SK282649B6 - Protilátka proti CD44v6, hybridómová bunková línia, molekula protilátky a jej použitie - Google Patents

Protilátka proti CD44v6, hybridómová bunková línia, molekula protilátky a jej použitie Download PDF

Info

Publication number
SK282649B6
SK282649B6 SK1548-96A SK154896A SK282649B6 SK 282649 B6 SK282649 B6 SK 282649B6 SK 154896 A SK154896 A SK 154896A SK 282649 B6 SK282649 B6 SK 282649B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antibody
vff
antibodies
binding
cell line
Prior art date
Application number
SK1548-96A
Other languages
English (en)
Other versions
SK154896A3 (en
Inventor
G�Nther R. Adolf
Erik Patzelt
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19944431297 external-priority patent/DE4431297A1/de
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh, Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh
Publication of SK154896A3 publication Critical patent/SK154896A3/sk
Publication of SK282649B6 publication Critical patent/SK282649B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70585—CD44
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2884—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD44
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Je opísaná protilátka účinná proti epitopu, kódovanému variantným exónom v6 génu CD44, produkovaná hybridómovou bunkovou líniou DSM ACC2174, ktorá je vhodná na použitie v terapii, v diagnostických postupoch, ako je adsorbentová imunoanalýza alebo rádioimunoanalýza a na diagnostiku nádorov.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka monoklonálnej protilátky proti epitopu, ktorý je kódovaný variantným exónom v6 génu CD44, od nej odvodených proti látkových molekúl a použitia uvedenej protilátky v diagnostike a terapii.
Doterajší stav techniky
Nedávno sa ukázalo, že expresia variantov povrchových glykoproteínov CD44 je potrebná a postačujúca na uvoľnenie takzvaného spontánneho metastázového správania sa tak nemetastázovaných pankreasových-adenokarcinómových bunkových línií krýs, ako aj nemetastázovaných fibrosarkómových bunkových línií krýs (Giinthert et al., 1991). Zatiaľ čo najmenšie CD44-izoformy a štandardné formy CD44s (alebo CD44std) sa rovnomerne exprimujú v celom rade rôznych tkanív vrátane epitelových buniek, určité Stepné varianty CD44 (CD44v, CD44var) sa exprimujú iba v jednej podskupine epitelových buniek. Uvedené CD44 varianty sa môžu pripravovať alternatívnym štiepením tak, že sa z CD44s celkom vystrihnú sekvencie 10 exónov (vl až v 10), ktoré môžu byť vo väčších variantoch prítomné v rozličných kombináciách (Screaton et al., 1992; Tôlget al., 1993; Hofmann et al., 1991). Varianty sa rozlišujú tým, že na jednom určitom mieste vonkajšej bunkovej časti proteínu sú vložené rozdielne aminokyselinové sekvencie. Takéto varianty možno nachádzať v rôznych bunkách ľudských nádorov a v ľudských nádorových tkanivách. Takto sa zistila expresia CD44-variantov v priebehu kolorektálnej karcinogenézy (Heider et al., 1993a). Expresia CD44-variantov chýba v normálnom ľudskom trámcovom epiteli a iba slabá expresia je zistiteľná v proliferujúcich kryptových bunkách. V neskorších štádiách šírenia nádorov, napríklad adenokarcinómov, všetky exprimujú malígne zvrhnuté varianty' CD44. Silnú tkanivovú expresiu variantov CD44 možno tiež zistiť v agresívnom ne-Hodgkinovom lymfóne (Koopman et al., 1993).
Exón v6 má osobitnú úlohu najmä pri metastázovom šírení (Rudy et al., 1993). Na zvieracom modeli môže protilátka proti vó-špecifickému epitopu brzdiť kolónie metastázujúcich buniek a rast metastáz. (Seiter et al., 1993). Pri kolónových nádoroch koreluje expresia v-6 s rozvíjaním nádoru. Pri žalúdočných nádoroch je expresia v-6 dôležitým diagnostickým znakom pri diferencovaní medzi nádormi intestinálneho typu a nádormi difúzneho typu (Heider et al., 1993b), V naposledy uvedených dvoch prácach sa expresia v-6 stanovovala pomocou protilátok proti vóšpecifickému epitopu.
Monoklonálna protilátka proti epitopu, ktorý je kódovaný exónom v-6 je v súčasnom stave techniky známa (Hofmann et al., 1991; Wiclenga et al., 1993). Z hľadiska vysokých potenciálnych výťažkov, ktoré tieto protilátky v diagnostike a terapii môžu mať, vzniká vysoká potreba protilátok, ktoré by mali zlepšené vlastnosti.
Podstata vynálezu
Úlohou tohto vynálezu je príprava protilátky, ktorá by mala zlepšené vlastnosti v porovnaní so známymi v6špecifickými protilátkami.
Uvedená úloha sa týmto vynálezom vyriešila. Podstatu vynálezu tvorí protilátka s označením VFF-18. Podstatu vynálezu tvorí aj hybridómová bunková línia, ktorá uvedenú protilátku vylučuje a ktorá je uložená v zbierke pod čís lom DSM ACC2174 u DSM - Deutsche Sammlung fur Mikroorganismem und Zellkulturen GmbH, Mescheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Spolková republika Nemecko.
V ďalšom texte sa výrazom protilátka alebo molekula protilátky nerozumie iba úplný imunoglobulín, ale z pohľadu väzbovej špecifickosti a afinity aj ekvivalentné látky, ako sú opisované deriváty protilátky a rekombinantné molekuly protilátky.
Protilátka VFF-18 podľa tohto vynálezu sa pripraví spôsobom, aký sa uvádza v príklade 1. Protilátka sa môže ďalej získať z uloženej hybridómovej bunkovej línie. Odborníkom v danej oblasti je zrejmá možná príprava derivátov protilátky podľa tohto vynálezu, alebo - vychádzajúc z výsledkov analýzy sekvencií uvedených protilátok, a/alebo použitím hybridómovej bunkovej línie, ktorá tieto protilátky produkuje - ako získať rekombinantné molekuly protilátky s rovnakým idiotypom, to znamená molekuly protilátky, v ktorých sa nachádzajú v oblastiach určujúcich antigénové väzbové miesto („complementarity-determining regions“, CDR) rovnaké sekvencie aminokyselín ako v protilátke VFF-18. Uvedené deriváty a rekombinantné protilátkové molekuly sú preto výslovne zahrnuté do tohto patentu.
Z úplného imunoglobulínu protilátky VFF-18 sa napríklad môžu pripraviť fragmenty Fab- alebo F(ab’)2, alebo ďalšie fragmenty (Kreitman et al., 1993). Na využitie v diagnostických postupoch sa VVF-18 protilátkové molekuly, ich fragmenty alebo rekombinantné molekuly protilátky s rovnakým idiotypom môžu viazať napríklad s rádioaktívnym izotopom 131I, ’ln, 99mTc alebo s rádioaktívnymi zlúčeninami (Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), enzýmami, ako je peroxidáza alebo alkalická fosfatáza (Catty et Raykundalia, 1989), s fluorescenčnými farbivami (Johnson, 1989) alebo molekulami biotínu (Guesdon et al., 1979). Na terapeutické použitie sa VFF-18 alebo odvodené molekuly protilátky VVF-18 môžu viazať s toxínmi (Vitetta et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Thcuer et al., 1993), cytostatikami (Schrappe et al., 1992), pro-liečivami (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989) alebo s rádioaktívnymi látkami. Protilátka sa ďalej môže viazať s cytokínom alebo iným imunomodulujúcim polypeptidom, napríklad s nádorovým nekróznym faktorom alebo interleukínom -2.
Odborník v danej oblasti je po analýze sekvencie aminokyselín protilátky VFF-18 a/alebo použitím hybridómovej bunkovej línie, ktorá uvedenú protilátku produkuje, osobitne ktorá obsahuje genetickú informáciu, schopný pripraviť rekombinantné protilátkové molekuly rovnakého idiotypu, ako je VFF-18. Uvedené rekombinantné molekuly môžu napríklad byť humanizované protilátky (Shin et al., 1989; Gtissov a Seeman, 1991), bišpecifické protilátky (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989), jednoreťazcové protilátky („single-chain-antibody“, scFv, Johnson a Bird, 1991), úplný alebo fragmentovaný imunoglobulín (Coloma et al., 1992; Nesbit et al., 1992, Barbas et al., 1992), alebo spôsobom „miešania“ reťazcov („chain-shuffling“) pripravené protilátky (Winter et al., 1994). Humanizovaná protilátka sa môže pripraviť napríklad CDR-štepením (EP 0239400). Môžu sa tiež modifikovať rámcové oblasti (EP 0519596). Na humanizovanie protilátok sa v súčasnosti môžu využiť spôsoby, ako je PCR (pozri napríklad EP 0368684; EP 0438310; WO 9207075) alebo počítačové modelovanie (pozri napríklad WO 9222653). Môžu sa pripraviť tiež fuzované proteíny, napríklad jednoreťazcová („single-chain“) protilátka/toxínom fúzovaný proteín (Cha udhary et al., 1990; Friedman et al., 1993). Uvedené molekuly protilátky sú preto tiež zahrnuté do vynálezu.
Odborníkom skúseným v danej oblasti je tiež zrejmé, ako získať presný epitop od VFF-18 a ako pripraviť ekvivalentnú protilátku s rovnakou väzbovou špecifickosťou. Môže sa to vykonať napríklad štúdiom väzby peptidu, a ako sa objasňuje v príklade 2, iba zmenou peptidu Hul. Taká protilátka sa tiež zahŕňa do tohto vynálezu.
Ďalší aspekt tohto vynálezu je použitie VFF-18 alebo od VFF-18 odvodených alebo ekvivalentných molekúl protilátky v diagnostike a v terapii.
Diagnostické postupy môžu byť známe diagnostické spôsoby s využitím molekúl protilátky podľa tohto vynálezu, napríklad enzýmová imunoadsorbentová analýza (ELISA, Catty a Raykundalia, 1989), rádioimunoanalýza (Catty a Murphy, 1989), imunohistochemické postupy (Heider et al., 1993b), alebo imunopijakovanie („Westem blotting“). Uvedené postupy sa môžu účelne vykonávať s tkanivami odobratými z tela alebo s telovým tekutinami, napríklad z biopsie. Vyšetrenie sa môže vykonávať na úrovni kvalitatívnej, polokvantitatívnej alebo kvantitatívnej. Uvedená protilátka alebo molekula protilátky sa pritom môže použiť napríklad spôsobom, aký sa v časti Doterajší stav techniky opísal pre inú v6-špecifickú protilátku (WO 9500851), pričom prednostné vlastnosti protilátky podľa tohto vynálezu alebo molekuly protilátky podľa tohto vynálezu znamenajú významné zlepšenie uvedených postupov.
Popri in vitro diagnostike sú molekuly protilátky podľa tohto vynálezu tiež vhodné na in vivo diagnostiku, najmä nádorov. Ak molekula protilátky je nosičom detegovateľného značkovača, potom detekcia značkovača umožňuje diagnostiku napríklad zobrazovaním nádorov in vivo („Imaging“), alebo napríklad umožňuje rádiopodporovanú chirurgiu („radioguided surgery“). Na použitie protilátok v spojení s rádioaktívnymi izotopmi na imunoscintilografiu („Imaging“) jestvuje napríklad celý rad postupov, na základe ktorých môže odborník v danej oblasti vykonať uskutočnenie tohto vynálezu (Siccardi et al., 1989; Keenan et al., 1987; Perkins a Pimm, 1992; Colcher et al., 1987; Thompson et al., 1984).
Terapeutické použitie môže byť napríklad obdobné použitiu protilátky 1.1ASML (Seiter et al., 1993). Použitie môže pritom byť buď systémové alebo topikálne, napríklad intravenózne (ako bolus alebo dlhodobá infúzia), intraperitoneálne, intramuskulárne, subkutánne alebo inými injekciami/infúziami. Možno pôsobiť tiež na jednotlivé orgány alebo údy. Protokoly podávania protilátok ( v spojení s izotopmi alebo neviazaných s inými látkami), ako je úplný imunoglobulín, fragment, rekombinantná chiméma molekula alebo iné, sú pri súčasnom stave techniky tohto odboru známe (Mulshine et al., 1991, Larson et al., 1991; Vitetta a Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992; Press et al., 1991; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears etal., 1982).
Výhodnejšie vlastnosti protilátky VFF-18 v porovnaní s inými proti-CD44v6 protilátkami sa opisujú v príkladoch 2 až 4.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Schematické znázornenie GST-CD44(v3 až v 10)- fúzových proteínov. GST = glutatión-S-transferáza z Schistosoma japonicum, v3 až vlO = variantná inzercia kcratinocytov-CD44. Šípka vyznačuje trombínové štiepne miesto.
Obrázok 2: Porovnanie sekvencie exónu v6 génu CD44 u človeka a krysy. Sekvencie peptidov Ral a Hul, na ktoré sa viažu protilátky 1.1ASML (proti-krysí CD44v6) a VFF-18 (proti-humánny CD44v6) sú zvýraznené tučnými písmenami. Rovnaké aminokyseliny sú označené hviezdičkou.
Obrázok 3: Väzba CD44v6-špecifických protilátok na syntetický peptid. Väzba protilátky na uvedený peptid sa stanovila enzýmovou imunoadsorbentovou analýzou ELISA, pri ktorej sa peptid imobilizoval a potom sa inkuboval roztokom protilátky'. Po príslušnom premývaní sa viazaná protilátka dokazovala pomocou protimyšacej-IgG-protilátky, konjugovanej s peroxidázou. (A): v prvom pokuse sa dokazovala väzba pre krysy-CD44v6 špecifickej protilátky 1.1ASML na peptid Ral (KWFEN EWQGK NPPT). (B): V ďalšom pokuse sa k Ral homológnemu peptidu z ľudskej CD44v6-sekvencie syntetizovali rôzne proti-humánneCD44v6-hybridómy, ktoré sa viazali na peptid Hul (QWFGN RWHEG YRQT). Pritom sa ukázalo, že VFF-18 sa zreteľne lepšie viaže na peptid ako zvyčajne používaná protilátka. (C): Na kvantitatívne vyhodnotenie sa uvedené pokusy opakovali s rôznymi koncentráciami čistených protilátok. Aj pri týchto pokusoch sa ukázalo, že VFF-18 má vyššiu väzbovú afinitu ako iné protilátky.
Obrázok 4; Väzba rádioaktívne značkovanej protilátky na nádorové bunky. Tri protilátky VFF-7 (anti-v6), VFF-8 (anti-v5) a VFF-18 (anti-v6) sa rádioaktívne označili pomocou N-sukcinimyl[2,3-3H]propionátom a použili sa na skúšky vzniku väzby na rôznych líniách nádorových buniek. Použili sa nasledujúce bunkové línie: CHO-CD44var: rekombinantná bunková línia škrečka (z vaječníka čínskeho škrečka); ľudské varianty CD44 (exóny v3 až vlO), exprimované na povrchu; HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, CO1.0 205: línie ľudského kolónového karcinómu; A431: línia ľudského karcinómu dlaždicového epitelu. Obrázok poukazuje na špecifickosť väzby protilátky na rôzne bunkové línie. Zatiaľ čo väzba v6-špecifickej protilátky VFF-7 a VFF-8 na rekombinantná bunkovú líniu CHO-CD44var leží v rámci rovnakého poriadku, na línii nádoru protilátka má veľmi rozdielne väzbové vlastnosti. V ojedinelých prípadoch sa pozorovala iba väzba VFF-18 a v obmedzenom rozsahu väzba VFF-8 (HT-29, CaCo, COLO 205), ri ostatných líniách buniek viazanie VFF-18 bolo zreteľne lepšie ako VFF-7.
Obrázok 5: Dôkaz rozpustných variant CD44, ktoré obsahujú exón v6 v ľudskom normálnom sére. V sendvičovej enzýmovej imunoadsorbentovej analýze ELISA sa na prevrstvenie použili tri v6-špecifické protilátky VFF-4, VFF-7 a VFF-18. Vo všetkých troch prípadoch sa použila s peroxidázou konjugovaná CD44std-špecifická protilátka (BU52, std = štandard) ako dokazovaná protilátka. Zisťoval sa signál z dvoch ľudských normálnych sér pri rôznom zriedení (skúšky (A) a (B)).
V obidvoch prípadoch možno pre VFF-18 pozorovať významne silnejší signál ako pre obidve ďalšie protilátky.
Obrázok 6: Hodnoty séra CD44 variantov, obsahujúcich v6. Dvoma rôznymi enzýmovými imunoanalýzami ELISA sa stanovil obsah rozpustného CD44var v sérach šiestich zdravých darcov. V jednej skúške sa na prevrstvenie použil VFF-7, v druhej VFF-18. Obidve protilátky rozoznávali exón v6. Ako porovnávací materiál v obidvoch prípadoch slúžili v CHO-bunkách získané rekombinantné rozpustné CD44 varianty (exón v3 až vlO). Enzýmová imunoanalýza VFF-18 mala v priemere 3,5-násobne vyššiu hodnotu ako enzýmová imunoanalýza VFF-7. To znamená, že do séra prichádzajúce rozpustné CD44var z VFF-18 sú lepšie rozoznávané ako z VFF-7.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava monoklonálnej protilátky VFF-18 Klonovanie pGEX-fuzových proteínov
Úplná variantná oblasť HPKII typov od CD44v (Hofmann et al., 1991) sa pomocou polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR) amplifikovala z ľudského keratínocytucDNA. Použili sa obidva PCR-priméry 5-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3', polohy 25 až 52, a 5'TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3 '.polohy 1013 až 984 LCL97-variantnej oblasti, ako ju opísal Hofamnn et al., obsahujúce EcoRI-rozoznávacie miesto a PCR produkt sa priamo použil na klonovanie do vektora pGEX-2T (Smith et al., 1988). Výsledný konštrukt (pGEX CD44v HPKII, v3 až vlO) kóduje pre fázový proteín s asi 70 kD, pozostávajúci z glutatión-S-transferázy z Schistosoma japonicutn a exónov v3 až vlO ľudského CD44 (obraz 1; Heider et al., 1993). Fúzový proteín sa exprimoval v
E. coli a následne sa čistil na základe afinity cez glutatiónagarózu (Smith et al., 1988).
Imunizácia a výber
Samičky Balb/c myší sa imunizovali intraperitoneálne s afinitne vyčisteným fúzovým proteínom podľa nasledujúcej schémy:
1. imunizácia: 90 pg fázového proteínu v úplnom Freundovom adjuvans
2. a 3. imunizácia: 50 pg fázového proteínu v neúplnom Freundovom adjuvans.
Imunizácie sa vykonávali s odstupom vždy 4 týždňov. 14 dní po poslednom imunizovaní sa zvieratá ešte v troch po sebe idúcich dňoch imunizovali vždy s 10 pg fázového proteínu v PBS. Na ďalší deň sa pomocou polyetylénglykolu 4000 fuzovali slezinové bunky zvieraťa, ktoré malo vyšší protilátkový titer, s P3.X63-Ag8.653 myelómovými bunkami myši. Hybridómové bunky sa selektovali na mikrotitračných platniach v prostredí HAT (Kohler a Milstein, 1975; Keamey et al., 1979).
Stanovenie protilátkového titra v séru alebo výber hybridómov sa vykonal pomocou ELISA. Pri tejto skúške sa mikrotitračné platne najprv prevrstvili s fuzovým proteínom (GST-CD44v3 až v 10) alebo iba glutatión-S-transferázou. Následne sa platne inkubovali vzorkami séra v sériovom riedení alebo prežitými hybridómami a stanovovala sa špecifická protilátka pomocou s peroxidázou konjugovaných protilátok proti imunoglobulínu myši. Hybridómy, ktoré reagovali iba s glutatión-S-transferázou sa odvrhli. Ostávajúca protilátka sa najprv charakterizovala pomocou techniky ELISA s doménošpecifickými fázovými proteínmi (exón v3, exón v5 + v6, exón v6 + v7, exón v8 + v 10) (Koopman et al., 1993). Imunochemická účinnosť uvedených protilátok sa skúšala na ľudských kožných štepoch. Protilátka VFF-18 sa identifikovala pomocou väzby na syntetický peptid Hul (QWFGNRWHEG YRQT). Sekvenciu peptidu Hul tvorí fragment ľudského CD44-exonu v6.
Analyt. tlmivý roztok: PBS (fosfátom tlmený soľný roztok) 0,5 %-ný BSA (albumín bovinného séra) 0,05 %-ný Tween 20
Substrátový roztok: Fa Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaitherburg MD, USA;
TBM peroxidázový substrát: peroxidázový roztok B (H2O2) 1:1.
Peptid (50 pg.mľ1 v prevrstvovacom tlmivom roztoku) sa cez noc imobilizoval na NUNC Maxisorp mikroplatniach (1.1ASML) alebo na Acti-A-platniach firmy Bio Products (VFF-protilátka) pri 4 °C. V prípade Acti-A-platní bol peptid na platňu viazaný kovalentne. Platne sa potom premyli s PBS/0,05 %-ný Tween, voľné adsorpčné miesta na povrchu platní sa blokovali analytickým tlmivým roztokom (1 hodinu pri teplote miestnosti) a platne sa opäť premyli s PBS/0,05 %-ným Tween 20. Platne Activ-A sa po blokovaní redukovali pomocou 10 mM bórhydridu sodného v 20 mM roztoku hydrogenuhličitanu sodného pri pH 9,0 (1 hodinu pri teplote miestnosti za pretriasania) a následne sa trikrát premyli s PBS/0,05 %-ným Tweenom 20. Potom sa do jamiek vložili hybridómy alebo roztoky protilátky v analytickom tlmivom roztoku v koncentráciách medzi 0,02 a 10 pg.mľ1 a platne sa 2 hodiny inkubovali pri teplote miestnosti na prístroji na pretriasanie platní. Potom sa platne opláchli trikrát s PBS/0,05 %-ný Tween 20. Potom sa pridala protimyšacia-IgG-protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou, 100 pl na jamku, vo vhodnom zriedení v analytickom tlmivom roztoku. Po dvojhodinovej inkubácii pri teplote miestnosti na triasačke platní sa platne trikrát premyli s PBS/0,05 %-ný Tween 20 a vyfarbili sa substrátovým roztokom. Po 10 až 15 minútach sa vyvíjanie zastavilo 2 M roztokom kyseliny sírovej a pomocou fotometra sa merala absorbancia pri 450 nm (vzťažné merania pri 690 nm).
Pri prvom pokuse sa stanovila väzba krysích CD44v6-špecifických protilátok 1.1ASML na peptid Ral (KWFEN EWQGKNPPT) - (Tabuľka 1, obrázok 3 (A)).
Tabuľka 1
1.1 ASML pg.mľ1 Absorbancia
10,00 1,652
5,00 1,702
2,50 1,658
1,25 1,595
0,63 1,502
0,31 1,211
0,16 0,971
0,08 0,686
0,04 0,458
0,02 0,270
V ďalšom pokuse sa syntetizoval k Ral homológny peptid z ľudského CD44v6 sekvencie (Hul, QWFGN RWHEG YRQT). Na Hul boli viazané rôzne protihumánne-CD44v6-protilátky. Pri tom sa zistilo, že VFF-18 má prekvapujúco vyššiu väzbovú afinitu v porovnaní s ďalšími použitými protilátkami (Tabuľka 2, obrázok 3 (B)).
Príklad 2
Väzba CD44v6-špecifických protilátok na syntetický peptid
Väzba CD44v6-špecifickej protilátky na syntetický peptid sa stanovovala pomocou enzýmovej imunoadsorbentovej analýzy ELISA.
Roztoky:
Prevrstvovací tlmivý roztok: 0,05 M roztok uhličitanu sodného, pH 9,6
Tabuľka 2
Protilátka Absorbancia
VFF-2 0,067
VFF-4 1,333
VFF-7 0,199
VFF-18 2,384
Na kvantitatívne vyhodnotenie sa na peptid Hul viazali osobitne vyčistené proti-humánne-CD44v6-protilátky v rôznych koncentráciách. Aj tu sa zreteľne ukázala lepšia väzbová afinita v porovnaní s ďalšími protilátkami (Tabuľka 3, obrázok 3 (C)).
Tabuľka 3
úg.mľ1 VFF-4 VFF-7 VFF-18
10,000 1,225 0,247 2,320
3,333 1,404 0,226 2,550
1,111 0,853 0,094 2,483
0,370 0,336 0,054 2,426
0,123 0,163 0,028 1,354
0,041 0,086 0,025 0,615
0,014 0,048 0,021 0,266
0,005 0,036 0,031 0,095
0,002 0,021 0,021 0,061
Príklad 3
Väzba rádioaktívne značenej CD44v6-špecifickej protilátky na nádorovú bunkovú líniu
Rádioaktívne značenie protilátky mCi N-sukcínimidyl-[2,3-3H]propionátu ([3H]-NSP, Amersham 1 mCi.mľ1) sa v posilikónovancj rúrke za vákua vodnej vývevy a pri 0 °C čo najrýchlejšie vyparil až do sucha. Pridalo sa 15 pg protilátky (1 mg.mľ1 v PBS, pH 7,4) a ponechalo sa 48 hodín pri 4 °C. Následne sa nadbytočný [3H]-NSP odstránil reakciou s 30 μΐ 1 M roztoku glycínu v PBS (20 minút pri teplote miestnosti). Oddelenie značkovanej protilátky od [3H]-glycínu sa vykonalo na stĺpci Sephadexu G 25 (objem stĺpca 15 ml), pričom sa ako premývací tlmivý roztok použil PSB/0,5 %-ný BSA. [3H]-značkovaná protilátka bola vo vytekajúcich objemoch kvapaliny. Množstvo protilátky sa stanovilo pomocou enzýmovej adsorbentovej imunoanalýzy ELISA detekciou myšacím imunoglobulínom a potom sa vypočítala špecifická aktivita.
Väzba rádioznačenej protilátky na nádorové bunky
Tri protilátky, VFF-7 (anti-v6), VFF-8 (anti-v5) a VFF-18 (anti-v6) sa označili rádioaktívnym N-sukcínimidyl[2,3-3H]propionátom a použili sa pri skúškach väzby na rôzne línie nádorových buniek. Pritom sa použili nasledovné bunkové línie: CHO-CD44var: rekombinantné bunkové línie škrečka (z vaječníka čínskeho škrečka); ľudské varianty CD44 (exóny v3 až v 10), exprimované na povrchu; HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO 205: línie ľudského kolónového karcinómu; A431: línia ľudského epitelového karcinómu dlaždicového epitelu.
Bunky sa vložili do otvorov 12-otvorovej kultivačnej tkanivovej platne, inkubovali sa cez noc pri 37 °C v CO2-liahni. Následne sa raz premyli s PBS a fixovali etanolom (1 minúta pri teplote miestnosti). Potom sa raz premyli kultivačným prostredím (RPMI 1640/10 % teľacieho séra) a nastala väzba rádioaktívnej protilátky (250 000 dpm/jamku v kultivačnom prostredí). Po 25 hodinovej inkubácii pri teplote miestnosti na zariadení na pretriasanie platní sa platne trikrát premyli s PBS/0,5 %-ným BSA, bunky sa solubilizovali pomocou 0,1 M roztoku NaOH/1 %-ný triton X-100 a merala sa rádioaktivita scincilačným počítačom. Nešpecifická väzba sa stanovila za prítomnosti 100-násobného nadbytku neoznačenej protilátky. Väzba sa vyjadrila vo vzťahu na jednotkový počet buniek (na 400 000 buniek). Po stanovení špecifickej aktivity protilátky bolo možné vyjadriť množstvo viazanej protilátky v fmoloch.
V tabuľke 4 a na obrázku 4 je uvedená špecifická väzba protilátky na rôzne bunkové línie. Zatiaľ čo väzba v6-špccifickej protilátky VFF-7 a VFF-18 na rekombinantnú bunkovú líniu CHO-CD44var je približne rovnaká, väzbové vlastnosti k líniám nádorových buniek sú veľmi rozdielne.
V niektorých prípadoch sa pozorovala väzba iba VFF-18 a veľmi malý rozsah väzby VFF-8 (HT-29, CaCo, COLO 205), pri iných bunkových líniách viazal VFF-18 významne lepšie ako VFF-7.
Tabuľka 4 _________________
Bunková línia VFF-7 fmol VFF-8 fmol VFF-18 fmol
CHO-CD44var 33,50 68,42 46,52
HCT 116 1,44 11,08 20,22
CX-1 0,19 2,20 9,48
HT -29 0,00 2,60 26,07
CaCo 0,03 2,81 12,57
COLO 205 0,00 0,32 2,88
A431 8,19 42,32 38,73
Príklad 4
ELISA na stanovenie rozpustných CD44v6 v sére
Roztoky:
Prevrstvovací tlmivý roztok: 0,05 M roztok uhličitanu sodného, pH 9,6
Analytický tlmivý roztok: PBS (fosfátom tlmený soľný roztok)
0,5 %-ný BSA (albumín bovinného séra)
0,05 %-ný Tween 20
Riedidlo vzoriek: Fa Bender MedSystems, Wien, Rakúsko Substrátový roztok: Fa Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaitherburg MD, USA;
TBM peroxidázový substrát: peroxidázový roztok B (H2O2) 1:1.
Mikrotitračné platne (Nunc-imunoplatne MaxiSorp F96) sa prevrstvili s 5 pg.mľ1 jednou k CD44v6-špecifickou protilátkou (inkubácia pri 4 °C cez noc). Následne sa platne premyli PBS/0,05 %-ný Tweenom, voľne adsorpčné miesta na povrchu platne sa blokovali analytickým tlmivým roztokom (1 hodinu pri teplote miestnosti) a znova sa raz premyli PBS/0,05 %-ným Tweenom. Vzorky séra sa zriedili v pomere najmenej 1 : 5 riedidlom vzoriek a ďalej sa riedili na platni v sérii riedení 1 : 2. Následne sa pridalo 50 μΐ/jamku proti-CD44std (kloň BU-52, The Binding Site, Birmingham) protilátky, konjugovanej s chrenovou peroxidázou, vo vhodnom zriedení (1 : 3000 až 1 : 10 000) s analytickým tlmivým roztokom. Po trojhodinovej inkubácii pri teplote miestnosti na trasiacom zariadení na platne, sa platne trikrát premyli s PBS/0,05 %-ným Tweenom 20 a vyfarbili sa substrátovým roztokom. Po 10 až 15 minútach sa vyvíjanie zastavilo 2 M roztokom kyseliny sírovej, a fotometrom sa merala absorbancia pri 450 nm (vzťažná vlnová dĺžka 690 nm).
Na kvantifikáciu sa paralelne k vzorkám séra pripravilo riedenie rozpustného CD44-štandardného preparátu v sérii riedení s analytickým tlmivým roztokom. Tento preparát sa získal vyčistením prežitých rekombinantných buniek (CHO) škrečka, ktoré exprimujú rozpustný CD44v3. Pri CD44v3 až vlO ide o ľudský CD44 variant, ktorý obsahuje cez exóny v3 až vlO kódovanú peptidovú sekvenciu.
Tabuľka 5 a obrázok 5 podávajú dôkaz rozpustných variantov CD44, ktoré obsahujú exón v6, v normálnom ľudskom sére. V sendvičovej ELISA sa použili uvedené tri v6špecifické protilátky VFF-4, VFF-7 a VFF-18 ako prevrstvovacie protilátky. Vo všetkých troch prípadoch sa ako dôkazová protilátka použila CD44std-špeciflcká protilátka (BU-52, std = štandardná), konjugovaná s peroxidázou. Uvádza sa signál z dvoch rôznych ľudských sér pri rôznych zriedeniach. V obidvoch prípadoch ((A) a (B)) sa pri VFF18 pozoruje významne silnejší signál ako pri ostatných dvoch protilátkach.
Tabuľka 5 A
Sérum 1
Zriedenie VFF-4 VFF-7 VFF-18
1 5 0,406 0,417 3,143
1 10 0,378 0,289 3,055
1 20 0,296 0,179 2,630
1 40 0,207 0,072 1,778
1 80 0,109 0,062 1,084
1 160 0,050 0,030 0,594
1 320 0,026 0,008 0,318
1 640 0,012 0,007 0,159
Tabuľka 5 B
Sérum 2
Zr iedenie VFF-4 VFF-7 VFF-18
1 5 1,690 1,280 3,290
1 10 1,756 1,185 3,321
1 20 1,564 0,857 3,163
1 40 1,213 0,468 3,050
1 80 0,699 0,208 2,537
1 160 0,336 0,061 1,666
1 320 0,138 0,014 0,988
1 640 0,054 0,018 0,546
Tabuľka 6 a obrázok 6 znázorňujú hodnoty séra CD44 variantov, obsahujúcich v6. Dvoma rôznymi skúškami ELISA bol stanovený obsah rozpustnej CD44var v sérach šiestich zdravých darcov. Pri jednej skúške sa ako prevrstvovacia protilátka použila VFF-7, v druhej VFF-18. Obidve protilátky rozoznávajú exón v6. Ako porovnávací preparát slúžil v obidvoch prípadoch v CHO-bunkách pripravený rekombinantný CD44-variant (exón v3 až v 10). ELISA s VFF-18 mala v priemere 3,5 násobne vyššie hodnoty ako ELISA s VFF7. Znamená to, že v sére sa nachádzajúce rozpustné CD44var sú v porovnaní k rekombinantným proteínom lepšie rozoznávané VFF-18 ako VFF-7.
4. Molekula protilátky podľa nároku 3, ktorá je fragmentom protilátky podľa nároku 1.
5. Molekula protilátky podľa nároku 4, ktorou je Fabalebo F(ab')2-fragment.
6. Molekula protilátky podľa nároku 3, kde protilátka jc viazaná s inou molekulou.
7. Molekula protilátky podľa nároku 6, kde iná molekula je polypeptid.
8. Molekula protilátky podľa jedného z nárokov 3 až 5, kde protilátka je viazaná s rádioaktívnym izotopom.
9. Molekula rekombinantnej protilátky s idiotypom protilátky podľa nároku 1.
10. Molekula rekombinantnej protilátky podľa nároku 9, ktorou je chimérna, humanizovaná, jednoreťazcová alebo vytvorená presunom reťazcov.
11. Molekula rekombinantnej protilátky podľa nároku 9 alebo 10, ktorá je viazaná s inou molekulou alebo s rádioaktívnym izotopom.
12. Molekula protilátky, ktorá rozoznáva rovnaký epitop ako protilátka podľa nároku 1.
13. Použitie protilátky alebo molekuly protilátky podľa jedného z nárokov 1 alebo 3 až 12 v diagnostických postupoch mimo ľudského alebo zvieracieho tela.
14. Použitie podľa nároku 13, kde uvedeným postupom je enzýmová adsorbentová imunoanalýza alebo rádioimunoanalýza.
15. Použitie podľa nároku 13, kde uvedeným postupom je imunohistochemický postup.
16. Protilátka alebo molekula protilátky podľa jedného z nárokov 1 alebo 3 až 12, na farmaceutické použitie.
17. Použitie protilátky alebo molekuly protilátky podľa jedného z nárokov 1 alebo 3 až 11 na prípravu prostriedku na diagnostiku nádorov in vivo.
výkresov
Tabuľka 6
Darca VFF-7 ng.mľ1 2 3 VFF-18 ng.mľ1 VFF-18/VFF-7
1 18,2 75,9 4,17
2 32,1 85,5 2,66
3 22,4 87,6 3,91
4 27,7 91,6 3,31
5 26,8 98,3 3,67
6 95,4 33,2 3,48
stred št. odchýlka CV% 3,53 0,52 14,9 %
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (3)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Protilátka proti epitopu obsahujúca sekvenciu aminokyselín, ktorá je kódovaná premenným exónom v6 génu CD44, vyznačujúca sa tým, že je to protilátka VFF-18, produkovaná hybridómovou bunkovou líniou s úschovným číslom DSM ACC2174.
  2. 2. Hybridómová bunková línia uložená pod číslom DSM ACC2174.
  3. 3. Molekula protilátky získaná chemickou alebo enzymatickou modifikáciou protilátky podľa nároku 1.
SK1548-96A 1994-06-08 1995-06-02 Protilátka proti CD44v6, hybridómová bunková línia, molekula protilátky a jej použitie SK282649B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4419913 1994-06-08
DE19944431297 DE4431297A1 (de) 1994-09-02 1994-09-02 Monoklonaler Antikörper gegen CD44v6
PCT/EP1995/002126 WO1995033771A1 (de) 1994-06-08 1995-06-02 MONOKLONALER ANTIKÖRPER GEGEN CD44v6

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK154896A3 SK154896A3 (en) 1997-08-06
SK282649B6 true SK282649B6 (sk) 2002-10-08

Family

ID=25937246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1548-96A SK282649B6 (sk) 1994-06-08 1995-06-02 Protilátka proti CD44v6, hybridómová bunková línia, molekula protilátky a jej použitie

Country Status (28)

Country Link
US (1) US5916561A (sk)
EP (1) EP0765343B1 (sk)
JP (2) JP3387929B2 (sk)
KR (2) KR100379217B1 (sk)
CN (1) CN1125083C (sk)
AT (1) ATE197592T1 (sk)
BG (1) BG64181B1 (sk)
BR (1) BR9507964A (sk)
CA (1) CA2192370A1 (sk)
CO (1) CO4410258A1 (sk)
CZ (1) CZ291274B6 (sk)
DE (1) DE59508864D1 (sk)
DK (1) DK0765343T3 (sk)
ES (1) ES2151603T3 (sk)
FI (1) FI964845A (sk)
GR (1) GR3035388T3 (sk)
HK (1) HK1011697A1 (sk)
HU (1) HU220168B (sk)
NO (1) NO317948B1 (sk)
NZ (1) NZ288224A (sk)
PL (1) PL190897B1 (sk)
PT (1) PT765343E (sk)
RO (1) RO118753B1 (sk)
RU (1) RU2204606C2 (sk)
SI (1) SI0765343T1 (sk)
SK (1) SK282649B6 (sk)
UA (1) UA58482C2 (sk)
WO (1) WO1995033771A1 (sk)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY24389A1 (es) * 1995-12-06 2001-10-25 Karlsruhe Forschzent Composición farmacéutica para el tratamiento de carcinoma de epitelio plano
AU1672097A (en) 1996-02-15 1997-09-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody that recognizes antigens present on the surface of endothelial cell of tumor vessel
DE19648209A1 (de) * 1996-11-21 1998-05-28 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Tumorzelldepletion CD34-positiver Zellen
DE19708713C2 (de) * 1997-03-04 2002-11-28 Boehringer Ingelheim Int Verwendung von anti-CD44 Antikörpern enthaltenden Präparationen zur Behandlung bestimmter Tumore und zur Unterdrückung von Immunreaktionen
EP1460132A1 (en) * 1998-06-08 2004-09-22 Fuso Pharmaceutical Industries Ltd. Antibodies with specific immunoreactivity to thyroid carcinoma cells
WO2000002922A1 (fr) * 1998-07-10 2000-01-20 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Anticorps specifique des domaines intracellulaires de la thyrosinephosphatase
US8048416B2 (en) 1999-10-08 2011-11-01 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US8071072B2 (en) * 1999-10-08 2011-12-06 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US7189397B2 (en) * 1999-10-08 2007-03-13 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20090004103A1 (en) * 1999-10-08 2009-01-01 Young David S F Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20080124327A1 (en) * 1999-10-08 2008-05-29 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US7947496B2 (en) * 1999-10-08 2011-05-24 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20050100542A1 (en) * 1999-10-08 2005-05-12 Young David S. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US6972324B2 (en) 2001-05-18 2005-12-06 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Antibodies specific for CD44v6
CA2443437A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antibodies specific for cd44v6
US20030103985A1 (en) * 2001-05-18 2003-06-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates
WO2003018044A1 (en) * 2001-08-24 2003-03-06 Stroemblad Staffan New drug
US20040126379A1 (en) * 2002-08-21 2004-07-01 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
WO2004024750A2 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Dyax Corporation Cd44-binding ligands
US20040120949A1 (en) * 2002-11-08 2004-06-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy
US20060140963A1 (en) * 2003-04-14 2006-06-29 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD59
EP1806365A1 (en) 2006-01-05 2007-07-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
EP2266593A1 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Karlsruher Institut für Technologie Use of CD44v6 in the treatment of ophthalmic diseases
WO2011020529A2 (en) * 2009-08-19 2011-02-24 Merck Patent Gmbh Antibodies for the detection of integrin complexes in ffpe material
CN102337298B (zh) * 2011-08-19 2013-11-06 黄开红 一种输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用
DK2886126T3 (en) 2013-12-23 2017-09-18 Exchange Imaging Tech Gmbh Nanoparticle conjugated to CD44-binding peptides
KR20210004961A (ko) * 2018-02-22 2021-01-13 아브마트 상하이 컴퍼니, 엘티디. 치료 항체 및 그의 용도
CN109593125A (zh) * 2018-12-12 2019-04-09 深圳市龙华区人民医院 基于***癌干细胞标志物cd44的抗原表位多肽cd44-p1及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2149635A1 (en) * 1992-11-20 1994-06-09 David Tarin Peptide corresponding to cd44 exon 6, antibodies specific for said peptide and use of these antibodies for diagnosis of tumors
ES2110764T3 (es) * 1993-06-18 1998-02-16 Biotie Therapies Oy Composiciones y metodos de diagnostico empleando anticuerpos monoclonales contra la cd44v6.
WO1995000851A1 (de) * 1993-06-22 1995-01-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Verfahren zur diagnose und analyse von tumoren

Also Published As

Publication number Publication date
NO965239L (no) 1996-12-06
PL190897B1 (pl) 2006-02-28
HU9603387D0 (en) 1997-01-28
HU220168B (hu) 2001-11-28
CN1152925A (zh) 1997-06-25
BG101024A (en) 1997-09-30
FI964845A0 (fi) 1996-12-04
PL317536A1 (en) 1997-04-14
UA58482C2 (uk) 2003-08-15
JPH10501797A (ja) 1998-02-17
RU2204606C2 (ru) 2003-05-20
CA2192370A1 (en) 1995-12-14
JP3387929B2 (ja) 2003-03-17
CZ359196A3 (en) 1997-11-12
CO4410258A1 (es) 1997-01-09
DK0765343T3 (da) 2000-12-27
SI0765343T1 (en) 2001-02-28
NZ288224A (en) 1999-04-29
ATE197592T1 (de) 2000-12-15
NO965239D0 (no) 1996-12-06
KR970703368A (ko) 1997-07-03
JP2003034700A (ja) 2003-02-07
HK1011697A1 (en) 1999-07-16
EP0765343B1 (de) 2000-11-15
DE59508864D1 (de) 2000-12-21
AU701885B2 (en) 1999-02-11
BR9507964A (pt) 1997-09-02
CZ291274B6 (cs) 2003-01-15
EP0765343A1 (de) 1997-04-02
SK154896A3 (en) 1997-08-06
CN1125083C (zh) 2003-10-22
BG64181B1 (bg) 2004-03-31
NO317948B1 (no) 2005-01-10
WO1995033771A1 (de) 1995-12-14
PT765343E (pt) 2001-02-28
AU2737095A (en) 1996-01-04
US5916561A (en) 1999-06-29
GR3035388T3 (en) 2001-05-31
RO118753B1 (ro) 2003-10-30
KR100379217B1 (ko) 2003-06-11
FI964845A (fi) 1996-12-04
HUT76260A (en) 1997-07-28
ES2151603T3 (es) 2001-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK282649B6 (sk) Protilátka proti CD44v6, hybridómová bunková línia, molekula protilátky a jej použitie
DK172440B1 (da) Monoklonale antistoffer og derivater deraf, fremgangsmåde til deres fremstilling, hybridomacellelinie og fremgangsmåde til
US7183384B2 (en) Monoclonal antibody 7H11 reactive with human cancer
EP3029069B1 (en) Anti-human cd26 monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof
KR101682257B1 (ko) 인간 ｃｘｃｌ１ 단백질의 면역학적 측정 방법
CN113321731A (zh) 结合人程序性死亡配体1(pd-l1)的抗体
EP3653644A1 (en) Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (gdf-15), and uses thereof for treating cancer cachexia and cancer
CN104144948A (zh) 用于治疗的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架
US20220119546A1 (en) Plectin-1 binding antibodies and uses thereof
KR20080106157A (ko) Ｆａｓ 결합 항체
EP1001020A1 (en) Antihuman pre-b cell receptor antibodies
KR100473824B1 (ko) 상피종의진단및치료방법
JP4913034B2 (ja) Ａｄａｍｔｓ１３活性検定用抗体及び活性検定方法
US7560095B2 (en) Cancer specific monoclonal antibodies
CN109705219B (zh) 与间皮素结合的单克隆抗体及其制备方法
KR20120118412A (ko) 인간 간-카르복실에스터라제 １을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도
CA2607930A1 (en) Acute leukemia and lymphoblastic lymphoma-specific cd43 epitope and use thereof
CA1334176C (en) Monoclonal antibody recognizing gamma atrial natriuretic polypeptide
JP2955082B2 (ja) ヒトカルシトニンのｎ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体
CN113597432A (zh) 抗EpCAM抗体及其应用
JP2792651B2 (ja) ヒト膵臓癌に対するモノクローナル抗体
KR100493932B1 (ko) 레지스틴에 대한 단클론 항체, 이의 제조 방법, 및 용도
JP4037933B2 (ja) 抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体
JP2925479B2 (ja) 肺小細胞癌検出薬及びその使用
US9163080B2 (en) Anti-single-chain type IV collagen polypeptide antibody, pharmaceutical drug, diagnostic, preventive, or therapeutic drug for tumour containing the antibody