WO2012020622A1 - ヒト型化抗ｅｇｆｒ抗体リジン置換可変領域断片及びその利用 - Google Patents

ヒト型化抗ｅｇｆｒ抗体リジン置換可変領域断片及びその利用 Download PDF

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variable region
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泉 熊谷
中西　猛
英明 真田
竜太郎 浅野
光央 梅津
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国立大学法人東北大学
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    • C07K2317/626—Diabody or triabody

Definitions

  • the present invention relates to all the lysine residues in the humanized variable region (H chain or L chain) of the anti-human epidermal growth factor receptor 1 antibody 528, or one specific lysine selected arbitrarily.
  • the present invention relates to a “humanized anti-EGFR antibody lysine substitution variable region fragment” obtained by substituting all other lysine residues other than the residues with other appropriate amino acids, and uses thereof.
  • immunotherapy has been used as a safe treatment for cancer (malignant tumors) and rheumatism.
  • an antibody that specifically shows cytotoxic activity against cancer is used.
  • Antibody drugs composed of such antibodies are recognized as safe and secure with high side effects, low side effects, and high therapeutic effects. On the other hand, it is necessary to produce them using established animal cells. .
  • low-molecular-weight antibodies such as single-chain antibodies (scFv) in which the VH and VL domains of an antibody are contained in a single polypeptide chain has become a global trend.
  • Such low-molecular-weight antibodies can be produced even in inexpensive E. coli, but there is a concern that the half-life in the body decreases due to the decrease in molecular weight and the duration of drug efficacy decreases.
  • a complete antibody such as IgG binds to a target antigen in a multivalent amount, whereas a low-molecular antibody usually has a monovalent valence, so that a decrease in affinity is also a problem.
  • Non-Patent Document 1 can be referred to.
  • BiTE is a small tandem scFv-type small molecule that links two scFvs together.
  • Bispecific antibodies are the only clinical trials (Science.ci2008 Aug 15; 321 (5891): 974-7.).
  • this BiTE is prepared using animal cells, yield and production cost are problematic.
  • tandem scFv type low molecular bispecific antibodies such as BiTE are difficult to prepare from E. coli soluble fraction although they are small molecules (J Mol Biol. 2003 330 (1): 99- 111.) In fact, BiTE is prepared using animal cells.
  • Bispecific antibodies one of the multispecific antibodies, can specifically bind to two different antigens. Research has been actively conducted on the possibility that it can be used as a therapeutic agent having an antitumor effect.
  • a diabody (Dabody) is the smallest unit of such a bispecific antibody.
  • Each heavy chain (H chain) variable region (V region) (represented as “VH”) derived from the same parent antibody.
  • VH and the light chain (L chain) variable region (V region) represented as "VL” VL was devised by utilizing the property of forming a heterodimer by non-covalent bonds with each other ( Non-patent document 2).
  • Such diabody-type bispecific antibodies are characterized by low molecular weight (molecular weight of about 60,000), low immunogenicity and high permeability to tumor tissues, and, for example, microorganisms such as Escherichia coli. It can be mentioned that inexpensive mass production is possible, and that functional modification using genetic engineering is easy.
  • the present inventors have so far developed a diabody-type bispecific antibody (Ex3) prepared using an anti-human epidermal growth factor receptor 1 (Her1) antibody 528 and an anti-CD3 antibody OKT3, and the antibody as a human. It has been found that a typed diabody-type bispecific antibody (hExh3) has an extremely strong antitumor effect (Patent Document 1). Furthermore, in order to exhibit the above-mentioned excellent effects by comparing with diabody-type bispecific antibodies prepared using other antibodies, humanized 528 antibody and humanized OKT3 antibody are human. It was speculated that the structural stability of the typed variable region itself, and combinations thereof, were very important.
  • Patent Document 2 highly functional bispecific antibodies having various structures based on humanized diabody-type bispecific antibodies and the like.
  • Anti-human epidermal growth factor receptor 1 (Her1) antibody 528 has a cancer cell growth inhibitory effect.
  • scFv humanized 528 single chain antibody
  • attempts have already been made to multimerize scFv by modifying a linker (Non-patent Document 5).
  • scFv dimers that induce apoptosis in lymphoma have also been reported (Non-Patent Document 6).
  • scFv multimers that exert growth inhibitory effects on solid cancers and EGFR positive carcinomas have been reported.
  • the present inventor has developed a multimerized small molecule antibody composed of a single chain antibody (scFv) based on the anti-human epidermal growth factor receptor 1 (Her1) antibody 528, which has excellent cancer cell growth. It was shown to have an inhibitory effect (Patent Document 3).
  • scFv single chain antibody
  • Her1 anti-human epidermal growth factor receptor 1
  • Non-patent Document 7 As another method for solving problems such as a decrease in the half-life in the body and a decrease in affinity possessed by low molecular weight antibodies, conventionally, for the addition of high molecular polymers such as polyethylene glycol (PEG), to improve drug efficacy, Chemical modification with anticancer agents has been performed. Conventionally, lysine residues are mutated for chemical modification of proteins having physiological activity such as antibodies. For example, there is an example of successful lysine substitution of TNF ⁇ using a phage display method (Non-patent Document 7). However, the procedure is not always simple. On the other hand, lysine can be substituted for antibody fragments relatively easily while maintaining activity by using a germline database (Non-patent Document 8).
  • lysine which is most commonly used as a target residue for protein chemical modification, usually exists on the protein surface, so that uniform modification is difficult and the activity may be significantly reduced. Furthermore, in the modification of antibody molecules, there is a concern that the activity may be reduced or lost when lysine in the CDR that directly interacts with the target antigen is substituted. In fact, there has been no successful site-specific chemical modification such as PEGylation by replacing all other lysine residues with other amino acids while leaving only one lysine residue at one specific site. .
  • the main object of the present invention is to provide a variable region fragment of an antibody that can site-specifically modify only a specific lysine residue or N-terminal amino group in order to solve the above-mentioned problems. To do.
  • the present inventor has added the lysine residue of the humanized variable region (including within CDR) of anti-human epidermal growth factor receptor 1 antibody 528 to a known germ sequence database.
  • the binding activity was sufficiently retained although a slight decrease in affinity was observed.
  • the three-dimensional structure of the humanized 528 antibody determined by the molecular substitution method
  • the present invention relates to each aspect shown below.
  • [Aspect 1] In the humanized variable region (5L) of the L chain of the anti-human epidermal growth factor receptor 1 (Her1) antibody 528 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, all lysine residues or specific one site A humanized anti-EGFR antibody lysine-substituted light chain variable region fragment, wherein all lysine residues other than lysine residues are substituted with other amino acids.
  • a humanized anti-EGFR antibody lysine-substituted light chain variable region fragment, wherein all lysine residues other than lysine residues are substituted with other amino acids.
  • the 44th lysine residue is an arginine residue
  • the 55th lysine residue is a glutamine residue
  • 79th lysine residue is a threonine residue
  • the 108th lysine residue is a glutamic acid residue
  • the 112th lysine residue is a glutamic acid residue.
  • the 44th lysine residue is an arginine residue
  • the 55th lysine residue is a glutamine residue
  • 79th lysine residue is a threonine residue
  • the 108th lysine residue is a glutamic acid residue
  • the 112th lysine residue is a glutamic acid residue.
  • the 12th lysine residue is an alanine residue
  • the thirteenth lysine residue is a glutamic acid residue
  • the 19th lysine residue is a glutamine residue
  • the 23rd lysine residue is an alanine residue
  • the 63rd lysine residue is a glutamic acid residue
  • the 65th lysine residue is a glutamine residue.
  • the 12th lysine residue is an alanine residue
  • the thirteenth lysine residue is a glutamic acid residue
  • the 19th lysine residue is a glutamine residue
  • the 23rd lysine residue is an alanine residue
  • the 63rd lysine residue is a glutamic acid residue
  • the 65th lysine residue is a glutamine residue.
  • Aspect 11 An antibody molecule comprising the lysine-substituted light chain variable region fragment according to aspects 1 to 4, 9 or 10 and the lysine-substituted heavy chain variable region fragment according to aspects 5 to 8, 9 or 10 as constituent elements.
  • Aspect 12 IgG type antibody molecule, single chain antibody (scFv), dimer of single chain antibody, bispecific antibody, diabody type bispecific antibody, highly functional bispecific antibody or 12.
  • the antibody molecule of embodiment 11 selected from the group consisting of multimerized small molecule antibodies.
  • Aspect 13 The dimer according to embodiment 12, wherein one lysine residue contained in the lysine-substituted light chain variable region fragment or the lysine-substituted heavy chain variable region fragment is crosslinked.
  • the humanized variable region (OL) of the L chain of the anti-CD3 antibody OKT3 and the humanized variable region (OH) of the H chain of the anti-CD3 antibody OKT3 are amino acids represented by SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8, respectively.
  • Aspect 15 A single-chain polypeptide constituting the antibody molecule according to any one of Aspects 11 to 14.
  • Aspect 16 A nucleic acid molecule encoding the lysine-substituted variable region fragment according to any one of Aspects 1 to 8, or the single-chain polypeptide according to Aspect 15.
  • Aspect 17 A nucleic acid molecule that encodes both the two types of single-chain polypeptides constituting the antibody molecule according to any one of Aspects 11 to 14.
  • Aspect 18 A replicable cloning vector or expression vector containing the nucleic acid molecule according to Aspect 16 or 17.
  • Aspect 19 The vector according to Aspect 18, which is a co-expression vector.
  • Aspect 20 The vector according to Aspect 18 or 19, which is a plasmid vector.
  • Aspect 22 A method for producing an antibody molecule according to Aspect 11 or 12, wherein the host cell according to Aspect 21 is cultured, and two kinds of single-chain polypeptides constituting the antibody molecule are expressed. The method comprising recovering and purifying a peptide, associating the two kinds of single-chain polypeptides, and separating and recovering the formed antibody molecule.
  • the prokaryotic cell is Escherichia coli, and two types of single-chain polypeptides are recovered from the culture medium supernatant, perizuma fraction, intracellular soluble fraction, or intracellular insoluble fraction of Escherichia coli.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody molecule according to any one of aspects 11 to 14 as an active ingredient.
  • the humanized anti-EGFR antibody lysine-substituted L chain or H chain variable region fragment of the present invention restricts the lysine residues contained therein to a specific one position. Has also been confirmed to sufficiently retain the binding activity (affinity) to target cells. As a result, various chemical modifications could be achieved site-specifically and uniformly.
  • a dimer obtained by ligation using a chemical cross-linking agent via a lysine residue remaining in a single-chain antibody composed of a humanized anti-EGFR antibody lysine-substituted L chain variable region fragment and H chain variable region fragment The body showed the expected growth-inhibiting effect, and the effect was increased according to the length of the cross-linking agent.
  • a humanized diabody-type bispecific antibody comprising a variable region fragment obtained by site-specific chemical modification of only a specific lysine residue with polyethylene glycol is transformed into the original humanized diabody-type bispecific antibody. It was confirmed to have similar antigen binding activity.
  • the result of the binding activity with respect to A431 cell of the single chain antibody (lysine substituted scFv) by flow cytometry is shown.
  • PEGylation of lysine substituted scFv is shown.
  • a method for dimerization of lysine-substituted scFv is shown.
  • the cell growth inhibitory activity of the dimer of lysine substituted scFv is shown.
  • the preparation of a PEGylated diabody-type bispecific antibody is shown. Shows binding activity of PEGylated diabody-type bispecific antibody by flow cytometry
  • the humanized anti-EGFR antibody lysine-substituted L chain variable region fragment or humanized anti-EGFR antibody lysine-substituted H chain variable region fragment of the present invention (both of which are also referred to as “lysine-substituted variable region fragments”), respectively.
  • the humanized variable region of the L chain of the anti-human epidermal growth factor receptor 1 (Her1) antibody 528 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or the humanized variable region of the H chain (5H) is characterized in that all lysine residues or all lysine residues other than lysine residues at one specific selected site are substituted with other amino acids.
  • 5L has lysine residues at the 5th position of the 44th, 55th, 79th, 108th and 112th positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, leaving any one particular lysine residue therein. I can do it.
  • lysine residues other than 5L 108th lysine residue are substituted with other amino acid residues.
  • 5H has lysine residues at 6 positions of 12, 13, 19, 23, 63 and 65 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and any one of the specific sites in it. It can leave a lysine residue.
  • lysine residues other than the 19th lysine residue of 5H are substituted with other amino acid residues.
  • Non-patent Document 8 amino acid reproductive sequence database known to those skilled in the art.
  • selecting amino acids having a high probability of existence at each position amino acids having a high probability of existence at each position, Substitution with these amino acids can be carried out using site-directed mutagenesis to produce the heavy chain variable region fragment and the light chain variable region fragment of the present invention.
  • a single chain antibody (scFv comprising the same) )
  • scFv comprising the same
  • suitable cells expressing EGFR such as A431 cells (ATCC No.CRL-1555) which is a human squamous cell carcinoma cell line
  • substitution examples can be given as specific examples of substitution of each lysine residue in 5L:
  • the 44th lysine residue is an arginine residue
  • the 55th lysine residue is a glutamine residue
  • 79th lysine residue is a threonine residue
  • the 108th lysine residue is a glutamic acid residue
  • the 112th lysine residue is a glutamic acid residue.
  • each lysine residue in 5H can include the following substitution examples: The following substitutions in 5H: The 12th lysine residue is an alanine residue, The thirteenth lysine residue is a glutamic acid residue; The 19th lysine residue is a glutamine residue, The 23rd lysine residue is an alanine residue, The 63rd lysine residue is a glutamic acid residue, or The 65th lysine residue is a glutamine residue.
  • lysine-substituted variable region fragment of the present invention all of the above-mentioned lysine residues or all lysine residues other than the lysine residue at one specific selected site are substituted with other amino acids. Under appropriate conditions, one such specific lysine residue or N-terminal amino group can be modified site-specifically.
  • site-specific modification for example, polyethylene glycol (PEGylation) or a suitable drug (anticancer agent, radioisotope, etc.) having a function of preventing a decrease in the half-life of the antibody and a decrease in affinity Can be linked to one specific lysine residue or N-terminal amino group of the lysine-substituted variable region fragment of the present invention.
  • PEGylation polyethylene glycol
  • anticancer agent radioisotope, etc.
  • Various types of antibody molecules can be prepared using the lysine-substituted variable region fragment of the present invention as a constituent element. Examples of this include, for example, ordinary IgG type antibody molecules, single chain antibodies (scFv), single chain antibody dimers, bispecific antibodies, diabody type bispecific antibodies (Patent Document 1), A highly functional bispecific antibody (Patent Document 2) or a multimerized low-molecular antibody (Patent Document 3) can be mentioned.
  • the single chain antibody containing the lysine-substituted light chain variable region fragment and the lysine-substituted heavy chain variable region fragment of the present invention can be easily prepared using conventional techniques. As shown in the following examples, unexpectedly from the prior art, this single chain antibody (containing a lysine residue only at one specific position) is a single chain antibody before lysine residue substitution. It was confirmed that the activity of (h528scFv) was substantially retained.
  • Multimers such as dimers can be prepared by cross-linking each other via a lysine residue or N-terminal amino group at one specific site contained in such a single-chain antibody.
  • one specific lysine residue in the dimer can be present in either the L chain or the H chain.
  • the site of one lysine residue contained in each single-chain antibody constituting the dimer is in the H chain (HK), “HK-HK”, and when both are in the L chain (LK), “ It becomes a homodimer having the structure of “LK-LK”.
  • LK When the site of one lysine residue contained in one single chain antibody is in the L chain and the site of one lysine residue contained in the other single chain antibody is in the H chain, LK and It becomes a dimer consisting of HK.
  • bispecific antibodies can be easily produced by crosslinking the single chain antibody of the present invention with single chain antibodies having other antigen specificities.
  • the cross-linking reaction can be performed using an appropriate cross-linking reagent known to those skilled in the art, such as SANH (succinimidyl 4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone) and SFB (succinimidyl 4-formylbenzoate) ⁇ ⁇ ⁇ .
  • SANH succinimidyl 4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone
  • SFB succinimidyl 4-formylbenzoate
  • the constant region or Fc region contained in the BsAb of the present invention is not particularly limited as long as it is derived from a human antibody.
  • CL may be derived from either ⁇ or ⁇ chain.
  • the Fc region or H chain constant region is usually derived from an IgG ⁇ chain.
  • CH1, CH2 and CH3, and CL include those having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, and SEQ ID NO: 33 disclosed in Patent Document 2, respectively.
  • the PreSission sequence is a sequence containing a protease cleavage site.
  • protease there are no particular limitations on the type of protease to be used.
  • enzymes known to those skilled in the art such as Thrombin and FactorFXa can be used, and an amino acid sequence including a protease cleavage site can be appropriately selected accordingly. .
  • the L chain variable region should be on the N-terminal side of the H chain variable region (LH ).
  • Various antibodies (antibody molecules) characterized by type are also included in the present invention.
  • the humanized diabody-type bispecific antibody similar to each lysine-substituted variable region fragment of the present invention, a complete lysine-substituted product of the anti-CD3 antibody heavy and light chain variable region fragments based on the germline sequence database.
  • Various bispecific antibodies can be constructed by preparing (substitutions in which all lysine residues contained are substituted with other amino acid residues) and combining with each lysine-substituted variable region fragment of the present invention.
  • the multimerized low-molecular-weight antibody is formed by, for example, associating 2 to 4 single-chain antibodies, and further, the single-chain antibody has a C-terminal 1 of the lysine-substituted variable region fragment on the N-terminal side.
  • One to several amino acids or 1 to several amino acids at the N-terminal of the lysine-substituted variable region fragment on the C-terminal side may be removed.
  • a single chain antibody containing the lysine-substituted L chain variable region fragment or the lysine-substituted H chain variable region fragment of the present invention can also be used as a component of the multimerized low-molecular antibody described in Patent Document 3.
  • each of the above antibody molecules containing the lysine-substituted variable region fragment of the present invention that is site-specifically modified with polyethylene glycol or the like as a constituent element is an antibody molecule containing the lysine-substituted variable region fragment of the present invention as a constituent element.
  • the anti-EGFR antibody-producing mouse B cell hybridoma 528 has been deposited with the Medical Cell Resource Center attached to the Institute of Aging Medicine, Tohoku University (ID: TKG0555). Further, the hybridoma producing the 528 antibody is stored as ATCC No. HB-8509 in the American Type Culture Collection (ATCC) and can be easily obtained from such depository.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the anti-CD3 antibody OKT3 is also deposited at the Medical Cell Resource Center attached to the Institute for Aging Medicine, Tohoku University (ID: TKG0235).
  • the hybridoma producing the OKT3 antibody is stored as ATCC No. CRL-8001 in the American Type Culture Collection (ATCC) and can be easily obtained from such depository.
  • cDNA can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA is extracted using ISOGEN (Nippon Gene), cDNA is prepared by First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences), and reference paper (Krebber, A. et al. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. J Immunol Methods 201, 35-55. (1997)) PCR was performed using the cloning primers synthesized to determine the sequence of the variable regions of these antibodies. can do.
  • “Humanization” of the variable region contained in the single-chain polypeptide constituting the lysine-substituted variable region fragment or antibody molecule of the present invention is the complementarity in the humanized variable region of human immunoglobulin (recipient antibody).
  • a non-human animal (donor antibody) such as a mouse, rat, or rabbit and having the desired specificity, affinity, and ability in at least some of the residues of the complementarity-determining region (CDR) It refers to an antibody that is substituted by a residue derived from CDR.
  • human immunoglobulin Fv framework (FR) residues may be replaced by corresponding non-human residues.
  • humanized antibodies may comprise residues that are not found in either the recipient antibody and the introduced CDR sequences or framework sequences. These modifications are made to further improve or optimize the antibody performance. For more details, see Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); EP-B-239400; Presta, Curr. Op. 2, 593-596 (1992); and EP-B-451216 ⁇ ⁇ ⁇ .
  • ⁇ ⁇ Humanization of such antibody humanized variable regions can be performed according to methods known to those skilled in the art.
  • humanized antibodies are prepared by analyzing various conceptual humanized products using a three-dimensional immunoglobulin model of recipient and donor antibodies. Three-dimensional immunoglobulin models are well known to those skilled in the art.
  • WO92 / 22653 and the like can be referred to.
  • humanized humanized variable regions include antibodies in which the complementarity determining region (CDR) in the humanized variable region is derived from a mouse antibody and the other part is derived from a human antibody. it can.
  • CDR complementarity determining region
  • an appropriate site in the single-chain polypeptide for example, a framework (FR) that may affect the CDR structure.
  • the function of the humanized antibody can be improved by causing site-specific mutations in the middle part, for example, canonical or vernier sequences.
  • humanization of the 528 humanized variable region was performed by the CDR-grafting method.
  • VH and VL homology searches are performed, and the human antibody sequence having the highest homology FR (frame work) is selected in consideration of the length of each CDR (complementarity determining region). It is preferable to design an amino acid sequence in which the CDR of the selected human antibody is replaced with the CDR of 528, and for the corresponding codon, it is preferable to use the E. coli optimal codon as before, and to perform total synthesis of the gene by overlap PCR method I can do it.
  • humanized OKT3 humanized variable regions have already been reported and have been confirmed to retain sufficient activity compared to mouse OKT3 (Adair, J. R. et al. Humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3. Hum Antibodies Hybridomas 5, 41-7. (1994)).
  • total synthesis of the gene was performed by the overlap PCR method. At this time, it is preferable to use the optimal codon in E. coli, and the increase in the expression level in E. coli by using the total synthetic gene substituted with the optimal codon has already been reported.
  • the humanized variable region (5L) of the light chain of anti-human epidermal growth factor receptor 1 antibody 528, anti-human epidermal growth factor receptor 1 antibody 528, which is the basis for the constituent elements of various antibody molecules of the present invention H chain humanized variable region (5H), anti-CD3 antibody OKT3 L chain humanized variable region (OL), and anti-CD3 antibody OKT3 H chain humanized variable region (OH) base
  • SEQ ID NO: 1 and 2 SEQ ID NO: 3 and 4
  • SEQ ID NO: 5 and 6 SEQ ID NO: 7 and 8, respectively.
  • the lysine-substituted L chain variable region fragment and the lysine-substituted H chain variable region fragment in each single-chain polypeptide are connected by an appropriate peptide linker.
  • the peptide linker makes it difficult for single-chain antibodies to interact with each other in the molecule, and allows the formation of multimers by a plurality of single-chain antibodies, and as a result, VHs derived from different single-chain antibodies.
  • VL are appropriately associated, so that the function of the original protein (the polypeptide is derived from the original protein or derived from the original protein), for example, part of biological activity or It is not particularly limited as long as it can take a structure that simulates or promotes all of them, and for example, it is selected from those widely known in the art or modified from the known linker. Is possible.
  • the peptide linker is preferably 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 2 to 10 amino acids in length.
  • each single-chain polypeptide may not directly contain the above peptide linker, and two lysine-substituted variable region fragments may be directly linked.
  • the C-terminal of the lysine-substituted variable region fragment on the N-terminal side in each single-chain polypeptide it is preferable that 1 to several amino acids or 1 to several amino acids at the N-terminal of the lysine-substituted variable region fragment on the C-terminal side have been removed.
  • an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added (provided that the lysine substitution variable region fragment of the present invention in SEQ ID NO: 4 Amino acid mutations possessed), and the functions and activities of the polypeptide comprising the original amino acid sequence, for example, the amino acid sequence substantially retained with the antigen specificity of the lysine-substituted variable region fragment are also included in the present invention. It can be used as a polypeptide of a single chain antibody constituting an antibody molecule.
  • amino acids that are deleted, substituted, inserted or added are preferably substituted for homologous amino acids (polar / nonpolar amino acids, hydrophobic / hydrophilic amino acids, positive / negative charged amino acids, aromatic amino acids, etc.), Alternatively, it is preferable that amino acid deletion or addition does not cause a significant change in the three-dimensional structure and / or local charge state of the protein or that they are not substantially affected.
  • Polypeptides having such deleted, substituted or added amino acids include, for example, site-directed mutagenesis methods (such as point mutagenesis and cassette mutagenesis), gene homologous recombination methods, primer extension methods, and It can be easily prepared by appropriately combining methods known to those skilled in the art such as PCR.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more, with respect to the total length of the original amino acid sequence. It can also be said to show sequence homology (identity).
  • nucleic acid molecules oligonucleotides
  • oligonucleotides encoding each region or sequence contained in the lysine-substituted variable region fragment of the present invention and the single-chain polypeptide contained in each antibody molecule are shown in the respective SEQ ID NOs. It has a base sequence.
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence showing a sequence homology of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more with the entire length of the nucleotide sequence described in each SEQ ID NO (however, SEQ ID NO: 4 Amino acid mutations of the lysine-substituted variable region fragments of the present invention are retained), and are considered to encode polypeptides having substantially the same activity or function as the above regions or sequences.
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid mutations of the lysine-substituted variable region fragments of the present invention are retained
  • Such a nucleic acid molecule contains a base sequence encoding at least one of two kinds of single-chain polypeptides constituting the diabody-type bispecific antibody of the present invention. It is preferred that the two types of single-chain polypeptides each contain both base sequences.
  • sequence homology between two amino acid sequences or base sequences are pre-processed in an optimal state for comparison. For example, by making a gap in one sequence, the alignment with the other sequence is optimized. Thereafter, the amino acid residues or bases at each site are compared. When the same amino acid residue or base as the corresponding site in the second sequence is present at a site in the first sequence, the sequences are identical at that site. Sequence homology between the two sequences is expressed as a percentage of the total number of sites (all amino acids or all bases) of the number of sites that are identical between the sequences.
  • homology means each amino acid residue constituting the chain between two chains in a polypeptide sequence (or amino acid sequence) or polynucleotide sequence (or base sequence). Means the number (number) of things that can be determined to be the same in the matching relationship between comrades or bases, and means the degree of sequence correlation between two polypeptide sequences or two polynucleotide sequences Is. Homology can be easily calculated. Many methods are known for measuring homology between two polynucleotide or polypeptide sequences, and the term “homology” is well known to those skilled in the art (eg, Lesk, A. M.
  • Preferred methods for measuring homology include those designed to obtain the largest match between the two sequences being tested. An example of such a method is one assembled as a computer program.
  • Preferred computer programming methods for measuring the homology between two sequences include GCG program package (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990)), etc., but are not limited thereto, and methods known in the art are used. be able to.
  • each nucleic acid molecule described above hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence represented by each SEQ ID NO. It includes DNA encoding a polypeptide having substantially the same function and activity as the polypeptide.
  • hybridization can be carried out according to a method known in the art or a method analogous thereto, such as the method described in Molecular cloning third.ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • Hybridization may be performed by a method known in the art, such as the method described in Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M, Ausubel et al, 1987), or the like. It can carry out according to the method according to it. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • stringent conditions in DNA hybridization are defined by an appropriate combination of salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. That is, stringency increases depending on whether the salt concentration is reduced, the organic solvent concentration is increased, or the hybridization temperature is increased.
  • washing conditions after hybridization also affect stringency. This wash condition is also defined by salt concentration and temperature, and the stringency of the wash increases with decreasing salt concentration and increasing temperature.
  • “stringent conditions” means that the degree of homology between each base sequence is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more on the average on the whole. It means that the hybrid is specifically formed only between base sequences having high homology.
  • the conditions include a sodium concentration of 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and a pH of 6 to 8 at a temperature of 60 ° C. to 68 ° C.
  • hybridization is performed under conditions of 5 SSC (750 mM NaCl, 75 mM ⁇ trisodium citrate), 1% SDS, 5 x Denhardt solution 50% formaldehyde, and 42 ° C. Washing is carried out under the conditions of 0.1 x SSC (15 mM NaCl, 1.5 mM trisodium citrate), 0.1% SDS, and 55 ° C.
  • nucleic acid when a nucleic acid encoding a lysine substitution variable region fragment in each single-chain polypeptide is prepared, it can be totally synthesized by an overlap PCR method based on a previously designed amino acid sequence.
  • nucleic acid is a molecule that encodes a single-chain polypeptide, its chemical structure and acquisition route are not particularly limited, and include, for example, gDNA, cDNA, chemically synthesized DNA, mRNA, and the like. is there.
  • telomere can be isolated from a cDNA library by hybridization based on the sequence described in the literature, or by the polymerase chain reaction (PCR) technique.
  • the DNA is placed in an expression vector, which is then placed in an E. coli (C. coli) cell, COS cell, Chinese hamster ovary cell (CHO cell), or myeloma cell that does not produce immunoglobulin.
  • E. coli C. coli
  • COS cell COS cell
  • CHO cell Chinese hamster ovary cell
  • myeloma cell that does not produce immunoglobulin.
  • a host cell can be transfected and a monoclonal antibody synthesized in the recombinant host cell.
  • the PCR reaction can be carried out by a method known in the art or a method or modification method substantially similar thereto, for example, R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R.
  • the PCR method can be performed using a commercially available kit suitable for the PCR method, and can also be performed according to a protocol clarified by the kit manufacturer or the kit vendor.
  • nucleic acid encoding the single-chain polypeptide constituting the antibody molecule of the present invention thus obtained or each region contained therein appropriately encodes a desired peptide or amino acid according to the purpose by means known to those skilled in the art.
  • modification of a nucleic acid means insertion, deletion or substitution of a base in at least one codon encoding an amino acid residue in the obtained original nucleic acid.
  • altering the amino acid sequence itself constituting a single-chain polypeptide by replacing a codon encoding an original amino acid residue with a codon encoding another amino acid residue.
  • a single-chain polypeptide is used so that a codon (optimum codon) suitable for a host cell such as E. coli is used without changing the amino acid itself.
  • the encoding nucleic acid can also be modified.
  • by changing to an optimal codon it is possible to improve the expression efficiency of the single-chain polypeptide in the host cell.
  • the antibody molecule of the present invention can be produced using methods known to those skilled in the art, for example, various means such as genetic engineering techniques or chemical synthesis.
  • genetic engineering techniques for example, a replicable cloning vector or expression vector containing a nucleic acid encoding the polypeptide of each single-chain antibody constituting the bispecific antibody is prepared, and this vector is used as a host. Transforming the cells, culturing the transformed host cells to express the single chain polypeptide in the host cells, recovering and purifying the polypeptide, associating the single chain polypeptides, It can be produced by separating and recovering the formed antibody molecules.
  • replicable expression vector and “expression vector” refer to a piece of DNA (usually double-stranded), in which the DNA contains Can be inserted with foreign DNA fragments.
  • Foreign DNA is defined as heterologous DNA, which is a DNA that is not found naturally in the subject host cell.
  • Vectors are used to carry foreign or heterologous DNA strands into appropriate host cells. Once in the host cell, the vector can replicate independently of the host chromosomal DNA cage, and several copies of the vector and its inserted (foreign) DNA cage can be generated.
  • the vector contains the elements essential to allow translation of the foreign DNA into a polypeptide. Thus, many molecules of polypeptides encoded by foreign DNA can be synthesized rapidly.
  • Such vectors are operably linked to an appropriate control sequence so that the DNA sequence is expressed in an appropriate host (ie, to allow expression of foreign DNA). It means a “DNA construct” containing the determined DNA sequence.
  • control sequences include a promoter for transcription transcription, any operator sequence to control such transcription, sequences encoding appropriate mRNA ribosome binding sites, enhancers, reardenylation sequences, and transcription and translation. (translation) An array for controlling the end of the cage can be mentioned.
  • the vector can appropriately contain various sequences known to those skilled in the art, for example, restriction enzyme cleavage sites, marker genes (selection genes) such as drug resistance genes, signal sequences, leader sequences, and the like as necessary.
  • sequences or elements can be appropriately selected and used by those skilled in the art depending on conditions such as the type of foreign DNA, the host cell used, the culture medium, and the like. Further, for the purpose of facilitating the detection and purification of the produced single-chain polypeptide, a sequence encoding various peptide tags known to those skilled in the art (for example, c-myc tag and His-tag) is added. It can be included at the end of the sequence corresponding to this polypeptide.
  • the vector can be in any form such as a plasmid, a phage particle, or simply a genomic insert. Once introduced into a suitable host by transformation, the vector can replicate or function independently of the resident genome. Alternatively, the vector may be one that is integrated into the genome.
  • any cell known to those skilled in the art can be used.
  • typical host cells include prokaryotic cells such as E. coli and Chinese hamster ovary cells (CHO cells).
  • Mammalian cells such as rabbits and human-derived cells, and eukaryotic cells such as yeast and insect cells.
  • the transformed bacteria can be cultured under any mortgage conditions and methods known to those skilled in the art.
  • As the host for example, BL21 ⁇ ⁇ star (DE3) strain, 2xYT medium as the medium, culture temperature around 28 ° C, induction of expression with IPTG of about 0.5 mM, the antibody molecule of the present invention in the culture supernatant or soluble fraction The yield can be greatly improved, and the production efficiency can be increased.
  • a single-chain polypeptide obtained by such expression in a host cell is generally recovered from the culture medium as a secreted polypeptide, but if it is produced directly without a secretion signal, the host It can be recovered from cell lysates. If the single-chain polypeptide is membrane-bound, it can be released from the membrane using a suitable detergent (eg, Triton-X100).
  • a suitable detergent eg, Triton-X100
  • the purification operation can be performed by appropriately combining methods known to those skilled in the art. For example, if necessary, chemical modification such as PEGylation is performed, followed by centrifugation, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, fractionation on an ion exchange column, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, silica It is suitably purified by chromatography, chromatography on heparin sepharose, anionic or cationic resin chromatography (polyaspartic acid column etc.), chromatofocusing, SDS-PAGE, ammonium sulfate precipitation, and affinity chromatography. Affinity chromatography is one of the preferred purification techniques with high efficiency utilizing the affinity with a peptide tag of a single-chain polypeptide.
  • the purification operation is preferably performed after the single-chain polypeptide is solubilized and denatured.
  • This solubilization treatment can be performed using any agent known to those skilled in the art as a dissociating agent such as alcohols such as ethanol, guanidine hydrochloride, and urea.
  • the antibody molecule of the present invention can be produced by associating (unwinding) the two kinds of single-chain polypeptides thus purified, and separating and recovering the formed antibody molecule.
  • the association treatment means that a single single-chain polypeptide is returned to a state having a desired biological activity by returning it to an appropriate spatial arrangement. Therefore, the association treatment also has the meaning of returning the polypeptides or domains to the associated state, so it can also be referred to as “reassociation”, and in the sense of having the desired biological activity. It can also be called reconstruction, or it can be called refolding.
  • the association treatment can be performed by any method known to those skilled in the art. For example, the concentration of the denaturing agent (for example, guanidine hydrochloride) in the buffer solution containing the single-chain polypeptide is decreased stepwise by, for example, dialysis. The method is preferred.
  • the antibody molecule of the present invention can be prepared from, for example, a culture medium supernatant of a culture host cell such as Escherichia coli, a perizma fraction, a cell-soluble fraction, or a cell-insoluble fraction. is there.
  • a co-expression vector containing both nucleic acid molecules corresponding to the single-chain polypeptide constituting the antibody molecule of the present invention as a vector of the present invention, or a nucleic acid molecule encoding each of the single-chain polypeptides
  • the same host cell is transformed with the expression vector containing it, and each single-chain polypeptide is expressed in the transformed bacterium, and then antibody molecules are formed, which are transformed into the culture medium supernatant or soluble of cultured host cells such as Escherichia coli. It can be prepared from the fraction. Therefore, in such a case, the above-described association (rewinding) process becomes unnecessary, and high productivity can be obtained at low cost.
  • BL21 star (DE3) strain (Invitrogen) is used as the host, and the culture is performed at 28 ° C. using 2 ⁇ YT medium. After overnight shaking culture (OD at 600 nm is approximately 5), expression was induced by IPTG with a final concentration of 0.5 mM, and after culturing for 16 hours, medium supernatant fraction and cells were treated with osmotic pressure The target protein is recovered from this fraction (periplasm fraction).
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises as an active ingredient a substance selected from the group consisting of the antibody molecule of the present invention, a single-chain polypeptide, a nucleic acid, a vector, and a transformed host cell. .
  • a substance selected from the group consisting of the antibody molecule of the present invention a single-chain polypeptide, a nucleic acid, a vector, and a transformed host cell.
  • such an active ingredient has an action of significantly eliminating, killing, or damaging (positive) tumor cells expressing the epidermal growth factor receptor in vitro and in vivo. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an antitumor agent against such tumor cells.
  • the effective amount of the active ingredient of the present invention can be appropriately determined by those skilled in the art depending on, for example, the therapeutic purpose, the type of tumor, the site and size of the subject to be administered, various conditions of the patient, the administration route, and the like.
  • a typical single dose or daily dose will depend on the above conditions and, if possible, first in vitro and then, for example, using assays known in the art for tumor cell survival or growth.
  • appropriate dose ranges can be determined with appropriate animal models that can extrapolate dose ranges for human patients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains various pharmaceutically acceptable pharmacological agents well known to those skilled in the art in addition to the active ingredient, depending on various conditions such as the type of active ingredient, pharmaceutical form, administration method / purpose, and pathological condition of the administration target.
  • Components eg, carriers, excipients, buffers, stabilizers, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a tablet, solution, powder, gel, spray, or microcapsule, colloidal distribution system (liposome, microemulsion, etc.), macroemulsion, etc., depending on the above various conditions.
  • colloidal distribution system liposome, microemulsion, etc.
  • macroemulsion etc.
  • administration methods include intravenous, intraperitoneal, intracerebral, intraspinal, intramuscular, intraocular, intraarterial, in particular intrabiliary or intralesional injection or injection, and sustained release system formulations. It is done.
  • the active substances according to the invention can be administered continuously by infusion or by bulk injection.
  • Sustained release formulations are generally of a form from which the active substance of the present invention can be released for a period of time, and suitable examples of sustained release preparations include solid hydrophobic polymers containing proteins.
  • a semipermeable carrier is included, which is in the form of a molded product, such as a film or microcapsule.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by methods known to those skilled in the art, for example, the Japanese Pharmacopoeia Manual Editorial Committee, 13th revision, Japanese Pharmacopoeia Manual, issued on July 10, 1996, Yodogawa Shoten Co., Ltd. In view of the description, it can be appropriately selected and manufactured from among them.
  • the humanized variable region (5H) of H chain all lysine residues including those in the CDR in each region were substituted with other appropriate amino acids.
  • variable region fragments 5H (VH0K) and 5L (VL0K) in which all lysine residues were substituted with other amino acids as described below were obtained as examples of lysine-substituted variable region fragments.
  • the 44th lysine residue is an arginine residue
  • the 55th lysine residue is a glutamine residue
  • 79th lysine residue is a threonine residue
  • the 108th lysine residue is a glutamic acid residue
  • the 112th lysine residue is a glutamic acid residue.
  • the 12th lysine residue is an alanine residue
  • the thirteenth lysine residue is a glutamic acid residue
  • the 19th lysine residue is a glutamine residue
  • the 23rd lysine residue is an alanine residue
  • the 63rd lysine residue is a glutamic acid residue
  • the 65th lysine residue is a glutamine residue.
  • the humanized anti-EGFR antibody lysine-substituted heavy chain variable wherein the 19th glutamine residue of 5H is re-substituted with a lysine residue after re-substitution with the original lysine residue at any of the above sites in 5L or 5H
  • a region fragment “VH1K” and a humanized anti-EGFR antibody lysine-substituted light chain variable region fragment “VL1K” in which the 108th glutamic acid residue of 5 L was replaced with a lysine residue were prepared.
  • VH0K and VL0K were used as single-chain antibodies (lysine-substituted scFv) containing each lysine-substituted variable region fragment thus selected.
  • Three types, “0K” containing, “HK” containing VH1K and VL0K, and “LK” containing VH0K and VL1K were prepared in the following outline.
  • the expression vector was prepared based on the humanized 528scFv expression vector (pRA-h5Hh5L (G1): Patent Document 3) that has already been constructed by the present inventors.
  • each humanized scFv expression vector having a 15 amino acid linker (GGGGS) 3 was prepared by replacing the h5H site or h5L site including the linker sequence.
  • GGGGS 15 amino acid linker
  • His-tag Hisx6: histidine hexamer tag
  • A431 cells which is a human squamous cell carcinoma cell line
  • A431 cells which is a human squamous cell carcinoma cell line
  • NC negative control
  • PC positive control
  • the binding activity (affinity) of the three types of single chain antibodies of the present invention to A431 cells is not substantially different from the activity of the single chain antibody (h528scFv) before lysine residue substitution. (Retained) was confirmed.
  • scFv HK and LK were dimerized.
  • SANH is a molecule with an NHS ester at one end and a hydrazine group at the opposite end
  • SFB is an NHS ester at one end and an aldehyde group at the opposite end.
  • the NHS ester and amino group binding reaction was performed by dialysis against borate buffer (pH 8.5, 25 ° C), and then adding SANH or SFB adjusted to 20 mM with dimethyl sulfoxide (DMSO) to a final concentration of 2 mM. Add (10% DMSO) and let stand at 25 ° C. for 2 hours. Hydrazone binding is performed by dialysis against a buffer of pH 7.0 or lower for 2 hours to remove excess SANH and SFB, and simultaneously change the pH, and mix the sample with SANH and SFB bound after completion of dialysis (pH 6.0). (PBS)) and left at 25 ° C. for 2 hours to form a dimer (FIG. 3).
  • dimers having different distances between scFvs could be prepared by using two kinds of crosslinking reagents having different crosslinking distances.
  • the cells were counted, adjusted to 2 ⁇ 10 3 cells per 100 ⁇ L of RPMI (10% FBS), dispensed 100 ⁇ L each into a 96-well plate, and allowed to stand at 37 ° C. overnight.
  • the target protein was diluted with RPMI to the target concentration, 200 ⁇ L of antibody protein was dispensed onto the plate prepared the previous day, and cultured at 37 ° C. for 96 hours. After removing the culture medium from the plate, washing with PBS, adding MTS, PMS, and RPMI, and incubating at 37 ° C.
  • the dimer of the present invention induces cell growth inhibitory activity that is not found in the monomer (HK or LK).
  • MTS reagent CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega
  • PMS CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega
  • the diabody- type bispecific antibody of the present invention was prepared according to the method described in Patent Document 1.
  • a single-chain polypeptide (528VL 1K (Lys108) -OKT3 VH Lys (-))) consisting of all the lysine residues substituted with other amino acid residues was prepared, and this is shown in Example 3.
  • PEGylated single chain polypeptide comprising a lysine-substituted L chain variable region fragment that is PEGylated under the described conditions (pH 8.5) and site-specifically PEGylated only at the 108th lysine of the L chain variable region fragment of the 528 antibody Got.
  • a chain polypeptide (528VH-OKT3 VL) was prepared.
  • the unpurified PEGylated single-chain polypeptide thus prepared and the other single-chain polypeptide were mixed in an equimolar amount, and after rewinding by dialysis, gel filtration chromatography (Hiload superdex TM 200 26/60 PG, Purified with a flow rate of 2 mL / min and eluent PBS), each fraction with a retention volume of 120-200 mL was subjected to SDS-PAGE.
  • the diabody-type bispecific of the present invention containing, as a constituent, a lysine-substituted L chain variable region fragment in which only the 108th lysine of the L chain variable region fragment of the 528 antibody was site-specifically PEGylated at peak 2 (1 ⁇ M / mL) fraction uniformly containing the sex antibody (PEG Ex3) was obtained.
  • PEG Ex3 a lysine-substituted L chain variable region fragment in which only the 108th lysine of the L chain variable region fragment of the 528 antibody was site-specifically PEGylated at peak 2 (1 ⁇ M / mL) fraction uniformly containing the sex antibody
  • the diabody-type bispecific antibody prepared in Example 5 was subjected to flow cytometry as described in Example 2.
  • a primary antibody sample a PEGylated diabody-type bispecific antibody (100 pmol) obtained from peak 1 and peak 2 in gel filtration chromatography was used.
  • a 265 pmol antibody sample was used for the reaction between the diabody-type bispecific antibody contained in peak 2 in gel filtration chromatography and T-LAK.
  • PC positive control
  • FITC-conjugate anti-HA as a detection antibody Antibody was added and fluorescence was measured.
  • the diabody-type bispecific antibody contained in peak 2 in gel filtration chromatography has binding activity to EGFR and CD3.
  • a single chain antibody (h528scFv) acquires multivalent binding by multimerization, and as a result shows a growth inhibitory effect (Patent Document 3), but the distance between variable regions cannot be freely changed.
  • the single-chain antibody according to the present invention having a specific lysine residue as a reactive group is capable of uniform chemical modification and has various high-functional designs depending on the chemical crosslinking agent. It has a high technical advantage where possible. For example, lysine substitution of antibody fragments targeting cancer-related antigens, such as the creation of highly multivalent molecules by using chemical crosslinking agents with a large number of branches, anticancer agents, and other modifications with radioisotopes It can be said that the body is extremely useful.
  • humanized anti-EGFR antibody lysine-substituted L chain or H chain variable region fragment of the present invention, or a single chain antibody composed thereof, is used as a component of various antibody molecules to further enhance the functionality. Can be planned.

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Abstract

目的は、標的細胞に対する結合活性（親和性）を十分に保持し、更に、様々な化学修飾を部位特異的にかつ均一に達成することができるような、ヒ卜型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｌ鎖又は同Ｈ鎖可変領域断片、又はそれらから構成される一本鎖抗体等を提供すること。 本発明は、配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列から成る抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８のＬ鎖又はＨ鎖のヒト型化可変領域において、全てのリジン残基又は特定の一つの部位のリジン残基以外の全てのリジン残基が他のアミノ酸に置換されて成る、ヒ卜型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｌ鎖可変領域断片に係る。

Description

ヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換可変領域断片及びその利用
　本発明は、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８ヒト型化可変領域の（Ｈ鎖又はＬ鎖）において、全てのリジン残基、又は、任意に選択される特定の一つの部位のリジン残基以外の全てのリジン残基を他の適当なアミノ酸に置換して得られる「ヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換可変領域断片」及びその利用等に関する。
　がん（悪性腫瘍）及びリウマチ等に対する安全な治療法として、近年、免疫療法が用いられている。がんに対する免疫療法では、がんに対して特異的に細胞傷害活性を示す抗体が使用される。このような抗体から成る抗体医薬は、副作用の少ない、安心安全で治療効果の高いことが認められる一方、確立された動物細胞を用いて製造する必要があるためにコスト高が問題となっている。
　このため、ある抗体のＶＨとＶＬのドメインが一本のポリペプチド鎖中にある一本鎖抗体(scFv)のような低分子抗体の作製が世界的な潮流となっている。このような低分子抗体は安価な大腸菌でも製造可能であるが、分子量の低下によって体内半減期が低下し、薬効持続時間が減少することが懸念される。また、IgGの様な完全抗体は、標的抗原に対し多価で結合するのに対し、通常、低分子抗体は結合価が一価となるため、親和性の低下も問題となっている。更に、抗体医薬の主な作用機序はFc領域を介した抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)ともされているため、Fc領域を有さないscFvは効果の低さが懸念される。尚、scFvについては、非特許文献１を参照することができる。
このため、がん細胞と免疫細胞を架橋するよう特異付けた低分子二重特異性抗体などが開発されてきており、BiTEと呼ばれる、2つのscFv同士を連結させたtandem scFv型の低分子二重特異性抗体が唯一臨床治験に進んでいる(Science. 2008 Aug 15;321(5891):974-7.)。しかしながらこのBiTEは、動物細胞を用いて調製しているため、収量や製造コストが問題となっている。BiTEのようなtandem scFv型の低分子二重特異性抗体は、低分子であるものの大腸菌可溶性画からの調製は困難であるとの報告もあり(J Mol Biol. 2003 330(1):99-111.)、事実BiTEは動物細胞を用いて調製されている。
　多重特異性抗体のうちの一つである二重特異性抗体(Bispecific Antibody:BsAb)は２つの異なる抗原に対して特異的に結合することが可能であるため、この特性を生かして特異的な抗腫瘍効果を持った治療薬としての利用法が可能であるとして、その研究が盛んに行われている。ダイアボディ（diabody:Db）とはこのような二重特異性抗体の最小単位であり、それぞれ同じ親抗体由来の重鎖（H鎖）の可変領域（V領域）（「VH」と表わされる）VHと軽鎖（L鎖）の可変領域（V領域）（「VL」と表わされる）VLとが互いに非共有結合によりヘテロ二量体を形成するという性質を利用し考案されたものである（非特許文献２）。
　このようなダイアボディ型二重特異性抗体の特徴としては、低分子（分子量約60,000）であることによる低免疫原性及び腫瘍組織への高浸透性、更には、例えば、大腸菌等の微生物を利用した安価な大量製造が可能であること、又、遺伝子工学を利用した機能改変が容易であることを挙げることができる。
本発明者等は、これまでに、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８及び抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を用いて作製したダイアボディ型二重特異性抗体(Ex3)及び該抗体をヒト型化したダイアボディ型二重特異性抗体(hExh3)は極めて強力な抗腫瘍効果を有していることを見出している（特許文献１）。更に、他の抗体を用いて作製したダイアボディ型二重特異性抗体との比較により、該が上記の優れた効果を発揮する為には、ヒト型化５２８抗体及びヒト型化ＯＫＴ３抗体のヒト型化可変領域自身の構造的安定性、及びこれらの組み合わせが非常に重要であることが推測された。
　更に、本発明者等はヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体等に基づき多様な構造を有する高機能性二重特異性抗体を開発している（特許文献２）。
又、ダイアボディ型二重特異性抗体以外の二重特異性抗体の調製等は、以下の非特許文献３及び非特許文献４に記載されている。
　抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８はがん細胞の成長阻害効果を有する。しかしながら、既に記載したように、EGFRへの結合価が一価の場合、抗原との親和性が低く、その効果がほとんど見られないことが知られている。実際にヒト型化５２８の一本鎖抗体（scFv）にはがん細胞成長阻害効果が認められなかった。scFvが有するこのような欠点を克服するために、既にリンカーの改変によるscFvの多量体化が試みられてきた（非特許文献５）。近年では、リンパ腫にアポトーシスを誘導するscFv二量体なども報告されている（非特許文献６）。しかしながら、固形がんやEGFR陽性がん腫に対して、成長阻害効果を発揮するscFv多量体の例は報告されていない。
本発明者は、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８に基づく一本鎖抗体(scFv)から構成される多量体化低分子抗体を開発し、これらは優れたがん細胞成長阻害効果を有することが示された（特許文献３）。
低分子抗体が抱える体内半減期の低下及び親和性の低下等の問題を解決する他の方法として、従来から、ポリエチレングリコール(PEG)等の高分子ポリマーの付加、薬効の向上に向けては、抗がん剤などによる化学修飾が行われてきた。抗体のような生理活性を有するタンパク質の化学修飾のために、リジン残基を変異させることが従来から行われている。例えば、ファージ提示法を用いてTNFαのリジン置換に成功した例などがある（非特許文献７）。しかしながらその手順は必ずしも簡便ではない。一方、抗体断片は生殖配列データベースを利用することで、活性を保持したまま比較的簡便にリジンを置換することができる（非特許文献８）。
 
特許第３８０３７９０号明細書 国際公開第WO2007/108152号パンフレット 特開２０１０－１１９３０３号公報
Rosenburg and Moore (Ed.), "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", Vol. 113, Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994) Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993 Alt M, et. al. Novel tetravalent and bispecific IgG-like antibody molecules combining single-chain diabodies with the immunoglobulin gamma1 Fc or CH3 region. FEBS Lett., 454, 90-4. (1999) Lu D, et. al. A fully human recombinant IgG-like bispecific antibody to both the epidermal growth factor receptor and the insulin-like growth factor receptor for enhanced antitumor activity. J Biol Chem., 280, 19665-72. (2005) Biomol Eng. 2001 18(3):95-108 Biochem Biophys Res Commun. 2004 315(4):912-8 Nat Biotechnol. 2003;21(5):546-52. Bioconjug Chem. 2003;14(2):480-7
上記のようにタンパク質の化学修飾の標的残基として最も汎用的に用いられるリジンは、通常タンパク質表面に複数存在するため、均一な修飾が困難である他に大幅に活性が低下する場合もある。更に、抗体分子の修飾では、標的抗原と直接相互作用するCDR中のリジンを置換した場合には活性の低下や消失が懸念される。実際に、特定の一つの部位のリジン残基のみを残してその他のリジン残基を全て他のアミノ酸に置換してし、PEG化等の部位特異的化学修飾に成功した例はこれまでにない。
従って、本発明の主な目的は、上記の課題を解決すべく、特定のリジン残基又はＮ末端アミノ基のみを部位特異的修飾できるような抗体の可変領域断片等を提供することを目的とする。
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のヒト型化可変領域（CDR内も含む）のリジン残基を、公知の生殖配列データベースに基づき全て他のアミノ酸に置換したところ、若干の親和性の低下はみられたものの十分に結合活性を保持しており、更に、分子置換法により決定したヒト化型５２８抗体の立体構造を考慮しつつ、５２８ヒト型化可変領域のＨ鎖又はＬ鎖において１ヶ所のみを本来のリジンに再置換したところ、機能を保持していることが確認された。そこで、実際に化学修飾の例としてPEG化を行った結果、期待通りの部位特異的修飾、即ち、リジンに再置換された特定の位置に1分子だけPEGを付加させることに成功し、本発明を完成した。
即ち、本発明は以下に示す各態様に係るものである。
［態様１］
配列番号２で示されるアミノ酸配列から成る抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）において、全てのリジン残基又は特定の一つの部位のリジン残基以外の全てのリジン残基が他のアミノ酸に置換されて成る、ヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｌ鎖可変領域断片。
［態様２］
５Ｌにおける１０８番目のリジン残基以外の全てのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、態様１記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片。
［態様３］
５Ｌにおける以下の置換の少なくとも一つを含む、態様１または２記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片：
４４番目のリジン残基がアルギニン残基、
５５番目のリジン残基がグルタミン残基、
７９番目のリジン残基がトレオニン残基、
１０８番目のリジン残基がグルタミン酸残基、又は、
１１２番目のリジン残基がグルタミン酸残基。
［態様４］
５Ｌにおける以下の置換を含む、態様１記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片：
４４番目のリジン残基がアルギニン残基、
５５番目のリジン残基がグルタミン残基、
７９番目のリジン残基がトレオニン残基、
１０８番目のリジン残基がグルタミン酸残基、及び
１１２番目のリジン残基がグルタミン酸残基。
［態様５］
配列番号４で示されるアミノ酸配列から成る抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）において、全てのリジン残基又は特定の一つのリジン残基以外の全てのリジン残基が他のアミノ酸に置換されて成る、ヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｈ鎖可変領域断片。
［態様６］
５Ｈにおける１９番目のリジン残基以外のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、態様５記載のリジン置換Ｈ鎖可変領域断片。
［態様７］
５Ｈにおける以下の置換の少なくとも一つを含む、態様５または６記載のリジン置換Ｈ鎖可変領域断片：
１２番目のリジン残基がアラニン残基、
１３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、
１９番目のリジン残基がグルタミン残基、
２３番目のリジン残基がアラニン残基、
６３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、又は、
６５番のリジン残基がグルタミン残基。
［態様８］
５Ｈにおける以下の置換を含む、態様５記載のリジン置換Ｈ鎖可変領域断片：
１２番目のリジン残基がアラニン残基、
１３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、
１９番目のリジン残基がグルタミン残基、
２３番目のリジン残基がアラニン残基、
６３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、及び、
６５番のリジン残基がグルタミン残基。
［態様９］
一つのリジン残基又はＮ末端アミノ基が部位特異的に修飾されている、態様１～８のいずれか一項に記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片又はリジン置換Ｈ鎖可変領域断片。
［態様１０］
ポリエチレングリコールによって部位特異的に修飾されている態様９記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片又はリジン置換Ｈ鎖可変領域断片。
［態様１１］
態様１～４、９又は１０記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片及び態様５～８、９又は１０記載のリジン置換Ｈ鎖可変領域断片を構成要素として含む抗体分子。
［態様１２］ＩｇＧ型抗体分子、一本鎖抗体(scFv)、一本鎖抗体の二量体、二重特異性抗体、ダイアボディ型二重特異性抗体、高機能性二重特異性抗体又は多量体化低分子抗体から成る群から選択される、態様１１記載の抗体分子。
［態様１３］
リジン置換Ｌ鎖可変領域断片又はリジン置換Ｈ鎖可変領域断片に含まれる一つのリジン残基が架橋されてなる、態様１２記載の二量体。
［態様１４］
抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）、及び、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）が、夫々、配列番号６及び配列番号８で示されるアミノ酸配列から成る、態様１１記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
［態様１５］態様１１～１４のいずれか一項に記載の抗体分子を構成する一本鎖ポリペプチド。
［態様１６］態様１～８のいずれか一項に記載のリジン置換可変領域断片、又は、態様１５に記載の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸分子。
［態様１７］態様１１～１４のいずれか一項に記載の抗体分子を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを共にコードする核酸分子。
［態様１８］態様１６又は１７記載の核酸分子を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
［態様１９］共発現ベクターである、態様１８記載のベクター。
［態様２０］プラスミドベクターである、態様１８又は１９記載のベクター。
［態様２１］態様１９ないし２０のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
［態様２２］態様１１又は１２記載の抗体分子の製造方法であって、態様２１に記載の宿主細胞を培養し、該抗体分子を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該ポリペプチドを回収・精製し、該２種類の一本鎖ポリペプチドを会合させ、形成された抗体分子を分離・回収することから成る、前記方法。
［態様２３］原核細胞が大腸菌であり、２種類の一本鎖ポリペプチドを大腸菌の培養培地上清、ペリズマ画分、菌体内可溶性画分、又は、菌体内不溶性画分から回収する、態様２２記載の製造方法。
［態様２４］態様１４記載の抗体分子の製造方法であって、態様１９記載の共発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し該抗体分子を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該形質転換菌内でダイアボディ型二重特異性抗体を形成せしめ、形成された二重特異性抗体を分離・回収することから成る、前記方法。
［態様２５］　態様１１～１４のいずれか一項に記載の抗体分子を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
［態様２６］腫瘍細胞を排除する、殺傷する、傷害する及び／又は減少せしめるためのものであることを特徴とする態様２５記載の医薬組成物。
本発明のヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｌ鎖又は同Ｈ鎖可変領域断片、又はそれらから構成される一本鎖抗体は、そこに含まれるリジン残基を特定の１箇所に制限することによっても標的細胞に対する結合活性（親和性）を十分に保持していることが確認された。この結果、様々な化学修飾を部位特異的にかつ均一に達成することができた。
ヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｌ鎖可変領域断片及び同Ｈ鎖可変領域断片から構成される一本鎖抗体に残るリジン残基を介して化学架橋剤を用いて連結させて得られた二量体には期待通りの増殖抑制効果がみられ、架橋剤の長さに応じた効果の増強もみられた。
更に、ポリエチレングリコールで特定のリジン残基のみを部位特異的に化学修飾した可変領域断片を含むヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体が元のヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体と同様の抗原結合活性を有していることが確認された。
フローサイトメトリーによる一本鎖抗体（リジン置換scFv）のA431細胞に対する結合活性の結果を示す。 リジン置換scFvのＰＥＧ化を示す。 リジン置換scFvの二量体化の手法を示す。 リジン置換scFvの二量体の細胞増殖阻害活性を示す。 ＰＥＧ化ダイアボディ型二重特異性抗体の調製の様子を示す。 フローサイトメトリーによるＰＥＧ化ダイアボディ型二重特異性抗体の結合活性を示す
本発明のヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｌ鎖可変領域断片又はヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｈ鎖可変領域断片（この両者をまとめて、「リジン置換可変領域断片」ともいう）は、夫々、配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列から成る抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）又はＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）において、全てのリジン残基、又は、任意に選択される特定の一つの部位のリジン残基以外の全てのリジン残基を他のアミノ酸が置換されて成ることを特徴とする。
５Ｌには、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、４４、５５、７９、１０８、及び１１２番目の５ヶ所所にリジン残基があり、その中の任意の特定の一つのリジン残基を残すことが出来る。例えば、実施例では５Ｌの１０８番目のリジン残基以外のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換されている。
一方、５Ｈには、配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１２、１３、１９、２３，６３及び６５番目の６ヶ所所にリジン残基があり、その中の任意の特定の一つの部位のリジン残基を残すことが出来る。例えば、実施例では５Ｈの１９番目のリジン残基以外のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換されている。
リジン残基と置換される他のアミノ酸残基の種類に特に制限はない。例えば、ヒト型化抗体５２８の結晶構造を参考にし、あるいは、当業者に公知の抗体の生殖配列データベース（非特許文献８）を利用して各々の位置での存在確率の高いアミノ酸を選択し、部位特異的変異導入法を用いてこれらのアミノ酸への置換を行って本願発明のＨ鎖可変領域断片及びＬ鎖可変領域断片を作製することができる、更に、それらから成る一本鎖抗体（scFv）を当業者に公知の方法を用いて調製し、その後、例えば、ヒト扁平上皮がん細胞株であるA431細胞（ATCC No.CRL-1555）のようなＥＧＦＲを発現している適当な細胞に対する結合活性（親和性）を測定することによって、リジン残基置換前の一本鎖抗体（h528scFv）の活性が実質的に保持されているものを容易に選択することが出来る。
　例えば、５Ｌにおける各リジン残基の置換の具体例として以下の置換例を挙げることが出来る：
４４番目のリジン残基がアルギニン残基、
５５番目のリジン残基がグルタミン残基、
７９番目のリジン残基がトレオニン残基、
１０８番目のリジン残基がグルタミン酸残基、又は、
１１２番目のリジン残基がグルタミン酸残基。
　　又は、５Ｈにおける各リジン残基の置換の具体例として以下の置換例を挙げることが出来る：
５Ｈにおける以下の置換：
１２番目のリジン残基がアラニン残基、
１３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、
１９番目のリジン残基がグルタミン残基、
２３番目のリジン残基がアラニン残基、
６３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、又は、
６５番のリジン残基がグルタミン残基。
本発明のリジン置換可変領域断片は上記の全てのリジン残基、又は、任意に選択される特定の一つの部位のリジン残基以外の全てのリジン残基が他のアミノ酸と置換されているので、適当な条件下で、係る特定の一つのリジン残基又はＮ末端アミノ基を部位特異的に修飾することができる。このような部位特異的修飾を利用して、例えば、抗体の体内半減期の低下及び親和性の低下等を防ぐ機能を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）又は適当な薬剤（抗癌剤、放射性同位体等）を本発明のリジン置換可変領域断片の特定の一つのリジン残基又はＮ末端アミノ基に結合させることが可能となる。
本発明のリジン置換可変領域断片を構成要素として、様々な型の抗体分子を作製することが出来る。この例として、例えば、通常のＩｇＧ型抗体分子、一本鎖抗体(scFv)、一本鎖抗体の二量体、二重特異性抗体、ダイアボディ型二重特異性抗体（特許文献１）、高機能性二重特異性抗体（特許文献２）又は多量体化低分子抗体（特許文献３）を挙げることが出来る。
本発明のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片及びリジン置換Ｈ鎖可変領域断片を含む一本鎖抗体は従来技術を用いて容易に作製することが出来る。以下の実施例で示されるように、従来技術からは予想外なことに、この一本鎖抗体（特定の一つの位置のみにリジン残基を含む）はリジン残基置換前の一本鎖抗体（h528scFv）の活性を実質的に保持していることが確認された。
このような一本鎖抗体に含まれる特定の一つの部位のリジン残基又はＮ末端アミノ基を介して互いに架橋することによって二量体等の多量体を調製することが出来る。例えば、二量体において特定の一つのリジン残基はＬ鎖又はＨ鎖のいずれに存在させることも出来る。二量体を構成する各一本鎖抗体に含まれる一つのリジン残基の部位がＨ鎖にある場合（ＨＫ）には「ＨＫ－ＨＫ」、共にＬ鎖にある場合（ＬＫ）には「ＬＫ－ＬＫ」という構造のホモ二量体となる。一方の一本鎖抗体に含まれる一つのリジン残基の部位がＬ鎖にあり、もう一方の一本鎖抗体に含まれる一つのリジン残基の部位がＨ鎖にある場合には、ＬＫとＨＫとから成る二量体となる。
　更に、本発明の一本鎖抗体を他の抗原特異性を有する一本鎖抗体と架橋させることによって、二重特異性抗体を容易に作製することも出来る。
架橋反応は、例えば、SANH(succinimidyl 4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone)及びSFB(succinimidyl 4-formylbenzoate) 等の当業者に公知の適当な架橋試薬を用いて行うことができる。架橋距離の異なる架橋試薬を用いて各一本鎖抗体の間の距離を自由に調整することが出来る。更に、分岐数の多い化学架橋剤を用いることで、高多価の分子を容易に作製することも出来る。
ヒト型化高機能性二重特異性抗体（BsAb）に含まれる様々な型の具体的な構造及びその製造方法は国際公開第WO2007/108152号パンフレット（特許文献２）に詳細に記載されている。本発明のBsAbに含まれる定常領域又はＦｃ領域はヒト抗体に由来するものである限り特に制限はない。例えば、ＣＬはκまたはλ鎖の何れに由来するものでも良い。又、Ｆｃ領域又はＨ鎖定常領域は、通常、ＩｇＧのγ鎖に由来するものが使用される。ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、並びにＣＬの一例として、夫々、特許文献２に開示された配列番号２９及び配列番号３０、配列番号３３に示したアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。
このBsAbを構成する一本鎖ポリペプチドに含まれる、PreSission配列、ヒンジ領域、ペプチドリンカー、シグナルペプチド等のアミノ酸配列の代表例として、特許文献２の図３－３及び図３－４に開示された配列を挙げることが出来る。尚、PreSission配列はプロテアーゼ切断部位を含む配列である。使用するプロテアーゼの種類に特に制限はなく、例えば、Thrombin及びFactor Xa等の当業者に公知の酵素を使用することが出来、それに応じて、プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列を適宜選択することが出来る。
又、ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体及び上記高機能性二重特異性抗体等を構成する各ポリペプチドにおいて、Ｌ鎖可変領域がＨ鎖可変領域のＮ末側にあること（ＬＨ型）を特徴とする各種の抗体（抗体分子）も本発明に含まれる。ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体においては、本発明の各リジン置換可変領域断片と同様に、生殖配列データベースを基に抗CD3抗体のＨ鎖及びＬ鎖可変領域断片の完全リジン置換体（含まれる全てのリジン残基を他のアミノ酸残基に置換したもの）を作製し、本発明の各リジン置換可変領域断片と組み合わせて各種の二重特異性抗体を構築することが出来る。
更に、上記の一本鎖抗体（scFv）から構成される多量体化低分子抗体は、特許文献３に詳細に記載されている。該多量体化低分子抗体は、例えば、２～４個の該一本鎖抗体が会合して成り、更に、各一本鎖抗体においてＮ末端側にあるリジン置換可変領域断片のＣ末端の１ないし数個のアミノ酸、又は、Ｃ末端側にあるリジン置換可変領域断片のＮ末端の１ないし数個のアミノ酸が除去されていても良い。従って、本発明のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片又はリジン置換Ｈ鎖可変領域断片を含む一本鎖抗体も特許文献３に記載の多量体化低分子抗体の構成要素として使用することが出来る。
　更に、ポリエチレングリコール等によって部位特異的に修飾されている本発明のリジン置換可変領域断片を構成要素として含む上記の各抗体分子は、本発明のリジン置換可変領域断片を構成要素として含む抗体分子を作製した後に、ＰＥＧ化等の当業者に公知の適当な化学的修飾方法で容易に調製することが出来る。
　抗EGFR抗体産生マウスB細胞ハイブリドーマ528は、東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターに寄託されている（ＩＤ：ＴＫＧ０５５５）。更に、５２８抗体を産生するハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）においてATCC No.HB-8509 として保管されており、かかる寄託機関からも容易に入手可能である。
一方、抗CD3抗体OKT3も東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターに寄託されている（ＩＤ：ＴＫＧ０２３５）。又、OKT3抗体を産生するハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）においてATCC No.CRL-8001 として保管されており、かかる寄託機関からも容易に入手可能である。
これらを用いて、当業者に公知の方法によってcDNAを調製することが出来る。例えば、ISOGEN(ニッポンジーン社)を用いmRNAを抽出、First-Strand cDNA Synthesis Kit(Amersham Biosciences社)によりcDNAを調製し、参考論文（Krebber, A. et al. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. J Immunol Methods 201, 35-55. (1997)）に基づき合成したクローニングプライマーを用いPCRを行いこれら各抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域の配列を決定することができる。
　本発明のリジン置換可変領域断片又は抗体分子を構成する一本鎖ポリペプチドに含まれる可変領域の「ヒト型化」とは、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）のヒト型化可変領域における相補性決定領域 (complementarity-determining region; CDR)の残基の少なくとも一部において、マウス、ラット、またはウサギといったような非ヒト動物（ドナー抗体）であり且つ所望の特異性、親和性、および能力を有するCDR に由来する残基によって置換されている抗体を意味する。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基によって置換される場合もある。さらに、ヒト型化抗体は、レシピエント抗体および導入されたCDR またはフレームワーク配列のいずれにおいても見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに優れたものあるいは最適なものとするために行われる。更に詳しくは、Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323-329 (1988);EP-B-239400; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992); およびEP-B-451216 を参照することができる。
  このような抗体のヒト型化可変領域のヒト型化は当業者に公知の方法に従って実施することが出来る。例えば、レシピエント抗体及びドナー抗体の３次元イムノグロブリンモデルを使用し、種々の概念的ヒト型化生成物を分析する工程により、ヒト型化抗体が調製される。３次元イムノグロブリンモデルは、当業者にはよく知られている。更に詳細については、WO92/22653等を参照することができる。
　従って、ヒト型化されたヒト型化可変領域の例として、ヒト型化可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス抗体由来であり、その他の部分がヒト抗体由来である抗体を挙げることができる。
　本発明では更に、ヒト型化によって抗体自身の機能低下等が生起する場合があるので、一本鎖ポリペプチド中の適当な部位、例えば、ＣＤＲ構造に影響を与える可能性があるフレームワーク（ＦＲ）中の部位、例えば、canonical 配列又はvernier 配列において部位特異的変異を起こさせることによってヒト型化抗体の機能の改善をすることが出来る。
　具体的には、528ヒト型化可変領域のヒト型化はCDR grafting法により行った。まずVH、VLそれぞれ相同性検索を行い、各CDR(complementarity determining region)の長さ等を考慮した上でもっとも相同性の高いFR(frame work)をもつヒト抗体配列を選択する。選択したヒト抗体のCDRを528のCDRと入れ換えたアミノ酸配列を設計し、対応するコドンについては先と同様に大腸菌至適コドンを用いることが好ましく、オーバーラップPCR法により遺伝子の全合成を行うことが出来る。
　又、ヒト型化OKT3ヒト型化可変領域はすでに報告されており、マウスOKT3に比べて十分に活性を保持していることも確かめられている(Adair, J. R. et al. Humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3. Hum Antibodies Hybridomas 5, 41-7. (1994))。この文献に記載されているヒト型化OKT3ヒト型化可変領域のアミノ酸配列を基に、オーバーラップPCR法により遺伝子の全合成を行った。この際にコドンは大腸菌における至適コドンを用いることが好ましく、至適コドンに置換した全合成遺伝子を用いることでの大腸菌における発現量の増加はすでに報告されている。
　本発明の各種抗体分子の書く構成要素の基となる、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）、及び、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列の一例を、夫々、配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、並びに、配列番号７及び８で示す。
各一本鎖ポリペプチドにおけるリジン置換Ｌ鎖可変領域断片及びリジン置換Ｈ鎖可変領域断片は適当なペプチドリンカーで連結されていることが好ましい。該ペプチドリンカーは、一本鎖抗体の分子内での相互作用を困難にし、複数の一本鎖抗体による多量体の形成を可能ならしめ、その結果、互いに別の一本鎖抗体に由来するＶＨとＶＬが適切に会合することによって、オリジナルのタンパク質（当該ポリペプチドは該オリジナルのタンパク質に由来するものあるいは該オリジナルのタンパク質から誘導されたものである）の機能、例えば生物活性などの一部あるいはその全てを模擬又は促進する構造をとることができるようなものであれば特に限定されず、例えば当該分野で広く知られたものあるいは該公知のリンカーを改変したものの中から選択して使用することが可能である。例えば、ペプチドリンカーは１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは２～１０個のアミノ酸の長さであることが好ましい。
更に、各一本鎖ポリペプチドは上記のペプチドリンカーを含まずに、二つのリジン置換可変領域断片が直接結合していても良い。このような場合には、各一本鎖抗体の三次元的自由度を高めて多量体化を促進させるために、各一本鎖ポリペプチドにおいてＮ末端側にあるリジン置換可変領域断片のC末端の１ないし数個のアミノ酸、又は、C末端側にあるリジン置換可変領域断片のN末端の１ないし数個のアミノ酸が除去されていることが好ましい。
更に、上記の各配列番号で示される各アミノ酸配列において、一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列（但し、配列番号４において本発明のリジン置換可変領域断片が有するアミノ酸変異は保持される）であって、元のアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能・活性、例えば、リジン置換可変領域断片の抗原特異性と実質的に保持しているアミノ酸配列も本発明の抗体分子を構成する一本鎖抗体のポリペプチドとして使用することが出来る。欠失、置換、挿入若しくは付加されるアミノ酸は、好ましくは、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士が置換されるか、又は、アミノ酸の欠失若しくは付加によって、蛋白質の三次元構造及び／又は局所的電荷状態に大きな変化が生じない、又は、実質的にそれらが影響を受けないようなものが好ましい。このような欠失、置換又は付加されるアミノ酸を有するポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法（点突然変異導入及びカセット式変異導入等）、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作製することが可能である。尚、これらの一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列は、元のアミノ酸配列全長に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の配列相同性（同一性）を示すものということもできる。　
本発明のリジン置換可変領域断片及び各抗体分子に含まれる一本鎖ポリペプチドに含まれる各領域又は配列をコードする核酸分子（オリゴヌクレオチド）の代表例は、上記の各配列番号に示された塩基配列を有するものである。その他に、各配列番号に記載の塩基配列の全長と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の配列相同性を示すような塩基配列から成る核酸分子（但し、配列番号４における本発明のリジン置換可変領域断片が有するアミノ酸変異は保持される）は、上記の各領域又は配列と実質的に同等の活性又は機能を有するポリペプチドをコードしていると考えられるので、これらの核酸分子も上記の本発明の核酸に含まれる。このような核酸分子には本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドの少なくともいずれか一つのポリペプチドをコードする塩基配列が含まれているが、２種類の一本鎖ポリペプチドを夫々コードする２種類に塩基配列が共に含まれていることが好ましい。
　２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行なう。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
ここで、「相同性（同一性）」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同士の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」なる用語は、当業者には周知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994); Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、GCG プログラムパッケージ (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)) 、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990)) 等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができる。
　更に、上記の各核酸分子は、各配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記配列番号で示された各ポリペプチドの機能・活性と実質的に同じものを有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むものである。
　ここで、ハイブリダイゼーションは、Molecular cloning third.ed.（Cold Spring Harbor Lab.Press，2001）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
　ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
本明細書において、ＤＮＡのハイブリダイズにおける「ストリンジェント（stringent）な条件」は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。
従って、「ストリンジェントな条件」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃～６８℃において、ナトリウム濃度150～900mM、好ましくは600～900mM、pH 6～8であるような条件を挙げることが出来る。ストリンジェントな条件の一具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものである。
　更に、各一本鎖ポリペプチドにおけるリジン置換可変領域断片をコードする核酸を作製する場合には、予め設計されたアミノ酸配列に基づきオーバーラップPCR法により全合成することができる。尚、「核酸」とは、一本鎖ポリペプチドをコードする分子であれば、その化学構造及び取得経路に特に制限はなく、例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡ等を含むものものである。
　具体的には、cDNAライブラリーから、文献記載の配列に基づいてハイブリダイゼーションにより、あるいはポリメラーゼチェインリアクション(PCR) 技術により単離されうる。一旦単離されれば、DNA は発現ベクター中に配置され、次いでこれを、大腸菌（E. coli ）細胞、COS 細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞) 、またはイムノグロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞にトランスフェクションさせ、該組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させることができる。PCR 反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えば R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al., Science, 239: 487, 1988 ; H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed., “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; M. A. Innis et al. ed., “PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、PCR 法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
DNA など核酸の配列決定は、例えばSanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)などを参考にすることができる。また一般的な組換えDNA 技術は、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (ed.), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)及び D. M. Glover et al. (ed.), “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) などを参考にできる。
　こうして取得された本発明の抗体分子を構成する一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードする核酸は、目的に応じて、当業者に公知の手段により適宜所望のペプチド又はアミノ酸をコードするように改変することができる。この様にDNA を遺伝子的に改変又は修飾する技術は、Mutagenesis: a Practical Approach, M.J．Mcpherson (Ed.), (IRL Press, Oxford, UK(1991) における総説において示されており、例えば、位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、カセット変異誘発法及びポリメラーゼチェインリアクション(PCR) 変異生成法を挙げることができる。
　ここで、核酸の「改変」とは、得られたオリジナルの核酸において、アミノ酸残基をコードする少なくとも一つのコドンにおける、塩基の挿入、欠失または置換を意味する。例えば、オリジナルのアミノ酸残基をコードするコドンを、別のアミノ酸残基をコードするコドンにより置換することにより一本鎖ポリペプチドを構成するアミノ酸配列自体を改変する方法がある。
　又は、本明細書の実施例に記載されているように、アミノ酸自体は変更せずに、大腸菌等の宿主細胞にあったコドン（至適コドン）を使用するように、一本鎖ポリペプチドをコードする核酸を改変することも出来る。このように至適コドンに改変することによって、宿主細胞内における一本鎖ポリペプチドの発現効率等の向上を図ることが出来る。
　本発明の抗体分子は、当業者に公知の方法、例えば、遺伝子工学的手法又は化学合成等の各種手段を用いて製造することが出来る。遺伝子工学的手法としては、例えば、該二重特異性抗体を構成する夫々の一本鎖抗体のポリペプチドをコードする核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクターを作製し、このベクターで宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換された宿主細胞を培養して宿主細胞中で一本鎖ポリペプチドを発現させ、該ポリペプチドを回収・精製し、それらの一本鎖ポリペプチドを会合させ、形成された抗体分子を分離・回収することによって製造することが出来る。
　ここで、「複製可能な発現ベクター(replicable expression vector)」および「発現ベクター(expression vector) 」は、DNA（通常は二本鎖である）の断片(piece) をいい、該DNAは、その中に外来のDNAの断片を挿入せしめることができる。外来のDNAは、異種DNA (heterologous DNA)として定義され、このものは、対象宿主細胞においては天然では見出されないDNA である。ベクターは、外来DNAまたは異種DNA を適切な宿主細胞に運ぶために使用される。一旦、宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体DNA とは独立に複製することが可能であり、そしてベクターおよびその挿入された（外来）DNA のいくつかのコピーが生成され得る。さらに、ベクターは外来DNAのポリペプチドへの翻訳を可能にするのに不可欠なエレメントを含む。従って、外来DNAによってコードされるポリペプチドの多くの分子が迅速に合成されることができる。
  このようなベクターは、適切な宿主中で DNA配列を発現するように、適切な制御配列(control sequence)とそれが機能するように(operably)（即ち、外来DNAが発現できるように）連結せしめられたDNA配列を含有する DNA構築物(DNA construct) を意味している。そうした制御配列としては、転写(transcription) させるためのプロモーター、そうした転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、リアデニル化配列、及び転写や翻訳(translation) の終了を制御する配列等が挙げられる。更にベクターは、、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて適宜含むことが出来る。これらの各種配列又は要素は、外来DNAの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することが出来る。更に、製造した一本鎖ポリペプチドの検出及び精製等を容易にする目的のために、当業者に公知の各種のペプチドタグ（例えば、ｃ－ｍｙｃタグ及びＨｉｓ－ｔａｇ）をコードする配列を一本鎖ポリペプチドに対応する配列の末端等に含ませることが出来る。
　該ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単純にゲノムの挿入体(genomic insert)等の任意の形態が可能である。一旦、適切な宿主の中に形質転換で導入せしめられると、該ベクターは宿住のゲノムとは独立して複製したり機能するものであり得る。又は、該ベクターはゲノムの中に組み込まれるものであってもよい。
　宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができるが、例えば、代表的な宿主細胞としては、大腸菌(E. coli) 等の原核細胞、及び、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞) 、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞が挙げることができる。形質転換菌は当業者に公知の任意の抵当な条件・方法で培養することができる。宿主として、例えば、BL21 star(DE3)株、培地として2xYT培地、培養温度28℃前後、0.5 mM 程度のIPTGで発現を誘導することによって、培養上清又は可溶性画分における本発明の抗体分子の収量を大幅に向上させることができ、製造効率を高めることが可能となる。
  このような宿主細胞における発現等により得られた一本鎖ポリペプチドは一般に分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それが分泌シグナルを持たずに直接に産生された場合には宿主細胞溶解物から回収することが出来る。一本鎖ポリペプチドが膜結合性である場合には、適当な洗浄剤（例えば、トライトン-X100) を使用して膜から遊離せしめることができる。
　精製操作は当業者に公知の任の方法を適宜組み合わせて行うことが出来る。例えば、必用に応じてＰＥＧ化等の化学修飾を行った後、遠心分離、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、及びアフィニティクロマトグラフィーによって好適に精製される。アフィニティクロマトグラフィーは、一本鎖ポリペプチドが有するぺプチドタグとの親和力を利用した効率が高い好ましい精製技術の一つである。
　尚、回収された一本鎖ポリペプチドは不溶性画分に含まれていることも多いために、精製操作は、一本鎖ポリペプチドを可溶化し変性状態にした上で行うことが好ましい。この可溶化処理は、エタノールなどのアルコール類、グアニジン塩酸塩、尿素などの解離剤として当業者に公知の任意の薬剤を使用して行うことが出来る。更に、こうして精製された２種類の一本鎖ポリペプチドを会合（巻き戻し）せしめ、形成された抗体分子を分離して回収することによって、本発明の抗体分子を製造することが出来る。
　会合処理は、単独の一本鎖ポリペプチドを適切な空間的配置に戻すことによって、所望の生物活性を有する状態に戻すことを意味する。従って、会合処理は、ポリペプチド同志あるいはドメイン同志を会合した状態に戻すという意味も有しているので「再会合」ともいうことができるし、所望の生物活性を有するものにするという意味で、再構成ということもでき、或いは、リフォールディング (refolding)とも呼ぶことが出来る。会合処理は当業者に公知の任意の方法で行うことが出来るが、例えば、透析操作により、一本鎖ポリペプチドを含むバッファ溶液中の変性剤（例えば、塩酸グアニジン）の濃度を段階的に下げる方法が好ましい。この過程で、凝集抑制剤、及び酸化剤を反応系に適宜添加することによって、酸化反応の促進を図ることも可能である。形成された多量体化低分子抗体の分離及び回収も当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。
　以上に示したように、本発明の抗体分子は、例えば、大腸菌など培養宿主細胞の培養培地上清、ペリズマ画分、菌体内可溶性画分、又は、菌体内不溶性画分から調製することが可能である。
　本発明のベクターとして、本発明の抗体分子を構成する一本鎖ポリペプチドに対応する核酸分子を共に含む共発現ベクターを用いることによって、又は、一本鎖ポリペプチドの夫々をコードする核酸分子を含む発現ベクターを同一の宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換菌内で夫々の一本鎖ポリペプチドが発現した後に抗体分子が形成され、それを大腸菌など培養宿主細胞の培養培地上清又は可溶性画分から調製することが可能である。従って、このような場合には、上記の会合（巻き戻し）処理は不要となり、低コストで高生産性が得られる。
更に、該形質転換菌の菌体内可溶性画分からの調製量を向上させるためには、以下のような条件とすることが好ましい。宿主としてBL21 star(DE3)株(Invitrogen)を用い、培養は2xYT培地を用い28℃で行う。一晩振盪培養後(600 nmのO.D.が 約5)となったところで、終濃度0.5 mM のIPTGにより発現を誘導し、さらに16時間培養後に、培地上清画分と菌体を浸透圧処理後の画分(ペリプラズム画分)から目的タンパク質を回収する。
　本発明の医薬組成物は、本発明の抗体分子、一本鎖ポリペプチド、核酸、ベクター、及び形質転換された宿主細胞から成る群から選ばれたものを有効成分として含有することを特徴とする。かかる有効成分は、以下の実施例に示されているように、インビトロ及びインビボで上皮細胞成長因子受容体を発現する（陽性）腫瘍細胞を有意に排除・殺傷・傷害する作用を有しているので、本発明の医薬組成物はこのような腫瘍細胞に対する抗腫瘍剤として使用することが出来る。
　本発明の有効成分の有効量は、例えば治療目的、腫瘍の種類、部位及び大きさ等の投与対象における病状、患者の諸条件、及び投与経路等によって当業者が適宜決めることが出来る。典型的な１回の投与量又は日用量は、上記の条件に応じ、可能ならば、例えば当分野で既知の腫瘍細胞の生存又は生長についての検定法を使用して、まずインビトロで、そして次に、人間の患者のための用量範囲を外挿し得る適切な動物モデルで、適当な用量範囲を決定することもできる。
　本発明の医薬組成物には、有効成分の種類、薬剤形態、投与方法・目的、投与対象の病態等の各種条件に応じて、有効成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し得る各種成分（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等）を適宜添加することが出来る。
　本発明の医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、及び、噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リポソーム、マイクロエマルジョン等）、及びマクロエマルジョン等の種々薬剤形態をとり得る。
　投与方法としては、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、特には胆管内、又は病変内経路による注入又は注射、及び持続放出型システム製剤による方法が挙げられる。本発明の活性物質は、輸液により連続的に、または大量注射により投与されることができる。尚、本発明の医薬組成物を投与する場合には、食作用又は細胞傷害活性を有する細胞と共に投与することが好ましい。或いは、投与前に本発明のＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体のような有効成分と上記細胞とを混合することによって、投与前に該抗体を予め該細胞に結合させておくことが好ましい。
  持続放出製剤は、一般的には、そこから本発明の活性物質をある程度の時間放出することのできる形態のものであり、持続放出調製物の好適な例は、蛋白質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性担体を含み、該担体は、例えばフィルムまたはマイクロカプセル等の成型物の形態のものである。
　本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、第十三改正　日本薬局方解説書、平成８年７月10日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して製造することができる。
　尚、本明細書及び図面において、用語はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
　以下に参考例及び実施例を参照して本発明を具体的に説明するが、これらは単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
  全ての参考例及び実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。尚、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、DNA クローニングでは J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, “Molecular Cloning", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) 及び D. M. Glover et al. ed., “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; 特にPCR 法では、H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed.,“DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995)   及び M. A. Innis et al. ed.,“PCR Protocols", Academic Press, New York (1990)に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書(protocols) や添付の薬品等を使用している。
ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８のヒト型化可変領域（５Ｈ又は５Ｌ）のリジン置換可変領域断片の作製
　まず、ヒト化型５２８抗体の結晶構造を分子置換法により決定した。その結果を表１に示す。こうして得られた構造を参照し、且つ、生殖配列データベース（非特許文献８）を利用することで、公知の位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）を用いて、配列番号２で示される抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）、及び、配列番号４で示される抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）において、各領域内のＣＤＲ中のリジン残基も含めて全てのリジン残基を他の適当なアミノ酸で置換させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　その結果、リジン置換可変領域断片の例として、全てのリジン残基が以下のような他のアミノ酸に置換された可変領域断片５Ｈ（ＶＨ０Ｋ）及び５Ｌ（ＶＬ０Ｋ）が得られた。
　５Ｌにおけるリジン残基の置換：
４４番目のリジン残基がアルギニン残基、
５５番目のリジン残基がグルタミン残基、
７９番目のリジン残基がトレオニン残基、
１０８番目のリジン残基がグルタミン酸残基、及び
１１２番目のリジン残基がグルタミン酸残基。
５Ｈにおけるリジン残基の置換：
１２番目のリジン残基がアラニン残基、
１３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、
１９番目のリジン残基がグルタミン残基、
２３番目のリジン残基がアラニン残基、
６３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、及び、
６５番のリジン残基がグルタミン残基。
　　更に、５Ｌ又は５Ｈにおける上記の任意の部位で元のリジン残基に再置換し、５Ｈの１９番目のグルタミン残基がリジン残基に再置換されたヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｈ鎖可変領域断片「ＶＨ１Ｋ」、及び、５Ｌの１０８番目のグルタミン酸残基がリジン残基に再置換されたヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｌ鎖可変領域断片「ＶＬ１Ｋ」を作製した。
リジン置換可変領域断片を含む一本鎖抗体（scFv）の作製
次に、こうして選択された各リジン置換可変領域断片を含む一本鎖抗体（リジン置換scFv ）として、ＶＨ０Ｋ及びＶＬ０Ｋを含む「０Ｋ」、ＶＨ１Ｋ及びＶＬ０Ｋを含む「ＨＫ」、及びＶＨ０Ｋ及びＶＬ１Ｋを含む「ＬＫ」の３種類を以下の概要で調製した。
発現ベクターはすでに本発明者等によって構築されているヒト型化528scFv発現ベクター(pRA-h5Hh5L(G1):特許文献３)を基に作製した。即ち、それぞれのベクターを制限酵素NcoIとEagIで消化後、リンカー配列を含めてh5H部位あるいはh5L部位を入れ換えることで、15アミノ酸リンカー(GGGGS)3を有する各ヒト型化scFv発現ベクターを作製した。C末端側には精製のためのHis-tag (Hisx6:ヒスチジン6量体tag)が並列に導入されている。これを大腸菌を宿主として用いて発現させ、本発明の一本鎖抗体を得た。
　フローサイトメトリー（Flow cytometry）により一本鎖抗体のヒト扁平上皮がん細胞株であるA431細胞（ATCC No.CRL-1555）に対する結合活性を調べた。標的細胞に対し一次抗体として各scFvを100pmol加え30分、4℃で静置後、0.1%NaN3/PBSで2回洗浄し、続いて二次抗体としてEx3ダイアボディで免疫したウサギの抗血清を加え同様の操作を行った。最後に三次抗体としてFITC-conjugate anti-rabbit
抗体を加え同様の操作を行った後、蛍光を測定した。ネガティブコントロール(以下、「NC」)は一次抗体の代わりにPBS/0.1%/NaN3を加え、ポジティブコントロール(以下、「PC」)には一次抗体としてh528scFv（配列番号９、１０）を用いた。図１に示す結果が得られた。
更に、これらの一本鎖抗体をＳＰＲ法（J Biol Chem. 2010 Jul 2;285(27):20844-9.）による速度解析したところ、以下の表２に示すような結果が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
以上のことから、本発明の３種類の一本鎖抗体のA431細胞に対する結合活性（親和性）は、リジン残基置換前の一本鎖抗体（h528scFv）の活性と比べて実質的に変わらない（保持されている）ことが確認された。
　リジン置換可変領域断片を含む一本鎖抗体（scFv）のＰＥＧ化
次に、実施例２で作製したＨＫ又はＬＫ（２０μM）を含む６Ｍ　Gdn-HCl/PBS溶液に一端にＮＨＳエステルを有する５ｋＤａのＰＥＧ（2mM）を加え、２５℃で２時間（ｐＨ７～１０）静置してＨＫ及びＬＫに含まれる特定の一つのリジン残基を部位特異的にＰＥＧ化し、その反応液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。得られた結果を図２に示す。これによれば、ｐＨ８．５において部位特異的ＰＥＧ化が高い効率（６４～７３％程度）で達成することが出来た。
　リジン置換可変領域断片を含む一本鎖抗体の二量体の作製及び細胞傷害活性
更に、架橋試薬として、SANH(succinimidyl 4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone)とSFB(succinimidyl 4-formylbenzoate)を用いてscFvであるＨＫ及びＬＫの二量体化を行った。SANHは、一端にNHSエステル、逆端にヒドラジン基を持ち、SFBは一端にNHSエステル、逆端にアルデヒド基を持つ分子である。これらとＨＫ又はＬＫをそれぞれ結合させた後、SANHと結合したＨＫ又はＬＫと、SFBと結合したＨＫ又はＬＫを混合することで、ヒドラゾン結合を形成させ、二量体化抗体を作製することができる。まず、NHSエステルとアミノ基の結合反応は、ホウ酸バッファ(pH 8.5、25℃)に透析後、ジメチルスルホキシド(DMSO)で20 mMに調製したSANH、またはSFBを終濃度2 mMとなるように加え(10% DMSO)、25℃で2時間静置し行った。ヒドラゾン結合は、pH 7.0以下のバッファに2時間透析することにより、過剰なSANH、SFBの除去と同時に、pHの変更を行い、透析完了後のSANH、SFBが結合したサンプルを混合し(pH 6.0(PBS))、25℃で2時間静置することで、二量体の形成を行った（図３）。ここで、架橋距離の異なる二種類の架橋試薬を用いることで各scFv間の距離が異なる二量体を作製することが出来た。
A431細胞の増殖がこうして得られた本発明の二量体によりどれほど阻害されるかをMTS assayにより検討した。セルカウントを行い、RPMI（10 % FBS）100μLあたり細胞2×103個になるよう調整し、96穴プレートに100μLずつ分注、37℃で一晩静置した。目的蛋白質を目的濃度になるようにRPMIで希釈、前日準備したプレートに抗体蛋白質を200μLずつ分注し、37℃で96時間培養した。プレートの培養液を取り除き、PBS により洗浄、MTS、PMS、RPMIを加え、37℃で30～60分インキュベートした後、プレートリーダーで490nm の吸光度を測定した。その結果、図４に表されるように、本発明の二量体は単量体（ＨＫ又はＬＫ）では見られない細胞増殖阻害活性を誘導することがわかった。
　(注) MTS 試薬 (CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega社製) 、PMS(CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay,Promega 社製)
 
ＰＥＧ化ダイアボディ型二重特異性抗体の調製
更に、特許文献１に記載された方法に準じて本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を作製した。まず、本発明のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片（ＶＬ１Ｋ）、及び、配列番号８で示されるアミノ酸配列から成る抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）の完全リジン置換体（含まれる全てのリジン残基を他のアミノ酸残基に置換したもの）から成る一本鎖ポリペプチド（528VL 1K (Lys108)-OKT3 VH Lys(-)））を作製し、これを実施例３に記載の条件（ｐＨ８．５）でＰＥＧ化し、５２８抗体のＬ鎖可変領域断片の１０８番目のリジンのみ部位特異的にＰＥＧ化されたリジン置換Ｌ鎖可変領域断片を含むＰＥＧ化一本鎖ポリペプチドを得た。
同様に、配列番号４で示される抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）及び配列番号６で示される抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）から成る一本鎖ポリペプチド（528VH -OKT3 VL）を作製した。
こうして作製した未精製のＰＥＧ化一本鎖ポリペプチドともう一方の一本鎖ポリペプチドを等モル混合し、透析法による巻き戻し後、ゲルろ過クロマトグラフィ（Hiload superdex（商標）200 26/60 PG、流速2 mL/min、溶出液PBS）により精製し、保持体積120-200 mL各画分をSDS-PAGEにかけた。その結果、ピーク２に、５２８抗体のＬ鎖可変領域断片の１０８番目のリジンのみ部位特異的にＰＥＧ化されたリジン置換Ｌ鎖可変領域断片を構成要素として含む本発明のダイアボディ型二重特異性抗体（ＰＥＧ　Ｅｘ３）を均一に含む（1 μM/mL）画分が得られた。以上の結果を図５に示す。
ＰＥＧ化ダイアボディ型二重特異性抗体の結合活性
実施例５で作製したダイアボディ型二重特異性抗体について、実施例２に記載のフローサイトメトリー（Flow cytometry）を実施した。一次抗体試料としてゲルろ過クロマトグラフィににおけるピーク１及びピーク２から取得したＰＥＧ化ダイアボディ型二重特異性抗体（100 pmol）を使用した。但し、ゲルろ過クロマトグラフィにおけるピーク２に含まれるダイアボディ型二重特異性抗体とT-LAKとの反応については265 pmolの抗体試料を用いた。ポジティブコントロール(以下、「PC」)には一次抗体としてリジン残基が未置換であるＥｘを用いた。続いて検出抗体としてFITC-conjugate anti-HA
抗体を加え蛍光を測定した。
その結果、図６に表されるように、ゲルろ過クロマトグラフィにおけるピーク２に含まれるダイアボディ型二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＣＤ３に対して結合活性を有することが示された。
一本鎖抗体（h528scFv）は多量体化させることで多価性の結合を獲得し、結果増殖抑制効果を示すが(特許文献３)、可変領域間の距離を自由に変化させることはできない。これに対して、反応基として特定の一箇所のみリジン残基を有する本発明に係る一本鎖抗体は、均一な化学修飾が可能、且つ、化学架橋剤に応じた様々な高機能性設計も可能な点で技術的優位性が高い。例えば、分岐数の多い化学架橋剤を用いることで、高多価の分子を創出したり、抗がん剤他、放射性同位体による修飾など、がん関連抗原を標的とした抗体断片のリジン置換体は利用価値が極めて高いといえる。
更に、本発明のヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｌ鎖又は同Ｈ鎖可変領域断片、又はそれらから構成される一本鎖抗体は様々な抗体分子の構成要素として利用し、更なる高機能化を図ることが出来る。

Claims (26)

  1. 配列番号２で示されるアミノ酸配列から成る抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）において、全てのリジン残基又は特定の一つの部位のリジン残基以外の全てのリジン残基が他のアミノ酸に置換されて成る、ヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｌ鎖可変領域断片。
  2. ５Ｌにおける１０８番目のリジン残基以外の全てのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、請求項１記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片。
  3. ５Ｌにおける以下の置換の少なくとも一つを含む、請求項１または２記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片：
    ４４番目のリジン残基がアルギニン残基、
    ５５番目のリジン残基がグルタミン残基、
    ７９番目のリジン残基がトレオニン残基、
    １０８番目のリジン残基がグルタミン酸残基、又は、
    １１２番目のリジン残基がグルタミン酸残基。
  4. ５Ｌにおける以下の置換を含む、請求項１記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片：
    ４４番目のリジン残基がアルギニン残基、
    ５５番目のリジン残基がグルタミン残基、
    ７９番目のリジン残基がトレオニン残基、
    １０８番目のリジン残基がグルタミン酸残基、及び
    １１２番目のリジン残基がグルタミン酸残基。
  5. 配列番号４で示されるアミノ酸配列から成る抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）において、全てのリジン残基又は特定の一つのリジン残基以外の全てのリジン残基が他のアミノ酸に置換されて成る、ヒト型化抗ＥＧＦＲ抗体リジン置換Ｈ鎖可変領域断片。
  6. ５Ｈにおける１９番目のリジン残基以外のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、請求項５記載のリジン置換Ｈ鎖可変領域断片。
  7. ５Ｈにおける以下の置換の少なくとも一つを含む、請求項５または６記載のリジン置換Ｈ鎖可変領域断片：
    １２番目のリジン残基がアラニン残基、
    １３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、
    １９番目のリジン残基がグルタミン残基、
    ２３番目のリジン残基がアラニン残基、
    ６３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、又は、
    ６５番のリジン残基がグルタミン残基。
  8. ５Ｈにおける以下の置換を含む、請求項５記載のリジン置換Ｈ鎖可変領域断片：
    １２番目のリジン残基がアラニン残基、
    １３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、
    １９番目のリジン残基がグルタミン残基、
    ２３番目のリジン残基がアラニン残基、
    ６３番目のリジン残基がグルタミン酸残基、及び、
    ６５番のリジン残基がグルタミン残基。
  9. 一つのリジン残基又はＮ末端アミノ基が部位特異的に修飾されている、請求項１～８のいずれか一項に記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片又はリジン置換Ｈ鎖可変領域断片。
  10. ポリエチレングリコールによって部位特異的に修飾されている請求項９記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片又はリジン置換Ｈ鎖可変領域断片。
  11. 請求項１～４、９又は１０記載のリジン置換Ｌ鎖可変領域断片及び請求項５～８、９又は１０記載のリジン置換Ｈ鎖可変領域断片を構成要素として含む抗体分子。
  12. ＩｇＧ型抗体分子、一本鎖抗体(scFv)、一本鎖抗体の二量体、二重特異性抗体、ダイアボディ型二重特異性抗体、高機能性二重特異性抗体又は多量体化低分子抗体から成る群から選択される、請求項１１記載の抗体分子。
  13. リジン置換Ｌ鎖可変領域断片又はリジン置換Ｈ鎖可変領域断片に含まれる一つのリジン残基が架橋されてなる、請求項１２記載の二量体。
  14. 抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）、及び、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）が、夫々、配列番号６及び配列番号８で示されるアミノ酸配列から成る、請求項１１記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
  15. 請求項１１～１４のいずれか一項に記載の抗体分子を構成する一本鎖ポリペプチド。
  16. 請求項１～８のいずれか一項に記載のリジン置換可変領域断片、又は、請求項１５に記載の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸分子。
  17. 請求項１１～１４のいずれか一項に記載の抗体分子を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを共にコードする核酸分子。
  18. 請求項１６又は１７記載の核酸分子を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
  19. 共発現ベクターである、請求項１８記載のベクター。
  20. プラスミドベクターである、請求項１８又は１９記載のベクター。
  21. 請求項１９ないし２０のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  22. 請求項１１又は１２記載の抗体分子の製造方法であって、請求項２１に記載の宿主細胞を培養し、該抗体分子を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該ポリペプチドを回収・精製し、該２種類の一本鎖ポリペプチドを会合させ、形成された抗体分子を分離・回収することから成る、前記方法。
  23. 原核細胞が大腸菌であり、２種類の一本鎖ポリペプチドを大腸菌の培養培地上清、ペリズマ画分、菌体内可溶性画分、又は、菌体内不溶性画分から回収する、請求項２２記載の製造方法。
  24. 請求項１４記載の抗体分子の製造方法であって、請求項１９記載の共発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し該抗体分子を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該形質転換菌内でダイアボディ型二重特異性抗体を形成せしめ、形成された二重特異性抗体を分離・回収することから成る、前記方法。
  25. 請求項１１～１４のいずれか一項に記載の抗体分子を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
  26. 腫瘍細胞を排除する、殺傷する、傷害する及び／又は減少せしめるためのものであることを特徴とする請求項２５記載の医薬組成物。
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