JP3387929B2 - ＣＤ４４ｖ６に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ＣＤ４４ｖ６に対するモノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、CD44遺伝子の変異体（variant）エキソンv
6によってコードされるエピトープに対するモノクロー
ナル抗体、該モノクローナル抗体から誘導される抗体分
子、及び診断及び治療の目的のための抗体又は抗体分子
の利用に関する。
6によってコードされるエピトープに対するモノクロー
ナル抗体、該モノクローナル抗体から誘導される抗体分
子、及び診断及び治療の目的のための抗体又は抗体分子
の利用に関する。
近年、表面糖蛋白CD44の変異体の発現が、非転移性ラ
ット繊維肉腫細胞系のみでなく、非転移性ラット膵臓腺
癌細胞系の、いわゆる自発的な転移作用を引き起こすこ
とに必要且つ十分であることが示された（Gunthertら,1
991）。最も小さいCD44イソ型、標準型CD44（すなわちC
D44std）は、上皮細胞を含む種々の組織で遍在的に発現
するが、ある種のCD44接合（splice）変異体（CD44v、C
D44var）は上皮細胞のサブセット（subset）でのみ発現
する。CD44変異体は、10個のエキソン（v1−v10）の配
列がCD44s中で完全に除去されるような選択的なスプラ
イシングによって生じるが、異なる組み合わせ中でより
大きな変異体に生じることができる（Screatonら,1992;
Tolgら,1992;Hofmannら,1991）。変異体は、タンパク質
の細胞外部位の一定の部位に種々のアミノ酸配列が挿入
している点で異なっている。そのような変異体は、ヒト
の腫瘍組織及び種々のヒト腫瘍細胞において検出するこ
とができる。そこで、結腸直腸の発癌の過程におけるCD
44の発現が近年研究された（Heiderら,1993a）。CD44変
異体の発現は、正常ヒト結腸上皮細胞では見られず、増
殖する腺窩細胞では弱い発現のみが検出される。腫瘍の
進行の後期においては、例えば、腺癌、全ての悪性腫瘍
においてCD44の変異体が発現する。高濃度のCD44変異体
の組織発現は、攻撃的なNon−Hodgkinリンパ腫において
も見られる（Koopmanら,1993）。
ット繊維肉腫細胞系のみでなく、非転移性ラット膵臓腺
癌細胞系の、いわゆる自発的な転移作用を引き起こすこ
とに必要且つ十分であることが示された（Gunthertら,1
991）。最も小さいCD44イソ型、標準型CD44（すなわちC
D44std）は、上皮細胞を含む種々の組織で遍在的に発現
するが、ある種のCD44接合（splice）変異体（CD44v、C
D44var）は上皮細胞のサブセット（subset）でのみ発現
する。CD44変異体は、10個のエキソン（v1−v10）の配
列がCD44s中で完全に除去されるような選択的なスプラ
イシングによって生じるが、異なる組み合わせ中でより
大きな変異体に生じることができる（Screatonら,1992;
Tolgら,1992;Hofmannら,1991）。変異体は、タンパク質
の細胞外部位の一定の部位に種々のアミノ酸配列が挿入
している点で異なっている。そのような変異体は、ヒト
の腫瘍組織及び種々のヒト腫瘍細胞において検出するこ
とができる。そこで、結腸直腸の発癌の過程におけるCD
44の発現が近年研究された（Heiderら,1993a）。CD44変
異体の発現は、正常ヒト結腸上皮細胞では見られず、増
殖する腺窩細胞では弱い発現のみが検出される。腫瘍の
進行の後期においては、例えば、腺癌、全ての悪性腫瘍
においてCD44の変異体が発現する。高濃度のCD44変異体
の組織発現は、攻撃的なNon−Hodgkinリンパ腫において
も見られる（Koopmanら,1993）。
エキソンv6は、特に転移が広がる間に、特別の役割を
するらしい（Rudyら,1993）。動物モデルにおいて、v6
特異的エピトープに対する抗体は転移細胞の定着及び転
移の増大を妨げることができる（Seiterら,1993）。結
腸癌においては、v6の発現は腫瘍の増殖と相関関係があ
る（Wielengaら,1993）。胃癌においては、v6の発現
は、腸管型腫瘍を拡散型腫瘍と区別するための重要な診
断マーカーである（Heiderら,1993b）。後の２つの刊行
物において、v6の発現は、v6特異的エピトープに対する
抗体を用いて検出されている。
するらしい（Rudyら,1993）。動物モデルにおいて、v6
特異的エピトープに対する抗体は転移細胞の定着及び転
移の増大を妨げることができる（Seiterら,1993）。結
腸癌においては、v6の発現は腫瘍の増殖と相関関係があ
る（Wielengaら,1993）。胃癌においては、v6の発現
は、腸管型腫瘍を拡散型腫瘍と区別するための重要な診
断マーカーである（Heiderら,1993b）。後の２つの刊行
物において、v6の発現は、v6特異的エピトープに対する
抗体を用いて検出されている。
エキソンv6によってコードされるエピトープに対する
モノクローナル抗体は当業界において知られている（Ho
fmannら,1991;Wielengaら,1993）。そのような抗体に
は、診断及び治療において高い潜在的な有用性があるの
で、改良された特性を有する抗体が必要とされる。
モノクローナル抗体は当業界において知られている（Ho
fmannら,1991;Wielengaら,1993）。そのような抗体に
は、診断及び治療において高い潜在的な有用性があるの
で、改良された特性を有する抗体が必要とされる。
本発明は、従来のv6特異的抗体に比して明らかに優れ
た特性を有する抗体を提供することを目的とする。
た特性を有する抗体を提供することを目的とする。
本発明は、この目的を達成した。本発明は、VFF−18
と命名された抗体に関する。更に、本発明はこの抗体を
分泌し、DSM−Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,D−38124
Braunschweig,Germanyにおいて、番号DSM ACC2174で
寄託されたハイブリドーマ細胞系に関する。
と命名された抗体に関する。更に、本発明はこの抗体を
分泌し、DSM−Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,D−38124
Braunschweig,Germanyにおいて、番号DSM ACC2174で
寄託されたハイブリドーマ細胞系に関する。
「抗体」又は「抗体分子」という用語は、以後、完全
な免疫グロブリンだけでなく、結合特異性及び親和性に
関して同等の物質及び記載の抗体誘導体及び組み換え抗
体分子をいう。
な免疫グロブリンだけでなく、結合特異性及び親和性に
関して同等の物質及び記載の抗体誘導体及び組み換え抗
体分子をいう。
抗体VFF−18は、実施例１の方法で調製された。抗体
は、寄託されたハイブリドーマ細胞系からも得ることが
できる。本発明の抗体誘導体を調製すること、又は抗体
の配列分析から始め、及び／又はこの抗体を生産するハ
イブリドーマ細胞系を用いることにより同じイディオタ
イプで組み換え抗体分子、即ち、抗原結合部位（相補的
決定部位、CDR）に抗体VFF−18と同じアミノ酸配列を有
する抗体分子を調製することは、平均の熟練者の技術の
範囲である。従って、組み換え抗体分子だけでなくその
ような誘導体は、明らかに本発明に含まれる。
は、寄託されたハイブリドーマ細胞系からも得ることが
できる。本発明の抗体誘導体を調製すること、又は抗体
の配列分析から始め、及び／又はこの抗体を生産するハ
イブリドーマ細胞系を用いることにより同じイディオタ
イプで組み換え抗体分子、即ち、抗原結合部位（相補的
決定部位、CDR）に抗体VFF−18と同じアミノ酸配列を有
する抗体分子を調製することは、平均の熟練者の技術の
範囲である。従って、組み換え抗体分子だけでなくその
ような誘導体は、明らかに本発明に含まれる。
例えば、Fab又はＦ（ab'）２フラグメント又はその他
のフラグメントはVFF−18抗体の完全な免疫グロブリン
から生成することができる（Kreitmanら,1993）。診断
の手順のために、例えば、VFF−18抗体分子、それのフ
ラグメント又は同じイディオタイプの組み換え抗体分子
を、131I,111In,99mTc等の放射活性アイソトープ又は放
射活性化合物（Larsonら,1991;Thomasら,1989;Srivasta
va,1988）、パーオキシダーゼ又はアルカリホスファタ
ーゼ等の酵素（Catty及びRaykundalia,1989）、蛍光色
素（Johnson,1989）又はビオチン分子（Guesdonら,197
9）と結合させることができる。治療に適用するために
は、VFF−18又はVFF−18から誘導される抗体分子を、毒
素（Vitettaら,1991;Vitetta及びThorpe,1991;Kreitman
ら,1993;Theuerら,1993）、細胞成長抑止剤（Schrappe
ら,1992）、プロドラッグ（Wangら,1992;Senterら,198
9）又は放射活性物質と結合させることができる。更
に、抗体をサイトカイン又は免疫調節ポリペプチド、例
えば腫瘍壊死因子又はインターロイキン−２と結合させ
ることができる。
のフラグメントはVFF−18抗体の完全な免疫グロブリン
から生成することができる（Kreitmanら,1993）。診断
の手順のために、例えば、VFF−18抗体分子、それのフ
ラグメント又は同じイディオタイプの組み換え抗体分子
を、131I,111In,99mTc等の放射活性アイソトープ又は放
射活性化合物（Larsonら,1991;Thomasら,1989;Srivasta
va,1988）、パーオキシダーゼ又はアルカリホスファタ
ーゼ等の酵素（Catty及びRaykundalia,1989）、蛍光色
素（Johnson,1989）又はビオチン分子（Guesdonら,197
9）と結合させることができる。治療に適用するために
は、VFF−18又はVFF−18から誘導される抗体分子を、毒
素（Vitettaら,1991;Vitetta及びThorpe,1991;Kreitman
ら,1993;Theuerら,1993）、細胞成長抑止剤（Schrappe
ら,1992）、プロドラッグ（Wangら,1992;Senterら,198
9）又は放射活性物質と結合させることができる。更
に、抗体をサイトカイン又は免疫調節ポリペプチド、例
えば腫瘍壊死因子又はインターロイキン−２と結合させ
ることができる。
更に、抗体VFF−18のアミノ酸配列の分析後、及び／
又はこの抗体を生産するハイブリドーマ細胞系の使用に
より、特にこの細胞内に含有される遺伝情報の解析によ
り、熟練者はVFF−18と同じイディオタイプの組み換え
抗体分子を生産することができる。これを達成する方法
が、技術水準の一部を形成する。例えば、このような組
み換え抗体は、抗体（Shinら,1989;Gussow及びSeemann,
1991）、二価特異的抗体（bispecific antibodies）（W
einerら,1993;Goodwin,1989）、一本鎖抗体（scFV,John
son及びBird,1991）、完全な又は断片的な免疫グロブリ
ン（Colomaら,1992;Nesbitら,1994,Barbasら,1992）、
又は鎖をシャッフルすることによって生成した抗体（Wi
nterら,1994）を人体に適応させることができる。人間
に適応させる抗体は、例えば、CDRグラフティング（CDR
grafting）によって生成することができる（EP 023940
0）。枠組み部分も修飾してもよい（EP 0519596）。最
近では、抗体を人間に適応させるために、PCR（例え
ば、EP 0368684;EP 0438310;WO 9207075を参照された
い）等の方法又はコンピューターモデリング（例えば、
WO 9222653を参照されたい）が用いられる。融合タンパ
ク質、例えば、一本鎖抗体／毒素融合タンパク質も生産
される（Chaudharyら,1990;Friedmanら,1993）。従っ
て、この種の抗体分子は、本発明に含まれる。
又はこの抗体を生産するハイブリドーマ細胞系の使用に
より、特にこの細胞内に含有される遺伝情報の解析によ
り、熟練者はVFF−18と同じイディオタイプの組み換え
抗体分子を生産することができる。これを達成する方法
が、技術水準の一部を形成する。例えば、このような組
み換え抗体は、抗体（Shinら,1989;Gussow及びSeemann,
1991）、二価特異的抗体（bispecific antibodies）（W
einerら,1993;Goodwin,1989）、一本鎖抗体（scFV,John
son及びBird,1991）、完全な又は断片的な免疫グロブリ
ン（Colomaら,1992;Nesbitら,1994,Barbasら,1992）、
又は鎖をシャッフルすることによって生成した抗体（Wi
nterら,1994）を人体に適応させることができる。人間
に適応させる抗体は、例えば、CDRグラフティング（CDR
grafting）によって生成することができる（EP 023940
0）。枠組み部分も修飾してもよい（EP 0519596）。最
近では、抗体を人間に適応させるために、PCR（例え
ば、EP 0368684;EP 0438310;WO 9207075を参照された
い）等の方法又はコンピューターモデリング（例えば、
WO 9222653を参照されたい）が用いられる。融合タンパ
ク質、例えば、一本鎖抗体／毒素融合タンパク質も生産
される（Chaudharyら,1990;Friedmanら,1993）。従っ
て、この種の抗体分子は、本発明に含まれる。
更に、VFF−18の正確なエピトープを同定すること、
及びこの知識をもって同じ結合特異性を有する等価の抗
体を生産することは平均的な熟練者の技術範囲である。
正確なエピトープは、実施例２に示すペプチド結合研
究、例えば、ペプチドHulの配列を変えることにより同
定される。従って、このような抗体も本発明の範囲内で
ある。
及びこの知識をもって同じ結合特異性を有する等価の抗
体を生産することは平均的な熟練者の技術範囲である。
正確なエピトープは、実施例２に示すペプチド結合研
究、例えば、ペプチドHulの配列を変えることにより同
定される。従って、このような抗体も本発明の範囲内で
ある。
本発明の更なる面は、診断及び治療のための、VFF−1
8、VFF−18の誘導体又は等価の抗体分子の利用である。
8、VFF−18の誘導体又は等価の抗体分子の利用である。
診断方法は、本発明の抗体分子を用いる公知の方法、
例えば、酵素−結合免疫アッセイ（ELISA,Catty及びRay
kundalia,1989）、ラジオイムノアッセイ（Catty及びMu
rphy,1989）、免疫組織化学的方法（Heiderら,1993b）
又はウエスタンブロット等に基づいて行うことができ
る。このような方法は、適切には、例えば、生検として
体から得られる組織試料又は液体で行われる。このよう
な分析は、定性的、半定量的又は定量的に行われる。抗
体又は抗体分子は、他のv6特異的抗体について先行技術
において記載されているように用いられ、本発明による
抗体又は抗体分子の有益な特性は、そのような工程に重
要な改良を構成する。
例えば、酵素−結合免疫アッセイ（ELISA,Catty及びRay
kundalia,1989）、ラジオイムノアッセイ（Catty及びMu
rphy,1989）、免疫組織化学的方法（Heiderら,1993b）
又はウエスタンブロット等に基づいて行うことができ
る。このような方法は、適切には、例えば、生検として
体から得られる組織試料又は液体で行われる。このよう
な分析は、定性的、半定量的又は定量的に行われる。抗
体又は抗体分子は、他のv6特異的抗体について先行技術
において記載されているように用いられ、本発明による
抗体又は抗体分子の有益な特性は、そのような工程に重
要な改良を構成する。
in vitroの診断に加え、本発明の抗体分子はin vivo
の診断、特に腫瘍の診断に適している。抗体分子が検出
できるラベルを有していれば、ラベルは診断の目的のた
めに、例えば、in vivoで腫瘍の像を描くため、又は放
射線誘導手術（radioguided surgery）のために検出で
きる。免疫シンチグラフィー（画像）のための放射活性
アイソトープと結合した抗体の利用としては、例えば、
本発明を実施することができる多くの方法がある（Sicc
ardiら,1989;Keenanら,1987;Perkins及びPimm,1992;Col
cherら,1987;Thompsonら,1984）。
の診断、特に腫瘍の診断に適している。抗体分子が検出
できるラベルを有していれば、ラベルは診断の目的のた
めに、例えば、in vivoで腫瘍の像を描くため、又は放
射線誘導手術（radioguided surgery）のために検出で
きる。免疫シンチグラフィー（画像）のための放射活性
アイソトープと結合した抗体の利用としては、例えば、
本発明を実施することができる多くの方法がある（Sicc
ardiら,1989;Keenanら,1987;Perkins及びPimm,1992;Col
cherら,1987;Thompsonら,1984）。
治療への適用は、例えば、抗体ASML1.1の利用に類似
して行うことができる（Seiterら,1993）。抗体分子
は、例えば、静脈（丸薬又はパーマントインフュージョ
ン）、腹膜内、筋肉内又は皮下注射又は点滴で全身又は
局所に投与される。また、単一の組織、又は手足が灌流
される。結合した、又は非結合抗体の投与のための計画
案が論文に見出される（Mulshineら,1991;Larsonら,199
1;Vitetta及びThorpe,1991;Vitettaら,1991;Breitzら,1
992;Pressら,1989;Weinerら,1989;Chatalら,1989;Sears
ら,1982）。
して行うことができる（Seiterら,1993）。抗体分子
は、例えば、静脈（丸薬又はパーマントインフュージョ
ン）、腹膜内、筋肉内又は皮下注射又は点滴で全身又は
局所に投与される。また、単一の組織、又は手足が灌流
される。結合した、又は非結合抗体の投与のための計画
案が論文に見出される（Mulshineら,1991;Larsonら,199
1;Vitetta及びThorpe,1991;Vitettaら,1991;Breitzら,1
992;Pressら,1989;Weinerら,1989;Chatalら,1989;Sears
ら,1982）。
VFF−18の、他の抗CD44v6抗体に比して優れた特性
は、実施例２〜４に示されている。
は、実施例２〜４に示されている。
図面
図1:GST−CD44（v3−v10）融合タンパク質の図による
説明、GST＝Schistosoma japonicumのグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ。v3−v10＝ケラチン生成細胞CD4
4の変異体挿入物。矢印は、トロンビン切断部位。
説明、GST＝Schistosoma japonicumのグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ。v3−v10＝ケラチン生成細胞CD4
4の変異体挿入物。矢印は、トロンビン切断部位。
図2:ヒト及びラットのCD44遺伝子のエキソンv6の配列
の比較。抗体1.1ASML（抗−ラットCD44v6）又はVFF−18
（抗−ヒトCD44v6）によって認識されるペプチドRal及
びHulの配列を、それぞれ太字で表した。一致するアミ
ノ酸をアステリスクで印をつけた。
の比較。抗体1.1ASML（抗−ラットCD44v6）又はVFF−18
（抗−ヒトCD44v6）によって認識されるペプチドRal及
びHulの配列を、それぞれ太字で表した。一致するアミ
ノ酸をアステリスクで印をつけた。
図3:CD44v6特異的抗体の合成ペプチドへの結合。ペプ
チドへの抗体の結合は、ペプチドを固定し抗体溶液とイ
ンキュベーションするELISAにより検出した。適当な洗
浄工程の後、結合した抗体をパーオキシダーゼ結合抗−
マウスIgG抗体で検出した。（Ａ）：最初の実験で、CD4
4v6ラット特異的抗体1.1ASMLのペプチドRal（KWFEN EWQ
GK NPPT）への結合が証明された。（Ｂ）：別の実験
で、Ralに同族であるがヒトCD44v6配列由来のペプチド
が合成された。別の抗−ヒトCD44v6ハイブリドーマの上
清がHul（QWFGN RWHEG YRQT）と呼ばれるペプチドに結
合した。VFF−18が、試験した他の抗体よりもペプチド
に良く結合することが見出された。（Ｃ）：定量的な評
価のために、実験を精製された抗体の種々の濃度で繰り
返した。また、この実験で、VFF−18が他の抗体に比較
して高い結合アフィニティーを示すことがわかった。
チドへの抗体の結合は、ペプチドを固定し抗体溶液とイ
ンキュベーションするELISAにより検出した。適当な洗
浄工程の後、結合した抗体をパーオキシダーゼ結合抗−
マウスIgG抗体で検出した。（Ａ）：最初の実験で、CD4
4v6ラット特異的抗体1.1ASMLのペプチドRal（KWFEN EWQ
GK NPPT）への結合が証明された。（Ｂ）：別の実験
で、Ralに同族であるがヒトCD44v6配列由来のペプチド
が合成された。別の抗−ヒトCD44v6ハイブリドーマの上
清がHul（QWFGN RWHEG YRQT）と呼ばれるペプチドに結
合した。VFF−18が、試験した他の抗体よりもペプチド
に良く結合することが見出された。（Ｃ）：定量的な評
価のために、実験を精製された抗体の種々の濃度で繰り
返した。また、この実験で、VFF−18が他の抗体に比較
して高い結合アフィニティーを示すことがわかった。
図4:放射活性抗体の腫瘍細胞への結合。３種類の抗
体、VFF−７（抗−v6）、VFF−８（抗−v5）及びVFF−1
8（抗−v6）がＮ−スクシニミル［2,3−3H］プロピオネ
ートで放射活性ラベルされ、種々の腫瘍細胞系で結合検
定に用いられた。以下の細胞系が用いられた：即ち、CH
O−CD44var:細胞表面でヒト変異体CD44（エキソンv3−v
10）を発現する組み換えハムスター細胞系（チャイニー
ズハムスター卵巣）;HCT−116、CX−１、HT−29、CaC
o、COLO 205、ヒト結腸癌細胞系;A431:ヒト扁平上皮細
胞癌細胞系が用いられた。抗体の種々の細胞系への特異
的結合が見られた。v6特異的抗体VFF−７及びVFF−18の
組み換え細胞系CHO−CD44varへの結合は同じ程度である
が、抗体は、腫瘍細胞系に関しては異なる結合の作用を
示す。いくつかのケースにおいては、VFF−18と少しの
程度のVFF−８の結合のみが見られ（HT−29、CaCo、COL
O 205）、他のケースではVFF−18はVFF−７よりも非常
に良く結合する。
体、VFF−７（抗−v6）、VFF−８（抗−v5）及びVFF−1
8（抗−v6）がＮ−スクシニミル［2,3−3H］プロピオネ
ートで放射活性ラベルされ、種々の腫瘍細胞系で結合検
定に用いられた。以下の細胞系が用いられた：即ち、CH
O−CD44var:細胞表面でヒト変異体CD44（エキソンv3−v
10）を発現する組み換えハムスター細胞系（チャイニー
ズハムスター卵巣）;HCT−116、CX−１、HT−29、CaC
o、COLO 205、ヒト結腸癌細胞系;A431:ヒト扁平上皮細
胞癌細胞系が用いられた。抗体の種々の細胞系への特異
的結合が見られた。v6特異的抗体VFF−７及びVFF−18の
組み換え細胞系CHO−CD44varへの結合は同じ程度である
が、抗体は、腫瘍細胞系に関しては異なる結合の作用を
示す。いくつかのケースにおいては、VFF−18と少しの
程度のVFF−８の結合のみが見られ（HT−29、CaCo、COL
O 205）、他のケースではVFF−18はVFF−７よりも非常
に良く結合する。
図5:ヒト正常血清中のエキソンv6を含む可溶性CD44変
異体の検出。３種類のv6に特異的な抗体、VFF−４、VFF
−７及びVFF−18が、サンドウィッチELISAにおけるコー
ティング抗体として用いられた。３種類の全てのケース
において、検出抗体として、パーオキシダーゼ結合CD44
std特異的抗体（BU−52、std＝標準）が用いられた。種
々の希釈における２種類の正常ヒト血清のシグナルがこ
れらの検定（（Ａ）及び（Ｂ））で示された。両方のケ
ースにおいて、他の２種類の抗体に比較してVFF−18
で、実質的に強いシグナルが示された。
異体の検出。３種類のv6に特異的な抗体、VFF−４、VFF
−７及びVFF−18が、サンドウィッチELISAにおけるコー
ティング抗体として用いられた。３種類の全てのケース
において、検出抗体として、パーオキシダーゼ結合CD44
std特異的抗体（BU−52、std＝標準）が用いられた。種
々の希釈における２種類の正常ヒト血清のシグナルがこ
れらの検定（（Ａ）及び（Ｂ））で示された。両方のケ
ースにおいて、他の２種類の抗体に比較してVFF−18
で、実質的に強いシグナルが示された。
図6:v6を含むCD44変異体の血清中濃度。６人の健康な
ドナーの血清中の可溶性CD44varの含量が２種のELISAに
よって定量された。１つの試験ではVFF−７が用いら
れ、他の試験ではVFF−18がコーティング抗体として用
いられた。両方の抗体はエキソンv6を認識する。両方の
ケースにおいて、CHO細胞中で生産された組み換え可溶
性CD44変異体（エキソンv3−v10）がコントロールとし
て供給された。平均で、VFF−18 ELISAは、VFF−７ E
LISAに比して3.5倍高い値を示した。これは、血清中に
現れるCD44varは、VFF−７よりもVFF−18によってより
良く認識されることを意味する。
ドナーの血清中の可溶性CD44varの含量が２種のELISAに
よって定量された。１つの試験ではVFF−７が用いら
れ、他の試験ではVFF−18がコーティング抗体として用
いられた。両方の抗体はエキソンv6を認識する。両方の
ケースにおいて、CHO細胞中で生産された組み換え可溶
性CD44変異体（エキソンv3−v10）がコントロールとし
て供給された。平均で、VFF−18 ELISAは、VFF−７ E
LISAに比して3.5倍高い値を示した。これは、血清中に
現れるCD44varは、VFF−７よりもVFF−18によってより
良く認識されることを意味する。
実施例
実施例1:モノクローナル抗体VFF−18の製造
pGEX融合タンパク質のクローニング
CD44vのHPKIIタイプの完全な変異部位をヒトケラチノ
サイトcDNA由来のポリメラーゼチェーンリアクション
（PCR）で増幅した（Hofmannら,1991）。用いられた２
種のPCRプライマー（Hofmannらによって記載されたLCLC
97変異部位の25〜52位の5'−CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAA
ATG−3'、1013〜984位のTGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTG
GA−3'）は、ベクターpGEX−2Tに直接PCR生成物をクロ
ーンするために用いられるEcoR I認識部位を含有する
（Smithら,1988）。得られた構築物（pGEX CD44v HPK
II、v3−v10）は、Schistosoma japonicumのグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼとヒトCD44のエキソンv3−
v10を含む、約70kdalの融合タンパク質をコードする
（図1;Heiderら,1993a）。この融合タンパク質は大腸菌
中で発現され、次いでグルタチオンアガロースを用いた
アフィニティークロマトグラフィーにより精製された
（Smithら,1988）。
サイトcDNA由来のポリメラーゼチェーンリアクション
（PCR）で増幅した（Hofmannら,1991）。用いられた２
種のPCRプライマー（Hofmannらによって記載されたLCLC
97変異部位の25〜52位の5'−CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAA
ATG−3'、1013〜984位のTGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTG
GA−3'）は、ベクターpGEX−2Tに直接PCR生成物をクロ
ーンするために用いられるEcoR I認識部位を含有する
（Smithら,1988）。得られた構築物（pGEX CD44v HPK
II、v3−v10）は、Schistosoma japonicumのグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼとヒトCD44のエキソンv3−
v10を含む、約70kdalの融合タンパク質をコードする
（図1;Heiderら,1993a）。この融合タンパク質は大腸菌
中で発現され、次いでグルタチオンアガロースを用いた
アフィニティークロマトグラフィーにより精製された
（Smithら,1988）。
免疫及びスクリーニング
アフィニティー精製した融合タンパク質を用いて、以
下に示す計画によりメスのBalb/cマウスを腹腔注射によ
り免疫した。
下に示す計画によりメスのBalb/cマウスを腹腔注射によ
り免疫した。
1.免疫:Freundの完全アジュバント中の90gの融合タンパ
ク質 2.及び3.免疫:Freundの不完全アジュバント中の50gの融
合タンパク質 免疫は、それぞれ４週間隔で行った。最後に免疫の14
日後に、10μｇの融合タンパク質を含む食塩加リン酸バ
ッファー（PBS）で３日連続して追加免疫した。次の
日、抗体価の高い動物の脾臓細胞を、ポリエチレングリ
コール4000を用いてP3.X63−Ag8.653マウス骨髄腫細胞
と融合した。ハイブリドーマ細胞をHAT培地中のマイク
ロタイタープレート中で選択した（Kohler及びMilstei
n,1975;Kearneyら,1979）。
ク質 2.及び3.免疫:Freundの不完全アジュバント中の50gの融
合タンパク質 免疫は、それぞれ４週間隔で行った。最後に免疫の14
日後に、10μｇの融合タンパク質を含む食塩加リン酸バ
ッファー（PBS）で３日連続して追加免疫した。次の
日、抗体価の高い動物の脾臓細胞を、ポリエチレングリ
コール4000を用いてP3.X63−Ag8.653マウス骨髄腫細胞
と融合した。ハイブリドーマ細胞をHAT培地中のマイク
ロタイタープレート中で選択した（Kohler及びMilstei
n,1975;Kearneyら,1979）。
血清中の抗体価の決定、又はハイブリドーマ上清のス
クリーニングを、それぞれ、ELISAを用いて行った。こ
の検定において、マイクロタイタープレートを、先ず、
融合タンパク質（GST−CD44v3−10）又はグルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼでコートした。次いで、ウェ
ルを連続希釈した血清又はハイブリドーマ上清とインキ
ュベートし、特定の抗体をマウス免疫グロブリンに対す
るパーオキシダーゼ結合抗体で検出した。グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼとのみ反応するハイブリドー
マを廃棄した。次いで、残りの抗体を、領域特異的融合
タンパク質（エキソンv3、エキソンv5＋v6、エキソンv6
＋v7、エキソンv8−v10）を用いて特徴づけた（Koopman
ら,1993）。その後、ヒト皮膚切片でこれらの抗体の免
疫組織化学的反応試験を行った。次いで、抗体VFF−18
を合成ペプチドHul（QWFGNRWHEGYRQT）との結合によっ
て同定した。Hulの配列はヒトCD44エキソンv6の断片で
ある。
クリーニングを、それぞれ、ELISAを用いて行った。こ
の検定において、マイクロタイタープレートを、先ず、
融合タンパク質（GST−CD44v3−10）又はグルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼでコートした。次いで、ウェ
ルを連続希釈した血清又はハイブリドーマ上清とインキ
ュベートし、特定の抗体をマウス免疫グロブリンに対す
るパーオキシダーゼ結合抗体で検出した。グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼとのみ反応するハイブリドー
マを廃棄した。次いで、残りの抗体を、領域特異的融合
タンパク質（エキソンv3、エキソンv5＋v6、エキソンv6
＋v7、エキソンv8−v10）を用いて特徴づけた（Koopman
ら,1993）。その後、ヒト皮膚切片でこれらの抗体の免
疫組織化学的反応試験を行った。次いで、抗体VFF−18
を合成ペプチドHul（QWFGNRWHEGYRQT）との結合によっ
て同定した。Hulの配列はヒトCD44エキソンv6の断片で
ある。
実施例2:CD44v6特異的抗体の合成ペプチドへの結合
CD44v6特異的抗体の合成ペプチドへの結合をELISAに
より検出した。
より検出した。
溶液：
コーティングバッファー:0.05M 炭酸ナトリウム，
pH9.6
検定バッファー:PBS（食塩加リン酸バッファー）
0.5％BSA（牛血清アルブミン）
0.05％Tween20
基質溶液： Kierkegaard ＆ Perry Laboratorie
s,Gaithersburg,MD,USA;TMBパーオキシダーゼ基質：パ
ーオキシダーゼ溶液Ｂ（H2O2）1:1 ペプチド（コーティングバッファー中50μg/ml濃度）
をNUNC Maxisorpimmunoplate（1.1ASML）又はBio Produ
cts由来のActi Aプレート（VFF抗体）に４℃で一晩固定
した。Acti Aプレートの場合は、ペプチドはプレートに
共有結合で結合した。次いで、プレートをPBS/0.05％
Tween20で洗浄し、プレート表面のフリーの吸着部位を
検定バッファーを用いてブロックし（室温で１時間）、
再びPBS/0.05％ Tween20で洗浄した。Acti Aプレート
を、10mM硼化水素ナトリウム加20mM炭酸水素ナトリウ
ム,pH9.0で希釈し（室温で１時間攪拌しながら）、次い
で３回洗浄した。0.02〜10.0μg/mlの濃度のハイブリド
ーマ上清又は抗体溶液を、それぞれウェルに加え、室温
で２時間振盪させた。その後、プレートをPBS/0.05％
Tween20で３回洗浄した。次いて、検定バッファー中に
適当に希釈された、西洋ワサビパーオキシダーゼ結合抗
マウスIgG抗体を100μl/ウェル加えた。振りながら２時
間室温でインキュベートした後、プレートを３回洗浄
し、基質溶液をウェルに加えた。10〜15分後、2M硫酸で
現像を止め、分光光度計で450nm（対照:690nm）の吸光
度を測定した。
s,Gaithersburg,MD,USA;TMBパーオキシダーゼ基質：パ
ーオキシダーゼ溶液Ｂ（H2O2）1:1 ペプチド（コーティングバッファー中50μg/ml濃度）
をNUNC Maxisorpimmunoplate（1.1ASML）又はBio Produ
cts由来のActi Aプレート（VFF抗体）に４℃で一晩固定
した。Acti Aプレートの場合は、ペプチドはプレートに
共有結合で結合した。次いで、プレートをPBS/0.05％
Tween20で洗浄し、プレート表面のフリーの吸着部位を
検定バッファーを用いてブロックし（室温で１時間）、
再びPBS/0.05％ Tween20で洗浄した。Acti Aプレート
を、10mM硼化水素ナトリウム加20mM炭酸水素ナトリウ
ム,pH9.0で希釈し（室温で１時間攪拌しながら）、次い
で３回洗浄した。0.02〜10.0μg/mlの濃度のハイブリド
ーマ上清又は抗体溶液を、それぞれウェルに加え、室温
で２時間振盪させた。その後、プレートをPBS/0.05％
Tween20で３回洗浄した。次いて、検定バッファー中に
適当に希釈された、西洋ワサビパーオキシダーゼ結合抗
マウスIgG抗体を100μl/ウェル加えた。振りながら２時
間室温でインキュベートした後、プレートを３回洗浄
し、基質溶液をウェルに加えた。10〜15分後、2M硫酸で
現像を止め、分光光度計で450nm（対照:690nm）の吸光
度を測定した。
最初の実験で、ラットCD44v6特異的抗体1.1ASMLのペ
プチドRal（KWFEN EWQGK NPPT）への結合が検出された
（表１、図３（Ａ））。
プチドRal（KWFEN EWQGK NPPT）への結合が検出された
（表１、図３（Ａ））。
別の実験では、Ralと相同のヒトCD44v6配列由来のペ
プチドが合成された（Hul,QWFGN RWHEG YRQT）。種々の
抗−ヒトCD44v6抗体がHulと結合した。驚くことに、VFF
−18が、試験した他の抗体に比して、このペプチドと高
い結合アフィニティーを示した（表２、図３（Ｂ））。
プチドが合成された（Hul,QWFGN RWHEG YRQT）。種々の
抗−ヒトCD44v6抗体がHulと結合した。驚くことに、VFF
−18が、試験した他の抗体に比して、このペプチドと高
い結合アフィニティーを示した（表２、図３（Ｂ））。
定量的な評価のために、種々の濃度における精製抗−
ヒトCD44v6抗体をペプチドHulと結合させた。ここで
も、他の抗体に比して、VFF−18の実質的に良い結合ア
フィニティーが見られた（表３、図３（Ｃ））。
ヒトCD44v6抗体をペプチドHulと結合させた。ここで
も、他の抗体に比して、VFF−18の実質的に良い結合ア
フィニティーが見られた（表３、図３（Ｃ））。
実施例3:放射活性ラベルしたCD44v6特異的抗体の腫瘍細
胞系への結合抗体の放射活性ラベル 1mCiのＮ−スクシニミジル−［2,3−3H］−プロピオ
ネート（［3H］−NSP,Amersham,1mci/ml）を、０℃で、
シリコーンで処理した試料容器中で、水流ポンプ中で、
ほとんど乾燥するまで蒸発させた。15μｇの抗体（PBS,
pH7.4中、1mg/ml濃度）を加え、４℃で48時間インキュ
ベートした。次いで、30μｌの1Mグリシン加PBSと室温
で20分間反応させることにより、過剰の［3H］−NSPを
消滅させた。［3H］−グリシンからのラベル化抗体の分
離は、セファデックスＧ−25−Ｍ（カラム容積:15m
l）、及び溶出バッファーとしてPBS/0.5％BSAを用いて
行った。［3H］−ラベル化抗体はボイドボリュームに現
れた。抗体の量を、マウス免疫グロブリンとしてELISA
を用いて定量し、特異的活性を計算した。
胞系への結合抗体の放射活性ラベル 1mCiのＮ−スクシニミジル−［2,3−3H］−プロピオ
ネート（［3H］−NSP,Amersham,1mci/ml）を、０℃で、
シリコーンで処理した試料容器中で、水流ポンプ中で、
ほとんど乾燥するまで蒸発させた。15μｇの抗体（PBS,
pH7.4中、1mg/ml濃度）を加え、４℃で48時間インキュ
ベートした。次いで、30μｌの1Mグリシン加PBSと室温
で20分間反応させることにより、過剰の［3H］−NSPを
消滅させた。［3H］−グリシンからのラベル化抗体の分
離は、セファデックスＧ−25−Ｍ（カラム容積:15m
l）、及び溶出バッファーとしてPBS/0.5％BSAを用いて
行った。［3H］−ラベル化抗体はボイドボリュームに現
れた。抗体の量を、マウス免疫グロブリンとしてELISA
を用いて定量し、特異的活性を計算した。
放射ラベル化抗体の腫瘍細胞への結合
３種の抗体、VFF−７（抗−v6）、VFF−８（抗−v5）
及びVFF−18（抗−v6）をＮ−スクシニミジル−［2,3−
3H］−プロピオネートで放射ラベルし、種々の腫瘍細胞
系で結合検定に用いた。以下の細胞系を用いた：即ち、
CHO−CD44var:細胞表面でヒト変異体CD44（エキソンv3
−v10）を発現する組み換えハムスター細胞系（チャイ
ニーズハムスター卵巣）:HCT−116、CX−１、HT−29、C
aCo、COLO 205、ヒト結腸癌細胞系:A431:ヒト扁平上皮
細胞癌細胞系が用いられた。
及びVFF−18（抗−v6）をＮ−スクシニミジル−［2,3−
3H］−プロピオネートで放射ラベルし、種々の腫瘍細胞
系で結合検定に用いた。以下の細胞系を用いた：即ち、
CHO−CD44var:細胞表面でヒト変異体CD44（エキソンv3
−v10）を発現する組み換えハムスター細胞系（チャイ
ニーズハムスター卵巣）:HCT−116、CX−１、HT−29、C
aCo、COLO 205、ヒト結腸癌細胞系:A431:ヒト扁平上皮
細胞癌細胞系が用いられた。
細胞を12ウェルの組織培養プレートに接種し、CO2イ
ンキュベーター中で37℃で一晩培養し、PBSで洗浄しエ
タノールで固定した（室温で１分）。次いで、細胞を培
養培地（RPMI 1640/10％牛胎児血清）で洗浄し、放射
活性担体（培養培地に溶解したもの、250000dpm/ウェ
ル）を加えた。振盪しながら室温で25時間インキュベー
トした後、プレートをPBS/0.5％BSAで３回洗浄し、0.1M
水酸化ナトリウム/1％Triton X−100で細胞を可溶化し
放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。10
0倍過剰のラベルしていない抗体の存在下、非特異的結
合を検出した。結合は、標準細胞数と相関関係があった
（400000細胞）。抗体の特異的活性を検出した後、結合
抗体の量をfmolで表した。
ンキュベーター中で37℃で一晩培養し、PBSで洗浄しエ
タノールで固定した（室温で１分）。次いで、細胞を培
養培地（RPMI 1640/10％牛胎児血清）で洗浄し、放射
活性担体（培養培地に溶解したもの、250000dpm/ウェ
ル）を加えた。振盪しながら室温で25時間インキュベー
トした後、プレートをPBS/0.5％BSAで３回洗浄し、0.1M
水酸化ナトリウム/1％Triton X−100で細胞を可溶化し
放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。10
0倍過剰のラベルしていない抗体の存在下、非特異的結
合を検出した。結合は、標準細胞数と相関関係があった
（400000細胞）。抗体の特異的活性を検出した後、結合
抗体の量をfmolで表した。
表４及び図４に、抗体の種々の細胞への特異的結合を
示した。v6特異的抗体VFF−７及びVFF−18の組み換え細
胞系CHO−CD44varへの結合はほぼ同じ程度であるけれど
も、これらの抗体は、腫瘍細胞系に対しては実質的に異
なる結合作用を示す。いくつかのケースにおいては、VF
F−18のみが結合を示し、より小さい範囲でVFF−８の結
合も見られ（HT−29、CaCo、COLO 205）、他のケース
ではVFF−18がVFF−７よりも顕著に結合した。
示した。v6特異的抗体VFF−７及びVFF−18の組み換え細
胞系CHO−CD44varへの結合はほぼ同じ程度であるけれど
も、これらの抗体は、腫瘍細胞系に対しては実質的に異
なる結合作用を示す。いくつかのケースにおいては、VF
F−18のみが結合を示し、より小さい範囲でVFF−８の結
合も見られ（HT−29、CaCo、COLO 205）、他のケース
ではVFF−18がVFF−７よりも顕著に結合した。
実施例4:血清中の可溶性CD44v6の検出のためのELISA
溶液：
コーティングバッファー:0.05M炭酸ナトリウム,pH9.6
検定バッファー:PBS（食塩加リン酸バッファー）
0.5％BSA（牛血清アルブミン）
0.05％Tween 20
試料希釈液： Bender MedSystems,Vienna,Austria
基質溶液： Kierkegaard ＆ Perry Laboratorie
s,Gaithersburg,MD,USA;TMBパーオキシダーゼ基質：パ
ーオキシダーゼ溶液Ｂ（H2O2）1:1 マイクロタイタープレート（Nunc−Immunoplate Maxi
Sorp F96）を５μg/mlのCD44v6特異的抗体でコートした
（４℃で一晩インキュベート）。その後、プレートをPB
S/0.05％Tween 20で洗浄し、プレート表面のフリーの吸
着部位を検定バッファーを用いてブロックし（室温で１
時間）、プレートを再び洗浄した。血清試料を検定バッ
ファーで予め少なくとも1:5に希釈し、ウェル内で更に
連続的に1:2に希釈した。次いで、検定バッファーで適
当に希釈した（1:3000−1:10000）西洋ワサビパーオキ
シダーゼ結合抗−CD44std抗体（Clone BU−52,The Bind
ing Site,Birmingham）を50μl/ウェルに加えた。振盪
しながら室温で３時間インキュベートした後、プレート
を３回洗浄し、基質溶液を加えた。10〜15分後、2M硫酸
で発色を止め、分光光度計で450nm（対照:690nm）の吸
光度を測定した。
s,Gaithersburg,MD,USA;TMBパーオキシダーゼ基質：パ
ーオキシダーゼ溶液Ｂ（H2O2）1:1 マイクロタイタープレート（Nunc−Immunoplate Maxi
Sorp F96）を５μg/mlのCD44v6特異的抗体でコートした
（４℃で一晩インキュベート）。その後、プレートをPB
S/0.05％Tween 20で洗浄し、プレート表面のフリーの吸
着部位を検定バッファーを用いてブロックし（室温で１
時間）、プレートを再び洗浄した。血清試料を検定バッ
ファーで予め少なくとも1:5に希釈し、ウェル内で更に
連続的に1:2に希釈した。次いで、検定バッファーで適
当に希釈した（1:3000−1:10000）西洋ワサビパーオキ
シダーゼ結合抗−CD44std抗体（Clone BU−52,The Bind
ing Site,Birmingham）を50μl/ウェルに加えた。振盪
しながら室温で３時間インキュベートした後、プレート
を３回洗浄し、基質溶液を加えた。10〜15分後、2M硫酸
で発色を止め、分光光度計で450nm（対照:690nm）の吸
光度を測定した。
定量化のために、可溶性CD44標準試料の検定バッファ
ーによる連続希釈液を血清試料と平行して準備した。こ
の試料は、可溶性CD44v3−v10を発現する組み換えハム
スター細胞（CHO）の上清から精製した。CD44v3−v10
は、エキソンv3〜v10を含むヒトCD44変異体である。
ーによる連続希釈液を血清試料と平行して準備した。こ
の試料は、可溶性CD44v3−v10を発現する組み換えハム
スター細胞（CHO）の上清から精製した。CD44v3−v10
は、エキソンv3〜v10を含むヒトCD44変異体である。
表５及び図５は、正常ヒト血清中にエキソンv6を含む
可溶性CD44変異体が存在することを示す。３種のv6特異
的抗体VFF−４、VFF−７及びVFF−18を、サンドイッチE
LISAにおけるコーティング抗体として用いた。３種の全
てのケースにおいて、パーオキシダーゼ結合CD44std特
異的抗体（BU−52,std＝標準）を検出抗体として用い
た。種々の希釈において２種の正常ヒト血清のシグナル
が見られた（（Ａ）及び（Ｂ））。両方のケースにおい
て、VFF−18では、他の抗体に比して実質的に強いシグ
ナルが観察された。
可溶性CD44変異体が存在することを示す。３種のv6特異
的抗体VFF−４、VFF−７及びVFF−18を、サンドイッチE
LISAにおけるコーティング抗体として用いた。３種の全
てのケースにおいて、パーオキシダーゼ結合CD44std特
異的抗体（BU−52,std＝標準）を検出抗体として用い
た。種々の希釈において２種の正常ヒト血清のシグナル
が見られた（（Ａ）及び（Ｂ））。両方のケースにおい
て、VFF−18では、他の抗体に比して実質的に強いシグ
ナルが観察された。
表６及び図６は、CD44変異体を含むv6の血清中の濃度
を示す。６人の健康人ドナーの血清中の可溶性CD44var
の量を２種のELISAで定量した。１つの試験ではVFF−７
を、他の試験ではVFF−18をコーティング抗体として用
いた。両方のケースにおいて、コントロールとしてCHO
細胞中で生産される組み換え可溶性CD44変異体（エキソ
ンv3−v10）を用いた。VFF−18 ELISAはVFF−７ ELIS
Aに比して平均3.5倍高い値を示した。これは、組み換え
タンパク質と比較しての値を意味する。血清中に存在す
る可溶性CD44varは、VFF−７よりもVFF−18により良く
認識される。
を示す。６人の健康人ドナーの血清中の可溶性CD44var
の量を２種のELISAで定量した。１つの試験ではVFF−７
を、他の試験ではVFF−18をコーティング抗体として用
いた。両方のケースにおいて、コントロールとしてCHO
細胞中で生産される組み換え可溶性CD44変異体（エキソ
ンv3−v10）を用いた。VFF−18 ELISAはVFF−７ ELIS
Aに比して平均3.5倍高い値を示した。これは、組み換え
タンパク質と比較しての値を意味する。血清中に存在す
る可溶性CD44varは、VFF−７よりもVFF−18により良く
認識される。
参考文献
Barbas C F,Bjorling E,Chiodi F,Dunlop N,Cababa D,J
ones T M,Zebedee S L,Persson M A A,Nara P L,Norrby
E,Burton D R.Rcombinant human Fab fragments neutr
alize human type 1 immunodeficiency virus in vitr
o.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:9339−9343（1992） Breitz H B,Weiden P L,Vanderheyden J−L,Appelbaum
J W,Bjorn M J,Fer M F,Wolf S B,Ratcliff B A,Seiler
C A,Foisie D C,Fisher D R,Schroff R W,Fritzberg A
R,Abrams P G.Clinical experience with rhenium−18
6−labeled monoclonal antibodies for radioimmunoth
erapy:results of phase I trials.J.Nucl.Med.33:1099
−112（1992） Catty,D.,Raykundalia,C.ELISA and related immunoass
ays.In:Catty,D（Hrsg）.Antibodies Vol.II.IRL Press
Oxford（1989）,97−152,pp105−109 Catty,D.,Murphy,G.Immunoassays using radiolabels.I
n:Catty,D（Hrsg）.Antibodies Vol.II.IRL Press Oxfo
rd（1989）,pp77−96 Chatal J−F,Saccavini J−C,Gestin J−F,Thedrez P,C
urtet C,Kremer M,Guerreau D,Nolibe D,Fumoleau P,Gu
illard Y.Biodistribution of indium−111−labeled O
C 125 monoclonal antibody intraperitoneally inject
ed into patients operated on for ovarian carcinoma
s.Cancer Res.49:3087−3094（1989） Chaudhary V K,Batra J K,Galdo M G,Willingham M C.F
itzgerald D J,Pastan I.A rapid method of cloning f
unctional variable−region antibody genes in Esche
richia coli as single−chain immunotoxins.Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.87:1066（1990） Colcher D,Esteban J,Carrasquillo J A,Sugarbaker P,
Reynolds J C,Bryant G,Larson S M,Schlom J.Compleme
ntation of intracavitary and intravenous administr
ation of a monoclonal antibody（B72.3）in patients
with carcinoma.Cancer Res.47:4218−4224（1987） Coloma M J,Hastings A,Wims L A,Morrison S L.Novel
vectors for the expression of antibody molecules u
sing variable regions generated by polymerase chai
n reaction.J.Immunol.Methods 152:89−104（1992） Friedmann P N,McAndrew S J.Gawlak S L,Chace D,Trai
l P A,Brown J P,Siegall C B,BR96 sFv−PE40,a poten
t single−chain immunotoxin that selectively kills
carcinoma cells.Cancer Res.54:334−339（1993） Goodwin D A.A new approach to the problem of targe
ting specific monoclonal antibodies to human tumor
s using anti−hapten chimeric antibodies.J.Nucl.Me
d.Biol.16:645（1989） Gunthert,U.,Hofmann,M.,Rudy,W.,Reber,S.,Zoller,M.,
Haussman,I.,Matzku,S.,Wenzel,A.,Ponta,H.,and Herrl
ich,P.A new variant of glycoprotein CD44 confers m
etastatic potential to rat carcinoma cells.Ce11 6
5:13−24（1991） Guesdon,J.I.,Ternynck,T.,Avrameas,S.J.Histochem.Cy
tochem.27:1131（1979） Gussow D,Seemann G.Humanization of monoclonal anti
bodies.Methods Enzymol.203:99−121（1991） Heider,K.−H.,Hofmann,M.,Horst,E.,van Berg,F.,Pont
a,H.,Herrlich,P.,and Pals,S.T.A human homologue of
the rat metastasis−associated variant of CD44 is
expressed in colorectal carcinomas and adenomatou
s polyps.J.Cell Biol.120:227−233（1993a） Heider,K.−H.,Dammrich,J.,Skroch−Angel,P.,Muller
−Hermelink,H−K.,Vollmers,H−P.,Herrlich,P.,and P
onta,H.Differential expression of CD44 splice vari
ants in intestinal−and diffuse−type human gastri
c carcinomas and normal gastric mucosa.Cancer Res.
53:4197−4203（1993b） Hofmann,M.,Rudy,W.,Zoller,M.,Tolg,C.,Ponta,H.,Herr
lich P.,and Gunthert,U.CD44 splice variants confer
metastatic behavior in rats:homologous sequences
are expressed in human tumor cell lines.Cancer Re
s.51:5292−5297（1991） Johnson,G.D.Immunofluorescence.In:Catty,D（Hrsg）.
Antibodies Vol.II.IRL Press Oxford（1989）,179−20
0,pp180−189 Johnson S.Bird R E.Construction of single−chain d
erivatives of monoclonal antibodies and their prod
uction in Escherichia coli.Methods Enzymol.203:88
−98（1991） Kearney,J.F.,Radbruch A.,Liesegang B.,Rajewski K.A
New mouse myeloma cell line that has lost immunog
lobulin expression but permits construction of ant
ibody−secreting hybrid cell lines.J.Immunol.123:1
548（1979） Keenan A M,Weinstein J N,Carrasquillo J A,Bunn P
A,Reynolds J C,Foon K A et al.Immunolymphoscintigr
aphy and the dose dependence of 111In−labeled T10
1 monoclonal antibody in patients with cutaneous T
−cell lymphoma.Cancer Res.47:6093−6099（1987） Kohler,G.,Milstein,C.Continous culture of fused ce
lls secreting antibody predefined specificity.Natu
re 265:495（1975） Koopman,G.,Heider,K.−H.,Horts,E.,Adolf,G.R.,van d
en Berg,F.,Ponta,H.,Herrlich,P.,Pals,S.T.Activated
human lymphocytes and aggressive Non−Hodgkin's l
ymphomas express a homologue of the rat metastasis
−associated variant of CD44.J.Exp.Med.177:897−90
4（1993） Kreitman R J Hansen H J,Jones A L,FitzGerald D J
P,Goldenberg D M,Pastan I.Pseudomonas exotoxin−ba
sed immunotoxins containing the antibody LL2 of LL
2−Fab' induce regression of subcutaneous human B
−cell lymphomain mice.Cancer Res.53:819−825（199
3） Larson S M,Cheung N−K V,Leibel S A.Radioisotope C
onjugates.In:DeVita V T,Hellman S,Rosenberg S A（E
ds.）.Biologic therapy of cancer.J.B.Lippincott Co
mp.,Philadelphia,496−511（1991） Mulshine J L,Magnani J L,Linnoila R I:Applications
of monoclonal antibodies in the treatment of soli
d tumors.In:DeVita V T.Hellman S,Rosenberg S A（Ed
s）.Biologic therapy of cancer.J.B.Lippincott Com
p.,Philadelphia,pp563−588（1991） Nesbit M,Fu Z F,McDonald−Smith J.Steplewski Z,Cur
tis P J.Production of a functional monoclonal anti
body recognizing human colorectal carcinoma cells
from a baculovirus expression system.J.Immunol Met
hods 151:201−208（1992） Perkins A C,Pimm M V.A role for gamma scintigraphy
in cancer immunology and immunotherapy.Eur.J.Nuc
l.Med.19:1054−1063（1992） Press O W,Eary J F.Badger C C,Martin P J,Applebaum
F R,Levy R,Miller R,Brown S,Nelp W B,Krohn K A,Fi
sher D,DeSantes K,Porter B,Kidd P,Thomas E D,Berns
tein I D,Treatment of refractory Non−Hodgkin's ly
mphoma with radiolabeled MB−１（anti−CD37）antib
ody.J.Clin.Oncol.7:1027−1038（1989） Rudy,W.,Hofmann,M.,Schwartz−Albiez,R.,Zoller,M.,H
eider,K−H.,Ponta,H.,Herrlich,P.The two major CD44
proteins expressed on a metastatic rat tumor cell
line are derived form different splice variants:E
ach one individually suffices to confer metastatic
behaviour.Cancer Res.53:1262−1268（1993） Schrappe M,Bumol T F,Apelgren L D,Briggs S L,Koppe
l G A,Markowitz D D,Mueller B M,Reisfeld R A.Long
−term growth supperssion of human glioma xenograf
ts by chemo−immunoconjugates of 4−desacetylvinbl
astine−３−carboxyhydrazide and monoclonal antibo
dy 9.2.27.Cancer Res.52:3838−3844（1992） Screaton,G.R.,Bell,M.V.,Jackson,D.G.,Cornelis,F.
B.,Gerth,U.,and Bell J.I.Genomic structure of DNA
encoding the lymphocyte homing receptor CD44 revea
ls at least 12 alternatively spliced exons.Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.89:12160−12164（1992） Sears H F,Mattis J,Herlyn D,Hayry P,Atkinson B,Ern
st C.Steplewski Z,Koprowski H.Phase−I clinical tr
ial of monoclonal antibody in treatment of gastroi
ntestinal tumors.Lancet 1982（１）:762−765（198
2） Seiter,S.,Arch,R.,Reber,S.,Komitowski,D.,Hofmann,
M.,Ponta,H:,Herrlich,P.,Matzku,S.,Zoller,M.Prevent
ion of tumor metastasis formation by anti−variant
CD44.J.Exp.Med.177:443−455（1993） Senter P D,Schreiber G J,Hirschberg D L,Ashe S A,H
ellstrom K E,Hellstrom I.Enhancement of the in vit
ro and in vivo antitumor activities of phosphoryla
ted mitomycin C and etoposide derivatives by monoc
lonal antibody−alkaline phosphatase conjugates.Ca
ncer Res.49:5789−5792（1989） Shin S−U,Morrison S L.Production and properties o
f chimeric antibody molecules.Methods Enzymol.178:
459−476（1989） Smith,D.B.,Johnson,K.S.Single−step purification o
f polypeptide expressed in Escherichia coli as fus
ions with glutathione S−transferase.Gene 67:31−4
0（1988） Srivastava S C（Hrsg）.Radiolabeled monoclonal ant
ibodies for imaging and therapy.Life Sciences Seri
es A 152,Plenum New York（1988） Tolg,C.,Hofmann,M.,Herrlich,P.,and Ponta,H.Splicin
g choice from ten variant exons establishes CD44 v
ariability.Nucleic Acids.Res.21:1225−1229（1993） Theuer C P,Kreitman R J.FitzGerald D J,Pastan I.Im
munotoxins made with a recombinant form of pesudom
onas exotoxin A that do not require proteolysis fo
r activity.Cancer Res.53:340−347（1993） Thompson C H,Stacker S A,Salehi N,Lichtenstein M,L
eyden M J,Andrews J T.Immunoscintigraphy for detec
tion of lymph node metastases from breast cancer.L
ancet 1984（２）:1245−1247（1984） Thomas G D,Dykes P W,Bradwell A R.Antibodies for t
umour immunodetection and methods for antibody rad
iolabeling.In:Catty D（Ed.）.Antibodies.IRL Press
Oxford,（1989）,pp223−244 Vitetta E S,Thorpe P E.Immunotoxins.In:DeVita V T,
Hellman S,Rosenberg S A（Eds.）.Biologic therapy o
f cancer.J.B.Lippincott Comp.,Philadeophia,482−49
5（1991） Vitetta E S,Stone M,Amlot P.Fay J,May R,Till M,New
man J.Clark P,Collins R,Cunningham D,Ghetie V,Uhr
J W,Thorpe P E.Phase I immunotoxin trial in patien
ts with B−cell lymphoma.Cancer Res.51:4052−4058
（1991） Wang S−M,Chern J−W,Yeh M−Y,Ng J C,Tung E,Roffle
r S R.Specific activation of glucuronide prodrugs
by antibody−targeted enzyme conjugates for cancer
therapy.Cancer Res.52:4484−4491（1992） Weiner L M,O'Dwyer J,Kitson J,Comis R L,Frankel A
E,Bauer R J,Kopnrad M S,Groves E S.Phase I evaluat
ion of an anti−breast carcinoma monoclonal antibo
dy 260F9−recobminant ricin A chain immunoconjugat
e.Cancer Res.49:4062−4067（1989） Wielenga,V.J.M.,Heider,K.−H.,Offerhaus,G.J.A.,Ado
lf.G.R.,van den Berg,F.M.,Ponta,H.,Herrlich,P.,Pal
s,S.T.Expression of CD44 variant proteins in human
colorectal cancer is related to tumor progressio
n.Cancer Res.53:4754−4756（1993） Winter,G.,Griffith,A.D.,Hawkins,R.E.,Hoogenboom,H.
R.Making antibodies by phage display technology.An
n.Rev.Immunol.12,433−455（1994）
ones T M,Zebedee S L,Persson M A A,Nara P L,Norrby
E,Burton D R.Rcombinant human Fab fragments neutr
alize human type 1 immunodeficiency virus in vitr
o.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:9339−9343（1992） Breitz H B,Weiden P L,Vanderheyden J−L,Appelbaum
J W,Bjorn M J,Fer M F,Wolf S B,Ratcliff B A,Seiler
C A,Foisie D C,Fisher D R,Schroff R W,Fritzberg A
R,Abrams P G.Clinical experience with rhenium−18
6−labeled monoclonal antibodies for radioimmunoth
erapy:results of phase I trials.J.Nucl.Med.33:1099
−112（1992） Catty,D.,Raykundalia,C.ELISA and related immunoass
ays.In:Catty,D（Hrsg）.Antibodies Vol.II.IRL Press
Oxford（1989）,97−152,pp105−109 Catty,D.,Murphy,G.Immunoassays using radiolabels.I
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rd（1989）,pp77−96 Chatal J−F,Saccavini J−C,Gestin J−F,Thedrez P,C
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s.Cancer Res.49:3087−3094（1989） Chaudhary V K,Batra J K,Galdo M G,Willingham M C.F
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unctional variable−region antibody genes in Esche
richia coli as single−chain immunotoxins.Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.87:1066（1990） Colcher D,Esteban J,Carrasquillo J A,Sugarbaker P,
Reynolds J C,Bryant G,Larson S M,Schlom J.Compleme
ntation of intracavitary and intravenous administr
ation of a monoclonal antibody（B72.3）in patients
with carcinoma.Cancer Res.47:4218−4224（1987） Coloma M J,Hastings A,Wims L A,Morrison S L.Novel
vectors for the expression of antibody molecules u
sing variable regions generated by polymerase chai
n reaction.J.Immunol.Methods 152:89−104（1992） Friedmann P N,McAndrew S J.Gawlak S L,Chace D,Trai
l P A,Brown J P,Siegall C B,BR96 sFv−PE40,a poten
t single−chain immunotoxin that selectively kills
carcinoma cells.Cancer Res.54:334−339（1993） Goodwin D A.A new approach to the problem of targe
ting specific monoclonal antibodies to human tumor
s using anti−hapten chimeric antibodies.J.Nucl.Me
d.Biol.16:645（1989） Gunthert,U.,Hofmann,M.,Rudy,W.,Reber,S.,Zoller,M.,
Haussman,I.,Matzku,S.,Wenzel,A.,Ponta,H.,and Herrl
ich,P.A new variant of glycoprotein CD44 confers m
etastatic potential to rat carcinoma cells.Ce11 6
5:13−24（1991） Guesdon,J.I.,Ternynck,T.,Avrameas,S.J.Histochem.Cy
tochem.27:1131（1979） Gussow D,Seemann G.Humanization of monoclonal anti
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a,H.,Herrlich,P.,and Pals,S.T.A human homologue of
the rat metastasis−associated variant of CD44 is
expressed in colorectal carcinomas and adenomatou
s polyps.J.Cell Biol.120:227−233（1993a） Heider,K.−H.,Dammrich,J.,Skroch−Angel,P.,Muller
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c carcinomas and normal gastric mucosa.Cancer Res.
53:4197−4203（1993b） Hofmann,M.,Rudy,W.,Zoller,M.,Tolg,C.,Ponta,H.,Herr
lich P.,and Gunthert,U.CD44 splice variants confer
metastatic behavior in rats:homologous sequences
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s.51:5292−5297（1991） Johnson,G.D.Immunofluorescence.In:Catty,D（Hrsg）.
Antibodies Vol.II.IRL Press Oxford（1989）,179−20
0,pp180−189 Johnson S.Bird R E.Construction of single−chain d
erivatives of monoclonal antibodies and their prod
uction in Escherichia coli.Methods Enzymol.203:88
−98（1991） Kearney,J.F.,Radbruch A.,Liesegang B.,Rajewski K.A
New mouse myeloma cell line that has lost immunog
lobulin expression but permits construction of ant
ibody−secreting hybrid cell lines.J.Immunol.123:1
548（1979） Keenan A M,Weinstein J N,Carrasquillo J A,Bunn P
A,Reynolds J C,Foon K A et al.Immunolymphoscintigr
aphy and the dose dependence of 111In−labeled T10
1 monoclonal antibody in patients with cutaneous T
−cell lymphoma.Cancer Res.47:6093−6099（1987） Kohler,G.,Milstein,C.Continous culture of fused ce
lls secreting antibody predefined specificity.Natu
re 265:495（1975） Koopman,G.,Heider,K.−H.,Horts,E.,Adolf,G.R.,van d
en Berg,F.,Ponta,H.,Herrlich,P.,Pals,S.T.Activated
human lymphocytes and aggressive Non−Hodgkin's l
ymphomas express a homologue of the rat metastasis
−associated variant of CD44.J.Exp.Med.177:897−90
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P,Goldenberg D M,Pastan I.Pseudomonas exotoxin−ba
sed immunotoxins containing the antibody LL2 of LL
2−Fab' induce regression of subcutaneous human B
−cell lymphomain mice.Cancer Res.53:819−825（199
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onjugates.In:DeVita V T,Hellman S,Rosenberg S A（E
ds.）.Biologic therapy of cancer.J.B.Lippincott Co
mp.,Philadelphia,496−511（1991） Mulshine J L,Magnani J L,Linnoila R I:Applications
of monoclonal antibodies in the treatment of soli
d tumors.In:DeVita V T.Hellman S,Rosenberg S A（Ed
s）.Biologic therapy of cancer.J.B.Lippincott Com
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tis P J.Production of a functional monoclonal anti
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from a baculovirus expression system.J.Immunol Met
hods 151:201−208（1992） Perkins A C,Pimm M V.A role for gamma scintigraphy
in cancer immunology and immunotherapy.Eur.J.Nuc
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sher D,DeSantes K,Porter B,Kidd P,Thomas E D,Berns
tein I D,Treatment of refractory Non−Hodgkin's ly
mphoma with radiolabeled MB−１（anti−CD37）antib
ody.J.Clin.Oncol.7:1027−1038（1989） Rudy,W.,Hofmann,M.,Schwartz−Albiez,R.,Zoller,M.,H
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−term growth supperssion of human glioma xenograf
ts by chemo−immunoconjugates of 4−desacetylvinbl
astine−３−carboxyhydrazide and monoclonal antibo
dy 9.2.27.Cancer Res.52:3838−3844（1992） Screaton,G.R.,Bell,M.V.,Jackson,D.G.,Cornelis,F.
B.,Gerth,U.,and Bell J.I.Genomic structure of DNA
encoding the lymphocyte homing receptor CD44 revea
ls at least 12 alternatively spliced exons.Proc.Na
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st C.Steplewski Z,Koprowski H.Phase−I clinical tr
ial of monoclonal antibody in treatment of gastroi
ntestinal tumors.Lancet 1982（１）:762−765（198
2） Seiter,S.,Arch,R.,Reber,S.,Komitowski,D.,Hofmann,
M.,Ponta,H:,Herrlich,P.,Matzku,S.,Zoller,M.Prevent
ion of tumor metastasis formation by anti−variant
CD44.J.Exp.Med.177:443−455（1993） Senter P D,Schreiber G J,Hirschberg D L,Ashe S A,H
ellstrom K E,Hellstrom I.Enhancement of the in vit
ro and in vivo antitumor activities of phosphoryla
ted mitomycin C and etoposide derivatives by monoc
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ncer Res.49:5789−5792（1989） Shin S−U,Morrison S L.Production and properties o
f chimeric antibody molecules.Methods Enzymol.178:
459−476（1989） Smith,D.B.,Johnson,K.S.Single−step purification o
f polypeptide expressed in Escherichia coli as fus
ions with glutathione S−transferase.Gene 67:31−4
0（1988） Srivastava S C（Hrsg）.Radiolabeled monoclonal ant
ibodies for imaging and therapy.Life Sciences Seri
es A 152,Plenum New York（1988） Tolg,C.,Hofmann,M.,Herrlich,P.,and Ponta,H.Splicin
g choice from ten variant exons establishes CD44 v
ariability.Nucleic Acids.Res.21:1225−1229（1993） Theuer C P,Kreitman R J.FitzGerald D J,Pastan I.Im
munotoxins made with a recombinant form of pesudom
onas exotoxin A that do not require proteolysis fo
r activity.Cancer Res.53:340−347（1993） Thompson C H,Stacker S A,Salehi N,Lichtenstein M,L
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tion of lymph node metastases from breast cancer.L
ancet 1984（２）:1245−1247（1984） Thomas G D,Dykes P W,Bradwell A R.Antibodies for t
umour immunodetection and methods for antibody rad
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Hellman S,Rosenberg S A（Eds.）.Biologic therapy o
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man J.Clark P,Collins R,Cunningham D,Ghetie V,Uhr
J W,Thorpe P E.Phase I immunotoxin trial in patien
ts with B−cell lymphoma.Cancer Res.51:4052−4058
（1991） Wang S−M,Chern J−W,Yeh M−Y,Ng J C,Tung E,Roffle
r S R.Specific activation of glucuronide prodrugs
by antibody−targeted enzyme conjugates for cancer
therapy.Cancer Res.52:4484−4491（1992） Weiner L M,O'Dwyer J,Kitson J,Comis R L,Frankel A
E,Bauer R J,Kopnrad M S,Groves E S.Phase I evaluat
ion of an anti−breast carcinoma monoclonal antibo
dy 260F9−recobminant ricin A chain immunoconjugat
e.Cancer Res.49:4062−4067（1989） Wielenga,V.J.M.,Heider,K.−H.,Offerhaus,G.J.A.,Ado
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
前置審査
(72)発明者 アドルフ ギュンター エル
オーストリア アー1070 ウィーン シ
ュティフトガッセ 15−17−10
(72)発明者 パッツェルト エリック
オーストリア アー3002 プンケルスド
ルフ ハンス ブッフミューラー ガッ
セ ８
(56)参考文献 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．177,
Ｎｏ．４（1993）ｐ．897−904
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 16/30
C12N 5/10
C12P 21/08
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (14)
- 【請求項１】寄託番号DSM ACC2174のハイブリドーマ細
胞株によって生産される、CD44遺伝子の変異性エキソン
v6によってコードされるアミノ酸配列中のエピトープに
対する抗体VFF−18。 - 【請求項２】請求項１記載の抗体VFF−18を産生する、
寄託番号DSM ACC2174のハイブリドーマ細胞株。 - 【請求項３】請求項１記載の抗体に放射活性アイソトー
プおよび／または毒素を結合することによって得ること
ができる抗体分子。 - 【請求項４】請求項１記載の抗体の断片に放射活性アイ
ソトープおよび／または毒素を結合することによって得
ることができる抗体分子であって、CD44遺伝子の変異性
エキソンv6によってコードされるアミノ酸配列中のエピ
トープに結合し得る前記抗体分子。 - 【請求項５】請求項１記載の抗体の断片が請求項１記載
の抗体のFab又はＦ（ab′）２断片であることを特徴と
する請求項４に記載の抗体分子。 - 【請求項６】請求項１記載の抗体のイディオタイプを有
し、CD44遺伝子の変異性エキソンv6によってコードされ
るアミノ酸配列中のエピトープに結合し得る組換え抗体
分子。 - 【請求項７】請求項１記載の抗体のイディオタイプを有
する組換え抗体分子であって、相補性決定領域（CDR）
において請求項１に記載の抗体のCDRのアミノ酸配列と
同一のアミノ酸配列を有し、CD44遺伝子の変異性エキソ
ンv6によってコードされるアミノ酸配列中のエピトープ
に結合し得ることを特徴とする前記抗体分子。 - 【請求項８】キメラ分子、ヒト化抗体又は一本鎖抗体で
あるか、又は鎖のシャッフリングによって生成した抗体
分子であることを特徴とする、請求項６または７に記載
の組換え抗体分子。 - 【請求項９】他の分子又は放射活性アイソトープに結合
していることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか１
項に記載の組換え抗体分子。 - 【請求項１０】請求項１又は３〜９のいずれか１項に記
載の抗体又は抗体分子を使用することを特徴とする、ヒ
ト又は動物の腫瘍のin vitro検出方法。 - 【請求項１１】酵素結合免疫アッセイ又はラジオイムノ
アッセイであることを特徴とする、請求項10記載の方
法。 - 【請求項１２】免疫組織化学的方法であることを特徴と
する、請求項10記載の方法。 - 【請求項１３】請求項１又は３〜９のいずれか１項に記
載の抗体又は抗体分子を含む、腫瘍治療用医薬組成物。 - 【請求項１４】請求項１又は３〜９のいずれか１項に記
載の抗体又は抗体分子を含む、in vivo腫瘍診断用医薬
組成物。
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