JP7344876B2 - 組換えポリペプチドにおける操作されたo-グリコシル化及びその使用 - Google Patents
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Description
本明細書にその全体が参照により援用されるのは、本明細書と同時に提出され、次のように特定される、コンピュータ可読ヌクレオチド/アミノ酸配列リストである:2017年12月21日に作成された「OGLYC-100-US-PSP-SequenceListing.TXT」と命名される、1件の11,891バイトのASCII(テキスト)ファイル。
a.細胞培養培地の存在下において、操作された治療用ポリペプチドを宿主細胞内で発現させるステップと;
b.任意選択的に、組換え治療用ポリペプチドを精製するステップと
を含んでなる、O-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを生産する方法を提供し、少なくとも1つの操作されたO-結合グリコシル化配列が、組換え治療用ポリペプチドのO-グリカンに共有結合するように、
i.操作された治療用ポリペプチド質は、少なくとも1つのO-結合グリコシル化配列を含んでなり、
ii.細胞培養培地は、O-グリコシル化用試薬を含んでなる。
a.少なくとも1つの操作されたO-結合グリコシル化配列を含んでなる操作された治療用ポリペプチドをコードする、DNAを含んでなる、発現ベクターを得るステップと;
b.宿主細胞に発現ベクターを形質移入するステップと
をさらに含んでなる。
a.操作された治療用ポリペプチドは、少なくとも1つの操作されたO-結合グリコシル化配列を含んでなり、
b.組換え治療用ポリペプチドは、少なくとも1つのO-グリカンに共有結合する、少なくとも1つの操作されたO-結合グリコシル化配列を含んでなる。
P-(O-グリカン)-M
を含んでなるO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートが形成され得て、
式中、Pは操作された組換え治療用ポリペプチドを表し、MはPに結合することが望ましい分子を表す。したがってO-グリカンは、PとMとの間の連結基の役割を果たす。
P-(O-グリカン)-M
を含んでなるO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートを生産する方法を提供し、
式中、Pは発明の操作された組換え治療用ポリペプチドを表し、MはPに結合することが望ましい分子を表す。方法は、
(i)本発明のO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを提供するステップと;
(ii)MをO-グリカンに連結させるように、O-グリカンをMと反応させるステップと
を含んでなる。
一実施形態では、本発明のO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、30kDa未満の分子量を有する。一実施形態では、本発明のO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、約30kDa以上の分子量を有する。一実施形態では、本発明のO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、約65kDa以上の分子量を有する。一実施形態では、本発明のO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、約100kDa以上の分子量を有する。一実施形態では、本発明のO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、約150kDa以上の分子量を有する。
操作されたO-結合グリコシル化配列は、たとえ生物学的活性が、操作されたO-結合グリコシル化配列を含まない対応する組換え治療用ポリペプチドの生物学的活性から変化したとしても、タンパク質がなおも生物学的に活性であるという条件で、本発明のO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチド上の任意の箇所に存在し得る。タンパク質の構造/機能に対する操作されたO-グリコシル化配列の効果を判定するための適切な実験は、使用されている特定の治療用ポリペプチドの当業者に公知であろう。
-(L1)m-(操作されたO-連結グリコシル化配列)-(L2)n-
の片側又は両側上に存在してもよく、
式中、m及びnは独立して0又は1である。また、L1はL2と同一であっても、2つが異なってもよい。L1及び/又はL2は、好ましくは天然タンパク質を最小限に乱すように短いが、アクセス性について妥協するために長さが変動する。リンカーは、1~30、好ましくは1~10、最も好ましくは1~5アミノ酸残基であってもよい。
本発明の組換え治療用ポリペプチドは、O-グリコシル化された少なくとも1つの残基を有するように操作されている。
操作されたO-結合グリコシル化配列は、定義された長さであってもよい。操作されたO-結合型グリコシル化配列は、O-結合グリコシル化の標的となるのに十分な長さであるが、タンパク質の構造/機能の妨害が皆無又は最小限であるように十分に短い長さでなければならない。
O-グリコシル化用試薬は、典型的に(i)グリカン及び(ii)触媒的トランスフェラーゼ酵素を含む。異なるタイプの(i)及び(ii)が典型的に組み合わされて異なるグリカン構造を生産し、多くのグリカンは成熟を達成するために、複数のタイプの(i)及び(ii)を必要とする。細胞型によってもたらされるグリカンの特性は、(i)及び(ii)の可用性/発現によって制御される。この環境は、当業者によって変更され得る。例えば、CHO細胞は通常、Core 1グリカン構造をもたらすが、これはグリカン飢餓若しくは触媒的トランスフェラーゼの過剰発現又はノックアウトによって変更されてもよい。
一実施形態では、導入されたO-グリカンは、グリカン構造の伸長を可能にする。グリカン構造の伸長は、完全に/部分的にシアル化されていてもされていなくてもよい、一般的なムチン型グリカン構造(Core 1などの)を生じてもよい。代案としては、導入されたO-グリカンが修飾されて、ブロッキング基が組み込まれて伸長が妨げられ、又は特定のグリカン構造の形成が促進されて、例えば、Tn抗原からCore 1構造への成熟が妨げられ、又はCore 1エピトープのシアル化(修飾GalNAc又はGal供給からの)が妨げられてもよい。
なおも別の態様では、さらなる分子がO-グリカンに付着されて、O-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートが形成され得る。したがって、本発明は、上記で定義されたとおりのO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを含んでなる、O-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートを提供し、さらなる分子MはO-グリカンに共有結合される。
P-(O-グリカン)-M
を含んでなるO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートが形成され得て、
式中、Pは操作された組換え治療用ポリペプチドを表し、MはPに結合することが望ましい分子を表す。したがってO-グリカンは、PとMとの間の連結基の役割を果たす。
P-(O-グリカン)-M
を含んでなるO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートを生産する方法を提供し、
式中、Pは発明の操作された組換え治療用ポリペプチドを表し、MはPに結合することが望ましい分子を表す。方法は、
(i)本発明のO-グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを提供するステップと;
(ii)MをO-グリカンに共有結合させるように、O-グリカンをMと反応させるステップと
を含んでなる。
(a)N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(hydroxybenztriazole)エステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、p-ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、及び芳香族エステルをはじめとするが、これに限定されるものではない、カルボキシル基及びそれらの種々の誘導体;
(b)例えば、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換され得る、ヒドロキシル基;
(c)ハロゲン化物が後に、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルバニオン、又はアルコキシドイオンなどの求核基で置換され、その結果、ハロゲン原子の官能基における新しい基の共有結合がもたらされ得る、ハロアルキル基;
(d)例えば、マレイミド基などのディールス・アルダー反応に参加できる、求ジエン体基;
(e)例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン又はオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を通じて、又はグリニャール付加又はアルキルリチウム付加などの機序を通じて、引き続く誘導体化を可能にするような、アルデヒド又はケトン基;
(f)例えば、スルホンアミドを形成するための引き続くアミンとの反応のための、ハロゲン化スルホニル基;
(g)例えば、ジスルフィドに変換され、又はハロゲン化アシルと反応し得る、チオール基;
(h)例えば、アシル化、アルキル化又は酸化型であり得る、アミン又はスルフヒドリル基;
(i)例えば、付加環化、アシル化、マイケル付加などを被り得る、アルケン;及び
(j)例えば、アミン及びヒドロキシル化合物と反応し得る、エポキシド。
ステップ1:M’+マレイミド-リンカー-アルキン→M’-リンカー-アルキン
ステップ2:M’-リンカー-アルキン+P-(O-グリカン)→P-(O-グリカン)-リンカー-M
など、最初にMをリンカー基と反応させる必要があることがある。
ステップ1:P-(O-グリカン)’+アルキン-リンカー-マレイミド→P-(O-グリカン)’-リンカー-マレイミド
ステップ2:P-(O-グリカン)’-リンカー-マレイミド+M)→P-(O-グリカン)-リンカー-M
など、最初にP-(O-グリカン)をリンカー基と反応させる必要があることがある。
操作された治療用ポリペプチドの発現には、任意の適切な宿主細胞を使用してもよいことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、操作された治療用ポリペプチドは、哺乳類細胞株で発現される。例えば、操作された治療用ポリペプチドは、CHO細胞株又はHEK細胞株で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、CHO細胞株が使用される。その他の実施形態では、HEK293F又はHEK293TなどのHEK細胞株が使用される。
本発明は、本発明の上記製品のいずれかを患者に投与するステップを含んでなる、患者において疾患を治療又は予防する方法を提供する。
[項1]
a.細胞培養培地の存在下において、操作された治療用タンパク質を宿主細胞内で発現させるステップと;
b.任意選択的に、組換え治療用タンパク質を精製するステップと
を含んでなる、O-グリコシル化組換え治療用タンパク質を生産する方法であって、少なくとも1つのO-結合グリコシル化配列が、前記組換え治療用タンパク質のO-グリカンに共有結合するように、
i.前記操作された治療用タンパク質が、少なくとも1つの操作されたO-結合グリコシル化配列を含んでなり、
ii.前記細胞培養培地が、O-グリコシル化用試薬を含んでなる、方法。
[項2]
a.前記少なくとも1つの操作されたO-結合グリコシル化配列を含んでなる前記操作された治療用タンパク質をコードする、DNAを含んでなる、発現ベクターを得るステップと;
b.宿主細胞に前記発現ベクターを形質移入するステップと
をさらに含んでなる、上記項1に記載の方法。
[項3]
前記細胞培養培地が、O-グリカンがアジ化物で標識されるようにアジ化物含有化合物を含んでなる、上記項1又は2のいずれか一項に記載の方法。
[項4]
前記アジ化物含有化合物がGalNAzである、上記項4に記載の方法。
[項5]
上記項1~4のいずれか一項に記載の方法によって生産された、O-グリコシル化組換え治療用タンパク質。
[項6]
少なくとも1つのO-グリカンに共有結合した少なくとも1つの操作されたO-結合グリコシル化配列を含んでなり、天然グリコシル化パターンをさらに含んでなる、O-グリコシル化組換え治療用タンパク質。
[項7]
前記O-グリカンがアジ化物官能基で標識されている、上記項6に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質。
[項8]
O-結合グリコシル化配列を含んでなり、前記O-結合グリコシル化配列が表1に記載されるものから選択された配列を含んでなる、ポリペプチド。
[項9]
O-結合グリコシル化配列を含んでなり、前記O-結合グリコシル化配列が表1に記載されるものから選択された配列を含んでなり、前記O-結合グリコシル化配列がO-グリカンに共有結合する、O-グリコシル化ポリペプチド。
[項10]
操作された治療用タンパク質を発現する宿主細胞からO-グリコシル化組換え治療用タンパク質を生産するための、O-グリコシル化用試薬を含んでなる細胞培養培地の使用であって、
a.前記操作された治療用タンパク質が、少なくとも1つの操作されたO-結合グリコシル化配列を含んでなり、
b.前記組換え治療用タンパク質が、少なくとも1つのO-グリカンに共有結合する、前記少なくとも1つの操作されたO-結合グリコシル化配列を含んでなる、使用。
[項11]
上記項5~7のいずれか一項に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質又は上記項8若しくは上記項9に記載のポリペプチドと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
[項12]
薬剤として使用するための、上記項5~7のいずれか一項に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質又は上記項8若しくは上記項9に記載のポリペプチド。
[項13]
上記項5~7のいずれか一項に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質又は上記項8若しくは上記項9に記載のポリペプチドを患者に投与するステップを含んでなる、前記患者において疾患を治療又は予防する方法。
[項14]
a.上記項5~7のいずれか一項に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質又は上記項8若しくは9に記載のポリペプチドを提供するステップと;
b.前記O-グリカンに分子を共有結合させるように、前記O-グリカンを前記組換え治療用タンパク質に結合することが望ましい前記分子の反応基と反応させるステップと
を含んでなる、O-グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲートを生産する方法。
[項15]
前記反応が、アジ化物-アルキンカップリング反応を含んでなる、上記項14に記載の方法。
[項16]
上記項14~15のいずれか一項に記載の方法によって生産された、O-グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲート。
[項17]
上記項5~7のいずれか一項に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質又は上記項8若しくは9に記載のポリペプチドを含んでなり、前記組換え治療用タンパク質に結合することが望ましい分子が前記O-グリカンに共有結合する、O-グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲート。
[項18]
上記項16又は17のいずれか一項に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
[項19]
薬剤として使用するための、上記項16又は17のいずれか一項に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲート。
[項20]
上記項16又は17のいずれか一項に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲートを患者に投与するステップを含んでなる、前記患者において疾患を治療又は予防する方法。
上記の実施形態は、例示的な例として理解されるべきである。さらなる実施形態が想定される。任意の一実施形態に関して記載される任意の特徴は、単独で又は記載されるその他の特徴と組み合わせて使用されてもよく、任意のその他の実施形態又は任意のその他の実施形態の任意の組み合わせの1つ又は複数の特性と組み合わせて使用されてもよいものと理解される。さらに、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を逸脱することなく、上に記載されない等価物及び修正物もまた使用されてもよい。
サイモシン-β4タンパク質からの短いアミノ酸配列は、サイモシン-β4:リンカー:Fc融合タンパク質としてN末端に存在する場合、O-グリコシル化をもたらすことが分かった。融合タンパク質中サイモシン-β4アミノ酸配列は、次のようである:
次に、実施例1からの配列の選択をさらに特性評価した。
質量分析法を用いて、CHO又はHEK細胞のどちらかで発現された際の融合タンパク質における、存在するグリコフォームとシアル化レベルとを決定した。結果を図2に示す。
SEC-MALSを用いて、融合タンパク質の物理化学的特性を測定した。結果を図3に示す。
hGLP-1R細胞を用いたHTFRcAMPアッセイを使用して、融合タンパク質の薬物動態特性をラットにおいて測定し、コンストラクト半減期を判定した。図4から見て分かるように、配列PLPTAE(配列番号9)を含む融合タンパク質は、野生型よりも若干短い半減期を有し、配列ATAEP(配列番号13)を含む融合タンパク質は、野生型より長い半減期を有した。
最後に、いくつかの融合タンパク質上でペプチド活性を測定した。結果を図5に示す。図から分かるように、変更された配列の存在は、機能への影響が少ない。
Ac4GalNAz(及び継代に存在するグルコースのみ、補足なし)を含有する培養培地中で、PTAEPG(配列番号41)O-グリコシル化配列がある組換えFcタンパク質を一過性に発現するCHO細胞を37℃で72時間培養した。増加する濃度のAc4GalNAz中で培養された細胞のグリカンGalNAc及びGalNAzの百分率占有率を測定し、結果を図6に示す。図6から見て分かるように、融合タンパク質を一過性に発現するCHO細胞のAc4GalNAz供給は、高レベルのGalNAz取り込みをもたらす。
Fcタンパク質へのGalNAz標識の成功裏の組み込みに続いて、次にGalNAz標識されたタンパク質上にアルキン基(例えば、DBCO又はDIBO)を含む部分を「クリック」する実験を実施した。
ヘテロ二官能性架橋剤;Fc-スキャフォールド+ペプチドコンジュゲーション
コンジュゲーションには、ヘテロ二官能性架橋剤(DBCO-マレイミド及びDBCO-PEG4-マレイミド)の使用が含まれる。精製することなくワンポット様式で、SPAACと一緒にマレイミド補完ペプチド(遊離チオールを提示する)を使用した(1:4:16のアジ化物/アルキン-マレイミド/フリー-チオール)。これは、良好なレベルのコンジュゲーション効率を提供した。
コンジュゲーションには、ホモ二官能性架橋剤(DBCO-PEG4-DBCO)を介したO-GalNAzを提示するFc-スキャフォールドの二量体化が関与した。SPAACは、リンカーが過剰で固定化されていない場合でさえも、コンジュゲートされた化学種を成功裏に生成した。
CRISPR/Cas9遺伝子編集技術を用いて、CHO K1 GALEノックアウト細胞を生成した。CHO UDP-グルコース4-エピメラーゼ遺伝子(GALE;NW_003622938.1)を標的化して、CRISPRガイドRNA(gRNA)を構築した。簡潔に述べると、HAMのF12培地中で培養されたCHO K1 細胞に、5’-ccacacggtactggagctgc-3’(エクソン2)、5’-gtactggagctgctggaggc-3’(エクソン2)、及び5’-cggcgggtccaggaactgac-3’(エクソン3)の3つのgRNAを同時形質移入し、このプラスミドは、CRISPR形質移入細胞の同定のためのRFPレポーター遺伝子もまた発現する。FACSベースの選別によって、RFP陽性細胞を単一細胞クローンに選別した。次にウエスタンブロット分析によって、クローンをGALE KOについてスクリーニングした。
HEK293F細胞株は、懸濁培養中で増殖するHEK293細胞のクローン変異型であり、一過性形質移入後に、高い細胞密度及び高い組換えタンパク質収率を達成し得る。効率的なCRIPSR/Cas9仲介遺伝子ノックアウトを達成することは、懸濁培養中では困難である。したがって、高レベルの遺伝子ノックアウトを保証する以下の手順が考案された。ポリ-D-リジン処理細胞培養プレート内において、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したFreeStyle 293発現培地(Thermo Fisher)中で細胞を培養することによって、HEK293F細胞を接着性にした。次に接着性HEK293F細胞に、ヒトUDP-グルコース4-エピメラーゼ遺伝子(GALE;NC_000001.11)を標的化するCRISPR/Cas9プラスミドを形質移入した。簡潔に述べると、HEK293F細胞に、5’-gtactggagctgctggaggc-3’(エクソン3)及び5’-cggcgggtccaggaactgac-3’(エクソン4)の2つのgRNAを同時形質移入し、このプラスミドは、CRISPR形質移入細胞の同定のためのRFPレポーター遺伝子もまた発現する。FACSベースの選別によって、RFP陽性細胞を単一細胞クローンに選別した。ウエスタンブロット分析によって、クローンをGALE KOについてスクリーニングした。HEK293F GALE KOクローンを同定した後、細胞を懸濁培養に再適応させて、最終的な懸濁HEK293F GALE KO細胞株を作製した。懸濁培養への迅速な再適応は、1週間にわたり培養培地のFBS濃度を10%、5%から2%に順次低下させ、その後、通常の培養のためのFreeStyle培地中の1x106細胞/mlで、振盪フラスコに細胞を直接接種することによって達成した。
Claims (12)
- O-グリコシル化組換え治療用タンパク質を生産する方法であって、前記方法が、細胞培養培地の存在下において、操作された治療用タンパク質を宿主細胞内で発現させるステップを含み;ここで、
i.前記操作された治療用タンパク質が、少なくとも1つのO-結合グリコシル化配列が組み込まれた操作された治療用タンパク質であり、
ii.前記細胞培養培地が、O-グリコシル化用試薬としてGalNAz又はAc4GalNAzを含んでなり、
それによって前記組換え治療用タンパク質において前記O-結合グリコシル化配列の少なくとも1つが、アジ化物官能基で標識されたO-グリカンに共有結合により結合され、ここで、前記O-結合グリコシル化配列が配列番号2~14から選択された配列である、
方法。 - 前記組換え治療用タンパク質を精製するステップをさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
- a.前記操作された治療用タンパク質をコードする、DNAを含んでなる、発現ベクターを得るステップと;
b.宿主細胞に前記発現ベクターを形質移入するステップと
をさらに含んでなる、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記操作された治療用タンパク質に2つ以上のO-結合グリコシル化配列が組み込まれている、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記2つ以上のO-結合グリコシル化配列が、同一であっても又は異なっていてもよい、請求項4に記載の方法。
- 配列番号2~14から選択された少なくとも1つのO-結合グリコシル化配列を含んでなり、前記O-結合グリコシル化配列の少なくとも1つが、アジ化物官能基で標識されたO-グリカンに共有結合している、O-グリコシル化組換え治療用タンパク質。
- 天然グリコシル化パターンをさらに含んでなる、請求項6に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質。
- 請求項6又は7に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
- a.請求項6又は7に記載のO-グリコシル化組換え治療用タンパク質を提供するステップと;
b.前記O-グリカンに、前記組換え治療用タンパク質に結合することが望ましい分子を共有結合により連結させるように、前記アジ化物官能基を前記分子の反応基と反応させるステップと
を含んでなる、O-グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲートを生産する方法。 - 前記反応が、アジ化物-アルキンカップリング反応を含んでなる、請求項9に記載の方法。
- 配列番号2~14から選択された少なくとも1つのO-結合グリコシル化配列を含んでなる治療用タンパク質と、前記治療用タンパク質に結合することが望ましい分子とのコンジュゲートであって、前記O-結合グリコシル化配列の少なくとも1つが、前記分子と共有結合により連結されたO-グリカンに共有結合により結合されている、コンジュゲート。
- 請求項11に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
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