende CD1a humanas y los antígenos unidos a las moléculas de unión iniciarán un ataque de linfocitos T potente sobre el conjugado, que conducirá en última instancia a la destrucción de la célula.
Alternativamente, las moléculas de unión humanas como se describen en la presente invención pueden conjugarse con marcadores y usarse para fines de detección y/o analíticos y/o diagnósticos. Los marcadores usados para marcar las moléculas de unión para esos fines dependen de las técnicas y/o los procedimientos de detección/análisis/diagnóstico específicos usados, tales como, entre otros, tinción inmunohistoquímica de muestras de tejido, detección por citometría de flujo, detección por citometría de barrido láser, inmunoensayos de fluorescencia, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), bioensayos (p. ej., ensayos de inhibición del crecimiento), aplicaciones de transferencia de bandas western, etc. Para la tinción inmunohistoquímica de muestras de tejido los marcadores preferidos son enzimas que catalizan la producción y el depósito local de un producto detectable. Las enzimas conjugadas normalmente con moléculas de unión para permitir su visualización inmunohistoquímica son bien conocidas e incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina, P-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa de rábano y ureasa. Los sustratos típicos para la producción y depósito de productos visualmente detectables incluyen, pero no se limitan a, o-nitrofenil-beta-D-galactopiranósido (ONPG), diclorhidrato de o-fenilenediamina (OPD), p-nitrofenil fosfato (PNPP), p-nitrofenil-beta-D-galactoprianósido (PNPG), 3',3'diaminobencidina (DAB), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), 4-cloro-1-naftol (CN), 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP), ABTS, BluoGal, yodonitrotetrazolio (INT), cloruro de nitroazul de tetrazolio (NBT), metosulfato de fenazina (PMS), monofosfato de fenolftaleína (PMP), tetrametil bencidina (TMB), tetranitroazul de tetrazolio (TNBT), X-Gal, X-Gluc, y X-glucósido. Otros sustratos que pueden usarse para producir productos para depósito local son sustratos luminiscentes. Por ejemplo, en presencia de peróxido de hidrógeno, la peroxidasa de rábano puede catalizar la oxidación de diacilhidrazidas cíclicas tales como el luminol. Además de eso, las moléculas de unión del inmunoconjugado de la invención también pueden marcarse usando oro coloidal o pueden marcarse con radioisótopos, tales como 33P, 32P, 35S, 3H y 125I. Cuando las moléculas de unión de la presente invención se usan para detecciones por citometría de flujo, detecciones por citometría de barrido láser o inmunoensayos de fluorescencia, pueden marcarse de forma útil con fluoróforos. Una amplia variedad de fluoróforos útiles para marcaje fluorescente de las moléculas de unión de la presente invención incluye, pero no se limita a, tintes Alexa Fluor y Alexa Fluor&commat, tintes BODIPY, Cascade Blue, Cascade Yellow, dansilo, lisamina rodamina B, Marina Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 514, Pacific Blue, rodamina 6G, verde rodamina, rojo rodamina, tetrametilrodamina, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, isotiocianato de fluoresceína (FITC), aloficocianina (APC), Rficoeritrina (PE), proteína clorofila peridinina (PerCP), Texas Red, fluoróforos de energía de resonancia fluorescente en tándem PerCP-Cy5.5, PE-Cy5, PE-Cy5.5, PE-Cy7, Texas Red-PE, y APC-Cy7. Cuando las moléculas de unión de la presente invención se usan para detección secundaria usando avidina, estreptavidina, captavidina o neutravidina marcadas, las moléculas de unión pueden marcarse con biotina.
Además de eso, las moléculas de unión humanas de la invención pueden conjugarse con tintes o agentes fotoactivos tales como cromógenos fluorescentes y otros o tintes para usar los inmunoconjugados obtenido de este modo en fotorradiación, fototerapia o terapia fotodinámica. Los tintes o agentes fotoactivos incluyen, pero no se limitan a, photofrin.RTM, diporfirinas y diclorinas sintéticas, ftalocianinas con o sin sustituyentes metálicos, ftalocianina de cloroaluminio con o sin sustituyentes variables, tetrafenil porfirinas O-sustituidas, 3,1-meso tetrakis (opropionamido fenil) porfirina, verdinas, purpurinas, derivados de estaño y cinc de octetilpurpurina, etiopurpurina, hidroporfirinas, bacterioclorinas de la serie tetra(hidroxifenil) porfirina, clorinas, clorina e6, derivado mono-1-aspartilo de clorina e6, derivado di-1-aspartilo de clorina e6, clorina e6 de estaño (IV), meta-tetrahidroxifenilclorina, derivados de benzoporfirina, derivados monoácidos de benzoporfirina, aductos de tetracianoetileno de benzoporfirina, aductos de acetilendicarboxilato de dimetilo de benzoporfirina, aductos de Diels-Alder, anillo monoacídico derivado "a" de benzoporfirina, PC de aluminio sulfonado, AlPc sulfonada, disulfonado, derivado tetrasulfonado, naftalocianinas de aluminio sulfonadas, naftalocianinas con o son sustituyentes metálicos y con o sin sustituyentes variables, antracenodionas, antrapirazoles, aminoantraquinona, tintes de fenoxazina, derivados de fenotiazina, tintes de calcogenopirilio, derivados catiónicos de selena y telurapirilio, PC catiónica sustituida en el anillo, derivado de feoforbida, porfirinas naturales, hematoporfirina, protoporfirina IX inducida por ALA, precursores metabólicos endógenos, benzonaftoporfirazinas del ácido 5-aminolevulínico, sales de iminio catiónicas, tetraciclinas, texafirina de lutecio, etio-purpurina de estaño, porficenos, benzofenotiazinio y sus combinaciones.
Cuando los inmunoconjugados de la invención se usan para uso diagnóstico in vivo, las moléculas de unión humanas también pueden hacerse detectables por conjugación con, p. ej., agentes de contraste para técnicas de imagen por resonancia magnética (MRI), tales como ácido dietilentriaminopentaacético de gadolinio, con agentes de contraste para ultrasonidos o con agentes de contraste para rayos X, o mediante marcaje radioisotópico.
Además, las moléculas de unión humanas o los inmunoconjugados de la invención también pueden unirse a soportes sólidos, que son especialmente útiles para inmunoensayos o purificación del compañero de unión. Tales soportes sólidos pueden ser porosos o no porosos, planos o no planos e incluyen, pero no se limitan a, soportes de vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Las moléculas de unión también pueden, por ejemplo, conjugarse de forma útil con medios de filtración, tales como sefarosa activada con NHS o sefarosa activada con CNBr con fines de de cromatografía de inmunoafinidad. También pueden unirse de forma útil a microesferas paramagnéticas, normalmente mediante interacción biotina-estreptavidina. Las microesferas pueden usarse para aislar células que expresan o presenta CD1a humanas o sus fragmentos. Como otro ejemplo, las moléculas de unión humanas de la presente invención pueden unirse de forma útil a la superficie de una placa de microvaloración para ELISA.
Otro aspecto de la presente invención se ocupa de moléculas de ácido nucleico como se definen en el presente documento que codifican moléculas de unión humanas de la presente invención. En otro aspecto más, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican al menos las moléculas de unión humanas que se unen específicamente a CD1a humanas. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico se aíslan o purifican.
El experto apreciará que se pretende que las variantes funcionales de estas moléculas de ácido nucleico también sean parte de la presente invención. Las variantes funcionales son secuencias de ácidos nucleicos que pueden traducirse directamente, usando el código genético estándar, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la traducida a partir de las moléculas de ácido nucleico progenitoras.
Preferentemente, las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de unión que comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 8 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 20.
En una realización específica de la invención las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de unión de la invención comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID N.º: 7, la SEC ID N.º: 9, la SEC ID N.º: 11, la SEC ID N.º: 13, la SEC ID N.º: 15 y la SEC ID N.º: 17.
En una realización específica de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de unión de la invención comprenden las secuencia de nucleótidos de la SEC ID N.º: 7 y la SEC ID N.º: 19.
Es otro aspecto de la invención proporcionar vectores, es decir, construcciones de ácidos nucleicos, que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Los vectores pueden derivar de plásmidos tales como, entre otros, F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti, etc; cósmidos; fagos tales como lambda, lambdoide, M13, Mu, P1, P22, Q , T-par, T-impar, T2, T4, T7, etc; virus vegetales tales como, entre otros, virus del mosaico de la alfalfa, bromovirus, capilovirus, carlavirus, carmovirus, caulivirus, clostervirus, comovirus, criptovirus, cucumovirus, diantovirus, fabavirus, fijivirus, furoxivirus, geminivirus, hordeivirus, ilarvirus, luteovirus, maclovirus, marafivirus, necrovirus, nepovirus, fitorepvirus, rabdovirus vegetal, potexvirus, potivirus, sobemovirus, tenuivirus, tobamovirus, tobravirus, virus del bronceado del tomate, tombusvirus, timovirus, etc; o virus animales tales como, entre otros, adenovirus, arenovíridos, baculovíridos, birnavíridos, bunyavíridos, calcivíridos, cardiovirus, coronavíridos, corticovíridos, cistovíridos, virus de Epstein-Barr, enterovirus, filovíridos, flavivíridos, virus de la glosopeda, hepaADNvíridos, virus de hepatitis, herpesvíridos, virus de inmunodeficiencia, virus de la gripe, inovíridos, iridovíridos, ortomixovíridos, papovavirus, paramixovíridos, parvovíridos, picornavíridos, poliovirus, poliADNvíridos, poxvíridos, reovíridos, retrovirus, rabdovíridos, rinovirus, virus del bosque de Semliki, tetravíridos, togavíridos, torovíridos, virus vaccinia, virus de la estomatitis vesicular, etc. Pueden usarse vectores para la clonación y/o la expresión de las moléculas de unión de la invención y pueden usarse incluso para fines de tratamiento génico. Los vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención unidas de forma operable a una o más moléculas de ácido nucleico reguladoras de la expresión también están cubiertas por la presente invención. La elección del vector depende de los procedimientos de recombinación seguidos y del huésped usado. La introducción de vectores en células huésped puede efectuarse, entre otros, por transfección con fosfato de calcio, infección vírica, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección con lipofectamina o electroporación. Los vectores pueden duplicarse de forma autónoma o pueden duplicarse junto con el cromosoma en el que se han integrado. Preferentemente, los vectores contienen uno o más marcadores de selección. Como es bien sabido por los expertos en la técnica, la elección de los marcadores puede depender de las células huésped elegidas, aunque esto no es crítico para la invención. Incluyen, pero no se limitan a, kanamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, gen de la timidina cinasa del virus Herpes simplex (HSV-TK), el gen de la hidrofolato reductasa de ratón (dhfr). Los vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de unión como se describen anteriormente unidas de forma operable a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas o péptidos que pueden usarse para aislar las moléculas de unión también están cubiertas por la invención. Estas proteínas o péptidos incluyen, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa, proteínas de unión a maltosa, polihistidina de unión a metales, proteína verde fluorescente, luciferasa y betagalactosidasa.
Los huéspedes que contienen una o más copias de los vectores mencionados anteriormente son un objeto adicional de la presente invención. Preferentemente, los huéspedes son células huésped. Las células huésped incluyen, pero no se limitan a, células de origen mamífero, vegetal, de insectos, fúngico o bacteriano. Las células bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células de bacterias grampositivas tales como varias especies de los géneros Bacillus, Streptomyces y Staphilococcus o células de bacterias gramnegativas tales como varias especies de los géneros Escherichia y Pseudomonas. En el grupo de células fúngicas se usan preferentemente células de levadura. La expresión en levadura puede lograrse usando cepas de levadura tales como, entre otras, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Hansenula polymorpha. Además, pueden usarse células de insectos tales como células de Drosophila y Sf9 como células huésped. Además, las células huésped pueden ser células vegetales tales como, entre otras, células de plantas de cultivo tales como plantas de silvicutura, o células de plantas que proporcionan alimento y materias primas tales como plantas de cereales o plantas medicinales, o células de plantas ornamentales
o células de cultivo de bulbos de flores. Las plantas o células de plantas transformadas (transgénicas) se producen por procedimientos conocidos, por ejemplo, transferencia génica mediada por Agrobacterium, transformación de discos de hoja, transformación de protoplastos por transferencia de ADN inducida por polietilenglicol, electroporación, sonicación, microinyección o transferencia génica biolística. Adicionalmente, un sistema de expresión adecuado puede ser un sistema de baculovirus. En la presente invención se prefieren sistemas de expresión que utilizan células de mamíferos tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células BHK o células de melanoma de Bowes. Las células de mamíferos proporcionan proteínas expresadas con modificaciones postraduccionales que son lo más similares a moléculas naturales de origen mamífero. Dado que la presente invención se ocupa de moléculas que pueden tener que administrarse a seres humanos, un sistema de expresión completamente humano sería especialmente preferido. Por lo tanto, incluso más preferentemente, las células huésped son células humanas. Los ejemplos de células humanas son, entre otros, células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 y HEK293T. Las células de mamíferos preferidas son retinoblastos embrionarios humanos tales como células 911 o la línea celular depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña, el 29 de febrero de 1996 bajo el número 96022940 y comercializada bajo la marca comercial PER.C6TM (PER.C6 es una marca pendiente de Crucell Holland B.V.). En realizaciones preferidas, las células productoras humanas comprenden al menos una parte funcional de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una región E1 de adenovirus en formato expresable. En realizaciones incluso más preferidas, dichas células huésped derivan de una retina humana y se inmortalizan con ácidos nucleicos que comprenden secuencias E1 adenovíricas, tales como la línea celular depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña, el 29 de febrero de 1996 bajo el número 96022940 y comercializada bajo la marca comercial PER.C6TM, y sus derivados. La producción de proteínas recombinantes en células huésped pueden realizarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. El uso de las células comercializadas bajo la marca comercial PER.C6TM como plataforma de producción para proteínas de interés se ha descrito en el documento WO 00/63403.
En otra realización más, las moléculas de unión humanas de la presente invención también pueden producirse en mamíferos transgénicos no humanos tales como, entre otros, conejos, cabras o vacas, y ser segregadas, por ejemplo, en su leche.
Es otro aspecto de la invención proporcionar un procedimiento de producción de moléculas de unión humanas o sus variantes funcionales de acuerdo con la presente invención. El procedimiento comprende las etapas de a) cultivar un huésped como se describe en la presente invención bajo condiciones que conduzcan a la expresión de las moléculas de unión humanas y, opcionalmente, b) recuperar las moléculas de unión humanas expresadas. Las moléculas de unión humanas expresadas pueden recuperarse del extracto sin células, pero preferentemente se recuperan del medio de cultivo. Los procedimientos para recuperar proteínas, tales como moléculas de unión, de extractos sin células o medio de cultivo son bien conocidos por el experto en la técnica. Las moléculas de unión humanas que pueden obtenerse mediante el procedimiento descrito anteriormente también son parte de la presente invención.
Alternativamente, además de la expresión en huéspedes, tales como células huésped, las moléculas de unión humanas de la invención pueden producirse sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales o en sistemas de traducción sin células usando ARN derivados de moléculas de ADN de acuerdo con la invención. Las moléculas de unión humanas que pueden obtenerse mediante los procedimientos sintéticos de producción o sistemas de traducción sin células descritos anteriormente también son parte de la presente invención.
En otra realización alternativa más, las moléculas de unión humanas de acuerdo con la presente invención pueden ser generadas por mamíferos transgénicos no humanos, tales como, por ejemplo, ratones o conejos transgénicos, que expresan genes de inmunoglobulinas humanas. Preferentemente, los mamíferos transgénicos no humanos tienen un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana que codifican la totalidad o parte de las moléculas de unión humanas como se describen anteriormente. Los mamíferos transgénicos no humanos pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de CD1a humanas o uno de sus fragmentos y/o células que expresan moléculas CD1a humanas. Los protocolos para inmunizar mamíferos no humanos están bien establecidos en la técnica. Véase Using Antibodies; A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York y Current Protocols in immunology. Editado por: J.B. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., Nueva York.
Los protocolos de inmunización incluyen frecuentemente inmunizaciones múltiples, con o sin adyuvantes tales como el adyuvante completo de Freund y el adyuvante incompleto de Freund, pero también pueden incluir inmunizaciones con ADN desnudo. En otra realización, las moléculas de unión humanas son producidas por linfocitos B o células plasmáticas derivadas de los animales transgénicos. En otra realización más, las moléculas de unión humanas son producidas por hibridomas que se preparan por fusión de linfocitos B obtenidos a partir de los mamíferos transgénicos no humanos descritos anteriormente con células inmortalizadas. Los linfocitos B, células plasmáticas e hibridomas que se pueden obtener a partir de los mamíferos transgénicos no humanos descritos anteriormente y las moléculas de unión humanas que se pueden obtener a partir de los mamíferos transgénicos no humanos, linfocitos B, células plasmáticas e hibridomas descritos anteriormente, también son parte de la presente invención.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para identificar moléculas de unión humanas de acuerdo con la invención o moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención y comprende las etapas de a) poner en contacto una colección de fagos de moléculas de unión humanas con material que comprende CD1a humanas o una parte de ellas, b) seleccionar al menos una vez un fago unido al material que comprende CD1a humanas o una parte de ellas y c) separar y recuperar el fago unido al material que comprende CD1a humanas o una parte de ellas. El material que comprende CD1a humanas puede ser, p. ej., células transfectadas con plásmidos de expresión de CD1a humanas, CD1a humanas aisladas, la parte extracelular de CD1a humanas, proteínas de fusión que comprenden CD1a humanas o una parte de ellas y similares. Los procedimientos de presentación de fagos para identificar y obtener moléculas de unión, p. ej., anticuerpos, son actualmente procedimientos bien establecidos conocidos por el experto en la técnica. Se describen, p. ej., en la patente de EE. UU. N.º 5.696.108; Burton y Barbas (1994); y de Kruif y col. (1995b). Para la construcción de colecciones de presentación de fagos, se expresan colecciones de genes de regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos monoclonales humanos en la superficie de partículas de bacteriófagos, preferentemente bacteriófagos filamentosos, por ejemplo, en Fv monocatenario (scFv) o en formato Fab (de Kruif y col., 1995b). Las colecciones grandes de fagos que expresan fragmentos de anticuerpos contienen normalmente más de 1,0*109 especificidades de anticuerpo y pueden ensamblarse a partir de las regiones V de las inmunoglobulinas expresadas en linfocitos B de individuos inmunizados o no inmunizados. Alternativamente, las colecciones de presentación de fagos pueden construirse a partir de regiones variables de inmunoglobulinas que se han ensamblado parcialmente in vitro para introducir diversidad adicional de anticuerpos en la colección (colecciones semisintéticas). Por ejemplo, las regiones variables ensambladas in vitro contienen bandas de ADN producido sintéticamente, distribuido aleatoriamente o parcialmente aleatoriamente en aquellas regiones de las moléculas que son importantes para la especificidad de los anticuerpos,
p. ej., las regiones CDR. Los anticuerpos en fagos específicos de antígeno pueden seleccionarse a partir de la colección inmovilizando antígenos diana tales como moléculas CD1a humanas o sus fragmentos sobre una fase sólida y exponiendo posteriormente los antígenos diana a una colección de fagos para permitir la unión de fagos que expresan fragmentos de anticuerpos específicos para el antígeno unido a la fase sólida. Los fagos no unidos se retiran por lavado y los fagos unidos se eluyen de la fase sólida para la infección de bacterias de Escherichia coli (E. coli) y su subsiguiente propagación. Normalmente se requieren varias series de selección y propagación para enriquecer lo suficiente en fagos que se unen específicamente al antígeno diana. Los fagos también pueden seleccionarse por su unión a antígenos complejos tales como mezclas complejas de proteínas o células completas tales como células transfectadas con plásmidos de expresión de CD1a humanas o células que expresan CD1a humanas de forma natural. La selección de anticuerpos en células completas tiene la ventaja de que los antígenos diana se presentan en su configuración nativa, es decir, sin alteraciones por posibles cambios conformacionales que podrían haber sido introducidos en el caso en el que un antígeno se inmoviliza en una fase sólida. Los anticuerpos en fagos específicos de antígeno pueden seleccionarse a partir de la colección incubando una población celular de interés, expresando antígenos conocidos y desconocidos sobre su superficie, con la colección de anticuerpos en fagos dejando, por ejemplo, que la parte scFv o Fab del fago se una a los antígenos de la superficie celular. Tras la incubación y varios lavados para retirar los fagos no unidos y unidos débilmente, las células de interés se tiñen con anticuerpos marcados fluorescentes específicos y se separan en un clasificador de célula activadas por fluorescencia (FACS). Los fagos que se han unido con sus partes scFv o Fab a estas células se eluyen y se usan para infectar Escherichia coli para permitir la amplificación de la nueva especificidad. Generalmente, se requieren una o más series de selección para separar los fagos de interés del gran exceso de fagos que no se unen. Pueden analizarse los patrones de tinción específicos de las preparaciones de fagos monoclonales, permitiendo la identificación del antígeno que se está reconociendo (de Kruif y col., 1995a). El procedimiento de presentación de fagos puede extenderse y mejorarse eliminando elementos de unión no pertinentes durante el cribado mediante la adición de un exceso de moléculas que no son diana similares, pero no idénticas, a la diana, y potenciar considerablemente de este modo la probabilidad de encontrar moléculas de unión pertinentes (Este procedimiento se denomina el procedimiento MasbstractTM. MabstractTM es una solicitud de marca comercial pendiente de Crucell Holland B.V., véase también la patente de EE. UU. número 6.265.150). Alternativamente, pueden realizarse una o más etapas de eliminación antes o después del cribado.
En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento de obtención de una molécula de unión humana o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) realizar el procedimiento de identificación de moléculas de unión humanas de acuerdo con la invención o moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención descrito anteriormente y b) aislar a partir del fago recuperado la molécula de unión humana o el ácido nucleico que codifica la molécula de unión humana. Una vez que se ha determinado o identificado un nuevo anticuerpo monoclonal en fago con el procedimiento de identificación de moléculas de unión humanas o moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de unión humanas descrito anteriormente, el ADN que codifica el scFv o Fab puede aislarse a partir de las bacterias o fagos y combinarse con técnicas estándar de biología molecular para fabricar construcciones que codifican scFv bivalentes o inmunoglobulinas humanas completas de una especificidad deseada (p. ej., IgG, IgA o IgM). Estas construcciones pueden transfectarse en líneas celulares adecuadas y pueden producirse anticuerpos monoclonales humanos completos (Huls y col., 1999; Boel y col., 2000).
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de unión humana, al menos uno de sus fragmentos o variantes funcionales, al menos un inmunoconjugado de acuerdo con la invención
o una de sus combinaciones. Además de eso, las composiciones pueden comprender, entre otras, moléculas estabilizantes, tales como albúmina o polietilenglicol o sales. Preferentemente, las sales usadas son sales que mantienen la actividad biológica deseada de las moléculas de unión humanas y no imparten ningún efecto toxicológico indeseado. Los ejemplos de dichas sales incluyen, pero no se limitan a, sales de adición ácida y sales de adición básica. Las sales de adición ácida incluyen, pero no se limitan a, aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como a partir de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos mono y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos fenilsustituidos, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición básica incluyen, pero no se limitan a, aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares. Si es necesario, las moléculas de unión de la invención pueden recubrirse de o con un material para protegerlas de la acción de ácidos u otras condiciones naturales o no naturales que pueden inactivar las moléculas de unión humanas.
En otro aspecto más, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico como se definen en la presente invención. Las composiciones pueden comprender soluciones acuosas tales como soluciones acuosas que contienen sales (p. ej., NaCl o sales como se describen anteriormente), detergentes (p. ej., SDS) y/u otros componentes adecuados.
Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una molécula de unión humana de acuerdo con la invención, al menos uno de sus fragmentos o variantes funcionales, al menos un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, al menos una composición de acuerdo con la invención o sus combinaciones. La composición farmacéutica de la invención comprende además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede comprender además al menos otro agente terapéutico, profiláctico y/o de diagnóstico.
Normalmente, las composiciones farmacéuticas deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las moléculas de unión humanas, sus variantes o fragmentos, inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en forma de polvo para su reconstitución en el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado antes o en el momento de la administración. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son secado a vacío y secado por congelación (liofilización) que proporcionan un polvo del principio activo más un ingrediente adicional deseado a partir de una de sus soluciones previamente filtrada de forma estéril.
Alternativamente, las moléculas de unión humanas, sus variantes o fragmentos, inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en disolución y el excipiente farmacéuticamente aceptable puede añadirse y/o mezclarse antes o en el momento de la administración para proporcionar una forma inyectable de dosis unitaria. Preferentemente, el excipiente farmacéuticamente aceptable usado en la presente invención es adecuado para concentraciones de fármaco elevadas, puede mantener una fluidez adecuada y, si es necesario, retrasar la absorción.
La elección de la vía de administración óptima de las composiciones farmacéuticas estará influenciada por varios factores incluyendo las propiedades físico-químicas de las moléculas activas dentro de las composiciones, la urgencia de la situación clínica y la relación de las concentraciones en plasma de las moléculas activas con el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, si es necesario, las moléculas de unión humanas de la invención pueden prepararse con vehículos que las protegerán contra una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados.
Se pueden usar, entre otros, polímeros biodegradables biocompatibles tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Además, puede ser necesario recubrir las moléculas de unión humanas con, o coadministrar las moléculas de unión humanas con un material o compuesto que evite la inactivación de las moléculas de unión humanas. Por ejemplo, las moléculas de unión humanas pueden administrarse a un sujeto en un vehículo adecuado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente.
Las vías de administración pueden dividirse en dos categorías principales, administración oral y parenteral. Estas dos categorías incluyen, pero no se limitan a, administración por bolos, bucal, epidérmica, epidural, por inhalación, intraabdominal, intraarterial, intraarticular, intrabronquial, intracapsular, intracardiaca, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelar, intracerebronventricular, intracólica, intracervical, intradérmica, intragástrica, intrahepática, intramedular, intramuscular, intramiocárdica, intranasal, intraocular, intraorbital, intraósea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intraplaca, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intraesternal, intrasinovial, intratecal, intratorácica, intratumoral, intrauterina, intravenosa, intraventricular, intravesical, rectal, espinal, subaracnoidea, subcapsular, subcutánea, subcuticular, sublingual, tópica, transdérmica, transmucosal, transtraqueal y vaginal. La vía de administración preferida es intravenosa.
Las formas de dosificación orales pueden formularse, entre otros, como comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleagionosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras, cápsulas de gelatina blandas, jarabes o elixires, píldoras, grageas, líquidos, geles o suspensiones. Estas formulaciones pueden contener excipientes farmacéuticos incluyendo, pero sin limitarse a, diluyentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes granuladores y disgregantes tales como almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes tales como almidón, gelatina o goma arábiga; agentes lubricantes tales como estearato de calcio, behenato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, estearato de magnesio, aceite mineral, polietilenglicol, estearilo de sodio, fumarato, ácido esteárico, talco, estearato de cinc, conservantes tales como n-propil-p-hidroxibenzoato; agentes colorantes, saborizantes o edulcorantes tales como sacarosa, sacarina, glicerol, propilenglicol o sorbitol; aceites vegetales tales como aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco; aceites minerales tales como parafina líquida, agentes humectantes tales como cloruro de benzalconio, docusato sódico, lecitina, poloxámero, lauril sulfato de sodio, ésteres de sorbitán; y agentes espesantes tales como agar, ácido algínico, cera de abeja, carboximetilcelulosa de calcio, carragenina, dextrina o gelatina.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden formularse para administración parenteral. Las formulaciones para administración parenteral pueden estar, entre otras, en forma de soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas, isotónicas, estériles, no tóxicas, para inyección o infusión. Las vías de administración parenteral preferidas incluyen inyección o infusión intravenosa, intraperitoneal, epidural, intramuscular e intratumoral. Las soluciones o suspensiones pueden comprender agentes que no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, tales como 1,3-butanodiol, solución de Ringer, solución de Hank, solución isotónica de cloruro de sodio, aceites tales como mono- o diglicéridos sintéticos o ácidos grasos tales como ácido oleico, agentes anestésicos locales, conservantes, tampones, agentes potenciadores de la viscosidad o solubilidad, antioxidantes solubles en agua tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares, antioxidantes solubles en aceite tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares, y agentes quelantes metálicos tales como ácido cítrico, ácido entilendiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Las moléculas de unión humanas de acuerdo con la invención, sus variantes o fragmentos, los inmunoconjugados de acuerdo con la invención, las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, las composiciones de acuerdo con la invención o las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden usarse como medicamentos. Pueden usarse, entre otros, para el diagnóstico, prevención, tratamiento o sus combinaciones, de un trastorno o enfermedad neoplásicos. Preferentemente, el trastorno o enfermedad neoplásicos se selecciona del grupo que consiste en leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mieloide crónica en crisis hemoblástica (CML-BC), leucemia mielomonocítica crónica, leucemia promielocítica aguda, síndrome mielodisplásico, leucemia mielomonocítica juvenil, leucemia linfoblástica agua (ALL), leucemia no linfocítica aguda (ANLL), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (T-ALL), leucemia linfocítica granular grande (LGLL), leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (B-CLL) e histiocitosis de células de Langerhans. Las moléculas de unión humanas de la invención son adecuadas para el tratamiento de pacientes que no han sido tratados que padecen cualquiera de los trastornos y enfermedades anteriores, pacientes que han sido o son tratados y están en remisión o no están en remisión y pacientes con enfermedades o trastornos recurrentes/resistentes.
Las moléculas o composiciones mencionadas anteriormente pueden emplearse junto con otras moléculas útiles para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento. Pueden usarse in vitro, ex vivo o in vivo. Las moléculas se formulan normalmente en las composiciones y composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad terapéuticamente o diagnósticamente eficaz. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o puede reducirse o aumentarse la dosis proporcionalmente como indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Las moléculas y composiciones de acuerdo con la presente invención son preferentemente estériles. Los procedimientos para hacer estériles estas moléculas y composiciones son bien conocidos en la técnica. Las otras moléculas útiles para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento pueden administrarse en un régimen de dosificación similar al propuesto para las moléculas de unión humanas de la invención. Si las otras moléculas se administran por separado, pueden administrarse a un sujeto con un trastorno o enfermedad neoplásicos antes (p. ej., 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días, 2 semanas, 4 semanas o 6 semanas antes) de, a la vez que o después (p. ej., 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días, 2 semanas, 4 semanas o 6 semanas después) de la administración de una o más de las moléculas de unión humanas o composiciones farmacéuticas de la invención. El régimen de dosificación se determina durante ensayos clínicos en pacientes humanos.
Las moléculas de unión humanas y composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión humanas son especialmente útiles, y frecuentemente preferidas, cuando han de administrarse a seres humanos como agentes terapéuticos o de diagnóstico in vivo, ya que la respuesta inmunitaria del receptor frente al anticuerpo administrado frecuentemente será sustancialmente menor que la ocasionada por la administración de una molécula de unión monoclonal murina, quimérica o humanizada.
Alternativamente, se administran las células que se modifican genéticamente para expresar las moléculas de unión humanas de la invención a pacientes in vivo. Tales células pueden obtenerse a partir de un animal o paciente o un donante con MHC compatible y pueden incluir, pero no se limitan a, fibroblastos, células de la médula ósea, células sanguíneas (p. ej., linfocitos), adipocitos, células musculares, células endoteliales, etc. Las células se modifican genéticamente in vitro usando técnicas de ADN recombinante para introducir las moléculas de ácido nucleico de la invención en las células. Preferentemente, las moléculas de unión humanas son segregadas desde las células. Las células modificadas que expresan y preferentemente segregan las moléculas de unión humanas como se describen en el presente documento pueden introducirse en el paciente, por ejemplo, sistémicamente, p. ej., en la circulación o por vía intraperitoneal.
En otras realizaciones, las células pueden incorporarse en una matriz o pueden encapsularse e implantarse en el organismo. En un marco de tratamiento génico, las moléculas de unión humanas pueden administrarse en forma de un vector capaz de infectar células del huésped, que codifica una molécula de unión humana de acuerdo con la invención. En otro aspecto, la invención se ocupa del uso de moléculas de unión humanas, sus fragmentos o variantes, inmunoconjugados de acuerdo con la invención, moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, composiciones o composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención en la preparación de un medicamento para el diagnóstico, profilaxis, tratamiento o sus combinaciones, de un trastorno o enfermedad neoplásicos. El trastorno o enfermedad neoplásicos se selecciona preferentemente del grupo descrito anteriormente.
Además de eso, los kits que comprenden al menos una molécula de unión humana de acuerdo con la invención, al menos una de sus variantes o fragmentos, al menos un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, al menos una composición de acuerdo con la invención, al menos una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, al menos un vector de acuerdo con la invención, al menos un huésped de acuerdo con la invención o una de sus combinaciones también forman parte de la presente invención. Opcionalmente, los componentes de los kits de la invención descritos anteriormente se empaquetan en contenedores adecuados y se etiquetan para diagnóstico, prevención y/o tratamiento de las afecciones indicadas. Los componentes mencionados anteriormente pueden almacenarse en contenedores de dosis unitarias o múltiples, por ejemplo, ampollas selladas, viales, botellas, jeringas y tubos de ensayo, como una solución acuosa, preferentemente estéril, o como una formulación liofilizada, preferentemente estéril, para reconstitución. Los contenedores pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico y pueden tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón horadable con una aguja de inyección hipodérmica). El kit puede comprender además más contenedores que comprenden un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, medio de cultivo para uno o más de los huéspedes adecuados. Asociadas con los kits pueden existir instrucciones incluidas habitualmente en empaquetamientos comerciales de productos terapéuticos, profilácticos y/o diagnósticos, que contienen información sobre, por ejemplo, las indicaciones, uso, dosificación, fabricación, administración, contraindicaciones y/o advertencias relacionadas con el uso de dichos productos terapéuticos, profilácticos y/o de diagnóstico.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de detección de CD1a humanas o una de sus variantes
o partes, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) poner en contacto una muestra con una cantidad diagnósticamente efectiva de una molécula de unión humana de la invención o una de sus variantes funcionales o fragmentos o un inmunoconjugado de acuerdo con la invención y b) determinara si la molécula de unión humana o su fragmento o variante funcional o inmunoconjugado se une específicamente a un compuesto de la muestra. Los procedimientos de detección son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transferencia de bandas western, RIA, ELISA y procedimientos inmunohistoquímicos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Generación de células dendríticas in vitro
Se obtuvieron células dendríticas (CD) cultivadas mediante el aislamiento de monocitos a partir de capas leucocíticas, usando centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll para retirar los granulocitos, formación de rosetas con glóbulos rojos de oveja (formación de rosetas-SRBC) para retirar los linfocitos T y adherencia plástica durante 2 horas a 37 ºC para retirar otras células y obtener monocitos. Los monocitos obtenidos se cultivaron durante cinco días en presencia de GM-CSF e IL-4 para diferenciarlos en DC inmaduras (principalmente caracterizadas por un fenotipo CD1a+/CD83-). Una incubación adicional de dos días en presencia de un cóctel de GM-CSF, IL-4, PGE2, IL-1�, IL-6 y TNF-a dio como resultado el desarrollo de DC maduras (principalmente caracterizadas por un fenotipo CD1a+/CD83+) (Jonuleit y col., 1997) (Véase la Figura 1).
Ejemplo 2
Selección de anticuerpos en fago que portan fragmentos Fv monocatenarios en células dendríticas por clasificación celular
Después de cinco y siete días de cultivo, respectivamente, se obtuvieron aproximadamente 1,5*107 monocitos maduros e inmaduros derivados de CD a partir de los matraces de cultivo de tejido y se mezclaron con 0,5 ml de una colección de presentación de anticuerpos scFv en fago semisintética. Esta colección de fragmentos de anticuerpo monocatenarios humanos se construyó como se describe por de Kruif y col. (1995b). Brevemente, la colección consistía en una combinación de 49 líneas germinales de genes VH fusionados con ~108 regiones CDR3 de cadenas pesadas sintéticas y 7 cadenas ligeras. Las regiones CDR3 tenían longitudes que variaban entre 6 y 15 aminoácidos. Las cadenas ligeras estaban codificadas por miembros de las familias V
K1 aVK4 YVA1 aVA3. La colección final comprendía aproximadamente 4x108 clones individuales.
Se bloquearon 0,5 ml de la colección anterior que contenían aproximadamente 1013 partículas de fago por ml a 4 ºC durante 15 minutos en medio RPMI que contenía un 20 % de suero fetal bovino y EDTA 5 mM. Después de eso, se añadieron aproximadamente 1,5*107 DC inmaduras o aproximadamente 7,3*106 DC maduras a la colección bloqueada en presencia de aproximadamente 7,5*107 leucocitos de sangre periférica (PBL) recién obtenidos que actúan como células sustractoras en un volumen final de 5 ml. Esta mezcla se rotó lentamente durante la noche a 4 ºC. Al día siguiente, las células se lavaron dos veces con 50 ml de medio RPMI enfriado en hielo que contenía un 20 % de suero fetal bovino y EDTA 5 mM y se tiñeron con 100 μl de anticuerpo anti-CD83 conjugado con PE (BD PharMingen) y 100 μl de anticuerpo anti-CD1a conjugado con FITC (BD PharMingen) para visualizar las poblaciones de células dendríticas en un citómetro de flujo. Estos anticuerpos no reconocieron los PBL y, por lo tanto, se obtuvo una población de DC pura. Después de una incubación de 1 hora en hielo, las células se lavaron una vez con 15 ml del medio anterior y se resuspendieron en de 4 a 6 ml del medio. Justo antes de la clasificación, se separaron las células con un filtro de células (BD). La clasificación de células se realizó en un clasificador de células activadas por fluorescencia FACStarPLUS con los parámetros de selección fijados alrededor de las CD CD83-CD1a+ inmaduras o CD83+CD1a+ maduras. Para cada población celular, se clasificaron de 104 a 105 células con fagos todavía unidos.
Para eluir fagos específicamente unidos, las células se sedimentaron durante 10 minutos a 1200 rpm. Después de esto, se resuspendieron en un volumen de 100 μl del sobrenadante obtenido y se llevaron a un tubo de 50 ml que contenía 150 μl de citrato de sodio 76 mM. Tras 10 minutos a temperatura ambiente, el pH se neutralizó añadiendo 200 μl de tampón Tris-HCl 1 M (pH 7,4). Finalmente, se añadieron 1 ml de medio 2TY y 1 ml de Escherichia coli XL1 azul en fase logarítmica. La infección se dejó avanzar durante 30 minutos a 37 ºC. Después, las bacterias se centrifugaron a 2800 rpm durante 10 minutos, se suspendieron en 0,5 ml de 2TY y se plaquearon en placas de agar que contenían 25 μg/ml de tetraciclina, 100 μg/ml de ampicilina y glucosa al 5 %. Después de cultivarlas durante la noche a 37 ºC, las placas se rasparon y las bacterias se congelaron en viales de almacenamiento o se usaron para preparar la siguiente colección restringida, usando el fago colaborador VCSM13. Tras la Cebadora serie de selección se obtuvieron 7,6*104 y 2,5*104 colonias a partir de la selección con DC maduras e inmaduras, respectivamente.
La serie de selección descrita anteriormente se repitió dos veces más, con la condición de que, tanto después de la segunda como de la tercera serie, las bacterias se sembraron en la dilución adecuada, permitiendo el aislamiento de colonias individuales. Los veinte clones individuales obtenidos se crecieron por separado y se rescataron con fago colaborador VCSM13 para preparar disoluciones de anticuerpos en fagos. Después, cada uno de los veinte clones obtenidos se ensayó para evaluar la unión específica a la población de DC inmaduras y maduras (véanse los paneles superiores de la Figura 2 para la unión del anticuerpo en fago monocatenario representativo denominado SC02-113 a DC maduras e inmaduras).
Ejemplo 3
Identificación de CD1a como el antígeno reconocido por los anticuerpos en fago scFv seleccionados
En total, se realizaron tres series de selección y, tanto después de la segunda serie como de la tercera, se ensayaron anticuerpos en fago para evaluar la unión específica a una variedad de tipos celulares, es decir, DC cultivadas, PBL, suspensiones celulares de las amígdalas y de líquido sinovial, varias líneas celulares incluyendo K562, U266, IM9, U937, THP, CEM, Fravel, HL60, Raji, RPMI8226, Hepgll, HELA, HT29 y Jurkatt, una línea celular C1R transfectada con la molécula CD1a y líneas celulares A431 transfectadas con las moléculas CD80, CD83 y CD86. Para teñir las células, se bloquearon 100 μl de los anticuerpos en fago añadiendo 50 μl de PBS que contenía un 4 % de leche en polvo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadieron a los anticuerpos en fago bloqueados 5x105 células en 50 μl de PBS que contenía BSA al 1 % y la mezcla obtenida se incubó en hielo durante 1 hora. Después de eso, la mezcla obtenida se lavó tres veces con 200 μl de PBS que contenía BSA al 1 %. Para detectar los anticuerpos en fago unidos a células, se incubaron las células con 20 μl de una dilución 1:800 de anticuerpo policlonal anti-M13 de oveja durante 20 minutos en hielo. Después, las células se lavaron con PBS que contenía BSA al 1 % y se incubaron con 20 μl de una dilución 1:700 de anticuerpo policlonal de burro anti-oveja conjugado con PE durante 20 minutos en hielo.
Para visualizar DC se lavaron las células de nuevo con PBS que contenía BSA al 1 %, se tiñeron con 10 μl de anticuerpo anti-CD1a conjugado con FITC (BD PharMingen) diluido 1:10 y se suspendieron en 200 μl de PBS que contenían BSA al 1 %. Se realizaron ensayos de citometría de flujo usando un FACScan (Becton Dickinson).
Los veinte anticuerpos en fago scFv derivados de las selecciones descritas anteriormente se unieron exclusivamente a la línea celular transfectada con CD1a (véase el panel inferior de la derecha de la Figura 2 para la unión del anticuerpo en fago scFv representativo denominado SC02-113 a la línea celular transfectada con CD1a). Las células C1R transfectadas con vector que contenía un inserto de CD1a fueron claramente positivas, mientras que la línea celular C1R transfectada con vector sin inserto CD1a (transfección simulada) fue negativa tras la tinción con los anticuerpos en fago (véase el panel inferior de la izquierda de la Figura 2 para la unión del anticuerpo en fago scFv representativo denominado SC02-113 a la línea celular con transfección simulada). Las líneas celulares A431 transfectadas con CD80, CD83 y CD86 fueron negativas tras la tinción con los anticuerpos en fago (datos no mostrados).
Ejemplo 4
Caracterización de los scFv específicos para CD1a humanas
A partir de los veinte clones de anticuerpos en fago (scFv) que se unieron exclusivamente a la línea celular transfectada con CD1a humanas, se obtuvo ADN plasmídico y se determinaron las secuencias de nucleótidos de acuerdo con técnicas estándar. Brevemente, la secuencia de nucleótidos de la VH y la VL de los veinte clones se determinó usando los cebadores M13REV (5'-AACAGCTATGACCATG (SEC ID N.º: 23)) y fdSeq (5'-GAATTTTCTGTATGAGG (SEC ID N.º: 24)) en una reacción secuencial con el kit de secuenciación Taq con el siguiente protocolo de ciclos (25 ciclos): 94 ºC durante 10 segundos (desnaturalización), 50 ºC durante 5 segundos (alineamiento) y 60 ºC durante 4 minutos (extensión). El ADN precipitado se disolvió en tampón de muestra, se hizo migrar y se analizó en un secuenciador fluorescente automático ABRIPRISM. Las secuencia de nucleótidos obtenidas se compararon con la base de datos VBASE, que es bien conocida por el experto medio en la técnica de anticuerpos, y se determinó la familia génica de cada cadena individual. Resultó que los veinte clones contenían seis scFv diferentes. Éstos se denominaron SC02-113, SC02-114, SC02-115, SC02-116, SC02-117 y SC02-118 respectivamente (véase la Tabla 1). Las secuencias de aminoácidos de los scFv denominados SC02-113, SC02114, SC02-115, SC02-116, SC02-117 y SC02-118 se muestran en las SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 33 y SEC ID N.º: 35, respectivamente (véase la Tabla 1). Las secuencias de nucleótidos de los scFv denominados SC02-113, SC02-114, SC02-115, SC02-116, SC02-117 y SC02-118 se muestran en las SEC ID N.º: 26, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 30, SEC ID N.º: 32, SEC ID N.º: 34 y SEC ID N.º: 35, respectivamente (véase la Tabla 1). La identidad de los genes VH y VL y las secuencias CDR3 de cadena pesada de los scFv específicos para CD1a humanas también se representan en la Tabla 1.
Ejemplo 5
Construcción de moléculas de inmunoglobulina totalmente humanas (anticuerpos anti-CD1a monoclonales humanos) a partir de los Fv monocatenarios anti-CD1a seleccionados
Las regiones variables de cadena pesada y ligera de los scFv denominados SC02-113, SC02-114, SC02-115, SC02116, SC02-117 y SC02-118 se amplificaron por PCR usando oligonucleótidos para incluir sitios de restricción y/o secuencias para expresión en los vectores de expresión de IgG pSyn-C03-HCy1 (véase la SEC ID N.º: 37), pSynC05-CK (véase las SEC ID N.º: 38) y pSyn-C04-CA (véase la SEC ID N.º: 39). Las regiones variables de cadena pesada de los scFv denominados SC02-113, SC02-114, SC02-115, SC02-116, SC02-117 y SC02-118 se clonaron en el vector pSyn-C03-HCy1; la región variable de cadena ligera compartida de los scFv denominados SC02 -113, SC02-114, SC02-116, SC02-117 y SC02-118 se clonó en el vector pSyn-C05-CK; la región variable de cadena ligera del scFv denominado SC02-115 se clonó en el vector pSyn-C04-cA. El gen VL compartido entre los scFv SC02-113, SC02-114, SC02-116, SC02-117 y SC02-118 se amplificó en Cebador lugar usando oligonucleótidos 5K-I (SEC ID N.º: 40) y sy3K-C (SEC ID N.º: 41) (véase más adelante) y los productos de PCR se clonaron en el vector pSyn-C05-CK. El gen VL gen para scFv SC02-115 se amplificó en Cebador lugar usando nucleótidos sy5L-A (SEC ID N.º: 42) y 3L-B (SEC ID N.º: 43) (véase más adelante) y el producto de PCR se clonó en el vector pSyn-C04-cA. Se verificaron las secuencia de nucleótidos para todas las construcciones de acuerdo con técnicas estándar conocidas por el experto en la técnica.
Los genes VH se amplificaron en Cebador lugar usando los siguientes juegos de oligonucleótidos: SC02-113, 5H-Fshort (SEC ID N.º: 44) y sy3H-A (SEC ID N.º: 45); SC02-114, SC02-116 y SC02-117, 5H-B (SEC ID N.º: 46) y sy3H-A (SEC ID N.º: 45); SC02-118, 5H-B**65 (SEC ID N.º: 47) y sy3H-A (SEC ID N.º: 45); SC02-115; en Cebador lugar 5H-A (SEQ ID NO:48) y 115int68 (SEC ID N.º: 49) y después el producto de PCR obtenido se amplificó de nuevo con los cebadores 5H-A (SEC ID N.º: 48) y sy3H-A (SEC ID N.º: 45). Después, los productos de PCR se clonaron en el vector pSyn-C03-HCy1 Y las secuencias de nucle
ótidos se verificaron de acuerdo con técnicas estándar conocidas por el experto en la técnica.
5H-B**65
Las construcciones de expresión resultantes pgG102-113C03, pgG102-114C03, pgG102-115C03, pgGl02-116C03, pgG102-117C03 y pgGl02-118C03 (cuyos depósitos tienen los números de acceso 03102801, 03102802, 03102803, 03102804, 03102805 y 03102806) que codifican las cadenas pesadas de las IgG humanas anti-CD1a se expresaron de forma transitoria en combinación con la construcción pSyn-C05-VkI (cuyo depósito tiene el número de acceso 03102807), con la excepción de la construcción pgG102-115C03, que se transfectó con la construcción pSyn-C04-V13 (cuyo depósito tiene el número de acceso 03102808), que codifica las cadenas ligeras en células 293T, y se obtuvieron sobrenadantes que contenían anticuerpos IgG1. Las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesadas de los anticuerpos denominados 02-113, 02-114, 02-115, 02-116, 02-117 y 02-118 (los anticuerpos también se denominan en el presente documento CR2113, CR2114, CR2115, CR2116, CR2117 y CR2118, respectivamente) se muestran en las SEC ID N.º: 50, 52, 54, 56, 58 y 60, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesadas de los anticuerpos denominados 02-113, 02-114, 02-115, 02-116, 02-117 y 02-118 (los anticuerpos también se denominan en el presente documento CR2113, CR2114, CR2115, CR2116, CR2117 y CR2118, respectivamente) se muestran en las SEC ID N.º: 51, 53, 55, 57, 59 y 61, respectivamente.
La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de los anticuerpos 02-113, 02-114, 02-116, 02-117 y 02-118 se muestra en la SEC ID N.º: 62 y la del anticuerpo 02-115 en la SEC ID N.º: 64. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de los anticuerpos 02-113, 02-114, 02-116, 02-117 y 02-118 se muestra en la SEC ID N.º: 63 y la del anticuerpo 02-115 en la SEC ID N.º: 65. Posteriormente, se purificaron los anticuerpos en columnas de proteína A y columnas de exclusión por tamaño usando procedimientos de purificación estándar usados generalmente para inmunoglobulinas (véase, por ejemplo, el documento WO 00/63403).
Se confirmó la capacidad de los anticuerpos de IgG1 anti-CD1a humanos para unirse a líneas celulares transfectadas con CD1a esencialmente como se describe para los scFv (véase el Ejemplo 3) Los anticuerpos anti-CD1a purificados se diluyeron a concentraciones diversas (representadas en las figuras) y se detectaron con IgGK anti-humanas de ratón marcadas con FITC o estreptavidina marcada con FITC en el caso de anticuerpos anti-CD1a humanas biotiniladas. Además de las líneas celulares C1R-CD1a y C1R con transfección simulada descritas en el Ejemplo 3, se ensayaron las líneas celulares C1R-CD1b, ClR-CD1c, ClR-CD1d y B16-CD1a y B16 con transfección simulada. Cada tinción se repitió tres veces y se comparó con el anticuerpo de control de isotipo no relacionado de control negativo denominado CR2027 usando la prueba de Kolmogorov - Smirnov. Para calcular las estadísticas de K-S, se realizó una superposición de histogramas del anticuerpo de control de isotipo y el anticuerpo anti-CD1a. Se determinó el desplazamiento logarítmico entre los picos de los histogramas y se usó para calcular el valor de D. Cuanto mayor es el desplazamiento logarítmico del pico de respuesta del anticuerpo anti-CD1a con respecto al pico de respuesta del anticuerpo de control de isotipo, mayor es el valor de D.
Tras la conversión a IgG completas, los seis anticuerpos se unieron al transfectante B16-CD1a a una concentración de 10 μg/ml, sin embargo sólo cuatro de los seis, es decir, los anticuerpos denominados CR2113, CR2114, CR2117, CR2118 se unieron al transfectante C1R-CD1a (véase la Figura 3, figuras del lado izquierdo). Ninguno de los anticuerpos se unió significativamente a C1R o B16 con transfección simulada (véase la Figura 3, figuras del lado derecho).
No se detecto tinción específica de ninguno de los seis anticuerpos monoclonales anti-CD1a humanos en los transfectantes C1R-CD1b o C1R-CD1d (véase la Figura 4). Se detectó una tinción ligera, pero significativa (p<0,05) para los dos anticuerpos CR2114 y CR2117 en transfectantes C1R-CD1c (véase la Figura 4). Los resultados demuestran la especificidad de unión de los anticuerpos para CD1a humanas, incluso entre la familia de genes de CD1 humanas altamente conservadas. Además, también se llevó a cabo la tinción en timocitos de ratón recién preparados, que expresan CD1a y CD1d murinas a niveles bajos. No se observó tinción específica para ninguno de los seis anticuerpos monoclonales anti-CD1a humano, demostrando la especificidad de especie de los anticuerpos (véase la Tabla 2).
Se generaron curvas de unión para los anticuerpos CR2113, CR2114, CR2117 y CR2118 midiendo la unión en células B16-CD1a transfectadas con FACS como anteriormente usando las concentraciones de anticuerpo que varían desde 0,01 hasta 10 μg/ml. Se usaron anticuerpos tanto no marcados como biotinilados y el patrón de tinción fue indistinguible entre las dos formas (véanse las Figuras 5A-D). CR2113 mostró saturación de unión a 1 μg/ml, CR2114 non se saturó a 10 μg/ml y CR2117 y CR2118 tiñeron los transfectantes menos intensamente comparados con CR2113 y CR2114.
Se realizaron experimentos de competición para determinar si los anticuerpos reconocen epítopos diferentes. Se tiñeron células de melanoma de ratón B16 que expresaban CD1a humanas con CR2113, CR2114, CR2117, CR2118 no marcados o el control negativo CR2027 a concentraciones diferentes (0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 50, 100 μg/ml) durante 30 minutos y después se tiñeron con uno de los anticuerpos anteriores marcados con biotina como se describe anteriormente durante 5 minutos a una concentración de 2,5 μg/ml. La detección se realizó mediante estreptavidina marcada con FITC con 20 minutos de incubación. Además, la tinción se realizó como se describe anteriormente (véase el Ejemplo 3). Cada tinción se realizó tres veces sucesivas y se calculó el valor de D con la estadísticas de K-S (véase anteriormente). La tinción del anticuerpo de control no marcado CR2027 se muestra mediante la línea discontinua, la tinción usando el anticuerpo de ensayo se representa con una línea continua. CR2113 fue capaz de competir consigo mismo de manera dependiente de dosis, sin embargo, ninguno de los otros anticuerpos pudo competir con CR2113 biotinilado por la unión (véase la Figura 6A). Esto se debe, probablemente, a su afinidad de unión superior por CD1a humanas en comparación con los otros anticuerpos. Por el contrario, CR2113 no marcado fue capaz de competir por la unión de CR2114 (véase la Figura 6B), CR2117 (véase la Figura 6C) y CR2118 (véase la Figura 6D) a transfectantes B16-CD1a de manera dependiente de la concentración. Tampoco CR2117 o CR2118 fueron capaces de competir con CR2114 por la unión a CD1a. Esto podría deberse a una afinidad por debajo de la óptima.
En conclusión, los cuatro anticuerpos ensayados parecen compartir epítopos solapados, aunque en el caso de CR2113 y CR2114 es poco probable que éstos sean idénticos debido a las diferencias de la especificidad vistas en la Figura 3.
Ejemplo 6
Inmunohistoquímica con anticuerpos anti-CD1a monoclonales humanos
Se analiza la capacidad de los anticuerpos anti-CD1a monoclonales humanos para unirse a tejidos normales mediante inmunohistoquímica. Con este fin, secciones congeladas de los siguientes tejidos normales: glándula adrenal; vejiga, cerebro (cerebelo y cerebro); vasos sanguíneos (arterias aorta y coronaria); trompa de Falopio; esófago; estómago (antro pilórico y cuerpo); duodeno; íleo; colon; corazón; riñón; hígado; pulmón; ganglio linfático; ovario; páncreas; paratiroides; nervio periférico; glándula pituitaria; placenta; próstata; glándula salival; piel; médula espinal; bazo; músculo estriado; testículos; amígdala; tiroides; uréter y útero (cuello y endometrio) se cortan, se montan en portaobjetos de vidrio y se secan a temperatura ambiente. Las secciones se bloquean para peroxidasa endógena con azida de sodio 50 mM que contiene un 0,03 % de H2O2 durante 20 minutos, seguido de bloqueo para biotina endógena de acuerdo con el protocolo proporcionado (X0590, Dako). Posteriormente, las secciones se bloquean con PBS que contiene BSA al 4 % y suero humano normal al 10 % antes de la incubación con las IgG humanas anti-CD1a humanas biotiniladas durante 60 minutos a temperatura ambiente. Para detectar moléculas de IgG unidas las secciones se incuban con peroxidasa de rábano acoplada a estreptavidina (Dako) seguida de incubación con diaminobencidina (Sigma), dando como resultado el depósito local de cristales marrones. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina para visualizar células nucleadas dentro de las secciones. Antes del análisis se deshidratan las secciones y los portaobjetos se sellan con eukitt (BDH).
Ejemplo 7
Análisis por citometría de flujo de la expresión de moléculas CD1a en líneas celulares tumorales y muestras tumorales recién obtenidas con anticuerpos anti-CD1a monoclonales humanos
Se usa el conjunto de anticuerpos IgG anti-CD1a humanos para evaluar la expresión de CD1a en las siguientes muestras tumorales recién obtenidas: leucemia mieloide aguda (AML), leucemia no linfocítica aguda (MILL), leucemia mieloide crónica en crisis hemoblástica (CML-BC), leucemia linfocítica granular grande (LGLL), leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (B-CLL), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (T-ALL) y línea celular SUP-T1. Con este fin, se tiñen 2*105 células mononucleares preparadas por separación en gradiente de ficoll-paque (para muestra recién preparadas) o a partir de cultivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (para líneas celulares) con los anticuerpos IgG anti-CD1a humanos de la invención a concentraciones que varían desde 0 hasta 50 μg/ml a 4 ºC. La unión de los anticuerpos denominados 02-113, 02-114, 02-115, 02-116, 02-117 y 02-118 se visualiza usando IgG de cabra anti-humanas biotiniladas (específicas de Fc, Caltag) seguidos de ficoeritrinaestreptavidina (Caltag). Las células teñidas se analizan por citometría de flujo. Se esperan niveles de tinción de moderados a altos en subpoblaciones de las células tumorales de acuerdo con el fenotipo establecido con monoclonales de ratón anti-CD1a. Se espera que sean necesarios niveles de expresión de CD1a de moderados a altos para que los anticuerpos monoclonales anti-CD1a humanos sean útiles como moléculas terapéuticas.
Ejemplo 8
Estudios de internalización con anticuerpos anti-CD1a monoclonales humanos
Se realizan ensayos de internalización con líneas celulares que expresan CD1a tales como células Jurkatt, con el fin de determinar la capacidad de internalización de los anticuerpos IgG1 anti-CD1a humanas monoclonales humanos. Los anticuerpos IgG anti-CD1a humanas se tiñen con tinte de marcaje Oregon Green-480-SE (Molecular Probes) como sigue. Se disuelven 0,1 mg del tinte en 10 μl de DMSO, se añaden a 0,4 mg de anticuerpo en un volumen final de 0,4 ml de PBS y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, esta mezcla se carga en una columna de Sephadex G25 equilibrada con PBS. El anticuerpo marcado se eluye con PBS y se recoge la fracción coloreada. Se cargan alícuotas de 5*105 células Jurkatt con el anticuerpo adecuado a una concentración saturante en hielo durante 30 minutos. El anticuerpo no unido se retira mediante tres lavados con medio RPMI 1640 enfriado en hielo que contiene medio FBS al 10 %. Posteriormente, las células se resuspenden en 50 μl del medio y se incuban durante 1 hora a 4 ºC (no hay internalización) o a 37 ºC para permitir la internalización de los anticuerpos. Tras los tres lavados con PBS enfriado en hielo, los anticuerpos unidos a la superficie celular se retiran de las células con 2,5 mg/ml de subtilisina durante 1 hora a 4 ºC. Las células se lavan de nuevo con PBS-BSA al 1 % enfriado en hielo y las muestras se analizan por citometría de flujo. Con las células que se incuban a 4 ºC (una temperatura a la que no se produce internalización) las IgG unidas a células pueden retirarse de las células como se muestra por pérdida de fluorescencia. Por otro lado, cuando las células se incuban a 37 ºC para permitir la internalización de los anticuerpos, las células siguen siendo fluorescentes tras eliminar los anticuerpos unidos a moléculas CD1a en la superficie celular retirando las células usando subtilisina. Esto indica que los anticuerpos anti-CD1a se internalizan en las células y se han hecho resistentes al tratamiento con proteasa. Por el contrario, un anticuerpo de control negativo, anti-CD20 (que no se internaliza, véase Ghetie y col. (2001)), puede retirarse de las células a ambas temperaturas, lo que indica que el anticuerpo se une a su diana, pero no se internaliza en la célula. Por un lado, la internalización de anticuerpos anti-CD1a permitirá una mayor eficacia de los inmunoconjugados que contienen ciertas moléculas tóxicas acopladas a los anticuerpos anti-CD1a que se internalizan, si tales moléculas tóxicas necesitan atravesar la membrana celular para una función/actividad eficaces. Por otro lado, los anticuerpos anti-CD1a incapaces de internalizarse pueden ser útiles en radioconjugados. Tales conjugados no necesitan atravesar la membrana celular para ejercer un efecto citotóxico. Además, los anticuerpos unidos a la superficie de células diana pueden captar leucocitos citotóxicos tales como células asesinas naturales (ADCC) o dirigir el depósito del complemento (CDC). Las internalización rápida de CD1a tras la unión de los anticuerpos podría interferir con estos procesos.
Ejemplo 9
Inducción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en células tumorales usando anticuerpos anti-CD1a humanos
Para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-CD1a humanos monoclonales humanos de inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se realizan ensayos estándar de liberación de 51Cr. Para experimentos de ADCC, se marcan células tumorales diana HL60 o U937 con 100 μCi de 51Cr (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) durante 1 hora a 37 ºC. Tras un lavado exhaustivo, las células diana se plaquean en placas de microvaloración de suelo U a una concentración de 5*103 células/pocillo. Posteriormente se añaden células mononucleares de sangre periférica humanas aisladas a varias proporciones efector-diana que varían desde 80:1 hasta 10:1. Las mezclas de células se incuban por triplicado a 37 ºC en presencia de diversas concentraciones de los anticuerpos anti-CD1a monoclonales humanos en un volumen final de 150 μl. Tras 4 horas de incubación, se recoge parte del sobrenadante y se mide su contenido en 51Cr. El porcentaje de lisis específica se calcula usando la fórmula: % lisis específica = ([cpm experimentales - cpm basales] / [cpm máximas - cpm basales]) x 100 %. La lisis máxima se determina lisando las células diana con Triton X-100 al 1 %, mientras que la liberación basal se mide incubando las células diana con medio solo.
Para los experimentos de CDC se sigue el mismo procedimiento, con la excepción de que las células efectoras se reemplazan con 50 μl de suero humano como fuente de complemento.
Si la lisis específica de células diana debida a ADCC y/o CDC es significativamente mayor cuando las células se incuban con los anticuerpos anti-CD1a que cuando las células se incuban con anticuerpos de control, hay una probabilidad mayor de que los anticuerpos anti-CD1a sean más eficaces como anticuerpos desnudos y en un entorno in vivo.
Ejemplo 10
Eficacia antitumoral in vivo de anticuerpos anti-CD1a humanos en un modelo de tumor de ratón transfectado con CD1a
Para analizar la eficacia antitumoral potencial de los anticuerpos anti-CD1a humanos in vivo, se realizan experimentos en animales empleando un modelo de tumor de B16 de ratón transfectadas con CD1-a humanas. Este tumor se ha descrito ampliamente en la bibliografía sobre inmunología de tumores (véase Fidler y col. (1976)) y crece progresivamente, por ejemplo, en ratones sinérgicos C57B1/6. Para ensayar el efecto del tratamiento anti-CD1a, se inocularon ratones C57B1/6, C57B1/6 atímicos, SCID o NOD-SCID por vía subcutánea en el día 0 con 1*106 células tumorales B16. Cada ratón recibe células B16 transfectadas con ADNc de CD1a en la orientación sentido (es decir, se expresa normalmente) en un flanco. En el flanco opuesto, los ratones reciben células B16 transfectadas con ADNc de CD1a en la orientación antisentido (es decir, no se expresa) para actuar como control negativo. En algunos experimentos las células CD1a-B16 se cotransfectan con luciferasa para la detección en tiempo real del crecimiento del tumor. A los animales se les suministra una dosis de 240 μg de anticuerpo anti-CD1a humano por vía intraperitoneal (i.p.) en el día 1, seguida de tres dosis más de 80 μg de anticuerpo i.p. en los días 3, 6 y 9. Después, los animales se monitorizan para evaluar el crecimiento del tumor durante más de 28 días, los animales se sacrifican cuando los tamaños de los tumores exceden los 2 cm3 o tras la ulceración del tumor. El tamaño del tumor puede monitorizarse mediante técnicas de imagen por fluorescencia (en el caso de células B16 transfectadas con luciferasa) o directamente mediante calibres. Un efecto antitumoral potencial de los anticuerpos se analiza comparando la excrecencia del tumor en animales que reciben tratamiento con anticuerpos en comparación con grupos de control que se tratan con el vehículo de solución salina o con un anticuerpo de control de IgG humana.
Todos los anticuerpos anti-CD1 monoclonales capaces de unirse específicamente a CD1a podrían ensayarse en el modelo in vivo. La efectividad en el ensayo de ADCC y/o CDC no es un criterio para la inclusión en el estudio in vivo. La inhibición significativa del crecimiento del tumor en comparación con los controles de isotipo de anticuerpo se considera una indicación fuerte de que los anticuerpos monoclonales anti-CD1a son eficaces en la inhibición del crecimiento de tumores que expresan CD1a en seres humanos.
Ejemplo 11
Análisis BIACORE de los anticuerpos anti-CD1a
El BIACORE 3000, que aplica la técnica de resonancia de plasmón superficial en tiempo real, se usa para realizar medidas de afinidad con los anticuerpos anti-CD1a preparados como se describe anteriormente y un anticuerpo de 5 control anti-CD1a murino. En Cebador lugar, el ligando, es decir, la proteína CD1a (Abnova corporation), se inmoviliza como un ligando en un chip sensor de canal de 4 flujos (Fc) CM5 de calidad para investigación usando acoplamiento de aminas. Brevemente, la matriz de dextrano del chip CM5 (BIACORE) se activa con una mezcla de N-hidroxisuccinimida (NHS) y N-etil-N'-(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Después, la proteína CD1a (preferentemente 30 μg/ml) se acopla a los grupos carboxilo activados de la matriz. Después del acoplamiento, se 10 añade etanolamina-HCl 1 M (pH 8,5) para desactivar los grupos carboxilo activos restantes. Uno de los cuatro canales se activa y se desactiva sin acoplamiento a proteína CD1a y sirve como canal de flujo de control. Después de esto, se realizan ensayos cinéticos. Con ese fin, se investigan el índice de asociación (Ka), el índice de disociación (Kd) y la afinidad (KD) de los anticuerpos anti-CD1a. Se aplican una serie de concentraciones entre 0,01 y 1000 nM a 25 ºC (factor de dilución 2, tampón de dilución HBS-EP). Uno de los cuatro canales se usa como célula 15 de flujo de referencia y la inyección de tampón HBS-EP sirve como inyección de control. Se inyectan cincuenta μl de los anticuerpos correspondientes con un caudal constante de 20 μl/min, Al final de la inyección, se aplica durante 750 segundos el tampón HBS-EP, seguido de la regeneración del chip CM5 con pulsos de tampón de regeneración (por ejemplo, glicina, pH 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El experimento se repite 3 veces para determinar la variación del ensayo. Después, se usa el programa informático de evaluación de BIACORE para 20 ajustar las curvas de asociación y disociación de las concentraciones de las series de concentraciones. La afinidad se determina basándose en estos ajustes. Para minimizar los posibles efectos de avidez de los anticuerpos bivalentes, se incluyen los siguientes 4 parámetros importantes durante la evaluación; 1) intervalo de concentración de 0,1 - 10 x KD, 2) valores bajos de error estándar de índices de Ka y Kd, 3) valores de Chi2 residuales bajos y 4) buena precisión (preferentemente <20 %). Los anticuerpos anti-CD1a se unen preferentemente con afinidad alta en
25 el intervalo de 0,1-50 nM.
Tabla 1: Secuencias de nucleótidos y aminoácidos, secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada e identidad génica de los genes VH y VL de los scFv específicos para CD1a.
Nombre del scFv
Secuencia de aminoácidos de HCDR3 SEC ID N.º de la secuencia de nucleótidos del scFv SEC ID N.º de la secuencia de aminoácidos del scFv Familia VH Familia VL
SC02-113
APYMMYFDS (SEC ID N.º: 1) SEC ID N.º: 25 SEC ID N.º: 26 VH4:DP-66 Vk1:DPK-9
SC02-114
ETWWQSFDY (SEC ID N.º: 2) SEQ ID N.º: 27 SEC ID N.º: 28 VH3:DP-51 Vk1:DPK-9
SC02-115
SQMPSYFDY (SEC ID N.º: 3) SEC ID N.º: 29 SEC ID N.º: 30 VH1:DP-14 VA3:DPL-16
SC02-116
DALWLAFDY (SEC ID N.º: 4) SEC ID N.º: 31 SEC ID N.º: 32 VH3:DP-47 Vk1:DPK-9
SC02-117
STPWFSFDY (SEC ID N.º: 5) SEC ID N.º: 33 SEC ID N.º: 34 VH3:DP-48 Vk1:DPK-9
SC02-118
SAWWLSFDS (SEC ID N.º: 6) SEC ID N.º: 35 SEC ID N.º: 36 VH3:DP-48 Vk1:DPK-9
Tabla 2: Unión de los anticuerpos monoclonales anti-CD1a humanos a timocitos de ratón medida por citometría de flujo.
Anticuerpo
Timocitos de ratón (valor de D)
CR2113
0
CR2114
0
CR2115
0
CR2116
0
CR2117
0
CR2118
0
Control positivo (ratón anti-CD1a humanas-FITC)
0,03
Control negativo (anticuerpo anti-GBSIII)
0
Control negativo (IgG de ratón; K-FITC)
0
REFERENCIAS
5 Amiot M., Bernard A., Raynal B., Knapp W., Deschildre C. y Boumsell L. (1986), J. Immunol. 136:1752-1757.
Boel E., Verlaan S., Poppelier M.J., Westerdaal N.A., Van Strijp J.A. y Logtenberg T. (2000), J. Immunol. Methods 239:153-166. Burton D.R. y Barbas C.F. (1994), Adv. Immunol. 57:191-280. De Kruif J., Terstappen L., Boel E. y Logtenberg T. (1995a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3938-3942.
10 De Kruif J., Boel E. y Logtenberg T. (1995b), J. Mol. Biol. 248:97-105. Fidler I.J., Gersten D.M. y Budmen M. B. (1976), Cancer Research 36:3610-3165. Furue M., Nindl M., Kawabe K., Nakamura K., Ishibashi Y. y Sagawa K. (1992), J. Am. Acad. Dermatol. 27:419-426. Ghetie M.A., Bright H. y Vitetta E.S. (2001), Blood 97:1392-1398. Huls G., Heijnen I.J., Cuomo E., van der Linden J., Boel E., van de Winkel J. y Logtenberg T. (1999), Cancer Res.
15 59: 5778-5784.
Jonuleit H., Kuhn U., Miiller G., Steinbrink K., Paragnik L., Schmitt E., Knop J., Enk A.H. (1997), Eur. J. Immunology 27:3135-3142. Kelly K.M., Beverly P.C., Chu A.C., Davenport V., Gordon I., Smith M. y Pritchard J. (1994), J. Pediatr. 125:717-722. Merle-Beral H., Boumsell L., Michel A. y Debre P. (1989), Br. J. Haematol. 72:209-212.
20 Salomone M.C., Roisman F.R., Santiago J., Satz M.L. y Fainboim L. (1990a), Dis. Markers 8:265-274. Salomone M.C., Roisman F.R., Santiago J., Satz M.L. y Fainboim L. (1990b), Dis. Markers 8:275-281. Teunissen M.B. (1992), Histochem. J. 24:697-716. Van Kroonenburgh M.J. y Pauwels E.K. (1988), Nucl. Med. Commun. 9:919-930.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Crucell Holland BV The Johns Hopkins UniversityThrosby, MarkVan Meijer, MarjaGermeraad, Wilfred T.V.Arceci, Robert J.Kruisbeek, Ada M.
<120> MOLÉCULAS DE UNIÓN HUMANAS CONTRA CD1a
<130> 0097 WO 00 ORD
<160> 65
<170> PatentIn versión 3.1
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> HCDR3 de SC02-113
<400> 1
Ala Pro Tyr Met Met Tyr Phe Asp Ser1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> HCDR3 de SC02-114
<400> 2
Glu Thr Trp Trp Gln Ser Phe Asp Tyr1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> HCDR3 de SC02-115
<400> 3
Ser Gln Met Pro Ser Tyr Phe Asp Tyr1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> HCDR3 de SC02-116
<400> 4
Asp Ala Leu Trp Leu Ala Phe Asp Tyr1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> HCDR3 de SC02-117
<400> 5
Ser Thr Pro Trp Phe Ser Phe Asp Tyr1 5
<210> 6
<211> 9
<212> <213>
PRT Secuencia artificial
<220> <223> HCDR3 de SC02-118 <400> 6 Ser Ala Trp Trp Leu Ser Phe Asp Ser1 5
<210> <211> <212> <213>
7 351 ADN Secuencia artificial
<220> <223> <220> <221> <222> <223>
Región variable de cadena pesada de 02-113 CDS (1)..(351)
<400> 7 cag gtg cag ctg cag gag tcc ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gagGln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tct ttc agt ggc tacThr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr20 25 30 tac tgg agc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg gag tgg attTyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45 ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac tac aac ccc tcc ctc aagGly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60 agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctgSer Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80 aag ctg agc tct gtg acc gct gcg gac acg gcc gtg tat tac tgt gcaLys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95 aag gcc cct tat atg atg tat ttt gac tcc tgg ggc cag ggc acc ctgLys Ala Pro Tyr Met Met Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
48 96 144 192 240 288 336
100 105 110
gtg acc gtc tcc agc 351 Val Thr Val Ser Ser
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de 02-113
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Lys Ala Pro Tyr Met Met Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 9
<211> 354
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<220>
<223> <220> <221> <222> <223>
Región variable de cadena pesada de 02-114 CDS (1)..(354)
<400> 9 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg gggGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tatSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30 agc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gttSer Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45 tca tac att agt agt agt agt agt acc ata tac tac gca gac tct gtgSer Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tca ctg tatLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga gac gag gac acg gcc gtg tat tac tgtLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95 gca aag gag act tgg tgg cag tcc ttt gac tac tgg ggc cag ggc accAla Lys Glu Thr Trp Trp Gln Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110 ctg gtg acc gtc tcc agcLeu Val Thr Val Ser Ser 115
48 96 144 192 240 288 336 354
<210> <211> <212> <213>
10 118 PRT Secuencia artificial
<220> <223> Región variable de cadena pesada de 02-114 <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20
25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Lys Glu Thr Trp Trp Gln Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212> <213>
11 354 ADN Secuencia artificial
<220> <223> <220> <221> <222> <223>
Región variable de cadena pesada de 02-115 CDS (1)..(354)
<400> 11 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gcg aag aag cct ggg gccGln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Ala Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc acc ggc tacSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30 tat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atgTyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45 gga tgg atc agc gct tac aat ggt aac aca aac tat gca cag aag ctcGly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu50 55 60
48 96 144 192
cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg agc aca gcc tacGln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80 atg gag ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgtMet Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95 gca agg tcg cag atg ccg agt tac ttt gac tac tgg ggc cag ggc accAla Arg Ser Gln Met Pro Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110 ctg gtg acc gtc tcc agcLeu Val Thr Val Ser Ser 115
240 288 336 354
<210> <211> <212> <213>
12 118 PRT Secuencia artificial
<220> <223> Región variable de cadena pesada de 02-115 <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Ala Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Ser Gln Met Pro Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210>
13
<211>
354
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región variable de cadena pesada de 02-116
<220>
<221>
CDS
<222>
(1)..(354)
<223>
<400>
13
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg gggGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
48
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agc agc tatSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
96
gcc atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtcAla Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
144
tca gct att agt ggt agt ggt ggt agc aca tac tac gca gac tcc gtgSer Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
192
aag ggc cgg ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tatLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
240
ctg caa atg aac agc cta aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgtLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
288
gca aag gac gct ctt tgg ctg gct ttt gac tac tgg ggc cag ggc accAla Lys Asp Ala Leu Trp Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
336
ctg gtg acc gtc tcc agcLeu Val Thr Val Ser Ser
354
115
<210>
14
<211>
118
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<223> Región variable de cadena pesada de 02-116
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Lys Asp Ala Leu Trp Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 15
<211> 351
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de 02-117
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(351)
<223>
<400> 15 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cat cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca ggc tct gga ttc acc ttc agt agc tatSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30 gct atg cac tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg gag tgg gtaAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45 tca gct att ggt act ggt ggt ggc aca tac tat gca gac tcc gtg aagSer Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60 ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc ttg tat cttGly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80 caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgt gcaGln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95 agg tct acg cct tgg ttt tcc ttt gac tac tgg ggc cag ggc acc ctgArg Ser Thr Pro Trp Phe Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110 gtg acc gtc tcc agcVal Thr Val Ser Ser 115
96 144 192 240 288 336 351
<210> <211> <212> <213>
16 117 PRT Secuencia artificial
<220> <223> Región variable de cadena pesada de 02-117 <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Arg Ser Thr Pro Trp Phe Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212> <213>
17 351 ADN Secuencia artificial
<220> <223> <220> <221> <222> <223>
Región variable de cadena pesada de 02-118 CDS (1)..(351)
<400> 17 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cat cct ggg gggGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca ggc tct gga ttc acc ttc agt agc tatSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30 gct atg cac tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg gag tgg gtaAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45 tca gct att agt act ggt ggt ggc aca tac tat gca gac tcc gtg aagSer Ala Ile Ser Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60 ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc ttg tat cttGly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80 caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgt gcaGln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95 agg agt gct tgg tgg ctg tcc ttt gac tcc tgg ggc cag ggc acc ctgArg Ser Ala Trp Trp Leu Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110 gtg acc gtc tcc agcVal Thr Val Ser Ser
48 96 144 192 240 288 336 351
<210> 18
<211> 117
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de 02-118
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ala Ile Ser Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Arg Ser Ala Trp Trp Leu Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 19
<211> 330
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de 02-113, 02-114, 02-116, 02-117y 02-118
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<223>
<400> 19 gac att cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tac 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc cct cca 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgg acc gtg 330 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 20
<211> 110
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de 02-113, 02-114, 02-116, 02-117y 02-118
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val100 105 110
<210> <211> <212> <213>
21 354 ADN Secuencia artificial
<220> <223> <220> <221> <222> <223>
Región variable de cadena ligera de 02-115 CDS (1)..(354)
<400> 21 tcc tcc gag ctg acc cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cagSer Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15 aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gcaThr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30 agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tatSer Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45 ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tccGly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaaSer Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80 gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac agc agt ggt aac catAsp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His85 90 95
48 96 144 192 240 288
gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt gag tcg cggVal Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu Ser Arg100 105 110 ccg caa gct tac cgt gctPro Gln Ala Tyr Arg Ala115
336 354
<210> <211> <212> <213>
22 118 PRT Secuencia artificial
<220> <223> Región variable de cadena ligera de 02-115 <400> 22 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu Ser Arg100 105 110
Pro Gln Ala Tyr Arg Ala115
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16
<210> <211> <212> <213>
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<220> <223> Cebador fdSeq <400> 24 gaattttctg tatgagg
17
<210> <211> <212> <213>
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Secuencia de scFv SC02-113 CDS (1)..(720)
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48 96 144 192
agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctgSer Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80 aag ctg agc tct gtg acc gct gcg gac acg gcc gtg tat tac tgt gcaLys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95 aag gcc cct tat atg atg tat ttt gac tcc tgg ggc caa ggt acc ctgLys Ala Pro Tyr Met Met Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110 gtc acc gtc tcg agt ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggcVal Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly115 120 125 ggt ggc gga tcg gaa att gag ctc acc cag tct cca tcc tcc ctg tctGly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser130 135 140 gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agcAla Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser145 150 155 160 att agc agc tac tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cctIle Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro165 170 175 aag ctc ctg atc tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tcaLys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser180 185 190 agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agcArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser195 200 205 agt ctg caa cct gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tacSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr210 215 220 agt acc cct cca acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgtSer Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg225 230 235 240
240 288 336 384 432 480 528 576 624 672 720
<210> <211> <212> <213>
26 240 PRT Secuencia artificial
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Lys Ala Pro Tyr Met Met Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser130 135 140
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser145 150 155 160
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Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser195 200 205
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr210 215 220
Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg225 230 235 240
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<212> ADN
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<223> Secuencia de scFv SC02-114
<220>
<221>
CDS
<222>
(1)..(723)
<223>
<400>
27
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg gggGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
48
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tatSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
96
agc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gttSer Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
144
tca tac att agt agt agt agt agt acc ata tac tac gca gac tct gtgSer Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
192
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tca ctg tatLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80
240
ctg caa atg aac agc ctg aga gac gag gac acg gcc gtg tat tac tgtLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
288
gca aag gag act tgg tgg cag tcc ttt gac tac tgg ggc caa ggt accAla Lys Glu Thr Trp Trp Gln Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
336
ctg gtc acc gtc tcg agt ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tctLeu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125
384
ggc ggt ggc gga tcg gaa att gag ctc acc cag tct cca tcc tcc ctgGly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu130 135 140
432
tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cagSer Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln145 150 155 160
480
agc att agc agc tac tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gccSer Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala165 170 175
528
cct aag ctc ctg atc tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc ccaPro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro180 185 190
576
tca agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atcSer Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile195 200 205
624
agc agt ctg caa cct gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agtSer Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser210 215 220
672
tac agt acc cct cca acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaaTyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys225 230 235 240 cgtArg
720 723
<210> <211> <212> <213>
28 241 PRT Secuencia artificial
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Lys Glu Thr Trp Trp Gln Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu130 135 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln145 150 155 160
Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
165 170 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro180 185 190
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile195 200 205
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser210 215 220
Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys225 230 235 240
Arg
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<212> ADN
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<400> 29 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gcgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc aaggtcgtag 300 atgccgagtt actttgacta ctggggccaa ggtaccctgg tcaccgtctc gagaggtgga 360 ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgt ctgagctgac tcaggaccct 420 gctgtgtctg tggccttggg acagacagtc aggatcacat gccaaggaga cagcctcaga 480 agctattatg caagctggta ccagcagaag ccaggacagg cccctgtact tgtcatctat 540 ggtaaaaaca accggccctc agggatccca gaccgattct ctggctccag ctcaggaaac 600 acagcttcct tgaccatcac tggggctcag gcggaagatg aggctgacta ttactgtaac 660 tcccgggaca gcagtggtaa ccatgtggta ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 720 ggt 723
<210> 30 <211> 241
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30
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Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Ser Gln Met Pro Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val130 135 140
Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val165 170 175
Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg180 185 190
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly195 200 205
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser
210
215 220
Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu225 230 235 240
Gly
<210> <211> <212> <213>
31 723 ADN Secuencia artificial
<220> <223> <220> <221> <222> <223>
Secuencia de scFv SC02-116 CDS (1)..(723)
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48 96 144 192 240 288 336 384
ggc ggt ggc gga tcg gaa att gag ctc acc cag tct cca tcc tcc ctgGly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu130 135 140 tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cagSer Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln145 150 155 160 agc att agc agc tat tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gccSer Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala165 170 175 cct aag ctc ctg atc tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc ccaPro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro180 185 190 tca agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atcSer Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile195 200 205 agc agt ctg caa cct gaa gat ttt gca act tac tac tgt gct cag aggSer Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Arg210 215 220 agt tat ccg cct cct aag ttc ggc caa ggg acc aag gtg gat atc aaaSer Tyr Pro Pro Pro Lys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys225 230 235 240 cgtArg
432 480 528 576 624 672 720 723
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32 241 PRT Secuencia artificial
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95 Ala Lys Asp Ala Leu Trp Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu130 135 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln145 150 155 160 Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Arg210 215 220
Ser Tyr Pro Pro Pro Lys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys225 230 235 240 Arg
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
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<220>
<221> CDS
<222> (1)..(720)
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gct atg cac tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg gag tgg gta 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca gct att ggt act ggt ggt ggc aca tac tat gca gac tcc gtg aag 192 Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc ttg tat ctt 240 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80
caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgt gca 288 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
agg tct acg cct tgg ttt tcc ttt gac tac tgg ggc caa ggt acc ctg 336 Arg Ser Thr Pro Trp Phe Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
gtc acc gtc tcg agt ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc 384 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
ggt ggc gga tcg gaa att gag ctc acc cag tct cca tcc tcc ctg tct 432 Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
130 135 140
gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc 480 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser145 150 155 160
att agc agc tac tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct 528 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
165 170 175
aag ctc ctg atc tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca 576 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
180 185 190
agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc 624 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
agt ctg caa cct gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac 672 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr
210 215 220
agt acc cct cca acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt 720 Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg225 230 235 240
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de scFv SC02-117
<400> 34
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Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ala Ile Ser Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Arg Ser Ala Trp Trp Leu Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser130 135 140
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser145 150 155 160
Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro165 170 175
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gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 900 taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc 960 ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct 1020 ccgcggccgg gaacggtgca ttggaagctg gcctggatgg cctgactctc ttaggtagcc 1080 ttgcagaagt tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa gacaggttta 1140 aggagatcaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga ctcttgcgtt tctgataggc 1200 acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc actcccagtt 1260 caattacagc tcgccaccat ggcctgcccc ggcttcctgt gggccctggt gatcagcacc 1320 tgcctggaat tcagcatgag cagcgctagc accaagggcc ccagcgtgtt ccccctggcc 1380 cccagcagca agagcaccag cggcggcaca gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac 1440 ttccccgagc ccgtgaccgt gagctggaac agcggcgcct tgaccagcgg cgtgcacacc 1500 ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgccc 1560 agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc 1620 aaggtggaca aacgcgtgga gcccaagagc tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc 1680 cctgcccccg 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attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa 3420 agctcccggg agcttgtata tccattttcg gatctgatca agagacagga tgaggatcgt 3480 ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc 3540 tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc 3600 tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg 3660 aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag 3720 ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg 3780 ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg 3840 caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac 3900 atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg 3960 acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc 4020 ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg 4080 aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gatcgctatc 4140 aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc 4200 gcttcctcgt 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gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 4860 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 4920 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 4980 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 5040 gctggtagcg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 5100 gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 5160 gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 5220 tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc 5280 ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 5340 ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 5400 atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 5460 ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 5520 tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 5580 attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt 5640 tcccaacgat 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<210> 39
<211> 6283
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> pSyn-C04-Clambda
<400> 39 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgttaa ttaacatgaa 180 gaatctgctt agggttaggc gttttgcgct gcttcgctag gtggtcaata ttggccatta 240 gccatattat tcattggtta tatagcataa atcaatattg gctattggcc attgcatacg 300 ttgtatccat atcataatat gtacatttat attggctcat gtccaacatt accgccatgt 360 tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc 420 ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc 480 aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 540 actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 600 caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 660 tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 720 ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag 780 cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt 840 tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa 900 atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt 960 cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga 1020 tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt ggaatcgatg actctcttag gtagccttgc 1080 agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga 1140 gatcaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 1200 attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat 1260 tacagctcgc caccatggcc tgccccggct tcctgtgggc cctggtgatc agcacctgcc 1320 tcgagatccc cggaccgcgg ccgcaagctt accgtgctgg gccagcccaa ggccgctccc 1380 agcgtgaccc tgttcccccc ctcctccgag gagctgcagg ccaacaaggc caccctggtg 1440 tgcctcatca gcgacttcta ccctggcgcc gtgaccgtgg cctggaaggc cgacagcagc 1500 cccgtgaagg ccggcgtgga gaccaccacc cccagcaagc agagcaacaa caagtacgcc 1560 gccagcagct acctgagcct cacccccgag cagtggaaga gccaccggag ctacagctgc 1620 caggtgaccc acgagggcag caccgtggag aagaccgtgg cccccaccga gtgcagctaa 1680 tagacttaag tttaaaccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg 1740 ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 1800 cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 1860 gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 1920 atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtatc 1980 cccacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 2040 ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 2100 ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 2160 ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 2220 ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 2280 gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 2340 tataagggat tttggccatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 2400 ttaacgcgaa ttaattctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc 2460 cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa 2520 gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac 2580 catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc 2640 tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc 2700 tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct 2760 cccgggagct tgtatatcca ttttcggatc tgatcagcac gtgatgaaaa agcctgaact 2820 caccgcgacg tctgtcgaga agtttctgat cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctgat 2880 gcagctctcg gagggcgaag aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata 2940 tgtcctgcgg gtaaatagct gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca 3000 ctttgcatcg gccgcgctcc cgattccgga agtgcttgac attggggaat tcagcgagag 3060 cctgacctat tgcatctccc gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tgcctgaaac 3120 cgaactgccc gctgttctgc agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg ctgcggccga 3180 tcttagccag acgagcgggt tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac 3240 atggcgtgat ttcatatgcg cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat 3300 ggacgacacc gtcagtgcgt ccgtcgcgca ggctctcgat gagctgatgc tttgggccga 3360 ggactgcccc gaagtccggc acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctgac 3420 ggacaatggc cgcataacag cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca 3480 atacgaggtc gccaacatct tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac 3540 gcgctacttc gagcggaggc atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc gggcgtatat 3600 gctccgcatt ggtcttgacc aactctatca gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc 3660 agcttgggcg cagggtcgat gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg 3720 tacacaaatc gcccgcagaa gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc 3780 cgatagtgga aaccgacgcc ccagcactcg tccgagggca aaggaatagc acgtgctacg 3840 agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga 3900 cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa 3960 cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa 4020 taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 4080 tcatgtctgt ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg taatcatggt catagctgtt 4140 tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 4200 gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 4260 gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 4320 ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 4380 ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 4440 cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 4500 gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 4560 tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 4620 ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 4680 atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 4740 gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 4800 tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 4860 cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 4920 cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 4980 tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 5040 cggcaaacaa accaccgctg gtagcggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 5100 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 5160 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 5220 ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 5280 tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 5340 atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 5400 tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 5460 aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 5520 catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 5580 gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 5640 ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 5700 aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 5760 atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 5820 cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 5880 gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 5940 agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 6000 gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 6060 caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 6120 ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 6180 tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 6240 aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtc 6283
<210> 40
<211> 54
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5k-I
<400> 40 acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgaccc agtctccatc ctcc 54
<210> 41
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-C
<400> 41 gggaccaagg tggagatcaa acggaccgtg gccgccccca gc 42
<210> 42
<211> 52
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy5L-A
<400> 42 acctgtctcg agttttccat ggcttcctcc gagctgaccc aggaccctgc tg
52
<210> <211> <212> <213>
43 44 ADN Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido 3L-B <400> 43 ttttccttag cggccgcgac tcacctagga cggtcagctt ggtc
44
<210> <211> <212> <213>
44 49 ADN Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido 5H-Fshort <400> 44 acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctgcagg agtccggcc
49
<210> <211> <212> <213>
45 47 ADN Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido sy3H-A <400> 45 gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac cagggtgccc tggcccc
47
<210> <211> <212> <213>
46 46 ADN Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido 5H-B <400> 46 acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctggtgg agtctg
46
<210> <211> <212> <213>
47 65 ADN Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido 5H-B**65 <400> 47 acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctggtgg agtctggggg aggcttggta catcc
60 65
<210> <211> <212> <213>
48 47 ADN Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido 5H-A <400> 48 acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctggtgc agtctgg
47
<210> <211> <212> <213>
49 68 ADN Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido 115int68 <400> 49 caccagggtg ccctggcccc agtagtcaaa gtaactcggc atctgcgacc ttgcacagta atacacgg
60 68
<210>
50
<211>
1341
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Cadena pesada de 02-113
<220>
<221>
CDS
<222>
(1)..(1341)
<223>
<400>
50
cag gtg cag ctg cag gag tcc ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gagGln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu1 5 10 15
48
acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tct ttc agt ggc tacThr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr20 25 30
96
tac tgg agc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg gag tgg attTyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45
144
ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac tac aac ccc tcc ctc aagGly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60
192
agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctgSer Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80
240
aag ctg agc tct gtg acc gct gcg gac acg gcc gtg tat tac tgt gcaLys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
288
aag gcc cct tat atg atg tat ttt gac tcc tgg ggc cag ggc acc ctgLys Ala Pro Tyr Met Met Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
336
gtg acc gtc tcc agc gct agc acc aag ggc ccc agc gtg ttc ccc ctgVal Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu115 120 125
384
gcc ccc agc agc aag agc acc agc ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgcAla Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys130 135 140
432
ctg gtg aag gac tac ttc ccc gag ccc gtg acc gtg agc tgg aac agcLeu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser145 150 155 160
480
ggc gcc ttg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccc gcc gtg ctg cag agc
528
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser165 170 175
agc ggc ctg tac agc ctg agc agc gtg gtg acc gtg ccc agc agc agc 576 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac cac aag ccc agc aac 624 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
acc aag gtg gac aaa cgc gtg gag ccc aag agc tgc gac aag acc cac 672 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
acc tgc ccc ccc tgc cct gcc ccc gag ctg ctg ggc gga ccc tcc gtg 720 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val225 230 235 240
ttc ctg ttc ccc ccc aag ccc aag gac acc ctc atg atc agc cgg acc 768 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
ccc gag gtg acc tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gag gac ccc gag 816 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
gtg aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac aac gcc aag 864 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
acc aag ccc cgg gag gag cag tac aac agc acc tac cgg gtg gtg agc 912 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
gtg ctc acc gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag 960 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320
tgc aag gtg agc aac aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aag acc atc 1008 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
agc aag gcc aag ggc cag ccc cgg gag ccc cag gtg tac acc ctg ccc 1056 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
ccc agc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtg tcc ctc acc tgt ctg 1104 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
gtg aag ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aac 1152 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc 1200 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser385 390 395 400
gac ggc agc ttc ttc ctg tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc cgg 1248 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
tgg cag cag ggc aac gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg 1296 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430 cac aac cac tac acc cag aag agc ctg agc ctg agc ccc ggc aag 1341 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 51
<211> 447
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de 02-113
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Lys Ala Pro Tyr Met Met Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440 445
<210>
52
<211>
1344
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Cadena pesada de 02-114
<220>
<221>
CDS
<222>
(1)..(1344)
<223>
<400>
52
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg gggGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
48
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tatSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
96
agc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gttSer Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
144
tca tac att agt agt agt agt agt acc ata tac tac gca gac tct gtgSer Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
192
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tca ctg tatLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80
240
ctg caa atg aac agc ctg aga gac gag gac acg gcc gtg tat tac tgtLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
288
gca aag gag act tgg tgg cag tcc ttt gac tac tgg ggc cag ggc accAla Lys Glu Thr Trp Trp Gln Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
336
ctg gtg acc gtc tcc agc gct agc acc aag ggc ccc agc gtg ttc cccLeu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125
384
ctg gcc ccc agc agc aag agc acc agc ggc ggc aca gcc gcc ctg ggcLeu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly130 135 140
432
tgc ctg gtg aag gac tac ttc ccc gag ccc gtg acc gtg agc tgg aacCys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160
480
agc ggc gcc ttg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccc gcc gtg ctg cagSer Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
528
165 170 175
agc agc ggc ctg tac agc ctg agc agc gtg gtg acc gtg ccc agc agc 576 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
agc ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac cac aag ccc agc 624 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
aac acc aag gtg gac aaa cgc gtg gag ccc aag agc tgc gac aag acc 672 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
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aag tgc aag gtg agc aac aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aag acc 1008 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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agc ggc ctg tac agc ctg agc agc gtg gtg acc gtg ccc agc agc agcSer Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser180 185 190
576
ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac cac aag ccc agc aac 624 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
acc aag gtg gac aaa cgc gtg gag ccc aag agc tgc gac aag acc cac 672 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
acc tgc ccc ccc tgc cct gcc ccc gag ctg ctg ggc gga ccc tcc gtg 720 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val225 230 235 240
ttc ctg ttc ccc ccc aag ccc aag gac acc ctc atg atc agc cgg acc 768 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
ccc gag gtg acc tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gag gac ccc gag 816 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
gtg aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac aac gcc aag 864 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
acc aag ccc cgg gag gag cag tac aac agc acc tac cgg gtg gtg agc 912 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
gtg ctc acc gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag 960 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320
tgc aag gtg agc aac aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aag acc atc 1008 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
agc aag gcc aag ggc cag ccc cgg gag ccc cag gtg tac acc ctg ccc 1056 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
ccc agc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtg tcc ctc acc tgt ctg 1104 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
gtg aag ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aac 1152 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc 1200 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser385 390 395 400
gac ggc agc ttc ttc ctg tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc cgg 1248 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
tgg cag cag ggc aac gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg 1296 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
cac aac cac tac acc cag aag agc ctg agc ctg agc ccc ggc aag 1341 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 59
<211> 447
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de 02-117
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Arg Ser Thr Pro Trp Phe Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440 445
<210> 60
<211> 1341
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Cadena pesada de 02-118
<220>
<221>
CDS
<222>
(1)..(1341)
<223>
<400>
60
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cat cct ggg gggGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15
48
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca ggc tct gga ttc acc ttc agt agc tatSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
96
gct atg cac tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg gag tgg gtaAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
144
tca gct att agt act ggt ggt ggc aca tac tat gca gac tcc gtg aagSer Ala Ile Ser Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60
192
ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc ttg tat cttGly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80
240
caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgt gcaGln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
288
agg agt gct tgg tgg ctg tcc ttt gac tcc tgg ggc cag ggc acc ctgArg Ser Ala Trp Trp Leu Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
336
gtg acc gtc tcc agc gct agc acc aag ggc ccc agc gtg ttc ccc ctgVal Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu115 120 125
384
gcc ccc agc agc aag agc acc agc ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgcAla Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys130 135 140
432
ctg gtg aag gac tac ttc ccc gag ccc gtg acc gtg agc tgg aac agcLeu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser145 150 155 160
480
ggc gcc ttg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccc gcc gtg ctg cag agcGly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser165 170 175
528
agc ggc ctg tac agc ctg agc agc gtg gtg acc gtg ccc agc agc agcSer Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser180 185 190
576
ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac cac aag ccc agc aacLeu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
624
195 200 205
acc aag gtg gac aaa cgc gtg gag ccc aag agc tgc gac aag acc cac 672 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
acc tgc ccc ccc tgc cct gcc ccc gag ctg ctg ggc gga ccc tcc gtg 720 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val225 230 235 240
ttc ctg ttc ccc ccc aag ccc aag gac acc ctc atg atc agc cgg acc 768 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
ccc gag gtg acc tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gag gac ccc gag 816 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
gtg aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac aac gcc aag 864 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
acc aag ccc cgg gag gag cag tac aac agc acc tac cgg gtg gtg agc 912 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
gtg ctc acc gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag 960 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320
tgc aag gtg agc aac aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aag acc atc 1008 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
agc aag gcc aag ggc cag ccc cgg gag ccc cag gtg tac acc ctg ccc 1056 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
ccc agc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtg tcc ctc acc tgt ctg 1104 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
gtg aag ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aac 1152 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc 1200 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser385 390 395 400
gac ggc agc ttc ttc ctg tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc cgg 1248 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
tgg cag cag ggc aac gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg 1296 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
cac aac cac tac acc cag aag agc ctg agc ctg agc ccc ggc aag 1341 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 61
<211> 447
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de 02-118
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ala Ile Ser Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Arg Ser Ala Trp Trp Leu Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440 445
<210> 62
<211> 642
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Cadena ligera de 02-113, 02-114, 02-116, 02-117 y 02-118
<220>
<221>
CDS
<222>
(1)..(642)
<223>
<400>
62
gac att cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta ggaAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
48
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tacAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30
96
tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atcLeu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
144
tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggcTyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
192
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cctSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
240
gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc cct ccaGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro85 90 95
288
acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgg acc gtg gcc gctThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110
336
ccc agc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag cag ctg aag agc ggcPro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125
384
acc gcc agc gtg gtg tgc ctg ctg aac aac ttc tac ccc cgg gag gccThr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140
432
aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctg cag agc ggc aac agc cagLys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160
480
gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac tcc acc tac agc ctg agcGlu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175
528
agc acc ctc acc ctg agc aag gcc gac tac gag aag cac aag gtg tacSer Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190
576
gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc agc ccc gtg acc aag agcAla Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205
624
ttc aac cgg ggc gag tgt 642 Phe Asn Arg Gly Glu Cys
<210> 63
<211> 214
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de 02-113, 02-114, 02-116, 02-117 y 02-118
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys210
<210> <211> <212> <213>
64 696 ADN Secuencia artificial
<220> <223> <220> <221> <222> <223>
Cadena ligera de 02-115 CDS (1)..(696)
<400> 64 tcc tcc gag ctg acc cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cagSer Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15 aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gcaThr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30 agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tatSer Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45 ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tccGly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaaSer Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80 gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac agc agt ggt aac catAsp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His85 90 95 gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt gag tcg cggVal Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu Ser Arg100 105 110 ccg caa gct tac cgt gct ggg cca gcc caa ggc cgc tcc cag cgt gacPro Gln Ala Tyr Arg Ala Gly Pro Ala Gln Gly Arg Ser Gln Arg Asp115 120 125
48 96 144 192 240 288 336 384
cct gtt ccc ccc ctc ctc cga gga gct gca ggc caa caa ggc cac cctPro Val Pro Pro Leu Leu Arg Gly Ala Ala Gly Gln Gln Gly His Pro130 135 140 ggt gtg cct cat cag cga ctt cta ccc tgg cgc cgt gac cgt ggc ctgGly Val Pro His Gln Arg Leu Leu Pro Trp Arg Arg Asp Arg Gly Leu145 150 155 160 gaa ggc cga cag cag ccc cgt gaa ggc cgg cgt gga gac cac cac cccGlu Gly Arg Gln Gln Pro Arg Glu Gly Arg Arg Gly Asp His His Pro165 170 175 cag caa gca gag caa caa caa gta cgc cgc cag cag cta cct gag cctGln Gln Ala Glu Gln Gln Gln Val Arg Arg Gln Gln Leu Pro Glu Pro180 185 190 cac ccc cga gca gtg gaa gag cca ccg gag cta cag ctg cca ggt gacHis Pro Arg Ala Val Glu Glu Pro Pro Glu Leu Gln Leu Pro Gly Asp195 200 205 cca cga ggg cag cac cgt gga gaa gac cgt ggc ccc cac cga gtg cagPro Arg Gly Gln His Arg Gly Glu Asp Arg Gly Pro His Arg Val Gln210 215 220 cta ata gac tta agt tta aac cgcLeu Ile Asp Leu Ser Leu Asn Arg225 230
432 480 528 576 624 672 696
<210> <211> <212> <213>
65 232 PRT Secuencia artificial
<220> <223> Cadena ligera de 02-115 <400> 65 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu Ser Arg100 105 110
Pro Gln Ala Tyr Arg Ala Gly Pro Ala Gln Gly Arg Ser Gln Arg Asp115 120 125
Pro Val Pro Pro Leu Leu Arg Gly Ala Ala Gly Gln Gln Gly His Pro130 135 140
Gly Val Pro His Gln Arg Leu Leu Pro Trp Arg Arg Asp Arg Gly Leu145 150 155 160
Glu Gly Arg Gln Gln Pro Arg Glu Gly Arg Arg Gly Asp His His Pro165 170 175
Gln Gln Ala Glu Gln Gln Gln Val Arg Arg Gln Gln Leu Pro Glu Pro180 185 190
His Pro Arg Ala Val Glu Glu Pro Pro Glu Leu Gln Leu Pro Gly Asp195 200 205
Pro Arg Gly Gln His Arg Gly Glu Asp Arg Gly Pro His Arg Val Gln210 215 220
Leu Ile Asp Leu Ser Leu Asn Arg225 230

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo monoclonal humano capaz de unirse específicamente a CD1a humano, caracterizado por que el anticuerpo monoclonal humano comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 8 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N.º: 20.
  2. 2.
    Un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el anticuerpo es una IgG1.
  3. 3.
    Un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2, caracterizado por que el anticuerpo tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en citotoxicidad celular mediada por anticuerpos, citotoxicidad dependiente del complemente e internalización.
  4. 4.
    Un inmunoconjugado que comprenden un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, comprendiendo además el inmunoconjugado al menos un marcador.
  5. 5.
    Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que el marcador se selecciona del grupo que consisten en una sustancia tóxica, una sustancia radioactiva, un liposoma, una enzima y sus combinaciones.
  6. 6.
    Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3.
  7. 7.
    Un vector que comprende al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.
  8. 8.
    Una célula huésped que comprende al menos un vector de acuerdo con la reivindicación 7.
  9. 9.
    Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por que la célula huésped es una célula humana.
  10. 10.
    Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que el procedimiento comprende las etapas de:
    a) cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9 bajo condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo monoclonal y, opcionalmente,
    b) recuperar el anticuerpo monoclonal humano expresado.
  11. 11.
    Una composición que comprende un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 o un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.
  12. 12.
    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 o una composición de acuerdo con la reivindicación 11, comprendiendo además la composición farmacéutica al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  13. 13.
    Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende además al menos otro agente terapéutico.
  14. 14.
    Un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, una composición de acuerdo con la reivindicación 11 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13 para su uso como un medicamento.
  15. 15.
    Un procedimiento para detectar CD1a humanas, en el que el procedimiento comprende las etapas de:
    a.
    poner en contacto una muestra con una cantidad diagnósticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 o un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 y
    b.
    determinar si el anticuerpo monoclonal humano o el inmunoconjugado se unen específicamente a un compuesto de la muestra.
    Día 5 CD cultivadas
    IL-4 + GM-CSF
    inmaduras
    monocitos
    CD83
    Ficoll
    formación de rosetas de SRBC
    IL-1f, IL-6, TNF-a, PGE2
    no adherencia Granulocitos
    -
    Día 7 Linfocitos T
    CD cultivadas Linfocitos B
    maduras Células NK
    CD1A
    FIGURA 1
    FIGURA 2
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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1539235A2 (en) 2002-07-01 2005-06-15 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to reg iv
SI1523496T1 (sl) 2002-07-18 2011-11-30 Merus B V Rekombinantno proizvajanje zmesi protiteles
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
HUE025347T2 (en) 2003-03-19 2016-02-29 Biogen Ma Inc NOGO receptor binding protein
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
US20100069614A1 (en) * 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
NZ543635A (en) 2003-06-25 2008-05-30 Crucell Holland Bv Human C-type lectin: a suitable target molecule for binding molecules, particularly immunoconjugates, in the diagnosis, prevention and/or treatment of myeloid neoplastic diseases such as AML and CML
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
WO2005063819A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Crucell Holland B.V. Human binding molecule against cd1a
AU2005258335B2 (en) 2004-06-24 2011-03-17 Biogen Ma Inc. Treatment of conditions involving demyelination
EP1879921B1 (en) 2005-05-12 2011-04-27 Crucell Holland B.V. Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof
AU2006269458B2 (en) 2005-07-08 2012-11-08 Biogen Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
CL2007002225A1 (es) * 2006-08-03 2008-04-18 Astrazeneca Ab Agente de union especifico para un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (pdgfr-alfa); molecula de acido nucleico que lo codifica; vector y celula huesped que la comprenden; conjugado que comprende al agente; y uso del agente de un
AU2007293662B2 (en) 2006-09-07 2012-10-04 Crucell Holland B.V. Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus H5N1 and uses thereof
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
CA2729961C (en) 2008-07-09 2018-05-01 Biogen Idec Ma Inc. Li113, li62 variant co2, anti-lingo antibodies
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
EA035344B1 (ru) 2012-04-20 2020-05-29 Мерюс Н.В. Способ получения двух антител из одной клетки-хозяина
EA030716B1 (ru) 2012-05-14 2018-09-28 Байоджен Ма Инк. Антагонисты lingo-2 для лечения заболеваний, в которых участвуют двигательные нейроны
EP3461535A1 (en) * 2013-09-20 2019-04-03 Children's Medical Center Corporation Treatment of inflammatory skin disease using inhibitors of cd1a
US9603927B2 (en) 2014-02-28 2017-03-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US9732154B2 (en) * 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
CN108064182B (zh) * 2014-09-09 2021-09-03 詹森生物科技公司 采用抗cd38抗体的联合疗法
AU2015358615B2 (en) 2014-12-04 2021-08-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute myeloid leukemia
EP3242893A1 (en) 2015-01-08 2017-11-15 Biogen MA Inc. Lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
WO2016126488A1 (en) * 2015-02-02 2016-08-11 Sea Lane Biotechnologies, Llc Anti-surrogate light chain antibodies
CA2986594A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Tufts Medical Center, Inc. Anti-cd38 antibodies for treatment of light chain amyloidosis and other cd38-positive hematological malignancies
EA036789B1 (ru) 2015-06-22 2020-12-22 Янссен Байотек, Инк. Комбинированная терапия гемобластозов антителами к cd38 и ингибиторами сурвивина
US20170044265A1 (en) 2015-06-24 2017-02-16 Janssen Biotech, Inc. Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
TWI724048B (zh) 2015-11-03 2021-04-11 美商健生生物科技公司 抗ｃｄ３８抗體之皮下調配物及其用途
AU2017229575A1 (en) 2016-03-08 2018-09-27 Janssen Biotech, Inc. GITR antibodies, methods, and uses
EA037973B1 (ru) * 2016-10-12 2021-06-18 Янссен Байотек, Инк. Антитела к gitr, способы и применение
US11618787B2 (en) 2017-10-31 2023-04-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma
CN114249818A (zh) * 2018-12-31 2022-03-29 美勒斯公司 截短的多价多元体
AU2021358662A1 (en) 2020-10-09 2023-05-04 Children's Medical Center Corporation CD1a ANTIBODIES AND USES THEREOF
KR20240013781A (ko) * 2021-05-26 2024-01-30 옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드 항체

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001082960A1 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Inhibition of polyclonal b cell activation and immunoglobulin class switching to pathogenic autoantibodies by blocking cd1-mediated interactions
US20010051156A1 (en) * 2000-04-28 2001-12-13 Defu Zeng Methods for inhibition of polyclonal B cell activation and immunoglobulin class switching to pathogenic autoantibodies by blocking CD1-mediated interactions
EP1174440A1 (en) * 2000-07-19 2002-01-23 U-BISys B.V. A selectively-expressed epitope on the human CD38 molecule detected by a phage display library-derived human scFv antibody fragment
AU2002310222A1 (en) * 2001-05-31 2002-12-09 Chiron Corporation P-cadherin as a target for anti-cancer therapy
AU2002361784A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
WO2005063819A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Crucell Holland B.V. Human binding molecule against cd1a

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