JP5335422B2 - 少なくとも1つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化 - Google Patents
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Description
本発明は、少なくとも1つの非天然システイン(non-native cysteine)を含んでいる組換え技術で調製され操作されたタンパク質(例えば、凝固因子またはトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼのタンパク質)を選択的に還元および誘導体化するための方法であって、還元反応が酸化還元緩衝液の存在下で又はトリアリールホスフィン還元剤の存在下で実施される方法に関する。
凝固因子VIIaは、止血の鍵となるイニシエーターである。これは、1〜3時間周辺に機能的な循環半減期を有する50-kDaの血漿タンパク質である。成熟タンパク質は、全体で12のジスルフィド結合対を形成する24のシステイン残基を含有する。これらのうち、前記プロテアーゼドメインにおけるCys340およびCys368を架橋しているジスルフィド結合は、高度に不安定であり、β-メルカプトエタノールなどの通常に使用される還元剤を低濃度で処理することでさえも容易に還元される〔Higashi(1997)を参照されたい〕。Cys340-Cys368(またはキモトリプシンナンバリングによるCys191-Cys220)は、凝固因子II, IX, X, XI およびプロテインCを含んでいるトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼ中で高度に保存されている〔Wang(1997)を参照されたい〕。これはS1結合ポケットの壁の一部を形成し、FVIIaのジスルフィド結合の還元において、アミド溶解活性(amidolytic activity)の損失(loss)を生じる〔Higashi(1997)を参照されたい〕。
組換え技術で調製されたタンパク質の分子内ジスルフィド結合に関与しないシステインのチオール基を介した化学的な結合に関する上記の障害に関して、本発明は規定の酸化還元緩衝液(例えば、チオール-ジスルフィド酸化還元触媒との組み合わせ)またはトリアリールホスフィンを、低分子量チオールおよび少なくとも1つの非天然システイン(例えば、凝固因子またはトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼのタンパク質)を含んでいる操作されたタンパク質の間の混合ジスルフィド結合を係る操作された又は天然のシステインで選択的に還元するために使用することをはじめて提供する。混合ジスルフィドの選択的な還元に続いて、自由システインを次に前記タンパク質において当業者に既知のチオール共役化学を用いる結合で修飾することができる。
(A)酸化還元緩衝剤
上記のとおり、本発明は、少なくとも1つの非天然システインを活性コンホメーションにおいて含んでいる操作したタンパク質(例えば、凝固因子またはトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼのタンパク質)を選択的に還元するための方法を提供する。問題のタンパク質には、ジスルフィド架橋で低分子量チオール(RS-Cys)に結合された1以上のシステイン部分が含まれ;この部分は、前記タンパク質が活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与しなく;前記方法には、低分子量チオール結合タンパク質を還元して非変性条件下で酸化還元緩衝剤を含んでいる混合物と反応させることを備える。
グルタチオンおよび他の低分子量チオールは一般に反応速度論的に貧弱(poor)な還元剤(reductants)/酸化剤(oxidants)であるので、最も好ましくはチオール/ジスルフィド酸化還元触媒を反応の速度を増強するための酸化還元緩衝剤の混合物に含ませる。
上記のとおり、本発明は、少なくとも1つの非天然システインを活性コンホメーションにおいて含んでいる操作したタンパク質(例えば、凝固因子またはトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼのタンパク質)を選択的に還元するための方法も提供する。問題のタンパク質には、ジスルフィド架橋で低分子量チオール(RS-Cys)に結合された1以上のシステイン部分が含まれ;この部分は、前記タンパク質が活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与しなく;前記方法は、低分子量チオール結合タンパク質を還元して非変性条件下でトリアリールホスフィン還元剤と反応させることを備える。
一般に、上記の酸化還元緩衝剤を用いる選択的な還元の戦略は、タンパク質が活性形態である場合に、少なくとも1つの非天然システインを含んでいる操作されたタンパク質〔特に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与していない操作されたシステインを有しているタンパク質〕に適用可能であると信じられており、それゆえ潜在的に低分子量チオール結合型(RS-Cys)の形態である。
1つの重要な態様において、混合物は、さらにタンパク質のインヒビターを含む。混合物中にインヒビターを含めることによって、タンパク質のコンホメーションが幾分か安定化され、それによって分子内のジスルフィド結合が酸化還元緩衝剤で還元される傾向が低いことが信じられている。好ましくは、タンパク質のインヒビターは、活性部位インヒビターである。
上記の選択的な還元の1つの重要な目的は、化学基(例えば、非ポリペプチド部分)の付着(結合)に使用できるシステイン基を解放(liberate)させることである。
(a) 1以上のカルボン酸、アミンスルホン酸(amines sulfonic acids)、ホスホン酸、又はその組み合わせを含みえる低分子の有機の荷電したラジカル(15〜1,000 Da)
(b) 低分子(15〜1,000 Da)の中性で親水性の分子;例えば、シクロデキストリン、またはポリエチレン鎖(任意に分枝状であってもよい)
(c) 低分子(15〜1,000 Da)の疎水性の分子;例えば、脂肪酸又はコール酸又はその誘導体
(d) 2,000〜60,000 Daの平均分子量を有しているポリエチレングリコール
(e) 明確な規定の精密ポリマー(well defined precision polymer);例えば、700〜20,000 Da、または好ましくは700〜10,000 Daの間の分子量を有しているデンドリマー
(f) 実質的に非免疫原性のポリペプチド;例えば、アルブミンまたは抗体または抗体の一部(任意でFcドメインを含んでいる)
(g) 高分子量の有機のポリマー;例えば、デキストラン。
本発明の好適な態様において、本発明は、ジスルフィド架橋で低分子量チオール(RS-Cys)に結合された1以上のシステイン部分を含んでいる活性コンホメーションのVII因子ポリペプチドを選択的に還元させるための方法に関する;該部分は、該VII因子ポリペプチドがその活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与していなく;該方法は、低分子量チオール結合型FVIIポリペプチドと還元型および酸化型のグルタチオンおよびグルタレドキシンを含んでいる混合物とを反応させる工程と、同時および/または引き続き少なくとも1つの選択的に還元されたシステイン(HS-Cys)部分を化学基と結合する工程とを備える(各工程は非変性条件下)。
材料および方法
材料: DL-ジチオスレイトール(DTT)を、Sigmaから購入した。還元型の及び酸化型のグルタチオン(それぞれGSHおよびGSSG), システイン (Cys), DL-ホモシステイン(hCy), システイニルグリシン(CG), およびγ-グルタミルシステイン(γ-GC)を、Sigmaから購入した。システアミン(Cya)および7-フルオロベンゾフラザン-4-スルホン酸アンモニウム塩(SBD-f)を、Flukaから購入した。トリス(2-カルボキシルエチル)ホスフィン(TCEP)を、Calbiochem(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)から購入した。ヨードアセトアミドを、Sigmaから購入した。色素生産性S-2288基質を、Chromogenix (Milano, イタリア)から購入した。PEG5k-マレイミド(2E2M0H01), PEG20k-マレイミド(2E2M0P01), PEG40k-マレイミド(2D3Y0T01), およびマレイミド-PEG3.4k-マレイミド(2E2E0F02)を、Nektar Therapeutics(Huntsville, AL)から購入した。d-Phe-Phe-Arg-クロロメチルケトンを、Bachemから購入した。トリフェニルホスフィン-3,3',3'' トリスルホン酸を、Aldrichから購入した。ヒト血漿由来のFXおよびFXaを、Enzyme Research Laboratories Inc.(South Bend, IN)から購入した。可溶性の組織因子1-219(sTF)を、公開された処置(Freskgard et al., 1996)にしたがって調製した。組換え型のFVIIaの発現および精製を、以前の記載(Thim など, 1988; Persson および Nielsen, 1996)のとおり実施した。全ての他の化学物質は、分析用グレード以上のものを使用した。
FVIIaは不安定な分子内ジスルフィド結合を含有する(DTTの存在下でインキュベーションすることによって証明された): FVIIa中に不安定な分子内ジスルフィド結合が存在することが、0, 0.5, 1, または5mMのジスルフィド還元剤DTTの存在下でインキュベーション後に触媒活性が損失することから決定された。反応を、300μMのFVIIa, およびDTTを含有している反応緩衝剤(50mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM CaCl2, 0.01%Tween80, pH7.0)中で室温で実施した。時間を合わせたインターバルで(At timed intervals)、20μlの反応物を、10mMのヨードアセトアミドを含有している160μlの反応緩衝液に移して、自由チオールを急速にアルキル化し、反応を停止させた。引き続いて、残留しているアミド溶解活性を、ポリスチレンマイクロタイタープレート(Nunc, Denmark)中で、20μlのS-2288色素生産性基質を終濃度1mMで添加し、SpectraMaxTM 340 ミクロプレート分光光度計にSOFTmax PROソフトウェア(v2.2; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)を備えた装置において、吸光度を405nmで連続的に10minモニターすることによって測定した。アミド溶解活性は、ゼロ時間(time zero)でDTTが存在しない傾きと比較して、リニアプログレス曲線(linear progress curves)の傾きとして報告された。表3を参照されたい。
条件培地(Conditioned medium)を、25mlカラムのQセファロース・ファースト・フロー(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に、5mM EDTA、0.1%トリトンX-100、および10mM Tris、pHの調製を8.0および伝導率の調整を水を添加することにより10〜11mS/cmにしたものを添加した後に、ロードした。前記タンパク質の溶出は、10mM Tris、50mM塩化ナトリウム、0.1% トリトンX-100、pH8.0から10mM Tris、50mM塩化ナトリウム、25mM CaCl2、0.1%トリトンX-100、pH7.5へのグラジエントで達成された。FVIIa 407Cを含有している分画を、プールし、そしてモノクローナル抗体 F1A2(Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark)をCNBr-活性化セファロース4B(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に連結したものを含んでいる25-mlカラムに適用した。前記カラムを、50mM HEPES、pH7.5(10mM CaCl2、100mM塩化ナトリウム、および0.02%トリトンX-100を含んでいる)で平衡化した。平衡化緩衝液および2M NaClを含有している平衡化緩衝液で洗浄した後、結合した物質は、CaCl2の代わりに10mM EDTAを含有している平衡化緩衝液で溶出された。貯蔵の前に、FVIIa 407Cを50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 緩衝剤へと透析で移行させた。各工程の収率をVII因子のELISA測定に続いて測定し、精製タンパク質をSDS-PAGEで分析した。
条件培地(Conditioned medium)を、25mlカラムのQセファロース・ファースト・フロー(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に、5mM EDTA、0.1%トリトンX-100、および10mM Tris、pHの調製を8.0および伝導率の調整を水を添加することにより10〜11mS/cmにしたものを添加した後に、ロードした。前記タンパク質の溶出は、10mM Tris、50mM塩化ナトリウム、0.1% トリトンX-100、pH8.0から10mM Tris、50mM塩化ナトリウム、25mM CaCl2、0.1%トリトンX-100、pH7.5へのグラジエントで達成された。FVIIa 407Cを含有している分画を、プールし、そしてモノクローナル抗体 F1A2(Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark)をCNBr-活性化セファロース4B(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に連結したものを含んでいる25-mlカラムに適用した。前記カラムを、50mM HEPES、pH7.5(10mM CaCl2、100mM塩化ナトリウム、および0.02%トリトンX-100を含んでいる)で平衡化した。平衡化緩衝液および2M NaClを含有している平衡化緩衝液で洗浄した後、結合した物質は、CaCl2の代わりに10mM EDTAを含有している平衡化緩衝液で溶出された。貯蔵の前に、FVIIa Q250Cを50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 緩衝剤へと透析で移行させた。各工程の収率をVII因子のELISA測定に続いて測定し、精製タンパク質をSDS-PAGEで分析した。
Eq.1 FVIIa + 2GSH ⇔ FVIIai + GSSG
逆反応(Kox)の見かけ上の平衡定数を、次の類縁関係(Eq.2)から推測できる:
Eq.2 f=amax/(1+[GSH]2/([GSSG] Kox))
式中のfは所与の[GSH]2/[GSSG]での残留アミド溶解活性(residual amidolytic activity)であり、amaxは低い[GSH]2/[GSSG]での限定アミド溶解活性(limiting amidolytic activity)である。
Eq.3 FVIIa 407C-GSH+GSH ⇔ FVIIa 407C+GSSG
逆反応の見かけ上の平衡定数(Kscoxと称される)を、次の類縁関係(Eq.4)から推測できる:
Eq.4 A407C-PEG5k =Amax([GSH]/[GSSG])/([GSH]/[GSSG]+Kscox)
式中のA407C-PEG5kは所与の[GSH]/[GSSG]比での5k-PEG化FVIIa 407Cのピーク領域であり、Amaxは高い[GSH]/[GSSG]での限定ピーク領域(limiting peak area)である。
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Claims (19)
- 少なくとも1つの非天然システインを活性コンホメーションにおいて含んでいる操作したタンパク質を選択的に還元するための方法であって、該タンパク質はジスルフィド架橋で低分子量チオール(RS-Cys)に結合された1以上のシステイン部分を具備し、該部分は該タンパク質がその活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与しておらず、前記方法は、低分子量チオール結合型タンパク質を酸化還元緩衝剤を含んでいる混合物と非変性条件下で反応させる工程を備え、ここにおいて、前記酸化還元緩衝液は還元型および酸化型のグルタチオンの酸化還元対であり、前記還元型グルタチオンの濃度は0.01〜2 mMの範囲であり、前記酸化型グルタチオンの濃度は0.001〜0.200 mMの範囲であり、前記タンパク質がVII因子ポリペプチド(FVII/FVIIa)である方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記混合物は、さらにチオール/ジスルフィド酸化還元触媒を含む方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記酸化還元触媒は、0.001〜20 μMの濃度で使用される方法。
- 請求項2または3に記載の方法であって、前記酸化還元触媒がグルタレドキシンである方法。
- 請求項2〜4に記載の方法であって、前記酸化還元触媒が、大腸菌からのGrx1, Grx2 またはGrx3, 酵母からのGrx1p, Grx2p, Grx3p, Grx4pまたはGrx5p, ヒトからのGrx1およびGrx2, 並びにそのバリアントから選択されるグルタレドキシンである方法。
- 請求項1〜5の何れか1項に記載の方法であって、前記混合物は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)を含まない方法。
- 請求項1〜6の何れか1項に記載の方法であって、前記混合物は、さらに前記タンパク質のインヒビターを含む方法。
- 請求項1〜7の何れか1項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、1以上の分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)を有する方法。
- 請求項1〜8の何れか1項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、1以上の分子間のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)を別の操作されたタンパク質と有する方法。
- 請求項1〜9の何れか1項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、不安定なジスルフィド結合を有するタンパク質である方法。
- 請求項1〜10の何れか1項に記載の方法であって、前記タンパク質が、選択的な還元反応が行われる場合に活性型である方法。
- 請求項1〜11の何れか1項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、1以上の分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)を有する方法。
- 請求項1〜12の何れか1項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、1以上の分子間のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)を別の操作されたタンパク質と有する方法。
- 請求項1〜13の何れか1項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、不安定なジスルフィド結合を有するタンパク質である方法。
- 請求項1〜14の何れか1項に記載の方法であって、少なくとも1つの選択的に還元されたシステイン(HS-Cys)部分を化学基と結合させる同時の及び/又は引き続く工程を備える方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記化学基がポリエチレングリコール(PEG)から選択される方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記化学基は、ポリエチレングリコールであり、500〜100,000の範囲の平均分子量を有しているものである方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記化学基は、ポリエチレングリコールであり、1000〜75,000の範囲の平均分子量を有しているものである方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記化学基は、ポリエチレングリコールであり、2,000〜60,000の範囲の平均分子量を有しているものである方法。
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