DE19648209A1

DE19648209A1 - Verfahren zur Tumorzelldepletion CD34-positiver Zellen

Info

Publication number: DE19648209A1
Application number: DE19648209A
Authority: DE
Inventors: Rupert Dr Handgretinger; Stefan Neu
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1996-11-21
Filing date: 1996-11-21
Publication date: 1998-05-28
Also published as: WO1998022508A3; WO1998022508A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Entfernung (purging) von Tumorzellen aus Präparationen, die CD34-positive Zellen enthalten, mit Hilfe CD44- spezifischer Antikörper.

Autologe Knochenmarkstransplantation ist nicht nur bei Therapie von Leukämie, son dern auch in der Therapie solider Tumoren von steigender Wichtigkeit. Der Nutzen autolo ger Knochenmarkstransplantationen wird durch ein erhöhtes Rezidivrisiko im Verlauf der Knochenmarksrekonstitution beeinträchtigt. Dieser Rückfall könnte von malignen Zellen herstammen, die die Knochenmarksfraktion in unterschiedlichem Maße kontaminieren (1, 2, 3).

Es existieren verschiedene Strategien, die Kotransplantation maligner Tumorzellen bei der autologen Transplantation zu verhindern. Die gebräuchlichste Methode, die Tumormas se zu reduzieren, ist Knochenmarksreinigung (bone marrow purging). Knochenmarkszellen werden mechanischen oder chemischen Verfahren unterworfen (4). Damit kann eine Ver ringerung der malignen Zellen um Werte von 3 bis mehr als 5 log erreicht werden (5, 4, 6), jedoch werden die malignen Zellen nicht in jedem Falle ausgerottet. Eine kürzlich ange wandte Methode ist die Anreicherung und Reinfusion von hämatopoetischen Stammzellen. Im Menschen exprimieren hämatopoetische Stammzellen CD34. Es wurden verschiedene Ansätze entwickelt, CD34-positive Zellen erfolgreich zu isolieren, wobei Immunoabsor bens-, immunomagnetische oder Zentrifigationsverfahren verwendet werden (7). Bis heute ist es kaum möglich, die gewünschte Zellpopulation im klinischen Maßstab bis zur Homo genität anzureichern. Dieses Erfordernis sollte erfüllt werden, um das Risiko kontaminieren der Zellen auszuschließen. Obwohl also Reinigungsverfahren und Stammzellanreicherungs strategien verwendet werden, besteht immer noch das Risiko minimaler übrigbleibender Erkrankung (minimal residual disease) bei autologer Transplantation.

Eine vielversprechende neue Strategie der Eliminierung oder Minimierung residualer maligner Zellen könnte aus der Kombination von Reinigungsmethoden und Stammzellanreicherung resultieren. Jedoch fehlt es dafür an tumorspezifischen Markern, d. h. Antigenen, die auf Tumorzellen, jedoch nicht auf hämatopoetischen Stammzellen exprimiert werden.

CD44 ist ein verbreitetes Antigen, das von verschiedenen Zellen exprimiert wird (8), darunter T-Zellen, Granulozyten und Thymozyten. CD44 ist als Hyaluronsäurerezeptor bekannt (9). Eine komplexe genomische Organisation mit wenigsten 20 Exons ist für die Erzeugung verschiedener Spleißvarianten verantwortlich (10, 8). Bis heute sind 15 ver schiedene Spleißtypen von CD44 bekannt. Um zwischen dem Standardrezeptorphänotyp und den gespleißten Phänotypen zu unterscheiden, wurde der gewöhnlich exprimierte Hya luronsäurerezeptor CD44s benannt, während alle Spleißvarianten mit CD44v bezeichnet wurden (8, 11). Alle Spleißvarianten sind länger und tragen zusätzliche extrazelluläre Prote indomänen. Die Erzeugung von CD44-Spleißvarianten scheint mit Prozessen der Aktivie rung, Entzündung und Tumorprogression korreliert zu sein (12, 13, 14, 15). Möglicherwei se in Analogie zu ihrer Funktion bei der Lymphozytenmigration wurde für variante CD44- Moleküle gezeigt, daß sie metastatische Fähigkeiten in Rattentumorzellinien hervorrufen können (16). Homologe dieser Varianten, insbesondere CD44v5 und CD44v6 wurden in verschiedenen menschlichen malignen Erkrankungen detektiert, darunter Non-Hodgkin's Lymphom (17), Brust (18), Magen (19) und Kolon (20), wo sie sowohl mit Tumorprogres sion und Tumorausbreitung als auch mit einer schlechten Prognose der Patienten in Verbin dung gebracht werden.

Die Erzeugung von CD44v5 und CD44v6 ist nicht auf metastasierende Zellen be schränkt, sondern die Expression dieser Spleißvarianten scheint ein allgemeines Muster der Immunabwehr zu sein (21). CD44v5 und CD44v6 sind einerseits für die Metastasenbildung verantwortlich (8, 22) und werden auf der anderen Seite von immunokompetenten Zellen exprimiert.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, verbesserte Verfahren zur Immunreinigung CD34-positiver Zellen (CD34+) bereitzustellen.

Diese Aufgabe konnte auf Grundlage des überraschenden Befundes gelöst werden, daß CD34-positive Zellen im Gegensatz zu vielen Tumorzellen die varianten Exons CD44v5 und CD44v6 nicht oder in sehr geringem Maße exprimieren. Damit wird ein neuer moleku larer Marker bereitgestellt, mit dessen Hilfe kontaminierende Tumorzellen in Stammzellprä parationen selektiv zerstört werden können.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines für variantes CD44 spezifischen Antikörpermoleküls zur selektiven Entfernung von Tumorzellen aus einer Zell präparation, die hämatopoetische Stamm- und/oder Vorläuferzellen enthält. Insbesondere betrifft dies Zellpräparationen, die hämatopoetische Stamm- und/oder Vorläuferzellen ent halten, die CD34 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Solche Zellpräparation können aus Kno chenmark, peripherem Blut, Nabelschnurblut oder Leukapheresematerial erhalten werden. Bei der Herstellung der Zellpräparation können CD34+-Zellen selektiv angereichert wer den, etwa durch immunoabsorbierende, immunomagnetische oder Zentrifugationstechniken, beispielsweise durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder magnetische Zellseparation (MACS).

Insbesondere kann für die erfindungsgemäße Verwendung ein Antikörpermolekül verwendet werden, das spezifisch für ein Epitop ist, das durch das variante Exon v5 und/oder das variante Exon v6 des CD44 Gens kodiert wird. Ein solches Antikörpermolekül kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein, ein komplettes Immunoglobulin oder aber auch ein Fragment davon, z. B. ein Fab-Fragment. Es kann sich dabei auch um ein hybrides oder chimäres ein- oder mehrkettiges und/oder durch Expression rekombinanter DNA hergestelltes Antikörpermolekül handeln, das die angegebene Spezifität aufweist. Besonders bevorzugt ist der monoklonale Antikörper VFF-18, der von einer Hybridoma zellinie sezerniert wird, die am 07.06.1994 unter dem Aktenzeichen DSM ACC2174 bei der DSM-Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt wurde (WO 95/33771).

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Antikörpermoleküle mit der beschriebenen Spezifität, die mit einem zytotoxischen Agens verknüpft sind, beispielsweise mit einem Toxin, vorzugsweise einem bakteriellen Toxin. Besonders bevorzugt ist dabei das Exotoxin der Gattung Pseudomonas. Das Toxin kann mit dem Antikörpermolekül kovalent verknüpft sein oder durch rekombinante Expression eines Antikörper-Toxin Fusionsproteins herge stellt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen Verwendungen von Antikörpermolekülen mit der beschriebenen Spezifität zur selektiven Entfernung von Tumorzellen aus einer Zellpräparation, die hämatopoetische Vorläuferzellen enthält, indem die Tumorzellen selektiv auf einem festem Träger, der beispielsweise magnetisch sein kann, immobilisiert werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Entfernung von Tumorzellen aus einer Zellpräparation, die hämatopoetische Vorläuferzellen enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Zellpräparation mit einem für variantes CD44 spezifi schen Antikörpermolekül in Kontakt gebracht wird.

Ein solches Verfahren kann beispielsweise dadurch gekennzeichnet sein, daß das An tikörpermolekül mit einem zytotoxischen Agens verknüpft ist.

Ein solches Verfahren kann auch dadurch gekennzeichnet sein, daß zur Entfernung der Tumorzellen ein fester Träger verwendet wird.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Zellpräparation, die nach ei nem der beschriebenen Verfahren erhältlich ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer wie vorste hend beschrieben gereinigten Zellpräparation zur Transplantation, insbesondere zur autolo gen Knochenmarkstransplantation.

Die Nuklein- und Aminosäuresequenz der varianten Exons des CD44-Gens ist be kannt (13, 29, 30). Die Existenz degenerierter oder alleler Varianten ist für die Ausführung der Erfindung nicht von Bedeutung; solche Varianten sind daher ausdrücklich mit ein geschlossen.

Die Sequenz von Exon v5 des menschlichen CD44-Gens ist:

Die Sequenz von Exon v6 des menschlichen CD44-Gens ist:

Die Herstellung von Antikörpern gegen bekannte Aminosäuresequenzen kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen (28). Beispielsweise kann ein Peptid dieser Sequenz synthetisch hergestellt und als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt wer den. Ein anderer Weg ist die Herstellung eines Fusionsproteins, das die gewünschte Ami nosäuresequenz enthält, indem eine Nukleinsäure (die synthetisch oder z. B. durch Polyme rase-Kettenreaktion (PCR) aus einer geeigneten Probe hergestellt werden kann), die für diese Sequenz kodiert, in einen Expressionsvektor integriert und das Fusionsprotein in ei nem Wirtsorganismus exprimiert wird. Das gegebenenfalls gereinigte Fusionsprotein kann dann als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt und Insert-spezifische Anti körper oder, im Falle monoklonaler Antikörper, Hybridome, die insertspezifische Antikör per exprimieren, mit geeigneten Verfahren selektiert werden. Solche Verfahren sind Stand der Technik. Heider et al. (27) und Koopman et al. (17) beschreiben die Herstellung von Antikörpern gegen variante Epitope von CD44. Antikörper gegen Epitope, die durch die Exons v5 und v6 kodiert werden, werden insbesondere in den Patentanmeldungen WO 95/00851 und WO 95/33771 beschrieben.

Antikörper, die für CD44v5 und/oder CD44v6 spezifisch sind, können mit einem zytotoxischem Agens, beispielsweise einem Toxin verknüpft werden. Geeignet sind bei spielsweise Ricin, insbesondere rekombinante Ricin-A-Kette oder Abrin A. Besonders ge eignet ist das Pseudomonas-Exotoxin. Das Toxin kann mit dem Antikörpermolekül kova lent verknüpft sein, beispielsweise über eine Thioetherbindung unter Verwendung des Kopp lungsagens Sulfo-sucinimidyl-4(N-maleimidomethyl)cyclo-hexan-1-carboxylat (vgl. Beispiel 2).

Es kann aber auch beispielsweise ein Antikörper/Toxin-Fusionsprotein verwendet werden. Verfahren zur Herstellung solcher Fusionsproteine sind im Stand der Technik be schrieben (31, 32).

Auch die Verwendung eines Antikörper-Zytostatikum-Konjugats ist möglich. Verfah ren zur Herstellung von Antikörper-Zytostatikum-Konjugaten sind im Stand der Technik beschrieben (33).

Zellpräparationen, die hämatopoetische Vorläuferzellen enthalten, können beispiels weise in einem geeigneten Zellkulturmedium in einer Konzentration von 10⁶-10⁸ Zellen/ml bei einer Temperatur von 37°C suspendiert, mit 0.01-10 µg/ml Antikörper-Pseudomonas- Exotoxin-Konjugat versetzt und 0.5 bis 20 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden, bei 37°C inkubiert werden. Vorzugsweise beträgt die Antikörper-Toxin-Konzentration 0.1-5 µg/ml, besonders bevorzugt 0.5-1 µg/ml. Anschließend können die Zellen mit Kultur medium gewaschen werden. Das Vorhandensein überlebender Tumorzellen kann in einem Koloniebildungsversuch (vgl. Beispiel 3) getestet und die Prozedur gegebenenfalls wieder holt werden. Die Überlebensrate klonogener hämatopoetischer Vorläuferzellen kann eben falls in einem entsprechenden Assay getestet werden (vgl. Beispiel 3).

Ein anderer Weg, die Erfindung auszuführen, besteht in einer immunomagnetischen Reinigung. Zellpräparationen, die hämatopoetische Vorläuferzellen enthalten, können bei spielsweise in einem geeigneten Zellkulturmedium in einer Konzentration von 10⁶-10⁸ Zellen/ml suspendiert, mit 0.1-20 µg/ml eines entsprechenden CD44-Antikörpers und un ter leichter Bewegung (Rollen oder Schütteln) beispielsweise für 10 bis 90 min, vorzugs weise für 30 min. unter Kühlung, z. B. bei 4°C inkubiert werden. Anschließend können die Zellen gewaschen und dann mit einem magnetischen sphärischen Trägermaterial versetzt werden, das mit einem Antikörper, der den verwendeten CD44-Antikörper binden kann, beschichtet ist. Solche Trägermaterialen sind im Handel erhältlich (vgl. Beispiel 3). Es schließt sich daran eine erneute Inkubation an, beispielsweise wieder für 30 min bei 4°C un ter leichter Bewegung. Dabei binden die Tumorzellen über die Antikörper-Antikörper- Wechselwirkung an den Träger. Der Träger mitsamt den spezifisch gebundenen Tumorzel len kann dann mit Hilfe eines Magneten entfernt werden.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die beschriebenen Ausführungsformen be schränkt. Sie schließt weitere Ausführungsformen von Verfahren zur Abtrennung von Tu morzellen aus den genannten Zellpräparationen ein, deren Kernelement die spezifische Wechselwirkung von CD44v5/CD44v6-Antikörpermolekülen mit Tumorzellen ist.

Abbildungen

Fig. 1a-e: Durchflußzytometrische Analyse angereicherter CD34+-Zellen, isoliert aus Na belschnurblut. Die Analyse wurde mit einem FACScan (Becton Dickinson) durchgeführt. 5000 Zellen wurden untersucht. Gezeigt ist ein Punktdiagramm (dot blot) der Fluoreszenz intensitäten (Fluoreszenz 1 (grün) gegen Fluoreszenz 2 (rot)).

Fig. 1a: Kontrollfärbung angereicherter Zellen mit nichtspezifischen Fluorochrom-markier ten Antikörpern (IgG1-FITC und IgG2a-PE).

Fig. 1b: Färbung angereicherter Zellen mit dem CD34-spezifischen Antikörper HPCA-2- FITC (grün).

Fig. 1c: Färbung angereicherter Zellen mit CD34-spezifischem HPCA-2-FITC (grün) und CD44s-spezifischem SFF-2-Biotin-Streptavidin-PE (rot).

Fig. 1d: Färbung angereicherter Zellen mit CD34-spezifischem HPCA-2-FITC (grün) und CD44v5-spezifischem VFF-8-Biotin-Streptavidin-PE (rot).

Fig. 1e: Färbung angereicherter Zellen mit CD34-spezifischem HPCA-2-FITC (grün) und CD44v6-spezifischem VFF-18-Biotin-Streptavidin-PE (rot).

Fig. 2: Durchflußzytometrische Analyse angereicherter CD34+-Zellen, isoliert aus Nabel schnurblut. Die Analyse wurde mit einem FACScan (Becton Dickinson) durchgeführt. 5000 Zellen wurden analysiert. Gezeigt ist ein Punktdiagramm der Lichtstreuungseigenschaften (Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung).

Fig. 3: Expression von CD44s, CD44v5 und CD44v6 in CD34+-Zellen, isoliert aus Leuka pheresematerial. Gezeigt ist die Antigenexpression individueller Proben.

Fig. 4: Expression von CD44s, CD44v5 und CD44v6 in CD34+-Zellen, isoliert aus Nabel schnurblut. Gezeigt ist die Antigenexpression individueller Proben.

Fig. 5: Expression von CD44s, CD44v5 und CD44v6 in CD34+-Zellen, isoliert aus Kno chenmark. Gezeigt ist die Antigenexpression individueller Proben.

Beispiele Beispiel 1: Expression von CD44s uni CD44v auf CD34+-Zellen Gewinnung von Nabelschnurblut und Isolierung mononukleärer Zellen

Bis zu 50 ml frisch erhaltenes Nabelschnurblut wurde mit 300 I.U. Heparin-Natrium (Promonta, Hamburg, Deutschland) vermischt. Mononukleäre Zellen wurden angereichert, wobei eine modifizierte Methode der Dichte-Sedimentation verwendet wurde. Blut, das nicht älter als 6 Stunden war, wurde 1 : 2 mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, PBS (Gibco, Renfrewshire, UK), verdünnt, die 5 mM EDTA enthielt. Als Trennmedium wurde Lympho prep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwegen) mit einer Dichte d=1.077 verwendet. Die Zentrifugation wurde bei 800 × g für 15 Min. ausgeführt. Die Fraktion der mononukleären Zellen wurde zweimal mit PBS/EDTA gewaschen.

Probenherstellung von Leukapheresematerial und Knochenmark

Cryokonserviertes Leukapheresematerial wurde schnell bei 37°C getaut und sofort in RPMI 1640/10% FCS (Hyclone, Cramlington, UK) resuspendiert. RPMI1640 (Biochrom, Berlin, Deutschland) wurde ohne Indikatorfarbstoff verwendet. Die Zellen wurden zweimal mit RPMI 1640 gewaschen. Frisch erhaltenes Leukapheresematerial und Knochenmarkspro ben wurden einmal mit RPMI1640 gewaschen. Um Klumpen zu entfernen, wurde das Ma terial mit 0.02% Kollagenase (Sigma, Deisenhofen, Deutschland), Typ V, und 200 U/ml DNAse (Calbiochem, Bad Soden, Deutschland) verdaut. Der Verdau wurde für 45-90 Min. bei Raumtemperatur ausgeführt, wobei die Zellsuspension sanft geschüttelt wurde. Zellen wurden durch ein 40 µm Nylonzellenfilter (Becton, Dickinson, San Jose, California) filtriert. Weitere Informationen zum benutzten Leukapheresematerial können Tabelle I ent nommen werden. Knochenmarksproben wurden von gesunden Donoren erhalten.

CD34-spezifische Färbung mononukleärer Zellen

Isolierte mononukleäre Zellen aus Nabelschnurblut sowie enzymatisch behandelte Zellen (Leukapherese/Knochenmarksproben) wurden in Markierungspuffer resuspendiert, der PBS/5 mM EDTA/0.5% BSA (Gibco) enthielt. CD34-Markierung wurde mit einem CD34 Progenitor Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) durchgeführt. CD34-spezifische Markierung von Zellen wurde gemäß der Herstellerangaben durchgeführt (23).

Magnetische positive Selektion von CD34+-Zellen

Antikörpermarkierte Zellen wurden in entgastem Markierungspuffer resuspendiert. Die Trennung wurde durchgeführt, wobei ein magnetisches Trennungssystem (23, 24) ver wendet wurde, magnetische Zellseparation MACS (Miltenyi Biotec). Zellen wurden in der Anwesenheit eines starken Magnetfeldes auf MiniMACS-Säulen, Typ MS, gegeben. Die Säulen wurden viermal mit Markierungspuffer gewaschen, gefolgt von der Elution mit Markierungspuffer in Abwesenheit eines Magnetfeldes. Zur Elution wurde ein Spritzen stempel benutzt. Mit einer zweiten Säule wurden die Zielzellen weiter gereinigt, wobei zwei Waschschritte angewendet wurden. Die Reinheit der isolierten Zellen wurde durch Durch flußzytometrie bestimmt. Fluorochrom-markierte Antikörper (alle von Becton Dickinson) wurden wie folgt appliziert: Unspezifische Kontrollantikörper (IgG1-FITC und IgG2a-PE), CD34-FITC (HPCA-2-FITC (Fluorescein-Isothiocyanat)) und CD34-PE (HPCA-2-PE).

Färbung von CD34+-Zellen mit CD44-spezifischen Antikörpern

Angereicherte Zielzellen aus Nabelschnurblut oder Leukapheresematerial wurden mit kaltem PBS (Gibco) gewaschen. Zellen wurden in Immunofluoreszenzpuffer, der 5% Po lyglobin N (Troponwerke, Köln, Deutschland) und 0.05% NaN₃ enthielt, resuspendiert. CD44-spezifische Antikörper (Tabelle II) wurden von Bender & Co. GesmbH (Wien, Österreich) bezogen. CD34-/CD44-Doppelfluoreszenzfärbung (FITC/PE- oder FITC/Bio tin-markierte Antikörper) wurde gleichzeitig durchgeführt, wobei ein CD34-spezifischer Antikörper und ein CD44-Antikörper der Wahl benutzt wurde. Die Inkubation erfolgte bei 4°C für 30 Min. in der Dunkelheit. Zellen wurden zweimal mit PBS (4°C) gewaschen. Pro ben, die mit Biotin markiertem CD44-Antikörper gefärbt wurden, wurden in Immunofluo reszenzpuffer resuspendiert und mit Streptavidin-PE (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) bei einer Konzentration von 5 µg/ml inkubiert. Die Inkubation wurde bei 4°C für 30 Min. in der Dunkelheit ausgeführt. Zellen wurden zweimal mit PBS (4°C) gewaschen und bis zur durchflußzytometrischen Analyse auf Eis gehalten.

Um die Leistung und Verläßlichkeit des Färbungssystems zu testen, wurden die Zel linien CCRF CEM (ATCC CLL 119), Jurkat (ATCC TIB 152) und MOLT-4 (ATCC CRL 1582) sowie Phytohämagglutinin-stimulierte Lymphozyten eines gesunden Freiwilligen be nutzt.

Durchflußzytometrische Analyse

Die Erhebung der Daten erfolgte unter Benutzung eines Single-Argon-Laser-Durch flußzytometers, FACScan (Becton Dickinson), das Licht mit einer Wellenlänge von 488 nm. emittierte. Die Analyse wurde mit einem PC-Lysys (Becton Dickinson), Software Version 1.0 und 1.1, auf einem IBM-kompatiblen Personalcomputer durchgeführt. Verschiedene Populationen von CD44-positiven und CD44-negativen Zellen wurden unter Verwendung von Dual Parameter Statistics in einem Punktdiagramm von grüner Fluoreszenz gegen rote Fluoreszenz unterschieden (Fig. 1a-e).

Reinheit von CD34+-Zellen, angereichert aus Nabelschnurblut, Leukapheresematerial und Knochenmarksproben

8 Nabelschnurblutproben, 7 Proben aus Leukapheresen und 4 Knochenmarksproben wurden prozessiert. Im Vergleich mit nichtseparierten mononukleären Zellen zeigten iso lierte Zellen ein anderes Lichtstreuungssignal (Fig. 2): Zellen, die der magnetischen Zellsor tierung unterworfen worden waren, zeigten höhere Werte der Vorwärtsstreuungssignale. Die Reinheit wurde durch FACS-Analyse untersucht. Die Prozentsätze von CD34+-Zellen wurden bestimmt. Mittelwerte (mittel ± SD) waren wie folgt Nabelschnurblut 96.1 ± 2.4%, Leukapherese 98.6 ± 0.9% und Knochenmarksproben 96.2 ± 0.5%.

Expression von CD44-Antigenen durch CD34-positive hämatopoetische Stammzellen

Durch Benutzung logischer Gates wurde die durchflußzytometrische Analyse der CD44-Expression auf CD34-positive Zellen beschränkt. Individuelle Proben von CD34+-Zellen aus Nabelschnurblut (Fig. 3), Leukapherese (Fig. 4) und Knochenmark (Fig. 5) zeig ten schwache Expression der untersuchten CD44-Varianten CD44v5 und CD44v6. Mit mittleren Werten von 0.6% in Proben von Knochenmark (Bereich 0.1-0.9%) zeigte die ses Gewebe nur eine marginale Expression der Spleißvariante CD44v5, und nur leicht er höhte Werte wurden in Proben aus Leukapheresen (Mittel 1.3%, Bereich 0.3-2.7%) und Nabelschnurblut (Mittel 1.4%, Bereich bis zu 3.2%) getunden. Im Vergleich mit der CD44v5-Expression wurde eine höhere Expression von CD44v6 in allen Typen von Proben gefunden, mit einer moderaten Zunahme in Proben aus Leukapiferesen (1.4mal höhere CD44v6-Expression), und einer größeren Zunahme in Knochenmark und Nabelschnurblut proben (2.5mal höher). Höhere Mittelwerte der CD44v6-Expression wurden von einem breiten Bereich der Proben von Knochenmark (Mittel 1.5%, Bereich 0.3-2.4), Leukaphe rese (Mittel 1.8%, Bereich 1.1-2.7), und Nabelschnurblut (Mittel 3.6%, Bereich 1.9-8.1) begleitet.

Im Gegensatz zur schwachen Expression von CD44-Spleißvarianten gab es eine star ke Expression der Standardform CD44s in allen untersuchten Probentypen. Mit Mittelwer ten von 98.6% (Leukapherese), 98.8% (Nabelschnurblut) zeigten fast alle Zellen CD44s Expression, im Knochenmark erreichte der Mittelwert das Maximum von 100%.

Allgemein wurde die niedrige Expression von CD44v und die hohe Expression von CD44s bestätigt (Tabelle III).

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere auch eine zweistufige Behandlung. In dem ersten Schritt werden CD34+-Zellen immunomagnetisch angereichert und im zweiten Schritt einer Immunreinigung (Immunopurging) unterworfen. Dabei können vorteilhaft An tikörper, die spezifisch für CD44v5 und CD44v6 sind bei der Immunreinigung verwendet werden.

Probenbeschreibung des Leukapheresematerials

CD44-spezifische Antikörper, die für die durchflußzytometrische Analyse ver wendet wurden

Expression von Standard- und variablen CD44-Antigenen auf CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen gemäß FACS-Analyse

Beispiel 2 Reinigung von hämatopoetischen Stammzellen mit Immunotoxinen Herstellung von Immunotoxinen

Antikörper, die spezifisch für durch CD44v5 oder CD44v6 kodierte Epitope sind (WO 95/00851 und WO 95/33771), können an Pseudomonas Exotoxin über eine Thioether-Bindung mit Sulfo-sucinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclo-hexan-1-carboxylat (Pierce, Rockford, Illinois, USA) wie in der Literatur beschrieben konjugiert werden (34). In Abänderung der zitierten Methode können nach der Inkubation des reduzierten MAk und Maleimidomethylcyclohexan-1-carboxylat-(Pseudomonas-Exotoxin) bei 4°C über Nacht ein gleiches Volumen gesättigter Amoniumsulfatlösung zugesetzt und die Präparation für eine weitere Stunde inkubiert werden. Der gebildete Niederschlag kann durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Min. gewonnen, in 1 ml PBS gelöst und der Gelfiltration unterworfen werden (35).

Fraktionen, die gereinigtes Konjugat enthalten, wie durch Natrium-Dodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelextrophorese festgestellt werden kann, werden vereinigt und in den Ex perimenten verwendet. Die Proteinkonzentration kann mit einem Bio-Rad Protein-Assay be stimmt werden, wobei Rindergammaglobulin als Standard benutzt werden kann.

Immunotoxinbehandlung

Präparationen mononukleärer Zellen aus Nabelschnurblut, Leukapheresematerial, oder Knochenmark (s. oben) oder CD34+-angereicherte Zellen aus diesen Quellen (s. oben) können verwendet werden. Sie können in Zellkulturmedium (RPMI 1640/FCS, Antibiotika) für 1 Stunde, 2 Stunden oder 20 Stunden bei 37°C mit 0.01 µg/ml, 0.1 µg/ml, 0.5 µg/ml oder 1.0 µg/ml Immunotoxin inkubiert werden. Als Immunotoxine können CD44v5- oder CD44v6-Antikörper-Pseudomonas-Exotoxin-Konjugate oder eine Mischung beider ver wendet werden. Die Zellen können vor der Inkubation suspendiert und während der Inku bation gerollt oder leicht geschüttelt werden. Nach der Inkubation können Zellen mit PBS/1% FCS oder Zellkulturmedium 2mal gewaschen und dann weiterverwendet werden. Die Effektivität der Behandlung kann in einem Koloniebildungsversuch getestet werden (4, s. auch Beispiel 3). Gegebenenfalls kann die Prozedur ein- oder zweimal wiederholt werden. Die Überlebensrate klonogener Vorläuferzellen kann ebenfalls gemäß der Methode in der zuletzt beschriebenen Literaturstelle getestet werden (4, s. Beispiel 3).

Beispiel 3 Immunomagnetische Behandlung

Zur immunomagnetischen Reinigung mononukleärer Zellen aus Nabelschnurblut oder Leukapherese oder Knochenmark oder daraus angereicherter CD34+-Präparationen können immunomagnetische sphärische Träger (beads), z. B. Dynabeads SAM ST (Dynal, Oslo, Norwegen) verwendet werden. Dies sind gleichförmige, magnetische Polystyrolträger, die mit kovalent oberflächengebundenem Schaf-anti-Maus-IgG beschichtet sind. Die SAM IgG- Antikörper binden alle Maus-IgG-Unterklassen. Entsprechend werden für dieses Experi ment murine CD44-Antikörper verwendet (WO 95/00851, WO 95/33771). Die jeweilige Zellpräparation (z. B. 106 bis 108 Zellen) können für 30 Min. bei 4°C in Plastikröhrchen in 1 ml RPMI 1640 (mit Supplementen) mit CD44v5- und/oder CD44v6-MAKs (jeweils 10 µg jeden Antikörpers) inkubiert werden. Die Röhrchen können während der Inkubation gerollt oder geschüttelt werden. Die Zellen können zweimal mit PBS/1% FCS gewaschen werden. Dann können die immunomagnetischen Träger, suspendiert in 0.5 ml Medium, zugegeben und unter Rollen oder Schütteln für 30 Min. bei 4°C inkubiert werden. Dabei kann ein Trä ger/Zellverhältnis von 50 : 1 eingestellt werden. Die Tumorzellen können dann aus der Mi schung entfernt werden, wobei ein flacher Kobalt-Samarium-Magnet verwendet werden kann (36). Die Effektivität der Reinigungsprozedur kann durch Untersuchung der verblei benden klonogenen Tumorzellen oder Knochenmarksstammzellen in der Suspension durch Koloniebildungs-Assays bestimmt werden. Gegebenenfalls kann ein Wiederholungszyklus der immunomagnetischen Separation durchgeführt werden.

Koloniebildende Assays für Tumor- und Knochenmarksvorläufer-Zellen

Die Zahl der koloniebildenden Tumorzellen kann in einem Softagarassay untersucht werden (37, 38). Softagar-Kulturen werden dreifach in 10-ml-Röhrchen angesetzt, in die 0.2 ml August-Rattenblutzellen (1 : 8 verdünnt), 0.2 ml entsprechend verdünnter Testzellsus pension, und 0.6 ml 0.5%igem Agar (Difco Laboratories, Detroit, USA) gegeben werden. Die Röhrchen können bei 37°C in 5% O₂/5% CO₂/90% N₂ inkubiert werden. 21 Tage nach Inkubation werden Kolonien mit mehr als 50 Zellen unter Benutzung eines Zeiss Ste reomikroskops gezählt.

Die lebensfähigen klonogenen Vorläuferzellen können in einer modifizierten Version (36) der Methode von Burgess A.W. et al. (39) gemessen werden. Die Testzellpräparation wird in einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen pro ml, in McCay's 5A Medium suspendiert, das 0.3% Agar, 15% FCS, 20 ng/ml rekombinanten menschlichen GM-CSF, 100 Einhei ten/ml Penicillin und 100 Einheiten Streptomycin/ml Medium enthält. Die GM-CSF-Kon zentration, die verwendet wird, kann auf der Basis von Titrationsexperimenten bestimmt werden. Jeweils 3 1-ml-Aliquots werden in 35-mm-Zellkulturschalen bei 37°C und 5% CO₂ in Luft für 14 Tage inkubiert, und Kolonien mit mehr als 40 Zellen gezählt.

Literatur

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Claims

1. Verwendung eines für variantes CD44 spezifischen Antikörpermoleküls zur selektiven Entfernung von Tumorzellen aus einer Zellpräparation, die hämatopoetische Stamm- und/oder Vorläuferzellen enthält.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die hämatopoetischen Stamm- und/oder Vorläuferzellen CD34 auf ihrer Oberfläche exprimieren.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül spezifisch für ein Epitop ist, das durch das variante Exon v5 oder das variante Exon v6 des CD44 Gens kodiert wird.

4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment eines monoklonalen Antikörpers ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül der monoklonale Antikörper VFF-18 (DSM2174) oder ein Fragment dieses Antikör pers ist.

6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül durch rekombinante Expression hergestellt wurde.

7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül mit einem zytotoxischen Agens verknüpft ist.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das zytotoxische Agens ein Toxin ist.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Toxin das Pseudo monas-Exotoxin ist.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Toxin mit dem Antikörpermolekül kovalent verknüpft wird oder durch rekombinante Expression eines Antikörper-Toxin Fusionsproteins hergestellt wird.

11. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellpräparation aus Knochenmark, peripherem Blut, Nabelschnurblut oder Leukapheresematerial erhalten wird.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellpräparation eine Zellpräparation ist, in der CD34+-Zellen angereichert wurden.

13. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen auf einem festem Träger immobilisiert werden.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Träger magne tisch ist.

15. Verfahren zur Entfernung von Tumorzellen aus einer Zellpräparation, die hämatopoe tische Stamm- und/oder Vorläuferzellen enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellpräparation mit einem für variantes CD44 spezifischen Antikörpermolekül in Kon takt gebracht wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül mit einem zytotoxischen Agens verknüpft ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung der Tu morzellen ein fester Träger verwendet wird.

18. Zellpräparation erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15-17.

19. Verwendung einer Zellpräparation gemäß Anspruch 18 zur Transplantation.