SE451849B - Sett att syntetisera glykosidiska bindningar samt anvendning av pa detta sett erhallna produkter - Google Patents

Description

451 10 15 20 25 30 35 CO -P- \O . 2 Ett stort antal oligosackaridstrukturer som ingår i olika glykokonjugat är idag fastställda.-Likaså' har den minsta enheten (ofta en di- eller trisackarid) v (som är nödvändig för den biologiska aktiviteten hos en känd oligosackarid blivit bestämd i många fall. > Som en följd härav pågår idag ett intensivt arbete både inom universitet och industri för att utveckla_ användningen av biologiskt aktiva oligosackarider inom en rad olika områden. Som exempel kan nämnasš - utvecklande av nya diagnostika och blodtypningsrea- gens, * syntes av högspecifika material för affiniteskroma- tografi, 7 7 - framtagning av monoklonala antikroppar, - framställning av cellspecifika agglutinationsreagens, - utveckling av nya terapeutiska metoder mha så kallad läkemedelstargeting där man utnyttjar mikrosfärer (<_l mikrometer) med inneslutet läkemedel och speci- fik oligosackarid på mikrosfärens yta, - utvecklande av en ny typ av terapi, som alternativ till antibiotika, baserad på inhibering av bakteriers och virus' vidhäftning på cellytor mha specifika oligosackarider, - stimulering av växters tillväxt och skydd mot pato- gener.

I Förutom ovan nämnda områden räknar man med en avsevärd framtida marknad för finkemikalier baserade på biologiskt aktiva kolhydrater.

Endast ett tiotal olika monosackarider ingår- i glykokonjugatens kolhydratdel, nämligen D-glukos (Glc), D-galaktos (Gal), D-mannos (Man), L-fukos (Fuc), N-acetyl-D-galaktosamin (GalNAc), N-acetyl-D-glukosamin (GlcNAc), N-acetyl-D-neuraminsyra (NeuAc), D-arabinos (Ara) och D-xylos (Xyl) (förkortningarna inom parentes följer IUPAC-IUB:s förkortade terminologi för mono- sackarider, J. Biol. Chem., volym 257, s. 3347-3354 (1982)). Antalet kombinationsmöjligheter blir emellertid nästan oändligt stort p g a att både anomer konfigu- 10 15 20 25 30 35 451 849 3 ration (a- eller B-) och position för den O-glykosi- diska bindningen kan varieras. Detta medför avsevärda *problem vid syntes av oligosackarider med konventionell organisk-kemisk syntes. De organisk-kemiska metoder som används kräver en omfattande skyddsgruppskemi med många syntessteg och därmed ofta låga totalutbyten som följd. Framställning i industriell skala med denna teknik är därför vanligen ogynnsam i detta sammanhang.

Enzymer är naturens egna katalysatorer. De upp- visar många attraktiva egenskaper, som t ex hög regio- och stereoselektivitet samt hög katalytisk effektivitet vid milda betingelser. Man hyser därför idag stora förhoppningar om att kunna utnyttja enzymer för stor- skalig selektiv syntes av oligosackarider med färre syntessteg och därmed högre totalutbyten än med orga- nisk-kemiskømetodik.

I litteraturen finns ett flertal enzymkatalyserade oligosackaridsynteser beskrivna (K. Nisizawa et al, i "The Carbohydrates, Chemistry and Biochemistry, 2nd Ed., Vol. IIA, pp 242-290, Academic Press, New York (1970)). Både hydrolaser (glykosidaser, EC nummer 3.2) och transferaser (EC nummer 2.4) har använts.

Av dessa har framförallt hydrolaser använts för oligo- sackaridsyntes. För att få till stånd en glykosid- fsyntes med denna typ av enzym har två tillvägagångssätt utnyttjats: omvänd hydrolys (kondensations- eller jämviktsmetod) samt transglykosidering (kinetisk metod).

EH Omvänd hydrolys; DOH + HOA'(_".* DOA + H20 (1) ROH + HOA Transglykosidering: DOR + EH¿::::ä E.D ;:::è DOA + EH (2) H20 DOH + EH (DOH är donatorsackarid, DOR är donatorsackarid med a- eller B-glykosidiskt bunden aglykon (=R), HOA är acceptorsackarid och EH är enzym). 451 849 10 15 20 25 30 35 4 Omvänd hydrolys kan ge höga utbyten om produkten är olöslig eller om reaktionen kan utföras med organiska lösningsmedel för att sänka vattenkoncentrationen.

Vid transglykosideringar har den höga enzymatiska aktiviteten gentemot donatorsubstanser som t ex fenyl- eller nitrofenylglykosider (R=feny1, nitrofenyl i ekv. 2) utnyttjats för att få ett högt produktutbyte. Även om dessa metoder visat sig fullt användbara i många situationer har problemet varit att styra reaktionerna så att donatorsubstansen binds O-glyko- sidiskt till den önskade positionen på acceptorsubstan- sen; Vanligen har l-6-bindningar (eller bindningar till primära hydroxylgrupper på acceptorsackariden) bildats medan 1-2-, 1-3- och l-4-bindningar, som oftast förekommer i glykokonjugat, ej bildats eller bildats i mindre omfattning. Vidare bildas med tidigare kända metoder ofta isomera produktblandningar, som är svåra ' att rena, p g a att den reducerande änden ej är glyko- siderad och därmed föreligger i produktlösningen som bade a- och B-anomeren. Vidare har tidigare metoder krävt ytterligare kemisk modifiering av produkterna innan de kunnat kopplas till proteiner, lipider, etc.

Föreliggande uppfinning syftar bl a till att elimi- nera eller reducera nackdelarna vid kända enzymatiska metoder och den syftar speciellt till att göra en styrning av regioselektiviteten vid enzymatisk kolhydratsyntes möjlig så att den önskade bindningen mellan donatorsubs- tans och acceptorsubstans bildas i högre omfattning än om ingen sådan styrning skett. Andra speciella syften med uppfinningen är att underlätta rening av produkterna och att möjliggöra direktsyntes av intressanta glykosider av oligosackarider.

Föreliggande uppfinning avser således ett sätt att styra regioselektiviteten för den bildade glykosid- bindningen mellan glykosyldonator och glykosylaccep- tor vid enzymatisk framställning av glykokonjugatderivat 10 15 20 25 30 35 451 '1849 5 genom omvänd hydrolys eller transglykosidering. Sättet kännetecknas av att en donatorsubstans, som utgöres av en monosackarid eller oligosackarid eller en glykosid av en monosackarid eller oligosackaríd, bringas att 'reagera med en acceptorsubstans, som är en O-, N-, 'C- eller S-glykosid, bestående av en monosackarid, oligosackarid eller en sackaridanalog och åtminstone en i 1-position O-, N-, C- eller S-glykosidiskt bunden aglykon, i närvaro av ett glykosidas, varvid a- eller B-konfiguration väljs på glykosidbindningen mellan glykosylgruppen och aglykonen i acceptorsubstansen, 'och att glykokonjugatderivatet separeras från reak- tionsblandningen.

Vid sättet enligt föreliggande uppfinning använder man som acceptorsubstans en glykosid av en mono- eller oligosackarid eller en analog därav med formeln HOAR2, där R2 är ett glykosidiskt bundet oorganiskt eller organiskt ämne (R2 är en aglykon, dvs ej ett kolhydrat).

Produkten vid sättet enligt uppfinningen betecknas med DOAR2, som symboliserar föreningar av typen D(ul-X)- A(u)R2, D(a1-x)A(ß)R2, D(ß1-x)A(a)R2 och D(B1-x)A(ß)R2 (D symboliserar mono- eller oligosackarid; A symboli- serar mono- eller oligosackarid eller analog därav; X betecknar 2, 3, 4 eller 6; u respektive B betecknar konfiguration på den 0-glykosidiska bindningen mellan D och A samt på den O-, N- S- eller C-glykosidiska bindningen mellan A och R2). Exempel på substanser av denna typ är Gal(al-3)Gal(a)-0Me, Ga1(al-3)Ga1(ß)-0Me, _GlcNAc(Bl-6)Man(d)-OMe och Man(al-2)Man(al-2)Man(a)-OMe (förkortningarna följer IUPAC-IUB:s rekommendationer för förkortad oligosackaridterminologi, J. Biol. Chem., *Volym 257, S. 3347-3354 (1982)).

Reaktionsschemana för omvänd hydrolys respektive transglykosidering blir då för sättet enligt uppfin- ningen följande: En .

DOH + HOAR24:_-P DOAR Omvänd hydrolys: + H O (3) 2 2 451 849 10 15' 20 25 30' 35 6, _ROH - + HOAR2 Transglykosidering: DOR + EH\ * E.D;=====?D0AR2 + EH H20 (4) DOH + EH Skillnaden mellan de tidigare reaktionerna och reaktionerna enligt uppfinningen är att man i reaktio- nerna (l) och (2) som acceptorsubstanser använt substan- ser av typen HOA, dvs substanser som ej är derivatise- rade i 1-position, medan man vid föreliggande uppfin- ning använder acceptorsubstanser som är derivatiserade i 1-position, dvs av typen HOAR2. Den tidigare pro- dukten blev alltså av typen DOA, medan produkten vid _ sättet enligt uppfinningen blir av typen ÛOARZ.

Valet av acceptorsubstans är inte kritiskt för genomförande av sättet enligt uppfinningen. Donator- substansen väljs med hänsyn till önskemälen i den aktuella situationen, främst under beaktande av vilken oligosackarid som skall syntetiseras och om syntesen önskas göras med omvänd hydrolys eller med transglyko- sidering. Donatorn kan följaktligen vara en mono- eller oligosackarid som är oderivatiserad eller som är derivatiserad i sin reducerande ände med ett glyko- sidiskt bundet organiskt ämne. Det organiska ämnet kan vara alifatiskt, aromatiskt, heterocykliskt, etc, och kan vara glykosidiskt bundet till D:s 1-position (DOR, jämför ekv. 2) i_Q- eller B-konfiguration. Som exempel på derivatiserade donatorsubstanser som kan användas enligt uppfinningen kan nämnas metyl-, etyl-, fenyl- och nitrofenylglykosider. Ett stort antal dona- torsubstanser av denna typ finns kommersiellt till- gängliga. Om sä icke är fallet är de lätta att synte- tisera med organisk eller enzymatisk syntes och be- gränsar därför inte användningen av uppfinningen.

Exempel på oligosackarider som kan användas är laktos och chitobios. I litteraturen finns väl beskrivet 10 15 20 25 »304 35 451 849 7 olika glykosidaser med aktivitet gentemot olika typer av alkyl- eller arylglykosider. Fackmannen kan därför utan svårighet välja lämplig grupp R med hänsyn till behoven i den enskilda situationen.

Enzymet väljs med hänsyn till önskemålen i den aktuella situationen, främst under beaktande av vilken oligosackarid som skall syntetiseras. Till exempel krävs ett a-glykosidas vid syntes av en d-glykosidisk bindning och ett B-glykosidas vid syntes av en 8-glyko- sidisk bindning. Föredragna enzymer är endoglykosidaser och exoglykosidaser ur gruppen EC 3.2. Exempel på enzymer som kan komma till användning vid uppfinningen är följande d- och B-glykosidaser: D-glukosidaser, D-galaktosidaser, L-fukosidaser, neuraminidaser, N-ace- tyl-D-glukosaminidaser, N-acetyl-D-galaktosaminidaser, xylosidaser och övriga glykosidaser i gruppen EC 3.2.

(Enzyme Nomenclature, Academic Press, s. 1-606, New York (1979): Enzymes, tredje upplagan, Dixon et al, (l979)ï.

Renhetsgraden hos det använda enzymet är inte Longman, kritisk. Enzymet kan användas in situ eller efter isolering helt eller delvis ur sin naturliga biologiska miljö. Intakta eller frystorkade celler såväl som mer eller mindre renade enzymer kan användas. Enzymet kan föreligga i kristallin form eller vara inneslutet i miceller. Ett mycket stort antal glykosidaser från olika typer av celler finns kommersiellt tillgängliga.

För övrigt är den biokemiska litteraturen mycket rik på detaljerad information om rening och isolering av.intressanta glykosidaser.

Enzymerna kan användas i löslig form eller vara immobiliserade genom utfällning, adsorption, inneslut- ning, kelering eller kovalent bindning till en fast fas, såsom ett polymert ämne, eller derivat därav som är olösligt i protiska eller aprotiska lösningsmedel (Methods in Enzymology, volym 44, Academic Press, b 10 15 20 25 30 35 451 849 8 (1976)). Vilken form som väljs är inte kritisk för uppfinningen. Om enzymet används i löslig form kan det först ha kemiskt modifierats på ett lämpligt sätt för att t ex öka stabiliteten gentemot förhöjda tempe- raturer eller organiska kosolventer. Enzym immobilise- *rat till en olöslig polymer omfattande t ex agaros, cellulosa, hydroxietylakrylat, glas, silika etc, är lätt att separera från produktblandningen och enzymet kan därmed återanvändas. Som extra fördel erhålls ofta en viss stabilisering gentemot förhöjda tempe- _raturer och organiska kosolventer. _ Valet av acceptorsubstans avgörs av vilken oligo- sackarid som man önskar syntetisera. Samma typer av 'monosackarider som ingår i donatorsubstansen kan ingå i acceptorn, dvs företrädesvis någon eller några av följande: Glc, Gal, Man, Fuc, Xyl, Ara, GlcNAc, Ga1NAc och NeuAc (förkortningarna enligt IUPAC-IUB:s-rekom- mendationer, se ovan). Acceptorsubstansen skall vara derivatiserad genom minst en i 1-position O-, N-, C- eller S-glykosidiskt bunden aglykon.

Dessutom kan enligt uppfinningen acceptorsubstan- sen även utgöras av sackarider som derivatiserats i någon eller nâgra positioner utöver 1-positionen.

En sådan derivatisering kan t ex bestå i att någon eller några hydroxylgrupper ersatts med väte eller någon organisk grupp. Exempel på en sådan acceptor- substans är p-nitrofenyl-2-deoxi-a-D-galaktopyranosid.

En annan viktig typ av sackaridderivat utgörs av substan- ser där ringsyret (dvs C-5-syre i hexoser), ersatts med kväve, svavel, etc. Exempel på ett sådant derivat 'är glukosanalogen moranolin, där C-5-syre ersatts med kväve. Oligosackaridanaloger som är effektiva inhibi- torer gentemot enzymer eller kolhydratbindande proteiner kan på detta sätt syntetiseras enligt uppfinningen.

Aglykonen R2 i HOAR2 kan vara av varierande typ och valet avgörs av behoven och önskemålen i den aktuella situationen. R2 kan utgöras av en oorganisk substans, gu. 10 15 20 25 30 35 451849 9 men framförallt kan R2 utgöras av ett organiskt ämne av varierande slag (alifatiskt, aromatiskt, hetero- cykliskt, heteroaromatiskt eller variationer därav).

R2 kan vara O-, N-, Sr eller C-glykosidiskt bundet till acceptorsackariden. Som exempel på lämpliga orga* niska aglykoner kan nämnas metyl-, etyl-, fenyl-, p-nitrofenyl-, o-nitrofenyl eller 2-bromoetylgrupper.

Produkter som erhållits med alkylglykosider (t ex metyl-, oktyl-, dodecylglykosider) som acceptorsubstan- 'ser kan användas som inhibitorer vid agglutinaticns- “tester eller vid affinitetskromatografi, utnyttjas vid inhibitionsbaserad terapi eller för läkemedels- targeting, utnyttjas som byggstenar för fortsatt enzy- matisk eller organisk syntes, etc. Nitrofenylglykosider .kan enkelt reduceras med t ex Pd/C till aminofenyl- glykosider, som kan kopplas kovalent till olika poly- merer (dextran, polyetylenglykol, agaros, cellulosa, silika, etc) samt till peptider, proteiner, enzymer, lipider eller analoger därav, etc (Methods in Enzymo- iogy, Academic Press, volymerna 34, 44, so och 104).

Dessutom kan aminogruppen lätt omvandlas till ett flertal andra reaktiva grupper, såsom isotiocyanat, diazo, N-bromoacetat, etc. Andra grupper som direkt eller efter kemisk modifiering kan användas som s k spacerarm lMethods in Enzymology, volym 34, Academic Press) p.s.s. som beskrivits ovan för aminofenylgruppen och som kan användas som aglykon (R2-grupp) enligt uppfinningen är t ex 2-bromoetyl-, 2-(2-karbometoxi- etyltio)etyl-, 2-aminoetyl- och 6-aminohexylgrupper eller derivat därav. Som acceptorsubstanser kan även användas glykosider med polymeriserbar aglykon, t ex 2-hydroxietylmetakrylat. Som exempel på N-glykosidiskt bunden aglykon kan nämnas 6-aminokapronsytaamid (~NHCO(CH2)NH2).

Andra aglykoner av speciellt intresse är aminosyror (serin, treonin, hydroxiprolin, hydroxilysin, asparagin, etc), peptider, lipider samt derivat eller analoger '451 849 10 15 20 25 30 35 - 10 till substanser inom dessa tre grupper. Aminosyra- och peptidglykosiderna kan vara skyddade på sina amino- och/eller på sina karboxylfunktioner med gängse grupper som används inom peptidsyntes (FMOC, CBZ, BOC, etc).

Med dessa agykoner kan enligt uppfinningen fragment eller analoger av glykokonjugat syntetiseras.

Som nämnts ovan är en viktig fördel med-syntesme- toden enligt uppfinningen att man kan styra syntesen så att den önskade positionen på acceptorsubstansen blir glykosidiskt substituerad. Den önskade oligosacka- ridisomeren bildas därmed i en större omfattning än vad som varit fallet med tidigare kända metoder. En annan fördel är att samma enzym kan katalysera syntesen av olika isomerer i olika omfattning beroende pâ val av aglykon och konfigurationen på dess glykosidiska 'bindning till sackariddelen i acceptorsubstansen.

Reningen av produkterna kan också avsevärt under- lättas i-de flesta fall eftersom man med sättet enligt uppfinningen slipper problemet med isomerisering på det anomera kolet i produktens reducerande ände. -Ännu en fördel är att intressanta finkemikalier kan syntetiseras med metoden enligt uppfinningen.

Substanser som direkt eller efter kemisk modifiering kan användas för t ex polymerisering, för immobilisering _till fasta bärare eller för bindning till enzymer eller proteiner kan erhållas. Syntesen av glykopeptider och glykolipider och analoger därav kan också avsevärt under- lättas med sättet enligt uppfinningen, eftersom aminosyra-, peptid- eller lipidderivat kan användas som aglykoner.

Syntesmetoden enligt uppfinningen kan utföras vid mycket skilda betingelser vad gäller exempelvis temperatur, pH-värde, buffert och koncentration av reaktanter. Olika kosolventer (N,N-dimetylformamid, acetonitril, dimetylsulfoxid, dioxan, pyridin, metanol, etanol, etylenglykol, etc) kan användas och i varierande koncentration tillsammans med vatten. Dessutom kan reaktionerna utföras i tvåfassystem, vatten-organiskt 10 15 20 25 30 35 45.1 849 ill lösningsmedel (cyklohexan, kloroform, metylenklorid, etc). Énzymet kan då vara inneslutet i omvända miceller (P. Luisi, Angew. Chem., volym 97, s. 449-60, (1985).

Reaktionerna kan också utföras i rent organiskt lös- ningsmedel med utfällt enzym (Kazandjian et al, J. 7 Amer. Chem. Soc., volym l07, (1985)). Reaktionsbetingel- serna är inte kritiska utan väljs främst med utgångs- punkt från de i den aktuella syntesen ingående reak- tanternas egenskaper och från praktiska lämplighetsskäl.

Som exempel kan nämnas att det med enzymer ofta är lämpligt att arbeta vid rumstemperatur och vid fallet vattenhaltigt medium med ett pH-värde som ligger i 'intervallet 4-ll.

Organiska kosolventer kan användas för att mini- mera hydrolysreaktioner. Av samma anledning kan två- fassystem användas.

Temperaturen kan likaså varieras för att påverka produktutbytet och enzymets stabilitet.

Syntesmetoden enligt uppfinningen är generellt tillämpbar för syntes av oligosackaridsekvenser, varför donatorsubstans och acceptorsubstans i princip kan innehålla godtyckliga mono- eller oligosackarider.

Av intresse är såsom nämnts i inledningen i främsta hand de mono- eller oligosackarider som ingår i glyko- proteiner eller glykolipider (Biology of Carbohydrates, volym 2 (1984), S. Hakomori, Ann. Rev. Biochem., volym 50, s. 733-64 (1981)).

Speciellt intressanta är dessa strukturers minsta fragment som är tillräckliga för att överföra biologisk information. Som exempel på viktiga sådana strukturer kan nämnas blodgruppsdeterminanterna, specifika recepto- rer för mikroorganismer (Gal(al-3)Galu-, E coli K88; GlcNac(ßl-3)GalB-, S. pneumoniae; Gal(ul-4)Galß~, p-fimbrierade E coli; Galßl-4GlcNAcB, S. saprofyticus; etc), differentieringsantigenerna i, I, CO 514, 38.13, etc (se tabell l och 2 i översiktsartikel av T. Éeizi, Nature, volym 314, s. 53-57 (1985)). 451 849 10 15 20 25 30 35 12 _ Några exempel på_hur uppfinningen kan komma till praktiskt utförande beskrivs i de efterföljande exemplen, som dock på intet sätt_är avsedda att begränsa uppfin- ningens omfattning (förkortningarna i exemplen följer IUPAC-IUB:s rekommendationer, J. Biol..Öhem., volym 257, s. 3347-3354 (1982)).

EXEMPEL 1 a i Syntes av Gal(dl-3)Gal(a)-0Me (metyl-3-O-a-D-galgktg: pyraposyl-a-D-galaktopyranosid) 1,8 g p-nitrofenyl-a-D-galaktopyranosid (Gal(u)- ~OPhNO2-p) och 18 g l-0-metyl-d-D-galaktopyranosid (Ga1(a)-OMe) löstes i 110 ml 0,05 M vattenlösning _ av natriumfosfat (pH 6,5) och 40 ml N,N-dimetylformamid. d-galaktosidas (a-D-galaktosid galaktohydrolas; EC 3.2.l.22; 0,2 ml; 10 enheter Boehringer) från kaffeböna tillsattes. Efter 7 dygn vid rumstemperatur avbröts reaktionen och produkten renades med pelarkromatografi (silika) och acetylerades med ättiksyraanhydrid och pyridin. Efter ytterligare ett pelarkromatografiskt steg och omkristallisation analyserades produkten med HPLC, 200 MHz NMR (IH och 13C) och med metylerings- analys. Utbytet av Gal(dl-3)Gal(m)-OMe var 600 mg eller 25% räknat på satsad mängd Gal(a)-0PhNO2-p.

Mindre än 40 mg (NMR, HPLC) bildades av en oidentifierad isomer produkt (förmodligen Gal(dl-6)-Ga1(u)*0Me) som avlägsnades efter acetyleringssteget med pelar- kromatografi (silika).

EXEMPEL 2 §ygtes av Gal(a1-3)Gal(ß)~OMe_Qgh Gal(dl-6)Ga1(B)-OMe 0,6 g Gal(d)-OPhNO2-p och 4 g Gal(B)~OMe löstes i 22 ml 0,05 M vattenlösning av natriumfosfat (pH 6,5) _och 9 ml N,N-dimetylformamid. a-galaktosidas från kaffeböna (EC 3.2.l.22; 0,2 ml; 10 enheter) tillsattes och reaktionen tilläts gå i rumstemperatur under 90 h.

Produkterna renades med pelarkromatografi p.s.s. som beskrivits i Exempel 1. Acetylerade produkter ana- lyserades med 200 MHz NMR (IH, 13C). Utbytet av 10 15 20 25 30 35 451_849 l3 Ga1(ul-6)Gal(ß)-OMe var 125 mg och av Gal(al-3)Gal(ß)fOMe 65 mg eller 16 respektive 8%.av den satsade mängden Gal (a ) -oPhuoz-p. I EXEMPEL 3 §x§§§§_ë!_§§ll§l:Zl§§ll§l:Q2ë§92:2_9s§_§§ll§l:âl§ell@l: :Qanusgæ ' _ s 0,9 g Gal(a)-OPhNO2-p löstes i 24 ml 0,05 M vatten-' lösning av natriumfosfat (pH 6,5) och 8 ml N,N-dimety1- 'formamid. fx-galaktosldas från kaffeböna (Ec-3.2.1.22; 0,2 ml; 10 enheter) tillsattes och reaktionen fick gå i 38 h vid rumstemperatur. Produkterna separerades med pelarkromatografi (silika, Sephadex G10) och analy- serades med UV (305 nm), 200 MHz NMR (IH, l3C) och med metyleringsanalys. Utbytet av Gal(a1-3)Ga1(q)+OPhN02-p var 150 mg och av Gal(al-2)Gal(a)-0PhN02-p 25 mg, dvs 10 respektive l,7% av satsad mängd Gal(a)-0pNP.

"EXEMPEL 4 êxnts§_ë!_§§ll@l:ålêëllsl:9Eh§92:2_m§ë_@:9§laëseäiëës â:êa_ë§2§:¶¿llu§_§i¶e: Syntesen utfördes p.sJs. som beskrivits i Exempel 3 men med d-galaktosidas (EC 3.2.1.22) från Aspergillus niger. I detta fall erhölls 40 mg Gal(al-3)Ga1(a)-OPhN02-p och 4 mg av en isomer produkt (förmodligen (a1-2)-iso- meren) samt spår (ca l mg) av ytterligare en isomer produkt. Dessa isomerer separerades i Sephadex G10- -steget. '* EXEMPEL 5 _ §ygt§§_gy Man(ul-2)Man(gl;0PhN02-Q (pFnitrofenyl-2-0-g: ZPIEÉEEQEYEÉÉQÉYÄIQIQIEÉEEQPYEÉEQÉÉÉÄ 0,63 g Man(d)fOPhN02-p löstes i 33 ml 0,05 M natrium- fosfat (pH 6,5) med 10 pM ZnCl2. 10 ml N,N-dimety1- formamid tillsattes. a-mannosidas (u-D-mannosid manno- hydrolas; EC 3.2.1.24; 0,3 ml; 10 enheter, Boehringer- -Mannheim) från Canavalia ensiformis tillsattes och reaktionen fick gå i 6 h i rumstemperatur och 36 h i kylrum (4°C). Produkten isolerades med pelarkromato- grafi (silikagel) och analyserades med NMR och mety- .451 849 10 15 20 25 30 35 14 leringsanalys. Utbytet av Man(ul-2)Man(a)-0PhNO2-p var 36 mg. Produkten var mer än 95% ren enligt NMR och övriga isomerer bildades i försumbar omfattning.

ExEMPEL 6 i ' ' Syntes av Man(dl-2)Man(a)-0Me (metyl-2-0-a-D-manno- pyranosyl-a-D-mannopyranosid) och av Man(al-6)Man(a)-0Me (metyl-6-0-G-D-manfl°Pyran°§2l:e:9:man§922§§aé§i§l 0,6 g p-nitrofenyl-a-D-mannopyranosid (Man(u)- -OPhN02-p och 6 g l-O-metyl-a-D-mannopyranosid (Man(u)- -OMe) löstes i 38 ml 0,05 M vattenlösning av natriumfos- fat (pH 6,5) med 10 pm »znclzl mn-aimeiylformamia tillsattes. u-mannosidas (EC 3.2.l.24; 0,3 ml; 15 enheter) från Canavalia ensiformis tillsattes och reaktionen fick gå i rumstemperatur i 14 h. Produkterna renades pà silikapelare analogt med synteserna i Exempel 1 och 2. Produkterna analyserades med NMR, metyle- ringsanalys och HPLC. 180 mg av Man(dl-2)Man(o)-OMe och 28 mg av Man(u1-6)Man(u)*OMe erhölls, dvs 23 res- pektive 4% av satsad mängd Man(a)-OPhNO2-p. " EXEMPEL 7_ .

Syntes av Man(al-2)Man(a)-0EtBr (2~bromoetyl-2*0-a- :æëaaeeyäëae§yl:¶:9:@§a§92xæëa9§iël 0,9 g Man(a)-0PhN02-p och 2,7 g 2-bromoetyl-u-D- g-mannopyranosid (Man(a)-OEtBr) löstes i 20 ml 0,05 M vattenlösning av natriumfosfat (pH 6,5). 7 ml N,N-di- metylformamid tillsattes. u-mannosidas (EC 3.2.l.24; 0,3 ml; 15 enheter) från Canavalia ensiformis tillsattes 'och reaktionen fick gå vid rumstemperatur i 72 h.

Produkten renades analogt med vad som beskrivits i Exempel 6. Produkten analyserades med NMR (200 MHz; IH, 13C). 200 mg Man(al-2)Man(a)-OEtBr erhölls och ca 30 mg av en oidentifierad isomer produkt (troligen (dl-6)isomeren).

EXEMPEL 8 §x§§s§_ë2_MaaLel:2lM§alel:êlMaaLel:9Me Denna substans bildades som en sidoprodukt vid Vstorskalig syntes av Man(al-2)Man(a)-0Me och Man(al-6)Man- f» f:- 10 15 20 25 4s1cs49 15 - (u)-OMe_från 20 g Man(a)-OPhNO2fp och 45 g Man(u)-0Me med 1 ml (50 enheter) av a-mannosidas från Canavalia ensiformis (EC 3.2.l.24) och betingelser i övrigt enligt Exempel 6. Produkten separerades från disacka- ridfraktionerna med pelarkromatografí (Sephadex G10, silika). Den acetylerade produkten separerades från isomera produkter (ca 35% av totalmängden) med pelar- kromatografi (silika). 250 mg acetylerad Man(al-2)- -Man(al-2)Man(u)-OMe erhöl1s§ Produkten analyserades med NMR (200 MHz: IH, 13 EÄEMPEL 9 _ ' . §yntes av Gal(ßl43)§§l(ß)-OMe (m§§yl-3-O-B-D-ga1akto- C) och med metyleringsanalys.

. Bxëëaeêxlztê:sëlëlsëeeyflsêaeëèël 2,7 g o-nitrofenyl-B-D-galaktopyranosid (Ga1(B)- -0PhN02-o) och 5 g Ga1(ß)~OMe löstes i 35 ml 0,05 M vattenlösning av natriumfosfat (pH 6,8) med l mM MgC12 och 10 mM merkaptoetanol. 15 ml N,N-dimetylformamid tillsattes. B-galaktosidas (B-D-galaktosid galakto- hydrolas; EC 3.2-1.23; 100 enheter, Sigma Laboratories) från Escherichia coli tillsattes och reaktionen fick gå i rumstemperatur i 24 h. Produkterna separerades med pelarkromatografi (silika och Sephadex G10). Efter acetylering och kromatografi på silikapelare erhölls 1,3 g acetylerad Gal(ß1-3)Ga1(ß)-0Me och 160 mg Gal(ß1-6)Ga1(6)~OMe (acetylerad). Analys med 200 MHz _NMm (IH. 13c).

Claims (22)

10 15 20 25 30 451 849 16 PATENTKRAV

1. '1. Sätt att styra regioselektiviteten för den bildade glykosidbindníngen mellan glykosyldonator och glykosylacceptor vid enzymatisk framställning av glykokonjugatderivat genom omvând.hydrolys eller transglykosidering, k ä n n e tye c k n a t av att en donatorsubstans, som utgöres av en monosackarid eller oligosackarid eller en glykosid av en monosackarid eller oligosackarid, bringas att reagera med en accep- torsubstans, som är en O-, N-, C- eller S-glykosid, bestående av en monosackarid, oligosackarid eller en sackaridanalog och åtminstone en i 1-position O-, N-, C- eller S-glykosidiskt bunden aglykon, i närvaro av ett glykosidas, varvid a- eller B-konfiguration väljs på glykosidbindningen mellan glykosylgruppen och aglykonen i acceptorsubstansen och att glykokon- jugatderivatet separeras från reaktionsblandningen.

2. "2. Sätt enligt krav l, av att i donator- och acceptorsubstansens kolhydratdel k å n n e.t e c k n a t »ingår en eller flera av monosackariderna L-fukos, D-galaktos, D-mannos, N~acetylneuraminsyra, N-acetyl- -D-galaktosamin och N-acetyl-D-glükosamin.

3. Sätt enligt krav 1, av att i acceptorsubstansen ingår en analog av någon k ä n n e t e c k-n a t av monosackariderna L-fukos, D-galaktos, D-mannos, N-acetyl-D-galaktosamin och N-acetyl-D-glukosamin.

4. Sätt enligt ett eller flera av kraven l-3, k ä n n e t e c k n a t av att aglykonen är ett alifa- tiskt eller aromatiskt ämne. _

5. Sätt enligt krav 4, av att aglykonen utgörs av en glykosidiskt bunden k ä n n e t e c k n a t metyl-, etyl-, fenyl-, p-nitrofenyl-, o-nitrofenyl- eller 2-bromoetylgrupp.

6. Sätt enligt ett eller flera av kraven 1-4, k ä n n e t e c k n a t av att aglykonen är ett orga- S451 849 17 niskt ämne som direkt eller efter kemisk modifiering ' 'kan bindas kovalent till lipider, peptider, proteiner, 10 15 20 25 39 35 enzymer eller till bärarmaterial som används i affi- nitetsfördelningssystem, vid affinitetskromatografi, vid diagnostik eller terani. S

7. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att aglykonen är polymeriserbar. _

8. Sätt enligt ett eller flera av kraven 1-6, k ä n n e t e cnk n a t av att aglykonen är en amino- syra, peptid, lipid eller ett derivat eller en analog därav. i Ä

9. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att donatorn år laktos eller chitobios.

10. Sätt enligt ett eller flera av kraven 1F8, k ä n n e t e c k n a t av att donatorsubstansen är en mono- eller oligosackarid med ett a- eller B-glyko- sidiskt bundet organiskt ämne. '

11. ll. Sätt enligt krav 10, Ik ä n n e t e c k n a t av att det organiska ämnet är en metyl-, etyl-, fenyl- eeller nitrofenylgrupp.

12. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att enzymet är ett endoglykosidas och/eller ett exoglykosidas till- hörande gruppen EC 3.2. _

13. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att enzymet är ett galaktosidas, mannosidas eller ett fukosidas.

14. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att det använda enzymet är termostabilt.

15. Sätt enligt ett eller flera_av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att enzymet används in situ eller efter att först ha isolerats helt eller delvis fràn sin naturliga biologiska miljö. 10 15 20 25 30 451- 849 . 18

16. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a~t _av att enzymet är i kristallin form.

17. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, -k ä n n e t e c k n a t av att enzymet är inneslutet i miceller.

18. Sätt enligt ett eller flera av de föregående' _kraven, k ä n n e t e c k n a t av att enzymet är

19. I kovalent modifierat med ett organiskt ämne. g 19. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att enzymet är immobiliserat via utfällning, adsorption, inneslut- ning, kelering eller kovalent bindning, till ett poly- mert ämne, eller ett derivat därav, som är olösligt i protiska eller aprotiska lösningsmedel.

20. -'20. Sätt enligt krav l9, k ä n n e t e c k n a t av att det polymera ämnet utgörs av agaros, cellulosa eller silika. I' _

21. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att ett glyko- konjugatderivat med biospecifik affinitet till ett annat ämne syntetiseras och isoleras.

22. Användning av en produkt erhållen enligt krav l direkt eller efter kemisk modifiering, för affinitetskromatografi, affinitetsfördelning i tváfas- system, diagnostik, terapi, immunisering, immunologisk karakterisering, ändring av enzymers/proteiners egen- skaper, mätning av enzymaktivitet, påverkan av köns- celler eller modifiering av försvars/tillväxtmekanismer hos växter. <1-,