CN113321731A - 结合人程序性死亡配体1(pd-l1)的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供特异性结合人程序性死亡配体1(PD‑L1)的分离的抗体以及此类抗体的抗原结合片段，以及包含所述抗PD‑L1抗体或结合片段和一组用于检测结合人PD‑L1的所述抗体或其抗原结合片段的复合物的试剂的试剂盒。本发明的抗体和抗原结合片段适用于组织样品中人PD‑L1表达的免疫组织化学检测。还提供编码本发明的抗体和抗原结合片段的核酸分子以及用于其表达的表达载体和宿主细胞。

Description

结合人程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体
本申请是申请日为2013年12月18日的中国专利申请CN201380065289.9 “结合人程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体”的分案申请。
技术领域
本发明涉及具有特异性序列的抗体，其结合人程序性死亡配体1(PD-L1)且适用于通过免疫组织化学(IHC)分析来检测人组织样品中的PD-L1表达。本发明还涉及采用这些抗人-PD-L1抗体的特异性IHC分析。
背景技术
PD-L1为一种细胞表面糖蛋白，其为两种用于程序性死亡1(PD-1)的已知配体之一，认为其在免疫调节和维持外周耐受性中起重要作用。已在许多免疫细胞的表面上观察到PD-L1的表达，所述免疫细胞包括未处理淋巴细胞和活化B和T细胞、单核细胞和树突状细胞(同上)。此外，PD-L1 mRNA由非淋巴组织(包括血管内皮细胞、上皮细胞、肌细胞)以及在扁桃体和胎盘组织中表达。参见例如Keir, M.E. 等人, Annu Rev Immunol. 26:677-704(2008); Sharp A.H. 等人, Nature Immunol. 8:239-245 (2007); Okazaki T andHonjo T, Internat. immunol. 19:813-824 (2007)。
也已在许多人癌症中观察到PD-L1表达，且肿瘤细胞表达的PD-L1与PD-1的相互作用可诱导肿瘤特异性T细胞的抑制或细胞凋亡。在例如卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌和黑色素瘤的大量样品中，在不考虑后续治疗情况下，证实PD-L1表达与不良预后和总存活期短有关。已证实阻断PD-L1与PD-1结合的抗PD-1单克隆抗体具有针对许多肿瘤类型的抗肿瘤活性，其中早期人临床数据表明具有表达PD-L1的肿瘤的患者更可能对抗PD-1治疗起反应。参见例如Iwai 等人, PNAS 99:12293-12297 (2002); Ohigashi 等人,Clin Cancer Res 11:2947-2953 (2005); Ghebeh 等人, Neoplasia 8:190-198 (2006);Hamanishi, J 等人, PNAS 104:3360-3365 (2007); Yang 等人, Invest Ophthalmol Vis Sci. 49(6):2518-2525 (2008); Gao 等人, Clin Cancer Res 15:971-979 (2009);Brahmer J.R. 等人, J Clin Oncol. 28:3167-3175 (2010)。
最近的报告描述15种抗人PD-L1抗体的检测***固定的石蜡包埋(FFPE)型人黑色素瘤样品中hPD-L1表达的效用的比较(Gadiot, J.,等人, Cancer 117(10)：2192-2201(2011))。此比较中所评价的效用标准为：(1)将石蜡包埋的组织染色的能力，(2)产生低背景染色和(3)通过与PD-L1融合蛋白进行预孵育来阻断与PD-L1的结合。作者推断Ab #4059 (一种兔抗人多克隆抗体(获自ProSci, Poway, CA USA))为15种测试抗体中唯一的可接受地符合所有这些标准的抗人PD-L1抗体(同上2195，第二栏)。
发明内容
本发明涉及一种抗人PD-L1单克隆抗体，其在FFPE扁桃体组织中产生一种IHC染色模式，本文的发明人认为该IHC染色模式与通过ProSci Ab #4059产生的染色模式相比免疫相关性更高。如下文实施例中所述，发明人发现此ProSci抗体(PRS4059，Sigma-Aldrich批号40590604)将扁桃体中的所有造血谱系以相等强度染色，而本发明的两种抗体22C3和20C3选择性染色扁桃体隐窝上皮细胞和滤泡性CD68+骨髓细胞(形态上与巨噬细胞一致)。此外，22C3和20C3显示这两个个别细胞群体之间的一致强度差异，其中隐窝上皮细胞中的染色强度显著大于滤泡性巨噬细胞。所有三种抗体(PRS4059、22C3和20C3)均通过与PD-L1抗原预孵育而中和，从而指示反应性由抗原结合结构域(CDR)介导。因此，本发明还涉及本发明抗体在检测人细胞表面上的PD-L1表达，包括检测FFPE组织切片中的PD-L1的IHC分析法中的用途。
在一个方面中，本发明提供一种特异性结合人PD-L1的分离的抗体或其抗原结合片段。分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的三个轻链CDR和CDRH1、CDRH2和CDRH3的三个重链CDR。
CDRL1选自：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 9的变体和SEQ ID NO: 21的变体。CDRL2选自SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 2的变体。CDRL3选自：SEQID NO: 3、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 10的变体和SEQ ID NO: 22的变体。
CDRH1选自：SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 26、SEQID NO: 27、SEQ ID NO: 14的变体、SEQ ID NO: 15的变体、SEQ ID NO: 26的变体和SEQ IDNO: 27的变体。CDRH2选自：SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 16的变体和SEQ ID NO: 28的变体。CDRH3选自：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO: 17的变体和SEQ ID NO: 29的变体。
在本发明的抗体和抗原结合片段中，除在参考序列中具有一个或两个保守氨基酸取代，且优选在参考序列中具有仅一个保守氨基酸取代外，变体CDR序列(轻链或重链)与参考序列相同。在优选实施方案中，三个轻链CDR中的至多两者为变体序列，且三个重链CDR中的至多两者为变体序列。在更优选实施方案中，六个CDR中的仅三者、两者或一者为变体序列。
在一个优选实施方案中，三个轻链CDR为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ IDNO: 3，且三个重链CDR为SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7。
在另一个优选实施方案中，三个轻链CDR为SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 2和SEQ IDNO: 10且三个重链CDR为SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17。
在又一个优选实施方案中，三个轻链CDR为SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 2和SEQID NO: 22且三个重链CDR为SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28和SEQ ID NO: 29。
一些本发明的抗体和抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区。轻链可变区选自：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 13的变体、SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO:25的变体，且重链可变区选自：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 20的变体、SEQID NO: 32和SEQ ID NO: 32的变体。在此类实施方案中，除在构架区(即CDR之外)具有多达五个保守氨基酸取代，且优选在构架区具有小于四个、三个或两个保守氨基酸取代外，变体轻链可变区序列与参考序列相同。类似地，除在构架区(即CDR之外)具有多达17个保守氨基酸取代，且优选在构架区具有小于十个、九个、八个、七个、六个或五个保守氨基酸取代外，变体重链可变区序列与参考序列相同。
在本发明的一个优选抗体或抗原结合片段中，轻链可变区为SEQ ID NO: 13且重链可变区为SEQ ID NO: 20。
本发明的另一个优选抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO: 25的轻链可变区和SEQ ID NO: 32的重链可变区。
在又一个实施方案中，本发明的抗体或结合片段包含SEQ ID NO: 25的轻链可变区和SEQ ID NO: 32的重链可变区，其中SEQ ID NO: 32中的X为pE。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或结合片段包含SEQ ID NO: 25的轻链可变区和SEQ ID NO: 32的重链可变区，其中SEQ ID NO: 32中的X为Q。
在所有上述抗体实施方案中，分离的抗体可以是任何类型的免疫球蛋白的全长抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE。抗体优选为IgG抗体，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个实施方案中，抗体包含小鼠IgG1恒定区。
尤其优选抗体为单克隆抗体20C3和22C3，其为分别由杂交瘤MEB037.20C3和MEB037.22C3表达的IgG1抗体。
本发明还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人PD-LI且阻断20C3或22C3或包含SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 32的参考抗体与人PD-L1的结合。在一个优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段阻断20C3和22C3中的每一者或以下中的每一者与人PD-L1的结合：(a)包含SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 20的参考抗体和(b)包含SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 32的参考抗体。
本发明还提供一种抗体组合物，其在制剂中包含上述抗体或抗体片段中的任一者。一种适合制剂包含20mM乙酸钠和9%蔗糖(pH 5.0)。在一个优选实施方案中，组合物包含抗体分子的混合物，其中混合物中的大多数(即大于60%、65%、70%、80%、85%、90%或95%中的任一者)抗体分子包含SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 32，其中SEQ ID NO: 32中的X为pE，且混合物中的其余抗体分子包含SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 32，其中SEQ ID NO: 32中的X为Q。
在任一上述实施方案中，抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、(Fab')2片段。
在任一上述实施方案中，抗体或抗原结合片段可进一步包含可检测标记。
本发明还提供一种编码任一上文所公开的抗体可变区的分离的核酸。在一个优选实施方案中，核酸包含SEQ ID NO: 33和SEQ ID NO: 34中的一者或两者。在另一个优选实施方案中，核酸包含SEQ ID NO: 35和SEQ ID NO: 36中的一者或两者。在任一个这些实施方案中，分离的核酸优选为表达载体。
本发明还涉及一种宿主细胞，其包含编码任一上文所公开的抗体可变区的表达载体。表达载体优选包含SEQ ID NO: 33和SEQ ID NO: 34或包含SEQ ID NO: 35和SEQ IDNO: 36。
本发明还提供一种分析自人移出的人组织样品中PD-L1表达的方法。该分析方法包括在允许PD-L1结合试剂特异性结合人PD-L1的条件下使组织样品与PD-L1结合试剂接触、移除未结合的PD-L1结合试剂和检测结合的PD-L1结合剂存在或不存在。在一个优选实施方案中，该方法进一步包括对结合的结合试剂的量进行定量。结合试剂为上文所述的单克隆抗体或抗原结合片段中的任一者。结合试剂优选为包含SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO:20或包含SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 32的抗体。在一个优选实施方案中，结合试剂为一种抗体组合物，其含有包含SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 32的抗体分子的混合物，其中大部分分子(即大于60%、65%、70%、80%、85%、90%或95%中的任一者)在SEQ ID NO: 32中的位置X处具有pE，且其余分子在SEQ ID NO: 32中的位置X处具有Q。
在另一个方面中，本发明提供一种分析人组织样品中的PD-L1表达的试剂盒。该试剂盒包含PD-L1结合剂和一组用于检测包含结合于人PD-L1的结合剂的复合物的试剂。PD-L1结合剂为特异性结合人PD-L1的任何上文所述的单克隆抗体或抗原结合片段。抗体或结合片段优选包含SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 20，或包含SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO:32。在一个优选实施方案中，结合试剂为一种抗体组合物，其含有包含SEQ ID NO: 25和SEQID NO: 32的抗体分子的混合物，其中大部分分子(即大于60%、65%、70%、80%、85%、90%或95%中的任一者)在SEQ ID NO: 32中的位置X处具有pE，且其余分子在SEQ ID NO: 32中的位置X处具有Q。
附图简要说明
图1显示由自杂交瘤MEB037.20C3分离的总RNA制备的抗体可变轻链和重链cDNA的核苷酸序列和由其编码的预测氨基酸序列(粗体)，括号指示前导肽的核苷酸和氨基酸序列且下划线指示CDR序列。
图2显示由自杂交瘤MEB037.22C3分离的总RNA制备的抗体可变轻链和重链cDNA的核苷酸序列和由其编码的预测氨基酸序列(粗体)，其中括号指示前导肽的核苷酸和氨基酸序列且下划线指示CDR序列。
图3显示抗体20C3和22C3的轻链和重链的成熟可变区的比对氨基酸序列，其中粗体指示序列发生变化的位置，下划线指示如由Kabat编号***所定义的CDR序列，且括号指示如由Chothia编号***所定义的重链CDR1。
图4显示使用市售抗体PRS4059(图4A)或本发明的22C3抗体(图4B)由免疫组织化学分析法所产生的扁桃体切片的染色，其中图4A和图4B右侧的切片显示与PD-L1-IgG1融合蛋白(R&D Systems)预孵育后的结果，该PD-L1-IgG1融合蛋白与抗人PD-L1抗体竞争以结合人PD-L1。
图5显示相邻正常FFPE扁桃体组织切片的照片，其中人PD-L1蛋白和原位杂交(ISH)mRNA表达分别使用抗体22C33(图5A)和原位杂交(ISH)(图5B)通过IHC分析法进行分析，且显示两个独特细胞群体之间的差异染色：隐窝上皮细胞(图5A，左侧放大图和图5B，上图)和滤泡性巨噬细胞(图5A，右侧放大图和图5B，下图)。
图6说明多种抗人PD-L1抗体和同种型对照抗体与HT144细胞(由mRNA分析(qPCR)已知其对hPD-L1的表达为阴性)(图6A)和LOX黑色素瘤细胞(已知其大量表达hPD-L1 mRNA(qPCR))(图6B)的结合的流式细胞评价的结果。
图7显示经工程改造的CHO细胞系(图7A)和人细胞系(图7B，图上方)的FFPE细胞沉淀上由抗体22C3产生的IHC染色，且显示染色强度与相同人细胞系中所测量的hPD-L1 mRNA表达水平显著相关(图7B，图下方)。
图8说明抗体22C3和20C3对hPD-L1的选择性结合和相对亲和力，其中图表显示基于细胞的ELISA实验的结果，其中将不表达hPD-L1(图8A)、表达hPDL-1(图8B和图8C)或表达人PD-L2(图8D)的细胞与指定初级抗体一起以指定浓度孵育，且然后如实施例中所述通过二级山羊抗人IgG抗体检测初级抗体的结合。
图9A、图9B和图9C分别显示抗体22C3、20C3和5F9的抗体结合竞争分析法的结果。数据显示抗体22C3 (图9A)和20C3 (图9B)结合不同但重叠的表位。
图10说明来自指定肿瘤类型的FFPE样品的22C3 ICH染色强度的半定量完形评分的结果，染色程度随评分数值的增加而增加。
图11说明IHC分析法中由抗体22C3检测的人PD-L1表达与黑色素瘤患者对抗人PD-1抗体(MK-3475)治疗的反应相关，图11A中显示对于hPD-L1表达描述为阳性、阴性或意义不明确的22C3-IHC染色的代表性图像，且图11B显示具有阳性或阴性反应且通过IHC分析法对于hPD-L1表达评分为阳性或阴性(包括评分为意义不明确的患者)的患者数目。
具体实施方式
缩写. 在本发明的整个说明书和实施例中将使用以下缩写：
ADCC 抗体依赖性细胞毒性
CDC 补体依赖性细胞毒性
CDR 除非另外指出，否则为使用Kabat编号***定义的免疫球蛋白可变区中的互补决定区
CHO 中国仓鼠卵巢
Clothia Al-Lazikani等人, JMB273:927-948 (1997)中所述的抗体编号***
EC50 产生50%功效或结合的浓度
ELISA 酶联免疫吸附剂分析法
FFPE ***固定石蜡包埋
FR 抗体构架区：除CDR区以外的免疫球蛋白可变区。
HRP 辣根过氧化酶
IFN 干扰素
IC50 产生50%抑制作用的浓度
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 由Elvin A. Kabat ((1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, Md.)创造的免疫球蛋白比对和编号***
mAb或Mab或MAb 单克隆抗体
MES 2-(N-吗啉基)乙烷磺酸
MOA 作用机制
NHS 正常人血清
PCR 聚合酶链式反应
pE 焦谷氨酸酯
PK 药代动力学
SEB 葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcus Enterotoxin B)
TT 破伤风类毒素
V区 IgG链的区段，其序列在不同抗体之间可不同。其延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的Kabat残基113。
VH 免疫球蛋白重链可变区
VK 免疫球蛋白κ轻链可变区。
定义
为可更容易理解本发明，下文对某些技术和科学术语进行特定定义。除非在本文中的其他地方特定定义，否则本文中所用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义。
除非上下文另外明确规定，否则如本文(包括随附权利要求)所使用的词语的单数形式，诸如"一(a, an)"和"该(the)"包括其相应的复数对象。
除非上下文或明确另外指示，否则"活化"在用于细胞或受体时是指用配体活化或处理细胞或受体。"配体"涵盖天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和来源于抗体的结合化合物。"配体"还涵盖小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。"活化"可指如由内部机制以及外部或环境因素所调节的细胞活化。
分子的"活性"可描述或可指分子与配体或受体的结合、催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性、其他分子的活性的调节等。分子的"活性"也可指调节或维持细胞间相互作用(例如粘着)的活性或维持细胞结构(例如细胞膜或细胞骨架)的活性。"活性"也可意指比活性(例如[催化活性]/[蛋白的毫克数]或[免疫活性]/[蛋白的毫克数])、生物区室中的浓度等。"活性"可指先天或适应性免疫***的组分的调节。
"给药"和"治疗"在用于动物、人、实验个体、细胞、组织、器官或生物流体时是指外源性医药剂、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、个体、细胞、组织、器官或生物流体的接触。细胞的治疗涵盖使试剂与细胞接触以及使试剂与流体接触，其中该流体与该细胞相接触。"给药"和"治疗"也意指通过试剂、诊断结合化合物或通过一种细胞例如对另一种细胞进行的体外和离体治疗。术语"个体"包括任何生物体，优选为动物，更优选为哺乳动物(例如大鼠、小鼠、犬、猫、兔)且最优选为人。
"治疗(Treat/treating)"意指将治疗剂，诸如含有任一种本发明的抗体或抗原结合片段的组合物以内部或外部方式施用于患有一种或多种疾病症状或怀疑患有疾病的个体或患者，该药剂对其具有治疗活性。通常，该药剂以诱导症状消退或以任何临床上可测量的水平抑制症状进展而有效减轻所治疗的个体或群体的一种或多种疾病症状的量施用。有效减轻任何特定疾病症状的治疗剂的量(也称为"治疗有效量")可根据诸如疾病病况、年龄和患者体重的因素以及药物在个体中引发所需反应的能力而变化。可通过医师或其他熟练保健提供者通常用于评价疾病症状的严重水平或进展状态的任何临床测量来评价疾病症状是否已减轻。尽管本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)不能有效减轻每一个体中的目标疾病症状，但如本领域中已知的任何统计学测试所确定，其应减轻统计上显著量的个体中的目标疾病症状，该测试为诸如Student氏t检验、chi2检验、根据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra-检验和Wilcoxon-检验。
"治疗"在用于人、兽医学或研究个体时是指治疗性治疗以及研究和诊断应用。"治疗"在用于人、兽医学或研究个体、或细胞、组织或器官时涵盖本发明的抗体或抗原结合片段与人或动物个体、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
抗PD-L1抗体
抗体20C3为由杂交瘤亚克隆MEB037.20C3.116产生的抗体。
抗体22C3为由杂交瘤亚克隆MEB037.22C3.138产生的抗体且与小鼠IgG1的异型S414R对应。22C3的成熟重链的N末端残基为谷氨酰胺或焦谷氨酸酯(pE)，其为当基因序列编码成熟重链或轻链中的N末端谷氨酰胺时通常在单克隆抗体中观察到的常见翻译后修饰。
本发明的抗体和抗原结合片段结合在某些人细胞的表面上表达的人PD-L1的成熟形式(缺乏分泌前前导序列，也称为前导肽)。术语"PD-L1"和"成熟PD-L1"在本文中可互换使用，且除非另外指出或自上下文中显而易见，否则应理解为意指相同分子。成熟人PD-L1分子由以下序列(SEQ ID NO: 37)的氨基酸19-290组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
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。
成熟人PD-L1的细胞外结构域由以下序列(SEQ ID NO: 38)组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
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。
如本文所使用，抗人PD-L1抗体或抗hPD-L1抗体是指特异性结合人PD-L1的抗体。"特异性结合人PD-L1"的抗体或"特异性结合包含人PD-L1的氨基酸序列的多肽"的抗体为呈现相比于其他抗原优先结合人PD-L1的抗体，但此特异性不需要绝对结合特异性。如果在抗hPD-L1抗体的结合可例如在不产生不当结果(诸如IHC诊断分析法中的假阳性)的情况下决定样品中是否存在人PD-L1，则认为抗hPD-L1抗体对人PD-L1具有"特异性"。本发明的抗hPD-L1抗体所需的特异性的程度可视抗体的预定用途而定，且至少通过其用于预定目的的适合性来定义。本发明的抗体或其结合片段以某一亲和力结合人PD-L1，该亲和力比对任何非PD-L1蛋白的亲和力大至少两倍、优选大至少十倍、更优选大至少20倍且最优选大至少100倍。如本文所使用，如果抗体结合包含给定序列的多肽，但不结合缺乏该序列的蛋白，则认为抗体特异性结合包含该序列的多肽，例如成熟人PD-L1(在此情况下为SEQ ID NO: 37的氨基酸19-290)。例如，特异性结合包含SEQ ID NO: 37的19-290的多肽的抗体可结合SEQID NO: 37的19-290的FLAG®标记形式，但不结合其他FLAG®标记的蛋白。
如本文所使用，术语"抗体"是指呈现所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广泛含义使用且特定涵盖(但不限于)单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化完全人抗体、嵌合抗体和骆驼单域抗体。"亲本抗体"为通过在抗体进行修饰以用于预定用途(诸如用作人治疗抗体而进行抗体的人源化)之前使免疫***暴露于抗原所获得的抗体。
如本文所使用，除非另外指出，否则"抗体片段"或"抗原结合片段"是指抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合由全长抗体结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗体结合片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；纳米抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
"Fab片段"由一个轻链、和一个重链的CH1和可变区构成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。"Fab片段"可以是抗体的木瓜蛋白酶裂解的产物。
"Fc"区含有两个包含抗体的CH1和CH2域的重链片段。该两个重链片段由两个或两个以上二硫键和CH3域的疏水性相互作用保持在一起。
"Fab'片段"含有一个轻链、和一个重链的含有VH域和 C H1域以及 CH1和C H2域之间的区域的部分或片段，以便可在两个Fab'片段的两个重链之间形成链间二硫键以形成F(ab') 2分子。
"F(ab')2片段"含有两个轻链和含有CH1和CH 2域之间的恒定区的一部分的两个重链，以便在两个重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab') 2片段由通过两个重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab'片段构成。" F(ab')2片段"可以是抗体的胃蛋白酶裂解的产物。
"Fv区"包含来自重链与轻链的可变区，但缺乏恒定区。
术语"单链Fv"或"scFv"抗体是指包含抗体的VH和VL域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽进一步包含介于VH和VL域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。对于scFv的评述，参见Pluckthun (1994) ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg和Moore编.Springer-Verlag, New York, pp. 269-315。还参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203。
"域抗体"为仅含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或两个以上VH区与肽接头共价接合以产生二价域抗体。二价域抗体的两个VH区可靶向相同或不同抗原。
"二价抗体"包含两个抗原结合位点。在一些情况下，该两个结合位点具有相同抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性(参见下文)。
在某些实施方案中，单克隆抗体在本文中还包括骆驼单域抗体。参见例如Muyldermans等人 (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230；Reichmann等人 (1999) J. Immunol. Methods 231:25；WO 94/04678；WO 94/25591；美国专利号6,005,079)。在一个实施方案中，本发明提供一种单域抗体，其包含两个具有修饰的VH域以便形成单域抗体。
如本文所使用，术语"双功能抗体"是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链(VH-VL或VL-VH)中包含连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用过短而无法使同一链上两个域之间配对的接头，所述域被迫与另一链的互补域配对且产生两个抗原结合位点。双功能抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Holliger等人. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448。对于工程改造的抗体变体的综述，一般参见Holliger和Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136。
通常，本发明的抗体或抗原结合片段在其人PD-L1结合活性以摩尔浓度计进行表达时保留其人PD-L1结合活性的至少10%(当与亲本抗体比较时)。本发明的抗体或抗原结合片段优选保留亲本抗体的人PD-L1结合亲和力的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%、或100%或100%以上。本发明的抗体或抗原结合片段还意欲可包括不实质上改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的"保守变体"或"功能保守变体")。
"分离的抗体"是指纯化状态且在该上下文中意指分子实质上不含其他生物分子，诸如核酸、蛋白、脂质、碳水化合物或其他物质(诸如细胞碎片和生长培养基)。一般而言，术语"分离"不意欲指完全不存在此类物质或不存在水、缓冲液或盐，除非其以实质上干扰如本文所述的结合化合物的实验或治疗性用途的量存在。
如本文所使用，术语"单克隆抗体"是指实质上均质的抗体群体，即除可以较小量存在的可能天然存在的突变外，包含该群体的抗体分子的氨基酸序列相同。相反，常规(多克隆)抗体制剂通常包括大量的在可变结构域中，尤其在其CDR中具有不同氨基酸序列的不同抗体，其通常对不同表位具有特异性。修饰语"单克隆"指示如自实质上均质的抗体群体获得的抗体特征，且不应理解为需要通过任何特定方法产生该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过Kohler等人,(1975) Nature 256：495首先描述的杂交瘤方法制得，或可通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)制得。"单克隆抗体"也可使用例如Clackson等人. (1991) Nature 352: 624-628和Marks等人. (1991) J. Mol. Biol.222: 581-597中所述的技术自噬菌体抗体文库分离。还参见Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731。
一般而言，基本抗体结构单元包含四聚体。各四聚体包括两个相同的多肽链对，各对具有一个"轻"链(约25kDa)和一个"重"链(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100个至110个或110个以上氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可定义主要负责效应功能的恒定区。通常将人轻链分类为κ和λ轻链。此外通常将人重链分类为μ、δ、γ、α或ε，且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或12个以上氨基酸的"J"区接合，其中重链还包括约10个以上氨基酸的"D"区。通常参见Fundamental Immunology第7章(Paul, W., 编, 第2版. RavenPress, N.Y. (1989)。
各轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除非在双功能性或双特异性抗体中，否则两个结合位点一般相同。
通常，重链与轻链的可变结构域包含位于相对保守的构架区(FR)内的三个高变区，也称为互补决定区(CDR)。CDR通常通过构架区比对，从而使得能够结合特异性表位。一般而言，自N末端到C末端，轻链与重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。一般根据Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, 等人;National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 第5版; NIH Publ. No. 91-3242(1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, 等人, (1977) J. Biol.Chem. 252:6609-6616; Chothia, 等人, (1987) J Mol. Biol. 196:901-917或Chothia,等人, (1989) Nature 342:878-883的定义将氨基酸归类至各结构域。
如本文所使用，术语"高变区"是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链可变结构域中的CDRH1、CDRH2和CDRH3)。参见Kabat等人. (1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. (通过序列定义抗体的CDR区)；还参见Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (通过结构定义抗体的CDR区)。如本文所使用，术语"构架"或"FR"残基是指除本文定义为CDR残基的高变区残基外的那些可变结构域残基。
"同源性"是指在最优选比对时两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置由相同碱基或氨基酸单体亚单位占据时，例如如果两个DNA分子中的每一者中的位置由腺嘌呤占据，则所述分子在该位置同源。同源性百分比为两个序列共享的同源位置数目除以总比较位置数×100。例如，如果在序列最优选比对时两个序列中10个位置中的8个匹配或同源，则两个序列80%同源。一般而言，在序列比对时进行比较以得到最大同源性百分比。例如，可通过BLAST算法进行比较，其中选择算法的参数以得到在各别参考序列的整个长度上的各别序列之间的最大匹配。
"分离的核酸分子"意指未与所有或一部分多核苷酸缔合的基因组的DNA或RNA、mRNA、cDNA或其合成来源或一些组合，其中分离的多核苷酸在自然界中可见或连接至在自然界中未连接的多核苷酸。就本发明的目的而言，应理解，"包含特定核苷酸序列的核酸分子"不涵盖完整染色体。"包含"指定核酸序列的分离的核酸分子除指定序列之外还可包括多达10种或甚至多达20种或20种以上其他蛋白或其部分或片段的编码序列，或可包括控制所述核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调节序列，和/或可包括载体序列。
词组"控制序列"是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵子序列(operatorsequence)和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列之间存在功能关系时，其为"可操作地连接"。例如，如果前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前体蛋白，则其与该多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点经定位以便有助于翻译，则其与编码序列可操作地连接。一般而言，"可操作地连接"意指所连接的DNA序列相邻且在分泌性前导序列的情况下，相邻且在阅读相(reading phase)中。然而，增强子不必为相邻的。连接通过在适宜限制性位点处连接来实现。如果此类位点不存在，则根据惯例使用合成寡核苷酸适配子或接头。
如本文所使用，表述"细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"可互换使用且所有此类名称均包括子代。因此，词语"转化物"和"转化的细胞"包括原代目标细胞和由其衍生的培养物(不考虑转移次数)。还应理解，由于有意或无意的突变，并非所有子代均具有精确相同的DNA含量。包括在最初转化细胞中所筛选的具有相同功能或生物活性的变体子代。当意欲使用不同名称时，应将其与上下文区分。
如本文所使用，"聚合酶链式反应"或"PCR"是指其中将特异性核酸序列、RNA和/或DNA扩增的程序或技术，如例如美国专利号4,683,195中所述扩增。一般而言，使用来自相关区域的末端或其以外的序列信息设计寡核苷酸引物。这些引物与待扩增模板的相反链的序列相同或类似。两个引物的5'末端核苷酸可与扩增物质的末端一致。可使用PCR扩增特异性RNA序列、来自总基因组DNA的特异性DNA序列和自总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般而言参见Mullis等人(1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, 编, (1989) PCR Technology (Stockton Press, N.Y.)。如本文所使用，认为PCR为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应的一个实例，但非仅有实例，其包含使用已知核酸作为引物且使用核酸聚合酶扩增或产生核酸的特异性片段。
如本文所使用，"种系序列"是指非重组免疫球蛋白DNA序列的序列。可使用任何适合来源的非重排免疫球蛋白序列。可例如自美国国立卫生研究院的国立关节炎和肌肉骨胳和皮肤疾病研究所(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and SkinDiseases)的网站上的JOINSOLVER®种系数据库获得人种系序列。可例如如Giudicelli等人(2005) Nucleic Acids Res. 33:D256-D261中所述获得小鼠种系序列。
示例性抗PD-L1抗体的物理和功能特性
本发明提供分离的抗PD-L1抗体和抗体或其抗原结合片段在检测细胞表面上的PD-L1表达中的使用方法。本发明的抗PD-L1抗体的实例包括(但不限于)：抗体20C3和22C3(参见图1和图2)。20C3和22C3抗体结合非相同但相邻的表位(参见实施例2和图9)，从而指示可混合这两种抗体的CDR以衍生在这些表位中的一者或两者处特异性结合PD-L1的其他抗体。因此，结合人PD-L1的分离的抗体或其抗原结合片段可包含表1至表3中所示的轻链互补决定区中的三者和重链CDR中的三者。
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"保守修饰的变体"或"保守取代"是指用具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构型和刚性等)的其他氨基酸取代蛋白中的氨基酸，以便通常可在不改变蛋白的生物活性下进行改变。本领域技术人员认为多肽的非必要区域中的单一氨基酸取代一般不会实质上改变生物活性(参见例如Watson等人(1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co.,第224页(第4版))。另外，在结构上或功能上类似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。示例性保守取代阐述于表4中。
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本发明还涵盖本发明抗体的功能保守变体。如本文所使用，"功能保守变体"是指其中一个或多个氨基酸残基在不改变所要特性(如抗原亲和力和/或特异性)下发生改变的抗体或片段。此类变体包括(但不限于)将氨基酸用具有类似特性的氨基酸替换，诸如表4中的保守氨基酸取代。
在另一个实施方案中，本发明包括如下抗体或其抗原结合片段：特异性结合PD-L1，且具有VL域和VH域，且与表1或表2的轻链和重链CDR共享100%序列同源性且与表1或表2的轻链和重链成熟可变区共享至少90%、92%、94%、96%、98%或99%序列同源性。
核酸
本发明还提供编码本文所公开的抗PD-L1抗体和抗原结合片段的免疫球蛋白链的核酸。例如，本发明包括编码表1、表2和表3中所述的氨基酸的核酸以及与其杂交的核酸。
一般而言，核酸在低、中或高严格性条件下杂交且编码维持特异性结合PD-L1的能力的抗体。当第一核酸分子的单链形式可在适当温度条件和溶液离子强度下退火至第二核酸分子时，该第一核酸分子可与第二核酸分子"杂交"(参见Sambrook等人,上述)。温度和离子强度条件确定杂交的"严格性"。典型低严格性杂交条件包括55℃、5X SSC、0.1% SDS且无甲酰胺；或30%甲酰胺、5X SSC、0.5% SDS、在42℃下。典型中严格性杂交条件为40%甲酰胺、5X或6X SSC和0.1% SDS、在42℃下。高严格性杂交条件为50%甲酰胺、5X或6X SSC、在42℃下或任选地在较高温度(例如57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下。一般而言，SSC为0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠。杂交需要两个核酸含有互补序列，但视杂交的严格性而定，可能存在碱基之间的错配。核酸杂交的适当严格性视核酸的长度和互补程度、本领域中众所周知的变量而定。两个核苷酸序列之间的相似或同源程度越大，则核酸可杂交的严格性越高。对于长度大于100个核苷酸的杂交物而言，已推导出计算熔融温度的方程(参见Sambrook等人,上述,9.50-9.51)。对于与较短核酸(例如寡核苷酸)的杂交而言，错配的位置更为重要，且寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook等人,上述,11.7-11.8)。
以下参考文献与常用于序列分析的BLAST算法有关：BLAST ALGORITHMS：BLASTALGORITHMS: Altschul, S.F., 等人, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W.,等人, (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., 等人, (1996) Meth.Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., 等人, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., 等人, (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., 等人, (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. 等人, (1994) Comput. Appl.Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., 等人, "A model ofevolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res.Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., 等人, "Matrices for detecting distantrelationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5,suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found.,Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States,D.J., 等人, (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., 等人, (1992) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., 等人, (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., 等人, (1990) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., 等人, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:5873-5877; Dembo, A., 等人, (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039;和Altschul,S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct localalignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S.Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York。。
在另一个实施方案中，本发明提供编码本文所述的分离的抗PD-L1抗体或抗原结合片段的多肽链中的至少一者的分离的核酸，例如DNA。在一些实施方案中，分离的核酸编码单核酸分子上的轻链与重链，且在其他实施方案中，在各别核酸分子上编码轻链和重链。在另一个实施方案中，核酸进一步编码信号序列。
本发明还提供包含本发明的分离的核酸的表达载体，其中该核酸可操作地连接至在用载体转染宿主细胞时由宿主细胞所识别的控制序列。还提供包含本发明的表达载体的宿主细胞和产生本文所公开的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在培养基中培养具有编码抗体或抗原结合片段的表达载体的宿主细胞，和自宿主细胞或培养基分离抗原或其抗原结合片段。
表位结合
本发明进一步提供通过分别与20C3或22C3结合于相同表位来阻断抗体20C3或22C3与人PD-L1结合的抗体或其抗原结合片段。此类抗体和结合片段可如下鉴定：使用本领域中已知的任何交叉阻断或竞争分析，包括实施例2中所述的八隅体竞争分析，随后鉴定交叉阻断抗体所结合的人PD-L1上的表位。如果目标与第一抗体预先结合至饱和使实现目标的半最大结合所需的第二抗体浓度增至2、3、4、5、10、20、50、100、200倍或200倍以上，则认为第一抗体交叉阻断第二抗体的结合。可使用本领域中众所周知的技术鉴定用于交叉阻断抗体的结合表位。
一种此类表位定位技术为与蛋白水解和质谱分析偶联的氢/氘交换(HDX-MS)。此方法依赖于当以多种时间间隔单独在重水(D2O)中或在其抗体存在下孵育时，由抗原进行的氘并入程度的准确测量和比较。氘与暴露区域中的蛋白的酰胺主链上的氢发生交换，而结合于抗体的抗原区域将受到保护且在通过蛋白水解片段的液相层析联合质谱分析(LC-MS/MS)进行分析之后显示较小或无交换。
基于实施例3中所述的HDX-MS表位定位，抗体22C3的成熟人PD-L1上的建议表位包含细胞外结构域(SEQ ID NO: 38)中的两个不连续氨基酸区段中的残基：156至178和196至206。其他表位残基可能存在于细胞外结构域(SEQ ID NO: 38)中的以下区段中：3至9；10至13；88至93和135至147。
因此，在一个实施方案中，通过与22C3结合于相同表位来阻断抗体22C3与人PD-L1结合的抗体结合SEQ ID NO: 38的第一氨基酸区段156至178中的残基和SEQ ID NO: 38的第二氨基酸区段196至206中的残基，且在一些实施方案中还结合SEQ ID NO: 38的以下区段中任何一者、两者或三者或所有四者中的残基：氨基酸3至9；氨基酸10至13；氨基酸88至93和氨基酸135至147。
制备抗体和其抗原结合片段的方法
产生亲本(例如啮齿动物)单克隆抗X抗体的杂交瘤细胞可通过本领域中通常已知的方法产生。这些方法包括(但不限于)最初由Kohler等人,(1975)(Nature 256：495-497)开发的杂交瘤技术以及三体杂交瘤技术(Hering等人, (1988) Biomed. Biochim. Acta.47：211-216和Hagiwara等人, (1993)Hum. Antibod. Hybridomas 4：15)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,(1983) Immunology Today 4：72和Cote等人, (1983)Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A 80：2026-2030)、EBV杂交瘤技术(Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 第77-96页, 1985)，和使用Cyto Pulse大室敲除融合电穿孔仪的基于电场的电融合(Cyto Pulse Sciences, Inc.,Glen Burnie, MD)。优选地，分离小鼠脾细胞且以PEG或基于标准方案通过与小鼠骨髓瘤细胞系电融合来融合。
然后可针对产生抗原特异性抗体来筛选所得杂交瘤。例如，可以50% PEG将来自免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。细胞可以约2 x 105个细胞/毫升接种于平底微量滴定板中，随后在含有以下物质的选择性培养基中孵育两周：20%胎儿克隆血清、18%"653"条件培养基、5% origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50个单位/毫升青霉素(penicillin)、50mg/ml链霉素(streptomycin)、50mg/ml庆大霉素(gentamycin)和1X HAT(Sigma；在融合后24小时添加HAT)。在两周之后，可在用HT替换HAT的培养基中培养细胞。然后可通过ELISA针对抗X单克隆IgG抗体筛选个别孔。一旦出现广泛杂交瘤生长，则通常可在10-14天后观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤再铺板，再筛选，且如果对于人IgG(抗X单克隆抗体)而言仍为阳性，则可通过限制稀释法亚克隆至少两次。
然后可体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。例如，可使用以下程序自小鼠杂交瘤细胞系MEB037.22C3.138产生约1克22C3抗体且进行纯化。将冷冻MEB037.22C3.138细胞解冻且使用含有2mM额外L-谷氨酰胺且含有或不含0.18%普洛尼克F-68(Pluronic F-68)的无杂交瘤血清的培养基将其粘附至震荡烧瓶中。普洛尼克F-68的存在可改善震荡烧瓶培养物的存活力。一旦细胞完全粘附至震荡烧瓶中，则在添加10%CHO CD高效进料B(Invitrogen，目录号A10240-01)的情况下在WAVE生物反应器(GEHealthcare Life Sciences)中在无血清培养基中进行20升产量培养。对于细胞扩增而言，在小WAVE袋中起始1升培养，且然后在WAVE生物反应器中将1L WAVE培养扩增成20L培养。可以0.5 x 106个活细胞/毫升的细胞密度起始20升培养，在第1天补料10% CHO CD高效进料B，且每天用1N Na2CO3进行pH值调节。四天之后收集细胞。可每天收集小样品进行NOVA分析。
可通过以下方法自杂交瘤培养物纯化本发明的抗hPD-L1抗体。通过使用1.2微米玻璃纤维和0.2微米乙酸纤维素过滤器深度过滤使杂交瘤培养物澄清。向澄清的收集物中添加等体积的2X ProSepA缓冲液(100mM硼酸、5M NaCl，pH 8.5)且将稀释的收集物装载于170mL床体积蛋白-A管柱上。管柱用5管柱体积(CV)1X ProSepA缓冲液(50mM硼酸、2.5MNaCl，pH 8.5)洗涤，然后用2CV 1X PBS洗涤，且将抗hPD-L1抗体用5CV洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH 3.0)洗脱。合并含有IgG的级分且通过添加1/10体积的1.0M Tris(pH值缓冲液)来中和pH值。然后使用10kDa一次性TFF盒无菌过滤经中和的抗体组合物。可通过针对10升配制缓冲液(20mM乙酸钠、9%蔗糖，pH 5.0)进行透滤且使用20次体积变化来配制抗体以进行储存。使用此方案，可制备浓度为约5.0mg/ml的抗体22C3，且通过SDS-PAGE、SEC HPLC和C8RP-HPLC测量纯度为至少98%，且内毒素水平小于0.1EU/ml且小于0.02EU/mg。
还可以重组方式产生本文所公开的抗PD-L1抗体(例如根据上文所讨论在大肠杆菌/T7表达***中)。在此实施方案中，编码本发明的抗体分子(例如VH或VL)的核酸可***基于pET的质粒中且表达于大肠杆菌/T7***中。本领域中已知几种用于产生重组抗体的方法。以重组方式产生抗体的方法的一个实例公开于美国专利号4,816,567中。可通过任何已知的用于将多核苷酸引入宿主细胞中的方法进行转化。将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法在本领域中众所周知且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸于脂质体中的囊封、基因枪注射(biolistic injection)和将DNA直接微注射至核中。另外，核酸分子可通过病毒载体引入哺乳动物细胞中。细胞转化的方法在本领域中众所周知。参见例如美国专利号4,399,216；4,912,040；4,740,461和4,959,455。
抗PD-L1抗体也可通过美国专利号6,331,415中所述的任一方法合成。
可用作表达本文所公开的抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系在本领域中众所周知且包括可获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)的许多永生化细胞系。这些细胞系尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾脏细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。尤其优选的细胞系经由测定具有高表达水平的细胞系来选择。其他可使用的细胞系为昆虫细胞系，诸如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分或片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使得在宿主细胞中表达抗体或更优选使抗体分泌至生长宿主细胞的培养基中的时间来产生抗体。
可使用标准蛋白纯化方法自培养基回收抗体。此外，可使用多种已知技术来增强本发明的抗体(或来自其的其他部分)自生产细胞系(production cell lines)的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达***(GS***)为一种在特定条件下增强表达的常见方法。GS***完全或部分结合欧洲专利号0 216 846、0 256 055和0 323 997和欧洲专利申请号89303964.4进行讨论。
多克隆抗体为在一种或多种其他不同抗体中或在其存在下产生的抗体。一般而言，多克隆抗体由不同B-淋巴细胞的集合产生，例如用相关免疫原处理的动物的B-淋巴细胞，由此产生全部针对该免疫原的不同抗体的群体。通常，多克隆抗体直接获自免疫动物，例如脾脏、血清或腹水液。
本发明进一步包括本文所公开的抗PD-L1抗体的抗体片段。抗体片段包括F(ab)2片段，其可由IgG的例如胃蛋白酶酶促裂解产生。Fab片段可通过例如用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)2来产生。Fab片段为通过二硫桥附接至VH-CH1链的 VL-CL链。F(ab)2片段为两个Fab片段，该两个Fab片段又由两个二硫桥附接。F(ab)2分子的Fab部分包括Fc区中的其间安置有二硫桥的部分。FV片段为 VL或VH区。
可视免疫球蛋白的重链的恒定结构域的氨基酸序列而将免疫球蛋白归为不同类别。存在至少五个主要免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且几种这些类别可进一步分成子类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本发明包含任一这些抗体类别或子类中的抗体和抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如人恒定区，诸如γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如人轻链恒定区，诸如λ或κ人轻链区或其变体。例如(但不限于)，人重链恒定区可以是γ1且人轻链恒定区可以是κ。在替代实施方案中，抗体的Fc区为具有Ser228Pro突变的γ4(Schuurman, J等人, Mol. Immunol. 38：1-8, 2001)。
在一些实施方案中，可将不同恒定结构域附接至来源于本文提供的CDR的人源化VL和VH区。例如，如果本发明的抗体(或片段)的特定预定用途需要效应功能有改变，则可使用除人IgG 1 外的重链恒定结构域，或可利用杂交IgG 1/IgG 4 。
抗体工程改造
在特定实施方案中，需要如下文所述将含有暴露的侧链的某些氨基酸变为另一氨基酸残基以提供更大的最终抗体的化学稳定性。天冬酰胺的去酰胺可在N-G或D-G序列上发生且引起产生异天冬氨酸残基，该异天冬氨酸残将扭接引入多肽链中且降低其稳定性(异天冬氨酸作用)。在某些实施方案中，本发明的抗体不含有天冬酰胺异构化位点。
例如，天冬酰胺(Asn)残基可变成Gln或Ala以降低在任何Asn-Gly序列处，尤其在CDR内形成异天冬氨酸的可能。类似问题可能存在于Asp-Gly序列处。Reissner和Aswad(2003) Cell. Mol. Life Sci. 60：1281。异天冬氨酸形成可削弱或完全消除抗体与其目标抗原的结合。参见Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116：731-734。在一个实施方案中，使天冬酰胺变为谷氨酰胺(Gln)。还可能需要改变与天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)残基相邻的氨基酸以降低去酰胺的可能性，这在小氨基酸与天冬酰胺或谷氨酰胺相邻时以更大机率发生。参见Bischoff和Kolbe(1994) J. Chromatog. 662：261。另外，CDR中的任何甲硫氨酸残基(通常为暴露于溶剂的Met)可变为Lys、Leu、Ala或Phe以降低甲硫氨酸硫氧化的可能性，由此可降低抗原结合亲和力且也有助于最终抗体制剂中的分子异质性。同上。在一个实施方案中，将甲硫氨酸变为丙氨酸(Ala)。另外，为防止可能易裂的Asn-Pro肽键或使其减至最少，可能需要使CDR中所见的任何Asn-Pro组合变为Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。随后筛选具有此类取代的抗体以确保取代不会使针对人PD-L1的抗体的亲和力或特异性、或其他所要生物活性降低至不可接受的水平。
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抗体缀合物
本文所公开的抗PD-L1抗体分子也可与化学部分诸如放射性核素或其他可检测标记缀合。放射性核素包括99Tc,90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th、and 40K、157Gd、55Mn、52Tr和56Fe。荧光或化学发光标记包括荧光团，诸如稀土螯合剂、荧光素和其衍生物、若丹明(rhodamine)和其衍生物、异硫氰酸酯、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、152Eu、丹酰、伞酮、荧光素、鲁米那标记(luminal label)、异鲁米那标记、芳族吖啶酯标记(aromatic acridinium ester label)、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、水母发光蛋白标记、2,3-二氢酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记和稳定自由基。
可采用本领域中已知的任何使抗体分子与多种部分缀合的方法，包括以下文献中所述的方法：Hunter, 等人, (1962) Nature 144:945; David, 等人, (1974)Biochemistry 13:1014; Pain, 等人, (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; 和Nygren,J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407。缀合抗体的方法在本领域中常规且极为众所周知。
实验和诊断用途
本文所公开的抗PD-L1抗体和抗体片段可用于特异性检测在细胞表面上表达的人PD-L1。细胞可存在于获自人个体的组织或血清样品中，且使用本领域中已知的多种体外分析方法中的任一者进行PD-L1表达的检测。
例如，特定实施方案包括ELISA分析(酶联免疫吸附剂分析法)，其通常包含以下步骤：
(a)用抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包被基底(例如微量滴定板孔(例如塑料板)的表面)；
(b)将待测试是否存在人PD-L1的样品包被于基底；
(c)洗涤板，由此移除样品中未结合的物质；
(d)包被也对人PD-L1具有特异性的经可检测标记的抗体(例如与酶连接的抗体)；
(e)洗涤基底，由此移除未结合的经标记的抗体；
(f)如果经标记的抗体与酶连接，则包被可由酶转化成荧光信号的化学品；和
(g)检测经标记的抗体的存在。
在另一个实施方案中，经标记的抗体用可与ABTS(例如2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3,3',5,5'-四甲基联苯胺反应产生可检测的变色的过氧化酶标记。或者，经标记的抗体用可在闪烁体存在下通过闪烁计数器检测的可检测放射性同位素(例如3H)标记。
本发明的抗PD-L1抗体和其抗原结合片段可用于 Western印迹法(Western blot)或免疫蛋白印迹程序。该程序形成本发明的一部分且包括例如：
(1)使待测试是否存在人PD-L1的膜或其他固体基底与本发明的抗体或其抗原结合片段接触。此类膜可呈基于硝酸纤维素或乙烯(例如聚偏二氟乙烯(PVDF))的膜的形式，其中在非变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中测试是否存在X的蛋白已转移至该膜(例如在凝胶中电泳分离之后)。在膜与抗PD-L1抗体或片段接触之前，任选地例如用脱脂乳粉等封闭该膜以便结合膜上的非特异性蛋白结合位点
(2)洗涤膜一或多次以移除未结合的抗PD-L1抗体或片段和其他未结合的物质；和
(3)检测结合的抗PD-L1抗体或片段。
结合的抗体或片段可如下进行检测：将结合的抗体或片段与经可检测标记的二级抗体(抗免疫球蛋白抗体)一起孵育，且然后检测是否存在二级抗体。
本文所公开的抗PD-L1抗体和其抗原结合片段也可用于免疫组织化学(IHC)分析法中，该分析法可使用本领域中已知的多种IHC形式进行且组成本发明的实施方案。典型IHC分析使用约3-4毫米且优选4微米、安装于显微镜载片上且干燥的FFPE组织切片且包含例如(1)使组织切片经受脱蜡和水合，使再水合的组织切片与本发明的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段接触；和(2)在组织中一个或多个细胞的表面上检测抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。如果抗体或片段本身经可检测标记，则其可直接检测。或者，抗体或片段可由已检测到的经可检测标记的二级抗体结合。
优选IHC分析法采用市售Dako EnVisionTM FLEX 检测***，其意欲与DakoAutostainer仪器(Dako,Agilent Technologies Company,Glostrup,Denmark)一起使用。当将此***与22C3抗体或包含22C3抗体的重链和轻链可变区的抗体一起使用时，可如下文所述进行IHC分析。将安装于载片上的四微米厚的FFPE组织切片风干过夜，在60℃下烘烤45分钟，脱蜡且再水合。在脱蜡之后，使FFPE载片经历通过在97℃下使用EnVision™ FLEX高pH值目标检索溶液且随后在室温下20分钟而进行的热诱导的表位检索。然后洗涤载片，用2μg/mL的22C3染色60分钟，且然后如下使用Dako EnVision™ FLEX试剂进行检测：EnVision™ FLEX+ MS连接剂(15分钟)、EnVision™ FLEX/HRP (20分钟)、EnVision™ FLEX DAB(10分钟)和DAB增强剂(7分钟)，其中插有洗涤步骤。
本文所公开的某些抗PD-L1抗体和其抗原结合片段也可用于体内肿瘤成像。此类方法可包括将经放射性标记的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段注射至待测试是否存在与PD-L1表达相关的肿瘤的人患者体内，随后对患者的身体进行核成像以检测是否存在经标记的抗体或片段，例如在结合于肿瘤的包含高浓度的抗体或片段的基因座处。
成像技术包括SPECT成像(单光子发射计算机断层摄影法)或PET成像(正电子发射断层摄影法)。标记包括例如碘-123(123I)和锝-99m(99mTc)(例如与SPECT成像结合使用)、或11C、13N、15O或18F (例如与PET成像结合使用)、或铟-111(参见例如Gordon等人,(2005)International Rev. Neurobiol. 67：385-440)。
检测试剂盒和治疗试剂盒
为方便起见，本文所公开的抗体或特异性结合剂可提供于试剂盒，即预定量的试剂与用于进行诊断或检测分析的说明书的包装组合中。当抗体经酶标记时，该试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。此外，可包括其他添加剂，诸如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。多种试剂的相对量可广泛变化以提供可实质上使分析法的灵敏度最优化的溶液中的试剂浓度。具体而言，试剂可以干粉形式(通常经冻干)提供，其包括一经溶解即提供具有合适浓度的试剂溶液的赋形剂。
还提供诊断或检测试剂和包含一种或多种此类试剂的试剂盒，其用于多种检测分析法(包括例如免疫分析法，诸如ELISA(夹心型或竞争性形式))。在使用试剂盒时可将试剂盒的组分预先附接至固体载体或可包被于固体载体的表面。在一些实施方案中，在使用之前，信号产生构件(means)可与本发明的抗体预先缔合或可能需要与一种或多种组分(例如缓冲液、抗体-酶缀合物、酶底物等)组合。试剂盒还可包括其他试剂，例如用于使与固相表面的非特异性结合减少的封闭试剂、洗涤试剂、酶底物等。固相表面可呈管、珠粒、微量滴定板、微球体或其他适用于固定蛋白、肽或多肽的物质的形式。在特定方面中，催化化学发光或显色产物形成或化学发光或显色底物的减少的酶为信号产生构件的组分。此类酶在本领域中众所周知。试剂盒可包含本文所述的捕获试剂和检测试剂中的任一者。试剂盒任选地也可包含用于实施本发明方法的说明书。
还可制备本文所公开的检测试剂盒，其包含本文所公开的抗体或抗原结合片段中的至少一者和使用组合物作为检测试剂的说明书。用于此类试剂盒的容器通常可包含至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他适合容器，可将一种或多种检测组合物置于所述容器中且优选进行适当等分。本文所公开的试剂盒通常还包括用于含有严禁商业销售的小瓶的构件，诸如其中夹持有所要小瓶的注射或吹制塑料容器。当试剂盒内包括放射性标记、显色、荧光或其他类型的可检测标记或检测构件时，标记剂可与检测组合物本身提供于同一容器中，或可另外置于可置放该第二组合物且进行适当等分的第二不同容器构件中。或者，可在单个容器构件中制备检测试剂，且在大多数情况下，试剂盒通常还包括用于含有严禁商业销售的小瓶和/或方便封装和递送的构件。
还提供用于进行本文所述的检测或监测方法的器件或装置。此类装置可包括可投入样品的腔室或管、任选地包括阀门或泵以引导样品流穿过器件的流体处理***、任选的用于自血液分离血浆或血清的过滤器、用于添加捕获试剂或检测试剂的混合室和任选的用于检测与捕获试剂免疫复合物结合的可检测标记的量的检测器件。样品流动可以是被动的(例如通过一旦施用样品即不需要进一步操作装置的毛细管力、流体静力或其他力)或主动的(例如通过施加经由机械泵、电渗泵、离心力或气压增加而产生的力)或通过主动与被动力的组合实现。
其他实施方案还提供一种处理器、计算机可读内存和储存于计算机可读内存上且适合于在处理器上执行以实施任一种本文所述的方法的程序。适合计算***、环境和/或组态的实例包括个人计算机、服务器计算机、手提式或膝上型器件、多处理器***、基于微处理器的***、机顶盒、可编程的消费电子产品、网络PC、小型计算机、主机计算机、包括以上***或器件中的任一者的分布式计算环境(distributed computing environments)或本领域中已知的任何其他***。
通用方法
分子生物学中的标准方法描述于Sambrook, Fritsch和Maniatis(1982和1989第2版, 2001第3版) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Sambrook和Russell (2001) Molecular Cloning, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Wu(1993) Recombinant DNA, 第217卷, Academic Press, San Diego, CA)中。标准方法还发表于Ausbel等人,(2001) Current Protocols in Molecular Biology, 第1-4卷,John Wiley and Sons, Inc. New York, NY中，该文献描述细菌细胞和DNA诱变中的克隆(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白表达(第3卷)和生物信息(第4卷)。
描述蛋白纯化方法，其包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶(Coligan等人,(2000) Current Protocols in Protein Science, 第1卷, John Wiley and Sons,Inc., New York)。描述化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白的糖基化(参见例如Coligan等人,(2000) Current Protocols in Protein Science, 第2卷, JohnWiley and Sons, Inc., New York；Ausubel等人,(2001) Current Protocols in Molecular Biology,第3卷, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY,第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich,Co.(2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N. J.,第384-391页)。描述多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan等人,(2001)Current Protcols in Immunology, 第1卷, John Wiley and Sons, Inc., New York；Harlow和Lane(1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY；Harlow和Lane, 同上)。可获得用于表征配体/受体相互作用的标准技术(参见例如Coligan等人,(2001) Current Protocols in Immunology, 第4卷,John Wiley, Inc., New York)。
可制备单克隆、多克隆和人源化抗体(参见例如Sheperd和Dean (编) (2000)Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann和Dubel(编) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow和Lane(1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243; Carpenter, 等人 (2000) J. Immunol. 165:6205; He, 等人 (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang 等人 (1999) J. Biol. Chem.274:27371-27378; Baca 等人 (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia 等人 (1989) Nature 342:877-883; Foote和Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499;美国专利号6,329,511)。
人源化的替代方法为使用展示于噬菌体上的人抗体文库或转基因基因小鼠中的人抗体文库(Vaughan 等人 (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995)Nature Medicine 1:837-839; Mendez 等人 (1997) Nature Genetics 15:146-156;Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas 等人 (2001)Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York; Kay 等人 (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin 等人(1999) Nature Biotechnol. 17:397-399)。
抗原纯化并非为产生抗体所必需。动物可用带有相关抗原的细胞进行免疫。然后可自免疫动物分离脾细胞，且可使脾细胞与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见例如Meyaard 等人 (1997)Immunity 7:283-290; Wright 等人 (2000) Immunity13:233-242;Preston 等人, 上述; Kaithamana 等人 (1999) J. Immunol. 163:5157-5164)。
抗体可与例如小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)缀合。抗体适用于治疗、诊断、试剂盒或其他目的，且包括与例如染料、放射性同位素、酶或金属(例如胶态金)偶联的抗体(参见例如Le Doussal 等人 (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini 等人(1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts 等人 (2002) J. Immunol. 168:883-889)。
可获得用于流式细胞术的方法，其包括荧光活化细胞分选(FACS)(参见例如Owens, 等人 (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 第2版; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, JohnWiley and Sons, Hoboken, NJ)。可获得适用于修饰核酸的荧光试剂，包括用作例如诊断试剂的核酸引物和探针、多肽和抗体(Molecular Probes (2003) Catalogue, MolecularProbes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO)。
描述免疫***组织学的标准方法(参见例如Muller-Harmelink (编) (1986)Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY;Hiatt, 等人 (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, andWilkins, Phila, PA; Louis, 等人 (2002) Basic Histology: Text and Atlas,McGraw-Hill, New York, NY)。
可获得用于测定例如抗原片段、前导序列、蛋白折叠、功能域、糖基化位点和序列比对的软件包装和数据库(参见例如GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc,Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA);DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, 等人 (2000)Bioinformatics 16: 741-742; Menne, 等人 (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, 等人 (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690)。
实施例
实施例1. 抗PD-L1杂交瘤的产生和筛选
将Balb/C小鼠用含人PD-L1-Fc融合蛋白(R&D Systems®目录号156-B7-100)的佐剂进行免疫。此融合蛋白含有与人IgG1片段(Pro100-Lys 300)融合的PD-L1的细胞外结构域(Phe19-Thr239)。在进行12次免疫之后，收集两只对人PD-L1具有高滴度的小鼠的***，且进行电融合以产生两批杂交瘤，给予其实验室名称MEB033和MEB037。
筛选MEB033和MEB037杂交瘤批料的上清液以鉴定产生针对人PD-L1的抗体的杂交瘤。筛选采用针对与人hPD-L1-Fc蛋白的结合的基于蛋白的ELISA；和针对与人PD-L1-CHO人PD-L1-CHO稳定转化物和亲本CHO细胞(作为阴性对照)的结合的基于细胞的ELISA。来自88个MEB037克隆和23个MEB033杂交瘤克隆的上清液测试为对抗PD-L1抗体的存在呈阳性(数据未显示)，且测试其样品对来自正常人扁桃体的FFPE组织切片的IHC反应性(数据未显示)。
在该88个克隆中，基于与由下表中所列举的市售抗PD-L1抗体获得的染色模式相比较，仅11个来自MEB037批料的克隆产生具有可保证进一步评估的充分强度和表观特异性的染色模式：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
当发明人将由实验抗体获得的多种染色模式与由这些市售抗人PD-L1抗体获得的模式进行比较时，其观察到染色模式之间的显著差异，包括染色的位置和染色细胞的类型。为了试图解释这些差异，发明人进行许多其他实验且发现这些市售抗体均不提供用于FFPE切片中PD-L1表达的IHC所需的属性的组合：(1)灵敏度，即检测阳性对照组织(例如人扁桃体)中正常生理表达以及肿瘤组织(例如人黑色素瘤样品)中表达的能力；(2)特异性，即染色模式需要与PD-L1的已知解剖/细胞分布相关且需为可中和的；和(3)稳健，即在用于分析"重复"组织切片时染色模式较少变化至无变化。
例如，发明人发现Sigma/ProSco PRS4059抗体在扁桃体裂解物上显示多条色带(可证实其均不表示PD-L1)，未能对通过流式细胞术证实为PD-L1阳性的LOX黑色素瘤细胞系进行染色，且未能通过IHC将阳性与阴性细胞系区分开。
一些这些数据显示于图4中，其中与PRS4059抗体(其由Gadiot等人(同上)鉴定为15种抗人PD-L1抗体中唯一的适用于检测FFPE组织切片中的PD-L1表达的候选物)相比，扁桃体切片的免疫组织化学染色将22C3和20C3鉴定为FFPE组织上的两种具有罕见且有用免疫组织化学特性的抗体。在发明人所进行的实验中，Prosci抗体(PRS4059，批号40590604，主要以0.4mg/ml使用，随后使用兔聚合物检测***(DAKO Envision))以相等强度染色扁桃体中的所有造血谱系(图4A)，而22C3抗体选择性染色扁桃体隐窝上皮细胞和滤泡性CD68+骨髓细胞(形态上与巨噬细胞一致)(图4B)。由抗体20C3观察到实质上相同的染色模式(数据未显示)。此外，22C3和20C3显示这两个离散细胞群体之间的一致染色强度差异，其中隐窝上皮细胞远高于滤泡性巨噬细胞。所有三种抗体均可通过与PD-L1抗原一起预孵育来中和，从而指示反应性通过抗原结合结构域(CDR)介导。
实施例2. 20C3和22C3抗PD-L1抗体的品质评价
此实施例描述经实施以评价20C3和22C3抗体在用于FFPE组织切片的IHC分析法中的效用的其他实验。
一个实验评价这两种抗体在正常人FFPE扁桃体切片的IHC分析法中检测多种人PD-L1(hPD-L1)蛋白表达的能力，且22C3的代表性图像显示于图5A中。用22C3进行免疫组织化学染色强烈标记扁桃体隐窝上皮细胞，以及显示CD68+滤泡性骨髓群体的弱至中度染色(假定的巨噬细胞)。两种抗体(20C3数据未显示)均以明确界定的膜/细胞表面模式标记这两种细胞类型中的细胞。在相邻FFPE扁桃体组织切片上通过独立方法(用于hPD-L1 mRNA的原位杂交[ISH])证实扁桃体中hPD-L1表达的适当性(即IHC染色限于两种细胞群体(隐窝上皮细胞和滤泡性巨噬细胞))。另外，如由IHC所评价的hPD-L1蛋白的差异表达(隐窝上皮细胞>>滤泡性巨噬细胞)与由ISH所观察到的hPD-L1 mRNA的相对丰度一致。
另一实验评价20C3和22C3对hPD-L1表达细胞的结合特异性。将通过mRNA分析(qPCR)已知对hPD-L1表达呈阴性的HT144细胞和已知大量表达hPD-L1 mRNA(qPCR)的LOX黑色素瘤细胞用1微克/毫升的经纯化的小鼠IgG染色，该经纯化的小鼠IgG来自以上实施例1中所述实验中所产生的七种杂交瘤。还使用相同浓度的无关同种型对照小鼠抗体。使用荧光标记的抗小鼠二级抗体检测初级小鼠抗体。在染色且重复洗涤之后，通过流式细胞术分析细胞，计算群体的中值荧光强度(>10,000个收集的事件)。结果显示于图6中。
将20C3和22C3以及其他hPD-L1抗体用作流式细胞试剂以检测细胞表面hPD-L1。20C3与22C3直方曲线(图6A)与同种型对照抗体曲线相比的显著右移反映hPD-L1阳性LOX黑色素瘤细胞系上hPD-L1的选择性检测。与这些直方图和来自此分析的其他结果相关的中值荧光强度显示于图6B中。20C3和22C3结合的选择性通过在阴性细胞系HT144上缺乏重要结合(即与同种型相当的22C3和20C3的MFI)进一步证实。相反，图6B中的数据显示与hPD-L1阳性LOX黑色素瘤细胞系上的同种型相比，20C3与22C3的MFI增加至少10倍。因此，通过流式细胞评价，20C3与22C3(除克隆5F9、7C8、13D2和31D3之外)显示与hPD-L1表达细胞的选择性结合。
另一实验评估22C3抗体检测经工程改造和人细胞系上hPD-L1表达的能力。将对hPD-L1呈阴性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系用编码人PD-L1的表达载体转染以产生经工程改造的阳性对照细胞系。如图7B中所示，亲本CHO细胞系(阴性对照)和经转染的CHO细胞系(阳性对照)的***固定石蜡包埋(FFPE)细胞沉淀(pellet)的22C3免疫组织化学染色显示适当阳性和阴性染色。
将其他FFPE人细胞系沉淀(A375、HS578T和LOX黑色素瘤)用22C3染色且显示多种染色模式和强度(如图7B中所示)。22C3染色在Lox黑色素瘤细胞上强烈且均匀，但在A375和HS578T细胞沉淀中仅显示罕见的单阳性细胞。由20C3抗体观察到类似染色(数据未显示)。如以泛素mRNA作为基线使用qPCR所评价，在IHC分析中通过22C3在这3种细胞系中检测到的hPD-L1表达水平与这些细胞系中的PD-L1 mRNA水平充分相关。
在基于细胞的ELISA实验中评估22C3对hPD-L1表达细胞的选择性结合和相对亲和力。将几种细胞系(hPDL1-CHOK1细胞、亲本CHOK1细胞、hPDL2-CHOK1细胞和LOX细胞)铺板于经胶原蛋白包被的96孔板的个别孔上且生长至汇合。移除培养基且用含有介于1.4ng/ml与3,000ng/ml之间的渐增浓度的初级抗体的新鲜CHOK1培养基(含有10% BCS的DMEM/F12)替换。使用以下初级抗体：两种不同生产批量的抗体20C3和22C3中的每一者，其中小鼠IgG 1同种型、抗PD-L1抗体(Biolegend)和抗PD-L2抗体充当对照。初级抗体在37℃下孵育1小时，用PBS/0.01% Tween 20洗涤3次，且添加用CHOK1培养基以1：2000稀释的二级抗体(山羊抗人IgG、Fc特异性HRP(Southern Biotech，目录号1030-05)缀合物)。二级抗体在37℃下孵育1小时且如上洗涤5次。使用TMB进行ELISA，用0.1N磷酸中止，且读取450nm下的吸光度(减去650nm的背景)。图8中所示的结果显示22C3和20C3与表达hPD-L1的细胞的选择性结合，对于经hPD-L1 CHOK1工程改造的细胞和LOX细胞，22C3结合亲和力的亲和力均大于20C3。
进行类似ELISA实验以评价20C3或22C3抗体中的任一者是否结合小鼠PD-L1。未观察到任一种抗体与小鼠PD-L1的显著结合(数据未显示)。
进行实施例1中所述实验中所鉴定的不同抗hPD-L1抗体对之间的抗体结合竞争分析法("交叉阻断")。所述分析法采用ForteBio® Octet®平台，其基于生物膜干涉术。简而言的，该技术将初始抗体(mAb1)与生物传感器尖端表面的结合以归因于结合抗体使生物传感器尖端的光学厚度(Y轴)随着时间推移(X轴)而增加的波长位移(Δλ)进行测量。尖端由结合hPD-L1-Fc的抗huIgG传感器组成。抗PD-L1抗体结合时光学厚度的变化以由第一垂直红色点线开始的向上倾斜的曲线反映(参见图9A、图9B和图9C中的图表)，其表示将饱和浓度的mAb1(10微克/毫升)添加至溶液中。在达到平衡(约1000秒)之后，将第二抗体注入分析溶液中(在图9A、图9B和图9C中由第二垂直红色点线指示)。由曲线的额外偏移所示的第二mAb2的结合表明两种抗体结合于不相重叠的表位，而曲线较少偏移至无偏移表明两种抗体结合于重叠或相同的表位。
总而言之，结果显示22C3结合与除5H9外的所有其他抗hPDL-1克隆(作为mAb2进行测试)的额外结合进行竞争(图9A)。类似地，20C3也未能与5H9结合竞争，但显示与22C3以及4B7的中等程度的额外结合(图9B)。当一起考虑时，这些数据指示20C3和22C3结合重叠的表位。
22C3抗体检测不同肿瘤类型中多种hPD-L1表达的能力通过在由以下肿瘤制备的FFPE切片上进行IHC分析来评价：膀胱、食道、头颈、肾脏、HCC、乳腺、肺、卵巢和胃肿瘤。使用染色程度的半定量"完形"解释进行22C3与这些肿瘤组织切片反应性的初筛选。如图10所描述，22C3能够检测自基本上无染色(分数=0)至显著强烈表达(分数=4)的多种PD-L1表达，从而显示22C3的IHC分析引导可对禁止免疫抑制PD-1/PD-L1相互作用起反应的未来肿瘤类型的效用。
在研究中评价22C3抗体将患者分级的效用，所述患者很可能对阻断PD-1与PD-L1的相互作用的治疗起反应，所述研究利用获自18个参加第1阶段(P001)MK-3475(一种由Merck and Co.,Inc研发的抗PD1治疗抗体)试验的黑色素瘤患者的存档样品的22C3免疫组织化学评价。两位病理学家独立地评价所述情况且归为"阳性"、"阴性"或"意义不明确"，且描述这三个种类的代表性图像显示于图11A中。病理学家之间关于此样品集(n=18)的一致性为100%。
临床反应使用免疫相关反应标准(irRC)评价且与IHC结果相关。对于该分析而言，将"意义不明确的"情况视为阴性，从而使得分析灵敏度为72%且特异性为86%。图11B中所示的结果表明FFPE组织的22C3免疫组织化学染色具有作为患者选择生物标记的效用。
基于上文所述实验的结果，本文的发明人确定由88个实验杂交瘤中的两者(MEB037.20C3.138和MEB037.20C3.116)所产生的抗体具有考虑发展成为候选FFPE反应性IHC诊断试剂所要的灵敏度、特异性和稳健性的组合。
实施例3. 人PD-L1上表位针对22C3抗PD-L1抗体的定位
使用抗体22C3和PD-L1-His蛋白(其含有与十一聚体组氨酸标记融合的成熟人PD-L1的细胞外结构域(SEQ ID NO: 38))进行HDX-MS表位定位。人PD-L1的细胞外结构域(SEQID NO: 38)上的区段156至178和196至206在结合于抗体22C3时显示强保护作用(平均氘化水平差异>10%)。另外，区段3至9、10至13、88至93和135至147显示微小但重要的保护(平均氘化水平差异为5%至10%)。
本文所引用的所有参考文献均通过引用并入，其引用的程度如同特定且个别地将各个别公开、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利通过引用并入一样。按照37 C.F.R.§1.57(b)(1)，对于此关于参考文献通过引用并入的陈述，申请人意指每一个别公开、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，每一文献遵照37 C.F.R.§1.57(b)(2)进行明确标识，即使此类引用并不紧邻通过引用并入的专用陈述。说明书中包含关于通过引用并入的专用陈述(如果存在)并不以任何方式削弱此关于通过引用并入的通用陈述。本文中参考文献的引用不意欲承认参考文献为相关现有技术，也不构成对这些公开或文献的内容或日期的任何承认。
本发明并不限于本文所述的特定实施方案的范围。实际上，本领域技术人员将自先前描述和附图知晓除本文所述的内容外的本发明的多种修改。此类修改意欲落在随附权利要求的范围内。
认为以上书面说明书足以使本领域技术人员能够实践本发明。本领域技术人员将自以上描述知晓除本文所示和所述的内容外的本发明的多种修改且此类修改落在随附权利要求的范围内。
序列表
<110> 默沙东公司
<120> 结合人程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体
<130> 23411
<150> US 61/745,386
<151> 2012-12-21
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8的Xaa可为His或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 位置9的Xaa可为Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位置10的Xaa可为Arg或Ser
<400> 1
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Xaa Xaa Xaa Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1的Xaa可为Gln或Lys
<400> 3
Xaa Gln Ser Tyr Asp Val Val Thr
1 5
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> 位置22的Xaa可为Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 位置31的Xaa可为His或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> 位置32的Xaa可为Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 位置33的Xaa可为Arg或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (95)..(95)
<223> 位置95的Xaa可为Gln或Lys
<400> 4
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Xaa Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa Gln
85 90 95
Ser Tyr Asp Val Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 位置4的Xaa可为Ile或Met
<400> 5
Ser Tyr Trp Xaa His
1 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位置7的Xaa可为Asp或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 位置9的Xaa可为His或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 位置12的Xaa可为Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 位置13的Xaa可为Glu或Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> 位置16的Xaa可为Ile或Met
<400> 6
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Xaa Tyr Xaa Glu Tyr Xaa Xaa Lys Phe Xaa
1 5 10 15
Asp
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5的Xaa可为Ile或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13的Xaa可为Phe或Tyr
<400> 7
Ser Gly Trp Leu Xaa His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Xaa
1 5 10
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 位置3的Xaa可为His或Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 位置4的Xaa可为Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13的Xaa可为Glu或Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 位置34的Xaa可为Ile或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 位置56的Xaa可为Asp或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> 位置82的Xaa可为His或Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> 位置84的Xaa可为Ile或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (103)..(103)
<223> 位置103的Xaa可为Ile或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (111)..(111)
<223> 位置111的Xaa可为Phe或Tyr
<400> 8
Gln Val Xaa Xaa Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Xaa Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Xaa His Trp Xaa Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Xaa Tyr Xaa Glu Tyr Xaa Xaa Lys Phe
50 55 60
Xaa Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Xaa Xaa Ser Xaa Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Xaa Leu Xaa Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Trp Leu Xaa His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Xaa Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 10
Gln Gln Ser Tyr Asp Val Val Thr
1 5
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 11
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Phe Gly
20
<210> 12
<211> 132
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 12
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Phe Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Val Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Leu Lys
130
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 13
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Asp Val Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 14
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 15
Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 16
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Asn Glu Tyr Ser Glu Lys Phe Met
1 5 10 15
Asp
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 17
Ser Gly Trp Leu Val His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 18
Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 19
<211> 141
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 19
Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Glu
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Asn Glu Tyr Ser
65 70 75 80
Glu Lys Phe Met Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ala Ser Thr
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Trp Leu Val His Gly Asp Tyr Tyr Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 20
<211> 122
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 20
Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Glu Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Asn Glu Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Met Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ala Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Trp Leu Val His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 21
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr Ser Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 22
Lys Gln Ser Tyr Asp Val Val Thr
1 5
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 23
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly
20
<210> 24
<211> 132
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 24
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu His Thr Ser Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asp Val Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Leu Lys
130
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 25
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr
20 25 30
Ser Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asp Val Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 26
Ser Tyr Trp Ile His
1 5
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 27
Gly Thr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His
1 5 10
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 28
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr His Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Ile
1 5 10 15
Asp
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 29
Ser Gly Trp Leu Ile His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 30
Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 31
<211> 141
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr His Glu Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Ile Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met His Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Trp Leu Ile His Gly Asp Tyr Tyr Phe
115 120 125
Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 32
<211> 122
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1的Xaa可为Gln或焦谷氨酸酯
<400> 32
Xaa Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr His Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Ile Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Trp Leu Ile His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 396
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 33
atggattcac aggcccaggt tcttatattg ctgctgctat gggtatctgg tacctttggg 60
gacattgtga tgtcacaatc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120
atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 180
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 240
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gccagcaatc ttatgatgtg 360
gtcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 396
<210> 34
<211> 423
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 34
atggaaaggc actggatctt tctcttcctg ttttcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60
gtccaggttc agcagtctgg ggctgaactg gcagaacctg gggcctcagt gaagatgtcc 120
tgcaaggcct ctggctacat ctttactagc tactggatgc actggctaaa gcagaggcct 180
ggacagggtc tggaatggat tggatacatt aatcccagca gtgattataa tgaatacagt 240
gagaaattca tggacaaggc cacattgact gcagacaaag cctccaccac agcctacatg 300
caactgatca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag atcgggatgg 360
ttagtacatg gagactatta ttttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 420
tca 423
<210> 35
<211> 396
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 35
atggattcac aggcccaggt tcttatattg ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60
gacattgtga tgtcacagtc tccctcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120
atgacctgca aatccagtca gagtctgctc cacactagca cccgaaagaa ctacttggct 180
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctattgggc atccactagg 240
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaaacaatc ttatgatgtg 360
gtcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 396
<210> 36
<211> 423
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 36
atggaaaggc actggatctt tctcttcctg ttttcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60
gtccaccttc agcagtctgg ggctgaactg gcaaaacctg gggcctcagt gaagatgtcc 120
tgcaaggctt ctggctacac gtttactagt tactggatac actggataaa gcagaggcct 180
ggacagggtc tggaatggat tggatacatt aatccttcct ctggttatca tgaatacaat 240
cagaaattca ttgacaaggc cacattgact gctgacagat cctccagcac agcctacatg 300
cacctgacca gcctgacgtc tgaagactct gcagtctatt actgtgcaag atcgggatgg 360
ttaatacatg gagactacta ctttgacttc tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 420
tca 423

Claims (10)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人PD-L1且包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的三个轻链CDR和CDRH1、CDRH2和CDRH3的三个重链CDR，其中：
(a) CDRL1选自：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 9的变体和SEQ ID NO: 21的变体；
(b) CDRL2选自SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 2的变体；
(c) CDRL3选自：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 10的变体和SEQ ID NO: 22的变体；
(d) CDRH1选自：SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 26、SEQID NO: 27、SEQ ID NO: 14的变体、SEQ ID NO: 15的变体、SEQ ID NO: 26的变体和SEQ IDNO: 27的变体；
(e) CDRH2选自：SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 16的变体和SEQ ID NO: 28的变体；和
(f) CDRH3选自：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 17的变体和SEQ ID NO: 29的变体。
2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述三个轻链CDR为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3且所述三个重链CDR为SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6和SEQID NO: 7。
3.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述三个轻链CDR为SEQ ID NO:9；SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 10且所述三个重链CDR为SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17。
4.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述三个轻链CDR为SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 22且所述三个重链CDR为SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28和SEQ ID NO: 29。
5.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区和重链可变区，其中：
(a) 所述轻链可变区选自：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 13的变体、SEQID NO: 25和SEQ ID NO: 25的变体；和
(b) 所述重链可变区选自：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 20的变体、SEQID NO: 32和SEQ ID NO: 32的变体。
6.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区和重链可变区，其中：
(a) 所述轻链可变区为SEQ ID NO: 13且所述重链可变区为SEQ ID NO: 20；
(b) 所述轻链可变区为SEQ ID NO: 25且所述重链可变区为SEQ ID NO: 32，其中SEQID NO: 32中的X为Q；或
(c) 所述轻链可变区为SEQ ID NO: 25且所述重链可变区为SEQ ID NO: 32，其中SEQID NO: 32中的X为pE。
7.分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人PD-L1且阻断参考抗体的结合，所述参考抗体包含：
(a) SEQ ID NO: 13的轻链可变区和SEQ ID NO: 20的重链可变区；或
(b) SEQ ID NO: 25的轻链可变区和SEQ ID NO: 32的重链可变区。
8.权利要求7的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述参考抗体包含SEQ ID NO: 25的轻链可变区和SEQ ID NO: 32的重链可变区，且所述阻断抗体结合SEQ ID NO: 38的第一氨基酸区段156至178中的残基和SEQ ID NO: 38的第二氨基酸区段196至206中的残基。
9.权利要求8的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述阻断抗体进一步结合选自以下的人PD-L1区段中的任何一者、两者或三者或所有四者中的残基：SEQ ID NO: 32的氨基酸3至9；SEQ ID NO: 38的氨基酸10至13；SEQ ID NO: 38的氨基酸88至93和SEQ ID NO: 38的氨基酸135至147。
10.分离的核酸，其编码抗体轻链可变区和抗体重链可变区中的一者或两者，其中
(a) 所述抗体轻链可变区选自：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 25；和
(b) 所述抗体重链可变区选自：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 32，其中SEQ ID NO: 32中的X为Q。
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