TW202227473A

TW202227473A - Ｇｌｐ１－ｇｃｇｒ抗體融合蛋白變體及包含其的組成物

Info

Publication number: TW202227473A
Application number: TW110139308A
Authority: TW
Inventors: 仝慶合; 崔波; 李皓; 洵劉
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2020-10-23
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2022-07-16
Also published as: WO2022083720A1

Abstract

本披露關於GLP1-GCGR抗體融合蛋白變體及包含其的組成物。具體而言，本披露關於GLP1-GCGR抗體融合蛋白的變體，尤其是糖基化變體，以及包含GLP1-GCGR抗體融合蛋白及其變體的組成物、製備和表徵的方法，以及該組成物的用途。

Description

GLP1-GCGR抗體融合蛋白變體及包含其的組成物

本申請要求2020年10月23日提交的專利申請(申請號CN202011143417.5)和2021年10月13日提交的專利申請(申請號CN202111192158.X)的優先權。

本披露關於生物製藥領域，尤係關於GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化變體，以及包含該糖基化變體的醫藥組成物及其用途。

這裡的陳述僅提供與本披露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。

GLP1是影響胰島素分泌最主要的激素之一，人體內具有生物活性的GLP1主要包括GLP1(7-36)醯胺和GLP1(7-37)兩種形式。GLP1藉由小腸L細胞分泌，主要以葡萄糖濃度依賴性方式促進胰島素分泌，保護胰島β細胞，抑制胰高血糖素分泌來降低機體血糖水平。胰高血糖素與胰島素作用相反，主要起升高機體血糖的作用。

胰高血糖素受體(GCGR)為G蛋白偶合受體(GPCR)的B型類別的成員。藉由G蛋白偶合，GCGR刺激可以活化腺苷酸環化酶和cAMP依賴性細胞內信號傳導通路以及磷酸肌醇介導的信號傳導。隨後包括磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、果糖-1、6-二磷酸酶和葡萄糖-6-磷酸酯酶在內的糖異生酶的表達增加，促進葡糖異生作用。此外，GCGR信號傳導可以活化糖原磷酸化酶和抑制肝糖合酶，從而促進糖原分解。研究發現，GCGR基因剔除鼠呈現出GLP1升高、肝糖輸出減少、脂代謝增加、食欲減退等一系列表型。

蛋白質的糖基化是一種最常見的蛋白翻譯後修飾，是在糖基轉移酶作用下將糖類轉移至蛋白質(如，蛋白質上的胺基酸殘基)並形成糖苷鍵的過程。

哺乳動物中蛋白質的糖基化類型主要可分為兩種：N-連接的糖基化和O-連接的糖基化。在N-連接的糖基化中，寡糖共價附接至天冬醯胺；而在O-連接的糖基化中，該附接通常發生在絲胺酸或酪胺酸的羥基上。O-糖基化也可以以羥賴胺酸為連接點，然後逐次將糖殘基轉移上去形成寡糖鏈。葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾(Glucosyl-galactosyl hydroxylysine)的過程如下：賴胺酸經賴胺醯羥化酶(lysyl hydroxylase enzyme)催化，形成5-羥賴胺酸(5-hydroxylysine)。然後進一步經羥基賴胺酸-半乳糖基轉移酶和半乳糖基羥基-賴胺酸-葡萄糖基轉移酶催化，連接上一個半乳糖和葡萄糖，最終形成葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾，使蛋白或肽產生約340Da質量增加。但葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾在抗體產品中非常罕見。

本披露提供一種GLP1的糖基化修飾變體，其包含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾；其中該GLP1的糖基化修飾變體具有更高的穩定性。在一些實施方案中，其中該糖基化變體不易發生肽鏈的斷裂。

本披露同時也提供一種具有基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白，其中該糖基化修飾使融合蛋白具有更好的穩定性，並且，該修飾並不會影響融合蛋白的活性。

在一些實施方案中，前述的GLP1的糖基化修飾變體，其包含半乳糖-羥賴胺酸修飾；在一些實施方案中，前述的GLP1的糖基化修飾變體，其包含葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1的糖基化修飾變體，其中該GLP1包含選自SEQ ID NO：1-5中任一所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述的GLP1的糖基化修飾變體，其中該糖基化修飾位點在GLP1的K28處。其中該胺基酸位置依據自然順序規則編號獲得。

在一些實施方案中，前述的GLP1的糖基化修飾變體，其包含至少1個葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1的糖基化修飾變體，其包含至少2個葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1的糖基化修飾變體，其包含多個葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

本披露提供一種GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其包含根據前述任一項所述的GLP1的糖基化修飾變體和抗GCGR抗體。

本披露同時也提供一種GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其包含GLP1的糖基化修飾變體和抗GCGR抗體，其中該GLP1的糖基化修飾變體包含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該抗GCGR抗體包含：

重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，前述GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，

其中該GLP1的糖基化修飾變體包含半乳糖-羥賴胺酸修飾。

其中該GLP1的糖基化修飾變體包含葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該GLP1的糖基化修飾變體包含選自SEQ ID NO：4、1、2、3和5中任一所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾位點在GLP1的K28處。

在一些實施方案中，前述GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該GLP1包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列，且其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾位點在SEQ ID NO：4的K28處。

重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：12、13、14或15所示的胺基酸序列；和

輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：16、17或18所示的胺基酸序列。

如SEQ ID NO：19所示的重鏈恆定區，和如SEQ ID NO：20所示的輕鏈恆定區。

如SEQ ID NO：21所示的重鏈，和如SEQ ID NO：22所示的輕鏈。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該GLP1的C-端藉由接頭或直接連接至抗GCGR抗體。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該GLP1的C-端藉由接頭連接至抗GCGR抗體的重鏈可變區N-端。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該GLP1的C-端藉由接頭連接至抗GCGR抗體的輕鏈可變區N-端。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該GLP1的C-端藉由接頭(G₄S)₃連接至抗GCGR抗體的重鏈可變區N-端。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其包含兩條序列相同的第一肽鏈和兩條序列相同的第二肽鏈，其中，

第一肽鏈，其包含如SEQ ID NO：23、24、25或26所示的胺基酸序列；和

第二肽鏈，其包含如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列。

第一肽鏈，其包含如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；和

第二肽鏈，其包含如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾為半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾為葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾位點在SEQ ID NO：23-26中任一所示的第一肽鏈的K28處。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾至少包含1個葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾為至少包含2個葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾為包含多個葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其相對於不含糖基化的GLP1-GCGR抗體融合蛋白具有約340Da或約680Da的分子量增加。葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾的在蛋白水平理論平均分子量是340.2806Da，質譜實際檢測的分子量通常與理論分子量會存在偏差，但偏差不會超過5Da。在本申請中，檢測到的分子量包括340Da。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該糖基化修飾變體相對於不含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾抗體融合蛋白發生340Da±5Da或680Da±10Da的分子量增加；其中該分子量藉由去糖還原分子量LC-MS或去糖完整分子量LC-MS分析測定。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其相對於不含基於羥賴胺酸的O-糖基化的GLP1-GCGR抗體融合蛋白不易發生肽鏈的斷裂，具有更高的穩定性。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其相對於不含基於羥賴胺酸的O-糖基化的GLP1-GCGR抗體融合蛋白，該糖基化變體的第一鏈不易在K28、W25和/或F22位發生斷裂；其中該胺基酸位置依據自然順序規則編號獲得。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其相對於不含基於羥賴胺酸的O-糖基化的GLP1-GCGR抗體融合蛋白，該糖基化變體的第一鏈不易在K28、W25和/或F22位發生斷裂。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其相對於不含基於羥賴胺酸的O-糖基化的GLP1-GCGR抗體融合蛋白，該糖基化變體的第一鏈不易在K28和/或W25位發生斷裂。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其相對於不含基於羥賴胺酸的O-糖基化的GLP1-GCGR抗體融合蛋白，該糖基化變體的第一鏈不易在K28和/或F22位發生斷裂。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其相對於不含基於羥賴胺酸的O-糖基化的GLP1-GCGR抗體融合蛋白，該糖基化變體的第一鏈不易在W25和/或F22位發生斷裂。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，在25℃放置4天後，其中該糖基化變體的第一肽鏈不容易在K28、W25和/或F22位點發生斷裂，其中該胺基酸位置依據自然規則編號獲得。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，在25℃放置4天後，其中該糖基化變體的第一肽鏈在K28、W25和/或F22位點發生斷裂的比率之和小於22%，小於15%或小於5%。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，在25℃放置7天後，其中該糖基化變體的第一肽鏈在K28、W25和/或F22位點發生斷裂的比率之和小於33%，小於20%，小於15%或小於5%。

本披露提供一種組成物，其包含GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其中該GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體包含前述任一項所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體。

本披露提供一GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其中該GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體包含前述任一項所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體。

在一些實施方案中，GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體是均質的。

在另一些實施方案中，GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體是非均質的。群體中包含基於羥賴胺酸的O-糖修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體、和/或未包含基於羥賴胺酸的O-糖修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，是一種混合體，其包含：含有其他修飾(即：除葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸以外的修飾)的GLP1-GCGR抗體融合蛋白和含有葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，是一種混合體，其包含：含有葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白糖基化修飾變體以及無葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白。

在一些實施方案中，前述GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其中該GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體包含：

第二肽鏈，其包含如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其中該GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體包含葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其中該GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體包含如SEQ ID NO：23所示的第一肽鏈和如SEQ ID NO：22所示的第二肽鏈，且包含一個或多個葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其中該GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體為：

i)同二聚體變體，其中兩條第一肽鏈均包含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾；或

ii)異二聚體變體，其中只有一條第一肽鏈包含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其中該GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體的基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾發生在第一肽鏈的K28處。其中該胺基酸位置依據自然順序規則編號獲得。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體物，其中該GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體的基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾至少包含1個葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其中該GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體的基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾至少包含2個葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其中該GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體的基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾包含多個葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

i)同二聚體變體，其中兩條第一肽鏈均包含葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾；或

ii)異二聚體變體，其中只有一條第一肽鏈包含葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。

在一些實施方案中，前述的糖基化修飾變體在GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體中的比例至少為0.1%。在一些實施方案中，前述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其中該糖基化修飾變體在GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體中的比例至少為1%。在一些實施方案中，前述的的糖基化修飾變體在GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體中的比例至少為10%。其中該糖基化修飾變體的含量藉由LC-MS(液相色譜-質譜法)測量。

本披露還提供一種醫藥組成物，其含有如前任一項所述的GLP1的糖基化修飾變體，或如前任一項所述GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，或如前所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。

本披露還提供一種降低受試者血糖濃度的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如前任一項所述的GLP1的糖基化修飾變體，或如前任一項所述GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，或如前所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，或如前所述的醫藥組成物。

在一些實施方案中，該治療有效量為單位劑量的組成物中含有0.1-3000mg的如前任一項所述的GLP1的糖基化修飾變體，或如前任一項所述GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，或如前所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，或如前所述的醫藥組成物。

本披露還提供如前任一項所述的GLP1的糖基化修飾變體，或如前任一項所述GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，或如前所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，或如前所述的醫藥組成物在製備用於治療代謝障礙的藥物中的用途。

本披露中如前任一項所述的GLP1的糖基化修飾變體，或如前任一項所述GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，或如前所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，或如前所述的醫藥組成物可用作藥物，較佳用作降低血糖的藥物。

本披露還提供一種治療代謝障礙的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如前任一項所述的GLP1的糖基化修飾變體，或如前任一項所述GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，或如前所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，或如前所述的醫藥組成物。

本披露中如前任一項所述的GLP1的糖基化修飾變體，或如前任一項所述GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，或如前所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，或如前所述的醫藥組成物可用作治療代謝障礙的藥物。

在一些實施方案中，其中該代謝障礙選自：代謝綜合症、肥胖症、葡萄糖耐量受損、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高滲綜合症、圍術期高血糖症、高胰島素血症、胰島素抵抗綜合症、空腹血糖受損、血脂異常、動脈粥樣硬化和糖尿病前期狀態。

本披露中涉及的抗GLP1及GLP1-GCGR抗體融合蛋白的序列及相關性能均已記載在公開號為WO2020125744的國際申請中，該申請中的全部內容引用至本申請。

本披露中涉及的GLP1序列如下：

本披露中涉及的抗GCGR抗體相關序列如下：

抗GCGR抗體的可變區如下：

>hu1803_VH.1：

SEQ ID NO：12；

>hu1803_VH.1A：

SEQ ID NO：13；

>hu1803_VH.1B：

SEQ ID NO：14；

>hu1803_VH.1C：

SEQ ID NO：15；

>hu1803_VL.1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYSSTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNIFPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：16；

>hu1803_VL.1A：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGAVKLLIYYSSTLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQTNIFPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：17；

>hu1803_VL.1B：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYSSTLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQTNIFPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：18。

上表中抗體名稱所指代的抗體輕、重鏈可變區可以分別與抗體輕、重鏈恆定區連接形成全長抗體。在本披露中如無明確說明時，形成全長抗體時輕鏈可變區與SEQ ID NO：20所示的Kappa鏈恆定區連接形成抗體輕鏈，重鏈可變區與SEQ ID NO：19所示的IgG4-AA連接形成抗體重鏈。

IgG4-AA的重鏈恆定區序列如下：

SEQ ID NO：19；

抗體的輕鏈(Kappa鏈)恆定區序列如下：

SEQ ID NO：20。

示例性的抗GCGR抗體序列：

hu1803-9重鏈序列：

SEQ ID NO：21；

hu1803-9輕鏈序列：

SEQ ID NO：22。

將GLP1多肽直接或藉由接頭(G₄S)₃連接至抗GCGR抗體重鏈的N端，與抗GCGR抗體輕鏈共同藉由CHO表達系統表達，獲得本披露中的GLP1-GCGR抗體融合蛋白(其結構見圖1)。示例性的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的序列如下所示：

1.融合蛋白hu1803-9D：

hu1803-9D第一條鏈

SEQ ID NO：23；

hu1803-9D第二條鏈

SEQ ID NO：22。

2.融合蛋白hu1803-9A：

hu1803-9A第一條鏈

SEQ ID NO：24；

hu1803-9A第二條鏈：

SEQ ID NO：22。

3.融合蛋白hu1803-9B：

hu1803-9B第一條鏈

SEQ ID NO：25；

hu1803-9B第二條鏈：

SEQ ID NO：22。

4.融合蛋白hu1803-9C：

hu1803-9C第一條鏈

SEQ ID NO：26；

hu1803-9C第二條鏈：

SEQ ID NO：22。

圖1：本披露的GLP1-GCGR抗體融合蛋白結構示意圖。

圖2：GLP1-GCGR抗體融合蛋白質譜鑑定譜圖。

圖3A至圖3B：Ides酶切後質譜鑑定譜圖；圖3A顯示Fd部分的質譜圖；圖3B顯示Fc/2單體的質譜圖。橫坐標為質量(Da)；縱坐標為質譜信號強度。

圖4A至圖4B：K28位O-糖基化肽段的質譜二級圖譜；圖4A為K28位O-糖基化修飾位點鑑定質譜圖；圖4B為K28位O-糖基化肽段的糖基化修飾特徵碎片質譜圖，其中1944.825Da為母離子，1782.7725Da為母離子-162Da，1620.7184Da為母離子-324Da。橫坐標為質量(Da)；縱坐標為質譜信號強度。

圖5A至圖5C：GLP1-GCGR抗體融合蛋白的第一鏈質譜檢測結果；圖5A為正常GLP1-GCGR的第一鏈質譜檢測結果；圖5B為GLP1-GCGR突變體1的第一鏈質譜檢測結果；圖5C為GLP1-GCGR突變體2的第一鏈質譜檢測結果。橫坐標為質量(Da)；縱坐標為質譜信號強度。

圖6：GLP1-GCGR抗體融合蛋白的HIC分析圖譜。

圖7A至圖7B：HIC收集樣品峰3(圖7A)和峰4(圖7B)去糖完整分子量質譜檢測結果；“完整”為正常GLP1-GCGR去糖完整抗體融合蛋白的峰；“完整 +340Da”表示在正常GLP1-GCGR的基礎上帶有1個葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾的峰。橫坐標為質量(Da)；縱坐標為質譜信號強度。

術語

為了更容易理解本披露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本披露所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。

說明書和申請專利範圍中所用的單數形式“一個”、“一種”和“該”包括複數指代，除非上下文清楚表明並非如此。

除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。

術語“和/或”，例如“X和/或Y”應當理解為意指“X和Y”或“X或Y”並且應當被用來提供對兩種含義或任一含義的明確支持。

本披露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

術語“胺基酸”是指天然存在的和合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基谷胺酸和O-鄰磷酸絲胺酸。胺基酸類似物是指與天然存在的胺基酸具有相同基本化學結構(即與氫結合的α碳、羧基、胺基和R基團，例如高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶)的化合物。此類類似物具有修飾的R基團(例如，正亮胺酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有如下結構的化合物，該結構與胺基酸的一般化學結構不同但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用。

術語“抗體融合蛋白”是指將目的蛋白質(多肽)與抗體連接形成的具有生物活性的融合蛋白。該融合蛋白具有所連接的蛋白質的生物學活性以及免疫球蛋白活性。在一些實施方案中，本披露所述的抗體融合蛋白是指GLP1多肽與抗GCGR抗體的融合蛋白(GLP1-GCGR抗體融合蛋白)，其中該GLP1融合至抗GCGR抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區的N-端。在一些實施方式中，該GLP1多肽藉由接頭連接至抗GCGR抗體重鏈可變區的N-端，形成具有四肽結構的GLP1-GCGR抗體融合蛋白。在一些實施方式中，該GLP1-GCGR抗體融合蛋白具有兩條序列相同的第一鏈和兩條序列相同的第二鏈，其中，第一肽鏈，其包含SEQ ID NO：23、24、25或26所示的胺基酸序列；和第二肽鏈，其包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列。

本文所用的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的“糖基化變體”是這樣的融合蛋白，與未糖基化的GLP1-GCGR抗體融合蛋白相比，其具有一個或多個附著於GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖類部分。在一個實施方案中，該糖基化變體具有附著於GLP1-GCGR抗體融合蛋白的第一肽鏈的寡糖結構。在一個實施方案中，該糖基化變體具有附著於GLP1-GCGR抗體融合蛋白的第一肽鏈的基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾。在某些實施方案中，該糖基化變體具有附著於GLP1-GCGR抗體融合蛋白的一條或兩條第一鏈的GLP1上的葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。在某些實施方案中，該糖基化位點在第一鏈的K28胺基處。在某些實施方案中，兩個第一條鏈都發生糖基化(同二聚體變體)。在某些其他實施方案中，只有一個第一鏈發生糖基化(異二聚體變體)。在某些實施方案中，共價附著於第一鏈中的K28的寡糖在糖基化變體間可以是異質的。

“N-連接的糖基化”中N-連接是指碳水化合物部分與天門冬醯胺殘基的側鏈連接。三肽序列天門冬醯胺-X-絲胺酸(NXS)和天門冬醯胺-X-蘇胺酸(NXT)，其中X是除脯胺酸外的任何胺基酸，是碳水化合物部分與天門冬醯胺側鏈酶連接的識別序列。所屬技術領域具有通常知識者已知，例如小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3中的每一種，以及人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgD CH2區在胺基酸殘基297具有單獨的N連接糖基化位點。

“O-連接的糖基化”或“O-糖基化”是指將N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種糖與含羥基的胺基酸連接。O-連接的糖基化位點通常是天然胺基酸(例如，絲胺酸、蘇胺酸)或非天然胺基酸(例如，5-羥脯胺酸或5-羥賴胺酸)的羥基側鏈。示例性O-連接的糖殘基包括但不限於N-乙醯半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖。在本披露中，葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾即是一種O-糖基化修飾，其中GLP1序列中賴胺酸首先被羥基化，然後依次連接半乳糖和葡萄糖。

“GLP1多肽”、“GLP-1多肽”、“GLP1肽”或“GLP1”是指能結合並激活GLP1受體的肽。包括GLP-1、GLP-1類似物和GLP-1受體肽激動劑，部分具體的GLP-1肽例如：利西拉來(Lixisenatide)/AVE0010/ZP10/Lyxumia、艾塞那肽(Exenatide)/毒蜥外泌肽-4/Byetta/Bydureon/ITCA 650/AC-2993、利拉魯肽/Victoza、索馬魯肽(Semaglutide)、他司魯肽(Taspoglutide)、Syncria/阿必魯肽(Albiglutide)、度拉糖肽(Dulaglutide)、rExendin-4、CJC-1134-PC、PB-1023、TTP- 054、蘭稜肽(Langlenatide)/HM-11260C、CM-3、GLP-1 Eligen、ORMD-0901、NN-9924、NN-9926、NN-9927、Nodexen、Viador-GLP-1、CVX-096、ZYOG-1、ZYD-1、GSK-2374697、DA-3091、MAR-701、MAR709、ZP-2929、ZP-3022、TT-401、BHM-034、MOD-6030、CAM-2036、DA-15864、ARI-2651、ARI-2255、艾塞那肽-XTEN和胰高血糖素-Xten，本披露中示例性的GLP1包含如SEQ ID NO：1-5所示的序列。

“GCGR”是胰高血糖素(Glucagon)受體，是GPCR家族的成員之一，胰高血糖素與GCGR結合後主要藉由激活下游途徑，加速糖原分解、脂肪分解和/或糖異生，使血糖升高。

術語“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，和抗體片段，只要它們展現出期望的抗原結合活性。

“天然抗體”指具有不同結構的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150,000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫化物鍵合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成。從N至C端，每條重鏈具有一個可變區(VH)，又稱作可變重域或重鏈可變域，接著是三個恆定域(CH1,CH2和CH3)。類似地，從N至C端，每條輕鏈具有一個可變區(VL)，又稱作可變輕域，或輕鏈可變域，接著是一個恆定輕(CL)域。根據其恆定域胺基酸序列，抗體輕鏈包括兩種類型，kappa(κ)和lambda(λ)。根據抗體重鏈恆定區的胺基酸的組成和排列順序不同，可將抗體分為五類，或稱為抗體同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域(CH1、CH2和CH3)組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區包含一個結構域，即CL。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補性決定區(CDR)，其間穿插有稱為框架區(FR)的較保守區。每條輕鏈的包含3個CDR區：LCDR1、LCDR2、和LCDR3；每條重鏈的包含3個CDR區：HCDR1、HCDR2和HCDR3。每個VH和VL由從胺基末端排到羧基末端按以下順序排列的三個CDR和四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq))的結合。

術語“互補決定區”、“CDR”或“高變區”是指可變結構域內主要促成抗原結合的區域。通常，每個重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每個輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以各種公知方案來確定CDR的胺基酸序列邊界，例如：“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則、“ABM”編號規則、“contact”編號規則(參見Martin,ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)；Front Immunol.2018 Oct 16；9：2278)等。這些編號系統之間的關係是所屬技術領域具有通常知識者熟知的。

例如，對於經典格式，遵循Kabat規則，該重鏈可變域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。

遵循Chothia規則，VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並且VL中的胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。

遵循IMGT規則，VH中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-38(CDR1)、56-65(CDR2)和105-117(CDR3)，VL中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-38(CDR1)、56-65(CDR2)和105-117(CDR3)。

遵循AbM規則，VH中的CDR胺基酸編號為26-35(HCDR1)、50-58(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並且VL中的胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。

除非另有說明，本披露實施例中的可變區和CDR序列均適用“Kabat”編號規則。

術語“抗體框架”或“FR區”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

“抗體恆定區結構域”指來源於抗體的輕鏈和重鏈的恆定區的結構域，包括CL和來源於不同類抗體的CH1、CH2、CH3結構域。本披露的恆定區還包括該人抗體重鏈恆定區和人抗體輕鏈恆定區的“常規變體”，其指現有技術已公開的來源於人的不改變抗體可變區結構和功能的重鏈恆定區或輕鏈恆定區的變體，示例性變體包括對重鏈恆定區進行定點改造和胺基酸替換的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區變體，具體替換如現有技術已知的YTE突變、L234A和/或L235A突變、S228P突變、和/或獲得knob-into-hole結構的突變(使得抗體重鏈具有knob-Fc和hole-Fc組合)，這些突變已被證實使得抗體具有新的性能，但不改變抗體可變區的功能。

“抗體片段”指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，該部分與完整抗體所結合的抗原相結合。抗體片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab')2、Fd、dAb；駱駝科VHH結構域；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。

“接頭”或“連接子”指用於連接多肽(如蛋白質結構域)的多肽序列，通常具有一定的柔性，接頭的使用不會使多肽原有結構和功能喪失。典型的連接子包含約1-30個、2-24個或3-15個胺基酸。在一些實施方案中，其中該接頭為(G₄S)n，其中n為1-20中的整數；較佳地，n為3。

術語“Fc結構域”、“Fc區”或“片段可結晶區”用於定義抗體重鏈的C末端區域，包括天然序列Fc區和變體Fc區。在一些實施方式中，人IgG重鏈的Fc區定義為從Cys226位置處的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。抗體重鏈的Fc區的邊界還可以變化，例如缺失Fc區的C末端賴胺酸(根據EU編號系統的殘基447)或缺失Fc區的C末端甘胺酸和賴胺酸(根據EU編號系統的殘基446和447)。因此，在一些實施方式中，完整抗體的組成物可以包括去除了所有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組成物可以包括沒有去除K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組成物具有帶有和不帶有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體混合物的抗體群體。用於本文所述抗體的合適天然序列Fc區包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。除非本文中另有規定，Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號方式依照EU編號系統，又稱作EU索引，如記載於Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。

術語“全長抗體”，“完整抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用，指與天然抗體結構具有基本上類似的結構或者具有含有如本文中所界定的Fc區的重鏈的抗體。

“特異性地結合”、“特異性結合”或“結合”是指抗體(或抗體片段)，以比針對其他抗原或表位更高的親和力，結合至某個抗原或其表位。通常，抗體以約1×10^-7M或更小(例如約1×10^-8M或更小、約1×10^-9M或更小、約1×10^-10M或更小、約1×10^-11M或更小，或者約1×10^-12M或更小)的平衡解離常數(KD)結合抗原或其表位，通常KD為該抗體結合至非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的至少百分之一。可使用標準程序來測量KD。然而，特異性結合至抗原或其表位的抗體可能對其它相關的抗原具有交叉反應性；例如，對來自其它物種(同源)(諸如人或猴，例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp))或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset))的同源抗原具有交叉反應性。

“親和力”指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。分子X對其配偶體Y的親和力通常可以用解離常數(KD)來表述。親和力可以藉由本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的方法。

術語“k_assoc”或“ka”意在是指特定抗體-抗原相互作用的締合速率。如本文所使用的術語“k_dis”或“kd”意在是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如本文所使用的，術語“KD”意在是指解離常數，其獲得自kd與ka的比率(即kd/ka)並且表示為莫耳濃度(M)。可以使用本領域良好建立的方法測定抗體的KD值。用於測定抗體KD的方法包括使用生物傳感系統例如系統測量表面電漿共振，或藉由溶液平衡滴定法(SET)測量溶液中的親和力。

術語“核酸”在本文中可與術語“多核苷酸”互換使用，並且是指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，該核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。

除非另有說明，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡並密碼子取代)和互補序列以及明確指明的序列。具體地，如下詳述，簡並密碼子取代可以藉由產生如下序列而獲得，在這些序列中，一個或多個所選的(或全部)密碼子的第三位被混合鹼基(mixed-base)和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res[核酸研究].19：5081,1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem [生物化學雜誌].260：2605-2608,1985；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes[分子與細胞探針]8：91-98,1994)。

序列“同一性”指，當對兩條序列進行最佳比對時，必要時引入間隙，以獲取最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分，兩條序列的胺基酸/核酸在等價位置相同的程度(百分比)。為測定序列同一性百分比，比對可以藉由屬於本領域技術的範圍內的多種方式來實現，例如使用公開可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。本所屬技術領域具有通常知識者可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。

當適用胺基酸序列時，“保守修飾的變體”或“保守性取代”指使用具有相似特徵(例如，電荷、側鏈尺寸、親水性/疏水性、骨架構型和剛性等)的其他胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得通常可以做出這樣的變化而統計學上不顯著改變蛋白的生物活性。所屬技術領域具有通常知識者知曉，在通常情況下，在多肽的非必需區域中的單胺基酸置換基本上不改變生物活性(參見例如，Watson等，(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(4th Ed.))。此外，結構或功能上類似的胺基酸的置換不太可能破壞生物活性。示例性的保守性置換如下表中所示。

術語“保守修飾的變體”當適用核酸序列時，保守修飾的變體是指那些編碼相同或基本上相同的胺基酸序列的核酸，或在該核酸不編碼胺基酸序列的情況下，是指基本相同的序列。由於遺傳密碼的簡並性，任何給定的蛋白質均可以由多個功能相同的核酸編碼。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙胺酸。因此，在密碼子指定丙胺酸的每個位置，該密碼子可以改變為任何該相應密碼子而不改變編碼的多肽。此類核酸變異是“沉默變異”，它們是保守修飾變異中的一種。本文中編碼多肽的每個核酸序列也描述了核酸的每種可能的沉默變異。所屬技術領域具有通常知識者將認識到，核酸中的每個密碼子(除了AUG通常是甲硫胺酸的唯一密碼子；和TGG通常是色胺酸的唯一密碼子)均可以被修飾以產生功能相同的分子。因此，在每個該序列中均隱含了編碼多肽的核酸的每一種沉默變異。

術語“約”、“大約”是指數值在由所屬技術領域具有通常知識者所測定的具體值的可接受誤差範圍內，可接受誤差範圍取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，在本領域每一次實行中“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著其後所示的具體數值±30%的範圍。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級、或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本申請說明書和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。

“GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體”是指包含GLP1-GCGR抗體融合蛋白不同修飾變體的混合群體，其群體中不僅包含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾變體，無糖基化修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白，還包含其他修飾變體，如N-糖基化修飾變體等。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白糖基化修飾變體或GLP1糖基化修飾變體與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。

術語“藥學上可接受的載體”意指生理學上相容的任何溶劑、分散介質、塗層、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收增強或延遲劑等。藥學上可接受的載體的一些實例為水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、具有氯化鈉的乙酸鹽緩衝液、右旋糖、甘油、聚乙二醇、乙醇等以及其組合。在許多情況下，組成物中較佳包含等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。藥學上可接受的物質的其他實例為表面活性劑、濕潤劑或少量輔助物質例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其增強抗體的保質期或有效性。

本披露的醫藥組成物可藉由本領域已知的各種方法施用。施用途徑和/或方式根據所希望的結果而變化。較佳地，施用可以是玻璃體內、靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下或在靶標部位附近施用。藥學上可接受的載體應適合於玻璃體內、靜脈內、肌肉內、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(例如，藉由注射或輸注)。根據施用途徑，活性化合物(即抗體，雙特異性和多特異性分子)可以包被在材料中以保護化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然條件的作用。

術語“受試者”包括人類和非人類動物。非人動物包括所有脊椎動物(例如哺乳動物和非哺乳動物)例如非人靈長類(例如，食蟹猴)、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非指出時，否則該術語“患者”或“受試者”在本文中可互換地使用。如本文所使用的，術語“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。在某些實施方案中，個體或受試者是人。

“施用”、“給予”和“處理”，當其應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。

“樣品”是指從受試者分離的類似流體、細胞、或組織的採集物，以及存在於受試者體內的流體、細胞或組織。示例性樣品為生物流體，諸如血液、血清和漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液、淚液、***物、痰、分泌組織和器官的黏膜分泌物、***分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體、由支氣管灌洗液收集的流體、滑液、與受試者或生物來源接觸的液體溶液，例如細胞和器官培養基(包括細胞或器官條件培養基)、灌洗液等，組織活檢樣品、細針穿刺、手術切除的組織、器官培養物或細胞培養物。

“治療/處理”(及其語法變型)指試圖改變所治療個體的天然過程的臨床干預，並且可以為了預防或者在臨床病理學的過程期間實施。治療的期望效果包括但不限於預防疾病的發生或再發生、減輕症狀、減輕/減少疾病的任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病狀態、和消退或改善的預後。在一些實施方案中，使用本披露的抗體來延遲疾病的形成或減緩疾病的進展。

“有效量”一般是足以降低症狀的嚴重程度及/或頻率、消除這些症狀及/或潛在病因、預防症狀及/或其潛在病因出現及/或改良或改善由疾病狀態引起或與其相關的損傷的量。

在一些實施例中，有效量是治療有效量或預防有效量。

“治療有效量”是足以治療疾病狀態或症狀、尤其與該疾病狀態相關的狀態或症狀，或者以其他方式預防、阻礙、延遲或逆轉該疾病狀態或以任何方式與該疾病相關的任何其他不理想症狀的進展的量。

“預防有效量”是當給予受試者時將具有預定預防效應，例如預防或延遲該疾病狀態的發作(或復發)，或者降低該疾病狀態或相關症狀的發作(或復發)可能性的量。

完全治療或預防效應未必因給予一個劑量便發生，而且可能僅在給予一系列劑量之後發生。因而，治療或預防有效量可以一次或多次給予的方式給予。“治療有效量”和“預防有效量”可取決於以下因素變化：諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及治療劑或治療劑組合在個體中引發期望的應答的能力。有效治療劑或治療劑組合的示例性指標包括例如患者改善的健康狀況。

術語“代謝障礙”的具體示例為代謝綜合症、肥胖症、葡萄糖耐量受損、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高滲綜合症、圍術期高血糖症、高胰島素血症、胰島素抵抗綜合症、空腹血糖受損、血脂異常、動脈粥樣硬化或糖尿病前期狀態。

以下結合實施例和測試例進一步描述本披露，但這些實施例和測試例並非限制著本披露的範圍。本披露實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件；未註明具體來源的試劑材料，為市場購買獲得。

實施例1.O-糖基化抗體融合蛋白的製備和鑑定

藉由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生抗GLP1-GCGR抗體群體，後經過protein A親和純化獲得GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體。

對GLP1-GCGR抗體融合蛋白hu1803-9D進行去糖還原分子量LC-MS分析，具體實驗過程如下：

用pH7.9碳酸氫銨將GLP1-GCGR抗體融合蛋白樣品稀釋到0.5mg/mL，取100μL樣品，分別加入1μL肽N糖苷酶F(PNGase F，new England lab，QPF-001-B)，45℃水浴1小時，加入2μL 1M DTT溶液，37℃水浴30分鐘；反應完成後進行LC-MS分析。

LC條件如下：液相色譜為Waters UPLC H-class；色譜管柱為Waters BEH C4 2.1×50mm，1.7μm色譜管柱；進樣量：0.5μL；管柱溫：80℃；流速：0.3mL/分；沖提梯度流動相B(0.1%甲酸乙腈)在15分鐘從5%升為30%，再在接下來的一分鐘從30%升為90%。

質譜為Waters Xevo G2-XS QTOF質譜，採用正離子模式進行數據採集，採集完的數據使用Waters unifi軟體進行數據分析。

結果顯示(見圖2)，GLP1-GCGR抗體融合蛋白hu1803-9D的重鏈經過去N-糖處理後仍存在多種異質體；但第一鏈的主要成分均得到解析，包括第一鏈發生羥基化或者氧化的成分(第一鏈+16Da)和第一鏈的GCGR抗體重鏈C末端賴胺酸未缺失成分(第一鏈+K)。但是，仍有高比例(約20%)的比正常第一鏈增加340Da組分未能得到解析。

實施例2.糖基化的鑑定和表徵

1.Ides酶切還原分子量LC-MS分析：

Ides酶可以特異性的酶切IgG，還原處理後會得到Fc/2和Fd兩部分，經LC-MS檢測，以此來對340Da修飾發生的位置進行初步定位。

Ides酶切還原分子量LC-MS分析方法如下：

用pH7.9碳酸氫銨將GLP1-GCGR抗體融合蛋白hu1803-9D樣品稀釋到0.5mg/mL，取100μL樣品，分別加入50單位Ides酶(Genovis，FabRICATOR)，37℃水浴4小時，加入2μL 1M DTT溶液，37℃水浴30分鐘；反應完成後進行LC-MS分析。

質譜為Waters Xevo G2-XS QTOF質譜，採用正離子模式進行數據採集，採集完的數據使用Waters unifi軟體進行數據分析。結果見圖3A和圖3B。

結果顯示，使分子量增加340Da的修飾發生在Fd部分。

2.肽圖LC-MS分析：

採用Glu-c酶對樣品進行酶切處理，然後進行肽圖LC-MS分析，具體實驗過程如下：

hu1803-9D樣品經過6M鹽酸胍的250mM Tris-HCl(pH7.4)溶液進行變性處理，然後在37℃條件下加入終濃度20mM DTT還原處理1小時，後續加入終濃度為50mM的IAM進行烷基化封閉，後續使用Glu-c(Promega，V1651)在37℃ 酶切7小時，90℃滅活5分鐘後恢復至室溫後，加入chymotrypsin(Promega，V1062)反應完成後經LC-MS分析。

LC條件如下：液相色譜為Waters UPLC H-class，色譜管柱為Waters BEH C18 2.1×150mm，1.7μm色譜管柱；進樣量：0.5μL；管柱溫：65℃；流速：0.3mL/分；沖提梯度流動相B(0.1%甲酸乙腈)在65分鐘從2%升為40%。

質譜為Waters XeVo G2-XS QTOF質譜，採用正離子模式進行數據採集，採集完的數據使用Waters unifi軟體進行數據分析。質譜結果見圖4A和圖4B。

經質譜分析發現在，在hu1803-9D第一肽鏈的GLP-1多肽K28發生增加340Da的後修飾，如圖4A所示。碎片離子y20(KGGGGGGGSGGGGSGGGGSE，SEQ ID NO：27)的分子量為1732.6911Da，碎片離子y19(GGGGGGGSGGGGSGGGGSE，SEQ ID NO：28)的分子量為1264.4795Da，碎片離子y20比碎片離子y19多了一個K，理論上講，二者的分子量差值應該為128Da，但是實際上二者的差值為468Da，比理論分子量多出340Da。且LVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSE肽段(SEQ ID NO：29)在CID質譜碎裂的二級譜圖顯示為糖基化常見的特徵碎片，母離子-162Da和-324Da(見圖4B)，以上兩種糖基化特徵碎片和分子量增加340Da證明了該肽段發生的翻譯後修飾為葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾(Glucosyl-galactosyl hydroxylysine)。

3.胺基酸突變實驗：

藉由胺基酸突變，進一步驗證在hu1803-9D的重鏈K28發生Glucosylgalactosyl hydroxylysine修飾；

1)在hu1803-9D第一肽鏈的GLP-1多肽中的V27-K28-G29序列內加入一個絲胺酸(S)，最終胺基酸序列突變成V-K-S-G，獲得hu1803-9D突變體1；

2)將hu1803-9D第一肽鏈的第28位的K突變成R(精胺酸)，獲得hu1803-9D突變體2。

將突變後的GLP1-GCGR抗體融合蛋白基因序列轉染至CHO細胞，表達純化，獲得GLP1-GCGR抗體融合蛋白突變體1和2。然後使用去糖還原分子量LC-MS分析，具體實驗過程如下：

用pH7.9碳酸氫銨將GLP1-GCGR抗體融合蛋白及其突變體樣品稀釋到0.5mg/mL，取100μL樣品，分別加入1μL PNGase F(new England lab，QPF-001-B)，45℃水浴1小時，加入2μL 1M DTT溶液，37℃水浴30分鐘；反應完成後進行LC-MS分析。

結果如圖5A至圖5C所示，相對於未突變的GLP1-GCGR抗體融合蛋白(圖5A，53512、53852峰)，在hu1803-9D突變體1(圖5B，峰53600)和突變體2(圖5C，峰53540)中均未檢測到340Da增加的成分，此結果進一步驗證了融合蛋白分子量增加340Da的修飾發生在K28位。

實施例3.糖基化修飾對GLP1-GCGR融合蛋白穩定性的影響

為了後續能夠研究葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾對融合蛋白的影響，進行了25℃高溫實驗。將GLP1-GCGR融合蛋白hu1803-9D在25℃放置4天或7天，之後進行去糖還原分子量LC-MS分析實驗。對發生葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸(+340Da)修飾的第一鏈組分和不發生該修飾的第一鏈組分的穩定性數據進行了分類統計。結果如表5所示。

結果顯示，GLP1-GCGR融合蛋白hu1803-9D在25℃放置4天或7天後，具有葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸(+340Da)修飾第一鏈的大碎片(包含在第一鏈的K28位、W25位和F22位斷裂產生的碎片)產生的比例明顯低於未發生該修飾的第一鏈的大碎片產生的比例。

該結果進一步證實了在K28發生的葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾可以抑制GLP1-GCGR抗體融合蛋白第一鏈的大碎片的產生，有助於提高GLP1-GCGR抗體融合蛋白的穩定性。

實施例4.GLP1-GCGR糖基化修飾對融合蛋白功能的影響

1.GLP1-GCGR糖基化變體的分離和純化：

為了進一步獲得富含葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化變體，採用了HIC(疏水色譜)對於樣品進行分離和純化。具體過程如下：

儀器：Agilent 1260；色譜管柱：MAbPacTM HIC-10(Thermo貨號：088481)；流動相A：50mM PB和2M硫酸銨(pH=7.0)；流動相B：50mM PB(pH=7.0)；流速：0.8mL/分；管柱溫：30℃；檢測波長280nm；

色譜梯度如下：在0-5分鐘內，67.0%的流動相B平衡；在5-40分鐘內流動相B從67%變為85.4%；40-40.1分鐘內，流動相B從85.4變為100%；40.1-45分鐘內，流動相B維持在100%；45-45.1分鐘內，流動相B從100變為67%；45.1-60分鐘內，流動相B維持在67%。後續採用Agilent餾分收集器進行組分收集。

GLP-1-GCGR抗體融合蛋白hu1803-9D的HIC典型圖譜如圖6所示，後續對圖6中的標註的峰3和峰4兩個組分進行收集，收集後獲得樣品進行去糖完整分子量分析，結果如圖7A和圖7B所示。

結果顯示，峰4主要為未發生葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾的GLP1-GCGR融合蛋白hu1803-9D，峰3主要為發生1個Glucosylgalactosyl hydroxylysine修飾的GLP1-GCGR融合蛋白hu1803-9D。

2.葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸翻譯後修飾對於GLP1-GCGR活性的影響：

藉由檢測融合蛋白阻斷GCGR配體與GCGR結合及基於細胞的GLP-1R結合激活實驗，檢測糖基化修飾對GLP1-GCGR抗體融合蛋白活性的影響。具體實驗過程可參照WO2020125744的測試例2和測試例6。

2.1 抗體融合蛋白阻斷GCGR配體與GCGR結合試驗：

(1)測試目的：

藉由GLP1-GCGR抗體融合蛋白hu1803-9D阻斷GCGR配體胰高血糖素與GCGR結合試驗來評估抗體融合蛋白的拮抗活性。

(2)測試原理：

cAMP與CRE結合可啟動CRE下游螢光素酶基因(luciferase)的表達，螢光素酶與其受質結合後發出螢光，藉由螢光信號變化反映抑制效率。將CRE選殖至螢光素酶基因的上游，藉由與含GCGR基因的質粒共轉染CHO-K1細胞，挑選出同時高表達CRE及GCGR的單株細胞。GLP-1/GCGR抗體融合蛋白和胰高血糖素可競爭性的與GCGR結合，阻斷GCGR的下游信號傳遞，影響下游cAMP的表達，藉由測定螢光信號變化可評估GLP-1/GCGR抗體融合蛋白對GCGR的拮抗活性。

(3)測試樣品：

①.具有葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白hu1803-9D，藉由本實施例第1節純化收集峰3獲得(簡稱峰3樣品)；

②.不具有葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白hu1803-9D，藉由本實施例第1節純化收集峰4獲得(簡稱峰4樣品)。

(4)實驗步驟：

a.用新鮮細胞培養基製取細胞懸液，以20000個細胞/孔加入80μL培養體系的96孔細胞培養板中，5%二氧化碳，37℃培養16小時。

b.每孔分別加入10μL配製好的待測融合蛋白，再加入10μL配好的胰高血糖素，5%二氧化碳，37℃培養5小時。

c.每孔加入加100μL檢測液ONE Glo(Promega)，室溫避光放置7分鐘。

d.酶標儀Victor3上檢測螢光，計算GCGR嵌合抗體融合對人GCGR配體胰高血糖素的結合阻斷的IC50值。

結果顯示，葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾對抗體融合蛋白hu1803-9D的GCGR拮抗活性幾乎無影響。

2.2 基於細胞的GLP-1R結合激活實驗

(1)測試目的：

評估GLP1-GCGR抗體融合蛋白hu1803-9D的GLP-1部分對GLP-1R的激活活性。

(2)測試原理：

cAMP與CRE結合可啟動CRE下游螢光素酶基因的表達，螢光素酶與其受質結合後發出螢光，藉由螢光信號變化反映抑制效率。將CRE選殖至螢光素酶基因的上游，藉由與含GLP-1R基因的質粒共轉染CHO-K1細胞，挑選出同時高表達CRE及GLP-1R的單株細胞。GLP-1/GCGR抗體融合蛋白可與GLP-1R結合，激活GLP-1R的下游信號傳遞，刺激下游cAMP的表達，藉由測定螢光信號變化可評估GLP1-GCGR抗體融合蛋白hu1803-9D對GLP-1R的激活活性。

(3)測試樣品：

①.具有糖基化修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白hu1803-9D，藉由本實施例第1節純化收集峰3獲得(簡稱峰3樣品)；

②.不具有糖基化修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白hu1803-9D，藉由本實施例第1節純化收集峰4獲得(簡稱峰4樣品)。

(4)實驗步驟：

a.用新鮮細胞培養基製取細胞懸液，以25000個細胞/孔加入90μL培養體系的96孔細胞培養板中，5%二氧化碳，37℃培養16小時。

b.每孔分別加入10μL配製好的待測融合蛋白，5%二氧化碳，37度培養5小時。

c.每孔加入加100μL檢測液ONE Glo(Promega)，室溫避光放置7分鐘。

d.酶標儀Victor3上檢測螢光，計算GLP1-GCGR抗體融合蛋白對GLP-1R的結合激活的EC50值。

結果顯示，葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾對抗體融合蛋白hu1803-9D的GLP-1R激活活性幾乎無影響。

<110> 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD.) 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司(SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)

<120> GLP1-GCGR抗體融合蛋白變體及包含其的組成物

<130> 721111CPCT

<140> PCT/CN2021/

<141> 2021-10-22

<150> 202011143417.5

<151> 2020-10-23

<150> 202111192158.X

<151> 2020-10-13

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> 人(homo sapiens)

<223> GLP1-A

<400> 1

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 變體

<223> GLP1-B

<400> 2

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 變體

<223> GLP1-C

<400> 3

<210> 4

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 變體

<223> GLP1-D

<400> 4

<210> 5

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 變體

<223> GLP1-E

<400> 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803-HCDR1

<400> 6

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803-HCDR2

<400> 7

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803-HCDR3

<400> 8

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803-LCDR1

<400> 9

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803-LCDR2

<400> 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803-LCDR3

<400> 11

<210> 12

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VH.1

<400> 12

<210> 13

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VH.1A

<400> 13

<210> 14

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VH.1B

<400> 14

<210> 15

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VH.1C

<400> 15

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VL.1

<400> 16

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VL.1A

<400> 17

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VL.1B

<400> 18

<210> 19

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> IgG4-AA的重鏈恆定區

<400> 19

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 抗體的輕鏈(Kappa鏈)恆定區

<400> 20

<210> 21

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9重鏈

<400> 21

<210> 22

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9輕鏈

<400> 22

<210> 23

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9D第一條鏈

<400> 23

<210> 24

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9A第一條鏈

<400> 24

<210> 25

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9B第一條鏈

<400> 25

<210> 26

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9C第一條鏈

<400> 26

<210> 27

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 碎片離子y20

<400> 27

<210> 28

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 碎片離子y19

<400> 28

<210> 29

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 肽段

<400> 29

Claims

一種GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其包含：

GLP1的糖基化修飾變體、和

抗GCGR抗體；

其中，該GLP1的糖基化修飾變體包含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾；

較佳地，其中該抗GCGR抗體包含：

重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
如請求項1所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該GLP1的糖基化修飾變體包含半乳糖-羥賴胺酸修飾或葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。
如請求項1或2所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該GLP1的糖基化修飾變體包含選自SEQ ID NO：4、1、2、3和5中任一所示的胺基酸序列；較佳地，其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾位點在GLP1的K28處。
如請求項1至3中任一項所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該抗GCGR抗體包含：

重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：12、13、14或15所示的胺基酸序列；和

輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：18、16或17所示的胺基酸序列。
如請求項4所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該抗GCGR抗體包含：

如SEQ ID NO：19所示的重鏈恆定區，和

如SEQ ID NO：20所示的輕鏈恆定區；

較佳地，其中該抗GCGR抗體包含：

如SEQ ID NO：21所示的重鏈，和

如SEQ ID NO：22所示的輕鏈。
如請求項1至5中任一項所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該GLP1的糖基化修飾變體的C-端藉由接頭連接至抗GCGR抗體的重鏈可變區N-端。
如請求項6所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其包含兩條序列相同的第一肽鏈和兩條序列相同的第二肽鏈，其中，

第一肽鏈，其包含如SEQ ID NO：23、24、25或26所示的胺基酸序列；和

第二肽鏈，其包含如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列。
如請求項7所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其為：

i)同二聚體變體，其中兩條第一肽鏈均包含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾；或

ii)異二聚體變體，其中只有一條第一肽鏈包含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾。
如請求項8所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾為葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾；較佳地，其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾發生在第一肽鏈的K28處。
如請求項9所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其相對於不含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白，具有340Da±5Da或680Da±10Da的分子量增加，較佳具有340Da或680Da的分子量增加。
如請求項7至10中任一項所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體，其相對於不含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾的GLP1-GCGR抗體融合蛋白不易發生肽鏈的斷裂；較佳地，該糖基化變體的第一鏈不易在K28、W25和/或F22位發生斷裂。
一種GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其包含如請求項求1至11中任一項所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體。
如請求項12所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體，其中該糖基化修飾變體在該GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體中的比例至少為0.1%；較佳地，該比例至少為1%；更佳地，該比例至少為10%；視需要地，其中該糖基化修飾變體的含量藉由液相色譜-質譜法測量。
一種GLP1的糖基化修飾變體，其包含基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾。
如請求項14所述的GLP1的糖基化修飾變體，其包含半乳糖-羥賴胺酸修飾或葡萄糖-半乳糖-羥賴胺酸修飾。
如請求項14或15所述的GLP1的糖基化修飾變體，其中該GLP1包含選自SEQ ID NO：4、1、2、3和5中任一所示的胺基酸序列。
如請求項14所述的GLP1的糖基化修飾變體，其中該基於羥賴胺酸的O-糖基化修飾位點在GLP1的K28處。
一種醫藥組成物，其含有：

如請求項1至11中任一項所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體、或如請求項12或13所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體、或如請求項14至17中任一項所述的GLP1的糖基化修飾變體；以及

一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
一種降低受試者血糖濃度的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如請求項1至11中任一項所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體、或如請求項12或13所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體、或如請求項14至17中任一項所述的GLP1的糖基化修飾變體、或如請求項18所述的醫藥組成物。
一種治療代謝障礙的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如請求項1至11中任一項所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白的糖基化修飾變體、或如請求項12或13所述的GLP1-GCGR抗體融合蛋白群體、或如請求項14至17中任一項所述的GLP1的糖基化修飾變體，或如請求項18所述的醫藥組成物；較佳地，該代謝障礙選自：代謝綜合症、肥胖症、葡萄糖耐量受損、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高滲綜合症、圍術期高血糖症、高胰島素血症、胰島素抵抗綜合症、空腹血糖受損、血脂異常、動脈粥樣硬化和糖尿病前期狀態。