JPH0770195A - 糖修飾インターフェロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 簡便な化学的方法によってインターフェロン
−αを糖修飾することにより、肝臓集積性および生理活
性を高めた糖修飾インターフェロンを提供すること。 【構成】 ラクトースラクトンとインターフェロン−α
との結合反応生成物であり、ガラクトース残基で修飾さ
れたことを特徴とする糖修飾インターフェロン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、人工的に合成される糖
修飾インターフェロンに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、生体由来の生理活性を有する蛋白
質あるいは糖蛋白質を医薬あるいは診断薬として利用す
る試みがなされている。しかし、有効かつ特異的に利用
するために、生体内での安定性を高めたり、代謝におけ
るシグナル作用、細胞内局所でのシグナル作用、レセプ
タ−や標的細胞に対する認識としてのシグナル作用を強
めたり発現させたりすることが必須となってきている。
その方法として、化学的に蛋白質を修飾することによ
り、該蛋白質の血中安定性を高めること、シグナル作用
を高め、標的細胞あるいは標的臓器への取り込みを促進
させること、蛋白質の生理活性を増大させこと、さらに
は新たな生理活性を付与することなどが期待されてい
る。

【０００３】標的臓器としての肝臓への集積性に関連し
て、肝臓とガラクト−スとの親和性が報告されている
（Kawasaki.T ＆ Ashwell.G., J.Biol.Chem., 251,129
6,1976及びLee.Y.C.et al., J.Biol.Chem.,258,199,198
3）。この知見に基づいて肝癌、肝硬変、肝炎などの肝
疾患に有効な生理活性を有する蛋白質に、末端にガラク
ト−スを有する糖を結合させることにより、効率的に肝
臓への蛋白質の取り込みを増大させ、治療効果を高める
ことができる。

【０００４】例えば、β−Ｄ−ガラクトピラノシルポリ
エチレングリコールで修飾された生理活性蛋白質などが
知られている（特開昭６３−１５２３９３）。また、末
端にガラクトース・ガラクトースの結合を有する糖鎖を
多量に含む糖蛋白質を遺伝子操作で製造する技術も知ら
れている（特開平１−１０２０９９）。しかし、従来の
技術は複雑な製造工程、生理活性蛋白質を変性させる可
能性のある反応条件等が必要であったり、特殊な真核細
胞を用いて糖蛋白質として発現させる必要があり、十分
満足な結果は得られていないし、実用化もされていな
い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡便
な化学的方法によってインターフェロン−α（以下、
「ＩＦＮ−α」と略すこともある）を糖修飾することに
より、肝臓集積性および生理活性を高めた糖修飾インタ
ーフェロンを提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、以上の課
題を解決するために鋭意検討した結果、以下の手段によ
ってＩＦＮ−αにガラクトースが導入された糖修飾イン
ターフェロンを得ることができ、かつ糖修飾によるイン
ターフェロンの活性の減少を防ぐことができ、得られた
糖修飾インターフェロンの肝臓集積性が極めて高いこと
を見出し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明はラクトースラクトンと
ＩＦＮ−αとの結合反応生成物であり、ガラクトース残
基で修飾されたことを特徴とする糖修飾インターフェロ
ンである。以下本発明を詳細に説明する。ラクトースラ
クトンは公知物質であり、以下の方法によって製造する
ことができる。

【０００８】ラクトースを低級アルコール（例、メタノ
ール）中、ヨウ素等の酸化剤で酸化し、還元末端のグル
コピラノースを開環してラクタネート（lactanate）と
し、次いで強酸性陽イオン交換樹脂（例、ダウエックス
(Dowex) ５０(H⁺)）等を用いて酸性条件とすることに
よって脱水閉環し、ラクトースラクトンを得ることがで
きる(Polymer Journal,17,(4),567-575(1985))。

【０００９】ラクトースラクトンと反応させるＩＦＮ−
αは、特定のアミノ酸配列および糖鎖構造には限定され
ず、ラクトースラクトンと結合反応する官能基を少なく
とも１個有していればよい。また、反応に用いるＩＦＮ
−αの構造は、アミノ酸の他、糖鎖、その他の修飾基を
有したインターフェロン誘導体でもよい。例えば、本発
明の糖修飾インターフェロンに使用できるＩＦＮ−αと
しては、ヒトを含む各種動物由来（細胞培養によるもの
を含む）のもの、組換え生物由来のもの、合成品のいず
れでもよい。

【００１０】該官能基としては、ラクトースラクトンが
開環して生じるガラクトース誘導体に存在するカルボキ
シル基と反応するものであれば特に制限はないが、一般
的には第１級アミノ基等が例示できる。本発明において
は、ラクトースラクトンと該官能基が反応し、ＩＦＮ−
α分子中および／またはＩＦＮ−α分子末端にガラクト
ース残基を有する糖修飾インターフェロンが極めて効率
よく製造される。

【００１１】ＩＦＮ−αの糖修飾率、即ち、ガラクトー
ス残基結合率は、ＩＦＮ−αに対するラクトースラクト
ンの使用量、反応時間等の反応条件によって変動する
が、本発明の糖修飾インターフェロンは、ＩＦＮ−α分
子中に少なくとも一個以上該糖が修飾されていればよ
く、使用目的に応じて種々選定できる。第１級アミノ基
としては、リジン残基のε−アミノ基またはＮ末端のア
ミノ基が挙げられる。例えば、ラクトースラクトンとＩ
ＦＮ−αとが、前記第１級アミノ基を介したアミド結合
反応のみにより糖修飾インターフェロンを生成した場合
の反応式は以下の通りである。

【００１２】

【化１】

【００１３】式中、（ａ）はラクトースラクトンの構造
を、（ｂ）は、ＩＦＮ−αの一般式を、（ｃ）は生成し
た糖修飾インターフェロンの一般式を示す。また、ｍ
は、ＩＦＮ−αの第１級アミノ基の数、ｎはアミド結合
数、ＲはＩＦＮ−α骨格、またｍ≧ｎ、好ましくはｍ＞
ｎである。本発明の糖修飾インターフェロンの合成は、
ラクトースラクトンとＩＦＮ−αの反応を水性溶媒中、
０〜４５℃で行うことが好ましい。反応溶媒としては、
水または緩衝液（例、ほう酸塩緩衝液、りん酸塩緩衝
液、りん酸緩衝生理食塩水等）の水性溶媒が使用され
る。反応温度はＩＦＮ−αが変性または失活しない温度
であればよいが、通常約０〜４５℃の範囲、特に室温付
近が好ましい。反応のｐＨは約３〜１０の広い範囲であ
りうるが、中性付近が望ましい。反応時間は約０．５〜
１００時間程度、好ましくは２０〜５０時間であればよ
い。反応に際して、ラクトースラクトンおよびＩＦＮ−
αそれぞれの使用量は、生成する糖修飾インターフェロ
ンの生理活性を指標として予備実験によって決定するこ
とができる。通常、ＩＦＮ−αの第１級アミノ基に対し
て約０．５〜５０倍モルである。

【００１４】上記反応後、反応液を透析、塩析、限外濾
過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、ＨＰＬ
Ｃ、電気泳動等通常の蛋白質の精製法で精製し、目的の
糖修飾インターフェロンの精製物を得ることができる。
本発明の糖修飾インターフェロンには、ＩＦＮ−αにガ
ラクトース残基が導入されているためガラクト−スに親
和性を持つ肝実質細胞の特性を利用して選択的にまた効
率的にＩＦＮ−αを肝組織に到達させることが可能であ
り、肝癌、肝硬変、肝炎等の肝疾患の治療または予防に
特に有効性を発揮する。さらに、本発明の糖修飾インタ
ーフェロンは生体内での半減期も延長されており、持続
性を有している。

【００１５】本発明の糖修飾インターフェロンを、通常
自体公知の担体、希釈剤等を用いて適宜の医薬品組成物
（例、注射剤、錠剤、カプセル剤）として非経口的また
は経口的にヒトを含む哺乳動物に投与することができ
る。例えば、本発明の糖修飾ＩＦＮ−αを抗ウイルス剤
または抗腫瘍剤として用いるには、注射剤としてはＩＦ
Ｎ−αの量として約１×１０⁵〜１０×１０⁵単位／日で
患者に投与することができる。

【００１６】

【実施例】以下、本発明の具体的実施例を説明するが、
本発明は、これに限定されるものではない。 参考例：ラクト−スラクトンの製造 （１）ラクタネートの製造 ラクトース２６ｇを水４５０ｍｌに溶解し、メタノール
３５ｍｌを加え、さらにヨウ素３７．４５ｇを含むメタ
ノール６００ｍｌを４０℃で加え、次いで４％水酸化カ
リウム溶液（３５．２ｇ／８７５ｍｌ）を加えて４０℃
で６０分反応させた。ヨウ素の色が消失したら氷冷し、
メタノール１０００ｍｌを加え、沈澱を濾取し、冷メタ
ノールとエーテルで洗浄し、水１５０ｍｌに溶解してメ
タノールを添加し、沈澱を濾取してラクトースのグルコ
ースが開環し、その１位がカルボキシル基のカリウム塩
である化合物（ラクタネート）１８ｇを得た。 （２）ラクトースラクトンの製造 （１）で製造したラクタネート１０ｇを水２００ｍｌに
溶解し、ダウエックス(Dowex) ５０(H⁺)カラムに通過
させて、遊離型とし、これを濃縮し、メタノールを加え
て濃縮した。メタノールを溜去し、生成した沈澱にエタ
ノールを加え、沈澱を濾取してラクトースラクトンを得
た。

【００１７】実施例１：ＩＦＮ−αのラクト−スラクト
ンによる修飾（１） 〔製造〕ヒトリンパ芽球由来のインタ−フェロン溶液
（天然型インタ−フェロン-α；スミフェロン（商品
名、住友製薬（株））；分子量17000-30000，リジン残
基10個／分子，350MU/ml/1.7mg蛋白質）0.05mlずつにラ
クト−スラクトン12.3、 61.5、 184.5および307.5μg
の0.1% のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液を
加えて室温で48時間反応した。反応液を0.1%ＳＤＳを含
む水に対して透析した。それぞれのロットをLL-IFN-1、
2、3および4とした。 〔生理活性〕活性の残存率、ＩＦＮ−αの抗ウイルス作
用を担う（２′−５′）オリゴアデニル酸（2-5A）の肝
での産生量を表１に示す。

【００１８】活性力価は、FL細胞／シンドビスウイルス
系での色素取り込み法によるCPE₅₀法で測定し、WHOのリ
ンパ芽球インタ−フェロンを標準品として用いた。2-5A
産生量は各検体（0.068mg 蛋白質）をICRマウスに静脈
内投与し、24時間後に肝臓をすりつぶした後、超遠心分
離（4℃，17000 ×g,15 分）を行い、上清の2-5A産生能
を測定した。2-5A産生能は2-5AS（2-5A合成酵素）の上
昇することを指標にした。活性は 2・5-Aラジオイムノア
ッセイキット（栄研）を用いて測定した。すなわち、被
検サンプル50μl に、poly(I),poly(C)アガロ−スゲル
を加えて10分間室温で放置し、2-5AS を吸着させて活性
化した後、緩衝液1ml で共存干渉物を洗浄除去した後、
ATP 500 μl を加え37℃で1 時間酵素反応させた。こう
して産生された2-5Aに¹²⁵I標識2-5Aと抗2-5A抗血清懸濁
液をそれぞれ100 μlずつ加えて37℃で1 時間競合反応
させた後、2000×g で30分間遠心分離した。遠心分離後
の上清を除去し、沈渣の放射活性を測定した。はじめに
加えた¹²⁵I標識2-5A量に対する結合% を算出し、同時に
作製した標準曲線によって検体中の2-5AS によって産生
された2-5Aを定量した。結果を表１に示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】〔体内動態〕ロットLL-IFN-4を［2,3-³H］
スクシンイミジルプロピオネートで標識し、2670kBq/mg
の³H-LL-IFN-4 及び2007kBq/mgの³H-IFNを調製した。雄
性C₃H/HeN 6 週齢マウス尾静脈から10μg 蛋白質相当を
投与し、投与後経時的に動物を屠殺し血液及び各臓器の
放射活性を測定して体内動態を調べた。その結果を表２
に示した。

【００２１】

【表２】

【００２２】実施例２：ＩＦＮ−αのラクト−スラクト
ンによる修飾（２） 〔製造〕ＩＦＮ−α（350MU/ml/1.7mg 蛋白質）0.5ml
にラクト−スラクトン3.075mgの0.1% SDS水溶液を加え
て室温で96時間反応させ、実施例２に準じて処理して糖
修飾ＩＦＮ−αを得た。

【００２３】ロット LL-IFN-5 残存活性 20.7% 〔生理活性〕このロットLL-IFN-5又はＩＦＮ−αをICR
マウスに10MU/57.8 μg 蛋白質投与し、3 、6 および24
時間後の各時間に屠殺し、肝臓での2-5A産生能を実施例
１に準じて測定した。その結果を図１に示した。

【００２４】

【発明の効果】本発明の糖修飾インターフェロンは、未
修飾のインターフェロンに比べて肝臓への集積性が極め
て高く、生体内での半減期が延長されている。このた
め、肝癌、肝硬変、肝炎等の肝疾患の治療または予防に
該糖修飾インターフェロンを使用すると、未修飾のイン
ターフェロンを使用した場合に比べて極めて高い治療効
果または予防効果をあげることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による糖修飾ＩＦＮ−αと未処理のＩＦ
Ｎ−αをICR マウスに投与した際の肝臓での2-5A産生能
を経時的に測定した結果を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトースラクトンとインターフェロン
   −αとの結合反応生成物であり、ガラクトース残基で修
   飾されたことを特徴とする糖修飾インターフェロン。