EA017770B1 - Способы лечения с использованием гликопэгилированного g-csf - Google Patents

Способы лечения с использованием гликопэгилированного g-csf Download PDF

Info

Publication number
EA017770B1
EA017770B1 EA200970915A EA200970915A EA017770B1 EA 017770 B1 EA017770 B1 EA 017770B1 EA 200970915 A EA200970915 A EA 200970915A EA 200970915 A EA200970915 A EA 200970915A EA 017770 B1 EA017770 B1 EA 017770B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
peptide
glycosyl
group
modifying group
polymer
Prior art date
Application number
EA200970915A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200970915A1 (ru
Inventor
Дэвид А. Цопф
Хайнц Лубенау
Original Assignee
Биодженерикс Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Биодженерикс Аг filed Critical Биодженерикс Аг
Publication of EA200970915A1 publication Critical patent/EA200970915A1/ru
Publication of EA017770B1 publication Critical patent/EA017770B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A61K9/0056—Mouth soluble or dispersible forms; Suckable, eatable, chewable coherent forms; Forms rapidly disintegrating in the mouth; Lozenges; Lollipops; Bite capsules; Baked products; Baits or other oral forms for animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Jib Cranes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

В изобретении представлен гликопэгилированный G-CSF, обладающий терапевтической активностью и обладающий фармакокинетическими параметрами и свойствами, улучшенными по сравнению с идентичным или близко аналогичным пептидом G-CSF, который не гликопэгилирован. Далее, в изобретении представлены способы стимуляции гематопоэза у субъекта, в особенности у субъекта, который подвергался или будет подвергаться радиационной или химической терапии. Способы и композиции согласно изобретению могут далее применяться для предотвращения, облегчения и лечения миелосупрессивных эффектов таких терапий.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки
По заявке на данное изобретение испрашивается приоритет согласно датам подачи предварительной заявки на патент США № 60/909917, поданной 3 апреля 2007 г.; предварительной заявки на патент США № 60/911788, поданной 13 апреля 2007 г.; и предварительной заявки на патент США № 60/986240, поданной 7 ноября 2007 г., содержание которых полностью включено посредством ссылки в настоящее описание для любых целей.
Предпосылки изобретения
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (О-С8Р) представляет собой гликопротеин, стимулирующий выживание, пролиферацию, дифференцировку и функцию клеток-предшественников нейтрофильных гранулоцитов и зрелых нейтрофилов. Обе формы рекомбинантного человеческого О-С8Г, использующиеся в клинике, представляют собой мощные стимуляторы гранулопоэза нейтрофилов, эффективные в отношении предотвращения инфекционных осложнений некоторых нейтропенических состояний. Они могут использоваться для ускорения восстановления популяции нейтрофилов после миелосупрессивных воздействий.
О-С8Г уменьшает болезненность противораковой химиотерапии путем снижения частоты фебрильной нейтропении, болезненность высокодозной химиотерапии с одновременной трансплантацией костного мозга, а также частоту и длительность инфекционных заболеваний у пациентов с тяжелой хронической нейтропенией. Кроме того, было показано, что О-С8Г обладает терапевтическим эффектом при введении пациенту после начала инфаркта миокарда.
Хорошо известно, что острая миелосупрессия вследствие цитотоксической химиотерапии является дозоограничивающим фактором при терапии рака. Также наблюдаются побочные эффекты в отношении других нормальных тканей, однако костный мозг обладает наибольшей чувствительностью по отношению к способам лечения, специфичным для пролиферирующих клеток, таким как химиотерапия и радиационная терапия. Для некоторых онкологических больных гематопоэтическая токсичность часто ограничивает возможность повышения дозы химиотерапии. Повторные или высокодозные курсы химиотерапии могут приводить к истощению пула кроветворных стволовых клеток и их потомства.
Предотвращение и защита от побочных эффектов химиотерапии и радиационной терапии могут принести большую пользу онкологическим больным. Было показано, что О-С8Р и другие факторы роста уменьшают тяжесть таких побочных эффектов путем увеличения количества критических клетокмишеней, в особенности кроветворных клеток-предшественников.
Человеческий О-С8Р был клонирован в 1986 году группами исследователей из Японии и США (см., например, №ща1а е! а1., №11игс. 319, 415-418, 1986). Существует две формы природного человеческого гликопротеина, одна из которых содержит 175, а другая 178 аминокислот. Для разработки фармацевтических продуктов с применением технологии рекомбинантной ДНК использовалась более часто встречающаяся и более активная форма, содержащая 175 аминокислот.
Рекомбинантный человеческий О-С8Р, синтезированный в системе экспрессии Е.сой, называется филграстим. Структура филграстима незначительно отличается от природного гликопротеина. Другая форма человеческого рекомбинантного О-С8Р называется ленограстим и синтезируется в клетках яичников китайского хомячка (СНО).
11С-С8Е представляет собой мономерный протеин, который димеризует рецептор О-С8Р путем образования комплекса 2:2 из 2 молекул О-С8Р и 2 рецепторов (Ногап е! а1., Вюсйетщру, 35(15):4886-96 (1996)). С помощью метода рентгеновской кристаллографии были обнаружены следующие остатки в составе О-С8Р, формирующие часть молекулы, взаимодействующую с рецептором: 04, Р5, А6, 87, 88, Ь9, Р10, ф11, 812, Ь15, К16, Е19, ф20, Ь108, Ό109, Ό112, Т115, Т116, ф119, Е122, Е123 и Ь124 (см., например, Агйопп е! а1. (1999), Ыа!иге. 401:713).
Имеющиеся в продаже формы ГЙ0-С8Р обладают кратковременным фармакологическим действием и часто должны вводиться пациенту более одного раза в день в продолжение лейкопенического состояния. Более долгое время полужизни молекулы в циркуляции позволило бы уменьшить количество введений, необходимых для облегчения лейкопении и предотвращения инфекций. Другая проблема имеющихся в продаже продуктов ГЙ0-С8Р заключается в возникновении дозозависимой боли в костях. Поскольку боль в костях, испытываемая пациентами, является значительным побочным эффектом терапии ГЙ0-С8Р, желательна разработка продукта гО-С8Р, не вызывающего боли в костях, либо путем разработки продукта, не обладающего этим эффектов в силу своей природы или эффективности в малых дозах, недостаточных для развития боли в костях. Таким образом, очевидна необходимость разработки улучшенных рекомбинантных молекул О-С8Р.
Были описаны искусственно полученные варианты 11С-С8Е (см. патенты США № 5581476, 5214132, 5362853, 4904584 и Кзебйааг-ОНоп е! а1., ВюсйетЩгу. 35:9034-9041, 1996). Также была описана модификация 11С-С8Р и других полипептидов путем введения по меньшей мере одной дополнительной углеводной цепи по сравнению с нативным полипептидом (патент США № 5218092). Кроме того, были описаны и изучены полимерные модификации нативного 11С-С8Е, включая добавление РЕО-групп (см., например, 8а1аке-151пка\\'а е! а1. (1992), Се11 8!гис!иге апб ЕппсЕоп. 17:157; Во\\еп е! а1. (1999), Ехрептеп!а1 Нета!о1о§у. 27:425; патенты США № 5824778, 5824784, АО 96/11953, АО 95/21629 и АО 94/20069).
- 1 017770
Из уровня техники известно присоединение синтетических полимеров к полипептидной цепи с целью улучшения фармакокинетических свойств гликопротеиновых лекарственных средств. Типичным примером полимера, конъюгируемого с пептидами, является полиэтиленгликоль (РЕС, ПЭГ). Было показано, что использование РЕС для дериватизации пептидных лекарственных средств понижало иммуногенность пептидов. Например, в патенте США № 4179337 (Όανίδ с1 а1.) раскрываются неиммуногенные полипептиды, такие как ферменты и пептидные гормоны, связанные с полиэтиленгликолем или полипропиленгликолем. Для таких пептидов, помимо пониженной иммуногенности, характерно увеличенное время клиренса из циркуляции в связи с увеличением размера конъюгатов рассматриваемых пептидов с РЕС.
Один метод присоединения РЕС (и его производных) к пептидам представляет собой неспецифическое связывание через аминокислотный остаток пептида (см., например, патенты США № 4088538, 4414147, 4055635, а также РСТ АО 87/00056). Другой метод присоединения РЕС к пептидам представляет собой неспецифическое окисление гликозильных остатков на гликопептиде (см., например, АО 94/05332).
При использовании этих неспецифических методов полиэтиленгликоль присоединяется случайно и неспецифически к реактивным остаткам в составе пептидной цепи. Очевидно, что для случайного присоединения молекул РЕС характерен ряд недостатков, включая гетерогенность конечного продукта и вероятность снижения биологической или ферментативной активности пептида. Таким образом, для производства лекарственных пептидов предпочтительна стратегия дериватизации, приводящая к получению специфически меченого, легко характеризуемого и практически гомогенного продукта. Такие способы разработаны.
Специфически меченные, гомогенные пептидные лекарственные средства можно получать ίη νίίτο с помощью ферментов. В отличие от типичных неспецифических способов присоединения к пептиду синтетического полимера или другой метки, синтезы, основанные на ферментах, обладают преимуществами региоселективности и стереоселективности. Два главных класса ферментов, применимых для синтеза меченых пептидов включают гликозилтрансферазы (например, сиалилтрансферазы, олигосахарилтрансферазы, Ν-ацетилглюкозаминилтрансферазы) и гликозидазы. Эти ферменты можно использовать для специфического присоединения сахаров, которые далее можно модифицировать для получения лекарственного вещества. В качестве альтернативы гликозилтрансферазы и модифицированные гликозидазы могут использоваться для прямого переноса модифицированных сахаров на полипептидную цепь (см., например, патент США № 6399336 и публикации заявок на патент США 20030040037, 20040132640, 20040126838 и 20040142856, каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки). Также известны способы, комбинирующие элементы как химического, так и ферментативного синтеза (см., например, УататоЮ с1 а1., СагЬойукг. Ке8. 305:415-422 (1998) и публикацию заявки на патент США 20040137557, включенные в настоящее описание посредством ссылки).
В ответ на потребность в улучшенном лекарственном С-С8Г, в настоящем изобретении представлен гликопэгилированный С-С8Г, обладающий терапевтической активностью, а также улучшенными фармакокинетическими параметрами и свойствами по сравнению с негликопэгилированными идентичным пептидом С-С8Г или его близким аналогом. Далее в настоящем изобретении представлены способы усиления гематопоэза у субъекта, в особенности у субъекта, который получал или будет получать лечение в виде радиационной или химиотерапии.
Сущность изобретения
В соответствии с вышесказанным в одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы и композиции, стимулирующие продукцию стволовых клеток у реципиента трансплантата костного мозга. Эти способы и композиции включают введение реципиенту трансплантата костного мозга некоторого количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Г и полимерной модифицирующей группы. В одном аспекте полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка пептида через интактную гликозильную связывающую группу.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлены способы и композиции, увеличивающие число гранулоцитов у субъекта. Этот способ включает стадию введения субъекту некоторого количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Г и полимерной модифицирующей группы. В одном аспекте пептид С-С8Г имеет аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО Ш N0:1, а полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к пептиду С-С8Г в области аминокислотной последовательности, начинающейся глицином в положении 126 и заканчивающейся серином в положении 143.
- 2 017770
Еще в одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы и композиции, повышающие продукцию стволовых клеток у субъекта. Эти способы включают стадию введения субъекту некоторого количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы. В дальнейшем аспекте пептид С-С8Е включает структуру согласно формуле чЛЛЛГ
I—Т11Г134—О—Са1МАс-(6а1)с—8|а—РЕС где с.| равно 0 или 1 и
81а-РЕС имеет структуру согласно формуле
где η означает целое число от 1 до 2000.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы предотвращения, лечения или ослабления миелосупрессии, в особенности миелосупрессии, обусловленной противоопухолевой терапией. В одном аспекте этот способ включает введение реципиенту некоторого количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа ковалентного конъюгата может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Е у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Е посредством интактной гликозильной связывающей группы.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлены способы лечения заболевания у субъекта, для которого характерно подавление продукции белых кровяных клеток у субъекта. В одном аспекте способ лечения заболевания включает стадию введения субъекту некоторого количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа ковалентного конъюгата может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Е у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Е посредством интактной гликозильной связывающей группы. Количество пептида, вводимого субъекту, достаточно для эффективного облегчения состояния субъекта.
Еще в одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы лечения нейтропении у млекопитающего. Эти способы включают стадию введения фармацевтически эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа ковалентного конъюгата может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Е у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Е посредством интактной гликозильной связывающей группы.
Еще в одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы лечения тромбоцитопении у млекопитающего. Эти способы включают стадию введения фармацевтически эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа ковалентного конъюгата может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Е у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Е посредством интактной гликозильной связывающей группы.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы увеличения популяции кроветворных стволовых клеток в культуре. Эти способы включают стадию добавления к культуре стволовых клеток эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа ковалентного конъюгата может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Е у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Е посредством интактной гликозильной связывающей группы.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлены способы стимуляции гематопоэза у субъекта. Эти способы включают стадию введения субъекту эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа ковалентного конъюгата может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Е у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Е посредством интактной гликозильной связывающей группы.
Еще в одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы увеличения числа кроветворных клеток-предшественников у субъекта. Эти способы включают стадию введения субъекту эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа ковалентного конъюгата может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Е у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Е посредством интактной гликозильной связывающей группы.
- 3 017770
В одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы стимуляции продукции стволовых клеток у донора. Эти способы включают стадию введения донору эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа ковалентного конъюгата может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Р у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Р посредством интактной гликозильной связывающей группы.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлены способы повышения длительного приживления трансплантата костного мозга у реципиента. Эти способы включают стадию введения реципиенту костного мозга пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа ковалентного конъюгата может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Р у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Р посредством интактной гликозильной связывающей группы.
Еще в одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы стимуляции кроветворных клеток-предшественников у субъекта. Эти способы включают стадию введения субъекту первой композиции, содержащей соединение формулы 1,1'-1,4-фенилен-бис-(метилен)-бис-1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан (ΛΜΌ3100) и второй композиции, содержащей пептид, представляющий собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа ковалентного конъюгата может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Р у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Р посредством интактной гликозильной связывающей группы. Первая и вторая композиции могут вводиться субъекту последовательно в любом порядка или одновременно.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлена дозированная форма для перорального введения. Эта дозированная форма для перорального введения может содержать следующие компоненты: (а) пептид, представляющий собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Р у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Р посредством интактной гликозильной связывающей группы; (Ь) поверхностно-активное вещество (вещества); (с) жирную кислоту (кислоты) и (ά) кишечно-растворимый материал. В одном аспекте компоненты (а) (Ь) и (с) смешивают в жидкой фазе и лиофилизируют перед объединением с компонентом (ά).
В другом аспекте в настоящем изобретении представлен способ повышения продукции стволовых клеток у донора, где способ включает стадии введения донору некоторого количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы. В дальнейшем аспекте полимерная модифицирующая группа ковалентного конъюгата присоединяется к пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка пептида посредством интактной гликозильной связывающей группы. Еще в одном аспекте изобретения количество пептида, вводимого донору, находится в интервале от 1 до приблизительно 20 мг.
Еще в одном аспекте изобретения представлен способ повышения продукции стволовых клеток у донора, где способ включает стадии введения донору некоторого количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы. В дальнейшем аспекте полимерная модифицирующая группа присоединяется к пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка пептида посредством интактной гликозильной связывающей группы. Еще в одном аспекте количество пептида, вводимого донору, может быть в виде единичной дозированной формы. В одном воплощении единичная доза выбирается из 25, 50, 100 и 200 мкг/кг.
Описание чертежей
На фиг. 1 приведены данные, относящиеся к абсолютному количеству нейтрофилов (ЛЫС) в ответ на ΧΜ22 (25; 50; 100 мкг/кг) и нейласту (100 мкг/кг).
На фиг. 2 приведены данные, относящиеся к количеству СЭ34+ клеток в ответ на ХМ22 (25; 50; 100 мкг/кг) и нейласту (100 мкг/кг).
Фиг. 3 представляет собой таблицу данных, относящихся к фармакокинетическим параметрам для четырех различных опытных групп.
На фиг. 4 приведены данные, относящиеся к абсолютному количеству нейтрофилов (АЫС) в ответ на ХМ22 (6 мг) и нейласту (6 мг).
На фиг. 5 приведены данные, относящиеся к количеству СЭ34+ клеток в ответ на ХМ22 (6 мг) и нейласту (6 мг).
На фиг. 6 приведены данные фармакодинамики, относящиеся к количеству нейтрофилов в ответ на С-С8Р. глико-РЕС-С-С8Р. нейласту и контрольную композицию у яванских макак.
На фиг. 7 приведены данные фармакокинетики, относящиеся к концентрации указанных композиций в плазме у яванских макак.
На фиг. 8 приведена схематическая модель структуры глико-РЕС-С-С8Р и его рецептора.
На фиг. 9 приведены данные, относящиеся к концентрации ΧΜ22 и нейласты в сыворотке крови после введения трех различных доз ΧΜ22 и 100 мкг/кг нейласты.
- 4 017770
На фиг. 10 приведены данные, относящиеся к концентрации ХМ22 и нейласты в сыворотке крови после введения 6 мг ХМ22 и 6 мг нейласты.
Подробное описание изобретения и предпочтительных воплощений
Сокращения
В описании приняты следующие обозначения:
РЕС, ПЭГ - полиэтиленгликоль;
РРС, ИНГ - полипропиленгликоль;
Ага - арабинозил;
Гги - фруктозил;
Гис -фукозил;
Са1 - галактозил;
СаШАс - Ν-ацетилгалактозаминил;
С1с - глюкозил;
С1сNАс - Ν-ацетилглюкозаминил;
Мап - маннозил;
МапАс - маннозаминил ацетат;
Ху1 - ксилозил;
№иАс - сиалил (Ν-ацетилнейраминил);
М6Р - маннозо-6-фосфат;
81а - сиаловая кислота;
Ν-ацетилнейраминил и их производные и аналоги;
С-С8Г означает гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.
Определения.
Если не определено иначе, значение всех технических и научных терминов, использующихся в настоящем описании, в целом совпадает с общепринятыми значениями, известными специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В общем, используемые в настоящем описании номенклатура и лабораторные процедуры, относящиеся к культуре клеток, молекулярной генетике, органической химии и химии и гибридизации нуклеиновых кислот хорошо известны и широко применяются в уровне техники. Для синтеза пептидов и нуклеиновых кислот используются стандартные техники. В общем, техники и процедуры проводятся согласно общепринятым способам, известным из уровня техники и различных общих руководств (см. 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С’1опйщ: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2-е изд. (1989), СоИ 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз, СоИ 8ргтд НагЬог, ΝΥ, включенное в настоящее описание посредством ссылки), ссылки на которые приводятся в тексте настоящего документа. Используемые в настоящем описании номенклатура и лабораторные процедуры, относящиеся к аналитической химии и органическому синтезу, описанные ниже, хорошо известны и широко применяются в уровне техники. Для химических синтезов и химических анализов используются стандартные техники или их модификации.
Все олигосахариды, рассмотренные в настоящем изобретении, описываются полным или сокращенным названием нередуцирующего сахарида (т.е. Са1), за которым следует конфигурация гликозидной связи (α или β), связь с кольцом (1 или 2), положение в кольце редуцирующего сахарида, участвующего в связи (2, 3, 4, 6 или 8) и полное или сокращенное название редуцирующего сахарида (например, С1сNАс). Каждый сахарид предпочтительно представляет собой пиранозу. В обзоре ЕззепйаН о! С1усоЬю1оду, ред. Уагк1 е! а1., С8НЬ Ргезз (1999) рассматривается общепринятая гликобиологическая номенклатура.
Предполагается, что у олигосахаридов имеется редуцирующий и нередуцирующий концы независимо от того, является ли сахарид на редуцирующем конце редуцирующим сахаридом. В соответствии с принятой номенклатурой в настоящем изобретении олигосахариды изображаются с нередуцирующим концом слева и редуцирующим концом справа.
Термин сиаловая кислота относится к любому представителю семейства девятиуглеродных карбоксилированных сахаров. Наиболее часто встречающийся представитель семейства сиаловых кислот представляет собой Ν-ацетилнейраминовую кислоту (2-кето-5-ацетамидо-3,5-дидезокси-О-глицеро-Огалактононулопираноз-1-оновую кислоту (часто сокращается до №и5Ас, №иАс или NАNА). Второй представитель семейства представляет собой Ν-гликолилнейраминовую кислоту (№и5Сс или №иСс), где Ν-ацетильная группа №иАс гидроксилирована. Третий представитель семейства сиаловых кислот представляет собой 2-кето-3-дезоксинонулозоновую кислоту (ΚΌΝ) (№1йапо е! а1. (1986), 1. Вю1. Сйет. 261:11550-11557; Капатоп е! а1., 1. Вю1. Сйет. 265:21811-21819 (1990)). Также сюда включаются 9-замещенные сиаловые кислоты, такие как 9-О-С1-С6-ацил-№и5Ас, как 9-О-лактил-№и5Ас или 9-О-ацетил-№и5Ас, 9-дезокси-9-фтор-№и5Ас и 9-азидо-9-дезокси-Ыеи5Ас. См. обзор семейства сиаловых кислот Уагк1, С1усоЫо1оду. 2:25-40 (1992), 81а1ю АсИз: Сйет1з1гу, Ме!аЬойзт апб Гипсйоп, ред. В. 8сйаиег (8ргтдег-Уег1ад, №\ν Υо^к (1992)). Синтез и использование соединений сиаловых кислот в процедуре сиализации раскрыты в заявке на международный патент \УО 92/16640, опубликованной 1 октября 1992 г.
- 5 017770
Термин пептид обозначает полимер, который состоит из мономеров-аминокислот, связанных между собой амидными связями, также называемый полипептидом. Кроме того, сюда включаются неприродные аминокислоты, такие как β-аланин, фенилглицин и гомоаргинин. Также в настоящем изобретении могут использоваться аминокислоты, не кодируемые генами. Далее, в настоящем изобретении могут использоваться модифицированные аминокислоты, содержащие реактивные группы, сайты гликозилирования, полимеры, лекарственные вещества, биомолекулы и т.д. Все аминокислоты, использующиеся в настоящем изобретении, могут представлять собой как Ό-, так и Ь-изомеры. В общем случае предпочтителен Ь-изомер. Кроме того, в настоящем изобретении могут использоваться другие пептидомиметики. При использовании в настоящем описании пептид обозначает как гликозилированные, так и негликозилированные пептиды. Также сюда включаются пептиды, не полностью гликозилируемые в системе экспрессии пептида. См. обзор 8ра1о1а с1 а1., в Сйет181ту апб ВюсйетШту οί Лтшо Άοί6δ, Рерббек апб Рго1с1П5. ред. В. ХУетЫет. Магсе1 Эеккег. Ыете Уотк, с. 267 (1983).
Аминокислотная или нуклеотидная последовательность пептида гомологична другой последовательности, если они до некоторой степени идентичны. Предпочтительно, чтобы гомологичная последовательность была по меньшей мере приблизительно на 85% идентична эталонной последовательности, предпочтительно идентична приблизительно на 90-100%, более предпочтительно идентична по меньшей мере приблизительно на 91%, идентична по меньшей мере приблизительно на 92%, идентична по меньшей мере приблизительно на 93%, идентична по меньшей мере приблизительно на 94%, еще более предпочтительно идентична по меньшей мере приблизительно на 95-99%, предпочтительно идентична по меньшей мере приблизительно на 96%, идентична по меньшей мере приблизительно на 97%, идентична по меньшей мере приблизительно на 98%, еще более предпочтительно идентична по меньшей мере приблизительно на 99% и идентична приблизительно на 100% референской аминокислотной или нуклеотидной последовательности.
Термин конъюгат пептида относится к разновидности изобретения, где пептид конъюгируется с модифицированным сахаром, как описано в настоящем изобретении.
Термин аминокислота относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к производным и миметикам аминокислот, имеющим сходную функцию с природными аминокислотами. Природными аминокислотами являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, подвергающиеся последующей модификации, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот обозначают соединения, имеющие базовую химическую структуру, идентичную природным аминокислотам, т.е. содержащие α-углеродный атом с присоединенными водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и В-группой, т.е. гомосерин, норлейцин, метионин сульфоксид, метионин метилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные В-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные цепи, но сохраняют базовую химическую структуру, идентичную природным аминокислотам. Аминокислотные миметики обозначают химические соединения, которые имеют структуру, отличающуюся от базовой химической структуры аминокислот, но чья функция сходна с функцией природных аминокислот.
При использовании в настоящем описании термин модифицированный сахар обозначает природный или неприродный сахар, присоединенный ферментативным способом к аминокислотному или гликозильному остатку пептида в способе настоящего изобретения. Модифицированный сахар выбирают из субстратов ферментов, включая, но не ограничиваясь, нуклеотиды сахаров (моно-, ди- и трифосфаты), активированные сахара, (например, гликозилгалиды, гликозилмезилаты) и сахара, которые не являются ни активированными, ни нуклеотидами сахаров. Модифицированный сахар ковалентно функционализирован модифицирующей группой. Применимые модифицирующие группы включают, но не ограничиваются, фрагменты РЕС, лекарственные фрагменты, диагностические фрагменты, биомолекулы и т.д. Модифицирующая группа предпочтительно представляет собой неприродный или немодифицированный сахар. Точка функционализации модифицирующей группой выбирается таким образом, чтобы она не препятствовала присоединению модифицированного сахара ферментативным путем к пептиду.
Термин водорастворимый означает фрагменты, обладающие некоторой обнаруживаемой растворимостью в воде. Способы обнаружения и/или измерения растворимости в воде хорошо известны из уровня техники. Типичные водорастворимые полимеры включают пептиды, сахариды, полиэфиры, полиамины, поликарбоксокислоты и т.д. Пептиды могут иметь смещаемые последовательности или состоять из одной аминокислоты, как, например, полилизин. Типичным полисахаридом является полисиаловая кислота. Типичным полимером является полиэтиленгликоль. Полиэтиленимин представляет собой типичный полиамин, и полиакриловая кислота представляет собой типичную поликарбоновую кислоту.
Полимерная цепь водорастворимого полимера может представлять собой полиэтиленгликоль (т.е. РЕС). Однако следует понимать, что другие родственные полимеры также применимы в настоящем изобретении и что в этой связи термин РЕС или полиэтиленгликоль является включающим, а не отличающим. Термин РЕС включает полиэтиленгликоль в любой форме, включая алкокси-РЕС, дифункциональный РЕС, многоплечий РЕС, раздвоенный РЕС, разветвленный РЕС, подвешенный РЕС (т.е. РЕС или родственные полимеры, чья одна или более функциональных групп подвешены на полимерной цепи) или
- 6 017770
РЕС, содержащий разрушаемые связи.
Полимерная цепь может быть линейной или разветвленной. Разветвленные полимерные цепи известны из уровня техники. Обычно разветвленный полимер состоит из центральной части и множества линейных полимерных цепей, связанных с центральной частью. Обычно используют разветвленные формы РЕС, получаемые путем добавления этиленоксида к различным полиолам, таким как глицерин, пентаэритрит и сорбит. Центральная часть также может состоять из нескольких аминокислот, таких как лизин. Разветвленный полиэтиленгликоль может в общем быть представлен формулой К(-РЕС-ОН)т, где Я обозначает центральную часть, такую как глицерин или пентаэритрит, а т обозначает количество ветвей. Также в качестве полимерной цепи могут использоваться многоплечие молекулы РЕС, такие как описанные в патенте США № 5932462, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки.
В настоящем изобретении могут использоваться многие другие полимеры. В особенности применимы в настоящем изобретении непептидные водорастворимые полимерные цепи, имеющие от 2 до 300 концов. Примеры применимых полимеров включают, но не ограничиваются, другиеи полиалкиленгликоли, такие как полипропиленгликоль (РРС), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля и им подобные, полиоксиэтилированный полиол, полиолефиновый спирт, поливинилпирролидон, полигидроксипропилметакриламид, поли-а-гидроксикислота, поливиниловый спирт, полифосфазен, полиоксазолин, поли-Л-акрилоилморфолин, такой как описан в патенте США № 5629384, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки, а также их сополимеры, терполимеры и их смеси. Несмотря на то что молекулярный вес полимерных цепей может различаться, обычно он находится в интервале от приблизительно 100 до приблизительно 100000 Да, часто от приблизительно 6000 до приблизительно 80000 Да.
При употреблении в настоящем описании в контексте введения пептидного лекарственного препарата пациенту площадь под кривой (АИС) определяется как полная площадь под кривой, описывающей концентрацию лекарственного препарата в системном кровотоке пациента как функцию от времени от нуля до бесконечности.
При употреблении в настоящем описании в контексте введения пептидного лекарственного препарата пациенту термин время полужизни или 11/2 определяется как время, необходимое для уменьшения наполовину концентрации лекарственного препарата в плазме крови пациента. Для одного и того же пептидного лекарственного препарата может существовать несколько различных времен полужизни в зависимости от множественных механизмов клиренса, перераспределения и других механизмов, хорошо известных из уровня техники. Обычно α-время полужизни и β-время полужизни определяются таким образом, что α-фаза оказывается связанной с перераспределением, а β-фаза - с клиренсом. Однако для белковых лекарственных препаратов, которые по большей части не покидают кровотока, может существовать по меньшей мере два времени полужизни, связанных с клиренсом. Для некоторых гликозилированных пептидов быстрый клиренс во время β-фазы может быть опосредован рецепторами на макрофагах или эндотелиальных клетках, распознающими терминальные галактозу, Ν-ацетилгалактозамин, Ν-ацетилглюкозамин, маннозу или фукозу. Более медленное выведение в β-фазе может быть обусловлено клубочковой фильтрацией в почках молекул, имеющих эффективный радиус <2 нм (приблизительно 68 кДа) и/или специфическими или неспецифическими поглощением и метаболизмом в тканях. Гликопэгилирование может кэпировать терминальные сахара (например, галактозу или Ν-ацетилгалактозамин) и таким образом блокировать быстрый клиренс в а-фазе посредством рецепторов, распознающих эти сахара. Также оно может увеличивать эффективный радиус молекулы и таким образом ослаблять ее распределение и поглощение тканями, что приводит к удлинению поздней β-фазы. Таким образом, точный механизм влияния гликопэгилирования на время полужизни в α-фазе и β-фазе может варьировать в зависимости от размера, степени гликозилирования и других параметров, как хорошо известно из уровня техники. Более подробное разъяснение термина время полужизни см. Рйаттасеи11са1 Вю1есйио1о§у (1997, ред. ΏΡΑ Стотте1т и КО 8тбе1аг, Наптооб РиЫ18Йег8, Ат81етбат, р. 101-120).
При использовании в настоящем описании термин гликоконъюгирование означает конъюгирование ферментативным путем модифицированного сахара с аминокислотным или гликозильным остатком полипептида, например пептида С-С8Р согласно настоящему изобретению. Подвидом гликоконъюгирования является гликопэгилирование, где модифицирующая группа модифицированного сахара представляет собой полиэтиленгликоль и его алкильные (например, т-РЕС) или реактивные (например, Н2Л-РЕС, НООС-РЕС) производные.
Термины крупномасштабный и в промышленных масштабах употребляются взаимозаменяемо и означают цикл реакций, выход которого составляет по меньшей мере приблизительно 250 мг, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 500 мг и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1 г гликоконъюгата по завершении одного цикла реакций.
При использовании в настоящем описании термин гликозильная связывающая группа означает гликозильный остаток, к которому ковалентно присоединена модифицирующая группа (например, молекула РЕС, лекарственное вещество, биомолекула); гликозильная связывающая группа связывает модифицирующую группу с другой частью конъюгата. В способах согласно изобретению гликозильная свя
- 7 017770 зывающая группа ковалентно присоединяется к гликозилированному или негликозилированному пептиду, таким образом связывая агент с аминокислотным и/или гликозильным остатком в составе пептида. Гликозильную связывающую группу обычно получают из модифицированного сахара путем ферментативного связывания модифицированного сахара с аминокислотным и/или гликозильным остатком в составе пептида. Гликозильная связывающая группа может представлять собой структуру, полученную из сахарида, распадающегося в процессе образования кассеты модифицирующая группамодифицированный сахар (например, окисление образование основания Шиффа восстановление), или гликозильная связывающая группа может оставаться интактной. Интактная гликозильная связывающая группа означает связывающую группу, полученную из гликозильной группы, где мономер сахарида, связывающий модифицирующую группу и остальную часть конъюгата, не разрушен, например, путем окисления, например, метаперйодатом натрия. Интактные гликозильные связывающие группы согласно изобретению могут быть получены из природного олигосахарида путем добавления гликозильной единицы (единиц) или отщепления одной или более гликозидных единиц от исходной полисахаридной структуры.
При использовании в настоящем описании термин нацеливающий фрагмент означает фрагмент, селективно локализующийся в определенной ткани или отделе тела. Локализация опосредуется специфическим узнаванием молекулярных детерминант, размером молекулы нацеливающего агента или конъюгата, ионными взаимодействиями, гидрофобными взаимодействиями и т.д. Специалистам в уровне техники известны и другие механизмы нацеливания агента в определенную ткань или отдел тела. Типичные нацеливающие фрагменты включают антитела, фрагменты антител, трансферрин, Н8-гликопротеин, факторы свертывания крови, белки сыворотки, β-гликопротеин, С-С8Р, СМ-С8Р, М-С8Р, ЕРО и др.
При использовании в настоящем описании термин лекарственный фрагмент означает любой фрагмент, пригодный для терапии, включая, но не ограничиваясь, антитела, противовоспалительные вещества, противоопухолевые вещества, цитотоксины и радиоактивные вещества. Лекарственный фрагмент включает пролекарства биоактивных веществ, конструкты, в составе которых несколько лекарственных фрагментов связано с носителем, например мультивалентные агенты. Лекарственный фрагмент также включает белки и конструкты, включающие белки. Типичные белки включают, но не ограничиваются, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Р), гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (СМС8Р), интерферон (например, интерфероном α, β, γ), интерлейкин (например, интерлейкин II), белки сыворотки (например, факторы VII, νΐΐα, VIII, IX и X), человеческий хорионический гонадотропин (НСС), фолликулостимулирующий гормон (Р8Н) и лютеинизирующий гормон (ЬН), а также белки, слитые с антителами (например, рецептор фактора некроза опухоли (ΤΝΡΚ), слитый с доменом Рс).
При использовании в настоящем описании термин фармацевтически приемлемый носитель включает любой материал, при комбинации с которым конъюгат сохраняет активность и не реагирует с иммунной системой субъекта. Примеры включают, но не ограничиваются, любые общепринятые фармацевтические носители, такие как физиологический раствор, забуференный фосфатом, вода, эмульсии, такие как водно-масляная эмульсия, и различные типы смачивающих средств. Другие носители могут также включать стерильные растворы, таблетки, включая таблетки, покрытые оболочкой, и капсулы. Обычно такие носители содержат эксципиенты, такие как крахмал, молоко, сахар, некоторые типы глин, желатин, стеаровая кислота или ее соли, стеарат магния или кальция, тальк, растительные жиры или масла, камеди, гликоли или другие известные эксципиенты. Такие носители могут также включать вкусовые добавки или красители и другие ингредиенты. Композиции, содержащие такие носители, могут быть составлены с помощью широко известных общепринятых методов.
При использовании в настоящем описании термин введение означает пероральное введение, введение в виде суппозиториев, местный контакт, внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное введение, введение внутрь пораженных тканей, интраназальное или подкожное введение или имплантация субъекту устройства медленного высвобождения, например, мини-осмотического насоса. Введение может осуществляться любым путем, включая парентеральный и трансмукозальный (т.е. пероральный, назальный, вагинальный, ректальный или трансдермальный). Парентеральное введение включает, например, внутривенное, внутримышечное, внутриартериолярное, интрадермальное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрижелудочковое и интракраниальное введение. Далее, когда инъекция проводится с целью терапии опухоли, т.е способна вызывать апоптоз, введение может проводиться непосредственно в опухоль и/или в ткани, окружающие опухоль. Другие способы доставки включают, но не ограничиваются, использование липосомальных препаратов, внутривенной инфузии, трансдермальных пластырей и т.д.
При использовании в настоящем описании термин уменьшить интенсивность или уменьшение интенсивности означает любые признаки успеха лечения патологии или заболевания, включая любые объективные или субъективные параметры, такие как ослабление, понижение или уменьшение симптомов или улучшение физического или психического здоровья пациента.
- 8 017770
Термин терапия означает лечение заболевания или состояния, включая предотвращение возникновения заболевания или состояния у животного, которое может быть предрасположено к данному заболеванию, но пока не испытывает или не демонстрирует симптомы заболевания (профилактическое лечение), подавление заболевания (замедление или остановка его развития), облегчение симптомов или побочных эффектов заболевания (включая паллиативную терапию) и излечение заболевания (регрессия заболевания).
Термин эффективное количество, или количество, эффективное для, или терапевтически эффективное количество, или любой грамматический эквивалент означает количество, которое при введении животному для лечения заболевания, оказывается достаточным для эффективного лечения заболевания.
Термин выделенный относится к материалу, достаточно или полностью свободному от компонентов, используемых для производства этого материала. Для пептидных конъюгатов согласно изобретению термин выделенный относится к материалу, достаточно или полностью свободному от компонентов, которые обычно соседствуют с материалом в смеси, используемой для получения пептидного конъюгата. Выделенный и чистый употребляются взаимозаменяемо. Обычно выделенные пептидные конъюгаты согласно изобретению имеют уровень чистоты, предпочтительно выражаемый в виде интервала. Обычно нижнее значение интервала чистоты пептидных конъюгатов равно приблизительно 60%, приблизительно 70% или приблизительно 80% и верхнее значение интервала чистоты равно приблизительно 70%, приблизительно 80% или более чем приблизительно 90%.
Если чистота пептидных конъюгатов составляет более чем приблизительно 90%, их чистота также предпочтительно выражается интервалом. Обычно нижнее значение интервала равно приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 96% или приблизительно 98%. Верхнее значение интервала чистоты равно приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 96%, приблизительно 98% или приблизительно 100%.
Чистоту определяют с помощью аналитических методов, известных из уровня техники (например, интенсивность полосы на геле, окрашенном серебром, электрофорез в полиакриламидном геле, ВЭЖХ или сходные методы).
При использовании в настоящем описании практически каждый представитель популяции описывает характеристику популяции пептидных конъюгатов согласно изобретению, в которой определенный процент модифицированных сахаров, присоединяемых к пептиду, присоединяется к множественным идентичным акцепторным сайтам в составе пептида. Практически каждый представитель популяции относится к гомогенности сайтов в составе пептида, конъюгированного с модифицированным сахаром, и означает конъюгаты согласно изобретению гомогенные по меньшей мере приблизительно на 80%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% и более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95%. Гомогенность означает постоянство структуры в популяции акцепторных групп, с которыми конъюгируются модифицированные сахара. Таким образом, если в пептидном конъюгате согласно изобретению каждый модифицированный сахар конъюгирован с акцепторным сайтом, имеющим ту же структуру, что и акцепторные сайты, с которыми конъюгированы все остальные модифицированные сахара, говорят, что такой конъюгат гомогенен на 100%. Гомогенность обычно выражается в виде интервала. Нижнее значение интервала гомогенности пептидных конъюгатов равно приблизительно 60%, приблизительно 70% или приблизительно 80% и верхнее значение интервала гомогенности равно приблизительно 70%, приблизительно 80% или более чем приблизительно 90%.
Если гомогенность пептидных конъюгатов составляет не менее приблизительно 90%, их чистота также предпочтительно выражается интервалом. Обычно нижнее значение интервала равно приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 96%, или приблизительно 98%. Верхнее значение интервала чистоты равно приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 96%, приблизительно 98% или приблизительно 100%. Чистоту пептидных конъюгатов обычно определяют с помощью одного или более методов, известных специалистам в уровне техники (например, жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЬС-М8) или матричная лазерная десорбционная ионизационая времяпролетная масс-спектрометрия (тайтх акыйеб 1азсг бекотрйои та§8 Итс οί Πί§1ιΙ 5рсс1готс1гу. ΜΆΕΌΙΤΘΕ), капиллярный электрофорез и т.д.).
Достаточно однородная гликоформа или достаточно однородный паттерн гликозилирования при описании гликопептида означает процент акцепторных групп, гликозилированных рассматриваемой гликозилтрансферазой (например, фукозилтрансферазой). Например, в случае а1,2-фукозилтрансферазы, наблюдается достаточно однородный паттерн фукозилирования, если в пептидном конъюгате согласно изобретению практически все (как определено ниже) молекулы Οαΐβ 1,4-О1сМЛс-К. и их сиализованные аналоги фукозилированы. В фукозилированных структурах, описанных ниже, связь Рпс-С1сХЛс обычно представляет собой связь α1,6 или α1,3, причем в общем случае предпочтительна связь α1,6. Специалисту в области техники следует понимать, что исходный материал может содержать гликозилированные акцепторные группы (например, фукозилированные группы Οαΐβ 1,4-О1сХЛс-В). Это означает, что вычисленный процент гликозилирования будет включать как акцепторные группы, гликозилированные
- 9 017770 способами согласно настоящему изобретению, так и акцепторные группы, находящиеся в гликозилированном состоянии в исходном материале.
Термин достаточно в вышеприведенных определениях достаточно однородного в общем случае означает, что гликозилированы по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80% или более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% акцепторных групп данной гликозилтранс феразы.
При описании замещающих групп с помощью общепринятых химических формул формулы, записанные слева направо, также распространяются на химически идентичные замещающие группы, полученные при написании формулы справа налево, т.е., например, -СН2О- может быть также записано как -ОСН2-.
Если не указано иначе, термин алкил по отдельности или в составе другой замещающей группы означает прямую или разветвленную цепь, или циклический углеводородный радикал, или их комбинацию, которая может быть полностью насыщенной, моно- или полиненасыщенной и может включать дии мультивалентные радикалы, содержащие указанное число атомов углерода (т.е. С1-С!0 означает от 1 до 10 атомов углерода). Примеры насыщенных углеводородных радикалов включают, но не ограничиваются, такие группы, как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил, циклогексил, циклогексилметил, циклопропилметил, гомологи и изомеры, например, н-пентила, н-гексила, н-гептила, н-октила и т.д. Ненасыщенной алкильной группой называется группа, содержащая одну или более двойных или тройных связей. Примеры ненасыщенных алкильных групп включают, но не ограничиваются, винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентенил, 2-бутадиенил, 2,4-пентадиенил, 3-(1,4пентадиенил), этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил и высшие гомологи и изомеры. Если не указано иначе, термин алкил также включает алкильные производные, более детально описанные ниже, такие как гетероалкилы. Алкильные группы, ограничивающиеся углеводородными группами, называются гомоалкилы.
Термин алкилен по отдельности или в составе другой замещающей группы означает бивалентный радикал, полученный из алкана, как видно из неограничивающего примера -СН2СН2СН2СН2- и далее включает гетероалкиленовые группы, описанные ниже. В общем случае алкильная (или алкиленовая) группа содержит от 1 до 24 атомов углерода, при этом для настоящего изобретения предпочтительными являются группы, содержащие 10 или меньше атомов углерода. Низший алкил или низший алкилен означает алкильную или алкиленовую группу с более короткой цепью, обычно содержащую 8 или меньше атомов углерода.
Термины алкокси, алкиламино и алкилтио (или тиоалкокси) употребляются в своем общепринятом смысле и означают алкильные группы, присоединенные к остальной части молекулы через атом кислорода, аминогруппу или атом серы соответственно.
Термин гетероалкил по отдельности или в комбинации с другим термином означает, если не указано иначе, стабильную линейную или разветвленную цепь, или циклический углеводородный радикал, или их комбинацию, содержащую указанное число атомов углерода и по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, состоящей из О, Ν, 81 и 8, где атомы азота и серы могут необязательно находиться в окисленной форме, и гетероатом азота может необязательно находиться в четвертичной форме. Гетероатом (гетероатомы) О, Ν, 8 и 81 могут находиться в любом внутреннем положении гетероалкильной группы или в положении, в котором алкильная группа присоединяется к остальной части молекулы. Примеры включают, но не ограничиваются, -СН2-СН2-О-СН3, -ί.Ή2-ί.Ή2-ΝΗ-ί.Ή3. -СН2-СН2-^СН3)-СН3, -СН2-8-СН2-СНз, -СН2-СН2-8(О)-СН3, -СН2-СН2-8(О)2-СН3, -СН=СН-О-СН3, -81(СН3)3, -СШ-СН=^ОСНз и -СН=СН-МСН3)-СН3. До двух гетероатомов могут располагаться последовательно, например, -СН2-NН-ОСН3 и -СН2-О-81(СНз)з. Сходным образом, термин гетероалкилен по отдельности или в составе другой замещающей группы означает бивалентный радикал, полученный из гетероалкила, как видно из неограничивающего примера -СН2-СН2-8-СН2-СН2- и -СН2-8-СН2-СН2-СН2-. В гетероалкиленовых группах гетероатомы также могут занимать одно или оба крайних положения (например, алкиленокси, алкилендиокси, алкиленамино, алкилендиамино и т.д.). Далее, для алкиленовых и гетероалкиленовых связывающих групп направление записи формулы связывающей группы не определяет ориентации связывающей группы. Например, формула -С(О)2В'- означает как -С(О)2В'-, так и -В'С(О)2-.
Термин циклоалкил и гетероциклоалкил по отдельности или в комбинации с другими терминами означают, если не указано иначе, циклические формы алкила и гетероалкила соответственно. Кроме того, в циклоалкиле гетероатом может занимать положение, в котором гетероцикл присоединен к остальной части молекулы. Примеры циклоалкилов включают, но не ограничиваются, циклопентил, циклогексил, 1-циклогексенил, 3-циклогексенил, циклогептил и т.д. Примеры гетероциклоалкилов включают, но не ограничиваются, 1-(1,2,5,6-тетрагидропиридил), 1-пиперидинил, 2-пиперидинил,
3-пиперидинил, 4-морфолинил, 3-морфолинил, тетрагидрофуран-2-ил, тетрагидрофуран-3-ил, тетрагидротиен-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, 1-пиперазинил, 2-пиперазинил и т.д.
Термин гало или галоген по отдельности или в составе другой замещающей группы означает, если не указано иначе, атом фтора, хлора, брома или йода. Кроме того, термины, такие как галогенал
- 10 017770 кил, включают моногалогеналкил и полигалогеналкил. Например, термин галоген(С1-С4)алкил включает, но не ограничивается, трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, 4-хлорбутил, 3-бромопропил и т.д.
Термин арил означает, если не указано иначе, полиненасыщенную ароматическую замещающую группу, которая может состоять из одного или нескольких колец (предпочтительно от 1 до 3 колец), конденсированных или ковалентно связанных. Термин гетероарил означает арильные группы (или кольца), содержащие от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из Ν, О и 8, где атомы азота и серы необязательно находятся в окисленном состоянии и атом (атомы) азота необязательно находятся в четвертичном состоянии. Гетероарильная группа может присоединяться к остальной части молекулы через гетероатом. Неограничивающие примеры арильных и гетероарильных групп включают фенил, 1-нафтил, 2-нафтил,
4- бифенил, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил, 3-пиразолил, 2-имидазолил, 4-имидазолил, пиразинил,
2- оксазолил, 4-оксазолил, 2-фенил-4-оксазолил, 5-оксазолил, 3-изоксазолил, 4-изоксазолил,
5- изоксазолил, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил, 2-фурил, 3-фурил, 2-тиенил, 3-тиенил, 2-пиридил,
3- пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидил, 4-пиримидил, 5-бензотиазолил, пуринил, 2-бензимидазолил, 5-индолил, 1-изохинолил, 5-изохинолил, 2-хиноксалинил, 5-хиноксалинил, 3-хинолил, тетразолил, бензо[Ь]фуранил, бензо[Ь]тиенил, 2,3-дигидробензо[1,4]диоксин-6-ил, бензо[1,3]диоксол-5-ил и 6-хинолил. Замещающие группы для каждой из указанных кольцевых систем выбираются из группы приемлемых замещающих групп, описанных ниже.
Для краткости, при употреблении термина арил в комбинации с другими терминами (например, арилокси, арилтиокси, арилалкил) термин включает как арильные, так и гетероарильные кольца, как определено выше. Таким образом, термин арилалкил включает радикалы, где арильная группа присоединена к алкильной группе (т.е. бензил, фенэтил, пиридилметил и т.д.), включая алкильные группы, в которых атом углерода (например, метиленовая группа) замещен, например, атомом кислорода (например, феноксиметил, 2-пиридилоксиметил, 3-(1-нафтилокси)пропил и т.д.).
Все термины, приведенные выше (т.е. алкил, гетероалкил, арил и гетероарил), включают как замещенную, так и незамещенную форму указанного радикала. Предпочтительные замещающие группы для каждого из радикалов приведены ниже.
Замещающие группы для арильных и гетероарильных радикалов (включая группы, часто обозначаемые как алкилен, алкенил, гетероалкилен, гетероалкенил, алкинил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкенил и гетероциклоалкенил) имеют обобщающее название алкильные замещающие группы и могут представлять собой одну или более различных групп, выбранных из неограничивающего перечня: -0Я', =0, =ΝΚ', =Ν-ΘΚ', =ΝΚ'Κ, -галоген, -81Я'ЯЯ', -0С(0)Я', -С(0)Я', -С02Я', -С0ХЯ'Я, -0С(0)ХЯ'Я, -ХЯС(0)Я', -ΝΚ'<(Θ)ΝΚΚ', -ХЯС(0)2Я', -ΝΚ-^ΝΚ'ΚΚ')=ΝΚ, -ΝΚ<(ΝΚΙΚ)=ΝΚ', -8(0)Я', -8(0)2Я', -8(0)2ΝΚ'Κ, -ΝΚ802Κ'. -СИ и -ΝΘ2, в количестве, варьирующем от 0 до (2т'+1), где т' - суммарное число атомов углерода в каждом радикале; Я', Я'', Я''' и Я'', каждый независимо, предпочтительно означают водород, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, например арил, замещенный 1-3 галогенами, замещенные или незамещенные алкильные, алкоксильные или тиоалкокси группы или арилалкильные группы. Когда вещество согласно изобретению включает более одной Я-группы, например каждая из Я-групп выбирается независимо, так же как и каждая группа из Я', Я'', Я''' и Я'''', если присутствует более одной такой группы. Если Я' и Я'' связаны с одним и тем же атомом азота, они могут комбинироваться с атомом азота в 5-, 6- или 7-членное кольцо. Например, -ЛЯ'Я означает, но не ограничивается, 1-пирролидинил и 4-морфолинил. Из вышеприведенного обсуждения замещающих групп специалисту в области техники ясно, что термин алкил включает группы, содержащие атомы углерода, связанные с группами, отличающимися от атомов водорода, такими как галогеналкильные (например, -СЕ3 и -СН2СЕ3) и ацильные (например, -С(О)СН3, -С(0)СЕ3, -С(0)СН20СН3 и т.д.).
Так же как замещающие группы, описанные для алкильного радикала, замещающие группы для арильных и гетероарильных групп имеют обобщающее название арильные замещающие группы. Замещающие группы выбираются, например, из галогена, -0Я', =0, =ΝΚ', =Ν-0Κ', -ΝΚΈ, - 8Я', -галогена, -81Я'Я''Я''', -0С(0)Я', -С(0)Я', -С02Я', -С0\Я'Я''. -ОС^^ЯЯ, -ΝΚ''€(0)Κ', -ΝΚ'-€(0)ΝΚΚ', -ХЯС(0)2Я', -ΝΚ-С (ΝΚγΚ'γΚ')=ΝΚ, -ΝΚ-^ΝΚ'^'^ΝΚ''', -8(0)Я', -8(0)2Я', -8(0)2ΝΚΉ, -ΝΚ802Κ', -ΟΝ и -Ν02, -Я', -Ν3, -СН(Яй)2, фтор(С1-С4)алкокси и фтор(С1-С4)алкил в количестве, варьирующем от нуля до суммарного числа свободных валентностей ароматического кольца, где Я', Я'', Я''' и Я'''', каждый независимо, предпочтительно означают водород, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил или замещенный или незамещенный гетероарил. Когда вещество согласно изобретению включает более одной Я-группы, например, каждая из Я-групп выбирается независимо, так же как и каждая группа из Я', Я'', Я''' и Я'''', если присутствует более одной такой группы. В схемах, приведенных ниже, символ X означает Я, как описано выше.
Две замещающие группы на соседних атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно заменены замещающей группой вида -Т-С(О)-(СЯК')и-И-, где Т и и незасисимо представляют собой -ΝΚ-, -0-, -СЯЯ1 - или одинарную связь и и представляет собой целое число от 0 до 3. В качестве альтернативы две замещающие группы на соседних атомах арильного или гетероарильного кольца могут необязательно заменяться замещающими группами вида -А-(СН2)Г-В-, где А и В независимо пред
- 11 017770 ставляют собой -СВВ'-, -Ο-, -ΝΒ-, -8-, -8(0)-, -δ(Ο)2-, -δ(Θ)2ΝΒ'- или одинарную связь; а г означает целое число от 1 до 4. Одна из одинарных связей вновь образованного кольца может необязательно заменяться двойной связью. В качестве альтернативы две замещающие группы на соседних атомах арильного или гетероарильного кольца могут необязательно заменяться замещающими группами вида -(СКк')2-Х-(СВВ''')й-, где ζ и ά независимо означают целые числа от 0 до 3, а X означает -Ο-, -ΝΒ'-, -8-, -δ(Θ)-, -δ(0)2- или -δ(Θ)2ΝΒ'-. Замещающие группы В, В', В'' и В''' предпочтительно выбираются независимо из водорода или замещенного или незамещенного (С1-С6)алкила.
При использовании в настоящем описании термин гетероатом включает кислород (О), азот (Ν), серу (8) и кремний (δί).
Термин стволовые клетки означает мультипотентные или недифференцированные клетки, способные к неограниченному самокопированию и дифференцировке в различные ткани тела. Стволовые клетки могут дифференцироваться в нормальные компоненты крови, включая красные кровяные клетки, белые кровяные клетки и тромбоциты. Стволовые клетки, как правило, локализуются в костном мозге и в крови и могут быть извлечены для трансплантации.
Термин кроветворная клетка означает клетку, связанную с образованием клеток крови. Термин может употребляться взаимозаменяемо с определенным выше термином стволовые клетки.
При использовании в настоящем описании термин стимуляция продукции стволовых клеток включает все процессы, увеличивающие число стволовых клеток ίη νίνο или ίη νίίτο. Большее число стволовых клеток может быть обусловлено увеличением числа клеток-предшественников. Термин также включает процессы транспорта стволовых клеток в костный мозг и из костного мозга.
Сходным образом, термин стимуляция продукции кроветворных стволовых клеток включает все процессы, увеличивающие число кроветворных клеток ίη νίνο или ίη νίίτο. Большее число кроветворных клеток может быть обусловлено большим количеством клеток-предшественников, ускорением созревания плюрипотентных стволовых клеток в кроветворные клетки или их комбинацией. Термин также включает процессы транспорта кроветворных клеток в костный мозг и из костного мозга.
Термин гранулоциты означает белые кровяные клетки, для которых характерно присутствие гранул в цитоплазме.
Введение.
Настоящее изобретение охватывает способы введения гликопэгилированного О-С8Б с целью предотвращения, облегчения симптомов или лечения заболеваний и состояний, связанных с дефицитом кроветворения, часто обусловленным химиотерапией, радиационной терапией и тромбоцитопенией. О-С8Б в основном действует на костный мозг, стимулируя продукцию воспалительных лейкоцитов, и далее действует как эндокринный гормон, инициирующий замещение нейтрофилов, выработанных в ходе воспалительных функций. О-С8Б также находит применение в клинике при замене костного мозга после химиотерапии.
В настоящем изобретении представлен конъюгат, содержащий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (О-С8Б). Настоящее изобретение также распространяется на конъюгаты, содержащие гликозилированные и негликозилированные пептиды, обладающие стимулирующей активностью гранулоцитарного колониестимулирующого фактора. Конъюгаты могут быть дополнительно модифицированы дальнейшей конъюгацией с различными молекулами, такими как лекарственные вещества, диагностические вещества, направляющие вещества и т.д. В конъюгатах О-С8Б, описанных в настоящем изобретении, к гликозильному или аминокислотному остатку в составе пептида О-С8Б может быть ковалентно присоединена полимерная модифицирующая группа предпочтительно посредством гликозильной связывающей группы. В примерном воплощении полимерная модифицирующая группа представляет собой водорастворимый полимер. В дальнейшем предпочтительном воплощении водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
В примерных воплощениях пептид О-С8Б согласно изобретению может вводиться пациенту с целью предотвращения инфекции у онкологических больных, проходящих радиационную терапию, химиотерапию и пересадку костного мозга, с целью мобилизации клеток-предшественников для сбора при трансплантации клеток-предшественников из периферической крови, для лечения тяжелой хронической или относительной лейкопении вне зависимости от ее причины и для поддерживающей терапии пациентов с острой миелоидной лейкемией. Кроме того, полипептидные конъюгаты или композиции согласно изобретению могут использоваться для терапии СПИДа или других иммунодефицитных заболеваний, а также бактериальных инфекций, заболевания сердца и гепатитов А, В и С.
В одном воплощении пептидный конъюгат О-С8Б согласно изобретению может вводиться субъекту для повышения гематопоэза. Гематопоэзом называется процесс, в ходе которого клеткипредшественники развиваются в зрелые клетки крови, включая красные кровяные клетки, белые кровяные клетки и тромбоциты. Нормальный гематопоэз координируется действием различных регуляторов, включая гликопротеины, такие как колониестимулирующие факторы. Эти регуляторы модулируют выживание, пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток и клеток-предшественников и состояние активации зрелых клеток. Нарушение гематопоэза приводит к снижению продукции клеток крови и тромбоцитов, что ведет к снижению иммунитета и невозможности заживления ран и борьбы с инфек
- 12 017770 циями.
В настоящем изобретении представлены способы и композиции для стимуляции гематопоэза у субъекта. Способы согласно изобретению включают стадию введения субъекту эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Б и полимерной модифицирующей группы.
В одном аспекте стимуляция гематопоэза включает увеличение числа кроветворных клетокпредшественников у субъекта, что приводит также к повышению зрелых кроветворных клеток (клеток крови). Кроветворные клетки-предшественники перемещаются и задерживаются в костном мозге, где они созревают и превращаются в красные и белые кровяные клетки. Способы стимулирования числа кроветворных клеток-предшественников согласно изобретению включают стадию введения субъекту эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Б и полимерной модифицирующей группы. В одном воплощении применение пептида увеличивает число кроветворных клеток-предшественников, представляющих собой СО34+ клетки.
Миелосупрессия.
Миелосупрессия представляет собой уменьшение продукции клеток крови. Нормальная кровь содержит большое количество клеток, включая красные кровяные клетки, переносящие кислород, и белые кровяные клетки, борющиеся с инфекциями. Нормальная кровь также содержит тромбоциты, крошечные фрагменты клеток, запускающие процесс свертывания крови. Эти клетки и фрагменты клеток происходят из костного мозга, вещества, находящегося внутри некоторых костей. Здоровый костный мозг каждый день продуцирует большое количество красных кровяных клеток, белых кровяных клеток и тромбоцитов. При миелосупрессии костный мозг продуцирует слишком мало таких клеток. В настоящем изобретении представлены способы и композиции для лечения, облегчения симптомов и предотвращения миелосупрессии.
Одной из характерных особенностей миелосупрессии является подавление продукции белых кровяных клеток у субъекта. Это подавление продукции белых кровяных клеток может быть обусловлено некоторыми видами терапии, в особенности противоопухолевой терапии, такими как химиотерапия и радиационная терапия. Подавление продукции белых кровяных клеток также может быть обусловлено заболеваниями, такими как идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура. В одном аспекте конъюгаты согласно изобретению используются для лечения и облегчения заболеваний, характеризующихся нарушением продукции белых кровяных клеток.
Заболевания, обусловленные миелосупрессией, включают нейтропению (включая фебрильную нейтропению) и тромбоцитопению. Нейтропения представляет собой заболевание, характеризующееся ненормальным понижением числа нейтрофилов в крови (наиболее распространенного типа белых кровяных клеток). Понижение может быть относительным или абсолютным. В одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы лечения нейтропении у млекопитающего. Эти способы включают стадии введения фармацевтически эффективного количества конъюгатов С-С8Б согласно изобретению. Было показано, что С-С8Б влияет на фебрильную нейтропению и смертность среди взрослых онкологических больных (Кийетет е! а1., 1. С1ш. Опе. (2007), 25(21):3158-67).
Тромбоцитопения представляет собой заболевание, при котором число тромбоцитов в крови ненормально низкое; для этого заболевания часто характерны ненормальные кровотечения. Способы согласно изобретению включают терапии тромбоцитопении у млекопитающих. Эти способы включают стадии введения фармацевтически эффективного количества конъюгатов С-С8Б согласно изобретению. При использовании в настоящем описании термин тромбоцитопения охватывает как заболевания известной этиологии, так и идиопатическую тромбоцитопению.
Тромбоцитопения и идиопатическая тромбоцитопения также называются в настоящем описании тромбоцитопеническая пурпура и идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура.
Стимуляция стволовых клеток.
Один способ преодоления миелосупрессии заключается в стимуляции продукции стволовых клеток. Стимуляция продукции стволовых клеток включает увеличение числа стволовых клеток, включая число кроветворных клеток-предшественников, и числа гранулоцитов, включая нейтрофилы и эозинофилы. Стимуляция продукции стволовых клеток также включает усиленный транспорт стволовых клеток из костного мозга в периферическую кровь. Такая стимуляция облегчает забор стволовых клеток у донора, поскольку периферическая кровь более легкодоступна, чем костный мозг. В одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы стимуляции продукции стволовых клеток у субъекта.
В другом аспекте предотвращение, облегчение симптомов и лечение миелосупрессии достигаются за счет использования способов и композиций согласно изобретению путем стимуляции кроветворных клеток-предшественников у субъекта. Стимуляция кроветворных клеток-предшественников включает как увеличение числа кроветворных клеток-предшественников, так и усиленный транспорт кроветворных клеток-предшественников в костный мозг и из костного мозга.
Кроветворные клетки-предшественники, такие как клетки СЭ34+. созревают и дифференцируются в компоненты крови, а именно в красные и белые кровяные клетки. В настоящем изобретении представлены способы стимуляции кроветворных клеток-предшественников у субъекта, включающие стадию
- 13 017770 введения субъекту: (1) первой композиции, содержащей компонент, имеющий формулу 1,1'-1,4-фенилен-бис-(метилен)-бис-1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан (ΛΜΌ3100), и (2) второй композиции, содержащей пептид, который представляет собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы. В одном воплощении первую и вторую композиции вводят субъекту последовательно в любом порядке. В другом воплощении первую и вторую композицию вводят субъекту одновременно. В одном воплощении обе композиции вводят субъекту подкожно.
ΛΜΌ3100 представляет собой бицикламовое производное, способное мобилизовать большое число клеток СЭ34+ в кровоток как у здоровых субъектов, так и у онкологических больных, как было показано в работах Ы1е5 е! а1., Βίοοά (2003), 102:2728-30; Эеуте е! а1., 1. С1т. Опсо1. (2004), 22:1095-1102. Также исследования показали, что комбинация ΛΜΌ3100 и негликозилированной формы С-С8Р способна мобилизовать большее число клеток С.’Э34+ в кровоток, чем один С-С8Р (Р1ошепЬегд е! а1., Β1οοά (2005), 106(5):1867-1874).
В одном воплощении продукция стволовых клеток стимулируется у субъекта, служащего донором костного мозга или кроветворных клеток. Донор получает пептидный конъюгат, описанный выше. Количество стволовых клеток у донора повышается, и эти стволовые клетки выходят из костного мозга в периферическую кровь. Такие клетки затем легко выделяются из крови донора с помощью методов, известных из уровня техники. В таких воплощениях донор и реципиент костного мозги или кроветворных клеток могут быть одним и тем же лицом (аутологичный донор) или донором может быть субъект, не являющийся реципиентом (аллогенный донор).
В другом аспекте пептидные конъюгаты согласно изобретению комбинируются по меньшей мере с одним химиотерапевтическим агентом.
Трансплантаты костного мозга.
В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлены способы и композиции для стимуляции продукции стволовых клеток у реципиента трансплантата костного мозга. Эти способы включают стадию введения реципиенту некоторого количества пептида, представляющего собой конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы. В одном воплощении полимерная модифицирующая группа представляет собой водорастворимый полимер, который может быть ковалентно связан с пептидом С-С8Р у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Р, предпочтительно посредством интактной гликозильной связывающей группы. Пептид может вводиться реципиенту перед трансплантацией костного мозга, после трансплантации или одновременно с трансплантацией.
Успех трансплантации определяет длительное приживление трансплантата. Термин приживление означает процесс, в ходе которого инфузированные или пересаженные донорские стволовые клетки направляются в костный мозг реципиента и продуцируют клетки крови всех типов. Первым признаком приживления является появление в крови реципиента новых белых клеток, красных клеток и тромбоцитов после пересадки стволовых клеток. Длительное приживление трансплантата означает процесс, в ходе которого инфузированные или пересаженные донорские стволовые клетки остаются в костном мозге реципиента и продуцируют клетки крови в течение длительного периода времени без отторжения иммунной системой реципиента. При включении в трансплантат средних и поздних клетокпредшественников ускоряется продукция зрелых клеток донорского происхождения и поддерживается процесс приживления.
В соответствии с вышесказанным в настоящем изобретении представлены способы и композиции, повышающие длительное приживление трансплантата костного мозга, полученного реципиентом. В одном примерном воплощении пептид согласно изобретению вводят донору до трансплантации костного мозга. Пептид стимулирует гематопоэз у донора, в частности, за счет увеличения количества клетокпредшественников, что увеличивает вероятность успешного и длительного приживления при пересадке костного мозга и/или кроветворных клеток реципиенту. Пересаженный костный мозг может принадлежать самому реципиенту (аутологичный трансплантат) или костный мозг может быть пересажен от донора того же биологического вида (аллогенный трансплантат).
В другом воплощении пептид согласно изобретению вводят реципиенту костного мозга с целью повышения длительного приживления трансплантата донорского костного мозга, полученного от самого реципиента или другого субъекта. Получение пептида реципиентом может стимулировать гематопоэз у реципиента, что повышает вероятность приживления трансплантата путем стимуляции продукции кроветворных клеток-предшественников донорским костным мозгом.
Трансплантаты кроветворных клеток.
Трансплантация кроветворных клеток является общепринятым способом лечения различных наследственных или злокачественных заболеваний. В то время как при некоторых процедурах трансплантации используют всю популяцию клеток костного мозга, при других процедурах используют более узкие популяции, обогащенные стволовыми клетками. Кроме костного мозга, такие клетки могут быть получены из других источников, таких как периферическая кровь и пуповинная кровь новорожденных. Одно из преимуществ использования стволовых клеток из периферической крови заключается в том, что такие клетки значительно легче забрать из периферической крови, чем из костного мозга. Однако малое количество плюрипотентных клеток/клеток-предшественников в кровотоке является лимитирующим
- 14 017770 фактором для трансплантации стволовых клеток из периферической крови. Таким образом, для использования в трансплантации необходимо увеличить число стволовых клеток ех νίνο.
В соответствии со сказанным в настоящем изобретении представлены способы увеличения числа стволовых клеток в культуре. В примерном воплощении такие способы включают добавления эффективного количества пептида согласно изобретению в культуру кроветворных клеток. В примерном воплощении такой пептид представляет собой конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы. В одном воплощении полимерная модифицирующая группа представляет собой водорастворимый полимер, который может быть ковалентно присоединен к пептиду С-С8Е у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Е, предпочтительно посредством интактной гликозильной связывающей группы. В одном воплощении в настоящем изобретении представлены способы получения увеличенных популяций стволовых клеток и клеток-предшественников, которые могут использоваться для трансплантации. Эти способы включают стадию добавления к культуре стволовых клеток эффективного количества пептида согласно изобретению.
Трансплантаты органов.
Так же как и трансплантаты костного мозга, транспланты солидных органов, таких как печень, почка, сердце и легкое, могут вызывать различные иммунные реакции у реципиента. Такие иммунные реакции могут приводить к острому отторжению этих трансплантатов. С-С8Е и другие гематопоэтические факторы роста могут использоваться для терапии таких ответов (см. патент США № 5718893). Соответственно, способы и композиции согласно настоящему изобретению могут использоваться для предотвращения или уменьшения вероятности развития острого отторжения трансплантатов органов у пациента.
Сердечное заболевание.
В одном воплощении способы и композиции согласно настоящему изобретению могут использоваться для облегчения течения сердечного заболевания и улучшения функционирования сердца. В одном воплощении способы и композиции согласно изобретению используются для стимуляции высвобождения стволовых клеток, формирующих сосуды. Терапия С-С8Е может ослаблять стенокардию у пациентов с сердечным заболеванием, включая пациентов после многочисленных операций и пациентов, принимающих максимальные дозы стандартных лекарственных препаратов (см., например, Мек1са1 Νοτκ Токау, .Типе 4, 2007, 8еуеге Неай Экеаке РакеШк Ойегек Νον Норе). Другие исследования показали, что С-С8Е способен защитить сердечные мышцы, что предотвращает их смерть, даже если мышцы были повреждены сердечным заболеванием (см., например, 8ипкау Те1едгарй Νοντ Лидик1 5, 2007, Оиг Аог1к-Пгк1 Неайк 1На( Керап ТНеткекек). С-С8Е по отдельности или в комбинации со зрелыми стволовыми клетками пациентов может использоваться в ходе лечения для замещения мертвых сердечных тканей и образования новых кровеносных сосудов.
Неврологические заболевания.
В одном воплощении способы и композиции согласно изобретению могут использоваться для лечения неврологических заболеваний, включая без ограничения болезнь Альцгеймера и другие дегенеративные заболевания мозга. Исследования болезни Альцгеймера на мышиных моделях показали, что в этих моделях С-С8Е может обратить симптомы, сходные с болезнью Альцгеймера (см. Тка1 е! а1. (2007), 1. Ехр. Мек. 204(6):1273-80). Эти исследования показали, что инъекция С-С8Е в кровоток стимулирует выход кроветворных клеток из костного мозга. Эти стволовые клетки попадают из кровотока в мозг, где они прикрепляются к местам повреждений и дифференцируются в новые клетки. Применение С-С8Е приводит к росту новых клеток в местах наибольших повреждений нейронов.
Конъюгаты С-С8Е
В соответствии со способами, упомянутыми выше, пептид представляет собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы. Полимерная модифицирующая группа может ковалентно присоединяться к пептиду С-С8Е у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Е, предпочтительно посредством гликозильной связывающей группы. В одном воплощении гликозильная связывающая группа представляет собой интактную гликозильную связывающую группу. В предпочтительных воплощениях полимерная модифицирующая группа и гликозильная связывающая группа ковалентно присоединены посредством линкера. В примерном воплощении полимерная модифицирующая группа представляет собой водорастворимый полимер, такой как полиэтиленгликоль.
С-С8Е был клонирован и секвенирован. В примерном воплощении аминокислотная последовательность С-С8Е соответствует 8Еф ГО NО:1. Специалисту в области техники очевидно, что настоящее изобретение не ограничивается последовательностями, приведенными в настоящем описании.
Настоящее изобретение также распространяется на варианты С-С8Е, известные из уровня техники. В качестве примера, никоим образом не ограничивающего настоящее изобретение, можно привести вариант С-С8Е, описанный в патенте США № 6166183, где описывается С-С8Е, состоящий из природной совокупности лизиновых остатков, далее связанный с одной или двумя молекулами полиэтиленгликоля. Кроме того, в патентах США № 6004548, 5580755, 5582823 и 5676941 описывается вариант С-С8Е, в котором один или более цистеиновых остатков в положениях 17, 36, 42, 64 и 74 заменены на аланин или серин. В патенте США № 5416195 описана молекула С-С8Е, в которой цистеин в положении 17, аспар
- 15 017770 тат в положении 27 и серины в положениях 65 и 66 заменены на серин, серин, пролин и пролин соответственно. Из уровня техники известны и другие варианты, описанные, например, в патенте США № 5399345. Дополнительные варианты имеют аминокислотную последовательность, выбираемую из 8ЕС ΙΌ N0:3-11.
Экспрессия и активность модифицированной молекулы С-С8Р согласно настоящему изобретению может быть определена с помощью способов, хорошо известных из уровня техники, как описано, например, в патенте США № 4810643. К примеру, активность можно измерить с помощью анализа включения тимидина, помеченного радиоактивной меткой. Вкратце, костный мозг от здоровых доноров разделяют по плотности в Нсо11-Нурас.|ис (1,077 г/мл, РНагтааа. Р|5еа1а\\ау. N1), и клетки с низкой плотностью суспендируют в среде Есоге (С1ВС0, Ьа 1о11а, СА), содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, глутамин и антибиотики. Приблизительно 2х104 клеток костного мозга человека инкубируют в контрольной среде либо с добавлением С-С8Р согласно настоящему изобретению в 96-луночном планшетах с плоским дном при приблизительно 37°С, 5% СО2 в воздухе в течение приблизительно 2 суток. Культурам дают импульсную метку в виде 0,5 мкКюри на лунку 3Н-тимидина в течение приблизительно 4 ч (№те Епд1апб №с1еат, ВобЮп, Ма88.) и измеряют включение метки, как описано, например, в работе Уейиа, с1 а1. (1983, В1ооб 61:781). Более сильное включение 3Н-тимидина клетками костного мозга человека по сравнению с клетками костного мозга в присутствии контрольного вещества есть показатель активности и жизнеспособности вещества С-С8Р.
Конъюгаты согласно изобретению образуются путем ферментативного присоединения модифицированного сахара к гликозилированному или негликозилированному пептиду С-С8Р. Модифицированный сахар, расположенный между пептидом С-С8Р и модифицирующей группой на сахаре, в настоящем описании может называться, например, интактной гликозильной связывающей группой. Используя исключительную селективность ферментов, таких как гликозилтрансферазы, настоящее изобретение позволяет получить пептиды, несущие желаемую группу в одном или более определенных положений. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением модифицированный сахар присоединяется напрямую к выбранному локусу на пептидной цепи С-С8Р или в качестве альтернативы модифицированный сахар добавляется к углеводной группе полипептида. Пептиды, в которых модифицированные сахара присоединяются как к углеводу в составе гликопептида, так и напрямую к аминокислотному остатку, входящему в состав полипептидной цепи С-С8Р, также охватываются настоящим изобретением.
В отличие от известных химических и ферментативных стратегий совершенствования пептида, способы согласно изобретению возможно использовать для сборки пептидов и гликопептидов, имеющих практически гомогенный паттерн дериватизации; ферменты, используемые в соответствии с настоящим изобретением, в общем селективны в отношении определенного аминокислотного остатка или комбинации аминокислотных остатков в составе пептида С-С8Р. Такие методы также могут применяться к крупномасштабному производству модифицированных пептидов и гликопептидов. Таким образом, способы согласно изобретению предоставляют практическое средство для крупномасштабного производства гликопептидов с предварительно выбранными паттернами дериватизации. Эти способы особенно хорошо применимы для модификации лекарственных пептидов, включая, но не ограничиваясь, гликопептиды, гликозилированные не полностью в ходе их продукции в клеточной системе (например, клетки млекопитающих, насекомых, растений, грибов, дрожжей или прокариотические клетки) или в трансгенных растениях или животных.
В настоящем изобретении также представлены конъюгаты гликозилированных или негликозилированных пептидов С-С8Р с увеличенным терапевтическим временем полужизни благодаря, например, сниженной скорости клиренса или пониженной скорости поглощения иммунной или ретикулоэндотелиальной системой (КЕ8). Кроме того, способы согласно изобретению предоставляют возможность маскировки антигенных детерминант на пептидах, что ослабляет или отменяет иммунную реакцию хозяина на пептид. Селективное присоединение направляющих агентов также может использоваться для направления пептида в определенную ткань или к определенному рецептору на поверхности клетки, специфическому для данного направляющего агента.
В одном воплощении в настоящем изобретении представлен конъюгат выбранной модифицирующей группы и пептида С-С8Р. Мостик между пептидом и модифицирующей группой включает гликозильную связывающую группу, расположенную между пептидом и выбранной группой. Как обсуждается в настоящем описании, выбранная модифицирующая группа в целом представляет собой любую группу, которая может присоединяться к сахаридной единице, с образованием модифицированного сахара, узнаваемого соответствующим ферментом-трансферазой, присоединяющей модифицированный сахар к пептиду или гликозильному остатку на пептиде. При вставке между пептидом и выбранной группой сахаридный компонент модифицированного сахара становится гликозильной связывающей группой, например интактной гликозильной связывающей группой. Гликозильная связывающая группа образуется из любого моно- или олигосахарида, который после модификации модифицирующей группой представляет собой субстрат для фермента, добавляющего модифицированный сахар к аминокислотному или гликозильному остатку в составе пептида.
- 16 017770
Гликозильная связывающая группа может представлять собой или включать сахаридную группу, модифицируемую с нарушением структуры до или во время добавления модифицирующей группы. Например, гликозильная связывающая группа может быть получена из сахаридного остатка, получаемого путем окислительной деградации интактного сахарида до соответствующего альдегида, например, с помощью метаперйодата и далее превращаемого в основание Шиффа с соответствующим амином, которое затем восстанавливается до соответствующего амина.
Конъюгаты согласно изобретению обычно имеют следующую общую структуру:
где символы а, Ь, с, ά и 8 означают положительные целые числа, отличные от нуля;
ΐ означает ноль или положительное целое число;
Агент обычно представляет собой водорастворимую группу, например РЕС-группу;
Линкер может представлять собой любую из множества связывающих групп (см. ниже).
В качестве альтернативы линкер может представлять собой одинарную связь или линкер нулевого порядка.
Модифицирующие группы могут представлять собой, как обсуждается далее в настоящем описании, любую группу, присоединяемую к сахаридной единице. Такие группы включают полимеры, включая водорастворимые и водонерастворимые полимеры, а также могут включать лекарственные вещества, диагностические вещества, направляющие вещества, токсические вещества и т.д. В примерном воплощении модифицирующая группа представляет собой водорастворимый полимер, например т-РЕС. Водорастворимый полимер ковалентно присоединяется к пептиду С-С8Р посредством гликозильной связывающей группы, ковалентно связанной с аминокислотным или гликозильным остатком в составе пептида С-С8Р. В настоящем изобретении также представлены конъюгаты, в которых аминокислотный остаток и гликозильный остаток модифицированы гликозильной связывающей группой.
Пептиды согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере один Ν- или О-связанный сайт гликозилирования. В дополнение к представлению конъюгатов, образованных с помощью ферментативного присоединения гликозильной связывающей группы, в настоящем изобретении представлены конъюгаты с высокогомогенным паттерном замен. Используя способы согласно изобретению, возможно образовывать пептидные конъюгаты, в которых практически все модифицированные сахара в популяции конъюгатов согласно изобретению присоединены ко множественным копиям аминокислотного или гликозильного остатка с идентичной структурой. Таким образом, в одном аспекте в настоящем изобретении представлен пептидный конъюгат, содержащий популяцию водорастворимых полимерных молекул, ковалентно связанных с пептидом С-С8Р посредством интактной гликозильной связывающей группы. В примерном воплощении конъюгата согласно изобретению практически каждый представитель популяции водорастворимых полимерных молекул связан посредством гликозильной связывающей группы с гликозильным остатком в составе пептида С-С8Р, а все гликозильные остатки в составе пептида С-С8Р, к которым присоединены гликозильные связывающие группы, имеют одинаковые структуры.
Также представлен пептидный конъюгат, в котором популяция водорастворимых полимерных молекул связана с ним посредством гликозидной связывающей группы. В одном воплощении практически каждый представитель популяции водорастворимых полимерных молекул связан посредством гликозильной связывающей группы с аминокислотным остатком в составе пептида С-С8Р, а все аминокислотные остатки в составе пептида С-С8Р, к которым присоединены гликозильные связывающие группы, имеют одинаковые структуры.
В настоящем изобретении также представлены конъюгаты, аналогичные описанным выше, в который пептид С-С8Р конъюгирован с лекарственным фрагментом, диагностическим фрагментом, нацеливающим фрагментом, фрагментом токсина и т.д. через интактную гликозильную связывающую группу. Каждый из вышеперечисленных фрагментов может быть малой молекулой, природным полимером (например, полипептидом) или синтетическим полимером.
Модифицированные сахара.
В настоящем изобретении представлены модифицированные сахара, модифицированные нуклеотидные сахара и конъюгаты модифицированных сахаров. В модифицированных сахарах согласно изобретению сахарная группа предпочтительно представляет собой сахарид, дезоксисахарид, аминосахарид или Ν-ацилсахарид. Термин сахарид и эквивалентные ему термины сахарил, сахар и гликозил означает мономеры, димеры, олигомеры и полимеры. Сахарную группу также функционализируют модифицирующей группой. Модифицирующую группу конъюгируют с сахарной группой, обычно путем конъюгирования с амино-, сульфгидрильной или гидроксильной, например первичной гидроксильной, группой на углеводном остатке. В примерном воплощении модифицирующая группа присоединяется посредством аминогруппы в составе сахара, например, через амид, уретан или мочевину, образующиеся в результате реакции амина с реактивным производным модифицирующей группы.
- 17 017770
В качества сахарного остова конъюгатов согласно изобретению может использоваться любой сахар. Типичные сахарные остовы, применимые для получения композиций согласно изобретению, включают, но не ограничиваются, глюкозу, галактозу, маннозу, фукозу и сиаловую кислоту. Другие применимые сахара включают аминосахара, такие как глюкозамин, галактозамин, маннозамин, 5-аминный аналог сиаловой кислоты и др. Сахарный остов может представлять собой структуру, встречающуюся в природе, или он может быть модифицирован и содержать сайт для конъюгирования с модифицирующей группой. Например, в одном воплощении в настоящем изобретении представлен пептидный конъюгат, содержащий производное сиаловой кислоты, в котором 9-гидроксильная группа заменена на амин. Амин легко дериватизуется активированным аналогом выбранной модифицирующей группы.
Г ликозильные связывающие группы.
В соответствии с пептидными конъюгатами согласно любому из вышеописанных способов некоторые воплощения пептидных конъюгатов содержат гликозильную связывающую группу, представляющую собой остаток сиаловой кислоты.
Мостик между пептидом С-С8Е и выбранным веществом, таким как водорастворимый полимер, включает интактную гликозильную связывающую группу, расположенную между пептидом и выбранным веществом. Как обсуждается в настоящем описании, выбранное вещество представляет собой практически любую молекулу, которая присоединяется к сахаридной единице, что приводит к получению модифицированного сахара, который распознается соответствующим ферментом-трансферазой, присоединяющим модифицированный сахар к пептиду С-С8Е. Сахаридный компонент модифицированного сахара, располагающийся между пептидом С-С8Е и выбранным веществом, называется интактной гликозильной связывающей группой. Гликозильная связывающая группа может быть образована любым моно- или олигосахаридом, который после модификации выбранным веществом представляет собой субстрат соответствующей трансферазы.
В одном воплощении гликозильная связывающая группа представляет собой остаток сиаловой кислоты, структура которого приведена ниже
СОО-
где В означает водорастворимый полимер, и водорастворимый полимер присоединен к остатку сиаловой кислоты посредством вышеупомянутого линкера.
В другом воплощении гликозильная связывающая группа представляет собой остаток сиаловой кислоты, структура которого приведена ниже
где п означает целое число от 1 до 2000.
Еще в одном воплощении гликозильная связывающая группа представляет собой модифицированный остаток сиаловой кислоты, структура которого приведена ниже
Э 7 7 7 7 где В представляет собой Н, СН2ОВ , СООВ или ОВ , В означает Н, замещенный или незамещенный алкил или замещенный или незамещенный гетероалкил;
В3 и В4 независимо выбраны из Н, замещенного или незамещенного алкила, ОВ8, ЫНС(О)В9 * * * * * *, В8 и В9 независимо выбраны из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила или сиаловой кислоты;
Ьа означает линкер, выбранный из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;
В16 и В17 означают независимо выбранные полимерные плечи;
X2 и X4 означают независимо выбранные связывающие фрагменты, соединяющие полимерные группы В16 и В17 с С; и
X5 * * представляет собой нереактивную группу.
В дальнейшем воплощении аминокислотный остаток выбирается из серина или треонина. В еще одном дальнейшем воплощении аминокислотный остаток представляет собой треонин в положении 133
81Х) ΙΌ ЫО:1.
- 18 017770
В одном воплощении гликозильная связывающая группа содержит субструктуру, выбранную из
-- (Са ΙΝΑο Оа1)р----Р15 ’ и где В15 означает модифицированный остаток сиаловой кислоты;
р означает целое число от 1 до 10.
В дальнейшем воплощении гликозильная связывающая группа имеет формулу, выбранную из (Оа ΙΝΑο—Оа1)р---81а----Р15
(ΟΙοΝΑο—Оа1)р—К
АЛО
ЛЛГ
Мап--- (ΟΙοΝΑο—ОаШ
АА—ΟΙοΝΑο—ΟΙοΝΑο—Мап (ΟΙοΝΑο—Са1)„—Р15
Мап---(ΟΙοΝΑο—ОаЩ—Р15
Мап--- (ΟΙοΝΑο—(За1)„—К15
Мап---(ΟΙοΝΑο—(ЗаЩ—-К15
Мап---(ΟΙοΝΑο—Оа1)р—К15 (ΟΙοΝΑο—Оа1)р—К15
ΟΙοΝΑο—Оа1)„—Р15
Мап---(ΟΙοΝΑο—Оа1)р~Р15'
ΟΙοΝΑο—Мап--(ΟΙοΝΑο—ОаГь—В15 (ΟΙοΝΑο—6а1)„—К10 где АА означает аминокислотный остаток указанного пептида;
ΐ означает целое число, равное 0 или 1;
р означает целое число от 1 до 10;
В15 выбирается из Н, ОН, сиаловой кислоты, указанного модифицированного сиалильного остатка и 81а-81ар, где 81ар означает указанный сиалильный остаток;
по меньшей мере один В15 выбирается из указанного модифицированного сиалильного остатка и 81а-81ар.
В одном воплощении аминокислотный остаток представляет собой аспарагиновый остаток. В другом воплощении указанный пептид С-С8Р имеет структуру, представленную ниже
ЛАДГ
I—ТЬг134—О~ Са1НАс-(Са1),.—81а—РЕС где с.| равно 0 или 1;
81а-РЕС имеет структуру, приведенную ниже
СОО'
где η означает целое число от 1 до 2000.
В дальнейшем воплощении η означает целое число от 400 до 500. В еще одном дальнейшем воплощении пептид О-С8Р имеет аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО Ш N0:1.
В обсуждении, приведенном ниже, изобретение проиллюстрировано посредством ссылки к применению избранных производных сиаловой кислоты. Специалисту в области техники ясно, что целью обсуждения является ясность иллюстрации и что предлагаемые структуры и композиции в целом приме
- 19 017770 нимы ко всему классу сахаридных групп, модифицированных сахаридных групп, активированных модифицированных сахаридных групп и конъюгатов модифицированных сахаридных групп.
В примерном воплощении в настоящем изобретении представлен пептидный конъюгат, содержащий модифицированью амин сахара, структура которого приведена ниже а
ΝΗ—Ь-К1 где С означает гликозильную группу;
Ь означает связь или линкер;
В1 означает модифицирующую группу.
Типичными связями являются связи между ИН2-группой гликозильной группы и группы с комплементарной реактивностью на модифицирующей группе. Таким образом, примерные связи включают, но не ограничиваются, ΝΗΒ1, ОВ1, 8В1 и т.д. Например, если В1 содержит карбоксильную группу, эта группа может быть активирована и связана с группой ΝΗ2 на гликозильном остатке, что дает связь со структурой ИНС(О)В!. Сходным образом, ОН- и 8Н-группы могут превращаться в соответствующие эфирные или тиоэфирные производные.
Примерные линкеры включают алкильные и гетероалкильные группы. Линкеры включают связывающие группы, например связывающие группы на основе ацилов, например -С(О)ИН-, -ОС(О)ИН- и т.д. Связывающие группы представляют собой связи между компонентами, принадлежащими к разным группам согласно изобретению, например между гликозильным остатком и линкером (Ь) или между линкером и модифицирующей группой (В1). Другие связывающие группы представляют собой эфиры, тиоэфиры и амины. Например, в одном воплощении линкер представляет собой аминокислотный остаток, такой как остаток глицина. Карбоксильная группа глицина превращается в соответствующий амид в ходе реакции с амином на гликозильном остатке, а амин глицина превращается в соответствующий амид или уретан в результате реакции с активированной карбоксикислотой или карбонатом модифицирующей группы.
Еще одним примерным линкером является РЕС-группа или РЕС-группа, функционализированная аминокислотным остатком. РЕС связывается с гликозильной группой через аминокислотный остаток на одном конце молекулы РЕС и с В1 через другой конец молекулы РЕС. В качестве альтернативы аминокислотный остаток может связываться с В1, а конец РЕС, не связанный с аминокислотным остатком, - с гликозильной группой.
Пример молекулы ИН-Ь-В1 имеет формулу -НН{С(О)(СН2)аНН}8{С(О)(СН2)Ь(ОСН2СН2)сО(СН2)аИН}1В1, где индексы з и ! независимо равны 0 или 1;
индексы а, Ь и б означают независимые целые числа от 0 до 20;
с означает целое число от 1 до 2500.
Другие сходные линкеры основаны на молекулах, в которых ПН-группа заменена, например, на -8, -О и -СН2.
В частности, в настоящем изобретении представлен пептидный конъюгат, содержащий соединения, в которых ПН-Ь-В1 представляет собой:
NΗС(О)(СΗ2)аNΗС(О)(СΗ2)ь(ОСΗ2СΗ2)сО(СΗ2)аNΗΒ1, ПНС(О)(СН2)Ь(ОСН2СН2)сО(СН2)аПНВ1,
ПНС(О)О(СН2)Ь(ОСН2СН2)сО(СН2)аПНВ1, NΗ(СΗ2)аNΗС(О)(СΗ2)ь(ОСΗ2СΗ2)сО(СΗ2)аNΗΒ1, пнсюхсщхпнв1,
ПЩСН^ПНВ1 и ПНВ1, где индексы а, Ь и б выбираются независимо из целых чисел от 0 до 20, предпочтительно от 1 до 5; индекс с означает целое число от 1 до 2500.
В примерном воплощении С означает сиаловую кислоту, и выбранные соединения согласно изобретению имеют формулы:
- 20 017770
Специалисту в области техники очевидно, что остаток сиаловой кислоты в примерных соединениях, приведенных выше, может заменяться любым другим аминосахаридом, включая, но не ограничиваясь, глюкозамин, галактозамин, маннозамин, их Ν-ацетилпроизводные и т.д.
В другом примерном воплощении первичная гидроксильная группа сахара функционализирована модифицирующей группой. Например, 9-гидроксил сиаловой кислоты может превращаться в соответствующий амин и функционализироваться для получения соединения согласно изобретению. Формулы согласно этому воплощению включают:
В дальнейшем примерном воплощении в настоящем изобретении представлен пептидный конъюгат, включающий модифицированные сахара, где гидроксильная группа в положении 6 превращается в соответствующую аминогруппу, несущую кассету линкер-модифицирующая группа, как описанные выше. Примерные сахарильные группы, применимые в качестве основы этих модифицированных сахаров, включают Са1, СаШЛс, С1с, ΟΚΝΆ^ Рис, Ху1, Мап и т.д. Типичный модифицированный сахар согласно
- 21 017770 этому воплощению имеет формулу
где К3-К5 и К7 независимо выбраны из Н, ОН, С(О)СН3, ΝΗ и ИНС(О)СН3;
К6 означает ОК1, ΝΉΚ1 или ΝΉ-Ь-К1, как описано выше.
Выбранные конъюгаты согласно изобретению основываются на маннозе, галактозе или глюкозе или на молекулах, имеющих стереохимию маннозы, галактозы или глюкозы. Общие формулы этих конъюгатов представлены ниже
В другом примерном воплощении в настоящем изобретении представлены соединения, как описано выше, которые активируют путем их превращения в соответствующие нуклеотидные сахара. Примерные нуклеотидные сахара, использующиеся в настоящем изобретении в своей модифицированной форме, включают нуклеотидмоно-, ди- и трифосфаты или их аналоги. В одном воплощении модифицированный нуклеотидный сахар выбирают из υΌΡ-гликозида, СМР-гликозида или ΘΌΡ-гликозида. Еще более предпочтительно нуклеотидную часть модифицированного нуклеотидного сахара выбирают из υΌΡ-галактозы, υΌΡ-галактозамина, υΌΡ-глюкозы, υΌΡ-глюкозамина, ΘΌΡ-маннозы, ΘΌΡ-фукозы, СМР-сиаловой кислоты или СΜΡ-NеиАс. В примерном воплощении нуклеотидфосфат связан с С-1.
Таким образом, в примерном воплощении, в котором гликозильная группа представляет собой сиаловую кислоту, в настоящем изобретении представлены пептидные конъюгаты, образованные соединениями, имеющими формулы:
где Ь-К1 соответствует обсужденному выше;
Ь1-К1 означает линкер, связанный с модифицирующей группой.
Как и Ь, примерные линкеры согласно Ь1 включают связь, алкильные и гетероалкильные группы.
В другом примерном воплощении в настоящем изобретении представлен конъюгат, образованный модифицированным сахаром согласно изобретению и субстратом, например пептидом, липидом, агликоном и т.д., в частности модифицированным сахаром и гликозильным остатком гликопептида или гликолипида. В этом воплощении сахарная группа модифицированного сахара превращается в гликозильную связывающую группу, расположенную между субстратом и модифицирующей группой. Примерная гликозильная связывающая группа представляет собой интактную гликозильную связывающую группу, в которой гликозильная группа или группы не разрушаются в результате химических (например, воздействие метаперйодата натрия) или ферментативных процессов (например, воздействие оксидазы). Выбранные конъюгаты согласно изобретению включают модифицирующую группу, присоединенную к аминогруппе аминосахарида, например маннозамина, глюкозамина, галактозамина, сиаловой кислоты и т.д. Примерная кассета модифицирующая группа-гликозильная связывающая группа согласно этому мотиву основана на структуре сиаловой кислоты, такой как приведенной в формулах:
где К1, Ь1 и Ь2 аналогичны описанным выше.
- 22 017770
Еще в одном примерном изобретении конъюгат образован субстратом и 1-м положением сахарильной группы, в котором модифицирующая группа присоединяется посредством линкера к 6-му атому углерода сахарильной группы. Таким образом, примерные конъюгаты согласно этому воплощению имеют формулы:
где радикалы аналогичны описанным выше.
Специалисту в области техники понятно, что модифицированные сахарильные группы, описанные выше, могут также быть конъюгированы с субстратом в положении 2, 3, 4 или 5 атома углерода.
Примерные соединения согласно этому воплощению включают соединения, имеющие формулы:
где Я-группы и индексы аналогичны описанным выше.
В настоящем изобретении также представлены нуклеотидны сахара, модифицированные Ь-Я1 по углероду в положении 6. Примерные молекулы согласно этому воплощению включают:
где Я-группы и Ь представляют собой группы, обсуждаемые выше; индех у равен 0, 1 или 2.
- 23 017770
Еще один примерный нуклеотид сахара согласно изобретению основан на молекулах, имеющих стереохимию ΟΌΡ-маннозы. Примерная молекула согласно этому воплощению имеет структуру
Еще в одном примерном воплощении в настоящем изобретении представлен конъюгат, основанный на стереохимии υΌΡ-галактозы. Примерное соединение согласно этому воплощению имеет структуру
Еще в одном примерном воплощении нуклеотидный сахар основан на стереохимии глюкозы. Примерная молекула согласно этому воплощению имеет формулу
Модифицирующая группа Я1 представляет собой любое соединение, выбранное из, включая, но не ограничиваясь, водорастворимых полимеров, водонерастворимых полимеров, лекарственных веществ, диагностических веществ и др. Природа примерных модифицирующих групп ниже обсуждается более подробно.
Водорастворимые полимеры.
В некоторых воплощениях полимерные модифицирующие группы конъюгатов С-С8Р согласно изобретению представляют собой водорастворимые полимеры. Эти водорастворимые полимеры могут быть линейными или разветвленными. В одном воплощении это водорастворимый полимер с практически гомодисперсным распределением молекулярных масс.
В некоторых воплощениях конъюгаты согласно изобретению содержат водорастворимые полимеры, представляющие собой полиэтиленгликоль, например метоксиполиэтиленгликоль. Полиэтиленгликоль, используемый в настоящем изобретении, не ограничен определенной формой или определенным
- 24 017770 интервалом молекулярной массы. Для неразветвленных молекул полиэтиленгликоля молекулярная масса предпочтительно находится в интервале от 500 до 100000. Предпочтительно использовать молекулярную массу в интервале от 2000 до 60000 и более предпочтительно в интервале от приблизительно 5000 до приблизительно 30000.
В другом воплощении полиэтиленгликоль представляет собой разветвленный РЕС с более одной прикрепленной РЕС-группой. Примеры разветвленных РЕС описаны в патентах США № 5932462; 5342940; 5643575; 5919455; 6113906; 5183660; в АО 02/09766 и в работах ΚοιΕπι Υ., Вюссчидай Сйет18Тгу 5:283-288 (1994) и Υ;·ιιη;·ΐ5;·ι1<ί е! а1., Адпс. ΒίοΙ. СНет., 52:2125-2127, 1998. В настоящем изобретении также раскрываются другие применимые разветвленные структуры РЕС.
В примерном воплощении молекулярная масса каждого полиэтиленгликоля разветвленного РЕС равна или превышает 2000, 5000, 10000, 15000, 20000, 40000 или 60000 Да.
Специалистам в области техники известны многие водорастворимые полимеры, применимые в настоящем изобретении. Термин водорастворимый полимер распространяется на молекулы, такие как сахариды (например, декстран, амилоза, гиалуроновая кислота, полисиаловая кислота, гепараны, гепарины и т.д.), полиаминокислоты, например полиаспартат и полиглутамат, нуклеиновые кислоты, синтетические полимеры (например, полиакриловая кислота, полиэфиры, например полиэтиленгликоль); пептиды, белки и т.д. Настоящее изобретение может осуществляться с участием любого водорастворимого полимера с единственным ограничением, заключающимся в том, что полимер должен содержать сайт для прикрепления остальной части конъюгата.
Способы активации полимеров также можно найти в АО 94/17039, патенте США № 5324844, АО 94/18247, АО 94/04193, патентах США № 5219564, 5122614, АО 90/13540, патенте США № 5281698 и далее в АО 93/15189, а также в работах, где рассматривается конъюгирование активированных полимеров с пептидами, например, фактором свертывания крови VIII (АО 94/15625), гемоглобином (АО 94/09027), молекулой-переносчиком кислорода (патент США № 4412989), рибонуклеазой и супероксиддисмутазой ^егогеБе е! а1., Арр. Вюсйет. Вю!есй. 11:141-45 (1985)).
В одном воплощении настоящего изобретения используются водорастворимые полимеры, в которых значительная часть полимерных молекул в образце полимера имеют приблизительно одинаковую молекулярную массу; такие полимеры называются гомодисперсными.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется ссылкой на конъюгат полиэтиленгликоля. Существует несколько обзоров и монографий на тему функционализации и конъюгирования РЕС. См., например, НаггЕ, Μαοτοηοΐ, СНет. Рйу§. С25:325-373 (1985); δсοи!еη, Μе!йοά8 ίη Еηζутο1οду. 135:30-65 (1987); Аοηд е! а1., Еηζуте МюгоЬ. Тес111ю1. 14:866-874 (1992); Ие^а^ е! а1., СпНса1 Веу1е\\'5 в Тйегареийс Эгид Саглег δу8ΐет8. 9:249-304 (1992); 2аНр§ку, Β^οсοη^ида!е СНет. 6:150-165 (1995) и Вйабга, е! а1., Р11агт;Ше. 57:5-29 (2002). Способы получения реактивных молекул РЕС и образования конъюгатов с использованием реактивных молекул известны из уровня техники. Например, в патенте США № 5672662 раскрывается водорастворимый и выделяемый конъюгат активного сложного эфира полимерной кислоты, выбранной из линейных или разветвленных полиалкиленоксидов, полиоксиэтилированных полиолов, полиолефиновых спиртов и полиакрилморфолина.
В патенте США № 6376604 описывается способ приготовления водорастворимого сложного эфира 1-бензотриазолилкарбоната и водорастворимого непептидного полимера путем реакции конечной гидроксильной группы полимера с ди-1-бензотриазолилкарбонатом в органическом растворителе. Активный сложный эфир используется для образования конъюгатов с биологически активным агентом, таким как белок или пептид.
В АО 99/45964 описывается конъюгат, состоящий из биологически активного вещества и активированного водорастворимого полимера, содержащего полимерную цепь, в которой по меньшей мере один конец связан с полимерной цепью стабильной связью, где по меньшей мере один конец содержит разветвленную молекулу, проксимальные реактивные группы которой связаны с разветвленной молекулой, в которой биологически активное вещество связано по меньшей мере с одной проксимальной реактивной группой. Другие разветвленные полиэтиленгликоли описаны в АО 96/21469, в патенте США № 5932462 описывается конъюгат, образованный разветвленной молекулой РЕС, включающей разветвленный конец, включающий реактивные функциональные группы. Свободные реактивные группы могут реагировать с биологически активными молекулами, такими как белок или пептид, образуя конъюгаты между полиэтиленгликолем и биологически активной молекулой. В патенте США № 5446090 описывается бифункциональный РЕС-линкер и его использование в образовании конъюгатов, включающих пептиды на обоих концах РЕС-линкера.
Конъюгаты, содержащие деградируемые РЕС-связи, описаны в АО 99/34833 и АО 99/14259, а также в патенте США № 6348558. Такие деградируемые связи применимы в настоящем изобретении.
Вышеописанные способы активации полимера, известные из уровня техники, применимы в контексте настоящего изобретения при образовании разветвленных полимеров, описанных в настоящем изобретении, а также для конъюгирования этих разветвленных полимеров с другими молекулами, такими как сахара, нуклеотидные сахара и т.д.
- 25 017770
Примерные молекулы полиэтиленгликоля, применимые в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, молекулы, имеющие формулу
Υ
Ζ ЛСН2)ь—Х(СН2СН2О)е(СН2)0— А1— к8 где Я8 означает Н, ОН, ΝΗ2, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, например ацетал, ОНС-, Н2Л-(СН2)Ч-, Н8-(СН2)Ч или -(СН2)чС(¥)2!;
индекс е означает целое число от 1 до 2500;
индексы Ь, ά и с.| независимо означают целые числа от 0 до 20;
Ζ и Ζ1 независимо означают ОН, ЛН2, уходящие группы, такие как имидазол, п-нитрофенил, НОВТ, тетразол, галид, 8-Я9, спиртовая часть активированных сложных эфиров; -(СН2)рС(У!)У или -(СН2)рИ(СН2)8С(¥1)у;
Υ означает Н(2), =О, =8, =Л-Я10;
X, Υ, Υ1, А1 и и независимо означают группы О, 8, Ν-Я11;
V означает ОН, ЛН2, галоген, 8-Я12, спиртовую часть активированных сложных эфиров, аминную часть активированных амидов, нуклеотидные сахара и белки;
индексы р, с.|. 5 и ν независимо выбираются из целых чисел от 0 до 20;
Я9, Я10, Я11 и Я12 независимо означают Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил и замещенный или незамещенный гетероарил.
В других примерных воплощениях молекула полиэтиленгликоля выбирается из следующих вариан тов:
н
Ме-(ОСН2СН2)е—Ν-Ζ
Ί1 о
Полиэтиленгликоль, применимый для образования конъюгата согласно изобретению, может быть линейным или разветвленным. Разветвленные молекулы полиэтиленгликоля, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, молекулы, описываемые следующей формулой:
где Я8 и Я8 выбираются независимо из групп, обозначаемых выше как Я8;
А1 и А2 независимо выбираются из групп, обозначаемых выше как А1; индексы е, £, о и с.| соответствуют описанным выше;
Ζ и Υ соответствуют описанным выше;
X1 и X1' независимо выбираются из 8, 8С(О)ЛН, НЛС(О)8, 8С(О)О, О, ΝΉ, ЛНС(О), (О)СЛН и
ЛНС(О)О, ОС(О)ЛН.
- 26 017770
В других примерных изобретениях разветвленный РЕС базируется на цистеиновой, сериновой или дилизиновой основе. Таким образом, дальнейшие примерные молекулы РЕС включают
Еще в одном воплощении разветвленная молекула РЕС основывается на трилизиновом пептиде. Трилизин может быть моно-, ди-, три- или тетрапэгилирован. Примерные молекулы согласно этому воплощению имеют формулы:
где е, £ и Г независимо выбираются из целых чисел от 1 до 2500;
с.|, д' и с.| представляют собой независимо выбранные целые числа от 1 до 20.
В примерных воплощениях настоящего изобретения РЕС представляет собой т-РЕС (5, 10 или 20 кДа). Примерная молекула разветвленного РЕС представляет собой серин- или цистеин-(т-РЕС)2, где т-РЕС представляет собой т-РЕС массой 20 кДа.
- 27 017770
Специалисту в области техники очевидно, что разветвленные полимеры, применимые в настоящем изобретении, включают вариации на вышеописанные темы. Например, конъюгат дилизина и РЕС, приведенный выше, может включать три полимерные субъединицы, где третья субъединица прикрепляется к α-амину, показанному на вышеприведенной структуре в неизмененном виде. Сходным образом, настоящее изобретение распространяется на использование трилизина, функционализированного тремя или четырьмя полимерными субъединицами.
Конкретные воплощения согласно настоящему изобретению включают
Ме'
О и
а также карбонаты и активные сложные эфиры этих молекул, такие как
Ме.
Другие активирующие или уходящие группы, применимые для активации линейного РЕС для использования для получения соединений, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются, молекулы:
о
Молекулы РЕС, активированные этими и другими молекулами, и способы получения активированного РЕС описаны в \УО 04/083259.
Специалисту в области техники понятно, что одно или более плечей разветвленного полимера, образуемых т-РЕС, может заменяться молекулой РЕС с отличной концевой группой, например ОН, СООН, ΝΉ2, С2-С10-алкил и т.д. Далее, структуры, приведенные выше, легко модифицируются путем вставки алкильных линкеров (или удаления атомов углерода) между α-атомом углерода и функциональной группой боковой цепи. Таким образом, в качестве основы для разветвленных молекул РЕС для использования в настоящем изобретении рассматриваются гомо-производные, а также высшие и низшие
- 28 017770 гомологи.
Разветвленные молекулы РЕС, описанные в настоящем изобретении, легко получить с помощью способов, таких как приведенные на схеме ниже:
КОН, МеОН
/7 .,=
СН2СуТЕА °
где Ха означает О или 8;
г означает целое число от 1 до 5;
индексы е и ί независимо означают целые числа от 1 до 2500.
Таким образом, согласно этой схеме природная или неприродная аминокислота приводится в контакт с активированным производным т-РЕС, в данном случае тозилатом, образуя соединение 1 путем алкилирования гетероатома Х3 боковой цепи. Монофункционалированная т-РЕС аминокислота ацилируется по Ν-концу реактивным производным т-РЕС в соответствующих условиях, что приводит к сборке разветвленного т-РЕС 2. Для специалиста в области техники очевидно, что тозилатная уходящая группа может быть заменена любой применимой уходящей группой, например галогеном, мезилатом, трифлатом и т.д. Сходным образом, реактивный карбонат, используемый для ацилирования амина, может заменяться активным сложным эфиром, например Ν-гидроксисукцинимидом и т.д., или кислота может активироваться ίη κίΐπ с использованием дегидратирующего агента, такого как дициклогексилкарбодиимид, карбонилдиимидазол и т.д.
В примерном воплощении модифицирующая группа представляет собой РЕС-группу, однако любая модифицирующая группа, например водорастворимый полимер, водонерастворимый полимер, лекарственное вещество и др. могут включаться в гликозидную группу через подходящую связь. Модифицированный сахар образуется ферментативным путем, химическим путем или путем их комбинации, которые приводят к получению модифицированного сахара. В примерном воплощении сахара заменяются активным амином в любом положении, к которому затем может присоединиться модифицирующая молекула, однако сахар должен оставаться субстратом фермента, присоединяющего модифицированный сахар к пептиду С-С8Е. В примерном воплощении, где модифицированным сахаром является галактозамин, аминогруппа присоединяется к атому углерода в положении 6.
Также с помощью молекул РЕС, таких как полиэтиленгликоль (РЕС), можно увеличить время полужизни ίη νίνο лекарственных гликопептидов. Например, химическая модификация белков молекулой РЕС (пэгилирование) увеличивает размер их молекул и понижает доступность поверхностных и функциональных групп, зависящую от размера молекулы РЕС, связанной с белком. Это приводит к увеличению времени полужизни в плазме крови и протеолитической стабильности, а также уменьшает иммуногенность вещества и скорость его усвоения печенью (СНаГГее с1 а1. 1. С1т. Ιηνβδΐ. 89:1643-1651 (1992); Руа1ак с1 а1. Век. Соттип. СНет. Ра11ю1. РНагтасо1. 29:113-127 (1980)). Было показано, что пэгилирование интерлейкина-2 усиливает его противоопухолевое действие ίη νί\Ό (Ка!те е1 а1. Ргос. №111. Асай. 8сЕ И8Л. 84:1487-1491 (1987)) и что пэгилирование фрагмента Е(аЬ')2, полученного из моноклонального антитела А7 повышает его локализацию в опухоли (Кйатцта е1 а1. Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотпит. 28:1387-1394 (1990)). Таким образом, в другом воплощении время полужизни ίη νί\Ό пептида, дериватизованного молекулой РЕС по способу согласно изобретению, повышается по сравнению со временем жизни ίη νί\Ό не дериватизованного пептида.
Увеличение времени полужизни пептида ίη νί\Ό лучше всего выражается с помощью процентного интервала увеличения этого показателя. Нижняя граница процентного интервала увеличения равняется приблизительно 40%, приблизительно 60%, приблизительно 80%, приблизительно 100%, приблизительно 150% или более чем приблизительно 200%. Верхняя граница интервала равняется приблизительно 60%, приблизительно 80%, приблизительно 100%, приблизительно 150% или более чем приблизительно 250%.
- 29 017770
Пептид 6-С8Р.
Практически любой пептид или вещество, являющееся гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, имеющее любую последовательность, может быть использовано в качестве пептидного компонента конъюгатов согласно настоящему изобретению. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор клонирован и секвенирован. В примерном воплощении пептид С-С8Р имеет последовательность, приведенную в 8Е9 Ш N0:1:
ΜΤΡ^6ΡΑ88^Ρ^8Ρ^^ΚС^Ε^VΚΚ^^^^6ΑΑ^^ΕΚ^СΑΤΥΚ ЕСНРЕЕЕУЕЕСН8ЕО1РА¥АРЬ38СР8<ЗАЬ<ЗЕА<-гСЕ8(2ЕН8<лЕ Ρ^Υ^^^^^Α^Ε0I8ΡΕ^^ΡΤ^^Τ^^^^VΑ^ΡΑΤΤΊλV^^ΜΕΕ ЕСМАРАЕрРТрСАМРАРА8АРрККАС6УЕУАЗНЕ98РЕЕУ ЗУВЛТЕШЬАрР (8Е<Э 10 N0: 1).
В другом примерном воплощении пептид С-С8Р имеет последовательность, приведенную в 8Ер ГО N0:2:
ТРЬСРА85ЕР08РЬЕКСЕЕ0УК^СО6ААЕрЕКЕСАТ¥КЕ
СНРЕЕЕУЕЕОНЗЬО1Р\¥АРЕЗЗСРЗрАЬ0ЕАССЕ8рЕНЗОЕЕ ΕΥ96ΕΕ9ΑΕΕΟΙ8ΡΕΕϋΡΤΕΟΤΕ9ΕθνΑΌΡΑΤΤΙ^9ΜΕΕΕ СМАРАЕ9РТрСАМРАРА8АЕ(}ККАССУЕУА8НЕр8РЕЕУ8 УКУЬКНЪАСЗР (8Е0 Ш N0: 2).
В других примерных воплощениях пептид С-С8Р имеет последовательность, приведенную в 8Ер ГО N0:3-11:
МТРЕС₽А88ЬР98РЬЬКСЬЕрУКК1рСОСААЬ(2ЕКЬУ8ЕСА
ТУКЕСНРЕЕЬУЕЕ6Н8Е61Р\¥АРЕ88СР89АЕ0ЕАССЕ80Е
Н8СЕРЕ¥^СЕЕфАЕЕ618РЕЕСРТЕОТЕ()ЕОУАОРАТТ1У/() ς»ΜΕΕΙΌΜΑΡΑΙ.ςΡΤς)σΑΜ₽ΑΓΆ8ΑΡ0ΚΙ<Α6θνΕνΑ8ΗΕΡ 8ГЬЕУ8УКУЫШЬА2Р (8Е<> ГО N0:3)
МА(дРАТ98РМКЕМАЕ9ЕЕЕ\УН8АЬ\УГУ9ЕАТРЕ(ЗРА88Е
РрЗРЕБКСЬЕрУЖрСОСААЕСЗЕКЕСАТУКЕСНРЕЕЕУЕЕ
6Н8ЕС1Р\¥АРЕ88СР89АЕ9ЬА6СЕ89ЬН86ЬЕЕУ(26ЕЕ(2А
ΕΕΟΙ8ΡΕΕΟΡΤΕΟΤΕ9ΕϋνΑΟΓΑΓΠ\ν9ς)ΜΕΕΕΟΜΑΡΑΕς)Ρ
Т0САМРАРА8АЕ0ККАООУЕУА8НЬ08РЬЕУ8УКУЕкНЕА рР (8Ε<}ΙΟΝΟ:4)
МАСРАТфЗРМКЬМАЕрЕЬЕ^УНЗАЬ^УТУфЕАТРЕСРАЗЗЬ
РрБРЕЕКСЕЕОУЕЮрСОСААЕОЕКЕУЗЕСАТУКЬСНРЕЕЕ
УЕЕСН8ЕСПАУАРЕ88СР89АЕ(?ЕАССЕ89ЕН8СЕЕЕУ96Е
ΕρΑΕΕΟΙδΡΕΕΟΡΤΕϋΤΕρΕϋνΑΕϊΓΑΤΤΙψί^ΜΕΕΕΟΜΑΡΑ
ЕСЗРТрСАМРАРАЗАРрКЛАСбУЕУАБНИ^ГЕЕУЗУКУЕК
НЬАрР (8Е0 ΙΟ N0:5)
МУТРЕ6РА88ЕР98ГЕЕКСЕЕ<2УКК19ОО6ААЕ(2ЕКЕСАТУ
КЬСНРЕЕЕУЕЕОНТЕО1Р\¥АРЬ88СР80АЕ9ЕАССЕ39ЕН8
СЬРЕУ()СЕЕ()АЕЕС18РЕЕСРТЕОТЕ0ЕОУАОЕАТТ1УадМ
ЕЕЕОМАРАЕОРТОСАМРАРАЗАРОККАССУЕУАЗНБОЗРЕ
ЕУЗУКУЕЯНЕАОР(8ЕО ГО N0:6);
МТРЕСРАЗЙЕРрЗЕЕЕКСЕЕУУККДрОРСААЕрЕКЕСАТУЬС
ЕСНРЕЕЕУЕЕСНТЪСЛРУ/АРЕЗЗСРЗОАЕОЕАОСЕЗОЕНЗСЕ
ΡΕΥΟΟΕΕΟΑΕΕΟΙΒΡΕΕΟΡΤΕΟΤΕΟΕΟνΑΟΡΑΤΤΙΨΟΟΜΕΕ
ЕСМАРАЕ9РТ06АМРАГА8АГ9ККА6СУЕУА8НЕ(28ЕЕЕУ
8ΥΕνΕΕΗΕΑΟΡ(8ΕΟ ГО N0:7);
ΜνΤΡΕΟΡΑ88ΕΡς>8ΕΕΕΚΕΕΕς>νΐΙΚΐς)0Ο6ΑΑΕ(2ΕΚΕαΑΤΥ
КЕСНРЕЕЕУЕЕС88ЕС1РА¥АРЕ88СР89АЕ0ЕАССЕ8ОЕН86
ΕΓΕΥΟαΕΕΟΑΕΕΰΙδΡΕΕαΡΤΕΠΤΕΟΕΟνΑΟΓΑΤΤΙΧνΟφΜΕ
ЕЕОМАРАБС}РТ96АМРАЕА8АГ(2ВКА6СУЕУА8НЕР8РЕЕ νδΥΚ.νΕΚΗΕΑ(2Ρ(8Ε(2 ΙΒ N0:8);
МрТРЕбРАЗЗЕРОЗЕЕЬКСЬЕСМШОбРбААЕОЕКЕСАТУ
КЕСНРЕЕЕУЕЕаН8Е61Р\УАРЕ88СР59АЕ0ЕА<ЗСЕЗ()ЕН8 <3ΕΡΕΥ()ΟΕΕρΑΕΕ(3Ι8ΡΕΕ<3ΡΤΕΟΤΕζ>ΕθνΑΟΕΑΤΠ\νζ>0Μ ЕЕЕСМАРАЕрРТОСАМРАРАЗАЕОКЯАСбУЕУАЗНЕОЗРЬ
ЕУ8УКУЬКНЕА9Р(8Е9 ГО N0:9);
МТРЬОРАЗЗЕРОЗРЬЕКСЕЕрУЕККЗООбААЕОЕКЕСАТУК:
ЕСНРЕЕЕУЬЕОНЗЕСШАУАРЕЗЗСРЗрАЕрЬАССЬЗрЕНКСЕ
ГЕУОС!ЕЕРАЕЕС18РЕЕ6РТЕОТЕОЕОУАОРАТТ1\УОС)МЕЕ
БОМАР АЕрРТ(}(ЗАМРАРА8АЕрШ<АССУЕУА8НЕЕ)8РЕЕУ
8УКУЬКНЬАОРТрОАМР(8ЕО ГО N0:10) и
МТРБОРА88ЕР08РЕЕКСЕЕрУЕК1рОО6ААБ0ЕКЕСА1УК
ЕСНРЕЕБУЕЕО88Е61Р\УАРЕ88СР89АЕ0ЕАССЕ80ЕН8СЕ
РЕ¥0СЕБрАЕЕС18РЕЕСРТЕОТБрЕОУАОРАТТ1АУ00МЕЕ ^СΜΑΡΤΤΤΡΤ^ΤΑΜΡΑΡΑ8ΑΡ^ΚΚΑССV^VΑ8Η^^8Ρ^ΕV
8УКУЬКНЬА9Р(8ЕО ГО N0:11)
- 30 017770
Настоящее изобретение ни в коей мере не ограничено вышеприведенными последовательностями.
В примерном воплощении пептиды С-С8Е согласно изобретению содержат по меньшей мере один сайт О-связанного гликозилирования, который гликозилируется гликозильным остатком, включающим РЕС-группу. РЕС ковалентно присоединяется к пептиду С-С8Е посредством интактной гликозильной связывающей группы. Гликозильная связывающая группа ковалентно связывается с аминокислотным или гликозильным остатком в составе пептида С-С8Е. В качестве альтернативы гликозильная связывающая группа присоединяется к одной или более гликозильных единиц в составе гликопептида. В настоящем изобретении также представлены конъюгаты, в составе которых гликозильная связывающая группа присоединяется как к аминокислотному, так и к гликозильному остаткам.
Молекула РЕС присоединяется к интактному гликозильному линкеру напрямую или через негликозильный линкер, например замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гете роалкил.
В примерном воплощении пептид С-С8Е содержит группу, имеющую формулу (I)
где Ό выбирается из -ОН и В1-Ь-ХН;
С выбирается из В’-Ь- и -С(О)(С1-С6)алкила;
В1 означает группу, содержащую остаток линейного или разветвленного полиэтиленгликоля; и
Ь означает линкер, представляющий собой связь, замещенный или незамещенный алкил или замещенный или незамещенный гетероалкил, так, если Ό означает ОН, С означает В’-Ь-, и если С означает -С(О)(С1-С6)алкил, Ό означает В^Ь-ХН-.
В структурах из модифицированной сиаловой кислоты, описанных в настоящем описании, СООН также обозначает СОО- и/или ее соль.
В одном воплощении В’-Ь имеет формулу
где а означает целое число от 0 до 20.
В примерном воплощении В1 имеет структуру, выбираемую из
где е и £ означают независимые целые числа от 1 до 2500;
с.| означает целое число от 1 до 20.
В других воплощениях В1 имеет структуру, выбираемую из
где е и £ означают независимые целые числа от 1 до 2500; с.| означает целое число от 1 до 20.
- 31 017770
В других воплощениях К1 имеет структуру, выбираемую из
где е и £ означают независимые целые числа от 1 до 2500;
с.| и д' означают независимые целые числа от 1 до 20.
Еще в одном воплощении в настоящем изобретении представлен конъюгат пептида С-С8Е, где К1 имеет структуру, выбираемую из
где е, £ и ί1 означают независимые целые числа от 1 до 2500; д, д' и д означают независимые целые числа от 1 до 20.
В других воплощениях К1 имеет структуру, выбираемую из с(о)сн2снуосн2сн2)восн3 ’ и
С(О)ОСН2СН2(ОСН2СН2)гОСНз где е и £ означают независимые целые числа от 1 до 2500.
- 32 017770
В другом примерном воплощении в настоящем изобретении представлен пептид, содержащий группу, имеющую формулу
Са1 может присоединяться к аминокислоте или гликозильному остатку, который присоединен напрямую или не напрямую (например, через гликозильный остаток) к аминокислоте.
В других воплощениях группа имеет формулу
СаШАс может присоединяться к аминокислоте или гликозильному остатку, который присоединен напрямую или не напрямую (например, через гликозильный остаток) к аминокислоте.
Еще в одном примерном воплощении пептид содержит группу, имеющую формулу
где АА означает аминокислотный остаток указанного пептида и в обеих вышеприведенных структурах Ό и С аналогичны приведенным выше.
Примерный аминокислотный остаток пептида С-С8Р, посредством которого одна или более вышеприведенных молекул может образовывать конъюгат, включает серин и треонин, например треонин в положении 133 8Еф ΙΌ NО:1.
В другом примерном воплощении в настоящем изобретении представлен конъюгат С-С8Р, включающий гликозильный остаток, приведенный в формуле
где а, Ь, с, б, ί, г, з, !, и означают независимые целые числа, выбираемые из 0 и 1; индекс с.| означает 1;
индексы е, £, д и 1 независимо выбираются из целых чисел от 0 до 6; индексы _), к, 1 и т независимо выбираются из целых чисел от 0 до 100;
индексы ν, те, х и у независимо выбираются из 0 и 1 и по меньшей мере один из индексов ν, те, х и у означает 1.
Символ АА означает аминокислотный остаток пептида С-С8Р.
Символ 81а-(К) означает группу, имеющую формулу
он где Ό выбирается из -ОН и Β'-Ε-ΝΜ-; символ С означает К1-Ь-или -С(О)(С1-С6)алкил;
К1 означает группу, содержащую остаток линейного или разветвленного полиэтиленгликоля;
Ь означает линкер, представляющий собой связь, замещенный или незамещенный алкил или замещенный или незамещенный гетероалкил.
- 33 017770
Обычно, если Ό означает ОН, С означает КЗ-Ь-, и если С означает -С(О)(С1-С6) алкил, Ό означает К’-Ь-ЫН-.
В другом примерном воплощении модифицированная РЕС группа сиаловой кислоты в составе конъюгата согласно изобретению имеет формулу
где индекс 8 означает целое число от 0 до 20;
η означает целое число от 1 до 2500.
В одном воплощении 8 равняется 1 и группа т-РЕС имеет молекулярную массу приблизительно 20 кДа.
Еще в одном примерном воплощении сиаловая кислота, модифицированная РЕС, имеет формулу
где Ь означает замещенную или незамещенную алкильную или замещенную или незамещенную гетероалкильную связывающую группу, соединяющую молекулу сиаловой кислоты и молекулу РЕС.
В одном воплощении по меньшей мере два, более предпочтительно три, более предпочтительно четыре вышеупомянутых аспарагиновых остатка функционализируются Ν-связанной гликановой цепью, приведенной выше.
Конъюгаты согласно изобретению включают интактные гликозильные связывающие группы, которые могут быть моно- или мультивалентными (например, антеннальные структуры). Таким образом, конъюгаты согласно изобретению включают молекулы, в которых выбранная группа присоединяется к пептиду посредством как моновалентной гликозильной связывающей группы, так и мультивалентной связывающей группы. Настоящее изобретение также распространяется на конъюгаты, в которых более одной выбранной группы присоединяется к пептиду посредством мультивалентной связывающей группы.
Водонерастворимые полимеры.
В другом воплощении, аналогичном описанным выше, модифицированные сахара включают водонерастворимый полимер, в отличие от водорастворимого полимера. Конъюгаты согласно изобретению могут также включать один или более водонерастворимых полимеров. Данное воплощение настоящего изобретения иллюстрируется с помощью использования конъюгата в качестве переносчика, обеспечивающего контролируемую доставку лекарственного пептида. Полимерные системы доставки лекарств известны из уровня техники. См. например, Οιιηη с1 а1., ред. РОЬУМЕШС ОКИСЗ ΑΝΏ ОКИС ОЕЫУЕКУ 8У8ТЕМ8, АС8 8утро8шт 8спс8, т. 469, Атепсап СНет1са1 8ос1с1у, ХУгЩапЩоп, Э.С. 1991. Специалисту в области техники ясно, что практически любая известная система доставки лекарств применима к конъюгатам согласно настоящему изобретению.
Вышеприведенные варианты К1, Ь-К1, К15, К15 и других радикалов в равной степени применимы в отношении водонерастворимых полимеров, которые могут быть встроены без ограничений в линейные и разветвленные структуры с использованием химических методов, доступных для специалистов в области техники.
Типичные водонерастворимые полимеры включают, но не ограничиваются, полифосфазины, поливиниловые спирты, полиамиды, поликарбонаты, полиалкилены, полиакриламиды, полиалкиленгликоли, полиалкиленоксиды, полиалкилентерефталаты, поливиниловые эфиры, поливиниловые сложные эфиры, поливинилгалиды, поливинилпирролидоны, полигликолиды, полисилоксаны, полиуретаны, полиметилметакрилаты, полиэтилметакрилаты, полибутилметакрилаты, полиизобутилметакрилаты, полигексэтилметакрилаты, полиизодецилметакрилаты, полилаурилметакрилаты, полифенилметакрилаты, полиметилакрилаты, полиизопропилакрилаты, полиизобутилакрилаты, полиоктадецилакрилаты, полиэтилены, полипропилены, полиэтиленгликоли, полиэтиленоксиды, полиэтилентерефталаты, поливинил
- 34 017770 ацетаты, поливинилхлориды, полистирены, поливинилпирролидоны, плюроники и поливинилфенолы и их сополимеры.
Синтетически модифицированные природные полимеры, применимые для использования в конъюгатах согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются, алкилцеллюлозы, гидроксиалкилцеллюлозы, эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы и нитроцеллюлозы. Особенно предпочтительные представители больших классов синтетически модифицированных природных полимеров включают, но не ограничиваются, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидрокиспропилметилцеллюлозу, гидроксибутилметилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, пропионат целлюлозы, ацетат бутират целлюлозы, ацетат фталат целлюлозы, карбоксиметилцеллюлозу, триацетат целлюлозы, натриевую соль сульфата целлюлозы и полимеры акриловых и метакриловых эфиров альгиновой кислоты.
Эти и другие полимеры, обсуждаемые в настоящем описании, могут быть легко получены из коммерческих источников, таких как 81дша СНеш1са1 Οο. (8!. Ροιιίκ, МО.), ΡοΚκ^ι^κ (ЛУаггепЮп, РА.), А1йпс11 (МПтаикее, ^Ь), Р1ика (Кοηкοηкοта, ΝΥ) и ΒίοΡηά (ШсНп-топТ СА), или синтезированы из мономеров, приобретенных у этих поставщиков с использованием общепринятых техник.
Типичные биоразрушаемые полимеры для использования в конъюгатах согласно изобретению включают, но не ограничиваются, полилактиды, полигликолиды и их сополимеры, полиэтилентерефталат, полибутират, поливалерианат, поли(лактид-ко-капролактон), поли(лактид-ко-гликолид), полиангидриды, полиортоэфиры, а также их смеси и сополимеры. Композиции, образующие гели, такие как включающие коллаген, плюроники и т.д., являются особенно применимыми.
Полимеры, применимые в настоящем изобретении, включают гибридные полимеры, включающие водонерастворимые материалы, содержащие по меньшей мере в части своей структуры биорассасываемую молекулу. Примером такого полимера может служить полимер, включающий водонерастворимый сополимер, содержащий биорассасываемую область, гидрофильную область и множество функциональных групп, образующих поперечные связи, в составе полимерной цепи.
Для целей настоящего изобретения термин водонерастворимые материалы включает материалы, достаточно нерастворимые в воде или в водосодержащих средах. Таким образом, несмотря на то что некоторые области или сегменты сополимера могут быть гидрофильными или даже водорастворимыми, полимерная молекула в целом не растворяется в воде в достаточной мере.
Для целей настоящего изобретения термин биорассасываемая молекула включает область, которая может метаболизироваться, подвергаться распаду, всасыванию и/или выведению через нормальные выводящие пути тела. Такие продукты метаболизма или распада также предпочтительно достаточно нетоксичны для тела.
Биорассасываемая область может быть гидрофобной или гидрофильной, если сополимерная композиция в целом не становится водорассасываемой. Таким образом, биорассасываемую область выбирают, основываясь на предпочтении того, чтобы полимер в целом оставался водонерастворимым. Соответственно, относительные свойства, т.е. содержание различных типов функциональных групп и относительные пропорции биорассасываемой области и гидрофобной области, выбираются таким образом, чтобы применимые биорассасываемые композиции оставались водонерастворимыми.
Типичные рассасываемые полимеры включают, например, синтетические рассываемые блоксополимеры поли-а-гидроксикарбоксокислоты/полиоксиалкилена (см. СоНи, е! а1., патент США № 4826945). Эти сополимеры не соединены поперечными связями и являются водорастворимыми, что позволяет телу выводить деградированные блок-сополимерные композиции. См. Υοιπκκ е! а1., I. Вюшей. Ма!ег. Кек. 21:1301-1316 (1987) и (οΐιιι е! а1., I. Вюшеб. Ма!ег. Кек. 22:993-1009 (1988).
Предпочитаемые в настоящее время биорассасываемые полимеры включают один или более компонентов, выбираемых из полиэфиров, полигидроксикислот, полилактонов, полиамидов, полиэфирамидов, полиаминокислот, полиангидридов, полиортоэфиров, поликарбонатов, полифосфазинов, полифосфоэфиров, политиоэфиров, полисахаридов и их смесей. Еще более предпочтительно биорассасываемый полимер включает полигидроксикислотный компонент. Из полигидроксикислот предпочтительны полилактат, полигликолят, поликапронат, полибутират, поливалерианат и их сополимеры и смеси.
В добавление к образующим фрагментам, абсорбируемым ш νίνο (биорассасываемым), предпочтительные полимерные покрытия для использования в способах согласно изобретению могут также образовывать выводимый и/или метаболизируемый фрагмент.
В настоящем изобретении также могут использоваться сополимеры высшего порядка. Например, в работе Сакеу е! а1., патент США № 4438253, выданном 20 марта 1984 г., раскрываются триблоксополимеры, получаемые в результате трансэтерификации полигликолевой кислоты и полиалкиленгликоля с гидроксильным концом. Такие композиции раскрываются в качестве рассасывающегося монофиламентного шовного материала. Г ибкость таких композиций регулируется путем включения ароматического ортокарбоната, такого как тетра-п-толил ортокарбонат, в структуру сополимера.
Также могут использоваться другие сополимеры, основывающиеся на молочной и/или гликолевой кислоте. Например, в работе 8рти е! а1., патент США № 5202413, выданный 13 апреля 1993 г., раскрываются биоразлагаемые мультиблок-сополимеры, содержащие последовательно блоки полилактида
- 35 017770 и/или полигликолида, полученные путем раскрывающей кольцо полимеризации лактида и/или гликолида на олигомерный диоловый или диаминный остаток, с последующим удлинением цепи с помощью бифункционального соединения, такого как диизоцианат, диацилхлорид или дихлоросилан.
Биорассасываемые области покрытий, применимые в настоящем изобретении, могут разрабатываться так, чтобы они могли расщепляться гидролитическим и/или ферментативным путем. Для целей настоящего изобретения расщепляемый гидролитическим путем означает подверженность сополимера, в особенности биорассасываемой области, гидролизу в воде или в водосодержащей среде. Сходным образом, при употреблении в настоящем описании расщепляемый ферментативным путем означает подверженность сополимера, в особенности биорассасываемой области, расщеплению эндогенными или экзогенными ферментами.
При помещении внутрь тела гидрофильная область может расщепляться на выводимые и/или метаболизируемые фрагменты. Таким образом, гидрофильная область может включать, например, полиэфиры, полиалкиленоксиды, полиолы, поливинилпирролидин, поливиниловый спирт, полиалкилоксазолины, полисахариды, углеводы, пептиды, белки и их сополимеры и смеси. Далее, гидрофильная область может также представлять собой, например, полиалкиленоксид. Такие полиалкиленоксиды могут включать, например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и их смеси и сополимеры.
Также в настоящем изобретении могут применяться полимеры, являющиеся компонентами гидрогелей. Гидрогели представляют собой полимерные материалы, способные поглощать относительно большие количества воды. Примеры веществ, образующих гидрогели, включают, но не ограничиваются, полиакриловые кислоты, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, поливиниловый спирт, поливинилпирролидин, желатин, карагенан и другие полисахариды, гидроксиэтиленметакриловую кислоту (НЕМА), а также их производные и т.д. Получаемые гидрогели могут быть стабильными, биоразрушаемыми и биорассасываемыми. Кроме того, гидрогелевые композиции могут включать субъединицы, обладающие одним или более из этих свойств.
Из уровня техники известны биосовместимые гидрогелевые композиции, чью целостность можно контролировать с помощью поперечных сшивок, которые в настоящее время предпочтительны для использования в способах согласно изобретению. Например, в работах НиЬЬе11 е! а1., патент США № 5410016, выданный 25 апреля 1995 г., и 5529914, выданный 25 июня 1996 г., раскрываются водорастворимые системы, представляющие собой поперечно сшитые блок-сополимеры, чей водорастворимый центральный сегмент блока помещается между двумя гидролитически лабильными периферическими сегментами. Концы таких сополимеров далее кэпированы фотополимеризуемыми акрилатными функциональными группами. После образования поперечных сшивок такие системы превращаются в гидрогели. Водорастворимый центральный блок таких сополимеров может содержать полиэтиленгликоль, тогда как гидролитически лабильные периферические сегменты могут представлять собой поли-αгидроксикислоту, такую как полигликолят или полилактат. См. 8а\\'11пеу е! а1., Масгото1еси1ез. 26:581587 (1993).
В другом предпочтительном воплощении гель представляет собой термореверсивный гель. В настоящее время предпочтительными являются термореверсивные гели, включающие компоненты, такие как плюроники, коллаген, желатин, гиалуроновая кислота, полисахариды, полиуретановый гидрогель, полиуретан-мочевинный гидрогель и их комбинации.
Еще в одном примерном воплощении конъюгат согласно изобретению включает липосомный компонент. Липосомы могут быть получены с помощью способов, известных специалисту в уровне техники, например, как описано в работе Еррз!ет е! а1., патент США № 4522811. Например, липосомные препараты можно получать путем растворения соответствующего липида (липидов) (таких как стеароил фосфатидилэтаноламин, стеароил фосфатидилхолин, арахадоил фосфатидилхолин и холестерин) в неорганическом растворителе, который затем выпаривают, получая тонкую пленку сухого липида на поверхности контейнера. Далее в контейнер вводят водный раствор активного вещества или его фармацевтически приемлемой соли. Затем контейнер крутят вручную, чтобы смыть липидный материал со стенок контейнера и разбить липидные агрегаты, что и приводит к получению суспензии липосом.
Описанные выше микрочастицы и способы получения микрочастиц приводятся в качестве примера и не охватывают весь спектр микрочастиц, применимых в настоящем изобретении. Специалисту в области техники понятно, что в настоящем изобретении применимы множество микрочастиц, получаемых различными способами.
Форматы структур, обсуждаемые выше в контексте водорастворимых полимеров, как линейных, так и разветвленных в общем применимы и в отношении водонерастворимых полимеров. Так, например, цистеиновые, сериновые, дилизиновые и трилизиновые разветвленные основы могут функционализироваться двумя водонерастворимыми полимерными группами. Способы получения таких веществ аналогичны способам получения водорастворимых полимеров.
- 36 017770
Способы получения конъюгатов С-С8Р.
Помимо конъюгатов, обсуждаемых выше, в настоящем изобретении представлены способы получения этих и других конъюгатов. Таким образом, в одном аспекте в настоящем изобретении представлен способ образования ковалентного конъюгата между выбранной группой и пептидом С-С8Р. Кроме того, в изобретении представлены способы нацеливания конъюгатов согласно изобретению в определенную ткань или отдел тела.
В примерных воплощениях конъюгат образуется между молекулой РЕС (или переносимой ферментативным путем гликозильной молекулы, содержащей молекулу РЕС) и гликозилированным или негликозилированным пептидом. РЕС конъюгируется с пептидом С-С8Р через интактную гликозильную связывающую группу, расположенную между и ковалентно связанную с пептидом С-С8Р и с молекулой РЕС, или с негликозильным линкерным конструктом РЕС (например, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил). Способ включает приведение пептида С-С8Р в контакт со смесью, содержащей модифицированный сахар и гликозилтранферазу, субстратом которой является модифицированный сахар. Реакцию проводят в условиях, подходящих для образования ковалентной связи между модифицированным сахаром и пептидом С-С8Р. Сахарная группа модифицированного сахара выбирается из нуклеотидных сахаров, активированных сахаров и сахаров, не являющихся нуклеотидными и не активированных.
Акцепторный пептид (гликозилированный или негликозилированный) обычно синтезируют бе ηονο или рекомбинантно экспрессируют в прокариотических клетках (например, бактериальных клетках, таких как Е.сой) или в эукариотических клетках, таких как клетки млекопитающих, дрожжей, насекомых, грибов или растений. Пептид С-С8Р может представлять собой как полноразмерный пептид, так и его фрагмент. Далее, пептид С-С8Р может быть дикого типа или мутантным. В примерном изобретении С-С8Р несет мутацию, добавляющую один или более сайтов Ν- или О-связанного гликозилирования в последовательность пептида.
В примерном воплощении фактор IX подвергается О-гликозилированию и функционализируется следующим образом. Получают пептид с открытым аминокислотным сайтом гликозилирования либо, если пептид гликозилирован, гликозильную группу удаляют, чтобы открыть аминокислоту. Например, серин или треонин подвергают α-1 Ν-ацетиламиногалактозилированию (СаШАс) и ХАс-галактозилированный пептид сиализируют кассетой сиаловая кислота-модифицирующая группа с использованием 8Т6СаШАсТ1. В качестве альтернативы ХАс-галактозилированный пептид галактозилируют с использованием Соге-1-Са1Т-1 и полученный продукт сиализируют кассетой, сиаловая кислота-модифицирующая группа с использованием 8Т3Са1Т1. Примерный конъюгат согласно этому способу содержит следующие связи: Тйг-а-1-СаШАс-в-1,3-СаТа2,3-81а*, где 81а* означает кассету сиаловая кислота-модифицирующая группа.
В способах согласно изобретению, сходных с вышеописанными, использующих множественные ферменты и сахарильные доноры, индивидуальные стадии гликозилирования могут проводиться по отдельности или соединены в так называемый 8тд1е ро1 реакции. Например, в реакции с тремя ферментами, приведенной выше, СаШАс-трансфераза, Са1Т и 81аТ и их доноры можно комбинировать в одном сосуде. В качестве альтернативы реакция с СаШАс может проводиться отдельно, а Са1Т и 81аТ и подходящие доноры сахарила могут добавляться в ходе одной стадии. Другой способ проведения реакций включает последовательное добавление каждого фермента и соответствующих доноров и проведение реакции способом мпДе ро1. Комбинации каждого из вышеприведенных способов применимы для получения соединений согласно изобретению.
В конъюгатах согласно изобретению, в особенности в гликопэгилированных Ν-связанных гликанах, кассета 81а-модифицирующая группа может связываться с Са1 α-2,6 или α-2,3 связью.
Способы согласно изобретению также предоставляют модификацию не полностью гликозилированных пептидов, полученных в рекомбинантной системе. При использовании в способе согласно изобретению модифицированного сахара пептид С-С8Р может быть одновременно гликозилирован далее и дериватизован, например, молекулой РЕС, лекарственным веществом и т.д. Сахарная группа модифицированного сахара может представлять собой остаток, который был бы конъюгирован с акцептором в полностью гликозилированном пептиде, или другую углеводную группу с желаемыми свойствами.
Пептиды С-С8Р, модифицируемые способами согласно настоящему изобретению, могут представлять собой синтетические пептиды, пептиды дикого типа или мутантные пептиды, полученные с помощью способов, известных из уровня техники, таких как направленный мутагенез. Гликозилирование пептидов обычно Ν-связанное или О-связанное. Примерное Ν-связывание представляет собой присоединение модифицированного сахара к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X означает любую аминокислоту, кроме пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной группы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного сахара (например, Ν-ацетилгалактозамина, галактозы, маннозы, С1сNАс, глюко
- 37 017770 зы, фукозы или ксилозы) к гидроксидной боковой цепи гидроксиаминокислоты, предпочтительно серина или треонина, хотя также может использоваться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
В одном примерном воплощении С-С8Е экспрессируют в системе клеток млекопитающих и модифицируют путем обработки сиалидазой для отщепления терминальных остатков сиаловой кислоты и последующим пэгилированием с использованием 8Т3Са13 и донора РЕС-сиаловой кислоты.
В другом примерном воплощении С-С8Е, экспрессируемый в клетках млекопитающих, вначале обрабатывают сиалидазой для отщепления терминальных остатков сиаловой кислоты, а затем пэгилируют с использованием 8Т3Са13 и донора РЕС-сиаловой кислоты и далее сиализируют с использованием 8Т3Са13 и донора сиаловой кислоты.
С-С8Е, экспрессируемый в системе клеток млекопитающих, также возможно обработать сиалидазой и галактозидазой для отщепления терминальных остатков сиаловой кислоты и галактозы, а затем галактозилировать с использованием донора галактозы и галактозилтрансферазы и далее пэгилировать с использованием 8Т3Са13 и донора РЕС-сиаловой кислоты.
Еще в одном примерном воплощении С-С8Е не обрабатывают вначале сиалидазой, но гликопэгилируют путем реакции переноса сиаловой кислоты с кассетой модифицирующей группы-сиаловой кислоты и фермента, такого как 8Т3Са13.
В дальнейшем примерном воплощении С-С8Е экспрессируют в клетках насекомых и модифицируют с помощью следующей процедуры: вначале к С-С8Е добавляют Ν-ацетилглюкозамин с использованием соответствующего донора Ν-ацетилглюкозамина и одной или более СпТ-Ι, II, IV и V; затем С-С8Е пэгилируют с использованием донора РЕС-галактозы и галактозилтрансферазы.
С-С8Е, полученный из дрожжей, также может быть гликопэгилирован. Например, С-С8Е вначале обрабатывают эндогликаназой для отщепления гликозильных групп, галактозилируют с использованием донора галактозы и галактозилтрансферазы и затем пэгилируют с помощью 8Т3Са13 и донора РЕСсиаловой кислоты.
Добавление сайтов гликозилирования к пептиду или другой структуре легко достигается путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит один или более сайтов гликозилирования. Добавление сайтов гликозилирования может также осуществляться путем введения одного или более остатка, презентирующего ОН-группу, предпочтительно остатков серина или треонина, в последовательность пептида С-С8Е (для сайтов О-связанного гликозилирования). Добавление сайтов гликозилирования может осуществляться путем мутации или полного химического синтеза пептида СС8Е Аминокислотную последовательность пептида С-С8Е предпочтительно меняют путем изменений на уровне ДНК, в особенности мутаций заранее выбранных оснований ДНК, кодирующей пептид, таким образом, что полученные кодоны транслируются в желаемые аминокислоты. Мутацию (мутации) ДНК предпочтительно осуществляют с помощью способов, известных из уровня техники.
В примерном воплощении сайт гликозилирования добавляется с помощью перетасовки полинуклеотидов. Полинуклетиды, кодирующие пептид-кандидат, можно модулировать с помощью протоколов перетасовки ДНК. Перетасовка ДНК представляет собой процесс рекурсивной рекомбинации и мутации, выполняемой с помощью случайной фрагментации совокупности родственных генов, и последующей повторной сборки фрагментов с помощью процесса, сходного с полимеразной цепной реакцией. См. например, 81еттег, Ргос. №И. Асай. 8ск И8А. 91:10747-10751 (1994); 81еттег, №11иге. 370:389-391 (1994) и патенты США № 5605793, 5837458, 5830721 и 5811238.
В настоящем изобретении также представлен способ присоединения к пептиду (или удаления с пептида) одного или более выбранных гликозильных остатков, после чего по меньшей мере с одним выбранным гликозильным остатком в составе пептида конъюгируют модифицированный сахар. Настоящее воплощение применимо, например, если требуется конъюгировать модифицированный сахар с выбранным гликозильным остатком, отсутствующим в составе пептида или присутствующим в недостаточном количестве. Таким образом, перед присоединением модифицированного сахара к пептиду выбранный гликозильный остаток конъюгируют с пептидом С-С8Е путем ферментативного или химического связывания. В другом воплощении изменяют паттерн гликозилирования гликопептида перед конъюгированием модифицированного сахара путем удаления углеводного остатка с гликопептида. См. например, \\'О 98/31826.
Присоединение или удаление углеводных групп с гликопептида проводится химическим или ферментативным путем. Химическое дегликозилирование предпочтительно проводится путем воздействия на вариант полипептида вещества - трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентного вещества. Это воздействие приводит к отщеплению большинства или всех сахаров, кроме связывающего сахара (Ν-ацетилглюкозамин или Ν-ацетилгалактозамин), в то время как пептид остается интактным. Химическое дегликозилирование описывается в работах Накшиййт е! а1., Агсй. Вюсйет. Вюрйув. 259:52 (1987) и Ейде е! а1., Апа1. Вюсйет. 118:131 (1981). Ферментативное отщепление углеводных групп от вариантов полипептида может проводиться с использованием различных эндо- и экзогликозилаз, как описано в Тйо!акига е! а1., Ме1й. Епхуто1. 138:350 (1987).
- 38 017770
Химическое присоединение гликозильных групп проводится любым методом, принятым в уровне техники. Ферментативное присоединение углеводных групп предпочтительно проводится с использованием модификаций способов, описанных в настоящем документе, с заменой нативных гликозильных единиц на модифицированные сахара, используемые в настоящем изобретении. Другие способы присоединения сахарных групп описаны в патентах США № 5876980, 6030815, 5728554 и 5922577.
Примерные точки прикрепления выбранного гликозильного остатка включают, но не ограничиваются: (а) консенсусные сайты Ν- и О-гликозилирования; (Ь) терминальные гликозильные группы, представляющие собой акцепторы для гликозилтрансферазы; (с) аргинин, аспарагин и гистидин; (б) свободные карбоксильные группы; (е) свободные сульфидрильные группы, такие как сульфгидрильная группа цистеина; (ί) свободные гидроксильные группы, такие как гидроксильные группы серина, треонина или гидроксипролина; (д) ароматические остатки, такие как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана; или (11) амидную группу глутамина. Примерные способы, применимые в настоящем изобретении, описаны в \УО 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987 г. и в работе Арби апб \Уп51оп, СКС СК1Т. КЕУ. В1ОСНЕМ., р. 259-306 (1981).
В примерном воплощении в настоящем изобретении представлен способ получения пэгилирован-
символ С означает КЗ-Ь- или -С(О)(С1-С6)алкил;
В1 означает группу, содержащую остаток линейного или разветвленного полиэтиленгликоля;
символ Ь означает линкер, выбираемый из связи, замещенного или незамещенного алкила или замещенного или незамещенного гетероалкила.
В общем случае, если Ό означает ОН, С означает КЗ-Ь-, и если С означает -С(О)(С1-С6)алкил, Ό означает КЗ-Ь-ΝΗ-.
Способ согласно изобретению включает (а) приведение субстрата - пептида С-С8Е - в контакт с донором РЕС-сиаловой кислоты и ферментом, переносящим группу РЕС-сиаловой кислоты на субстратпептид С-С8Е.
Примерный донор РЕС-сиаловой кислоты представляет собой нуклеотидный сахар, такой как имеющий формулу
и фермент, переносящий РЕС-сиаловую кислоту на аминокислотный или гликозильный остаток пептида С-С8Е, в условиях, подходящих для переноса.
В одном воплощении перед образованием конъюгата согласно изобретению субстрат - пептид СС8Е экспрессируют в клетке-хозяине. Примерная клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. В других воплощениях клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого, растения, гриба или бактериальную клетку.
Способ, представленный в настоящем описании, применим к любому из конъюгатов С-С8Е, описанных в разделах выше.
Пептиды С-С8Е, модифицированные способами согласно настоящему изобретению, могут быть синтетическими пептидами или пептидами дикого типа или они могут быть мутантными пептидами, полученными способами, известными из уровня техники, такими как сайт-направленный мутагенез. Гликозилирование пептидов обычно Ν-связанное или О-связанное. Примерное Ν-связывание представляет собой присоединение модифицированного сахара к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидная последовательность аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин, где X означает любую аминокислоту, кроме пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной группы к боковой цепи аспагарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностий в составе полипептида обозначает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного сахара (например,
- 39 017770
Ν-ацетилгалактозамин, галактоза, манноза, С1сNΑс, глюкоза, фукоза или ксилоза) к гидроксильной боковой цепи гидроксиаминокислоты, предпочтительно серина или треонина, хотя также могут использоваться необычные или неприродные аминокислоты, например 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Добавление сайтов гликозилирования к пептиду или другой структуре может осуществляться в соответствии с настоящим изобретением путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит один или более сайтов гликозилирования. Добавление сайтов гликозилирования может также осуществляться путем введения одного или более остатка, презентирующего ОН-группу, предпочтительно остатков серина или треонина, в последовательность пептида (для сайтов О-связанного гликозилирования). Добавление сайтов гликозилирования может осуществляться путем мутации или полного химического синтеза пептида. Аминокислотную последовательность пептида в некоторых воплощениях меняют путем изменений на уровне ДНК, в особенности мутаций заранее выбранных оснований ДНК, кодирующей пептид таким образом, что полученные кодоны транслируются в желаемые аминокислоты. Мутация (мутации) ДНК осуществляются с помощью способов, известных из уровня техники.
В примерном воплощении сайт гликозилирования добавляется с помощью перетасовки полинуклеотидов. Полинуклетиды, кодирующие пептид-кандидат, можно модулировать с помощью протоколов перетасовки ДНК. Перетасовка ДНК представляет собой процесс рекурсивной рекомбинации и мутации, выполняемой с помощью случайной фрагментации совокупности родственных генов, и последующей повторной сборки фрагментов с помощью процесса, сходного с полимеразной цепной реакцией. См. например, 81еттег, Ргос. №111. Асак. 8с1. И8А. 91:10747-10751 (1994); 8!еттег, №а1иге. 370:389-391 (1994) и патенты США № 5605793, 5837458, 5830721 и 5811238.
Примерные способы добавления или удаления сайтов гликозилирования и удаления гликозильных структур или субструктур подробно описаны в АО 04/099231, АО 03/031464 и родственных заявках на патенты США и РСТ.
В настоящем изобретении также используется способ присоединения к пептиду С-С8Р (или удаления с пептида С-С8Р) одного или более выбранных гликозильных остатков, после чего по меньшей мере с одним выбранным гликозильным остатком в составе пептида конъюгируют модифицированный сахар. Такие техники применимы, например, если требуется конъюгировать модифицированный сахар с выбранным гликозильным остатком, отсутствующим в составе пептида или присутствующим в недостаточном количестве. Таким образом, перед присоединением модифицированного сахара к пептиду выбранный гликозильный остаток конъюгируют с пептидом С-С8Р путем ферментативного или химического связывания. В другом воплощении изменяют паттерн гликозилирования гликопептида перед конъюгированием модифицированного сахара путем удаления углеводного остатка с гликопептида. См. например, АО 98/31826.
Примерные точки прикрепления выбранного гликозильного остатка включают, но не ограничиваются: (а) консенсусные сайты Ν-связанного гликозилирования и сайты О-связанного гликозилирования;
(b) терминальные гликозильные группы, представляющие собой акцепторы для гликозилтрансферазы;
(c) аргинин, аспарагин и гистидин; (к) свободные карбоксильные группы; (е) свободные сульфидрильные группы, такие как сульфгидрильная группа цистеина; (й) свободные гидроксильные группы, такие как гидроксильные группы серина, треонина или гидроксипролина; (д) ароматические остатки, такие как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана; или (Н) амидную группу глутамина. Примерные способы, применимые в настоящем изобретении, описаны в АО 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987 г., и в работе АрИп апк АгкЮп, СКС СК1Т. КЕУ. В1ОСНЕМ., р. 259-306 (1981).
В соответствии с настоящим изобретением модифицированные РЕС сахара конъюгируют с гликозилированным или негликозилированным пептидом с использованием соответствующего фермента, осуществляющего конъюгирование. Предпочтительно концентрации модифицированного сахара-донора (доноров), фермента (ферментов) и акцепторного пептида (пептидов) подбирать так, чтобы гликозилирование осуществлялось до достижения желаемой степени модификации акцептора. Следует понимать, что несмотря на то что предметом обсуждения, приведенного ниже, является сиалилтрансфераза, оно в общем применимо и по отношению к другим гликозилтрансферазным реакциям.
Известно несколько способов применения гликозилтрансфераз для синтеза требуемых олигосахаридных структур, которые в общем случае применимы к настоящему изобретению. Примерные методы описаны, например, в АО 96/32491, а также в работе Ио е! а1., Риге Арр1. СНет. 65:753 (1993), патентах США № 5352670, 5374541, 5545553 и патентах США, находящихся в общественном владении № 6399336 и 6440703, включенных в настоящее описание посредством ссылки.
В настоящем изобретении может использоваться одна гликозилтрансфераза или комбинация гликозилтрансфераз.
Например, возможно использовать комбинацию сиалилтрансферазы и галактозилтрансферазы. В воплощениях, где используется более одного фермента, ферменты и субстраты предпочтительно комбинируют в начальной реакционной смеси или ферменты и реагенты для второй ферментативной реакции добавляют к реакционной среде, когда первая ферментативная реакция завершена или почти завершена. При последовательном проведении двух ферментативных реакций в одном сосуде общий выход продук
- 40 017770 та оказывается большим по сравнению с процедурами, включающими выделение промежуточного продукта. Кроме того, облегчается очистка и удаление лишних растворителей и побочных продуктов.
В одном воплощении и первый, и второй фермент представляют собой гликозилтрансферазы. В другом предпочтительном воплощении один фермент представляет собой эндогликозидазу. В другом воплощении используют более двух ферментов для сборки модифицированного гликопротеина согласно изобретению. Ферменты используют для изменения сахаридной структруры на пептиде С-С8Р в любой момент до или после присоединения модифицированного сахара к пептиду.
Еще в одном воплощении способы согласно изобретению включают использование одной или более экзо- или эндогликозидазы. Гликозидаза может быть мутантной и/или вариантной, такой фермент образует или изменен с целью образования, а не разрыва гликозильных связей. Такая мутантная гликаназа обычно содержит замену аминокислотного остатка в активном центре на кислый аминокислотный остаток. Например, если эндогликаназа представляет собой епбо-Н, замещению обычно подвергаются Азр в положении 130, С1и в положении 132 или их комбинация. Аминокислотные остатки обычно заменяются на серин, аланин, аспарагин или глутамин.
Такой мутантный фермент может катализировать реакцию с помощью стадии синтеза, аналогичной реакции, обратной стадии гидролиза, катализируемой эндогликаназой. В таком воплощении молекуладонор гликозила (например, желаемая олиго- или моносахаридная структура) содержит уходящую группу, и реакция проходит с добавлением молекулы-донора к остатку С1сNАс на белке. Например, уходящая группа может представлять собой галоген, такой как фторид. В других воплощениях уходящая группа представляет собой Азп или молекулу Азп-пептид. В дальнейших воплощениях остаток С1сNАс на молекуле-доноре гликозила является модифицированным. Например, остаток С1сNАс может содержать 1,2-оксазолиновую группу.
В одном воплощении ферменты, используемые для получения конъюгата согласно изобретению, присутствуют в каталитических количествах. Каталитическое количество конкретного фермента варьирует в зависимости от концентрации субстрата фермента, а также от условий реакции, таких как температура, время и рН. Способы определения каталитического количества для данного фермента для выбранных концентраций субстрата и условий реакции хорошо известны специалистам в уровне техники.
Температура проведения реакций согласно изобретению может варьировать от немного выше нуля до температуры денатурации самого чувствительного фермента. Предпочтительный интервал температуры составляет от приблизительно 0 до приблизительно 55°С и более предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 37°С. В другом примерном воплощении один или более компонентов настоящего способа проводят при повышенной температуре с использованием термофильного фермента.
В одном аспекте реакционную смесь сохраняют в течение периода времени, достаточного для гликозилирования акцептора и, таким образом, получения желаемого конъюгата. Некоторое количество конъюгата часто можно детектировать через несколько часов, а извлекаемое количество обычно образуется через 24 ч или ранее. Специалисту в области техники понятно, что скорость реакции зависит от нескольких переменных факторов (например, концентрация фермента, концентрация донора, концентрация акцептора, объем растворителя), которые можно оптимизировать для выбранной системы.
В настоящем изобретении также представлено производство модифицированных пептидов в промышленных масштабах. При использовании в настоящем описании в промышленных масштабах обычно относится к производству по меньшей мере 1 г конечного очищенного конъюгата.
В обсуждении, приведенном ниже, для иллюстрации изобретения используется конъюгирование молекул модифицированной сиаловой кислоты с гликозилированным пептидом. Примерная модифицированная сиаловая кислота помечена ΡΞΟ. Нижеприведенное обсуждение сконцентрировано на использовании сиаловой кислоты, модифицированной ΡΗ0, и гликозилированных пептидов для ясности изложения и не подразумевает, что настоящее изобретение ограничивается конъюгированием этих двух веществ. Специалисту в области техники очевидно, что обсуждение в целом применимо к присоединению модифицированных гликозильных групп, отличных от сиаловой кислоты. Кроме того, обсуждение равно применимо к модификации гликозильной единицы агентами, отличными от ΡΞΟ, включая другие соединения ΡΞΟ, лекарственные вещества и биомолекулы.
Для селективного присоединения пэгилированных или ППГилированных углеводов к пептиду или гликопептиду можно использовать ферментативный подход. В таком способе используют модифицированные сахара, содержащие ΡΗ0, ΡΡ0 или маскированную реактивную функциональную группу, которые комбинируют с соответствующей гликозилтрансферазой или гликосинтазой. Путем выбора гликозилтрансферазы, образующей желаемую углеводную связь, и использования модифицированного сахара в качестве субстрата-донора возможно присоединить ΡΞΟ или ΡΡ0 напрямую к пептидной цепи С-С8Р, к имеющимся углеводным остаткам гликопептида или к углеводным остаткам, добавленным к пептиду.
На пептиде С-С8Р, модифицируемом согласно способам, описанным в настоящем изобретении, находится акцептор сиалилтрансферазы, в виде природной структуры или введенный в состав пептида рекомбинантным, ферментативным или химическим путем. Применимые акцепторы включают, например, галактозильные акцепторы, такие как 6а1β1,461сNАс, 0;·ι1β 1,40;·ι1ΝΛ^ 0;·ι1β 1,30;·ι1ΝΛ^ лакто-№тетраоза,
- 41 017770
Са1β1,3С1сNАс, Са1в1,3Ага, Са1β1,6С1сNАс, Са1в1,4С1с (лактоза), и другие акцепторы, известные специалисту в области техники (см., например, РаиЕоп е! а1., 1. Вю1. СЬет. 253:5617-5624 (1978)).
В одном воплощении акцептор сиалилтрансферазы присутствует на гликопептиде и модифицируется после синтеза гликопептида ίη у1уо. Такие гликопептиды можно сиализировать с использованием заявленных способов без предварительного изменения паттерна гликозилирования гликопептида. В качестве альтернативы способы согласно изобретению могут применяться для сиализации пептида, не содержащего подходящего акцептора; вначале модифицируют пептид с целью включения акцептора, используя способы, известные из уровня техники. В примерном воплощении остаток СаШАс добавляют путем воздействия СаШАс-трансферазы.
В примерном воплощении галактозильный акцептор собирают путем добавления остатка галактозы к подходящему акцептору, связанному с пептидом С-С8Р, например С1сNАс. Этот способ включает инкубацию модифицируемого пептида С-С8Р в реакционной смеси, содержащей достаточное количество галактозилтрансферазы (например, Οπ1β1,3 или Οπ1β1,4) и подходящего донора галактозила (например, ϋϋΡ-галактозы). Реакцию проводят практически до завершения или в качестве альтернативы реакция терминируется после добавления заранее выбранного количества галактозного остатка. Для специалиста в области техники очевидны и другие способы сборки выбранного сахаридного акцептора.
Еще в одном воплощении олигосахариды, связанные с гликопептидом, вначале обрезаются целиком или частично, что открывает акцептор сиалилтрансферазы или группу, к которой могут присоединяться один или более подходящих остатка для образования подходящего акцептора. Для реакций присоединения и обрезки сахаров могут использоваться ферменты, такие как гликозилтрансферазы и эндогликозилазы (см., например, патент США № 5716812).
В нижеприведенной дискуссии способ согласно изобретению иллюстрируется использованием модифицированных сахаров, к которым присоединены группы РЕС. Этот способ выбран для ясности изложения. Для специалиста в области техники очевидно, что это обсуждение равно относится к воплощениям, в которых модифицированный сахар несет лекарственное вещество, биомолекулу и т.д.
В примерном воплощении настоящего изобретения, в котором углеводный остаток обрезается перед добавлением модифицированного сахара, периферические остатки маннозы обрезают до биантеннальной структуры первого поколения. К одному или более углеводным остаткам, открытым путем обрезки, конъюгируют модифицированный сахар, несущий группу РЕС. В одном примере группа РЕС присоединяется через группу С1сNАс, конъюгированную с группой РЕС. К одному или обоим терминальным остаткам маннозы биантеннальной структуры присоединяют модифицированный С1сNАс. В качестве альтернативы немодифицированный С1сNАс может присоединяться к одному или обоим концам разветвленной группы.
В другом примерном воплощении молекулу РЕС присоединяют к одному или обоим терминальным остаткам маннозы биантеннальной структуры посредством модифицированного сахара, содержащего остаток галактозы, конъюгированный с остатком С1сNАс, присоединенным к терминальным остаткам маннозы. В качестве альтернативы немодифицированная Са1 может присоединяться к одному или обоим терминальным остаткам С1сNАс.
Еще в одном примере молекула РЕС присоединяется к остатку Са1 с использованием модифицированной сиаловой кислоты.
В другом примерном воплощении структура из периферических остатков маннозы обрезается до маннозы, от которой разветвляется биантеннальная структура. В одном примере молекулу РЕС присоединяют через С1сNАс, модифицированный полимером. В качестве альтернативы к маннозе присоединяют немодифицированный С1сNАс, а затем Са1 с присоединенной молекулой РЕС. Еще в одном воплощении немодифицированные остатки С1сNАс и Са1 последовательно присоединяют к маннозе, а затем присоединяют сиаловую кислоту, модифицированную молекулой РЕС.
В дальнейшем примерном воплощении периферические остатки маннозы обрезаются до С1сNАс, к которому присоединена первая манноза. Этот С1сNАс конъюгируют с остатком Са1, несущим молекулу РЕС. В качестве альтернативы к С1сNАс присоединяют немодифицированную Са1, а затем сиаловую кислоту, модифицированную водорастворимым сахаром. Еще в одном дальнейшем примере терминальный С1сNАс конъюгируют с Са1 и далее С1асNАс фукозилируют модифицированной фукозой, несущей молекулу РЕС.
Периферические остатки маннозы также могут быть обрезаны до первого С1сNАс, присоединенного к Άδη в составе пептида. В одном примере С1сNАс в составе остатка С1сNАс-(Ρис)а конъюгируют с С1сNАс, несущим водорастворимый полимер. В другом примере С1сNАс в составе остатка С1сNАс(Рис)а модифицируют Са1, несущей водорастворимый полимер. В еще одном дальнейшем воплощении С1сNАс модифицируют Са1 с последующим конъюгированием Са1 с остатком сиаловой кислоты, модифицированным молекулой РЕС.
- 42 017770
Другие примерные воплощения описаны в публикациях заявок на находящиеся в общественной собственности патенты США № 20040132640; 20040063911; 20040137557; заявках на патенты США № 10/369979; 10/410913; 10/360770; 10/410945 и РСТ/и802/32263, каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки.
Вышеприведенные примеры иллюстрируют возможности способов, описанных в настоящей публикации. Используя способы, описанные в настоящей публикации, возможно обрезать и нарастить углеводный остаток, имеющий практически любую желаемую структуру. Модифицированный сахар может присоединяться к концам углеводной группы, как описано выше, или он может находиться между пептидной цепью и концом углевода.
В примерном воплощении существующую сиаловую кислоту отщепляют от гликопептида С-С8Р с помощью сиалидазы, открывая, таким образом, большинство подлежащих галактозиловых остатков. В качестве альтернативы пептид или гликопептид помечают остатками галактозы или олигосахаридным остатком, заканчивающимся галактозной единицей. После воздействия или присоединения остатков галактозы для присоединения модифицированной сиаловой кислоты используют соответствующую сиалилтрансферазу. Схематическое изображение такого подхода приведено на схеме 1.
При другом подходе, изображенном на схеме 2, на сиаловой кислоте присутствует замаскированная реактивная функциональная группа. На эту замаскированную функциональную группу предпочтительно не оказывают влияния условия, используемые для присоединения модифицированной сиаловой кислоты к С-С8Р. После ковалентного присоединения модифицированной сиаловой кислоты к пептиду С-С8Р маскирующую группу отщепляют и пептид С-С8Р конъюгируют с агентом, таким как РЕС. Агент конъюгируют с пептидом особым образом путем его реакции с немаскированной реактивной группой на остатке модифицированного сахара.
Схема 2
>-5Е1
-МНСОСН25 3Е1
РРС-галид
ЗА-5ЫНСОСН2Б-5Е1
Может использоваться любой модифицированный сахар, описанный в настоящем описании, вместе с соответствующей гликозилтрансферазой, в зависимости от терминальных сахаров олигосахаридных боковых цепей гликопептида (табл. 1). Как обсуждалось выше, терминальный сахар гликопептида, необходимый для введения пэгилированной структуры, может вводиться естественным путем во время экс прессии или может присоединяться после экспрессии с использованием соответствующих гликозидазы (гликозидаз), гликозилтрансферазы (гликозилтрансфераз) или смеси гликозидазы (гликозидаз) и гликозилтрансферазы (гликозилтрансфераз).
- 43 017770
Таблица 1
Производные <ЗОР-фукозы
Производные иЭР-галактозамина (если Α=ΝΗ, Вс может означать ацетил)
Производные иОР-глюкозамина (если Α=ΝΗ, Щ может означать ацетил)
В дальнейшем примерном воплощении υΌΡ-галактоза-РЕО реагирует с β 1,4-галактозилтрансферазой из коровьего молока, которая переносит модифицированную галактозу на соответствующую терминальную структуру Ν-ацетилглюкозамина. Терминальные остатки ΟΙοΝΑο на гликопептиде могут быть получены во время его экспрессии, если она происходит в таких системах, как системы млекопитающих, насекомых, растений или грибов, но также могут быть получены путем воздействия на гликопептид требуемыми сиалидазой, и/или гликозидазой, и/или гликозилтрансферазой.
В другом примерном воплощении для переноса пэгилированного ΟΙοΝ на терминальный остаток маннозы на полипептиде используется ΟΙοΝΑο-трансфераза, такая как ΟΝΤ1-5. Еще в одном дальнейшем примерном воплощении Ν- и О-связанные гликановые структуры удаляют с гликопептида ферментативным путем, чтобы открыть аминокислотный или терминальный гликозильный остаток, который затем конъюгируют с модифицированным сахаром. Например, используют эндогликаназу для удаления Ν-связанных структур гликопептида, чтобы открыть терминальный ΟΙοΝΛο. связанный с Аки в составе полипептида. Для присоединения РЕО-галактозы к открытому ΟΙοΝΑο используют иЭР-Оа1-РЕО и соответствующую галактозилтрансферазу.
В альтернативном воплощении модифицированный сахар добавляют напрямую к пептидной цепи О-С8Е, используя гликозилтрансферазу, переносящую остатки сахаров на пептидную цепь. Это примерное воплощение приведено на схеме 3. Примерные гликозилтрансферазы, применимые в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, ОаШАс-трансферазы (ΟαΙΝΑο Τ1-14), 61сNΑс-трансферазы, фукозилтрансферазы, глюкозилтрансферазы, ксилозилтрансферазы, маннозилтрансферазы и т.д. Такой подход позволяет напрямую присоединить модифицированные сахара к пептидам, не несущим углеводов, или в качестве альтернативы к существующим гликопептидам. В обоих случаях присоединение модифицированного сахара имеет место в определенном положении пептидной цепи, определяемой субстратной специфичностью гликозилтрансферазы, а не случайным образом, что имеет место при модификации пептидной цепи белка химическими способами. В белки или гликопептиды, не содержащие пептидной последовательности субстрата гликозилтрансферазы, можно ввести различные вещества путем встраивания соответствующей аминокислотной последовательности в полипептидную цепь.
- 44 017770 ра1ЫН-С0(СНг}дМН-РЕС
Схема 3
(ΟίΐΙΝΑϋΤϊ)
РЕО'
Са1МН-СО(СНг)4МН-РЕ<3
В каждом из примерных воплощений, приведенных выше, после конъюгирования модифицированного сахара с пептидом можно провести одну или более дополнительных стадий химической или ферментативной модификации. В примерном воплощении фермент (например, фукозилтрансфераза) используется для присоединения гликозильной единицы (например, фукозы) к терминальному модифицированному сахару, присоединенному к пептиду С-С8Р. В другом примере ферментативная реакция используется для кэпирования сайтов, с которыми модифицированный сахар не смог конъюгироваться. В ка честве альтернативы используется химическая реакция с целью изменения структуры конъюгированного модифицированного сахара. Например, конъюгированный модифицированный сахар реагирует с агентами, стабилизирующими или дестабилизирующими его связь с пептидным компонентом, к которому присоединен пептидный сахар. В другом примере с компонента модифицированного сахара снимается защита после его конъюгирования с пептидом. Специалисту в области техники понятно, что существует множество ферментативных и химических процедур, применимых в способах согласно настоящему изобретению на стадии, следующей за конъюгированием модифицированного сахара с пептидом С-С8Р. Настоящее изобретение распространяется на дальнейшее усложнение конъюгата модифицированного сахара с пептидом С-С8Р.
Ферменты.
Помимо ферментов, обсуждаемых выше в контексте образования ацилсвязанных конъюгатов, паттерн гликозилирования конъюгата и исходных субстратов (например, пептидов, липидов) может быть усложнен, обрезан или модифицирован каким-то другим образом с помощью способов, использующих другие ферменты. Способы перестройки пептидов и липидов с использованием ферментов, переносящих донор сахара на акцептор, подробно обсуждаются в работе ПеРгее8, \¥О 03/031464 А2, опубликованной 17 апреля 2003 г. Краткое описание выбранных ферментов для использования в настоящем методе при ведено ниже.
Гликозилтрансферазы.
Гликозилтрансферазы катализируют пошаговое присоединение активированных сахаров (доноры представляют собой ЫЭР- или ЫМР-сахара) к белку, гликопептиду, липиду или гликолипиду или к невосстанавливающему концу растущего олигосахарида. Ν-связанные гликопептиды синтезируют с помощью трансферазы и липидсвязанного олигосахаридного донора По1-РР-ЫАС2С1сзМапд путем блокового переноса и последующей обрезки стержня. В этом случает природа стержневого сахарида несколько отличается от последующих присоединяемых сахаров. Из уровня техники известно очень большое количество гликозилтрансфераз.
Гликозилтрансферазы, применимые в настоящем изобретении, могут быть любыми при условии, что они могут использовать модифицированный сахар в качестве донора. Примеры таких ферментов включают гликозилтрансферазу пути Лелуара, такую как галактозилтрансферазу, Ν-ацетилглюкозаминилтрансферазу, Ν-ацетилгалактозаминилтрансферазу, фукозилтрансферазу, сиалилтрансферазу, маннозилтрансферазу, ксилозилтрансферазу, глюкурононилтрансферазу и т.д.
Для ферментативных углеводных синтезов, включающих гликозилтрансферазные реакции, гликозилтрансфераза может быть клонирована или выделена из любого источника. Известно много клонированных гликозилтрансфераз, а также их полинуклеотидные последовательности. См., например, Т1е \ν\ν\ν Си^е То С1оηеά С1усо8у11гап8Гега8е8 (11ир:/Л\л\лул'сксо.ик/ТС181/д1_81^е.1ит). В различных публичных базах данных, таких как СепВапк, 8\у188-Рго1, ЕМВЬ и др., можно найти аминокислотные последовательности гликозилтрансфераз и нуклеотидные последовательности, кодирующие гликозилтрансфе разы, из которых можно вывести их аминокислотные последовательности.
Гликозилтрансферазы, которые могут использоваться в способах согласно изобретению, включают, но не ограничиваются, галактозилтрансферазы, фукозилтрансферазы, глюкозилтрансферазы, Ν-ацетилгалактозаминилтрансферазы, Ν-ацетилглюкозаминилтрансферазы, глюкуронилтрансферазы, сиалилтрансферазы, маннозилтрансферазы, трансферазы глюкуроновой кислоты, трансферазы галактуроновой кислоты и олигосахарилтрансферазы. Применимые гликозилтрансферазы включают гликозилтрансферазы, полученные как из эукариот, так и из прокариот.
ДНК, кодирующая гликозилтрансферазы, может быть получена с помощью химического синтеза, скрининга обратных транскриптов мРНК из соответствующих клеток или культур клеточных линий, скрининга геномных библиотек соответствующих клеток или комбинаций этих процедур. Скрининг мРНК или геномной ДНК может проводиться с использованием олигонуклеотидных проб, выстроенных
- 45 017770 на основе последовательностей генов гликозилтрансфераз. Пробы можно пометить детектируемой группой, такой как флуоресцентная группа, радиоактивный атом или хемилюминесцентная группа, в соответствии с известными процедурами и использовать в общепринятых гибридизационных тестах. В качестве альтернативы последовательности генов гликозилтрансфераз могут быть получены путем полимеразной цепной реакции (РСЯ), для которой олигонуклеотидные праймеры РСЯ получают из последовательности генов гликозилтрансфераз. См. патент США № 4683195 на имя Ми1Й8 е[ а1., патент США № 4683202 на имя МиШк.
Гликозилтрансферазу можно синтезировать в клетках-хозяевах, трансформированных векторами, содержащими ДНК, кодирующую фермент гликозилтрансферазу. Векторы используются для амплификации ДНК, кодирующей фермент гликозилтрансферазу и/или для экспрессии ДНК, кодирующей фермент гликозилтрансферазу. Вектор экспрессии представляет собой реплицирующийся ДНК-конструкт, в котором последовательность ДНК, кодирующая фермент гликозилтрансферазу, функционально связана с подходящими регуляторными последовательностями, способными регулировать экспрессию фермента гликозилтрансферазы в подходящем хозяине. От выбора хозяина и способа трансформации зависит, насколько необходимыми являются такие регулирующие последовательности. В общем случае регулирующие последовательности включают транскрипционный промотор, необязательную операторную последовательность, регулирующую транскрипцию, последовательность, кодирующую подходящие сайты связывания рибосомальной мРНК, и последовательности, регулирующие терминацию транскрипции и трансляцию. Амплификационные векторы не нуждаются в экспрессии регулирующих доменов. Необходимой является только способность реплицироваться в хозяине, что обычно достигается с помощью точки начала репликации, и ген селекции для распознавания трансформантов.
В примерном воплощении в настоящем изобретении используется прокариотический фермент. Такие гликозилтрансферазы включают ферменты, участвующие в синтезе липоолигосахаридов (ЬО8), продуцируемых многими грамотрицательными бактериями (Ргейои е[ а1., СгШса1 Ре\зе\\ъ ίη МюгоЬю1оду 23(3):139-180 (1996)). Такие ферменты включают, но не ограничиваются, белки оперона гГа таких видов, как Е.сой и 8а1топе11а 1урй1тигшт, включающие β1,6-галакτозилτрансферазу и β1,3-галактозилтрансферазу (см., например, номера в базе данных ЕМВЬ М80599 и М86935 (Е.сой); номер в базе данных ЕМВЬ 856361 (8.1урй|тпг1ит)), глюкозилтрансферазу (номер в базе данных 8\\!55-Рго1 Р25740 (Е.сой) β1,2-глюкозилтрансферазу (гГа1) (номер в базе данных 8\\!55-Рго1 Р27129 (Е.сой) и номер в базе данных 8\\!55-Рго1 Р19817 (8.1урЫтипит)) и β1,2-N-ацеτилглюкозаминилτрансферазу (гГаК) (номер в базе данных ЕМВЬ И00039 (Е.сой)). Другие гликозилтрансферазы с известными аминокислотными последовательностями включают гликозилтрансферазы, кодируемые оперонами, такими как гГаВ, охарактеризованными в организмах, таких как К1еЬые11а рпеитошае, Е.сой, 8а1топе11а 1урй|тпг1ит, 8а1топе11а егИелса, Уегыша еШегосоййса, МусоЬас1егшт 1ерго5ит, и оперон гй1 Ркеиботопак аегидтока.
В настоящем изобретении применимы также галактозидазы, участвующие в производстве структур, содержащих лакто-Л-неотетраозу, ^-галактозил-β-1,4-Ν-ацетил-^-глюкозаминил-β-1,3-^-галактозил-β1,4-Э-глюкозу и трисахаридную последовательность группы крови Рк, О-галактозил-а-1,4-0-галактозилβ-1,4-^-глюкозу, идентифицированную в составе ЬО8 патогенов слизистых Летела доппогйоеае и Л.тешпдйШк (8сйойеп е[ а1., 1. Меб. МюгоЬюй 41:236-243 (1994)). Гены Л.тешпдй1б18 и Л.допоггйоеае, кодирующие гликозилтрансферазы, участвующие в биосинтезе этих структур, были идентифицированы у Л.тешпдй1й18 иммунотипов Ь3 и Ь1 (.Тептпдк е[ а1., Мо1. МюгоЬюй 18:729-740 (1995)) и у мутанта Р62 Л.допоггйоеае (СоЬййсй, 1. Ехр. Меб. 180:2181-2190 (1994)). У Л.тешпдШйЬ локус, состоящий из трех генов, 1д1А, 1д1В и 1д1Е, кодирует ферменты гликозилтрансфераз, необходимые для присоединения трех последних сахаров в цепи лакто-Л-неотетраозы (^акагсйик е[ а1., 1. Вю1. Сйет. 271:19166-73 (1996)). Недавно была показана ферментативная активность продуктов генов 1д[В и !д1А, что является первым доказательством из предсказанной гликозилтрансферазной функции (^акагсйик е[ а1., 1. Вю1. Сйет. 271(45):28271-276 (1996)). У Л.допоггйоеае существуют два дополнительных гена, 1дЮ, присоединяющий [УО-СаШАс к положению 3 терминальной галактозы лакто-Л-неотетраозной структуры, и 1д1С, присоединяющий терминальный а-Э-Са1 к лактозному элементу обрезанной ЬО8, что приводит к образованию структуры антигена группы крови Рк (СоЬййсй (1994), см. выше). У Л. тептдйШк отдельный иммунотип Ь1 также экспрессирует антиген группы крови Рк, и было показано, что этот иммунотип несет ген 1д£С (.Тептпдк е[ а1. (1995), см. выше). Гликозилтрансферазы Летела и ассоциированные с ними гены также описаны в публикации И8РЛ 5545553 (Со1кййсй). Также были охарактеризованы гены а1,2фукозилтрансферазы и а1,3-фукозилтрансферазы НейсоЬас!ег ру1оп (Магйп е[ а1., 1. Вю1. Сйет. 272:21349-21356 (1997)). Также в настоящем изобретении применимы гликозилтрансферазы Сатру1оЬас1ег )е)иш (см., например, ййр://аГтЬ.сη^8-т^8.£^/~реά^о/СΑΖΥ/дΐГ_42.йΐт1).
Фукозилтрансферазы.
В некоторых воплощениях гликозилтрансфераза, используемая в способах согласно изобретению, представляет собой фукозилтрансферазу. Фукозилтрансферазы известны специалистам в области техники. Примерные фукозилтрансферазы включают ферменты, переносящие Ь-фукозу с СЭР-фукозы на гидроксильное положение акцепторного сахара. Также в настоящем изобретении применимы фукозил
- 46 017770 трансферазы, переносящие не нуклеотидный сахар на акцептор.
В некоторых воплощениях акцепторный сахар представляет собой, например, С1сNАс в группе Са1в(1^-3,4)СкЫАсв в составе олигосахаридного гликозида. Подходящие для осуществления этой реакции фукозилтрансферазы включают фукозилтрансферазу Са1β(1^3,4)С1сNАсβ1-α(1^3,4) (РТШ Е.С. Νο. 2.4.1.65), впервые охарактеризованную в составе человеческого молока (см. Ра1с1с, е! а1., СагЬоНубга!е Век. 190:1-11 (1989); Рйее1к, е! а1., 1. Вю1. СНет. 256:10456-10463 (1981) и Νυηβζ, е! а1., Сап. 1. СНет. 59:2086-2095 (1981)) и фукозилтрансферазы Са1в(1^4)С1сХАсв-а (РТ1У, РТУ, РТУЕ), обнаруженные в человеческой сыворотке крови. Также охарактеризована РТУП (Е.С. Νο. 2.4.1.65), фукозилтрансфераза сиалил а(2№3)Са1в((1№3)С1сХАсв. Также охарактеризована рекомбинантная форма фукозилтрансферазы Са1в(1^-3,4)СкЫАсв-а(1^3,4) (см. Эитак, е! а1., Вюогд. Меб. Ье!!егк. 1:425-428 (1991) и Кико^ккаЬа!а11о, е! а1., Сепек апб Эеуе1ортеп1. 4:1288-1303 (1990)). Другие примерные фукозилтрансферазы включают, например, а1,2-фукозилтрансферазу (Е.С. № 2.4.1.69). Ферментативное фукозилирование может проводиться с использованием способов, описанных в работе МоШсопе, е! а1., Еиг. 1. ВюсНет. 191:169176 (1990) или в патенте США № 5374655. Клетки, использующиеся для продукции фукозилтрансферазы, также содержат ферментативную систему для синтеза СЦР-глюкозы.
Галактозилтрансферазы.
В другой группе воплощений гликозилтрансфераза представляет собой галактозилтрансферазу. Примерные галактозилтрансферазы включают а(1,3)-галактозилтрансферазы (Е.С. №. 2.4.1.151, см., например, ОаЬко\\'кк| е! а1., Тгапкр1ап! Ргос. 25:2921 (1993) и Уатато!о е! а1. №1иге. 345:229-233 (1990), бычью (СепВапк _)04989, ^1акке е! а1., 1. Вю1. СНет. 264:14290-14297 (1989)), мышиную (СепВапк т26925; Ьагкеп е! а1., Ргос. №Г1 Асаб. 8ск И8А. 86:8227-8231 (1989)), свиную (СепВапк Ь36152; 8!гаНап е! а1., 1ттипо депейск. 41:101-105 (1995)). Другая подходящая а1,3-галактозилтрансфераза представляет собой галактозилтрансферазу, участвующую в синтезе антигена группы крови В (ЕС 2.4.1.37, Уатато!о е! а1., 1. Вю1. СНет. 265:1146-1151 (1990) (человеческая)). Еще одна примерная галактозилтрансфераза представляет собой соге Са1-Т1.
Для использования в способах согласно изобретению также подходят в1,4-галактозилтрансферазы, включающие, например, ЕС 2.4.1.90 (РасХАс-синтетаза) и ЕС 2.4.1.22 (лактозосинтетаза) (бычья (Ц'Адок!аго е! а1., Еиг. 1. ВюсНет. 183:211-217 (1989)), человеческая (Маки е! а1., ВюсНет. ВюрНук. Век. Соттип. 157:657-663 (1988)), мышиная (№1к-иа\уа е! а1., 1. ВюсНет. 104:165-168 (1988)), а также Е.С. 2.4.1.38 и керамид галактозилтрансфераза (ЕС 2.4.1.45, 8!аН1 е! а1., 1. №игокск Век. 38:234-242 (1994)). Другие применимые галактозилтрансферазы включают, например, а1,2-галактозилтрансферазы (например, из 8сН^ζοкассНа^οтусек ротЬе, СНаре11 е! а1., Мо1. Вю1. Се11. 5:519-528 (1994)).
Сиалилтрансферазы.
Сиалилтрансферазы представляют собой другой тип гликозилтрансфераз, применимый к рекомбинантным клеткам и реакционным смесям согласно изобретению. Клетки, продуцирующие рекомбинантные сиалилтрансферазы, также продуцируют СМР-сиаловую кислоту, являющуюся донором сиаловой кислоты для сиалилтрансфераз. Примеры сиалилтрансфераз, применимых в настоящем изобретении, включают 8Т3Са1 III (например, крысиную или человеческую 8Т3Са1 III), 8Т3Са1 IV, 8Т3Са1 I, 8Т3Са1 II, 8Т6Са1 I, 8Т3Са1 У, 8Т6Са1 II, 8Т6СаШАс I, 8Т6СаШАс II и 8Т6СаШАс III (в настоящем описании используется номенклатура сиалилтрансфераз, приведенная в работе Ткир е! а1., С1усоЬю1оду 6: ν-χίν (1996)). Примерная а(2,3)-сиалилтрансфераза, обозначаемая как а(2,3)-сиалилтрансфераза (ЕС 2.4.99.6) переносит сиаловую кислоту на нередуцирующую терминальную Са1 в составе дисахарида или гликозида Са1в 1№3С1с. См. Уап беп Еупбеп е! а1., 1. Вю1. СНет. 256:3159 (1981), \Уетк1ет е! а1., 1. Вю1. СНет. 257:13845 (1982) и \Уеп е! а1., 1. Вю1. СНет. 267:21011 (1992). Другая примерная а2,3-сиалилтрансфераза (ЕС 2.4.99.4) переносит сиаловую кислоту на нередуцирующую терминальную Са1 дисахарида или гликозида. См. Веапск е! а1., 1. Вю1. СНет. 254:4444 (1979) и С111екр1е е! а1., 1. Вю1. СНет. 267:21004 (1992).
Дальнейшие примерные ферменты включают Са1-β-1,4-С1сNАс α-2,6 сиалилтрансферазу (см. Кигоката е! а1. Еиг. 1. ВюсНет. 219:375-381 (1994)).
Предпочтительно, чтобы для гликозилирования углеводов на гликопептидах сиалилтрансфераза была способна переносить сиаловую кислоту на последовательность Са1β1,4С1сNАс как наиболее распространенную предпоследнюю последовательность, подлежащую терминально сиаловой кислоте на полностью сиализованных углеводных струкурах (см. табл. 2).
- 47 017770
Таблица 2
Сиалилтрансферазы, использующие последовательность Са1β1,4С1сNАс в качестве акцепторного субстрата
Сиалилтрансфераза Происхождение Образованная последовательность (последовательности) Ссылка
ЗТбСа!1 Млекопитающие Νβιι Аса2.6Саф 1,4С1СИАс- 1
ЗТЗСа! III Млекопитающие ΝβιιΑοα2,3631β 1,40!ΟΝΑο- ΝβπΑ€α2,30α1β1,30ΙΟΝΑο- I
8ТЗСа1 IV Млекопитающие ХеиАса2.,ЗСаф1,4С1СИАс- ΝοιιΑοα2,3θ31βΕ3ϋΚ'ΝΑο- 1
8Т6Са1 П Млекопитающие МеиАса2,6Са1р1,4С1СНА
8Т6Са1 П фотобактерия МеиАса2,66аф1,46Ι€ΝΑο- 2
ЗТЗСа! V Ν. ηιβηίη§ί1ίάβ8 Ν. еопопТюеае Ией Аса2,ЗСа1р 1,4С1С1Ч Ас- 3
1) СмсНее е! а1., Вю/ТесНто^у. 9:1347-1355 (1991).
2) Υататο!ο е! а1., I. ВюсНет. 120:104-110 (1996).
3) СПЬей е! а1., I. Вю1. СНет. 271:28271-28276 (1996).
Примером сиалилтрансферазы, применимой в заявленных методах, является δТ3Са1 III, также обозначаемая а(2,3)-сиалилтрансфераза (ЕС 2.4.99.6). Этот фермент катализирует перенос сиаловой кислоты на Са1 в составе гликозида Са1β1,3С1сNАс или Са1β1,4С1сNАс (см., например, Аеη е! а1., I. Вю1 СНет. 267:21011 (1992); Vаη άеη Ецпбен е! а1., I. Вю1 СНет. 256:3159 (1991)) и ответственная за сиализацию аспарагинсвязанных олигосахаридов в составе гликопептидов. Сиаловая кислота связывается с Са1 с образованием α-связи между двумя сахаридами. Связывание (связь) сахаридов осуществляется по положению 2 №иАс и положению 3 Са1. Этот конкретный фермент может быть выделен из печени крыс (АешбДеш е! а1., I. Вю1. СНет. 257:13845 (1982)); известны последовательности человеческой кДНК (δ;·ΐ5;·ι1<ί е! а1. (1993), I. Вю1 СНет. 268:22782-22787; Кпадаиа & Раи^ (1994), I. Вю1 СНет. 269:13941401) и геномной ДНК (Кйада^а е! а1. (1996), I. Вю1. СНет. 271:931-938), что позволяет получить этот фермент с помощью рекомбинантной экспрессии. В одном воплощении в заявленных способах сиализации используется крысиная δТ3Са1 III.
Другие примерные сиалилтрансферазы, применимые в настоящем изобретении, включают сиалилтрансферазы СатрукЬасЮг дедьтЕ включая С8Т4 и С8Т-П, и сиалилтрасферазы, образующие α(2,3)связи. См., например, АО 99/49051.
Сиалилтрансферазы, отличные от приведенных в табл. 2, также применимы в экономичном и крупномасштабном процессе сиализации коммерчески значимых гликопептидов. В качестве простого теста применимости этих других ферментов различные количества каждого фермента (1-100 мЕд/мг белка) реагируют с асиало-α! АСР (в концентрации 1-10 мг/мл) и сравнивают способность рассматриваемой сиалилтрансферазы сиализировать гликопептиды с бычьей δТ6Са1 I, δТ3Са1 III или обеими сиалилтрансферазами. В качестве альтернативы для этой оценки вместо асиало-α! АСР могут использоваться другие гликопептиды или Ν-связанные олигосахариды, отщепляемые ферментативным путем от пептидной цепи. Для практического крупномастабного процесса сиализации пептидов применимы сиалилтрансферазы, обладающие способностью сиализировать Ν-связанные олигосахариды гликопептидов более эффективно, чем δТ6Са1 I.
СаШАс трансферазы.
Также применимы в настоящем изобретении Ν-ацетилгалактозаминилтрансферазы, в особенности для связывания молекулы СаШАс с аминокислотой в сайте О-гликозилирования пептида. Подходящие Ν-ацетилгалактозаминилтрансферазы включают, но не ограничиваются, а(1,3)-№ацетилгалактозаминилтрансферазу, в(1,4)-№ацетилгалактозаминилтрансферазы (№ща1а е! а1., I. Вю1. СНет. 267:1208212089 (1992) и δт^!Н е! а1., I. Вю1. СНет. 269:15162 (1994)) и полипептидной Ν-ацетилгалактозаминилтрансферазу (Ηοιιτι е! а1., I. Вю1. СНет. 268:12609 (1993)).
Хорошо известна продукция белков, таких как СаШАс Т1-хх с использованием клонированных генов с помощью генной инженерии. См., например, патент США № 4761371. Один способ включает сбор достаточных образцов, и далее аминокислотная последовательность определяется секвенированием с Ν-конца. Полученная информация затем используется для изолирования клона кДНК, кодирующего полноразмерную (мембраносвязанную) трансферазу, экспрессия которой в клеточной линии насекомых δ£9 позволяет синтезировать полностью активный фермент. Акцепторная специфичность фермента далее определяется с использованием полуколичественного анализа аминокислот, окружающих известные сай
- 48 017770 ты гликозилирования в 16 различных белках и последующего анализа гликозилирования синтетических пептидов ίπ νίΙΐΌ. Эта работа показала, что в гликозилированных сегментах пептидов больше доля определенных аминокислотных остатков и что аминокислотные остатки в определенных положениях, окружающих гликозилированные остатки серина и треонина, могут оказывать более выраженное влияние на эффективность акцептора, чем другие аминокислоты.
Связанные с клеткой гликозилтрансферазы.
В другом воплощении ферменты, использующиеся в способе согласно настоящему изобретению, представляют собой связанные с клеткой гликозилтрансферазы. Хотя известно большое количество растворимых гликозилтрансфераз (см., например, патент США № 5032519), гликозилтрансферазы, ассоциированные с клеткой, обычно находятся в мембраносвязанной форме. Считается, что многие изученные ранее мембраносвязанные ферменты представляют собой белки, встроенные в мембрану; т.е. они не отделяются от мембраны путем обработки ультразвуком и требуют воздействия детергента для солюбилизации. Были идентифицированы поверхностные гликозилтрансферазы на поверхности клеток позвоночных и беспозвоночных и также было установлено, что такие поверхностные гликозилтрансферазы сохраняют каталитическую активность в физиологических условиях. Однако более известная роль гликозилтрансфераз на поверхности клеток заключается в распознавании клетками друг друга (Во!й, ОЬЕСиЬАВ АРРВОАСНЕ8 ТО 8ВРВЛСТТВВВЛВ РНЕЛОМЕКА, 1990).
Были разработаны способы изменения гликозилаз, экспрессируемых клетками. Например, в работе Ьагзеи е! а1., Ргос. Νι!1. Асаб. 8с1. И8А. 86:8227-8231 (1989) описывается генетический подход к выделению клонированных последовательностей ДНК, определяющих экспрессию олигосахаридных структур на поверхности клетки и соответствующих им гликозилтрансфераз. Известно, что в библиотеке кДНК, полученной из мРНК, выделенной из мышиной клеточной линии, экспрессируется ИПР-галактоза; в-Э-галактозил-1,4-Л-ацетил-О-глюкозаминид а1,3-галактозилтрансфераза была трансфицирована в клетки СО8-1. В культивированных трансфицированных клетках затем определяли активность α 1,3 -галактозилтрансферазы.
В работе ВгапсЬсо е! а1., Ргос. Νι!1. Асаб. 8с1. И8А. 89:2713-2717 (1992) раскрывается способ заякоривания β-лактамазы на внешней поверхности ЕзсйепсЫа сой. Получают трехкомпонентный слитый белок, состоящий из (ί) сигнальной последовательности белка внешней поверхности мембраны; (ίί) внутримембранного домена белка внешней поверхности мембраны и (ίίί) полной последовательности зрелой β-лактамазы, что дает молекулу активной β-лактамазы, связанную с мембраной. Однако способ по Ргаиз1зсо распространяется только на прокариотические клеточные системы и, как признают авторы, требует наличия полного продукта трехчастного слияния для правильного функционирования.
Сульфотрансферазы.
В настоящем изобретении также представлены способы получения пептидов, включающих сульфатированные молекулы, содержащие, например, сульфатированные полисахариды, такие как гепарин, гепарансульфат, каррагенен и родственные вещества. Применимые сульфотрансферазы включают, например, хондроитин-6-сульфотрансферазу (кДНК кур, описанная в работе Рики1а е! а1., Т Вю1. Сйет. 270:18575-18580 (1995); номер в базе данных СепВапк Ό49915), гликозаминогликан
Ν-ацетилглюкозамин N-деацетилаза/N-сульфоΊрансфераза 1 (Э|хоп е! а1., Сепотюз. 26:239-241 (1995); ИЫ8918) и гликозаминогликан Ν-ацетилглюкозамин N-деацетилаза/N-сульфотрансфераза 2 (кДНК мыши, описанная в Оге11апа е! а1., Т Вю1. Сйет. 269:2270-2276 (1994) и Епкззоп е! а1., Т Вю1. Сйет. 269:10438-10443 (1994); кДНК человека, описанная в номере базы данных СепВапк И2304).
Гликозидазы.
Настоящее изобретение также распространяется на использование гликозидаз дикого типа и мутантов. Было показано, что мутантые ферменты β-галактозидазы катализируют образование дисахаридов путем связывания α-гликозилфторида с галактозильной акцепторной молекулой (ХУййегз. патент США № 6284494; выданный 4 сентября 2001 г.). Другие гликозидазы, применимые для использования в настоящем изобретении, включают, например, β-глюкозидазы, β-галактозидазы, β-маннозидазы, β-ацетилглюкозаминидазы, β-Ν-ацетилгалактозаминидазы, β-ксилозидазы, β-фукозидазы, целлюлазы, ксиланазы, галактаназы, маннаназы, гемицеллюлазы, амилазы, глюкоамилазы, α-глюкозидазы, α-галактозидазы, α-маннозидазы, α-Ν-ацетилглюкозаминидазы, α-Ν-ацетилгалактозаминидазы, α-ксилозидазы, α-фукозидазы и нейраминидазы/сиалидазы.
Иммобилизованные ферменты.
В настоящем изобретении также представлено использование ферментов на твердой и/или растворимой подложке. В примерном воплощении представлена гликозилтрансфераза, конъюгированная с РЕС посредством интактного гликозильного линкера в соответствии со способами согласно изобретению. Конъюгат РЕС-линкер-фермент необязательно прикреплен к твердой подложке. Использование ферментов на твердой подложке в способах согласно изобретению упрощает приготовление реакционной смеси и очистку продукта реакции, а также облегчает выделение фермента из смеси. В способах согласно изобретению используется конъюгат гликозилтрансферазы. Специалисту в области техники очевидны другие комбинации ферментов и подложек.
- 49 017770
Слитые белки.
В других примерных воплощениях в способах согласно изобретению используются слитые белки, обладающие более одной ферментативной активностью, участвующей в синтезе желаемого конъюгата гликопептида. Слитые белки могут состоять, например, из каталитически активного домена гликозилтрансферазы, соединенного с каталитическим доменом вспомогательного фермента. Каталитический домен вспомогательного фермента может, например, катализировать какую-либо стадию образования нуклеотидного сахара, являющегося донором для гликозилтрансферазы, или катализировать реакцию гликозилтрансферазного цикла. Например, полинуклеотид, кодирующий гликозилтрансферазу, может быть слит в одной рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим фермент, участвующий в синтезе нуклеотидного сахара. Полученный слитый белок может катализировать не только синтез нуклеотидного сахара, но и перенос сахарной группы на акцепторную молекулу. Слитый белок может представлять собой два или более фермента цикла, связанных в одну экспрессируемую нуклеотидную последовательность. В других воплощениях слитый белок включает каталитически активные домены двух или более гликозилтрансфераз. См., например, патент США № 5641668. Различные применимые слитые белки облегчают дизайн и производство модифицированных гликопептидов согласно изобретению (см., например, заявку на патент РСТ/СА98/01180, опубликованную как \УО 99/31224 24 июня 1999 г.).
Получение модифицированных сахаров.
В общем случае, в способах согласно изобретению используются модифицированные сахара. В одном аспекте сахарная группа или группы кассеты сахарная группа-линкер и РЕС или кассеты РЕСлинкер связываются друг с другом посредством реактивных групп, обычно превращающихся в процессе связывания в новую органическую функциональную группу или нереактивную группу. Реактивная функциональная группа (группы) сахара может находиться в любом положении молекулы сахара. Реактивные группы и классы реакций, применимые в настоящем изобретении, обычно представляют собой группы и реакции, хорошо известные из области техники химии биоконъюгатов. В настоящее время предпочтительны классы реакций с участием реактивных сахарных групп, проходящие в сравнительно мягких условиях. Такие реакции включают, но не ограничиваются, нуклеофильные замещения (т.е. реакции аминов и спиртов с ацилгалидами, активными сложными эфирами), электрофильные замещения (например, энаминные реакции) и присоединения к множественным связям углерод-углерод и углеродгетероатом (например, реакция Майкла, присоединение Дилса-Альдера). Эти и другие применимые реакции описываются, например, в публикациях Магсй, АЭУАКСЕЭ ОВСАШС СНЕМ18ТВУ, 3-е изд., ίοΐιη ^йеу & 8оп8, №\ν Уогк, 1985; Негтапкоп, ВЮСОЮиСАТЕ ТЕС.’НМСиЕ8, Асадетю Ргс55. 8ап Οίοβο. 1996 и Реепеу е1 а1., МОЭ1Р1САТ1ОК ОР РВОТЕШ8; Адуапсек ίη СЕетМгу 8епс5, νοί. 198, Атепсап Сйетка1 8ос1е1у, ХУаЧипдШп, Э.С., 1982.
Применимые реактивные функциональные группы, подвешенные на сахарном ядре или модифицирующей группе, включают, но не ограничиваются:
(a) карбоксильные группы и их различные производные, включая, но не ограничиваясь, сложные эфиры Ν-гидроксисукцинимида, сложные эфиры Ν-гидроксибензотриазола, ацилгалиды, ацилимидазолы, тиоэфиры, сложные эфиры п-нитрофенила, алкильные, алкенильные, алкинильные и ароматические сложные эфиры;
(b) гидроксильные группы, которые могут превращаться, например, в эфиры, сложные эфиры, альдегиды и т.д.;
(c) галогеналкильные группы, где галид может позднее заменяться нуклеофильной группой, такой как, например, амин, карбоксилат-анион, тиоловый анион, карбанион или алкоксидный ион, что приводит к ковалентному присоединению новой группы вместо функциональной группы атома галогена;
(д) диенофильные группы, способные принимать участие в реакциях Дилса-Альдера, такие как, например, малеимидогруппы;
(е) альдегидные или кетоновые группы с последующей возможной дериватизацией путем образования карбонильных производных, таких как, например, иминов, гидразонов, семикарбазонов или оксимов, или с помощью механизмов, таких как реакции Гриньяра или реакции с алкиллитием;
(ί) сульфонилгалоидные группы для последующих реакций с аминами, например, с образованием сульфонамидов;
(д) тиоловые группы, которые могут, например, превращаться в дисульфиды или реагировать с ацилгалидами;
(11) аминогруппы или сульфгидрильные группы, которые могут быть, например, ацилированы, алкилированы или окислены;
(ί) алкены, подвергающиеся, например, циклоприсоединению, ацилированию, участвующими в реакции Майкла и т.д.;
(ί) эпоксиды, которые могут реагировать, например, с аминными и гидроксильными соединениями.
Реактивные функциональные группы могут выбираться таким образом, что они не участвуют или не препятствуют реакциям, необходимым для сборки реактивного сахарного ядра или модифицирующей группы. В качестве альтернативы присутствие защищающей группы может защищать реактивную функциональную группу от участия в реакции. Специалисту в области техники очевидны способы защиты
- 50 017770 конкретной функциональной группы таким образом, что это не влияет на выбранные условия реакции. Примеры подходящих защищающих групп см., например, в работе Огеепе е! а1., РЯ0ТЕСТ1УЕ ОЯ0иР8 ΙΝ 0Я0АХ1С 8¥ЯТНЕ818, .ΙοΙιιι \\!1е\ & 8опк, Хеи Уотк, 1991.
В нижеприведенном обсуждении описываются некоторые конкретные примеры модифицированных сахаров, применимых в настоящем изобретении. В примерных воплощениях в качестве сахарного ядра, к которому присоединяется модифицирующая группа, используется производное сиаловой кислоты. Нижеприведенное обсуждение концентрируется на производных сиаловой кислоты исключительно для ясности изложения и не подразумевает ограничения объема настоящего изобретения. Специалистам в области техники очевидно, что аналогичным образом, описанным на примере сиаловой кислоты, можно активировать и дериватизовывать другие различные сахарные группы. Например, существует множество способов модификации галактозы, глюкозы, Ν-ацетилгалактозамина и фукозы и других углеводных субстратов, которые легко модифицируются способами, известными из уровня техники. См. например, Е1йа1аЬ1 е! а1., Сигг. Мей. СНет. 6:93 (1999) и 8сНаГег е! а1., I. 0гд. СНет. 65:24 (2000).
В примерном воплощении пептид О-С8Е, который модифицируется по способу согласно изобретению, представляет собой гликопептид, продуцируемый клетками млекопитающих (например, клетками СН0) или в трансгенном животном, и, таким образом, содержит не полностью сиализованные Ν- и/или 0-связанные олигосахаридные цепи. Олигосахаридные цепи гликопептида, не содержащие сиаловой кислоты и содержащие терминальный остаток галактозы, могут быть пэгилированы, ППГилированы или модифицированы каким-либо другим образом с помощью модифицированной сиаловой кислоты.
На схеме 4 на аминогликозид 1 воздействуют активным эфиром - производным защищенной аминокислоты (например, глицина), при этом аминный остаток сахара превращается в соответствующий аддукт амида защищенной аминокислоты. Далее на аддукт воздействуют альдолазой с образованием αгидроксикарбоксилата 2. Соединение 2 превращается в соответствующее производное СМР путем воздействия СМР-8А-синтетазы, с последующей каталитической гидрогенизацией производного СМР с получением соединения 3. Амин, введенный во время образования аддукта глицина, используется в качества места присоединения РЕО путем реакции соединения 3 с активированным производным РЕО или РРО (например, РЕС-С(0)ХН8, РЕО-0С(0)0-п-нитрофенил), что приводит к получению соединений 4 и 5 соответственно.
Схема 4
1. СМР-2А-синтетаза, СТР
2. Н2/Р<1/С
СМР-8А-5-МНСОСН2МН—С(О)О-РЕО
В табл. 3 приведены примеры типичных монофосфатов сахаров, дериватизованных молекулой РЕО. Некоторые соединения, приведенные в табл. 3, получены способом, приведенным на схеме 4. Другие производные получены способами, известными из уровня техники. См., например, Керр1ег е! а1., С1усоЫо1о§у. 11:11Я (2001) и Сйайет е! а1., 61усоЬю1о§у. 10:1049 (2000). Другие аминные реактивные аналоги РЕО и РРО имеются в продаже или могут быть получены способами, легкодоступными для специалистов в области техники.
- 51 017770
Таблица 3
АсМН
АсМН
Модифицированные фосфаты сахаров, применимые в настоящем изобретении, могут быть замещены в других положениях, так же как и в приведенных выше. Предпочтительные в настоящее время замещения сиаловой кислоты приведены в формуле
где X означает связывающую группу, предпочтительно выбираемую из -Ο-, -Ν(Η)-, -8, СН2- и -Ν(Β)2, в которой каждый В независимо выбирается из В!-В5;
каждый из символов Υ, Ζ, А и В означает группу, выбранную из группы, приведенной выше для X;
каждый из X, Υ, Ζ, А и В выбирается независимо, и, таким образом, они могут быть идентичными или различаться;
символы В1, В2, В3, В4 и В5 означают Н, молекулу РЕС, лекарственное вещество, биомолекулу или другое вещество. В качестве альтернативы эти символы означают линкер, связанный с молекулой РЕС, лекарственным веществом, биомолекулой или другим веществом.
Примерные вещества, присоединенные к конъюгатам, раскрываемым в настоящем описании, включают, но не ограничиваются, производные РЕС (например, ацил-РЕС, ацил-алкил-РЕС, алкил-ацил-РЕС, карбамоил-РЕС, арил-РЕС), производные РРС (например, ацил-РРС, ацил-алкил-РРС, алкил-ацил-РРС, карбамоил-РРС, арил-РРС), лекарственные вещества, диагностические вещества, маннозо-6-фосфат, гепарин, гепаран, 8ЬЕХ, маннозу, маннозо-6-фосфат, 81а1у1 Ьевдк X, ЕСЕ, УЕСЕ, белки, хондроитин, кера
- 52 017770 тан, дерматан, альбумин, интегрины, антеннальные олигосахариды, пептиды и др. Способы конъюгирования различных модифицирующих групп к сахаридной группе легко доступны специалистам в области техники (ΡΟΕΥ(ΕΤΗΥΕΕΝΕ ΟΕΥίΌΕ С1ΙΕΜΙ8ΤΚΥ: ВЮТЕСНМСАЬ ΑΝΏ В1ОМЕО1САЕ АРРиСАПО^, под ред. I. М11Ю11 Натк, Р1епит РиЬ. ^гр., 1992; ΙΌΕΥίΕΊΉΥΕΕΥΕ СЕ¥СОЕ) СНЕМ1САЬ ΛΝΩ В1ОЬОС1САЬ АРРЬ1САТ1О№, под ред. I. Μί11οπ Натк, АС8 8утрοк^ит 8епек Νο. 680, Атепсап СНеш1са1 8οс^еΐу, 1997; Неталто^ ΒIΟСΟN^υСАΤΕ ΤΕ^ΝΐρυΕ8, Асабеш1с Ргекк, 8ап Эхе^, 1996 и Оипп е! а1., Εύδ. РΟ^ΥΜΕКIС ΌΚυ68 ΛΥΌ ΌΚυΟ ΌΕΕίνΕΚΥ 8Υ8ΤΕΜ8, АС8 8утрοк^ит 8епек. νο1. 469, Атепсап СНеш1са1 8οс^еΐу, ^акЫпдпп, Ό. С. 1991).
Линкерные группы (группы, образующие поперечные сшивки).
Получение модифицированных сахаров для использования в способах согласно настоящему изобретению включает присоединение молекулы ΡΕΟ к остатку сахара и предпочтительному образованию стабильного аддукта, который является субстратом для гликозилтрансферазы. Таким образом, часто предпочтительно использовать линкер, например линкер, образованный путем реакции ΡΕΟ и сахарной группы с агентом, образующим поперечные сшивки, для конъюгации ΡΕΟ и сахара. Примерные бифункциональные соединения, которые могут использоваться для присоединения модифицирующих групп к углеводным группам, включают, но не ограничиваются, бифункциональные полиэтиленгликоли, полиамиды, полиэфиры, полиэстеры и др. Из литературных данных известны общие подходы к связыванию углеводов с другими молекулами. См., например, Ьее е! а1., ВюсЕеш1к!гу. 28:1856 (1989); ВЕаЕа е! а1., Апа1. ВюсЕет. 178:408 (1989); 1апЕа е! а1., I. Ат. СНет. 8ο^ 112:8886 (1990) и ВеЕпагкИ е! а1., \УО 92/18135. В обсуждении, приведенном ниже, считается, что реактивные группы не ухудшают свойств сахарной группы вновь образованного модифицированного сахара. Предмет обсуждения выбран для ясности изложения. Специалисту в области техники очевидно, что обсуждение также относится к реактивным группам на модифицирующей группе.
Для модификации компонентов модифицированного сахара с помощью внутримолекулярных химических поперечных сшивок используются различные реагенты (см. обзоры реагентов и процедур для образования поперечных сшивок νο1Ε, Р., Ме!Н. Εηζутο1. 25:623-651, 1972; ^ее!а11, Н.Н., апЕ Сοοпеу, Б.А., в ΕΝΖΥΜΕ8 А8 ΌΚυ68. (под ред. ^кепЬег^ и ^Ьейк), р. 395-442, №11еу, Уем ΥοΑ, 1981; Ιί Т.Н., Ме!Н. Εпζутο1. 91:580-609, 1983; МаЕтоп е! а1., Μο1. Вю1. Кер. 17:167-183, 1993, каждый из которых включен в настоящую публикацию посредством ссылки). Предпочтительные реагенты, образующие поперечные сшивки, получают из различных образующих поперечные сшивки реагентов нулевой длины и гомобифункциональных и гетеробифункциональных реагентов, образующих поперечные сшивки. Образующие поперечные сшивки реагенты нулевой длины включают прямую конъюгацию двух присутствующих химических групп без внесения дополнительного материала. К этой категории принадлежат агенты, катализирующие образование дисульфидной связи. Другим примером являются реагенты, индуцирующие конденсацию карбоксильной группы и первичной аминогруппы с формированием амидной связи, такие как карбодиимиды, этилхлорформат, К-реагент Вудворда (2-этил-5-фенилизоксазолий-3'сульфонат) и карбонилдиимидазол. Помимо этих химических реагентов, в качестве образующего поперечные сшивки реагента нулевой длины может выступать фермент трансглютаминаза (глютамил-пептид γ-глютамилтрансфераза; ЕС 2.3.2.13). Этот фермент катализирует реакцию переноса ацила на карбоксамидные группы глютаминильных остатков, связанных с белком, обычно используя первичную аминогруппу в качестве субстрата. Предпочтительные гомо- и гетеробифункциональные реагенты содержат два идентичных или различающихся сайта соответственно, которые могут быть реактивными в отношении амино-, сульфгидрильных, гуанидиновых, индольных или неспецифических групп.
Свертывание нерастворимого С-С8Р.
Многие рекомбинантные белки, экспрессирующиеся в бактериях, экспрессируются в виде нерастворимых агрегатов в бактериальных тельцах включения. Тельца включения представляют собой белковые отложения, обнаруживаемые в цитоплазме и периплазме бактерий (см., например, С1агк, Сиг. Ор. Вю!есЕ. 12:202-207 (2001)). Рекомбинантные белки С-С8Р экспрессируются в бактериальных тельцах включения, и в настоящей публикации представлены способы свертывания таких белков, позволяющие получить активные белки С-С8Р.
Условия для свертывания активного С-С8Р.
Чтобы получить активные белки С-С8Р из бактериальных клеток, белки С-С8Р экспрессируются в бактериальных тельцах включения. Бактерии собирают, подвергают разрушению и тельца включения изолируют и промывают. В одном воплощении проводят три промывки: первая промывка буфером с рН 6,0-9,0, содержащим моновалентную соль, например хлорид натрия; неионный детергент, например ΤπΙοπ Х-100; ионный детергент, например дезоксихолат натрия; и ЭДТА; вторая промывка буфером, не содержащим детергента, и третья промывка Н2О. Далее, белки, находящиеся в тельцах включения, солюбилизируют. Солюбилизация может осуществляться с использованием денатурантов, гуанидилхлорида или мочевины; экстремальных значений рН или детергентов или любых комбинаций вышеприведенных воздействий. В одном воплощении для солюбилизации С-С8Р используют 5-6 М гуанидин НС1 или мочевину. В другом воплощении добавляют ΌΤΤ.
- 53 017770
После солюбилизации денатуранты удаляют из белковой смеси, содержащей С-С8Е. Удаление денатурантов может проводиться с помощью различных способов, включая перевод в буфер для свертывания или замену буфера. Способы замены буфера включают диализ, диафильтрацию, гель-фильтрацию и иммобилизацию белка на твердой подложке (см., например, С1агк, Сиг. Ор. В1о!еск. 12:202-207 (2001)). Для удаления денатурантов можно комбинировать любые из вышеперечисленных способов.
Образование дисульфидных связей в белках С-С8Е стимулируется добавлением буфера для свертывания, содержащего пару окислитель-восстановитель. Пары окислитель-восстановитель включают восстановленный и окисленный глютатион (-18Е-1/С88С), цистеин/цистин, цистеамин/цистамин, ЭТТ/С88С и ЭТЕ/С88С (см., например, С1агк, Сиг. Ор. Вю1ес11. 12:202-207 (2001)). В одном воплощении пара окислитель-восстановитель представляет собой С8Н/С88С в соотношении 10:1.
Свертывание может проводиться в буферах с рН в интервале, например, от 6,0 до 10,0. Буферы для свертывания могут включать другие добавки для облегчения свертывания, например Ь-аргинин (0,4-1 М); РЕС; низкие концентрации денатурантов, такие как мочевина (1-2 М) и гуанидин хлорид (0,51,5 М); и детергенты (например, СНарк, δΌδ, СТАВ, лаурил мальтозид, Т\гееп 80 и Тгйоп Х-100).
После свертывания белок С-С8Е можно диализовать с целью удаления пары окислительвосстановитель или других нежелательных компонентов буфера. В одном воплощении диализ проводят с использованием буфера, содержащего ацетат натрия, глицерин и неионный детергент, например Тгееп80. После диализа белок С-С8Е может подвергаться дальнейшей очистке и/или концетрированию с помощью ионообменной хроматографии. В одном воплощении используется катионообменная смола 8Р-сефароза.
Специалисту в области техники понятно, что белок свернут правильно, если свернутый белок обладает детектируемой биологической активностью. Для белка С-С8Е активность может быть измерена различными методами. Например, биологически активные белки С-С8Е являются субстратами О-связанного гликозилирования, описанного в заявках на патент США 60/535284, поданной 8 января 2004 г.; 60/544411, поданной 12 февраля 2004 г.; и нотариальном реестре № 019957-018820И8, поданном 2 февраля 2004 г., содержание которых включено в настоящую публикацию посредством ссылки для любых целей. Активность белка С-С8Е также может измеряться с помощью анализа пролиферации клеток или анализа белых кровяных клеток у крыс (также описано в заявках на патент США 60/535284, поданной 8 января 2004 г.; 60/544411, поданной 12 февраля 2004 г.; и нотариальном реестре № 019957-018820И8, поданном 2 февраля 2004 г., содержание которых включено в настоящую публикацию посредством ссылки для любых целей). Анализ пролиферации клеток и анализ белых кровяных клеток могут проводиться до или после О-связанного гликозилирования свернутых белков С-С8Е.
Способы выделения конъюгатов согласно изобретению.
В качестве альтернативы продукты, полученные в результате вышеописанных процессов, могут применяться без очистки. Однако обычно предпочтительно выделение продукта. Могут использоваться стандартные хорошо известные способы выделения гликозилированных сахаридов, такие как тонкослойная или толстослойная хроматография, колоночная хроматография, ионообменная хроматография или мембранная фильтрация. Предпочтительно для выделения использовать мебранную фильтрацию, более предпочтительно с применением обратноосмотической мембраны, или одну или более техник колоночной хроматографии, как обсуждается ниже в настоящем описании, а также в литературе, цитируемой в настоящем описании. Например, для удаления белков, таких как гликозилтрансферазы, может использоваться мембранная фильтрация, где мембраны имеют отсечку по молекулярной массе от приблизительно 3000 до приблизительно 10000. Далее для удаления солей и/или очистки сахаридного продукта может использоваться нанофильтрация или обратный осмос (см., например, АО 98/15581).
Нанофильтрационные мембраны представляют собой класс обратно осмотических мембран, пропускающих моновалентные соли, но задерживающих поливалентые соли и незаряженные растворенные вещества больше от приблизительно 100 до приблизительно 2000 Да, в зависимости от используемой мембраны. Таким образом, в обычном применении сахариды, полученные с помощью способов согласно настоящему изобретению, будут задерживаться мембраной, а примесные соли проходить через мембрану.
Если модифицированный гликопротеин производится внутри клетки, то на первой стадии удаляют дебрис, т.е. клетки-хозяева или лизированные фрагменты, например, с помощью центрифугирования или ультрафильтрации; белок может быть необязательно концентрирован с помощью имеющегося в продаже фильтра для концентрации белка с последующим отделением полипептидного варианта от примесей в течение одной или более стадий, выбираемых из иммуноаффинной хроматографии, разделения на ионообменной колонке (например, с диэтиламиноэтилом (ЭЕЛЕ) или матриксами, содержащими карбоксиметильные или сульфопропильные группы), хроматографии на В1ие-8ерйагоке, СМ В1ие-8ерйагоке, МО№О-ф, МО№О-8, 1епШ 1ес!ш-8ерНагоке, АСА-8ерНагоке, Соп А-8ерНагоке, ЕШег Тоуореаг1, Ви1у1 Тоуореаг1, РНепу1 Тоуореаг1 или рго!еш А 8ерйагоке, δΌδ-РАСЕ-хроматографии, силика-хроматографии, хроматофокусирования, обратнофазной ВЭЖХ (например, силикагель с присоединенными алифатическими группами), гель-фильтрацию с использованием, например, молекулярного сита 8ерйракех или эксклюзионной хроматографии, хроматографии на колонках, селективно связывающих полипептид, и
- 54 017770 осаждения этанолом или сульфатом аммония.
Модифицированные гликопептиды, продуцируемые в культуре, обычно выделяют путем первичной экстракции из клеток, ферментов и т.д. с последующими одной или более стадиями концентрации, высаливания, водной ионообменной или эксклюзионной хроматографии. Модифицированный гликопротеин может быть дополнительно очищен с помощью аффинной хроматографии. Наконец, на финальных стадиях очистки может применяться ВЭЖХ.
На любой из вышеперечисленных стадий может добавляться ингибитор протеаз, например фенилметилсульфонилфторид (РМ8Р) для ингибирования протеолиза, а также антибиотики для предотвращения роста случайных контаминатнов.
В другом воплощении супернатанты из систем, продуцирующих модифицированный гликопептид согласно изобретению, сначала концентрируют, используя имеющийся в продаже фильтр для концентрации белков, например блок для ультрафильтрации Аписон или Мййроге РеШсоп. После стадии концентрации концентрат может быть нанесен на подходящий матрикс для очистки. Например, подходящий аффинный матрикс может содержать лиганд пептида, молекулу лектина или антитела, связанную с подходящей подложкой. В качестве альтернативы может использоваться анионообменная смола, например матрикс или субстрат с подвешенными группами ЭЕЛЕ. Подходящие матриксы включают акриламид, агарозу, декстран, целлюлозу или другие, обычно используемые в процессе очистки белков. В качестве альтернативы может использоваться катионообменная стадия. Подходящие катионообменники включают различные нерастворимые матриксы, содержащие сульфопропильные или карбоксиметильные группы. Особенно предпочтительны сульфопропильные группы.
Наконец, для дальнейшей очистки композиции, содержащей полипептидный вариант, может использоваться одна или более стадий ВЭЖХ, использующий гидрофобные среды КР-НРЬС, например силикагель с подвешенными метильными или другими алифатическими группами. Некоторые или все вышеперечисленные стадии очистки в различных комбинациях также могут применяться для получения гомогенного модифицированного гликопротеина.
Модифицированный гликопротеин согласно изобретению, полученный путем крупномасштабной ферментации, можно очищать способами, аналогичными описанным в работе Ьгйа1 е! а1., 1. СНготаЮд. 296:171 (1984). В этой ссылке описаны две последовательные стадии КР-НРЬС для очистки рекомбинантного человеческого 1Ь-2 на препаративной ВЭЖХ-колонке. В качестве альтернативы для очистки модифицированного гликопротеина могут использоваться такие техники, как аффинная хроматография.
Фармацевтическая композиция.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция. Фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый разбавитель и ковалентный конъюгат неприродных молекулы РЕС, лекарственного вещества или биомолекулы и гликозилированного или негликозилированного пептида. Полимер, лекарственное вещество или биомолекула конъюгированы с пептидом С-С8Р через интактную гликозильную связывающую группу, расположенную между и ковалентно связанную с пептидом С-С8Р, и также с полимером, лекарственным веществом или биомолекулой.
Фармацевтическе композиции согласно изобретению применимы в различных системах доставки лекарств. Препараты, применимые в настоящем изобретении, описаны в КенипЦопА РНагтасен11са1 8с1епсе5, Масе РнЫЫнпд Сотрапу, РШайефЫа, РА, 17'1' ей. (1985). Краткий обзор способов доставки лекарств см. в публикации Ьапдег, 8с1епсе. 249:1527-1533 (1990).
Фармацевтические композиции могут составляться для любого подходящего способа введения, включая, например, местное, пероральное, назальное, внутривенное, интракраниальное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно представляет собой воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения может использоваться любой из вышеперечисленных носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. Также в качестве носителя фармацевтической композиции согласно изобретению могут использоваться подходящие биоразрушаемые микросферы (например, полилактат полигликолат). Соответствующие биоразрушаемые микросферы раскрываются, например, в патентах США № 4897268 и 5075109.
Обычно фармацевтические композиции вводятся парентеральным путем, например внутривенно. Таким образом, в настоящем изобретении представлены композиции для парентерального введения, содержащие вещество, растворенное или суспендированное в подходящем носителе, предпочтительно водном носителе, например в воде, буфере, физиологическом растворе, РВ8 и др. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые дополнительные вещества, требуемые для достижения условий, близких к физиологическим, такие как регуляторы рН и буферы, регуляторы тоничности, смачивающие агенты, детергенты и др.
Эти композиции могут стерилизоваться с помощью общепринятых техник стерилизации или пропускаться через стерилизующий фильтр. Полученные водные растворы могут упаковываться для использования как есть или в лиофилизированной форме, в этом случае лиофилизированный препарат объединяется со стерильным водным носителем перед введением. рН препаратов обычно находится в интервале
- 55 017770 от 3 до 11, более предпочтительно от 5 до 9 и наиболее предпочтительно от 7 до 8.
В некоторых воплощениях гликопептиды согласно изобретению могут включаться в липосомы, образованные стандартными липидами, образующие везикулы. Существуют различные способы получения липосом, описанные, например, в работе 8хока е! а1., Апп. Кес. Вюркуз. Вюепд. 9:467 (1980) и патентах США № 4235871, 4501728 и 4837028. Нацеливание липосом с использованием различных нацеливающих агентов (например, сиалилгалактозиды согласно изобретению) хорошо известно из уровня техники (см., например, патенты США № 4957773 и 4603044).
Для связывания нацеливающих агентов с липосомами могут использоваться стандартные способы. Эти способы обычно включают встраивание в липосомы липидных компонентов, таких как фосфатитилэтаноламин, которые могут быть активированы для присоединения нацеливающих агентов или дериватизованных липофильных соединений, таких как гликопептиды, дериватизованные липидами согласно изобретению.
Для функционирования нацеливающих механизмов обычно необходимо, чтобы нацеливающие агенты находились на поверхности липосомы таким образом, чтобы нацеливающие группы могли взаимодействовать со своей мишенью, например с рецептором на клеточной поверхности. Углеводы согласно изобретению можно присоединить к молекуле липида до образования липосомы, используя способы, известные специалистам в области техники (например, алкилирование или ацилирование гидроксильной группы на углеводе длинноцепочечным алкилгалидом или жирной кислотой соответственно). В качестве альтернативы липосома может формироваться таким образом, что соединительная часть встраивается в мембрану во время формирования мембраны. Соединительная часть должна включать липофильную часть, встраивающуюся и жестко закрепляющуюся в мембране. Она также должна включать реактивную часть, химически доступную на поверхности липосомы, контактирующей с водной средой. Реактивная часть выбирается таким образом, что она подходит с химической точки зрения для образования стабильной химической связи с нацеливающим агентом или углеводом, присоединяемым позднее. В некоторых случаях возможно прямое присоединение нацеливающего агента к соединительной молекуле, но в большинстве случаев удобнее использовать третью молекулу в качестве химического мостика, связывая таким образом соединительную молекулу, находящуюся в мембране, с нацеливающим агентом или углеводом в трехмерном пространстве, а не на поверхности везикулы.
Соединения, полученные способами согласно изобретению, также могут оказаться применимыми в качестве диагностических реагентов. Например, могут использоваться меченые соединения для локализации места воспаления или опухолевых метастаз у пациента, у которого подозревается воспаление. Для такого применения соединения могут быть помечены 125Ι, 14С или тритием.
Активным ингредиентом в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению является гликопэгилированный С-С8Р и его производные, обладающие биологическими свойствами фолликулостимулирующего гормона, например стимулирующие овуляцию. Предпочтительно, чтобы композиция согласно изобретению, содержащая С-С8Р, вводилась парентерально (например, внутривенно, внутримышечно, подкожно или внутрибрюшинно). Ожидается, что эффективные дозировки будут сильно варьировать в зависимости от заболевания, подвергающегося лечению, и пути введения, но будут находиться в интервале от 0,1 (приблизительно 7 Ед) до 1000 мкг/кг (приблизительно 7000 Ед) веса тела для активного вещества. Предпочтительные дозировки для лечения анемических состояний составляют от приблизительно 50 до приблизительно 300 Ед/кг три раза в неделю. Поскольку в настоящем изобретении представлен С-С8Р, обладающий повышенным временем пребывания ш νί\Ό, при введении композиции согласно изобретению указанные дозировки могут быть снижены.
Дозированные формы.
В предпочтительных аспектах в соответствии с любым вышеописанным способом пептидные конъюгаты согласно изобретению, используемые для лечения заболевания, относящегося к гематопоэзу или миелосупрессии, предоставляются в виде дозированных форм для перорального введения. В предпочтительных воплощениях эти дозированные формы для перорального введения включают следующие компоненты: (а) пептид, представляющий собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и водорастворимого полимера, где водорастворимый полимер ковалентно присоединен к пептиду С-С8Р у гликозильного или аминокислотного остатка пептида С-С8Р посредством интактной гликозильной связывающей группы; (Ь) одно или более поверхностно-активное вещество; (с) одну или более жирных кислот и (б) кишечно-растворимый материал. В особенно предпочтительных воплощениях пептид, поверхностноактивные вещества и жирные кислоты смешивают в жидкой фазе и лиофилизируют перед объединением с кишечно-растворимым материалом.
Следует понимать, что примеры и воплощения, описанные в настоящей публикации, приводятся исключительно в целях иллюстрации и что, в свете этого, различные модификации и изменения, предлагаемые специалистам в области техники, включаются в сущность и объем настоящего изобретения и охватываются приведенной формулой изобретения. Все публикации, патенты и заявки на патент, цитируемые в настоящем описании, полностью включены в него посредством ссылки для любых целей.
Нижеследующие примеры приведены для иллюстрации композиций и способов согласно настоящему изобретению и не ограничивают заявленное изобретение.
- 56 017770
Примеры
Пример 1. Данные фармакодинамики на примере подсчета нейтрофилов в ответ на пептидный конъюгат С-С8Е согласно изобретению.
Исследования фармакодинамики на примере подсчета нейтрофилов в ответ на конъюгаты С-С8Е согласно изобретению и имеющегося в продаже С-С8Е нейласта показали, что композиции согласно изобретению имели сходный с нейластой период действия (фиг. 1) в одинаковой концентрации. Количество нейтрофилов зависело от дозы - повышающиеся концентрации конъюгатов С-С8Е согласно изобретению (глико-РЕС С-С8Е) приводили к повышению количества нейтрофилов на пике периода действия. Глико-РЕС С-С8Е индуцировал ответ, примерно на 30% выше по сравнению с нейластой, что указывает на повышенную на 60% биодоступность глико-РЕС С-С8Е по сравнению с нейластой при сравнимых дозах.
Исследование включало 53 субъекта. В каждой дозовой группе было по 20 субъектов, из которых 15, определенных случайным образом, получали глико-РЕС С-С8Е, а 5 - нейласту. В общем, глико-РЕС С-С8Е переносился хорошо, профиль побочных эффектов был сходен с таковым для нейласты. Не было ни одного прекращения исследования по причине побочных эффектов. Также не было ни одного случая серьезных побочных эффектов. Кроме того, не было выявлено антител к глико-РЕС С-С8Е.
В табл. 4 приведены репрезентативные данные по трем различным концентрациям глико-РЕС С-С8Е за период времени от 24 до 168 ч после введения глико-РЕС С-С8Е.
Таблица 4
Чаем Глико-РЕ© &—СЗЕ (100 мкг) Глико-ΡΕβ в-С5Е (50 Мкг) ГЛИКО-РЕЕ 6-СЗЕ (25 мкг)
24 26, 0778 27,8917 25, 825
72 35,222 31,5167 16,550
96 36, 9222 23,7667 12,4625
144 24,2667 19, 625 11,7625
168 22,9556 16,8167 12,3625
Пример 2. Данные фармакодинамики на примере подсчета клеток ί.Ό34+ в ответ на пептидный конъюгат С-С8Е согласно изобретению.
Исследования фармакодинамики на примере подсчета клеток ί.Ό34+ в ответ на конъюгаты С-С8Е согласно изобретению (глико-РЕС С-С8Е) и имеющегося в продаже С-С8Е нейласта показали, что композиции согласно изобретению имели сходный с нейластой период действия (фиг. 2) в одинаковой концентрации. Глико-РЕС С-С8Е индуцировал значительно большее количество клеток СЭ34+ на пике своей активности, чем нейласта в той же концентрации.
Количество клеток зависело от дозы - повышающиеся концентрации глико-РЕС С-С8Е приводили к повышению количества клеток ί.Ό34+ на пике периода действия.
В табл. 5 приведены репрезентативные данные по трем различным концентрациям глико-РЕС СС8Е за период времени от 72 до 168 ч после введения глико-РЕС С-С8Е.
Таблица 5
Пример 3. Данные фармакодинамики на примере подсчета нейтрофилов в ответ на пептидный конъюгат С-С8Е согласно изобретению: исследование фиксированной дозы.
Исследования фармакодинамики на примере подсчета нейтрофилов в ответ на фиксированные дозы конъюгатов С-С8Е согласно изобретению (глико-РЕС С-С8Е) и имеющегося в продаже С-С8Е нейласта показали, что композиции согласно изобретению имели сходный с нейластой период действия (фиг. 4) в одинаковой концентрации. Глико-РЕС С-С8Е индуцировал ответ примерно на 30% выше по сравнению с нейластой, что указывает на повышенную на 60% биодоступность глико-РЕС С-С8Е по сравнению с нейластой при исследуемой дозе.
В исследовании принимали участие 36 здоровых субъектов. В общем, глико-РЕС С-С8Е переносился хорошо, побочные эффекты были сходны с таковыми для нейласты. Не было ни одного прекращения исследования по причине побочных эффектов и также не было ни одного случая серьезных побочных эффектов. Кроме того, не было выявлено антител к глико-РЕС С-С8Е.
- 57 017770
Пример 4. Данные фармакодинамики на примере подсчета клеток СБ34+ в ответ на пептидный конъюгат С-С8Е согласно изобретению: исследование фиксированной дозы.
Исследования фармакодинамики на примере подсчета клеток СБ34+ в ответ на фиксированные дозы конъюгатов С-С8Е согласно изобретению (глико-РЕС С-С8Е) и имеющегося в продаже С-С8Е нейласта показали, что композиции согласно изобретению имели сходный с нейластой период действия (фиг. 5).
Пример 5. Мобилизация аллогенных/аутологичных предшественников клеток СБ34+ в периферической крови.
Донорам костного мозга вводили 10-20 мкг/кг гликопэгилированного С-С8Е (глико-РЕС С-С8Е) в течение 5 дней для повышения уровня клеток СБ34+ со значений, характерных для состояния покоя (приблизительно 2 клетки/мкл) до приблизительно 10 клеток/мкл, что достаточно для получения 2-4х106 клеток СБ34+/кг в ходе однократного афереза. Доноры костного мозга могут быть аллогенными (отличными от реципиента) или аутологичными (идентичными реципиенту).

Claims (42)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ повышения продукции стволовых клеток у донора, где указанный способ включает введение указанному донору эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы.
  2. 2. Способ по п.1, где указанная полимерная модифицирующая группа представляет собой водорастворимый полимер.
  3. 3. Способ по п.2, где указанный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
  4. 4. Способ по п.2, где указанный водорастворимый полимер выбирается из линейного водорастворимого полимера и разветвленного водорастворимого полимера.
  5. 5. Способ по п.1, где указанная полимерная модифицирующая группа и указанная гликозильная связывающая группа ковалентно соединены посредством линкера.
  6. 6. Способ по п.5, где указанная гликозильная связывающая группа включает модифицированный остаток сиаловой кислоты и где указанный модифицированный остаток сиаловой кислоты имеет структуру согласно формуле
    СОО' где К означает указанную полимерную модифицирующую группу, указанная полимерная модифицирующая группа присоединена к указанному остатку сиаловой кислоты посредством указанного линке ра.
  7. 7. Способ по п.6, где указанный модифицированный остаток сиаловой кислоты имеет структуру согласно формуле
    СОО·
    НО Жл Η<'ο4^'°Ρ^οΛ'ΗΝ·χν'ΗΝ 0Н п о где п означает целое число от 1 до 2000.
  8. 8. Способ по п.1, где указанная полимерная модифицирующая группа имеет, по существу, гомодис персное распределение молекулярных масс.
  9. 9. Способ по п.1, где указанная гликозильная связывающая группа содержит модифицированный остаток сиаловой кислоты, имеющий формулу
    Э 7 7 7 7 где К представляет собой Н, СН2ОК , СООК или ОК , К означает Н, замещенный или незамещенный алкил или замещенный или незамещенный гетероалкил;
    К3 и К4 независимо выбраны из Н, замещенного или незамещенного алкила, ОК8, NНС(О)К9 * * * * * *, К8 и К9 независимо выбраны из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила или сиаловой кислоты;
    Ьа означает линкер, выбранный из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;
    К16 и К17 означают независимо выбранные полимерные плечи;
    X2 и X4 означают независимо выбранные связывающие фрагменты, соединяющие полимерные группы К16 и К17 с С; и
    X5 * * представляет собой нереактивную группу.
  10. 10. Способ по п.1, где указанный аминокислотный остаток выбирается из серина и треонина.
  11. 11. Способ по п.1, где указанный пептид С-С8Р имеет аминокислотную последовательность
    8ЕО ΙΌ ^:1.
  12. 12. Способ по п.11, где указанный аминокислотный остаток представляет собой треонин в положении 134 8ЕО ΙΌ ^:1.
  13. 13. Способ по п.6, где указанная гликозильная связывающая группа содержит субструктуру, выби- раемую из
    - 67 017770 ζ----(ОаШАс)р—(Оа()д—К15 ?----<Са1МАс>р—(<3а1)ч—50---К15
    5 и Ь где В15 означает указанный модифицированный остаток сиаловой кислоты и р и с.| означают независимые целые числа, выбираемые из 0 или 1.
  14. 14. Способ по п.13, где д равняется 0.
  15. 15. Способ по п.6, где указанная гликозильная связывающая группа имеет формулу, выбираемую из кЛАА ιΛΑΑ
    Мап---(ΘΙοΝΑο—6а1)р-Р15 (ΘΙοΝΑο—Са!к—Р1®
    Мап---(С1сЫАс—Оа1)р—Р15'
    Мал--- (С1сЫАс—Са1)р—К15 (01сЫАс—<3а1)р—К15 (С1сШс-Са1)„-К15 (С1сЫАс—©а1к—Р15
    ΘΙοΝΑό—Са1)р-К15
    Мап---(С1сЫАс—Са1)р-К15
    ΟΙοΝΑο—Мап—(ΟΙοΝΑο—6а1)р-К15
    Мал--- ΘΙοΝΑο—6а!
    (ΟΙοΝΑο—Са1)р—К15 где АА означает аминокислотный остаток указанного пептида;
    ΐ означает целое число, равное 0 или 1;
    р означает целое число от 1 до 10 и
    В15 выбирается из Н, ОН, сиаловой кислоты, указанного модифицированного сиалильного остатка и 81а-81ар, 81ар означает указанный сиалильный остаток, где по меньшей мере один В15 выбирается из указанного модифицированного сиалильного остатка и 81а-81ар.
  16. 16. Способ по п.15, где указанный аминокислотный остаток представляет собой остаток аспарагина.
  17. 17. Способ увеличения числа гранулоцитов у субъекта, где указанный субъект подходит для трансплантации костного мозга, где указанный способ включает введение указанному субъекту эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы, где указанный пептид С-С8Е имеет аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕЦ ΙΌ NО:1, и где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду С-С8Е в области указанного пептида С-С8Е, начинающейся глицином в положении 126 и заканчивающейся серином в положении 143.
  18. 18. Способ повышения продукции стволовых клеток у субъекта, где указанный способ включает введение указанному субъекту эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы, где указанный пептид С-С8Е включает структуру согласно формуле .АЛЛА
    I —ΊΊ1Γ134—о—6а1ИАс_(Са1)с(“3|а~РЕС где д равно 0 или 1 и
    - 68 017770
    81а-РЕС имеет структуру согласно формуле где п означает целое число от 1 до 2000.
  19. 19. Способ по п.18, где п означает целое число от 400 до 500.
  20. 20. Способ по п.18, где указанный пептид С-С8Е имеет аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ №О:1.
  21. 21. Способ предотвращения, лечения или ослабления миелосупрессии, обусловленной противораковой терапией, где указанный способ включает введение реципиенту указанной противораковой терапии эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы.
  22. 22. Способ по п.21, где указанная противораковая терапия выбирается из радиационной терапии и химиотерапии.
  23. 23. Способ по п.21, где указанная полимерная модифицирующая группа и указанная гликозильная связывающая группа ковалентно соединены посредством линкера.
  24. 24. Способ по п.23, где указанная гликозильная связывающая группа представляет собой остаток сиаловой кислоты, где указанный остаток сиаловой кислоты имеет структуру согласно формуле
    ООО’ где К означает указанную полимерную модифицирующую группу, указанная полимерная модифицирующая группа присоединена к указанному остатку сиаловой кислоты посредством указанного линке ра.
  25. 25. Способ лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в лечении, где указанное заболевание характеризуется подавлением продукции белых кровяных клеток у указанного субъекта, где указанный способ включает стадию введения указанному субъекту некоторого количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы, где указанное количество эффективно для облегчения указанного заболевания у указанного субъекта.
  26. 26. Способ по п.25, где указанное подавление продукции белых кровяных клеток обусловлено химиотерапией, радиационной терапией или идиопатической тромбоцитопенической пурпурой.
  27. 27. Способ лечения нейтропении у млекопитающего, включающий введение фармацевтически эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно при соединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы.
  28. 28. Способ лечения тромбоцитопении у млекопитающего, включающий введение фармацевтически эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы.
  29. 29. Способ увеличения популяции кроветворных стволовых клеток в культуре, где указанный способ включает стадию добавления к указанным стволовым клеткам эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы.
  30. 30. Способ повышения гематопоэза у субъекта, где указанный способ включает стадию введения указанному субъекту эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Е и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы.
  31. 31. Способ увеличения количества кроветворных клеток-предшественников у субъекта, где указан
    - 69 017770 ный способ включает введение указанному субъекту эффективного количества пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы.
  32. 32. Способ по п.31, где указанные кроветворные клетки-предшественники представляют собой клетки СЭ34+.
  33. 33. Способ обеспечения длительного приживления трансплантата костного мозга, где указанный способ включает:
    (a) введение донору указанного костного мозга пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы;
    (b) выделение указанного костного мозга из указанного донора и (c) инфузию указанного костного мозга реципиенту.
  34. 34. Способ по п.33, где донор представляет собой то же лицо, что и реципиент.
  35. 35. Способ по п.34, где донор представляет собой лицо, отличное от реципиента.
  36. 36. Способ увеличения числа кроветворных клеток-предшественников у субъекта, где указанный способ включает введение указанному субъекту:
    (a) первой композиции, содержащей соединение формулы (1), представляющее 1,1'-1,4-фениленбис-(метилен)-бис-1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан (АМ03100); и (b) второй композиции, содержащей пептид, представляющий собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы.
  37. 37. Способ по п.36, где указанная первая композиция и указанная вторая композиция вводятся последовательно и в любом порядке.
  38. 38. Способ по п.36, где указанная первая композиция и указанная вторая композиция вводятся одновременно.
  39. 39. Способ по п.36, где указанные кроветворные клетки-предшественники представляют собой клетки СЭ34+.
  40. 40. Дозированная форма для перорального введения, включающая компоненты:
    (a) пептид, представляющий собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и водорастворимого полимера, где указанный водорастворимый полимер ковалентно присоединен к указанному пептиду С-С8Р у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида С-С8Р посредством интактной гликозильной связывающей группы;
    (b) поверхностно-активное вещество (вещества);
    (c) жирную кислоту (кислоты);
    (б) кишечно-растворимый материал, где указанные компоненты (а) (Ь) и (с) смешивают в жидкой фазе и лиофилизируют перед объединением с компонентом (б).
  41. 41. Способ повышения продукции стволовых клеток у донора, включающий введение указанному донору пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы, в количестве от 1 до 20 мг.
  42. 42. Способ повышения продукции стволовых клеток у донора, включающий введение указанному донору пептида, представляющего собой ковалентный конъюгат пептида С-С8Р и полимерной модифицирующей группы, где указанная полимерная модифицирующая группа ковалентно присоединена к указанному пептиду у гликозильного или аминокислотного остатка указанного пептида посредством гликозильной связывающей группы, в количестве, находящемся в единичной дозированной форме, выбираемой из 25, 50, 100 и 200 мкг/кг.
EA200970915A 2007-04-03 2008-04-01 Способы лечения с использованием гликопэгилированного g-csf EA017770B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90991707P 2007-04-03 2007-04-03
US91178807P 2007-04-13 2007-04-13
US98624007P 2007-11-07 2007-11-07
PCT/US2008/059045 WO2008124406A2 (en) 2007-04-03 2008-04-01 Methods of treatment using glycopegylated g-csf

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200970915A1 EA200970915A1 (ru) 2010-04-30
EA017770B1 true EA017770B1 (ru) 2013-03-29

Family

ID=39831541

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200970915A EA017770B1 (ru) 2007-04-03 2008-04-01 Способы лечения с использованием гликопэгилированного g-csf

Country Status (21)

Country Link
US (1) US9050304B2 (ru)
EP (1) EP2144923B1 (ru)
JP (3) JP2010523582A (ru)
KR (2) KR20100016160A (ru)
CN (1) CN101796063B (ru)
AU (1) AU2008237411B2 (ru)
BR (1) BRPI0809670A8 (ru)
CA (1) CA2682897C (ru)
CY (2) CY1114517T1 (ru)
DK (1) DK2144923T3 (ru)
EA (1) EA017770B1 (ru)
ES (1) ES2406267T3 (ru)
HR (1) HRP20130382T1 (ru)
IL (1) IL201203A (ru)
LT (1) LTC2144923I2 (ru)
NO (1) NO2014002I1 (ru)
NZ (1) NZ580030A (ru)
PL (1) PL2144923T3 (ru)
PT (1) PT2144923E (ru)
RS (1) RS52845B (ru)
WO (1) WO2008124406A2 (ru)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7157277B2 (en) * 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
ES2420581T3 (es) 2003-03-14 2013-08-26 Biogenerix Gmbh Polímeros solubles en agua ramificados y sus conjugados
SG155777A1 (en) 2003-04-09 2009-10-29 Neose Technologies Inc Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
ES2380093T3 (es) * 2003-05-09 2012-05-08 Biogenerix Ag Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento humana
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
NZ547168A (en) * 2003-11-24 2010-05-28 Biogenerix Ag Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2005056760A2 (en) * 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated follicle stimulating hormone
WO2005070138A2 (en) 2004-01-08 2005-08-04 Neose Technologies, Inc. O-linked glycosylation of peptides
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US20090292110A1 (en) * 2004-07-23 2009-11-26 Defrees Shawn Enzymatic modification of glycopeptides
WO2006031811A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
EP2586456B1 (en) 2004-10-29 2016-01-20 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
JP4951527B2 (ja) 2005-01-10 2012-06-13 バイオジェネリックス アーゲー 糖ｐｅｇ化顆粒球コロニー刺激因子
US20070154992A1 (en) 2005-04-08 2007-07-05 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20080255026A1 (en) 2005-05-25 2008-10-16 Glycopegylated Factor 1X Glycopegylated Factor Ix
EP1888098A2 (en) 2005-05-25 2008-02-20 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
US20110003744A1 (en) * 2005-05-25 2011-01-06 Novo Nordisk A/S Glycopegylated Erythropoietin Formulations
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
JP2009544327A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
NZ580030A (en) 2007-04-03 2012-06-29 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
JP5876649B2 (ja) 2007-06-12 2016-03-02 ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ ヌクレオチド糖の改良製造法
US7968811B2 (en) * 2007-06-29 2011-06-28 Harley-Davidson Motor Company Group, Inc. Integrated ignition and key switch
EA020069B1 (ru) 2007-08-27 2014-08-29 Биодженерикс Аг Жидкая лекарственная форма конъюгата
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
EP2626080A3 (en) 2008-02-27 2014-03-05 Novo Nordisk A/S Conjugated factor VIII molecules
AU2010248886A1 (en) * 2009-05-13 2011-12-01 The University Of North Carolina At Chapel Hill Cyclin dependent kinase inhibitors and methods of use
CA2768155C (en) * 2009-06-16 2016-08-23 The University Of Bath Materials and methods relating to glycosylation
WO2011101277A1 (en) 2010-02-16 2011-08-25 Novo Nordisk A/S Conjugated proteins
CN102892780B (zh) 2010-03-17 2015-07-29 通益制药有限公司 获得生物活性的重组人g-csf的方法
ES2959218T3 (es) * 2013-05-09 2024-02-21 Advanced Neuroregenerative Therapies Llc Composición para mejorar los niveles de biomarcadores anti-envejecimiento en un receptor
KR101623906B1 (ko) 2014-07-23 2016-05-24 주식회사 이큐스앤자루 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물
US11267858B2 (en) 2019-05-31 2022-03-08 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment using G-CSF protein complex
US11684655B2 (en) 2019-05-31 2023-06-27 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neutorpenia using G-CSF protein complex
US20230027238A1 (en) * 2019-12-04 2023-01-26 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment using g-csf protein complex

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070014759A1 (en) * 2003-12-03 2007-01-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor

Family Cites Families (400)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1479268A (en) 1973-07-05 1977-07-13 Beecham Group Ltd Pharmaceutical compositions
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
GB1451798A (en) 1973-08-02 1976-10-06 Ici Ltd Prostanoic acid derivatives
CH596313A5 (ru) 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
US4385260A (en) 1975-09-09 1983-05-24 Beckman Instruments, Inc. Bargraph display
US4414147A (en) 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4451566A (en) 1981-12-04 1984-05-29 Spencer Donald B Methods and apparatus for enzymatically producing ethanol
US4438253A (en) 1982-11-12 1984-03-20 American Cyanamid Company Poly(glycolic acid)/poly(alkylene glycol) block copolymers and method of manufacturing the same
DE3474632D1 (en) 1983-03-01 1988-11-24 Crc Ricerca Chim Pharmaceutical compositions containing the cytidine monophosphate of 5-acetamido-3,5-dideoxy-d-glycero-d-galactononulosaminic acid
DE3308806A1 (de) 1983-03-12 1984-09-13 Basf Ag, 6700 Ludwigshafen Fungizide mittel, substituierte glucopyranosylamine und verfahren zur bekaempfung von pilzen
JPS59172425A (ja) 1983-03-18 1984-09-29 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4565653A (en) 1984-03-30 1986-01-21 Pfizer Inc. Acyltripeptide immunostimulants
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4675414A (en) 1985-03-08 1987-06-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Maleimidomethyl-carbonate polyethers
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
EP0229108B1 (en) 1985-06-26 1990-12-27 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
JPS6238172A (ja) 1985-08-12 1987-02-19 株式会社　高研 抗血栓性医用材料の製造方法
SE451849B (sv) 1985-12-11 1987-11-02 Svenska Sockerfabriks Ab Sett att syntetisera glykosidiska bindningar samt anvendning av pa detta sett erhallna produkter
IT1213029B (it) 1986-01-30 1989-12-07 Bracco Ind Chimica Spa Chelati di ioni metallici paramagnetici.
US4767702A (en) 1986-02-06 1988-08-30 Cohenford Menashi A Paper strip assay for neisseria species
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US4925796A (en) 1986-03-07 1990-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US5272066A (en) 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
IL82834A (en) 1987-06-09 1990-11-05 Yissum Res Dev Co Biodegradable polymeric materials based on polyether glycols,processes for the preparation thereof and surgical artiicles made therefrom
US5153265A (en) 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8810808D0 (en) 1988-05-06 1988-06-08 Wellcome Found Vectors
US5169933A (en) 1988-08-15 1992-12-08 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5874261A (en) 1988-09-02 1999-02-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for the purification of glycosyltransferases
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
US5104651A (en) 1988-12-16 1992-04-14 Amgen Inc. Stabilized hydrophobic protein formulations of g-csf
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
US6166183A (en) 1992-11-30 2000-12-26 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
DE68925966T2 (de) 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
ATE176924T1 (de) 1988-12-23 1999-03-15 Genentech Inc Verfahren zur herstellung von menschlicher dnase
EP0454730A1 (en) 1989-01-19 1991-11-06 The Upjohn Company Somatotropin analogs
EP0456642A1 (en) 1989-01-31 1991-11-21 The Upjohn Company Somatotropin analogs
US5194376A (en) 1989-02-28 1993-03-16 University Of Ottawa Baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels
US5059535A (en) 1989-04-12 1991-10-22 Chembiomed, Ltd. Process for the separation and purification of sialyl transferases
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DK0470128T4 (da) 1989-04-19 2003-12-01 Enzon Inc Aktive polyalkylenoxidcarbonater til modifikation af polypeptider
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5342940A (en) 1989-05-27 1994-08-30 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US5182107A (en) 1989-09-07 1993-01-26 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
US5154924A (en) 1989-09-07 1992-10-13 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
US5527527A (en) 1989-09-07 1996-06-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
US5672683A (en) 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
US5032519A (en) 1989-10-24 1991-07-16 The Regents Of The Univ. Of California Method for producing secretable glycosyltransferases and other Golgi processing enzymes
US5312808A (en) 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
IL96477A0 (en) * 1989-12-01 1991-08-16 Amgen Inc Megakaryocyte production
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US5324663A (en) 1990-02-14 1994-06-28 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
US5595900A (en) 1990-02-14 1997-01-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
DE4009630C2 (de) 1990-03-26 1995-09-28 Reinhard Prof Dr Dr Brossmer CMP-aktivierte fluoreszierende Sialinsäuren sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
US5180674A (en) 1990-04-16 1993-01-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
US5583042A (en) 1990-04-16 1996-12-10 Neose Pharmaceuticals, Inc. Apparatus for the synthesis of saccharide compositions
GB9107846D0 (en) 1990-04-30 1991-05-29 Ici Plc Polypeptides
US5951972A (en) 1990-05-04 1999-09-14 American Cyanamid Company Stabilization of somatotropins and other proteins by modification of cysteine residues
US5399345A (en) 1990-05-08 1995-03-21 Boehringer Mannheim, Gmbh Muteins of the granulocyte colony stimulating factor
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
CU22302A1 (es) 1990-09-07 1995-01-31 Cigb Secuencia nucleotidica codificante para una proteina de la membrana externa de neisseria meningitidis y uso de dicha proteina en preparados vacunales
SK386392A3 (en) 1990-07-10 1994-08-10 Boehringer Ingelheim Int Interferon alpha
DE4028800A1 (de) 1990-09-11 1992-03-12 Behringwerke Ag Gentechnische sialylierung von glykoproteinen
US5410016A (en) 1990-10-15 1995-04-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers
US5529914A (en) 1990-10-15 1996-06-25 The Board Of Regents The Univeristy Of Texas System Gels for encapsulation of biological materials
EP0513332A4 (en) 1990-11-14 1993-03-17 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
US5164374A (en) 1990-12-17 1992-11-17 Monsanto Company Use of oligosaccharides for treatment of arthritis
US5833982A (en) 1991-02-28 1998-11-10 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
US5788965A (en) 1991-02-28 1998-08-04 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
US5861374A (en) 1991-02-28 1999-01-19 Novo Nordisk A/S Modified Factor VII
JP3459416B2 (ja) 1991-02-28 2003-10-20 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 修飾されたファクター▲ｖｉｉ▼
AU1676992A (en) 1991-03-18 1992-10-21 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
EP0576592B1 (en) 1991-03-18 2000-05-31 The Scripps Research Institute Oligosaccharide enzyme substrates and inhibitors: methods and compositions
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
US5212075A (en) 1991-04-15 1993-05-18 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for introducing effectors to pathogens and cells
DE69231467T2 (de) 1991-05-10 2001-01-25 Genentech Inc Auswählen von agonisten und antagonisten von liganden
SE9201544L (sv) 1991-05-31 1992-12-01 Ciba Geigy Ag Saett att framstaella glykosyltransferaser
GB2256197B (en) 1991-05-31 1995-11-22 Ciba Geigy Ag Yeast as host for expression of heterologous glycosyl transferase enzymes
US5352670A (en) 1991-06-10 1994-10-04 Alberta Research Council Methods for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides
US5374655A (en) 1991-06-10 1994-12-20 Alberta Research Council Methods for the synthesis of monofucosylated oligosaccharides terminating in di-N-acetyllactosaminyl structures
KR950014915B1 (ko) 1991-06-19 1995-12-18 주식회사녹십자 탈시알로당단백-포함화합물
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
EP0863154A1 (en) 1991-10-12 1998-09-09 The Regents Of The University Of California Use of thiol redox proteins for reducing protein intramolecular disulfide bonds, for improving the quality of cereal products, dough and baked goods
US6319695B1 (en) 1991-10-15 2001-11-20 The Scripps Research Insitute Production of fucosylated carbohydrates by enzymatic fucosylation synthesis of sugar nucleotides; and in situ regeneration of GDP-fucose
ATE168014T1 (de) 1991-11-08 1998-07-15 Somatogen Inc Hämoglobine als arzneimittelabgabesystem
US5384249A (en) 1991-12-17 1995-01-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α2→3 sialyltransferase
IT1260468B (it) 1992-01-29 1996-04-09 Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole
ATE228565T1 (de) 1992-03-09 2002-12-15 Univ California Nukleinsäure, expressionsvektor und zusammensetzungen zur identifizierung und herstellung von rekombinanten sialyltransferasen
US5858751A (en) 1992-03-09 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for producing sialyltransferases
US5962294A (en) 1992-03-09 1999-10-05 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for the identification and synthesis of sialyltransferases
WO1993018787A1 (en) 1992-03-25 1993-09-30 New York University Trans-sialidase and methods of use and making thereof
US6037452A (en) 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
JPH0686684A (ja) 1992-05-26 1994-03-29 Monsanto Co シアロ抱合体の合成
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
JPH08503125A (ja) 1992-08-07 1996-04-09 プロジェニクス・ファーマスーティカルス・インコーポレーテッド 非ペプチジル成分と複合化されたＣＤ４−ガンマ２およびＣＤ４−ＩｇＧ２免疫複合体、並びにその使用
WO1994004193A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
JP3979678B2 (ja) 1992-08-24 2007-09-19 サントリー株式会社 新規糖転移酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該酵素の製造方法
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5308460A (en) 1992-10-30 1994-05-03 Glyko, Incorporated Rapid synthesis and analysis of carbohydrates
US6361977B1 (en) 1992-11-24 2002-03-26 S. Christopher Bauer Methods of using multivariant IL-3 hematopoiesis fusion protein
JP2845698B2 (ja) 1992-11-25 1999-01-13 オルガノ株式会社 復水循環系の復水に含まれる陰イオンの測定方法及び装置
JP3202365B2 (ja) 1992-12-04 2001-08-27 株式会社紀文フードケミファ オリゴマンヌロン酸を重合度によって分離する方法
NO934477L (no) 1992-12-09 1994-06-10 Ortho Pharma Corp PEG hydrazon- og PEG oksim-bindingdannende reagenser og proteinderivater derav
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
CA2110543A1 (en) 1992-12-09 1994-06-10 David E. Wright Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives thereof
WO1994015625A1 (en) 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5202413A (en) 1993-02-16 1993-04-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alternating (ABA)N polylactide block copolymers
US6180134B1 (en) 1993-03-23 2001-01-30 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced ciruclation effector composition and method
EP0643132B1 (en) 1993-03-29 2006-05-31 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Alpha-1,3-fucosyltransferase
US5374541A (en) 1993-05-04 1994-12-20 The Scripps Research Institute Combined use of β-galactosidase and sialyltransferase coupled with in situ regeneration of CMP-sialic acid for one pot synthesis of oligosaccharides
US5409817A (en) 1993-05-04 1995-04-25 Cytel, Inc. Use of trans-sialidase and sialyltransferase for synthesis of sialylα2→3βgalactosides
SK141695A3 (en) 1993-05-14 1996-10-02 Cytel Corp Analogous compound sialyl lex, pharmaceutical agent containing this compound and method of preparation of lactoseammoniacal salt
AU6663294A (en) 1993-05-14 1994-12-12 Upjohn Company, The Cloned dna encoding a udp-galnac:polypeptide,n-acetylgalactos aminyltransferase
CA2162726A1 (en) 1993-05-21 1994-12-08 Kathleen L. Berkner Modified factor vii
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5621039A (en) 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
CN1129953A (zh) 1993-07-15 1996-08-28 尼奥斯药品公司 糖组分的合成方法
DE4325317C2 (de) 1993-07-29 1998-05-20 Univ Dresden Tech Verfahren zur radioaktiven Markierung von Immunglobulinen
IL192290A0 (en) 1993-08-17 2008-12-29 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
JPH0770195A (ja) 1993-08-23 1995-03-14 Yutaka Mizushima 糖修飾インターフェロン
US6485930B1 (en) 1993-09-15 2002-11-26 The Scripps Research Institute Mannosyl transfer with regeneration of GDP-mannose
KR960704934A (ko) 1993-09-22 1996-10-09 이나모리 준스케 항혈전활성을 갖는 펩티드 및 이의 제조방법(Peptide having antithrombotic activity and process for producing the same)
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US5369017A (en) 1994-02-04 1994-11-29 The Scripps Research Institute Process for solid phase glycopeptide synthesis
JP3516272B2 (ja) 1994-02-10 2004-04-05 株式会社成和化成 化粧品基材
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5492841A (en) 1994-02-18 1996-02-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagents
DE69533569T2 (de) 1994-03-07 2006-01-05 Dendritic Nanotechnologies, Inc., Mt. Pleasant Bioaktive und/oder gezielte dendrimere-konjugate enthaltend genetisches material
IL113010A (en) 1994-03-31 1999-10-28 Pharmacia & Upjohn Ab Pharmaceutical formulation comprising factor viii with an activity of at least 500iu/ml and an enhancer for improved subcutaneous intramuscular or intradermal administration
US5432059A (en) 1994-04-01 1995-07-11 Specialty Laboratories, Inc. Assay for glycosylation deficiency disorders
US5646113A (en) 1994-04-07 1997-07-08 Genentech, Inc. Treatment of partial growth hormone insensitivity syndrome
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
US5545553A (en) 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
WO1996010089A1 (fr) 1994-09-29 1996-04-04 Ajinomoto Co., Inc. Modification d'un peptide et d'une proteine
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5834251A (en) 1994-12-30 1998-11-10 Alko Group Ltd. Methods of modifying carbohydrate moieties
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
IL116730A0 (en) 1995-01-13 1996-05-14 Amgen Inc Chemically modified interferon
SE9501285L (sv) 1995-04-06 1996-10-07 Johanna Ljung Förfarande för framställning av biologiskt aktiva proteiner
US6030815A (en) 1995-04-11 2000-02-29 Neose Technologies, Inc. Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US5876980A (en) 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US5728554A (en) 1995-04-11 1998-03-17 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of glycosidic linkages
US5922577A (en) 1995-04-11 1999-07-13 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of glycosidic linkages
EP0820520B1 (en) 1995-04-11 2002-08-14 Neose Technologies, Inc. Improved enzymatic synthesis of oligosaccharides
US5695760A (en) 1995-04-24 1997-12-09 Boehringer Inglehiem Pharmaceuticals, Inc. Modified anti-ICAM-1 antibodies and their use in the treatment of inflammation
CA2227326A1 (en) 1995-05-15 1996-11-21 Philip Dehazya Carbohydrate-mediated coupling of peptides to immunoglobulins
US6015555A (en) 1995-05-19 2000-01-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
US5824864A (en) 1995-05-25 1998-10-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize gene and protein for insect control
US6127153A (en) 1995-06-07 2000-10-03 Neose Technologies, Inc. Method of transferring at least two saccharide units with a polyglycosyltransferase, a polyglycosyltransferase and gene encoding a polyglycosyltransferase
US5858752A (en) 1995-06-07 1999-01-12 The General Hospital Corporation Fucosyltransferase genes and uses thereof
US6251864B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
WO1996040731A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Pegylated modified proteins
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
MX9800482A (es) 1995-07-27 1998-04-30 Cytec Tech Corp Polimeros cationicos sinteticos como promotores para el aprestamiento con anhidrido alquenil-succinico.
US5770420A (en) 1995-09-08 1998-06-23 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
CA2658039A1 (en) 1995-09-21 1997-03-27 Genentech, Inc. Human growth hormone variants
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
CA2165041C (en) 1995-12-12 2005-07-05 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides, and the products formed thereby
US5716812A (en) 1995-12-12 1998-02-10 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides, and the products formed thereby
WO1997021822A2 (en) 1995-12-12 1997-06-19 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides using mutant glycosidase enzymes
JP3065925B2 (ja) 1996-01-30 2000-07-17 日清製油株式会社 活性酸素種消去剤及び退色防止剤
EP0888377B1 (en) 1996-03-08 2007-12-12 The Regents Of The University Of Michigan MURINE alpha(1,3)-FUCOSYLTRANSFERASE (Fuc-TVII)
ATE341344T1 (de) 1996-08-02 2006-10-15 Ortho Mcneil Pharm Inc Polypeptide mit einzelnem kovalent gebundenen n- terminalen wasserlöslichen polymer
WO1998006422A1 (fr) * 1996-08-13 1998-02-19 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Agents de proliferation des cellules souches hematopoietiques
US20020064546A1 (en) 1996-09-13 2002-05-30 J. Milton Harris Degradable poly(ethylene glycol) hydrogels with controlled half-life and precursors therefor
CA2268168C (en) 1996-10-10 2008-04-29 Cytel Corporation Carbohydrate purification using ultrafiltration, reverse osmosis and nanofiltration
US6087325A (en) 1996-10-15 2000-07-11 The Liposome Company, Inc. Peptide-lipid conjugates
HUP0001650A3 (en) 1996-11-08 2001-09-28 Neose Technologies Inc Horsham Improved expression vectors
US6399336B1 (en) 1997-01-16 2002-06-04 Neose Technologies, Inc. Practical in vitro sialylation of recombinant glycoproteins
ATE200030T1 (de) 1997-01-29 2001-04-15 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylationsverfahren
DE19709787A1 (de) 1997-03-11 1998-09-17 Bayer Ag Oligosaccaride und deren Derivate sowie ein chemo-enzymatisches Verfahren zu deren Herstellung
US5945314A (en) 1997-03-31 1999-08-31 Abbott Laboratories Process for synthesizing oligosaccharides
CA2288992C (en) 1997-04-30 2012-06-12 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
JPH10307356A (ja) 1997-05-08 1998-11-17 Konica Corp ハロゲン化銀乳剤およびそれを用いたハロゲン化銀写真感光材料
US6183738B1 (en) 1997-05-12 2001-02-06 Phoenix Pharamacologics, Inc. Modified arginine deiminase
US6075134A (en) 1997-05-15 2000-06-13 The Regents Of The University Of California Glycoconjugates and methods
WO1998055630A2 (en) 1997-06-06 1998-12-10 The Governors Of The University Of Alberta Alpha-1,3-fucosyltransferase of helicobacter pylori
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
AU8269898A (en) 1997-06-27 1999-01-19 Regents Of The University Of California, The Drug targeting of a peptide radiopharmaceutical through the primate blood-brain barrier in vivo with a monoclonal antibody to the human insulin receptor
US20030027257A1 (en) 1997-08-21 2003-02-06 University Technologies International, Inc. Sequences for improving the efficiency of secretion of non-secreted protein from mammalian and insect cells
WO1999013063A1 (en) 1997-09-09 1999-03-18 Nycomed Imaging As Factor vii fragments and analogs thereof and their use in the treatment of blood clottng disorders
DE69840412D1 (de) 1997-10-31 2009-02-12 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
WO1999028491A1 (en) 1997-12-01 1999-06-10 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of gangliosides
EP0924298A1 (en) 1997-12-18 1999-06-23 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Protein expression in baculovirus vector expression systems
DE69913316T2 (de) 1998-01-07 2004-11-18 Debio Recherche Pharmaceutique S.A. Abbaubare, heterobifunktionelle polyethylenglykolacrylate, sowie damit herstellbare gele und konjugate
AU2559799A (en) 1998-01-22 1999-08-09 Genentech Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and humanized anti-il-8 monoclonal antibodies and uses of same
US6362254B2 (en) 1998-03-12 2002-03-26 Shearwater Corporation Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
CA2324616A1 (en) 1998-03-25 1999-09-30 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Trimeric antigenic o-linked glycopeptide conjugates, methods of preparation and uses thereof
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
WO1999055376A1 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Peg-lhrh analog conjugates
US20030166525A1 (en) 1998-07-23 2003-09-04 Hoffmann James Arthur FSH Formulation
CZ299164B6 (cs) 1998-10-16 2008-05-07 Biogen Idec Ma Inc. Farmaceutická kompozice obsahující glykosylovaný interferon-beta-1a navázaný na polymer
US7304150B1 (en) 1998-10-23 2007-12-04 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
DE69936351T2 (de) 1998-10-30 2008-02-21 Novozymes A/S Glykosylierte proteine mit reduzierter allergenität
CA2350079A1 (en) 1998-11-13 2000-05-25 Henrick Clausen Udp-galactose: beta-n-acetyl-glucosamine beta1,3galactosyltransferases. beta3gal-t5
DE19852729A1 (de) 1998-11-16 2000-05-18 Werner Reutter Rekombinante Glycoproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung
EP1131415A4 (en) 1998-11-18 2002-09-11 Neose Technologies Inc PRODUCTION OF CHEAP OLIGOSACCHARIDES
US6465220B1 (en) 1998-12-21 2002-10-15 Glycozym Aps Glycosylation using GalNac-T4 transferase
HU228488B1 (en) 1999-01-29 2013-03-28 Amgen Inc Gcsf conjugates
US6503744B1 (en) 1999-02-01 2003-01-07 National Research Council Of Canada Campylobacter glycosyltransferases for biosynthesis of gangliosides and ganglioside mimics
US6949372B2 (en) 1999-03-02 2005-09-27 The Johns Hopkins University Engineering intracellular sialylation pathways
DE60014879T2 (de) 1999-04-22 2005-10-13 Astrazeneca Ab Test zum nachweis der aktivität von phospho-n-acetylmuramyl-pentapeptid-translokase
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
US6261805B1 (en) 1999-07-15 2001-07-17 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Sialyiation of N-linked glycoproteins in the baculovirus expression vector system
WO2001005434A2 (en) 1999-07-20 2001-01-25 Amgen Inc. Hyaluronic acid-protein conjugates
US6642038B1 (en) 1999-09-14 2003-11-04 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. GlcNAc phosphotransferase of the lysosomal targeting pathway
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
ES2377935T3 (es) 1999-12-02 2012-04-03 Zymogenetics, Inc. Procedimiento para dirigir células que expresan receptor -3 o -2 del factor de crecimiento de fibroblastos
US6348558B1 (en) 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
WO2001045796A2 (en) 1999-12-22 2001-06-28 Shearwater Corporation Method for the preparation of 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol)
JP4593048B2 (ja) 1999-12-24 2010-12-08 協和発酵キリン株式会社 分岐型ポリアルキレングリコール類
AU2352201A (en) 1999-12-30 2001-07-16 Maxygen Aps Improved lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
MXPA02006795A (es) 2000-01-10 2005-04-19 Maxygen Holdings Ltd Conjugados g-csf.
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
WO2001058493A1 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Maxygen Aps Conjugates of follicle stimulating hormones
IL150692A0 (en) 2000-02-11 2003-02-12 Maxygen Aps FACTOR VII OR VIIa-LIKE MOLECULES
AU2001232337A1 (en) 2000-02-18 2001-08-27 Kanagawa Academy Of Science And Technology Pharmaceutical composition, reagent and method for intracerebral delivery of pharmaceutically active ingredient or labeling substance
US20010041683A1 (en) 2000-03-09 2001-11-15 Schmitz Harold H. Cocoa sphingolipids, cocoa extracts containing sphingolipids and methods of making and using same
US6570040B2 (en) 2000-03-16 2003-05-27 The Regents Of The University Of California Chemoselective ligation
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US6905683B2 (en) 2000-05-03 2005-06-14 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII variants
WO2001083725A1 (en) 2000-05-03 2001-11-08 Novo Nordisk A/S Human coagulation factor vii variants
US7338932B2 (en) 2000-05-11 2008-03-04 Glycozym Aps Methods of modulating functions of polypeptide GalNAc-transferases and of screening test substances to find agents herefor, pharmaceutical compositions comprising such agents and the use of such agents for preparing medicaments
NZ522320A (en) 2000-05-12 2007-03-30 Neose Technologies Inc In vitro modification of glycosylation patterns of recombinant glycopeptides
PT1311285E (pt) 2000-05-15 2005-06-30 Hoffmann La Roche Composicao farmaceutica liquida contendo um derivado de eritropoietina
CA2408851C (en) 2000-05-16 2011-07-12 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
MXPA03000105A (es) 2000-06-28 2004-09-13 Glycofi Inc Metodo para producir glicoproteinas modificadas.
US6423826B1 (en) 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
EP1299535A2 (en) 2000-06-30 2003-04-09 Maxygen Aps Peptide extended glycosylated polypeptides
KR100396983B1 (ko) 2000-07-29 2003-09-02 이강춘 고반응성의 가지 달린 고분자 유도체 및 고분자와 단백질또는 펩타이드의 접합체
WO2002013873A2 (en) 2000-08-17 2002-02-21 Synapse Technologies, Inc. P97-active agent conjugates and their methods of use
WO2002013843A2 (en) 2000-08-17 2002-02-21 University Of British Columbia Chemotherapeutic agents conjugated to p97 and their methods of use in treating neurological tumours
EP1325113B1 (en) 2000-10-02 2010-04-21 Novo Nordisk Health Care AG Factor vii glycoforms
US20020142964A1 (en) 2000-11-02 2002-10-03 Nissen Torben Lauesgaard Single-chain polypeptides
PL364932A1 (en) 2000-11-27 2004-12-27 Rmf Dictagene S.A. Process for folding chemically synthesized polypeptides
AU2002217944A1 (en) 2000-11-28 2002-06-11 University Of Massachusetts Methods and reagents for introducing a sulfhydryl group into the 5'-terminus of rna
CA2431964C (en) 2000-12-20 2013-09-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
DE60144439D1 (de) 2000-12-20 2011-05-26 Hoffmann La Roche Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg)
US7892730B2 (en) 2000-12-22 2011-02-22 Sagres Discovery, Inc. Compositions and methods for cancer
PA8536201A1 (es) 2000-12-29 2002-08-29 Kenneth S Warren Inst Inc Protección y mejoramiento de células, tejidos y órganos que responden a la eritropoyetina
US6531121B2 (en) 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
SE0004932D0 (sv) 2000-12-31 2000-12-31 Apbiotech Ab A method for mixed mode adsorption and mixed mode adsorbents
CA2469846A1 (en) 2001-02-27 2002-09-26 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US7235638B2 (en) 2001-03-22 2007-06-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Coagulation factor VII derivatives
KR20030085041A (ko) 2001-03-22 2003-11-01 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 응고 인자 ⅶ 유도체
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
EP1392350A2 (en) 2001-05-11 2004-03-03 Aradigm Corporation Optimization of the molecular properties and formulation of proteins delivered by inhalation
AU2002342653A1 (en) 2001-05-14 2002-11-25 The Gouvernment Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health Modified growth hormone
JP4444652B2 (ja) 2001-07-11 2010-03-31 マキシゲン・ホールディングズ・リミテッド Ｇ−ｃｓｆ結合体
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
NZ530955A (en) 2001-08-01 2006-12-22 Neose Technologies Inc Neutral glycosphingolipids and glycosyl-sphingosines and methods for isolating the same
WO2003016469A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Neose Technologies, Inc. Chemo-enzymatic synthesis of sialylated oligosaccharides
EP1435972B1 (en) 2001-08-29 2016-03-09 Seneb Biosciences Inc. Novel synthetic ganglioside derivatives and compositions thereof
US6930086B2 (en) 2001-09-25 2005-08-16 Hoffmann-La Roche Inc. Diglycosylated erythropoietin
US7052868B2 (en) 2001-09-27 2006-05-30 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7399613B2 (en) 2001-10-10 2008-07-15 Neose Technologies, Inc. Sialic acid nucleotide sugars
US7439043B2 (en) 2001-10-10 2008-10-21 Neose Technologies, Inc. Galactosyl nucleotide sugars
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7265085B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7226903B2 (en) 2001-10-10 2007-06-05 Neose Technologies, Inc. Interferon beta: remodeling and glycoconjugation of interferon beta
US7297511B2 (en) 2001-10-10 2007-11-20 Neose Technologies, Inc. Interferon alpha: remodeling and glycoconjugation of interferon alpha
ES2516041T3 (es) 2001-10-10 2014-10-30 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glicoconjugación de la hormona del crecimiento humano (hGH)
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7179617B2 (en) 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7265084B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US6784154B2 (en) 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
CA2468230A1 (en) 2001-11-28 2003-06-05 Neose Technologies, Inc. Glycopeptide remodeling using amidases
DE60228492D1 (de) 2001-11-28 2008-10-02 Neose Technologies Inc Remodellierung von glycoproteinen unter verwendung von endoglycanasen
US7473680B2 (en) 2001-11-28 2009-01-06 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
US20060035224A1 (en) 2002-03-21 2006-02-16 Johansen Jack T Purification methods for oligonucleotides and their analogs
AU2003239365A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Neose Technologies, Inc. Recombinant glycosyltransferase fusion proteins
RU2362807C2 (ru) 2002-06-21 2009-07-27 Ново Нордиск Хелт Кэр Аг Конъюгат полипептида фактора vii, способ его получения, его применение и содержащая его фармацевтическая композиция
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
DE10232916B4 (de) 2002-07-19 2008-08-07 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Vorrichtung und Verfahren zum Charakterisieren eines Informationssignals
DE60336826D1 (de) 2002-07-23 2011-06-01 Biogenerix Ag Synthese von oligosacchariden, glykolipiden und glykoproteinen unter verwendung bakterieller glykosyltransferasen
CN1671722A (zh) 2002-08-01 2005-09-21 加拿大国家研究院 弯曲菌的聚糖和糖肽
US20060240045A1 (en) 2002-08-02 2006-10-26 Francois-Xavier Berthet Neisserial vaccine compositions comprising a combination of antigens
CA2497777A1 (en) 2002-09-05 2004-03-18 The General Hospital Corporation Modified asialo-interferons and uses thereof
JP2006501820A (ja) 2002-09-06 2006-01-19 バイエル・フアーマシユーチカルズ・コーポレーシヨン 修飾ｇｌｐ−１受容体アゴニストおよびそれらの薬理学的使用法
US7470779B2 (en) 2002-09-20 2008-12-30 Pfizer Inc. Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein
ATE370968T1 (de) 2002-09-25 2007-09-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Varianten des menschliche koagulationsfaktors vii
ATE505487T1 (de) 2002-09-30 2011-04-15 Bayer Healthcare Llc Fvii- oder fviia-varianten mit erhöhter koagulationswirkung
US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
NZ539415A (en) 2002-10-09 2008-12-24 Neose Technologies Inc Remodelling and glycoconjugation of erythropoietin
ATE365794T1 (de) 2002-11-08 2007-07-15 Glycozym Aps Verfahren zur identifizierung von die funktionen von polypeptid-galnac-transferasen modulierenden agentien, solche agentien umfassende pharmazeutische zusammensetzungen und verwendung solcher agentien zur herstellung von arzneimitteln
JP4412461B2 (ja) 2002-11-20 2010-02-10 日油株式会社 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体
US7459436B2 (en) 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US20050064540A1 (en) 2002-11-27 2005-03-24 Defrees Shawn Ph.D Glycoprotein remodeling using endoglycanases
EP1424344A1 (en) 2002-11-29 2004-06-02 Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung Modified cDNA factor VIII and its derivates
ES2312523T3 (es) 2002-12-13 2009-03-01 Bioceuticals Arzneimittel Ag Procedimiento para la produccion y purificacion de eritropoyetina.
RS20050502A (en) 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of interferon- beta with enhanced biological potency
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
KR101085375B1 (ko) 2003-02-26 2011-11-21 넥타르 테라퓨틱스 중합체-인자 ⅷ 부분 콘쥬게이트
ES2420581T3 (es) 2003-03-14 2013-08-26 Biogenerix Gmbh Polímeros solubles en agua ramificados y sus conjugados
EP1603954A4 (en) 2003-03-18 2006-04-12 Neose Technologies Inc ACTIVATED FORMS OF WATER SOLUBLE POLYMERS
PT1605897E (pt) 2003-03-19 2012-09-10 Lilly Co Eli Compostos de glp-1 ligado a polietilenoglicol
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
SG155777A1 (en) 2003-04-09 2009-10-29 Neose Technologies Inc Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
EP1613261A4 (en) 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES
US20130344050A1 (en) 2003-04-09 2013-12-26 Novo Nordisk A/S Glycopegylated Factor IX
US7718363B2 (en) 2003-04-25 2010-05-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokine receptor complex and assays for identifying tissue protective compounds
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2333598T5 (es) 2003-05-06 2013-09-04 Biogen Idec Hemophilia Inc Proteinas quimericas del factor de coagulacion fc para tratar la hemofilia.
ES2380093T3 (es) 2003-05-09 2012-05-08 Biogenerix Ag Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento humana
WO2004101597A2 (en) 2003-05-13 2004-11-25 Frutarom Ltd. Methods for the reduction of disulfide bonds
US7074755B2 (en) 2003-05-17 2006-07-11 Centocor, Inc. Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives
EP1481985A1 (en) 2003-05-28 2004-12-01 Innogenetics N.V. Modified hepatitis C virus (HCV) NS3 for medical treatment
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
US20060198819A1 (en) 2003-08-08 2006-09-07 Novo Nordisk Healthcare A/G Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
EP1653996A2 (en) 2003-08-08 2006-05-10 Novo Nordisk Health Care AG Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
EP1653991A2 (en) 2003-08-08 2006-05-10 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
CN1882355A (zh) 2003-09-09 2006-12-20 沃伦药品公司 保持内源性***组织保护活性的长效***
US7524813B2 (en) 2003-10-10 2009-04-28 Novo Nordisk Health Care Ag Selectively conjugated peptides and methods of making the same
NZ547168A (en) 2003-11-24 2010-05-28 Biogenerix Ag Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080318850A1 (en) 2003-12-03 2008-12-25 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated Factor Ix
WO2005055946A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP1694315A4 (en) 2003-12-03 2009-10-28 Novo Nordisk As GLYCOPEGYLATED FACTOR IX
WO2005056760A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated follicle stimulating hormone
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
WO2005070138A2 (en) 2004-01-08 2005-08-04 Neose Technologies, Inc. O-linked glycosylation of peptides
US20080058245A1 (en) 2004-01-09 2008-03-06 Johnson Karl F Vectors for Recombinant Protein Expression in E. Coli
US20070105770A1 (en) 2004-01-21 2007-05-10 Novo Nordisk A/S Transglutaminase mediated conjugation of peptides
EP1720892B1 (en) 2004-01-26 2013-07-24 BioGeneriX AG Branched polymer-modified sugars and nucleotides
LT3385384T (lt) 2004-02-12 2020-09-25 Archemix Llc Aptamero terapija, naudinga su komplementu susijusių ligų gydymui
CA2557782A1 (en) 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
US20070037966A1 (en) 2004-05-04 2007-02-15 Novo Nordisk A/S Hydrophobic interaction chromatography purification of factor VII polypeptides
AU2005243427B2 (en) 2004-05-04 2010-07-22 Novo Nordisk Health Care Ag O-linked glycoforms of polypeptides and method to manufacture them
JP4251399B2 (ja) 2004-05-21 2009-04-08 独立行政法人産業技術総合研究所 Ｏ結合型糖鎖が付加されたペプチドのスクリーニング方法
JP2008501344A (ja) 2004-06-03 2008-01-24 ネオス テクノロジーズ インコーポレイティッド 切り詰め型ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドおよび核酸
EP1765992A4 (en) 2004-06-03 2009-01-07 Neose Technologies Inc SHORTEN GALNACT2 POLYPEPTIDES AND NUCLEIC ACIDS
AU2005260763B2 (en) 2004-06-30 2011-12-22 Nektar Therapeutics Polymer-factor IX moiety conjugates
JP2008509889A (ja) 2004-06-30 2008-04-03 イージェン コーポレーション ペグ化インターフェロンα−１ｂ
AU2005270092A1 (en) 2004-07-02 2006-02-09 Cerami, Anthony Method of producing fully carbamylated erythropoietin
WO2006014466A2 (en) 2004-07-02 2006-02-09 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Novel carbamylated epo and method for its production
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US20090292110A1 (en) 2004-07-23 2009-11-26 Defrees Shawn Enzymatic modification of glycopeptides
SE0401951D0 (sv) 2004-07-29 2004-07-29 Amersham Biosciences Ab Chromatography method
US20060024286A1 (en) 2004-08-02 2006-02-02 Paul Glidden Variants of tRNA synthetase fragments and uses thereof
EP1778838A2 (en) 2004-08-02 2007-05-02 Novo Nordisk Health Care AG Conjugation of fvii
US8828939B2 (en) 2004-08-17 2014-09-09 Csl Behring Gmbh Modified vitamin K dependent polypeptides
WO2006031811A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
WO2006035057A1 (en) 2004-09-29 2006-04-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified proteins
EP2586456B1 (en) 2004-10-29 2016-01-20 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
CN101124331B (zh) 2004-11-12 2013-04-24 拜尔健康护理有限责任公司 Fvⅲ的位点定向修饰
US20090054623A1 (en) 2004-12-17 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. Lipo-Conjugation of Peptides
AU2005323106B2 (en) 2004-12-22 2010-07-29 Ambrx, Inc. Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
JP2008526864A (ja) 2005-01-06 2008-07-24 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 糖断片を用いる糖結合
JP4951527B2 (ja) * 2005-01-10 2012-06-13 バイオジェネリックス アーゲー 糖ｐｅｇ化顆粒球コロニー刺激因子
WO2006078645A2 (en) 2005-01-19 2006-07-27 Neose Technologies, Inc. Heterologous polypeptide expression using low multiplicity of infection of viruses
PA8660701A1 (es) 2005-02-04 2006-09-22 Pfizer Prod Inc Agonistas de pyy y sus usos
ATE527371T1 (de) 2005-03-24 2011-10-15 Biogenerix Ag Expression löslicher, aktiver, eukaryotischer glucosyltransferasen in prokaryotischen organismen
US20060246544A1 (en) 2005-03-30 2006-11-02 Neose Technologies,Inc. Manufacturing process for the production of peptides grown in insect cell lines
JP2008534559A (ja) 2005-04-01 2008-08-28 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 血液凝固ｆｖｉｉｉ類似体
US20070154992A1 (en) 2005-04-08 2007-07-05 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
DK2311972T3 (en) 2005-05-11 2015-04-27 Eth Zuerich Recombinant N-glycosylated proteins from prokaryotic cells
US20080255026A1 (en) 2005-05-25 2008-10-16 Glycopegylated Factor 1X Glycopegylated Factor Ix
US20110003744A1 (en) 2005-05-25 2011-01-06 Novo Nordisk A/S Glycopegylated Erythropoietin Formulations
EP1888098A2 (en) 2005-05-25 2008-02-20 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
WO2006134173A2 (en) 2005-06-17 2006-12-21 Novo Nordisk Health Care Ag Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprising at least one non-native cysteine
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
KR20080080081A (ko) 2005-08-19 2008-09-02 네오스 테크놀로지스, 인크. 글리코페닐화 인자 ⅶ 및 인자 ⅶ에이
EP2316930A1 (en) 2005-09-14 2011-05-04 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor VII polypeptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
DE102006009437A1 (de) 2006-03-01 2007-09-13 Bioceuticals Arzneimittel Ag G-CSF-Flüssigformulierung
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
KR20090013816A (ko) 2006-05-24 2009-02-05 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ⅸ 유사체
JP2009544327A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化
ITMI20061624A1 (it) 2006-08-11 2008-02-12 Bioker Srl Mono-coniugati sito-specifici di g-csf
WO2008025856A2 (en) 2006-09-01 2008-03-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified glycoproteins
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
US20100041872A1 (en) 2006-10-04 2010-02-18 Defrees Shawn Glycerol linked pegylated sugars and glycopeptides
US20080207487A1 (en) 2006-11-02 2008-08-28 Neose Technologies, Inc. Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines
NZ580030A (en) 2007-04-03 2012-06-29 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
US20090053167A1 (en) 2007-05-14 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. C-, S- and N-glycosylation of peptides
JP2010531135A (ja) 2007-06-04 2010-09-24 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを使用したｏ結合型グリコシル化
JP5876649B2 (ja) 2007-06-12 2016-03-02 ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ ヌクレオチド糖の改良製造法
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
US20100286067A1 (en) 2008-01-08 2010-11-11 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070014759A1 (en) * 2003-12-03 2007-01-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEFREES et al. GlycoPEGylation of recombinant therapeutic proteins produced in Escherichia coli. Glycobiology. 2006 Sep; 16(9):833-443, whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20100016160A (ko) 2010-02-12
EA200970915A1 (ru) 2010-04-30
CY2014006I1 (el) 2019-11-27
DK2144923T3 (da) 2013-05-13
KR20150064246A (ko) 2015-06-10
WO2008124406A3 (en) 2008-11-27
PL2144923T3 (pl) 2013-12-31
JP2013227344A (ja) 2013-11-07
NO2014002I1 (no) 2014-06-02
EP2144923B1 (en) 2013-02-13
BRPI0809670A2 (pt) 2014-10-07
CN101796063B (zh) 2017-03-22
US20100120666A1 (en) 2010-05-13
LTC2144923I2 (lt) 2016-12-12
BRPI0809670A8 (pt) 2018-12-18
WO2008124406A2 (en) 2008-10-16
NZ580030A (en) 2012-06-29
HRP20130382T1 (hr) 2013-05-31
CN101796063A (zh) 2010-08-04
CA2682897C (en) 2016-11-22
JP5922065B2 (ja) 2016-05-24
EP2144923A4 (en) 2010-12-08
EP2144923A2 (en) 2010-01-20
CY2014006I2 (el) 2019-11-27
JP2016029088A (ja) 2016-03-03
CY1114517T1 (el) 2016-10-05
IL201203A (en) 2017-01-31
PT2144923E (pt) 2013-05-15
IL201203A0 (en) 2010-05-17
US9050304B2 (en) 2015-06-09
JP2010523582A (ja) 2010-07-15
ES2406267T3 (es) 2013-06-06
CA2682897A1 (en) 2008-10-16
AU2008237411B2 (en) 2013-10-03
RS52845B (en) 2013-12-31
AU2008237411A1 (en) 2008-10-16
NO2014002I2 (no) 2014-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA017770B1 (ru) Способы лечения с использованием гликопэгилированного g-csf
JP4657219B2 (ja) ＧｌｙｃｏＰＥＧ化された顆粒球コロニー刺激因子
KR101209111B1 (ko) 글리코페질화 인자 나인
JP4951527B2 (ja) 糖ｐｅｇ化顆粒球コロニー刺激因子
US7956032B2 (en) Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
JP4719686B2 (ja) ＧｌｙｃｏＰＥＧ化エリスロポエチン
US20080318850A1 (en) Glycopegylated Factor Ix
ZA200604554B (en) Glycopegylated Factor IX
RU2400490C2 (ru) Гликопэгилированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
UA99454C2 (ru) Способ лечения с использованием гликопегилированнного g-csf (варианты)

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU