JP2009544327A - Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化 - Google Patents

Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化 Download PDF

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Abstract

本発明は、１種または複数の本発明の外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含むアミノ酸配列を有するシークオンポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、ポリペプチド結合体の作製方法、ならびにこのような結合体およびそれらの医薬組成物の使用方法を提供する。本発明は、シークオンポリペプチドのライブラリーをさらに提供し、このようなライブラリーの各メンバーは、少なくとも１つの本発明の外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む。このようなライブラリーの作製方法および使用方法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００６年７月２１日に出願された米国特許仮出願第６０／８３２，４６１号、２００７年１月２５日に出願された米国特許仮出願第６０／８８６，６１６号、２００７年６月４日に出願された米国特許仮出願第６０／９４１，９２０号および２００７年１月１８日に出願された米国特許仮出願第６０／８８１，１３０号（各々が、すべての目的のために全内容が参照により本明細書中に組み込まれている）の優先権を主張する。
本発明は、グリコシル化によるポリペプチド修飾の分野に関する。具体的には、本発明は、短い酵素が認識するＯ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を使用したグリコシル化ポリペプチドを調製する方法に関する。
本発明は、ポリペプチド、好ましくは治療効果のあるポリペプチドのグリコシル化および修飾に関する。特定の生理反応を生じさせるためのグリコシル化および非グリコシル化ポリペプチドの投与は、医薬技術において周知である。例えば、精製ｈＧＨおよび組換えｈＧＨの両方は、ｈＧＨ欠乏（例えば子供の小人症）に関連する状態および疾患を治療するために使用される。他の例は、公知の抗ウイルス活性を有するインターフェロン、ならびに白血球の産生を刺激する顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が関連する。
野生型グリコシル化パターンを有するポリペプチドを製造するために使用できる発現系が欠如していることは、治療剤としてのこのようなポリペプチドの使用を制限してきた。不適切または不完全にグリコシル化されたポリペプチドは免疫原性である場合があり、ペプチドの急速な中和および／またはアレルギー反応の発生をもたらす場合があることは当技術分野において公知である。組換え技術によって生成された糖ペプチドの他の欠陥には、最適以下の効力と血流からの急速なクリアランスとが挙げられる。
グリコシル化ポリペプチド治療剤の生成において固有の問題を解決する１つのアプローチは、ポリペプチドを発現後にｉｎ ｖｉｔｒｏで修飾することであった。ポリペプチド発現後のｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾は、存在するグリカン構造の修飾およびグリコシル部分の非グリコシル化アミノ酸残基への結合の両方について用いられてきた。組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼの広範な選択肢を利用できるようになり、特注設計されたグリコシル化パターンおよびグリコシル構造を有する哺乳動物の糖結合体（glycoconjugate)のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素合成が可能となった。例えば、米国特許第５，８７６，９８０号、同第６，０３０，８１５号、同第５，７２８，５５４号、同第５，９２２，５７７号、ならびにＷＯ／９８３１８２６、ＵＳ２００３１８０８３５、およびＷＯ０３／０３１４６４を参照されたい。
さらに、糖ペプチドは、水溶性ポリマーなどの１種または複数の非糖修飾基によって誘導体化されてきた。ペプチドに結合される例示的なポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）である。ポリペプチドの分子の大きさを増加させるＰＥＧ−結合は、循環しているＰＥＧ−結合されたポリペプチドの免疫原性を減少させ、クリアランス時間を延長させるために使用されてきた。例えば、Ｄａｖｉｓらに付与された米国特許第４，１７９，３３７号は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）に結合した酵素およびポリペプチド−ホルモンなどの非免疫原性ポリペプチドを開示している。
ＰＥＧおよびその誘導体のポリペプチドへの結合のための主要な方法は、アミノ酸残基を介した非特異的結合が関与する（例えば、米国特許第４，０８８，５３８号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，４１４，１４７号、米国特許第４，０５５，６３５号、およびＰＣＴ ＷＯ８７／０００５６を参照されたい）。ＰＥＧ−結合の他の方法は、糖ペプチドのグリコシル残基の非特異的酸化が関与する（例えば、ＷＯ９４／０５３３２を参照されたい）。
これらの非特異的方法では、ＰＥＧを、ポリペプチド骨格上の反応性残基にランダムで非特異的な様式で付加する。このアプローチは、最終産物の均質性の欠如、および修飾されたポリペプチドの生物活性または酵素活性の減少の可能性を含めた重大な欠点を有する。したがって、特異的に標識され、容易に特性決定ができ、本質的に均質な産物の形成をもたらす治療用ポリペプチドのための誘導体化方法が、非常に望ましい。
特異的に修飾された均質なポリペプチド治療剤は、酵素の使用によってｉｎ ｖｉｔｒｏで生成することができる。合成ポリマーなどの修飾基をポリペプチドに結合するための非特異的方法とは異なり、酵素をベースとする合成は、位置選択性および立体選択性という利点がある。標識ポリペプチドの合成に使用するための２つの主要な部類の酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）、およびグリコシダーゼである。これらの酵素は、引き続いて修飾基を含むように変化させることができる糖の特異的結合のために使用することができる。代わりに、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾グリコシダーゼを使用して、修飾された糖をポリペプチド骨格に直接転移させることができる（例えば、米国特許第６，３９９，３３６号、および米国特許出願公開第２００３００４００３７号、同第２００４０１３２６４０号、同第２００４０１３７５５７号、同第２００４０１２６８３８号、および同第２００４０１４２８５６号（各々は参照により本明細書中に組み込まれている）を参照されたい。化学的および酵素的アプローチの両方を合わせた方法も公知である（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：４１５〜４２２（１９９８年）および米国特許出願公開第２００４０１３７５５７号（参照により本明細書中に組み込まれている）を参照されたい。
炭水化物は、いくつかの方法で糖ペプチドに結合し、そのうちアスパラギンへのＮ−結合ならびにセリンおよびスレオニンへのＯ−結合は、組換え糖タンパク質治療剤のために最も適切である。Ｏ−結合型グリコシル化は、すべての真核細胞の、分泌され細胞表面に関連する糖タンパク質上に見出される。Ｏ−結合型グリコシル化によって生じる構造には大幅な多様性がある。このようなグリカンは、ゴルジ複合体内に常在する何百もの酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）の触媒活性によって生成される。グリカン構造のレベルおよびＯ−グリカンのタンパク質骨格への結合の位置において多様性が存在する。高度の多様性の可能性にもかかわらず、Ｏ−結合型グリコシル化は、多細胞生物の間に高度に保存されていることを示す高度に制御されたプロセスであることは明らかである。
抗体は、定常領域における保存された位置でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ（１９９７年）Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１〜１２８；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９７年）ＴｉｂＴＥＣＨ１５：２６〜３２）。抗体のオリゴ糖側鎖は、それらの機能（ＷｉｔｔｗｅｒおよびＨｏｗａｒｄ、（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５；Ｂｏｙｄら、（１９９６年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１）、ならびに分子間および分子内相互作用（Ｇｏｏｃｈｅｅら、（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１３４７；Ｐａｒｅｋｈ、（１９９１年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１：７５０；Ｈａｒｔ、（１９９２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４：１０１７；ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ（１９９６年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９）に影響を与える。
ヒトＩｇＧでは、コアオリゴ糖は通常ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃから構成され、外側の残基の数に僅かな差異がある。例えば、個々のＩｇＧの間の差異は、ガラクトースおよび／もしくはガラクトース−シアル酸の２つの末端ＧｌｃＮＡｃでの結合によって、または第３のＧｌｃＮＡｃアーム（バイセクティングＧｌｃＮＡｃ）の結合によって起こる。グリコシダーゼによる開裂または突然変異誘発による炭水化物部分の除去は、Ｃ１ｑおよびＦｃγＲへの結合、ならびに補体活性化およびＡＤＣＣなどの下流の反応に影響を与えることが見出されてきた。（Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：４０７〜４１５（１９８５年）；Ｄｕｎｃａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：７３８〜７４０（１９８８年）；Ｗａｌｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５９：３４７〜３５３（１９８９年））。炭水化物が存在する場合、糖残基の性質は、ＩｇＧのエフェクター機能に影響を与える場合がある（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３９３〜３４０２（１９９８年））。
すべてのポリペプチドは、それらのアミノ酸配列の一部としてグリコシル化配列を含まない。さらに、存在するグリコシル化配列は、修飾基の結合に適切でない場合がある。このような修飾によって、例えば修飾されたポリペプチドの生物活性の望ましくない減少がもたらされる場合がある。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列中のグリコシル化配列の正確な生成と、それらの部位への修飾を正確に方向付ける能力との両方を可能とする方法の必要性が当技術分野で存在する。本発明はこれらおよび他の必要性に対処する。
酵素による糖結合反応は、ポリペプチド中の特定のＯ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を特異的に標的とすることができるという発見を、本発明は説明する。次いで、修飾基を含有していてもよいさらなるグリコシル残基を、このように得られた糖結合体に酵素的または化学的に付加することができる。一例では、グリコシル化配列を含む変異ポリペプチドを生じさせる変異によって、標的化グリコシル化配列を親ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）に導入するが、このグリコシル化配列は、相当する親ポリペプチド中に存在しないか、または同一の位置で存在しない（外因性グリコシル化配列）。このような変異ポリペプチドは、本明細書において「シークオンポリペプチド（sequon polypeptides）」と称される。したがって、本発明は、１つまたは複数のＯ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を含むシークオンポリペプチドを提供する。一実施形態では、各グリコシル化配列は、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ（例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）などのグリコシルトランスフェラーゼなどの酵素の基質である。さらに、本発明は、シークオンポリペプチドと修飾基（例えば、水溶性ポリマー修飾基）との間の結合体を提供する。本発明は、シークオンポリペプチドの作製方法ならびにポリペプチド結合体の作製および使用方法をさらに提供する。本発明は、本発明のポリペプチド結合体を含む医薬組成物をさらに提供する。本発明はまた、シークオンポリペプチドのライブラリーも提供し、このようなライブラリーの各メンバーは、少なくとも１つの本発明のＯ−結合型グリコシル化配列を含む。このようなライブラリーの作製および使用方法も提供する。
第１の態様では、本発明は、グリコシル化または非グリコシル化シークオンポリペプチドとポリマー修飾基との間の共有結合体（covalent conjugate）を提供する。シークオンポリペプチドは、本発明の外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む。ポリマー修飾基は、シークオンポリペプチドにＯ−結合型グリコシル化配列でグリコシル連結基を介して結合しており、前記グリコシル連結基は、シークオンポリペプチドおよびポリマー修飾基の両方の間に介在しかつ共有結合している。一実施形態では、親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ではない。他の実施形態では、親ポリペプチドは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ではない。さらに別の実施形態では、親ポリペプチドは、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）ではない。さらなる実施形態では、親ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ではない。他の実施形態では、親ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ではない。
第２の態様では、本発明は、シークオンポリペプチドを含むポリペプチド結合体を提供し、シークオンポリペプチドは外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む。ポリペプチド結合体は、式（Ｖ）
Figure 2009544327
（式中、ｑは０または１でよい）による部分を含む。
式（Ｖ）において、ｗは、０および１から選択される整数である。ＡＡ−Ｏ−は、ヒドロキシル基によって置換されている側鎖を有するアミノ酸から誘導される部分である（例えば、セリンまたはスレオニン）。このアミノ酸は、Ｏ−結合型グリコシル化配列中で見出される。ｑが１である場合、アミノ酸は内部アミノ酸であり、ｑが０である場合、アミノ酸はＮ末端またはＣ末端アミノ酸である。一実施形態では、Ｚ＊はグリコシル部分である。他の実施形態では、Ｚ＊はグリコシル連結基である。一実施形態では、Ｘ＊はポリマー修飾基である。他の実施形態では、Ｘ＊は、ポリマー修飾基に共有結合しているグリコシル連結基である。一実施形態では、親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ではない。他の実施形態では、親ポリペプチドは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ではない。さらに別の実施形態では、親ポリペプチドは、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）ではない。さらなる実施形態では、親ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ではない。他の実施形態では、親ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ではない。
本発明はまた、本発明のポリペプチド結合体および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物も提供する。
第３の態様では、本発明は、外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含むシークオンポリペプチドを提供する。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、式（Ｉ）によるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、式（ＩＩ）によるアミノ酸配列を有する。
（Ｘ）ｍＰＯ＊Ｕ（Ｂ）ｐ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｏ）ｔ（Ｐ）ｎ（Ｉ）（配列番号１）、および
（Ｘ）ｍ（Ｂ１）ｐＴＵＢ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｐ）ｎ（ＩＩ）（配列番号２）。
一実施形態では、式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、整数ｍは０である。他の実施形態では、ｍは１である。一実施形態では、整数ｎは０である。他の実施形態では、ｎは１である。一実施形態では、整数ｐは０である。他の実施形態では、ｐは１である。一実施形態では、整数ｒは０である。他の実施形態では、ｒは１である。一実施形態では、整数ｓは０である。他の実施形態では、ｓは１である。一実施形態では、整数ｔは０である。他の実施形態では、ｔは１である。
式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、Ｐは、プロリンである。一実施形態では、Ｏ＊はセリン（Ｓ）である。他の実施形態では、Ｏ＊はスレオニン（Ｔ）である。一実施形態では、Ｕは、プロリン（Ｐ）である。他の実施形態では、Ｕはグルタミン酸（Ｅ）である。さらに別の実施形態では、Ｕはグルタミン（Ｑ）である。さらなる実施形態では、Ｕはアスパラギン酸（Ｄ）である。関連する実施形態では、Ｕはアスパラギン（Ｎ）である。他の実施形態では、Ｕはスレオニン（Ｔ）である。さらに別の実施形態では、Ｕはセリン（Ｓ）である。さらなる実施形態では、Ｕは、グリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）などの非荷電アミノ酸である。Ｘ、ＢおよびＢ１は、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである。Ｚ、ＪおよびＯは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである。一実施形態では、親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ではない。他の実施形態では、親ポリペプチドは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ではない。さらに別の実施形態では、親ポリペプチドは、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）ではない。さらなる実施形態では、親ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ではない。他の実施形態では、親ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ではない。
一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＯ＊Ｐである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＯ＊ＥＩ（Ｐ）ｎである。さらに別の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＥＩである。さらなる実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＯ＊ＱＡ（Ｐ）ｎである。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＯ＊ＴＶＳである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＶＳＰである。さらに別の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＯ＊ＱＧＡである。さらなる実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＧＡＰである。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＯ＊ＱＧＡＭ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＴＥＯ＊Ｐである。さらに別の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＶＬである。さらなる実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＯ＊ＶＬ（Ｐ）ｎである。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＯ＊ＴＶＬである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＶＬＰである。さらに別の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＬＹＶＰである。さらなる実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＯ＊ＴＬＹＶ（Ｐ）ｎである。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＬＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＤＡ（Ｐ）ｎである。さらに別の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＥＮ（Ｐ）ｎである。さらなる実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＤ（Ｐ）ｎである。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＡＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＯ＊ＳＡＶである。さらに別の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＡＶＰである。さらなる実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＧ（Ｐ）ｎである。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＸＴＥＯ＊Ｐである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＤＧ（Ｐ）ｎである。
上記の配列において、ｍ、ｎ、Ｏ＊およびＸは上記のように定義される。
他の態様では、本発明は、複数のメンバーを含むシークオンポリペプチドのライブラリーを提供し、ライブラリーの各メンバーは、共通の親ポリペプチドに相当し、ライブラリーの各メンバーは、外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、式（Ｉ）（配列番号１）によるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、式（ＩＩ）（配列番号２）によるアミノ酸配列を有する。式（Ｉ）および式（ＩＩ）は、本明細書において上記で説明する。一実施形態では、親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ではない。他の実施形態では、親ポリペプチドは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ではない。さらに別の実施形態では、親ポリペプチドは、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）ではない。さらなる実施形態では、親ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ではない。他の実施形態では、親ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ではない。
さらなる態様において、本発明は、宿主細胞においてシークオンポリペプチドを発現させるステップを含む方法を提供し、このシークオンポリペプチドは本発明の外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、式（Ｉ）（配列番号１）によるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、式（ＩＩ）（配列番号２）によるアミノ酸配列を有する。式（Ｉ）および式（ＩＩ）は、本明細書において上記で説明する。一実施形態では、親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ではない。他の実施形態では、親ポリペプチドは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ではない。さらに別の実施形態では、親ポリペプチドは、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）ではない。さらなる実施形態では、親ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ではない。他の実施形態では、親ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ではない。
さらに別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチド結合体の作製方法を提供する。この方法は、（ｉ）シークオンポリペプチドを組換えで生成するステップと、（ｉｉ）外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列においてシークオンポリペプチドを酵素によってグリコシル化するステップとを含む。この方法はまた、ステップ（ｉｉ）のグリコシル化ポリペプチドをグリコＰＥＧ化するステップをさらに含む。
本発明はまた、シークオンポリペプチドのライブラリーの作製方法も提供し、各シークオンポリペプチドは共通の親ポリペプチドに相当する。この方法は、（ｉ）Ｏ−結合型グリコシル化配列を親ポリペプチド中の第１のアミノ酸位置に導入することによって、第１のシークオンポリペプチドを組換えで生成するステップと、（ｉｉ）同一のＯ−結合型グリコシル化配列を親ポリペプチド中のさらなるアミノ酸位置に導入することによって、少なくとも１つのさらなるシークオンポリペプチドを組換えで生成するステップとを含む。
さらに、本発明は、リードポリペプチドの同定方法を提供する。この方法は、（ｉ）本発明のシークオンポリペプチドのライブラリーを生成するステップと、（ｉｉ）ライブラリーの少なくとも１つのメンバーを酵素によるグリコシル化反応に供し、グリコシル部分をグリコシル供与体分子からＯ−結合型グリコシル化配列の少なくとも１つへと転移するステップとを含むが、前記グリコシル部分は、修飾基によって誘導体化されていてもよい。
本発明のさらなる態様、利点および目的は、下記の詳細な説明から明らかであろう。
例示的非グリコシル化および例示的グリコシル化変異ＮＴ−３ポリペプチド（表１６のＡ．２）（配列番号＊＊）のＭＡＬＦＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す図である。図１Ａは、非グリコシル化ＮＴ−３のＭＡＬＦＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。ポリペプチドはＷ３１１０大腸菌中で封入体として発現し、リフォールディングされ、精製された。図１Ｂは、グリコシル化ＮＴ−３のＭＡＬＦＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。精製したＮＴ−３変異体を、実施例２に記載されているようにグリコシルトランスフェラーゼＧａｌＮＡｃ−Ｔ２およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと共にインキュベートした。反応生成物は、約２０３Ｄａの予想される質量の増加に特徴付けられ（予想値：＋２０３．２）、これは非グリコシル化ポリペプチドと比較した場合単一のＧａｌＮＡｃ残基の付加に相当する。 例示的非グリコシル化および例示的グリコシル化変異ＦＧＦ−２１ポリペプチド（表１８のＢ．２０）（配列番号＊＊）のＭＡＬＦＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す図である。図２Ａは、非グリコシル化ＦＧＦ−２１のＭＡＬＦＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。ポリペプチドはｔｒｘＢ、ｇｏｒ、ｓｕｐｐ大腸菌株中で可溶性タンパク質として発現し、リフォールディングされ、精製された。図２Ｂは、グリコシル化ＦＧＦ−２１のＭＡＬＦＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。精製したＦＧＦ−２１変異体を、実施例４に記載されているようにグリコシルトランスフェラーゼＧａｌＮＡｃ−Ｔ２およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと共にインキュベートした。反応生成物は、約２０３Ｄａの予想される質量の増加に特徴付けられ（予想値：＋２０３．２、観測値：２０９）、これは非グリコシル化ポリペプチドと比較した場合単一のＧａｌＮＡｃ残基の付加に相当する。 様々な非ＰＥＧ化およびグリコＰＥＧ化ヒトＮＴ−３変異ポリペプチドについての、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果を示す図である。ＮＴ−３バリアントを、実施例２に記載されているように精製し、グリコＰＥＧ化した。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ｓａｆｅｓｔａｉｎで染色した。ゲルＡ：ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．１（レーン１）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．１（レーン２）、分子量マーカー（レーン３）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．２（レーン４）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．２（レーン５）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．４（レーン６）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．４（レーン７）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．５（レーン８）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．５（レーン９）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．７（レーン１０）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．７（レーン１１）；ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／コア−１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．１（レーン１２）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／コア−１／ＳＴ３Ｇａｌ１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．１（レーン１３）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／コア−１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．２（レーン１４）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／コア−１／ＳＴ３Ｇａｌ１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．２（レーン１５）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／コア−１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．４（レーン１６）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／コア−１／ＳＴ３Ｇａｌ１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．４（レーン１７）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／コア−１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．５（レーン１８）、分子量マーカー（レーン１９）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／コア−１／ＳＴ３Ｇａｌ１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．５（レーン２０）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／コア−１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．７（レーン２１）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２／コア−１／ＳＴ３Ｇａｌ１で処理した表１６（配列番号＊＊）のＮＴ−３バリアントＡ．７（レーン２２）。約１４ｋＤの分子量を有する下の囲まれた領域におけるバンドは、非ＰＥＧ化ＮＴ−３変異体に相当する。約４９〜６２ｋＤの分子量を有する上の囲まれた領域におけるバンドは、グリコＰＥＧ化ＮＴ−３バリアントに相当する。 第ＶＩＩＩ因子の例示的アミノ酸配列を示す表である。 Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子の例示的アミノ酸配列を示す表である。 例示的な親ポリペプチド／Ｏ−結合型グリコシル化配列の組合せの要約を示す表である。各列は、本発明の１つの実施形態を表し、示されたＯ−結合型グリコシル化配列（例えば、ＰＴＰ）が、示された親ポリペプチド（例えば、ＢＭＰ−７）に導入され、本発明のシークオンポリペプチドが生じる。Ｏ−結合型グリコシル化配列は、親ポリペプチド中に異なるアミノ酸位置（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端または内部アミノ酸位置）で導入してもよい。Ｏ−結合型グリコシル化配列は、既存のアミノ酸を置換して、または置換することなく、親ポリペプチド中に導入してもよい。
Ｉ．略語
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ｍ−ＰＥＧ、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；ｍ−ＰＰＧ、メトキシ−ポリ（プロピレングリコール）；Ｆｕｃ、フコースまたはフコシル；Ｇａｌ、ガラクトースまたはガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコースまたはグルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノースまたはマンノシル；ＭａｎＡｃ、酢酸マンノサミンまたは酢酸マンノサミニル；Ｓｉａ、シアル酸またはシアリル；およびＮｅｕＡｃ、Ｎ−アセチルノイラミンまたはＮ−アセチルノイラミニル。
ＩＩ．定義
別に定義しない限り、本明細書で使用するすべての専門用語および科学用語は、一般に本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野で周知であり通常用いられる。核酸およびペプチド合成には標準的な技術を使用する。当技術分野での従来の方法、および本明細書を通して提供される様々な一般の参考文献によって、技術および手順は一般に行われる（一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（参照により本明細書中に組み込まれている）を参照されたい）。本明細書において使用される命名法、ならびに下記に記載する分析化学および有機合成化学における実験手順は、当技術分野で周知であり一般に用いられる。標準技術またはその改変は、化学合成および化学的分析に使用される。
本明細書に記載するすべてのオリゴ糖は、非還元糖の名称または略語（すなわち、Ｇａｌ）、次いでグリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合（１または２）、結合に関与する還元糖の環の位置（２、３、４、６または８）、次に、還元糖の名称または略語（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）によって記載する。各糖は、好ましくはピラノースである。標準的な糖生物学命名法の概説については、例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖａｒｋｉら、（編）ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）を参照されたい。オリゴ糖は、糖成分の１つとしてグリコシル模倣部分（mimetic moiety)を含む場合がある。オリゴ糖は、還元末端の糖が実際に還元糖であるかないかにかかわらず、還元末端および非還元末端を有すると考えられる。
「グリコシル部分」という用語は、糖残基由来の任意の基を意味する。「グリコシル部分」には、単糖、およびオリゴ糖が挙げられ、「グリコシル模倣部分」を包含する。
「グリコシル模倣部分」という用語は、本明細書で使用する場合、グリコシル部分（例えば、ヘキソースまたはペントース）に構造的に類似する部分を意味する。「グリコシル模倣部分」の例には、グリコシル部分のグリコシド酸素もしくは環酸素または両方が、結合、または他の原子（例えば、硫黄）、または炭素含有基（例えば、ＣＨ２）もしくは窒素含有基（例えば、ＮＨ）などの他の部分によって置換されている部分が含まれる。その例には、置換または非置換シクロヘキシル誘導体、環状チオエーテル、環状第２級アミン、チオグリコシド結合を含む部分などが挙げられる。一例では、「グリコシル模倣部分」は、酵素による触媒反応においてポリペプチドのアミノ酸残基または糖ペプチドのグリコシル部分に転移する。これは、例えば「グリコシル模倣部分」をハロゲンなどの脱離基で活性化させることによって実現することができる。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、１本鎖または２本鎖の形態の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを意味する。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸に類似した結合特性を有し、天然由来のヌクレオチドに類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オーソロガス、ＳＮＰ、および相補配列、ならびに明示的に示される配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、１つまたは複数の選択した（またはすべての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換された配列を生じさせることによって実現することができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８（１９８５年）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１〜９８（１９９４年））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。それには、コード領域の前後の領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含むことができる。
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に対して適用する場合、その核酸またはタンパク質が、天然状態では関連している他の細胞成分を本質的に有さないことを示す。それは均質な状態が好ましいが、乾燥状態または水溶液でよい。純度および均質性は典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して決定される。調製物中に存在する主要な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子にフランキングし対象とする遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中で本質的に１つのバンドを生じることを示す。特にこの用語は、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％の純度、さらに好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度であることを意味する。
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を意味する。天然アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を意味する。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。「アミノ酸模倣物（mimetics)」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を意味する。
「非荷電アミノ酸」という用語は、酸性（例えば、−ＣＯＯＨ）または塩基性（例えば、−ＮＨ２）官能基を含まないアミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸には、リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）が含まれる。酸性アミノ酸には、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）が含まれる。「非荷電アミノ酸には、例えば、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）が含まれるが、−ＯＨまたは−ＳＨ基を含むアミノ酸（例えば、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）およびシステイン（Ｃ））も含まれる。
部位特異的方法で非天然アミノ酸誘導体または類似体をポリペプチド鎖に組み込むことを可能にする、当技術分野で公知の様々な方法がある。例えば、ＷＯ０２／０８６０７５を参照されたい。
アミノ酸は本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する一般に知られている３文字記号によるか、または１文字記号によるかのいずれかによって言及することができる。ヌクレオチドも同様に、一般に認められている１文字コードによって言及することができる。
「保存的に修飾されたバリアント」とは、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列を意味する。遺伝コードの縮重により、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがあるコドンによって指定されるすべての位置において、コードされるポリペプチドを変更することなく記述した相当するコドンのいずれかにコドンを変更することができる。このような核酸のバリエーション（variation)は、保存的に修飾されたバリエーションの１つの種である「サイレントバリエーション」である。本明細書においてポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、すべての可能性のある核酸のサイレントバリエーションも説明する。核酸中の各コドン（通常メチオニンについて唯一のコドンであるＡＵＧ、およびトリプトファンについて唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を得ることができることを当業者であれば理解するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載された各配列に潜在的に含まれている。
アミノ酸配列に関して、コードされた配列中の単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変更、付加または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列の個々の置換、欠失または付加は、その変更が化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾されたバリアント」であることを当業者であれば理解するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。このような保存的に修飾されたバリアントは、本発明の多形バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えて存在し、それらを除外しない。
下記の８つの群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照されたい）。
「ペプチド」とは、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介して結合しているポリマーを意味する。本発明のペプチドは、サイズか様々である場合があり、例えば、２個のアミノ酸から数百個または数千個のアミノ酸である。より大きなペプチド（例えば、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個または少なくとも５０個のアミノ酸残基）は、代わりに「ポリペプチド」または「タンパク質」と称される。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン、ホモアルギニンおよびホモフェニルアラニンも含まれる。遺伝子がコードしないアミノ酸も、本発明に使用することができる。さらに、反応性基、グリコシル化配列、ポリマー、治療的部分、生体分子などを含むように修飾されたアミノ酸も本発明において使用することができる。本発明に使用されるアミノ酸のすべては、Ｄ−またはＬ−異性体である場合がある。Ｌ−異性体が一般に好ましい。さらに、他のペプチド模倣物も、本発明において有用である。本明細書で使用する場合、「ペプチド」または「ポリペプチド」とは、グリコシル化および非グリコシル化ペプチドの両方または「ポリペプチド」を意味する。ポリペプチドを発現させる系によって不完全にグリコシル化されたポリペプチドも含まれる。一般の概説については、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ（編）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６７頁（１９８３年）を参照されたい。
本出願において、アミノ酸残基は、「１」と番号付けされるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端メチオニン）からの相対位置によって（典型的には上付き文字で）番号付けされる。Ｎ末端アミノ酸は、「１」と番号付けされるメチオニン（Ｍ）でもよい。ポリペプチドのＮ末端がメチオニンなしで始まる場合、各アミノ酸残基と関連する番号は、Ｎ末端メチオニンの欠如を反映するように容易に調節することができる。例示的なポリペプチドのＮ末端は、メチオニンで始まっても始まらなくてもよいと理解される。
「親ポリペプチド」という用語は、本発明の「外因性」Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を含まないアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを意味する。しかし、「親ポリペプチド」は、１つまたは複数の天然の（内因性）Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を含んでもよい。例えば、野生型ポリペプチドは、Ｏ−結合型グリコシル化配列ＰＴＰを含んでもよい。「親ポリペプチド」という用語は、野生型ポリペプチド、融合ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）、ならびに（例えば、１つまたは複数のアミノ酸の置換、アミノ酸の挿入、アミノ酸の欠失などによってあらかじめ修飾された）任意のそのバリアントを含めた任意のポリペプチド（このような修飾が本発明のＯ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列の形成をもたらさない限り）を意味する。一実施形態では、親ポリペプチドのアミノ酸配列、または親ポリペプチドをコードする核酸配列は確定しており、何らかの形で公共で利用できる。例えば、親ポリペプチドは、野生型ポリペプチドであり、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、公的に利用可能なタンパク質データベース（例えば、ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ、ＥｘＰａｓｙ、タンパク質データバンクなど）の一部である。他の例では、親ポリペプチドは野生型ポリペプチドではないが、治療用ポリペプチド（すなわち、承認薬）として使用され、このようなポリペプチドの配列は、科学に関する公開資料または特許において公的に使用可能である。さらに他の例では、親ポリペプチドのアミノ酸配列または親ポリペプチドをコードする核酸配列は、本発明の時点で何らかの形で一般の人々が入手可能であった。一実施形態では、親ポリペプチドは、より大きな構造の一部である。例えば親ポリペプチドは、抗体の定常領域（Ｆｃ）領域またはＣＨ２ドメインに相当し、これらのドメインは、全抗体の一部である場合がある。一実施形態では、親ポリペプチドは、不明な配列の抗体ではない。
「変異ポリペプチド」または「ポリペプチドバリアント」という用語は、そのアミノ酸配列が、その相当する野生型形態、天然に存在する形態または任意の他の親形態のアミノ酸配列とは異なるポリペプチドの形態を意味する。変異ポリペプチドは、変異ポリペプチドを生じさせる１つまたは複数の変異、例えば、置換、挿入、欠失などを含有することができる。
「シークオンポリペプチド」という用語は、そのアミノ酸配列中に本発明の「外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列」を含むポリペプチドバリアントを意味する。「シークオンポリペプチド」は、少なくとも１つの外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含有するが、１つまたは複数の内因性（例えば、天然の）Ｏ−結合型グリコシル化配列も含んでもよい。
「外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列」という用語は、親ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）のアミノ酸配列に導入される本発明のＯ−結合型グリコシル化配列を意味し、この親ポリペプチドは、Ｏ−結合型グリコシル化配列を含まないか、または異なる位置でＯ−結合型グリコシル化配列を含む。一例では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列を有さない野生型ポリペプチドに導入される。他の例では、野生型ポリペプチドは、第１のＯ−結合型グリコシル化配列を第１の位置で天然で含む。第２のＯ−結合型グリコシル化が、第２の位置でこの野生型ポリペプチドに導入される。この修飾によって、第２の位置で「外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列」を有するポリペプチドがもたらされる。外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列は、変異によって親ポリペプチドに導入されてもよい。代わりに、外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を有するポリペプチドを、化学合成によって作製できる。
「親ポリペプチドに相当する」（またはこの用語の文法的変形）という用語は、本発明のシークオンポリペプチドを説明するために使用され、シークオンポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１つの本発明の外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列の存在することによってのみ、相当する親ポリペプチドのアミノ酸配列と異なる。典型的には、シークオンポリペプチドおよび親ポリペプチドのアミノ酸配列は、高率の同一性を示す。一例では、「親ポリペプチドに相当する」とは、シークオンポリペプチドのアミノ酸配列が、親ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９８％の同一性を有することを意味する。他の例では、シークオンポリペプチドをコードする核酸配列は、親ポリペプチドをコードする核酸配列に対して、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９８％の同一性を有する。
「グリコシル化配列（例えば、Ｏ−結合型グリコシル化配列）を親ポリペプチドに導入する（または付加する、など）」（もしくはその文法的変形）、またはグリコシル化配列を含めるために「親ポリペプチドを修飾する」（もしくはその文法的変形）という用語は、親ポリペプチドは、このような変換のための物理的出発物質であることを必ずしも意味しないが、むしろ親ポリペプチドは他のポリペプチドを作製するためのアミノ酸配列のガイドを提供することを意味する。一例では、「グリコシル化配列を親ポリペプチドに導入する」とは、親ポリペプチドの遺伝子は、適切な変異によって修飾され、シークオンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が生じることを意味する。他の例では、「グリコシル化配列を親ポリペプチドに導入する」とは、このように得られたポリペプチドが、親ポリペプチド配列をガイドとして使用して理論的に設計されることを意味する。次いで、設計されたポリペプチドを、化学的または他の手段によって生じさせることができる。
「リードポリペプチド」という用語は、効果的にグリコシル化および／またはグリコＰＥＧ化することができる本発明のシークオンポリペプチドを意味する。本発明のシークオンポリペプチドをリードポリペプチドと見なすために、このようなポリペプチドは、適切な反応条件にさらされた場合、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは約８０％、約８５％、約９０％または約９５％の反応収率でグリコシル化またはグリコＰＥＧ化される。最も好ましいのは、９５％を超える反応収率でグリコシル化またはグリコＰＥＧ化できる本発明のリードポリペプチドである。好ましい一実施形態では、リードポリペプチドは、各Ｏ−結合型グリコシル化配列のただ１個のアミノ酸残基がグリコシル化またはグリコＰＥＧ化（モノグリコシル化）される様式でグリコシル化またはグリコＰＥＧ化される。
「ライブラリー」という用語は、各々が共通の親ポリペプチドに相当する異なるポリペプチドを集めたものを意味する。ライブラリー中の各ポリペプチド種は、ライブラリーのメンバーと称される。好ましくは、本発明のライブラリーは、そこからリードポリペプチドを同定する集団がもたらされる十分な数と多様性のポリペプチドを集めたものを表す。ライブラリーは、少なくとも２つの異なるポリペプチドを含む。一実施形態では、ライブラリーは、約２〜約１０のメンバーを含む。他の実施形態では、ライブラリーは、約１０〜約２０のメンバーを含む。さらに別の実施形態では、ライブラリーは、約２０〜約３０のメンバーを含む。さらなる実施形態では、ライブラリーは、約３０〜約５０のメンバーを含む。他の実施形態では、ライブラリーは、約５０〜約１００のメンバーを含む。さらに別の実施形態では、ライブラリーは、１００を超えるメンバーを含む。ライブラリーのメンバーは、混合物の一部でもよく、または互いに分離していてもよい。一例では、ライブラリーのメンバーは、他の成分を含んでもよい混合物の一部である。例えば、少なくとも２つのシークオンポリペプチドは、多量の細胞培養ブロス中に存在する。他の例では、ライブラリーのメンバーは各々、別々に発現しており、単離されてもよい。単離されたシークオンポリペプチドは、マルチウェルの容器中に含有されてもよく、各ウェルは異なるタイプのシークオンポリペプチドを含有する。
本発明の「ＣＨ２」ドメインという用語は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ２定常ドメインを意味する。免疫グロブリンＣＨ２ドメインの定義において、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．（１９７８年）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３２：１〜７５が、一般に免疫グロブリンについて、特にヒトＩｇＧ１に適用されるような免疫グロブリンのドメイン構造について言及している。
「ＣＨ２ドメインを含むポリペプチド」または「少なくとも１つのＣＨ２ドメインを含むポリペプチド」という用語は、全抗体分子、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃドメイン）、または免疫グロブリンのＣＨ２領域と同等である領域を含む融合タンパク質を含むことを意図している。
「ポリペプチド結合体」という用語は、ポリペプチドが、本明細書に記載の糖部分（例えば、修飾された糖）で糖結合される本発明の種を意味する。代表的な例では、ポリペプチドは、外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を有するシークオンポリペプチドである。
「プロリン残基に近接した」または「プロリン残基に近接」とは本明細書で使用する場合、プロリン残基から約１０個未満のアミノ酸だけ離れた、好ましくは、プロリン残基から約９個、８個、７個、６個または５個未満のアミノ酸だけ離れた、より好ましくは、プロリン残基から約４個、３個または２個未満の残基だけ離れたアミノ酸を意味する。「プロリン残基に近接した」アミノ酸は、プロリン残基のＣ末端側またはＮ末端側にある場合がある。
「シアル酸」という用語は、炭素９個のカルボキシル化糖ファミリーの任意のメンバーを意味する。シアル酸ファミリーの最も一般のメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸である（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略記される場合が多い）。ファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されているＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏら、（１９８６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０〜１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１〜２１８１９（１９９０年））。９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ（９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃなど）、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの概説については、例えば、Ｖａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２：２５〜４０（１９９２年）；Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ（編）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年））を参照されたい。シアリル化の手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日に公開された国際出願ＷＯ９２／１６６４０に開示されている。
本明細書で使用する場合、「修飾された糖」という用語は、天然または非天然炭水化物を意味する。一実施形態では、「修飾された糖」は、本発明の方法を使用してポリペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に酵素によって付加される。修飾された糖は、それだけに限らないが、糖ヌクレオチド（一、二および三リン酸）、活性化糖（例えば、ハロゲン化グリコシル、グリコシルメシレート）および活性化されておらずヌクレオチドでもない糖が挙げられるいくつかの酵素基質から選択される。「修飾された糖」は、「修飾基」によって共有結合によって官能化される。有用な修飾基には、それだけに限らないが、ポリマー修飾基（例えば、水溶性ポリマー）、治療的部分、診断的部分、生体分子などが挙げられる。一実施形態では、修飾基は、天然グリコシル部分（例えば、天然多糖）ではない。修飾基は、好ましくは非天然である。一例では、「非天然修飾基」は、ポリマー修飾基であり、少なくとも１つのポリマー部分は非天然である。他の例では、非天然修飾基は、修飾された炭水化物である。「修飾された糖」が酵素によってポリペプチドに付加されるのを妨げないように修飾基による官能化の位置が選択される。「修飾された糖」はまた、修飾基で官能化され、グリコシルトランスフェラーゼなどの天然酵素または修飾された酵素の基質である、任意のグリコシル模倣部分を意味する。
本明細書で使用する場合、「ポリマー修飾基」という用語は、少なくとも１つのポリマー部分（ポリマー）を含む修飾基である。ポリペプチドに付加されるポリマー修飾基は、このようなポリペプチドの特性、例えば、そのバイオアベイラビリティ、生物活性または体内におけるその半減期を変更することができる。例示的なポリマーには、水溶性ポリマーおよび水不溶性ポリマーが挙げられる。ポリマー修飾基は、直鎖状または分枝状である場合があり、ポリ（アルキレングリコール）およびその誘導体などの、１つまたは複数の独立して選択されるポリマー部分を含むことができる。一例では、ポリマーは非天然である。例示的な実施形態では、ポリマー修飾基には、水溶性ポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）およびその誘導体（ＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）およびその誘導体（ＰＰＧ、ｍ−ＰＰＧ）などが挙げられる。好ましい実施形態では、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）は、本質的にホモ分散性である分子量を有する。一実施形態では、ポリマー修飾基は、天然多糖ではない。
「水溶性」という用語は、水中で検出可能な程度の溶解度を有する部分を意味する。水溶性の検出および／または定量化の方法は、当技術分野で周知である。例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、糖、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などが挙げられる。ペプチドは、混合配列を有するものでも、単一のアミノ酸から構成されるもの、例えば、ポリ（リシン）でもよい。例示的多糖は、ポリ（シアル酸）である。例示的ポリ（エーテル）は、ポリ（エチレングリコール）、例えば、ｍ−ＰＥＧである。ポリ（エチレンイミン）は、例示的ポリアミンであり、ポリ（アクリル）酸は、代表的なポリ（カルボン酸）である。
水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）（すなわちＰＥＧ）でよい。しかし、他の関連するポリマーも本発明の実施において使用するのに適切であり、ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）という用語を使用することは、この点において包括的であり限定的でないことを意図することを理解すべきである。ＰＥＧという用語は、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、ペンダント型ＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格から垂れ下がった１つまたは複数の官能基を有するＰＥＧまたは関連するポリマー）、または内部に分解性の結合を有するＰＥＧを含めた、任意の形態のポリ（エチレングリコール）を含む。
ポリマー骨格は、直鎖状でも分枝状でもよい。分枝ポリマー骨格は、一般に当技術分野において公知である。典型的には、分枝ポリマーは、中央の分枝コア部分と、中央の分枝コアに連結した複数の線状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、エチレンオキシドを、グリセロール、ペンタエリトリトールおよびソルビトールなどの様々なポリオールに付加することによって調製できる分枝形態で通常使用される。中央の分枝部分も、リシンまたはシステインなどのいくつかのアミノ酸から誘導することができる。一例では、分枝ポリ（エチレングリコール）は、一般形態でＲ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（式中、Ｒはグリセロールまたはペンタエリトリトールなどのコア部分を表し、ｍはアームの数を表す）として表すことができる。参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第５，９３２，４６２号に記載されているようなマルチアームＰＥＧ分子も、ポリマー骨格として使用することができる。
多くの他のポリマーも、本発明に適している。非ペプチド性および水溶性であるポリマー骨格は、本発明に特に有用である。適切なポリマーの例には、それだけに限らないが、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの他のポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールなどとのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第５，６２９，３８４号に記載されているようなポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ならびにコポリマー、ターポリマー、およびこれらの混合物が挙げられる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は変化する場合があるが、典型的には約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、多くの場合約５，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲である。
「糖結合（glycoconjugation）」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリペプチド、例えば、本発明の変異ヒト成長ホルモンのアミノ酸またはグリコシル残基への、修飾された糖種の酵素を介した結合を意味する。一例では、修飾された糖は、１つまたは複数の修飾基に共有結合している。「糖結合」の小区分は、「グリコール−ＰＥＧ化」または「グリコ−ＰＥＧ化」であり、修飾された糖の修飾基は、ポリ（エチレングリコール）、またはアルキル誘導体（例えば、ｍ−ＰＥＧ）もしくは反応性官能基を有する誘導体（例えば、Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）などのその誘導体である。
「大規模な」および「工業規模」という用語は互換的に使用され、単一の反応サイクルの完了時に、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、さらに好ましくは少なくとも約１グラムの糖結合体を生成する反応サイクルを意味する。
「Ｏ−結合型グリコシル化配列」または「シークオン」という用語は、ヒドロキシル基を有するアミノ酸残基（例えば、セリンまたはスレオニン）を含む（例えば、約３個〜約９個のアミノ酸、好ましくは約３個〜約６個のアミノ酸を含有する）任意のアミノ酸配列を意味する。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、好ましくはポリペプチドのアミノ酸配列の一部である場合、グリコシルトランスフェラーゼなどの酵素の基質である。典型的な実施形態では、酵素は、上記のヒドロキシル基（「グリコシル化部位」と称される）を修飾することによって、グリコシル部分をＯ−結合型グリコシル化配列に転移させる。本発明は、野生型ポリペプチドまたはその任意の他の親形態において天然のＯ−結合型グリコシル化配列（内因性Ｏ−結合型グリコシル化配列）と、「外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列」とを区別する。外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含むポリペプチドは、「シークオンポリペプチド」と称される。親ポリペプチドのアミノ酸配列は、組換え技術、化学合成または他の手段によって外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含むように修飾することができる。関連する「Ｓ−結合型グリコシル化配列」という用語は類似したものであり、スルフヒドリル基（例えば、システイン、Ｍｅ−システイン）を有するアミノ酸残基を含み、好ましくはポリペプチドのアミノ酸配列の一部である場合、グリコシルトランスフェラーゼなどの酵素の基質である任意のアミノ酸配列を意味する。
「グリコシル連結基」という用語は、本明細書で使用する場合、修飾基（例えば、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子）が共有結合しているグリコシル残基を意味する。グリコシル連結基は、修飾基を結合体の残りに結合させる。本発明の方法において、「グリコシル連結基」は、グリコシル化または非グリコシル化ポリペプチドに共有結合し、したがって修飾基をポリペプチドのアミノ酸および／またはグリコシル残基へと連結させる。「グリコシル連結基」は、ポリペプチドのアミノ酸および／またはグリコシル残基への「修飾された糖」の酵素的結合によって、「修飾された糖」から一般に誘導される。グリコシル連結基は、修飾基−修飾された糖カセットの形成（例えば、酸化→シッフ塩基形成→還元）の間に分解する糖に由来する構造である場合があり、またはグリコシル連結基は損傷のない場合がある。「損傷のないグリコシル連結基」とは、修飾基を結合体の残りに連結させる糖モノマーが、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムによって分解されない、例えば酸化されない、グリコシル部分から誘導される連結基を意味する。本発明の「損傷のないグリコシル連結基」は、グリコシルユニットの付加、または親糖構造からの１つもしくは複数のグリコシルユニットの除去により、天然オリゴ糖から誘導される場合がある。「グリコシル連結基」には、グリコシル模倣部分を含んでもよい。例えば、修飾された糖をグリコシル化ポリペプチドに付加するために使用されるグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ）は、グリコシル模倣基質（例えば、糖部分がグリコシル模倣部分、例えば、シアリル模倣部分である修飾された糖）への耐性を示す。修飾されたグリコシル模倣糖の転移は、グリコシル模倣部分であるグリコシル連結基を有する結合体をもたらす。
「標的化部分」という用語は、本明細書で使用する場合、体の特定の組織または領域に選択的に局在化する種を意味する。局在化は、分子決定因子、標的化物質または結合体の分子の大きさ、イオン相互作用、疎水的相互作用などの特異的認識によってもたらされる。特定の組織または領域に作用物質を標的化する他の機構は当業者に公知である。例示的な標的化部分には、抗体、抗体フラグメント、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「治療的部分（therapeutic moiety）」とは、それだけに限らないが、抗生物質、抗炎症薬、抗腫瘍薬、細胞毒、および放射性剤が挙げられる、治療に有用な任意の作用物質を意味する。「治療的部分」には、生理活性剤のプロドラッグ、複数の治療的部分が担体に結合している構築体、例えば、多価作用物質が挙げられる。治療的部分にはまた、タンパク質およびタンパク質を含む構築体も挙げられる。例示的なタンパク質には、それだけに限らないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ）、インターロイキン（例えば、インターロイキンＩＩ）、血清タンパク質（例えば、因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、およびＸ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）および抗体融合タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子受容体（（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン融合タンパク質））が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「抗腫瘍薬」とは、それだけに限らないが、代謝拮抗剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、有糸***阻害剤、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、副腎皮質ステロイド、インターフェロンおよび放射性剤などの細胞毒および薬剤が挙げられる、癌を抑制するのに有用な任意の薬剤を意味する。また「抗腫瘍薬」という用語の範囲内に包含されるのは、抗腫瘍活性を有するポリペプチドの結合体、例えばＴＮＦ−αである。結合体には、それだけに限らないが、治療用タンパク質と本発明の糖タンパク質との間に形成されるものが挙げられる。代表的な結合体は、ＰＳＧＬ−１とＴＮＦ−αとの間に形成されるものである。
本明細書で使用する場合、「細胞毒または細胞毒性剤」とは、細胞に害を及ぼす任意の薬剤を意味する。その例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにその類似体または相同体が挙げられる。他の毒素には、例えば、リシン、ＣＣ−１０６５および類似体、デュオカルマイシンが挙げられる。さらに他の毒素には、ジフテリア毒素、および蛇毒（例えば、コブラ毒）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「放射性剤」には、診断または腫瘍の破壊に効果的な任意の放射性同位体が挙げられる。その例には、それだけに限らないが、インジウム−１１１、コバルト−６０が挙げられる。さらに、典型的には放射性同位体の混合物を表すウラン、ラジウム、およびトリウムなどの天然放射性元素は、放射性剤の適切な例である。金属イオンは典型的には、有機キレート部分とキレート化する。
多くの有用なキレート基、クラウンエーテル、クリプタンドなどは、当技術分野において公知であり、本発明の化合物（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡなど、およびＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰなどのそれらのホスホン酸類似体）に組み込むことができる。例えば、Ｐｉｔｔら、「Ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｒｏｎ Ｏｖｅｒｌｏａｄ」、ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＥＤＩＣＩＮＥ；Ｍａｒｔｅｌｌ（編）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８０年、２７９〜３１２頁；Ｌｉｎｄｏｙ、ＴＨＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣ ＬＩＧＡＮＤ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８９年；Ｄｕｇａｓ、ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年、およびそこに掲載されている参考文献を参照されたい。
さらに、キレート剤、クラウンエーテルおよびシクロデキストリンの他の分子への結合を可能にする多種多様の経路は、当業者は利用可能である。例えば、Ｍｅａｒｅｓら、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃｈｅｌａｔｅ−Ｔａｇｇｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ，ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＳＰＥＣＴＳ、Ｆｅｅｎｅｙら（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２年、３７０〜３８７頁；Ｋａｓｉｎａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、９：１０８〜１１７（１９９８年）；Ｓｏｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、８：２４９〜２５５（１９９７年）を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」には、結合体と合わせた場合、結合体の活性を保持し、対象の免疫系に非反応性である任意の材料が挙げられる。「薬学的に許容できる担体」には、ビヒクル、希釈剤および溶媒などの固体および液体が挙げられる。その例には、それだけに限らないが、標準的医薬担体（リン酸緩衝溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤など）のいずれかが挙げられる。他の担体にはまた、滅菌溶液、コーティング錠剤を含めた錠剤、およびカプセル剤が挙げられる。典型的にはこのような担体は、デンプン、乳、糖、特定のタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは植物性油、ガム、グリコール、または他の公知の賦形剤などの賦形剤を含有する。このような担体にはまた、香味および色の添加剤または他の成分も含まれてもよい。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤される。
本明細書で使用する場合、「投与する」とは、対象への経口投与、坐薬としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋内、病巣内、もしくは皮下投与、吸入による投与、または徐放性装置、例えばミニ浸透圧ポンプの埋め込みを意味する。投与は、非経口および経粘膜（例えば、経口、経鼻、経膣、直腸、または経皮）を含めた任意の経路によるが、特に吸入による。非経口投与には、例えば、静脈内、筋内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内および頭蓋内が挙げられる。さらに、腫瘍の治療、例えばアポトーシスの誘発のための注射である場合、腫瘍および／または腫瘍を取り巻く組織に直接投与することができる。他の送達方法には、それだけに限らないが、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が挙げられる。
「寛解（ameliorating）」または「寛解する」という用語は、症状の緩和、軽減もしくは減少、または患者の肉体的および精神的に満足のいく状態の改善などの任意の客観的または主観的パラメーターを含めた、病態または状態の治療が成功した症状を意味する。症状の寛解は、理学的検査および／または精神医学的評価の結果を含めた客観的または主観的パラメーターに基づくことができる。
「治療法」という用語は、疾患にかかりやすいが疾患の症状をまだ体験していない、または示さない対象（例えば、ヒト）において、疾患または状態が起こることを妨げ（予防的治療）、疾患を抑制し（その進行を遅らせ、または抑える）、（対症療法を含めて）疾患の症状または副作用の軽減を実現し、疾患を軽減する（疾患の退行をもたらす）ことを含めた疾患または状態を「治療すること」または「治療」を意味する。
「有効量」もしくは「有効な量」もしくは「治療有効量」という用語、または任意の文法的に同等の用語は、疾患を治療するために動物またはヒトに投与した場合、その疾患の治療をもたらすのに十分な量を意味する。
「単離された」という用語は、その材料を生成するために使用される成分が実質的にまたは本質的に存在しない材料を意味する。本発明のポリペプチド結合体について、「単離された」という用語は、ポリペプチド結合体を調製するために使用される混合物において、その材料に通常伴う成分が実質的にまたは本質的に存在しない材料を意味する。「単離された」および「純粋な」は、互換的に使用される。典型的には、本発明の単離ポリペプチド結合体は、範囲として表現されるのが好ましい純度のレベルを有する。ポリペプチド結合体の純度の範囲の下限は、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上限は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。
ポリペプチド結合体が約９０％を超えて純粋である場合は、それらの純度は範囲として表現されることも好ましい。純度の範囲の下限は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上限は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の純度である。
純度は、任意の分析の技術分野において認められた方法によって決定する（例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、質量分析、または同様の手段）。
「集団の本質的に各メンバー」とは、本明細書で使用する場合、ポリペプチドに付加された選択した割合の修飾された糖がポリペプチド上の複数の同一の受容体部位に付加される、本発明のポリペプチド結合体の集団の特質を説明する。「集団の本質的に各メンバー」は、修飾された糖に結合したポリペプチド上の部位の「均質性」を意味し、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％均質である本発明の結合体を意味する。
「均質性（homogeneity）」とは、修飾された糖が結合している受容体部分の集団にわたる構造の一貫性を意味する。したがって、各々の修飾された糖部分が、他のすべての修飾された糖が結合している受容体部位と同じ構造を有する受容体部位に結合している本発明のポリペプチド結合体において、ポリペプチド結合体は、約１００％均質であると考えられる。均質性は典型的には、範囲として表現される。ポリペプチド結合体の均質性の範囲の下限は、約５０％、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上限は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。
ポリペプチド結合体が約９０％を超えてまたは約９０％と等しく均質である場合、それらの均質性も範囲として表現されることが好ましい。均質性の範囲の下限は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上限は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の均質性である。ポリペプチド結合体の純度は典型的には、当業者に公知の１種または複数の方法、例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動などによって決定される。
糖ペプチド種に言及する場合、「実質的に均一なグリコフォーム」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」とは、対象のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）によってグリコシル化されている受容体部分の割合を意味する。例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、（下記定義のような）実質的にすべてのＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびシアリル化されたその類似体が、本発明のペプチド結合体においてフコシル化されている場合、実質的に均一なフコシル化パターンが存在する。出発物質がグリコシル化受容体部分（例えば、フコシル化されたＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含有し得ることは当業者であれば理解しよう。したがって、計算されるグリコシル化比率は、本発明の方法によってグリコシル化される受容体部分、ならびに出発物質中ですでにグリコシル化されている受容体部分を含むであろう。
上記の定義の「実質的に均一な」における「実質的に」という用語は一般に、特定のグリコシルトランスフェラーゼの受容体部分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはさらに好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されていることを意味する。
置換基が、左から右に記載された従来の化学式によって特定されている場合、構造を右から左に書くことからもたらされる化学的に同一の置換基が同様に包含され、例えば−ＣＨ２Ｏ−は、−ＯＣＨ２−を意味することも意図される。
「アルキル」という用語は、特に明記しない限り、それ自体でまたは他の置換基の部分として、完全飽和、一不飽和もしくは多価不飽和でよい、直鎖もしくは分枝鎖炭化水素基、または環状（すなわち、シクロアルキル）炭化水素基、またはこれらの組合せを意味し、示した炭素原子の数を有する２価（例えば、アルキレン）および多価基を含むことができる（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０とは１〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素基の例には、それだけに限らないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体および異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有する基である。不飽和アルキル基の例には、それだけに限らないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−プロピニルおよび３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高次の相同体および異性体が挙げられる。「アルキル」という用語はまた、他に断らない限り、「ヘテロアルキル」などの下記でより詳細に規定するアルキルの誘導体を含むことを意味する。炭酸水素基に限定されたアルキル基は、「ホモアルキル」と称される。
「アルキレン」という用語は、それ自体でまたは他の置換基の一部として、これだけに限らないが−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−によって例示されるような、アルカンから誘導される２価の基を意味し、さらに「ヘテロアルキレン」として下記で説明する基を含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有する基が本発明において好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有するより短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語はそれらの従来の意味で使用され、各々、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して、分子の残りに結合するアルキル基を意味する。
「ヘテロアルキル」という用語は、特に明記しない限り、それ自体でまたは他の用語と組み合わせて、明示された数の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（窒素および硫黄原子は酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されてもよい）からなる、安定的な直鎖もしくは分枝鎖の炭化水素基、または環状炭化水素基、またはこれらの組合せを意味する。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、ＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置またはアルキル基が分子の残りに結合している位置に配置されてもよい。その例には、それだけに限らないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など、２個までのヘテロ原子が連続してもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体でまたは他の置換基の部分として、これらだけに限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−によって例示されるようなヘテロアルキルから誘導される２価の基を意味する。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子はまた、鎖の末端の一方または両方を占めることができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基について、連結基の配向は、連結基の式が書かれる方法によって示されない。例えば、式−ＣＯ２Ｒ’は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’および−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’の両方を表す。
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、特に明記しない限り、それ自体でまたは他の用語と組み合わせて、各々「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状型を表す。さらにヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りに結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例には、それだけに限らないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例には、それだけに限らないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、特に明記しない限り、それ自体でまたは他の置換基の部分として、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」という用語は、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことを意味するが、それだけに限られることはない。
「アリール」という用語は、特に明記しない限り、単一の環、または一緒になって縮合もしくは共有結合している複数の環（好ましくは１〜３環）の場合がある多価不飽和の芳香族置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳｉおよびＢから選択される１〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）を意味し、窒素原子および硫黄原子は酸化されてもよく、窒素原子は四級化されてもよい。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りに結合することができる。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記のアリール環系およびヘテロアリール環系の各々のための置換基は、下記の許容できる置換基の群から選択される。
簡単に言うと、「アリール」という用語には、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組み合わせて使用される場合、上記の定義のようなアリール環およびヘテロアリール環の両方が含まれる。したがって、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（例えば、メチレン基）が、例えば酸素原子によって置換されているアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含めて、アリール基がアルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）に結合している基を含むことを意味する。
上記の用語の各々（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、示した基の置換および非置換形態の両方を含むことを意味する。各タイプの基のための好ましい置換基を、下記に提供する。
（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称されることが多い基を含めた）アルキル基およびヘテロアルキル基の置換基は、「アルキル基の置換基」と総称して呼ばれ、これらだけに限らないが、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から、０から（２ｍ’＋１）（式中、ｍ’は、このような基中の炭素原子の総数である）までの範囲の数で選択される種々の基の１つまたは複数でよい。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””は、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、例えば、１〜３個のハロゲンによって置換されたアリール、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を各々独立に意味することが好ましい。例えば、本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合、各々のＲ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基がこれらの基の複数が存在する場合にそうであるように、Ｒ基の各々は、独立して選択される。Ｒ’およびＲ”が同一の窒素原子に結合している場合、それらは窒素原子と一緒になって、５員環、６員環、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意味するが、それらだけに限らない。置換基の上記の考察から、「アルキル」という用語は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの、水素基以外の基に結合した炭素原子を含んだ基を含むことを意味すると当業者は理解するであろう。
アルキル基について記載した置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基の置換基は、「アリール基の置換基」と一般に称される。置換基は、例えば置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから、０から芳香環系上の空の原子価の総数までの範囲の数で選択され、式中、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””は、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されることが好ましい。本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合、各々のＲ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基がこれらの基の複数が存在する場合にそうであるように、Ｒ基の各々は、独立して選択される。
アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基の２個は、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは、独立して、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｑは、０〜３の整数である）の置換基によって置換されてもよい。代わりに、アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基の２個は、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−（式中、ＡおよびＢは、独立に、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは、１〜４の整数である）の置換基によって置換されてもよい。このように形成された新規な環の単結合の１つは、二重結合によって置換されてもよい。代わりに、アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基の２個は、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ”Ｒ”’）ｄ−（式中、ｓおよびｄは、独立に０〜３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基によって置換されてもよい。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は、水素または置換もしくは非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから独立して選択されることが好ましい。
本明細書で使用する場合、「アシル」という用語は、カルボニル残基Ｃ（Ｏ）Ｒを含有する置換基を意味する。Ｒの例示的な種には、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「縮合環系」という用語は、各環が他の環と共通の少なくとも２つの原子を有する、少なくとも２つの環を意味する。「縮合環系には、芳香環ならびに非芳香環が含まれてもよい。「縮合環系」の例は、ナフタレン、インドール、キノリン、クロメンなどである。
本明細書で使用する場合、「ヘテロ原子」という用語には、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、ケイ素（Ｓｉ）およびホウ素（Ｂ）が挙げられる。
記号「Ｒ」は、置換基を表す一般の略語である。例示的な置換基には、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換ヘテロシクロアルキル基が挙げられる。
「薬学的に許容できる塩」という用語には、本明細書に記載する化合物上に見出される特定の置換基によって比較的無毒性の酸または塩基によって調製される活性化合物の塩が含まれる。本発明の化合物が、比較的酸性の官能性を含有する場合、このような化合物の中性形態を、未希釈であるかまたは適切な不活性溶媒中の十分な量の所望の塩基と接触させることによって、塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容できる塩基付加塩の例には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩もしくはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能性を含有する場合、このような化合物の中性形態を、未希釈であるかまたは適切な不活性溶媒中の十分な量の所望の酸と接触させることによって、酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容できる酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などの無機酸から誘導される塩、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的無毒性の有機酸から誘導される塩が挙げられる。アルギン酸塩などのアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などの有機酸の塩も挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６：１〜１９（１９７７年）を参照されたい）。本発明のある特定の化合物は、化合物が塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換されることを可能にする塩基性および酸性の官能性の両方を含有する。
化合物の中性形態は、従来の様式で塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を単離することによって生成することが好ましい。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解性など特定の物理学的性質において様々な塩の形態と異なるが、そのほかの点では本発明の目的のために、塩は化合物の親形態と同等である。
塩の形態に加えて、本発明は、プロドラッグ形態の化合物を提供する。本明細書に記載する化合物のプロドラッグは、生理条件下で化学変化を容易に受け本発明の化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグは、ｅｘ ｖｉｖｏ環境で化学的または生化学的方法によって本発明の化合物に変換することができる。例えば、プロドラッグは、適切な酵素または化学試薬を有する経皮パッチ容器中に置かれた場合、本発明の化合物に徐々に変換されることができる。
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形態、ならびに水和形態を含めた溶媒和形態で存在することができる。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と同等であり、本発明の範囲内に包含される。本発明の特定の化合物は、多数の結晶性形態またはアモルファス形態で存在し得る。一般に、すべての物理的形態は、本発明が意図する使用に対して同等であり、本発明の範囲内であることを意図している。
不斉炭素原子（光心）または二重結合を有する本発明の特定の化合物、ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体は、本発明の範囲内に包含される。
本発明の化合物は、単一の異性体（例えば、エナンチオマー、シス−トランス異性体、位置異性体、ジアステレオマー）として、または異性体の混合物として調製することができる。好ましい実施形態では、化合物は実質的に単一の異性体として調製される。実質的に異性体的に純粋な化合物を調製する方法は、当技術分野において公知である。例えば、鏡像異性的に濃縮された混合物および純粋な鏡像異性化合物は、キラル中心の立体化学を未変化のままにしておく反応またはその完全な反転をもたらす反応と組み合わせて、鏡像異性的に純粋な合成中間体を使用することによって調製することができる。代わりに、最終生成物または合成経路の間の中間体は、単一の立体異性体に分離することができる。特定の立体中心を反転または未変化のままにするための技術、および立体異性体の混合物を分離するための技術は、当技術分野で周知であり、特定の状況のために適切な方法を選択することは十分に当業者の能力の範囲内である。一般に、Ｆｕｒｎｉｓｓら（編）、ＶＯＧＥＬ’Ｓ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第５版、Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｌｔｄ．、Ｅｓｓｅｘ、１９９１年、８０９〜８１６頁；およびＨｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８（１９９０年）を参照されたい。
本明細書において使用されるラセミ化合物、アンビスカレミック（ambiscalemic）化合物およびスカレミック（scalemic）化合物、または鏡像異性的に純粋な化合物の図形表示は、Ｍａｅｈｒ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．、６２：１１４〜１２０（１９８５年）から採用されている。実線と破線のくさび形は、キラル要素の絶対配置を表すために使用され、波線は、それが表す結合が生じさせることができる立体化学的意味と無関係であることを示し、太い実線と破線は、相対配置を示すがいかなる絶対立体化学も意味しない幾何学的記号であり、くさび形輪郭線および点線または破線は、不確定な絶対配置の鏡像異性的に純粋な化合物を表す。
「鏡像体過剰率」およびジアステレオマー過剰率」という用語は、本明細書において互換的に使用される。単一の立体中心を有する化合物は、「鏡像体過剰」で存在すると称され、少なくとも２つの立体中心を有する化合物は、「ジアステレオマー過剰」で存在すると称される。
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する原子の１つまたは複数の天然ではない割合の原子同位体を含有してもよい。例えば、化合物は、例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）などの放射性同位体で放射標識されてもよい。本発明の化合物のすべての同位体の変形は、放射性であってもはなくても、本発明の範囲内に包含されることを意図する。
「反応性官能基」とは、本明細書で使用する場合、それだけに限らないが、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、サルフェート、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルフィット、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物が挙げられる基を意味する。反応性官能基にはまた、生体結合体を調製するために使用するもの、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなどが含まれる。これらの官能基の各々の調製方法は、当技術分野で周知であり、特定の目的のためのそれらの適用または修飾は、当業者の能力の範囲内である（例えば、ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ（編）、ＯＲＧＡＮＩＣ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＧＲＯＵＰ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９８９年を参照されたい）。
「非共有結合タンパク質結合基」は、結合的様式で、損傷のないポリペプチドまたは変性ポリペプチドと相互作用する部分である。相互作用は、生物学的環境中で可逆的または不可逆的でもよい。本発明のキレート剤または複合体への「非共有結合タンパク質結合基」の組込みは、非共有結合的な様式でポリペプチドと相互作用する能力を有する作用物質または複合体を提供する。例示的な非共有結合相互作用には、疎水性−疎水性相互作用および静電相互作用が挙げられる。例示的な「非共有結合タンパク質結合基」には、アニオン基、例えば、リン酸、チオリン酸、ホスホン酸、カルボン酸、ボロン酸、硫酸、スルホン、スルホン酸、チオ硫酸、およびチオスルホン酸が挙げられる。
「グリコシルトランスフェラーゼ切断体（truncation）」または「切断型（truncated）グリコシルトランスフェラーゼ」または文法的変形、ならびに「ドメイン欠失グリコシルトランスフェラーゼ」または文法的変形とは、天然グリコシルトランスフェラーゼより少ないアミノ酸残基を有するが、特定の酵素活性を保持するグリコシルトランスフェラーゼを意味する。切断型グリコシルトランスフェラーゼには、例えば、切断型ＧｎＴ１酵素、切断型ＧａｌＴ１酵素、切断型ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ酵素、切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２酵素、切断型コア−１−ＧａｌＴ１酵素、約３２〜約９０個のアミノ酸残基（例えば、ヒト酵素を参照されたい）、切断型ＳＴ３Ｇａｌ１酵素、切断型ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−１酵素、および切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２酵素が挙げられる。酵素が活性を保持する限りは任意の数のアミノ酸残基を欠失させることができる。いくつかの実施形態では、ドメインまたはドメインの部分は欠失させることができ、例えば、シグナルアンカー（signal-anchor）ドメインを欠失させ、幹領域および触媒ドメインを含む切断体を残すことができ、シグナルアンカードメインおよび幹領域の部分を欠失させ、残りの幹領域および触媒ドメインを含む切断体を残すことができ、またはシグナルアンカードメインおよび幹領域を欠失させ、触媒ドメインを含む切断体を残すことができる。グリコシルトランスフェラーゼ切断はまた、タンパク質のＣ末端で起こる場合がある。例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２などのいくつかのＧａｌＮＡｃＴ酵素は、酵素活性を減少させることなく欠失させることができるＣ末端レクチンドメインを有する。
「リフォールディング（refolding）発現系」とは、この微生物において発現した場合、それらの適切／活性形態でジスルフィド含有タンパク質をリフォールディングする能力を有する、酸化的細胞内環境を有する細菌または他の微生物を意味する。代表例には、大腸菌（例えば、Ｏｒｉｇａｍｉ（商標）（修飾された大腸菌ｔｒｘＢ−／ｇｏｒ−）、Ｏｒｉｇａｍｉ２（商標）など）、シュードモナス（例えば、フルオレッセンス）に基づく系が挙げられる。Ｏｒｉｇａｍｉ（商標）技術についての例示的な参考文献については、例えば、Ｌｏｂｅｌら、（２００１年）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ１４（２）、２０５〜２１２；およびＬｏｂｅｌら、（２００２年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．２５（１）、１２４〜１３３を参照されたい。
ＩＩＩ．導入
本発明は、少なくとも１つの外因性Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を含むシークオンポリペプチドを提供する。各シークオンポリペプチドは、親ポリペプチドに相当する。一実施形態では、親ポリペプチドは、Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を含まない。他の実施形態では、親ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）は、Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を天然で含む。このような親ポリペプチドに相当するシークオンポリペプチドは、異なる位置でさらなるＯ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を含む。一実施形態では、各グリコシル化配列は、酵素（例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２などのグリコシルトランスフェラーゼ）の基質である。酵素は、グリコシル供与体分子から、ヒドロキシル基（例えば、セリンまたはスレオニン）またはスルフヒドリル基（例えば、システイン）によって置換されているアミノ酸側鎖の酸素原子または硫黄原子へのグリコシル部分の転移を触媒する。そのアミノ酸は、Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列の一部である。グリコシル化配列と結合することのできる例示的なグリコシル部分には、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース部分が挙げられる。
本発明はまた、修飾された糖部分が、直接的（例えば、グリコＰＥＧ化反応によって）または間接的に（例えば、介在性グリコシル残基を介して）、ポリペプチド内に位置するＯ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列に結合しているポリペプチド結合体を提供する。ポリペプチドは、野生型ポリペプチドを含めた任意のポリペプチド、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が公知である承認された生物学的製剤でよい。一実施形態では、親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、治療用抗体、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−７）または血液因子（例えば、第ＶＩ因子、第ＶＩＩＩ因子もしくはＦＩＸ）などの治療用ポリペプチドである。したがって、本発明は、それらのアミノ酸配列中に１つもしくは複数の外因性Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を含む治療用ポリペプチドバリアントを提供する。本発明は、このようなポリペプチドの糖結合体をさらに提供する。
このようなポリペプチド結合体を生成する方法も提供する。本発明のグリコシル化およびグリコＰＥＧ化方法は、Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を組み込んだ任意のポリペプチド上で行うことができる。この方法は、外因性グリコシル化配列を含むことによって相当する親ポリペプチドとは異なるシークオンポリペプチドのポリペプチド結合体を生じさせるのに特に有用である。
本発明の方法は、例えば、免疫系または細網内皮系（ＲＥＳ）による、クリアランス速度の減少または取込み速度の減少によって治療の半減期を増加させるポリペプチド結合体を提供する。さらに、本発明の方法は、ポリペプチド上の抗原決定基をマスクし、それによってポリペプチドに対する宿主免疫応答を減少または除去する手段を提供する。適切な修飾された糖を使用した標的化物質のポリペプチドへの選択的結合を使用して、特定の標的化物質に特異的な特定の組織または細胞膜受容体にポリペプチドを標的化することができる。タンパク質分解酵素によって開裂または認識されるタンパク質上の特定の部位を変化させることによって実現する結果である、タンパク質分解による劣化に対する抵抗の向上を示すタンパク質も提供する。一実施形態では、このような部位は、本発明のＯ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列によって置換、または部分的に置換されている。
さらに、本発明の方法は、親ポリペプチドの「生物活性プロファイル」を調節するために使用することができる。本発明の方法を使用した、水溶性ポリマー（例えば、ｍＰＥＧ）などの修飾基の親ポリペプチドへの共有結合は、このように得られたポリペプチド種のバイオアベイラビリティ、薬力学的特性、免疫原性、代謝安定性、体内分布および水溶性を変化させることができるだけでなく、望ましくない治療活性の減少または所望の治療活性の増加ももたらすことができることを本発明者らは認識してきた。例えば、前者は、造血剤エリスロポエチン（ＥＰＯ）について観察されてきた。例えば、特定の化学的にＰＥＧ化されたＥＰＯバリアントは、赤血球形成活性の減少を示した一方で、野生型ポリペプチドの組織保護作用は維持された。このような結果は、例えば、米国特許第６，５３１，１２１号；ＷＯ２００４／０９６１４８、ＷＯ２００６／０１４４６６、ＷＯ２００６／０１４３４９、ＷＯ２００５／０２５６０６およびＷＯ２００２／０５３５８０に記載されている。選択したポリペプチドの特異な生物活性の評価に有用な例示的な細胞系を、下記の表１に要約する。
Figure 2009544327
一実施形態では、本発明のポリペプチド結合体は、阻害剤などの、生物学的標的タンパク質（例えば、受容体）、天然リガンドまたは非天然リガンドへの結合親和性の減少または増加を示す。例えば、一群の特異的受容体への結合親和性を抑制することは、関連する細胞のシグナル伝達および下流の生物学的事象（例えば、免疫応答）を減少または排除する場合がある。したがって、親ポリペプチド（結合体が相当する）と同一、類似のまたは異なる治療プロファイルを有するポリペプチド結合体を作製するために、本発明の方法を使用することができる。本発明の方法は、特異的（例えば、向上した）生物学的機能を有するグリコＰＥＧ化治療剤を同定し、任意の治療用ポリペプチドまたは他の生物活性のあるポリペプチドの治療プロファイルを「微調整」するために使用することができる。グリコＰＥＧ化（ＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）（商標）は、Ｎｅｏｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの商標であり、共有特許および特許出願、例えば、（ＷＯ２００７／０５３７３１；ＷＯ２００７／０２２５１２；ＷＯ２００６／１２７８９６；ＷＯ２００５／０５５９４６；ＷＯ２００６／１２１５６９；およびＷＯ２００５／０７０１３８）に開示されている技術を意味する。
ＩＶ．組成物
ポリペプチド
第１の態様では、本発明は、シークオンポリペプチドを提供する。シークオンポリペプチドは、少なくとも１つの本発明の外因性Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を含むアミノ酸配列を有する。一実施形態では、シークオンポリペプチドのアミノ酸配列は、１種または複数の野生型、変異型または切断型グリコシルトランスフェラーゼの基質である外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む。好ましいグリコシルトランスフェラーゼは、完全長または切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（例えば、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）などのＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを含む。例示的なＧａｌＮＡｃ−Ｔ２酵素を表１３に示す（配列番号＊＊）。
例示的な実施形態では、本発明のシークオンポリペプチドは、相当する親ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）のアミノ酸配列を変更することによる組換え技術によって生じる。組換えポリペプチドの調製方法は当業者に公知である。例示的な方法を本明細書の下記に記載する。シークオンポリペプチドのアミノ酸配列は、天然および外因性（すなわち、非天然）Ｏ−結合型グリコシル化配列の組合せを含有してもよい。
親ポリペプチドは任意のポリペプチドでよい。例示的な親ポリペプチドには、野生型ポリペプチドおよびそのフラグメント、ならびにそれらの天然の対応物から（例えば、事前の変異または切断により）修飾されたポリペプチドが挙げられる。親ポリペプチドはまた融合タンパク質でもよい。他の実施形態では、親ポリペプチドは、現在医薬品として使用されているものなどの治療用ポリペプチド（すなわち、承認薬物）である。親ポリペプチドの非限定的選択肢は、２００６年６月８日に出願された米国特許出願第１０／５５２，８９６号（参照により本明細書中に組み込まれている）の図２８に示されている。
例示的な親ポリペプチドには、繊維芽細胞増殖因子（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２およびＦＧＦ−２３）などの増殖因子、血液凝固因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子および第ＸＩＩＩ因子）、ホルモン（ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）および濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）など）、ならびにサイトカイン（インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）およびインターフェロン（例えば、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ）など）が挙げられる。
他の例示的な親ポリペプチドには、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ（例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（商標））、酸−α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、α−Ｌ−イズロニダーゼ（例えば、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（商標））、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、β−グルコシダーゼ（例えば、米国特許出願第１０／４１１，０４４号に記載されている酵素を参照されたい）、およびα−ガラクトシダーゼＡ（例えば、米国特許第７，１２５，８４３号に記載されている酵素を参照されたい）などの酵素が挙げられる。
他の例示的な親ポリペプチドには、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン（例えば、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−５）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、α１−アンチトリプシン（ＡＴＴ、またはα−１プロテアーゼ阻害剤）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ヒルジン、レプチン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、グルカゴン様ペプチド（例えば、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）、プロキネチシン、ＣＤ４、α−ＣＤ２０、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質およびエキセンディン−４が挙げられる。
また本発明の範囲内であるのは、抗体である親ポリペプチドである。抗体という用語は、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃドメイン）、単鎖抗体、ラマ抗体、ナノボディーズなどを含むことを意味する。またこの用語に含まれるものは、Ｉｇキメラなどの抗体−融合タンパク質である。好ましい抗体には、ヒト化モノクローナル抗体またはそのフラグメントが含まれる。このような抗体のすべての公知のアイソタイプは、本発明の範囲内である。例示的な抗体には、内皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（例えば、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））などの抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−２３など）の増殖因子に対するもの、ならびにそれらの各々の受容体に対する抗体が挙げられる。他の例示的抗体には、抗−ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（例えば、米国特許出願第１０／４１１，０４３号を参照されたい）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体（例えば、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標））、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））、ＩＩｂ／ＩＩＩａなどの抗糖タンパク質モノクローナル抗体（例えば、Ｒｅｏｐｒｏ（商標））、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））、ＣＤ４およびα−ＣＤ３、抗ＰＳＧＬ−１およびＣＥＡモノクローナル抗体が挙げられる。上に挙げたポリペプチドにいずれかの任意の修飾（例えば、事前に変異した）型も、本発明の範囲内である。
例示的な一実施形態では、親ポリペプチドは、Ｇ−ＣＳＦではない。他の例示的な実施形態では、親ポリペプチドは、ｈＧＨではない。さらに他の例示的な実施形態では、親ポリペプチドは、ＩＮＦ−αではない。さらなる例示的な実施形態では、親ポリペプチドは、ＦＧＦではない。他の例示的な実施形態では、親ポリペプチドは、野生型Ｇ−ＣＳＦではない。他の例示的な実施形態では、親ポリペプチドは、野生型ｈＧＨではない。さらに他の例示的な実施形態では、親ポリペプチドは、野生型ＩＮＦ−αではない。さらなる例示的な実施形態では、親ポリペプチドは、野生型ＦＧＦポリペプチドではない。
グリコシル化配列
本発明のグリコシル化配列には、Ｏ−結合型グリコシル化配列およびＳ−結合型グリコシル化配列が含まれる。Ｏ−結合型グリコシル化配列の下記の考察は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意味しない。
一実施形態では、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列は、野生型ポリペプチド中に天然に存在する。このような野生型ポリペプチドのポリペプチド結合体は、本発明の範囲内である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、親ポリペプチド中で存在しない、または同じ位置に存在しない（外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列）。外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列の親ポリペプチドへの導入によって、本発明のシークオンポリペプチドが生じる。Ｏ−結合型グリコシル化配列を、変異によって親ポリペプチドに導入してもよい。他の例では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、シークオンポリペプチドの化学合成によって親ポリペプチドのアミノ酸配列に導入される。
本発明のＯ−結合型グリコシル化配列は、任意の短いアミノ酸配列でよい。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、約２個〜約２０個、好ましくは約２個〜約１０個、さらに好ましくは約３個〜約９個、最も好ましくは約３個〜約６個のアミノ酸残基を含む。本発明のＯ−結合型グリコシル化配列は、ヒドロキシル基を有する側鎖を有する少なくとも１個のアミノ酸（例えば、セリンまたはスレオニン）を含む。一実施形態では、シークオンポリペプチドを酵素によるグリコシル化反応に供する場合、このヒドロキシル基はグリコシル化部位となる。このグリコシル化反応の間、ヒドロキシル基の水素原子は、グリコシル部分によって置換される。したがって、グリコシル化反応の間にグリコシル部分によって修飾されたヒドロキシル基を有するアミノ酸は、「グリコシル化の部位」または「グリコシル化部位」と称される。
Ｏ−結合型グリコシル化配列の位置付け
一実施形態では、Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列は、ポリペプチド（例えば、本発明のシークオンポリペプチド）の一部である場合、グリコシルトランスフェラーゼの基質である。一例では、グリコシル化配列は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（例えば、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）の基質である。他の例では、グリコシル化配列は、レクチンドメイン欠失ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（例えば、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）またはレクチンドメイン切断型ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）などの修飾酵素の基質である。適切なグリコシル化反応の間に本発明の各Ｏ−結合型グリコシル化配列がグリコシル化する効率は、酵素のタイプおよび性質による場合があり、グリコシル化配列の状況、特にグリコシル化部位の周りのポリペプチドの三次元構造による場合もある。
一般に、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ポリペプチドのアミノ酸配列中の任意の位置に導入することができる。一例では、グリコシル化配列を、親ポリペプチドのＮ末端に導入する（すなわち、第１のアミノ酸の前または第１のアミノ酸の直後）（アミノ末端変異体）。他の例では、グリコシル化配列を、親ポリペプチドのアミノ末端の近くに導入する（例えば、Ｎ末端の１０個のアミノ酸残基の範囲内）。他の例では、グリコシル化配列は、親ポリペプチドの最後のアミノ酸の直後の親ポリペプチドのＣ末端に位置する（カルボキシ末端変異体）。さらに他の例では、グリコシル化配列を、親ポリペプチドのＣ末端の近くに導入する（例えば、Ｃ末端の１０個のアミノ酸残基の範囲内）。さらに他の例では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、親ポリペプチドのＮ末端とＣ末端との間の任意の位置に位置する（内部変異体）。修飾されたポリペプチドは、その生物活性が相当する親ポリペプチドの生物活性から変化をしていようとも、生物活性のあることが一般に好ましい。
シークオンポリペプチドのグリコシル化効率に影響を与える重要な要因は、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）および溶媒分子を含めた他の反応パートナーにとっての、グリコシル化部位（例えば、スレオニン側鎖）の到達性である。グリコシル化配列がポリペプチドの内部ドメイン中に位置している場合、グリコシル化は非効率となりやすいであろう。したがって、一実施形態では、グリコシル化配列は、ポリペプチドの溶媒にさらされている表面に相当するポリペプチドの領域に導入される。例示的なポリペプチドの高次構造は、グリコシル化配列のヒドロキシル基が内側に配向せず、ポリペプチドの他の領域と水素結合を形成する高次構造である。他の例示的な高次構造は、ヒドロキシル基が近接するタンパク質と水素結合を形成する可能性が低い高次構造である。
一例では、グリコシル化配列は、親タンパク質の事前に選択した特異的領域内に生じる。実際に、ポリペプチド骨格のグリコシル化は、ポリペプチドのループ領域内で通常起こり、典型的にはヘリックスまたはβ−シート構造内では起こらない。したがって、一実施形態では、本発明のシークオンポリペプチドは、Ｏ−結合型グリコシル化配列を親ポリペプチドのループドメインに相当する領域に導入することによって生じる。
例えば、タンパク質ＢＭＰ−７の結晶構造は、Ａｌａ７２とＡｌａ８６との間、ならびにＩｌｅ９６とＰｒｏ１０３との間の２つの伸長したループ領域を含有する。Ｏ−結合型グリコシル化配列がポリペプチド配列のそれらの領域内に存在しているＢＭＰ−７変異体が生じると、変異によってポリペプチドの元の三次構造がほとんどまたはまったく破壊されないポリペプチドがもたらされる場合がある（例えば、実施例１．９を参照されたい）。
しかし、Ｏ−結合型グリコシル化配列の、β−シートまたはα−ヘリックス高次構造内にあたるアミノ酸位置における導入も、新しく導入されたＯ−結合型グリコシル化配列で効率的にグリコシル化されるシークオンポリペプチドをもたらすことができることを本発明者らは見出した。β−シートまたはα−ヘリックスドメインへのＯ−結合型グリコシル化配列の導入は、ポリペプチドに構造的変化をもたらし、それがひいては効率的なグリコシル化を可能にする場合がある。
タンパク質の結晶構造を用いて、Ｏ−結合型グリコシル化配列の導入に最も適しており、有望な修飾部位の事前の選択を可能にする、野生型ポリペプチドまたは親ポリペプチドのそれらのドメインを同定することができる。
結晶構造が入手可能でない場合、ポリペプチドのアミノ酸配列を使用して、有望な修飾部位を事前に選択することができる（例えば、ループドメイン対α−ヘリックスドメインの予測）。しかし、ポリペプチドの三次元構造が公知であっても、構造動力および酵素／受容体の相互作用は、溶液中で変化する。したがって、適切な変異部位の同定ならびに適切なグリコシル化配列の選択は、いくつかのシークオンポリペプチド（例えば、本発明のシークオンポリペプチドのライブラリー）の生成、および適切なスクリーニングプロトコル、例えば本明細書に記載するものを使用した、それらのバリアントの望ましい特性についての試験を伴う場合がある。
一実施形態では、親ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。一例では、抗体または抗体フラグメントの定常領域（例えば、ＣＨ２ドメイン）は、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列で修飾される。一例では、天然Ｎ−結合型グリコシル化配列が置換される、または機能的に損なわれるように、Ｏ−結合型グリコシル化配列を導入する。他の実施形態では、ＣＨ２ドメインの選択した領域にわたるシークオンスキャニングを行い、各々が本発明の外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む抗体のライブラリーを生じさせる。さらに別の実施形態では、このように得られたポリペプチドバリアントを、酵素によるグリコシル化反応に供し、グリコシル部分を導入されたグリコシル化配列に付加する。十分にグリコシル化されているそれらのバリアントは、適切な受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａなどのＦｃ受容体）に結合する能力について分析することができる。一実施形態では、このようなグリコシル化抗体または抗体フラグメントは、親抗体またはその天然グリコシル化の型と比較した場合、Ｆｃ受容体に対して結合親和性の増加を示す。本発明のこの態様は、２００７年１月１８日に出願された米国特許仮出願第６０／８８１，１３０号（その開示内容はその全体が本明細書中に組み込まれている）にさらに記載されている。記載されている修飾は、抗体のエフェクター機能を変化させることができる。一実施形態では、グリコシル化抗体バリアントは、エフェクター機能の減少、例えば、ナチュラルキラー細胞の表面上またはキラーＴ細胞の表面上に見出される受容体への結合親和性の減少を示す。
他の実施形態では、Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列は、親ポリペプチド配列内には導入されず、むしろ、親ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかへのペプチドリンカーフラグメントの付加によって、親ポリペプチドの配列が伸長する（ペプチドリンカーフラグメントは、「ＰＴＰ」などの本発明のＯ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を含む）。ペプチドリンカーフラグメントは、任意の数のアミノ酸を有することができる。一実施形態では、ペプチドリンカーフラグメントには、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約５０個、または５０個を超えるアミノ酸残基が含まれる。ペプチドリンカーフラグメントは、アミノ基（例えば、リシン）またはスルフヒドリル基（例えば、システイン）などの反応性官能基を有する内部アミノ酸または末端アミノ酸残基を含んでもよい。このような反応性官能基を使用して、ポリペプチドを、本発明の他のポリペプチド、細胞毒、小分子薬または他の修飾基などの他の部分に連結させることができる。本発明のこの態様は、２００７年１月１８日に出願された米国特許仮出願第６０／８８１，１３０号（その開示内容はその全体が本明細書中に組み込まれている）にさらに記載されている。
代表的な実施形態では、本発明は、下式（式中、整数ｓは０または１である）を有するＣ末端配列を含むポリペプチドを提供する。
Figure 2009544327
上記の構造の二量体およびオリゴマーを利用して、ペプチドリンカーフラグメントが結合しているポリペプチドのより高度なオリゴマーを形成することができることを当業者であれば理解するであろう。例示的な実施形態では、ペプチドリンカーフラグメントには、リンカーの分枝点の役割を果たすリシン残基が含まれ、例えば、リシンのアミノ基はリンカーの「アーム」のための結合点の役割を果たす。例示的な実施形態では、リシンは、メチオニン部分を置換する。
例示的な実施形態では、ペプチドリンカーフラグメントの少なくとも１つのスレオニン残基は、グリコシル化することができる。他の実施形態では、ペプチドリンカーフラグメントのスレオニン部分の２つ、さらに好ましくは３つ、さらにより好ましくは４つがグリコシル化している。
他の例示的な実施形態では、リンカーフラグメントは、ジスルフィド結合の形成によって、同一のまたは異なる構造の他のリンカーフラグメントと共に二量体化される。したがって、本発明の代表的なポリペプチドは、式
Figure 2009544327
（式中、指数ｕおよびｓは、０および１から独立して選択される）を有する連結基を含む。
一実施形態では、本発明のペプチドリンカーフラグメントによって修飾される親ポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントである。この実施形態による一例では、親ポリペプチドはｓｃＦｖである。本明細書に記載する方法は、本発明のｓｃＦｖを調製するために使用することができ、ここでｓｃＦｖまたはリンカーは、グリコシル連結基を介してペプチドに結合しているグリコシル部分または修飾基によって修飾される。グリコシル化および糖結合の例示的な方法は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３および米国特許出願第１０／４１１，０１２号（各々は参照により本明細書中にその全体が組み込まれている）に記載されている。
塩基性アミノ酸残基の存在がグリコシル化の効率に影響する
Ｏ−結合型グリコシル化配列がグリコシル化部位の近くにプロリン（Ｐ）残基を含む場合、グリコシル化が最も効率的であることを本発明者らは見出した。さらに、特定のＯ−結合型グリコシル化配列（例えば、ＰＴＥＩ）では、およびある場合には、グリコシル化配列（例えば、ＰＴＥＩＰ）の直後の第２のプロリン残基は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２をグリコシルトランスフェラーゼとして使用する場合、グリコシル化を効率的にさらに促進する。
しかし、例示的な配列ＰＴｘＰおよびＰＳｘＰ（式中、ｘは任意のアミノ酸を表し、２個のプロリン残基は２個のアミノ酸のみで分離されている）は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２によって本質的にグリコシル化されないことを本発明者らはまた見出した。したがって、一実施形態では、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列は、ＰＳｘＰおよびＰＴｘＰを含まない。
非荷電アミノ酸による、Ｏ−結合型グリコシル化部位に近接した塩基性アミノ酸残基（例えば、リシン）の置換は、特定の酵素を使用する場合、グリコシル化速度を大幅に向上させることを本発明者らはさらに見出した。
例えば、酵素ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は、グリコシル化部位（例えば、Ｏ−結合型グリコシル化配列内のスレオニンまたはセリン残基）と任意のリシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）残基との間に少なくとも３個のアミノ酸残基が見出される本発明のＯ−結合型グリコシル化配列を認識することが好ましい。例えば、配列ＰＴｘｙｚＫ（式中、ｘ、ｙ、およびｚは、任意の非塩基性アミノ酸を表す）は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２によってグリコシル化される場合がある一方、配列ＰＴｘｙＫは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２によってグリコシル化される可能性は低い。したがって、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２をグリコシル化のために使用する好ましい実施形態では、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列は、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）残基に近接していない、親ポリペプチドのアミノ酸配列内の位置に導入される。他の実施形態では、１個もしくは複数の近接した塩基性アミノ酸を、非荷電アミノ酸（例えば、アラニン）などの非塩基性アミノ酸、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの酸性アミノ酸によって置換することによって、変異体は伸長する。例示的な配列を、実施例１．３．（配列番号＊＊）に示す。
２つのＯ−結合型グリコシル化配列が単一のプロリン残基（下記のスキーム１におけるＰ）を中心とする場合、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は、複数のＧａｌＮＡｃ残基をこのような構造に付加することができることを本発明者らはまた見出した。スレオニン残基またはセリン残基が存在する場合、酵素は配列に応じて４位または１位にＧａｌＮＡｃ部分を付加する。興味深いことに、適切なアミノ酸残基が存在する場合、第１のＧａｌＮＡｃ部分が４位に付加されると、第２のＧａｌＮＡｃ部分は３位および／または６位に付加されることができる。しかし、４位がグリコシル化されない場合、３位および６位もグリコシル化されない。これは、酵素のレクチンドメインの、最初に付加されたＧａｌＮＡｃ残基への結合と、引き続く３位および／または６位への触媒活性の方向付けとによって説明することができる。したがって、一実施形態では、多数のグリコシル化を減少させるために、欠失型または切断型レクチンドメインを有するグリコシルトランスフェラーゼを、グリコシル化反応において使用することができる。例示的な切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２酵素のアミノ酸配列を、本明細書において表１３で提供する（例えば、配列番号＊＊）。
Figure 2009544327
スキーム１において、アミノ酸位置１〜７は、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）または任意の他の非荷電アミノ酸を表す。
一実施形態では、大腸菌などの特定の生物における変異ポリペプチドの発現能（例えば、実施例１を比較されたい）、タンパク質分解安定性、構造的特性および／またはポリペプチドの他の特性を調節するため、特定のアミノ酸残基が、Ｏ−結合型グリコシル化配列中に含まれる。
一実施形態では、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列は、式（Ｉ）によるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、式（ＩＩ）によるアミノ配列を含む。さらに別の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、式（Ｉ）によるアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、式（ＩＩ）によるアミノ酸配列を有する。
（Ｘ）ｍＰＯ＊Ｕ（Ｂ）ｐ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｏ）ｔ（Ｐ）ｎ（Ｉ）（配列番号１）、および
（Ｘ）ｍ（Ｂ１）ｐＴＵＢ（Ｚ）ｒ（Ｐ）ｎ（Ｊ）ｓ（ＩＩ）（配列番号２）
式（Ｉ）および（ＩＩ）において、整数ｍ、ｎ、ｐ、ｒ、ｓおよびｔは、０および１から独立して選択される。Ｘ、Ｕ、Ｂ、Ｚ、ＪおよびＯは、任意のアミノ酸でよい。好ましい実施形態では、Ｕは、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から選択されるメンバーである。Ｘ、Ｂ１およびＢは、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである。Ｚ、ＪおよびＯは好ましくは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである。Ｐは、プロリンであり、Ｔはスレオニンであり、Ｓはセリンである。
一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊（Ｐ）ｎ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＥＩ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＡ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＡＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＡＹ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＴＹ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＩＮＴ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＩＮＡ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＶＧＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＧＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＶＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＶＡ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＶＬ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＶＬ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＶＧＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＧＡ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＧＡＭ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＴＥＴ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＥＴＱＩ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＶＬ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＴＱ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＬＹ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＬＹＶ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＬＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＤＡ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＥＮ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＧ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＤ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＡＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＬＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＭＶ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＡＴＱ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＡＶ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＶＧ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＥＯ＊Ｙ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＧ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＤＧ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＧＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＡＤ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＧＡ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＩＮＡ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＴＧＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＴＱＳ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＮＱＥ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＧＹＡ（Ｐ）ｎである。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＭＩＡＴ（Ｐ）ｎである。
一実施形態では、上記の配列において、整数ｍは０である。他の実施形態では、ｍは１である。一実施形態では、整数ｎは０である。他の実施形態では、ｎは１である。一実施形態では、Ｏ＊はセリン（Ｓ）である。他の実施形態では、Ｏ＊はスレオニン（Ｔ）である。Ｐはプロリンである。Ｘは任意のアミノ酸でよい。一実施形態では、Ｘはグルタミン酸（Ｅ）である。他の実施形態では、Ｘはグルタミン（Ｑ）である。他の実施形態では、Ｘはアスパラギン酸（Ｄ）である。他の実施形態では、Ｘはアスパラギン（Ｎ）である。他の実施形態では、Ｘはスレオニン（Ｔ）である。他の実施形態では、Ｘはセリン（Ｓ）である。さらに別の実施形態では、Ｘは、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）またはバリン（Ｖ）などの非荷電アミノ酸である。上記の配列において、各Ｔ（スレオニン）は、Ｓ（セリン）によって独立して置換されてもよく、各セリン（Ｓ）は、Ｔ（スレオニン）によって独立して置換されてもよい。
この実施形態による例示的なＯ−結合型グリコシル化配列には、（Ｘ）ｍＰＴＰ、（Ｘ）ｍＰＴＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡＹ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＴＹ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＧＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＧＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＧＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＥＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＴＱＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＴＱ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＭＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＴＱ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＶＧ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＥＴＹ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＤＧ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＴＧＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＧＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＱＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＮＱＥ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＧＹＡ（Ｐ）ｎおよび（Ｘ）ｍＭＩＡＴ（Ｐ）ｎ（式中、ｍ、ｎおよびＸは上記のように定義される）が挙げられる。一実施形態では、これらの配列において、各Ｔ（スレオニン）は、Ｓ（セリン）によって独立して置換されてもよく、各セリン（Ｓ）は、Ｔ（スレオニン）によって独立して置換されてもよい。
他の例示的な実施形態では、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＯ＊Ｐ、ＸＰＯ＊ＱＡ（Ｐ）ｎ、ＸＰＯ＊ＥＩ（Ｐ）ｎ、ＸＰＯ＊ＩＮＴ（Ｐ）ｎ、ＸＰＯ＊ＴＶＳ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＶＳＰ、ＸＰＯ＊ＱＧＡ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＧＡＰ、ＸＰＯ＊ＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＶＬ、ＸＰＯ＊ＶＬ（Ｐ）ｎ、ＸＰＯ＊ＴＶＬ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＶＬＰ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＬＹＶＰ、ＸＰＯ＊ＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＡＳ（Ｐ）ｎ、ＸＰＯ＊ＳＡＶ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＡＶＰおよびＸＴＥＴ（Ｐ）ｎから選択されるアミノ酸配列を有する。これらの配列において、各Ｔ（スレオニン）は、Ｓ（セリン）によって独立して置換されてもよく、各セリン（Ｓ）は、Ｔ（スレオニン）によって独立して置換されてもよい。整数ｍおよびｎ、ならびにＸは上記のように定義される。
さらに他の例示的な実施形態では、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列は、ＸＰＴＰ、ＸＰＴＱＡ（Ｐ）ｎ、ＸＰＴＥＩ（Ｐ）ｎ、ＸＰＴＩＮＴ（Ｐ）ｎ、ＸＰＴＴＶＳ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＳＰ、ＸＰＴＱＧＡ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡＰ、ＸＰＴＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、ＸＴＥＴＰ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ、ＸＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、ＸＰＴＴＶＬ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＬＰ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹＶＰ、ＸＰＴＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＳ（Ｐ）ｎ、ＸＰＴＳＡＶ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＶＰおよびＸＴＥＴ（Ｐ）ｎから選択されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、各Ｔ（スレオニン）は、Ｓ（セリン）によって独立して置換されてもよく、各セリン（Ｓ）は、Ｔ（スレオニン）によって独立して置換されてもよい。整数ｍおよびｎ、ならびにＸは上記のように定義される。
一実施形態では、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＥＩ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＥＩＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＡ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＡＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＩＮＴ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＩＮＴＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＴＶＳ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＴＶＬ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡＭ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡＭＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＴＥＴＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＶＬ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＶＬＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＬＳＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＤＡＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＥＮＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＤＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＡＳＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＴＶＳＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＳＡＶ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＴＬＹＶ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＴＬＹＶＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＳＳＧＰ（配列番号＊＊）である。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＳＤＧＰ（配列番号＊＊）である。
親ポリペプチドがグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）である例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱ、ＰＴＴ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＧ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡＹ、ＰＴＴＬＹ、ＰＴＧＳＬＰ、ＰＴＴＳＥＰ、ＰＴＡＶＩＰ、ＰＴＳＧＥＰ、ＰＴＴＬＹＰ、ＰＴＶＬＰ、ＴＥＴＰ、ＰＳＤＧＰおよびＰＴＥＶＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＧＬＰ−１である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱ、ＰＴＴ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＧ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡＹ、ＰＴＴＬＹ、ＰＴＧＳＬＰ、ＰＴＴＳＥＰ、ＰＴＡＶＩＰ、ＰＴＳＧＥＰ、ＰＴＴＬＹＰ、ＰＴＶＬＰ、ＴＥＴＰ、ＰＳＤＧＰおよびＰＴＥＶＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＧＬＰ−１である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型Ｇ−ＣＳＦポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＱ、ＰＴＴ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＧ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡＹ、ＰＴＴＬＹ、ＰＴＧＳＬＰ、ＰＴＴＳＥＰ、ＰＴＡＶＩＰ、ＰＴＳＧＥＰ、ＰＴＴＬＹＰ、ＰＴＶＬＰ、ＴＥＴＰ、ＰＳＤＧＰおよびＰＴＥＶＰから選択されないことが好ましい。
親ポリペプチドがＧ−ＣＳＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＡＰＴＰおよびＰＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型Ｇ−ＣＳＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＡＰＴＰおよびＰＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型Ｇ−ＣＳＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型Ｇ−ＣＳＦポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＡＰＴＰおよびＰＴＰから選択されないことが好ましい。
親ポリペプチドがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＶＬＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＬＹＶ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＱＡおよびＴＥＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ｈＧＨである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＬＹＶ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡおよびＴＥＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ｈＧＨであるさらに他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型ｈＧＨポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＬＹＶ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡおよびＴＥＴＰから選択されないことが好ましい。
親ポリペプチドがＩＮＦ−αである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、好ましくはＴＥＴＰでない。親ポリペプチドが野生型ＩＮＦ−αである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、好ましくはＴＥＴＰではない。親ポリペプチドが野生型ＩＮＦ−αであるさらに他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型ＩＮＦ−αポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、好ましくはＴＥＴＰではない。
親ポリペプチドがＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１）である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＰ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＳＡＶおよびＰＴＳＡＶＡＡから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＦＧＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＰ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＳＡＶおよびＰＴＳＡＶＡＡから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＦＧＦであるさらに他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型ＦＧＦポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＰ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＳＡＶおよびＰＴＳＡＶＡＡから選択されないことが好ましい。
一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、適切なグリコシル化反応に供された場合、高効率でグリコシル化される。例えば、適切なグリコシル化反応の反応収率は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％である。他の実施形態では、酵素がＧａｌＮＡｃ−Ｔ２である場合、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、グリコシル化配列当たり１個のみのアミノ酸残基においてＧａｌＮＡｃ残基によってグリコシル化される。
シークオンポリペプチド
本発明のＯ−結合型グリコシル化配列は、任意の親ポリペプチドに導入して、本発明のシークオンポリペプチドを生じさせることができる。本発明のシークオンポリペプチドは、当技術分野において公知の方法および本明細書の下記に記載する方法を使用して作製することができる（例えば、組換え技術または化学合成によって）。一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列が親配列に挿入され、全長および各々の数のアミノ酸が親ポリペプチドのアミノ酸配列に付加されるように、親配列が修飾される。他の実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、親ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸を置換する。他の実施形態では、既存のアミノ酸の１個または複数をグリコシル化配列の一部となるように使用して、バリエーションを親ポリペプチドに導入する。例えば、親ペプチド中のプロリン残基は保持し、プロリンの直後のアミノ酸は変異させて、本発明のＯ−結合型−グリコシル化配列を生じさせる。さらに別の実施形態では、アミノ酸挿入および既存のアミノ酸の置換の組合せを用いて、Ｏ−結合型グリコシル化配列を生じさせる。
特定の実施形態では、本発明の特定の親ポリペプチドを、本発明の特定のＯ−結合型グリコシル化配列と併用して使用する。例示的な親ポリペプチド／Ｏ−結合型グリコシル化配列の組合せを、表２に要約する（図６）。図６において各列は例示的な本発明の実施形態を表す。示されている組合せは、本発明の単一のシークオンポリペプチド、シークオンポリペプチドのライブラリー、シークオンポリペプチド結合体および方法を含めた本発明のすべての態様において使用することができる。示された親ポリペプチドについての図６に記載の実施形態は、本明細書において記載されている他の親ポリペプチドにも等しく適用することができることを当業者であれば理解するであろう。
シークオンポリペプチドのライブラリー
グリコシル化またはグリコＰＥＧ化反応に供された場合、効率的に（例えば、申し分のない収率で）グリコシル化またはグリコＰＥＧ化されているポリペプチドの同定のための１つの戦略は、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列を、例えばβ−シートドメインおよびα−ヘリックスドメインを含めた、親ポリペプチドのアミノ酸配列内の種々の異なる位置に挿入し、次いでヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２などのグリコシルトランスフェラーゼの効率的な基質として機能する能力について、いくつかのこのように得られたシークオンポリペプチドを試験することである。
したがって、他の態様では、本発明は、複数の異なるメンバーを含むシークオンポリペプチドのライブラリーを提供し、ライブラリーの各メンバーは、共通の親ポリペプチドに相当し、かつ少なくとも１つの独立して選択される本発明の外因性Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を含む。一実施形態では、ライブラリーの各メンバーは、各々が親ポリペプチド中の異なるアミノ酸位置で、同一のＯ−結合型グリコシル化配列を含む。他の実施形態では、ライブラリーの各メンバーは、異なるＯ−結合型グリコシル化配列を含むが、それは親ポリペプチド中の同一のアミノ酸位置である。本発明のライブラリーと関連して有用なＯ−結合型グリコシル化配列を本明細書に記載する。一実施形態では、本発明のライブラリーにおいて使用されるＯ−結合型グリコシル化配列は、式（Ｉ）（配列番号１）によるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、本発明のライブラリーにおいて使用されるＯ−結合型グリコシル化配列は、式（ＩＩ）（配列番号２）によるアミノ酸配列を有する。式（Ｉ）および式（ＩＩ）を、本明細書の以下に記載する。
好ましい実施形態では、本発明のライブラリーと関連して使用されるＯ−結合型グリコシル化配列は、（Ｘ）ｍＰＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡＹ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＴＹ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＧＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＧＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＧＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＥＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＴＱＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＴＱ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＭＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＴＱ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＶＧ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＥＴＹ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＤＧ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＴＧＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＧＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＱＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＮＱＥ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＧＹＡ（Ｐ）ｎおよび（Ｘ）ｍＭＩＡＴ（Ｐ）ｎ（式中、ｍおよびｎは、０および１から独立して選択される整数である）からのアミノ酸配列を有する。Ｘは任意のアミノ酸でよく、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から選択されるメンバーである。各Ｔ（スレオニン）は、Ｓ（セリン）によって独立して置換されてもよい。
ライブラリーの各メンバーが共通のＯ−結合型グリコシル化配列を有する一実施形態では、親ポリペプチドは、「ｍ」アミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。一例では、シークオンポリペプチドのライブラリーは、（ａ）親ポリペプチド中の第１のアミノ酸位置（ＡＡ）ｎ（式中、ｎは、１〜ｍから選択されるメンバーである）でＯ−結合型グリコシル化配列を有する第１のシークオンポリペプチドと、（ｂ）少なくとも１つのさらなるシークオンポリペプチド（各々のさらなるシークオンポリペプチドは、Ｏ−結合型グリコシル化配列が、さらなるアミノ酸位置に導入されており、各々のさらなるアミノ酸位置は、（ＡＡ）ｎ＋ｘおよび（ＡＡ）ｎ−ｘ（式中、ｘは、１〜（ｍ−ｎ）から選択されるメンバーである）から選択される）とを含む。例えば、第１のシークオンポリペプチドは、選択したＯ−結合型グリコシル化配列を第１のアミノ酸位置に導入することによって生じる。次いで引き続くシークオンポリペプチドはまた、同一のＯ−結合型グリコシル化配列を、親ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のさらに近くに位置するアミノ酸位置に導入することによって生じさせることができる。
このような状況において、ｎ−ｘが０（ＡＡ０）である場合、グリコシル化配列は、親ポリペプチドのＮ末端アミノ酸の直前に導入される。例示的シークオンポリペプチドは、部分配列：「ＰＴＰＭ１．．．」を有する場合がある。
第１のアミノ酸位置（ＡＡ）ｎは、親ポリペプチドのアミノ酸配列中の任意の場所でよい。一実施形態では、第１のアミノ酸位置（例えば、ループドメインの初め）が選択される。
各々のさらなるアミノ酸位置は、親ポリペプチド中の任意の場所でよい。一例では、シークオンポリペプチドのライブラリーは、（ＡＡ）ｎ＋ｐおよび（ＡＡ）ｎ−ｐ（式中、ｐは１〜約１０、好ましくは１〜約８、さらに好ましくは１〜約６、さらにより好ましくは１〜約４、最も好ましくは１〜約２から選択される）から選択されるアミノ酸位置で、Ｏ−結合型グリコシル化配列を有する第２のシークオンポリペプチドを含む。一実施形態では、シークオンポリペプチドのライブラリーは、アミノ酸位置（ＡＡ）ｎでＯ−結合型グリコシル化配列を有する第１のシークオンポリペプチドと、アミノ酸位置（ＡＡ）ｎ＋１または（ＡＡ）ｎ−１でＯ−結合型グリコシル化配列を有する第２のシークオンポリペプチドとを含む。
他の例では、さらなるアミノ酸位置の各々は、予め選択したアミノ酸位置に極めて隣接している。さらに他の例では、各々のさらなるアミノ酸位置は、予め選択したアミノ酸位置から正確に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸だけ離れている。
親ポリペプチドの「所与のアミノ酸位置での」Ｏ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列の導入とは、変異が所与のアミノ酸位置のすぐ隣から開始して（Ｃ末端に向かって）導入されることを意味する。完全挿入（任意の既存のアミノ酸を置換しない）によって、または任意の数の既存のアミノ酸を置換することによって、導入がなされる場合がある。
例示的な実施形態では、シークオンポリペプチドのライブラリーは、Ｏ−結合型グリコシル化配列を、親ポリペプチドの連続したアミノ酸位置（各々はその前に選択したアミノ酸位置にすぐ隣接して位置している）に導入し、それによって所望の最終的なアミノ酸位置に達するまでアミノ酸鎖にわたってグリコシル化配列を「スキャニング」することによって作製される。すぐ隣接したとは、親ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に向かって正確に１個先のアミノ酸位置を意味する。例えば、第１の変異体は、グリコシル化配列をアミノ酸位置ＡＡｎに導入することによって作製される。ライブラリーの第２のメンバーは、グリコシル化部位をアミノ酸位置ＡＡｎ＋１に、第３の変異体をＡＡｎ＋２に導入することなどによって生じる。この手順は、「シークオンスキャニング」と称されてきた。シークオンスキャニングの例を、本明細書において例えば実施例１．９に提供する。シークオンスキャニングは、第１のメンバーがグリコシル化配列をアミノ酸位置（ＡＡ）ｎで有し、第２のメンバーがアミノ酸位置（ＡＡ）ｎ＋２で有し、第３のメンバーが（ＡＡ）ｎ＋４で有するなどのように、ライブラリーを設計することを伴う場合があることを当業者であれば理解するであろう。同様に、ライブラリーのメンバーは、グリコシル化配列の他の戦略的配置によって特徴付けられる場合がある。例えば：
Ａ）メンバー１：（ＡＡ）ｎ；メンバー２：（ＡＡ）ｎ＋３；メンバー３：（ＡＡ）ｎ＋６；メンバー４：（ＡＡ）ｎ＋９など。
Ｂ）メンバー１：（ＡＡ）ｎ；メンバー２：（ＡＡ）ｎ＋４；メンバー３：（ＡＡ）ｎ＋８；メンバー４：（ＡＡ）ｎ＋１２など。
Ｃ）メンバー１：（ＡＡ）ｎ；メンバー２：（ＡＡ）ｎ＋５；メンバー３：（ＡＡ）ｎ＋１０；メンバー４：（ＡＡ）ｎ＋１５など。
一実施形態では、シークオンポリペプチドの第１のライブラリーは、本発明の選択したＯ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を、親ポリペプチドの特定の領域（例えば、特定のループ領域の始めから、そのループ領域の終わりまで）にわたってスキャニングすることによって生じさせる。次いで、第２のライブラリーは、同一のグリコシル化配列をポリペプチドの他の領域にわたってスキャニングし、第１の領域と第２の領域との間に位置するアミノ酸位置を「省く」ことによって作製する。抜かされたポリペプチド鎖の部分は、例えば、生物活性のために重要な結合ドメイン、またはグリコシル化に不適切であると知られているポリペプチド配列の他の領域に相当する場合がある。ポリペプチドのさらなる伸長のために、「シークオンスキャニング」を行うことによって、任意の数のさらなるライブラリーを生じさせることができる。例示的な実施形態では、全ポリペプチドにわたってＯ−結合型グリコシル化配列をスキャニングし、親ポリペプチド中の各アミノ酸位置に変異を導入することによってライブラリーを作製する。
一実施形態では、ライブラリーのメンバーは、ポリペプチドの混合物の一部である。例えば、細胞培養物を複数の発現ベクター（各ベクターは本発明の異なるシークオンポリペプチドのための核酸配列を含む）で感染させる。発現すると、培養ブロスは、複数の異なるシークオンポリペプチドを含有する場合があり、したがってシークオンポリペプチドのライブラリーを含む。この技術は、どのライブラリーのシークオンポリペプチドが所与の発現系において最も効率的に発現しているかを決定するのに有用である場合がある。
他の実施形態では、ライブラリーのメンバーは、互いに単離されて存在する。例えば、上記の混合物のシークオンポリペプチドの少なくとも２つを単離することができる。単離されたポリペプチドは、共にライブラリーを表す。代わりに、ライブラリーの各シークオンポリペプチドを別々に発現させ、シークオンポリペプチドを単離してもよい。他の例では、ライブラリーの各メンバーは、化学的手段で合成され、精製されてもよい。
例示的なシークオンポリペプチド
例示的な親ポリペプチドは、組換えヒトＢＭＰ−７である。例示的な親ポリペプチドとしてのＢＭＰ−７の選択は、例示する目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。任意の親ポリペプチド（例えば、本明細書において記載したもの）は下記の例示的な修飾に同様に適切であることを、当業者であれば理解するであろう。このように得られた任意のポリペプチドバリアントは、本発明の範囲内である。本発明の生物活性のあるＢＭＰ−７バリアントは、当業者に公知の任意の適切な機能アッセイによって測定すると、その生物活性が実質的または完全に損失していない少なくとも１つの修飾を一部または全体的に含む任意のＢＭＰ−７ポリペプチドを含む。下記の配列（１４０個のアミノ酸）は、完全長ＢＭＰ−７配列（配列Ｓ．１）の生物活性のある部分を表す。
Figure 2009544327
上記の親ポリペプチド配列に基づく例示的なＢＭＰ−７バリアントポリペプチドを、下記の表３〜１１に列挙する。好ましい実施形態では、シークオンポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼ基質の必要条件を考慮して作製される。例えば、完全長または切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（好ましくは、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）をグリコシルトランスフェラーゼとして使用する場合、グリコシル化部位（例えば、スレオニン）に近接して（例えば、３個のアミノ酸残基の範囲内に）見出されるリシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）などの任意の塩基性アミノ酸残基は、他のアミノ酸によって置換されてもよい。下記の表１〜１０において、このような塩基性アミノ酸を下線で印を付ける。置換アミノ酸は、好ましくはアラニンなどの非荷電アミノ酸である。
例示的な一実施形態では、親配列中の相当する数のアミノ酸を置換して、変異を野生型ＢＭＰ−７アミノ酸配列Ｓ．１（配列番号＊＊）に導入し、親ポリペプチドと同じ数のアミノ酸残基を含有するシークオンポリペプチドを生じさせる。例えば、通常ＢＭＰ−７中の３個のアミノ酸を、Ｏ−結合型グリコシル化配列「プロリン−スレオニン−プロリン」（ＰＴＰ）で直接置換し、次いで順次にＰＴＰ配列をポリペプチドのＣ末端に移動することによって、各々がＰＴＰを含む１３７種のＢＭＰ−７バリアントが実現する。この実施形態による例示的な配列を、下記の表３に列挙する。
表３：３個の既存のアミノ酸がＯ−結合型グリコシル化配列「ＰＴＰ」によって置換されている、１４０個のアミノ酸を含むＢＭＰ−７バリアントの例示的なライブラリー
非荷電アミノ酸によって置換されてもよいグリコシル化部位に近接した塩基性アミノ酸を、下線で印を付ける。
１位に導入、３個の既存のアミノ酸を置換
Figure 2009544327
２位に導入、３個の既存のアミノ酸を置換
Figure 2009544327
３位に導入、３個の既存のアミノ酸を置換
Figure 2009544327
さらなるＢＭＰ−７バリアントは、上記の様式でグリコシル化配列を全配列にわたって「スキャニング」することによって作製することができる。このように得られたすべてのバリアントＢＭＰ−７配列は、本発明の範囲内である。このように作製された最終のシークオンポリペプチドは、下記の配列を有する。
１３７位に導入、３個の既存のアミノ酸を置換
Figure 2009544327
他の例示的な実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を親配列に付加することによって、Ｏ−結合型グリコシル化配列を、野生型ＢＭＰ−７アミノ酸配列Ｓ．１（配列番号＊＊）に導入する。例えば、親配列中の２個、１個または０個のアミノ酸を置換して、Ｏ−結合型グリコシル化配列ＰＴＰを親ＢＭＰ−７配列に付加する。この例では、付加するアミノ酸残基の最大数は、挿入したグリコシル化配列の長さに相当する。例示的な実施形態では、親配列は、正確に１個のアミノ酸だけ伸長する。例えば、通常ＢＭＰ−７中に存在する２個のアミノ酸を置換して、Ｏ−結合型グリコシル化配列ＰＴＰを親ＢＭＰ−７ペプチドに付加する。この実施形態による例示的な配列を、下記の表４に列挙する。
表４：２個の既存のアミノ酸がＯ−結合型グリコシル化配列「ＰＴＰ」によって置換されている、１４１個のアミノ酸を含む変異ＢＭＰ−７ポリペプチドの例示的なライブラリー
非荷電アミノ酸によって置換されてもよいグリコシル化部位に近接した塩基性アミノ酸を、下線で印を付ける。
１位に導入、２個のアミノ酸（ＳＴ）を置換
Figure 2009544327
２位に導入、２個のアミノ酸（ＴＧ）を置換
Figure 2009544327
３位に導入、２個のアミノ酸（ＧＳ）を置換
Figure 2009544327
４位に導入、２個のアミノ酸（ＳＫ）を置換
Figure 2009544327
５位に導入、２個のアミノ酸（ＫＱ）を置換
Figure 2009544327
さらなるＢＭＰ−７バリアントは、下記の配列に達するまで上記の様式でグリコシル化配列を全配列にわたって「スキャニング」することによって作製することができる。
１３８位に導入、２個の既存のアミノ酸（ＣＨ）を置換
Figure 2009544327
このように得られたすべてのＢＭＰ−７バリアントは、本発明の範囲内である。
他の例は、通常親ポリペプチド中に存在する１個のアミノ酸を置換した、親ポリペプチド（例えば、ＢＭＰ−７）へのＯ−結合型グリコシル化配列（例えば、ＰＴＰ）の付加を伴う（２個のアミノ酸挿入）。この実施形態による例示的な配列を、下記の表５に列挙する。
表５：ＰＴＰを含むＢＭＰ−７変異体の例示的なライブラリー、１個の既存のアミノ酸の置換（１４２個のアミノ酸）
非荷電アミノ酸によって置換されてもよいグリコシル化部位に近接した塩基性アミノ酸を、下線で印を付ける。
１位に導入、１個のアミノ酸（Ｓ）を置換
Figure 2009544327
２位に導入、１個のアミノ酸（Ｔ）を置換
Figure 2009544327
３位に導入、１個のアミノ酸（Ｇ）を置換
Figure 2009544327
４位に導入、１個のアミノ酸（Ｓ）を置換
Figure 2009544327
５位に導入、１個のアミノ酸（Ｋ）を置換
Figure 2009544327
さらなるＢＭＰ−７バリアントは、下記の配列に到達するまで上記の様式でグリコシル化配列を全配列にわたって「スキャニング」することによって作製することができる。
１３９位に導入、１個の既存のアミノ酸（Ｈ）を置換
Figure 2009544327
このように得られたすべてのＢＭＰ−７バリアントは、本発明の範囲内である。
さらに他の例は、親ポリペプチド中に通常存在するアミノ酸を置換せず、グリコシル化配列の全長を付加する、親ポリペプチド（例えば、ＢＭＰ−７）内のＯ−結合型グリコシル化配列の作製を伴う（例えば、ＰＴＰについて３個のアミノ酸挿入）。この実施形態による例示的な配列を、下記の表６に列挙する。
表６：ＰＴＰを含むＢＭＰ−７バリアントの例示的なライブラリー、３個のアミノ酸の付加（１４３個のアミノ酸）
非荷電アミノ酸によって置換されてもよいグリコシル化部位に近接した塩基性アミノ酸を、下線で印を付ける。
１位に導入、３個のアミノ酸を付加
Figure 2009544327
２位に導入、３個のアミノ酸を付加
Figure 2009544327
３位に導入、３個のアミノ酸を付加
Figure 2009544327
４位に導入、３個のアミノ酸を付加
Figure 2009544327
さらなるＢＭＰ−７変異体は、最終的配列に到達するまで上記の様式でグリコシル化配列を全配列にわたって「スキャニング」することによって生じさせることができる。
１４０位に導入、３個のアミノ酸を付加
Figure 2009544327
このように得られたすべてのＢＭＰ−７バリアントは、本発明の範囲内である。
表１〜５の例に類似したＢＭＰ−７バリアントは、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列のいずれかを使用して生じさせることができる。すべての得られたＢＭＰ−７バリアントは、本発明の範囲内である。例えばＰＴＰの代わりに、配列ＰＴＩＮＴ（配列番号＊＊）またはＰＴＴＶＳ（配列番号＊＊）を使用することができる。例示的な実施形態では、通常ＢＭＰ−７中に存在する５個のアミノ酸を置換して、ＰＴＩＮＴを親ポリペプチド中に導入する。この実施形態による例示的な配列を、下記の表７に列挙する。
表７：ＰＴＩＮＴを含むＢＭＰ−７バリアントの例示的なライブラリー、５個のアミノ酸の置換（１４０個のアミノ酸）
Figure 2009544327
さらなるＢＭＰ−７変異体は、最終的配列に到達するまで上記の様式でグリコシル化配列を全配列にわたって「スキャニング」することによって生じさせることができる。
Figure 2009544327
このように得られたすべての変異ＢＭＰ−７配列は、本発明の範囲内である。
他の例では、１〜５個のアミノ酸を親ポリペプチドに付加して、Ｏ−結合型グリコシル化配列ＰＴＩＮＴを、親配列のＮ末端もしくはＣ末端、またはその近くで、親ポリペプチド（例えば、ＢＭＰ−７）に付加する。この実施形態による例示的な配列を、下記の表８に列挙する。
表８：ＰＴＩＮＴを含むＢＭＰ−７バリアントの例示的なライブラリー
（１４１〜１４５個のアミノ酸）
アミノ末端変異体
１位に導入、５個のアミノ酸を付加
Figure 2009544327
１位に導入、４個のアミノ酸を付加、１個のアミノ酸（Ｓ）を置換
Figure 2009544327
１位に導入、３個のアミノ酸を付加、２個のアミノ酸（ＳＴ）を置換
Figure 2009544327
１位に導入、２個のアミノ酸を付加、３個のアミノ酸（ＳＴＧ）を置換
Figure 2009544327
１位に導入、１個のアミノ酸を付加、４個のアミノ酸（ＳＴＧＳ）を置換
Figure 2009544327
カルボキシ末端変異体
１４０位に導入、５個のアミノ酸を付加
Figure 2009544327
１３９位に導入、４個のアミノ酸を付加、１個のアミノ酸（Ｈ）を置換
Figure 2009544327
１３８位に導入、３個のアミノ酸を付加、２個のアミノ酸（ＣＨ）を置換
Figure 2009544327
１３７位に導入、２個のアミノ酸の付加、３個のアミノ酸（ＧＣＨ）を置換
Figure 2009544327
１３６位に導入、１個のアミノ酸を付加、４個のアミノ酸（ＣＧＣＨ）を置換
Figure 2009544327
さらに他の例は、１〜５個のアミノ酸を親配列に付加し、親ポリペプチド（例えば、ＢＭＰ−７）へのＯ−結合型グリコシル化配列ＰＴＴＶＳ（配列番号＊＊）の挿入を伴う。この実施形態による例示的な配列を、下記の表９に列挙する。
表９：ＰＴＴＶＳを含むＢＭＰ−７バリアントの例示的なライブラリー
非荷電アミノ酸によって置換されてもよいグリコシル化部位に近接した塩基性アミノ酸を、下線で印を付ける。
１個のアミノ酸の挿入
Figure 2009544327
さらなるＢＭＰ−７変異体は、最終的配列に到達するまで上記の様式でグリコシル化配列を全配列にわたって「スキャニング」することによって生じさせることができる。
Figure 2009544327
このように得られたすべてのＢＭＰ−７バリアントは、本発明の範囲内である。
２個のアミノ酸の挿入
Figure 2009544327
さらなるＢＭＰ−７バリアントは、最終的配列に到達するまで上記の様式でグリコシル化配列を全配列にわたって「スキャニング」することによって生じさせることができる。
Figure 2009544327
このように得られたすべてのＢＭＰ−７バリアントは、本発明の範囲内である。
３個のアミノ酸の挿入
Figure 2009544327
さらなるＢＭＰ−７バリアントは、最終的配列に到達するまで上記の様式でグリコシル化配列を全配列にわたって「スキャニング」することによって生じさせることができる。
Figure 2009544327
このように得られたすべてのＢＭＰ−７バリアントは、本発明の範囲内である。
４個のアミノ酸の挿入
Figure 2009544327
さらなるＢＭＰ−７バリアントは、最終的配列に到達するまで上記の様式でグリコシル化配列を全配列にわたって「スキャニング」することによって生じさせることができる。
Figure 2009544327
このように得られたすべてのＢＭＰ−７バリアントは、本発明の範囲内である。
５個のアミノ酸の挿入
Figure 2009544327
さらなるＢＭＰ−７バリアントは、最終的配列に到達するまで上記の様式でグリコシル化配列を全配列にわたって「スキャニング」することによって生じさせることができる。
Figure 2009544327
このように得られたすべてのＢＭＰ−７バリアントは、本発明の範囲内である。
Ｏ−結合型グリコシル化配列を含有するシークオンポリペプチドの他の例は、２００５年８月２２日に出願された米国特許仮出願第６０／７１０，４０１号、および２００５年９月２３日に出願された同第６０／７２０，０３０号、ＷＯ２００４／９９２３１およびＷＯ２００４／１０３２７（すべての目的のために、参照により本明細書中に組み込まれている）に開示されている。
一例では、Ｏ−結合型グリコシル化配列（例えば、ＰＴＰ）は、既存のアミノ酸の置換および／または挿入によって、選択したポリペプチド領域内のすべての可能性のあるアミノ酸位置に配置される。この実施形態による例示的な配列を、下記の表１０および表１１に列挙する。
表１０：Ａ７３とＡ８２との間にＰＴＰを含むＢＭＰ−７バリアントの例示的なライブラリー
既存のアミノ酸の置換
Figure 2009544327
表１１：Ｉ９５とＰ１０３との間にＰＴＰを含むＢＭＰ−７バリアントの例示的なライブラリー
非荷電アミノ酸によって置換されてもよいグリコシル化部位に近接した塩基性アミノ酸を、下線で印を付ける。
既存のアミノ酸の置換
Figure 2009544327
既存のアミノ酸の間に挿入（１個のアミノ酸の付加）
Figure 2009544327
既存のアミノ酸の間に挿入（１個のアミノ酸の付加）
Figure 2009544327
上記の置換および挿入は、配列番号＊＊から＊＊などの本発明の任意のＯ−結合型グリコシル化配列を使用して作製することができる。このように得られたすべてのＢＭＰ−７バリアントは、本発明の範囲内である。
他の例示的な実施形態では、上記のものなどの１つまたは複数のＯ−グリコシル化配列を、血液凝固因子、例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子ポリペプチドに挿入する。ＢＭＰ−７との関連から明らかなように、Ｏ−グリコシル化配列は、ＢＭＰ−７で例示される様々なモチーフのいずれかで挿入することができる。例えば、Ｏ−グリコシル化配列は、野生型配列に固有の任意のアミノ酸を置換することなく野生型配列に挿入することができる。例示的な実施形態では、Ｏ−グリコシル化配列を、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、またはその近くに挿入する。他の例示的な実施形態では、野生型ポリペプチド配列に固有の１つまたは複数のアミノ酸残基は、Ｏ−グリコシル化部位の挿入の前に除去される。さらに他の例示的な実施形態では、野生型配列に固有の１つまたは複数のアミノ酸残基は、Ｏ−グリコシル化配列の成分であり（例えば、プロリン）、Ｏ−グリコシル化配列は、野生型アミノ酸を包含する。野生型アミノ酸は、Ｏ−グリコシル化配列のどちらかの末端またはＯ−グリコシル化配列の内部に存在することができる。
さらに、任意の既存のＮ−結合型グリコシル化配列は、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列によって置換することができる。さらに、Ｏ−結合型グリコシル化配列を、１つまたは複数のＮ−結合型グリコシル化配列に隣接して挿入することができる。好ましい実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列の存在によって、Ｎ−結合型グリコシル化配列のグリコシル化が妨げられる。
代表例では、親ポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子である。この実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、上記のモチーフのいずれかに従ってＡ、ＢまたはＣドメインに挿入することができる。複数のＯ−結合型グリコシル化部位は、また上記のモチーフのいずれかに従って、単一のドメインまたは複数のドメインに挿入することができる。例えば、Ｏ−グリコシル化部位は、Ａ、ＢおよびＣドメイン、ＡおよびＣドメイン、ＡおよびＢドメイン、またはＢおよびＣドメインの各々に挿入することができる。代わりに、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＡおよびＢドメイン、またはＢおよびＣドメインにフランキングすることができる。第ＶＩＩＩ因子のための例示的アミノ酸配列を、図４に提供する。
他の例示的な実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。この実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、第ＶＩＩＩ因子ヘテロ二量体の８０Ｋｄサブユニットと９０Ｋｄサブユニットとを結合するペプチドリンカー中に挿入することができる。代わりに、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ａドメインおよびリンカー、またはＣドメインおよびリンカーにフランキングすることができる。ＢＭＰ−７との関連で以上の説明から明らかなように、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、既存のアミノ酸の置換なしに挿入することができ、または親ポリペプチドの１つもしくは複数のアミノ酸を置換して挿入することができる。Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子についての例示的な配列を、図５に提供する。
他のＢドメイン欠失第ＶＩＩ因子ポリペプチドも、例えば、Ｓａｎｄｂｅｒｇら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３８（２）：４〜１２（２０００年）（その開示は参照により本明細書に組み込まれている）において開示されているＢドメイン欠失第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含めて、本発明における使用に適切である。
さらなる例示的な実施形態では、親ポリペプチドはｈＧＨであり、上記のモチーフのいずれかに従ってＯ−グリコシル化部位が付加される。
当業者であれば明らかなように、本発明の複数の変異Ｏ−結合型グリコシル化配列を含んだポリペプチドも、本発明の範囲内である。さらなる変異を導入して、例えば、生物活性、代謝安定性（例えば、タンパク質分解の減少）、薬物動態などのポリペプチド特性の調節を可能にしてもよい。
種々のバリアントが調製されると、例えばＧａｌＮＡｃ−Ｔ２などのＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを使用して、Ｏ−結合型グリコシル化またはグリコＰＥＧ化の基質として機能するそれらの能力を評価することができる。成功したグリコシル化および／またはグリコＰＥＧ化は、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたはＱ−ＴＯＦ）、（例えば、デンシトメトリーと組み合わせた）ゲル電気泳動、またはクロマトグラフ分析（例えば、ＨＰＬＣ）などの当技術分野において公知の方法を使用して検出し、定量化することができる。所与のポリペプチドまたはポリペプチド結合体の生物活性を分析するために、酵素阻害アッセイ、受容体結合アッセイおよび／または細胞をベースとするアッセイなどの生物学的アッセイを使用することができる。評価の戦略を本明細書において下記にさらに詳細に記載する（例えば、「リードポリペプチドの同定」、実施例２、実施例４および図１〜３を参照されたい）。各ポリペプチドの化学的および生物学的評価に有用な適切なアッセイ系を選択および／または開発することは、当業者の能力の範囲内であろう。
ポリペプチド結合体
他の態様では、本発明は、グリコシル化または非グリコシル化ポリペプチド（例えば、シークオンポリペプチド）と、選択した修飾基（例えば、ポリマー修飾基）との間の共有結合体を提供し、この修飾基は、グリコシル連結基（例えば、損傷のないグリコシル連結基）を介してポリペプチドに結合している。グリコシル連結基は、ポリペプチドおよび修飾基の両方の間に介在しかつ共有結合している。グリコシル連結基は、本発明のＯ−結合型グリコシル化配列のアミノ酸残基に直接結合しているか、または代わりに、１つまたは複数のさらなるグリコシル残基を介してＯ−結合型グリコシル化配列に結合している。本発明の結合体の調製方法は、本明細書、ならびに米国特許第５，８７６，９８０号、同第６，０３０，８１５号、同第５，７２８，５５４号、および同第５，９２２，５７７号、ならびにＷＯ９８／３１８２６、ＷＯ２００３／０３１４６４、ＷＯ２００５／０７０１３８、ＷＯ２００４／９９２３１、ＷＯ２００４／１０３２７、ＷＯ２００６／０７４２７９、ならびに米国特許出願公開第２００３１８０８３５号（これらのすべては、すべての目的のために参照により本明細書中に組み込まれている）に記載されている。
本発明の結合体は典型的には、一般構造
Figure 2009544327
（式中、記号ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｓは、正の０ではない整数を表し、ｔは、０または正の整数のいずれかである）に相当するであろう。「修飾基」には、治療剤、生理活性剤、検出可能な標識、ポリマー（例えば、水溶性ポリマー）などが挙げられる。リンカーは、多様な連結基（下記）のいずれかでよい。代わりに、リンカーは単結合でもよい。ポリペプチドの本質は、制限がない。
例示的なポリペプチド結合体は、（例えば、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用によって）Ｏ−結合型グリコシル化配列に結合したＯ−結合型ＧａｌＮＡｃ残基を含む。一実施形態では、ＧａｌＮＡｃ自体は、修飾基で誘導体化され、グリコシル連結基を表す。他の実施形態では、さらなるグリコシル残基が、ＧａｌＮＡｃ部分に結合している。例えば、各々がグリコシル連結基として作用することができるＧａｌまたはＳｉａ部分を、ＧａｌＮＡｃ基に付加する。代表的な実施形態では、Ｏ−結合型サッカリル残基は、ＧａｌＮＡｃ−Ｘ＊、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｘ＊、ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−Ｘ＊、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｘ＊、またはＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｘ＊（Ｘ＊は修飾基である）である。
ポリペプチドは、ＧａｌＮＡｃ部分によってＯ−結合型グリコシル化配列でＯ−グリコシル化されることが好ましい。コア−１−ＧａｌトランスフェラーゼおよびＳＴ６ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（例えば、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−１）などのＧａｌＮＡｃに付加させることが知られているグリコシルトランスフェラーゼを使用して、さらなる糖残基をＯ−結合型ＧａｌＮＡｃ部分に付加することができる。代わりに、複数の糖部分を、ポリペプチドに直接、またはすでに存在するＯ−結合型−ＧａｌＮＡｃ残基に付加することができる。この実施形態に有用なグリコシルトランスフェラーゼには、ＳＴ３Ｇａｌトランスフェラーゼ（例えば、ＳＴ３Ｇａｌ１およびＣＳＴ−ＩまたはＣＳＴ−ＩＩ）ならびにＳＴ８−シアリルトランスフェラーゼが挙げられる。これらの方法は共に、２つ以上の糖残基を含むグリコシル構造をもたらすことができる。
一実施形態では、本発明は、それらの置換パターンが高度に均質であるポリペプチド結合体を提供する。本発明の方法を使用して、本発明の結合体の集団にわたって修飾された糖部分の本質的にすべてが、構造的に同一のアミノ酸またはグリコシル残基に結合しているポリペプチド結合体を形成することが可能である。したがって、例示的な実施形態では、本発明は、グリコシル連結基を介してＯ−結合型グリコシル化配列内のアミノ酸残基（例えば、セリンまたはスレオニン）に共有結合をしている１つまたは複数の水溶性ポリマー部分を含むシークオンポリペプチド結合体を提供する。一例では、そこに結合しているグリコシル連結基を有する各アミノ酸残基は、同一の構造を有する。他の例示的な実施形態では、水溶性ポリマー部分の集団の本質的に各メンバーは、グリコシル連結基を介してポリペプチドのグリコシル残基に結合しており、グリコシル連結基が結合しているポリペプチドの各グリコシル残基は同一の構造を有する。
一態様によれば、本発明は、Ｏ−結合型グリコシル化配列（例えば、外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列）を有するシークオンポリペプチドを含む共有結合体を提供し、前記ポリペプチド結合体は、式（Ｖ）による部分を含む。
Figure 2009544327
式（Ｖ）において、ｗは、０および１から選択される整数である。ＡＡ−Ｏ−は、Ｏ−結合型グリコシル化配列内のアミノ酸から誘導される部分である。典型的には、ＡＡ−Ｏ−部分は、ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するアミノ酸（例えば、セリンまたはスレオニン）から誘導される。一実施形態では、整数ｑは０であり、アミノ酸はＮ末端またはＣ末端アミノ酸である。他の実施形態では、ｑは１であり、アミノ酸は内部アミノ酸である。Ｚ＊は、単糖およびオリゴ糖から選択されるグリコシル部分である。Ｚ＊は、グリコシル模倣部分でよい。
一実施形態では、式（Ｖ）におけるｗは１であり、本発明のポリペプチド結合体は、少なくとも１つの修飾基を含む。一例では、Ｘ＊は、修飾基（例えば、ポリマー修飾基）である。他の例では、Ｘ＊は、修飾基に共有結合しているグリコシル連結基である。例示的な実施形態では、式（Ｖ）におけるＸ＊は、シアリル部分（Ｓｉａ）を含む。他の実施形態では、Ｘ＊は、ガラクトシル部分（Ｇａｌ）を含む。さらに別の実施形態では、Ｘ＊は、ＳｉａおよびＧａｌ部分の組合せ（例えば、Ｇａｌ−Ｓｉａ部分）を含む。さらなる実施形態では、Ｘ＊は、ＧａｌＮＡｃ部分を含む。好ましい実施形態では、Ｘ＊は、Ｓｉａ部分である。
例示的な実施形態では、式（Ｖ）におけるＺ＊は、Ｇａｌ部分を含む。他の例示的な実施形態では、Ｚ＊は、ＧａｌＮＡｃ部分を含む。さらに別の実施形態では、Ｚ＊は、ＧｌｃＮＡｃ部分を含む。さらなる実施形態では、Ｚ＊は、Ｘｙｌ、ＧｌｃまたはＳｉａ部分を含む。Ｚ＊はまた、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ、ＸｙｌおよびＧｌｃ部分の組合せであってもよい。一実施形態では、Ｚ＊は、ＧａｌＮＡｃ−模倣部分を含む。一実施形態では、Ｚ＊は、ＧａｌＮＡｃ部分である。他の実施形態では、Ｚ＊は、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ部分である。さらに別の実施形態では、Ｚ＊は、ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ部分である。さらなる実施形態では、Ｚ＊は、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ部分である。
例示的な実施形態では、共有結合体は、下式（式中、Ｒ４０は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３非置換アルキルである）を有する部分を含む。
Figure 2009544327
好ましい実施形態では、上記の式におけるＲ４０はメチルである。
グリコシル連結基
修飾された糖の糖成分は、ポリペプチドと修飾基との間に介在している場合、「グリコシル連結基」となる。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、修飾基による修飾の後、適切なグリコシルトランスフェラーゼの基質である単糖またはオリゴ糖から形成される。他の例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、グリコシル模倣部分から形成される。本発明のポリペプチド結合体は、１価または多価であるグリコシル連結基を含むことができる（例えば、アンテナ構造）。したがって、本発明の結合体は、選択した部分が１価のグリコシル連結基を介してポリペプチドに結合している両方の種を含む。本発明にまた含まれるのは、複数の修飾基が多価の連結基を介してポリペプチドに結合している結合体である。
例示的な実施形態では、式（Ｖ）のＸ＊は、式（ＶＩ）による部分を含む。
Figure 2009544327
一実施形態では、式（ＶＩ）において、ＥはＯである。他の実施形態では、ＥはＳである。さらに他の実施形態では、ＥはＮＲ２７またはＣＨＲ２８（式中、Ｒ２７およびＲ２８は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールおよび置換または非置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーである）である。一実施形態では、Ｅ１はＯである。他の実施形態では、Ｅ１はＳである。
一実施形態では、式（ＶＩ）において、Ｒ２はＨである。他の実施形態では、Ｒ２は−Ｒ１である。さらに他の実施形態では、Ｒ２は−ＣＨ２Ｒ１である。さらなる実施形態では、Ｒ２は−Ｃ（Ｘ１）Ｒ１である。これらの実施形態において、Ｒ１は、ＯＲ９、ＳＲ９、ＮＲ１０Ｒ１１、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルである。式中、Ｒ９は、Ｈ、金属イオン、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびアシルから選択されるメンバーである。Ｒ１０およびＲ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびアシルから独立して選択されるメンバーである。一実施形態では、Ｘ１はＯである。他の実施形態では、Ｘ１は、置換または非置換アルケニル、ＳおよびＮＲ８（式中、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである。
一実施形態では、式（ＶＩ）において、ＹはＣＨ２である。他の実施形態では、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２である。さらに別の実施形態では、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２である。さらなる実施形態では、ＹはＣＨである。一実施形態では、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨである。他の実施形態では、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨである。さらに別の実施形態では、ＹはＣＨ（ＯＨ）である。さらなる実施形態では、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）である。一実施形態では、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）である。Ｙ２は、Ｈ、ＯＲ６、Ｒ６、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、
Figure 2009544327
（式中、Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、Ｌａ−Ｒ６ｂ、Ｃ（Ｏ）Ｒ６ｂ、Ｃ（Ｏ）−Ｌａ−Ｒ６ｂ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｌａ−Ｒ６ｂ、Ｃ（Ｏ）−Ｌａ−Ｒ６ｂ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーであり、Ｒ６ｂは、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよび修飾基から選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである。
式（ＶＩ）において、Ｒ３、Ｒ３’およびＲ４は、Ｈ、ＯＲ３”、ＳＲ３”、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、−Ｌａ−Ｒ６ｃ、−Ｃ（Ｏ）−Ｌａ−Ｒ６ｃ、−ＮＨ−Ｌａ−Ｒ６ｃ、＝Ｎ−Ｌａ−Ｒ６ｃおよび−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｌａ−Ｒ６ｃ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｌａ−Ｒ６ｃ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−Ｌａ−Ｒ６ｃ（式中、Ｒ３”は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ６ｃは、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、ＮＲ１３Ｒ１４および修飾基から選択されるメンバーであり、Ｒ１３およびＲ１４は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである）から独立して選択されるメンバーである。
上記の実施形態では、各Ｌａは、結合およびリンカー基から独立して選択されるメンバーである。
他の実施形態では、式（ＶＩ）のＸ＊は、式（ＶＩＩ）
Figure 2009544327
（式中、Ｒ１、Ｌａ、Ｒ３”およびＲ６ｃは上記のように定義される）による部分を含む。一実施形態では、式（ＶＩＩ）において、Ｒ１はＯＲ９である。この実施形態による一例では、Ｒ９はＨ、負の電荷または金属対イオンである。
さらに別の実施形態では、Ｒ６ｂ（式ＶＩ）およびＲ６ｃ（式ＶＩまたは式ＶＩＩ）の少なくとも１つは、
Figure 2009544327
（式中、ｓ、ｊおよびｋは、０〜２０から独立して選択される整数であり、各ｎは、０〜２５００から独立して選択される整数であり、ｍは、１〜５の整数である。Ｑは、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ１６およびＲ１７は、独立して選択されるポリマー部分であり、Ｘ２およびＸ４は、ポリマー部分Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合する独立して選択される連結フラグメントである。Ｘ５は非反応性基である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＡ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーであり、Ａ１２およびＡ１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである。
他の実施形態では、式（ＶＩ）中のＸ＊は、式（ＩＩＩ）
Figure 2009544327
（式中、Ｒ９は、Ｈ、単一の負の電荷または金属対イオンである）による部分を含む。（−Ｌａ−Ｒ６ｃは、本明細書においてＲｐとも称される）。
一実施形態では、式（ＶＩＩＩ）において、−Ｌａ−Ｒ６ｃは、下記である。
Figure 2009544327
他の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）において、−Ｌａ−Ｒ６ｃは、
Figure 2009544327
（式中、「＊」で示した立体中心は、ラセミ化合物または確定している場合がある）である。一実施形態では、立体中心は、（Ｓ）配置を有する。他の実施形態では、立体中心は、（Ｒ）配置を有する。
さらに別の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）において、−Ｌａ−Ｒ６ｃは、下記である。
Figure 2009544327
さらに別の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）において、−Ｌａ−Ｒ６ｃは、下記である。
Figure 2009544327
式（ＶＩＩＩ）の上記の実施形態の各々において、ｒは１〜２０から選択される整数であり、ｆおよびｅは、１〜５０００から独立して選択される整数である。
修飾基
本発明の修飾基は、任意の化学部分でよい。例示的な修飾基を下記で考察する。修飾基は、所与のポリペプチドの特性（例えば、生物学的または物理化学的性質）を変化させるそれらの能力のために選択することができる。修飾基の使用によって変化する場合がある例示的なポリペプチド特性には、それだけに限らないが、薬物動態、薬理作用、代謝安定性、体内分布、水溶性、親油性、組織への標的能および治療活性プロファイルが挙げられる。好ましい修飾基は、このような修飾基により修飾された本発明のポリペプチド結合体の薬理作用および薬物動態を向上させるものである。他の修飾基は、診断用途またはｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的アッセイ系において使用することができるポリペプチドの修飾に有用である場合がある。
例えば、治療用糖ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で高めることができる。ポリペプチドのＰＥＧによる化学修飾（ＰＥＧ化）は、それらの分子サイズを増加させ、典型的には表面到達性および官能基到達性（各々はポリペプチドに結合しているＰＥＧ部分の数および大きさに依存している）を低下させる。しばしば、この修飾によって、血漿内半減期の改善およびタンパク質分解安定性、ならびに免疫原性および肝臓取込みの減少がもたらされる（Ｃｈａｆｆｅｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６４３〜１６５１（１９９２年）；Ｐｙａｔａｋら、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：１１３〜１２７（１９８０年））。例えば、インターロイキン−２のＰＥＧ化は、その抗腫瘍能をｉｎ ｖｉｖｏで増加させることが報告されており（Ｋａｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：１４８７〜１４９１（１９８７年））、モノクローナル抗体Ａ７から誘導されるＦ（ａｂ’）２のＰＥＧ化は、腫瘍局在を改善してきた（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８：１３８７〜１３９４（１９９０年））。したがって、他の実施形態では、本発明の方法によってＰＥＧ部分で誘導体化されたポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、非誘導体化親ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比べて増加する。
ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加は、親ポリペプチドに対する割合の増加の範囲として最もよく表される。割合の増加の範囲の下限は、約４０％、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％または約２００％である。その範囲の上限は、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％、または約２５０％超である。
水溶性ポリマー修飾基
一実施形態では、修飾基は、直鎖状および分枝状から選択されるポリマー修飾基である。一例では、修飾基には、１つまたは複数のポリマー部分が含まれ、各ポリマー部分は独立して選択される。
多くの水溶性ポリマーは当業者に公知であり、本発明を実施するのに有用である。水溶性ポリマーという用語は、糖（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えば、ポリ（エチレングリコール）；ペプチド、タンパク質などの種を包含する。本発明は、結合体の残りが結合することができる点がポリマーに含まれなくてはならないというただ１つの制限を有する任意の水溶性ポリマーで行うことができる。
修飾基を１つまたは複数のポリペプチド部分に結合するための修飾基の反応性誘導体（例えば、反応性ＰＥＧ類似体）の使用は、本発明の範囲内である。本発明は、反応性類似体の本質によって限定されない。
好ましい実施形態では、修飾基は、ＰＥＧまたはＰＥＧ類似体である。ポリ（エチレングリコール）の多くの活性化誘導体が市販されており、文献に記載されている。本発明において有用な基質をそれを使用して調製する適切な活性化ＰＥＧ誘導体を選択し、必要に応じて合成することは、十分当業者の能力の範囲内である。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、７：１７５〜１８６（１９８４年）；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２：３５８２〜３５８６（１９７７年）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６５：１１４〜１２７（１９８７年）；Ｋｏｉｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１１：６５９〜６６７（１９８３年））、トレシレート（Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１０４：５６〜６９（１９８４年）；Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２：１１９〜１２８（１９９０年））；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導活性エステル（Ｂｕｃｋｍａｎｎら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８２：１３７９〜１３８４（１９８１年）；Ｊｏｐｐｉｃｈら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８０：１３８１〜１３８４（１９７９年）；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、７：１７５〜１８６（１９８４年）；Ｋａｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８４：１４８７〜１４９１（１９８７年）；Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５１：４３１０〜４３１５（１９９１年）；Ｂｏｃｃｕら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．、３８Ｃ：９４〜９９（１９８３年）、カルボネート（Ｚａｌｉｐｓｋｙら、ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年、３４７〜３７０頁；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５：１００〜１１４（１９９２年）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１１：１４１〜１５２（１９８５年））、ギ酸イミダゾリル（Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３１：２５〜３３（１９８３年）；Ｂｅｒｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、７１：１６４１〜１６４７（１９８８年））、４−ジチオピリジン（Ｗｏｇｈｉｒｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、４：３１４〜３１８（１９９３年））、イソシアネート（Ｂｙｕｎら、ＡＳＡＩＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、Ｍ６４９−Ｍ−６５３（１９９２年））、およびエポキシド（Ｎｏｉｓｈｉｋｉらに発行された米国特許第４，８０６，５９５号（１９８９年））を参照されたい。他の連結基には、アミノ基と活性化ＰＥＧとの間のウレタン連結が挙げられる。Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１：１４１〜１５２（１９８５年）を参照されたい。
ポリマーの活性化の方法は、ＷＯ９４／１７０３９、米国特許第５，３２４，８４４号、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／０４１９３、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、ＷＯ９０／１３５４０、米国特許第５，２８１，６９８号、およびＷＯ９３／１５１８９に見出すことができ、活性化ポリマーと、ペプチド、例えば凝固第ＶＩＩＩ因子（ＷＯ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９号）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１〜４５（１９８５年））との結合については。
本発明において有用な活性化ＰＥＧ分子およびそれらの試薬の作製方法は、当技術分野において公知であり、例えば、ＷＯ０４／０８３２５９に記載されている。
本明細書において記載する化合物を調製するのに有用な線状ＰＥＧを活性化するのに適切な活性化基または脱離基には、それだけに限らないが、下記の種が挙げられる。
Figure 2009544327
例示的な水溶性ポリマーは、ポリマー試料中のポリマー分子のかなりの割合がほぼ同じ分子量のものであり、このようなポリマーは、「ホモ分散性」である。
ポリ（エチレングリコール）結合体を参照することにより、本発明をさらに例示する。ＰＥＧの官能化および結合についてのいくつかの概説および研究書が利用可能である。例えば、Ｈａｒｒｉｓ、Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５〜３７３（１９８５年）；Ｓｃｏｕｔｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１３５：３０〜６５（１９８７年）；Ｗｏｎｇら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６〜８７４（１９９２年）；Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ９：２４９〜３０４（１９９２年）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０〜１６５（１９９５年）；およびＢｈａｄｒａら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５７：５〜２９（２００２年）を参照されたい。反応性ＰＥＧ分子の調製および反応性分子を使用した結合体の形成の経路は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，６７２，６６２号は、直鎖状または分枝状ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、およびポリ（アクリロモルホリン）から選択されたポリマー酸の活性エステルの水溶性で単離することができる結合体を開示している。
米国特許第６，３７６，６０４号は、有機溶媒中でポリマーの末端ヒドロキシルとジ（１−ベンゾトリアゾイル）カーボネートとを反応させることによる、水溶性および非ペプチド性ポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリルカーボネートエステルの調製方法を記載する。活性エステルは、ポリペプチドなどの生物活性のある作用物質との結合体の形成に使用される。
ＷＯ９９／４５９６４は、生物活性のある作用物質と、安定的な連結によってポリマー骨格に連結された少なくとも１つの末端（その少なくとも１つの末端は、分枝部分に連結している近接した反応性基を有する分枝部分を含む）を有するポリマー骨格を含む活性化水溶性ポリマーとを含む結合体を記載しており、生物活性のある作用物質は、近接した反応性基の少なくとも１つに連結している。他の分枝ポリ（エチレングリコール）は、ＷＯ９６／２１４６９に記載されている。米国特許第５，９３２，４６２号は、反応性官能基を含む分枝末端を含む分枝ＰＥＧ分子と共に形成される結合体を記載している。遊離の反応性基は、ポリペプチドなどの生物活性のある種と反応可能であり、ポリ（エチレングリコール）と生物活性のある種との間に結合体を形成する。米国特許第５，４４６，０９０号は、二官能性ＰＥＧリンカー、およびＰＥＧリンカー末端の各々にペプチドを有する結合体の形成におけるその使用を記載している。
分解可能なＰＥＧ連結を含む結合体は、ＷＯ９９／３４８３３、ＷＯ９９／１４２５９、ならびに米国特許第６，３４８，５５８号に記載されている。このような分解可能な連結は、本発明に適用できる。
上記のポリマー活性化の当技術分野において認められた方法は、本明細書において記載する分枝ポリマーの形成において、およびこれらの分枝ポリマーの他の種、例えば、糖、糖ヌクレオチドなどへの結合のためにも、本発明の状況において有用である。
例示的な水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である。本発明に使用されるポリ（エチレングリコール）は、特定の形態または分子量範囲に限定されない。未分枝ポリ（エチレングリコール）分子では、分子量は好ましくは、５００〜１００，０００である。２０００〜６０，０００の分子量が使用されるのが好ましく、約５，０００〜約４０，０００がさらに好ましい。
本発明において有用な例示的なポリ（エチレングリコール）分子には、それだけに限らないが、下式を有するものが挙げられる。
Figure 2009544327
式中、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、例えば、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｑ−、ＨＳ−（ＣＨ２）ｑ、または−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ）Ｚ１である。指数「ｅ」は１〜２５００の整数を表す。指数ｂ、ｄ、およびｑは、０から２０までの整数を独立して表す。記号ＺおよびＺ１は、ＯＨ、ＮＨ２、脱離基、例えば、イミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハロゲン化物、Ｓ−Ｒ９、活性エステルのアルコール部分；−（ＣＨ２）ｐＣ（Ｙ１）Ｖ、または−（ＣＨ２）ｐＵ（ＣＨ２）ｓＣ（Ｙ１）ｖを独立して表す。記号Ｙは、Ｈ（２）、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ１０を表す。記号Ｘ、Ｙ、Ｙ１、Ａ１、およびＵは、部分Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒ１１を独立して表す。記号Ｖは、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ１２、活性エステルのアルコール成分、活性アミドのアミン成分、糖ヌクレオチド、およびタンパク質を表す。指数ｐ、ｑ、ｓおよびｖは、０から２０までの整数から独立して選択されるメンバーである。記号Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキルおよび置換または非置換ヘテロアリールを独立して表す。
本発明の結合体を形成するのに有用なポリ（エチレングリコール）は、直鎖状または分枝状である。本発明における使用に適切な分枝ポリ（エチレングリコール）分子には、それだけに限らないが、下式によって説明されるものが挙げられる。
Figure 2009544327
式中、Ｒ８およびＲ８’は、上記のＲ８について定義した基から独立して選択されるメンバーである。Ａ１およびＡ２は、上記のＡ１について定義した基から独立して選択されるメンバーである。指数ｅ、ｆ、ｏ、およびｑは、上記の通りである。ＺおよびＹは、上記の通りである。Ｘ１およびＸ１’は、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨから独立して選択されるメンバーである。
他の例示的な実施形態では、分枝ＰＥＧは、システイン、セリンまたはジリシンのコアに基づいている。他の例示的な実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、下記の構造から選択される。
Figure 2009544327
さらなる実施形態では、ポリ（エチレングリコール）は、結合した複数のＰＥＧ部分を有する分枝ＰＥＧである。分枝ＰＥＧの例は、米国特許第５，９３２，４６２号；米国特許第５，３４２，９４０号；米国特許第５，６４３，５７５号；米国特許第５，９１９，４５５号；米国特許第６，１１３，９０６号；米国特許第５，１８３，６６０号；ＷＯ０２／０９７６６；Ｋｏｄｅｒａ Ｙ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５：２８３〜２８８（１９９４年）；およびＹａｍａｓａｋｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５２：２１２５〜２１２７、１９９８年に記載されている。好ましい実施形態では、分枝ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は、４０，０００ダルトン以下である。
代表的なポリマー修飾部分には、側鎖含有アミノ酸、例えば、セリン、システイン、リシン、および小さなペプチド、例えば、ｌｙｓ−ｌｙｓに基づいた構造が含まれる。例示的な構造には、下記が含まれる。
Figure 2009544327
ジリシン構造中の遊離アミンはまた、ＰＥＧ部分とのアミドまたはウレタン結合によってＰＥＧ化することができることを当業者であれば理解するであろう。
さらに別の実施形態では、ポリマー修飾部分は、トリリシンペプチドに基づいた分枝ＰＥＧ部分である。トリリシンは、モノ−、ジ−、トリ−、またはテトラ−ＰＥＧ化されてよい。この実施形態による例示的な種は、式
Figure 2009544327
（式中、指数ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、指数ｑ、ｑ’およびｑ”は、１〜２０から独立して選択される整数である）を有する。
当業者であれば明らかなように、本発明のおいて有用な分枝ポリマーには、上記の主題についての変型が含まれる。例えば、上記で示したジリシン−ＰＥＧ結合体は、３つのポリマーサブユニットを含むことができ、α−アミンに結合している第３サブユニットは、上記の構造において修飾されていないことが示されている。同様に、所望の様式でポリマー修飾部分により標識されている３つまたは４つのポリマーサブユニットで官能化されているトリリシンの使用は、本発明の範囲内である。
１つまたは複数のポリマー部分（例えば、ＰＥＧ）を含む分枝修飾基と共にポリペプチド結合体を形成するのに有用な例示的前駆体は、下記式を有する。
Figure 2009544327
一実施形態では、この式による分枝ポリマー種は、本質的に純粋な水溶性ポリマーである。Ｘ３’は、イオン性基（例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｈ２ＰＯ４、ＨＳＯ３、ＮＨ２、およびその塩など）または他の反応性官能基、例えば、下記などを含む部分である。Ｃは炭素である。Ｘ５は非反応性基（例えば、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨなど）である。一実施形態では、Ｘ５は、好ましくはポリマー部分ではない。Ｒ１６およびＲ１７は、非反応性基（例えば、Ｈ、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル）およびポリマーアーム（例えば、ＰＥＧ）から独立して選択される。Ｘ２およびＸ４は、好ましくは生理条件下で本質的に非反応性である連結フラグメントである。Ｘ２およびＸ４は、独立して選択される。例示的なリンカーには、芳香族もエステル部分も含まれない。代わりに、これらの連結は、生理的に適切な条件下で分解するように設計されている１つまたは複数の部分、例えば、エステル、ジスルフィドなどを含むことができる。Ｘ２およびＸ４は、ポリマーアームＲ１６およびＲ１７をＣに結合させる。一実施形態では、Ｘ３’が、リンカー、糖またはリンカー−糖カセット上の相補的反応性の反応性官能基と反応する場合、Ｘ３’は、連結フラグメントの成分に変換される。
Ｘ２およびＸ４を含めた例示的な連結フラグメントは、独立して選択され、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、およびＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ２Ｓ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｓ、（ＣＨ２）ｏＯ、（ＣＨ２）ｏＳまたは（ＣＨ２）ｏＹ’−ＰＥＧを含み、式中、Ｙ’は、Ｓ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、またはＯであり、ｏは１〜５０の整数である。例示的な実施形態では、連結フラグメントＸ２およびＸ４は、異なる連結フラグメントである。
例示的な実施形態では、上記の前駆体またはその活性化誘導体の１つは、Ｘ３’と、糖部分上の相補的反応性基、例えばアミンとの反応を介して、糖、活性化糖または糖ヌクレオチドと反応し、それによってそれらに結合する。代わりに、Ｘ３’は、下記のスキーム２によって、リンカーＬａの前駆体上の反応性官能基と反応する。
Figure 2009544327
例示的な実施形態では、修飾基は、天然または非天然アミノ酸、アミノ酸類似体またはアミノ酸模倣物、または１種もしくは複数のこのような種から形成される小さなペプチドから誘導される。例えば、本発明の化合物において見出される特定の分枝ポリマーは、下式を有する。
Figure 2009544327
この例では、連結フラグメントＣ（Ｏ）Ｌａは、分枝ポリマー修飾部分の前駆体上の反応性官能基、例えばＸ３’と、糖部分またはリンカー前駆体上の反応性官能基との反応によって形成される。例えば、Ｘ３’がカルボン酸である場合、それは活性化され、アミノ糖からぶら下がっているアミン基に直接結合し（例えば、Ｓｉａ、ＧａｌＮＨ２、ＧｌｃＮＨ２、ＭａｎＮＨ２など）、アミドを形成することができる。さらなる例示的反応性官能基および活性化前駆体を、本明細書において下記に記載する。記号は、上記のものと同じ本質を有する。
他の例示的な実施形態では、Ｌａは、構造
Figure 2009544327
（式中、ＸａおよびＸｂは、独立して選択される連結フラグメントであり、Ｌ１は、結合、置換または非置換アルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアルキルから選択される）を有する連結部分である。
ＸａおよびＸｂの例示的な種には、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、およびＯＣ（Ｏ）ＮＨが挙げられる。
他の例示的な実施形態では、Ｘ４は、Ｒ１７（α−アミン部分および／または側鎖ヘテロ原子がポリマー修飾部分で修飾された、アミノ酸、ジ−ペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）またはトリペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）である）へのペプチド結合である。
ポリマーが水溶性ポリマー、特にポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である種を参照することにより、上記の本発明の実施形態をさらに例示する。下記の節における焦点は、例示を明確にするためであり、ＰＥＧを例示的なポリマーとして使用する記載した様々なモチーフは、ＰＥＧ以外のポリマーが利用される種にも同様に適用できることを当業者であれば理解するであろう。
任意の分子量、例えば、１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａおよび８０ｋＤａのＰＥＧが、本発明において有用である。
他の例示的な実施形態では、ポリペプチド結合体には、下記の群から選択される部分が含まれる。
Figure 2009544327
上記の式の各々において、指数ｅおよびｆは、１〜２５００の整数から独立して選択される。さらなる例示的な実施形態では、ｅおよびｆは、約１ｋＤａ、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約５５ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約６５ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約７５ｋＤａおよび約８０ｋＤａのＰＥＧ部分を提供するために選択される。記号Ｑは、置換もしくは非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、例えば、メチル）、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはＨを表す。
他の分枝ポリマーは、ジリシン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ペプチド、例えば
Figure 2009544327
および、トリリシンペプチド（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）、例えば、
Figure 2009544327
に基づいた構造を有する。
上記の式の各々において、指数ｅ、ｆ、ｆ’およびｆ”は、１〜２５００から独立して選択される整数を表す。指数ｑ、ｑ’およびｑ”は、１〜２０から独立して選択される整数を表す。
他の例示的な実施形態では、本発明の結合体は、
Figure 2009544327
（式中、Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーであり、指数ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、指数ｑは、０〜２０から選択される整数である）から選択されるメンバーである式を含む。
他の例示的な実施形態では、本発明の結合体は、
Figure 2009544327
（式中、Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーであり、好ましくはＭｅであり、指数ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である）から選択されるメンバーである式を含む。
他の例示的な実施形態では、本発明の結合体は、下式による構造を含む。
Figure 2009544327
式中、指数ｍおよびｎは、０〜５０００から独立して選択される整数である。指数ｊおよびｋは、０〜２０から独立して選択される整数である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＡ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ１２およびＡ１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである。
上記の式による一実施形態では、分枝ポリマーは、下式
Figure 2009544327
による構造を有する。例示的な実施形態では、Ａ１およびＡ２は、−ＯＣＨ３およびＯＨから独立して選択されるメンバーである。
他の例示的な実施形態では、リンカーＬａは、アミノグリシン誘導体から選択されるメンバーである。この実施形態による例示的なポリマー修飾基は、下式による構造を有する。
Figure 2009544327
一例では、Ａ１およびＡ２は、ＯＣＨ３およびＯＨから独立して選択されるメンバーである。この例による例示的なポリマー修飾基は、下式を含む。
Figure 2009544327
例えば、アミノ酸リンカーまたはグリセロールをベースとするリンカーを含むものなど、修飾基が立体中心を含む上記の実施形態の各々において、立体中心はラセミ化合物であるかまたは確定している場合がある。このような立体中心が確定している一実施形態では、それは（Ｓ）配置を有する。他の実施形態では、立体中心は（Ｒ）配置を有する。
分枝ポリマーのｍ−ＰＥＧアームの１つまたは複数は、異なる末端、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキルなどを有するＰＥＧ部分によって置換することができることを当業者であれば理解するであろう。さらに、上記の構造は、アルキルリンカーを、α−炭素原子と側鎖の官能基との間に挿入する（または炭素原子を除去する）ことによって容易に修飾される。したがって、「ホモ」誘導体、ならびにより高級な相同体およびより低級な相同体は、本発明において有用な分枝ＰＥＧのコアの範囲内である。
本明細書において記載する分枝ＰＥＧ種は、下記のスキーム３
Figure 2009544327
（式中、ＸａはＯまたはＳであり、ｒは１〜５の整数であり、指数ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数である）に記載するような方法によって容易に調製される。
したがってスキーム３によると、天然または非天然アミノ酸は、活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体、この場合はトシレートと接触し、側鎖ヘテロ原子Ｘａをアルキル化することによって１が形成される。単官能化ｍ−ＰＥＧアミノ酸は、反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体と共にＮ−アシル化条件にさらされ、それによって分枝ｍ−ＰＥＧ２が構築される。当業者であれば理解するであろうが、トシレート脱離基は、任意の適切な脱離基、例えば、ハロゲン、メシレート、トリフレートなどによって置換することができる。同様に、アミンをアシル化するために利用される反応性カーボネートは、活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどによって置換することができ、または酸は、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどの脱水剤を使用してｉｎ ｓｉｔｕで活性化することができる。
例示的な実施形態では、修飾基はＰＥＧ部分であるが、任意の修飾基、例えば、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療的部分などを、適切な連結を介してグリコシル部分に組み込むことができる。修飾された糖は、酵素的手段、化学的手段またはこれらの組合せによって形成され、したがって修飾された糖が生成する。例示的な実施形態では、糖は、任意の位置で（修飾部分の結合を可能にし、修飾された糖をＧ−ＣＳＦポリペプチドにカップリングすることができる酵素の基質として、糖が機能することもさらに可能にする）活性アミンによって置換される。例示的な実施形態では、ガラクトサミンが修飾された糖である場合、アミン部分は、６位で炭素原子に結合する。
水不溶性ポリマー
他の実施形態では、上記と類似して、修飾された糖は、水溶性ポリマーよりはむしろ水不溶性ポリマーを含む。本発明の結合体はまた、１種または複数の水不溶性ポリマーを含むことができる。本発明のこの実施形態は、制御された様式で治療用ポリペプチドを送達するビヒクルとしての結合体の使用によって例示される。ポリマー薬物送達システムは、当技術分野において公知である。例えば、Ｄｕｎｎら（編）、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳシンポジウムシリーズ第４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１年を参照されたい。実質的に任意の公知の薬物送達システムを、本発明の結合体に適用できることは当業者であれば理解するであろう。
代表的な水不溶性ポリマーには、それだけに限らないが、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニックおよびポリビニルフェノールおよびそれらのコポリマーが挙げられる。
本発明の結合体において有用な合成的に修飾された天然ポリマーには、それだけに限らないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースが挙げられる。広範な部類の合成的に修飾された天然ポリマーの特に好ましいメンバーには、それだけに限らないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、三酢酸セルロース、硫酸セルロースナトリウム塩、ならびにアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルおよびアルギン酸のポリマーが挙げられる。
本明細書において議論されているこれらおよび他のポリマーは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ、ＰＡ．）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ．）、Ｆｌｕｋａ（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、ＮＹ）、およびＢｉｏＲａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）などの商業的供給源から容易に入手することができ、またはそうでなければ標準的な技術を使用してこれらの供給業者から得たモノマーから合成することができる。
本発明の結合体において有用な代表的な生分解性ポリマーには、それだけに限らないが、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびそのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ブレンド、およびそのコポリマーが挙げられる。特に有用なものは、コラーゲン、プルロニックなどを含むものなどのゲルを形成する組成物である。
本発明において有用なポリマーには、それらの構造の少なくとも一部内に生体再吸収性分子を有する水不溶性物質を含む「ハイブリッド」ポリマーが含まれる。このようなポリマーの一例は、ポリマー鎖毎に生体再吸収性領域、親水性領域および複数の架橋性官能基を有する水不溶性コポリマーを含むものである。
本発明の目的のために、「水不溶性物質」には、水中または水を含有する環境中で実質的に不溶性である物質が含まれる。したがって、コポリマーの特定の領域またはセグメントは親水性またはそれどころか水溶性の場合があるが、ポリマー分子は概して、実質的に水に溶解しない。
本発明の目的のために、「生体再吸収性分子」という用語は、体の通常の排出経路によって代謝または分解および再吸収および／または除去されることができる領域を含む。このような代謝物または分解産物は、体に対して実質的に無毒性であることが好ましい。
生体再吸収性領域は、コポリマー組成物が全体として水溶性とならない限りは、疎水性または親水性のいずれかでよい。したがって、生体再吸収性領域は、ポリマーが全体として水不溶性を保持するという優先度に基づいて選択される。したがって、相対的特性、すなわち、含有されている官能基の種類、ならびに生体再吸収性領域および親水性領域の相対比率は、有用な生体再吸収性組成物が水不溶性を保持するのを確実にするように選択される。
例示的な吸収性ポリマーには、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の合成的に生成された吸収性ブロックコポリマーが挙げられる（Ｃｏｈｎら、米国特許第４，８２６，９４５号を参照されたい）。これらのコポリマーは架橋しておらず水溶性であるので、体は分解したブロックコポリマー組成物を排出することができる。Ｙｏｕｎｅｓら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１〜１３１６（１９８７年）；およびＣｏｈｎら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３〜１００９（１９８８年）を参照されたい。
現在、好ましい生体再吸収性ポリマーには、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（チオエステル）、多糖およびこれらの混合物から選択される１種または複数の成分が含まれる。さらに好ましくは、生体再吸収性ポリマーには、ポリ（ヒドロキシ）酸成分が含まれる。ポリ（ヒドロキシ）酸の中では、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ならびにこれらのコポリマーおよび混合物が好ましい。
ｉｎ ｖｉｖｏで吸収される（「生体再吸収される」）フラグメントを形成することに加えて、本発明の方法において使用される好ましいポリマーコーティングはまた、***可能および／または代謝可能なフラグメントを形成することができる。
より高次のコポリマーも、本発明において使用することができる。例えば、１９８４年３月２０日に発行されたＣａｓｅｙら、米国特許第４，４３８，２５３号は、ポリ（グリコール酸）およびヒドロキシル末端ポリ（アルキレングリコール）のエステル交換から生成されたトリブロックコポリマーを開示している。このような組成物は、吸収性モノフィラメント縫合糸としての使用が開示されている。このような組成物の可撓性は、テトラ−ｐ−トリルオルトカーボネートなどの芳香族オルトカーボネートのコポリマー構造への組込みによって制御される。
乳酸および／またはグリコール酸をベースとする他のポリマーも、利用することができる。例えば、１９９３年４月１３日に発行されたＳｐｉｎｕ、米国特許第５，２０２，４１３号は、オリゴマージオールまたはジアミン残基へのラクチドおよび／またはグリコリドの開環重合、それに続くジイソシアネート、ジアシルクロリドまたはジクロロシランなどの２官能性化合物による鎖拡張によって生成されるポリラクチドおよび／またはポリグリコリドの順次に並んだブロックを有する生分解性マルチブロックコポリマーを開示している。
本発明において有用なコーティングの生体再吸収性領域は、加水分解および／または酵素によって開裂可能であるように設計することができる。本発明の目的のために、「加水分解によって開裂可能な」とは、コポリマー、特に生体再吸収性領域が、水または水を含有する環境中で加水分解を受けやすいことを意味する。同様に、「酵素によって開裂可能な」とは、本明細書で使用する場合、コポリマー、特に生体再吸収性領域が、内因性または外因性酵素によって開裂されやすいことを意味する。
体内に置かれた場合、親水性領域は、***可能および／または代謝可能なフラグメントへと処理することができる。したがって、親水性領域は、例えば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリジン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、多糖、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ならびにこれらのコポリマーおよび混合物を含むことができる。さらに、親水性領域はまた、例えば、ポリ（アルキレン）オキシドである場合がある。このようなポリ（アルキレン）オキシドには、例えば、ポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシド、ならびにそれらの混合物およびコポリマーを含むことができる。
ヒドロゲルの成分であるポリマーも本発明において有用である。ヒドロゲルは、比較的大量の水を吸収することができるポリマー材料である。ヒドロゲルを形成する化合物の例には、それだけに限らないが、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラギーナンおよび他の多糖、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにその誘導体などが挙げられる。安定した生分解性および生体再吸収性のヒドロゲルを生成することができる。さらに、ヒドロゲル組成物には、これらの特性の１つまたは複数を示すサブユニットを含むことができる。
その完全性を架橋によって制御できる生体適合性のヒドロゲル組成物は公知であり、本発明の方法における使用に現在のところ好ましい。例えば、１９９５年４月２５日に発行されたＨｕｂｂｅｌｌら、米国特許第５，４１０，０１６号、および１９９６年６月２５日に発行された同第５，５２９，９１４号は、加水分解によって不安定な２つの延長部に挟まれた水溶性の中央のブロックセグメントを有する架橋ブロックコポリマーである水溶性の系を開示している。このようなコポリマーは、光重合可能なアクリレート官能基でさらにエンドキャップされる。架橋された場合、これらの系はヒドロゲルとなる。このようなコポリマーの水溶性中央ブロックは、ポリ（エチレングリコール）を含むことができ、一方加水分解によって不安定な延長部は、ポリグリコール酸またはポリ乳酸などのポリ（α−ヒドロキシ酸）でよい。Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２６：５８１〜５８７（１９９３年）を参照されたい。
他の実施形態では、ゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲルおよびこれらの組合せなどの成分を含んだ熱可逆性ゲルが、現在好ましい。
さらに他の例示的な実施形態では、本発明の結合体には、リポソームの成分が含まれる。リポソームは、例えば、１９８５年６月１１日に発行されたＥｐｐｓｔｅｉｎら、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような当業者には公知の方法によって調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、無機溶媒に適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラキドニルホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）を溶解し、次いで溶媒を蒸発させ、容器の表面上に乾燥した脂質の薄膜を残すことによって調製することができる。次いで、活性化合物または薬学的に許容できるその塩の水溶液を容器に導入する。次いで、容器を手でかき混ぜて、容器の側面から脂質物質をはがし、脂質凝集物を分散させ、それによってリポソーム懸濁液が形成される。
上記の微粒子、および微粒子の調製方法を例示として提示するが、本発明で有用な微粒子の範囲を規定することを意図しない。異なる方法によって作製された数々の微粒子は本発明において有用であることは、当業者であれば明らかであろう。
直鎖および分枝状の両方の水溶性ポリマーとの関連で上述した構造的フォーマットは、水不溶性ポリマーに関しても一般に適用できる。したがって、例えば、システイン、セリン、ジリシン、およびトリリシン分枝コアは、２つの水不溶性ポリマー部分で官能化することができる。これらの種を生成するために使用される方法は一般に、水溶性ポリマーを生成するために使用されるものと非常に類似する。
他の修飾基
本発明はまた、ポリペプチドが、グリコシル連結基を介して治療的部分、診断的部分、標的化部分、毒素部分などに結合している、上記のものと類似した結合体を提供する。上記の部分の各々は、小分子、天然ポリマー（例えば、ポリペプチド）または合成ポリマーの場合がある。
またさらなる実施形態では、本発明は、結合体の成分としての標的化物質の存在によって、選択的に特定の組織に局在する結合体を提供する。例示的な実施形態では、標的化物質はタンパク質である。例示的なタンパク質には、トランスフェリン（脳、血液プール）、ＨＳ−糖タンパク質（骨、脳、血液プール）、抗体（脳、抗原特異的抗体を有する組織、血液プール）、凝固因子Ｖ−ＸＩＩ（損傷を受けた組織、血餅、癌、血液プール）、血清タンパク質、例えば、α−酸糖タンパク質、フェチュイン、α−胎児性タンパク（脳、血液プール）、β２−糖タンパク質（肝臓、アテローム性動脈硬化プラーク、脳、血液プール）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＥＰＯ（免疫刺激、癌、血液プール、赤血球の過剰産生、神経保護）、アルブミン（半減期の増加）、ＩＬ−２およびＩＦＮ−αが挙げられる。
例示的な標的化された結合体において、インターフェロンα２β（ＩＦＮ−α２β）は、ＰＥＧ部分の各末端にグリコシル連結基を含む二官能性リンカーを介してトランスフェリンに結合している（スキーム１）。例えば、ＰＥＧリンカーの１つの末端は、トランスフェリンに結合している損傷のないシアル酸リンカーによって官能化されており、他方はＩＦＮ−α２βに結合している損傷のないＣ−結合型Ｍａｎリンカーによって官能化されている。
生体分子
他の実施形態では、修飾された糖は生体分子を有する。またさらなる実施形態では、生体分子は、機能タンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸（例えば、単一のヌクレオチドまたはヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ならびに一本鎖および二本鎖以上の核酸）、レクチン、受容体またはこれらの組合せである。
好ましい生体分子は、本質的に非蛍光性であるか、またはアッセイにおいて蛍光マーカーとして使用するには不適切な最低限の蛍光を放出するものである。さらに、糖ではない生体分子を使用することが一般に好ましい。この優先度の例外は、他の実体（例えば、ＰＥＧ、生体分子、治療的部分、診断的部分など）の共有結合によって修飾されたそうでなければ天然の糖の使用である。例示的な実施形態では、生体分子である糖部分は、リンカーアームに結合しており、糖−リンカーアームカセットは、本発明の方法によって続いてポリペプチドに結合される。
本発明を実施するのに有用な生体分子は、任意の源から誘導することができる。生体分子は天然源から単離することができ、または合成法によって生成することができる。ポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは変異ポリペプチドの場合がある。化学的突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発または当業者に公知の変異を誘発する他の手段によって、変異がもたらされる場合がある。本発明を実施するのに有用なポリペプチドには、例えば、酵素、抗原、抗体および受容体が挙げられる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでよく、損傷のないかまたはフラグメントでよい。ポリペプチドは、方向付けられた進化のプログラムの産物でよい。
天然および合成ポリペプチドの両方ならびに核酸は、本発明との関連で有用であり、これらの分子は、任意の利用可能な反応性基によって糖残基成分または架橋剤に結合することができる。例えば、ポリペプチドは、反応性アミン、カルボキシル、スルフヒドリル、またはヒドロキシル基を介して結合することができる。反応性基は、ポリペプチド末端またはポリペプチド鎖の内部の部位に存在することができる。核酸は、塩基（例えば、環外アミン）または糖部分上の利用可能なヒドロキシル基（例えば、３’−または５’−ヒドロキシル）上の反応性基を介して結合することができる。ペプチドおよび核酸鎖は、１つまたは複数の部位でさらに誘導体化され、鎖への適切な反応性基の結合を可能とすることができる。Ｃｈｒｉｓｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３０３１〜３０３９（１９９６年）を参照されたい。
さらなる実施形態では、本発明の方法によって修飾されたポリペプチドを特異的組織に方向付け、それによってその組織へのポリペプチドの送達を、組織に送達される誘導体化されていないポリペプチドの量と比較して高めるように生体分子を選択する。またさらなる実施形態では、選択した期間中に特異的組織に送達される誘導体化されたポリペプチドの量は、誘導体化によって少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約１００％高まる。現在、標的化用途のための好ましい生体分子には、抗体、ホルモンおよび細胞表面受容体のためのリガンドが挙げられる。
またさらなる例示的な実施形態では、ビオチンを有する結合体を提供する。したがって、例えば、選択的にビオチン化されたポリペプチドは、１つもしくは複数の修飾基を有するアビジンまたはストレプトアビジン部分の結合によって作製される。
治療的部分
他の実施形態では、修飾された糖は、治療的部分を含む。治療的部分と生体分子のカテゴリーとの間に重複があることを当業者であれば理解するであろう。多くの生体分子が、治療特性または治療能を有する。
治療的部分は臨床用途のためにすでに受け入れられている作用物質でもよく、またはその使用が実験的である薬物、またはその作用もしくは作用機序が調査中の薬物でもよい。治療的部分は、所与の病態において証明された作用を有していてもよく、または所与の病態において望ましい作用を示すとただ仮定されているものでもよい。他の実施形態では、治療的部分は、選択した組織と相互作用する能力について選別されている化合物である。本発明を実施するのに有用な治療的部分には、種々の薬理活性を有する広範囲の薬物の部類からの薬物が含まれる。好ましい治療的部分は、本質的に非蛍光性であるか、またはアッセイにおいて蛍光マーカーとして使用するには不適切な最低限の蛍光を放出するものである。さらに、糖ではない治療的部分を使用することが一般に好ましい。この優先度の例外は、ＰＥＧ、生体分子、治療的部分、診断的部分などの他の実体の共有結合によって修飾された糖の使用である。他の例示的な実施形態では、治療用糖部分は、リンカーアームに結合しており、糖−リンカーアームカセットは、本発明の方法によって続いてポリペプチドに結合される。
治療用および診断用薬を様々な他の種に結合する方法は、当業者には周知である。例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６年；およびＤｕｎｎら（編）、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳシンポジウムシリーズ第４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１年を参照されたい。
例示的な実施形態では、治療的部分は、選択した条件下で開裂する連結を介して修飾された糖に結合する。例示的な条件には、それだけに限らないが、選択したｐＨ（例えば、胃、腸、エンドサイトーシス液胞）、活性酵素の存在（例えば、エステラーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ）、光、熱などが挙げられる。多くの開裂可能な基は、当技術分野において公知である。例えば、Ｊｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、７６１：１５２〜１６２（１９８３年）；Ｊｏｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１４５１８〜１４５２５（１９９０年）；Ｚａｒｌｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２４：９１３〜９２０（１９８０年）；Ｂｏｕｉｚａｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５５：１４１〜１４７（１９８６年）；Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１：２０５〜２１０（１９８６年）；Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３：１８５９〜１８６７（１９８９年）を参照されたい。
有用な治療的部分の部類には、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。ＮＳＡＩＤは、例えば、下記のカテゴリーから選択することができる。（例えば、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、フェナミン酸誘導体、ビフェニルカルボン酸誘導体およびオキシカム）；ヒドロコルチゾンなどを含めたステロイド性抗炎症薬；抗ヒスタミン薬（例えば、クロルフェニラミン、トリプロリジン）；鎮咳薬（例えば、デキストロメトルファン、コデイン、カラミフェンおよびカルベタペンタン）；鎮痒薬（例えば、メトジラジンおよびトリメプラジン）；抗コリン薬（例えば、スコポラミン、アトロピン、ホマトロピン、レボドパ）；制吐薬および制嘔吐薬（例えば、シクリジン、メクリジン、クロルプロマジン、ブクリジン）；食欲減退薬（例えば、ベンズフェタミン、フェンテルミン、クロルフェンテルミン、フェンフルラミン）；中枢興奮薬（例えば、アンフェタミン、メタンフェタミン、デキストロアンフェタミンおよびメチルフェニデート）；抗不整脈薬（例えば、プロパノロール、プロカインアミド、ジソピラミド、キニジン、エンカイニド）；β−アドレナリン遮断薬（例えば、メトプロロール、アセブトロール、ベタキソロール、ラベタロールおよびチモロール）；強心薬（例えば、ミルリノン、アムリノンおよびドブタミン）；降圧薬（例えば、エナラプリル、クロニジン、ヒドララジン、ミノキシジル、グアナドレル、グアネチジン）；利尿薬（例えば、アミロリドおよびヒドロクロロチアジド）；血管拡張薬（例えば、ジルチアゼム、アミオダロン、イソクスプリン、ナイリドリン、トラゾリンおよびベラパミル）；血管収縮薬（例えば、ジヒドロエルゴタミン、エルゴタミンおよびメチルセルギド）；抗潰瘍薬（例えば、ラニチジンおよびシメチジン）；麻酔薬（例えば、リドカイン、ブピバカイン、クロロプロカイン、ジブカイン）；抗うつ剤（例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン）；トランキライザーおよび鎮静薬（例えば、クロルジアゼポキシド、ベナクチジン、ベンズキナミド、フルラゼパム、ヒドロキシジン、ロキサピンおよびプロマジン）；抗精神病薬（例えば、クロルプロチキセン、フルフェナジン、ハロペリドール、モリンドン、チオリダジンおよびトリフルオペラジン）；抗菌薬（抗菌薬、抗真菌薬、抗原虫薬および抗ウイルス薬）。
本組成物に組み込むのに好ましい抗菌剤には、例えば、β−ラクタム薬、キノロン薬、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アミカシン、トリクロサン、ドキシサイクリン、カプレオマイシン、クロルヘキシジン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クリンダマイシン、エタンブトール、イセチオン酸ヘキサミジン、メトロニダゾール、ペンタミジン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メタサイクリン、メテナミン、ミノサイクリン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ミコナゾールおよびアマンタジンの薬学的に許容できる塩が挙げられる。
本発明を実施する上で他の有用な薬物部分には、抗悪性腫瘍薬（例えば、抗アンドロゲン（例えば、ロイプロリドまたはフルタミド）、殺細胞剤（例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、シクロホスファミド、ブスルファン、シスプラチン、β−２−インターフェロン）、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、代謝拮抗剤（例えば、フルオロウラシル、メソトレキセート、メルカプトプリン、チオグアニン）が挙げられる。この部類にまた含まれるのは、診断および治療の両方のための放射性同位体をベースとする薬剤、リシン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン、クリケアマイシンなどの結合された毒素、ならびに関連する構造およびその類似体である。
治療的部分はまた、ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラジオール、ロイプロリド、メゲストロール、オクトレオチドまたはソマトスタチン）；筋弛緩薬（例えば、シンナメドリン、シクロベンザプリン、フラボキサート、オルフェナドリン、パパベリン、メベベリン、イダベリン、リトドリン、ジフェノキシレート、ダントロレンおよびアズモレン）；鎮痙薬；骨活性化薬（例えば、ジホスホネートおよびホスホノアルキルホスフィネート薬化合物）；内分泌調節薬（例えば、避妊薬（例えば、エチノジオール、エチニルエストラジオール、ノルエチンドロン、メストラノール、デソゲストレル、メドロキシプロゲステロン））、糖尿病の修飾因子（例えば、グリブリドまたはクロルプロパミド）、タンパク同化薬（テストラクトンまたはスタノゾロールなど）、およびロゲン（例えば、メチルテストステロン、テストステロンまたはフルオキシメステロン）、抗利尿薬（例えば、デスモプレシン）およびカルシトニン）でもよい。
本発明においてまた有用なのは、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベステロール）、グルココルチコイド（例えば、トリアムシノロン、ベタメタゾンなど）およびプロゲストゲン（ノルエチンドロン、エチノジオール、ノルエチンドロン、レボノルゲストレルなど）；甲状腺剤（例えば、リオチロニンまたはレボチロキシン）または抗甲状腺剤（例えば、メチマゾール）；抗高プロラクチン血症薬（例えば、カベルゴリン）；ホルモン抑制剤（例えば、ダナゾールまたはゴセレリン）、分娩促進剤（例えば、メチルエルゴノビンまたはオキシトシン）およびプロスタグランジン（ミソプロストール、アルプロスタジルまたはジノプロストンなど）である。
他の有用な修飾基には、免疫調節薬（例えば、抗ヒスタミン剤、肥満細胞安定化薬（ロドキサミドおよび／またはクロモリンなど）、ステロイド（例えば、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベクロメタゾン、またはクロベタゾール）、ヒスタミンＨ２アンタゴニスト（例えば、ファモチジン、シメチジン、ラニチジン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、シクロスポリン）などが挙げられる。スリンダク、エトドラク、ケトプロフェンおよびケトロラクなどの抗炎症活性を有する群も有用である。本発明と関連した他の有用な薬物は、当業者には明らかであろう。
修飾された糖
修飾されたグリコシル供与体種（「修飾された糖」）は、修飾された糖ヌクレオチド、活性化され修飾された糖、およびヌクレオチドでなく活性化されてもいない単純な糖である修飾された糖から選択されるのが好ましい。任意の所望の炭水化物または非炭水化物構造を、本発明の方法を使用してポリペプチドに付加することができる。典型的には、この構造は単糖であるが、本発明は、修飾された単糖の使用に限定されない。オリゴ糖、多糖およびグリコシル模倣部分も有用である。
修飾基は、酵素的手段、化学的手段またはこれらの組合せによって糖部分に結合し、それによって修飾された糖が生成される。糖は、修飾基の結合を可能とする任意の位置で置換されるが、その場合でも修飾された糖がポリペプチドに連結されるのに使用される酵素の基質として、糖が機能するのを可能とする。例示的な実施形態では、シアル酸が糖である場合、シアル酸は、ピルビル側鎖か、またはシアル酸中で通常アセチル化されているアミン部分上の５位において、修飾基によって置換される。
糖ヌクレオチド
本発明の特定の実施形態では、修飾された糖ヌクレオチドを利用して、修飾された糖をポリペプチドに付加する。修飾された形態で本発明において使用される例示的な糖ヌクレオチドには、ヌクレオチドモノホスフェート、ヌクレオチドジホスフェートまたはヌクレオチドトリホスフェートまたはその類似体が挙げられる。好ましい実施形態では、修飾された糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、およびＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらにより好ましくは、修飾された糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。糖ヌクレオチドのＮ−アセチルアミン誘導体も、本発明の方法において有用である。
一例では、ヌクレオチド糖種は、水溶性ポリマーによって修飾される。例示的な修飾された糖ヌクレオチドは、糖上のアミン部分によって修飾された糖基を有する。修飾された糖ヌクレオチド、例えば、糖ヌクレオチドのサッカリル−アミン誘導体も、本発明の方法において有用である。例えば、（修飾基を有さない）サッカリルアミンは、ポリペプチド（または他の種）に酵素によって結合することができ、遊離サッカリルアミン部分はその後所望の修飾基に結合する。代わりに、修飾された糖ヌクレオチドは、修飾された糖をポリペプチド上のサッカリル受容体に転移させる酵素の基質として機能することができる。
例示的な実施形態では、修飾された糖は、６−アミノ−Ｎ−アセチル−グリコシル部分をベースとする。Ｎ−アセチルガラクトサミンについて下記のスキーム４に示されるように、修飾された糖ヌクレオチドは、標準的な方法を用いて容易に調製することができる。
Figure 2009544327
上記のスキーム４において、指数ｎは、０〜２５００、好ましくは１０〜１５００、さらに好ましくは１０〜１２００の整数を表す。記号「Ａ」は、活性化基、例えばハロ、活性エステルの成分（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、カーボネートの成分（例えば、ｐ−ニトロフェニルカーボネート）などを表す。他のＰＥＧ−アミドヌクレオチド糖は、これおよび類似の方法によって容易に調製されることを当業者であれば理解するであろう。
他の例示的な実施形態では、アミド部分は、ウレタンまたは尿素などの基によって置換されている。
またさらなる実施形態では、Ｒ１は、分枝ＰＥＧ、例えば、上述したそれらの種の１つである。この実施形態による例示的な化合物には、
Figure 2009544327
（式中、Ｘ４は結合またはＯであり、ＪはＳまたはＯである）が挙げられる。
さらに上記のように、本発明は、直鎖または分枝状の水溶性ポリマーで修飾されたヌクレオチド糖を使用して形成されるポリペプチド結合体を提供する。例えば、下式
Figure 2009544327
（式中、Ｘ４はＯまたは結合であり、ＪはＳまたはＯである）を有する化合物は、本発明の範囲内である。
同様に、本発明は、６位の炭素が修飾されている修飾された糖種のヌクレオチド糖を使用して形成されるポリペプチド結合体
Figure 2009544327
（式中、Ｘ４は結合またはＯであり、ＪはＳまたはＯであり、ｙは０または１である）を提供する。
下式
Figure 2009544327
（式中、ＪはＳまたはＯである）を有するポリペプチドおよび糖ペプチド結合体も提供する。
活性化糖
他の実施形態では、修飾された糖は活性化糖である。本発明において有用な活性化され修飾された糖は、典型的には脱離基を含むように合成的に変化させたグリコシドである。一例では、活性化糖は、酵素反応において、活性化糖をポリペプチドまたは糖ペプチド上の受容体上に転移させるために使用される。他の例では、化学的手段によって活性化糖をポリペプチドまたは糖ペプチドに付加する。「脱離基」（または活性化基）とは、酵素によって制御される求核置換反応において容易に置換される、または代わりに、求核反応パートナー（例えば、スルフヒドリル基を有するグリコシル部分）を利用した化学反応において置換されるそれらの部分を意味する。各タイプの反応のために適切な脱離基を選択することは当業者の能力の範囲内である。多くの活性化糖が、当技術分野において公知である。例えば、Ｖｏｃａｄｌｏら、ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＹ、第２巻、Ｅｒｎｓｔら（編）、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２０００年；Ｋｏｄａｍａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：６４１９（１９９３年）；Ｌｏｕｇｈｅｅｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７７１７（１９９９年））を参照されたい。
脱離基の例には、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、トシレートエステル、メシレートエステル、トリフレートエステルなどが挙げられる。酵素媒介反応において使用するための好ましい脱離基は、受容体へのグリコシドの酵素転移を立体的に有意に妨げないものである。したがって、活性化グリコシド誘導体の好ましい実施形態には、グリコシルフッ化物およびグリコシルメシレートが挙げられ、グリコシルフッ化物が特に好ましい。グリコシルフッ化物の中で、α−ガラクトシルフッ化物、α−マンノシルフッ化物、α−グルコシルフッ化物、α−フコシルフッ化物、α−キシロシルフッ化物、α−シアリルフッ化物、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルフッ化物、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフッ化物、β−ガラクトシルフッ化物、β−マンノシルフッ化物、β−グルコシルフッ化物、β−フコシルフッ化物、β−キシロシルフッ化物、β−シアリルフッ化物、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルフッ化物およびβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフッ化物が最も好ましい。非酵素的求核置換では、これらおよび他の脱離基が有用である場合がある。例えば、活性化供与体グリコシドは、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、またはブロモ−グリコシドでよい。
例示として、グリコシルフッ化物は、最初にアセチル化し、次いで糖部分をＨＦ／ピリジンで処理することによって遊離糖から調製することができる。これによって、保護（アセチル化）されたグリコシルフッ化物（すなわち、α−グリコシルフッ化物）の熱力学的に最も安定的なアノマーが生じる。より安定的でないアノマー（すなわち、β−グリコシルフッ化物）が所望である場合、ペルアセチル化糖をＨＢｒ／ＨＯＡｃまたはＨＣＩで変換し、アノマー臭化物または塩化物を生じさせることによってそれを調製することができる。この中間体はフッ化銀などのフッ化塩と反応して、グリコシルフッ化物を生じる。アセチル化グリコシルフッ化物は、メタノール（例えば、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）中で穏やかな（触媒）塩基と反応させることによって脱保護することができる。さらに、多くのグリコシルフッ化物は市販である。
他の活性化グリコシル誘導体は、当業者に公知の従来の方法を使用して調製することができる。例えば、グリコシルメシレートは、糖の完全ベンジル化ヘミアセタール形態を塩化メシルで処理し、次いで接触水素化によってベンジル基を除去することによって調製することができる。
さらなる例示的な実施形態では、修飾された糖は、アンテナ構造を有するオリゴ糖である。他の実施形態では、アンテナの末端の１つまたは複数は、修飾部分を有する。複数の修飾部分がアンテナ構造を有するオリゴ糖に結合している場合は、オリゴ糖は修飾部分を「増幅する」のに有用であり、ポリペプチドに結合している各オリゴ糖ユニットは、修飾基の多くのコピーをポリペプチドに結合する。上記の図に記載の本発明の典型的な結合体の一般構造は、アンテナ構造を使用した本発明の結合体を調製することから得られる多価の種を包含する。多くのアンテナ糖の構造は当技術分野において公知であり、本方法は、それらによって制限なく実施することができる。
修飾された糖の調製
一般に、糖部分と修飾基との間の共有結合は、反応性官能基の使用によって形成され、この官能基は連結プロセスによって典型的には新規な有機官能基または非反応種に形質転換される。結合を形成するために、修飾基および糖部分は、相補的反応性官能基を有する。反応性官能基は、糖部分上の任意の位置に配置されることができる。
本発明を実施するのに有用な反応性基および反応の部類は一般に、生体結合体化学の当技術分野で周知のものである。反応性糖部分と共に利用可能な現在好ましい部類の反応は、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらには、それだけに限らないが、求核置換（例えば、アミンおよびアルコールのハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）および炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールズアルダー付加）が挙げられる。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６年；およびＦｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２年に記載されている。
反応性官能基
糖核または修飾基からぶら下がっている有用な反応性官能基には、それだけに限らないが、
（ａ）カルボキシル基、ならびにそれだけに限らないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルが挙げられる様々なその誘導体、
（ｂ）例えば、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換することができるヒドロキシル基、
（ｃ）ハロゲン化物が、例えば、アミン、カルボン酸陰イオン、チオール陰イオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基によって後で置換されることができ、したがってハロゲン原子の官能基において新しい基の共有結合がもたらされるハロアルキル基、
（ｄ）ディールズアルダー反応に参加することができるジエノフィル基、例えば、マレイミド基、
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、またはグリニャール付加もしくはアルキルリチウム付加などの機構を介して、その後の誘導体化が可能となるようなアルデヒド基またはケトン基、
（ｆ）アミンとのその後の反応で、例えば、スルホンアミドが形成されるハロゲン化スルホニル基、
（ｇ）例えば、ジスルフィドに変換できるか、またはハロゲン化アシルと反応できるチオール基、
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化または酸化されることのできるアミンまたはスルフヒドリル基、
（ｉ）例えば、環状付加、アシル化、マイケル付加などを受けることができるアルケン、
（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド
が挙げられる。
反応性官能基は、反応性糖核または修飾基を構築するのに必要な反応に参加しないか、または妨げないように選択することができる。代わりに、反応性官能基は、保護基の存在によって反応に参加することから保護することができる。選択した一連の反応条件を妨げないような特定の官能基の保護の仕方を当業者であれば理解している。有用な保護基の例については、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年を参照されたい。
架橋基
本発明の方法において使用するための修飾された糖の調製は、修飾基の糖残基との結合と、グリコシルトランスフェラーゼの基質である安定的な付加体の形成とを含む。糖および修飾基は、零次または高次架橋剤によって連結することができる。修飾基を炭水化物部分に結合するために使用することができる例示的な二官能性化合物には、それだけに限らないが、二官能性のポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが挙げられる。炭水化物を他の分子に連結するための一般のアプローチは、文献において知られている。例えば、Ｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：１８５６（１９８９年）；Ｂｈａｔｉａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８：４０８（１９８９年）；Ｊａｎｄａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：８８８６（１９９０年）およびＢｅｄｎａｒｓｋｉら、ＷＯ９２／１８１３５を参照されたい。下記の考察において、反応性基は、新生の修飾された糖の糖部分上で温和であるとして処理される。考察の焦点は、例示を明確にするためである。この考察は修飾基上の反応性基にも適切であることを当業者であれば理解するであろう。
種々の試薬を使用して、修飾された糖の成分を分子内化学的架橋で修飾する（架橋試薬および架橋の手順の概説については、Ｗｏｌｄ，Ｆ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３〜６５１、１９７２年；Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．、およびＣｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．、ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＳ ＤＲＵＧＳ（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ、およびＲｏｂｅｒｔｓ（編））３９５〜４４２頁、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８１年；Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０〜６０９、１９８３年；Ｍａｔｔｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７〜１８３、１９９３年（これらのすべては参照により本明細書中に組み込まれている）を参照されたい）。好ましい架橋試薬は、様々なゼロ長、ホモ二官能性、およびヘテロ二官能性の架橋試薬から誘導される。ゼロ長架橋試薬は、外来性物質の導入をせずに２つの内在の化学基の直接の結合を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する作用物質は、このカテゴリーに属する。他の例は、カルボキシルおよび第１級アミノ基の縮合を誘導して、カルボジイミド、クロロギ酸エチル、ウッドワード試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホネート）およびカルボニルジイミダゾールなどのアミド結合を形成する試薬である。これらの化学試薬に加えて、酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．２．１３）は、ゼロ長の架橋試薬として使用することができる。この酵素は、タンパク質と結合したグルタミニル残基のカルボキサミド基で、通常第１級アミノ基を基質として、アシル転移反応を触媒する。好ましいホモ二官能性およびヘテロ二官能性試薬は、各々２つの同一の部位または２つの異なる部位を含有し、その部位はアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または非特異的な基と反応性でよい。
本発明は、部位特異的反応性部分の使用に加えて、糖を修飾基に連結するための非特異的反応性基の使用を意図する。
例示的な非特異的架橋剤には、暗所では完全に不活性であり、適切なエネルギーの光子の吸収によって反応種に変換される光活性化が可能な基が含まれる。一実施形態では、光活性化が可能な基は、アジドを加熱または光分解すると生じるニトレンの前駆体から選択される。電子不足のニトレンは、極めて反応性であり、Ｎ−Ｈ、Ｏ−Ｈ、Ｃ−Ｈ、およびＣ＝Ｃを含めた種々の化学結合と反応することができる。３つのタイプのアジド（アリール、アルキル、およびアシル誘導体）を用いることができるが、アリールアジドが現在用いられる。光分解によるアリールアジドの反応性は、Ｃ−Ｈ結合よりもＮ−ＨおよびＯ−Ｈで良好である。電子不足のアリールニトレンは、急速に環を拡大して、デヒドロアゼピンを形成し、このデヒドロアゼピンはＣ−Ｈ挿入生成物を形成するよりも、求核試薬と反応する傾向がある。環中のニトロ基またはヒドロキシル基などの電子求引性置換基の存在によって、アリールアジドの反応性が増加する場合がある。このような置換基は、アリールアジド吸収極大をより長い波長に押し上げる。非置換アリールアジドは、２６０〜２８０ｎｍの範囲の吸収極大を有し、一方ヒドロキシおよびニトロアリールアジドは、３０５ｎｍを超えた有効な光を吸収する。したがって、ヒドロキシおよびニトロアリールアジドは、非置換アリールアジドより、より有害でない光分解条件を親和性成分のために用いることを可能にするため、最も好ましい。
さらなる実施形態では、リンカー基は、開裂して糖残基から修飾基を放出することができる基を備える。多くの開裂可能な基は、当技術分野において公知である。例えば、Ｊｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ７６１：１５２〜１６２（１９８３年）；Ｊｏｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４５１８〜１４５２５（１９９０年）；Ｚａｒｌｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：９１３〜９２０（１９８０年）；Ｂｏｕｉｚａｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５５：１４１〜１４７（１９８６年）；Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：２０５〜２１０（１９８６年）；Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８５９〜１８６７（１９８９年）を参照されたい。さらに、広範囲の開裂可能な二官能性（ホモ二官能性およびヘテロ二官能性の両方）リンカー基は、Ｐｉｅｒｃｅなどの供給業者から市販されている。
例示的な開裂可能な部分は、光、熱またはチオール、ヒドロキシルアミン、塩基、過ヨウ素酸塩などの試薬を使用して開裂することができる。さらに、特定の好ましい基は、エンドサイトーシスが行われるのに応じてｉｎ ｖｉｖｏで開裂する（例えば、ｃｉｓ−アコニチル；Ｓｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８（１９９１年）を参照されたい）。好ましい開裂可能な基は、ジスルフィド、エステル、イミド、カーボネート、ニトロベンジル、フェナシルおよびベンゾイン基からなる群から選択されるメンバーである開裂可能な部分を含む。
下記の考察において、本発明を実施するのに有用な修飾された糖のいくつかの具体例を記載する。例示的な実施形態では、シアル酸誘導体は、修飾基が結合する糖核として利用される。シアル酸誘導体についての考察の焦点は、例示を明確にするためのみであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。種々の他の糖部分は、一例としてシアル酸を使用して記載したものと類似の方法で活性化および誘導体化することができることを当業者であれば理解するであろう。例えば、糖基質の２〜３例を挙げると、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびフコースを修飾するために多数の方法が利用可能であり、これらは当技術分野で認められた方法によって容易に修飾される。例えば、Ｅｌｈａｌａｂｉら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：９３（１９９９年）およびＳｃｈａｆｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：２４（２０００年）を参照されたい。
例示的な実施形態では、本発明の方法によって修飾されたポリペプチドは、原核細胞（例えば、大腸菌）、酵母および哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を含めた真核細胞、またはトランスジェニック動物中で産生される糖ペプチドであり、したがって不完全にシアリル化されたＮ−および／またはＯ−結合型オリゴ糖鎖を含有する。シアル酸を欠き末端ガラクトース残基を含有する糖ペプチドのオリゴ糖鎖は、グリコＰＥＧ化、グリコＰＰＧ化することができ、またはそうでなければ修飾されたシアル酸で修飾することができる。
スキーム５において、アミノグリコシド１を、保護されたアミノ酸（例えば、グリシン）誘導体の活性エステルで処理し、糖アミン残基を相当する保護されたアミノ酸アミド付加体に変換する。付加体をアルドラーゼで処理し、α−ヒドロキシカルボキシレート２を形成させる。化合物２は、ＣＭＰ−ＳＡシンテターゼの活性によって相当するＣＭＰ誘導体に変換され、次いでＣＭＰ誘導体の接触水素化によって、化合物３が生じる。グリシン付加体の形成によって導入されるアミンは、化合物３と活性化（ｍ−）ＰＥＧまたは（ｍ−）ＰＰＧ誘導体（例えば、ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＰＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ）との間の反応によって、ＰＥＧまたはＰＰＧ結合の部位として利用され、４または５を各々生成する。
Figure 2009544327
下記の表１１に、ＰＥＧまたはＰＰＧ部分によって誘導体化された糖モノホスフェートの代表的な例を記載する。表２の特定の化合物は、スキーム４の方法によって調製される。他の誘導体は、当技術分野において認められた方法によって調製される。例えば、Ｋｅｐｐｌｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１１：１１Ｒ（２００１年）；およびＣｈａｒｔｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１０：１０４９（２０００年））を参照されたい。他のアミン反応性ＰＥＧおよびＰＰＧ類似体は市販であり、またはそれらは当業者が容易に利用可能な方法によって調製することができる。
表１１：ＰＥＧまたはＰＰＧで誘導体化された糖モノホスフェートの例
Figure 2009544327
本発明の実施において有用な修飾された糖ホスフェートは、上記に示した位置だけでなく他の位置でも置換することができる。現在、シアル酸の好ましい置換を、式（ＶＩＩＩ）に記載する。
Figure 2009544327
式中、Ｘは、好ましくは−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｓ、ＣＨ２−、および−Ｎ（Ｒ）２（式中、各Ｒは、Ｒ１〜Ｒ５から独立して選択されるメンバーである）から選択される連結基である。記号Ｙ、Ｚ、ＡおよびＢはそれぞれ、Ｘの本質のために上記の基から選択される基を表す。Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＡおよびＢは、各々独立して選択され、したがって、それらは同一でもは異なってもよい。記号Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、水溶性ポリマー、治療的部分、生体分子または他の部分を表す。代わりに、これらの記号は、水溶性ポリマー、治療的部分、生体分子または他の部分に結合したリンカーを表す。
本明細書において開示されている結合体に結合する例示的な部分には、それだけに限らないが、ＰＥＧ誘導体（例えば、アルキル−ＰＥＧ、アシル−ＰＥＧ、アシル−アルキル−ＰＥＧ、アルキル−アシル−ＰＥＧカルバモイル−ＰＥＧ、アリール−ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アルキル−ＰＰＧ、アシル−ＰＰＧ、アシル−アルキル−ＰＰＧ、アルキル−アシル−ＰＰＧカルバモイル−ＰＰＧ、アリール−ＰＰＧ）、治療的部分、診断的部分、マンノース−６−リン酸、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬｅｘ、マンノース、マンノース−６−リン酸、シアリルルイスＸ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、アンテナオリゴ糖、ペプチドなどが挙げられる。様々な修飾基を糖部分に結合する方法を、当業者は容易に利用できる（ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ出版社、１９９２年；ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（編）、ＡＣＳシンポジウムシリーズ第６８０巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９７年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６年；およびＤｕｎｎら（編）、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳシンポジウムシリーズ第４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１年）。
例示的な戦略は、ヘテロ二官能性架橋剤ＳＰＤＰ（ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを使用した糖への保護されたスルフヒドリルの組込み、次いで修飾基上の他のスルフヒドリルとのジスルフィド結合の形成のためのスルフヒドリルの脱保護を伴う。
ＳＰＤＰにより修飾された糖がグリコシルトランスフェラーゼ基質として作用する能力に悪影響を及ぼす場合、２−イミノチオランまたはＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）などの数々の他の架橋剤の１つを使用して、ジスルフィド結合を形成する。２−イミノチオランは第１級アミンと反応し、保護されていないスルフヒドリルをアミン含有分子に即座に組み込む。ＳＡＴＡはまた第１級アミンと反応するが、保護されたスルフヒドリルを組み込み、ヒドロキシルアミンを使用してこれを後で脱アセチル化し、遊離スルフヒドリルを生成させる。いずれの場合にも、組み込まれたスルフヒドリルは、他のスルフヒドリルまたはＳＰＤＰなどの保護されたスルフヒドリルと自由に反応し、必要とされるジスルフィド結合を形成する。
上記の戦略は、本発明において有用なリンカーを例示するものであり、限定するものではない。修飾基をポリペプチドに架橋させるための様々な戦略において使用できる他の架橋剤が利用可能である。例えば、ＴＰＣＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインヒドラジドおよびＴＰＭＰＨ（（Ｓ−（２−チオピリジル）メルカプト−プロピオノヒドラジド）は、穏やかな過ヨウ素酸塩処理によって予め酸化された炭水化物部分と反応し、それによって架橋剤のヒドラジド部分と過ヨウ素酸塩によって生成されたアルデヒドとの間にヒドラゾン結合を形成する。ＴＰＣＨおよびＴＰＭＰＨは、２−ピリジルチオンに保護されたスルフヒドリル基を糖上に導入し、これはＤＴＴで脱保護することができ、次いで成分間のジスルフィド結合の形成などの結合に使用される。
ジスルフィド結合が安定的な修飾された糖を生成するのに適切でないことが見出された場合、成分の間により安定的な結合を組み込む他の架橋剤を使用することができる。ヘテロ二官能性架橋剤ＧＭＢＳ（Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）およびＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン）は、第１級アミンと反応し、それによってマレイミド基を成分上に導入する。その後、マレイミド基は、上記の架橋剤によって導入することができる、他の成分上のスルフヒドリルと反応し、それによって成分間に安定的なチオエーテル結合を形成することができる。成分間の立体障害が、成分の活性またはグリコシルトランスフェラーゼ基質として作用する修飾された糖の能力を妨げる場合、成分間に長いスペーサーアームを導入し、上記の架橋剤（すなわち、ＳＰＤＰ）のいくつかの誘導体を含む架橋剤を使用することができる。したがって、有用で適切な架橋剤が多数あり、各々は、最適なポリペプチド結合体および修飾された糖の生成について有する効果に基づいて選択される。
種々の試薬が、修飾された糖の成分を分子内の化学架橋によって修飾するために使用される（架橋試薬および架橋の手順の概説については：Ｗｏｌｄ，Ｆ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３〜６５１、１９７２年；Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．、およびＣｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．、ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＳ ＤＲＵＧＳ．（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ、およびＲｏｂｅｒｔｓ（編））３９５〜４４２頁、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８１年；Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０〜６０９、１９８３年；Ｍａｔｔｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７〜１８３、１９９３年を参照されたい。（これらのすべては参照により本明細書中に組み込まれている））。好ましい架橋試薬は、様々なゼロ長、ホモ二官能性、およびヘテロ二官能性架橋試薬から誘導される。ゼロ長架橋試薬は、外因性の物質を導入せずに、２つの内因性化学基の直接結合を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する作用物質は、このカテゴリーに属する。他の例は、カルボジイミド、クロロギ酸エチル、ウッドワード試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホネート）、およびカルボニルジイミダゾールなどの、カルボキシル基および第１級アミノ基の縮合を誘発して、アミド結合を形成する試薬である。これらの化学試薬に加えて、酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．２．１３）も、ゼロ長架橋試薬として使用することができる。この酵素は、通常第１級アミノ基を基質として、タンパク質結合グルタミニル残基のカルボキサミド基でのアシル転移反応を触媒する。好ましいホモ二官能性およびヘテロ二官能性試薬は、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または非特異的な基と反応性である場合がある２つの同一部位または２つの異なる部位を各々含有する。
架橋試薬における好ましい特異的部位
１．アミノ反応性基
一実施形態では、架橋剤上の部位は、アミノ反応性基である。アミノ反応性基の有用な非限定的例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、イミドエステル、イソシアネート、ハロゲン化アシル、アリールアジド、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルデヒド、および塩化スルホニルが挙げられる。
ＮＨＳエステルは、修飾された糖成分の（芳香族を含めた）第１級アミノ基と優先的に反応する。ヒスチジンのイミダゾール基は、反応に際し第１級アミンと競合することが知られているが、その反応生成物は不安定であり、容易に加水分解される。この反応は、アミドを形成し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが放出される、ＮＨＳエステルの酸カルボキシル上でのアミンの求核攻撃を伴う。したがって、元のアミノ基の正の電荷は失われる。
イミドエステルは、修飾された糖成分のアミン基との反応に関して最も特異的なアシル化試薬である。イミドエステルは、ｐＨ７〜１０で第１級アミンとのみ反応する。第１級アミンは、イミデートを求核攻撃し、中間体を生じ、これは高ｐＨでアミジンに、または低ｐＨで新しいイミデートに分解される。新しいイミデートは、他の第１級アミンと反応し、それによって２個のアミノ基を架橋することができる。これは単官能であると推定されるイミデートが二官能的に反応する事例である。第１級アミンとの反応の主要生成物は、元のアミンよりも強い塩基であるアミジンであり。したがって、元のアミノ基の正の電荷は保持される。
イソシアネート（およびイソチオシアネート）は、修飾された糖成分の第１級アミンと反応し、安定的な結合を形成する。スルフヒドリル、イミダゾール、およびチロシル基とのそれらの反応は、比較的不安定な生成物を生じさせる。
アシルアジドも、親和性成分の求核性アミンがわずかにアルカリ性条件、例えばｐＨ８．５で酸性カルボキシル基を攻撃する、アミノ特異的試薬として使用される。
１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどのハロゲン化アリールは、修飾された糖成分のアミノ基およびチロシンフェノール基と優先的に反応するが、スルフヒドリル基およびイミダゾール基とも反応する。
モノカルボン酸およびジカルボン酸のｐ−ニトロフェニルエステルも、有用なアミノ反応性基である。試薬特異性はあまり高くないが、α−およびε−アミノ基は、最も速く反応するように思われる。
グルタルアルデヒドなどのアルデヒドは、修飾された糖の第１級アミンと反応する。不安定なシッフ塩基が、アミノ基とアルデヒド類のアルデヒドとの反応によって形成されるが、グルタルアルデヒドは、安定的な架橋によって修飾された糖を修飾することができる。典型的な架橋条件のｐＨであるｐＨ６〜８では、環状ポリマーは脱水され、α−β不飽和アルデヒドポリマーが形成される。しかし、シッフ塩基は、他の二重結合に結合している場合安定的である。両方の二重結合の共鳴相互作用によって、シッフ結合の加水分解が妨げられる。さらに、アミンは、高い局所濃度でエチレン二重結合を攻撃し、安定的なマイケル付加生成物を形成することができる。
芳香族塩化スルホニルは修飾された糖成分の種々の部位と反応するが、アミノ基との反応が最も重要であり、安定的なスルホンアミド結合をもたらす。
２．スルフヒドリル反応性基
他の実施形態では、部位はスルフヒドリル反応性基である。スルフヒドリル反応性基の有用な非限定的例には、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ピリジルジスルフィド、およびチオフタルイミドが挙げられる。
マレイミドは、修飾された糖成分のスルフヒドリル基と優先的に反応し、安定的なチオエーテル結合を形成する。それらはまた、ヒスチジンの第１級アミノ基およびイミダゾール基とも大幅に遅い速度で反応する。しかしｐＨ７で、単純チオールの反応速度は、相当するアミンの反応速度より１０００倍速いため、このｐＨでマレイミド基はスルフヒドリルに特異的な基とみなすことができる。
ハロゲン化アルキルは、スルフヒドリル基、スルフィド、イミダゾール、およびアミノ基と反応する。しかし、中性からわずかにアルカリ性のｐＨで、ハロゲン化アルキルは、スルフヒドリル基と主に反応し、安定的なチオエーテル結合を形成する。より高いｐＨでは、アミノ基との反応が好ましい。
ピリジルジスルフィドは、ジスルフィド交換を介して遊離スルフヒドリルと反応し、混合性ジスルフィドを生じる。その結果、ピリジルジスルフィドは、最も特異的スルフヒドリル反応性基である。
チオフタルイミドは、遊離スルフヒドリル基と反応し、ジスルフィドを形成する。
３．カルボキシル反応性残基
他の実施形態では、水および有機溶媒の両方に可溶性のカルボジイミドは、カルボキシル反応性試薬として使用される。これらの化合物は、遊離カルボキシル基と反応し、利用可能なアミンと次いで連結しアミド結合を生じることができるプソイド尿素を形成し、これはカルボジイミドによるカルボキシル基の修飾の仕方を教示する（Ｙａｍａｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０：４８３６〜４８４２、１９８１年）。
架橋試薬における好ましい非特異的部位
部位特異的反応性部分の使用に加えて、本発明は、糖を修飾基に連結するための非特異的な反応性基の使用を企図する。
例示的な非特異的架橋剤には、暗所では完全に不活性であり、適切なエネルギーの光子の吸収によって反応種に変換される光活性化が可能な基が含まれる。一実施形態では、光活性化が可能な基は、アジドを加熱または光分解すると生じるニトレンの前駆体から選択される。電子不足のニトレンは、極めて反応性であり、Ｎ−Ｈ、Ｏ−Ｈ、Ｃ−Ｈ、およびＣ＝Ｃを含めた種々の化学結合と反応することができる。３つのタイプのアジド（アリール、アルキル、およびアシル誘導体）を用いることができるが、アリールアジドが現在用いられる。光分解によるアリールアジドの反応性は、Ｃ−Ｈ結合よりもＮ−ＨおよびＯ−Ｈで良好である。電子不足のアリールニトレンは、急速に環を拡大して、デヒドロアゼピンを形成し、このデヒドロアゼピンはＣ−Ｈ挿入生成物を形成するよりも、求核試薬と反応する傾向がある。環中のニトロ基またはヒドロキシル基などの電子求引性置換基の存在によって、アリールアジドの反応性が増加する場合がある。このような置換基は、アリールアジド吸収極大をより長い波長に押し上げる。非置換アリールアジドは、２６０〜２８０ｎｍの範囲の吸収極大を有し、一方ヒドロキシおよびニトロアリールアジドは、３０５ｎｍを超える有効な光を吸収する。したがって、ヒドロキシおよびニトロアリールアジドは、非置換アリールアジドより、より有害でない光分解条件を親和性成分のために用いることを可能にするため、最も好ましい。
他の好ましい実施形態では、光活性化が可能な基は、フッ化アリールアジドから選択される。フッ化アリールアジドの光分解生成物は、アリールニトレンであり、これらはすべて、Ｃ−Ｈ結合挿入を含めたこの基の特徴的な反応を高効率で受ける（Ｋｅａｎａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：３６４０〜３６４７、１９９０年）。
他の実施形態では、光活性化が可能な基は、ベンゾフェノン残基から選択される。ベンゾフェノン試薬は一般に、アリールアジド試薬より高い架橋収率を生じる。
他の実施形態では、光活性化が可能な基は、光分解によって電子不足のカルベンを形成するジアゾ化合物から選択される。これらのカルベンは、Ｃ−Ｈ結合への挿入、（芳香族系を含めた）二重結合への付加、水素の吸引、および炭素イオンを生じさせる求核中心への配位を含めた種々の反応を受ける。
さらに他の実施形態では、光活性化が可能な基は、ジアゾピルベートから選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルジアゾピルベートのｐ−ニトロフェニルエステルは、脂肪族アミンと反応し、ジアゾピルビン酸アミドを生じ、これは紫外線による光分解を受けてアルデヒドを形成する。光分解されたジアゾピルベート修飾親和性成分は、架橋を形成するホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドと同様に反応するであろう。
ホモ二官能性試薬
１．第１級アミンと反応性のホモ二官能性架橋剤
アミン反応性架橋剤の合成、特性、および用途は、商業的に文献で記載されている（架橋の手順および試薬の概説は、上記を参照されたい）。多くの試薬が利用可能である（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ．）。
ホモ二官能性ＮＨＳエステルの好ましい非限定的例には、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタルタレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルタレート（スルホ−ＤＳＴ）、ビス−２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス−２−（スルホスクシンイミドオキシ−カルボニルオキシ）エチルスルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオネート（ＤＳＰ）、およびジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（スルホ−ＤＳＰ）が挙げられる。ホモ二官能性イミドエステルの好ましい非限定的例には、ジメチルマロンイミデート（ＤＭＭ）、ジメチルスクシンイミデート（ＤＭＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−オキシジプロピオンイミデート（ＤＯＤＰ）、ジメチル−３，３’−（メチレンジオキシ）ジプロピオンイミデート（ＤＭＤＰ）、ジメチル−，３’−（ジメチレンジオキシ）ジプロピオンイミデート（ＤＤＤＰ）、ジメチル−３，３’−（テトラメチレンジオキシ）−ジプロピオンイミデート（ＤＴＤＰ）、およびジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）が挙げられる。
好ましくは、ホモ二官能性イソチオシアネートの非限定的例には、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）、および４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン（ＤＩＤＳ）が挙げられる。
好ましくは、ホモ二官能性イソシアネートの非限定的例には、キシレン−ジイソシアネート、トルエン−２，４−ジイソシアネート、トルエン−２−イソシアネート−４−イソチオシアネート、３−メトキシジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネート、２，２’−ジカルボキシ−４，４’−アゾフェニルジイソシアネート、およびヘキサメチレンジイソシアネートが挙げられる。
好ましくは、ホモ二官能性ハロゲン化アリールの非限定的例には、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）、および４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニル−スルホンが挙げられる。
好ましくは、ホモ二官能性脂肪族アルデヒド試薬の非限定的例には、グリオキサール、マロンジアルデヒド、およびグルタルアルデヒドが挙げられる。
好ましくは、ホモ二官能性アシル化試薬の非限定的例には、ジカルボン酸のニトロフェニルエステルが挙げられる。
好ましくは、ホモ二官能性芳香族塩化スルホニルの非限定的例には、フェノール−２，４−ジスルホニルクロリド、およびα−ナフトール−２，４−ジスルホニルクロリドが挙げられる。
好ましくは、さらなるアミノ反応性ホモ二官能性試薬の非限定的例には、アミンと反応してビスカルバメートを生じるエリトリトールビスカーボネートが挙げられる。
２．遊離スルフヒドリル基と反応性のホモ二官能性架橋剤
このような試薬の合成、特性、および用途は、文献に記載されている（架橋の手順および試薬の概説は、上記を参照されたい）。試薬の多くは市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。
好ましくは、ホモ二官能性マレイミドの非限定的例には、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、Ｎ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−フェニレン）ビスマレイミド、アゾフェニルジマレイミド、およびビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテルが挙げられる。
好ましくは、ホモ二官能性ピリジルジスルフィドの非限定的例には、１，４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミドブタン（ＤＰＤＰＢ）が挙げられる。
好ましくは、ホモ二官能性ハロゲン化アルキルの非限定的例には、２，２’−ジカルボキシ−４，４’−ジヨードアセトアミドアゾベンゼン、α，α’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、α、α’−ジブロモ−ｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｂ−ブロモエチル）ベンジルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジ（ブロモアセチル）フェニルヒドラジン、および１，２−ジ（ブロモアセチル）アミノ−３−フェニルプロパンが挙げられる。
３．ホモ二官能性で光活性化が可能な架橋剤
このような試薬の合成、特性、および用途は、文献に記載されている（架橋の手順および試薬の概説は、上記を参照されたい）。試薬のいくつかは市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。
好ましくは、ホモ二官能性の光活性化が可能な架橋剤の非限定的例には、ビス−β−（４−アジドサリチルアミド）エチルジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ジ−Ｎ−（２−ニトロ−４−アジドフェニル）−シスタミン−Ｓ，Ｓ−二酸化物（ＤＮＣＯ）、および４，４’−ジチオビスフェニルアジドが挙げられる。
ヘテロ二官能性試薬
１．ピリジルジスルフィド部分を有するアミノ反応性ヘテロ二官能性試薬
このような試薬の合成、特性、および用途は、文献に記載されている（架橋の手順および試薬の概説は、上記を参照されたい）。試薬の多くは市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。
好ましくは、ピリジルジスルフィド部分およびアミノ反応性ＮＨＳエステルを有するヘテロ二官能性試薬の非限定的例には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル６−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサノエート（スルホ−ＬＣＳＰＤＰ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、およびスルホスクシンイミジル６−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミドヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）が挙げられる。
２．マレイミド部分を有するアミノ反応性ヘテロ二官能性試薬
このような試薬の合成、特性、および用途は、文献に記載されている。好ましくは、マレイミド部分およびアミノ反応性ＮＨＳエステルを有するヘテロ二官能性試薬の非限定的例には、スクシンイミジルマレイミジルアセテート（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル３−マレイミジルプロピオネート（ＢＭＰＳ）、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）、スクシンイミジル６−マレイミジルヘキサノエート（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル３−マレイミジルベンゾエート（ＳＭＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびスルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）が挙げられる。
３．ハロゲン化アルキル部分を有するアミノ反応性ヘテロ二官能性試薬
このような試薬の合成、特性、および用途は、文献に記載されている。好ましくは、ハロゲン化アルキル部分およびアミノ反応性ＮＨＳエステルを有するヘテロ二官能性試薬の非限定的例には、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル−６−（ヨードアセチル）アミノヘキサノエート（ＳＩＡＸ）、スクシンイミジル−６−（６−（（ヨードアセチル）−アミノ）ヘキサノイルアミノ）ヘキサノエート（ＳＩＡＸＸ）、スクシンイミジル−６−（（（４−（ヨードアセチル）−アミノ）−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノヘキサノエート（ＳＩＡＣＸ）、およびスクシンイミジル−４（（ヨードアセチル）−アミノ）メチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＩＡＣ）が挙げられる。
アミノ反応性ＮＨＳエステルおよびジハロゲン化アルキル部分を有するヘテロ二官能性試薬の一例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル２，３−ジブロモプロピオネート（ＳＤＢＰ）である。ＳＤＢＰは、そのアミノ基を結合することによって分子内架橋を親和性成分に導入する。ジブロモプロピオニル部分の第１級アミン基への反応性は、反応温度によって制御される（ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．７：５８１〜５９２（１９８８年））。
好ましくは、ハロゲン化アルキル部分およびアミノ反応性ｐ−ニトロフェニルエステル部分を有するヘテロ二官能性試薬の非限定的例には、ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）が挙げられる。
他の架橋剤は、当業者には公知である。例えば、Ｐｏｍａｔｏら、米国特許第５，９６５，１０６号を参照されたい。特定の用途のために適切な架橋剤を選択することは、当業者の能力の範囲内である。
開裂可能なリンカー基
さらなる実施形態では、リンカー基は、開裂し、糖残基から修飾基を放出することができる基を備える。多くの開裂可能な基は当技術分野において公知である。例えば、Ｊｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ７６１：１５２〜１６２（１９８３年）；Ｊｏｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４５１８〜１４５２５（１９９０年）；Ｚａｒｌｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：９１３〜９２０（１９８０年）；Ｂｏｕｉｚａｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５５：１４１〜１４７（１９８６年）；Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：２０５〜２１０（１９８６年）；Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８５９〜１８６７（１９８９年）を参照されたい。さらに、広範囲の開裂可能な二官能性（ホモ二官能性およびヘテロ二官能性の両方）のリンカー基は、Ｐｉｅｒｃｅなどの供給業者から市販されている。
例示的な開裂可能な部分は、光、熱またはチオール、ヒドロキシルアミン、塩基、過ヨウ素酸塩などの試薬を使用して開裂することができる。さらに、特定の好ましい基は、エンドサイトーシスが行われるのに応じてｉｎ ｖｉｖｏで開裂する（例えば、ｃｉｓ−アコニチル；Ｓｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８（１９９１年）を参照されたい）。好ましい開裂可能な基は、ジスルフィド、エステル、イミド、カーボネート、ニトロベンジル、フェナシルおよびベンゾイン基からなる群から選択されるメンバーである開裂可能な部分を含む。
本発明による特定の実施形態には、
Figure 2009544327
ならびにカーボネート、ならびに
Figure 2009544327
などのこれらの種の活性エステルが含まれる。
本発明の例示的な結合体
例示的な実施形態では、ポリペプチドはインターフェロンである。インターフェロンは、ヒトにおいて、ウイルスまたは２本鎖ＲＮＡによる誘導後にヒト初代線維芽細胞によって分泌される抗ウイルス性の糖タンパク質である。インターフェロンは、治療剤、例えば、抗ウイルス剤（例えば、Ｂ型およびＣ型肝炎）、抗腫瘍剤（例えば、肝細胞癌）として、ならびに多発性硬化症の治療において重要である。インターフェロン−αに関する参考文献については、Ａｓａｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２７（補足４）：Ｓ２１〜Ｓ２５（１９９１年）；Ｎａｇｙら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８（３）：４６７〜４７０（１９８８年）；Ｄｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ、３（１）：１３〜１９（１９８９年）；Ｈａｂｉｂら、Ａｍ．Ｓｕｒｇ．、６７（３）：２５７〜２６０（３／２００１）；およびＳｕｇｙｉａｍａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１７：９２１〜９２７（１９９３年）を参照されたい。インターフェロン−βについて考察する参考文献については、例えば、Ｙｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、６４（１）：９１〜１００（１９９６年）；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、６５（１）：５９〜６７（２００１年）；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｆｏｌｉａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、３９（２）：９１〜９３（２００１年）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、１８（１）：１〜２４（１９９６年）；Ｔａｋａｎｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２９４（２）：７４６〜７５２（２０００年）；Ｓｂｕｒｌａｔｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、１４：１８９〜１９２（１９９８年）；Ｄｏｄｄら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、７８７：１８３〜１８７（１９８４年）；Ｅｄｅｌｂａｕｍら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、１２：４４９〜４５３（１９９２年）；Ｃｏｎｒａｄｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２（３０）：１４６００〜１４６０５（１９８７年）；Ｃｉｖａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７３：３１１〜３１６（１９８８年）；Ｄｅｍｏｌｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２：１７９〜１８９（１９９４年）；Ｓｅｄｍａｋら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、９（補足１）：Ｓ６１〜Ｓ６５（１９８９年）；Ｋａｇａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３（３３）：１７５０８〜１７５１５（１９８８年）；Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎら、米国特許第４，８９４，３３０号；Ｊａｙａｒａｍら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、３（２）：１７７〜１８０（１９８３年）；Ｍｅｎｇｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ．、６６：３９１〜４０１（１９８７年）；Ｖｏｎｋら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、３（２）：１６９〜１７５（１９８３年）；およびＡｄｏｌｆら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、１０：２５５〜２６７（１９９０年）を参照されたい。
例示的インターフェロン結合体において、インターフェロンα、例えば、インターフェロンα２ｂおよび２ａは、損傷のないグリコシルリンカーを介して水溶性ポリマーに結合している。
さらなる例示的な実施形態では、本発明は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の結合体を提供する。Ｇ−ＣＳＦは、神経新生前駆細胞の機能的に成熟した好中球への増殖、分化および活性化を刺激する糖タンパク質である。注入されたＧ−ＣＳＦは、急速に体内から除去される。例えば、Ｎｏｈｙｎｅｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３９：２５９〜２６６（１９９７年）；Ｌｏｒｄら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７（７）：２０８５〜２０９０（０７／２００１年）；Ｒｏｔｏｎｄａｒｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１（２）：１１７〜１２８（１９９９年）；およびＢｏｎｉｇら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２８：２５９〜２６４（２００１年）を参照されたい。
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦの修飾方法を包含する。ＧＭ−ＣＳＦは、活性化Ｔ細胞、マクロファージ、内皮細胞、および間質性線維芽細胞によって産生されるサイトカインとして当技術分野で周知である。ＧＭ−ＣＳＦは、主として骨髄に作用し、炎症性白血球の産生を増加させ、炎症性作用の間に消費される好中球の補充を開始させる内分泌性ホルモンとしてもさらに機能する。さらなるＧＭ−ＣＳＦは、マクロファージ活性化因子であり、ランゲルハンス細胞の樹状細胞への分化を促進する。Ｇ−ＣＳＦと同様に、ＧＭ−ＣＳＦも、化学療法後の骨髄置換において臨床用途を有する。
核酸
他の態様では、本発明は、本発明のシークオンポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。シークオンポリペプチドは、そのアミノ酸配列中に１つまたは複数の本発明の外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む。一実施形態では、本発明の核酸は発現ベクターの一部である。他の関連する実施形態では、本発明は、本発明の核酸を含む細胞を提供する。例示的な細胞には、大腸菌の様々な系統、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞などの宿主細胞が含まれる。
医薬組成物
本発明のポリペプチド結合体は、広範囲の医薬品への用途を有する。例えば、糖結合エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、一般的な貧血、再生不良性貧血、化学療法により誘発された傷害（骨髄傷害など）、慢性腎不全、腎炎、およびサラセミアを治療するために使用することができる。修飾されたＥＰＯは、脳／脊椎傷害、多発性硬化症、およびアルツハイマー病などの神経障害を治療するためにさらに使用することができる。
第２の例は、ＡＩＤＳおよびＢ型またはＣ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＢＶ）、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）などの種々のウイルスに起因するウイルス感染；ヘアリーセル白血病、ＡＩＤＳ−関連カポジ肉腫、悪性黒色腫、濾胞性非ホジキンリンパ腫、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、腎臓癌、骨髄腫、慢性骨髄性白血病、頭頸部癌、骨癌などの癌；ならびに子宮頚部異形成；および多発性硬化症などの中枢神経系（ＣＮＳ）の障害を治療するために使用することができるインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）である。さらに、本発明の方法によって修飾されたＩＦＮ−αは、シェーグレン症候群（自己免疫疾患）、ベーチェット病（自己免疫性炎症性疾患）、線維筋痛症（筋骨格系の疼痛／疲労を伴う障害）、アフタ性潰瘍（口内びらん）、慢性疲労症候群、および肺線維症などの各種の他の疾患および状態を治療するために有用である。
他の例は、多発性硬化症（再発／寛解型または慢性進行型）などのＣＮＳ障害；ＡＩＤＳおよびＢ型またはＣ型肝炎；ヒトパピローマウイルス（ＨＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）などの種々のウイルスに起因するウイルス感染；耳感染症、筋骨格感染症；ならびに乳癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、頭頚部癌、基底細胞癌、子宮頚部異形成、黒色腫、皮膚癌、および肝臓癌を含めた癌を治療するために有用であるインターフェロン−βである。本発明の方法によって修飾されたＩＦＮ−βはまた、移植片拒絶（例えば、骨髄移植）、ハンチントン舞踏病、大腸炎、脳炎、肺線維症、黄斑変性症、肝硬変、および角結膜炎などの他の疾患および状態を治療するためにも使用される。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）はさらなる例である。本発明の方法によって修飾されたＧ−ＣＳＦは、癌を治療するための化学療法における補助剤、ならびに特定の医療処置に関連する状態または合併症、例えば、化学療法によって誘発された骨髄傷害、白血球減少症（全般的）、化学療法によって誘発された発熱性好中球減少症、骨髄移植と関連する好中球減少症、および重症慢性好中球減少症を予防しまたは軽減するための補助剤として使用することができる。修飾されたＧ−ＣＳＦはまた、移植；末梢血細胞動員；骨髄機能廃絶化学療法または骨髄抑制化学療法を受ける予定の患者において採取するための末梢血前駆細胞動員；および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のための導入／強化療法後の好中球減少症、発熱、抗生物質使用、入院の期間の減少のためにも使用することができる。喘息およびアレルギー性鼻炎を含めた他の状態または障害を、修飾されたＧ−ＣＳＦで治療することができる。
１つのさらなる例として、本発明の方法によって修飾されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、小人症、小児および大人の低身長、カヘキシー／筋肉疲労、全身性筋萎縮症、および性染色体異常（例えば、ターナー症候群）などの成長に関連した状態を治療するために使用することができる。修飾されたｈＧＨを使用して治療することのできる他の状態には、短腸症候群、リポジストロフィー、骨粗鬆症、***、火傷、女性の不妊症、骨再生、一般の糖尿病、ＩＩ型糖尿病、骨関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および不眠症が挙げられる。さらに、修飾されたｈＧＨはまた、様々なプロセス、例えば、全組織の再生、骨再生、および創傷治癒などを促進するために、またはワクチン補助剤として使用することができる。
したがって、他の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つのポリペプチドまたはポリペプチド結合体、および薬学的に許容できる希釈剤、担体、ビヒクル、添加剤またはこれらの組合せを含む医薬組成物を提供する。例示的な実施形態では、医薬組成物は、水溶性ポリマー（例えば、非天然水溶性ポリマー）と本発明のグリコシル化または非グリコシル化ポリペプチドとの間の共有結合体、および薬学的に許容できる希釈剤を含む。例示的な水溶性ポリマーには、ポリ（エチレングリコール）およびメトキシ−ポリ（エチレングリコール）が挙げられる。代わりに、ポリペプチドは、治療的部分または生体分子などのポリ（エチレングリコール）誘導体以外の修飾基に結合する。修飾基は、ポリペプチドおよび修飾基の両方の間に介在しかつ共有結合している損傷のないグリコシル連結基を介してポリペプチドに結合する。他の例示的な実施形態では、
本発明の医薬組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用に適切である。本発明に使用するための適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５年）に見出される。薬物送達方法の概説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０年）を参照されたい。
医薬組成物は、例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋内の投与を含めた任意の適切な投与方法のために製剤することができる。皮下注射などの非経口投与のために、担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含むことが好ましい。経口投与のために、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムなどの上記の担体または固体担体のいずれかを用いることができる。ミクロスフィア（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）などの生分解性マトリックスも、本発明の医薬組成物のための担体として用いることができる。適切な生分解性ミクロスフィアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および同第５，０７５，１０９号に開示されている。
通常、医薬組成物は、皮下または非経口的に、例えば、静脈内に投与される。したがって、本発明は、許容できる担体、好ましくは水性担体、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳなどに溶解または懸濁した化合物を含む、非経口投与のための組成物を提供する。組成物はまた、Ｔｗｅｅｎ２０およびＴｗｅｅｎ８０などの界面活性剤；マンニトール、ソルビトール、スクロース、およびトレハロースなどの安定剤；ならびにＥＤＴＡおよびメタクレゾールなどの保存料も含有することができる。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、界面活性剤などの、生理条件に近づけるのに必要な薬学的に許容できる補助物質を含有することができる。
これらの組成物は、従来の滅菌法によって滅菌することができ、または滅菌濾過することができる。このように得られた水溶液は、そのまま使用するために包装することができ、または凍結乾燥し、凍結乾燥した調製品を投与前に無菌水性担体と混合することができる。調製のｐＨは典型的には、３〜１１、さらに好ましくは５〜９、最も好ましくは７〜８であろう。
いくつかの実施形態では、本発明の糖ペプチドは、標準的な小胞を形成する脂質から形成されたリポソームに組み込むことができる。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０年）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号および同第４，８３７，０２８号に記載されているように、リポソームを調製するために種々の方法が使用可能である。種々の標的化物質（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を使用したリポソームの標的化は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照されたい）。
標的化物質をリポソームにカップリングするための標準的方法を使用することができる。これらの方法は一般に、標的化物質の結合のために活性化することができるホスファチジルエタノールアミンなどの脂質成分、または本発明の脂質誘導体化された糖ペプチドなどの誘導体化された親油性化合物の、リポソームへの組込みを伴う。
標的化の機構は一般に、標的部分が標的、例えば、細胞膜受容体との相互作用に利用可能となるように、標的化物質がリポソームの表面に位置していることを必要とする。リポソームが形成される前に、本発明の炭水化物は、当業者に公知の方法（例えば、炭水化物上に存在するヒドロキシル基の、各々長鎖ハロゲン化アルキルまたは脂肪酸によるアルキル化またはアシル化）を使用して脂質分子に結合することができる。代わりに、膜の形成時に連結部分が最初に膜に組み込まれるような方法で、リポソームを作製してもよい。連結部分は、膜にしっかりと埋め込まれ固定された親油性部分を有さなければならない。それはまた、リポソームの水性表面上で化学的に利用可能な反応性部分を有さなければならない。反応性部分は、後で加えられる標的化物質または炭水化物と共に安定的な化学結合を形成するのに化学的に適切であるように選択する。ある場合には、標的剤を連結分子に直接結合することが可能であるが、ほとんどの場合、化学架橋として作用する第３の分子を使用し、それによって膜中にある連結分子と、小胞の表面から三次元的に伸長している標的剤または炭水化物とを連結することがより適切である。
本発明の方法によって調製される化合物は、診断薬としても有用である場合がある。例えば、炎症を有することが疑われる患者における炎症または腫瘍転移の領域の場所をつきとめるために標識化合物を使用することができる。この使用のために、化合物は、１２５Ｉ、１４Ｃ、またはトリチウムで標識することができる。
本発明の範囲を制限することは意図しないが、上記の実施形態（例えば、シークオンポリペプチド、ポリペプチド結合体、ポリペプチドのライブラリー、医薬組成物、ポリペプチドをコードする核酸などの組成物に関するもの）の各々において、下記の例示的な実施形態が一般に好ましい。親ポリペプチドがグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）である例示的な一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱ、ＰＴＴ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＧ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡＹ、ＰＴＴＬＹ、ＰＴＧＳＬＰ、ＰＴＴＳＥＰ、ＰＴＡＶＩＰ、ＰＴＳＧＥＰ、ＰＴＴＬＹＰ、ＰＴＶＬＰ、ＴＥＴＰ、ＰＳＤＧＰおよびＰＴＥＶＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＧＬＰ−１である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱ、ＰＴＴ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＧ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡＹ、ＰＴＴＬＹ、ＰＴＧＳＬＰ、ＰＴＴＳＥＰ、ＰＴＡＶＩＰ、ＰＴＳＧＥＰ、ＰＴＴＬＹＰ、ＰＴＶＬＰ、ＴＥＴＰ、ＰＳＤＧＰおよびＰＴＥＶＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＧＬＰ−１である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型Ｇ−ＣＳＦポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＱ、ＰＴＴ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＧ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡＹ、ＰＴＴＬＹ、ＰＴＧＳＬＰ、ＰＴＴＳＥＰ、ＰＴＡＶＩＰ、ＰＴＳＧＥＰ、ＰＴＴＬＹＰ、ＰＴＶＬＰ、ＴＥＴＰ、ＰＳＤＧＰおよびＰＴＥＶＰから選択されないことが好ましい。
親ポリペプチドがＧ−ＣＳＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＡＰＴＰおよびＰＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型Ｇ−ＣＳＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＡＰＴＰおよびＰＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型Ｇ−ＣＳＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型Ｇ−ＣＳＦポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＡＰＴＰおよびＰＴＰから選択されないことが好ましい。
親ポリペプチドがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＶＬＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＬＹＶ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＱＡおよびＴＥＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ｈＧＨである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＬＹＶ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡおよびＴＥＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ｈＧＨであるさらに他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型ｈＧＨポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＬＹＶ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡおよびＴＥＴＰから選択されないことが好ましい。
親ポリペプチドがＩＮＦ−αである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、好ましくはＴＥＴＰではない。親ポリペプチドが野生型ＩＮＦ−αである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、好ましくはＴＥＴＰではない。親ポリペプチドが野生型ＩＮＦ−αであるさらに他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型ＩＮＦ−αポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、好ましくはＴＥＴＰではない。
親ポリペプチドがＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１）である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＰ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＳＡＶおよびＰＴＳＡＶＡＡから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＦＧＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＰ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＳＡＶおよびＰＴＳＡＶＡＡから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＦＧＦであるさらに他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型ＦＧＦポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＰ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＳＡＶおよびＰＴＳＡＶＡＡから選択されないことが好ましい。
Ｖ．方法
グリコシルトランスフェラーゼの基質としてのシークオンポリペプチドの同定
グリコシル化反応に供された場合、満足のいく収率でグリコシル化することができるシークオンポリペプチドの同定のための１つの戦略は、シークオンポリペプチドのライブラリーを調製し（各シークオンポリペプチドは少なくとも１つの本発明のＯ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を含む）、各シークオンポリペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼの効率的な基質として機能する能力について試験することである。シークオンポリペプチドのライブラリーは、選択した本発明のＯ−結合型またはＳ−結合型グリコシル化配列を親ポリペプチドのアミノ酸配列中の異なる位置に含むことによって作製することができる。
シークオンポリペプチドのライブラリー
一態様によれば、本発明は、シークオンポリペプチドの１つまたは複数のライブラリーを生じさせる方法を提供し、このシークオンポリペプチドは、親ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）に相当する。一実施形態では、親ポリペプチドは、ｍアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列中の各アミノ酸位置は、（ＡＡ）ｎ（ｎは１〜ｍから選択されるメンバーである）で表される。シークオンポリペプチドのライブラリーを生じさせる例示的な方法は、（ｉ）本発明のＯ−結合型グリコシル化配列を親ポリペプチド中の第１のアミノ酸位置（ＡＡ）ｎに導入することによって、第１のシークオンポリペプチドを（例えば、組換えによって、化学的または他の手段によって）生成するステップと、（ｉｉ）Ｏ−結合型グリコシル化配列をさらなるアミノ酸位置に導入することによって、少なくとも１つのさらなるシークオンポリペプチドを生成するステップとを含む。一実施形態では、さらなるアミノ酸位置は、（ＡＡ）ｎ＋ｘである。他の実施形態では、さらなるアミノ酸位置は、（ＡＡ）ｎ−ｘである。これらの実施形態において、ｘは、１〜（ｍ−ｎ）から選択されるメンバーである。一実施形態では、さらなるシークオンポリペプチドは、同一のＯ−結合型グリコシル化配列を第１のシークオンポリペプチドとして含む。他の実施形態では、さらなるシークオンポリペプチドは、第１のシークオンポリペプチドとは異なるＯ−結合型グリコシル化配列を含む。例示的な実施形態では、シークオンポリペプチドのライブラリーは、本明細書で上記に記載する「シークオンスキャニング」によって作製される。本発明のライブラリーにおいて有用な例示的な親ポリペプチドおよびＯ−結合型グリコシル化配列も、本明細書に記載する。
リードポリペプチドの同定
酵素によるグリコシル化および／またはグリコＰＥＧ化反応に供された場合、効果的にグリコシル化および／またはグリコＰＥＧ化されるポリペプチドを、ライブラリーのメンバーから選択することが望ましい場合がある。効果的にグリコシル化および／またはグリコＰＥＧ化されることが見出されるシークオンポリペプチドは、「リードポリペプチド」と称される。例示的な実施形態では、酵素によるグリコシル化またはグリコＰＥＧ化反応の収率は、１種または複数のリードポリペプチドを選択するために使用される。他の例示的な実施形態では、リードポリペプチドについての酵素によるグリコシル化またはグリコＰＥＧ化の収率は、約１０％〜約１００％、好ましくは約３０％〜約１００％、さらに好ましくは約５０％〜約１００％、最も好ましくは約７０％〜約１００％である。グリコシル化リードポリペプチドを他の酵素によるグリコシル化またはグリコＰＥＧ化反応に供することによって、効率的にグリコシル化されることができるリードポリペプチドをさらに評価してもよい。
したがって、本発明は、ポリペプチドを同定する方法を提供する。例示的な方法は、（ｉ）本発明のシークオンポリペプチドのライブラリーを生成するステップと、（ｉｉ）ライブラリーの少なくとも１つのメンバーを酵素によるグリコシル化反応（または場合により酵素によるグリコＰＥＧ化反応）に供するステップとを含む。一実施形態では、この反応の間に、グリコシル部分は、グリコシル供与体分子から少なくとも１つのＯ−結合型グリコシル化配列に転移され、このグリコシル部分は、修飾基によって誘導体化されていてもよい。この方法には、（ｉｉｉ）ライブラリーの少なくとも１つのメンバーについての酵素によるグリコシル化またはグリコＰＥＧ化反応の収率を測定するステップをさらに含んでもよい。当技術分野において公知の任意の方法および本明細書の下記に記載する方法を使用して、測定を行うことができる。この方法には、ステップ（ｉｉ）の前に、（ｉｖ）ライブラリーの少なくとも１つのメンバーを精製するステップをさらに含んでもよい。
ステップ（ｉｉ）の転移されたグリコシル部分は、単糖およびオリゴ糖、ならびにグリコシル模倣基を含めた任意のグリコシル部分でよい。例示的な実施形態では、最初のグリコシル化反応においてシークオンポリペプチドの付加されるグリコシル部分は、Ｇａｌ部分である。他の例示的な実施形態では、グリコシル部分はＧａｌＮＡｃ部分である。引き続くグリコシル化反応を用いて、さらなるグリコシル残基（例えば、Ｇａｌ）をこのように得られたＧａｌＮＡｃ−ポリペプチドに付加することができる。修飾基は、ｍＰＥＧなどの水溶性ポリマーを含めた本発明の任意の修飾基でよい。一実施形態では、ステップ（ｉｉ）の酵素によるグリコシル化反応は、ポリペプチドが発現している宿主細胞において起こる。他の実施形態では、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉ）は、同一の反応容器で行われる。この方法には、（ｖ）ステップ（ｉｉ）の生成物をＰＥＧ化反応に供するステップをさらに含んでもよい。一実施形態では、ＰＥＧ化反応は、酵素によるグリコＰＥＧ化反応である。他の実施形態では、ＰＥＧ化反応は、化学的ＰＥＧ化反応である。この方法には、（ｖｉ）ＰＥＧ化反応の収率を測定するステップをさらに含んでもよい。ＰＥＧ化反応の収率を測定するのに有用な方法を、下記に記載する。この方法には、（ｖｉｉ）シークオンポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを作製するステップをさらに含んでもよい。この方法には、（ｖｉｉｉ）宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップをさらに含んでもよい。
（任意のリードポリペプチドを含めた）シークオンポリペプチドの作製方法は、当技術分野において公知である。例示的な方法を本明細書に記載する。この方法には、（ｉ）シークオンポリペプチドに相当する核酸配列を含む発現ベクターを作製するステップを含んでもよい。この方法には、（ｉｉ）宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップをさらに含んでもよい。この方法には、（ｉｉｉ）シークオンポリペプチドを宿主細胞中で発現させるステップをさらに含むことができる。この方法には、（ｉｖ）シークオンポリペプチドを単離するステップをさらに含んでもよい。この方法には、（ｖ）例えばＧａｌＮＡｃ−Ｔ２などのグリコシルトランスフェラーゼを使用して、Ｏ−結合型グリコシル化配列においてシークオンポリペプチドを酵素によってグリコシル化するステップをさらに含んでもよい。対象とするシークオンポリペプチド（例えば、選択したリードポリペプチド）は、工業規模で発現させることができる（例えば、２５０ｍｇ超、好ましくは５００ｍｇ超のタンパク質の単離をもたらす）。シークオンポリペプチド
例示的な実施形態では、シークオンポリペプチドのライブラリーの各メンバーは、酵素によるグリコシル化反応に供される。例えば、各シークオンポリペプチドは、別々にグリコシル化反応に供され、グリコシル化反応の収率は、１種または複数の選択した反応条件によって決定される。
例示的な実施形態では、ライブラリーの１つまたは複数のシークオンポリペプチドは、グリコシル化および／またはグリコＰＥＧ化などのさらなる処理の前に精製される。
他の例では、シークオンポリペプチドの群は、混合することができ、シークオンポリペプチドのこのように得られた混合物は、グリコシル化またはグリコＰＥＧ化反応に供することができる。例示的な一実施形態では、ライブラリーのすべてのメンバーを含有する混合物を、グリコシル化反応に供する。一例では、この実施形態によると、グリコシル供与体試薬を、（存在するグリコシル化部位に対して）化学量論量未満でグリコシル化反応混合物に加え、シークオンポリペプチドが酵素の基質として競合する環境を生じることができる。次いで、事前にグリコシル化混合物の分離または精製をしてもしなくても、酵素の基質であるそれらのシークオンポリペプチドは、例えばマススペクトル分析に基づいて同定することができる。この同じアプローチは、各々が本発明の異なるＯ−結合型グリコシル化配列を含有するシークオンポリペプチドの群に使用することができる。
酵素によるグリコシル化反応、酵素によるグリコＰＥＧ化反応または化学的グリコＰＥＧ化反応の収率は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して決定することができる。例示的な実施形態では、グリコシル化またはグリコＰＥＧ化ポリペプチドと、未反応（例えば、非グリコシル化または非グリコＰＥＧ化）ポリペプチドとを区別するのに使用される方法は、質量分析（例えば、ＬＣ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を伴う技術を使用して決定する。他の例示的な実施形態では、ゲル電気泳動を伴う技術を使用して収率を決定する。さらに他の例示的な実施形態では、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を伴う技術を使用して収率を決定する。さらなる例示的な実施形態では、ＨＰＬＣまたはＧＣなどのクロマトグラフィーを伴う技術を使用して収率を決定する。一実施形態では、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）を使用して、いくつかのグリコシル化反応を並行して行う。プレートは、各ウェルの底に分離培地または濾過培地（例えば、ゲル−濾過膜）を備えてもよい。質量分析または他の手段による分析の前に、各試料を予め調整するために旋回を用いることができる。
宿主細胞内のグリコシル化
本発明のシークオンポリペプチドの一部である変異Ｏ−結合型グリコシル化配列の最初のグリコシル化は、ポリペプチドが発現している宿主細胞中でも起こる場合がある。この技術は、例えば２００６年９月６日に出願された米国特許仮出願第６０／８４２，９２６号（参照により本明細書中にその全体が組み込まれている）に記載されている。宿主細胞は、大腸菌またはシュードモナス菌株などの原核微生物でよい）。例示的な実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｘＢ ｇｏｒ ｓｕｐｐ変異大腸菌細胞である。
他の例示的な実施形態では、細胞内のグリコシル化は、ポリペプチドと、そのポリペプチドを基質として使用することができかつ宿主細胞内でポリペプチドを細胞内グリコシル化することができる酵素とを共発現させ、糖部分のグリコシル化配列への細胞内転移を可能とする条件下で宿主細胞を増殖させることによって達成される。例示的酵素は、「活性化ヌクレオチド糖：ポリペプチドグリコシルトランスフェラーゼタンパク質」（例えば、可溶性で活性の真核生物のＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ）である。他の例示的な実施形態では、シークオンポリペプチドが発現している微生物は、細胞内酸化環境を有する。微生物は、細胞内酸化環境を有するように遺伝子操作することができる。細胞内グリコシル化は、単一のグリコシル残基の転移に限定されない。いくつかのグリコシル残基を、必要とされる酵素の共発現および各々のグリコシル供与体の存在によって順次に付加することができる。このアプローチはまた、商業規模でシークオンポリペプチドを製造するのに使用することができる。
宿主細胞内の変異Ｏ−結合型グリコシル化配列中でシークオンポリペプチドが効率的にグリコシル化されているか否かを決定する方法が利用可能である。例えば、（１つまたは複数の精製ステップ後の）細胞ライセートを、質量分析によって分析し、グリコシル化シークオンポリペプチドと非グリコシル化シークオンポリペプチドとの比を測定する。他の例では、グリコシル化ポリペプチドを非グリコシル化ポリペプチドから分離するゲル電気泳動によって、細胞ライセートを分析する。
リードポリペプチドのさらなる評価
最初のスクリーニング手順が、修飾されていないグリコシル部分を使用した酵素によるグリコシル化（例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２によるＧａｌＮＡｃ部分の転移）を伴う一実施形態では、選択したリードポリペプチドは、例えば他の酵素反応または化学修飾によるさらなる修飾のための効率的な基質である能力についてさらに評価することができる。例示的な実施形態では、引き続く「スクリーニング」は、グリコシル化リードポリペプチドを他のグリコシル化反応（例えば、Ｇａｌの付加）および／またはＰＥＧ化反応に供することを伴う。
ＰＥＧ化反応は、例えば、化学的ＰＥＧ化反応または酵素によるグリコＰＥＧ化反応の場合がある。効率的にグリコＰＥＧ化されたリードポリペプチドを同定するために、（予めグリコシル化されていてもよい）少なくとも１つのリードポリペプチドをＰＥＧ化反応に供し、この反応の収率を決定する。一例では、各リードポリペプチドのＰＥＧ化収率を決定する。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化反応の収率は、約１０％〜約１００％、好ましくは約３０％〜約１００％、さらに好ましくは約５０％〜約１００％、最も好ましくは約７０％〜約１００％である。ＰＥＧ化収率は、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｑ−ＴＯＦ）、（例えば、デンシトメトリーなどの定量化のための手段と組み合わせた）ゲル電気泳動、ＮＭＲ技術、ならびに分析するポリペプチドのＰＥＧ化種と非ＰＥＧ化種との分離に有用な適切なカラム材料を使用するＨＰＬＣなどのクロマトグラフ法などの、ポリペプチド分析に適切な任意の当技術分野において公知の分析方法を使用して決定することができる。上記のようにグリコシル化のために、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）を使用して、いくつかのＰＥＧ化反応を平行して行うことができる。プレートは、各ウェルの底に分離培地または濾過培地（例えば、ゲル−濾過膜）を備えてもよい。質量分析または他の手段による分析の前に、各試料を予め調整するために旋回および再構成を用いることができる。
他の例示的な実施形態では、シークオンポリペプチドのグリコシル化およびグリコＰＥＧ化は、下記で説明するように「ワンポット反応」で起こる。一例では、シークオンポリペプチドを、第１の酵素（例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）および適切な供与体分子（例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）と接触させる。第２の酵素（例えば、コア−１−ＧａｌＴ１）および第２のグリコシル供与体（例えば、ＵＤＰ−Ｇａｌ）を加える前に、混合物を適切な時間インキュベートする。任意の数のさらなるグリコシル化／グリコＰＥＧ化反応をこの様式で行うことができる。代わりに、複数の酵素および複数のグリコシル供与体を変異ポリペプチドと接触させて、１つの反応段階で複数のグリコシル残基を付加することができる。例えば、変異ポリペプチドを、適切な緩衝系中で３種の異なる酵素（例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、コア−１−ＧａｌＴ１およびＳＴ３Ｇａｌ１）、ならびに３種の異なるグリコシル供与体部分（例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌおよびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ）と接触させ、ポリペプチド−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧなどのグリコＰＥＧ化変異ポリペプチドを生じさせる（実施例４．６を参照されたい）。上記の方法を使用して全収率を決定することができる。
ポリペプチド結合体の形成
他の態様では、本発明は、修飾基とポリペプチドとの間に共有結合体を形成する方法を提供する。本発明のポリペプチド結合体は、グリコシル化または非グリコシル化ポリペプチドと、水溶性ポリマー、治療的部分、生体分子、診断的部分、標的化部分などの多様な種との間に形成される。ポリマー、治療的部分または生体分子は、ポリペプチドおよび修飾基（例えば、水溶性ポリマー）の両方の間に介在しかつ共有結合しているグリコシル連結基を介してポリペプチドに結合している。修飾された糖の糖部分は、ヌクレオチド糖、活性化糖、およびヌクレオチドでもなく活性化もしていない糖から選択することが好ましい。
例示的な実施形態では、ポリペプチド結合体は、修飾された糖のポリペプチドへの酵素的結合によって形成される。修飾された糖は、Ｏ−結合型グリコシル化配列に直接付加されるか、または直接的もしくは間接的に（例えば、１つまたは複数のグリコシル残基を介して）Ｏ−結合型グリコシル化配列に結合しているグリコシル残基に直接付加される。
本発明のポリペプチド結合体を作製する例示的な方法は、（ｉ）本発明のＯ−結合型グリコシル化配列を含むシークオンポリペプチドを組換えで生成するステップと、（ｉｉ）Ｏ−結合型グリコシル化配列においてシークオンポリペプチドを酵素によってグリコシル化するステップとを含む。例示的な実施形態では、この方法は、変異ポリペプチドと、グリコシル供与体（例えば、修飾された糖）およびグリコシル供与体が基質であるグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）などの酵素を含有する混合物とを接触させるステップを含む。酵素がグリコシル部分とポリペプチドとの間に共有結合を形成するのに適切な条件下で、反応を起こす。
グリコシルトランスフェラーゼなどの酵素の精巧な選択性を使用して、本方法は、１つまたは複数の特異的位置に修飾基を有するポリペプチドを提供する。したがって、本発明によると、修飾された糖は、ポリペプチド鎖内のＯ−結合型グリコシル化配列に直接結合しているか、代わりに修飾された糖は、糖ペプチドの炭水化物部分上に付加している。修飾された糖が、グリコシル化部位と直接ポリペプチド骨格のアミノ酸残基との両方に結合しているポリペプチドも本発明の範囲内である。
公知の化学的および酵素的ペプチド合成戦略と対照的に、本発明の方法は、実質的に均質な誘導体化パターンを有するポリペプチドおよび糖ペプチドを構築することを可能にする。本発明に使用される酵素は、ポリペプチドの特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基の組合せに対して一般に選択的である。本発明の方法はまた、修飾されたポリペプチドおよび糖ペプチドの大規模な製造のための実用的手段を提供する。
例示的な実施形態では、ポリペプチドは、下記の方法で、水溶性ポリマーによってＯ−グリコシル化され官能化される。ポリペプチドは、利用可能なＯ−結合型グリコシル化配列を伴って生成される。ＧａｌＮＡｃを、グリコシル化配列中のセリンまたはスレオニン残基に付加し、このように得られたＧａｌＮＡｃ−ペプチドを、ＳＴ６Ｇａｌ−１を使用してシアル酸修飾基カセットでシアリル化する。代わりに、ＧａｌＮＡｃ−ペプチドをコア−１−ＧａｌＴ−１を使用してガラクトシル化し、産物を、ＳＴ３Ｇａｌ−１を使用してシアル酸修飾基カセットでシアリル化する。本発明による例示的結合体は、下記の連結を有する。Ｔｈｒ−α−１−ＧａｌＮＡｃ−β−１，３−Ｇａｌ−α２，３−Ｓｉａ＊（Ｓｉａ＊はシアル酸修飾基カセットである）。
グリコシル化ステップは、別々に行うことができ、または多数の酵素およびサッカリル供与体を使用して「シングルポット」反応において合わせることができる。例えば、上記の３種の酵素反応において、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧａｌＴおよびＳｉａＴ、ならびに各々のグリコシル供与体分子を、単一の容器中で合わせることができる。代わりに、ＧａｌＮＡｃ反応を最初に行い、ＧａｌＴおよびＳｉａＴならびに適切なサッカリル供与体の両方を引き続き付加することができる。他の例は、各酵素および適切なグリコシル供与体を順次に付加し、反応を「シングルポット」モチーフで行うことを伴う。上記の方法の組合せも、本発明の化合物の調製に有用である。
本発明の結合体において、Ｓｉａ修飾基カセットは、α−２，６、またはα−２，３連結でＧａｌに連結することができる。
本発明は、１つまたは複数の選択したグリコシル残基をポリペプチドに付加（または除去）し、その後は修飾された糖をポリペプチドの選択したグリコシル残基の少なくとも１つに結合する手段も提供する。例えば、修飾された糖を、ポリペプチド上に存在しないかまたは所望の量で存在しない選択したグリコシル残基に結合することが所望である場合、本実施形態は有用である。したがって、修飾された糖をポリペプチドにカップリングする前に、選択したグリコシル残基を、酵素的または化学的カップリングによってポリペプチドに結合させる。他の実施形態では、修飾された糖の結合の前に、糖ペプチドのグリコシル化パターンを、糖ペプチドからの炭水化物残基の除去によって変化させる。例えば、ＷＯ９８／３１８２６を参照されたい。
糖ペプチド上にある任意の炭水化物部分の付加または除去は、化学的または酵素的に行われる。化学的脱グリコシル化は、ポリペプチドをトリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物にさらすことによって行われることが好ましい。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除いた大部分またはすべての糖の開裂をもたらし、一方ポリペプチドは損傷のないままである。化学的脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７年）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１年）によって記載されている。ポリペプチドバリアント上の炭水化物部分の酵素による開裂は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７年）に記載されたように種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用して行うことができる。
グリコシル部分の化学的付加は、任意の当技術分野において認められた方法によって行われる。糖部分の酵素による付加は、本発明に使用される修飾された糖を天然グリコシルユニットによって置換する、本明細書に記載した方法の変形形態を使用して行われるのが好ましい。糖部分を付加する他の方法は米国特許第５，８７６，９８０号、同第６，０３０，８１５号、同第５，７２８，５５４号および同第５，９２２，５７７号に開示されている。本発明に有用な例示的な方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０、およびＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）に記載されている。
２つ以上のポリペプチドを含むポリペプチド結合体
リンカーアームを介して一緒に連結した２つ以上のポリペプチドを含む結合体、すなわち多官能性結合体も提供し、少なくとも１つのポリペプチドは、Ｏ−グリコシル化され、または変異Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む。本発明の多官能性結合体は、同一のポリペプチドの２つ以上のコピー、または異なる構造および／もしくは特性を有する多様なポリペプチドのコレクションを含むことができる。この実施形態による例示的な結合体では、２つのポリペプチドの間のリンカーは、Ｏ−結合型グリコシル、損傷のないグリコシル連結基などのＯ−結合型グリコシル残基を介してポリペプチドの少なくとも１つに結合している。
一実施形態では、本発明は、連結基を介して２つ以上のポリペプチドを連結する方法を提供する。連結基は任意の有用な構造であり、直鎖および分枝鎖状構造から選択することができる。好ましくは、ポリペプチドに結合しているリンカーの各末端は、修飾された糖（すなわち、新生の損傷のないグリコシル連結基）を含む。
本発明の例示的方法では、２つのポリペプチドは、ＰＥＧリンカーを含むリンカー部分を介して共に連結している。構築体は、上記の図に記載されている一般構造に従う。本明細書に記載するように、本発明の構築体は、２つの損傷のないグリコシル連結基（すなわち、ｓ＋ｔ＝１）を含む。２つのグリコシル基を含むＰＥＧリンカーの焦点は、明確にすることを目的とし、本発明のこの実施形態において有用なリンカーアームの本質を限定するものと解釈すべきではない。
したがって、ＰＥＧ部分は、第１の末端で第１のグリコシルユニットによって官能化され、第２の末端で第２のグリコシルユニットによって官能化される。第１および第２のグリコシルユニットは好ましくは、異なるトランスフェラーゼの基質であり、第１および第２のポリペプチドが各々第１および第２のグリコシルユニットへ垂直に結合することを可能にする。実際には、（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２リンカーを、第１のポリペプチドおよび第１のトランスフェラーゼ（第１のグリコシルユニットが基質である）と接触させ、それによって（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２を形成する。次いで、トランスフェラーゼおよび／または未反応ポリペプチドを反応混合物から除去してもよい。第２のポリペプチドおよび第２のトランスフェラーゼ（第２のグリコシルユニットが基質である）を、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２結合体に付加し、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２−（ペプチド）２を形成する。グリコシル残基の少なくとも１つは、直接または間接にＯ−結合している。上記で概説した方法はまた、例えば、分枝ＰＥＧ、デンドリマー、ポリ（アミノ酸）、多糖などの使用によって、２つを超えるポリペプチドの間に結合体を形成するのにも適用されることを当業者であれば理解するであろう。
例示的な実施形態では、インターフェロンα２β（ＩＦＮ−α２β）は、ＰＥＧ部分の各末端における損傷のないグリコシル連結基を含む二官能性リンカーを介して、トランスフェリンに結合している（スキーム６）。ＩＦＮ結合体は、結合体のより大きなサイズの分子によって、ＩＦＮ単独のｉｎ ｖｉｖｏ半減期より増加したｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する。さらに、ＩＦＮのトランスフェリンへの結合は、結合体を脳に選択的に標的化する役割を果たす。例えば、ＰＥＧリンカーの１つの末端は、ＣＭＰシアル酸によって官能化され、他方はＵＤＰ ＧａｌＮＡｃによって官能化される。リンカーは、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの存在下でＩＦＮと結合し、リンカーアームのＧａｌＮＡｃの、ＩＦＮ上のセリンおよび／またはスレオニン残基への結合をもたらす。
Figure 2009544327
上記のプロセスは、所望の回数のサイクルで行うことができ、単一のリンカーを有する２個のポリペプチドの間の結合体の形成に限定されない。さらに、ＰＥＧ（または他の）リンカーの末端においてポリペプチドによって損傷のないグリコシル連結基を官能化する反応は、同一の反応容器中で同時に行うことができ、または段階的な様式で行うことができることを当業者であれば理解するであろう。反応が段階的な方法で行われる場合、各ステップで生成される結合体は、１種または複数の反応成分（例えば、酵素、ペプチド）から精製されてもよい。
さらなる例示的な実施形態を、スキーム７に記載する。スキーム７は、選択したタンパク質、例えば、ＧＭ−ＣＳＦを骨に標的化し、選択したタンパク質の循環半減期を増加させる結合体の調製方法を示す。
Figure 2009544327
式中、Ｇは、活性化糖部分（例えば、糖ヌクレオチド）上のグリコシル残基であり、結合体中で損傷のないグリコシルリンカー基に変換される。ｓが０を超える場合、Ｌは、ＧａｌＮＡｃ、またはＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌなどのサッカリル連結基である。
反応性ＰＥＧ誘導体が用いられる他の例示的な実施形態では、本発明は、基本的にはポリペプチドを血液プールに標的化して、ポリペプチドを糸球体によるタンパク質（例えば、アルブミン）の濾過を遅らせるのに十分な大きさの合成または天然ポリマーに結合することによって、選択したポリペプチドの血液循環半減期を延長する方法を提供する。本発明のこの実施形態を、スキーム８に例示し、ここでは例示的ポリペプチドであるＧ−ＣＳＦが、化学修飾および酵素修飾の組合せを使用してＰＥＧリンカーを介してアルブミンに結合している。
Figure 2009544327
スキーム８に示されるように、アルブミンの残基（例えば、アミノ酸側鎖）は、Ｘ−ＰＥＧ−（ＣＭＰ−シアル酸）（Ｘは活性化基（例えば、活性エステル、イソチオシアネートなど）である）などの反応性ＰＥＧ誘導体で修飾されている。ＰＥＧ誘導体およびＧ−ＣＳＦを混合し、ＣＭＰ−シアル酸が基質であるトランスフェラーゼと接触させる。さらなる例示的な実施形態では、リシンのε−アミンは、ＰＥＧ−リンカーのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応し、アルブミン結合体が形成される。リンカーのＣＭＰ−シアル酸は、ＧＣＳＦ上の適切な残基、例えば、Ｇａｌ、またはＧａｌＮＡｃに酵素によって結合しており、それにより結合体を形成する。上記の方法は記載した反応パートナーに限定されないことを当業者であれば理解するであろう。さらにこの方法は、例えば、２つを超える末端を有する分枝リンカーを利用することによって、２種を超えるタンパク質部分を含む結合体を形成するために行うことができる。
修飾された糖のポリペプチドへの酵素的結合
修飾された糖は、結合を媒介する適切な酵素を使用して、グリコシル化または非グリコシル化ポリペプチドに結合している。好ましくは、受容体が消費されるまでグリコシル化が進むように、修飾された供与体糖、酵素および受容体ポリペプチドの濃度を決定する。後述する考慮すべき点は、シアリルトランスフェラーゼとの関連で記載したが、他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に一般に適用される。
所望のオリゴ糖構造を合成するためのグリコシルトランスフェラーゼのいくつかの使用方法は公知であり、本発明に一般に適用される。例示的な方法は、例えば、ＷＯ９６／３２４９１およびＩｔｏら、Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３（１９９３年）、ならびに米国特許第５，３５２，６７０号；同第５，３７４，５４１号および同第５，５４５，５５３号に記載されている。
本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの組合せを使用して行われる。例えば、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組合せを使用することができる。複数の酵素を使用するこのような実施形態では、酵素および基質を最初の反応混合物中に合わせることが好ましく、または第１の酵素反応が完了もしくはほぼ完了すると、第２の酵素反応のための酵素および試薬を反応媒体に加える。単一の容器中で順次に２つの酵素反応を行うことによって、中間の種を単離する手順よりも全収率は向上する。さらに、浄化、ならびに余分な溶媒および副産物の処分が減少する。
本発明の結合体のＯ−結合型グリコシル部分は一般に、ポリペプチドに結合しているＧａｌＮＡｃ部分から始まる。ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのファミリーの任意のメンバー（例えば、表１３において本明細書に記載したもの）は、ＧａｌＮＡｃ部分をポリペプチドに結合するために使用することができる（例えば、Ｈａｓｓａｎ Ｈ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ＥＰ、Ｍａｎｄｅｌ Ｕ、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＭＡ、およびＣｌａｕｓｅｎ Ｈ（２０００年）；およびＣｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍｕｃｉｎ−Ｔｙｐｅ Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：Ｏ−Ｇｌｙｃａｎ Ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ｉｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＧａｌＮＡｃ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ；（編）Ｅｒｎｓｔ、Ｈａｒｔ、およびＳｉｎａｙ；Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ ｃｈａｐｔｅｒ「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ−ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、２７３〜２９２を参照されたい）。ＧａｌＮＡｃ部分自体は、グリコシル連結基であり、修飾基で誘導体化されてもよい。代わりに、サッカリル残基を、１種または複数の酵素および１種または複数の適切なグリコシル供与体基質を使用して作製する。次いで、修飾された糖を、伸長したグリコシル部分に付加することができる。
酵素は通常、エンドグルカナーゼ加水分解ステップの逆反応に類似した合成ステップによって反応を触媒する。これらの実施形態において、グリコシル供与体分子（例えば、所望のオリゴ糖または単糖構造）は脱離基を含有し、タンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基への供与体分子の付加によって反応が進む。例えば、脱離基は、フッ化物などのハロゲンでよい。他の実施形態では、脱離基は、Ａｓｎ、またはＡｓｎ−ペプチド部分である。またさらなる実施形態では、グリコシル供与体分子上のＧｌｃＮＡｃ残基は修飾される。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２オキサゾリン部分を含むことができる。
他の実施形態では、本発明の結合体を生成するために利用される酵素の各々は、触媒量で存在する。触媒量の特定の酵素は、酵素基質の濃度、ならびに温度、時間およびｐＨ値などの反応条件によって変化する。事前に選択した基質濃度および反応条件下での所与の酵素についての触媒量の決定手段は、当業者には周知である。
上記のプロセスが行われる温度は、凍結温度のすぐ上から最も感受性の酵素が変性する温度の範囲でよい。好ましい温度範囲は、約０℃〜約５５℃、さらに好ましくは約２０℃〜約３２℃である。他の例示的な実施形態では、本方法の１種または複数の成分は、好熱性酵素を使用して温度を上げた状態で行われる。
反応混合物を、受容体がグリコシル化するのに十分な一定の期間保持し、それによって所望の結合体を形成させる。結合体のいくつかは、数時間後に検出できることが多く、回収可能な量は通常２４時間以下に得られる。反応速度は、選択した系のために最適化されたいくつかの変動要因（例えば、酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒量）に依存することを当業者であれば理解する。
本発明はまた、修飾されたポリペプチドの工業規模の生成を提供する。本明細書で使用する場合、工業規模では一般に、好ましくは単一の反応サイクル後に、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、さらに好ましくは少なくとも約１グラムの最終の精製した結合体が生成され、すなわち、結合体は、同一の連続して繰り返される合成サイクルからの反応生成物の組合せではない。
下記の考察において、本発明は、修飾されたシアル酸部分の、グリコシル化ポリペプチドへの結合によって例示される。例示的な修飾されたシアル酸は、（ｍ−）ＰＥＧで標識される。ＰＥＧ−修飾されたシアル酸およびグリコシル化ポリペプチドの使用についての下記の考察の焦点は例示を明確にするためであり、本発明がこれらの２つのパートナーの結合に限定されることを意味することを意図しない。この考察は一般に、シアル酸以外の修飾されたグリコシル部分の付加に適用できることを当業者であれば理解する。さらにこの考察は、他の水溶性ポリマー、治療的部分、および生体分子を含めたＰＥＧ以外の作用物質によるグリコシルユニットの修飾に同様に適用できる。
修飾基（例えば、ｍＰＥＧまたはｍＰＰＧ）のポリペプチドまたは糖ペプチドへの選択的導入のために、酵素的アプローチを使用することができる。一実施形態では、この方法は、適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組み合わせた、修飾基を含む修飾された糖を利用する。所望の炭水化物連結を生じさせるグリコシルトランスフェラーゼを選択することによって、および修飾された糖を供与体基質として利用することによって、直接ポリペプチド骨格に、糖ペプチドの既存の糖残基に、またはポリペプチドに付加されている糖残基に、修飾基を導入することができる。他の実施形態では、この方法は、ポリペプチドまたは糖ペプチドへの修飾された糖の転移後に修飾基の結合のために使用することができるマスクされた反応性官能基を有する修飾された糖を利用する。
一例では、グリコシルトランスフェラーゼは、修飾シアリル残基を糖ペプチドに付加するのに使用されるシアリルトランスフェラーゼである。シアリル残基のグリコシド受容体を、例えば、ポリペプチドの発現中にＯ−結合型グリコシル化配列に付加することができ、または適切なグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはこれらの組合せを使用してポリペプチドの発現後に化学的もしくは酵素的に付加することができる。適切な受容体部分には、例えば、ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）、および当業者に公知の他の受容体などのガラクトシル受容体が挙げられる（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７〜５６２４（１９７８年）を参照されたい）。
例示的な実施形態では、ＧａｌＮＡｃ残基は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用によってＯ−結合型グリコシル化配列に付加される。Ｈａｓｓａｎ Ｈ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ＥＰ、Ｍａｎｄｅｌ Ｕ、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＭＡ、およびＣｌａｕｓｅｎ Ｈ（２０００年）、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍｕｃｉｎ−Ｔｙｐｅ Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：Ｏ−Ｇｌｙｃａｎ Ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ｉｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＧａｌＮＡｃ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ（（編）Ｅｒｎｓｔ、Ｈａｒｔ、およびＳｉｎａｙ）、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ ｃｈａｐｔｅｒ「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ−ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、２７３〜２９２頁。この方法には、ポリペプチドをインキュベートし、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼおよび適切なガラクトシル供与体を含有する反応混合物で修飾するステップが含まれる。実質的に完了まで反応を進行させるか、代わりに事前に選択した量のガラクトース残基が付加された場合に反応は終了する。選択した糖受容体を構築する他の方法は、当業者には明らかであろう。
下記の考察において、本発明の方法は、それに結合した水溶性ポリマーを有する修飾された糖の使用によって例示される。考察の焦点は、例示を明確にすることである。考察は、修飾された糖が治療的部分、生体分子などを有する実施形態に同様に適切であることは当業者であれば理解するであろう
他の例示的な実施形態では、水溶性ポリマーを、修飾ガラクトシル（Ｇａｌ）残基を介してＧａｌＮＡｃ残基に付加する。代わりに、未修飾Ｇａｌを末端ＧａｌＮＡｃ残基に付加することができる。
さらなる例では、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を、修飾されたシアル酸部分および適切なシアリルトランスフェラーゼを使用して末端Ｇａｌ残基に付加する。この実施形態を、下記のスキーム９に例示する。
Figure 2009544327
さらなるアプローチでは、マスクされた反応性官能基がシアル酸上に存在する。マスクされた反応性基は、修飾されたシアル酸をポリペプチドに結合するのに使用される条件に影響を受けないことが好ましい。修飾されたシアル酸のポリペプチドへの共有結合後に、マスクを除去し、修飾された糖残基上のマスクされていない反応性基の反応性修飾基との反応によって、ポリペプチドを水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧまたはＰＰＧ）などの修飾基に結合させる。この戦略を、下記のスキーム１０に例示する。
Figure 2009544327
任意の修飾された糖は、糖ペプチドのオリゴ糖側鎖の末端糖に応じて適切なグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせて使用することができる（表１２）。
Figure 2009544327
他の実施形態において、糖残基をポリペプチド骨格上のＯ−結合型グリコシル化配列に転移させることが知られているグリコシルトランスフェラーゼを使用して、修飾された糖をペプチド骨格に直接付加する。この例示的な実施形態を、下記のスキーム１１に記載する。本発明を実施するのに有用な例示的なグリコシルトランスフェラーゼには、それだけに限らないが、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ Ｔ１〜ＧａｌＮＡｃ Ｔ２０）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼなどが挙げられる。このアプローチの使用によって、修飾された糖が、任意の炭水化物を欠いているポリペプチドへ、または代わりに既存の糖ペプチドへ直接付加することを可能とする。
Figure 2009544327
上記に記載した例示的な実施形態の各々では、修飾された糖のポリペプチドへの結合に続いて、１つまたは複数のさらなる化学的または酵素的修飾ステップを用いることができる。例示的な実施形態では、酵素（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）を使用して、グリコシルユニット（例えば、フコース）をポリペプチドに結合した末端修飾された糖に付加する。他の例では、酵素反応を利用して、修飾された糖が結合し損ねた部位を「キャップする」（例えば、シアリル化する）。代わりに、化学反応を利用して、結合した修飾された糖の構造を変化させる。例えば、結合した修飾された糖を、修飾された糖が結合しているポリペプチド成分との連結を安定化または不安定化させる作用物質と反応させる。他の例では、修飾された糖の成分を、そのポリペプチドへの結合の後で脱保護する。修飾された糖がポリペプチドに結合した後の段階で、本発明の方法において有用な一連の酵素的および化学的手順があることを当業者であれば理解するであろう。修飾された糖−ペプチド結合体のさらなる作製は、本発明の範囲内である。
他の例示的な実施形態では、糖ペプチドは、標的化物質、例えばトランスフェリン（血液脳関門を通ってポリペプチドを送達し、かつエンドソームに送達する）、カルニチン（ポリペプチドを筋細胞に送達する；例えば、ＬｅＢｏｒｇｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９：１３５７〜６３（２０００年）を参照されたい、およびホスホネート、例えば、ビスホスホネート（ポリペプチドを骨および他の石灰質組織に標的化する；例えば、Ｍｏｄｅｒｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００２年８月、１０頁を参照されたい）に結合する。標的化に有用な他の作用物質は、当業者には明らかである。例えば、グルコース、グルタミンおよびＩＧＦも、筋肉を標的化するのに有用である。
標的化部分および治療用ポリペプチドは、本明細書において議論されているか、またはそうでない場合は当技術分野において公知の任意の方法によって結合される。上記のものに加えて、ポリペプチドも本明細書に記載のように誘導体化できることは当業者であれば理解するであろう。例示的なポリペプチドは、２００１年１０月１０日に出願された同時係属で共有の米国特許仮出願第６０／３２８，５２３号に添付された付属書類に記載されている。
例示的な実施形態では、標的化物質および治療用ポリペプチドは、リンカー部分を介して連結される。この実施形態では、治療用ポリペプチドまたは標的化物質の少なくとも１つは、本発明の方法によって損傷のないグリコシル連結基を介してリンカー部分に連結している。例示的な実施形態では、リンカー部分は、ポリ（エチレングリコール）などのポリ（エーテル）を含む。他の例示的な実施形態では、リンカー部分は、標的化された組織または体の領域への結合体の送達の後、ｉｎ ｖｉｖｏで分解し、治療用ポリペプチドを標的化物質から放出する少なくとも１つの結合を含む。
さらに他の例示的な実施形態では、治療用ポリペプチドを標的化部分に結合することなしに治療的部分上のグリコフォームを変更することによって、治療的部分のｉｎ ｖｉｖｏ分布が変更される。例えば、治療用ポリペプチドは、グリコシル基の末端ガラクトース部分をシアル酸（またはその誘導体）でキャップすることによって、細網内皮系による取込みから回避されることができる。
酵素
グリコシルトランスフェラーゼ
グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質、糖ペプチド、脂質もしくは糖脂質への、または成長中のオリゴ糖非還元末端への活性化糖（供与体ＮＤＰ−糖）の段階的な付加を触媒する。一括した転移におけるトランスフェラーゼおよび脂質結合オリゴ糖供与体Ｄｏｌ−ＰＰ−ＮＡＧ２Ｇｌｃ３Ｍａｎ９を介してＮ−結合糖ペプチドが合成され、次いでコアがトリミングされる。この場合、「コア」糖の性質は、それに続く結合物と多少異なる。非常に多数のグリコシルトランスフェラーゼが、当技術分野において公知である。
本発明に使用されるグリコシルトランスフェラーゼは、それが修飾された糖を糖供与体として利用できる限りどのようなものでもよい。このような酵素の例には、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼなどのＬｅｌｏｉｒの経路のグリコシルトランスフェラーゼが挙げられる。
グリコシルトランスフェラーゼ反応が関与する酵素による糖合成では、グリコシルトランスフェラーゼをクローン化し、または任意の供給源から単離することができる。多くのクローン化されたグリコシルトランスフェラーゼは、それらのポリヌクレオチド配列と同様に公知である。グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、およびアミノ酸配列を推定することができるグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬなどを含めた公的に使用可能な様々なデータベースに見出される。
本発明の方法において用いることのできるグリコシルトランスフェラーゼには、それだけに限らないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼが挙げられる。適切なグリコシルトランスフェラーゼには、真核生物から得られたもの、ならびに原核生物からのものが挙げられる。
化学合成により、適切な細胞または細胞系培養物からのｍＲＮＡの逆転写産物のスクリーニングにより、適切な細胞からのゲノムライブラリーのスクリーニングにより、またはこれらの手順の組合せにより、グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを得ることができる。グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から生じたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングを行ってもよい。プローブは、蛍光基、放射性原子または化学発光基などの検出可能な基で、公知の手順によって標識し、従来のハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用することができる。別の方法では、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順を使用することによって得ることができ、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーがグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から生成される（例えば、Ｍｕｌｌｉｓらへの米国特許第４，６８３，１９５号、およびＭｕｌｌｉｓへの米国特許第４，６８３，２０２号を参照されたい）。
グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主細胞中でグリコシルトランスフェラーゼを合成することができる。ベクターを使用して、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを増殖し、かつ／またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを発現させる。発現ベクターとは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を、適切な宿主中でグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現に効果を及ぼすことのできる適切な制御配列に作動的に連結した複製可能なＤＮＡ構築体である。このような制御配列の必要性は、選択した宿主および選択した形質転換方法に応じて変化するであろう。一般に、制御配列には、転写プロモーター、転写を制御する任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。増幅ベクターは発現制御ドメインを必要としない。必要なすべては、通常複製開始点によって付与される宿主中の複製能、および形質転換体の認識を促進する選択遺伝子である。
例示的な実施形態では、本発明は、原核生物の酵素を利用する。このようなグリコシルトランスフェラーゼには、多数のグラム陰性菌によって産生されるリポオリゴ糖（ＬＯＳ）の合成に関与する酵素が挙げられる（Ｐｒｅｓｔｏｎら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２３（３）：１３９〜１８０（１９９６年））。このような酵素には、それだけに限らないが、β１，６ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ＥＭＢＬ寄託番号Ｍ８０５９９およびＭ８６９３５（大腸菌）；ＥＭＢＬ寄託番号Ｓ５６３６１（サルモネラティフィムリウム）を参照されたい）、グルコシルトランスフェラーゼ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ寄託番号Ｐ２５７４０（大腸菌）、β１，２−グルコシルトランスフェラーゼ（ｒｆａＪ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ寄託番号Ｐ２７１２９（大腸菌）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ寄託番号Ｐ１９８１７（サルモネラティフィムリウム））、およびβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｒｆａＫ）（ＥＭＢＬ寄託番号Ｕ０００３９（大腸菌）を含めた大腸菌およびサルモネラティフィムリウムなどの種のｒｆａオペロンのタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列が知られている他のグリコシルトランスフェラーゼには、肺炎桿菌、大腸菌、サルモネラティフィムリウム、サルモネラエンテリカ、エルシニアエンテロコリチカ、マイコバクテリウムレプロサムなどの生物中で特徴付けられてきたｒｆａＢなどのオペロン、ならびに緑膿菌のｒｈ１オペロンによってコードされるものが含まれる。
また本発明における使用に適切なものは、粘膜病原体の淋菌および髄膜炎菌のＬＯＳ中で同定されたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−β−１，３−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコース、およびＰｋ血液型の三糖配列であるＤ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコースを含有する構造の生成に関与するグリコシルトランスフェラーゼである（Ｓｃｈｏｌｔｅｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２３６〜２４３（１９９４年））。これらの構造の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコードする髄膜炎菌および淋菌の遺伝子は、髄膜炎菌免疫型Ｌ３およびＬ１（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：７２９〜７４０（１９９５年））、ならびに淋菌の変異体Ｆ６２（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２１８１〜２１９０（１９９４年））から同定されてきた。髄膜炎菌では、ｌｇｔＡ、ｌｇｔＢおよびｌｇ Ｅの３種の遺伝子からなる座位は、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース鎖中の最後の糖３個の付加に必要なグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６〜７３（１９９６年））。最近、ｌｇｔＢおよびｌｇｔＡ遺伝子産物の酵素活性が示され、提唱されていたグリコシルトランスフェラーゼ機能についての最初の直接的な証拠が提供された（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１〜２７６（１９９６年））。淋菌では、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース構造の末端ガラクトースの３位にβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを付加するｌｇｔＤ、および切断型ＬＯＳのラクトース成分に末端α−Ｄ−Ｇａｌを付加し、それによってＰｋ血液型抗原構造を生じさせるｌｇｔＣという２種のさらなる遺伝子がある（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ（１９９４年）、上記）。髄膜炎菌では、独立した免疫型Ｌ１も、Ｐｋ血液型抗原を発現し、ｌｇｔＣ遺伝子を有することが示されてきた（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、（１９９５年）、上記）。ナイセリアグリコシルトランスフェラーゼおよび関連する遺伝子はまた、ＵＳＰＮ５，５４５，５５３（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ）にも記載されている。ヘリコバクターピロリからのα１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子も特徴付けられてきた（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１３４９〜２１３５６（１９９７年））。本発明においてまた有用であるのは、カンピロバクタージェジュニのグリコシルトランスフェラーゼである（例えば、ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｔｆ＿４２．ｈｔｍｌを参照されたい）。
（ａ）ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ
Ｏ−結合型グリコシル化における第１のステップは、ＧａｌＮＡｃをセリンおよびスレオニン受容体部位に通常転移するＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ）の大きなファミリーの１つまたは複数のメンバーによって触媒されることができる（Ｈａｓｓａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８１９７〜３８２０５（２０００年））。今日まで、哺乳動物ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼファミリーの１２のメンバーが、同定され特性が決定されてきており（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２２６２３〜２２６３８（２００２年））、この遺伝子ファミリーのいくつかのさらなる推定上のメンバーがゲノムデータベースの分析から予測された。ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼイソ型は、異なる動力学的特性を有し、時間的および空間的に異なる発現パターンを示し、それらが別個の生物学的機能を有することを示唆する（Ｈａｓｓａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８１９７〜３８２０５（２０００年））。ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼの配列の分析によって、これらの酵素が、２つの別個のサブユニットである中央の触媒ユニットと、「レクチンドメイン」と称される植物レクチンリシンと同様の配列を有するＣ末端ユニットとを含有するという仮説が導かれた（Ｈａｇｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：６７９７〜６８０３（１９９９年）；Ｈａｚｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０：１３５３〜１３５６（１９９７年）；Ｂｒｅｔｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：５６３〜５７１（１９９９年））。選択した保存された残基の部位特異的突然変異誘発を伴う以前の実験によって、触媒ドメインにおける変異は触媒活性を除去することが確認された。対照的に、「レクチンドメイン」における変異は、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼイソ型であるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の触媒活性に有意な効果を与えなかった（Ｔｅｎｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４９）：４７０８８〜９６（２００２年））。したがって、Ｃ末端「レクチンドメイン」は、官能性ではなく、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼの酵素機能に貢献しないと考えられた（Ｈａｇｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：６７９７〜６８０３（１９９９年））。
明らかなＧａｌＮＡｃ−糖ペプチド特異性を示さなかったポリペプチドＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼはまた、それらの推定上のレクチンドメイン（ＰＣＴ ＷＯ０１／８５２１５Ａ２）によって調節されているようである。最近、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の推定上のレクチンドメイン中の変異は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４において以前分析されたものと同様に（Ｈａｓｓａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８１９７〜３８２０５（２０００年））、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４と同様の様式で酵素活性を修飾したことが見出された。したがって、野生型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、多数の連続したＧａｌＮＡｃ残基を多数の受容体部位を有するポリペプチド基質に付加する一方、変異ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、複数のＧａｌＮＡｃ残基を同一の基質に付加しなかった（Ｔｅｎｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４９）：４７０８８〜９６（２００２年））。より最近では、マウスＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（Ｆｒｉｔｚら、ＰＮＡＳ ２００４、１０１（４３）：１５３０７〜１５３１２）ならびにヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（Ｆｒｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６、２８１（１３）：８６１３〜８６１９）のＸ線結晶構造が決定された。ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２構造は、触媒ドメインとレクチンドメインとの間の予想外の柔軟性が明らかにされ、グリコシル化基質を捕獲するためのＧａｌＮＡｃ−Ｔ２によって使用される新規な機構が示唆された。レクチンドメインを欠いているＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の動態解析によって、糖ペプチド基質に作用するこのドメインの重要性が確認された。しかし、非グリコシル化基質に関する酵素活性は、レクチンドメインの除去によって有意に影響を受けなかった。したがって、レクチンドメインを欠いている切断型ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２酵素または切断型レクチンドメインを有するそれらの酵素は、このように得られたモノグリコシル化ポリペプチドのさらなるグリコシル化が所望でないポリペプチド基質のグリコシル化のために有用である可能性がある。
いくつかのＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼは、特定のＧａｌＮＡｃ−グリコシル化糖ペプチドとの特異な活性を示すことが最近の証明によって示される。集合した可能性があるグリコシル化配列の一部のみが他のＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼによってＧａｌＮＡｃグリコシル化されている、ムチンのタンデム反復ドメインに相当する糖ペプチド上で、少なくとも３種のＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼイソ型であるＧａｌＮＡｃ−Ｔ４、−Ｔ７、および−Ｔ１０の触媒作用が選択的に作用する（Ｂｅｎｎｅｔｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４６０：２２６〜２３０（１９９９年）；Ｔｅｎ Ｈａｇｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７３９５〜１７４０４（２００１年）；Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３０４７２〜３０４８１（１９９８年）；Ｔｅｎ Ｈａｇｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７８６７〜２７８７４（１９９９年））。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４および−Ｔ７は、以前に利用されていたものに加えて、異なるＧａｌＮＡｃ−グリコシル化ポリペプチドを認識し、ＧａｌＮＡｃの受容体基質部位への転移を触媒する。このようなＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性の機能の１つは、高密度のＯ−結合型グリコシル化を伴う糖タンパク質中のＯ−グリカン占有の密度の制御ステップを表すと予想される。
この一例は、癌に関連するムチンＭＵＣ１のグリコシル化である。ＭＵＣ１は、５つの可能性のあるＯ−結合型グリコシル化配列を有する２０個の残基（ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ）のタンデム反復Ｏ−結合型グリコシル化領域を含有する。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、−Ｔ２、および−Ｔ３は、ＭＵＣ１タンデム反復のグリコシル化を開始し、３つの部位（ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ、下線をしたＧａｌＮＡｃ結合部位）のみで組み込むことができる。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４は、乳癌に関連するムチンであるＭＵＣ１の２０個のアミノ酸タンデム反復配列中の５つの受容体部位すべてへのＯ−結合型グリカン結合を完成することができることがこれまでに同定された唯一のＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼイソ型であるという点で、独特である。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４は、ＧａｌＮＡｃを、ＧａｌＮＡｃ４ＴＡＰ２４糖ペプチド上の他のＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼイソ型によって使用されていない少なくとも２つの部位に転移させる（ＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ、独特なＧａｌＮＡｃ−Ｔ４結合部位はボールド体）（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３０４７２〜３０４８１（１９９８年）。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４によって示されるような活性は、すべての可能性のある部位がグリコシル化されている癌細胞により発現されるＭＵＣ１のグリコフォームの産生に必要であるようである（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８１６５〜１８１７２（１９９９年））。乳汁分泌乳腺からの正常なＭＵＣ１は、反復毎に約２．６のＯ−結合型グリカンを有し（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２４７８０〜２４７９３（１９９７年）、癌細胞株Ｔ４７Ｄから誘導されるＭＵＣ１は、反復毎に４．８のＯ−結合型グリカンを有する（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８１６５〜１８１７２（１９９９年））。したがってＭＵＣ１の癌に関連した形態は、高密度のＯ−結合型グリカン占有と関連し、これはＧａｌＮＡｃ−Ｔ４と同一または同様のＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性によって達成される。他の酵素であるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１は、例えば、Ｔ．Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７（２５）：２２６２３〜２２６３８に記載されている。
遺伝子工学によるクローン化した遺伝子からの酵素ＧａｌＮＡｃ ＴＩ〜ＸＸなどのタンパク質の生成は周知である。例えば、米国特許第４，７６１，３７１号を参照されたい。１つの方法は、十分な試料を回収することを伴い、次いで酵素のアミノ酸配列をＮ末端配列決定によって決定する。次いで、この情報を使用して、昆虫細胞株Ｓｆ９中で発現すると、完全活性酵素の合成がもたらされる完全長（膜結合）トランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを単離する。次いで、１６種の異なるタンパク質中の公知のグリコシル化配列を取り囲むアミノ酸の半定量的分析の使用、続いてｉｎ ｖｉｔｒｏの合成ペプチドのグリコシル化研究によって酵素の受容体特異性を決定する。この処理によって、特定のアミノ酸残基は、グリコシル化ペプチドセグメント中で大きな比率を占め、グリコシル化されたセリンおよびスレオニン残基の周囲の特異的位置における残基は、他のアミノ酸部分よりも受容体効率により著しい影響を有する場合があることが示された。
ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの変異は、野生型酵素によって生成されるものと異なるグリコシル化パターンを生成するのに利用することができることが示されたため、本発明のＯ−結合型グリコシル化ポリペプチドの調製において１種または複数の変異または切断型ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを利用することは本発明の範囲内である。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２タンパク質の触媒ドメインおよび切断変異体は、例えば、２００４年６月３日に出願された米国特許仮出願第６０／５７６，５３０号；および２００４年８月３日に出願された米国特許仮出願第６０／５９８５８４号（両方ともすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれている）に記載されている。触媒ドメインはまた、公知のグリコシルトランスフェラーゼとの配列比較によっても同定することができる。ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（△５１）、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（△５１△４４５）などの切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２酵素、およびそれらの酵素を得る方法も、ＷＯ０６／１０２６５２（２００６年３月２４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０６／０１１０６５）および２００５年１月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０５／００３０２（すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれている）に記載されている。例示的なＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１配列を、下記の表１３に要約する。
表１３：例示的なＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１の配列
１．ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）
配列番号＊＊
Figure 2009544327
２．切断型ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２△５１）
配列番号＊＊
Figure 2009544327
３．切断型ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２
（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２△１〜５１△４４５〜５７１）
配列番号＊＊
Figure 2009544327
４．切断型ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２△５１）（代替形態）
配列番号＊＊
Figure 2009544327
５．切断型ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２
（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２△１〜５１△４４５〜５７１）代替形態
配列番号＊＊
Figure 2009544327
６．切断型ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２△５３）
配列番号＊＊
Figure 2009544327
７．切断型ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２
（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２△１〜５３△４４５〜５７１）
配列番号＊＊
Figure 2009544327
８．切断型ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２
（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２△５３）代替形態
配列番号＊＊
Figure 2009544327
９．切断型ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２
（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２△１〜５３△４４５〜５７１）代替形態
配列番号＊＊
Figure 2009544327
１０．切断型ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１△４０）
配列番号＊＊
Figure 2009544327
１１．切断型ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１△４０）代替形態
配列番号＊＊
Figure 2009544327
１２．ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ３（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３）
配列番号＊＊
Figure 2009544327
１３．ショウジョウバエＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ３（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３）
配列番号＊＊
Figure 2009544327
１４．マウスＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ３（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３）
配列番号＊＊
Figure 2009544327
１５．ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１１（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１）
配列番号＊＊
Figure 2009544327
（ｂ）フコシルトランスフェラーゼ
いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用されるグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当業者には公知である。例示的なフコシルトランスフェラーゼには、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースから受容体糖のヒドロキシ位に転移する酵素が含まれる。非ヌクレオチド糖を受容体に転移するフコシルトランスフェラーゼも、本発明において有用である。
いくつかの実施形態では、受容体糖は、例えば、オリゴ糖グリコシド中のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−基中のＧｌｃＮＡｃである。この反応に適切なフコシルトランスフェラーゼには、ヒト乳から最初に特徴付けられたＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ１−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）（Ｐａｌｃｉｃら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．１９０：１〜１１（１９８９年）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６〜１０４６３（１９８１年）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６〜２０９５（１９８１年）を参照されたい）およびヒト血清に見出されたＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ−αフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ）が挙げられる。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）、シアリルα（２→３）Ｇａｌβ（（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシルトランスフェラーゼも特徴付けられてきた。組換え型のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼも特徴付けられてきた（Ｄｕｍａｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１：４２５〜４２８（１９９１年）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ４：１２８８〜１３０３（１９９０年）を参照されたい）。他の例示的フコシルトランスフェラーゼには、例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６９）が挙げられる。酵素によるフコシル化は、Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９〜１７６（１９９０年）または米国特許第５，３７４，６５５号に記載の方法によって行うことができる。フコシルトランスフェラーゼの生成に使用される細胞も、ＧＤＰ−フコースを合成するための酵素の系を含むであろう。
（ｃ）ガラクトシルトランスフェラーゼ
他の群の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。例示的なガラクトシルトランスフェラーゼには、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３年）およびＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ３４５：２２９〜２３３（１９９０年）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ ｊ０４９８９、Ｊｏｚｉａｓｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０〜１４２９７（１９８９年））、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ ｍ２６９２５；Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２２７〜８２３１（１９８９年））、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４１：１０１〜１０５（１９９５年）を参照されたい）が挙げられる。他の適切なα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液型Ｂ抗原の合成に関与するものである（ＥＣ２．４．１．３７、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６〜１１５１（１９９０年）（ヒト））。本発明の実施にまた適切なものは、Ｃｈｏ，Ｓ．Ｋ．およびＣｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１３６２２〜１３６２８によって報告されているものなどのα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの可溶性形態である。
他の実施形態では、ガラクトシルトランスフェラーゼは、コア−１−ＧａｌＴ１などのβ（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼである。ヒトコア−１−β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、説明されてきた（例えば、Ｊｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、２７７（１）：１７８〜１８６を参照されたい）。キイロショウジョウバエ酵素は、Ｃｏｒｒｅｉａら、ＰＮＡＳ、２００３年、１００（１１）：６４０４〜６４０９およびＭｕｌｌｅｒら、ＦＥＢＳ Ｊ．、２００５年、２７２（１７）：４２９５〜４３０５において記載されている。その切断型バージョンを含めたさらなるコア−１−β３ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＷＯ／０１４４４７８および２００６年９月６日に出願された米国特許仮出願第６０／８４２，９２６号に開示されている。例示的な実施形態では、β（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼは、細菌中での発現のために最適化されたコドンであるバリエーションなどの、ＰｕｂＭｅｄ寄託番号ＡＡＦ５２７２４に記載された酵素（ＣＧ９５２０−ＰＣの転写物）およびその修飾されたバージョンから選択されるメンバーである。例示的な可溶性コア−１−ＧａｌＴ１（コア−１−ＧａｌＴ１△３１）酵素の配列を下記に示す。
コア−１−ＧａｌＴ１△３１の配列
（配列番号＊＊）
Figure 2009544327
また本発明の方法における使用に適切なものは、β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼであり、これには例えば、ＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンテターゼ）およびＥＣ２．４．１．２２（ラクトースシンテターゼ）（ウシ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１〜２１７（１９８９年））、ヒト（Ｍａｓｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７〜６６３（１９８８年））、マウス（Ｎａｋａｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５〜１６８（１９８８年））、ならびにＥＣ２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌら、Ｊ．ＮｅｕｒｏＳｃｉ．Ｒｅｓ．３８：２３４〜２４２（１９９４年））が挙げられる。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼには、例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、シゾサッカロミセスポンベ由来、Ｃｈａｐｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ５：５１９〜５２８（１９９４年））が挙げられる。
（ｄ）シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、本発明の組換え細胞および反応混合物において有用な他のタイプのグリコシルトランスフェラーゼである。組換えシアリルトランスフェラーゼを産生する細胞は、ＣＭＰ−シアル酸も産生するが、これはシアリルトランスフェラーゼのシアル酸供与体である。本発明における使用に適切なシアリルトランスフェラーゼの例には、ＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩ（例えば、ラットまたはヒトＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩ）、ＳＴ３Ｇａｌ ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ Ｉ、ＳＴ６Ｇａｌ Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ Ｖ、ＳＴ６Ｇａｌ ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ ＩＩ、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ ＩＩＩが挙げられる（本明細書において使用するシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６：ｖ〜ｘｉｖ（１９９６年）に記載の通りである）。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）と称される例示的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸をＧａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌに転移する。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９８１年）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２年）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２年）を参照されたい。他の例示的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）は、シアル酸を二糖またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌに転移する。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４４４（１９７９年）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４（１９９２年）を参照されたい。さらなる例示的酵素には、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ α−２，６シアリルトランスフェラーゼ（Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５〜３８１（１９９４年）を参照されたい）が挙げられる。
好ましくは、糖ペプチドの炭水化物のグリコシル化では、シアリルトランスフェラーゼは、完全にシアリル化された炭水化物構造上の末端シアル酸の基礎をなす最も一般的な最後から２番目の配列である、配列Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−にシアル酸を転移することができるであろう（下記の表１４を参照されたい）。
Figure 2009544327
特許請求の範囲にかかわる方法において有用なシアリルトランスフェラーゼの一例は、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）とも称されるＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩである。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸の転移を触媒し（例えば、Ｗｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２年）；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９９１年）を参照されたい）、糖ペプチド中のアスパラギン結合オリゴ糖のシアリル化に関与する。シアル酸は、Ｇａｌに結合し、２つの糖の間にα結合が形成される。糖の間の結合（連結）は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位との間である。この特定の酵素は、ラット肝臓から単離することができる（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２年））。ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉら、（１９９３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２〜２２７８７；Ｋｉｔａｇａｗａ ＆ Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４〜１４０１）およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１〜９３８）ＤＮＡ配列が知られており、組換え発現によるこの酵素の産生を容易とする。他の実施形態では、特許請求の範囲にかかわるシアリル化方法は、ラットＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩを使用する。
本発明において有用な他の例示的シアリルトランスフェラーゼには、α（２，３）を含めたカンピロバクタージェジュニから単離したものが挙げられる。例えば、ＷＯ９９／４９０５１を参照されたい。
表５に列挙した他のシアリルトランスフェラーゼも、商業的に重要な糖ペプチドの、経済的効率的で大規模なシアリル化方法において有用である。これらの他の酵素の有用性を見出す簡単な試験として、様々な量の各酵素（タンパク質１ｍｇ当たり１〜１００ｍＵ）をアシアロα１ＡＧＰ（１〜１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させて、ウシＳＴ６Ｇａｌ Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩのいずれか、または両方のシアリルトランスフェラーゼと比較した、対象とするシアリルトランスフェラーゼの糖ペプチドをシアリル化する能力を比較する。代わりに、他の糖ペプチドまたは糖ペプチド、またはポリペプチド骨格から酵素により放出されたＮ−結合オリゴ糖を、この評価のためにアシアロα１ＡＧＰの代わりに使用することができる。ＳＴ６Ｇａｌ Ｉより効率的に糖ペプチドのＮ−結合オリゴ糖をシアリル化する能力を有するシアリルトランスフェラーゼは、実用的で大規模なポリペプチドのシアリル化方法において有用である（本開示において、ＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩで説明するように）。他の例示的シアリルトランスフェラーゼを図１０に示す。
融合タンパク質
他の例示的な実施形態では、本発明の方法は、所望の糖ペプチド結合体の合成に関与する複数の酵素活性を有する融合タンパク質を利用する。融合ポリペプチドは、例えば、補助酵素の触媒活性ドメインと結合したグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインから構成される場合がある。補助酵素の触媒ドメインは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼの供与体であるヌクレオチド糖の形成におけるステップを触媒することができ、またはグリコシルトランスフェラーゼのサイクルに関与する反応を触媒することができる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレオチド糖合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドとインフレームで結合することができる。次いで、このように得られた融合タンパク質は、ヌクレオチド糖の合成だけではなく、糖部分の受容体分子への転移も触媒することができる。融合タンパク質は、１つの発現可能なヌクレオチド配列中に結合された２種以上のサイクル酵素である場合がある。他の実施形態では、融合タンパク質には、２種以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインが挙げられる。例えば、５，６４１，６６８を参照されたい。本発明の修飾された糖ペプチドは、容易に設計することができ、様々な適切な融合タンパク質を利用して製造することができる（例えば、ＷＯ９９／３１２２４として１９９９年６月２４日に公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１１８０を参照されたい）。
固定化酵素
細胞結合酵素に加えて、本発明はまた、固体および／または可溶性の支持体上に固定化された酵素の使用も提供する。例示的な実施形態では、本発明の方法によって損傷のないグリコシルリンカーを介してＰＥＧに結合しているグリコシルトランスフェラーゼを提供する。ＰＥＧ−リンカー−酵素結合体は、固体支持体に場合により結合している。本発明の方法において固体で支持された酵素を使用すると、反応混合物の用意および反応生成物の精製が単純化され、酵素の容易な回収も可能となる。本発明の方法では、グリコシルトランスフェラーゼ結合体が利用される。酵素および支持体の他の組合せは、当業者であれば明らかであろう。
ポリペプチド結合体の精製
本明細書で上記に記載する方法によって生成されるポリペプチド結合体は、精製をせずに使用することができる。しかし、このような生成物を回収することが通常好ましい。薄層または厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過などのグリコシル化糖精製のための標準的な周知の技術。膜濾過を使用することが好ましく、回収のために逆浸透膜、または本明細書の下記、および本明細書において引用した文献中において議論されているような１種もしくは複数のカラムクロマトグラフ技術を利用することがさらに好ましい。例えば、膜が約３０００〜約１０，０００の分画分子量を有する膜濾過は、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去するために使用することができる。次いで、ナノ濾過または逆浸透を使用して、塩の除去および／または生成物の糖の精製を行うことができる（例えば、ＷＯ９８／１５５８１を参照されたい）。ナノフィルター膜は、１価の塩を通過させるが、多価の塩および使用する膜に応じて約１００〜約２，０００ダルトンより大きい非荷電溶質を保持する種類の逆浸透膜である。したがって、典型的な用途では、本発明の方法によって調製される糖は、膜に保持され、混入している塩は通過するであろう。
修飾された糖タンパク質が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、細胞および細胞片を含めた粒状細片を、例えば遠心分離または限外濾過によって除去する。場合により、タンパク質は、市販のタンパク質濃縮フィルターによって濃縮し、次いでイムノアフィニティークロマトグラフィー、（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはカルボキシメチルまたはスルホプロピル基を含有するマトリックス上の）イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび疎水性相互作用イオンクロマトグラフィー（ＨＩＣ）などの１種または複数のクロマトグラフィーステップによって他の不純物からポリペプチドバリアントを分離することができる。例示的な固定相には、ブルーセファロース、ＣＭブルーセファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、Ｃｏｎ Ａ−セファロース、エーテルトヨパール、ブチルトヨパール、フェニルトヨパール、ＳＰ−セファロース、またはプロテインＡセファロースが挙げられる。
他のクロマトグラフ技術には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（例えば、添付の脂肪族基を有するシリカゲル）、例えば、セファデックス分子ふるいまたはサイズ排除クロマトグラフィーを使用したゲル濾過、選択的にポリペプチドを結合するカラム上のクロマトグラフィー、およびエタノール沈殿または硫安塩析が挙げられる。
培養液中で生成した修飾された糖ペプチドは、細胞、酵素などからの最初の抽出、続いて１種もしくは複数の濃縮、塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーのステップ、例えば、ＳＰセファロースによって通常単離される。さらに、修飾された糖タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。ＨＰＬＣも、１つまたは複数の精製ステップで用いることができる。
タンパク質分解を阻害するために、プロテアーゼ阻害剤、例えばメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を、上記のステップのいずれかに含んでもよく、外来性汚染物質の増殖を防止するために、抗生物質を含んでもよい。
他の実施形態では、本発明の修飾された糖ペプチドを生成する系からの上澄みを、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して最初に濃縮する。濃縮ステップの後、濃縮物を適切な精製マトリックスに加えてもよい。例えば、適切な親和性マトリックスは、適切な支持体に結合した、ポリペプチドのリガンド、レクチンまたは抗体分子を含む場合がある。代わりに、陰イオン樹脂、例えば、ペンダントＤＥＡＥ基を有するマトリックスまたは基質を用いることができる。適切なマトリックスには、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製に通常用いられる他の種類が挙げられる。代わりに、陽イオン交換ステップを用いることができる。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が特に好ましい。
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地、例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いた１つまたは複数のＲＰ−ＨＰＬＣステップを用いて、ポリペプチドバリアント組成物をさらに精製することができる。上記の精製ステップのいくつかまたはすべてはまた、様々な組合せで、均質な修飾された糖タンパク質を実現するために用いることができる。
大規模な発酵からもたらされる本発明の修飾された糖ペプチドは、Ｕｒｄａｌら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１（１９８４年）によって開示されたものと類似の方法によって精製することができる。この参考文献は、分取ＨＰＬＣカラム上で組換えヒトＩＬ−２の精製のための、２つの連続したＲＰ−ＨＰＬＣステップについて記載している。代わりに、アフィニティークロマトグラフィーなどの技術を利用して、修飾された糖タンパク質を精製することができる。
ポリペプチドコード配列の取得
一般の組換え技術
本発明のＯ−結合型グリコシル化配列を組み込む変異ポリペプチドの生成は、変異により、またはポリペプチドの完全化学合成により、相当する親ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることによって達成することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列は、所望のアミノ酸に翻訳するであろうコドンを生じさせるために、特にポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の事前に選択した塩基での変異によって、ＤＮＡレベルでの変化によって変えることが好ましい。ＤＮＡ変異は、当技術分野において公知の方法を使用して行われることが好ましい。
本発明は、組換え遺伝学の分野における通常の技術に依存する。本発明において有用な一般の方法を開示している基礎的テキストには、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４年）が挙げられる。
核酸のサイズは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）で表示する。これらは、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲル電気泳動から、配列された核酸から、または公表されたＤＮＡ配列から得られる推定である。タンパク質では、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で示す。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動から、配列されたタンパク質から、誘導されたアミノ酸配列から、または公表されたタンパク質配列から推定される。
市販ではないオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ＆ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜１８６２（１９８１年）によって最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル方法によって、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８（１９８４年）において記載されているように自動合成機を使用して化学合成することができる。遺伝子全体はまた、化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、任意の当技術分野において認められた戦略、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｒｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７〜１４９（１９８３年）に記載されているような天然アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣを使用して行う。
クローン化した野生型ポリペプチド遺伝子、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、Ｇｅｎｅ １６：２１〜２６（１９８１年）の２本鎖鋳型を配列決定するためのチェーンターミネーション法を使用して、クローニング後に検証することができる。
例示的な実施形態では、ポリヌクレオチドをシャフリングすることによってグリコシル化配列を付加する。候補のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャフリングプロトコルによって調節することができる。ＤＮＡシャフリングは、関連する遺伝子のプールのランダムな断片化、それに続くポリメラーゼ連鎖反応と同様のプロセスによるフラグメント再構築によって行われる繰り返し組換えおよび変異のプロセスである。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７〜１０７５１（１９９４年）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９〜３９１（１９９４年）；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８３７，４５８号、同第５，８３０，７２１号および同第５，８１１，２３８号を参照されたい。
野生型ペプチドコード配列のクローニングおよびサブクローニング
例えば、ヒト成長ホルモン、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ０００５１５、ＮＭ００２０５９、ＮＭ０２２５５６、ＮＭ０２２５５７、ＮＭ０２２５５８、ＮＭ０２２５５９、ＮＭ０２２５６０、ＮＭ０２２５６１、およびＮＭ０２２５６２などの、野生型ポリペプチドをコードする多数のポリヌクレオチド配列が決定され、商業的供給源から入手可能である。
ヒトゲノムの研究の急速な進展によって、ヒトＤＮＡ配列のデータベースから事前に同定されているポリペプチドをコードするものなど公知のヌクレオチド配列に対する特定の割合の配列相同性を有する任意の遺伝子断片を検索することができるクローニングアプローチが可能となった。このように同定された任意のＤＮＡ配列は、化学合成および／またはオーバーラップ伸長法などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって引き続き得ることができる。短い配列では、完全な新規合成が差し支えない場合があるが、一方、合成プローブを使用したヒトｃＤＮＡまたはゲノミックライブラリーからの完全長コード配列のさらなる単離は、より大きい遺伝子を得るのに必要である場合がある。
代わりに、ポリペプチドをコードする核酸配列は、相同性に基づいたプライマーがポリペプチドをコードする公知の核酸配列から誘導される場合が多いポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的クローニング技術を使用して、ヒトｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから単離することができる。この目的のために最も一般に使用される技術は、標準的テキスト、例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（上記）に記載されている。
野生型ポリペプチドのコード配列を得るために適切なｃＤＮＡライブラリーは市販でもよく、または構築することができる。ｍＲＮＡの単離、逆転写によるｃＤＮＡの作製、ｃＤＮＡの組換えベクターへの連結、増殖のための組換え宿主へのトランスフェクト、スクリーニング、およびクローニングの一般の方法は周知である（例えば、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ、２５：２６３〜２６９（１９８３年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい）。ＰＣＲによってヌクレオチド配列の増幅されたセグメントを得ると、野生型ポリペプチドをコードする完全長ポリヌクレオチド配列をｃＤＮＡライブラリーから単離するために、セグメントはさらにプローブとして使用することができる。適切な手順の一般の説明は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（上記）に見出すことができる。
同様の手順に従って、野生型ポリペプチドをコードする完全長配列、例えば、上記のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号の任意の１つを、ヒトゲノミックライブラリーから得ることができる。ヒトゲノムライブラリーは市販であるか、または様々な当技術分野において認められた方法によって構築することができる。一般に、ゲノミックライブラリーを構築するために、ＤＮＡを最初に、ポリペプチドが見出されそうな組織から抽出する。ついで、ＤＮＡを機械的に切断するか、または酵素によって消化し、長さ約１２〜２０ｋｂのフラグメントを得る。引き続いてフラグメントを、グラジエント遠心分離によって望ましくない大きさのポリヌクレオチドフラグメントから分離し、バクテリオファージλベクターに挿入する。これらのベクターおよびファージをｉｎ ｖｉｔｒｏで容器に入れる。組換えファージを、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６：１８０〜１８２（１９７７年）において記載されているようにプラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロニーハイブリダイゼーションを、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７２：３９６１〜３９６５（１９７５年）において記載されているように行う。
配列相同性に基づいて、変性したオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして設計することができ、ＰＣＲを適切な条件下で行い（例えば、Ｗｈｉｔｅら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９３年；ＧｒｉｆｆｉｎおよびＧｒｉｆｆｉｎ、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ出版社、１９９４年を参照されたい）、ｃＤＮＡまたはゲノミックライブラリーからのヌクレオチド配列のセグメントを増幅することができる。プローブとして増幅した配列のセグメントを使用して、野生型ポリペプチドをコードする完全長核酸を得る。
組換え野生型ポリペプチドがこのように得られた構築体から生成できるように、野生型ポリペプチドをコードする核酸配列を取得すると、コード配列をベクター、例えば、発現ベクターにサブクローニングすることができる。野生型ポリペプチドのコード配列へのさらなる修飾、例えば、ヌクレオチド置換を引き続き行い、分子の特性を変化させることができる。
ポリペプチド配列への変異の導入
コードするポリヌクレオチド配列から、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。引き続いて、このアミノ酸配列を修飾し、さらなるグリコシル化配列をアミノ酸配列中の様々な位置に導入することによってタンパク質のグリコシル化パターンを変化させることができる。
いくつかのタイプのタンパク質のグリコシル化配列は、当技術分野で周知である。例えば、真核生物において、Ｎ−結合型グリコシル化は、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘａａは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）のアスパラギン上で起こる（Ｋｏｒｎｆｅｌｄら、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６３１〜６６４（１９８５年）；Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２１４５〜２１４９（１９８７年）；Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓら、ＦＡＳＥＢ Ｊ７：５４０〜５５０（１９９３年）；およびＯｒｌｅａｎ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ第３巻（１９９６年））。Ｏ−結合型グリコシル化は、セリンまたはスレオニン残基で起こる（Ｔａｎｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９０６：８１〜９１（１９８７年）；およびＨｏｕｎｓｅｌｌら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１３：１９〜２６（１９９６年））。他のグリコシル化パターンは、グリコシルホスファチジルイノシトールをタンパク質のカルボキシル末端カルボキシル基に連結することによって形成される（Ｔａｋｅｄａら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：３６７〜３７１（１９９５年）；およびＵｄｅｎｆｒｉｅｎｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：５９３〜５９１（１９９５年）。この知識に基づいて、適切な変異をこのように野生型ポリペプチド配列に導入し、新規なグリコシル化配列を形成することができる。
ポリペプチド配列内のアミノ酸残基の直接の修飾は、新規なＮ−結合型またはＯ−結合型グリコシル化配列を導入するのに適切である場合があるが、より頻繁には新規なグリコシル化配列の導入はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を変異させることによって行われる。これは公知の突然変異誘発方法のいずれかを使用して行うことができ、そのいくつかを下記で説明する。
種々の変異作製プロトコルは、当技術分野で確立され、説明されている。例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４５０４〜４５０９（１９９７年）；およびＳｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９〜３９１（１９９４年）を参照されたい。一組の核酸のバリアント、したがってコードされたポリペプチドのバリアントを生成するために、手順を別々にまたは組合せて使用することができる。突然変異誘発のためのキット、ライブラリー構築、および他の多様性を生じさせる方法は、市販されている。
多様性を生じさせる変異の方法には、例えば、部位特異的突然変異誘発（ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３〜１２０１（１９８５年））、ウラシル含有鋳型を使用した突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４８８〜４９２（１９８５年））、オリゴヌクレオチドに導かれる突然変異誘発（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０：６４８７〜６５００（１９８２年））、ホスホロチオアート−修飾ＤＮＡ突然変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：８７４９〜８７６４および８７６５〜８７８７（１９８５年））、およびギャップを有する二本鎖ＤＮＡを使用した突然変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２：９４４１〜９４５６（１９８４年））が挙げられる。
変異を作製する他の方法には、点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ、３８：８７９〜８８７（１９８４年））、修復能に欠ける宿主株を使用した突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：４４３１〜４４４３（１９８５年））、欠失による突然変異誘発（ＥｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：５１１５（１９８６年））、制限選択および制限精製（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ、３１７：４１５〜４２３（１９８６年））、全遺伝子合成による突然変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９〜１３０１（１９８４年））、二重鎖切断修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：７１７７〜７１８１（１９８６年））、ポリヌクレオチドチェーンターミネーション法による突然変異誘発（米国特許第５，９６５，４０８号）、および誤りがちなＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１：１１〜１５（１９８９年））が挙げられる。
宿主生物における好ましいコドン使用頻度のための核酸の修飾
ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチド配列は、特定の宿主の好ましいコドン使用頻度と一致するようにさらに変更させることができる。例えば、細菌細胞の１系統の好ましいコドン使用頻度を使用して、本発明のポリペプチドバリアントをコードし、この系統によって好まれるコドンを含むポリヌクレオチドを得ることができる。宿主細胞が示す好ましいコドン使用頻度は、宿主細胞によって発現される多数の遺伝子中の好ましいコドンの平均使用頻度によって計算することができる（例えば、Ｋａｚｕｓａ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｊａｐａｎのウェブサイトから計算サービスが利用可能である）。この分析は、宿主細胞によって高度に発現される遺伝子に限定されることが好ましい。米国特許第５，８２４，８６４号は、例えば、双子葉植物および単子葉植物によって示される高度に発現された遺伝子によるコドン使用頻度を提供する。
修飾が完了すると、ポリペプチドバリアントのコード配列を配列決定によって確認し、次いで野生型ポリペプチドと同様の方法で組換え生成のために適当な発現ベクター中にサブクローニングする。
変異ポリペプチドの発現
配列確認の後、本発明のポリペプチドバリアントを、組換え遺伝学の分野で通常の技術を使用して、本明細書において開示しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって生成することができる。
発現系
本発明の変異ポリペプチドをコードする核酸の高レベルな発現を得るために、典型的には、転写を方向付ける強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、および翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクター中に、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは、当技術分野で周知であり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（上記）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（上記）に記載されている。野生型または変異ポリペプチドを発現する細菌発現系は、例えば、大腸菌、バチルス属、サルモネラ、およびカウロバクターにおいて利用可能である。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当技術分野で周知であり、市販もされている。一実施形態では、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ関連ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
異種核酸を発現させるのに使用されるプロモーターは、特定の用途よって変わる。このプロモーターは、異種の転写開始点からの距離が、天然の状態における転写開始点からの距離とほぼ同じ距離に位置してもよい。しかし当技術分野において公知であるように、この距離におけるいくつかの変型は、プロモーター機能の喪失を起こさずに実現することができる。
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的には、転写ユニット、または宿主細胞における変異ポリペプチドの発現のために必要なすべてのさらなる要素を含有する発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、変異ポリペプチドおよび転写物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナルをコードする核酸配列に作動可能に連結しているプロモーター、リボソーム結合部位、ならびに翻訳終結部位を含有する。ポリペプチドをコードする核酸配列は典型的には、開裂可能なシグナルペプチド配列に連結し、形質転換細胞によるポリペプチドの分泌を促進する。このようなシグナルペプチドには、とりわけ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリン、およびニューロン成長因子、およびオオタバコガの幼若ホルモンエステラーゼに由来するシグナルペプチドが挙げられる。このカセットのさらなる要素には、エンハンサーと、ゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用されている場合は、機能性のスプライス供与体および受容体部位を有するイントロンとが含まれる場合がある。
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率的な終結を実現するように、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含有すべきである。終端領域は、同一の遺伝子からプロモーター配列として得ることができ、または異なる遺伝子から得ることができる。
遺伝情報を細胞に送り込むために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核生物または原核細胞における発現のために使用される従来のベクターのいずれかを使用することができる。標準的細菌発現ベクターには、ｐＢＲ３２２をベースとするプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系が挙げられる。エピトープタグも、組換えタンパク質に付加して、例えば、ｃ−ｍｙｃを単離する便利な方法を提供することができる。
真核生物のウイルスからの調節エレメントを含有する発現ベクターは、真核生物の発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタインバーウイルスから誘導されるベクター中で典型的に使用される。他の例示的な真核生物ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ならびにＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞中の発現に効果的であることが示された他のプロモーターの方向付けでタンパク質の発現を可能とする任意の他のベクターが挙げられる。
いくつかの例示的な実施形態では、発現ベクターは、２００４年４月９日に出願された共有の米国特許出願（参照により本明細書中に組み込まれている）に開示されているｐＣＷｉｎ１、ｐＣＷｉｎ２、ｐＣＷｉｎ２／ＭＢＰ、ｐＣＷｉｎ２−ＭＢＰ−ＳＢＤ（ｐＭＳ３９）、およびｐＣＷｉｎ２−ＭＢＰ−ＭＣＳ−ＳＢＤ（ｐＭＸＳ３９）から選択される。
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの、遺伝子増幅を実現するマーカーを有する。代わりに、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの方向付けで変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する昆虫細胞中のバキュロウイルスベクターなどの、遺伝子増幅に関与しない高収率の発現系も適切である。
発現ベクター中に典型的に含まれる要素にはまた、大腸菌中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選定を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物の配列の挿入を可能にする、プラスミドの非必須領域中の特有の制限部位が挙げられる。選択された特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当技術分野において公知の多くの抵抗性遺伝子のいずれも適切である。真核細胞中のＤＮＡの複製を妨げないように、原核生物の配列を必要に応じて選択してもよい。
組換えタンパク質（例えば、本発明のｈｇｈ変異体）のペリプラズム発現が所望である場合、発現ベクターは、発現しようとするタンパク質のコード配列の５’に直接結合している、大腸菌ＯｐｐＡ（ペリプラズムのオリゴペプチド結合タンパク質）分泌シグナルまたはその修飾型などの分泌シグナルをコードする配列をさらに含む。このシグナル配列は、細胞質中で産生された組換えタンパク質を、細胞膜を通ってペリプラズム腔へと導く。この発現ベクターはさらに、組換えタンパク質がペリプラズム腔に入った場合、シグナル配列を酵素によって開裂することができるシグナルペプチダーゼ１のコード配列を含む場合がある。組換えタンパク質のペリプラズムでの産生についてのさらに詳細な説明は、例えば、Ｇｒａｙら、Ｇｅｎｅ３９：２４７〜２５４（１９８５年）、米国特許第６，１６０，０８９号および同第６，４３６，６７４号に見出すことができる。
上記のように、様々な保存的置換によって、ポリペプチドの生物活性を保持したまま任意の野生型もしくは変異ポリペプチドまたはそのコード配列を作製できることは当業者であれば認識するであろう。さらに、このように得られたアミノ酸配列を変更することなく特定の発現宿主中の好ましいコドン使用頻度に適応させるように、ポリヌクレオチドコード配列の修飾をまた行ってもよい。
トランスフェクション方法
標準的トランスフェクション方法を使用して、多量の変異ポリペプチドを発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞株を産生させ、次いでそれを標準的な技術を使用して精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９〜１７６２２（１９８９年）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（編）、１９９０年））を参照されたい。真核生物および原核細胞の形質転換は、標準的な技術によって行われる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９〜３５１（１９７７年）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ ＆ Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１０１：３４７〜３６２（Ｗｕら（編）、１９８３年）を参照されたい）。
宿主細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかを使用することができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、原形質融合、電気穿孔法、リポソーム、マイクロインジェクション、細胞質ベクター、ウイルスベクター、およびクローン化したゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質の宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が挙げられる（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（上記）を参照されたい）。使用する特定の遺伝子工学手順は、変異ポリペプチドを発現することができる宿主細胞に、少なくとも１つの遺伝子を首尾よく導入することができればよい。
宿主細胞における変異ポリペプチドの発現の検出
適切な宿主細胞に発現ベクターを導入した後、変異ポリペプチドの発現を促進する条件下でトランスフェクトされた細胞を培養する。次いで、細胞を組換えポリペプチドの発現についてスクリーニングし、それを標準的な技術を使用して培養物から引き続き回収する（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２年）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記；およびＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上記を参照されたい）。
遺伝子発現をスクリーニングするためのいくつかの一般法は、当業者には周知である。第１に、核酸レベルで遺伝子発現を検出することができる。核酸ハイブリダイゼーション技術を使用した特異的ＤＮＡおよびＲＮＡ測定の種々の方法を通常使用する（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上記）。いくつかの方法は、電気泳動分離（例えば、ＤＮＡの検出のためのサザンブロットおよびＲＮＡの検出のためのノーザンブロット）を伴うが、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出はまた電気泳動なしでも行うことができる（ドットブロットなど）。トランスフェクトされた細胞中の変異ポリペプチドをコードする核酸の存在は、配列特異的プライマーを使用してＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによっても検出することができる。
第２に、ポリペプチドレベルで遺伝子発現を検出することができる。遺伝子産物のレベルを測定するために、様々な免疫学的アッセイが、本発明の変異ポリペプチドと特異的に反応するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を特に使用して、当業者によって通常使用されている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第１４章、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８８；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７（１９７５年））。このような技術は、変異ポリペプチドまたはその抗原性部分に対して高い特異性を有する抗体を選択することによる抗体調製を必要とする。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は確立されており、それらの説明は文献に見出すことができる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：５１１〜５１９（１９７６年）を参照されたい。本発明の変異ポリペプチドに対する抗体の調製および変異ポリペプチドを検出する免疫学的アッセイの実施についてのさらなる詳細の説明は、下記のセクションで提供する。
組換えによって生成された変異ポリペプチドの精製
宿主細胞中の組換え変異ポリペプチドの発現を確認した後、次いで組換えポリペプチドを精製する目的で、適切な規模で宿主細胞を培養する。
１．細菌からの精製
典型的にはプロモーター誘導後に、形質転換された細菌によって、本発明の変異ポリペプチドが組換えによって大量に生成される場合、発現は構成性である場合があるが、タンパク質は不溶性凝集物を形成する場合がある。タンパク質封入体を精製するのに適したいくつかのプロトコルがある。例えば、凝集タンパク質（以下封入体と称する）の精製は典型的には、例えば、約１００〜１５０μｇ／ｍｌのリゾチームおよび０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（非イオン系界面活性剤）の緩衝液中でのインキュベーションによる細菌細胞の破壊による、封入体の抽出、分離および／または精製を伴う。細胞懸濁液は、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ粉砕機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）を使用して粉砕することができる。代わりに、細胞を氷上で超音波処理することができる。細菌を溶解する代替方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（両方とも上記）において記載されており、当業者であれば明らかであろう。
細胞懸濁液を、一般に遠心分離し、封入体を含有するペレットを、封入体を溶解しないが洗浄する緩衝液（例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（非イオン系界面活性剤））中で再懸濁させる。できるだけ多くの細胞残屑を除去するために洗浄ステップを繰り返すことが必要な場合がある。封入体の残りのペレットを、適切な緩衝液（例えば、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で再懸濁してもよい。他の適切な緩衝液は、当業者であれば明らかであろう。
洗浄ステップに続いて、強力な水素受容体であり強力な水素供与体（または各々がこれらの特性の１つを有する溶媒の組合せ）でもある溶媒を加えることによって、封入体を可溶化する。次いで、封入体を形成していたタンパク質を、適合した緩衝液で希釈または透析することによって再生してもよい。適切な溶媒には、それだけに限らないが、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、体積／体積ベース）、および塩酸グアニジン（約４Ｍ〜約８Ｍ）が挙げられる。ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および７０％ギ酸などの、凝集物形成タンパク質を可溶化することができるいくつかの溶媒は、タンパク質を不可逆的に変性させ、免疫原性および／または活性の欠如を伴う可能性があるため、この手順で使用するのに不適切である場合がある。塩酸グアニジンおよび同様の作用物質は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、変性剤を（例えば、透析により）除去または希釈すると再生が起こり、対象とする免疫学的活性および／または生物活性のあるタンパク質の再形成を可能にする場合がある。可溶化後に、標準的な分離技術によって、タンパク質を他の細菌タンパク質から分離することができる。細菌細胞内の封入体からの組換えポリペプチドの精製のさらなる説明については、例えば、Ｐａｔｒａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１８：１８２〜１９０（２０００年）を参照されたい。
代わりに、組換えポリペプチド、例えば変異ポリペプチドを、細菌のペリプラズムから精製することが可能である。組換えタンパク質が細菌のペリプラズムに移動する場合、当業者に公知の他の方法以外に低温浸透圧ショックによって細菌のペリプラズム画分を単離することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい）。組換えタンパク質をペリプラズムから単離するために、細菌細胞を遠心分離し、ペレットを形成させる。ペレットを、２０％スクロースを含有する緩衝液中で再懸濁させる。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、ペレットを氷冷の５ｍＭのＭｇＳＯ４中で再懸濁し、氷浴中に約１０分保持する。細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みをデカントし、取っておく。上澄み中にある組換えタンパク質は、当業者には周知の標準的な分離技術によって宿主タンパク質から分離することができる。
２．精製のための標準的なタンパク質分離技術
組換えポリペプチド、例えば本発明の変異ポリペプチドが、宿主細胞中に可溶性形態で発現している場合、その精製は、標準的タンパク質精製手順、例えば、本明細書の下記に記載したものに従うことができる、または他の場所、例えば、国際出願公開第２００６／１０５４２６（参照により本明細書に組み込まれている）において開示されている方法を使用して、精製を行うことができる。
溶解性による分画
しばしば最初のステップとして、タンパク質混合物が複合体である場合に、最初に塩析による分画によって、望ましくない宿主細胞タンパク質（または細胞培地に由来するタンパク質）の多くを、対象とする組換えタンパク質、例えば本発明の変異ポリペプチドから分離することができる。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させることによって、タンパク質を沈殿させる。そのときタンパク質はその溶解性によって沈殿する。タンパク質の疎水性が高いほど、より低濃度の硫酸アンモニウムで沈殿が起こる可能性が高い。典型的なプロトコルは、得られる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％となるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に加えることである。これによって大部分の疎水性タンパク質は沈殿する。（対象とするタンパク質が疎水性でない場合）沈殿物を廃棄し、対象とするタンパク質を沈殿させることが知られている濃度になるまで、硫酸アンモニウムを上澄みに加える。次いで、沈殿物を緩衝液中で可溶化し、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかによって過剰な塩を必要に応じて除去する。低温エタノールによる沈殿などのタンパク質の溶解性を利用する他の方法は当業者には周知であり、複合タンパク質混合物を分画するために使用することができる。
限外濾過
計算した分子量に基づいて、サイズのより大きなタンパク質およびサイズのより小さなタンパク質を、異なる孔径の膜を通す限外濾過を使用して単離することができる（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）。第１のステップとして、対象とするタンパク質、例えば変異ポリペプチドの分子量より低い分画分子量の孔径を有する膜を通して、タンパク質混合物を限外濾過する。次いで、限外濾過の保持液を、対象とするタンパク質の分子量より大きい分画分子量の膜によって限外濾過する。組換えタンパク質は、膜を通過して濾液へと入ると考えられる。次いで、濾液を下記で説明するようにクロマトグラフィーにかけることができる。
カラムクロマトグラフィー
（本発明の変異ポリペプチドなどの）対象とするタンパク質はまた、それらのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、またはリガンドへの親和性に基づいて他のタンパク質から分離することができる。さらに、ポリペプチドに対して産生される抗体を、カラムマトリックスに結合させ、ポリペプチドを免疫精製することができる。これらの方法のすべては、当技術分野で周知である。
クロマトグラフ技術は、任意の規模で、多くの異なるメーカー（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の装置を使用して行うことができることは当業者には明らかであろう。
変異ポリペプチド発現を検出するための免疫アッセイ
組換え変異ポリペプチドの生成を確認するために、免疫アッセイは、試料中のポリペプチドの発現を検出するのに有用である場合がある。組換えホルモンの発現レベルを定量化するためにも、免疫学的アッセイはまた有用である。変異ポリペプチドに対する抗体は、これらの免疫学的アッセイを行うために必要である。
変異ポリペプチドに対する抗体の産生
対象とする免疫原と特異的に反応するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生方法は当業者に公知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ、１９９１年；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９年；Ｓｔｉｔｅｓら、（編）ＢａｓｉｃおよびＣｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ、ＣＡ、およびそこで引用された参考文献；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８６年；およびＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７、１９７５年を参照されたい）。このような技術には、ファージまたは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリーから抗体を選択することによる抗体調製が含まれる（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５〜１２８１、１９８９年；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４〜５４６、１９８９年を参照されたい）。
所望の特異性を有する抗体を含有する抗血清を産生するために、対象とするポリペプチド（例えば、本発明の変異ポリペプチド）またはその抗原性フラグメントを使用して、適切な動物、例えば、マウス、ウサギ、または霊長類を免疫化することができる。標準的な免疫化プロトコルによってフロイントアジュバントなどの標準的なアジュバントを使用することができる。代わりに、その特定のポリペプチドから誘導された合成抗原ペプチドを担体タンパク質に結合し、その後免疫原として使用することができる。
試験血液をとり、対象とする抗原への反応性の力価を決定することによって、免疫原調製物に対する動物の免疫応答をモニターする。抗原に対する抗体の力価が適切に高くなった場合、動物から血液を採取し、抗血清を調製する。抗原に特異的に反応性の抗体を濃縮するための抗血清のさらなる分画、および抗体の精製を続いて行うことができる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（上記）、ならびに上記のタンパク質精製の一般的な説明を参照されたい）。
モノクローナル抗体を、当業者によく知られている様々な技術を使用して得る。典型的には、所望の抗原で免疫化した動物からの脾臓細胞を、通常骨髄腫細胞と融合させることによって不死化する（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１〜５１９、１９７６年を参照されたい）。不死化の代替方法には、例えば、エプスタインバーウイルス、癌遺伝子、もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で周知の他の方法が挙げられる。単一の不死化した細胞から生じたコロニーを、所望の特異性および抗原親和性を有する抗体の産生についてスクリーニングし、このような細胞によって産生されたモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物宿主の腹膜腔への注射を含めた様々な技術によって高めることができる。
さらに、Ｈｕｓｅら（上記）によって概説された一般的なプロトコルによってヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、所望の特異性を有する抗体またはそのような抗体の結合フラグメントをコードする核酸配列の同定によって、モノクローナル抗体を組換え技術により産生することもできる。上記の組換えポリペプチド産生の一般原則および方法は、組換法による抗体産生に適用される。
所望である場合、本発明の変異ポリペプチドを特異的に認識することができる抗体を、野生型ポリペプチドに対するそれらの交差反応性について試験し、それによって野生型タンパク質に対する抗体と区別することができる。例えば、変異ポリペプチドで免疫化した動物から得た抗血清を、野生型ポリペプチドを固定化したカラムに通すことができる。カラムを通過する抗血清の部分は、変異ポリペプチドのみを認識し、野生型ポリペプチドは認識しない。同様に、変異ポリペプチドに対するモノクローナル抗体も、変異体のみを認識するが野生型ポリペプチドを認識しないその排他性によってスクリーニングすることができる。
本発明の変異ポリペプチドのみを特異的に認識するが野生型ポリペプチドを認識しないポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、固体支持体上で固定化された変異ペプチドに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体と共に試料をインキュベートすることによって、野生型タンパク質から変異タンパク質を単離するのに有用である。
組換えポリペプチド発現を検出するための免疫アッセイ
本発明の変異ポリペプチドに対して特異的な抗体が利用可能となれば、試料中のポリペプチド、例えば細胞ライセートの量は、当業者に定性的および定量的結果を提供する種々の免疫アッセイ法によって測定することができる。一般的な免疫学的手順および免疫アッセイ手順の概説については、例えば、Ｓｔｉｔｅｓ、上記；米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；および同第４，８３７，１６８号を参照されたい。
免疫アッセイにおける標識化
免疫アッセイは、抗体および標的タンパク質によって形成された結合複合体に特異的に結合し、それを標識する標識剤を利用することが多い。標識剤は、それ自体が抗体／標的タンパク質複合体を含む部分の１つでよく、または抗体／標的タンパク質複合体に特異的に結合する他の抗体などの第３の部分でよい。標識は、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能である場合がある。その例には、それだけに限らないが、電磁ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン、テキサス赤色、ローダミンなど）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて通常使用される他のもの）、ならびに金コロイドまたは色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色標識が挙げられる。
ある場合には、標識剤は、検出可能な標識を有する二次抗体である。代わりに、二次抗体は標識を欠いている場合があるが、それは次に二次抗体が相当する種の抗体に特異的な標識された三次抗体が結合している場合がある。酵素標識ストレプトアビジンなどの第３の標識分子が特異的に結合することができる、ビオチンなどの検出可能な部分で、二次抗体を修飾することができる。
タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇなどの、免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合することができる他のタンパク質も、標識剤として使用することができる。これらのタンパク質は、連鎖球菌細菌の細胞壁の通常の構成成分である。それらは、種々の種からの免疫グロブリンの定常領域と非免疫原性の強い反応性を示す（一般に、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１：１４０１〜１４０６（１９７３年）；およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５：２５８９〜２５４２（１９８５年）を参照されたい）。
免疫アッセイ形式
対象とする標的タンパク質（例えば、変異ヒト成長ホルモン）を試料から検出するための免疫アッセイは、競合的でも非競合的でもよい。非競合的免疫アッセイは、捕捉した標的タンパク質の量を直接測定するアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、例えば、標的タンパク質に特異的な抗体を固体基質に直接結合させることができ、そこで抗体を固定化する。次いで、それは標的タンパク質を試験試料中で捕捉する。次いで、このように固定化された抗体／標的タンパク質複合体に、上記のように標識を有する二次抗体または三次抗体などの標識剤を結合させる。
競合アッセイでは、試料中に存在する標的タンパク質によって標的タンパク質に特異的な抗体から移された（または競合して出された）付加された（外因性）標的タンパク質の量を測定することによって、試料中の標的タンパク質の量を間接的に測定する。このようなアッセイの典型的な例では、抗体を固定化し、外因性標的タンパク質を標識する。抗体に結合した外因性標的タンパク質の量は、試料中に存在する標的タンパク質の濃度に反比例するため、抗体に結合し、したがってこのように固定化された外因性標的タンパク質の量に基づいて、試料中の標的タンパク質標識を決定することができる。
ある場合には、ウェスタンブロット（イムノブロット）分析を使用して、試料中の変異ポリペプチドの存在を検出し定量化する。この技術は一般に、分子量に基づくゲル電気泳動によって試料タンパク質を分離し、分離したタンパク質を適切な固体支持体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルターなど）に転移させ、試料を標的タンパク質に特異的に結合する抗体と共にインキュベートすることを含む。これらの抗体を直接標識してもよく、または代わりに変異ポリペプチドに対する抗体に特異的に結合する標識抗体（例えば、標識ヒツジ抗マウス抗体）を使用して、引き続き検出することができる。
他のアッセイ形式には、特定の分子（例えば、抗体）に結合し、カプセル化試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用するリポソーム免疫アッセイ（ＬＩＡ）が含まれる。次いで、標準的な技術によって放出された化学物質を検出する（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．、５：３４〜４１（１９８６年）を参照されたい）。
治療方法
上述した結合体に加えて、本発明は、疾患を発症する危険性がある対象または疾患を有する対象に、本発明のポリペプチド結合体を投与することによって、病態を予防、治癒または寛解する方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の結合体を特定の組織または体内の領域に標的化する方法を提供する。
下記の例は、本発明の組成物および方法を例示するために提供するが、特許請求された本発明を限定するために提供するのではない。
本発明の好ましい実施形態
一実施形態では、本発明は、グリコシル化または非グリコシル化シークオンポリペプチドとポリマー修飾基との間の共有結合体を提供し、前記シークオンポリペプチドは、親ポリペプチドに相当し、外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含み、前記ポリマー修飾基は、前記Ｏ−結合型グリコシル化配列でグリコシル連結基を介して前記シークオンポリペプチドに結合しており、前記グリコシル連結基は、前記シークオンポリペプチドおよび前記ポリマー修飾基の両方の間に介在しかつ共有結合しており、ただし、前記親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択されるメンバーではない。
前記ポリマー修飾基が、直鎖状および分枝状から選択されるメンバーであり、１つまたは複数のポリマー部分を含み、各ポリマー部分は独立して選択される、上記の実施形態の共有結合体。
前記ポリマー部分が、ポリ（エチレングリコール）およびメトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ｍ−ＰＥＧ）から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかの共有結合体。
前記グリコシル連結基が、損傷のないグリコシル連結基である、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかの共有結合体。
式（ＩＩＩ）
Figure 2009544327
（式中、Ｒ９はＨ、負の電荷または塩対イオンであり、Ｒｐは、
Figure 2009544327
（式中、ｎは、１〜２０から選択される整数であり、ｆおよびｅは、１〜２５００から独立して選択される整数である）から選択されるメンバーである）による部分を含む、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかの共有結合体。
前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかの共有結合体。
前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、（Ｘ）ｍＰＴＰ、（Ｘ）ｍＰＴＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＥＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎおよび（Ｘ）ｍＰＳＤＧ（Ｐ）ｎ（式中、ｍおよびｎは、０および１から独立して選択される整数であり、Ｐは、プロリンであり、Ｘは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかの共有結合体。
前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＰＴＰ、ＰＴＥＩ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＶＬ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰおよびＴＥＴＰから選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかの共有結合体。
本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによる共有結合体と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
シークオンポリペプチドを含み、前記シークオンポリペプチドが親ポリペプチドに相当し、かつ外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を有し、前記ポリペプチド結合体が、式（Ｖ）
Figure 2009544327
（式中、ｗは、０および１から選択される整数であり、ｑは、０および１から選択される整数であり、ＡＡ−Ｏ−は、ヒドロキシル基によって置換されている側鎖を有するアミノ酸から誘導される部分であり、前記アミノ酸は前記Ｏ−結合型グリコシル化配列内に位置し、Ｚ＊は、グリコシル部分およびグリコシル連結基から選択されるメンバーであり、Ｘ＊は、ポリマー修飾基およびポリマー修飾基に共有結合しているグリコシル連結基から選択されるメンバーであり、ただし、前記親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択されるメンバーではない）による部分を含む、ポリペプチド結合体。
前記アミノ酸が、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）である、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体。
前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、（Ｘ）ｍＰＴＰ、（Ｘ）ｍＰＴＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＥＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎおよび（Ｘ）ｍＰＳＤＧ（Ｐ）ｎ（式中、ｍおよびｎは、０および１から独立して選択される整数であり、Ｐは、プロリンであり、Ｘは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体。
前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＰＴＰ、ＰＴＥＩ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＶＬ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰおよびＴＥＴＰから選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体。
Ｚ＊が、ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳｉａおよびＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａから選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体。
前記ポリマー修飾基が、直鎖状および分枝状から選択されるメンバーであり、かつ１つまたは複数のポリマー部分を含み、前記ポリマー部分の各々は独立して選択される、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体。
前記ポリマー部分が、ポリ（エチレングリコール）およびその誘導体から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体
ｗが１である、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体。
Ｘ＊が、シアリル（Ｓｉａ）部分、ガラクトシル（Ｇａｌ）部分、ＧａｌＮＡｃ部分およびＧａｌ−Ｓｉａ部分から選択されるメンバーである部分を含む、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体。
前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体。
Ｘ＊が、式（ＶＩ）
Figure 2009544327
（式中、Ｅは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ２７およびＣＨＲ２８から選択されるメンバーであり、Ｒ２７およびＲ２８は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールおよび置換または非置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーであり、Ｅ１は、ＯおよびＳから選択されるメンバーであり、Ｒ２は、Ｈ、−Ｒ１、−ＣＨ２Ｒ１、および−Ｃ（Ｘ１）Ｒ１から選択されるメンバーであり、Ｒ１は、ＯＲ９、ＳＲ９、ＮＲ１０Ｒ１１、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ９は、Ｈ、負の電荷、金属イオン、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびアシルから選択されるメンバーであり、Ｒ１０およびＲ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびアシルから独立して選択されるメンバーであり、Ｘ１は、置換または非置換アルケニル、Ｏ、ＳおよびＮＲ８から選択されるメンバーであり、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり、Ｙは、ＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ、ＣＨ（ＯＨ）、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）、およびＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）から選択されるメンバーであり、Ｙ２は、Ｈ、ＯＲ６、Ｒ６、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、
Figure 2009544327
から選択されるメンバーであり、Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、Ｌａ−Ｒ６ｂ、Ｃ（Ｏ）Ｒ６ｂ、Ｃ（Ｏ）−Ｌａ−Ｒ６ｂ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーであり、Ｒ６ｂは、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよび修飾基から選択されるメンバーであり、Ｒ３、Ｒ３’およびＲ４は、Ｈ、ＯＲ３”、ＳＲ３”、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、−Ｌａ−Ｒ６ｃ、−Ｃ（Ｏ）−Ｌａ−Ｒ６ｃ、−ＮＨ−Ｌａ−Ｒ６ｃ、＝Ｎ−Ｌａ−Ｒ６ｃおよび−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｌａ−Ｒ６ｃから独立して選択されるメンバーであり、Ｒ３”は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ６ｃは、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、ＮＲ１３Ｒ１４および修飾基から選択されるメンバーであり、Ｒ１３およびＲ１４は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーであり、各Ｌａは、結合およびリンカー基から独立して選択されるメンバーである）による部分を含む、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体。
Ｘ＊が、式（ＶＩＩ）による部分を含む、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体。
Figure 2009544327
Ｒ６ｂおよびＲ６ｃの少なくとも１つが、
Figure 2009544327
（式中、ｓ、ｊおよびｋは、０〜２０から独立して選択される整数であり、各ｎは、０〜２５００から独立して選択される整数であり、ｍは、１〜５の整数であり、Ｑは、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ１６およびＲ１７は、独立して選択されるポリマー部分であり、Ｘ２およびＸ４は、ポリマー部分Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合させる独立して選択される連結フラグメントであり、Ｘ５は、ポリマー部分以外の非反応性基であり、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＡ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーであり、Ａ１２およびＡ１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体。
本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物。
前記シークオンポリペプチドが、配列番号１および配列番号２
（Ｘ）ｍＰＯ＊Ｕ（Ｂ）ｐ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｏ）ｔ（Ｐ）ｎ（配列番号１）、および
（Ｘ）ｍ（Ｂ１）ｐＴＵＢ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｐ）ｎ（配列番号２）
（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｒ、ｓおよびｔは、０および１から独立して選択される整数であり、Ｐは、プロリンであり、Ｏ＊は、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）から選択されるメンバーであり、Ｕは、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から選択されるメンバーであり、Ｘ、ＢおよびＢ１は、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーであり、Ｚ、ＪおよびＯは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーであり、ただし、前記親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択されるメンバーではない）から選択される外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む、親ポリペプチドに相当するシークオンポリペプチド。
前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、（Ｘ）ｍＰＴＰ、（Ｘ）ｍＰＴＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＥＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎおよび（Ｘ）ｍＰＳＤＧ（Ｐ）ｎ（式中、ｍおよびｎは、０および１から独立して選択される整数であり、Ｐは、プロリンであり、Ｘは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチド。
前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＰＴＰ、ＰＴＥＩ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＶＬ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰおよびＴＥＴＰから選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチド。
前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼの基質である、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチド。
少なくとも３個のアミノ酸が、前記Ｏ＊とリシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）残基との間に見出される、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかのシークオンポリペプチド。
前記親ポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチド。
前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチド。
前記本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチドをコードする単離された核酸。
本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによる前記核酸を含む発現ベクター。
本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによる前記核酸を含む細胞。
前記シークオンポリペプチドが、ＸＰＯ＊Ｐ、ＸＰＯ＊ＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＥＩ、ＸＰＯ＊ＱＡ（Ｐ）ｎ、ＸＰＯ＊ＴＶＳ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＶＳＰ、ＸＰＯ＊ＱＧＡ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＧＡＰ、ＸＰＯ＊ＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、ＸＴＥＯ＊Ｐ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＶＬ、ＸＰＯ＊ＶＬ（Ｐ）ｎ、ＸＰＯ＊ＴＶＬ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＶＬＰ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＬＹＶＰ、ＸＰＯ＊ＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＡＳ（Ｐ）ｎ、ＸＰＯ＊ＳＡＶ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＡＶＰ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＧ（Ｐ）ｎ、ＸＴＥＯ＊Ｐおよび（Ｘ）ｍＰＯ＊ＤＧ（Ｐ）ｎ（式中、ｍおよびｎは、０および１から独立して選択される整数であり、Ｏ＊は、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）から選択されるメンバーであり、Ｘは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から選択されるメンバーであり、各Ｓ（セリン）は、Ｔ（スレオニン）によって独立して置換されてもよく、各Ｔ（スレオニン）は、Ｓ（セリン）によって独立して置換されてもよい。）から選択される外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む、親ポリペプチドに相当するシークオンポリペプチド。
前記Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼの基質である、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチド。
少なくとも３個のアミノ酸が、前記Ｏ＊およびリシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）残基の間に見出される、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチド。
前記親ポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチド。
前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、繊維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ−７）、繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）、繊維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ−２３）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチド。
前記本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチドをコードする単離された核酸。
本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによる前記核酸を含む発現ベクター。
本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによる前記核酸を含む細胞。
複数の異なるメンバーを含むシークオンポリペプチドのライブラリーであって、ライブラリーの各メンバーは、共通の親ポリペプチドに相当し、かつ外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含み、前記Ｏ−結合型グリコシル化配列の各々は、配列番号１および配列番号２
（Ｘ）ｍＰＯ＊Ｕ（Ｂ）ｐ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｏ）ｔ（Ｐ）ｎ（配列番号１）、および
（Ｘ）ｍ（Ｂ１）ｐＴＵＢ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｐ）ｎ（配列番号２）
（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｒ、ｓおよびｔは、０および１から独立して選択される整数であり、Ｐは、プロリンであり、Ｏ＊は、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）から選択されるメンバーであり、Ｕは、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から選択されるメンバーであり、Ｘ、ＢおよびＢ１は、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーであり、Ｚ、ＪおよびＯは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から独立して選択されるメンバーである、ライブラリー。
前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、（Ｘ）ｍＰＴＰ、（Ｘ）ｍＰＴＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＥＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎおよび（Ｘ）ｍＰＳＤＧ（Ｐ）ｎ（式中、ｍおよびｎは、０および１から独立して選択される整数であり、Ｐは、プロリンであり、Ｘは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるライブラリー。
前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＰＴＰ、ＰＴＥＩ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＶＬ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰおよびＴＥＴＰから選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるライブラリー。
前記ライブラリーの各メンバーが、前記親ポリペプチド内の異なるアミノ酸位置で同一のＯ−結合型グリコシル化配列を含む、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるライブラリー。
前記ライブラリーの各メンバーが、前記親ポリペプチド中の同一のアミノ酸位置で異なるＯ−結合型グリコシル化配列を含む、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるライブラリー。
前記親ポリペプチドが、ｍアミノ酸を有し、各アミノ酸がアミノ酸位置に相当し、前記ライブラリーが、（ａ）前記Ｏ−結合型グリコシル化配列を第１のアミノ酸位置（ＡＡ）ｎ（式中、ｎは、１〜ｍから選択されるメンバーである）で有する第１のシークオンポリペプチドと、（ｂ）各々のさらなるシークオンポリペプチドが、前記Ｏ−結合型グリコシル化配列を、（ＡＡ）ｎ＋ｘおよび（ＡＡ）ｎ−ｘ（式中、ｘは、１〜（ｍ−ｎ）から選択されるメンバーである）から選択されるメンバーであるさらなるアミノ酸位置において有する少なくとも１つのさらなるシークオンポリペプチドとを含む、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるライブラリー。
（ＡＡ）ｎ＋ｐおよび（ＡＡ）ｎ−ｐ（式中、ｐは１〜１０から選択される）から選択された第２のアミノ酸位置で前記Ｏ−結合型グリコシル化配列を有する第２のシークオンポリペプチドを含む、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるライブラリー。
前記さらなるアミノ酸位置の各々が、予め選択したアミノ酸位置に隣接している、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるライブラリー。
前記Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼの基質である、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるライブラリー。
前記ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼが、レクチン−ドメイン欠失ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２およびレクチンドメイン切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるライブラリー。
前記親ポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるライブラリー。
前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、繊維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ−７）、繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）、繊維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ−２３）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるライブラリー。
シークオンポリペプチドが親ポリペプチドに相当し、配列番号１および配列番号２
（Ｘ）ｍＰＯ＊Ｕ（Ｂ）ｐ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｏ）ｔ（Ｐ）ｎ（配列番号１）、および
（Ｘ）ｍ（Ｂ１）ｐＴＵＢ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｐ）ｎ（配列番号２）
（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｒ、ｓおよびｔは、０および１から独立して選択される整数であり、Ｐは、プロリンであり、Ｏ＊は、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）から選択されるメンバーであり、Ｕは、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から選択されるメンバーであり、Ｘ、ＢおよびＢ１は、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーであり、Ｚ、ＪおよびＯは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーであり、ただし、前記親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択されるメンバーではない）から選択される外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む、シークオンポリペプチドを宿主細胞中で発現させるステップを含む方法。
前記シークオンポリペプチドを単離するステップをさらに含む、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記シークオンポリペプチドを、前記Ｏ−結合型グリコシル化配列で酵素によってグリコシル化するステップをさらに含む、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記酵素によるグリコシル化が、グリコシルトランスフェラーゼを使用して行われる、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記グリコシルトランスフェラーゼが、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２である、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２が、レクチン−ドメイン欠失ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２およびレクチンドメイン切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２から選択されるメンバーである、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記シークオンポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを作製するステップをさらに含む、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記宿主細胞に前記発現ベクターをトランスフェクトするステップをさらに含む、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記親ポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
（ｉ）前記シークオンポリペプチドを組換えで生成するステップと、（ｉｉ）前記シークオンポリペプチドを前記Ｏ−結合型グリコシル化配列で酵素によってグリコシル化するステップとを含む、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるポリペプチド結合体の作製方法。
ステップ（ｉｉ）の前記酵素によるグリコシル化が、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを使用して行われる、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼが、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２である、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２が、レクチン−ドメイン欠失ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２およびレクチンドメイン切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２から選択されるメンバーである、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
（ｉ）前記Ｏ−結合型グリコシル化配列を第１のアミノ酸位置（ＡＡ）ｎに導入することによって、第１のシークオンポリペプチドを組換えで生成するステップと、（ｉｉ）前記Ｏ−結合型グリコシル化配列を（ＡＡ）ｎ＋ｘおよび（ＡＡ）ｎ−ｘ（式中、ｘは、１〜（ｍ−ｎ）から選択されるメンバーである）から選択されるさらなるアミノ酸位置に導入することによって、少なくとも１つのさらなるシークオンポリペプチドを組換えで生成するステップとを含む、本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチドのライブラリーの作製方法。
（ｉ）本明細書の上記に記載の実施形態のいずれかによるシークオンポリペプチドのライブラリーを生成するステップと、（ｉｉ）前記ライブラリーの少なくとも１つのメンバーを酵素によるグリコシル化反応に供し、修飾基によって誘導体化されていてもよいグリコシル部分をグリコシル供与体分子から前記Ｏ−結合型グリコシル化配列の少なくとも１つに転移させ、それによって前記リードポリペプチドを同定するステップとを含む、リードポリペプチドを同定する方法。
前記ライブラリーの少なくとも１つのメンバーについて前記酵素によるグリコシル化反応の収率を測定するステップをさらに含む、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記測定が、質量分析、ゲル電気泳動、核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびＨＰＬＣから選択されるメンバーによって行われる、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記リードポリペプチドの前記収率が、約５０％〜約１００％である、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
ステップ（ｉｉ）の前に、前記ライブラリーの少なくとも１つのメンバーを精製するステップをさらに含む、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
ステップ（ｉｉ）の前記グリコシル部分が、ガラクトース部分およびＧａｌＮＡｃ部分から選択されるメンバーを含む、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
ステップ（ｉｉ）の前記酵素によるグリコシル化反応が、前記ライブラリーの前記少なくとも１つのメンバーが発現している宿主細胞内で行われる、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の生成物をＰＥＧ化反応に供するステップをさらに含み、前記ＰＥＧ化反応は、化学的ＰＥＧ化反応および酵素によるグリコＰＥＧ化反応から選択されるメンバーである、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）が、単一の反応容器中で行われる、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記ＰＥＧ化反応の収率を測定するステップをさらに含む、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記測定が、質量分析、ゲル電気泳動、核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびＨＰＬＣから選択されるメンバーで行われる、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記リードポリペプチドの前記ＰＥＧ化反応の前記収率が、約５０％〜約１００％である、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記リードポリペプチドが、前記ＰＥＧ化反応時に前記親ポリペプチドの治療活性と本質的に同一の治療活性を有する、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記リードポリペプチドが、前記ＰＥＧ化反応時に前記親ポリペプチドの治療活性と異なる治療活性を有する、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記シークオンポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを作製するステップを含む、本明細書における上記の実施形態のいずれかによる方法。
前記宿主細胞に前記発現ベクターをトランスフェクトするステップをさらに含む、本明細書における上記の実施形態による方法。
本発明の範囲を制限することは意図しないが、上記の実施形態（例えば、シークオンポリペプチドの作製方法、ライブラリーの作製方法およびシークオンポリペプチドの同定方法に関するもの）の各々において、下記の例示的な実施形態が一般に好ましい。親ポリペプチドがグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）である例示的な一実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱ、ＰＴＴ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＧ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡＹ、ＰＴＴＬＹ、ＰＴＧＳＬＰ、ＰＴＴＳＥＰ、ＰＴＡＶＩＰ、ＰＴＳＧＥＰ、ＰＴＴＬＹＰ、ＰＴＶＬＰ、ＴＥＴＰ、ＰＳＤＧＰおよびＰＴＥＶＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＧＬＰ−１である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱ、ＰＴＴ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＧ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡＹ、ＰＴＴＬＹ、ＰＴＧＳＬＰ、ＰＴＴＳＥＰ、ＰＴＡＶＩＰ、ＰＴＳＧＥＰ、ＰＴＴＬＹＰ、ＰＴＶＬＰ、ＴＥＴＰ、ＰＳＤＧＰおよびＰＴＥＶＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＧＬＰ−１である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型Ｇ−ＣＳＦポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＱ、ＰＴＴ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＧ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡＹ、ＰＴＴＬＹ、ＰＴＧＳＬＰ、ＰＴＴＳＥＰ、ＰＴＡＶＩＰ、ＰＴＳＧＥＰ、ＰＴＴＬＹＰ、ＰＴＶＬＰ、ＴＥＴＰ、ＰＳＤＧＰおよびＰＴＥＶＰから選択されないことが好ましい。
親ポリペプチドがＧ−ＣＳＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＡＰＴＰおよびＰＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型Ｇ−ＣＳＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＡＰＴＰおよびＰＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型Ｇ−ＣＳＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型Ｇ−ＣＳＦポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＡＰＴＰおよびＰＴＰから選択されないことが好ましい。
親ポリペプチドがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＶＬＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＬＹＶ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＱＡおよびＴＥＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ｈＧＨである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＬＹＶ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡおよびＴＥＴＰから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ｈＧＨであるさらに他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型ｈＧＨポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＬＹＶ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＱＡおよびＴＥＴＰから選択されないことが好ましい。
親ポリペプチドがＩＮＦ−αである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、好ましくはＴＥＴＰではない。親ポリペプチドが野生型ＩＮＦ−αである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、好ましくはＴＥＴＰではない。親ポリペプチドが野生型ＩＮＦ−αであるさらに他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型ＩＮＦ−αポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、好ましくはＴＥＴＰではない。
親ポリペプチドがＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１）である他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＰ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＳＡＶおよびＰＴＳＡＶＡＡから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＦＧＦである他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、ＰＴＰ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＳＡＶおよびＰＴＳＡＶＡＡから選択されないことが好ましい。親ポリペプチドが野生型ＦＧＦであるさらに他の例示的な実施形態では、Ｏ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合型グリコシル化配列が野生型ＦＧＦポリペプチド中に存在するプロリン残基の周りに設計されていなければそうでないが、ＰＴＰ、ＰＴＱＧＡ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＳＡＶおよびＰＴＳＡＶＡＡから選択されないことが好ましい。
［実施例］
下記の実施例は、例示としてのみ提示し、本発明の範囲を限定することを意図しない。本質的に同様の結果を得るために変更または修正することができる種々の重要でないパラメーターを、当業者であれば容易に認識するであろう。ヒトＢＭＰ−７およびヒトＮＴ−３を参照することによってこの方法を例示するが、グリコシル化部位を、下記の方法で他の骨形成タンパク質およびニューロトロフィン、例えばＢＭＰ−２を含めた他のタンパク質のペプチド配列に組み込むことができることは当業者であれば理解するであろう。
グリコシル化部位の骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７）への取込み
１．１．ＢＭＰ−７配列情報
例示的ＢＭＰ−７配列を下記に示す（Ｓ．１）。
ヒト骨形成タンパク質−７（配列番号＊＊）
Figure 2009544327
Ｎ末端メチオニンは、任意のＢＭＰ−７変異体中に存在してもしなくてもよい。この例では、アミノ酸残基の番号付けは、最も左の残基であるメチオニン（Ｍ）が、位置１として番号付けされる元の未修飾の配列に基づく。未修飾の配列に関して変異体配列がどのように異なるかを強調するために、下記の変異体配列中に現れる未修飾アミノ酸の番号付けを、修飾後も変更しないままとする。記載した配列修飾の複数は、本発明のＢＭＰ−７変異体中に存在する場合がある。
野生型ポリペプチド中に存在しないグリコシル化部位を生じさせるため、変異を導入するための好ましい領域は、アミノ酸１〜６、１０〜２１、２７〜３６、５５〜６５、７３〜８０、７５〜８５および１１７〜１２５をコードするヌクレオチド配列である。本発明の変異Ｏ−結合型グリコシル化配列、例えばＰＴＰまたはＰＴＩＮＴのいずれかを使用したシークオンスキャニングを使用して、新規なグリコシル化部位をＢＭＰ−７親ポリペプチドに挿入することができる。
この実施例は、Ｏ−結合型グリコシル化配列、例えば、セリンまたはスレオニン残基を野生型骨形成タンパク質−７配列に導入するアミノ酸配列変異を記載する。いくつかの変異ＢＭＰ−７ポリペプチドは、Ｏ−結合型グリコシル化配列を、アミノ末端を含むペプチド配列の７つの異なる領域に導入することによって作製した。Ｏ−結合型グリコシル化配列ＰＴＰおよびＰＴＩＮＴを各々使用して、アミノ酸７２〜８６と９６〜１０３との間の２つのループ領域にわたってシークオンスキャニングを行った。すべてのＢＭＰ−７変異体の封入体を調製した。
１．２．Ｍ１ＳＴＧＳＫの変異
これらのＢＭＰ−７のアミノ末端変異体において、野生型配列Ｍ１ＳＴＧＳＫ（配列番号＊＊）は、アミノ酸挿入およびアミノ酸置換の両方によって置換した。好ましい変異には、下記が挙げられる。
Figure 2009544327
この例では、Ｎ末端変異体について大腸菌の発現収率を向上させるために、フェニルアラニン（Ｆ）がＯ−結合型グリコシル化配列に含まれた。
１．３．Ｑ９ＮＲＳＫＴＰ１６ＫＮＱＥＡの変異
これらのＢＭＰ−７変異体において、野生型Ｑ９ＮＲＳＫＴＰ１６ＫＮＱＥＡ（配列番号＊＊）をアミノ酸残基または挿入によって置換し、それによってプロリン１６の近くにグリコシル化部位を生じさせた。好ましい例には、下記が挙げられる。
Figure 2009544327
１．４．ＶＡＥＮ３０ＳＳＤＱＲの変異
これらの変異体において、野生型ＶＡＥＮ３０ＳＳＤＱＲ配列（配列番号＊＊）を、グリコシル化配列を生させるアミノ酸残基によって置換した。好ましい例には、下記が挙げられる。
Figure 2009544327
１．５．ＤＷＩＩＡＰ６０ＥＧＹＡＡの変異
これらのＢＭＰ−７変異体において、野生型ＤＷＩＩＡＰ６０ＥＧＹＡＡ（配列番号＊＊）配列を、グリコシル化配列を生させるアミノ酸残基によって置換した。好ましい例には、下記が挙げられる。
Figure 2009544327
１．６．ＡＦＰ７５ＬＮＳＹＭの変異
これらの変異体において、野生型ＡＦＰ７５ＬＮＳＹＭ（配列番号＊＊）配列を、グリコシル化配列を生させるアミノ酸残基によって置換した。好ましい例には、下記が挙げられる。
Figure 2009544327
１．７．Ｐ７５ＬＮＳＹＭＮＡＴＮＨの変異
これらのＢＭＰ−７変異体において、野生型Ｐ７５ＬＮＳＹＭＮＡＴＮＨ（配列番号＊＊）配列を、グリコシル化配列を生させるアミノ酸残基によって置換した。好ましい例には、下記が挙げられる。
Figure 2009544327
１．８．ＹＦＤＤ１２０ＳＳＮＶＩの変異
これらのＢＭＰ−７変異体において、野生型ＹＦＤＤ１２０ＳＳＮＶＩ（配列番号＊＊）配列を、グリコシル化部位を生じさせるアミノ酸残基によって置換した。好ましい例には、下記が挙げられる。
Figure 2009544327
１．９．ＢＭＰ−７内のシークオンスキャニング
これらの変異体において、本発明のＯ−グリコシル化配列を使用して、ＢＭＰ−７配列の２つの異なる領域を変異させた。各領域における変異を、下記で別々に考察する。例示的な変異には、下記が挙げられる。
ＰＴＰおよびＰＴＩＮＴを使用したＣ７２ＡＦＰＬＮＳＹＭＮＡＴＨＡ内のシークオンスキャニング
これらのＢＭＰ−７変異体において、野生型配列Ｃ７２ＡＦＰＬＮＳＹＭＮＡＴＨＡ（配列番号＊＊）のアミノ酸を、ＰＴＰまたはＰＴＩＮＴによって置換し、各変異体内のグリコシル化部位を生じている全領域にわたって変異をスキャニングした。例には、下記が挙げられる。
ＰＴＰを使用した例示的なシークオンスキャニング
Figure 2009544327
ＰＴＩＮＴを使用した例示的なシークオンスキャニング
Figure 2009544327
ＰＴＰおよびＰＴＩＮＴを使用したＮ９６ＰＥＴＶＰＫＰＣＣ内のシークオンスキャニング
これらの変異体において、野生型配列Ｎ９６ＰＥＴＶＰＫＰＣＣ（配列番号＊＊）を、ＰＴＰまたはＰＴＩＮＴによって置換し、各変異体内のグリコシル化部位を生じている全領域にわたって変異をスキャニングした。好ましい例には、下記が挙げられる。
ＰＴＰを使用した例示的なシークオンスキャニング
Figure 2009544327
ＰＴＩＮＴを使用した例示的なシークオンスキャニング
Figure 2009544327
１．１０．ＢＭＰ−７変異体の精製
すべてのＢＭＰ−７変異体Ｃ．１〜Ｃ．５９を、下記のステップによって処理した。（ａ）発酵、（ｂ）細胞溶解、（ｃ）細胞内封入体（ＩＢ）の（例えば、遠心分離による）単離、（ｄ）ＩＢ可溶化、（ｅ）ＩＢ精製（例えば、Ｓ−セファロース）、および（ｆ）ＩＢリフォールディング。
グリコシル化配列のニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）への取込み
２．１．ＮＴ−３配列情報
ヒトＮＴ−３の例示的野生型アミノ酸配列（Ｓ．２）を下記に示す。
ヒトニューロトロフィン−３（配列番号＊＊）：
Figure 2009544327
この実施例は、Ｏ−結合型グリコシル化配列を、野生型ＮＴ−３配列Ｓ．２（配列番号＊＊）またはその任意の修飾した（例えば、事前に変異させた）バージョンに導入するアミノ酸配列変異を記載する。Ｏ−結合型グリコシル化部位を３つのループ領域ならびにアミノ末端に導入して、いくつかの変異体を生じさせた。
Ｎ末端メチオニン（Ｍ）は、任意のＮＴ−３変異体中に存在してもしなくてもよい。この例では、アミノ酸残基の番号付けは、Ｎ末端残基メチオニン（Ｍ）が位置１として番号付けされる元の未修飾の配列に基づく。未修飾の配列に関して変異体配列がどのように異なるかを強調するために、下記の変異体配列中に現れる未修飾アミノ酸の番号付けを、修飾後も変更しないままとする。記載した配列修飾の複数は、本発明のＮＴ−３変異体中に存在する場合がある。
ＮＴ−３ポリペプチド中で本発明のグリコシル化配列を生じさせるための変異の導入に好ましい領域は、野生型ＮＴ−３アミノ酸配列（Ｓ．２）のアミノ酸１〜９、２２〜３０、４５〜５４および９１〜９９をコードするヌクレオチド配列である。
２．２．Ｍ１ＹＡＥＨＫＳＨＲの変異
これらのアミノ末端変異体において、野生型配列Ｍ１ＹＡＥＨＫＳＨＲ（配列番号＊＊）は、アミノ酸挿入およびアミノ酸置換の両方によって置換される。例示的な変異には、下記が挙げられる。
Figure 2009544327
２．３．ＶＴＤＫ２５ＳＳＡＩＤの変異
これらの変異体において、野生型ＶＴＤＫ２５ＳＳＡＩＤ配列（配列番号＊＊）を、グリコシル化配列を生させるアミノ酸残基によって置換する。好ましい例には、下記が挙げられる。
Figure 2009544327
２．４．ＧＮＳＰ４８ＶＫＱＹＦＹの変異
これらの変異体において、野生型配列ＧＮＳＰ４８ＶＫＱＹＦＹ（配列番号＊＊）を、グリコシル化配列を生させるアミノ酸残基によって置換する。好ましい例には、下記が挙げられる。
Figure 2009544327
２．５．ＴＳＥ９３ＮＮＫＬＶＧの変異
これらの変異体において、野生型配列ＴＳＥ９３ＮＮＫＬＶＧ（配列番号＊＊）を、グリコシル化配列を生させるアミノ酸残基によって置換する。好ましい例には、下記が挙げられる。
Figure 2009544327
２．６．ヒトＮＴ−３変異体の発現および精製
発現
種々のＮＴ−３変異体を、Ｗ３１１０大腸菌中で３７℃にて発現能について試験した。結果：すべての試験した変異体Ａ．１〜Ａ．１６（配列番号＊＊）は、発現していた。細胞溶解後、封入体を遠心分離によって単離した。
ｈＮＴ−３封入体の可溶化および亜硫酸化
洗浄したＩＢペレットを、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭの亜硫酸ナトリウム、１０ｍＭのテトラチオン酸ナトリウム、および７．５Ｍの尿素を含有する緩衝液中で可溶化した（１００ｍｇ／ｍｌ）。室温で約２０分間攪拌することによって、可溶化を行った。懸濁液を４℃で２時間さらに攪拌した。ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を０．１５％の最終濃度まで加え、４℃で約１時間攪拌し、次いで１時間インキュベートした。混合物を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−３Ｂ遠心分離を使用して５０００ｒｐｍ／４℃で３０分間遠心分離した。上澄みを０．４５μｍシリンジフィルターで濾過し、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＳＰＦＦ）平衡緩衝液（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５Ｍの尿素、ｐＨ５）で少なくとも１０倍に希釈し、次いでＳＰＦＦカラムに充填した。カラムを平衡緩衝液で洗浄した。タンパク質を５０ｍＭのＭＯＰＳ、５Ｍの尿素、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ７．０）で溶出した。
ｈＮＴ−３変異体のリフォールディングおよび精製
リフォールディング緩衝液は、０．１ＭのＴｒｉｓ、２Ｍの尿素、０．１ＭのＮａＣｌ、１５％ ＰＥＧ３００、１０ｍＭのグリシン、２５ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ９．１）から構成された。ＳＰＦＦからの主要なピークの画分を、プールし、リフォールディング緩衝液に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で希釈した。Ｌ−システインを約５ｍＭまで加え、穏やかに攪拌しながら４℃で５日間インキュベートすることによって、リフォールディングを開始させた。
リフォールディングしたプールのｐＨを、ｐＨ７に調節し、０．４５μｍフィルターで濾過し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡させたＭａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填した。タンパク質を、ＮａＣｌ（０〜１．５Ｍ）および塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ、０〜０．２５Ｍ）の上昇する濃度の直線勾配によって同一の緩衝液中で溶出した。主要なピークのタンパク質を回収し、グリコシル化およびグリコＰＥＧ化研究に使用した。
２．７．ｈＮＴ−３変異体のグリコＰＥＧ化
グリコシル化およびグリコＰＥＧ化のためのｈＮＴ−３変異体のスクリーニング
すべてのｈＮＴ−３変異タンパク質を、Ｈｉｇｈ Ｓクロマトグラフィーを使用して精製し、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％ポリソルベート８０および０．０２％ＮａＮ３を含有する反応緩衝液中に移した。タンパク質へのＧａｌＮＡｃの付加を、約１ｍｇ／ｍｌのｈＮＴ−３、ｈＮＴ−３ １ｍｇ当たり５０ｍＵのＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、０．７ｍＭのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、および０．７ｍＭのＭｎＣｌ２からなる反応物５０μｌ中で３２℃にて一晩行った。ＧａｌＮＡｃの取込みを、ＭＡＬＤＩによってモニターした。Ａ．１〜Ａ．１６（配列番号＊＊）中の種々の変異体を、ＧａｌＮＡｃの付加によって効率的にグリコシル化した。これらの変異体について、グリコシル化率は５０％を超えることが見出された。
完了すると、反応混合物を２つの等しい分量に分けた。１つの分量を、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩにより触媒される直接ＰＥＧ化に使用した。様々なＰＥＧサイズ（２０Ｋ、３０Ｋおよび分枝状４０Ｋ（ＮＯＦ））のＳＡ−ＣＭＰ−ＰＥＧストック溶液を、ｈＮＴ−３に対して約３：１の最終モル比まで加えた。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを、少なくとも２０ｍＵ／ｍｇ ｈＮＴ−３の最終濃度まで加えた。反応を３２℃で行い、ＰＥＧ化をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイした。
第２の分量は、ＵＤＰ−Ｇａｌストック溶液（４２ｍＭ）、コア−１−ＧａｌＴ１（１．４Ｕ／ｍｌ）、および上記の反応緩衝液からなる酵素混合物と混合した。ガラクトシル化を３２℃で一晩行い、ガラクトシル基の取込みをＭＡＬＤＩによってモニターした。ガラクトシル化が完了すると、様々なＰＥＧサイズ（２０Ｋ、３０Ｋおよび分枝状４０Ｋ（ＮＯＦ））のＳＡ−ＣＭＰ−ＰＥＧストック溶液を、ｈＮＴ−３に対して約３：１の最終モル比まで加えた。ＳＴ３ＧａｌＩを、少なくとも２０ｍＵ／ｍｇ ｈＮＴ−３の最終濃度まで加えた。反応を３２℃で行い、ＰＥＧ化をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイした。
２．８．修飾ｈＮＴ−３変異体の分取グリコＰＥＧ化および精製
選択したｈＮＴ−３変異体の分取グリコＰＥＧ化を３ステップで行った。（ａ）ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２により触媒されるＧａｌＮＡｃの付加、（ｂ）コア−１−ＧａｌＴ１により触媒されるガラクトシル基の取込み、（ｃ）ＳＴ３ＧａｌＩにより触媒されるＳＡ−ＰＥＧ−２０ｋＤａの付加。
約２３６μｇのタンパク質を含有するｈＮＴ−３タンパク質溶液に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（５０ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（１００ｍＭ）、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（２．１Ｕ／ｍｌ）を加えた。反応を３２℃で約２０時間行い、反応を完了させるためにＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（５０ｍＭ）およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（２．１Ｕ／ｍｌ）を補足した後さらに３時間続けた。次いで、ＵＤＰ−Ｇａｌ（４２ｍＭ）およびコア−１−ＧａｌＴ１（１．４Ｕ／ｍｌ）を、反応混合物に加えた。反応を３２℃で一晩行った。ＭＡＬＤＩ分析は、約１００％のガラクトシル化を示した。次いで、ＳＴ３ＧａｌＩ（０．６５Ｕ／ｍｌ）およびＳＡ−ＣＭＰ−ＰＥＧ−２０Ｋ（０．１ｍｇ／μｌ）を加えた。インキュベーションを一晩続けた。
反応混合物を水で約１０ｍｌまで希釈し、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓカラム（約２ｍｌのＣＶ）に充填し、それを５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で事前に平衡化した。５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１．５ＭのＮａＣｌ、０．２５ＭのＴＭＡＣの直線勾配を使用して８０分にわたって０．５ｍＬ／分で、タンパク質を溶出した。ＰＥＧ化されたｈＮＴ−３を含有する画分をプールし、濃縮し、ＳＵＰＥＲＤＥＸ２００カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。
２．９．結果の要約
発現の結果、選択したヒトＮＴ−３変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化およびｉｎ ｖｉｔｒｏグリコＰＥＧ化を、下記の表１６で要約する。
Figure 2009544327
様々なベクターおよび大腸菌宿主細胞を使用したヒトＢＭＰ−７およびヒトＮＴ−３の発現
ＢＭＰ−７天然配列Ｓ．１（配列番号＊＊）および上記のＢＭＰ−７変異体Ｃ．１〜Ｃ．３１（配列番号＊＊）（実施例１）、ならびにＮＴ−３天然配列Ｓ．２（配列番号＊＊）および上記のＮＴ−３変異体Ａ．１〜Ａ．１６（配列番号＊＊）（実施例２）は、異なる大腸菌宿主細胞中で種々のベクターを使用して発現することができる。天然配列の実験結果を、下記の表１７に要約する。さらに、すべてのＢＭＰ−７変異体Ｃ．１〜Ｃ．３１（配列番号＊＊）を、Ｗ３１１０大腸菌中で３７℃にて封入体として発現させた。
Figure 2009544327
ＢＭＰ−７およびＮＴ−３、または変異ＢＭＰ−７およびＮＴ−３は、グリコシル化または糖結合することができる（参照により本明細書中に組み込まれているＷＯ０３／３１４６４を参照されたい）。好ましくは、変異ＢＭＰ−７またはＮＴ−３は、グリコＰＥＧ化され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分は、グリコシル連結を介して変異ＢＭＰ−７またはＮＴ−３ポリペプチドに結合している（参照により本明細書中に組み込まれているＷＯ０３／３１４６４を参照されたい）。タンパク質のグリコＰＥＧ化は、それだけに限らないが、半減期の向上、曲線下面積（ＡＵＣ）値の向上、クリアランスの低下、および免疫原性の低下が挙げられる生物物理学的性質の向上をもたらすことが期待されている。
Ｏ−結合型グリコシル化配列のＦＧＦ−２１への導入
４．１．配列情報
ＦＧＦ−２１の例示的アミノ酸配列（Ｓ．３）を下記に示す。
繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）（配列番号＊＊）
Figure 2009544327
全部で４８つのＯ−グリコシル化変異体を調製し試験した。既存のプロリン残基の周りに変異を作製することによって、変異Ｏ−結合型グリコシル化配列を親ポリペプチドに導入した。９つの異なるプロリン残基での変異は、分枝状４０Ｋ−ｃｙｓ−ＰＥＧによってグリコシル化（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）およびグリコＰＥＧ化できた。
４．２．突然変異誘発およびクローニング
ヒトＦＧＦ２１タンパク質の完全長成熟形態をコードするｃＤＮＡを、公表された配列（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＭ０１９１１３）に基づいて合成した。発現ベクターを構築するための所望の変異および制限部位を組み込むであろう２セットのオリゴヌクレオチドを使用して、遺伝子をＰＣＲ増幅した。合成遺伝子を、フランキング５’ＮｄｅＩおよび３’ＸｈｏＩを使用して、発現ベクター骨格にサブクローニングした。使用したベクターは、修飾リーダー配列を有するｐＣＷｉｎ２であるか、またはｐＣＷＭ３であった。標準的な技術を使用してＰＣＲ、クローニング、および細菌形質転換を行った（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＦＭら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．１９９８年）。
４．３．ＦＧＦ−２１の発現
第１のステップにおいて、野生型ＦＧＦ−２１をｔｒｘＢ ｇｏｒ ｓｕｐｐ変異大腸菌細胞中で発現させ、生物活性について試験した。精製したポリペプチドは、ヒト初代脂肪細胞を使用してグルコース取込みアッセイにおいて生物活性があることが見出された。次いで、すべての変異ポリペプチドを、同様の手順を使用して発現させた。形質転換されたｔｒｘＢ ｇｏｒ ｓｕｐｐ変異大腸菌細胞の一晩の少量の培養物を使用して、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する５０〜１５０ｍＬの予め温めた動物質を含まないＬＢを接種した。培養物を３７℃で攪拌しながらインキュベートし、ＯＤ６００でモニターした。ＯＤ６００が０．６に達した場合、培養物を１８℃の振とう培養器に３０分間移した。次いで、形質転換細胞をＩＰＴＧによって共に１８℃で誘導した。ＩＰＴＧを０．１ｍＭの最終濃度まで加え、振とう培養を１８℃で１６〜２０時間続けた。遠心分離によって、細胞を４℃で１５分間の７０００×ｇによって回収した。スキャニング電気泳動ゲルのデンシトメトリーによって決定すると、発現レベルは１５〜２０％のライセートタンパク質であることが見出された。
４．４．ＦＧＦ−２１の精製
ＦＧＦ−２１を発現している代表的な２００ｍｌのｔｒｘＢ ｇｏｒ ｓｕｐｐ変異株からの冷凍の細胞ペレットを、微小流動化装置を２度通すことによって、５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）４０ｍｌ中で溶解した。不溶性物質を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローターを使用して遠心分離によって１５分間１３，０００ｒｐｍでペレット化した。２度のクロマトグラフィーステップを使用してすべてのＦＧＦ−２１変異体を精製した。最終の可溶性物質を、０．２２ミクロンフィルターに通過させ、１ｍｌのＱＦＦカラムに１ｍＬ／分で吸着させた。カラムをＡＫＴＡに結合し、５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）中の５００ｍＭのＮａＣｌまで２０ＣＶグラジエントを使用して溶出した。グラジエントの初期の部分の画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシーで染色し、どの画分にプールするかを決定した。次いで、プール画分を、さらにＴＢＳ緩衝液を使用して０．５ｍｌ／分で流れるＳＥＣカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １６／６０）上で分離した。
４．５．ＦＧＦ−２１のグリコシル化
精製したＦＧＦ−２１変異ポリペプチドを、酵素ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の基質として機能する能力について試験した。反応をモニターするためにＭＡＬＤＩを使用した。例示的な反応条件は以下の通りである。２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ６．７）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２中の各変異ＦＧＦ−２１タンパク質１０ｍｃｇを、タンパク質１ｍｇ当たり４０ｍＵのｈＧａｌＮＡｃ−Ｔ２および１０モル当量のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと共に３０℃で６時間インキュベートした。結果を下記の表１８に要約する。
アセトンを反応混合物の３倍の容積で加え、微量遠心管中で最高速度で回転し、タンパク質を沈殿させた。アセトンを除去し、ペレットを水で再懸濁する前に空気乾燥させた。０．５μｌを１０ｍｇ／ｍｌのシナピン酸０．５μｌと混合した。次いで、混合物をＭＡＬＤＩによって分析した。
変異体Ｂ．１〜Ｂ．４、Ｂ．１８、Ｂ．２０、Ｂ．２２、Ｂ．２８、Ｂ．２９、Ｂ．３１〜Ｂ．３６、Ｂ．４１およびＢ．４２は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を使用してＧａｌＮＡｃで完全にグリコシル化できた。変異体Ｂ．１９、Ｂ．２３、Ｂ．３７〜Ｂ．４０およびＢ．４３〜Ｂ．４４は、部分的にグリコシル化した。Ｂ．１８、Ｂ．２０、Ｂ．２９およびＢ．３１〜Ｂ．３６などのいくつかの変異体はグリコシル化したが、それらの変異体の特定の割合までさらなるＧａｌＮＡｃ残基を加えた。ＭＡＬＤＩスペクトルを使用して産物ピーク（ＡＵＣ）と反応物ピークとの比を得ることによって、グリコシル化の程度を推定した。
４．６．ＦＧＦ−２１のグリコＰＥＧ化
一般に、ポリペプチドがＧａｌＮＡｃグリコシル化された場合、引き続くＧａｌおよびＳＡ−ＰＥＧの付加は効率的であった。特に、Ｇａｌおよび４０ｋＤａのＰＥＧのグリコシル化（ＧａｌＮＡｃ）ポリペプチドへの付加について、ＦＧＦ−２１変異体Ｂ．１〜Ｂ．４、Ｂ．２２、Ｂ．２８、Ｂ．４１およびＢ．４２を評価した。例示的な反応条件を下記に要約する。
反応１：ＧａｌＮＡｃの付加
１０ｍｃｇのＦＧＦ−２１ポリペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）を、１０モル当量（０．４ｍＭ）のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＭＢＰ−ｈＧａｌＮＡｃＴ２（４０ｍＵ／ｍｇ）を含有する２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ６．７）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２中で３０℃にて６時間インキュベートした。
反応２：ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌおよび４０ｋＤａ−ＰＥＧの付加
１０ｍｃｇのＦＧＦ−２１ポリペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）を、１０モル当量（０．４ｍＭ）のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、１０モル当量のＵＤＰ−Ｇａｌ（０．４ｍＭ）、２モル当量のＣＭＰ−ＳＡ−４０ｋＰＥＧ（０．０８ｍＭ）（４０ＫＤａ−ｃｙｓ−ＰＥＧ）、ＭＢＰ−ｈＧａｌＮＡｃＴ２（４０ｍＵ／ｍｇ）、ＭＢＰ−ｄコア−１−ＧａｌＴ１（４０ｍＵ／ｍｇ）およびＳＴ３Ｇａｌ１（５０ｍＵ／ｍｇ）を含有する２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ６．７）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２中で３０℃にて１６時間インキュベートした。反応物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した（図３を参照されたい）。
４．７．結果の概要
ｔｒｘＢ ｇｏｒ ｓｕｐｐ変異大腸菌細胞中のＦＧＦ−２１変異体発現、グリコシル化およびグリコＰＥＧ化反応の結果を、下記の表１８に要約する。選択した変異体を、ヒト初代脂肪細胞を使用して細胞をベースとするグルコース取込みアッセイにおいて評価する。
Figure 2009544327
Ｃ末端リンカーのグリコシル化
ペプチドＨ２Ｎ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＣＯ２（４０μｇ）を、Ｓｆ９由来のＧａｌＮＡｃ Ｔ２（２００ｍユニット）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（１ｍＭ、最終）、ＭｎＣｌ２（１０ｍｍ、最終）およびＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）（５０ｍＭ、最終）と共にインキュベートした（２００μＬ）。３７℃での１８時間のインキュベーション後、反応物を４℃で保管した。次いで、試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析し、ペプチドに組み込まれたＧａｌＮＡｃ残基の数を決定した。
本発明を特定の実施形態に関連して開示してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態および変形形態を当業者であれば考案し得ることは明らかである。
本出願において引用したすべての特許、特許出願、および他の公開資料は、その全体が参照により組み込まれている。

Claims (84)

  1. グリコシル化または非グリコシル化シークオンポリペプチドとポリマー修飾基との間の共有結合体であって、前記シークオンポリペプチドは、親ポリペプチドに相当し、かつ外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含み、前記ポリマー修飾基は、前記シークオンポリペプチドに前記Ｏ−結合型グリコシル化配列においてグリコシル連結基を介して結合しており、前記グリコシル連結基は、前記シークオンポリペプチドおよび前記ポリマー修飾基の両方の間に介在しかつ共有結合しており、ただし、前記親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択されるメンバーではない共有結合体。
  2. 前記ポリマー修飾基が、直鎖状および分枝状から選択されるメンバーであり、かつ１つまたは複数のポリマー部分を含み、各ポリマー部分が独立して選択される、請求項１に記載の共有結合体。
  3. 前記ポリマー部分が、ポリ（エチレングリコール）およびメトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ｍ−ＰＥＧ）から選択されるメンバーである、請求項２に記載の共有結合体。
  4. 前記グリコシル連結基が、損傷のないグリコシル連結基である、請求項１に記載の共有結合体。
  5. 式（ＩＩＩ）
    Figure 2009544327
     （式中、
    Ｒ９は、Ｈ、負の電荷または塩対イオンであり、
    Ｒｐは、
    Figure 2009544327
     （式中、ｎは、１〜２０から選択される整数であり、ｆおよびｅは、１〜２５００から独立して選択される整数である）から選択されるメンバーである）による部分を含む、請求項４に記載の共有結合体。
  6. 前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、請求項１に記載の共有結合体。
  7. 前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、（Ｘ）ｍＰＴＰ、（Ｘ）ｍＰＴＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＥＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎおよび（Ｘ）ｍＰＳＤＧ（Ｐ）ｎ
    （式中、
    ｍおよびｎは、０および１から独立して選択される整数であり、
    Ｐは、プロリンであり、
    Ｘは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである、請求項１に記載の共有結合体。
  8. 前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＰＴＰ、ＰＴＥＩ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＶＬ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰおよびＴＥＴＰから選択されるメンバーである、請求項７に記載の共有結合体。
  9. 請求項１に記載の共有結合体と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
  10. シークオンポリペプチドを含むポリペプチド結合体であって、前記シークオンポリペプチドは、親ポリペプチドに相当し、かつ外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を有し、前記ポリペプチド結合体は、式（Ｖ）
    Figure 2009544327
     （式中、
    ｗは、０および１から選択される整数であり、
    ｑは、０および１から選択される整数であり、
    ＡＡ−Ｏ−は、ヒドロキシル基によって置換されている側鎖を有するアミノ酸から誘導される部分であり、前記アミノ酸は前記Ｏ−結合型グリコシル化配列中に位置し、
    Ｚ＊は、グリコシル部分およびグリコシル連結基から選択されるメンバーであり、
    Ｘ＊は、ポリマー修飾基およびポリマー修飾基に共有結合しているグリコシル連結基から選択されるメンバーである）による部分を含み、ただし、前記親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択されるメンバーではないポリペプチド結合体。
  11. 前記アミノ酸が、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）である、請求項１０に記載のポリペプチド結合体。
  12. 前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、
    （Ｘ）ｍＰＴＰ、（Ｘ）ｍＰＴＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＥＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎおよび（Ｘ）ｍＰＳＤＧ（Ｐ）ｎ
    （式中、
    ｍおよびｎは、０および１から独立して選択される整数であり、
    Ｐは、プロリンであり、
    Ｘは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである、請求項１０に記載のポリペプチド結合体。
  13. 前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＰＴＰ、ＰＴＥＩ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＶＬ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰおよびＴＥＴＰから選択されるメンバーである、請求項１２に記載のポリペプチド結合体。
  14. Ｚ＊が、ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳｉａおよびＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａから選択されるメンバーである、請求項１０に記載のポリペプチド結合体。
  15. 前記ポリマー修飾基が、直鎖状および分枝状から選択されるメンバーであり、かつ１つまたは複数のポリマー部分を含み、前記ポリマー部分の各々が独立して選択される、請求項１０に記載のポリペプチド結合体。
  16. 前記ポリマー部分が、ポリ（エチレングリコール）およびその誘導体から選択されるメンバーである、請求項１５に記載のポリペプチド結合体。
  17. ｗが１である、請求項１０に記載のポリペプチド結合体。
  18. Ｘ＊が、シアリルトランスフェラーゼ（Ｓｉａ）部分、ガラクトシル（Ｇａｌ）部分、ＧａｌＮＡｃ部分およびＧａｌ−Ｓｉａ部分から選択されるメンバーである部分を含む、請求項１７に記載のポリペプチド結合体。
  19. 前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、請求項１０に記載のポリペプチド結合体。
  20. Ｘ＊が、式（ＶＩ）
    Figure 2009544327
     （式中、
    Ｅは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ２７およびＣＨＲ２８から選択されるメンバーであり、
    Ｒ２７およびＲ２８は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールおよび置換または非置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーであり、
    Ｅ１は、ＯおよびＳから選択されるメンバーであり、
    Ｒ２は、Ｈ、−Ｒ１、−ＣＨ２Ｒ１、および−Ｃ（Ｘ１）Ｒ１から選択されるメンバーであり、
    Ｒ１は、ＯＲ９、ＳＲ９、ＮＲ１０Ｒ１１、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり、
    Ｒ９は、Ｈ、負の電荷、金属イオン、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびアシルから選択されるメンバーであり、
    Ｒ１０およびＲ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびアシルから独立して選択されるメンバーであり、
    Ｘ１は、置換または非置換アルケニル、Ｏ、ＳおよびＮＲ８から選択されるメンバーであり、
    Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり、
    Ｙは、ＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ、ＣＨ（ＯＨ）、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）、およびＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）から選択されるメンバーであり、
    Ｙ２は、Ｈ、ＯＲ６、Ｒ６、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、
    Figure 2009544327
     から選択されるメンバーであり、
    Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、Ｌａ−Ｒ６ｂ、Ｃ（Ｏ）Ｒ６ｂ、Ｃ（Ｏ）−Ｌａ−Ｒ６ｂ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーであり、
    Ｒ６ｂは、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよび修飾基から選択されるメンバーであり、
    Ｒ３、Ｒ３’およびＲ４は、Ｈ、ＯＲ３”、ＳＲ３”、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、−Ｌａ−Ｒ６ｃ、−Ｃ（Ｏ）−Ｌａ−Ｒ６ｃ、−ＮＨ−Ｌａ−Ｒ６ｃ、＝Ｎ−Ｌａ−Ｒ６ｃおよび−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｌａ−Ｒ６ｃから独立して選択されるメンバーであり、
    Ｒ３”は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり、
    Ｒ６ｃは、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、ＮＲ１３Ｒ１４および修飾基から選択されるメンバーであり、
    Ｒ１３およびＲ１４は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーであり、
    各Ｌａは、結合およびリンカー基から独立して選択されるメンバーである）による部分を含む、請求項１７に記載のポリペプチド結合体。
  21. Ｘ＊が、式（ＶＩＩ）
    Figure 2009544327
     による部分を含む、請求項２０に記載のポリペプチド結合体。
  22. Ｒ６ｂおよびＲ６ｃの少なくとも１つが、
    Figure 2009544327
     （式中、
    ｓ、ｊおよびｋは、０〜２０から独立して選択される整数であり、
    各ｎは、０〜２５００から独立して選択される整数であり、
    ｍは、１〜５の整数であり、
    Ｑは、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーであり、
    Ｒ１６およびＲ１７は、独立して選択されるポリマー部分であり、
    Ｘ２およびＸ４は、ポリマー部分Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合させる独立して選択される連結フラグメントであり、
    Ｘ５は、ポリマー部分以外の非反応性基であり、
    Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＡ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２および−ＳｉＡ１２Ａ１３から選択されるメンバーであり、
    Ａ１２およびＡ１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである）から独立して選択されるメンバーである、請求項２０に記載のポリペプチド結合体。
  23. 請求項１０に記載のポリペプチド結合体と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
  24. 親ポリペプチドに相当するシークオンポリペプチドであって、
    配列番号１および配列番号２
    （Ｘ）ｍＰＯ＊Ｕ（Ｂ）ｐ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｏ）ｔ（Ｐ）ｎ（配列番号１）、および
    （Ｘ）ｍ（Ｂ１）ｐＴＵＢ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｐ）ｎ（配列番号２）
    （式中、
    ｍ、ｎ、ｐ、ｒ、ｓおよびｔは、０および１から独立して選択される整数であり、
    Ｐは、プロリンであり、
    Ｏ＊は、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）から選択されるメンバーであり、
    Ｕは、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から選択されるメンバーであり、
    Ｘ、ＢおよびＢ１は、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーであり、
    Ｚ、ＪおよびＯは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から選択される外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含み、ただし、前記親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択されるメンバーではないシークオンポリペプチド。
  25. 前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、（Ｘ）ｍＰＴＰ、（Ｘ）ｍＰＴＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＥＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎおよび（Ｘ）ｍＰＳＤＧ（Ｐ）ｎ
    （式中、ｍおよびｎは、０および１から独立して選択される整数であり、
    Ｐは、プロリンであり、
    Ｘは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである、請求項２４に記載のシークオンポリペプチド。
  26. 前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＰＴＰ、ＰＴＥＩ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＶＬ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰおよびＴＥＴＰから選択されるメンバーである、請求項２５に記載のシークオンポリペプチド。
  27. 前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼのための基質である、請求項２４に記載のシークオンポリペプチド。
  28. 少なくとも３個のアミノ酸が、前記Ｏ＊と、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）残基との間に見出される、請求項２４に記載のシークオンポリペプチド。
  29. 前記親ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項２４に記載のシークオンポリペプチド。
  30. 前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、請求項２４に記載のシークオンポリペプチド。
  31. 請求項２４に記載の前記シークオンポリペプチドをコードする単離された核酸。
  32. 請求項３１に記載の前記核酸を含む発現ベクター。
  33. 請求項３１に記載の前記核酸を含む細胞。
  34. ＸＰＯ＊Ｐ、ＸＰＯ＊ＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＥＩ、ＸＰＯ＊ＱＡ（Ｐ）ｎ、ＸＰＯ＊ＴＶＳ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＶＳＰ、ＸＰＯ＊ＱＧＡ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＧＡＰ、ＸＰＯ＊ＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、ＸＴＥＯ＊Ｐ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＶＬ、ＸＰＯ＊ＶＬ（Ｐ）ｎ、ＸＰＯ＊ＴＶＬ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＶＬＰ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＴＬＹＶＰ、ＸＰＯ＊ＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＡＳ（Ｐ）ｎ、ＸＰＯ＊ＳＡＶ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＡＶＰ、（Ｘ）ｍＰＯ＊ＳＧ（Ｐ）ｎ、ＸＴＥＯ＊Ｐおよび（Ｘ）ｍＰＯ＊ＤＧ（Ｐ）ｎ
    （式中、
    ｍおよびｎは、０および１から独立して選択される整数であり、
    Ｏ＊は、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）から選択されるメンバーであり、
    Ｘは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から選択されるメンバーであり、
    各Ｓ（セリン）は、Ｔ（スレオニン）によって独立して置換されてもよく、
    各Ｔ（スレオニン）は、Ｓ（セリン）によって独立して置換されてもよい）から選択される外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含む親ポリペプチドに相当するシークオンポリペプチド。
  35. 前記Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼのための基質である、請求項３４に記載のシークオンポリペプチド。
  36. 少なくとも３個のアミノ酸が、前記Ｏ＊と、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）残基との間に見出される、請求項３４に記載のシークオンポリペプチド。
  37. 前記親ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項３４に記載のシークオンポリペプチド。
  38. 前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、繊維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ−７）、繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）、繊維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ−２３）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、請求項３４に記載のシークオンポリペプチド。
  39. 請求項３４に記載の前記シークオンポリペプチドをコードする単離された核酸。
  40. 請求項３９に記載の前記核酸を含む発現ベクター。
  41. 請求項３９に記載の前記核酸を含む細胞。
  42. 複数の異なるメンバーを含むシークオンポリペプチドのライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーは、共通の親ポリペプチドに相当し、かつ外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含み、前記Ｏ−結合型グリコシル化配列の各々は、配列番号１および配列番号２
    （Ｘ）ｍＰＯ＊Ｕ（Ｂ）ｐ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｏ）ｔ（Ｐ）ｎ（配列番号１）、および
    （Ｘ）ｍ（Ｂ１）ｐＴＵＢ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｐ）ｎ（配列番号２）
    （式中、
    ｍ、ｎ、ｐ、ｒ、ｓおよびｔは、０および１から独立して選択される整数であり、
    Ｐは、プロリンであり、
    Ｏ＊は、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）から選択されるメンバーであり、
    Ｕは、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から選択されるメンバーであり、
    Ｘ、ＢおよびＢ１は、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーであり、
    Ｚ、ＪおよびＯは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から独立して選択されるメンバーであるライブラリー。
  43. 前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、
    （Ｘ）ｍＰＴＰ、（Ｘ）ｍＰＴＥＩ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＩＮＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡＭ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＴＥＴ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＶＬ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＬＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＤＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＥＮ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＤ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＡＳ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＱＧＡ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＳＡＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＴＴＬＹＶ（Ｐ）ｎ、（Ｘ）ｍＰＳＳＧ（Ｐ）ｎおよび（Ｘ）ｍＰＳＤＧ（Ｐ）ｎ、
    （式中、
    ｍおよびｎは、０および１から独立して選択される整数であり、
    Ｐは、プロリンであり、
    Ｘは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである、請求項４２に記載のライブラリー。
  44. 前記外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＰＴＰ、ＰＴＥＩ、ＰＴＥＩＰ、ＰＴＱＡ、ＰＴＱＡＰ、ＰＴＩＮＴ、ＰＴＩＮＴＰ、ＰＴＴＶＳ、ＰＴＴＶＬ、ＰＴＱＧＡＭ、ＰＴＱＧＡＭＰおよびＴＥＴＰから選択されるメンバーである、請求項４３に記載のライブラリー。
  45. 前記ライブラリーの各メンバーが、同一のＯ−結合型グリコシル化配列を前記親ポリペプチド中の異なるアミノ酸位置で含む、請求項４２に記載のライブラリー。
  46. 前記ライブラリーの各メンバーが、異なるＯ−結合型グリコシル化配列を前記親ポリペプチド中の同一のアミノ酸位置で含む、請求項４２に記載のライブラリー。
  47. 前記親ポリペプチドがｍアミノ酸を有し、各アミノ酸がアミノ酸位置に相当し、前記ライブラリーが、
    （ａ）第１のアミノ酸位置（ＡＡ）ｎ（式中、ｎは、１〜ｍから選択されるメンバーである）で前記Ｏ−結合型グリコシル化配列を有する第１のシークオンポリペプチドと、
    （ｃ）各々のさらなるシークオンポリペプチドが、（ＡＡ）ｎ＋ｘおよび（ＡＡ）ｎ−ｘ（式中、ｘは、１〜（ｍ−ｎ）から選択されるメンバーである）から選択されるメンバーであるさらなるアミノ酸位置で前記Ｏ−結合型グリコシル化配列を有する、少なくとも１つのさらなるシークオンポリペプチドと
    を含む、請求項４２に記載のライブラリー。
  48. （ＡＡ）ｎ＋ｐおよび（ＡＡ）ｎ−ｐ（式中、ｐは１〜１０から選択される）から選択される第２のアミノ酸位置で前記Ｏ−結合型グリコシル化配列を有する第２のシークオンポリペプチドを含む、請求項４７に記載のライブラリー。
  49. 前記さらなるアミノ酸位置の各々が、予め選択したアミノ酸位置に隣接した、請求項４７に記載のライブラリー。
  50. 前記Ｏ−結合型グリコシル化配列が、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼのための基質である、請求項４２に記載のライブラリー。
  51. 前記ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼが、レクチン−ドメイン欠失ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２およびレクチンドメイン切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２から選択されるメンバーである、請求項５０に記載のライブラリー。
  52. 前記親ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項４２に記載のライブラリー。
  53. 前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、繊維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ−７）、繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）、繊維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ−２３）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、請求項４２に記載のライブラリー。
  54. 宿主細胞中でシークオンポリペプチドを発現させるステップを含み、前記シークオンポリペプチドは、親ポリペプチドに相当し、配列番号１および配列番号２
    （Ｘ）ｍＰＯ＊Ｕ（Ｂ）ｐ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｏ）ｔ（Ｐ）ｎ（配列番号１）、および
    （Ｘ）ｍ（Ｂ１）ｐＴＵＢ（Ｚ）ｒ（Ｊ）ｓ（Ｐ）ｎ（配列番号２）
    （式中、
    ｍ、ｎ、ｐ、ｒ、ｓおよびｔは、０および１から独立して選択される整数であり、
    Ｐは、プロリンであり、
    Ｏ＊は、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）から選択されるメンバーであり、
    Ｕは、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から選択されるメンバーであり、
    Ｘ、ＢおよびＢ１は、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーであり、
    Ｚ、ＪおよびＯは、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）および非荷電アミノ酸から独立して選択されるメンバーである）から選択される外因性Ｏ−結合型グリコシル化配列を含み、ただし、前記親ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択されるメンバーではない方法。
  55. 前記シークオンポリペプチドを単離するステップをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記シークオンポリペプチドを前記Ｏ−結合型グリコシル化配列において酵素によってグリコシル化するステップをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記酵素によってグリコシル化するステップが、グリコシルトランスフェラーゼを使用して達成される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記グリコシルトランスフェラーゼが、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２が、レクチン−ドメイン欠失ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２およびレクチンドメイン切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２から選択されるメンバーである、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記シークオンポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを作製するステップをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
  61. 前記宿主細胞に前記発現ベクターをトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記親ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項５４に記載の方法。
  63. 前記親ポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、濾胞成熟ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロキネチシン、エキセンディン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体、抗呼吸器合胞体ウイルスタンパク質Ｆモノクローナル抗体、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ａ−ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＥＧＦモノクローナル抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体および抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体から選択されるメンバーである、請求項５４に記載の方法。
  64. （ｉ）前記シークオンポリペプチドを組換えで生成するステップと、
    （ｉｉ）前記シークオンポリペプチドを前記Ｏ−結合型グリコシル化配列において酵素によってグリコシル化するステップと
    を含む、請求項１０に記載のポリペプチド結合体の作製方法。
  65. ステップ（ｉｉ）の前記酵素によるグリコシル化が、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを使用して達成される、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼが、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２が、レクチン−ドメイン欠失ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２およびレクチンドメイン切断型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２から選択されるメンバーである、請求項６６に記載の方法。
  68. （ｉ）前記Ｏ−結合型グリコシル化配列を、第１のアミノ酸位置（ＡＡ）ｎに導入することによって、第１のシークオンポリペプチドを組換えで生成するステップと、
    （ｉｉ）前記Ｏ−結合型グリコシル化配列を、（ＡＡ）ｎ＋ｘおよび（ＡＡ）ｎ−ｘ（式中、ｘは、１〜（ｍ−ｎ）から選択されるメンバーである）から選択されるさらなるアミノ酸位置に導入することによって、少なくとも１つのさらなるシークオンポリペプチドを組換えで生成するステップと
    を含む、請求項４７に記載のシークオンポリペプチドのライブラリーの作製方法。
  69. （ｉ）請求項４２に記載のシークオンポリペプチドのライブラリーを生成するステップと、
    （ｉｉ）前記ライブラリーの少なくとも１つのメンバーを酵素によるグリコシル化反応に供し、修飾基によって誘導体化されていてもよいグリコシル部分をグリコシル供与体分子から前記Ｏ−結合型グリコシル化配列の少なくとも１つに転移させ、それによって前記リードポリペプチドを同定するステップと
    を含む、リードポリペプチドを同定する方法。
  70. 前記ライブラリーの少なくとも１つのメンバーについての前記酵素によるグリコシル化反応の収率を測定するステップをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記測定が、質量分析、ゲル電気泳動、核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびＨＰＬＣから選択されるメンバーによって行われる、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記リードポリペプチドの前記収率が、約５０％〜約１００％である、請求項７０に記載の方法。
  73. ステップ（ｉｉ）の前に、前記ライブラリーの少なくとも１つのメンバーを精製するステップをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
  74. ステップ（ｉｉ）の前記グリコシル部分が、ガラクトース部分およびＧａｌＮＡｃ部分から選択されるメンバーを含む、請求項６９に記載の方法。
  75. ステップ（ｉｉ）の前記酵素によるグリコシル化反応が、前記ライブラリーの前記少なくとも１つのメンバーが発現している宿主細胞中で起こる、請求項６９に記載の方法。
  76. （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の生成物をＰＥＧ化反応に供し、前記ＰＥＧ化反応が、化学的ＰＥＧ化反応および酵素によるグリコＰＥＧ化反応から選択されるメンバーである、請求項６９に記載の方法。
  77. ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）が単一の反応容器中で行われる、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記ＰＥＧ化反応の収率を測定するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
  79. 前記測定が、質量分析、ゲル電気泳動、核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびＨＰＬＣから選択されるメンバーによって行われる、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記リードポリペプチドの前記ＰＥＧ化反応の前記収率が約５０％〜約１００％である、請求項７８に記載の方法。
  81. 前記リードポリペプチドが、前記ＰＥＧ化反応時に前記親ポリペプチドの治療活性と本質的に同一の治療活性を有する、請求項７６に記載の方法。
  82. 前記リードポリペプチドが、前記ＰＥＧ化反応時に前記親ポリペプチドの治療活性と異なる治療活性を有する、請求項７６に記載の方法。
  83. 前記シークオンポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを作製するステップをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
  84. 前記宿主細胞に前記発現ベクターをトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
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