DE69936351T2 - Glykosylierte proteine mit reduzierter allergenität - Google Patents

Glykosylierte proteine mit reduzierter allergenität Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie, insbesondere der Allergenität. Insbesondere betrifft sie die Allergenitätsherabsetzung durch die In-vivo-N-Glykolysierung von Proteinen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Proteine, einschließlich Enzyme, werden großtechnisch zur Anwendung in einer Vielzahl von industriellen Bereichen hergestellt. Heutzutage profitieren die Waschmittel-, Nahrungsmittel- sowie die pharmazeutischen Industrien von der Entwicklung moderner Protein- und Enzymtechnologien. Allerdings besteht ein Hauptnachteil, der mit der zunehmenden Exposition gegenüber Proteinen zusammenhängt, in dem Risiko von allergenen Reaktionen bei empfindlichen Individuen.
  • Darum ist die Allergieprävention bei empfindlichen Individuen ein Forschungsgebiet von großer Bedeutung. Der allgemeine Mechanismus hinter einer allergenen Reaktion wird in eine Sensibilisierungsphase und symptomatische Phase unterteilt. Die Sensibilisierungsphase umfasst eine erste Exposition eines Individuums gegenüber einem Allergen. Dieses Ereignis aktiviert T- und B-Lymphozyten und führt zur Produktion von allergenspezifischen Immunoglobulin E(IgE)-Antikörpern. Die symptomatische Phase wird durch eine zweite Exposition gegenüber dem gleichen oder einem ähnlichen Antigen ausgelöst. Die spezifischen IgE-Antikörper binden unter anderem an spezifische IgE-Rezeptoren auf Mastzellen und Basophilen, während sie gleichzeitig das Allergen einfangen. Die polyklonale Natur dieses Prozesses führt zur Verbrückung und zum Clustering der IgE-Rezeptoren und anschließend zur Aktivierung von Mastzellen und Basophilen. Diese Aktivierung wiederum löst die Freisetzung verschiedener chemischer Mediatoren aus, die an der frühen sowie späten Phasenreaktionen der symptomatischen Phase beteiligt sind. Es scheint, dass eine Korrelation zwischen dem IgE-Bindungsgrad und der Schwere der Allergiereaktion besteht. Im vorliegenden Zusammenhang folgt die Bezeichnung von Antikörpern der Standardbezeichnung, d.°h. IgE ist Immunoglobulin E usw.
  • Bevor die oben erwähnte spezifische Immunreaktion ins Spiel kommt, versucht der Körper die Invasoren durch nicht-spezifische Mechanismen zu entfernen. Beispielsweise in den Lungen und in der Leber und wahrscheinlich auch in der Haut funktionieren residente Makrophagen als Scavenger-Zellen. Scavenger sind phagozytisch aktive Zellen, die dazu ausgelegt sind, Fremdantigene, beispielsweise Bakterien, einzufangen und zu verdauen. Zur Verbesserung ihrer Scavenger-Effizienz exprimieren sie auf ihrer Oberfläche Scavenger-Rezeptoren sowie mannosereiche Rezeptoren, woran anionische und Mannose enthaltende Strukturen, die normalerweise auf der Bakterienoberfläche exprimiert werden, binden.
  • Es wird angenommen, dass die Herabsetzung des Bindens von bereits existierenden freien und zellgebundenen epitopspezifischen sowie kreuzreagierenden IgE-Antikörpern und die Herabsetzung der Produktion von IgE-Antikörpern durch verstärktes Erkennen von Antigenen durch phagozytische Zellen Faktoren sind, die den Körper dabei unterstützen, eine allergene Reaktion auf Proteine zu kontrollieren.
  • Ein Weg, dies zu erreichen, besteht in der Modifizierung des für die Allergenereaktion verantwortlichen Proteins. Solche Proteinmodifikationen wurden bereits auf dem Fachgebiet beschrieben. In WO 96/17929 , WO 96/40792 , WO 97/30148 und WO 98/35026 wurden Proteine chemisch durch die Addition von Polyethylenglykol modifiziert. Die Antigene können chemisch verändert werden, um die Bindung durch Antikörper herabzusetzen. Die Antigenderivate ergaben ein reduziertes Binden spezifischer Antikörper, eine herabgesetzte Antigenität, wie es durch die Produktion von IgG1-Antikörpern angegeben wird, und im Grunde genommen keine Allergenität, wie es durch das Fehlen von nachweisbaren spezifischen IgE-Antikörper-Spiegeln nahe gelegt wird.
  • Obwohl wirksam, ist das Verfahren der chemischen Modifizierung von Proteinen, d.°h. durch PEG-Ylierung, recht zeitraubend und somit kostenintensiv. Die vorliegende Erfindung schildert ein Verfahren zur Optimierung der In-vivo-Modifikation von Proteinen mit Glykosyl-Oligomeren mit dem Ziel der Herabsetzung der Allergenität von Proteinen. Dieser Ansatz kann die Herstellungskosten fünffach reduzieren.
  • WO 98/1337 beschreibt ein Verfahren, wobei die Aufnahme von löslichen Peptiden durch dendritische Zellen durch die Addition von Mannose-Resten an die Peptide verstärkt wird.
  • Dies erläutert eindeutig, dass es möglich ist, eine Immunreaktion auf ein lösliches Antigen durch chemische Addition von Zuckern, wie Mannose, zu manipulieren.
  • US A 5 041 376 offenbart ein Verfahren zur Identifizierung oder zur Abschirmung funktioneller Stellen oder Epitope durch Einbau von einer einzigen zusätzlichen nicht nativen N-Glykosylierungsstelle. Unter einer Reihe von Verfahren zur Bewertung struktureller und enzymatischer Eigenschaften der glykosylierten Varianten wendet diese Patentschrift einen monoklonalen Antikörpertest an, um zu bewerten, ob der Einbau einer Glykosylierungsstelle die Antikörperbindung herabgesetzt hat.
  • Babiker et al., J. Agric. Food chem. 1998, 46, 866–871, beschreiben ein Sojaprotein-Galactomannan-Konjugat, das durch die Maillard-Reaktion hergestellt wird, welches die Allergenität des 34-kDa-Proteins, das häufig durch den IgE-Antikörper in den Seren von Sojaempfindlichen Patienten als ein Hauptallergen erkannt wird, entfernte.
  • Im vorliegenden Zusammenhang werden die Begriffe Allergie, allergenisch und Allergenität gemäß ihren üblichen Definitionen verwendet, d.°h. um die Reaktion aufgrund von Immunantworten zu beschreiben, wobei der häufigste Antikörper IgE ist, der am wenigsten häufigste IgG4 ist, und Krankheiten aufgrund dieser Immunreaktionen zu beschreiben. Allergene Erkrankungen umfassen Urticaria, Heuschnupfen, Asthma und atopische Dermatitis. Gelegentlich können sich diese Krankheiten zu einem anaphylaktischen Schock entwickeln.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 1.
  • Weitere Ausführungsformen des Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 10 ausgeführt.
  • Somit beträgt bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Allergenität der glykosylierten Proteinvariante weniger als 50 %, vorzugsweise weniger als 25 %, stärker bevorzugt weniger als 1 % der Elternprotein-Allergenität, wie in Anspruch 1 definiert.
  • Eine glykosylierte Proteinvariante mit mindestens einer zusätzlichen Glykosylierungsstelle, durch die sich mindestens ein Epitop des Elternproteins schützen lässt, wobei die glykosylier te Proteinvariante im Wesentlichen die gleiche Funktionalität wie das Eltemprotein aufweist, kann durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden.
  • Zeichnungen
  • 1 zeigt das 3D-Bild von zwei konstruierten Lipolasevarianten.
  • 2 ist ein Gel, das eine Wildtyp-Lipolase und die beiden Lipolasevarianten, die in 1 dargestellt sind, zeigt.
  • 3 zeigt die integrierte Antikörperreaktion im IT-Rattenmodell.
  • 4 zeigt das integrierte Antikörperreaktionsniveau im SC-Mausmodell.
  • Ausführliche Offenbarung der Erfindung
  • Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Proteinen mit herabgesetzter Allergenität durch In-vivo-Glykosylierung. Der Gegenstand wird durch die Konstruktion eines DNA-Moleküls erreicht, das die Proteinvariante codiert, wobei das DNA-Molekül mindestens eine Subsequenz aufweist, die eine zusätzliche Glykosylierungsstelle codiert.
  • Das Wesentliche der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass Glykosylierung ein lösliches Antigen mit Verknüpfungsstellen zum Binden durch residente Makrophagen, z.°B. alveolare Makrophagen der Lunge, bereitstellt. Die Glykosylierung führt neue Epitope ein, jedoch gehören glykosylspezifische Antikörper selten, falls überhaupt, der IgE-Klasse an. Das Binden durch Makrophagen lenkt im Gegenteil die spezifische Immunantwort auf das Antigen wieder von einer Allergenreaktion ab.
  • Gleichzeitig stellt die Glykolysierung eine Abschirmung des Antigens vor zirkulierenden Antikörpern bereit, die mit dem Proteinteil des Antigens zu reagieren vermögen. Die Abschirmung von IgE-Epitopen trägt zu einer herabgesetzten Allergenität bei. Der Begriff Abschirmung bedeutet, dass die Glykosylkette des glykosylierten Proteins physikalisch mindestens ein Epitop des Elternproteins "abdeckt". Diese Abschirmung oder Abdeckung verhindert die spezifische Antikörpererkennung des Epitops. Die Wirksamkeit des Bindens durch Makrophagen sowie das Ausmaß, in dem die Epitope davor abgeschirmt werden, durch Antikörper erkannt zu werden, d. h. ob ein oder mehrere Epitope abgeschirmt werden, hängt vollkommen von der Natur der Glykosylkette ab, d. h. von der Komplexität und dem Mannosegehalt der Glykosylkette, und davon, ob die Glykosylkette verzweigt oder linear ist.
  • Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat überraschenderweise festgestellt, dass durch die Verwendung des beanspruchten Verfahrens, das die In-vivo-Glykosylierung von Proteinen einschließt, die Allergenität des Proteins stark herabgesetzt wird, nach intratrachealer Exposition bestimmt, dass jedoch die Allergenität der Proteine in einem geringeren Ausmaß herabgesetzt wird, nach subkutaner Exposition bestimmt, was angibt, dass der Mechanismus der herabgesetzten Allergenität durch Makrophagen, die in der Lungenalveole resident sind, dominiert werden kann. Es folgt, dass durch die Verwendung des vorliegenden Verfahrens der Produktion eines glykosylierten Proteins die Möglichkeit besteht, eine höhere Ausbeute eines Endprodukts mit herabgesetzter Allergenität im Vergleich zu den herkömmlichen chemischen Stand-der-Technik-Modifikationen zu erreichen. Dies beruht auf der Tatsache, dass das Endprodukt in vivo produziert wird und darum keine In-vitro-Modifikation und Reinigung erfordert.
  • Erfindungsgemäß ist die produzierte glykosylierte Proteinvariante eine N-glykolysierte Proteinvariante. N-Glykosylierung wird an Stellen der Sequenz Asn-Xaa-Ser, Asn-Xaa-Thr oder Asn-Xaa-Cys festgestellt, wobei weder der Xaa-Rest noch die Aminosäure, die auf die Tripeptid-Konsensussequenz folgt, ein Prolin ist (T. E. Creighton, 'Proteins – Structures and Molecular Properties, 2. Ausg., W. H. Freeman und Co., New York, 1993, Ss. 91–93). Somit ist es wünschenswert, solche Erkennungsstellen in die Sequenz des Elternproteins einzubauen. Die spezifische Natur der Glykosylkette der glykosylierten Proteinvariante kann je nach den spezifischen Anforderungen und Eigenschaften der Proteinvariante linear oder verzweigt sein.
  • Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die glykolysierte Proteinvariante im Wesentlichen die gleiche Funktionalität wie das Elternprotein aufweist.
  • Der Begriff "im Wesentlichen die gleiche Funktionalität" bezeichnet eine Proteinvariante als strukturell analog zu dem Elternprotein mit gleichwertigen oder noch besseren biologischen Funktionen und im Vergleich zu dem Elternprotein doch mit einer Glykosylierungsmodifika tion. Es ist möglich zu bewerten, ob die Modifikationen im Wesentlichen die Funktionalität der Proteinvariante beeinträchtigen, entweder durch Computermodellieren der gewünschten Substitutionen oder durch Messen der biologischen Aktivität der glykosylierten Proteinvariante, z. B. der enzymatischen Aktivität eines glykosylierten Proteins.
  • Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Allergenität der glykosylierten Proteinvariante mindestens 50 % geringer als die Elternprotein-Allergenität, ausgedrückt als die Spiegel an IgE-Antikörpern, die sich in Tieren entwickeln, die entsprechend dem Antigen exponiert waren, wie in Anspruch 1 definiert. Somit besteht vorzugsweise in Versuchstieren keine Allergenität der Proteinvariante im Vergleich zu der Wilttyp-Allergenität.
  • Zusätzlich zu der herabgesetzten Allergenität, die durch die Erkennung durch Makrophagen der glykosylierten Proteinvarianten mit zusätzlichen Glykosylierungsgruppe(n) verursacht wird, kann die zusätzliche Glykosylierung mindestens ein Oberflächenepitop des Proteins abschirmen, was zu einer herabgesetzten Antigenizität und daher zu der Möglichkeit einer weiteren Herabsetzung der Allergenität führt.
  • In dem vorliegenden Zusammenhang wird ein "Oberflächenepitop" als eine kleine Region auf einer Proteinoberfläche verstanden, die durch für dieses Protein spezifische Antikörper erkannt und gebunden wird.
  • Erfindungsgemäß kann die Herabsetzung der Antikörperbindung an die Proteinvariante mindestens eine 30%ige Herabsetzung der Antikörperbindung, vorzugsweise eine 45%ige Herabsetzung der Antikörperbindung sein, mit der Maßgabe, dass die Funktion der Proteinvariante im Wesentlichen nicht beeinträchtigt wird. Die Herabsetzung der Antikörperbindung kann unter Verwendung von kompetitivem ELISA gemessen werden.
  • Um die Epitop-Abschirmungswirkung der zusätzlichen Glykosylierungsstellen zu verstärken, können diese vorzugsweise in die Nachbarschaft von Epitopen auf der Proteinoberfläche eingebracht werden.
  • Die Identifizierung des (der) Epitop(e) kann durch bewährte Verfahren, wie diejenigen, die in WO 92/10755 (bei U. Løvborg), bei Walshet et al., J. Immunol. Methods, Bd. 121, 1 275– 280, 1989, und bei Schoofs et al., J. Immunol., Bd. 140, 611–616, 1987, Kohlman et al., Protein Sciences, Bd. 8 (Suppl. 2), Seite 68, 1999, offenbart sind, erreicht werden.
  • Bei einer bevorzugten Weise kann die Identifizierung des Epitops (der Epitope) durch Screening von Phage-Display-Bibliotheken erreicht werden. Ein Phage ist ein Virus, welches Bakterien infiziert. Das Prinzip hinter einem Phage-Display besteht darin, dass eine heterologe DNA-Sequenz in das Gen inseriert werden kann, das ein Hüllprotein des Phagen codiert. Der Phage produziert und zeigt das Hybridprotein auf seiner Oberfläche, wo es mit spezifischen Target-Mitteln Wechselwirken kann. Solche Target-Mittel können ein epitopspezifischer Antikörper sein. Darum ist es möglich, spezifische Phagen aus der Masse von Millionen von Phagen auszuwählen, die jeweils ihr eigenes Hybridprotein exprimieren. Eine statistische „Peptid-Display-Package-Bibliothek" ist eine Bibliothek, die Peptide von festgelegter Länge, beispielsweise mit einer Länge von 9 Aminosäuren, aufweist. Die Peptide der Hybridproteine der spezifischen Phagen, die proteinspezifische Antikörper binden, definieren die Epitope dieses bestimmten Elternproteins. Die entsprechenden Reste des Elternproteins können durch Vergleich der gewählten Peptidsequenzen mit der Aminosäuresequenz unter 3-dimensionalen Struktur des Elternproteins ermittelt werden. Um die Abschirmwirkung der zusätzlichen Glykoslyierungsgruppen zu verstärken, können diese in die Nachbarschaft von Oberflächen-Epitopen, die auf diese Weise identifiziert wurden, eingebracht werden.
  • Finden von geeigneten Substitutionen:
  • Werden geeignete Substitutionen zum Einbau von N-Glykosylierungsstellen gewählt, ist es wünschenswert, nach Asn-, Ser-, Thr- oder Cys-Resten zu suchen, die Teil einer Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys-Konsensussequenz sein könnten. Das Vervollständigen der Konsensussequenz durch ortsgerichtete Mutagenese erfordert nur eine Substitution und ist somit für die Proteinfaltung und Proteinfunktion weniger zerstörerisch. Außerdem kann Computermodellieren eingesetzt werden, um zu gewährleisten, dass Aminosäuresubstitutionen zu stabilen Proteinvarianten führen. Im Allgemeinen sind konservative Substitutionen und Substitutionen bevorzugt, die zu der Seitenkette des Asn-Restes der Glykosylierungs-Konsensussequenz führen, die gegenüber Lösungsmittel zugänglich ist. Die Zugänglichkeit gegenüber dem Lösungsmittel von Aminosäure-Seitenketten kann durch Einsatz des DSSP-Computerprogramms am relevanten Teil der Proteinstruktur bestimmt werden. Das DSSP-Programm ist bei W. Kabsch und C. Sander, BIOPOLYMERS 22 (1983), Ss. 2 577–2 637, offenbart.
  • Falls Substitutionen gewählt werden, die ein identifiziertes Epitop abschirmen sollen, kann unter Verwendung von Standardtechniken durch Computermodellieren bewertet werden, wie die Vorhersage darüber ist, wie N-verknüpfte Kohlenhydratgruppierung das in Frage kommende Epitop abschirmen. Es gibt mehrere Softwarepakete, die zur Vornahme dieser Bewertung eingesetzt werden können. Ein Beispiel ist die Insight suite of modeling-Software von MSI, Inc.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird mehr als eine zusätzliche Glykosylierungsstelle eingebaut. In diesem Fall kann die Bewertung, wie gut die Funktionalität des Proteins aufrechterhalten wird, während Antigenizität und/oder Allergenität herabgesetzt werden, a priori schwierig sein. Dies kann durch Erstellen einer Bibliothek von diversen Mutanten mit jeweils einer oder mehreren zusätzlichen eingebauten Glykosylierungsstellen und durch Auswählen derjenigen Varianten, die eine gute Funktionsretention und gleichzeitig eine gute Reduktion in der Antigenizität zeigen, erreicht werden. Im Falle von Lipase kann dies durch Prüfen der sekretierten, glykosylierten Lipasevarianten auf Enzymaktivität und Antigenbindung durch kompetitiven ELISA, wie nachstehend im experimentellen Abschnitt beschrieben, getestet werden; allerdings ist der Umfang der Erfindung keinesfalls auf Lipase beschränkt, die nur zur Bereitstellung eines Beispiels dient. Eine diversifizierte Bibliothek kann durch einen Bereich von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind (Reetz MT, Jarger KE; Biocatalysis, Discovery to Application, herausgegeben von Fessner WD, Bd. 200, Ss. 31–57, 1999, Stemmer, Nature, Bd. 370, S. 389–391, 1994, oder Zhao und Arnold, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 94, Ss. 7 997–8 000, 1997, oder Yano et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 95, Ss. 5 511–5 515, 1998) erstellt werden. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden Substitutionen durch ein Verfahren gefunden, das die folgenden Schritte umfasst: 1) ein Bereich von zusätzlichen Glykosylierungsstellen wird aufgelistet, 2) eine Bibliothek wird erstellt, die eine randomisierte Teilmenge dieser zusätzlichen Glykosylierungsstelle in das Zielgen einbaut, 3) die Bibliothek wird exprimiert, und bevorzugte Varianten werden selektiert. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird dieses Verfahren mit zusätzlichen Runden von Screening und/oder familiären Vermischen von Treffern aus der ersten Screeningrunde (J. E. Ness et al., Nature Biotechnology, Bd. 17, Ss. 893–896, 1999) und/oder durch Kombination mit anderen Verfahren zur Reduzierung der Allergenität durch genetische Mittel (wie diejenigen, die in WO 92/10755 offenbart sind) ergänzt.
  • Das Elternprotein kann jedes beliebige Protein sein. Der Begriff Elternprotein umfasst jedes Protein, wie ein Wildtyp-Protein oder eine Variante davon mit einer Funktionalität, die zu dem Elternprotein identisch ist.
  • Pharmazeutische Polypeptide
  • Der Begriff "pharmazeutische Polypeptide" ist als Polypeptide definiert, einschließlich von Peptiden wie Peptidhormonen, Proteinen und/oder Enzymen, die beim Einbringen in das Kreislaufsystem des Körpers von Menschen und/oder Tieren physiologisch aktiv sind.
  • Pharmazeutische Polypeptide sind potenziell immunogen, wenn sie in das Kreislaufsystem eingebracht werden.
  • Beispiele für "pharmazeutische Polypeptide", die bei der Erfindung betrachtet werden, umfassen Insulin, ACTH, Glucagon, Somatostatin, Somatotropin, Thymosin, Parathyroidhormon, Pigmenthormone, Somatomedin, Erythropoietin, luteinisierendes Hormon, chorionisches Gonadotropin, hypothalamische Freisetzungsfaktoren, antidiuretische Hormone, Thyroid stimulierendes Hormon, Relaxin, Interferon, Thrombopoetin (TPO) und Prolactin.
  • Demnach kann das erfindungsgemäße Verfahren auf Proteine angewandt werden, die für industrielle Zwecke eingesetzt werden, wie Enzyme.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Elternprotein ein Enzym und kann aus der Gruppe von Enzymen ausgewählt werden, die aus Proteasen, Lipasen, Phytasen, Polysaccharidlyasen, Oxidoreduktasen, Transglutaminasen, Glykosylhydrolasen und Glykoseisomerasen, insbesondere wie im Folgenden erwähnt, besteht.
  • Elternproteasen
  • Elternproteasen (d. h. Enzyme, die unter der Enzymklassifizierungsnummer E.C. 3.4 nach den Empfehlungen (1992) der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) klassifiziert sind, umfassen Proteasen innerhalb dieser Gruppe.
  • Beispiele umfassen Proteasen, die aus denjenigen ausgewählt sind, die aus den folgenden Enzymklassifizierungs(E. C.)-Nummern klassifiziert sind:
    3.4.11 (d. h. so genannte Aminopeptidasen), einschließlich 3.4.11.5 (Prolylaminopeptidase), 3.4.11.9 (X-Proaminopeptidase), 3.4.11.10 (bakterielle Leucylaminopeptidase), 3.4.11.12 (thermophile Aminopeptidase), 3.4.11.15 (Lysylaminopeptidase), 3.4.11.17 (Tryptophanylaminopeptidase), 3.4.11.18 (Methionylaminopeptidase).
    3.4.21 (d. h. so genannte Serinendopeptidasen), einschließlich 3.4.21.1 (Chymotrypsin), 3.4.21.4 (Trypsin), 3.4.21.19 (Glutamylendopeptidase Glu-C, V8 vom Staphylococcus aureus), 3.4.21.25 (Cucumisin), 3.4.21.32 (Brachyurin), 3.4.21.48 (Cerevisin) und 3.4.21.62 (Subtilisin);
    3.4.22 (d. h. so genannte Cysteinendopeptidasen), einschließlich 3.4.22.2 (Papain), 3.4.22.3 (Ficain), 3.4.22.6 (Chymopapain), 3.4.22.7 (Asclepain), 3.4.22.14 (Actinidain), 3.4.22.30 (Caricain) und 3.4.22.31 (Ananain);
    3.4.23 (d. h. so genannte Aspartinendopeptidasen), einschließlich 3.4.23.1 (Pepsin A), 3.4.23.18 (Aspergillopepsin I), 3.4.23.20 (Penicillopepsin) und 3.4.23.25 (Saccharopepsin) und
    3.4.24 (d. h. so genannte Metalloendopeptidasen), einschließlich 3.4.24.28 (Bacillolysin).
  • Beispiele für relevante Subtilisine umfassen Subtilisin BPN', Substilisin amylosacchariticus, Substilisin 168, Subtilisin mesentericopeptidase, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin 309, Subtilisin 147, Thermitase, Aqualysin, Bacillus PB92-Protease, Proteinase K, Protease TW7 und Protease TW3.
  • Spezielle Beispiele für solche leicht im Handel verfügbaren Proteasen umfassen Esperase®, Alcalase®, Neutrase®, Dyrazym®, Savinase®, Pyrase®, pankreatisches Trypsin NOVO (PTN), Bio-FeedTM Pro, Clear-Lens Pro (alle Enzyme erhältlich von Novo Nordisk A/S).
  • Beispiele für andere kommerzielle Proteasen umfassen Maxtase®, Maxacal®, Maxapem®, vertrieben von Gist-Brocades N.V., Opticlean®, vertrieben von Solvax und Cie., und Purafect®, vertrieben von Genencor International.
  • Es ist selbstverständlich, dass auch Proteasevarianten als Elternproteasen betrachtet werden. Beispiele für solche Proteasevarianten sind in EP 130.756 (Genentech), EP 214.435 (Henkel), WO 87/04461 (Amgen), WO 87/05050 (Genex), EP 251.446 (Genencor), EP 260.105 (Genencor), Thomas et al. (1985), Nature, 318, S. 375–376, Thomas et al. (1987), J. Mol. Biol., 193, S. 803–813, Russel et al. (1987), Nature, 328, S. 496–500, WO 88/08028 (Genex), WO 88/08033 (Amgen), WO 89/06279 (Novo Nordisk A/S), WO 91/00345 (Novo Nordisk A/S), EP 525 610 (Solvay) und WO 94/02618 (Gist-Brocades N.V.) offenbart.
  • Die Aktivität von Proteasen kann wie in "Methods of Enzymatic Analysis", 3. Ausg., 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 5, bestimmt werden.
  • Elternlipasen
  • Die Elternlipasen (d. h. Enzyme, die unter der Enzymklassifizierungsnummer E.C. 3.1.1 (Carbonsäureesterhydrolasen) gemäß den Empfehlungen (1992) der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) klassifiziert werden) umfassen die Lipasen innerhalb dieser Gruppe.
  • Beispiele umfassen Lipasen, die aus denjenigen ausgewählt sind, die unter den folgenden Enzymklassifizierungs(E. C.)-Nummern klassifiziert sind:
    3.1.1 (d. h. so genannte Carbonsäureesterhydrolasen), einschließlich (3.1.1.3) Triacylglycerollipasen, (3.1.1.4) Phosphorlipase A2.
  • Beispiele von Lipasen umfassen Lipasen, die sich von den folgenden Mikroorganismen ableiten. Die angegebenen Patentveröffentlichungen sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen:
    Humicola, z. B. H. brevispora, H. lanuginosa, H. brevis var. thermoidea und H. insolens ( US 4 810 414 )
    Pseudomonas, z. B. Ps. fragi, Ps. stutzeri, Ps. cepacia und Ps. fluorescens ( WO 89/04361 ) oder Ps. plantarii oder Ps. gladioli ( US-Patent Nr. 4 950 417 (Solvay enzymes)) oder Ps. alcaligenes und Ps. pseudoalcaligenes ( EP 218 272 ) oder Ps. mendocina ( WO 88/09367 ; US 5 389 536 ).
  • Fusarium, z. B. F. oxysporum ( EP 130 064 ) oder F. solani pisi ( WO 90/09446 ). Mucor (auch genannt Rhizomucor), z. B. M. miehei ( EP 238 023 ).
  • Chromobacterium (beispielsweise C. viscosum), Aspergillus (beispielsweise A. niger).
  • Candida, z. B. C. cylindracea (auch genannt C. rugosa) oder C. antarctica ( WO 88/02775 ) oder C. antarctica lipase A oder B ( WO 94/01541 und WO 89/02916 ).
  • Geotricum, z. B. G. candicum (Schimada et al. (1989), J. Biochem., 106, 383–388).
  • Penicillium, z. B. P. camembertii (Yamaguchi et al. (1991), Gene 103, 61–67).
  • Rhizopus, z. B. R. delemar (Hass et al. (1991), Gene 109, 107–113) oder R. niveus (Kugimiya et al. (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716–719) oder R. oryzae.
  • Bacillus, z. B. B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 53–260) oder B. stearothermophilus ( JP 64/7744992 ) oder B. pumilus ( WO 91/16422 ).
  • Spezielle Beispiele für im Handel unschwer erhältliche kommerzielle Lipasen umfassen Lipolase®, LipolaseTM Ultra, Lipozyme®, Palatase®, Novozym® 435, Lecitase® (alle erhältlich von Novo Nordisk A/S).
  • Beispiele für andere Lipasen sind LumafastTM, Ps. mendocian Lipase von Genencor Int. Inc.; LipomaxTM, Ps. pseudoalkaligenes Lipase von Gist Brocades/Genencor Int. Inc.; Fusarium solani Lipase (Cutinase) von Unilever; Bacillus sp. Lipase von Solvay Enzymes. Weitere Lipasen sind von anderen Firmen erhältlich.
  • Selbstverständlich werden auch Lipasevarianten als Elternenzym betrachtet. Beispiele für solche sind z. B. in WO 93/01285 und WO 95/22615 beschrieben.
  • Die Aktivität der Lipase kann bestimmt werden wie in "Methods of Enzymatic Analysis", 3. Ausg., 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 4, oder wie in AF 95/5 GB (auf Nachfrage erhältlich von Novo Nordisk A/S) beschrieben.
  • Eltern-Oxidoreduktasen
  • Die Eltern-Oxidoreduktasen (d. h. Enzyme, die unter der Enzymklassifizierungsnummer E.C. 1 (Oxidoreduktasen) nach den Empfehlungen (1992) der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) klassifiziert sind) umfassen die Oxidoreduktasen innerhalb dieser Gruppe.
  • Beispiele umfassen Oxidoreduktasen, die aus denjenigen ausgewählt sind, die unter den folgenden Enzymklassifizierungs(E.C.)-Nummern klassifiziert sind:
    Glycerol-3-phosphatdehydogenase _NAD+_ (1.1.1.8), Glycerol-3-phosphatdehydrogenase _NAD(P)+_ (1.1.1.94), Glycerol-3-phosphat-1-dehydrogenase _NADP_ (1.1.1.94), Glukoseoxidase (1.1.3.4), Hexoseoxidase (1.1.3.5), Catecholoxidase (1.1.3.14), Bilirubinoxidase (1.3.3.5), Alanindehydrogenase (1.4.1.1), Glutamatdehydrogenase (1.4.1.2), Glutamatdehydrogenase _NAD(P)+_ (1.4.1.3), Glutamatdehydrogenase _NADP+_ (1.4.1.4), L-Aminosäuredehydrogenase (1.4.1.5), Serindehydrogenase (1.4.1.7), Valindehydrogenase _NADP+_ (1.4.1.8), Leucindehydrogenase (1.4.1.9), Glycindehydrogenase (1.4.1.10), L-Aminosäureoxidase (1.4.3.2), D-Aminosäureoxidase (1.4.3.3), L-Glutamatoxidase (1.4.3.11), Protein-lysin-6-oxidase (1.4.3.13), L-Lysinoxidase (1.4.3.14), L-Aspartatoxidase (1.4.3.16), D-Aminosäuredehydrogenase (1.4.99.1), Proteindisulfidreduktase (1.6.4.4.), Thioredoxinreduktase (1.6.4.5), Proteindisulfidreduktase(glutathion) (1.8.4.2), Laccase (1.10.3.2), Catalase (1.11.1.6), Peroxidase (1.11.1.7), Lipoxygenase (1.13.11.12), Superoxiddismutase (1.15.1.1).
  • Diese Glukoseoxidasen können sich von Aspergillus niger ableiten.
  • Diese Laccasen können sich von Polyporus pinsitus, Myceliophtora thermophila, Coprinus cinereus, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia praticola, Scytalidium thermophilum und Rhus vernicifera ableiten.
  • Die Bilirubinoxidasen können sich von Myrothechecium verrucaria ableiten.
  • Die Peroxidasen können sich von Sojabohnen, Meerrettich oder Coprinus cinereus ableiten.
  • Die Proteindisulfidreduktase kann jede beliebige sein, die in einer der DK-Patentanmeldungen Nr. 768/93, 265/94 und 264/94 (Novo Nordisk A/S) erwähnt ist, die hier unter Bezugnahme mit eingeschlossen sind, einschließlich von Proteindisulfidreduktasen aus Rindern, Proteindisulfidreduktasen, die aus Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger stammen, und DsbA oder DsbC, die aus Escherichia coli stammen.
  • Spezielle Beispiele für im Handel unschwer erhältliche Oxidoreduktasen umfassen GluzymTM (Enzym, das von Novo Nordisk A/S erhältlich ist). Allerdings sind andere Oxidoreduktasen von anderen erhältlich.
  • Es ist selbstverständlich, dass Varianten von Oxidoreduktasen ebenfalls als das Elternenzym betrachtet werden.
  • Die Aktivität von Oxidoreduktasen kann bestimmt werden wie in "Methods of Enzymatic Analysis", 3. Ausg., 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 3, beschrieben.
  • Elternkohlenhydrate
  • Die Elternkohlenhydrate können wie alle Enzyme, die in der Lage sind, Kohlenhydratketten (z. B. Stärke) von insbesondere fünf- und sechsgliedrigen Ringstrukturen (d. h. Enzyme, die unter der Enzymklassifizierungsnummer E.C.3.2 (Glykosidasen) nach den Empfehlungen (1992) der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) klassifiziert sind) zu hydrolysieren, definiert werden. In der Gruppe der erfindungsgemäßen Kohlenhydraten sind auch Enzyme eingeschlossen, die in der Lage sind, Kohlenhydrate, z. B. sechsgliedrige Ringstrukturen, wie D-Glukose, zu z. B. fünfgliedrigen Ringstrukturen, wie D-Fructose, zu isomerisieren.
  • Beispiele umfassen Kohlenhydrate, die aus denjenigen gewählt sind, die unter den folgenden Enzymklassifizierungs(E.C.)-Nummern ausgewählt sind:
    α-Amylase (3.2.1.1), β-Amylase (3.2.1.2), Glucan-1,4-α-glukosidase (3.2.1.3), Cellulase (3.2.1.4), Endo-1,3(4)-β-glucanase (3.2.1.6), Endo-1,4-β-xylanase (3.2.1.8), Dextranase (3.2.1.11), Chitinase (3.2.1.14), Polygalacturonase (3.2.1.15), Lysozym (3.2.1.17), β- Glukosidase (3.2.1.21), α-Galaktosidase (3.2.1.22), β-Galaktosidase (3.2.1.23), Amylo-1,6-glukosidase (3.2.1.33), Xylan-1,4-β-xylosidase (3.2.1.37), Glukan-endo-1,3-β-D-glukosidase (3.2.1.39), α-Dextrin-endo-1,6-glukosidase (3.2.1.41, Sucrose-α-glukosidase (3.2.1.48), Glukan-endo-1,3-α-glukosidase (3.2.1.59), Glukan-1,4-β-glukosidase (3.2.1.74), Glukan-endo-1,6-β-glukosidase (3.2.1.75), Arabinan-endo-1,5-α-arabinosidase (3.2.1.99), Lactase (3.2.1.108), Chitonanase (3.2.1.132) und Xyloseisomerase (5.3.1.5).
  • Beispiele für relevante Kohlenhydrate umfassen α-1,3-Glukanasen, abgeleitet von Trichoderma harzianum; α-1,6-Glukanasen, abgeleitet von Paecilomycen; β-Glukanasen, abgeleitet von Bacillus subtilis; β-Glukanasen, abgeleitet von Humicola insolens; β-Glukanasen, abgeleitet von Aspergillus niger; β-Glukanasen, abgeleitet von Ketten von Trichoderma; β-Glukanasen, abgeleitet von Ketten von Oerskovia xanthineolytica; Exo-1,4-α-D-glukosidasen (Glukoamylasen), abgeleitet von Aspergillus niger; α-Amylasen, abgeleitet von Bacillus subtilis; α-Amylasen, abgeleitet von Bacillus amyloliquefaciens; α-Amylasen, abgeleitet von Bacillus stearothermophilus; α-Amylasen, abgeleitet von Aspergillus oryzae; α-Amylasen, abgeleitet von nicht-pathogenen Mikroorganismen; α-Galaktosidasen, abgeleitet von Aspergillus niger; Pentosanasen, Xylanasen, Cellobiasen, Cellulasen, Hemicellulasen, abgeleitet von Humicola insolens; Cellulasen, abgeleitet von Trichoderma reesei; Cellulasen, abgeleitet von nicht-pathogenem Schimmel; Pectinasen, Cellulasen, Arabinasen, Hemicellulasen, abgeleitet von Aspergillus niger; Dextranasen, abgeleitet von Penicillium lilacinum; Endoglukanasen, abgeleitet von nicht-pathogenem Schimmel; Pullulanasen, abgeleitet von Bacillus acidopullyticus; β-Galactosidasen, abgeleitet von Kluyveromyces fragilis; Xylanasen, abgeleitet von Trichoderma reesei.
  • Beispiele für im Handel leicht erhältliche Kohlenhydrate umfassen Alpha-GalTM, Bio-FeedTM Alpha, Bio-FeedTM Beta, Bio-FeedTM Plus, Bio-FeedTM Plus, Novozyme® 188, Carzeym®, Cellulast®, Cellusoft®, Ceremyl®, CitrozymTM, DenimaxTM, DezymeTM, DextrozymeTM, Finizym®, Fungamyl®, GamanaseTM, Glucanex®, Lactozym®, MaltogenaseTM, PentopanTM, PectinexTM, Promozyme®, PulpzymeTM, NovamylTM, Termamyl®, AMG (Amyloglukosidase Novo), Maltogenase®, Sweetzyme®, Aquazym®, Natalase® (alle Enzyme erhältlich von Novo Nordisk A/S). Andere Kohlehydrate sind von anderen Firmen erhältlich.
  • Die Kohlehydratvarianten können als das Elternenzym funktionieren.
  • Die Aktivität von Kohlehydraten kann wie in "Methods of Enzymatic Analysis", 3. Ausg., 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 4, beschrieben, bestimmt werden.
  • Elterntransferasen
  • Die Elterntransferasen (d. h. Enzyme, die unter der Enzymklassifizierungsnummer E.C. 2 nach den Recommendations (1992) der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) klassifiziert sind) umfassen die Transferasen innerhalb dieser Gruppe.
  • Die Elterntransferasen können jede beliebige Transferase in den Untergruppen von Transferasen sein: Transferasen, die Ein-Kohlenstoff-Gruppen transferieren (E.C. 2.1); Transferasen, die Aldehyd oder Reste transferieren (E.C. 2.2); Acyltransferasen (E.C. 2.3); Glukosyltransferasen (E.C. 2.4); Transferasen, die Alkyl- oder Arylgruppen transferieren, die anders sind als Methylgruppen (E.C. 2.5); Transferasen, die stickstoffhaltige Gruppen transferieren (2.6).
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Elterntransferase eine Transglutaminase E.C 2.3.2.13 (Proteinglutamin-μ-glutamyltransferase).
  • Transglutaminasen sind Enzyme, die in der Lage sind, eine Acyl-Transferreaktion zu katalysieren, wobei eine gamma-Carboxyamidgruppe eines Peptid-gebundenen Glutaminrestes der Acyldonor ist. Primäre Aminogruppen in einer Vielzahl von Verbindungen können als Acylakzeptoren mit der anschließenden Bildung von monosubstituierten gamma-Amiden von Peptid-gebundener Glutaminsäure funktionieren. Wenn die epsilon-Aminogruppe eines Lysinrestes in einer Peptidkette als Acylakzeptor dient, bilden die Transferasen intra- oder intermolekulare gamma-Glutamyl-epsilon-Lysyl-Vernetzungen.
  • Beispiele für Transglutaminasen sind in der anhängigen DK-Patentanmeldung Nr. 990/94 (Novo Nordisk A/S) beschrieben.
  • Die Elternglutaminase kann menschlichen, tierischen (z. B. vom Rind) oder mikrobiellen Ursprungs sein.
  • Beispiele für solche Elterntransglutaminasen sind von Tieren abgeleitete Transglutaminase, FXIIIa; mikrobielle Transglutaminasen, die von Physarum polycephalum (Klein et al., Journal of Bacteriology, Bd. 174, S. 2 599–2 605) abgeleitet sind; Transglutaminasen, die von Streptomyces sp. abgeleitet sind, einschließlich von Streptomyces lavendulae, Streptomyces lydicus (ehemals Streptomyces libani) und Streptoverticillium sp., einschließlich Streptoverticillium mobaraense, Streptoverticillium cinnamoneum und Streptoverticillium griseocarneum (Motoki et al., US 5 156 956 ; Andou et al., US 5 252 469 ; Kaempfer et al., Journal of General Microbioly, Bd. 137, S. 1 831–1 892; Ochi et al., International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 44, S. 285–292; Andou et al., US 5 252 469 ; Williams et al., Journal of General Microbioly, Bd. 129, S. 1 743–1 813).
  • Das Elternenzym kann auch Transferasevarianten darstellen.
  • Die Aktivität von Transglutaminasen kann bestimmt werden wie in "Methods of Enzymatic Analysis", 3. Ausg., 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 1–10 beschrieben.
  • Elternphytasen
  • Elternphytasen sind in der Gruppe von Enzymen eingeschlossen, die unter der Enzymklassifizierungsnummer E.C. 3.1.3 (Phosphorsäuremonoesterhydrolasen) nach den Empfehlungen (1992) der International Union of Biochemistry und Molecular Biology (IUBMB) klassifiziert sind.
  • Phytasen sind Enzyme, die von Mikroorganismen produziert werden, die die Umwandlung von Phytat zu Inositol und anorganischem Phosphor katalysieren.
  • Phytase produzierende Mikroorganismen umfassen Bakterien, wie Bacillus subtilis, Bacillus natto und Pseudomonas; Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae; und Fungi, wie Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus und Aspergillus nidulans und verschiedene andere Aspergillus-Spezies.
  • Beispiele für Elternphytasen umfassen Phytasen, die aus denjenigen ausgewählt sind, die unter den Enzymklassifizierungs(E.C.)-Nummern: 3-Phytase (3.1.3.8) und 6-Phytase (3.1.3.26) klassifiziert sind.
  • Die Aktivität der Phytasen kann wie in "Methods of Enzymatic Analysis", 3. Ausg., 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 1–10, bestimmt werden oder kann nach dem Verfahren, das in EP-A1-0 420 358 , Beispiel 2 A, beschrieben ist, bestimmt werden.
  • Eine Zusammensetzung kann mindestens ein Protein (Polypeptid) oder Enzym einschließen, das durch das erfindungsgemäße Verfahren produziert wird. Die Zusammensetzung kann weitere Polypeptide, Proteine oder Enzyme und/oder Bestandteile umfassen, die normalerweise in Körperpflegeprodukten wie Shampoo, Seifenstücke, Hautlotion, Hautcreme, Haarfärbemittel, Zahnpasta, Haushaltsgegenständen, Agrochemikalien, Körperpflegeprodukten, wie Reinigungspräparationen, z. B. für Kontaktlinsen, Kosmetika, Toilettenartikeln, Mund- und Hautpharmazeutika, Zusammensetzungen, die zur Behandlung von Textilien eingesetzt werden, Zusammensetzungen, die zur Herstellung von Lebensmitteln, z. B. beim Backen und in der Nahrung etc. verwendet werden.
  • Beispiele für die Proteine (Polypeptide)/Enzyme umfassen Enzyme, die Protease-, Lipase-, Oxidoreduktase-, Carbohydrase-, Transferase-, wie Transglutaminase-, Phytase- und/oder antimikrobielle Polypeptidaktivität aufweisen. Diese Enzyme können als Konjugate mit verminderter Aktivität vorhanden sein.
  • Das durch das erfindungsgemäße Verfahren produzierte Protein kann weiterhin typischerweise in einer Detergenszusammensetzung verwendet werden. Es kann in der Detergenszusammensetzung in Form eines nicht staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzym eingeschlossen sein. Nicht staubende Granulate können z. B. wie in US 4 106 991 und 4 661 452 (beide Novo Industrie A/S) offenbart hergestellt und können gegebenenfalls durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren beschichtet werden. Beispiele für wachsartige Beschichtungsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)-Produkte (Polyethylenglykol, PEG) mit mittleren Molekulargewichten von 1 000 bis 20 000; ethoxylierte Nonylphenole mit 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten; ethoxylierte Fettalkohole, wobei der Alkohol 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und wobei 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten vorhanden sind; Fettalkohole; Fettsäuren; Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende Beschichtungsmaterialien, die zur Anwendung durch Flüssigbetttechniken geeignet sind, sind in der Patentschrift GB 1483591 angegeben. Flüssige Enzympräparationen können beispielsweise durch Zugabe eines Polyols, wie Propylenglykol, eines Zuckers oder Zuckeralko hols, Milchsäure oder Borsäure nach den bewährten Verfahren stabilisiert werden. Weitere Enzymstabilisatoren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Geschützte Enzyme können nach dem in EP 238 216 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Die Detergenszusammensetzung kann in jeder zweckmäßigen Form, z. B. als Pulver, Granulatkörner, Paste oder als Flüssigkeit vorliegen. Ein flüssiges Detergens kann wässrig sein, das typischerweise bis zu 70 % Wasser und 0–30 % organisches Lösungsmittel enthält, oder nicht-wässrig sein.
  • Die Detergenszusammensetzung umfasst ein oder mehrere Tenside, die jeweils anionisch, nicht-ionisch, kationisch oder zwitterionisch sein können. Das Detergens enthält im Allgemeinen 0–50 % anionisches Tensid, wie lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkoholethoxysulfat (AEOS oder AES), sekundäre Alkansulfonate (SAS), alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkyl- oder Alkenylsuccinsäure oder Seife. Es kann auch 0–40 % nicht-ionisches Tensid enthalten, wie Alkoholethoxylat (AEO oder AE), carboxylierte Alkoholethoxylate, Nonylphenolethoxylat, Alkylpolyglykosid, Alkyldimethylaminoxid, ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid, Fettsäuremonoethanolamid oder Polyhydroxyalkylfettsäureamid (z. B. wie in WO 92/06154 ) beschrieben) enthalten.
  • Die Detergenszusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere andere Enzyme, wie z. B. Proteasen, Amylasen, Lipasen, Cutinasen, Cellulasen, Peroxidasen, Oxidasen und weitere antimikrobielle Polypeptide umfassen.
  • Das Detergens kann 1–65 % eines Detergens-Builders oder ein Komplexierungsmittel, wie Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Citrat, Nitrilotriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTMPA), Alkyl- oder Alkenylsuccinsäure, lösliche Silicate oder Schichtsilicate (z. B. SKS-6 von Hoechst) enthalten. Das Detergens kann auch ohne Builder, d. h. im Wesentlichen frei von Detergens-Buildern sein.
  • Das Detergens kann ein oder mehrere Polymere einschließen. Beispiele sind Carboxymethylcellulose (CMC), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Polyethylenglykol (PEG), Poly(vinylalkohol) (PVA), Polycarboxylate, wie Polyacrylate, Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymere und Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymere.
  • Das Detergens kann ein Bleichsystem enthalten, das eine H2O2-Quelle einschließen kann, wie Perborat oder Percarbonat, die mit einem Persäure bildenden Bleichaktivator kombiniert werden kann, wie Tetraacetylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzolsulfonat (NOBS). Alternativ kann das Bleichsystem Peroxysäuren von z. B. den Amid-, Imid- oder Sulfontyp umfassen.
  • Die Detergenszusammensetzung, die ein erfindungsgemäß produziertes Polypeptid umfasst, kann unter Verwendung von herkömmlichen Stabilisierungsmitteln, z. B. ein Polyol, wie Propylenglykol oder Glycerin, ein Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure, Borsäure oder ein Borsäurederivat, wie ein aromatischer Boratester, stabilisiert werden, und die Zusammensetzung kann wie in z. B. WO 92/19709 und WO 92/19708 beschrieben, formuliert werden.
  • Das Detergens kann auch weitere herkömmliche Detergensbestandteile enthalten, wie z. B. Textilstoff-Konditionierer, einschließlich von Tonen, Schaumverstärkern, Seifenschaum(Seifenlauge?)-Unterdrückern, Korrosionshemmern, Schmutzsuspendiermitteln, Antischmutzablagerungsmitteln, Farbstoffen, Bakteriziden, optischen Aufhellern oder Duftstoff.
  • Der pH (gemessen in wässriger Lösung bei Gebrauchskonzentration) ist im Allgemeinen neutral oder alkalisch, Z. B. im Bereich von 7–11.
  • Geschirrspülzusammensetzung
  • Weiterhin kann ein modifiziertes Enzymsystem, das erfindungsgemäß produziert wurde, auch in Geschirrspülmitteln eingesetzt werden.
  • Geschirrspülmittelzusammensetzungen umfassen ein Tensid, das anionisch, nicht-ionisch, kationisch, amphoter oder ein Gemisch dieser Typen sein kann. Das Detergens enthält 0–90 % nicht-ionisches Tensid, wie schäumungsarme oder nicht schäumende ethoxylierte propoxylierte geradkettige Alkohole.
  • Die Detergenszusammensetzung kann Detergens-Buildersalze von anorganischen und/oder organischen Typen enthalten. Die Detergens-Builder können in Phosphor enthaltende und Nicht-Phosphor enthaltende Typen unterteilt werden. Die Detergenszusammensetzung enthält normalerweise 1–90 % Detergens-Builder.
  • Beispiele für Phosphor enthaltende anorganische alkalische Detergens-Builder umfassen, sofern vorhanden, die wasserlöslichen Salze, insbesondere Alkalimetallpyrophosphate, Orthophosphate und Polyphosphate. Ein Beispiel für Phosphor enthaltenden organischen alkalischen Detergens-Builder umfasst, sofern vorhanden, die wasserlöslichen Salze von Phosphonaten.
  • Beispiele für Nicht-Phosphor enthaltende anorganische Builder, umfassen, wenn vorhanden, wasserlösliche Alkalimetallcarbonate, -borate und Silicate sowie die verschiedenen Typen von wasserunlöslichen kristallinen oder amorphen Aluminosilicaten, wovon die Zeolithe die am besten bekannten Vertreter sind.
  • Beispiele für geeignete organische Builder umfassen das Alkalimetall, Ammonium und substituiertes Ammonium, Citrate, Succinate, Malonate, Fettsäuresulfonate, Carboxymethoxysuccinate, Ammoniumpolyacetate, Carboxylate, Polycarboxylate, Aminopolycarboxylate, Polyacetylcarboxylate und Polyhydroxysulfonate.
  • Weitere geeignete organische Builder umfassen die höher molekularen Polymere und Copolymere, die bekanntlich Builder-Eigenschaften aufweisen, beispielsweise entsprechende Polyacrylsäure, Polymalein- und Polyacrylsäure/Polymaleinsäurecopolymere und ihre Salze.
  • Die Geschirrspülzusammensetzung kann Bleichmittel des Chlor/Bromtyps und des Sauerstofftyps enthalten. Beispiele für anorganische Chlor/Bromtyp-Bleichen sind Lithium-, Natrium- oder Calciumhypochlorid und -hypobromid sowie chloriertes Trinatriumphosphat. Beispiele für Bleichmittel vom organischen Chlor/Bromtyp sind heterocyclische N-Brom und N-Chlorimide, wie Trichlorisocyanursäure, Tribromisocyanursäure, Dibromisocyanursäure und Dichlorisocyanursäure und Salze davon mit Wasser-solubiliserenden Kationen, wie Kalium und Natrium. Hydantoinverbindungen sind ebenfalls geeignet.
  • Die Sauerstoffbleichen sind bevorzugt, beispielsweise in Form von einem anorganischen Persalz, vorzugsweise mit einem Bleichvorläufer oder als eine Peroxysäureverbindung. Typische Beispiele für geeignete Peroxy-Bleichverbindungen sind Alkalimetallperborate, sowohl Tetra- als auch Monohydrate, Alkalimetallpercarbonate, Persilicate und Perphosphate. Bevorzugte Aktivatormaterialien sind TAED und Glycerintriacetat.
  • Die Geschirrspülmittelzusammensetzung kann unter Verwendung von herkömmlichen Stabilisierungsmitteln für das Enzym (die Enzyme) stabilisiert werden, z. B. ein Polyol, wie Propylenglykol, ein Zucker oder ein Zuckeralkohol, Milchsäure, Borsäure oder ein Borsäurederivat, z. B. ein aromatischer Boratester.
  • Die Geschirrspülmittelzusammensetzung kann auch andere herkömmliche Detergensbestandteile enthalten, z. B. Entflockungsmittel, Füllstoffmaterialien, Schaumunterdrücker, Antikorrosionsmittel, Schmutzsuspendiermittel, Sequestriermittel, Antischmutzablagerungsmittel, Dehydratationsmittel, Farbstoffe, Bakterizide, fluoreszierende Mittel, Verdicker und Duftstoffe.
  • Schließlich kann das erfindungsgemäß hergestellte Enzym in herkömmlichen Geschirrspül-Detergentien eingesetzt werden, z. B. in jedem der Detergentien, die in einer der folgenden Patentveröffentlichungen beschrieben sind:
    EP 518719 , EP 518720 , EP 518721 , EP 516553 , EP 516554 , EP 516555 , GB 2200132 , DE 3741617 , DE 3727911 , DE 4212166 , DE 4137470 , DE 3833047 , WO 93/17089 , DE 4205071 , WO 52/09680 , WO 93/18129 , WO 93/04153 , WO 92/06157 , WO 92/08777 , EP 429124 , WO 93/21299 , US 5141664 , EP 561452 , EP 561446 , GB 2234980 , WO 93/03129 , EP 481547 , EP 530870 , EP 533239 , EP 554943 , EP 346137 , US 5112518 , EP 318204 , EP 318279 , EP 271155 , EP 271156 , EP 346136 , GB 2228945 , CA 2006687 , WO 93/25651 , EP 530635 , EP 414197 , US 5240632 .
  • Körperpflegeanwendungen:
  • Das erfindungsgemäß hergestellte Protein ist auch im Zusammenhang mit Körperpflegeanwendungen von Interesse.
  • Proteasen
  • Proteasen sind gut bekannte Wirkstoffe zum Reinigen von Kontaktlinsen. Sie hydrolysieren den proteinhaltigen Schmutz auf den Linsen und machen ihn dadurch löslich. Die Entfernung des Proteinschmutzes ist für den Tragekomfort wesentlich.
  • Proteasen sind auch wirksame Bestandteile in Hautreinigungsprodukten, wo sie die obere Schicht von toten keratinhaltigen Hautzellen entfernen und dadurch die Haut strahlender und frischer aussehen lassen.
  • Proteasen werden auch in Mundpflegeprodukten verwendet, insbesondere zum Reinigen von Gebissen, jedoch auch bei Zahnpasten.
  • Weiterhin können Proteasen in Toilettenartikeln, Bad- und Duschprodukten einschließlich von Shampoos, Conditionern, Lotionen, Cremen, Seifenstücken, Toilettenseifen und flüssigen Seifen, verwendet werden.
  • Lipasen
  • Lipasen können für kosmetische Anwendung und als Wirkstoffe in Hautreinigungsprodukten und Anti-Akne-Produkten zur Entfernung von überschüssigen Hautlipiden und in Bad- und Duschprodukten, wie Cremes und Lotionen, als Wirkstoff zur Hautpflege eingesetzt werden.
  • Lipasen können auch in Haarreinigungsprodukten (z. B. Shampoos) zur wirksamen Entfernung von Sebum und anderen fetthaltigen Materialien von der Haaroberfläche eingesetzt werden.
  • Lipasen sind auch Wirkstoffe in Produkten zum Reinigen von Kontaktlinsen, wo sie Lipidablagerungen von der Linsenoberfläche entfernen.
  • Oxidoreduktasen
  • Die häufigste Oxidoreduktase für Körperpflegeprodukte ist eine Oxidase (im Allgemeinen Glukoseoxidase) mit Substrat (z. B. Glukose), welches die Produktion von H2O2 gewährleistet, welches anschließend die Oxidation von beispielsweise SCN- oder I- zu antimikrobiellen Reagenzien (SCNO- oder I2) oder durch eine Peroxidase (im Allgemeinen Lactoperoxidase) auslöst. In der Natur ist ein Enzymkomplex, z. B. aus Milch und Speichel, bekannt.
  • Er wird kommerziell als antimikrobielles System in Mundpflegeprodukten (Mundspülung, Zahnpasta, Kaugummi) eingesetzt, wo sie auch mit einer Amyloglukosidase kombiniert werden kann, um die Glukose zu produzieren. Diese Systeme sind auch in Kosmetikprodukten zur Konservierung bekannt.
  • Antimikrobielle Systeme, die die Kombination einer Oxidase und einer Peroxidase umfassen, sind bei der Reinigung von Kontaktlinsen bekannt.
  • Eine weitere Anwendung von Oxidoreduktasen besteht im oxidativen Haarfärben unter Verwendung von Oxidasen, Peroxidasen und Laccasen.
  • Freie Radikale, die auf der Oberfläche der Haut (und des Haares) gebildet werden, sind bekanntlich mit dem Alterungsprozess der Haut assoziiert. Die freien Radikale aktivieren Kettenreaktionen, die zur Zerstörung von Fettmembranen, Collagen und Zellen führen. Die Anwendung von freien Radikalfängern, wie Superoxiddismutase, in Kosmetika ist bekannt (R. L. Goldemberg, DCI, Nov. 93, S. 48–52).
  • Die Proteindisulfidisomerase (PDI) ist ebenfalls eine Oxidoreduktase. Sie kann für Haarwellen (Reduktion und Reoxidation von Disulfidbindungen im Haar) und zur Reparatur von geschädigtem Haar (wo die Schädigung hauptsächlich die Reduktion von existierenden Disulfidbindungen bedeutet) eingesetzt werden.
  • Kohlehydrate
  • Plaque, die auf der Oberfläche von Zähnen gebildet wird, besteht hauptsächlich aus Polysacchariden. Sie haften an der Oberfläche der Zähne und der Mikroorganismen. Die Polysaccharide sind hauptsächlich α-1,6-gebundene Glukose (Dextran) und α-1,3-gebundene Glukose (Mutan). Die Anwendung verschiedener Typen von Glukanasen, wie Mutanase und Dextranase, unterstützt die Hydrolysierung des klebrigen Materials von Plaque, was die Entfernung durch mechanische Einwirkungen leichter macht.
  • Auch andere Biofilm-Arten, beispielsweise der Biofilm, der in Linsenbehältern gebildet wird, kann durch die Wirkung von Glukanasen entfernt werden.
  • Nahrung und Futter
  • Weitere konjugierte Enzyme oder Polypeptide mit herabgesetzter Allergenität, die erfindungsgemäß hergestellt wurden, können zweckmäßigerweise bei der Herstellung von Lebensmittel und Futter eingesetzt werden.
  • Proteasen
  • Das Gluten in Weizenmehl ist der wesentliche Bestandteil, der für verantwortlich ist, dass Mehl in Backwaren eingesetzt wird. Proteolytische Enzyme werden manchmal zur Modifizierung der Glutenphase des Teigs benötigt, z. B. ein Hartweizenmehl kann mit einer Protease weich gemacht werden.
  • Neutrase® ist eine im Handel erhältliche neutrale Metalloprotease, die zur Sicherstellung einer gleichmäßigen Teigqualität und Brotbeschaffenheit und zur Verbesserung des Aromas verwendet werden kann. Die Glutenproteine sind werden entweder moderat oder intensiver zu Peptiden abgebaut, wobei sorgfältige Kontrolle notwendig ist, um ausgiebiges Erweichen des Teiges zu vermeiden.
  • Proteasen werden auch zur Modifizierung von Milchprotein verwendet. Zur Koagulation von Casein in Milch, bei der Produktion von Käse, können Proteasen, wie Lab oder Chymosin, verwendet werden.
  • In der Brauindustrie werden Proteasen zum Brauen mit ungemälzten Cerealien und zur Kontrolle des Stickstoffgehaltes verwendet. In Tierfutterprodukten werden Proteasen sozusagen zu Expansion des tierischen Verdauungssystems verwendet.
  • Lipasen
  • Die Anwendung von Lipasen in der Backwarenindustrie ist recht neu. Der Zusatz von Lipase bewirkt verbesserte Teigeigenschaften und eine verbesserte Brot-Herstellungsqualität hinsichtlich größerem Volumen, verbesserter Krustenstruktur und weißerer Krustenfarbe. Die festgestellte Auswirkung kann durch einen Mechanismus erklärt werden, wobei die Lipase die Wechselwirkung zwischen Gluten und einigen Lipidfragmenten während des Teigmischens verändert. Dies führt zu einem verbesserten Gluten-Netzwerk.
  • Die Aromaentwicklung von Blauschimmelkäse (z. B. Danablue), bestimmten italienischem Käse und anderen Molkereiprodukten, die Butterfett enthalten, hängt von dem Abbau von Milchfett in freie Fettsäuren ab. Lipasen können zur Entwicklung von Aroma in solchen Produkten verwendet werden. In der öl- und fettproduzierenden Industrie werden Lipasen, z. B. zur Minimierung der Menge unerwünschter Nebenprodukte, zur Modifizierung von Fetten durch Umesterung und zur Synthese von Estern, verwendet.
  • Oxidoreduktasen
  • Weitere Oxidoreduktasen mit herabgesetzter Allergenität, die erfindungsgemäß produziert werden, können zweckmäßigerweise bei der Herstellung von Nahrungsmitteln und Futter verwendet werden.
  • Mehrere Oxidoreduktasen, Glukoseoxidase, Lipoxygenase, Peroxidase, Katalase und Kombinationen davon werden zum Backen verwendet. Traditionsgemäß verstärken Bäcker Gluten durch Zugabe von Ascorbinsäure und Kaliumbromat. Einige Oxidoreduktasen können zum Ersatz von Bromat in Teigsystemen durch Oxidation von freien Sulfhydryleinheiten in Glu tenproteinen verwendet werden. Hierdurch werden Disulfidverknüpfungen gebildet, die zu stärkeren elastischeren Teigen mit größerer Beständigkeit führen.
  • GluzymeTM (Novo Nordisk A/S) ist eine Glukoseoxidasepräparation mit Katalaseaktivität, die zum Ersatz von Bromat verwendet werden kann. Die Teigfestigkeit wird durch größere Beständigkeit gegenüber mechanischer Erschütterung, besserer Ofenentnahme und größerem Laibvolumen gemessen.
  • Kohlenhydrate
  • Mehl hat einen variierenden Gehalt an Amylasen, was zu Unterschieden in der Backqualität führt. Die Zugabe von Amylasen kann notwendig sein, um das Mehl zu standardisieren. Amylasen und Pentosanasen stellen im Allgemeinen Zucker für die Hefefermentation bereit, verbessern das Brotvolumen, Verzögern die Retrogradation und vermindern die Rate des Altwerdens und der Klebrigkeit, die von Pentosan-Klebstoffen herrührt. Beispiele für Kohlehydrate sind nachstehend angegeben.
  • Bestimmte maltogene Amylasen können zur Verlängerung der Lagerungsdauer von Brot für zwei oder mehr Tage, ohne dass in dem Produkt Gummiartigkeit auftritt, eingesetzt werden. Der Mechanismus dahinter besteht darin, dass die Amylasen selektiv die gelierte Stärke durch die Abspaltung von dem nicht reduzierenden Ende der Stärkemoleküle von niedermolekularen Zuckern und Dextrinen modifizieren. Die Stärke wird in einer solchen Weise modifiziert, dass Retrogradation weniger wahrscheinlich eintritt. Die produzierenden niedermolekularen Zucker verbessern das Backwaren-Wasserretentionsvermögen, ohne dass intermediär lange Dextrine erzeugt werden, die zur Gummiartigkeit in dem fertigen Produkt führen. Das Enzym wird während des Brotbackens inaktiviert, sodass es als Prozesshilfe angesehen werden kann, die nicht auf dem Etikett angegeben zu werden braucht. Eine Überdosierung von Novamyl kann fast ausgeschlossen werden.
  • Das Brotvolumen kann durch Pilz-α-Amylasen verbessert werden, die weiterhin eine gute und gleichmäßige Struktur der Brotkruste bereitstellen. Die α-Amylasen sind Endoenzyme, die Maltose, Dextrine und Glukose produzieren. Cerealische und einige bakterielle α-Amylasen werden bei Temperaturen oberhalb der Gelierungstemperatur von Stärke inaktiviert, darum werden bei Zugabe zu Weizenteig ein geringes Brotvolumen und ein klebriges Brotinneres erzielt. Fungamyl besitzt den Vorteil, wärmelabil zu sein und wird unmittelbar unterhalb der Geliertemperatur inaktiviert.
  • Enzympräparationen, die eine Anzahl von Pentosanase und Hemicellulaseaktivitäten enthalten, können die Handhabung und Stabilität des Teigs verbessern, und verbessern die Frische, die Krustenstruktur und das Volumen des Brotes.
  • Durch Hydrolyse der Fraktion von Pentosanen in Mehl verliert es einen großen Teil seines Wasserbindevermögens, und das Wasser steht dann für Stärke und Gluten zur Verfügung. Das Gluten wird biegsamer und dehnbarer, und die Stärke geliert leichter. Pentosanasen können in Kombination mit oder als Alternative zu Emulgatoren verwendet werden.
  • Weitere Kohlehydrate werden zur Herstellung von Sirupen als Stärke verwendet, die in Softdrinks, Süßigkeiten, Fleischprodukten, Molkereiprodukten, Brotprodukten, Eiscreme, Babynahrung, Marmelade etc. breit eingesetzt werden.
  • Die Umwandlung von Stärke wird normalerweise in drei Schritten durchgeführt. Als Erstes wird die Stärke unter Verwendung von α-Amylasen verflüssigt. Maltodextrine, primär aus Oligosacchariden und Dextrinen bestehend, werden erhalten.
  • Anschließend wird das Gemisch mit Amyloglukosidase zur Hydrolyse der Oligosaccharide und Dextrine zu Glukose behandelt. Auf diese Weise wird ein süßeres Produkt erhalten. Wenn maltosereiche Sirupe erwünscht sind, können β-Amylasen allein oder in Kombination mit einer Pullulanase (Debranching-Enzyme) eingesetzt werden.
  • Das Glukosegemisch kann durch Isomerisierung zu Fructose sogar noch süßer gemacht werden. Für diesen Zweck kann eine immobilisierte Glukoseisomerase verwendet werden.
  • In der Zuckerindustrie ist es eine übliche Praxis, den Abbau von Stärke in Zuckerrohrsäften zu beschleunigen. Dadurch wird der Stärkegehalt in dem Rohzucker herabgesetzt, und die Filtration in der Raffinationsanlage erleichtert.
  • Außerdem werden Dextranasen zum Abbau von Dextran in Rohzuckersäften und Sirupen verwendet.
  • In der Alkoholindustrie werden α-Amylasen zweckmäßigerweise für das Verdünnen von Stärke beim Destillieren von Maischen eingesetzt.
  • In der Brauindustrie werden α-Amylasen als Verflüssigungszusatz verwendet.
  • In der Molkereiindustrie werden β-Galaktosidasen (Lactasen) bei der Produktion von lactosearmer Milch für Personen, die an Lactosemalabsorption leiden, verwendet.
  • Werden aromatisierte Milchgetränke aus Lactase behandelter Milch hergestellt, kann die Zugabe von Zucker herabgesetzt werden, ohne dass die Süße des Produkts vermindert wird.
  • Bei der Herstellung von Kondensmilch kann Lactosekristallisation durch Lactasebehandlung vermieden werden, und das Risiko des durch Caseincoagulation in Lactosekristallen verursachten Eindickens wird somit herabgesetzt.
  • Bei der Produktion von Eiscreme, die aus Lactase behandelter Milch (oder Molke) hergestellt wird, bilden sich keine Lactosekristalle, und der Fehler der Sandigkeit tritt nicht auf.
  • Außerdem werden Xylanasen bekanntlich innerhalb einer Anzahl von Nahrungsmittel/Futtermittelindustrieanwendungen eingesetzt, wie in WO 94/21785 (Novo Nordisk A/S) verwendet.
  • α-Amylasen werden in der Tierfutterindustrie als Zusatz zu getreidehaltigem Futter zur Verbesserung der Verdaulichkeit von Stärke verwendet.
  • Antimikrobielle Polypeptide
  • Es können bestimmte bakteriolytische Enzyme verwendet werden, z. B. zum Waschen von Karkassen in der Fleischverpackungsindustrie (siehe US-Patentschrift Nr. 5 354 681 von Nova Industri A/S).
  • Transferasen
  • Transglutaminasen mit herabgesetzter Allergenität, die erfindungsgemäß hergestellt werden, können zweckmäßigerweise bei der Herstellung von Nahrung und Futter eingesetzt werden.
  • Transglutaminasen besitzen die Fähigkeit der Vernetzung von Proteinen. Diese Eigenschaft kann für das Gelieren von wässrigen Phasen, die Proteine enthalten, verwendet werden. Dies kann verwendet werden, wenn Aufstriche hergestellt werden ( DK-Patentanmeldung Nr. 1071/84 von Novo Nordisk A/S).
  • Transglutaminasen werden zur Verbesserung der Backqualität von Mehl, z. B. durch Modifizieren von Weizenmehl, das bei der Herstellung von Kuchen mit verbesserten Eigenschaften, wie verbesserter Geschmack, Kau-, Mundgefühl und mit einem höheren Volumen (siehe JP 1-110147 ) verwendet werden soll, verwendet.
  • Weiterhin zur Herstellung von pastenartigem Lebensmittelmaterial, z. B. das als Fettersatz in Lebensmitteln, wie Eiscreme, Garnierungen, gefrorenen Desserts, Mayonnaise und fettarmen Aufstrichen verwendet wird (siehe WO 93/22930 von Novo Nordisk A/S).
  • Außerdem zur Herstellung von Gelen für Joghurt, Mousses, Käse, Puddings, Orangensaft, aus Milch und Milchprodukten, und Binden von Hackfleischprodukten, Verbesserung von Geschmack und Konsistenz von Lebensmittelproteinen (siehe WO 94/21120 und WO 94/21129 von Novo Nordisk A/S).
  • Phytasen
  • Die Phytasen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden, können zweckmäßigerweise bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, wie Frühstücks-Cerealien, Kuchen, Süßigkeiten, Getränken, Brot oder Suppe etc. und Tierfutter verwendet werden.
  • Die Phytasen können entweder zur Ausnutzung der Phosphorbindung in dem Phytat/der Phytinsäure, die in Gemüseproteinquellen vorhanden ist oder zur Ausnutzung der für den Nährwert wichtigen Mineralien, die in Phytinsäurekomplexen gebunden sind, verwendet werden.
  • Mikrobielle Phytasen können als Futtermittel für monogastrische Tiere zugesetzt werden, um die Anreicherung des Futters mit anorganischem Phosphor zu vermeiden (siehe US-Patentschrift Nr. 3 297 548 ).
  • Weitere Phytasen können bei der Sojaverarbeitung eingesetzt werden. Speisen mit Sojabohnen können hohe Konzentrationen des nährwertarmen Faktors Phytat enthalten, was diese Proteinquelle zur Anwendung in Babynahrung und als Futter für Fische, Kälber und andere Nicht-Widerkäuer ungeeignet macht, da Phytat wesentliche darin vorhandene Mineralien chelatisiert (siehe EP 0 420 358 ).
  • Auch für Backzwecke können Phytasen verwendet werden. Brot mit besserer Qualität kann durch Backen von aufgeteilten Stücken eines Teigs, der Weizenmehl etc. und Phytase enthält, hergestellt werden (siehe JP-0-3076529-A ).
  • Eine hohe Phytaseaktivität im Koji-Schimmel wird bekanntlich bei der Herstellung von verfeinertem Sake eingesetzt (siehe JP-0-6070749-A ).
  • Textile Anwendungsmöglichkeiten:
  • Proteasen
  • Proteasen werden zur Degummierung und zur Sandwäsche von Seide verwendet.
  • Lipasen
  • Lipasen werden zur Entfernung von Fettsubstanz, die hydrophobe Ester enthält (z. B. Triglyceride), während des Appretierens von Textilien verwendet (siehe z. B. WO 93/13256 von Novo Nordisk A/S).
  • Oxidoreduktasen
  • Bei der bleichenden Reinigung von Textilien können Katalasen zur Entfernung von überschüssigem Wasserstoffperoxid dienen.
  • Kohlehydrate
  • Cellulolytische Enzyme werden bei der Appretur von Denimbekleidungen breit eingesetzt, um eine lokale Schwankung in der Farbdichte des Stoffes bereitzustellen (enzymunterstütztes "stone wash").
  • Auch bei dem Biopoliturverfahren finden cellulolytische Enzyme Anwendung. Das Biopolieren ist eine spezielle Behandlung der Garnoberfläche, die die Stoffqualität bezüglich Handhabung und Aussehen ohne Verlust der Stoff-Benetzbarkeit verbessert. Biopolieren kann durch Anwenden des z. B. in WO 93/20278 beschriebenen Verfahrens erhalten werden.
  • Während des Webens von Textilien werden die Fäden beträchtlicher mechanischer Belastung ausgesetzt. Um ein Reißen zu verhindern, werden die Fäden im Allgemeinen durch die Beschichtung (Schlichte) aus einer gelatinösen Substanz (Schlichte) verstärkt. Das häufigste Schlichtemittel ist Stärke in nativer oder modifizierter Form. Eine gleichmäßige und haltbare Appretur kann somit nur nach Entfernung der Schlichte von dem Textilstoff, dem so genannten Entschlichten, erhalten werden. Das Entschlichten von Textilstoffen, die mit einer Schlichte, die Stärke oder modifizierte Stärke enthält, geschlichtet wurden, wird vorzugsweise durch die Verwendung von amylolytischen Enzymen erleichtert.
  • Orale und dermale Pharmazeutika:
  • Proteasen
  • Verschiedene Kombinationen von hoch aufgereinigten Proteasen (z. B. Trypsin und Chymotrypsin) werden in oral einzunehmenden Pharmazeutika und in dermalen Pharmazeutika zur Bekämpfung z. B. von Entzündungen, Ödemen und Verletzungen verwendet.
  • Lederherstellung:
  • Transferase
  • Transglutaminase ist zur Verwendung bei dem Casein-Finishing von Leder durch Wirken als ein Härtungsmittel bekannt (siehe WO 94/13839 von Novo Nordisk).
  • Reinigung von glatten Flächen:
  • Das Reinigen von glatten Flächen z. B. in der Nahrungsmittelindustrie ist oft schwer, da die zur Herstellung von Milchprodukten, Fleisch, Fischprodukten, Getränken etc. verwendete Anlage oft eine komplizierte Form aufweist. Die Verwendung von Tensidzusammensetzungen in Form von Gelen und Schäumen, die Enzyme einschließen, hat gezeigt, dass sie die Reinigung glatter Flächen erleichtert und verbessert. Enzyme, die zweckmäßigerweise solchen Tensidzusammensetzungen zugesetzt werden können, sind insbesondere Proteasen, Lipasen, Amylasen und Cellulasen.
  • Solche Reinigungszusammensetzungen für glatte Oberflächen, die Enzyme umfassen, können auch zweckmäßigerweise im Transportbereich, beispielsweise zum Waschen von Autos oder für das allgemeine Waschen von Gefäßen eingesetzt werden.
  • Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung des Proteins, das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurde, oder eine Zusammensetzung, die das Protein in Produkten, die Polypeptide umfassen, einschließt.
  • Als Erstes kann das gesamte Konjugat oder die Zusammensetzung, die erfindungsgemäß hergestellt wurde, zweckmäßigerweise für Körperpflegeprodukte, wie Haarpflege- und Haarbehandlungsprodukte, eingesetzt werden. Diese umfassen Produkte wie Shampoo, Haar-Conditioner, Haarwellen-Zusammensetzungen, Haarfärbung-Zusammensetzungen, Haarwasser, Haarflüssigkeit, Haarcreme, Haarspülung, Haarspray.
  • Weiterhin betrachtet werden Mundpflegeprodukte, wie Zahnpasta, Mundspülung, Kaugummi.
  • Zusätzlich betrachtet werden Hautpflegeprodukte, wie Kosmetika, wie Hautcreme, Hautmilch, Reinigungscreme, Reinigungslotion, Reinigungsmilch, Coldcream, Cremeseife, Nähressenz, Hautlotion, Milchlotion, Calaminlotion, Handcreme, Pulverseife, Transparentseife, Sonnenöl, Sonnenschutz, Rasierschaum, Rasiercreme, Babyöl, Lippenstift, Lippencreme, cremige Grundierung, Gesichtspuder, Puderlidschatten, Puder, Grundierung, Make up-Grundlage, Essenzpuder, Bleichpuder.
  • Auch für Kontaktlinsen-Hygieneprodukte kann das erfindungsgemäße Konjugat zweckmäßigerweise verwendet werden. Solche Produkte umfassen Kontaktlinsen-Reinigungs- und Desinfektionsprodukte.
  • Die Verwendung von Detergentien, wie Waschpulver, Seife, Seifenstücke, Flüssigseife, wird ebenfalls betrachtet.
  • Die Erfindung kann auch die Verwendung eines DNA-Konstrukts, das eine glykosylierte Proteinvariante codiert, und eines Expressionsvektors, der das DNA-Konstrukt umfasst, einschließen. Der Expressionsvektor kann jeder beliebige Vektor sein, der dem DNA-Rekombinationsverfahren und der anschließenden erfolgreichen Expression in einem Wirtsorganismus unterzogen wird. Beim Einbringen in den Wirtsorganismus kann der Vektor autonom funktionieren. Durch einen Replikationsursprung kann das Plasmid sich außerhalb des Wirtszellengenoms replizieren. Alternativ kann es in das Wirtszellengenom eingebaut und zusammen mit dem Wirtszellengenom repliziert werden.
  • Außerdem kann die vorliegende Erfindung ein Verfahren einschließen, durch das eine glykosylierte Proteinvariante synthetisiert und exprimiert wird. Die Schritte hinsichtlich der Erzeugung des Endprodukts werden durch Kultivierung eines Wirtes erzielt, der zur Glykosylierung und Expression eines Proteins in einem geeigneten Medium in der Lage ist, um die Expression und Sekretion der glykosylierten Proteinvariante in das Medium zu erhalten. Darauf folgt die Gewinnung und Isolierung des Proteins aus dem Kulturmedium.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Produktion von Proteinvarianten in einer Wirtszelle. Die Wirtszelle kann jede beliebige Zelle sein, die zur großtechnischen Produktion von Proteinen geeignet ist, die in der Lage ist, ein Protein zu exprimieren und durch einen Expressionsvektor transformiert wird. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Er findung ist ein Wirt, der zur Glykolysierung in der Lage ist. Der Wirt kann aus bakteriellen Zellen, Pilzzellen und tierischen Zellen oder transgenen Pflanzenzellen gewählt werden. Die tierischen Zellen können beispielsweise Insekten- oder Säugerzellen sein.
  • Bei einer Ausführungsform ist der Wirt Hefe. Die Hefezelle kann aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichummn sp. und Geotrichum fermentans.
  • Bei einer anderen Ausführungsform wird die Wirtszelle unter anderem aus Fungi, wie Humicola lanuginosa oder Aspergillus oryzae, gewählt.
  • Bei wieder einer anderen Ausführungsform wird der Wirt unter Pflanzenzellen, wie transgene Pflanzenzellen, beispielsweise Kartoffelzellen, gewählt, oder der Wirt wird unter tierischen Zellen ausgewählt, wie Insektenzellen, beispielsweise Spodoptera frugiperda Sf9 und Sf21-Eierstockzellen, oder Säugerzellen, wie Affen CV1- und COS-Zellen, murine C127-Fibrolasten und chinesische Hamster-Eierstockzellen (CHO).
  • Der gewählte Wirt wird in einem geeigneten Medium kultiviert, wobei die Proteinvariante in dem Wirt exprimiert und glykosyliert wird. Schließlich wird die glykosylierte Proteinvariante aus dem Medium gewonnen.
  • Durch Vornehmen einer spezifischen Wahl des Wirts ist es möglich, die Natur der Glykosylierung der glykosylierten Proteinvariante zu wählen.
  • Materialien und Methoden
  • Materialien
  • Enzyme:
  • Lipolase: Lipase, die von Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa), Stamm DSM 4109 mittels Gentechnik stammt.
  • Materialien, Chemikalien und Lösungen:
    • Meerrettichperoxidase, markiert mit Anti-Ratten-Ig (Dako, DK, P162, Nr. 031; Verdünnung 1:1 000).
    • Maus-Anti-Ratten IgE (Serotec MCA193; Verdünnung 1:200).
    • Ratten-Anti-Maus IgE (Serotec MCA419; Verdünnung 1:100).
    • Biotin-markierter Maus-Anti-Ratten-IgG1-monoklonaler Antikörper (Zymed 03-9140; Verdünnung 1:1 000)
    • Biotin-markierter Ratten-Anti-Maus-IgG1-monoklonaler Antikörper (Serotec MCA336B; Verdünnung: 1:1 000)
    • Streptavidin-Meerrettichperoxidase (Kirkegärd & Perry 14-30-00; Verdünnung 1:1 000).
    • CovaLink-NH2-Platten (Nunc, Kat. Nr. 459439)
    • Cyanursäurechlorid (Aldrich) Aceton (Merck)
    • Ratten-Anti-Maus-IgG1, Biotin (SeroTec, Kat. Nr. MCA336B)
    • Streptavidin, Peroxidase (KPL)
    • Orthophenylendiamin (OPD) (Kem-en-Tec)
    • H2O2, 30 % (Merck)
    • Tween 20 (Merck)
    • Magermilchpulver (Difco)
    • H2SO4 (Merck)
  • Puffer und Lösungen:
    Carbonatpuffer (0,1 M, pH 10 (1 Liter)) Na2CO3 10,60 g
    PBS (pH 7,2 (1Liter)) NaCl 8,00 g
    KCl 0,20 g
    K2HPO4 1,04 g
    KH2PO4 0,32 g
    • Waschpuffer PBS, 0,05 % (Vol./Vol.) Tween 20
    • Blockierungspuffer PBS, 2 % (Gew./Vol.), Magermilchpulver
    • Verdünnungspuffer PBS, 0,05 % (Vol./Vol.) Tween 20, 0,5 % (Gew./Vol.) Magermilchpulver
    • Citratpuffer (0,1 M, pH 5,0-5,2 (1 Liter) Na-Citrat 20,60 g
    • Citronensäure 6,30 g
  • Aktivierung der CovaLink-Platten:
    • • Herstellen einer frischen Stammlösung von 10 mg Cyanursäurechlorid pro ml Aceton.
    • • Unmittelbar vor der Verwendung Verdünnung der Cyanursäurechlorid-Stammlösung mit PBS unter Rühren bis auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml.
    • • Zugeben von 100 ml der Lösung zu jeder Vertiefung der CovaLink-NH2-Platten und 5 min Inkubieren bei Raumtemperatur.
    • • 3 Mal Waschen mit PBS.
    • • Trocknen der frisch präparierten aktivierten Platten 30 min bei 50 °C.
    • • Sofortiges Verschließen einer jeden Platte mit Dichtungsband.
    • • Die voraktivierten Platten können 3 Wochen bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, wenn sie in einem Plastikbeutel gehalten werden.
    • Natriumborat, Borax (Sigma)
    • 3,3-Dimethylglutarsäure (Sigma)
    • CaCl2 (Sigma)
    • Tresylchlorid(2,2,2-trifluorethansulfonylchlorid) (Fluka)
    • 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) (Fluka)
    • N-Hydroxysuccinimid (Fluka Art. 56480)
    • Phosgen (Fluka Art. 79380)
    • Lactose (Merck 7656)
    • PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) von Sigma
    • Succinyl-alanin-alanin-prolin-phenylalanin-para-nitroanilid (Suc-AAPF-pNP) Sigma Nr. S-7388, Mw 624,6 g/Mol.
  • Farbsubstrat:
    • OPD: o-Phenylendiamin (Kementec Kat. Nr. 4260)
  • Versuchstiere:
    • Weibliche Balb/C-Mäuse (etwa 20 Gramm), bezogen von der Firma Bomholdtgaard, Ry, Dänemark.
    • Weibliche Brown-Norway-Ratten, die im Durchschnitt 180 g wogen.
  • Ausrüstung:
    • XCEL II (Novex)
    • ELISA-Reader (UVmax, Molecular Devices)
    • HPLC (Waters)
    • PFLC (Pharmacia)
    • Superdex-75-Säule, Mono-Q, Mono S von Pharmacia, SW.
    • SLT: Photometer von SLT LabInstruments
    • Größenausschlusschromatographie (Spherogel TSK-G2000 SW).
    • Größenausschlusschromatographie (Superdex 200, Pharmacia, SW)
    • Amicon-Zelle
  • Enzyme für DNA-Manipulationen
  • Wenn nicht anderweitig angegeben, werden sämtliche Enzyme für DNA-Manipulationen, wie z. B. Restriktionsendonukleasen, Ligasen etc., von der Firma England Biolabs. Inc., erhalten. Medium:
    BPX: Zusammensetzung (pro Liter)
    Kartoffelstärke 100 g
    gemahlene Gerste 50 g
    Sojamehl 20 g
    Na2HPO4 × 12 H2O 9g
    Pluronic 0,1 g
    Natriumcaseinat 10 g
  • Die Stärke in dem Medium wird mit α-Amylase verflüssigt, und das Medium wird durch Erhitzen bei 120 °C für 45 min sterilisiert. Nach Sterilisierung wird der pH-Wert des Mediums auf 9 durch Zugabe von NaHCO3 auf 0,1 M eingestellt.
  • Verfahren
  • Allgemeine molekularbiologische Verfahren:
  • Wenn nicht anderweitig angegeben, wurden die DNA-Manipulationen und Transformationen unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie (Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, f. M. et al. (Hrsg. "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., und Cutting, S. M. (Hrsg.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990) durchgeführt.
  • Die Enzyme für die DNA-Manipulationen wurden nach den Ausführungen der Lieferfirmen eingesetzt.
  • Immunisierung der Mäuse
  • Balb/C-Mäuse (20 Gramm) werden 10 Mal (in Intervallen von 14 Tagen) durch subkutane Injektion des fraglichen modifizierten oder unmodifizierten Polypeptids bzw. durch auf dem Fachgebiet bekannte Standardverfahren immunisiert.
  • Immunisierung der Ratten.
  • Zwanzig intratracheale Immunisierungen an Ratten wurden wöchentlich mit 100 μl 0,9 % (Gew./Vol.) NaCl (Kontrollgruppe) oder 100 μl der vorstehend erwähnten Proteinverdünnung durchgeführt. Gruppe 1 erhielt Wildtyp-Lipolase, Gruppe 2 erhielt Lipolasevariante Nr. 1, und Gruppe 3 erhielt Lipolasevariante Nr. 5. Jede Gruppe enthielt 10 Ratten. Blutproben (2 ml) wurden von Auge eine Woche nach jeder zweiten Immunisierung gesammelt. Das Serum wurde durch Blutgerinnung und Zentrifugation erhalten.
  • ELISA-IgE-Testsystem (für Brown-Norway-Ratten):
  • Ein Drei-Schichten-Sandwich-ELISA wird zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von spezifischen Antikörpern verwendet.
  • Das immunisierende Molekül wird als Beschichtungsantigen mit 10 m pro ml und 50 ml pro Vertiefung, in neutralem Phosphatpuffer, inkubiert über Nacht bei 4 °C, verwendet. Alle restlichen bindungsfähigen Punkte auf der Oberfläche der Vertiefung werden mit 2 % Magermilch, 200 ml pro Vertiefung in Phosphatpuffer für mindestens 30 min bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Sämtliche mit diesem Antigen zu testende Seren werden dieser Platte mit 50 ml pro Vertiefung unter Verwendung einer 8-Kanal-Pipette in Verdünnungsreihen von 10x verdünnt, gefolgt von Dreifach-Verdünnungen zugesetzt. Die Verdünnungen werden in Phosphatpuffer mit 0,5 % Magermilch und 0,05 % Tween 20 durch 2 h Inkubation auf einer Rührplattform bei Raumtemperatur durchgefuhrt. Das in "Tracer"-Molekül ist biotyliniertes Maus-Anti-Ratten-IgE, 50 ml pro Vertiefung und 2 000x in Phosphatpuffer mit 0,5 % Magermilch und 0,05 % Tween 20 verdünnt, 2 h inkubiert auf einer Rührplattform bei RT. Die Kontrolle (Blindprobe) erhielt die identische Abfolge, jedoch ohne Rattenserum. 50 ml pro Vertiefung Streptavidin-Meerrettichperoxidase, 2 000x verdünnt, wurde 1 h auf einer Rührplattform inkubiert. Das Farbsubstrat bei 50 ml pro Vertiefung ist OPD (6 mg) und H2O2 (4 ml einer 30 %-Lösung) pro 10 ml Citratpuffer, pH 5,2. Die Reaktion wird unter Verwendung von 100 ml 2 N H2SO4 pro Vertiefung gestoppt. Sämtliche Ablesungen erfolgen auf SLT bei 486 nm und 620 nm als Referenz. Die Daten werden berechnet und in Lotus dargestellt.
  • ELISA-Verfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von IgE-Antikörpern in BALG/C-Mäusen
  • Ein Drei-Schichten-Sandwich-ELISA wird zur Bestimmung der relativen Konzentrationen spezieller IgE-Serumantikörper verwendet.
    • 1) Beschichten der ELISA-Platte mit 10 mg Ratten-Anti-Maus-IgE oder Maus-Anti-Ratten-IgE/ml Puffer 1. 50 ml/Vertiefung. Über Nacht bei 4 °C Inkubieren.
    • 2) Entleeren der Platten und Blockieren mit Blockierungspuffer für mindestens ½ Stunde bei Raumtemperatur. 200 ml/Vertiefung. Vorsichtig Schütteln. 3 Mal Waschen der Platten mit Waschpuffer.
    • 3) Inkubieren mit Maus/Rattenserum, ausgehend von unverdünnt und fortgesetzt mit 2-fachen Verdünnungen. Freihalten von einigen Vertiefungen nur für Puffer 4 (Blindproben). 50 ml/Vertiefung. 30 Min. Inkubieren bei Raumtemperatur. Vorsichtig Schütteln. 3 Mal Waschen der Platten in Waschpuffer.
    • 4) Verdünnen des Enzyms in Verdünnungspuffer auf die entsprechende Proteinkonzentration. 50 ml/Vertiefung. 30 Min. bei Raumtemperatur Inkubieren. Vorsichtig Schütteln. 3 Mal Waschen der Platten in Waschpuffer.
    • 5) Verdünnung des spezifischen polyklonalen Anti-Enzym-Antiserums-Serums (pIg) zum Nachweis von gebundenem Antikörper in Verdünnungspuffer. 50 ml/Vertiefung. 30 Min. Inkubieren bei Raumtemperatur. Vorsichtig Schütteln. 3 Mal Waschen der Platten in Waschpuffer.
    • 6) Verdünnen von Meerrettichperoxidase-konjugierter Anti-pIg-Antikörper in Verdünnungspuffer. 50 ml/Vertiefung. 30 Min. Inkubieren bei Raumtemperatur. Vorsichtig Schütteln. 3 Mal Waschen der Platten in Waschpuffer.
    • 7) Mischen von 0,6 mg ODP/ml + 0,4 μl H2O2/ml in Substratpuffer. Herstellen der Lösung unmittelbar vor der Verwendung. Inkubieren für 10 min. 50 μl/Vertiefung.
    • 8) Zum Stoppen der Reaktion Zugabe von Stopplösung. 50 μl/Vertiefung.
    • 9) Lesen der Platten bei 492 nm mit 620 nm als Referenz. Die Daten werden berechnet und in Lotus dargestellt.
  • Balb/C-Mäuse-IgG-ELISA-Verfahren:
    • • Das Antigen wird auf 1 mg/ml in Carbonatpuffer verdünnt.
    • • 100 μl werden jeder Vertiefung zugesetzt. Die Platten werden über Nacht bei 4 °C beschichtet. Unspezifische Absorption wird durch Inkubieren jeder Vertiefung für 1 h bei Raumtemperatur mit 200 μl Blockierungspuffer blockiert.
    • • Die Platten werden 3x mit 300 μl Waschpuffer gewaschen.
    • • Unbekannte Mausseren werden in Verdünnungspuffer, typischerweise 10x, 20x und 40x oder höher, verdünnt.
    • • 100 μl werden jeder Vertiefung zugesetzt.
    • • Die Inkubation erfolgt 1 h bei Raumtemperatur.
    • • Ungebundenes Material wird durch 3 x Waschen mit Waschpuffer entfernt.
    • • Der Anti-Maus-IgG1-Antikörper wird 2 000x in Verdünnungspuffer verdünnt.
    • • 100 μl werden jeder Vertiefung zugesetzt.
    • • Die Inkubation erfolgt 1 h bei Raumtemperatur.
    • • Ungebundenes Material wird durch 3 x Waschen mit Waschpuffer entfernt.
    • • Streptavidin wird 1 000x in Verdünnungspuffer verdünnt.
    • • 100 μl werden jeder Vertiefung zugesetzt.
    • • Die Inkubation erfolgt 1 h bei Raumtemperatur.
    • • Ungebundenes Material wird durch 3 x Waschen mit 300 ml Waschpuffer entfernt.
    • • OPD (0,6 mg/ml) und H2O2 (0,4 ml/ml) werden in Citratpuffer gelöst.
    • • 100 μl werden jeder Vertiefung zugesetzt.
    • • Die Inkubation erfolgt für 10 min bei Raumtemperatur.
    • • Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 μl H2SO4 gestoppt.
    • • Die Platten werden bei 492 nm mit 620 nm als Referenz gelesen.
  • Molekularbiologische Verfahren:
  • Ortsgerichtete Mutagenese, Klonieren und Expression von Enzymvarianten in Hefe und Reinigen der Varianten wurden nach den Stand-der-Technik-Technologien durchgeführt.
  • ELISA, der antigenspezifisches Ratten-IgE nachweist: Dieser ELISA ist ein „Fänger-ELISA" und wurde auf CovaLink-NH2-Platten, aktiviert mit Cyanursäurechlorid, wie vom Hersteller beschrieben, durchgeführt. Der ELISA wurde in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung unter allgemein bekannten Bedingungen durchgeführt. Die Platten wurden über Nacht mit 100 μl Maus-Anti-Ratten-IgE (5 μg/ml) beschichtet. Nach diesem Stadium wurde Tween 20 den Pufferlösungen bis auf eine Endkonzentration von 0,01 % (Vol./Vol.) zugesetzt. Die unspezifische Absorption wurde mit 2 % (Gew./Vol.) Magermilch blockiert. Die unbekannten Rattenseren wurden in 0,5 % (Gew./Vol.) Magermilch verdünnt, typischerweise 10 x, 20 x und 40 x, und wurden den Vertiefungen zugesetzt. Lipolase wurde auf 1 μg/ml in 0,5 % (Gew./Vol.) Magermilch verdünnt, und 100 μl wurden jeder Vertiefung zugesetzt. Immobilisiertes Enzym wurde mit antigenspezifischem polyklonalem Serum in 0,5 % (Gew./Vol.) Magermilch nachgewiesen. Anti-Lipolase-Immunglobuline wurden unter Verwendung von Anti-Kaninchen-Immunglobulin-Antikörpern, markiert mit Meerrettichperoxidase, nachgewiesen.
  • ELISA, der antigenspezifisches Ratten-IgG1 nachweist: Dieser ELISA ist ein direkter ELISA und wurde auf CovaLink NH2-Platten durchgeführt, die mit Cyanursäurechlorid aktiviert waren, wie vom Hersteller beschrieben. Der ELISA wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung unter allgemein bekannten Bedingungen durchgeführt. Die Platten wurden über Nacht mit 100 μl Antigen (5 μg/ml) beschichtet. Nach diesem Stadium wurde Tween 20 den Pufferlösungen bis auf eine Endkonzentration von 0,01 % (Vol./Vol.) zugesetzt. Die unspezifische Adsorption wurde mit 2 % Magermilch blockiert. Die unbekannten Rattenseren wurden in 0,5 % (Gew./Vol.) Magermilch verdünnt, typischerweise 10 x, 20 x und 40 x, und wurden den Vertiefungen zugesetzt. Immobilisiertes antigenspezifisches Ratten-IgG1 wurde unter Verwendung eines biotinylierten Maus-Anti-Ratten-IgG1 in 0,5 % (Gew./Vol.) Magermilch nachgewiesen. Immobilisiertes Maus-Anti-Ratten-IgG1 wurde unter Verwendung einer streptavidingebundenen Meerrettichperoxidase nachgewiesen.
  • Statistische Analyse:
  • Die Unterschiede zwischen Messreihen wurden unter Verwendung von nicht parametrischen Verfahren ausgewertet: Der Kruskal-Wallis-Test und der Dunn's Multiple Comparison Test.
  • Beispiele
  • Die folgenden Experimente erläutern die Herabsetzung der Allergenität des Enzyms Lipase (E.C.3.1.1.3) aus Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa), Stamm DSM 4109 mittels Gentechnik. Das Enzym wurde mit zusätzlichen Glykosylierungsstellen in spezifischen Bereichen des Enzyms bereitgestellt.
  • Beispiel 1: Epitop-Identifizierung und Variantenauswahl
  • Die Lipasevarianten waren dazu ausgelegt, zusätzliche Glykosylierungsstellen der Konsensussequenz Asn-Xaa-Thr/Ser einzubringen. Als Erstes wurden die Epitope auf Lipase-Wildtyp identifiziert, um Glykosylierungsstellen zu wählen, um die Auswirkungen sowohl von „Makrophagen-Scavenging" und Epitop-Abschirmung zu maximieren.
  • Zur Identifizierung der Epitopmuster wurden Phage-Display-Bibliotheken, die statistische Peptidsequenzen (9-Mere) exprimieren, mit IgG, das aus Kaninchen-Anti-Lipase-Antiseren durch Caprylsäurepräzipitation aufgereinigt wurde, gescreent. Die IgG-Antikörper waren auf paramagnetischen Mikrokügelchen immobilisiert, die spezifische Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper trugen, wie vom Hersteller (Sigma) beschrieben. Ungebundenes Material wurde entfernt, und die beschichteten Mikrokügelchen wurden isoliert und mit der Phage-Display-Bibliothek, die 9-Mer-Oligopeptide mit statistischen Aminosäuresequenzen exprimiert, inkubiert. Die gebundenen Phagen wurden aus den Mikrokügelchen eluiert und mit einem entsprechenden Escheria coli-Stamm in Gegenwart eines Trägerphagen inkubiert und anschließend in Übereinstimmung mit dem existierenden Stand der Technik ausgestrichen. Die Plat ten, die Plaques aufwiesen, wurden auf spezifische Bindung an Anti-Lipase-Antikörpern nach dem Stand der Technik gescreent. Für jede Platte wurden zwei Kopien auf Nitrocellulosefilter vorgenommen. Filter Nr. 1 wurde mit gereinigtem Lipase-spezifischem IgG inkubiert, während Filter Nr. 2 mit gereinigtem Lipase-spezifischem IgG in Gegenwart von überschüssiger Lipase inkubiert wurde. Beide Filter wurden unter Verwendung von Anti-Kaninchen-IgG, markiert mit alkalischer Phosphatase, entwickelt. Die Plaques erschienen auf Filter Nr. 1, jedoch nicht auf Filter Nr. 2, wurden selektiert und nach dem Stand der Technik kultiviert. Die reaktivierten Oligopeptidsequenzen wurden durch automatisierte DNA-Sequenzanalyse identifiziert, und ihre Sequenzen zur Identifizierung von 5 wichtigen Epitopen abgeglichen:
    • 1. RPPR
    • 2. > EY
    • 3. P > PAP > S
    • 4. > RSA
    • 5. L > GRS
  • Diese Epitopmuster wurden auf der 3D-Struktur des Lipasemoleküls (ltib.pdb) durch Computeranalyse lokalisiert. Sie stimmten an der N-terminalen Extension (lip.1) und an den Positionen um die Reste E129-Y164 (lip.2.1), E129-Y220 (lip.2.2.-4), P253-P250-A243-P208/207-S214/216/217 (lip.3.0), R209-S214-Y220 (lip.4.0), L67-G65-R81-S83/85 (lip.5.1) bzw. L96/97-G212-R209/179-S214 (lip.5.2) (1) überein.
  • Nach den aus dem Phage-Display-Screening erhaltenen Information wurden Varianten mit zusätzlichen Glykosylierungsstellen nahe an diesen Epitopen mittels Protein-Engineering konstruiert. 1 zeigt zwei solche Varianten, Nr. 1 mit einer zusätzlichen Glykosylierungsstelle und Nr. 5 mit 4 zusätzlichen Glykosylierungsstellen. Lipase selbst besitzt eine Glykosylierungsstelle (N33 = Asn33-I1e34-Thr35), die beabstandet von dem identifizierten Epitopen angeordnet ist. In der Variante Nr. 1 wird vorausgesagt, dass ein Epitop durch die zusätzliche Glykosylierungsstelle beeinflusst wird, während 3 Epitope durch die zusätzliche Glykosylierung in Variante Nr. 5 beeinflusst werden. Tabelle 1: Substitutionen, die zur Erzeugung von zusätzlichen Glykosylierungsstellen eingebracht werden.
    Variante Glykosylierungs entsprechende Sub betroffenes Epitop
    stellen stitutionen
    Wildtyp N33 ohne
    Nr. 1 N33 lip.5.2
    N99 E99N, N101S
    Nr. 5 N33 lip.2.1
    N37 T37N, N39S lip.2.2-4
    N99 E99N, N101S lip.3.0
    N163 G163N, D165S lip.4.0
    N212 G212N lip.5.2
  • Beispiel 2: Konstruktion und Expression von glykosylierten Varianten
  • Ortsgerichtete Mutagenese und Klonierung der Enzymvarianten wurden durch die im Fachgebiet gut bekannten Standardtechniken (siehe z. B. Sambrook et al. (1989), Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY; Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2, S. 95–107) durchgeführt. Die Gensequenz der Wildtyp-Lipase kann in der EMBL/Genbank-Datenbasis unter der Zugangsnummer AF054513 gefunden werden, und der verwendete Vektor war CaHj483 ( WO 99/42566 ). Die resultierenden Expressionsvektoren wurden in Aspergillus oryzae JaL 228 ( PCT/DK 97/00037 ) unter Verwendung von Selektion auf Acetamid, wie in der Patentschrift EP 531 372 B1 beschrieben, transformiert. Die Transformanten waren reisolierte Sporen, die in Schüttelkolben fermentiert wurden, um die Lipasevarianten zu ergeben. Die resultierenden Lipasevarianten wurden durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen (Svendsen et al., Methods in Enzymology, Bd. 284, Ss. 317–340, 1997).
  • Somit wurden die Lipasevarianten in Aspergillus oryzae exprimiert, welcher bekanntlich zur Glykosylierung fähig ist. Die sezernierten Lipasevarianten wurden in den Zellen glykosyliert, wie durch die Mobilitätsverschiebung der Varianten im Vergleich zu dem Wildtyp bei der Westernblot-Analyse (2) gezeigt. Außerdem gibt die langsame Migration der Variante (Nr. 5) mit den meisten Glykosylierungsstellen wie erwartet an, dass das Ausmaß der Glykosylierung der Anzahl von Glykosylierungsstellen entspricht, die in die Sequenz eingebracht wurden.
  • Beispiel 3: Beibehaltene Funktionalität der Varianten
  • Wildtyp-Lipase und die Varianten wurden gereinigt, und ihre spezifische Aktivität wurde bestimmt. Kurz gesagt, wird ein Substrat für Lipase durch Emulgieren von Glycerintributyrat unter Verwendung von Gummi arabicum als Emulgator hergestellt. Die Lipaseaktivität wird bei pH 7 unter Verwendung des pH-Stat-Verfahrens getestet. Eine Einheit Lipaseaktivität (LU) ist definiert als die Menge, die zur Freisetzung von einem Mikromol Fettsäure pro Minute benötigt wird (Svendsen et al., Methods in Enzymology, Bd. 284, S. 317–340, 1997).
  • Die Aktivität wird als LU/ml von Lösungen mit der gleichen Proteinkonzentration ausgedrückt, bestimmt durch die A280-Messung. Wildtyp-Lipase besitzt eine Aktivität von 4 917 LU/ml, Variante Nr. 1 besitzt 4 478 LU/ml, und Variante Nr. 5 besitzt 4 222 LU/ml. Daher besitzen die Varianten im Wesentlichen die gleiche Funktionalität wie die Wildtyp-Lipase.
  • Beispiel 4: IT-Ratten-Studien (IgG1/IgE):
  • Die antigene und allergene Potenz der Varianten Nr. 1 und 5 der Wildtyp-Lipase wurde in einem Rattenmodell mit intratrachealer Exposition gegenüber Antigen verglichen.
  • Immunisierung: Zwanzig intratracheale Immunisierungen an Ratten (weibliche Brown-Norway-Ratten mit einem durchschnittlichen Gewicht von 180 g) wurden wöchentlich mit 100 μl 0,9 % (Gew./Vol.) NaCl (Kontrollgruppe) oder 100 μl Kochsalzlösung, die 15 μg Protein enthielt, durchgeführt. Gruppe 1 erhielt Wildtyp-Lipase, Gruppe 2 erhielt Lipasevariante Nr. 1, und Gruppe 3 erhielt Lipasevariante Nr. 5. Jede Gruppe enthielt 10 Ratten. Die Blutproben (2 ml) wurden aus dem Auge eine Woche nach jeder zweiten Immunisierung gesammelt. Das Serum wurde durch Blutgerinnung und Zentrifugation erhalten.
  • ELISA-Nachweis von antigenspezifischen Ratten-IgE: Dieser ELISA ist ein „Fänger-ELISA" und wurde auf CovaLink NH2-Platten (Nunc, Dänemark) durchgeführt, die mit Cyanursäu rechlorid, wie vom Hersteller beschrieben, aktiviert waren. Der ELISA wurde unter Standardbedingungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung durchgeführt. Die Platten wurden über Nacht mit 100 μl Maus-Anti-Ratten-IgE (5 μg/ml) beschichtet. Nach diesem Stadium wurden Tween 20 den Pufferlösungen bis zu einer Endkonzentration von 0,01 % (Vol./Vol.) zugesetzt. Die unspezifische Adsorption wurde mit 2 % (Gew./Vol.) Magermilch blockiert. Unbekannte Rattenseren wurden in 0,5 % (Gew./Vol.) Magermilch verdünnt, typischerweise 10x, 20x und 40x, und wurden den Vertiefungen zugesetzt. Die Lipase wurde auf 1 μg/ml in 0,5 % (Gew./Vol.) Magermilch verdünnt, und 100 μl wurden jeder Vertiefung zugesetzt. Das immobilisierte Enzym wurde mit antigenspezifischem polyklonalem Serum in 0,5 % (Gew./Vol.) Magermilch nachgewiesen. Die Anti-Lipase-Immunglobuline wurden unter Verwendung von Anti-Kaninchen-Immunglobulinantikörpern, markiert mit Meerrettichperoxidase, nachgewiesen.
  • ELISA-Nachweis von antigenspezifischem Ratten-IgG1: Dieser ELISA ist ein direkter ELISA und wurde auf CovaLink NH2-Platten (Nunc, Dänemark) aktiviert mit Cyanursäurechlorid, wie vom Hersteller beschrieben, durchgeführt. Der ELISA wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung unter Standardbedingungen durchgeführt. Die Platten wurden über Nacht mit 100 μl Antigen (5 μg/ml) beschichtet. Nach diesem Stadium wurde den Pufferlösungen Tween 20 bis zu einer Endkonzentration von 0,01 % (Vol./Vol.) zugesetzt. Die unspezifische Adsorption wurde mit 2 % Magermilch blockiert. Unbekannte Rattenseren wurden in 0,5 % (Gew./Vol.) Magermilch, typischerweise 10x, 20x und 40x, verdünnt und den Vertiefungen zugesetzt. Immobilisiertes antigenspezifisches Ratten-IgG1 wurde unter Verwendung eines biotinylierten Maus-Anti-Ratten-IgG1 in 0,5 % (Gew./Vol.) Magermilch nachgewiesen. Immobilisiertes Maus-Anti-Ratten-IgG1 wurde unter Verwendung einer streptavidingebundenen Meerrettichperoxidase nachgewiesen.
  • Unterschiede zwischen den Datenreihen wurden unter Verwendung nicht-parametrischer Verfahren ausgewertet: Der Kruskal-Wallis-Test und der Dunn's Multiple Comparison Test. Die Allergenität wird als "das Endpunkt-IgE-Antikörper-Niveau" und das "integrierte IgE-Antikörper-Antwort-Niveau" während des Experiments zusammengefasst.
  • 3 zeigt, wie die Allergenität der Lipasevarianten, bestimmt durch die integrierte IgE-Antwort abnimmt, wenn die Anzahl von Glykosylierungsstellen zunimmt. Tabelle 2 zeigt, wie die Endpunkt-Allergenität der Lipasevarianten, bestimmt durch die IgE-Antwort, eben falls abnimmt, wenn die Anzahl von Glykosylierungsstellen zunimmt. Die Antigenizität der Varianten, bestimmt als die IgG1-Antwort ist allerdings entweder konstant oder erhöht, wobei letzteres möglicherweise auf den antigenen Eigenschaften der Glykosylketten beruht. Tabelle 2: Endpunkt-Antikörper-Antwort-Niveaus im IT-Rattenmodell
    Enzym IgG1-Antwort (Antigenzität) (%) IgE-Antwort (Allergenität) (%)
    Lipase 100 100
    Variante Nr. 1 182 71
    Variante Nr. 5 93 42
  • Beispiel 5: SC-Mausstudien (IgG1 und IgE)
  • Die antigenen und allergenen Potenzen der Variante Nr. 1 und Nr. 5 und von Wildtyp-Lipase wurden in einem Mausmodell mit subkutaner Exposition gegenüber Antigen verglichen.
  • Das Immunisierungsprotokoll entsprach demjenigen der Rattenstudien (Beispiel 4), mit der Ausnahme, dass Immunisierungen subkutan mit einer Proteinkonzentration von 0,025 mg Protein/ml durchgeführt und Blutproben von nur 100 μl von kleineren Tieren (weibliche Balb/c-Mäuse, 9 Wochen alt von etwa 20 g) gesammelt wurden.
  • Die ELISA wurden auf eine Weise im Wesentlichen entsprechend derjenigen, der Rattenstudien (Beispiel 4) durchgeführt, außer dass Anti-Maus-IgE- und Anti-Maus-IgE-Antikörper verwendet und Verdünnungsreihen von 1:160 für IgG1-ELISA und von Unverdünnten für den IgE-ELISA begonnen wurden.
  • Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Es kann gesehen werden, dass die Allergenität, ausgedrückt als integrierte Antikörper-Antwort-Niveaus (wie es allgemein akzeptiert ist), für die glykosylierten Varianten herabgesetzt ist.
  • Somit zeigt Variante Nr. 5 in dem SC-Mausmodell herabgesetzte Allergenität, allerdings ist es nur eine begrenzte Herabsetzung in der Allergenität im Vergleich zu derjenigen, die in dem IT-Rattenmodell (Beispiel 4) festgestellt wird. Die Unterschiede zwischen diesen beiden Reihen von Ergebnissen geben an, dass die herabgesetzte Allergenität in Ratten mindestens teil weise auf dem verstärkten Scavenging durch Makrophagen, die für die Lunge spezifisch sind, beruht, z. B. alveolare Makrophagen. Die steht im Einklang mit Feststellungen, die auf dem Fachgebiet vorgenommen wurden, dass Proteine, die subkutan injiziert werden, eine geringe Wirkung auf alveolare Makrophagen besitzen (siehe zum Beispiel Halme et al., J. Immunotherapy with Emphasis an Tumor Immunology, Bd. 15, Ss. 283–291, 1994, oder Vasil'eva et al., Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii I Imunobiologii (10), Ss. 34–36, Okt. 1991), und auch mit Beobachtungen, dass alveolar, allerdings nicht interstitiell, Makrophagen die Funktion pulmonaler dendritischer Zellen als Stimulatoren der T-Zell-Proliferation unterdrücken (Armstrong LR, Christensen PJ, Paine R III et al. (1994), Am J Respir Cell Mol Biol 11: 682–691 und Holt PG, Oliver J, Bilyle B et al. (1993), J Exp Med: 397–407).
  • Bei subkutaner Injektion in Mäuse besteht nur eine eingeschränkte Herabsetzung in der Allergenität bei Variante Nr. 5 e. Der Unterschied zwischen diesen Ergebnissen und denjenigen, die durch intratracheale Installation der gleichen Proteine in Ratten (Beispiel 4) erhalten wurden, gibt an, dass die herabgesetzte Allergenität in Ratten mindestens teilweise auf dem verstärkten Scavenging durch die für die Lunge spezifischen Makrophagen, z. B. alveolare Makrophagen, beruht. Dies steht mit den Beobachtungen im Einklang, wie sie auf dem Fachgebiet bezüglich des Ausmaßes der Wirkung von Proteinen gemacht wurden, die subkutan an Alveolarmakrophagen injiziert wurden (siehe beispielsweise J. Immunotherapy with Emphasis an Tumor Immunology, Bd. 15, Ss. 283–291, 1994, oder Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii I Immunobiologii (10), Ss. 34–36, Okt. 1991).
  • Beispiel 6: Kompetitiver ELISA
  • Kompetitive ELISA-Experimente wurden für Lipase-Wildtyp und die beiden Varianten unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren mit spezifischem polyklonalem Anti-Lipase-Antiserum aus Kaninchen und Lipase-Wildtyp als Konkurrent durchgeführt (siehe z. B. J. Clausen, Immunochemical Techniques For The Identification And Estimation Of Macromolecules, Elsevier, Amsterdam, 1988, Ss. 187–188).
  • Der Wildtyp besitzt definitionsgemäß keinen Verlust an Kompetitivität und weist eine Endpunkt-Inhibition von 100 % auf. Variante Nr. 1 wies einen zweifachen Verlust an Kompetitivität und eine Endpunktinhibition von 90 % auf, wohingegen Variante Nr. 5 einen 256-fachen Verlust an Kompetitivität und eine Endpunktinhibition von 53 % aufwies.
  • Die Ergebnisse geben an, dass mindestens ein Teil der herabgesetzten Allergenität auf der herabgesetzten Antigenizität beruhen kann, was mit der Tatsache im Einklang steht, dass die Glykosylierungsstellen lip.2.-4., lip.3.0, lip.4.0 und lip.5.2 in der Nachbarschaft von Lipaseepitopen angeordnet sind.

Claims (10)

  1. Verfahren zur Herstellung einer N-glycosylierten Proteinvariante mit einer im Vergleich zum Ausgangsprotein verminderten Allergenizität, gemessen als reduzierte IgE-Antikörperproduktion in Tieren, den Menschen eingeschlossen, umfassend: – Konstruieren von DNA-Molekülen, die Proteinvarianten codieren, wobei die DNA-Moleküle, im Vergleich zu dem Ausgangsprotein, mindestens eine Subsequenz aufweisen, die eine zusätzliche N-Glycosylierungsstelle codiert, – Selektieren eines DNA-Moleküls, das eine glycosylierte Proteinvariante codiert, mit einer im Vergleich zu dem Ausgangsprotein um mindestens 50 % verminderten Allergenizität, wobei die Allergenizität als reduzierte IgE-Antikörperproduktion in Ratten, die der Variante intratracheal ausgesetzt waren, gemessen wird, – Einbauen des DNA-Moleküls, das die Variante codiert, in einen geeigneten Wirt, der zur Glycosylierung in der Lage ist, – Kultivieren des Wirts in einem geeigneten Medium, wobei die Proteinvariante in dem Wirt exprimiert und glycosyliert wird, – Gewinnen der glycosylierten Proteinvariante aus dem Medium.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Allergenizität, ausgedrückt durch die IgE-Antikörperantwort in Ratten, der glycosylierten Proteinvariante geringer ist als 1 % des Ausgangsproteins.
  3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, wobei das DNA-Molekül mindestens 2 Subsequenzen aufweist, die zusätzliche Glycosylierungsstellen codieren.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zusätzlichen) Glycosylierungsstelle(n) in eine Epitope beeinflussende Position eingebaut wird (werden).
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das (die) Epitop(e) durch Screening von Phagendisplaybibliotheken identifiziert wird (werden).
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteinvarianten eine diversifizierte Bibliothek von Varianten sind.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein ein Enzym ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Proteasen, Lipasen, Phytasen, Polysaccharidlyasen, Oxidoreductasen, Transglutaminasen, Glycosylhydrolasen, und Glycoseisomerasen.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Enzym eine Lipase ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die zusätzlichen Glycosylierungsstellen aus N33, N37, N163 und/oder N212 der Sequenz für Humicola lanuginosa-Lipase oder aus den entsprechenden Stellen in homologen Lipasen ausgewählt sind.
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