JP2013532176A - 安定化させた第viii因子バリアント - Google Patents
安定化させた第viii因子バリアント Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013532176A JP2013532176A JP2013519027A JP2013519027A JP2013532176A JP 2013532176 A JP2013532176 A JP 2013532176A JP 2013519027 A JP2013519027 A JP 2013519027A JP 2013519027 A JP2013519027 A JP 2013519027A JP 2013532176 A JP2013532176 A JP 2013532176A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fviii
- fviii variant
- variant
- amino acid
- domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- A61K38/37—Factors VIII
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
フォンウィレブランド因子(vWF):vWFは、血漿中に存在する大型の単量体/多量体糖タンパク質であり、内皮(バイベル-パラーデ小体)、巨核細胞(血小板のα顆粒)、および内皮下結合組織において構成的に生成する。その主要な機能は、他のタンパク質、特に、第VIII因子への結合であり、創傷部位への血小板の接着において重要である。第VIII因子は、vWFに結合するが、循環中では不活性である。第VIII因子は、vWFに結合しないと、急速に分解されるか、または除去される。したがって、FVIIIにおけるvWF結合能の低減または除去は、これまでのところ、循環半減期が延長された因子FVIIIのバリアントを得るのにまったく望ましくない手法であると考えられてきた。しかし、分子が半減期延長部分にコンジュゲートされているならば、部位特異的突然変異誘発によってvWFを低減または除去することが可能でありうる。EP0319315において開示されている通り、vWFへの結合の原因となる第VIII因子内の領域は、残基1670〜1684にわたる領域である。この領域に関わる、第VIII因子の点突然バリアントおよび/または欠失突然バリアントは、vwFに対する結合能を変化させると想定されている。本発明により特に好ましい点突然変異の例には、以下の点突然変異: Y1680F、Y1680R、Y1680N、およびE1682T、およびY1680Cのうちの1または複数を含むバリアントが含まれる。
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
例えば、FVIIIなどのポリペプチドの「固有の(intrinsic)安定性」または「in vitroにおける安定性」とは、場合によって、「安定性」、「物理的安定性」、「固有の(interent)安定性」、「構造的安定性」、「化学的安定性」、「固有の(intrinsic)安定性」、「熱力学的安定性」、「熱的安定性」、「フォールディングの安定性」などを指す。このような用語の一般的な主題は、それらが、ポリペプチドのin vitroにおける安定性を指し、このin vitroにおける安定性が、その三次元構造を安定化させるように作用するポリペプチドの固有の特性の総体として見られうることである。FVIIIは、in vivoにおいて多数のクリアランス機構の下にあるため、FVIIIのin vivoにおける安定性とFVIIIのin vitroにおける安定性との間には著明な差違が存在する。これまで、FVIIIのin vivoにおける循環半減期の延長を、この分子のin vitroにおける安定性を改善することにより得ることは考慮されてこなかった。
Gln316Lys、Gln316Lys/Met539Pro、Gln316His、Glu287Ala/Glu676Ala、Asp666Asn、Asp666Val、Arg279Ala/Lys1967Ala、Arg279Gln/Lys1967Gln、Glu287Val、Glu676Val、Glu287Val/Glu676Val、Asp519Ala/Glu665Ala、Asp519Ala/Glu665Val、Asp519Ala/Glu1984Ala、Asp519Ala/Glu1984Val Asp519Val/Glu665Val、Asp519Val/Glu1984Ala、Asp519Val/Glu1984Val Glu665Ala/Glu1984Ala、Glu665Ala/Glu1984Val、Glu665Val/Glu1984Ala、Glu665Val/Glu1984Val、Asp519Ala/Glu665Val/Glu1984Ala、Asp519Val/Glu665Val/Glu1984Ala、Asp519Val/Glu665Val/Glu1984Val、Asp519Ala、Asp519Val、Asp525Glu/Asp605Glu、Arg489Gly/Asp525Glu/Asp605Glu、Glu665Ala、Glu665Val、Glu1984AlaおよびGlu1984Val (配列番号1における位置)のうちの1つ、2つ以上を含む。
本明細書で用いられる「N8」および「F8-500」とは、既にWO09108806の例において開示されている、Bドメインが切断されたFVIIIバリアントのアミノ酸配列を指す。「N8」/「F8-500」バリアントは、配列番号2に示される配列を伴うBドメインを有し、この分子の活性化変化形は、内因性活性化FVIIIと本質的に同一である。この分子の特異的突然バリアントを、配列番号1の番号付けによる特異的アミノ酸置換を後続させた「F8-500」と称する。この分子の一部のバリアントは、好ましくは、切断Bドメイン内のOグリカンに位置する半減期延長部分にさらにコンジュゲートすることもできる。例えば、40kDaのPEG部分を、Oグリカンに結合させる場合は、この分子を、例えば、「40K-PEG-[O]-...」と名付ける。
組換えBドメイン切断O-グリコシル化第VIII因子およびそのバリアント、例えば、第VIII因子(M662C-D1828C)または第VIII因子(D519V-E1984A)の生成
細胞系および培養工程
第VIII因子のcDNAを用いて、哺乳動物用の発現プラスミドを構築した。前記プラスミドは、Y1680F突然変異を含むBドメイン欠失第VIII因子、全長ヒト第VIII因子のアミノ酸1〜740を含む第VIII因子重鎖、および全長ヒト第VIII因子のアミノ酸1649〜2332を含む第VIII因子軽鎖をコードする。重鎖配列および軽鎖配列は、全長ヒト第VIII因子のアミノ酸741〜750および1638〜1648による配列を含む21アミノ酸のリンカー(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR:配列番号2)により連結した。このプラスミドによりコードされる第VIII因子アミノ酸配列は、配列番号3(M662C-D1828C)に示される通りである:
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKCVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKCEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
細胞培養培地から、Bドメイン欠失第VIII因子(M662C-D1828C)を単離するために、Capto MMCカラムにおける濃縮ステップ、免疫吸着クロマトグラフィーによるステップ、アニオン交換クロマトグラフィーステップ、および最後のゲル濾過ステップを含めた、4ステップの精製手順を用いた。典型的には、以下の手順を用いた: 11リットルの滅菌濾過培地を、緩衝液A: 20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、50mMのNaCl、0.02%のTween 80、pH=7.5中で平衡化したCapto MMC(GE Healthcare、Sweden)によるカラム(1.6×12cm)へと、流速15ml/分で送入した。75mlの緩衝液Aでカラムを洗浄した後、1.5MのNaClを含有する75mlの緩衝液Aで洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、2.5MのNaCl、8Mのエチレングリコール、pH=7.5により、流速1ml/分でタンパク質を溶出させた。8mlの画分を回収し、第VIII因子活性についてアッセイした(比色アッセイ)。第VIII因子を含有する画分をプールし、通常約50mlのプール容量を得た。
組換えOグリコシル化第VIII因子をPEG化する手順
実施例1で得られた組換え第VIII因子分子は、以下の手順を用いてポリエチレングリコール(PEG)とコンジュゲートする。
Oグリカンにおける40kDa-グリコPEG-BDD-FVIII(M662C-D1828C)
水(pH7.3)中にイミダゾール(20mM)、塩化カルシウム(10mM)、Tween 80(0.02 %)、塩化ナトリウム(500mM)、およびグリセロール(1M)からなる緩衝液中で、BDD-FVIII(M662C-D1828C:配列番号3) (5.32mg、4.4ミリグラム/ml)を融解させた。
比色アッセイにおいて測定されたFVIII:C
以下の通りに、Coatest SP試薬(Chromogenix)を用いるFVIII比色アッセイにおいて、rFVIII化合物5〜8のFVIII活性(FVIII:C)を評価した: Coatestアッセイ緩衝液(防腐剤を伴う、50mMのトリス、150mMのNaCl、1%のBSA、pH7.3)中で、FVIII試料およびFVIII基準物質(例えば、NIBSCによる、国際FVIII基準物質第7版に照らして較正した精製野生型rFVIII)を希釈した。50μlの試料、基準物質、および緩衝液による陰性対照を、96ウェルマイクロ滴定プレート(Nunc)に二連で添加した。Coatest SPキットによる第IXa因子/ 第X因子試薬、リン脂質試薬、およびCaCl2を、5:1:3(容量:容量:容量)で混合し、このうちの75μlを、ウェルに添加した。室温で15分間にわたるインキュベーション後、50μlの第Xa因子基質S-2765/トロンビン阻害剤I-2581ミックスを添加し、反応物を室温で10分間にわたりインキュベートしてから、pH3の1Mクエン酸25μlを添加した。620nmにおける吸光度を基準波長として用いるSpectramaxマイクロ滴定プレートリーダー(Molecular Devises)上で、415nmにおける吸光度を測定した。陰性対照による値を、全ての試料から減じ、FVIII濃度と対比してプロットした吸光度値の線形回帰により、検量線を作成した。試料の活性を、HPLCにより決定されるタンパク質濃度で除することにより、比活性を計算した。軽鎖に対応するクロマトグラムのピーク下面積を積分し、野生型非修飾rFVIIIに対する並行的な解析における同じピーク面積と比較することにより、かつ、アミノ酸解析を介して飼料の濃度を決定した。Table 1(表1)におけるデータは、FVIII:Cの比活性が、O-グリコPEG化されたrFVIII化合物について維持されたことを裏付ける。
一段階血栓アッセイにおいて測定されたFVIII:C
以下の通り、一段階FVIII血栓アッセイにより、rFVIII化合物のFVIII:Cをさらに評価した。HBS/BSA緩衝液(1%のBSAを伴う、20mMのhepes、150mMのNaCl、pH7.4)中で、rFVIII試料およびFVIII基準物質(例えば、NIBSCによる、国際FVIII基準物質第7版に照らして較正した精製野生型rFVIII)を、約10U/mlまで希釈した後、VWF (Dade Behring)を含有するFVIII欠損血漿中で10倍に希釈した。その後、試料を、HBS/BSA緩衝液中で希釈した。単一の因子プログラムを用いて、ACL300R測定器またはACL5000測定器(Insturumentation Laboratory)上で、APTT血栓形成時間を測定した。VWF (Dade Behring)を伴うFVIII欠損血漿をアッセイ血漿として用い、SynthASil(HemosIL (商標); Instrumentation Laboratory)をaPTT試薬として用いた。血栓測定器では、希釈した試料または基準物質を、37℃で、FVIII欠損血漿およびaPTT試薬と混合する。塩化カルシウムを添加し、血栓形成までの時間を、濁度により決定する。FVIII基準物質の希釈液による血栓形成時間の検量線に基づき、試料中のFVIII:Cを計算する。Table 1(表1)におけるデータは、血栓形成と比色活性との比を裏付ける。
FVIIIバリアントをスクリーニングするためのFVIIIのin vitroにおける安定性についての塩化グアニジニウム加速化アッセイ
異なるFVIIIバリアントにおいて1Mの塩化グアニジニウムを伴う/伴わない場合のFVIII活性(FVIII:C)を、Coatest SP試薬(Chromogenix)を用いる比色FVIIIアッセイにより評価した。FVIII突然バリアントの生成および発現は、以下の通りに実施した。cMycタグをコードする断片を、28アミノ酸のBドメインリンカーを伴うFVIIIをコードする発現構築物中の重鎖のC末端に挿入した(Thim Lら、Haemophilia 2010; 16: 349〜48頁)。このFVIII-cMyc2の発現レベルおよび活性は、タグ付けされていないFVIIIと同様であった。さらなる制限部位を、FVIII-cMyc2発現構築物に付加しバリアント間におけるドメインのスワッピングを容易にした。
クエン酸で安定化させた血漿における減衰
FVIIIまたはFVIIIバリアント(10μl)を、クエン酸で安定化させてA型血友病血漿(George King Bio-Medical Inc.)90μlに、1IU/mlの濃度となるまで添加し、37℃で0、3、6、20、24、44、および48時間にわたりインキュベートした。その後、比色アッセイにおいて、FVIII活性について試料を解析した:FVIII試料およびFVIII基準物質(例えば、NIBSCによる第7次国際FVIII基準物質に照らして較正された野生型FVIII)の希釈液を、Coatestアッセイ緩衝液(防腐剤を伴う50mMのトリス、150mMのNaCl、1%のBSA、pH7.3)中で希釈した。50μlの試料、基準物質、および緩衝液による陰性対照を、96ウェルマイクロ滴定プレート(Nunc)に2連で添加した。Coatest SPキットによる第IXa因子/ 第X因子試薬、リン脂質試薬、およびCaCl2を5:1:3(容量:容量:容量)に混合し、この混合物75μLをウェルに添加した。室温で15分間にわたるインキュベーション後に、50μLの第Xa因子基質S-2765/トロンビン阻害剤I-2581ミックスを加し、反応物を、室温で10分間にわたりインキュベートしてから、1Mのクエン酸、pH3、25μLを添加した。620nmにおける吸光度を基準波長として用いるSpectramaxマイクロ滴定プレートリーダー(Molecular Devices)により、415nmにおける吸光度を測定した。全ての試料から陰性対照の値を減じ、残りの試料のFVIII活性を、較正された野生型FVIII希釈液から作成された検量線に基づき計算した。FVIII活性を、インキュベーション時間と対比してプロットし、GraphPad Prismソフトウェアによる単相減衰についての式を用いて血漿半減期(t1/2)を計算した。以下の表は、文献(Gale AJら、J Thromb Haemost 2006; 4: 1315〜22頁; Wakabayashi Hら、J Thromb Haemost 2009; 7: 438〜44頁)において既に記載されているFVIII-M662C-D1828CおよびFVIII-D519V-E1984Aの血漿t1/2と共に、野生型FVIIIおよびS149C-E1969C置換を伴うFVIIIの血漿t1/2を示す。FVIII-S149C-E1969Cの血漿中の安定性は、野生型FVIIIと比較して増大した。
ヒルジン/TAPで安定化させた血漿における減衰
クエン酸で安定化させたA型血友病血漿(George King Bio-Medical Inc.)に、ヒルジン(5.7μg/ml)およびダニ抗凝固タンパク質(TAP、12.9g/ml)を添加し、塩化カルシウムを20mMまで添加することにより、血漿を再石灰化させた。FVIIIまたはFVIIIバリアント(10μl)を、ヒルジン-TAPで安定化させた血漿90μlに、1IU/mlの濃度となるまで添加し、37℃で最長7日間の期間にわたり、例えば、0、3、6、24、48、72、96、168、192および216時間にわたりインキュベートした。その後、実施例7において記載した比色アッセイにおいて、FVIII活性について試料を解析した。以下の表は、野生型FVIIIの血漿t1/2、ならびに文献(Gale AJら、J Thromb Haemost 2006; 4: 1315〜22頁; Wakabayashi Hら、J Thromb Haemost 2009; 7: 438〜44頁)において既に記載されているFVIII-M662C-D1828CおよびFVIII-D519V-E1984Aを含めたバリアントの血漿t1/2を示す。データは、重鎖と軽鎖との間にジスルフィド架橋を挿入したFVIIIバリアントであるD666C-S1788Cの、ヒルジン-TAPで安定化させた血漿中の安定性が、野生型FVIIIと比較して増強されていることを示す。
トロンビン生成
洗浄した血小板を、記載される通りに(Lisman Tら、J Thromb Haemost 2005; 3: 742〜751頁)調製し、最終密度が1μl当たりの血小板150000個となるまで、A型血友病血漿(George King Bio-Medical Inc)に添加した。血小板を含有する血漿80μlを、マイクロ滴定ウェル内の脂質を再付加した組織因子(Innovin、Dade、最終希釈率1:50000に対応する約0.12pMの組織因子) 5μlと混合し、Flouroskan Ascentプレートリーダー(Thermo Electron Corporation)により37℃で10分間にわたりあらかじめ加熱した。野生型FVIIIまたはバリアント(最終濃度を2.7、0.9、0.3、0.1、0.33、0.11、0.0037、および0.0012nMとする)を、15μl中に添加した。CaCl2(最終濃度を16.7mMとする)と混合した蛍光原基質(Z-Gly-Gly-Arg-AMC、Bachem、最終濃度を417nMとする)を、1時間にわたり持続的に20μl中に添加してから、蛍光(励起波長を390nmとし、発光波長を460nmとする)を測定する。蛍光シグナルを、a2マクログロブリンを結合させたトロンビンの活性について補正し、記載される通りに(Hemker HCら、Pathophysiol Haemost Thromb 2003; 33:4〜15頁)、トロンビン濃度較正基準物質およびThrombinoscopeソフトウェア(Synapse BV)を用いることにより、トロンビン濃度へと変換した。安定化させたFVIII突然バリアントは、野生型FVIIIより多くのトロンビンを生成させた。これは、解析された最も低いFVIII濃度において最も顕著であった。これは、Thrombinoscopeソフトウェアから得られるトロンビン活性の最大レベルが示されるときに見られる(図1)。0.011nMの野生型FVIIIおよびバリアントにより得られるトロンビン活性の最大レベルを、以下:トロンビンの最大生成率=トロンビン活性の最大レベル/(トロンビン活性がピークとなるまでの時間-遅延)の通りにThrombinoscopeソフトウェアから得られるパラメータから計算したトロンビンの最大生成率と共にTable 5(表5)に示す。
FVIII欠損マウスおよびVWF欠損マウスにおけるrFVIIIの薬物動態
rFVIIIバリアントの薬物動態を、FVIII欠損マウス(Taconic m&bで飼育された、c57bl/6のバックグラウンドを伴う、FVIIIエクソン16ノックアウト(KO)マウス)またはvWF欠損マウス(Charles River、Germanyで飼育された、c57bl/6のバックグラウンドを伴う、vWFエクソン4+5 KOマウス)において評価した。vWF-KOマウスが、13%の正常FVIII:Cを有する一方、FVIII-KOマウスは、検出可能なFVIII:Cを有さなかった。体重を約25グラムとし、週齢の範囲を16〜28週齢とする、雄および雌の混合群(約1:1)を用いた。マウスの尾静脈に、rFVIIIの単回の静脈内注射(280iu/kg)を施した。血液は、投与の64時間後までの時点において、コーティング処理されていないガラス製の毛細管を用いて、眼窩神経叢から採取した。各マウスから3例ずつの試料を採取し、各時点において2〜4例の試料を回収した。血液は、クエン酸ナトリウムで即座に安定化させ、4倍容量のFVIII Coatest SP緩衝液(実施例4を参照されたい)中で希釈してから、4000×gで5分間にわたり遠心分離した。希釈した血液から得られた血漿をドライアイス上で凍結させ、-80℃で保存した。実施例4において記載される比色アッセイにより、FVIII:Cを決定した。Winnonlin Pro version 4.1ソフトウェアを用いるノンコンパートメント法(NCA)により、薬物動態解析を実施した。
A型血友病マウスによるFeCl3誘導傷害モデルにおいてPEG化とFVIIIの安定化とを組み合わせることによる止血効果の延長
40K-PEG-[O]-FVIII(M662C-D1828C)と対比した40K-PEG-[O]-N8の作用時間を、A型血友病(F8-KO)マウスによるFeCl3誘導傷害モデルにおいて探索した。
マウスに麻酔をかけ、これを温熱パッド(37℃)上に置いて体温を維持した。頸動脈を露出させ、超音波により血流を測定する流速プローブ(0.5PSB Nanoprobe)を、頸動脈の周囲に設置した。10%のFeCl3溶液に短時間浸漬した濾紙(2×5mm)を、露出された頸動脈の周囲に適用することにより、傷害(鉄を介する化学的酸化)を誘導した。3分後に濾紙を除去した。次いで、頸動脈を、0.9%のNaClで3回にわたり洗浄し、最後に流速プローブ内の空気を抜き、血流測定の最適化を確保するためにSurgilube(音響カプラ)を適用した。FeCl3で飽和させた濾紙を除去した後で、血流(ml/分)を、25分間にわたり記録し、FeCl3で飽和させた濾紙を除去してから血流が0ml/分となるまでの時間(分単位)を測定することにより、閉塞までの時間を決定した。25分後に閉塞が起こらなかった場合は、観察時間内に閉塞が起こらなくとも、閉塞時間を25分間として報告した。F8-KOマウス(n=6〜10)を、Advate (280U/kg)、40K-PEG-[O]-N8(280U/kg)、または媒体で処置した。FeCl3誘導傷害は、投与の5分後(急性作用)、または24、48、60、および72時間後に生じさせた。血流(ml/分)は、FeCl3を除去した25分後に報告し、その後閉塞までの時間を決定した。
FeCl3誘導傷害は、280IU/kgの40K-PEG-[O]-N8、280IU/kgの40K-PEG-[O]-F8(M662C+D1828C)、または媒体を投与した5分後(急性作用)、72、および96時間後に生じさせた。血流(ml/分)は、FeCl3を除去した25分後に報告し、その後閉塞までの時間を決定した(Table 4(表4)を参照されたい)。1群当たり5〜8匹ずつのマウスの平均およびSEMを示す。媒体で処置されたF8-KOマウスでは閉塞が起こらなかったのに対し、40K-PEG-O-N8および40K-PEG-[O]-F8(M662C+D1828C)で処置された全てのマウスでは投与の5分後(急性作用)に閉塞が起こり、平均の閉塞時間は、それぞれ、3.1±0.5分間および3.2±0.4であった。このモデルによる先行研究は、Advateで処置されたF8-KOマウスの閉塞時間が、24および48時間後においてそれぞれ13.0±3.4分間および15.9±2.9分間であるが、Advateを投与した60および72時間後には閉塞が観察されなかったことを明らかにしている。これに対し、40K-PEG-[O]-N8で処置したF8-KOマウスでは、72および96時間後のいずれにおいても、平均閉塞時間は長くなるが、閉塞が観察された(Table 5(表5))。興味深いことに、安定化させたグリコPEG化FVIIIバリアントは、グリコPEG化野生型FVIIIと比較して、FeCl3誘導血栓形成モデルにおける効果の持続時間のなお一層の延長を示している。したがって、ダンの事後検定を包含するクルスカル-ワリス検定を用いて、異なる群間における閉塞までの時間を比較したところ、96時間後において統計学的有意差が明らかであった(p<0.05)ことから、分子を安定化させる付加効果が確認された。
Claims (15)
- FVIII活性を有し、in vitroにおける安定性を増大させた、組換えFVIIIバリアントであって、半減期延長部分とコンジュゲートされ、in vitroにおける安定性を結果として増大させるアミノ酸変化が導入されている、組換えFVIIIバリアント。
- ジスルフィド架橋を含む、請求項1に記載の組換えFVIIIバリアント。
- 前記ジスルフィド架橋が、FVIIIバリアントの2つのドメインを共有結合により連結している、請求項2に記載の組換えFVIIIバリアント。
- ジスルフィド架橋が、重鎖と軽鎖とを連結している、請求項2に記載の組換えFVIIIバリアント。
- 疎水性のアミノ酸残基によるアミノ酸置換を含み、導入された疎水性のアミノ酸残基が、FVIIIバリアントの疎水性相互作用およびin vitroにおける安定性を増大させる、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。
- 正に帯電したアミノ酸残基および負に帯電したアミノ酸残基の形態でアミノ酸置換を含むバリアントであって、導入された帯電残基が、FVIIIバリアントの静電相互作用およびin vitroにおける安定性を増大させる、請求項1から5のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。
- Bドメイン切断バリアントである、請求項1から6のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。
- 側鎖基が、切断Bドメインに位置するOグリカンに連結され、前記FVIIIバリアントが活性化すると、前記側鎖基が除去される、請求項7に記載の組換えFVIIIバリアント。
- Bドメインの配列が、配列番号2に示される、請求項7または8に記載の組換えFVIIIバリアント。
- 半減期延長部分が、親水性ポリマー、抗体またはその抗原結合断片、Fcドメイン、ポリペプチド、および脂肪酸または脂肪酸誘導体からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。
- 配列番号3によるアミノ酸配列を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。
- 以下の置換:S149CおよびE1969Cを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。
- 以下の置換:D666CおよびS1788Cを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載のFVIIIバリアントを含む医薬組成物。
- 血友病を治療するための、請求項1から13のいずれか一項に記載のFVIIIバリアントまたは請求項14に記載の組成物の使用。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP10169592 | 2010-07-15 | ||
EP10169592.2 | 2010-07-15 | ||
US36547810P | 2010-07-19 | 2010-07-19 | |
US61/365,478 | 2010-07-19 | ||
PCT/EP2011/061349 WO2012007324A2 (en) | 2010-07-15 | 2011-07-06 | Stabilized factor viii variants |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013532176A true JP2013532176A (ja) | 2013-08-15 |
JP2013532176A5 JP2013532176A5 (ja) | 2014-08-21 |
Family
ID=42797590
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013519027A Ceased JP2013532176A (ja) | 2010-07-15 | 2011-07-06 | 安定化させた第viii因子バリアント |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20130183280A1 (ja) |
EP (1) | EP2593130A2 (ja) |
JP (1) | JP2013532176A (ja) |
CN (1) | CN102971006A (ja) |
WO (1) | WO2012007324A2 (ja) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7855279B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
US20110046060A1 (en) | 2009-08-24 | 2011-02-24 | Amunix Operating, Inc., | Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same |
CN116925238A (zh) | 2009-02-03 | 2023-10-24 | 阿穆尼克斯制药公司 | 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 |
US20130017997A1 (en) * | 2010-08-19 | 2013-01-17 | Amunix Operating Inc. | Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same |
EP3798230B1 (en) | 2011-06-06 | 2022-08-03 | Novo Nordisk A/S | Therapeutic antibodies |
US10421798B2 (en) | 2012-02-15 | 2019-09-24 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor VIII compositions and methods of making and using same |
SI2822577T1 (sl) | 2012-02-15 | 2019-07-31 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Rekombinantni proteini faktorja VIII |
JP2015519313A (ja) * | 2012-04-24 | 2015-07-09 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 血友病の治療に適する医薬組成物 |
US20150259665A1 (en) | 2012-10-15 | 2015-09-17 | Novo Nordisk Health Care Ag | Factor vii conjugates |
UY35343A (es) * | 2013-02-26 | 2014-09-30 | Bayer Healthcare Llc | Formulaciones y procedimientos para la producción de proteína recombinante aumentada |
DK3013855T3 (da) | 2013-06-24 | 2021-01-11 | Xiao Weidong | Mutante faktor VIII-sammensætninger og fremgangsmåder |
TW202003554A (zh) | 2013-08-14 | 2020-01-16 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 因子viii-xten融合物及其用途 |
EP3058066A1 (en) | 2013-10-15 | 2016-08-24 | Novo Nordisk Health Care AG | Coagulation factor vii polypeptides |
WO2015056187A1 (en) * | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Dr. Reddy’S Laboratories Limited | In-vitro method for determining fate of polypeptide variant |
WO2015132724A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Pfizer Inc. | Improved muteins of clotting factor viii |
DK3177317T3 (en) | 2014-08-04 | 2020-06-15 | Csl Ltd | Factor viii formulation |
SG11201706659WA (en) | 2015-03-06 | 2017-09-28 | Csl Behring Recombinant Facility Ag | Modified von willebrand factor having improved half-life |
US10745680B2 (en) | 2015-08-03 | 2020-08-18 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor IX fusion proteins and methods of making and using same |
AU2020300820A1 (en) | 2019-07-04 | 2022-03-03 | CSL Behring Lengnau AG | A truncated von willebrand factor (vWF) for increasing the in vitro stability of coagulation factor VIII |
CN114929735A (zh) * | 2019-11-01 | 2022-08-19 | 自由行疗法有限公司 | 因子viii构建体 |
US20220348637A1 (en) | 2019-11-11 | 2022-11-03 | CSL Behring Lengnau AG | Polypeptides for inducing tolerance to factor viii |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005500831A (ja) * | 2001-06-14 | 2005-01-13 | ザ スクリプス リサーチ インスティチュート | 操作されたジスルフィド結合を有する安定化蛋白質 |
JP2008546671A (ja) * | 2005-06-17 | 2008-12-25 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | 二量体及び多量体FVIIa化合物 |
JP2008546670A (ja) * | 2005-06-17 | 2008-12-25 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 少なくとも1つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化 |
WO2009108806A1 (en) * | 2008-02-27 | 2009-09-03 | Novo Nordisk A/S | Conjugated factor viii molecules |
JP2009532351A (ja) * | 2006-03-31 | 2009-09-10 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | ペグ化第viii因子 |
WO2010045568A1 (en) * | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Baxter International Inc. | Modified blood factors comprising a low degree of water soluble polymer |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2645588A (en) | 1987-12-04 | 1989-06-15 | Scripps Clinic And Research Foundation | The von willebrand factor binding domain of factor viii |
US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
KR100622796B1 (ko) | 1998-04-28 | 2006-09-13 | 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이. | 폴리올-ifn-베타 공액체 |
MXPA04003333A (es) | 2001-10-10 | 2006-02-22 | Neose Technologies Inc | Remodelado y glicoconjugacion de peptidos. |
ES2374935T3 (es) | 2005-03-24 | 2012-02-23 | Biogenerix Ag | Expresión de glicosiltransferasas eucariotas activas, solubles en organismos procariotas. |
WO2006103298A2 (en) * | 2005-04-01 | 2006-10-05 | Novo Nordisk Health Care Ag | Blood coagulation fviii analogues |
WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
US20080242607A1 (en) * | 2006-07-21 | 2008-10-02 | Neose Technologies, Inc. | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
-
2011
- 2011-07-06 JP JP2013519027A patent/JP2013532176A/ja not_active Ceased
- 2011-07-06 US US13/808,204 patent/US20130183280A1/en not_active Abandoned
- 2011-07-06 WO PCT/EP2011/061349 patent/WO2012007324A2/en active Application Filing
- 2011-07-06 CN CN2011800348298A patent/CN102971006A/zh not_active Withdrawn
- 2011-07-06 EP EP11735405.0A patent/EP2593130A2/en not_active Withdrawn
-
2016
- 2016-06-01 US US15/170,502 patent/US20160264645A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005500831A (ja) * | 2001-06-14 | 2005-01-13 | ザ スクリプス リサーチ インスティチュート | 操作されたジスルフィド結合を有する安定化蛋白質 |
JP2008546671A (ja) * | 2005-06-17 | 2008-12-25 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | 二量体及び多量体FVIIa化合物 |
JP2008546670A (ja) * | 2005-06-17 | 2008-12-25 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 少なくとも1つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化 |
JP2009532351A (ja) * | 2006-03-31 | 2009-09-10 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | ペグ化第viii因子 |
WO2009108806A1 (en) * | 2008-02-27 | 2009-09-03 | Novo Nordisk A/S | Conjugated factor viii molecules |
WO2010045568A1 (en) * | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Baxter International Inc. | Modified blood factors comprising a low degree of water soluble polymer |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6015028291; A. J. GALE: 'Intrinsic stability and functional properties of disulfide bond-stabilized coagulation factor VIIIa' Journal of Thrombosis and Haemostasis Vol.4, 2006, Pages 1315-1322 * |
JPN6015028292; A. J. GALE: 'An engineered interdomain disulfide bond stabilizes human blood coagulation factor VIIIa' Journal of Thrombosis and Haemostasis Vol.1, 2003, Pages 1966-1971 * |
JPN6015028294; K. P. RADTKE: 'Disulfide bond-stabilized factor VIII has prolonged factor VIIIa activity and improved potency in wh' Journal of Thrombosis and Haemostasis Vol.5, 2007, Pages 102-108 * |
JPN6015028295; H. WAKABAYASHI: 'Combining mutations of charged residues at the A2 domain interface enhances factor VIII stability ov' Journal of Thrombosis and Haemostasis Vol.7, 2009, Pages 438-444 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20130183280A1 (en) | 2013-07-18 |
EP2593130A2 (en) | 2013-05-22 |
US20160264645A1 (en) | 2016-09-15 |
WO2012007324A3 (en) | 2012-03-08 |
WO2012007324A2 (en) | 2012-01-19 |
CN102971006A (zh) | 2013-03-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20160264645A1 (en) | Stabilized Factor VIII Variants | |
JP6185097B2 (ja) | 因子viii融合タンパク質 | |
JP5914363B2 (ja) | 低減されたvwf結合を有する因子viii分子 | |
RU2722374C1 (ru) | Высокогликозилированный слитый белок на основе фактора свертывания крови человека viii, способ его получения и его применение | |
US8536126B2 (en) | Conjugated factor VIII molecules | |
EP2097096B1 (en) | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life | |
JP5826772B2 (ja) | コンジュゲートタンパク質 | |
JP6336522B2 (ja) | 細胞取込みが低下した第viii因子変異体 | |
US9878017B2 (en) | Covalent complex of von Willebrand Factor and factor VIII, compositions, and uses relating thereto | |
AU2017205776B2 (en) | Mutated von Willebrand factor | |
US10688157B2 (en) | Truncated von Willebrand factor polypeptides for treating hemophilia | |
EP3858865A1 (en) | Fusion protein of mutated single-chain human coagulation factor viii, preparation method therefor, and use thereof | |
EP1935430A1 (en) | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140703 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140703 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150713 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20151007 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160113 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160620 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161014 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20161021 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20161228 |
|
A045 | Written measure of dismissal of application [lapsed due to lack of payment] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A045 Effective date: 20180528 |