KR20210004961A - 치료 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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아브마트 상하이 컴퍼니, 엘티디.
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Abstract

서열식별번호: 19 또는 43을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이로 이루어진 CD44v6 또는 v9 에피토프에 특이적인 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다. 또한, 항체-약물-접합체 (ADC), 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 다른 유도체, 그를 코딩하는 핵산 분자, 그의 제조 방법, 그를 포함하는 제약 조성물, 및 질환의 치료 또는 진단에서의 그의 용도가 제공된다.

Description

치료 항체 및 그의 용도
CD44는 동형 세포, 세포-매트릭스 및 세포-세포골격 상호작용에 관여하는 막횡단 당단백질의 패밀리이다. CD44의 세포외 도메인은 수많은 매트릭스 대체물: 히알루론산, 에즈린, 라딕신, 모에신 및 메를린, 헤파린-친화성 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, p185HER2, 표피 성장 인자 및 간세포 성장 인자에 결합한다. 그의 세포내 도메인은 세포골격 대체물인 안키린에 결합하여, 세포 및 조직 아키텍처 형태를 결정한다 (Bourguignon et al., 1998, Front. Biosci. 3:D637-649; Welch et al., 1995, J. Cell. Physiol. 164:605-612).
염색체 11에 맵핑되는 CD44 유전자는 60 kb에 걸친 20개의 엑손을 함유하고, 5개의 구조적 도메인으로 세분될 수 있다. 20개의 엑손 중 10개인 엑손 1-5 및 16-20은 CD44의 표준 형태 (CD44s 또는 CD44std)를 구성한다. 이러한 최소 CD44 이소형 (CD44s)은 상피 세포를 포함한 상이한 조직들에서 편재적으로 발현되지만, 특정 CD44 스플라이스 변이체 (CD44v, CD44var)는 상피 세포의 하위세트 상에서만 발현된다.
CD44 변이체는, 단백질의 세포외 부분 내의 10개의 엑손 (v1-v10)의 서열이 CD44s에서 완전히 절제되지만 상이한 조합으로 더 큰 변이체에서 나타날 수 있는 방식으로, 메신저 RNA (mRNA) 수준에서 선택적 스플라이싱에 의해 생성된다 (Screaton et al., 1992; Toelg et al., 1993; Hofmann et al., 1991). 변이체는 상이한 아미노산 서열이 단백질의 세포외 부분의 특정 부위에 삽입된다는 점에서 상이하다. 이론적으로, CD44 변이체 (CD44v) 이소형에 대해 1000개 초과의 잠재적 펩티드 도메인 조합이 존재한다. 모든 변이체 엑손을 포함한다면 분자량 230 kD의 단백질이 생성될 것이지만, 대부분의 변이체 이소형은 120 kD 미만이다. 보다 긴 변이체 이소형 (CD44v1-10)은 스플라이싱된 엑손 6-15 중 1개 이상을 포함하며, 인간에서는 엑손 6 (v1)이 발현되지 않는다.
일부 스플라이스 변이체는 조직-특이적 방식으로 정상 상피 세포에 의해 발현된다. 예를 들어, CD44v10은 정상 림프구에 의해 발현된다 (Okamoto et al., 1998, J. Natl. Cancer Inst. 90:307-315).
그러나, 최근에는, 특정 CD44 변이체의 발현이 비-전이성 래트 췌장 선암종 세포주뿐만 아니라 비-전이성 래트 섬유육종 세포주의 소위 자발적 전이 거동을 유발하는데 필요하고 충분하다는 것이 밝혀졌다 (Guenthert et al., 1991). 이러한 변이체는 다양한 인간 종양 세포뿐만 아니라 인간 종양 조직에서 검출될 수 있다.
예를 들어, 오카모토 등(Okamoto et al.)의 문헌 [Okamoto et al., 2002, Am. J. Pathol. 160:441-447; Okamoto et al., 2001, J. Cell. Biol. 155:755-762; Murakami et al., 2003, Oncogene 22:1511-1516]은 여러 인간 종양 (전립선암 제외)에서 25-30 kD의 절단 생성물이 CD44의 세포질 부분에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출가능하다는 것을 제시하였다. CD44의 가용성 부분은 혈청에서 분자의 세포외 부분에 대한 항-CD44v 모노클로날 항체를 사용하여 100-160-kD 단편으로서 검출되었다 (Gansauge et al., 1997, Cancer 80:1733-1739). 순환 내로 흘러나온 CD44 이소형의 웨스턴 블롯 검출은 악성종양에 대한 진단 또는 예후 시험으로서의 역할을 할 수 있다 (Taylor et al., 1996, J. Soc. Gynecol. Invest. 3:289-294). 이어서 효소-연결된 혈청 면역검정 (ELISA)이 단백질의 보다 용이한 고감도 검출을 위해 개발될 수 있다. CD44v6의 증폭은 전이성 표현형의 췌장암 (Rall and Rustgi, 1995, Cancer Res. 55:1831-1835) 및 증가하는 등급의 유방암 (Woodman et al., 1996, Am. J. Pathol. 149:1519-1530; Bourguignon et al., 1999, Cell Motil. Cytoskeleton 43:269-287)에서 주목된다. 단일 또는 인접 변이체 엑손의 포함은 많은 양성 및 암 조직에서의 RT-PCR 및 서열분석에 의해 설명되었다 (Okamoto et al., 1998, J. Natl. Cancer Inst. 90:307-315; Okamoto et al., 2002, Am. J. Pathol. 160:441-447; Rall and Rustgi, 1995, Cancer Res. 55:1831-1835; Woodman, et al., 1996, Am. J. Pathol. 149:1519-1530; Bourguignon et al., 1999, Cell Motil. Cytoskeleton 43:269-287; Roca et al., 1998, Am. J. Pathol. 153:183-190; Franzmann et al., 2001, Otolaryngol. Head Neck Surg. 124:426-432; Terpe et al., 1996, Am. J. Pathol. 148:453-463; Christ et al., 2001, J. Leukoc. Biol. 69:343-352; Mortegani et al., 1999, Am. J. Pathol. 154:291-300; Miyake et al., 1998, Int. J. Cancer. 18:560-564; Yamaguchi et al., 1996, J. Clin. Oncol. 14:1122-1127).
전이 동안, 종양 세포는 원발성 부위로부터 탈착되고, 세포외 매트릭스 내로 이동하고, 혈액 및 림프관을 침습한다. 전이성 부위에서의 종양 생장은 CD44와 같은 부착 단백질을 통한 새로운 세포외 매트릭스에 대한 부착을 필요로 한다. 이는 많은 암이 탈조절된 CD44 mRNA 스플라이싱을 가져, 전이에 있어서 소정 역할을 할 수 있는 신규 CD44 변이체 이소형의 발현을 유도한다는 사실과 일치한다.
실제로, 결장직장 발암 과정에서의 CD44 변이체의 발현이 최근에 연구되었다 (Heider et al., 1993a). CD44 변이체의 발현은 정상 인간 결장 상피에는 부재하고, 약한 발현만이 음와의 증식 세포에서 검출가능하다. 종양 진행의 후기 단계에서, 예를 들어 선암종에서, 모든 악성종양은 CD44의 변이체를 발현한다. 또한, 변이체 CD44의 높은 수준의 조직 발현이 공격성 비-호지킨 림프종에서 나타났다 (Koopman et al., 1993).
엑손 v6은 특히 전이성 확산 과정에서 특별한 역할을 하는 것으로 보인다 (Rudy et al., 1993). 동물 모델에서, v6 특이적 에피토프에 대한 항체는 전이성 세포의 침강 및 전이의 성장을 방지할 수 있다 (Seiter et al., 1993). 결장 암종에서, v6 발현은 종양 진행과 상관관계가 있다 (Wielenga et al., 1993). 위 암종에서, v6 발현은 장 유형의 종양을 미만성 유형의 종양과 구별하는 중요한 진단 마커이다 (Heider et al., 1993b). 후자의 두 간행물에서, v6 특이적 에피토프에 대한 항체를 사용하여 v6 발현이 결정되었다.
CD44v6이 인간 종양 및 정상 조직에서 유리한 발현 패턴을 갖는 종양-연관 항원인 것으로 밝혀졌기 때문에 (Heider et al., 1995; Heider et al., 1996), 이는 항체-기반 진단 및 치료 접근법에 적용되어 왔다 (Heider et al., 1996; WO 95/33771; WO 97/21104).
다른 한편으로, CD44v9의 비정상적 발현은 위암, 결장암, 유방암, 폐암 및 두경부 편평 세포 암종과 연관되었다 (US20170137810A1). CD44v6 및 CD44v9는 둘 다 결장암에서 과다발현되는 것으로 이전에 입증되었다 (Wielenga et al., Am. J. Pathol., 1999, 154: 515-523). CD44v9는 또한 위암에서 과다발현되는 것으로 밝혀졌다 (Ue et al., Co-expression of osteopontin and CD44v9 in gastric cancer. Int J Cancer 1998; 79:127-132).
CD44v9 양성 세포는 종양의 후속 치료 내성, 재발 및 전이를 초래하는 ROS의 생산을 억제하는 증진된 능력을 입증한다 (Ishimoto et al., 2011; Tsugawaet al., 2012; Yae et al., 2012). 또한 CD44v9는 다양한 종양 유형에서 암 줄기 세포 마커인 것으로 보고되었다 (Aso et al., 2015).
인간에의 적용을 위해 비-인간 항체를 사용하는 경우에 발생하는 한 가지 심각한 문제는 이들이 환자에서 항체의 효능을 감소시키고 계속적인 투여를 손상시키는 인간 항-비-인간 반응을 급속하게 상승시킨다는 것이다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 비-인간 항체를 "인간화"하는 개념이 관련 기술분야에서 개발되었다. 제1 접근법에서, 비-인간 가변 영역이 인간 불변 영역에 연결되는 비-인간/인간 키메라 항체를 구축함으로써 비-인간 항체의 인간화를 달성하도록 시도되었다 (Boulianne G. L., Hozumi N. and Shulman, M. J. (1984) Production of functional chimeric mouse/human antibody Nature 312: 643). 이렇게 생성된 키메라 항체는 원래의 비-인간 항체의 결합 특이성 및 친화도를 보유한다.
그러나, 키메라 항체는, 마우스 항체보다 훨씬 더 우수하긴 하지만, 인간에서 항-키메라 반응을 여전히 도출할 수 있다 (LoBuglio A. F., Wheeler R. H., Trang J., Haynes A., Rogers K., Harvey E. B., Sun L., Ghrayeb J. and Khazaeli M. B. (1989) Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man: Kinetics and immune response. Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 4220). 이러한 접근법은 추후에, 비-인간 가변 영역으로부터의 상보성 결정 영역 (CDR)을 인간 가변 영역에 그라프팅함으로써 비-인간 서열의 양을 추가로 감소시키고, 이어서 이들 "재성형된 인간" 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킴으로써 정밀화되었다 (Riechmann L., Clark M., Waldmann H. and Winter G. (1988) Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332: 323). CDR-그라프팅된 또는 재성형된 인간 항체는 마우스 항체로부터 유래된 것으로 확인될 수 있는 단백질 서열을 거의 또는 전혀 함유하지 않는다. CDR-그라프팅에 의해 인간화된 항체가 심지어 천연 인간 항체에서 보여지는 바와 같은 일부 면역 반응, 예컨대 항-동종이형 또는 항-이디오타입 반응을 여전히 도출할 수도 있지만, CDR-그라프팅된 항체는 마우스 항체보다 훨씬 덜 면역원성이어서 보다 장기간의 환자 치료를 가능하게 할 것이다.
그러나, 곧 CDR-그라프팅 단독으로 충분한 결합 친화도를 갖는 항체를 항상 생성하지는 않는 것으로 밝혀졌다. CDR-그라프팅된 항체는 때때로 그의 모 비-인간 항체와 비교하여 상대적으로 불량한 결합 특징을 갖는데, 이는 예를 들어 CDR 내의 아미노산보다 더 많은 아미노산이 항원 결합에 관여할 수 있기 때문이다. 그 결과, 불량한 결합 친화도를 갖는 CDR-그라프팅된 항체는 요법에 유용한 것으로 간주되지 않는다. 따라서, CDR-그라프팅된 항체의 낮은 면역원성을 비-인간 모 항체에 우수한 결합 특징과 조합하는 항체를 생성하기 위한 시도가 이루어져 왔다. CDR-그라프팅 이외에, 인간화 프레임워크 영역 내의 1개 내지 여러개의 아미노산이 결합 친화도를 보유하기 위해 설치류 공여자 기원의 잔기로서 보유되어야 한다는 개념이 개발되었다 (Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 10029-10033).
이러한 항체가 진단 및 요법에서 가질 수 있는 높은 잠재적 유용성 때문에, 인간 질환, 예컨대 다양한 암의 치료에 적합한 개선된 특성을 갖는 항체가 필요하다.
본 발명의 기저를 이루는 한 가지 문제는, 바람직하게는 공지된 CD44v6 또는 CD44v9 특이적 항체와 비교하여 더 우수한 특성을 갖는 대안적인 CD44v6 또는 CD44v9 특이적 항체를 제공하는 것이었다.
본 발명의 한 측면은 단리된 CD44v6 에피토프에 특이적인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 CD44v6 에피토프는 서열식별번호(SEQ ID NO): 19를 포함하거나 / 이로 본질적으로 이루어지거나 (예를 들어, 에피토프는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐), 또는 서열식별번호: 19로 이루어지고; 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 단리된 CD44v6 에피토프에 대해 생성되거나, 또는 상기 단리된 CD44v6 에피토프 및 담체 단백질 (예컨대 알부민, 바람직하게는 BSA 또는 오브알부민, 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))을 포함하는 융합 단백질 또는 그의 화학적 접합체에 대해 생성된다.
특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 (1) 서열식별번호: 1의 중쇄 가변 영역 (HCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 2의 HCVR CDR2 서열 및 서열식별번호: 3의 HCVR CDR3 서열을 포함하는 HCVR; (2) 서열식별번호: 10의 경쇄 가변 영역 (LCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 11의 LCVR CDR2 서열 및 서열식별번호: 12의 LCVR CDR3 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD44v6 에피토프는 서열식별번호: 19이다.
특정 실시양태에서, CD44v6 에피토프는 서열식별번호: 19로 본질적으로 이루어진다 (예를 들어, 에피토프는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐).
특정 실시양태에서, CD44v6 에피토프는 서열식별번호: 24 (HEGYRQTPKEDS)이다.
특정 실시양태에서, (i) HCVR은 서열식별번호: 7-9 중 1개 이상을 추가로 포함하고/거나, (ii) LCVR은 서열식별번호: 13-18 중 1개 이상을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 CD44v6 에피토프 또는 상기 CD44v6 에피토프를 갖는 세포에 약 10 nM, 약 5 nM 또는 약 2 nM 또는 그 미만의 KD로 결합한다.
특정 실시양태에서, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간-마우스 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, CDR-그라프팅된 항체 또는 재표면화 항체이다.
특정 실시양태에서, 그의 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv 또는 scFv, 디술피드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGΔCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc이다.
관련 측면에서, 본 발명은 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 참조 모노클로날 항체에 의해 결합되는 CD44v6의 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 CD44v6의 동일한 에피토프에의 결합에 대해 상기 참조 모노클로날 항체와 경쟁하고, 여기서 상기 참조 모노클로날 항체는 (1) 서열식별번호: 1의 중쇄 가변 영역 (HCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 2의 HCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 3의 HCVR CDR3 서열을 포함하는 HCVR; (2) 서열식별번호: 10의 경쇄 가변 영역 (LCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 11의 LCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 12의 LCVR CDR3 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 단리된 CD44v9 에피토프에 특이적인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 CD44v9 에피토프는 서열식별번호: 43을 포함하거나 / 이로 본질적으로 이루어지거나 (예를 들어, 에피토프는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 43의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐), 또는 서열식별번호: 43으로 이루어지고; 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 단리된 CD44v9 에피토프에 대해 생성되거나, 또는 상기 단리된 CD44v9 에피토프 및 담체 단백질 (예컨대 알부민, 바람직하게는 BSA 또는 오브알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))을 포함하는 융합 단백질 또는 그의 화학적 접합체에 대해 생성된다.
특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 (1) 서열식별번호: 25의 중쇄 가변 영역 (HCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 26의 HCVR CDR2 서열 및 서열식별번호: 27의 HCVR CDR3 서열을 포함하는 HCVR; (2) 서열식별번호: 34의 경쇄 가변 영역 (LCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 35의 LCVR CDR2 서열 및 서열식별번호: 36의 LCVR CDR3 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD44v9 에피토프는 서열식별번호: 43이다.
특정 실시양태에서, CD44v9 에피토프는 서열식별번호: 43으로 본질적으로 이루어진다 (예를 들어, 에피토프는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐).
특정 실시양태에서, CD44v9 에피토프는 서열식별번호: 44 (SHEGLEEDKDH)이다.
특정 실시양태에서, (i) HCVR은 서열식별번호: 28-33 중 1개 이상을 추가로 포함하고/거나, (ii) LCVR은 서열식별번호: 37-42 중 1개 이상을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 CD44v9 에피토프 또는 상기 CD44v9 에피토프를 갖는 세포에 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM 또는 그 미만의 KD로 결합한다.
특정 실시양태에서, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간-마우스 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, CDR-그라프팅된 항체 또는 재표면화 항체이다.
특정 실시양태에서, 그의 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv 또는 scFv, 디술피드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGΔCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc이다.
관련 측면에서, 본 발명은 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 참조 모노클로날 항체에 의해 결합되는 CD44v9의 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 CD44v9의 동일한 에피토프에의 결합에 대해 상기 참조 모노클로날 항체와 경쟁하고, 여기서 상기 참조 모노클로날 항체는 (1) 서열식별번호: 25의 중쇄 가변 영역 (HCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 26의 HCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 27의 HCVR CDR3 서열을 포함하는 HCVR; (2) 서열식별번호: 34의 경쇄 가변 영역 (LCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 35의 LCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 36의 LCVR CDR3 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나의 HCVR 및/또는 LCVR을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 융합 단백질 (예컨대 키메라 항원 T 세포 수용체)이다.
본 발명의 또 다른 측면은 임의의 대상 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 임의의 대상 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
특정 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터 (예를 들어, 포유동물 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 곤충 발현 벡터 또는 박테리아 발현 벡터)이다.
본 발명의 또 다른 측면은 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 임의의 대상 폴리펩티드, 임의의 대상 폴리뉴클레오티드 또는 임의의 대상 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
특정 실시양태에서, 세포는 임의의 대상 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 임의의 대상 폴리펩티드를 발현한다.
특정 실시양태에서, 세포는 BHK 세포, CHO 세포 또는 COS 세포이다.
특정 실시양태에서, 세포는 세포의 표면 상에 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 임의의 대상 폴리펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 세포는 임의의 대상 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 임의의 대상 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 보유하는 T-세포 (CAR-T 세포)이다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열식별번호: 19를 포함하거나 / 이로 본질적으로 이루어지거나 (예를 들어, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어진 에피토프), 또는 서열식별번호: 19로 이루어진 단리된 CD44v6 에피토프를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 제28항의 단리된 CD44v6 에피토프 및 담체 단백질 (예컨대 알부민, 바람직하게는 BSA 또는 오브알부민, 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))을 포함하는 융합 단백질 또는 화학적 접합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열식별번호: 43을 포함하거나 / 이로 본질적으로 이루어지거나 (예를 들어, 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어진 에피토프), 또는 서열식별번호: 43으로 이루어진 단리된 CD44v9 에피토프를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 제28a항의 단리된 CD44v9 에피토프 및 담체 단백질 (예컨대 알부민, 바람직하게는 BSA 또는 오브알부민, 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))을 포함하는 융합 단백질 또는 화학적 접합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 임의의 대상 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포로부터 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 임의의 대상 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는, 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 임의의 대상 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 화학식을 갖는 면역접합체 (또는 항체-약물 접합체 또는 ADC)이며: Ab-[-L-D]n, 여기서 Ab는 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 임의의 대상 폴리펩티드이고, 이는 링커-약물 모이어티 -[-L-D]의 1개 이상의 단위에 공유 연결되고, 여기서 L은 링커이고, D는 세포독성 약물이고; n은 1 내지 20 (예를 들어, 1-12)의 정수이고; 여기서 각각의 링커-약물 모이어티는 동일하거나 상이한 링커 L 또는 세포독성 약물 D를 가질 수 있는 것인 면역접합체를 제공한다.
특정 실시양태에서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]는 Lys의 측쇄 아미노기를 통해 Ab에 공유 연결된다.
특정 실시양태에서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]는 Cys의 측쇄 티올 기를 통해 Ab에 공유 연결된다.
특정 실시양태에서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]는 부위-특이적으로 혼입된 비-천연 아미노산을 통해 Ab에 공유 연결된다.
특정 실시양태에서, 각각의 링커 L은 펩티드 단위를 포함한다.
특정 실시양태에서, 펩티드 단위는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 2-10 또는 2-5개의 아미노산 잔기를 포함한다.
특정 실시양태에서, 링커 L은 프로테아제 (예를 들어, 카텝신)에 의해 절단가능하지 않다.
특정 실시양태에서, 링커 L은 프로테아제 (예를 들어, 카텝신), 산성 환경 또는 산화환원 상태 변화에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커이다.
특정 실시양태에서, 세포독성 약물은 DNA 삽입제, 미세관 결합제, 토포이소머라제 I 억제제 또는 DNA 작은 홈 결합제이다.
특정 실시양태에서, 세포독성 약물은 아우리스타틴 부류, 예컨대 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 MMAF, 메이탄신 부류, 예컨대 DM-1, DM-3, DM-4, 칼리케아미신, 예컨대 오조가미신, SN-38 또는 PBD (피롤로벤조디아제핀)이다.
본 발명의 또 다른 측면은 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 폴리펩티드 또는 그의 면역접합체 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 CD44v6을 발현하는 세포를 임의의 대상 항-CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 대상 폴리펩티드 또는 그의 대상 면역접합체 또는 그의 대상 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, CD44v6을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다.
특정 실시양태에서, 종양 세포는 폐암 (예컨대 NSCLC)으로부터의 것이다.
특정 실시양태에서, 종양 세포는 결장직장암, 유방암, 두경부암, 난소암, 방광암, 췌장암 또는 뇌의 전이성 암으로부터의 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 CD44v9를 발현하는 세포를 임의의 대상 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 폴리펩티드 또는 그의 면역접합체 또는 그의 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, CD44v9를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다.
특정 실시양태에서, 종양 세포는 폐암 (예컨대 NSCLC)으로부터의 것이다.
특정 실시양태에서, 종양 세포는 결장직장암, 유방암, 간암, 두경부암, 난소암, 방광암, 췌장암 또는 뇌의 전이성 암으로부터의 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포가 CD44v6을 발현하는 암을 갖는 대상체에게 CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v6의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v6의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 세포가 CD44v6을 발현하는 세포-증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, CD44v6의 길항제는 임의의 대상 항-CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 대상 폴리펩티드 또는 그의 대상 면역접합체 또는 그의 대상 제약 조성물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암은 유방, 폐, 간, 결장직장, 두경부, 식도, 췌장, 난소, 방광, 위, 피부, 자궁내막, 난소, 고환, 식도, 전립선 또는 신장 기원을 포함한 상피 암종; 골 및 연부-조직 육종, 예컨대 골육종, 연골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종 (MFH), 평활근육종; 조혈 악성종양, 예컨대 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 백혈병; 신경외배엽 종양, 예컨대 말초 신경 종양, 성상세포종 또는 흑색종; 또는 중피종이다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포가 CD44v9를 발현하는 암을 갖는 대상체에게 CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v9의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v9의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 세포가 CD44v9를 발현하는 세포-증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, CD44v9의 길항제는 임의의 대상 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 폴리펩티드 또는 그의 면역접합체 또는 그의 제약 조성물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암은 유방, 폐, 간, 결장직장, 두경부, 식도, 췌장, 난소, 방광, 위, 피부, 자궁내막, 난소, 고환, 식도, 전립선 또는 신장 기원을 포함한 상피 암종; 골 및 연부-조직 육종, 예컨대 골육종, 연골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종 (MFH), 평활근육종; 조혈 악성종양, 예컨대 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 백혈병; 신경외배엽 종양, 예컨대 말초 신경 종양, 성상세포종 또는 흑색종; 또는 중피종이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체로부터의 샘플을 임의의 대상 항-CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, 대상체로부터의 샘플에서 CD44v6의 존재 및/또는 존재비를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체로부터의 샘플을 임의의 대상 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, 대상체로부터의 샘플에서 CD44v9의 존재 및/또는 존재비를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 (1) 대상체로부터의 암 샘플에서 CD44v6의 존재 및/또는 존재비를 결정하는 대상 방법을 사용하여 암 샘플에서 CD44v6을 발현하는 대상체를 확인하는 단계, (2) 상기 대상체에게 치료 유효량의 임의의 대상 항-CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 폴리펩티드 또는 그의 면역접합체 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 이에 의해 세포가 CD44v6을 발현하는 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 것인, 상기 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 (1) 대상체로부터의 암 샘플에서 CD44v9의 존재 및/또는 존재비를 결정하는 대상 방법을 사용하여 암 샘플에서 CD44v9를 발현하는 대상체를 확인하는 단계, (2) 상기 대상체에게 치료 유효량의 임의의 대상 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 폴리펩티드 또는 그의 면역접합체 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 이에 의해 세포가 CD44v9를 발현하는 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 것인, 상기 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 방법을 제공한다.
실시예에만 기재된 것 및 본 발명의 한 측면 하에만 기재된 것을 포함한 본원에 기재된 임의의 실시양태는 명백하게 배제되거나 부적절하지 않은 한 1개 이상의 다른 실시양태와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
도 1a는 CD44v6 또는 CD44v9 모노클로날 항체 mAb119 또는 mAb116을 단리하기 위한 살아있는 세포 Mab어레이(MabArray)의 개략도이다. 구체적으로, 약 6 x 104개의 상이한 모노클로날 항체 (mAb)를 어레이젯(Arrayjet) 프린터를 사용하여 4개의 유리 알데히드 칩 (75x25mm) 상에 인쇄하여 Mab어레이를 생성하였다. 이어서 Mab어레이 칩을 10% BSA로 밤새 차단한 후에 실험을 수행하였다. 폐암 세포주 PC9 세포를 녹색 형광 핵산 염색제 SYTO14 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))로 표지하고, 1시간 동안 PBS 중 1 x 107개 세포/mL의 밀도로 칩과 함께 인큐베이션하였다. 이어서 Mab어레이 칩을 PBS로 부드럽게 세척하고, 진픽스(Genepix) 스캐너로 스캐닝하였다.
도 1b는 4개의 독립적인 PC9 살아있는 세포 Mab어레이 실험에서의 mAb119 및 대조군 mAb의 영상을 보여준다. 살아있는 PC9 세포를 Mab어레이 칩 상에서 mAb119에 의해 포획하였다.
도 2는 PC9 세포에 대한 mAb119의 FACS 분석의 결과를 보여준다. PC9 세포를 얼음 상에서 30분 동안 mAb119의 연속 희석물 (30000 pM 내지 0.1 pM, 3배 연속 희석물)과 함께 인큐베이션함으로써 mAb119의 PC9 FACS 적정을 수행한 후에, 세포를 30분 동안 알렉사488-접합된 항-마우스 IgG (잭슨 랩(Jackson lab))로 염색하였다. BD C6을 사용하여 MFI를 분석하였다. 친화도 KD는 약 2 nM인 것으로 결정되었다.
도 3은 PC9 세포가 결합된 mAb119를 내재화하였다는 것을 보여준다. 살아있는 PC 세포를 커버슬립 상에서 배양하고, 얼음 상에서 1시간 동안 10 μg/mL mAb119와 함께 인큐베이션한 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서 세포를 37℃에서 0시간, 2시간 또는 4시간 동안 배양한 후에, 4% PFA로 고정한 후에, FACS에 의해 FITC 접합된 2차 항체로 검출하였다. 이어서 PC9 세포를 mAb119 (녹색 형광 염료 알렉사488에 의해 표지됨) 및 항-LAMP1 (적색 형광 염료 알렉사595에 의해 표지됨)에 의해 공동-염색하였다. 구체적으로, PC9 세포를 0.1% 트리톤 X로 투과시키고, mAb119 및 토끼 항-LAMP1 항체 (1:200, 압캠(Abcam)) 및 mAb119와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 항체를 각각 알렉사488 접합된 항-마우스 항체 및 알렉사595 접합된 항-토끼 항체로 표지하였다. 리소솜-회합 막 단백질 1 (LAMP1)은 주로 리소솜 막을 가로질러 발현되는 당단백질이다. mAb119 및 항-LAMP1의 공동국재화 신호는 황색 신호를 생성하며, 이는 PC9 세포에 의한 mAb119의 리소솜 구획으로의 내재화를 나타낸다. mAb119는 0시간에 LAMP1과의 임의의 공동-국재화 없이 세포 표면 상에서 처음 관찰되었다. mAb119 및 LAMP1의 공동국재화는 2시간 및 4시간에 관찰되었다.
표면 형광에 기초한 FACS 분석은 PC9 세포 상에서의 mAb119 내재화를 보여준다 (데이터는 제시되지 않음). 구체적으로, 살아있는 PC9 세포를 얼음 상에서 0.5시간 동안 10 μg/mL mAb119와 함께 인큐베이션한 후에, PBS로 3회 세척하였다. 이어서 세포를 37℃에서 0시간, 2시간 또는 4시간 동안 배양한 후에, 4% PFA로 고정시켰다. 이어서 세포를 알렉사488 접합된 항-마우스 항체로 염색하고, 표면 MFI를 계산함으로써 FACS로 분석하였다. mAb119의 표면 국재화를 나타내는 표면 MFI는 37℃에서 2시간 및 4시간 인큐베이션한 후에 각각 70% 및 80%만큼 감소하였다. PC9 세포에서의 평균 퍼센트 내재화 ± SEM (n = 3)으로서 표현된 FACS 데이터의 정량화가 제시된다. 수직축은 상대 표면 형광 (%)을 나타낸다. 데이터는 mAb119가 막 항원에 결합할 수 있고 PC9 세포에 내재화될 수 있다는 것을 제시한다.
도 4는 mAb119의 간접적 세포독성이 항원 발현-의존성이라는 것을 보여준다. PC9 또는 TE1 세포를 96-웰 플레이트에서 2000개 세포 / 웰의 전면생장률로 밤새 배양하였다. 72시간 동안 2 μg/mL MMAE-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체와 함께 mAb119의 연속 희석물로 세포를 처리하였다. 이어서 CCK8 (도진도(dojindo))에 의해 세포 수를 계산하였다. TE1 및 PC9 세포에서 상이한 세포독성이 관찰되었다. 항체 칵테일은 PC9 성장을 18 pM의 IC50으로 억제한 반면, 동일한 항체 칵테일은 TE1 세포 성장을 억제하지 않았다. 평균 퍼센트 성장 억제 ± SEM (n = 3)으로서 표현된, TE1 및 PC9 세포로부터 유도된 대표적인 데이터가 제시된다.
2종의 세포주에서의 mAb119 항원의 발현을 또한 FACS에 의해 결정하였다. 측면 삽입 패널은 mAb119에 의해 표지된 TE1 (상부 패널) 및 PC9 (하부 패널)의 FACS 분석을 보여준다. 결과는 PC9 세포가 mAb119 항원을 발현하지만 TE1 세포는 그렇지 않다는 것을 시사한다. 따라서 간접적 세포독성은 항원 발현과 양의 상관관계가 있었다.
도 5a 및 5b는 mAb119가 인간 CD44 v6 엑손을 표적화한다는 것을 보여준다. 48시간 동안 인간 CD44 v6 에피토프를 표적화하는 4종의 상이한 siRNA의 혼합물 또는 대조군 siRNA로 PC9를 형질감염시켰다. 이어서 형질감염된 세포를 mAb119로 염색하고 FACS에 의해 분석하거나, 또는 총 단백질을 추출하고 mAb119 항원의 존재비를 웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다. CD44v6의 녹다운은 FACS에서 mAb119 표면 염색 강도를 감소시켰다 (도 5a, CD44v6 siRNA (V6.si)가 mAb119의 표면 신호를 억제한다는 것을 보여주는 FACS 데이터 (n=3을 나타냄)). CD44v6의 녹다운은 또한 mAb119 항원의 단백질 발현 수준을 감소시켰다 (도 5b, CD44v6 siRNA (V6.si)가 mAb119 항원의 단백질 발현을 억제한다는 것을 보여주는 웨스턴 블롯팅 데이터 (n=3을 나타냄)). 데이터는 mAb119가 CD44v6을 표적화한다는 것을 시사한다.
도 6a는 mAb119-ADC (AMT119)의 구조의 개략도이다. mAb119를 MC-vc-PAB-MMAE와 접합시켰다.
도 6b는 AMT119의 HPLC-HIC (소수성 상호작용 크로마토그래피)의 그래프이다. 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 6이었다.
도 7은 PC9 및 TE1 세포에서의 AMT119의 세포독성을 보여준다. 그래프는 AMT119의 평균 퍼센트 성장 억제 ± SEM (n = 3)을 나타내는, PC9 및 TE1 세포로부터 유도된 대표적인 데이터이다. IC50 값은 PC9 및 TE1 세포에서 각각 2,600 pM 및 39,000 pM이었다. 차이는 2종의 세포주에서의 CD44v6의 상이한 발현 수준과 일치하였다 (도 4 참조).
도 8a 및 8b는 인간 비소세포 폐암 (NSCLC, 도 8a의 우측 패널) 및 정상 폐 조직 (도 8a의 좌측 패널)에서의 CD44v6의 발현을 보여준다. mAb119 항체를 사용하는 CD44v6 단백질의 IHC (면역조직화학) 검출이 일련의 정상 및 암 조직으로부터 제시되어 있으며, 이는 CD44v6이 종양-특이적 방식으로 상향조절되었음을 보여준다. 현미경사진 영상은 0, 1+, 2+ 및 3+ 염색 강도를 나타내는 종양 조직을 도시한다 (도 8a의 우측 패널). 도 8b는 NSCLC의 상이한 하위유형에서의 CD44v6의 유병률을 보여준다. SCC, 편평 세포 암종; LCC, 대세포 암종.
도 9는 PC9 세포에 대한 mAb116의 FACS 분석의 결과를 보여준다. PC9 세포를 얼음 상에서 30분 동안 mAb116의 연속 희석물 (30000 pM 내지 0.1 pM, 3배 연속 희석물)과 함께 인큐베이션함으로써 mAb116의 PC9 FACS 적정을 수행한 후에, 세포를 30분 동안 알렉사488-접합된 항-마우스 IgG (잭슨 랩)로 염색하였다. BD C6을 사용하여 MFI를 분석하였다. 친화도 KD는 약 980 pM (또는 0.98 nM)인 것으로 결정되었다.
도 10은 PC9 세포가 결합된 mAb116을 내재화하였다는 것을 보여준다. 살아있는 PC 세포를 커버슬립 상에서 배양하고, 얼음 상에서 1시간 동안 10 μg/mL mAb116과 함께 인큐베이션한 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서 세포를 37℃에서 0시간, 2시간 또는 4시간 동안 배양한 후에, 4% PFA로 고정한 후에, FACS에 의해 FITC 접합된 2차 항체로 검출하였다. 이어서 PC9 세포를 mAb116 (녹색 형광 염료 알렉사488에 의해 표지됨) 및 항-LAMP1 (적색 형광 염료 알렉사595에 의해 표지됨)에 의해 공동-염색하였다. 구체적으로, PC9 세포를 0.1% 트리톤 X로 투과시키고, mAb116 및 토끼 항-LAMP1 항체 (1:200, 압캠) 및 mAb116과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 항체를 각각 알렉사488 접합된 항-마우스 항체 및 알렉사595 접합된 항-토끼 항체로 표지하였다. mAb116 및 항-LAMP1의 공동국재화 신호는 황색 신호를 생성하며, 이는 PC9 세포에 의한 mAb116의 리소솜 구획으로의 내재화를 나타낸다. mAb116은 0시간에 LAMP1과의 임의의 공동-국재화 없이 세포 표면 상에서 처음 관찰되었다. mAb116 및 LAMP1의 공동국재화는 2시간 및 4시간에 관찰되었다.
표면 형광에 기초한 FACS 분석은 PC9 세포 상에서의 mAb116 내재화를 보여준다 (데이터는 제시되지 않음). 구체적으로, 살아있는 PC9 세포를 얼음 상에서 0.5시간 동안 10 μg/mL mAb116과 함께 인큐베이션한 후에, PBS로 3회 세척하였다. 이어서 세포를 37℃에서 0시간, 2시간 또는 4시간 동안 배양한 후에, 4% PFA로 고정시켰다. 이어서 세포를 알렉사488 접합된 항-마우스 항체로 염색하고, 표면 MFI를 계산함으로써 FACS로 분석하였다. mAb116의 표면 국재화를 나타내는 표면 MFI는 37℃에서 4시간 인큐베이션시 약 90%만큼 감소하였다. PC9 세포에서의 평균 퍼센트 내재화 ± SEM (n = 3)으로서 표현된 FACS 데이터의 정량화가 제시된다. 수직축은 상대 표면 형광 (MFI, %)을 나타낸다. 데이터는 mAb116이 막 항원에 결합할 수 있고 PC9 세포에 내재화될 수 있다는 것을 보여준다.
도 11은 mAb116 및 대조군 IgG의 간접적 세포독성을 보여준다. PC9 세포를 96-웰 플레이트에서 2000개 세포 / 웰의 전면생장률로 밤새 배양하였다. 이어서 72시간 동안 2 μg/mL MMAE-접합된 염소 항 마우스 IgG 항체와 함께 IgG 또는 mAb116의 연속 희석물로 세포를 처리하였다. 이어서 CCK8 (도진도)에 의해 세포 수를 계산하였다. mAb116 항체 칵테일은 PC9 성장을 약 30 pM의 IC50으로 억제하였지만, IgG 칵테일은 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 평균 퍼센트 성장 억제 ± SEM (n = 3)으로서 표현된, PC9 세포로부터 유도된 대표적인 데이터가 제시된다.
도 12a 및 12b는 mAb116이 인간 CD44 v9 엑손을 표적화한다는 것을 보여준다. 48시간 동안 인간 CD44 V9 에피토프를 표적화하는 siRNA 또는 대조군 siRNA로 PC9를 형질감염시켰다. 이어서 형질감염된 세포를 mAb116으로 염색하고 FACS에 의해 분석하거나, 또는 총 단백질을 추출하고 mAb116 항원의 존재비를 웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다. CD44v9의 녹다운은 FACS에서 mAb116 표면 염색 강도를 감소시켰다 (도 12a, CD44v9 siRNA (V9.si)가 mAb116의 표면 신호를 억제한다는 것을 보여주는 FACS 데이터 (n=3을 나타냄)). CD44v9의 녹다운은 또한 mAb116 항원의 단백질 발현 수준을 감소시켰다 (도 12b). 데이터는 mAb116이 CD44v9를 표적화한다는 것을 시사한다.
도 13a는 mAb116-ADC (AMT116)의 구조의 개략도이다. mAb116을 MC-vc-PAB-MMAE와 접합시켰다.
도 13b는 AMT116의 HPLC-HIC의 그래프이다. 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 4.23이었다.
도 14는 PC9 및 KYSE-150 (식도 암종 세포주) 세포에서의 AMT116의 세포독성을 보여준다. 그래프는 AMT116 및 IgG 대조군의 평균 퍼센트 성장 억제 ± SEM (n = 3)을 나타내는, PC9 및 KYSE-150 세포로부터 유도된 대표적인 데이터이다. AMT116의 IC50 값은 PC9 및 KYSE-150 세포에서 각각 134 pM 및 670.2 pM이었다.
도 15는 AMT116의 생체내 효능을 보여준다. 약 5 x 106개 KYSE-150 세포를 1:1 마트리겔에 현탁시킨 후에, 암컷 Balb/c 누드 마우스 (8-10주령, 20-22 g)의 우측 측복부에 주사하였다. 종양 부피 (0.5 x 길이 x 폭2으로 측정됨) 및 체중을 적어도 매주 2회 결정하였다. 마우스를 투여 전 그의 초기 종양 크기 (중앙 종양 부피 대략 250-500 mm3)에 기초하여 무작위로 그룹핑하였다 (n=5/군). 비히클 (PBS), AMT116 또는 대조군 ADC를 i.v. 주입에 의해 투여하였다 (3 mg/kg, q3d x3). 군 평균 (±SEM) 종양 부피를 연구 지속기간에 걸쳐 플롯팅하였다.
도 16a 및 16b는 인간 비소세포 폐암 (도 16a의 우측 패널) 및 정상 폐 조직 (도 16a의 좌측 패널)에서의 CD44v9의 발현을 보여준다. mAb116 항체를 사용하는 CD44v9 단백질의 IHC 검출이 일련의 정상 및 암 조직으로부터 제시되어 있으며, 이는 CD44v9가 종양-특이적 방식으로 상향조절되었음을 보여준다. 현미경사진 영상은 0, 1+, 2+ 및 3+ 염색 강도를 나타내는 종양 조직을 도시한다 (도 16a의 우측 패널). 도 16b는 NSCLC의 상이한 하위유형에서의 CD44v9의 유병률을 보여준다. SCC, 편평 세포 암종; LCC, 대세포 암종.
도 17은 다수의 종양 유형에서의 CD44v9의 과다발현을 보여준다. mAb116 항체를 사용하는 CD44v9 단백질의 IHC 검출이 일련의 정상 및 암 조직으로부터 제시되어 있으며, 이는 CD44v9가 종양-특이적 방식으로 상향조절되었음을 보여준다.
1. 개관
본원에 기재된 본 발명은 특정 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체, 예컨대 본원에 기재된 것이 암과 같은 질환을 치료하는데 효과적이라는 발견에 부분적으로 기초한다.
따라서 본 발명의 한 측면은 단리된 CD44v6 에피토프에 특이적인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 CD44v6 에피토프는 (1) 서열식별번호: 19를 포함하거나 / 이로 본질적으로 이루어지거나 (예를 들어, 에피토프는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐), 또는 (2) 서열식별번호: 19로 이루어진다.
예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라, 단리된 CD44v6 에피토프에 대해 생성되거나, 또는 상기 단리된 CD44v6 에피토프 및 담체 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 그의 화학적 접합체에 대해 생성될 수 있다 (하기 참조).
특정 실시양태에서, 항-CD44v6 모노클로날 항체는 (1) 서열식별번호: 1의 중쇄 가변 영역 (HCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 2의 HCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 3의 HCVR CDR3 서열을 포함하는 HCVR; 및/또는 (2) 서열식별번호: 10의 경쇄 가변 영역 (LCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 11의 LCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 12의 LCVR CDR3 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD44v6 에피토프는 서열식별번호: 19이다.
특정 실시양태에서, CD44v6 에피토프는 서열식별번호: 19로 본질적으로 이루어진다 (예를 들어, 에피토프는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐). 서열식별번호: 19의 N- 및/또는 C-말단에 부가된 / 여분의 잔기는 야생형 CD44v6에서 자연 발생 잔기 또는 인공 잔기일 수 있다.
특정 실시양태에서, CD44v6 에피토프는 서열식별번호: 24 (HEGYRQTPKEDS)이다.
특정 실시양태에서, (i) HCVR은 서열식별번호: 7-9 중 1개 이상을 추가로 포함하고/거나, (ii) LCVR은 서열식별번호: 13-18 중 1개 이상을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 단리된 항-CD44v6 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 CD44v6 에피토프 또는 상기 CD44v6 에피토프를 갖는 세포에 약 10 nM, 약 5 nM 또는 약 2 nM 또는 그 미만의 KD로 결합한다.
특정 실시양태에서, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간-마우스 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, CDR-그라프팅된 항체 또는 재표면화 항체이다.
특정 실시양태에서, 그의 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv 또는 scFv, 디술피드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGΔCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc이다.
관련 측면에서, 본 발명은 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 참조 모노클로날 항체에 의해 결합되는 CD44v6의 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 CD44v6의 동일한 에피토프에의 결합에 대해 상기 참조 모노클로날 항체와 경쟁하고, 여기서 상기 참조 모노클로날 항체는 (1) 서열식별번호: 1의 중쇄 가변 영역 (HCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 2의 HCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 3의 HCVR CDR3 서열을 포함하는 HCVR; (2) 서열식별번호: 10의 경쇄 가변 영역 (LCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 11의 LCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 12의 LCVR CDR3 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 단리된 CD44v9 에피토프에 특이적인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 CD44v9 에피토프는 (1) 서열식별번호: 43을 포함하거나 / 이로 본질적으로 이루어지거나 (예를 들어, 에피토프는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 43의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐), 또는 (2) 서열식별번호: 43으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 단리된 CD44v9 에피토프에 대해 생성되거나, 또는 상기 단리된 CD44v9 에피토프 및 담체 단백질 (예컨대 알부민, 바람직하게는 BSA 또는 오브알부민, 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))을 포함하는 융합 단백질 또는 그의 화학적 접합체에 대해 생성된다.
특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 (1) 서열식별번호: 25의 중쇄 가변 영역 (HCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 26의 HCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 27의 HCVR CDR3 서열을 포함하는 HCVR; 및/또는 (2) 서열식별번호: 34의 경쇄 가변 영역 (LCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 35의 LCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 36의 LCVR CDR3 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD44v9 에피토프는 서열식별번호: 43이다.
특정 실시양태에서, CD44v9 에피토프는 서열식별번호: 43으로 본질적으로 이루어진다 (예를 들어, 에피토프는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐). 서열식별번호: 43의 N- 및/또는 C-말단에 부가된 / 여분의 잔기는 야생형 CD44v9에서 자연 발생 잔기 또는 인공 잔기일 수 있다.
특정 실시양태에서, CD44v9 에피토프는 서열식별번호: 44 (SHEGLEEDKDH)이다.
특정 실시양태에서, (i) HCVR은 서열식별번호: 28-33 중 1개 이상을 추가로 포함하고/거나, (ii) LCVR은 서열식별번호: 37-42 중 1개 이상을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 CD44v9 에피토프 또는 상기 CD44v9 에피토프를 갖는 세포에 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM 또는 그 미만의 KD로 결합한다.
특정 실시양태에서, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간-마우스 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, CDR-그라프팅된 항체 또는 재표면화 항체이다.
특정 실시양태에서, 그의 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv 또는 scFv, 디술피드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGΔCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc이다.
관련 측면에서, 본 발명은 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 참조 모노클로날 항체에 의해 결합되는 CD44v9의 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 CD44v9의 동일한 에피토프에의 결합에 대해 상기 참조 모노클로날 항체와 경쟁하고, 여기서 상기 참조 모노클로날 항체는 (1) 서열식별번호: 25의 중쇄 가변 영역 (HCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 26의 HCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 27의 HCVR CDR3 서열을 포함하는 HCVR; (2) 서열식별번호: 34의 경쇄 가변 영역 (LCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 35의 LCVR CDR2 서열 및/또는 서열식별번호: 36의 LCVR CDR3 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나의 HCVR 및/또는 LCVR을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 융합 단백질 (예컨대 키메라 항원 T 세포 수용체)이다.
키메라 항원 T 세포 수용체 (CAR-T)는 또한 키메라 항원 수용체 (CAR), 키메라 면역수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 인공 T 세포 수용체로서 공지되어 있다. 이는 면역 이펙터 T 세포 상에 임의의 특이성을 그라프팅하는 조작된 수용체이다. 전형적으로, 이들 수용체는 T 세포 상에 모노클로날 항체의 특이성을 그라프팅하는데 사용되고, 이들의 코딩 서열의 전달은 레트로바이러스 벡터에 의해 용이해진다. 수용체는 상이한 공급원으로부터의 부분으로 구성되기 때문에 키메라로 불린다. CAR-T는, T 세포를 환자로부터 분리해내고 이들이 환자의 특정한 암에 특이적인 수용체, 예컨대 암 세포 상에 발현되는 CD44v6 또는 CD44v9를 발현하도록 변형시키는 입양 세포 전달을 사용하여 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 이어서 암 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있는 T 세포가 환자 내로 재도입된다. 환자 이외의 공여자로부터 공급된 T-세포의 변형이 또한 유사하게 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 CAR-T는 막횡단 도메인 (예컨대 CD3-제타 막횡단 도메인) 및 엔도도메인 (예컨대 CD3-제타 엔도도메인)에 융합된, 임의의 대상 모노클로날 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체로부터 유래된 대상 단일쇄 가변 단편 (scFv)의 융합체이다.
특정 실시양태에서, scFv 앞에, 신생 단백질을 내형질 세망으로 지시하고 후속 표면 발현을 지시하는 신호 펩티드가 선행된다. 임의의 진핵 신호 펩티드 서열이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 아미노-말단에 천연적으로 부착된 신호 펩티드가 사용된다 (예를 들어, 경쇄 - 링커 - 중쇄의 배향을 갖는 scFv에서, 경쇄의 천연 신호가 사용됨).
특정 실시양태에서, 가요성 스페이서가 부가되어 scFv가 최적의 항원 결합을 할 수 있도록 상이한 방향으로 배향되게 한다. 스페이서는 바람직하게는 항원 결합 도메인이 항원 인식을 용이하게 하도록 상이한 방향으로 배향되게 하기에 충분히 가요성이다. 특정 실시양태에서, IgG1로부터의 힌지 영역이 스페이서로서 사용된다. 특정 실시양태에서, 이뮤노글로불린의 CH2CH3 영역 및 CD3의 부분이 스페이서로서 사용된다. 대부분의 scFv 기반 구축물의 경우, IgG1 힌지가 통상적으로 충분하다.
특정 실시양태에서, 구축물은 세포 내로 돌출하여 목적하는 신호를 전달하는 신호전달 엔도도메인의 원래 분자로부터 유래된 전형적인 소수성 알파 나선인 막횡단 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 엔도도메인의 가장 막 근접한 성분으로부터의 막횡단 도메인, 예컨대 CD3-제타 막횡단 도메인이 사용된다.
특정 실시양태에서, 엔도도메인은 항원이 본 발명의 항원 결합 단편에 의해 결합된 후에 활성화 신호를 T 세포로 전달하는 3개의 ITAM을 함유하는 CD3-제타 엔도도메인이다.
특정 실시양태에서, 엔도도메인은 T 세포에 추가적인 신호를 제공하기 위해 구축물의 세포질 꼬리 (CD3-제타 도메인에 대해 N- 또는 C-말단)에 융합된, 공동자극 단백질 수용체 (예를 들어, CD28, 41BB, ICOS의 것)로부터의 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 엔도도메인은 효력을 증대시키거나 또는 증식 / 생존 신호를 전달하기 위해, 다수의 신호전달 도메인을 조합하며, 예컨대 CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 신속한 정제를 위한 식별 마커를 갖는 조작된 T 세포를 제공하기 위해, 스트렙-태그 II 서열 (스트렙타비딘에 대한 고유한 친화도를 나타내는 8개-잔기의 최소 펩티드 서열 (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys))을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 임의의 대상 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 임의의 대상 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
특정 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터 (예를 들어, 포유동물 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 곤충 발현 벡터 또는 박테리아 발현 벡터)이다.
본 발명의 또 다른 측면은 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 임의의 대상 폴리펩티드, 임의의 대상 폴리뉴클레오티드 또는 임의의 대상 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
특정 실시양태에서, 세포는 임의의 대상 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 임의의 대상 폴리펩티드를 발현한다.
특정 실시양태에서, 세포는 BHK 세포, CHO 세포 또는 COS 세포이다.
특정 실시양태에서, 세포는 세포의 표면 상에 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 임의의 대상 폴리펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 세포는 임의의 대상 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 임의의 대상 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 보유하는 T-세포 (CAR-T 세포)이다.
특정 실시양태에서, 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 트랜스포존은 트랜스진 보유 대상 CAR-T 구축물을 숙주 세포 게놈 내로 통합시키는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 비-통합 벡터 또는 에피솜 DNA/RNA 구축물, 예컨대 플라스미드 또는 mRNA가 대신 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 게놈 내로 통합되지 않으면서 T 세포에서 안정하게 유지되는 벡터는 삽입 돌연변이유발 또는 유전자독성의 위험 없이 장기간 트랜스진 발현을 가능하게 하는데 사용된다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열식별번호: 19를 포함하거나 / 이로 본질적으로 이루어지거나 (예를 들어, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어진 에피토프), 또는 서열식별번호: 19로 이루어진 단리된 CD44v6 에피토프를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 제28항의 단리된 CD44v6 에피토프 및 담체 단백질 (예컨대 알부민, 바람직하게는 BSA 또는 오브알부민, 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))을 포함하는 융합 단백질 또는 화학적 접합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열식별번호: 43을 포함하거나 / 이로 본질적으로 이루어지거나 (예를 들어, 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어진 에피토프), 또는 서열식별번호: 43으로 이루어진 단리된 CD44v9 에피토프를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 제28a항의 단리된 CD44v9 에피토프 및 담체 단백질 (예컨대 알부민, 바람직하게는 BSA 또는 오브알부민, 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))을 포함하는 융합 단백질 또는 화학적 접합체를 제공한다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 담체 단백질은, 면역 반응을 유도하고 항체를 생산하기에 스스로 충분히 크거나 복잡하지 않은 펩티드 또는 다른 합텐과의 커플링에 사용되는 임의의 단백질이다. 담체 단백질은, 그것이 크고 복잡하기 때문에, 접합된 합텐에 면역원성을 부여하여, 합텐 및 담체 상의 에피토프에 대해 항체가 생산되게 한다.
많은 단백질이 담체로서 사용될 수 있고, 합텐과의 접합을 달성시킬 수 있는 유용한 관능기의 면역원성, 용해도 및 이용가능성에 기초하여 선택된다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 또는 알부민, 예컨대 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 오브알부민이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 많은 이러한 담체 단백질은 상업적으로 입수가능하며, 예컨대 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 임젝트 마리컬쳐 키홀 림펫 헤모시아닌 (mcKLH); 청색 담체* 단백질 (KLH와 대부분의 동일한 면역원성 특성을 나타내는 콘콜레파스 콘콜레파스(Concholepas concholepas) 헤모시아닌 (CCH)의 정제된 제제); 써모 사이언티픽 임젝트 BSA (고도로 정제된 (즉, 분획 V) 소 혈청 알부민); 양이온화 소 혈청 알부민 (cBSA) (천연 BSA를 과량의 에틸렌디아민으로 변형시켜 제조됨, 본질적으로 모든 음으로-하전된 카르복실기를 양으로-하전된 1급 아민으로 캡핑하여, 고도로 양으로-하전된 단백질 (pI > 11)을 생성하며, 이는 천연 BSA와 비교하여 유의하게 증가된 면역원성을 가짐); 및 오브알부민이다.
본 발명의 CD44v6 및 CD44v9 에피토프는 담체 단백질에 융합되거나, 또는 예를 들어 담체 단백질의 표면 1급 아민 기 중 어느 1개 이상을 통해 담체 단백질에 화학적으로 접합될 수 있다.
합텐 / 에피토프 상에서 이용가능한 관능기, 요구되는 합텐 / 에피토프 배향 및 담체로부터의 거리, 및 생물학적 및 항원 특성에 대한 접합의 가능한 효과에 따라, 합텐 / 펩티드 에피토프를 담체 단백질에 접합시키기 위한 상이한 접근법이 이용가능하다. 예를 들어, 1급 아민 (N-말단 및 리신 잔기의 측쇄), 카르복실 기 (C-말단 또는 아스파르트산 및 글루탐산의 측쇄) 및 술프히드릴 (시스테인 잔기의 측쇄)을 갖는 에피토프가 이러한 기를 사용하는 접합을 위해 표적화될 수 있다. 일반적으로, 담체 단백질 내의 많은 1급 아민이 가교 시약을 통해 합텐을 커플링시키는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 단백질-담체 및 펩티드-담체 접합은 카르보디이미드 가교제 EDC (즉, 카르복실 및 아민 가교를 통한 EDC 접합)를 사용하여 수행된다.
특정 실시양태에서, 단백질-담체 및 펩티드-담체 접합은 말레이미드 접합 (술프히드릴 가교)을 사용하여 수행된다.
특정 실시양태에서, 단백질-담체 및 펩티드-담체 접합은 글루타르알데히드 접합 (아민-대-아민 가교)을 사용하여 수행된다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 임의의 대상 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포로부터 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 임의의 대상 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는, 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 임의의 대상 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 화학식을 갖는 면역접합체 (또는 항체-약물 접합체 또는 ADC)이며: Ab-[-L-D]n, 여기서 Ab는 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 임의의 대상 폴리펩티드이고, 이는 링커-약물 모이어티 -[-L-D]의 1개 이상의 단위에 공유 연결되고, 여기서 L은 링커이고, D는 세포독성 약물이고; n은 1 내지 20 (예를 들어, 1-12)의 정수이고; 여기서 각각의 링커-약물 모이어티는 동일하거나 상이한 링커 L 또는 세포독성 약물 D를 가질 수 있는 것인 면역접합체를 제공한다.
특정 실시양태에서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]는 Lys의 측쇄 아미노기를 통해 Ab에 공유 연결된다.
특정 실시양태에서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]는 Cys의 측쇄 티올 기를 통해 Ab에 공유 연결된다.
특정 실시양태에서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]는 부위-특이적으로 혼입된 비-천연 아미노산을 통해 Ab에 공유 연결된다.
특정 실시양태에서, 각각의 링커 L은 펩티드 단위를 포함한다.
특정 실시양태에서, 펩티드 단위는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 2-10 또는 2-5개의 아미노산 잔기를 포함한다.
특정 실시양태에서, 링커 L은 프로테아제 (예를 들어, 카텝신)에 의해 절단가능하지 않다.
특정 실시양태에서, 링커 L은 프로테아제 (예를 들어, 카텝신), 산성 환경 또는 산화환원 상태 변화에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커이다.
특정 실시양태에서, 세포독성 약물은 DNA 삽입제, 미세관 결합제, 토포이소머라제 I 억제제 또는 DNA 작은 홈 결합제이다.
특정 실시양태에서, 세포독성 약물은 아우리스타틴 부류, 예컨대 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 MMAF, 메이탄신 부류, 예컨대 DM-1, DM-3, DM-4, 칼리케아미신, 예컨대 오조가미신, SN-38 또는 PBD (피롤로벤조디아제핀)이다.
관련 측면에서, D 모이어티는 약물 분자 그 자체가 아니라 어댑터 분자 (예컨대 FITC)이며, 이는 어댑터 분자에 특이적인 범용 CAR-T에 의해 단단히 결합될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따르면, 어댑터 분자, 예컨대 FITC에 대해 매우 높은 친화도로 결합하는 단일 범용 CAR-T 세포는 이중특이적 SMDC (소분자 약물 접합체) 어댑터 분자와 공-투여되는 경우에 다양한 암 유형을 치료하는데 사용된다. 이들 독특한 이중특이적 어댑터는 어댑터, 예컨대 FITC 분자 및 종양-귀소 분자, 예컨대 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체의 항원-결합 단편을 사용하여 구축되어, 범용 CAR-T 세포를 암 세포와 정확하게 가교시켜, 국재화된 T 세포 활성화를 유발한다. 항종양 활성은 범용 CAR-T 세포 및 정확한 항원-특이적 어댑터 분자가 둘 다 존재하는 경우에만 유도된다. 항종양 활성 및 독성은 투여되는 어댑터 분자 용량을 조정함으로써 추가로 제어될 수 있다. 항원적으로 불균질한 종양의 치료는 목적하는 항원-특이적 어댑터의 혼합물의 투여에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 임의의 대상 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 폴리펩티드 또는 그의 면역접합체 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 CD44v6을 발현하는 세포를 임의의 대상 항-CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 대상 폴리펩티드 또는 그의 대상 면역접합체 또는 그의 대상 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, CD44v6을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다.
특정 실시양태에서, 종양 세포는 폐암 (예컨대 NSCLC)으로부터의 것이다.
특정 실시양태에서, 종양 세포는 결장직장암, 유방암, 두경부암, 난소암, 방광암, 췌장암 또는 뇌의 전이성 암으로부터의 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 CD44v9를 발현하는 세포를 임의의 대상 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 폴리펩티드 또는 그의 면역접합체 또는 그의 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, CD44v9를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다.
특정 실시양태에서, 종양 세포는 폐암 (예컨대 NSCLC)으로부터의 것이다.
특정 실시양태에서, 종양 세포는 결장직장암, 유방암, 간암, 두경부암, 난소암, 방광암, 췌장암 또는 뇌의 전이성 암으로부터의 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포가 CD44v6을 발현하는 암을 갖는 대상체에게 CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v6의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v6의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 세포가 CD44v6을 발현하는 세포-증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, CD44v6의 길항제는 임의의 대상 항-CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 대상 폴리펩티드 또는 그의 대상 면역접합체 또는 그의 대상 제약 조성물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암은 유방, 폐, 간, 결장직장, 두경부, 식도, 췌장, 난소, 방광, 위, 피부, 자궁내막, 난소, 고환, 식도, 전립선 또는 신장 기원을 포함한 상피 암종; 골 및 연부-조직 육종, 예컨대 골육종, 연골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종 (MFH), 평활근육종; 조혈 악성종양, 예컨대 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 백혈병; 신경외배엽 종양, 예컨대 말초 신경 종양, 성상세포종 또는 흑색종; 또는 중피종이다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포가 CD44v9를 발현하는 암을 갖는 대상체에게 CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v9의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v9의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 세포가 CD44v9를 발현하는 세포-증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, CD44v9의 길항제는 임의의 대상 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 폴리펩티드 또는 그의 면역접합체 또는 그의 제약 조성물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암은 유방, 폐, 간, 결장직장, 두경부, 식도, 췌장, 난소, 방광, 위, 피부, 자궁내막, 난소, 고환, 식도, 전립선 또는 신장 기원을 포함한 상피 암종; 골 및 연부-조직 육종, 예컨대 골육종, 연골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종 (MFH), 평활근육종; 조혈 악성종양, 예컨대 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 백혈병; 신경외배엽 종양, 예컨대 말초 신경 종양, 성상세포종 또는 흑색종; 또는 중피종이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체로부터의 샘플을 임의의 대상 항-CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, 대상체로부터의 샘플에서 CD44v6의 존재 및/또는 존재비를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체로부터의 샘플을 임의의 대상 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, 대상체로부터의 샘플에서 CD44v9의 존재 및/또는 존재비를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 (1) 대상체로부터의 암 샘플에서 CD44v6의 존재 및/또는 존재비를 결정하는 대상 방법을 사용하여 암 샘플에서 CD44v6을 발현하는 대상체를 확인하는 단계, (2) 상기 대상체에게 치료 유효량의 임의의 대상 항-CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 폴리펩티드 또는 그의 면역접합체 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 이에 의해 세포가 CD44v6을 발현하는 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 것인, 상기 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 (1) 대상체로부터의 암 샘플에서 CD44v9의 존재 및/또는 존재비를 결정하는 대상 방법을 사용하여 암 샘플에서 CD44v9를 발현하는 대상체를 확인하는 단계, (2) 상기 대상체에게 치료 유효량의 임의의 대상 항-CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 폴리펩티드 또는 그의 면역접합체 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 이에 의해 세포가 CD44v9를 발현하는 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 것인, 상기 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 방법을 제공한다.
상기 일반적으로 기재된 본 발명과 함께, 본 발명의 특정 구체적 측면 또는 실시양태가 하기 섹션에서 추가로 기재된다.
2. 정의
용어 "항체", "항체 분자" 및 "항체 단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 동등물로 간주될 것이다. 이들은 이뮤노글로불린 분자의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 내의 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적 분자, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질 또는 상기의 조합을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 무손상 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체를 포괄하고, 약어로서 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv (scFv) 돌연변이체, 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 그의 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기초하여, 이뮤노글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 그의 하위부류 (이소형) (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린은 상이하고, 널리 공지되어 있는 서브유닛 구조 및 3차원 구성을 갖는다. 항체는 네이키드이거나 또는 다른 분자, 예컨대 독소, 방사성동위원소 등에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 비-자연 발생의 재조합적으로 생성된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 자연 성분으로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, 항체는 재조합적으로 생산된다. 일부 실시양태에서, 항체는 하이브리도마에 의해 생산되거나 또는 항체의 라이브러리에서 생성된다.
"모노클로날 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)"은 코티아(Chothia) 및 레스크(Lesk) (문헌 [Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917] (본원에 참조로 포함됨))와 관련하여 카바트(Kabat) (문헌 [Kabat E. A., Wu T. T., Perry H. M., Gottesman K. S. and Foeller C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th Ed.). NIH Publication No. 91-3242. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.] (본원에 참조로 포함됨))에 따라 특이적 항원 결합에 관여하는 아미노산 서열인 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "프레임워크 변형"은 개별 상보성 결정 영역을 둘러싸는 가변 영역 내의 단일 또는 다중 아미노산의 교환, 결실 또는 부가를 지칭한다. 프레임워크 변형은 항체 단백질의 면역원성, 생산성 또는 결합 특이성에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 사용된 "항원-결합 단편", "항원-결합 부분" 또는 "단편"은 전장 서열보다 더 짧은 핵산 분자에 의해 코딩되지만 여전히 그의 항체 결합 활성을 보유한다는 것 (예를 들어, Kd에 의해 측정시 약간 더 불량한 결합 친화도일 수도 있지만, 실질적으로는 동일한 결합 특이성)을 특징으로 하는, 보다 짧은 버전의 항체 분자, 즉 임의의 폴리펩티드 하위세트를 지칭한다.
이들 용어는 무손상 항체의 한 부분을 지칭하고, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 항체의 "항원-결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 특정 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (비제한적으로) 다음을 포함한다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편 (예를 들어, 파파인에 의해 소화된 항체는 다음 3개의 단편을 생성함: 2개의 항원-결합 Fab 단편 및 항원에 결합하지 않는 1개의 Fc 단편); (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편 (예를 들어, 펩신에 의해 소화된 항체는 다음 2개의 단편을 생성함: 2가 항원-결합 F(ab')2 단편 및 항원에 결합하지 않는 pFc' 단편), 및 그의 관련 F(ab') 1가 유닛; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편 (즉, Fab에 포함되는 중쇄의 그 부분); (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, 및 관련 디술피드 연결된 Fv; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb (도메인 항체) 또는 sdAb (단일 도메인 항체) 단편 (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR).
항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 공지되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유도된다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117, 1993; Brennan et al., Science 229:81, 1985]). 특정 실시양태에서, 항체 단편은 재조합적으로 생산된다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이(E. coli) 또는 다른 숙주 세포에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있어서, 이들 단편의 다량 생산을 가능하게 한다. 이러한 항체 단편은 또한 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 선형 항체일 수 있고, 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
"모노클로날 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도의 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 동종 항체 집단을 지칭한다. 이는 전형적으로 상이한 항원 결정기에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 무손상 및 전장 모노클로날 항체 둘 다, 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포괄한다. 추가로, "모노클로날 항체"는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 및 트랜스제닉 동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 수의 방식으로 제조된 이러한 항체를 지칭한다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법을 사용하여, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 면역화하여, 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구에 의한 생산을 도출해낸다. 또한 림프구를 시험관내에서 면역화할 수 있다. 면역화 후에, 림프구를 단리하고, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 적합한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성하고, 이어서 이를 비융합 림프구 및 골수종 세포로부터 선택해 낼 수 있다. 이어서 면역침전, 이뮤노블롯팅에 의해 또는 시험관내 결합 검정 (예를 들어, 방사성면역검정 (RIA); 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA))에 의해 결정된 바와 같이 선택된 항원에 특이적으로 지시되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를, 표준 방법 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986)을 사용하는 시험관내 배양에서 또는 동물 내의 복수 종양으로서 생체내에서 증식시킬 수 있다. 이어서 폴리클로날 항체에 대해 기재된 바와 같이 배양 배지 또는 복수액으로부터 모노클로날 항체를 정제할 수 있다.
대안적으로 미국 특허 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 또한 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 성숙 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터, 예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 RT-PCR에 의해 단리하고, 통상적인 절차를 사용하여 그의 서열을 결정한다. 이어서 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 적합한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 이를 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시키는 경우에 (이들은 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않음), 이러한 숙주 세포에 의해 모노클로날 항체가 생성된다. 또한 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990; Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991]에 기재된 바와 같이 목적하는 종의 CDR을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 목적하는 종의 재조합 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 단리할 수 있다.
모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)를 재조합 DNA 기술을 사용하여 수많은 상이한 방식으로 추가로 변형시켜 대안적 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인으로 1) 예를 들어 인간 항체의 이러한 영역을 치환시켜 키메라 항체를 생성하거나 또는 2) 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드를 치환시켜 융합 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역을 말단절단 또는 제거하여 목적하는 모노클로날 항체의 항체 단편을 생성한다. 가변 영역의 부위-지정 또는 고밀도 돌연변이유발을 사용하여 모노클로날 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화할 수 있다.
용어 "인간화 항체"는 최소의 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 서열을 함유하는 특이적 이뮤노글로불린 쇄, 키메라 이뮤노글로불린 또는 그의 단편인 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린이다 (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988).
비-인간 또는 인간 항체를 조작, 인간화 또는 재표면화하는 방법이 또한 사용될 수 있고, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 인간화, 재표면화 또는 유사하게 조작된 항체는 비-인간, 예를 들어 비제한적으로, 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 또는 다른 포유동물인 공급원으로부터의 1개 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로 지칭되는 잔기에 의해 대체되고, 이는 전형적으로 공지된 인간 서열의 "유입" 가변, 불변 또는 다른 도메인으로부터 취해진다.
이러한 유입된 서열은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 면역원성을 감소시키거나 또는 결합, 친화도, 온-레이트, 오프-레이트, 결합력, 특이성, 반감기 또는 임의의 다른 적합한 특징을 감소, 증진 또는 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기가 CD44v6 또는 CD44v9 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다. 따라서, 가변 및 불변 영역의 비-인간 서열이 인간 또는 다른 아미노산으로 대체될 수 있지만 비-인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는 유지된다.
항체는 또한 임의로 항원 CD44v6 또는 CD44v9에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 조작된 인간화, 재표면화, 조작된 또는 인간 항체일 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 인간화 (또는 인간) 또는 조작된 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 및 재표면화 항체는 임의로, 모, 조작된 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 및 조작된 생성물의 분석 과정에 의해 제조될 수 있다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 개연성 있는 3차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석을 가능하게 하고, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원, 예컨대 CD44v6 또는 CD44v9에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 프레임워크 (FR) 잔기는 목적하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 컨센서스 및 유입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다.
본 발명의 항체의 인간화, 재표면화 또는 조작은 임의의 공지된 방법, 예컨대 비제한적으로 문헌 [Winter (Jones et al., Nature 321:522, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988, Sims et al., J. Immunol. 151:2296, 1993; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901, 1987, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151:2623, 1993; Raguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91(3):969-973, 1994]; 미국 특허 번호 5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7,557,189; 7,538,195; 및 7,342,110 (이들 각각은 그 안에 인용된 참고문헌을 비롯하여, 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
특정의 대안적 실시양태에서, CD44v6 또는 CD44v9에 대한 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 직접 제조될 수 있다. 시험관내에서 면역화되거나 또는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 면역화 개체로부터 단리된 불멸화 인간 B 림프구가 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol, 147 (l):86-95]; 및 미국 특허 5,750,373 참조). 또한, 인간 항체는, 예를 들어 문헌 [Vaughan et al., Nat. Biotech. 14:309- 314, 1996, Sheets et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 95:6157-6162, 1998, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381, 1991, 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991]에 기재된 바와 같이, 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 사용에 대한 기술은 또한 미국 특허 번호 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; 및 7,264,963; 및 문헌 [Rothe et al., J. Mol. Bio. doi: 10.1016/j.jmb.2007.12.018, 2007] (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 친화도 성숙 전략 및 쇄 셔플링 전략 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783, 1992] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨))은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 고친화도 인간 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
인간화 항체는 또한 면역화시 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에 기재되어 있다.
일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 내의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내에서 추가의 잔기를 치환시킴으로써 추가로 변형되어 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 정밀화 및 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 이뮤노글로불린에 상응하는 CDR 영역을 모두 또는 실질적으로 모두 함유하는 적어도 1개, 전형적으로는 2 또는 3개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이나, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하기 위해 사용되는 방법의 예는 미국 특허 5,225,539 및 5,639,641, 문헌 [Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(3):969-973, 1994; 및 Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904, 1996] (모두 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, "인간화 항체"는 재표면화 항체이다. 일부 실시양태에서, "인간화 항체"는 CDR-그라프팅된 항체이다.
항체의 "가변 영역"은 단독 또는 조합의 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역으로도 또한 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어진다. 각각의 쇄에서의 CDR들은 FR에 의해 함께 근접하게 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR들은 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 다음 적어도 2가지 기술이 존재한다: (1) 교차-종 서열 가변성에 기초한 접근법 (즉, 문헌 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법 (문헌 [Al-lazikani et al., J. Molec. Biol. 273:927-948, 1997]). 추가로, 이들 두 접근법의 조합이 관련 기술분야에서 CDR을 결정하는데 때때로 사용된다.
카바트 넘버링 시스템은 일반적으로, 가변 도메인 내의 잔기 (대략적으로, 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]).
카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] (본원에 참조로 포함됨)에서 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 이 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물 (카바트에 따라 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따라 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 주어진 항체에 대해 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬시킴으로써 결정될 수 있다. 코티아는 그 대신 구조 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917,1987). 카바트 넘버링 규정을 사용하여 넘버링되는 경우 코티아 CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 달라진다. 이는 카바트 넘버링 스킴이 H35A 및 H35B에서 삽입을 배치하기 때문이며 - 35A나 35B가 둘 다 존재하지 않는 경우에, 루프는 32에서 끝나고; 35A만이 존재하는 경우에, 루프는 33에서 끝나고; 35A 및 35B 둘 다가 존재하는 경우에, 루프는 34에서 끝난다. AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조적 루프 사이의의 절충을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다.
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용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조된 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 특정 실시양태에서, 인간 항체는 비-인간 서열을 갖지 않는다. 인간 항체의 이러한 정의는 무손상 또는 전장 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 이뮤노글로불린 분자의 아미노산 서열이 2개 이상의 종으로부터 유래된 것인 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등) 중 하나의 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 한편 불변 영역은 또 다른 종 (통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체 내의 서열과 상동이어서 그 종 (예를 들어, 인간)에서 면역 반응을 도출할 가능성을 피하거나 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 키메라 항체는 적어도 1개의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들어 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 변형된 항체는 항체와 인간 CD44v6 또는 CD44v9의 폴리펩티드의 회합을 제공하는 임의의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 이와 관련하여, 가변 영역은 체액성 반응을 시작하고 목적하는 종양 연관 항원에 대한 이뮤노글로불린 생성하기 위해 유도될 수 있는 임의의 유형의 포유동물의 것을 포함하거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 이에 따라, 변형된 항체의 가변 영역은, 예를 들어 인간, 뮤린, 비-인간 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 마카크 등) 또는 루핀 기원의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 이뮤노글로불린의 가변 및 불변 영역은 둘 다 인간이다. 다른 실시양태에서, 상용성 항체 (통상적으로 비-인간 공급원으로부터 유래됨)의 가변 영역은 결합 특성을 개선시키거나 분자의 면역원성을 감소시키기 위해 조작되거나 또는 특이적으로 맞추어질 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명에 유용한 가변 영역은 인간화될 수 있거나 또는 유입된 아미노산 서열의 포함을 통해 달리 변경될 수 있다.
특정 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 1개 이상의 CDR의 적어도 부분적 대체에 의해, 및 필요한 경우, 부분적 프레임워크 영역 대체 및 서열 변화에 의해 변경된다. CDR은, 프레임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 부류 또는 심지어는 하위부류의 항체로부터 유래될 수 있지만, CDR은 상이한 부류의 항체로부터, 특정 실시양태에서는 상이한 종의 항체로부터 유래될 것으로 생각된다. 하나의 가변 도메인의 항원-결합 능력을 또 다른 가변 도메인으로 전달하기 위해 모든 CDR을 공여자 가변 영역으로부터의 모든 CDR로 대체할 필요는 없을 수도 있다. 그보다는, 항원-결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기를 전달하는 것만이 필요할 수 있다. 미국 특허 번호 5,585,089, 5,693,761 및 5,693,762에 제시된 설명을 고려하여, 감소된 면역원성을 갖는 기능적 항체를 수득하는 것은 상용 실험의 수행 또는 시행 착오 시험에 의해 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있을 것이다.
가변 영역에 대한 변경에도 불구하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 변형된 항체가 불변 영역 도메인의 적어도 1개 이상의 부분이 결실되거나 또는 달리 변경되어, 목적하는 생화학적 특징, 예컨대 천연 또는 비변경 불변 영역을 포함하는 대략 동일한 면역원성의 항체와 비교할 때 증가된 종양 국재화 또는 감소된 혈청 반감기를 제공하는 항체 (예를 들어, 전장 항체 또는 그의 면역반응성 단편)를 포함할 것임을 인지할 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 본 발명과 상용성인 불변 영역에 대한 변형은 1개 이상의 도메인에서의 1개 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 즉, 본원에 개시된 변형된 항체는 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3) 중 1개 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인 (CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 결실된 변형된 불변 영역이 고려된다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실 구축물 또는 변이체 (ACH2 구축물)를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 생략된 불변 영역 도메인은 부재 불변 영역에 의해 전형적으로 부여되는 분자 가요성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (예를 들어, 10개의 잔기)에 의해 대체될 것이다.
특정 실시양태에서, 변형된 항체를 조작하여 CH3 도메인을 각각의 변형된 항체의 힌지 영역에 직접 융합시킬 수 있다는 것을 주목할 것이다. 다른 구축물에서, 힌지 영역과 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 펩티드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고, 남아있는 CH3 도메인 (변형 또는 비변형)이 5-20개의 아미노산 스페이서에 의해 힌지 영역에 연결되는 상용성 구축물이 발현될 수 있다. 이러한 스페이서를 부가하여, 예를 들어 불변 도메인의 조절 요소를 자유롭고 접근가능하게 하거나 또는 힌지 영역을 가요성이게 할 수 있다. 그러나, 아미노산 스페이서는 일부 경우에 면역원성인 것으로 입증되어 구축물에 대해 원치않는 면역 반응을 도출할 수 있다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 구축물에 부가되는 임의의 스페이서는 변형된 항체의 목적하는 생물학적 품질을 유지하도록 비교적 비-면역원성이거나 또는 심지어 전적으로 생략될 것이다.
전체 불변 영역 도메인의 결실 이외에, 본 발명의 항체는 소수 또는 심지어 단일 아미노산의 부분 결실 또는 치환이 제공될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서의 단일 아미노산의 돌연변이는 실질적으로 Fc 결합을 감소시켜 종양 국재화를 증가시키기에 충분할 수 있다. 유사하게, 조정될 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 C1Q 결합)을 제어하는 1개 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 간단히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분 결실은 대상 무손상 불변 영역 도메인과 연관된 다른 바람직한 기능은 남기면서 항체의 선택된 특징 (혈청 반감기)을 개선시킬 수 있다. 또한, 상기 언급된 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은, 예를 들어 생성되는 구축물의 프로파일을 증진시킬 수 있는 1개 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형될 수 있다. 이러한 점에서, 변형된 항체의 구성 및 면역원성 프로파일은 실질적으로 유지시키면서 보존된 결합 부위에 의해 제공되는 활성 (예를 들어, Fc 결합)을 방해하는 것이 가능할 수 있다. 특정 실시양태는 바람직한 특징을 증진시키기 위해, 예컨대 이펙터 기능을 감소 또는 증가시키기 위해 또는 보다 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 불변 영역에 대한 1개 이상의 아미노산의 부가를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특정 서열을 삽입 또는 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 본원에 제시된 키메라, 인간화 및 인간 항체 또는 그의 항체 단편과 실질적으로 상동인 변이체 및 등가물을 추가로 포함한다. 이들은, 예를 들어 보존적 치환 돌연변이, 즉 유사한 아미노산에 의한 1개 이상의 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 아미노산을 동일한 일반 부류 내의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것, 예를 들어 하나의 산성 아미노산을 또 다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 또 다른 염기성 아미노산으로 또는 하나의 중성 아미노산을 또 다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환에 의해 의도되는 것은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예컨대 본원 상기에 정의된 것이다.
용어 "에피토프" 및 "항원 결정기"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 특정한 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드인 경우에, 에피토프는 인접 아미노산 및 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치되는 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시 보유되는 반면에 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 입체형태로 적어도 3개, 보다 통상적으로는 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd) 또는 반수-최대 유효 농도 (EC50)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있으며, 반면 고친화도 항체는 일반적으로 항원에 더 신속히 결합하고 결합을 더 길게 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 목적을 위해 이들 중 임의의 방법이 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태가 본원에 기재된다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 상기 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 수치값 (일반적으로 하나는 본 발명의 항체와 연관되고 다른 하나는 참조/비교 항체와 연관됨) 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주할 만큼 상기 2개의 값 사이에 충분히 높은 정도의 유사성이 있다는 것을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 항체에 대한 값의 함수로서 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 또는 약 10% 미만이다.
"단리된" 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
관련 기술분야에 공지된 항체 및 다른 단백질의 정제 방법은 또한, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2008/0312425, 2008/0177048 및 2009/0187005 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다.
본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 물질이 적어도 50% 순수한 (즉, 오염물이 없는), 적어도 90% 순수한, 적어도 95% 순수한, 적어도 98% 순수한, 또는 적어도 99% 순수한 것을 지칭한다.
본 발명에 따른 항체 분자의 "기능적 변이체"는 본 발명에 따른 항체 분자와 실질적으로 유사한 생물학적 활성 (기능적 또는 구조적), 즉 실질적으로 유사한 기질 특이성 또는 기질 절단을 갖는 항체 분자이다.
용어 "기능적 변이체"는 또한 "단편", "대립유전자 변이체", "기능적 변이체", "축중성 핵산 코드에 기초한 변이체" 또는 "화학적 유도체"를 포함한다. 이러한 "기능적 변이체"는 1개 또는 여러개의 점 돌연변이, 코딩 서열 내의 1개 또는 여러개의 핵산 교환, 결실 또는 삽입, 또는 1개 또는 여러개의 아미노산 교환, 결실 또는 삽입을 보유할 수 있다. 상기 기능적 변이체는 여전히 그의 생물학적 활성, 예컨대 항체 결합 활성을 적어도 부분적으로 보유하거나 또는 심지어는 상기 생물학적 활성을 개선시키면서 보유한다.
본 발명에 따른 항체 분자의 "기능적 변이체"는 또한 본 발명에 따른 항체 분자와 실질적으로 유사한 생물학적 활성 (기능적 또는 구조적), 즉 실질적으로 유사한 표적 분자 결합 활성을 갖는 항체 분자를 포함할 수 있다.
"대립유전자 변이체"는 대립유전자 변이, 예를 들어 인간에서의 2개의 대립유전자에서의 차이로 인한 변이체이다. 상기 변이체는 여전히 그의 생물학적 활성, 예컨대 항체 표적 결합 활성을 적어도 부분적으로 보유하거나 또는 심지어는 상기 생물학적 활성을 개선시키면서 보유한다.
"유전자 코드의 축중성에 기초한 변이체"는 특정 아미노산이 여러 상이한 뉴클레오티드 삼중자에 의해 코딩될 수 있다는 사실로 인한 변이체이다. 상기 변이체는 여전히 그의 생물학적 활성, 예컨대 항체 결합 활성을 적어도 부분적으로 보유하거나 또는 심지어는 상기 생물학적 활성을 개선시키면서 보유한다.
"융합 분자"는, 예를 들어 리포터 분자, 예컨대 방사성표지, 화학 분자, 예컨대 독소 또는 형광 표지 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 분자에 융합된 본 발명에 따른 항체 분자일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명에 따른 "화학적 유도체"는 통상적으로 분자의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티를 함유하거나 또는 화학적으로 변형된 본 발명에 따른 항체 분자이다. 이러한 모이어티는 분자의 활성, 예컨대 표적 파괴 (예를 들어 종양 세포의 사멸)를 개선시킬 수 있거나 또는 그의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다.
분자는 두 분자가 실질적으로 유사한 구조 또는 생물학적 활성을 갖는 경우에 또 다른 분자와 "실질적으로 유사한" 것이다. 따라서, 두 분자가 유사한 활성을 갖는다면, 이들은 분자 중 하나의 구조가 다른 것에서 발견되지 않더라도 또는 아미노산 잔기의 서열이 동일하지 않은 경우에도 상기 용어가 본원에 사용된 바와 같이 변이체로 간주된다.
본 발명의 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 생물학적 기원, 구체적 실시양태에서, 예컨대 진핵 유기체의 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 인간 샘플이지만, 동물 샘플이 또한 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 샘플의 비제한적 공급원은, 예를 들어 고체 조직, 생검 흡인물, 복수, 유체 추출물, 혈액, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부, 호흡기, 장 및 비뇨생식관의 외부 절편, 눈물, 타액, 유액, 종양, 기관, 세포 배양물 및/또는 세포 배양 구성성분을 포함한다. "암성 / 종양 샘플"은 암성 세포를 함유하는 샘플이다. 상이한 유형의 세포 또는 조직을 비교하는 것, 상이한 발생 단계를 비교하는 것, 및 질환 또는 이상의 존재 및/또는 유형을 검출 또는 결정하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, CD44v6 또는 CD44v9의 발현의 측면 또는 샘플의 상태를 조사하는 것에 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 많은 용도를 위해, 최소의 가능한 항원-결합, 즉 CD44v6- 또는 CD44v9-결합 단위를 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 단백질은 Fab 단편 (항원-결합 단편=Fab)이다. 본 발명에 따른 이들 CD44v6-특이적 항체 단백질은 인접한 불변 영역에 의해 함께 유지되는 두 쇄의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 통상적인 항체로부터 프로테아제 소화, 예를 들어 파파인에 의해 형성될 수 있지만, 그 동안 유사한 Fab 단편이 또한 유전자 조작에 의해 생산될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 단백질은 펩신에 의한 단백질분해적 절단으로 제조될 수 있는 F(ab')2 단편이다.
유전자 조작 방법을 사용하여 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)만으로 이루어진 단축된 항체 단편을 생산하는 것이 가능하다. 이들은 Fv 단편으로 지칭된다 (가변 단편=가변부의 단편). 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 CD44v6- 또는 CD44v9-특이적 항체 분자는 이러한 Fv 단편이다. 이들 Fv-단편은 불변 쇄의 시스테인에 의한 두 쇄의 공유 결합이 결여되어 있기 때문에, Fv 단편은 종종 안정화된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을, 예를 들어 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산의 짧은 펩티드 단편에 의해 연결시키는 것이 유리하다. 이러한 방식으로, 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL로 이루어진 단일 펩티드 가닥이 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단일쇄-Fv (scFv)로 공지되어 있다. 선행 기술로부터 공지된 이러한 종류의 scFv-항체 단백질의 예는 문헌 [Huston et al. (1988, PNAS 16: 5879-5883)]에 기재되어 있다. 따라서, 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 CD44v6- 또는 CD44v9-특이적 항체 단백질은 단일쇄-Fv 단백질 (scFv)이다.
최근 수년간, scFv를 다량체 유도체로서 제조하기 위한 다양한 전략이 개발되었다. 이는 특히 개선된 약동학 및 생체분포 특성뿐만 아니라 증가된 결합력을 갖는 재조합 항체를 유도하는 것으로 의도된다. scFv의 다량체화를 달성하기 위해, scFv를 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로서 제조하였다. 다량체화 도메인은, 예를 들어 IgG 또는 코일드 코일 구조 (나선 구조)의 CH3 영역, 예컨대 류신-지퍼 도메인일 수 있다. 그러나, scFv의 VH/VL 영역 사이의 상호작용이 다량체화 (예를 들어 디-, 트리- 및 펜타바디)를 위해 사용되는 전략이 또한 존재한다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 단백질은 CD44v6- 또는 CD44v9-특이적 디아바디 항체 단편이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 디아바디는 2가 동종이량체 scFv 유도체를 의미한다 (Hu et al., 1996, PNAS 16: 5879-5883). scFv 분자 내 링커의 5-10개 아미노산으로의 단축은 쇄간 VH/NL- 중첩이 일어나는 동종이량체의 형성을 유도한다. 디아바디는 디술피드 가교의 혼입에 의해 추가적으로 안정화될 수 있다. 선행 기술로부터의 디아바디-항체 단백질의 예는 문헌 [Perisic et al. (1994, Structure 2: 1217-1226)]에서 찾을 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 미니바디는 2가 동종이량체 scFv 유도체를 의미한다. 이는 이뮤노글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 이량체화 영역으로서 함유하며, 이는 힌지 영역 (예를 들어 또한 IgG1로부터의 것) 및 링커 영역을 통해 scFv에 연결되는 융합 단백질로 이루어진다. 힌지 영역 내의 디술피드 가교는 대부분 고등 세포에서 형성되고 원핵생물에서는 형성되지 않는다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 단백질은 CD44v6-특이적 미니바디 항체 단편이다. 선행 기술로부터의 미니바디-항체 단백질의 예는 문헌 [Hu et al. (1996, Cancer Res. 56: 3055-61)]에서 찾을 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 트리아바디는 3가 동종삼량체 scFv 유도체를 의미한다 (Kortt et al. 1997 Protein Engineering 10: 423-433). VH-VL이 링커 서열 없이 직접 융합되는 scFv 유도체는 삼량체의 형성을 유도한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 2가, 3가 또는 4가 구조를 갖고 scFv로부터 유래된 소위 미니안티바디에 친숙할 것이다. 다량체화는 이량체, 삼량체 또는 사량체 코일드 코일 구조에 의해 수행된다 (Pack et al., 1993 Biotechnology II:, 1271-1277; Lovejoy et al. 1993 Science 259: 1288-1293; Pack et al., 1995 J. Mol. Biol. 246: 28-34).
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 단백질은 상기 언급된 항체 단편에 기초한 CD44v6- 또는 CD44v9-특이적 다량체화 분자이고, 예를 들어 트리아바디, 4가 미니안티바디 또는 펜타바디일 수 있다.
인간화 CD44v6- 또는 CD44v9-특이적 항체 단백질은 관련 기술분야에 공지된 분자 생물학 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 항체 단백질의 가변 영역은 전형적으로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것에 연결된다. 인간 불변 영역 DNA 서열은 다양한 인간 세포, 그러나 바람직하게는 불멸화 B 세포로부터 널리 공지된 절차에 따라 단리될 수 있다 (문헌 [Kabat et al. 상기 문헌] 및 WO 87/02671 참조). 따라서, 본 발명의 항체 단백질은 이들이 CD44v6 또는 CD44v9 항원에 대한 특이적 결합을 나타내는 한 불변 영역의 전부 또는 한 부분만을 함유할 수 있다. 불변 영역의 유형 및 정도의 선택은 보체 고정 또는 항체 의존성 세포 독성과 같은 이펙터 기능이 요구되는지 여부 및 항체 단백질의 목적하는 약리학적 특성에 좌우된다. 본 발명의 항체 단백질은 전형적으로 2개의 경쇄/중쇄 쌍으로 이루어진 사량체일 것이지만, 또한 이량체, 즉 1개의 경쇄/중쇄 쌍, 예를 들어 Fab 또는 Fv 단편으로 이루어진 이량체일 수 있다.
따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명은 인간 불변 영역에 각각 연결된 가변 경쇄 영역 및 가변 중쇄 영역을 갖는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 항체 단백질에 관한 것이다. 특히, 경쇄의 가변 영역을 인간 카파 불변 영역에 연결하고, 중쇄의 가변 영역을 인간 감마-1 불변 영역에 연결하였다. 경쇄 및 중쇄를 키메라화하기 위한 다른 인간 불변 영역도 또한 이용가능하다.
뮤린 항체의 가변 영역의 인간화는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. EP 0239400은 뮤린 가변 영역의 CDR을 인간 가변 영역의 프레임워크 내로 그라프팅하는 것을 개시한다. WO 90/07861은 추가의 프레임워크 변형을 도입함으로써 CDR-그라프팅된 가변 영역을 재성형하는 방법을 개시한다. WO 92/11018은 공여자 CDR을 공여자 프레임워크에 대해 높은 상동성을 갖는 수용자 프레임워크와 조합하는 인간화 Ig를 생산하는 방법을 개시한다. WO 92/05274는 뮤린 항체로부터 시작하는 프레임워크 돌연변이된 항체의 제조를 개시한다. 뮤린 모노클로날 항체의 인간화에 관련된 추가의 선행 기술 참고문헌은 EP 0368684; EP 0438310; WO 92/07075 또는 WO 92/22653이다. 모두 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 경쇄의 가변 영역 및 상기 중쇄 영역의 가변 영역 각각이 인간 불변 영역에 개별적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 항체 분자에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 경쇄의 상기 인간 경쇄 불변 영역이 인간 카파 불변 영역인, 본 발명에 따른 항체 분자에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 인간 중쇄 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역인, 본 발명에 따른 항체 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 항체 단백질은 치료제를 CD44v6 또는 CD44v9 항원에 표적화하기 위한 고도로 특이적인 도구를 제공한다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 항체-약물-접합체 (ADC)에서 임의로 링커를 통해 치료제에 접합된 본 발명에 따른 항체 단백질에 관한 것이다. 관련 기술분야에 공지된 많은 치료제 중에서, 방사성동위원소, 독소, 톡소이드, 염증생성 작용제, 효소, 안티센스 분자, 펩티드, 시토카인 및 화학요법제로 이루어진 군으로부터 선택된 치료제가 바람직하다. 방사성동위원소 중에서, 감마, 베타 및 알파-방출 방사성동위원소가 치료제로서 사용될 수 있다. β-방출 방사성동위원소가 치료 방사성동위원소로서 바람직하다. 186레늄, 188레늄, 131아이오딘 및 90이트륨이 악성 종양 세포의 국재화된 방사선조사 및 파괴를 달성하기 위해 특히 유용한 β-방출 동위원소인 것으로 입증되었다. 따라서, 186레늄, 188레늄, 131아이오딘 및 90이트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성동위원소가 본 발명의 항체 단백질에 접합된 치료제로서 특히 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 방사성아이오딘화를 위해, WO 93/05804에 개시된 바와 같은 방법이 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역접합체", "접합체" 또는 "ADC"는 세포 결합제 (즉, 항-CD44v6 또는 -CD44v9 항체 또는 그의 단편)에 연결되고 일반식: A-L-C (여기서 C = 세포독소, L = 링커 및 A = 세포 결합제 (CBA), 예컨대 항-CD44v6 또는 항-CD44v9 항체 또는 항체 단편)에 의해 정의되는 화합물 또는 그의 유도체를 지칭한다. 면역접합체는 또한 역순으로 일반식: C-L-A에 의해 정의될 수 있다.
"링커"는 화합물, 통상적으로 약물, 예컨대 본원에 기재된 세포독성제를 세포-결합제, 예컨대 항-CD44v6 또는 -CD44v9 항체 또는 그의 단편에 안정한 공유 방식으로 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티이다. 링커는 화합물 또는 항체가 활성인 상태로 유지되는 조건에서 산-유도된 절단, 광-유도된 절단, 펩티다제-유도된 절단, 에스테라제-유도된 절단 및 디술피드 결합 절단에 대해 감수성이거나 또는 실질적으로 그에 대해 저항성일 수 있다. 적합한 링커는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 디술피드 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광불안정성 기, 펩티다제 불안정성 기 및 에스테라제 불안정성 기를 포함한다. 링커는 또한 본원에 기재되고 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 하전된 링커 및 그의 친수성 형태를 포함한다.
용어 "암 세포", "종양 세포" 및 문법적 등가물은 대규모의 종양 세포 집단을 포함하는 비-종양발생 세포 및 종양발생 줄기 세포 (암 줄기 세포) 둘 다를 비롯한, 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 총 세포 집단을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "종양 세포"는 종양 세포를 암 줄기 세포와 구별되게 하는 재생 및 분화 능력이 결여된 종양 세포만을 지칭하는 경우에 "비-종양발생"이라는 용어로 변형될 것이다.
용어 "대상체"는 특정한 치료의 수용자가 되는 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 동물 (예를 들어, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체와 관련하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
1종 이상의 추가의 치료제와의 "조합" 투여는 동시 (공동) 투여 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다.
용어 "제약 제제"는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며 제제를 투여할 대상체에게 허용되는 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 멸균될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 면역접합체의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여 실험적으로 및 상용 방식으로 결정될 수 있다.
용어 "치료 유효량"은 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애의 "치료"에 효과적인 항체 또는 다른 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 약물의 치료 유효량은 암 세포 수를 감소시키고/거나; 종양 크기를 감소시키고/거나; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제하고/거나 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 특정 실시양태에서는 정지시킴); 종양 전이를 억제하고/거나 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 특정 실시양태에서는 정지시킴); 종양 성장을 어느 정도 억제하고/거나; 암과 연관된 증상 중 1종 이상을 어느 정도 경감시키고/거나; 유리한 반응, 예컨대 증가된 무진행 생존 (PFS), 무질환 생존 (DFS) 또는 전체 생존 (OS), 완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR), 또는 일부 경우에, 안정 질환 (SD), 진행성 질환 (PD)의 감소, 감소된 진행까지의 시간 (TTP), 또는 그의 임의의 조합을 유발할 수 있다. 본원의 정의 "치료하는"을 참조한다. 약물이 성장을 방지하고/거나 기존 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도로, 이는 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다.
"예방 유효량"은 목적하는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 반드시는 아니지만 전형적으로, 예방 용량은 질환의 초기 단계 전 또는 초기 단계에서 대상체에 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량 미만일 것이다.
"화학요법제"는 작용 메카니즘에 상관없이, 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. "치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키기 위한"과 같은 용어는 진단된 병리학적 상태 또는 장애의 증상을 치유하고/거나, 느리게 하고/거나, 경감시키고/거나, 그의 진행을 중지시키는 치료적 조치를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 자는 이미 장애를 갖는 것으로 진단된 자를 포함하고, 최소의 잔류 질환 또는 내성 질환 또는 재발성 질환을 갖는 자를 또한 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 환자가 하기 중 1개 이상을 나타내는 경우에, 대상체는 본 발명의 방법에 따라 암에 대해 성공적으로 "치료된다": 암 세포의 수 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 예를 들어 연부 조직 및 골 내로의 암의 확산을 비롯한 말초 기관 내로의 암 세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 전이의 억제 또는 부재; 종양 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 연관된 1종 이상의 증상의 경감; 감소된 이환율 및 사망률; 삶의 질의 개선; 종양의 종양발생성, 종양발생 빈도 또는 종양발생 능력의 감소; 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소; 종양발생 세포의 비-종양발생 상태로의 분화; 증가된 무진행 생존 (PFS), 무질환 생존 (DFS) 또는 전체 생존 (OS), 완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR), 안정 질환 (SD), 진행성 질환 (PD)의 감소, 감소된 진행까지의 시간 (TTP), 또는 그의 임의의 조합.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에는 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 1개 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 "캡" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대, 예를 들어 비하전된 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 모이어티, 예컨대, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것, 뿐만 아니라 비변형된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실 기는, 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호 기에 의해 보호될 수 있거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결을 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화될 수 있거나 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티 또는 아민으로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호 기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사한 형태, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, 알파-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결은 대안적 연결 기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR*, CO 또는 CH2 ("포름아세탈")에 의해 대체되고, 여기서 각각의 R 또는 R은 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬 (1-20 C)이고, 이는 에테르 (-O-) 연결, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬을 임의로 함유하는 것인 실시양태를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결은 동일한 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 포함한, 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
용어 "벡터"는 숙주 세포 내에 1개 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고 발현시킬 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 연관된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한 상기 정의에는, 예를 들어 1개 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함), 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기반으로 하기 때문에, 특정 실시양태에서, 폴리펩티드가 단일 쇄 또는 회합된 쇄로 발생할 수 있는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 펩티드 또는 단백질은 비-자연 발생이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 펩티드 또는 단백질은 다른 자연 발생 성분으로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 펩티드 또는 단백질은 재조합적으로 생산된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 임의의 보존적 아미노산 치환을 서열 동일성의 부분으로 간주하지 않으면서 최대 상응을 위해 (필요한 경우, 갭을 도입하여) 비교 및 정렬하는 경우에, 동일하거나 또는 명시된 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻는데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 서열 정렬 알고리즘의 하나의 이러한 비제한적 예는 문헌 [Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2264-2268, 1990]에 기재된 알고리즘이며, 이는 문헌 [Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873-5877, 1993]에서 변형되고, NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내로 혼입된다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1991). 특정 실시양태에서, 갭드(Gapped) BLAST가 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있으며; BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996), ALIGN, ALIGN-2 (제넨테크(Genentech), 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코) 또는 메그얼라인(Megalign) (DNASTAR)은 서열을 정렬하는데 사용될 수 있는 추가의 공개적으로 이용가능한 소프트웨어 프로그램이다. 특정 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어의 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다 (예를 들어, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 갭 가중치 40, 50, 60, 70 또는 90 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용함). 특정의 대안적 실시양태에서, 문헌 [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453, 1970)]의 알고리즘을 포함하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성을 결정할 수 있다 (예를 들어, 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5를 사용함). 대안적으로, 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 문헌 [Myers and Miller (CABIOS, 4:11-17, 1989)]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 예를 들어, 퍼센트 동일성은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 및 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 갖는 PAM120을 사용하여 결정될 수 있다. 특정한 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬에 대한 적절한 파라미터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 파라미터가 사용된다. 특정 실시양태에서, 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 백분율 동일성 "X"는 100 x (Y/Z)로 계산되며, 여기서 Y는 제1 및 제2 서열의 정렬 (육안 검사 또는 특정한 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨)에서 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Z는 제2 서열에서의 잔기의 총 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 길다면, 제2 서열에 대한 제1 서열의 퍼센트 동일성은 제1 서열에 대한 제2 서열의 퍼센트 동일성보다 더 길 것이다.
비제한적 예로서, 임의의 특정한 폴리뉴클레오티드가 참조 서열에 대해 특정 백분율 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 및 일부 실시양태에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성)을 갖는지 여부는, 특정 실시양태에서 베스트핏(Bestfit) 프로그램 (위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스(Unix)용 버전 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 53711 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크)을 사용하여 결정될 수 있다. 베스트핏은 문헌 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489, 1981]의 국부 상동성 알고리즘을 사용하여 두 서열 사이의 최고의 상동성 세그먼트를 찾는다. 특정한 서열이, 예를 들어 본 발명에 따른 참조 서열에 대해 95% 동일한지 여부를 결정하기 위해 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우에, 동일성 백분율이 참조 뉴클레오티드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고 참조 서열 내 뉴클레오티드의 총 수의 5% 이하의 상동성 차이가 허용되도록 파라미터가 설정된다.
일부 실시양태에서, 2개의 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 것은, 최대 상응을 위해 비교 및 정렬하는 경우에, 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 또는 육안 검사에 의한 측정시, 이들이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 일부 실시양태에서는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 동일성은 적어도 약 10, 약 20, 약 40-60개 잔기 길이 또는 그 사이의 임의의 정수 값인 서열 영역에 걸쳐, 또는 60-80개 잔기 보다 더 긴 영역, 적어도 약 90-100개 잔기에 걸쳐 존재하거나, 또는 서열은 예를 들어 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역과 같은 비교하는 서열의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 관련 기술분야에서 정의되었다. 예를 들어, 티로신을 페닐알라닌으로 치환하는 것은 보존적 치환이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체의 서열 내의 보존적 치환은 이러한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 항체가 항원(들), 즉 폴리펩티드 또는 항체가 결합하는 CD123/IL-3Rα에 결합하는 것을 제거하지 않는다. 항원-결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187, 1993; Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884, 1999; 및 Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417, 1997] 참조).
본 발명의 또 다른 측면은 치료제에 연결된 본 발명에 따른 항체 단백질을 제공하며, 여기서 상기 치료제는 방사성동위원소, 독소, 톡소이드, 전구약물 및 화학요법제로 이루어진 군으로부터 선택된 치료제이다.
특정 실시양태에서, 치료제는 항체 단백질에, MAG-3 (미국 특허 번호 5,082,930 A, EP 0247866 B1 (페이지 2 라인 55-56-페이지 3 라인 1-23)); MAG-2 GABA (미국 특허 번호 5,681,927 A, EP 0284071 B1 (페이지 6 라인 9-29)); 및 N2S2 ((=펜티오에이트) 미국 특허 번호 4,897,255 A, 5,242,679 A, EP 0188256 B1 (페이지 2, 라인 38-페이지 3, 라인 18)), (Ac)Phe-Lys(Alloc)-PABC-PNP, 6-말레이미도헥산산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 6-퀴녹살린카르복실산, 2,3-비스(브로모메틸)-Fmoc-Val-Cit-PAB, Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP, Mc-Val-Cit-PABC-PNP, Val-cit-PAB-OH (모두 본원에 참조로 포함됨)의 군으로부터 선택된 링커를 통해 연결된다.
특정 실시양태에서, 방사성동위원소는 186레늄, 188레늄, 131아이오딘 및 90이트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 단백질은 표지된다. 이러한 CD44v6- 또는 CD44v9-특이적 표지된 항체는 시험관내 및/또는 생체내에서 CD44v6 / CD44v9 항원의 국재화 및/또는 검출을 가능하게 한다.
표지는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능할 수 있는 마커로서 정의된다. 간접 마커는 그 자체로 검출될 수 없지만 간접 마커에 특이적인 추가의 직접적으로 검출가능한 마커를 필요로 하는 마커로서 정의된다. 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 표지는 검출가능한 마커이다. 매우 다양한 검출가능한 마커로부터, 검출가능한 마커는 효소, 염료, 방사성동위원소, 디곡시게닌 및 비오틴으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 표지는 검출가능한 마커, 예컨대 효소, 염료, 방사성동위원소, 디곡시게닌 및 비오틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 단백질은 영상화가능한 작용제에 접합된다. 매우 다양한 영상화가능한 작용제, 특히 방사성동위원소는 최신 기술로부터 이용가능하다. 특정 실시양태에서, 영상화가능한 작용제는 감마-방출 동위원소, 예컨대 125아이오딘이다. 특정 실시양태에서, 항체 단백질은 약 0.5 내지 약 15 mCi/mg, 또는 약 0.5 내지 약 14 mCi/mg, 또는 약 1 내지 약 10 mCi/mg, 또는 약 1 내지 약 5 mCi/mg, 및 약 2 내지 6 mCi/mg 또는 1 내지 3 mCi/mg의 비활성을 갖는다.
3. 조성물 및 제약 조성물
본 발명은 본원에 기재된 대상 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 면역-접합체 및 담체 (예를 들어, 제약상 허용되는 담체)를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)을 포함한다. 본 발명은 또한 대상 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 접합체 및 담체 (제약상 허용되는 담체)를 포함하고, 제2 치료제를 추가로 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)을 포함한다. 본 발명의 조성물은 혈액암, 백혈병 또는 림프종을 포함한, 포유동물 (예를 들어, 인간)에서의 비정상적 세포 성장을 억제하거나 증식성 장애를 치료하는데 유용하다.
특히, 본 발명은 본원에 기재된 CD44v6 또는 CD44v9-결합제 또는 그의 면역-접합체 중 1종 이상을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 비히클을 추가로 포함한다. 이들 제약 조성물은 혈액암, 백혈병 또는 림프종을 포함한, 인간 환자에서의 종양 성장을 억제하고 암을 치료하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 제제는 본 발명의 정제된 항체 또는 그의 면역-접합체를 제약상 허용되는 비히클 (예를 들어 담체, 부형제)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위해 제조된다 (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). 적합한 제약상 허용되는 비히클은 비독성 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 염, 예컨대 염화나트륨; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드 (예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 탄수화물, 예컨대 모노사카라이드, 디사카라이드, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
제약상 허용되는 담체는, 예를 들어 AMPA 글루타메이트 수용체 효능제, 길항제 또는 조정제의 흡수를 안정화시키거나 증가시키는 작용을 하는 생리학상 허용되는 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 생리학상 허용되는 화합물은, 예를 들어 탄수화물, 예컨대 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란, 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이트화제, 저분자량 단백질 또는 다른 안정화제 또는 부형제를 포함한다 (또한, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18th ed. Mack Publ., Easton] 참조). 관련 기술분야의 통상의 기술자는 생리학상 허용되는 화합물을 포함한 제약상 허용되는 담체의 선택이, 예를 들어 조성물의 투여 경로에 좌우된다는 것을 알 것이다.
적합한 제약상 허용되는 담체, 희석제 및 부형제는 일반적으로 널리 공지되어 있고, 임상 상황에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예는 (1) 약 1 mg/mL 내지 25 mg/mL 인간 혈청 알부민을 함유하거나 또는 함유하지 않는 둘베코 포스페이트 완충 염수, pH 약 7.4, (2) 0.9% 염수 (0.9% w/v NaCl), 및 (3) 5% (w/v) 덱스트로스를 포함하고; 또한 항산화제, 예컨대 트립타민 및 안정화제, 예컨대 트윈 20을 함유할 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물은 국부 또는 전신 치료를 위한 임의의 수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 (예컨대 질 및 직장 전달을 포함한 점막으로), 예컨대 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말; 폐 (예를 들어, 네뷸라이저에 의한 것을 포함한, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입에 의해; 기관내, 비강내, 표피 및 경피); 경구; 또는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입을 포함한 비경구; 또는 두개내 (예를 들어, 척수강내 또는 뇌실내) 투여일 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 투여는 정맥내 투여이다. 본원에 기재된 제약 조성물은 또한 시험관내 또는 생체외에서 사용될 수 있다.
동물 또는 인간 신체에서, 상기 기재된 바와 같은 제약 조성물을 정맥내 또는 다른 경로를 통해, 예를 들어 전신으로, 국부로 또는 국소로 관심 조직 또는 기관에, 치료되는 질환 또는 문제, 예를 들어 종양의 유형 및 기원에 따라 적용하는 것이 유리한 것으로 입증될 수 있다. 예를 들어, 전신 작용 방식은 상이한 기관 또는 기관계가 치료를 필요로 하는 경우, 예를 들어 전신 자가면역 질환, 또는 알레르기, 또는 외래 기관 또는 조직의 이식, 또는 미만성이거나 국재화하기 어려운 종양에서 요구된다. 국부 작용 방식은, 예를 들어 국부 종양과 같이 신생물성 또는 면역학적 작용의 국부 징후만이 예상되는 경우에 고려될 것이다.
본 발명의 항체 단백질을 포함하는 제약 조성물은 전문가에게 공지된 상이한 적용 경로, 특히 정맥내 주사 또는 표적 조직 내로의 직접 주사에 의해 적용될 수 있다. 전신 적용을 위해, 정맥내, 혈관내, 근육내, 동맥내, 복강내, 경구 또는 척수강내 경로가 바람직하다. 보다 많은 국부 적용은 피하로, 피내로, 심장내로, 폐엽내로, 수질내로, 폐내로 또는 치료될 조직 (결합-, 뼈-, 근육-, 신경-, 상피 조직) 내에 또는 그 근처에 직접적으로 수행될 수 있다. 목적하는 치료 지속기간 및 유효성에 따라, 제약 항체 조성물은 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로, 예를 들어 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 기준으로 및 상이한 투여량으로 투여될 수 있다.
상기 기재된 적용을 위한 항체 제제를 포함하는 적합한 제약 조성물을 제조하기 위해, 공지된 주사가능한 생리학상 허용되는 멸균 용액을 사용할 수 있다. 비경구 주사 또는 주입을 위한 즉시 사용 용액을 제조하기 위해, 수성 등장성 용액, 예컨대, 예를 들어 염수 또는 상응하는 혈장 단백질 용액이 용이하게 이용가능하다. 제약 조성물은 동결건조물 또는 건조 제제로서 제공될 수 있고, 이는, 예를 들어 부분들의 키트로서, 멸균 조건 하에 사용 직전 공지된 주사가능한 용액으로 재구성될 수 있다. 본 발명의 항체 조성물의 최종 제제는 본 발명에 따른 정제된 항체를 멸균 생리학상 허용되는 용액과 혼합함으로써 주사, 주입 또는 관류용으로 제조되며, 이는 공지된 담체 물질 또는/및 첨가제 (예를 들어 혈청 알부민, 덱스트로스, 중아황산나트륨, EDTA)로 보충될 수 있다.
적용되는 항체의 양은 질환의 성질에 좌우된다. 암 환자에서, 본 발명에 따른 제약 조성물에 포함된 "네이키드" 항체의 적용 용량은 적용당 0.1 내지 100 mg/m2, 5 내지 50 mg/m2, 10 mg/m2 내지 약 40 mg/m2, 10 mg/m2 내지 약 30 mg/m2, 또한 20 mg/m2 내지 약 30 mg/2, 및 약 25 mg/m2 체표면적일 수 있다. 또한, 약 50 mg/m2 체표면적의 항체 단백질 용량이 사용될 수 있다.
투여당 환자에게 적용되는 방사능의 용량은 효과적이기에 충분히 높아야 하지만, 용량 제한 독성 (DLT) 미만이어야 한다. 예를 들어 186레늄으로 방사성표지된 항체를 포함하는 제약 조성물의 경우, 치료 환경에서 초과되지 않아야 하는 최대 허용 용량 (MTD)이 결정되어야 한다. 이어서 암 환자에 대한 방사성표지된 항체의 적용은 MTD 미만인 용량의 반복 (매월 또는 매주) 정맥내 주입에 의해 수행될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Welt et al. (1994) J. Clin. Oncol. 12: 1193-1203] 참조). 다중 투여는 일반적으로 매주 간격으로의 투여가 바람직하지만; 그러나, 방사성표지된 물질은 보다 긴 간격으로, 즉 4-24주 간격, 바람직하게는 12-20주 간격으로 투여되어야 한다. 그러나, 통상의 기술자는 투여를 2회 이상의 적용으로 분할하는 것을 선택할 수 있으며, 이는 서로 직후에 또는 예를 들어 1일 내지 1주 범위의 일부 다른 미리 결정된 간격으로 적용될 수 있다.
또한, 적용된 방사능 용량은 하기 약술된 가이드라인에 따를 것이다. 일반적으로, 투여당 방사능 용량은 30 내지 75 mCi/m2/체표면적 (BSA)일 것이다. 따라서, 환자에게 적용될 본 발명에 따른 제약 조성물 중, 186레늄, 188레늄, 99m테크네튬, 133아이오딘 또는 90이트륨으로 표지된, 바람직하게는 186레늄으로 표지된 방사성표지된 항체의 양은 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 mCi/m2, 바람직하게는 50 mCi/m2이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 방사성표지된 항체의 용량이 MTD 50 mCi/m2인 제약 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 조성물은 아스코르브산, 겐티스산, 리덕트산, 에리소르브산, p-아미노벤조산, 4-히드록시벤조산, 니코틴산, 니코틴아미드, 2,5-디히드록시-1,4-벤젠디술폰산, 포비돈, 이노시톨 및/또는 시트레이트의 군으로부터 선택된 1종 이상의 방사성보호제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방사성보호제는 아스코르브산이다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 제약 조합 제제 또는 조합 요법으로서의 투여 요법에서 제2 화합물, 예컨대 관심 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 것으로 공지된 것과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 화합물은 항암제이다. 일부 실시양태에서, 방법은 면역접합체 단독의 투여와 비교하여 보다 우수한 효능을 생성하는 제2 화합물과 본 발명의 면역접합체의 투여를 포괄한다. 제2 화합물은, 예를 들어 국소, 폐, 경구, 비경구 또는 두개내 투여를 포함한 임의의 수의 방식을 통해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 경구 투여이다. 일부 실시양태에서, 투여는 정맥내 투여이다. 일부 실시양태에서, 투여는 경구 및 정맥내 투여 둘 다이다.
항체 또는 면역접합체는 또한 제약 조합 제제 또는 조합 요법으로서의 투여 요법에서 진통제 또는 다른 의약과 조합될 수 있다.
항체 또는 면역접합체는 제약 조합 제제 또는 조합 요법으로서의 투여 요법에서 항암 특성을 갖는 제2 화합물과 조합될 수 있다. 제약 조합 제제 또는 투여 요법의 제2 화합물은 조합의 ADC에 대해, 이들이 서로 불리한 영향을 미치지 않도록 하는 상보적 활성을 가질 수 있다. CD44v6- 또는 CD44v9-결합제 및 제2 항암제를 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 치료 유효량의 대상 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본원에 기재된 면역-접합체 또는 그의 조성물은, 단독으로 또는 제2 치료제와 조합되어, 정상 조혈 줄기 세포 (HSC)보다 백혈병성 줄기 세포 (LSC), 백혈병 전구세포 (LP) 및/또는 백혈병성 모세포의 증식을 우선적으로 억제한다. 특정 실시양태에서, 백혈병성 줄기 세포 (LSC), 백혈병 전구세포 (LP) 및/또는 백혈병성 모세포의 증식을 억제하는 상기 대상 작용제의 IC50값 또는 반수 최대 농도는, 정상 조혈 줄기 세포 (HSC)에 대한 것보다 적어도 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 100-, 150-, 300-, 500-배 또는 그 초과 배수 더 낮다.
4. 치료 방법
본 발명은 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 치료 유효량의 대상 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본원에 기재된 면역-접합체 또는 그의 조성물을 단독으로 또는 제2 치료제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 비정상적 세포 성장을 억제하거나 또는 증식성 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 암 치료용 의약의 제조에서의 본 발명에 따른 항체 단백질의 용도이다. 본 발명의 또 다른 측면은 암의 치료를 위한 상기 기재된 바와 같은 치료제에 접합된 본 발명에 따른 항체 단백질의 용도에 관한 것이다. 암은 악성 성장과 연관된 임의의 질환, 예컨대 고형 종양, 육종 및 백혈병을 포함한다. 이러한 질환에 대한 필요한 전제조건은 CD44v6 또는 CD44v9의 발현이다.
본 발명은 또한 표적 세포 또는 표적 세포를 함유하는 조직을 유효량의 대상 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본 발명의 면역-접합체와 접촉시키는 것을 포함하는, 선택된 세포 집단에서 세포 사멸을 유도하는 방법을 제공한다. 표적 세포는 접합체의 세포-결합제가 결합할 수 있는 세포이다.
선택된 세포 집단에서 세포 사멸을 유도하고/거나, 세포 성장을 억제하고/거나, 암을 치료하기 위한 본 발명의 방법은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 실시될 수 있다. 임상 생체내 사용을 위해, 본 발명의 세포독성 화합물 또는 접합체는 용액 또는 동결건조 분말로서 공급될 것이며, 멸균성 및 내독소 수준에 대해 시험된다.
특정 실시양태에서, 포유동물에서의 비정상적 세포 성장 또는 증식성 장애는 CD44v6 또는 CD44v9의 발현과 연관되거나 이를 특징으로 하는 질환 또는 상태, 예컨대 암이다.
예를 들어, 암은 유방, 폐, 간, 결장직장, 두경부, 식도, 췌장, 난소, 방광, 위, 피부, 자궁내막, 난소, 고환, 식도, 전립선 및 신장 기원을 포함한 상피 암종; 골육종, 연골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종 (MFH) 및 평활근육종을 포함한 골 및 연부-조직 육종; 림프종 및 백혈병을 포함한 조혈 악성종양; 말초 신경 종양, 성상세포종 및 흑색종을 포함한 신경외배엽 종양, 및 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 암은 또한 1) 유방, 폐, 간, 결장직장, 두경부, 식도, 췌장, 난소, 방광, 위, 피부, 자궁내막, 난소, 고환, 식도, 전립선 및 신장 기원을 포함한 상피 암종; 2) 골 및 연부-조직 육종: 골육종, 연골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종 (MFH), 평활근육종; 3) 조혈 악성종양: 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 백혈병; 4) 신경외배엽 종양: 말초 신경 종양, 성상세포종, 흑색종; 5) 중피종을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
고형 종양과 연관된 암성 질환 상태의 예는 결장직장암, 비소세포 폐암, 유방암, 두경부암, 난소암, 폐암, 방광암, 췌장암 및 뇌의 전이성 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 암은 적어도 1종의 음성 예후 인자를 갖는다.
본 발명의 또 다른 측면은 암 치료용 의약의 제조에서의 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 항체 단백질의 용도에 관한 것이며, 여기서 적용당 항체 단백질의 양은 0.1 내지 100 mg/m2, 5 내지 50 mg/m2, 10 mg/m2 내지 약 40 mg/m2, 10 mg/m2 내지 약 30 mg/m2, 또는 20 mg/m2 내지 약 30 mg/m2, 또는 약 25 mg/m2 체표면적, 또는 약 50 mg/m2 체표면적이다.
특정 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 방사성동위원소에 접합된 항체 단백질이 암 치료용 의약의 제조에 사용되며, 여기서 투여당 방사능 용량은 30 내지 75 mCi/m2 체표면적 (BSA)이다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 단백질은 186레늄, 188레늄, 99m테크네튬, 131아이오딘 또는 90이트륨, 예컨대 186레늄으로 방사성표지된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 암 치료용 의약의 제조에서의 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 방사성동위원소에 접합된 항체 단백질의 용도에 관한 것이며, 여기서 항체 용량은 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 mCi/m2, 또는 50 mCi/m2이다.
특정 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 방사성동위원소에 접합된 항체 단백질이 암 치료용 의약의 제조에 사용되며, 여기서 항체 단백질은 약 0.5 내지 약 15 mCi/mg, 또는 약 0.5 내지 약 14 mCi/mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 10 mCi/mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 5 mCi/mg, 및 가장 바람직하게는 2 내지 6 mCi/mg 또는 1 내지 3 mCi/mg의 비활성을 갖는다.
또한, 암 치료용 의약의 제조에서의 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 방사성동위원소에 접합된 항체 단백질의 용도이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 유도체는 약 7 내지 약 8의 pH 및 약 0.5 내지 약 2.0 mg/ml의 농도의 수용액으로 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명은 추가로 암 치료를 필요로 하는 개체에게 본 발명에 따른 항체 단백질을 1회 내지 수회 투여하여, 상기 항체 단백질이 CD44v6 또는 CD44v9에 선택적으로 결합하고, 항체 단백질에 연결된 치료제를 통해 종양 세포를 파괴하고, 치료적 성공을 모니터링하는 암 치료 방법에 관한 것이다. 상기 항체 단백질은 네이키드/비변형된 항체 단백질, 변형된 항체 단백질, 예컨대 예를 들어 융합 단백질 또는 치료제에 접합된 항체 단백질로서 존재할 수 있으며, 종양을 유효량의 상기 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 기재된 바와 같은 종양의 치료 방법은 시험관내 또는 생체내에서 효과적일 수 있다. 암은 상기 기재된 바와 같은 임의의 암이다.
암 요법 및 그의 투여량, 투여 경로 및 권장 용법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, [Physician's Desk Reference (PDR)]과 같은 문헌에 기재되었다. PDR은 다양한 암의 치료에 사용된 작용제의 투여량을 개시한다. 치료상 유효한 이들 상기 언급된 화학요법 약물의 투여 요법 및 투여량은 치료될 특정한 암, 질환의 정도 및 관련 기술분야의 의사에게 친숙한 다른 인자에 좌우될 것이고, 의사에 의해 결정될 수 있다. PDR의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 명백히 포함된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있는 화학요법제 및 접합체의 투여 요법 및 투여량을 결정하기 위해 하기 파라미터 중 1개 이상을 사용하여 PDR을 검토할 수 있다. 이들 파라미터는 다음을 포함한다: 포괄적 지수; 제조업체; 제품 (회사명 또는 약물 상표명); 카테고리 지수; 일반/화학 지수 (비-상표 일반 약물 명칭); 의약의 색 영상; FDA 표지와 일치하는 제품 정보; 화학 정보; 기능/작용; 적응증 & 금기; 시험 연구, 부작용, 경고.
적용되는 항체의 양은 질환의 성질에 좌우된다. 암 환자에서, "네이키드" 항체의 적용 용량은 적용당 0.1 내지 100 mg/m2, 5 내지 50 mg/m2, 10 mg/m2 내지 약 40 mg/m2, 10 mg/m2 내지 약 30 mg/m, 또한 20 mg/m2 내지 약 30 mg/m2, 및 약 25 mg/m2 체표면적, 또는 약 50 mg/m2 체표면적일 수 있다.
투여당 환자에게 적용되는 방사능의 용량은 효과적이기에 충분히 높아야 하지만, 용량 제한 독성 (DLT) 미만이어야 한다. 예를 들어 186레늄으로 방사성표지된 항체의 경우, 치료 환경에서 초과되지 않아야 하는 최대 허용 용량 (MTD)이 결정되어야 한다. 이어서 암 환자에 대한 방사성표지된 항체의 적용은 MTD 미만인 용량의 반복 (매월 또는 매주) 정맥내 주입에 의해 수행될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Welt et al. (1994) J. Clin. Oncol. 12: 1193-1203] 참조). 다중 투여는 일반적으로 매주 간격으로의 투여가 바람직하지만; 그러나, 방사성표지된 물질은 보다 긴 간격으로, 즉 4-24주 간격 또는 12-20주 간격으로 투여되어야 한다. 그러나, 통상의 기술자는 투여를 2회 이상의 적용으로 분할하는 것을 선택할 수 있으며, 이는 서로 직후에 또는 예를 들어 1일 내지 1주 범위의 일부 다른 미리 결정된 간격으로 적용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 암 치료 방법 (상기 참조)이 제공되며, 여기서 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 방사성동위원소에 접합된 항체 단백질은 약 0.5 내지 약 15 mCi/mg, 또는 약 0.5 내지 약 14 mCi/mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 10 mCi/mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 5 mCi/mg, 및 가장 바람직하게는 2 내지 6 mCi/mg 또는 1 내지 3 mCi/mg의 비활성을 갖는다.
또한, 본 발명에 따른 암 치료 방법 (상기 참조)이 제공되며, 여기서 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 방사성동위원소에 접합된 항체 단백질은 약 7 내지 약 8의 pH 및 약 0.5 내지 약 2.0 mg/ml의 농도의 수용액으로 존재한다.
특정 실시양태에서, 암은 결장직장암, 비소세포 폐암, 유방암, 두경부암, 난소암, 폐암, 방광암, 췌장암 또는 뇌의 전이성 암이다.
본 발명의 방법은 또한 세포, 예컨대 암 세포를 사멸시키는 시험관내 방법을 제공한다. 시험관내 사용의 예는, 이환 또는 악성 세포를 사멸시키기 위한 동일한 환자 내로의 이식 전 자가 골수의 처리; 적격 T 세포를 사멸시키고 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)을 예방하기 위한 이식 전 골수의 처리; 표적 항원을 발현하지 않는 목적하는 변이체를 제외한 모든 세포를 사멸시키기 위한 또는 목적하지 않는 항원을 발현하는 변이체를 사멸시키기 위한 세포 배양물의 처리를 포함한다.
비-임상 시험관내 사용의 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다.
임상 생체외 사용의 예는, 암 치료 또는 자가면역 질환의 치료에서 자가 이식 전 골수로부터 종양 세포 또는 림프성 세포를 제거하거나, 또는 GVHD를 예방하기 위해 이식 전 자가 또는 동종 골수 또는 조직으로부터 T 세포 및 다른 림프성 세포를 제거하는 것이다. 처리는 하기와 같이 수행될 수 있다. 골수를 환자 또는 다른 개체로부터 수거한 다음, 약 10 μM 내지 1 pM 범위의 농도로 본 발명의 세포독성제가 첨가된 혈청 함유 배지에서 약 37℃에서 약 30분 내지 약 48시간 동안 인큐베이션한다. 농도 및 인큐베이션 시간의 정확한 조건, 즉 용량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다. 인큐베이션 후, 골수 세포를 혈청 함유 배지로 세척하고, 공지된 방법에 따라 환자에게 정맥내로 다시 투여한다. 환자가 골수의 수거 시점과 처리된 세포의 재관류 사이에 다른 치료, 예컨대 절제 화학요법 또는 전신 방사선조사 과정을 받는 상황에서, 처리된 골수 세포는 표준 의료 장비를 사용하여 액체 질소 중에 동결 저장된다.
5. 핵산
본 발명의 추가 측면은 본 발명에 따른 항체 또는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산이다. 상기 핵산은 RNA 또는 바람직하게는 DNA일 수 있다. 상기 DNA 분자는 화학적으로 합성될 수 있다. 먼저, 적합한 올리고뉴클레오티드를 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 합성할 수 있고 (예를 들어 문헌 [Gait, M. J., 1984, Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach. IRL Press, Oxford, UK]), 이를 사용하여 합성 유전자를 생산할 수 있다. 합성 유전자를 생성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Stemmer et al. 1995, Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides, Gene 164(1): 49-53; Ye et al. 1992, Gene synthesis and expression in E. coli for pump, a human matrix metalloproteinase, Biochem Biophys Res Commun 186(1):143-9; Hayden et Mandecki 1988, Gene synthesis by serial cloning of oligonucleotides, DNA 7(8): 571-7]). 이들 방법을 사용하여 본 출원에 개시된 임의의 DNA 분자를 합성할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산은 5' 또는 3' 또는 5' 및 3' 비번역 영역을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 상류 및/또는 하류에 다른 비번역 영역을 함유할 수 있다. 비번역 영역은 조절 요소, 예컨대 예를 들어 전사 개시 단위 (프로모터) 또는 인핸서를 함유할 수 있다. 상기 프로모터는, 예를 들어 구성적, 유도성 또는 발생-제어된 프로모터일 수 있다. 특정 실시양태에서, 다른 공지된 프로모터, 인간 시토메갈로바이러스 (CMV) 및 라우스 육종 바이러스 (RSV)의 구성적 프로모터, 뿐만 아니라 원숭이 바이러스 40 (SV40) 및 단순 헤르페스 프로모터를 배제하지 않는다. 본 발명에 따른 유도성 프로모터는 항생제-내성 프로모터, 열-쇼크 프로모터, 호르몬-유도성 "유방 종양 바이러스 프로모터" 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다. 본 발명에 따른 핵산은 본 발명에 따른 항체 단백질의 단편을 코딩할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 일부를 지칭한다.
6. 벡터
본 발명의 또 다른 중요한 측면은 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 벡터이다. 예는 바이러스 벡터, 예컨대 예를 들어 백시니아, 셈리키-포스트-바이러스 및 아데노바이러스이다. COS-세포에서 사용하기 위한 벡터는 SV40 복제 기점을 갖고, 플라스미드의 높은 카피수를 달성하는 것을 가능하게 한다. 곤충 세포에서 사용하기 위한 벡터는, 예를 들어 이. 콜라이 전달 벡터이고, 예를 들어 프로모터로서 폴리헤드린을 코딩하는 DNA를 함유한다.
본 발명의 또 다른 측면은 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 재조합 DNA 벡터이다.
본 발명의 또 다른 측면은 벡터 pAD-CMV 또는 그의 기능적 유도체인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 재조합 DNA 벡터이다. 이러한 유도체는, 예를 들어 pAD-CMV1, pAD-CMV19 또는 pAD-CMV25이다.
벡터는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미국 특허 번호 5,648,267 A 또는 5,733,779 A에 개시된 것일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면은 벡터 N5KG1Val 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 재조합 DNA 벡터이다.
7. 세포 또는 숙주 세포
또 다른 측면은 본 발명에 따른 벡터를 함유하는 것을 특징으로 하는 숙주이다.
또 다른 측면은 진핵 숙주 세포인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 숙주이다. 본 발명에 따른 진핵 숙주 세포는 진균, 예컨대 예를 들어 피키아 파스토리스, 사카로미세스 세레비지아에, 쉬조사카로미세스, 트리코더마, 곤충 세포 (예를 들어 스포도프테라 프루기페르다로부터의 Sf-9 세포, 바큘로바이러스 발현 시스템을 갖는 세포), 식물 세포, 예를 들어 니코티아나 타바쿰으로부터의 세포, 포유동물 세포, 예를 들어 COS 세포, BHK, CHO 또는 골수종 세포를 포함한다.
체내에서도 항체 단백질이 형성되는 면역계의 세포의 후손에서, 본 발명에 따른 항체 단백질은 특히 잘 폴딩되고 글리코실화된다. 포유동물 숙주 세포, 바람직하게는 CHO 또는 COS 세포, 예를 들어 CHO DG44 (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77(7): 4216-20 (1980)) 또는 CHO-K1 (ATCC CCL-61) 세포가 바람직하다. 따라서, 또 다른 측면은 BHK, CHO 또는 COS 세포이고, 가장 바람직하게는 CHO DG44 또는 CHO-K1 (ATCC CCL-61) 세포인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 숙주이다.
특정 실시양태에서, 숙주는 박테리오파지이다.
특정 실시양태에서, 숙주는 원핵 숙주 세포이다. 원핵 숙주 세포의 예는 에스케리키아 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 스트렙토미세스 또는 프로테우스 미라빌리스이다.
본 발명은 추가로 하기 단계: 본 발명에 따른 숙주를 상기 항체 단백질이 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 조건 하에 배양하는 단계 및 상기 항체 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 항체 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항체는 하기와 같이 생산될 수 있다. 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 표준 방법에 의해 화학적으로 및 효소적으로 합성할 수 있다. 먼저, 적합한 올리고뉴클레오티드를 관련 기술분야에 공지된 방법으로 합성할 수 있다 (상기 상세설명). 올리고뉴클레오티드로부터 합성 유전자를 생성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (상기 상세설명). 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 이들 핵산 분자를 발현 벡터 (두 쇄가 하나의 벡터 분자 내에 있거나 또는 각각의 쇄가 개별 벡터 분자 내에 있음) 내로 클로닝할 수 있고, 이어서 이를 숙주 세포 내로 도입한다. 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포 (상기 상세설명), 예를 들어 COS, CHO (차이니즈 햄스터 난소), 또는 BHK 세포일 수 있다. 이어서 숙주 세포를 항체가 생산되는 조건 하에 적합한 배양 배지에서 배양한 다음, 항체를 표준 절차에 따라 배양물로부터 단리한다. 숙주 세포에서 재조합 DNA로부터 항체를 생산하는 절차 및 각각의 발현 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어 WO 94/11523, WO 97/9351, EP 0481790 참조).
본 발명은 또한 숙주가 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 또는 COS 세포인 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 경쇄 또는 중쇄에 대한 발현 단위를 보유하는 2개의 플라스미드로 공동-형질감염된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하는 역할을 하지만; 본원에 개시된 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1 항-CD44v6 모노클로날 항체 mAb119 및 항-CD44v9 모노클로날 항체 mAb116의 살아있는-세포 Mab어레이 단리
도 1a에 제시된 바와 같이, 약 6 x 104개의 상이한 모노클로날 항체 (mAb)를 어레이젯 프린터를 사용하여 4개의 유리 알데히드 칩 (75x25mm) 상에 인쇄하여 Mab어레이를 생성하였다. 이어서 Mab어레이 칩을 10% BSA로 밤새 차단한 후에 실험을 수행하였다. 폐암 세포주 PC9 세포를 녹색 형광 핵산 염색제 SYTO14 (써모피셔 사이언티픽)로 표지하고, 1시간 동안 PBS 중 1 x 107개 세포/mL의 밀도로 칩과 함께 인큐베이션하였다. 이어서 Mab어레이 칩을 PBS로 부드럽게 세척하고, 진픽스 스캐너로 스캐닝하였다.
도 1b는 4개의 독립적인 PC9 살아있는 세포 Mab어레이 실험에서의 mAb119 및 대조군 mAb의 영상을 보여준다. 살아있는 PC9 세포를 Mab어레이 칩 상에서 mAb119에 의해 포획하였다.
실시예 2 mAb119 항원은 PC9 세포의 표면 상에서 발현되고, PC9 세포에 의해 내재화된다
도 2는 PC9 세포에 대한 mAb119의 FACS 분석의 결과를 보여준다. PC9 세포를 얼음 상에서 30분 동안 mAb119의 연속 희석물 (30000 pM 내지 0.1 pM, 3배 연속 희석물)과 함께 인큐베이션함으로써 mAb119의 PC9 FACS 적정을 수행한 후에, 세포를 30분 동안 알렉사488-접합된 항-마우스 IgG (잭슨 랩)로 염색하였다. BD C6을 사용하여 MFI를 분석하였다. 친화도 KD는 약 2 nM인 것으로 결정되었다.
도 3은 PC9 세포가 결합된 mAb119를 내재화하였다는 것을 보여준다. 살아있는 PC 세포를 커버슬립 상에서 배양하고, 얼음 상에서 1시간 동안 10 μg/mL mAb119와 함께 인큐베이션한 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서 세포를 37℃에서 0시간, 2시간 또는 4시간 동안 배양한 후에, 4% PFA로 고정한 후에, FACS에 의해 FITC 접합된 2차 항체로 검출하였다. 이어서 PC9 세포를 mAb119 (녹색 형광 염료 알렉사488에 의해 표지됨) 및 항-LAMP1 (적색 형광 염료 알렉사595에 의해 표지됨)에 의해 공동-염색하였다. 구체적으로, PC9 세포를 0.1% 트리톤 X로 투과시키고, mAb119 및 토끼 항-LAMP1 항체 (1:200, 압캠) 및 mAb119와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 항체를 각각 알렉사488 접합된 항-마우스 항체 및 알렉사595 접합된 항-토끼 항체로 표지하였다. 리소솜-회합 막 단백질 1 (LAMP1)은 주로 리소솜 막을 가로질러 발현되는 당단백질이다. mAb119 및 항-LAMP1의 공동국재화 신호는 황색 신호를 생성하며, 이는 PC9 세포에 의한 mAb119의 리소솜 구획으로의 내재화를 나타낸다. mAb119는 0시간에 LAMP1과의 임의의 공동-국재화 없이 세포 표면 상에서 처음 관찰되었다. mAb119 및 LAMP1의 공동국재화는 2시간 및 4시간에 관찰되었다.
표면 형광에 기초한 FACS 분석은 PC9 세포 상에서의 mAb119 내재화를 보여준다 (데이터는 제시되지 않음). 구체적으로, 살아있는 PC9 세포를 얼음 상에서 0.5시간 동안 10 μg/mL mAb119와 함께 인큐베이션한 후에, PBS로 3회 세척하였다. 이어서 세포를 37℃에서 0시간, 2시간 또는 4시간 동안 배양한 후에, 4% PFA로 고정시켰다. 이어서 세포를 알렉사488 접합된 항-마우스 항체로 염색하고, 표면 MFI를 계산함으로써 FACS로 분석하였다. mAb119의 표면 국재화를 나타내는 표면 MFI는 37℃에서 2시간 및 4시간 인큐베이션한 후에 각각 70% 및 80%만큼 감소하였다. PC9 세포에서의 평균 퍼센트 내재화 ± SEM (n = 3)으로서 표현된 FACS 데이터의 정량화가 제시된다. 수직축은 상대 표면 형광 (%)을 나타낸다. 데이터는 mAb119가 막 항원에 결합할 수 있고 PC9 세포에 내재화될 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 3 mAb119의 간접적 세포독성은 항원 발현-의존성이다
도 4는 mAb119의 간접적 세포독성이 항원 발현-의존성이라는 것을 보여준다. PC9 또는 TE1 세포를 96-웰 플레이트에서 2000개 세포 / 웰의 전면생장률로 밤새 배양하였다. 72시간 동안 2 μg/mL MMAE-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체와 함께 mAb119의 연속 희석물로 세포를 처리하였다. 이어서 CCK8 (도진도)에 의해 세포 수를 계산하였다. TE1 및 PC9 세포에서 상이한 세포독성이 관찰되었다. 항체 칵테일은 PC9 성장을 18 pM의 IC50으로 억제한 반면, 동일한 항체 칵테일은 TE1 세포 성장을 억제하지 않았다. 평균 퍼센트 성장 억제 ± SEM (n = 3)으로서 표현된, TE1 및 PC9 세포로부터 유도된 대표적인 데이터가 제시된다.
2종의 세포주에서의 mAb119 항원의 발현을 또한 FACS에 의해 결정하였다. 측면 삽입 패널은 mAb119에 의해 표지된 TE1 (상부 패널) 및 PC9 (하부 패널)의 FACS 분석을 보여준다. 결과는 PC9 세포가 mAb119 항원을 발현하지만 TE1 세포는 그렇지 않다는 것을 시사한다. 따라서 간접적 세포독성은 항원 발현과 양의 상관관계가 있었다.
실시예 4 mAb119는 인간 CD44 v6 엑손을 표적화한다
도 5a 및 5b는 mAb119가 인간 CD44 v6 엑손을 표적화한다는 것을 보여준다. 48시간 동안 인간 CD44 v6 에피토프를 표적화하는 4종의 상이한 siRNA의 혼합물 또는 대조군 siRNA로 PC9를 형질감염시켰다. 이어서 형질감염된 세포를 mAb119로 염색하고 FACS에 의해 분석하거나, 또는 총 단백질을 추출하고 mAb119 항원의 존재비를 웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다. CD44v6의 녹다운은 FACS에서 mAb119 표면 염색 강도를 감소시켰다 (도 5a, CD44v6 siRNA (V6.si)가 mAb119의 표면 신호를 억제한다는 것을 보여주는 FACS 데이터 (n=3을 나타냄)). CD44v6의 녹다운은 또한 mAb119 항원의 단백질 발현 수준을 감소시켰다 (도 5b, CD44v6 siRNA (V6.si)가 mAb119 항원의 단백질 발현을 억제한다는 것을 보여주는 웨스턴 블롯팅 데이터 (n=3을 나타냄)). 데이터는 mAb119가 CD44v6을 표적화한다는 것을 시사한다.
항원-결합 모이어티로서 mAb119를 사용하여 항체-약물-접합체를 제조하였다. 도 6a는 mAb119가 MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 mAb119-ADC (AMT119)의 구조의 개략도를 보여준다. AMT119의 HPLC-HIC (소수성 상호작용 크로마토그래피)는 평균 약물-항체 비 (DAR)가 약 6이었다는 것을 나타낸다 (도 6b).
도 7은 PC9 및 TE1 세포에서의 AMT119의 세포독성을 보여준다. 그래프는 AMT119의 평균 퍼센트 성장 억제 ± SEM (n = 3)을 나타내는, PC9 및 TE1 세포로부터 유도된 대표적인 데이터이다. IC50 값은 PC9 및 TE1 세포에서 각각 2,600 pM 및 39,000 pM이었다. 차이는 2종의 세포주에서의 CD44v6의 상이한 발현 수준과 일치하였다 (도 4 참조).
실시예 5 인간 비소세포 폐암에서의 CD44v6의 발현
도 8a 및 8b는 인간 비소세포 폐암 (NSCLC, 도 8a의 우측 패널) 및 정상 폐 조직 (도 8a의 좌측 패널)에서의 CD44v6의 발현을 보여준다. mAb119 항체를 사용하는 CD44v6 단백질의 IHC (면역조직화학) 검출이 일련의 정상 및 암 조직으로부터 제시되어 있으며, 이는 CD44v6이 종양-특이적 방식으로 상향조절되었음을 보여준다. 현미경사진 영상은 0, 1+, 2+ 및 3+ 염색 강도를 나타내는 종양 조직을 도시한다 (도 8a의 우측 패널). 도 8b는 NSCLC의 상이한 하위유형에서의 CD44v6의 유병률을 보여준다. SCC, 편평 세포 암종; LCC, 대세포 암종.
실시예 6 mAb116 항원은 PC9 세포의 표면 상에서 발현되고, PC9 세포에 의해 내재화된다
도 9는 PC9 세포에 대한 mAb116의 FACS 분석의 결과를 보여준다. PC9 세포를 얼음 상에서 30분 동안 mAb116의 연속 희석물 (30000 pM 내지 0.1 pM, 3배 연속 희석물)과 함께 인큐베이션함으로써 mAb116의 PC9 FACS 적정을 수행한 후에, 세포를 30분 동안 알렉사488-접합된 항-마우스 IgG (잭슨 랩)로 염색하였다. BD C6을 사용하여 MFI를 분석하였다. 친화도 KD는 약 980 pM (또는 0.98 nM)인 것으로 결정되었다.
도 10은 PC9 세포가 결합된 mAb116을 내재화하였다는 것을 보여준다. 살아있는 PC 세포를 커버슬립 상에서 배양하고, 얼음 상에서 1시간 동안 10 μg/mL mAb116과 함께 인큐베이션한 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서 세포를 37℃에서 0시간, 2시간 또는 4시간 동안 배양한 후에, 4% PFA로 고정한 후에, FACS에 의해 FITC 접합된 2차 항체로 검출하였다. 이어서 PC9 세포를 mAb116 (녹색 형광 염료 알렉사488에 의해 표지됨) 및 항-LAMP1 (적색 형광 염료 알렉사595에 의해 표지됨)에 의해 공동-염색하였다. 구체적으로, PC9 세포를 0.1% 트리톤 X로 투과시키고, mAb116 및 토끼 항-LAMP1 항체 (1:200, 압캠) 및 mAb116과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 항체를 각각 알렉사488 접합된 항-마우스 항체 및 알렉사595 접합된 항-토끼 항체로 표지하였다. mAb116 및 항-LAMP1의 공동국재화 신호는 황색 신호를 생성하며, 이는 PC9 세포에 의한 mAb116의 리소솜 구획으로의 내재화를 나타낸다. mAb116은 0시간에 LAMP1과의 임의의 공동-국재화 없이 세포 표면 상에서 처음 관찰되었다. mAb116 및 LAMP1의 공동국재화는 2시간 및 4시간에 관찰되었다.
표면 형광에 기초한 FACS 분석은 PC9 세포 상에서의 mAb116 내재화를 보여준다 (데이터는 제시되지 않음). 구체적으로, 살아있는 PC9 세포를 얼음 상에서 0.5시간 동안 10 μg/mL mAb116과 함께 인큐베이션한 후에, PBS로 3회 세척하였다. 이어서 세포를 37℃에서 0시간, 2시간 또는 4시간 동안 배양한 후에, 4% PFA로 고정시켰다. 이어서 세포를 알렉사488 접합된 항-마우스 항체로 염색하고, 표면 MFI를 계산함으로써 FACS로 분석하였다. mAb116의 표면 국재화를 나타내는 표면 MFI는 37℃에서 4시간 인큐베이션시 약 90%만큼 감소하였다. PC9 세포에서의 평균 퍼센트 내재화 ± SEM (n = 3)으로서 표현된 FACS 데이터의 정량화가 제시된다. 수직축은 상대 표면 형광 (MFI, %)을 나타낸다. 데이터는 mAb116이 막 항원에 결합할 수 있고 PC9 세포에 내재화될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 7 mAb116의 간접적 세포독성은 항원 발현-의존성이다
도 11은 mAb116 및 대조군 IgG의 간접적 세포독성을 보여준다. PC9 세포를 96-웰 플레이트에서 2000개 세포 / 웰의 전면생장률로 밤새 배양하였다. 이어서 72시간 동안 2 μg/mL MMAE-접합된 염소 항 마우스 IgG 항체와 함께 IgG 또는 mAb116의 연속 희석물로 세포를 처리하였다. 이어서 CCK8 (도진도)에 의해 세포 수를 계산하였다. mAb116 항체 칵테일은 PC9 성장을 약 30 pM의 IC50으로 억제하였지만, IgG 칵테일은 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 평균 퍼센트 성장 억제 ± SEM (n = 3)으로서 표현된, PC9 세포로부터 유도된 대표적인 데이터가 제시된다.
실시예 8 mAb116은 인간 CD44 v9 엑손을 표적화한다
도 12a 및 12b는 mAb116이 인간 CD44 v9 엑손을 표적화한다는 것을 보여준다. 48시간 동안 인간 CD44 V9 에피토프를 표적화하는 siRNA 또는 대조군 siRNA로 PC9를 형질감염시켰다. 이어서 형질감염된 세포를 mAb116으로 염색하고 FACS에 의해 분석하거나, 또는 총 단백질을 추출하고 mAb116 항원의 존재비를 웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다. CD44v9의 녹다운은 FACS에서 mAb116 표면 염색 강도를 감소시켰다 (도 12a, CD44v9 siRNA (V9.si)가 mAb116의 표면 신호를 억제한다는 것을 보여주는 FACS 데이터 (n=3을 나타냄)). CD44v9의 녹다운은 또한 mAb116 항원의 단백질 발현 수준을 감소시켰다 (도 12b). 데이터는 mAb116이 CD44v9를 표적화한다는 것을 시사한다.
항원-결합 모이어티로서 mAb116을 사용하여 항체-약물-접합체를 제조하였다. 도 13a는 mAb116이 MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 mAb116-ADC (AMT116)의 구조의 개략도를 보여준다. AMT116의 HPLC-HIC (소수성 상호작용 크로마토그래피)는 평균 약물-항체 비 (DAR)가 약 4.23이었다는 것을 나타낸다 (도 13b).
도 14는 PC9 및 KYSE-150 (식도 암종 세포주) 세포에서의 AMT116의 세포독성을 보여준다. 그래프는 AMT116 및 IgG 대조군의 평균 퍼센트 성장 억제 ± SEM (n = 3)을 나타내는, PC9 및 KYSE-150 세포로부터 유도된 대표적인 데이터이다. AMT116의 IC50 값은 PC9 및 KYSE-150 세포에서 각각 134 pM 및 670.2 pM이었다.
도 15는 AMT116의 생체내 효능을 보여준다. 약 5 x 106개 KYSE-150 세포를 1:1 마트리겔에 현탁시킨 후에, 암컷 Balb/c 누드 마우스 (8-10주령, 20-22 g)의 우측 측복부에 주사하였다. 종양 부피 (0.5 x 길이 x 폭2으로 측정됨) 및 체중을 적어도 매주 2회 결정하였다. 마우스를 투여 전 그의 초기 종양 크기 (중앙 종양 부피 대략 250-500 mm3)에 기초하여 무작위로 그룹핑하였다 (n=5/군). 비히클 (PBS), AMT116 또는 대조군 ADC를 i.v. 주입에 의해 투여하였다 (3 mg/kg, q3d x3). 군 평균 (±SEM) 종양 부피를 연구 지속기간에 걸쳐 플롯팅하였다.
실시예 9 인간 비-소세포 폐암 및 다른 암에서의 CD44v9의 발현
도 16a 및 16b는 인간 비소세포 폐암 (도 16a의 우측 패널) 및 정상 폐 조직 (도 16a의 좌측 패널)에서의 CD44v9의 발현을 보여준다. mAb116 항체를 사용하는 CD44v9 단백질의 IHC 검출이 일련의 정상 및 암 조직으로부터 제시되어 있으며, 이는 CD44v9가 종양-특이적 방식으로 상향조절되었음을 보여준다. 현미경사진 영상은 0, 1+, 2+ 및 3+ 염색 강도를 나타내는 종양 조직을 도시한다 (도 16a의 우측 패널). 도 16b는 NSCLC의 상이한 하위유형에서의 CD44v9의 유병률을 보여준다. SCC, 편평 세포 암종; LCC, 대세포 암종.
도 17은 다수의 종양 유형에서의 CD44v9의 과다발현을 보여준다. mAb116 항체를 사용하는 CD44v9 단백질의 IHC 검출이 일련의 정상 및 암 조직으로부터 제시되어 있으며, 이는 CD44v9가 종양-특이적 방식으로 상향조절되었음을 보여준다.
실시예 10 항체 서열
mAb119 및 mAb116 모노클로날 항체의 다양한 영역 / 도메인의 서열이 하기에 열거되어 있다.
표 1 mAb119의 가변 영역의 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
HEGYRQTPKE (서열식별번호: 19) - 대상 항-CD44v6 항체를 생성시키는데 사용된 CD44v6 에피토프 서열.
HEGYRQTPKEDS (서열식별번호: 24)
표 2 mAb116의 가변 영역의 서열
Figure pct00004
SHEGLEEDKD (서열식별번호: 43) - 대상 항-CD44v9 항체를 생성시키는데 사용된 CD44v9 에피토프 서열.
SHEGLEEDKDH (서열식별번호: 44)

Claims (84)

  1. 단리된 CD44v6 에피토프에 특이적인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 상기 CD44v6 에피토프는 서열식별번호: 19를 포함하거나 / 이로 본질적으로 이루어지거나 (예를 들어, 에피토프는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐), 또는 서열식별번호: 19로 이루어지고; 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 단리된 CD44v6 에피토프에 대해 생성되거나, 또는 상기 단리된 CD44v6 에피토프 및 담체 단백질 (예컨대 알부민, 바람직하게는 BSA 또는 오브알부민, 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))을 포함하는 융합 단백질 또는 그의 화학적 접합체에 대해 생성되는 것인, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가
    (1) 서열식별번호: 1의 중쇄 가변 영역 (HCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 2의 HCVR CDR2 서열 및 서열식별번호: 3의 HCVR CDR3 서열을 포함하는 HCVR;
    (2) 서열식별번호: 10의 경쇄 가변 영역 (LCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 11의 LCVR CDR2 서열 및 서열식별번호: 12의 LCVR CDR3 서열을 포함하는 LCVR
    을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CD44v6 에피토프가 서열식별번호: 19인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, CD44v6 에피토프가 서열식별번호: 19로 본질적으로 이루어진 것인 (예를 들어, 에피토프가 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 19의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐) 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, CD44v6 에피토프가 서열식별번호: 24 (HEGYRQTPKEDS)인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) HCVR이 서열식별번호: 7-9 중 1개 이상을 추가로 포함하고/거나;
    (ii) LCVR이 서열식별번호: 13-18 중 1개 이상을 추가로 포함하는 것인
    단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD44v6 에피토프 또는 상기 CD44v6 에피토프를 갖는 세포에 약 10 nM, 약 5 nM 또는 약 2 nM 또는 그 미만의 KD로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간-마우스 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, CDR-그라프팅된 항체 또는 재표면화 항체인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그의 항원-결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv 또는 scFv, 디술피드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGΔCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 단리된 CD44v9 에피토프에 특이적인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 상기 CD44v9 에피토프는 서열식별번호: 43을 포함하거나 / 이로 본질적으로 이루어지거나 (예를 들어, 에피토프는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 19 플러스 서열식별번호: 43의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐), 또는 서열식별번호: 43으로 이루어지고; 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 단리된 CD44v9 에피토프에 대해 생성되거나, 또는 상기 단리된 CD44v9 에피토프 및 담체 단백질 (예컨대 알부민, 바람직하게는 BSA 또는 오브알부민, 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))을 포함하는 융합 단백질 또는 그의 화학적 접합체에 대해 생성되는 것인, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가
    (1) 서열식별번호: 25의 중쇄 가변 영역 (HCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 26의 HCVR CDR2 서열 및 서열식별번호: 27의 HCVR CDR3 서열을 포함하는 HCVR;
    (2) 서열식별번호: 34의 경쇄 가변 영역 (LCVR) CDR1 서열, 서열식별번호: 35의 LCVR CDR2 서열 및 서열식별번호: 36의 LCVR CDR3 서열을 포함하는 LCVR
    을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, CD44v9 에피토프가 서열식별번호: 43인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, CD44v9 에피토프가 서열식별번호: 43으로 본질적으로 이루어진 것인 (예를 들어, 에피토프가 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 C-말단 상의 1 또는 2개의 잔기, 또는 서열식별번호: 43 플러스 서열식별번호: 43의 N-말단 및 C-말단 둘 다 상의 1 또는 2개의 잔기로 이루어짐) 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, CD44v9 에피토프가 서열식별번호: 44 (SHEGLEEDKDH)인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) HCVR이 서열식별번호: 28-33 중 1개 이상을 추가로 포함하고/거나;
    (ii) LCVR이 서열식별번호: 37-42 중 1개 이상을 추가로 포함하는 것인
    단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD44v9 에피토프 또는 상기 CD44v9 에피토프를 갖는 세포에 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM 또는 그 미만의 KD로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간-마우스 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, CDR-그라프팅된 항체 또는 재표면화 항체인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그의 항원-결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv 또는 scFv, 디술피드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGΔCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 HCVR 및/또는 LCVR을 포함하는 폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 융합 단백질 (예컨대 키메라 항원 T 세포 수용체)인 폴리펩티드.
  21. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 HCVR 및/또는 LCVR을 포함하는 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, 융합 단백질 (예컨대 키메라 항원 T 세포 수용체)인 폴리펩티드.
  23. 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  25. 제23항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  26. 제25항에 있어서, 발현 벡터 (예를 들어, 포유동물 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 곤충 발현 벡터 또는 박테리아 발현 벡터)인 벡터.
  27. 제24항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 발현 벡터 (예를 들어, 포유동물 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 곤충 발현 벡터 또는 박테리아 발현 벡터)인 벡터.
  29. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드, 제23항의 폴리뉴클레오티드 또는 제25항 또는 제26항의 벡터를 포함하는 세포.
  30. 제29항에 있어서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드를 발현하는 세포.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, BHK 세포, CHO 세포 또는 COS 세포인 세포.
  32. 제29항에 있어서, 세포의 표면 상에 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드를 포함하는 세포.
  33. 제32항에 있어서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 보유하는 T-세포 (CAR-T 세포)인 세포.
  34. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드, 제24항의 폴리뉴클레오티드 또는 제27항 또는 제28항의 벡터를 포함하는 세포.
  35. 제34항에 있어서, 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드를 발현하는 세포.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, BHK 세포, CHO 세포 또는 COS 세포인 세포.
  37. 제34항에 있어서, 세포의 표면 상에 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드를 포함하는 세포.
  38. 제37항에 있어서, 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 보유하는 T-세포 (CAR-T 세포)인 세포.
  39. (a) 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포로부터 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드를 단리하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포인 방법.
  41. (a) 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포로부터 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드를 단리하는 단계
    를 포함하는, 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포인 방법.
  43. 하기 화학식을 갖는 면역접합체 (또는 항체-약물 접합체 또는 ADC)이며,
    Ab-[-L-D]n
    여기서
    Ab는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드이고, 이는 링커-약물 모이어티 -[-L-D]의 1개 이상의 단위에 공유 연결되고, 여기서 L은 링커이고, D는 세포독성 약물이고;
    n은 1 내지 20 (예를 들어, 1-12)의 정수이고;
    여기서 각각의 링커-약물 모이어티는 동일하거나 상이한 링커 L 또는 세포독성 약물 D를 가질 수 있는 것인
    면역접합체.
  44. 제43항에 있어서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]가 Lys의 측쇄 아미노기를 통해 Ab에 공유 연결된 것인 면역접합체.
  45. 제43항에 있어서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]가 Cys의 측쇄 티올 기를 통해 Ab에 공유 연결된 것인 면역접합체.
  46. 제43항에 있어서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]가 부위-특이적으로 혼입된 비-천연 아미노산을 통해 Ab에 공유 연결된 것인 면역접합체.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 링커 L이 펩티드 단위를 포함하는 것인 면역접합체.
  48. 제47항에 있어서, 펩티드 단위가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 2-10 또는 2-5개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  49. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 L이 프로테아제 (예를 들어, 카텝신)에 의해 절단가능하지 않은 것인 면역접합체.
  50. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 L이 프로테아제 (예를 들어, 카텝신), 산성 환경 또는 산화환원 상태 변화에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커인 면역접합체.
  51. 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 약물이 DNA 삽입제, 미세관 결합제, 토포이소머라제 I 억제제 또는 DNA 작은 홈 결합제인 면역접합체.
  52. 제51항에 있어서, 세포독성 약물이 아우리스타틴 부류, 예컨대 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 MMAF, 메이탄신 부류, 예컨대 DM-1, DM-3, DM-4, 칼리케아미신, 예컨대 오조가미신, SN-38 또는 PBD (피롤로벤조디아제핀)인 면역접합체.
  53. 하기 화학식을 갖는 면역접합체 (또는 항체-약물 접합체 또는 ADC)이며,
    Ab-[-L-D]n
    여기서
    Ab는 제10항 내지 제18항 및 xa 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드이고, 이는 링커-약물 모이어티 -[-L-D]의 1개 이상의 단위에 공유 연결되고, 여기서 L은 링커이고, D는 세포독성 약물이고;
    n은 1 내지 20 (예컨대 1-12)의 정수이고;
    여기서 각각의 링커-약물 모이어티는 동일하거나 상이한 링커 L 또는 세포독성 약물 D를 가질 수 있는 것인
    면역접합체.
  54. 제53항에 있어서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]가 Lys의 측쇄 아미노기를 통해 Ab에 공유 연결된 것인 면역접합체.
  55. 제53항에 있어서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]가 Cys의 측쇄 티올 기를 통해 Ab에 공유 연결된 것인 면역접합체.
  56. 제53항에 있어서, 각각의 링커-약물 모이어티 -[-L-D]가 부위-특이적으로 혼입된 비-천연 아미노산을 통해 Ab에 공유 연결된 것인 면역접합체.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 링커 L이 펩티드 단위를 포함하는 것인 면역접합체.
  58. 제57항에 있어서, 펩티드 단위가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 2-10 또는 2-5개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  59. 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 L이 프로테아제 (예를 들어, 카텝신)에 의해 절단가능하지 않은 것인 면역접합체.
  60. 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 L이 프로테아제 (예를 들어, 카텝신), 산성 환경 또는 산화환원 상태 변화에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커인 면역접합체.
  61. 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 약물이 DNA 삽입제, 미세관 결합제, 토포이소머라제 I 억제제 또는 DNA 작은 홈 결합제인 면역접합체.
  62. 제61항에 있어서, 세포독성 약물이 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), DM-1, DM-3, DM-4 또는 PBD (피롤로벤조디아제핀)인 면역접합체.
  63. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드 또는 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항의 면역접합체 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  64. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드 또는 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항의 면역접합체 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  65. CD44v6을 발현하는 세포를 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드 또는 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항의 면역접합체 또는 제63항의 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, CD44v6을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 세포가 종양 세포인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 종양 세포가 폐암 (예컨대 NSCLC)으로부터의 것인 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 종양 세포가 결장직장암, 유방암, 두경부암, 난소암, 방광암, 췌장암 또는 뇌의 전이성 암으로부터의 것인 방법.
  69. CD44v9를 발현하는 세포를 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드 또는 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항의 면역접합체 또는 제64항의 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, CD44v9를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 세포가 종양 세포인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 종양 세포가 폐암 (예컨대 NSCLC)으로부터의 것인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 종양 세포가 결장직장암, 유방암, 간암, 두경부암, 난소암, 방광암, 췌장암 또는 뇌의 전이성 암으로부터의 것인 방법.
  73. 세포가 CD44v6을 발현하는 암을 갖는 대상체에게 CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v6의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 세포가 CD44v6을 발현하는 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  74. 대상체에게 CD44v6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v6의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 세포가 CD44v6을 발현하는 세포-증식성 장애를 치료하는 방법.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, CD44v6의 길항제가 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드 또는 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항의 면역접합체 또는 제63항의 제약 조성물을 포함하는 것인 방법.
  76. 제73항 또는 제75항에 있어서, 상기 암이 유방, 폐, 간, 결장직장, 두경부, 식도, 췌장, 난소, 방광, 위, 피부, 자궁내막, 난소, 고환, 식도, 전립선 또는 신장 기원을 포함한 상피 암종; 골 및 연부-조직 육종, 예컨대 골육종, 연골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종 (MFH), 평활근육종; 조혈 악성종양, 예컨대 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 백혈병; 신경외배엽 종양, 예컨대 말초 신경 종양, 성상세포종 또는 흑색종; 또는 중피종인 방법.
  77. 세포가 CD44v9를 발현하는 암을 갖는 대상체에게 CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v9의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 세포가 CD44v9를 발현하는 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  78. 대상체에게 CD44v9 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD44v9의 길항제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 세포가 CD44v9를 발현하는 세포-증식성 장애를 치료하는 방법.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, CD44v9의 길항제가 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드 또는 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항의 면역접합체 또는 제64항의 제약 조성물을 포함하는 것인 방법.
  80. 제77항 또는 제79항에 있어서, 상기 암이 유방, 폐, 간, 결장직장, 두경부, 식도, 췌장, 난소, 방광, 위, 피부, 자궁내막, 난소, 고환, 식도, 전립선 또는 신장 기원을 포함한 상피 암종; 골 및 연부-조직 육종, 예컨대 골육종, 연골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종 (MFH), 평활근육종; 조혈 악성종양, 예컨대 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 백혈병; 신경외배엽 종양, 예컨대 말초 신경 종양, 성상세포종 또는 흑색종; 또는 중피종인 방법.
  81. 대상체로부터의 샘플을 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, 대상체로부터의 샘플에서 CD44v6의 존재 및/또는 존재비를 결정하는 방법.
  82. 대상체로부터의 샘플을 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, 대상체로부터의 샘플에서 CD44v9의 존재 및/또는 존재비를 결정하는 방법.
  83. (1) 제81항의 방법을 사용하여, 대상체로부터의 암 샘플에서 CD44v6의 존재 및/또는 존재비를 결정하여 암 샘플에서 CD44v6을 발현하는 대상체를 확인하는 단계,
    (2) 상기 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제19항 또는 제20항의 폴리펩티드 또는 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항의 면역접합체 또는 제63항의 제약 조성물을 투여하는 단계
    를 포함하며, 이에 의해 세포가 CD44v6을 발현하는 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 것인,
    세포가 CD44v6을 발현하는 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 방법.
  84. (1) 제82항의 방법을 사용하여, 대상체로부터의 암 샘플에서 CD44v9의 존재 및/또는 존재비를 결정하여 암 샘플에서 CD44v9를 발현하는 대상체를 확인하는 단계,
    (2) 상기 대상체에게 치료 유효량의 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제21항 또는 제22항의 폴리펩티드 또는 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항의 면역접합체 또는 제64항의 제약 조성물을 투여하는 단계
    를 포함하며, 이에 의해 세포가 CD44v9를 발현하는 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 것인,
    세포가 CD44v9를 발현하는 암을 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 방법.
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