JP2955082B2 - ヒトカルシトニンのｎ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒトカルシトニンのｎ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトカルシトニン(ｈ
ＣＴ)のＮ末端部分を特異的に認識するモノクローナル
抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体の製造
方法および該抗体を用いることを特徴とするヒトカルシ
トニンの検出方法に関する。
ＣＴ)のＮ末端部分を特異的に認識するモノクローナル
抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体の製造
方法および該抗体を用いることを特徴とするヒトカルシ
トニンの検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】カルシトニン(ＣＴ)は３２個のアミノ酸
からなるペブチドホルモンであり、哺乳類においては甲
状腺Ｃ細胞から分泌される。その主な生理作用として
は、骨に対する骨吸収抑制による血中カルシウムの低下
作用や腎臓に対する尿中無機リンの***促進による血清
リンの低下作用などが知られている。
からなるペブチドホルモンであり、哺乳類においては甲
状腺Ｃ細胞から分泌される。その主な生理作用として
は、骨に対する骨吸収抑制による血中カルシウムの低下
作用や腎臓に対する尿中無機リンの***促進による血清
リンの低下作用などが知られている。
【０００３】カルシトニンの測定はラットにおける血清
カルシウム低下作用を指標とする生物学的方法によって
行うことができるが、感度が低く、血中カルシトニンの
測定には用いられていない。1969年にＣlarkらは甲状腺
髄様癌組織から抽出したカルシトニンを抗原としたラジ
オイムノアッセイ(ＲＩＡ)による測定法を確立した。そ
の後合成ヒトカルシトニンを利用したＲＩＡ法が開発さ
れるに至り、血中ヒトカルシトニンの測定法として広く
検査に利用されるようになっている。血中カルシトニン
の測定は、臨床的には、甲状腺髄様癌の診断、治療経過
の観察、家族性甲状腺髄様癌のスクリーニングに、ま
た、異所性ＣＴ産生腫瘍の診断に有用である。さらに、
副甲状腺ホルモン(ＰＴＨ)などと共に、カルシウム代謝
の臨床研究においても必要不可欠である。
カルシウム低下作用を指標とする生物学的方法によって
行うことができるが、感度が低く、血中カルシトニンの
測定には用いられていない。1969年にＣlarkらは甲状腺
髄様癌組織から抽出したカルシトニンを抗原としたラジ
オイムノアッセイ(ＲＩＡ)による測定法を確立した。そ
の後合成ヒトカルシトニンを利用したＲＩＡ法が開発さ
れるに至り、血中ヒトカルシトニンの測定法として広く
検査に利用されるようになっている。血中カルシトニン
の測定は、臨床的には、甲状腺髄様癌の診断、治療経過
の観察、家族性甲状腺髄様癌のスクリーニングに、ま
た、異所性ＣＴ産生腫瘍の診断に有用である。さらに、
副甲状腺ホルモン(ＰＴＨ)などと共に、カルシウム代謝
の臨床研究においても必要不可欠である。
【０００４】現在市販されている血中ヒトカルシトニン
測定のためのＲＩＡキットは、抗ヒトカルシトニンポリ
クローナル血清を用いたものである。このような抗血清
は、免疫に使用した動物に固有のものであって、同一の
性質をもつ抗血清を得ることは難しく、品質の安定した
臨床キットを組むことができないという欠点を持ってい
る。また、抗血清は、種々のエピトープに対する抗体の
混合物であるため、ポリクローナル血清で血中のカルシ
トニンを測定した場合には、モノマーカルシトニン以外
の分解物も測定している可能性がある。このようにポリ
クローナル血清を用いたＲＩＡ法による測定では、正確
にカルシトニンの濃度を測定することはできない。
測定のためのＲＩＡキットは、抗ヒトカルシトニンポリ
クローナル血清を用いたものである。このような抗血清
は、免疫に使用した動物に固有のものであって、同一の
性質をもつ抗血清を得ることは難しく、品質の安定した
臨床キットを組むことができないという欠点を持ってい
る。また、抗血清は、種々のエピトープに対する抗体の
混合物であるため、ポリクローナル血清で血中のカルシ
トニンを測定した場合には、モノマーカルシトニン以外
の分解物も測定している可能性がある。このようにポリ
クローナル血清を用いたＲＩＡ法による測定では、正確
にカルシトニンの濃度を測定することはできない。
【０００５】ヒトカルシトニンと特異的に結合するモノ
クローナル抗体は、ヒトカルシトニンのある特定部分
(エピトープ)のみを認識して結合する。そこで、ヒトカ
ルシトニンの互いに異なるエピトープを認識する２種類
のモノクローナル抗体でサンドイッチ法による測定系を
構築すれば、分解物などの干渉を受けずにモノマーカル
シトニンのみを特異的に測定できると考えられる。現
在、ヒトカルシトニンに対するモノクローナル抗体の製
造に関する報告がいくつかあり、ヒトカルシトニンの中
央部分やＣ末端部分を認識するモノクローナル抗体が得
られている［L.Scopsi et al., "Monoclonal Antibodie
s against Calcitonin", Histochemistry 88, 113-125
(1988) ; Philippe Motte et al., "A Two-Site Immuno
radiometricAssay for Serum Calcitonin using Monocl
onal Anti-Peptide Antibodies", Henry Ford Hosp.Me
d.J. 35, 129-132 (1987)]。しかし、Ｎ末端構造を識別
できるモノクローナル抗体を製造した例はない。
クローナル抗体は、ヒトカルシトニンのある特定部分
(エピトープ)のみを認識して結合する。そこで、ヒトカ
ルシトニンの互いに異なるエピトープを認識する２種類
のモノクローナル抗体でサンドイッチ法による測定系を
構築すれば、分解物などの干渉を受けずにモノマーカル
シトニンのみを特異的に測定できると考えられる。現
在、ヒトカルシトニンに対するモノクローナル抗体の製
造に関する報告がいくつかあり、ヒトカルシトニンの中
央部分やＣ末端部分を認識するモノクローナル抗体が得
られている［L.Scopsi et al., "Monoclonal Antibodie
s against Calcitonin", Histochemistry 88, 113-125
(1988) ; Philippe Motte et al., "A Two-Site Immuno
radiometricAssay for Serum Calcitonin using Monocl
onal Anti-Peptide Antibodies", Henry Ford Hosp.Me
d.J. 35, 129-132 (1987)]。しかし、Ｎ末端構造を識別
できるモノクローナル抗体を製造した例はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトカルシ
トニンのＮ末端部分を特異的に認識するモノクローナル
抗体を提供するものである。また、本発明は上記抗体を
産生するハイブリドーマ、該抗体の製造方法および該抗
体を用いることを特徴とするヒトカルシトニンの検出方
法をも提供するものである。
トニンのＮ末端部分を特異的に認識するモノクローナル
抗体を提供するものである。また、本発明は上記抗体を
産生するハイブリドーマ、該抗体の製造方法および該抗
体を用いることを特徴とするヒトカルシトニンの検出方
法をも提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】一般にホルモンのような
低分子抗原に対するモノクローナル抗体を製造する場合
には、その製造過程において目的の抗原を生体の免疫シ
ステムが認識し易いように、低分子抗原をより大きなタ
ンパク質などの分子に結合させて免疫を行う。この低分
子抗原とタンパク質などを架橋するための試薬として
は、一般にグルタルアルデヒドや水溶性カルボジイミド
などが用いられる。本発明者らは、ヒトカルシトニンを
抗原としてモノクローナル抗体を製造する際に、架橋試
薬として１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピ
ル)カルボジイミド(ＥＤＣ)を用いてヒトカルシトニン
をオボアルブミンに結合させ、これを抗原として動物を
免疫することからなる方法によってヒトカルシトニンの
Ｎ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体を得
ることに成功した。
低分子抗原に対するモノクローナル抗体を製造する場合
には、その製造過程において目的の抗原を生体の免疫シ
ステムが認識し易いように、低分子抗原をより大きなタ
ンパク質などの分子に結合させて免疫を行う。この低分
子抗原とタンパク質などを架橋するための試薬として
は、一般にグルタルアルデヒドや水溶性カルボジイミド
などが用いられる。本発明者らは、ヒトカルシトニンを
抗原としてモノクローナル抗体を製造する際に、架橋試
薬として１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピ
ル)カルボジイミド(ＥＤＣ)を用いてヒトカルシトニン
をオボアルブミンに結合させ、これを抗原として動物を
免疫することからなる方法によってヒトカルシトニンの
Ｎ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体を得
ることに成功した。
【０００８】即ち、本発明のヒトカルシトニンのＮ末端
部分を特異的に認識するモノクローナル抗体は以下のよ
うにして製造することができる： (a)架橋試薬として１−エチル−３−(３−ジメチルアミ
ノプロピル)カルボジイミドを用いてヒトカルシトニン
をオボアルブミンに結合させ、これを抗原としてマウス
を免疫し、(b)該マウスの脾細胞とマウスのミエローマ
細胞とを融合させ、ヒトカルシトニンのＮ末端部分を特
異的に認識するモノクローナル抗体を産生しているハイ
ブリドーマを選択し、そして(c)該ハイブリドーマを適
当な条件下で培養し、該モノクローナル抗体を回収す
る。
部分を特異的に認識するモノクローナル抗体は以下のよ
うにして製造することができる： (a)架橋試薬として１−エチル−３−(３−ジメチルアミ
ノプロピル)カルボジイミドを用いてヒトカルシトニン
をオボアルブミンに結合させ、これを抗原としてマウス
を免疫し、(b)該マウスの脾細胞とマウスのミエローマ
細胞とを融合させ、ヒトカルシトニンのＮ末端部分を特
異的に認識するモノクローナル抗体を産生しているハイ
ブリドーマを選択し、そして(c)該ハイブリドーマを適
当な条件下で培養し、該モノクローナル抗体を回収す
る。
【０００９】工程(a)のペプチド−タンパク質結合体
は、ペプチド、タンパク質および架橋試薬を水中で、ま
たは適当な緩衝液中で混合し、反応させることによって
調製することができる。反応終了後、反応液を適当な溶
媒に対して透析し、これを抗原溶液として用いる。ま
た、マウスの免疫は、上記抗原溶液を適当なアジュバン
トと混合してアジュバント溶液を得、これをマウスに投
与することによって行う。一定期間経過後、さらに同一
の抗原で追加免疫を行ってもよい。免疫するマウスとし
てはＢalb／cマウスを用いるのが好ましい。工程(b)の
細胞融合は常法通りに行うことができる。マウスミエロ
ーマ細胞としては、ＳＰ２／０−Ａg１４、Ｐ３−ＮＳ
１−１−Ａg４−１などの細胞株を挙げることができ
る。細胞融合法としては、ポリエチレングリコール法、
電気穿孔法などを挙げることができる。また、得られた
ハイブリドーマの選択は、例えば酵素標識抗体法(ＥＬ
ＩＳＡ)により、ヒトカルシトニンの種々フラグメント
とハイブリドーマを適当な培地で培養して得た培養液と
を反応させ、ヒトカルシトニンのＮ末端を含むフラグメ
ントとのみ反応する抗体を産生しているハイブリドーマ
を選択することによって行うことができる。次いで、選
択したハイブリドーマを限界希釈法によってクローニン
グする。工程(c)のモノクローナル抗体の回収は、例え
ば工程(b)で得られたクローンをマウスの腹腔内に移植
してその腹水から、または大量培養装置を用いてクロー
ンを培養した培養液から常法通り回収することができ
る。また、回収した抗体を、硫安塩析、分子ふるい、ア
フィニティークロマトグラフィーなどによって精製して
もよい。
は、ペプチド、タンパク質および架橋試薬を水中で、ま
たは適当な緩衝液中で混合し、反応させることによって
調製することができる。反応終了後、反応液を適当な溶
媒に対して透析し、これを抗原溶液として用いる。ま
た、マウスの免疫は、上記抗原溶液を適当なアジュバン
トと混合してアジュバント溶液を得、これをマウスに投
与することによって行う。一定期間経過後、さらに同一
の抗原で追加免疫を行ってもよい。免疫するマウスとし
てはＢalb／cマウスを用いるのが好ましい。工程(b)の
細胞融合は常法通りに行うことができる。マウスミエロ
ーマ細胞としては、ＳＰ２／０−Ａg１４、Ｐ３−ＮＳ
１−１−Ａg４−１などの細胞株を挙げることができ
る。細胞融合法としては、ポリエチレングリコール法、
電気穿孔法などを挙げることができる。また、得られた
ハイブリドーマの選択は、例えば酵素標識抗体法(ＥＬ
ＩＳＡ)により、ヒトカルシトニンの種々フラグメント
とハイブリドーマを適当な培地で培養して得た培養液と
を反応させ、ヒトカルシトニンのＮ末端を含むフラグメ
ントとのみ反応する抗体を産生しているハイブリドーマ
を選択することによって行うことができる。次いで、選
択したハイブリドーマを限界希釈法によってクローニン
グする。工程(c)のモノクローナル抗体の回収は、例え
ば工程(b)で得られたクローンをマウスの腹腔内に移植
してその腹水から、または大量培養装置を用いてクロー
ンを培養した培養液から常法通り回収することができ
る。また、回収した抗体を、硫安塩析、分子ふるい、ア
フィニティークロマトグラフィーなどによって精製して
もよい。
【００１０】本発明のモノクローナル抗体を血中ヒトカ
ルシトニンを測定するために用いることができる。この
ような測定方法にはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、酵
素イムノアッセイ(ＥＩＡ)、蛍光イムノアッセイ(ＦＩ
Ａ)などが含まれる。本発明の抗体は、これら方法にお
いて通常用いられる操作に従って用いてよい。また、抗
体の標識が必要である場合には、酵素、蛍光物質、放射
性同位体など当分野で周知のものを用い、常法通り行っ
てよい。
ルシトニンを測定するために用いることができる。この
ような測定方法にはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、酵
素イムノアッセイ(ＥＩＡ)、蛍光イムノアッセイ(ＦＩ
Ａ)などが含まれる。本発明の抗体は、これら方法にお
いて通常用いられる操作に従って用いてよい。また、抗
体の標識が必要である場合には、酵素、蛍光物質、放射
性同位体など当分野で周知のものを用い、常法通り行っ
てよい。
【００１１】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。実施例１ 抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体の作
成 Ａ．カルシトニンアナログの化学合成と精製 カルシトニンアナログペプチドはペプチド自動合成機AB
I MODEL 430A(AppliedBiosystems社)を用いて化学合成
した。合成したペプチドを表１に示す。hＣＴ(1-10)、h
ＣＴ(11-20)、hＣＴ(21-32)、hＣＴ(1-22)およびhＣＴ
(11-32)はすべてヒトカルシトニン由来のペプチド断片
である。hＣＴ(21-32)とhＣＴ(11-32)はＣ末端がアミド
構造になるように合成した。
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。実施例１ 抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体の作
成 Ａ．カルシトニンアナログの化学合成と精製 カルシトニンアナログペプチドはペプチド自動合成機AB
I MODEL 430A(AppliedBiosystems社)を用いて化学合成
した。合成したペプチドを表１に示す。hＣＴ(1-10)、h
ＣＴ(11-20)、hＣＴ(21-32)、hＣＴ(1-22)およびhＣＴ
(11-32)はすべてヒトカルシトニン由来のペプチド断片
である。hＣＴ(21-32)とhＣＴ(11-32)はＣ末端がアミド
構造になるように合成した。
【表１】 合成ｈＣＴフラグメント N末端 C末端 hCT( 1-32)： CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH2 hCT( 1-10)： CGNLSTCMLG hCT(11-20)： TYTQDFNKFH hCT(21-32)： TFPQTAIGVGAP-NH2 hCT( 1-22)： CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFhCT(11-32)： TYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH2 Ｃ末端にアミド構造を持つhＣＴ(21-32)とhＣＴ(11-32)
はp-メチルベンズヒドリルアミン(ＢＨＡ)樹脂を固相樹
脂とするt-ブチルオキシカルボニル(t-Ｂoc)法によって
合成した。合成終了後の樹脂からの切り出しと脱保護は
トリフルオロメタンスルホン酸(ＴＦＭＳＡ)によって行
った。その他のペプチドはp-ヒドロキシメチルフェノキ
シメチルポリスチレン(ＨＭＰ)樹脂を固相とする９−フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆmoc)法によって
合成した。合成終了後の樹脂からの切り出しと脱保護は
トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)によって行った。樹脂から切
り出した合成ペプチドは、Waters μBONDASPHERE 5μ C
18-300Å(３.９mm×１５cm)カラムによる高速逆相クロ
マトグラフィーによって精製した。精製ペプチドのアミ
ノ酸配列はプロテインシーケンサーMODEL 477A(Applied
Biosystems社)によって分析した。
はp-メチルベンズヒドリルアミン(ＢＨＡ)樹脂を固相樹
脂とするt-ブチルオキシカルボニル(t-Ｂoc)法によって
合成した。合成終了後の樹脂からの切り出しと脱保護は
トリフルオロメタンスルホン酸(ＴＦＭＳＡ)によって行
った。その他のペプチドはp-ヒドロキシメチルフェノキ
シメチルポリスチレン(ＨＭＰ)樹脂を固相とする９−フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆmoc)法によって
合成した。合成終了後の樹脂からの切り出しと脱保護は
トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)によって行った。樹脂から切
り出した合成ペプチドは、Waters μBONDASPHERE 5μ C
18-300Å(３.９mm×１５cm)カラムによる高速逆相クロ
マトグラフィーによって精製した。精製ペプチドのアミ
ノ酸配列はプロテインシーケンサーMODEL 477A(Applied
Biosystems社)によって分析した。
【００１２】Ｂ．抗原の調製 抗原の免疫原性を高めるために、ヒトカルシトニンペプ
チドを２種類の担体タンパク質に２種類の架橋試薬を用
いて結合させた。即ち、担体タンパク質としてはオボア
ルブミンとキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)
を用い、架橋試薬としては１−エチル−３−(３−ジメ
チルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)とグルタ
ルアルデヒドを用いた。２５mg／mlヒトカルシトニン水
溶液(２２.４μl)に１０mg／mlオボアルブミン水溶液
(１６.８μl)と１００mg／mlのＥＤＣ(１６.８μl)を加
え、室温で遮光して一晩反応させた。次に、Ｈ2Ｏを加
えて全量を１mlとし、蒸留水に対して透析して、hＣＴ
−オボアルブミン抗原溶液とした。また、１.８７mg／m
lのヒトカルシトニンと３.１mg／mlのＫＬＨを含む０.
１Ｍリン酸ナトリウム溶液(pＨ７.０)(２００μl)に２
０％のグルタルアルデヒトを含む０.１Ｍリン酸ナトリ
ウム溶液(pＨ７.０)(１００μl)を加え、室温で１時間
撹拌して反応させた後、１Ｍグリシンを含む０.１Ｍリ
ン酸ナトリウム溶液(pＨ７.０)(２００μl)を加えて更
に室温で１時間撹拌した。得られた反応液を０.１Ｍリ
ン酸ナトリウム溶液(pＨ７.０)に対して透析して、hＣ
Ｔ−ＫＬＨ抗原溶液とした。２種類の抗原溶液は使用す
るまで４℃で保存した。
チドを２種類の担体タンパク質に２種類の架橋試薬を用
いて結合させた。即ち、担体タンパク質としてはオボア
ルブミンとキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)
を用い、架橋試薬としては１−エチル−３−(３−ジメ
チルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)とグルタ
ルアルデヒドを用いた。２５mg／mlヒトカルシトニン水
溶液(２２.４μl)に１０mg／mlオボアルブミン水溶液
(１６.８μl)と１００mg／mlのＥＤＣ(１６.８μl)を加
え、室温で遮光して一晩反応させた。次に、Ｈ2Ｏを加
えて全量を１mlとし、蒸留水に対して透析して、hＣＴ
−オボアルブミン抗原溶液とした。また、１.８７mg／m
lのヒトカルシトニンと３.１mg／mlのＫＬＨを含む０.
１Ｍリン酸ナトリウム溶液(pＨ７.０)(２００μl)に２
０％のグルタルアルデヒトを含む０.１Ｍリン酸ナトリ
ウム溶液(pＨ７.０)(１００μl)を加え、室温で１時間
撹拌して反応させた後、１Ｍグリシンを含む０.１Ｍリ
ン酸ナトリウム溶液(pＨ７.０)(２００μl)を加えて更
に室温で１時間撹拌した。得られた反応液を０.１Ｍリ
ン酸ナトリウム溶液(pＨ７.０)に対して透析して、hＣ
Ｔ−ＫＬＨ抗原溶液とした。２種類の抗原溶液は使用す
るまで４℃で保存した。
【００１３】Ｃ．マウスの免疫 ヒトカルシトニン-担体タンパク質抗原によるマウスの
免疫は、RibiAdjuvantSystem(RIBI IMMUNOCHEM RESEARC
H INC.)をアジュバントとして行った。即ち、アジュバ
ントと各抗原溶液を１：１に混合して、２０μg／mlお
よび２００μg／mlのヒトカルシトニンを含むアジュバ
ント溶液を調製した。０.２mlの各アジュバント溶液
を、４匹のＢalb／cマウス(雄、８週令)の腹腔内にそれ
ぞれ２週間ごとに計５回投与した。また、投与後３日目
ごとに免疫したマウスの尾より採血し、血清中のヒトカ
ルシトニンに対する抗体活性とその抗体のサブクラスを
モニターした。hＣＴに対して結合活性を有する血清抗
体のサブクラスは、Mouse TyperSub-Isotyping Kit(Bio
-Rad Laboratories)を用いたＥＬＩＳＡ法によって決定
した。抗体活性が上昇し、その抗体のサブクラスがＩg
Ｇクラスであるマウスを選択して、ミエローマ細胞との
融合に用いる脾細胞の供与体とした。
免疫は、RibiAdjuvantSystem(RIBI IMMUNOCHEM RESEARC
H INC.)をアジュバントとして行った。即ち、アジュバ
ントと各抗原溶液を１：１に混合して、２０μg／mlお
よび２００μg／mlのヒトカルシトニンを含むアジュバ
ント溶液を調製した。０.２mlの各アジュバント溶液
を、４匹のＢalb／cマウス(雄、８週令)の腹腔内にそれ
ぞれ２週間ごとに計５回投与した。また、投与後３日目
ごとに免疫したマウスの尾より採血し、血清中のヒトカ
ルシトニンに対する抗体活性とその抗体のサブクラスを
モニターした。hＣＴに対して結合活性を有する血清抗
体のサブクラスは、Mouse TyperSub-Isotyping Kit(Bio
-Rad Laboratories)を用いたＥＬＩＳＡ法によって決定
した。抗体活性が上昇し、その抗体のサブクラスがＩg
Ｇクラスであるマウスを選択して、ミエローマ細胞との
融合に用いる脾細胞の供与体とした。
【００１４】Ｄ．細胞融合 上記Ｃで選択した脾細胞供与マウスの静脈内に４μgま
たは４０μgのhＣＴ−オボアルブミンまたはhＣＴ−Ｋ
ＬＨを供与し、３日後にマウスより脾臓を取り出した。
脾細胞とミエローマ細胞(ＰＡＩ)(新井孝夫ら：単クロ
ーン性抗体、日本生化学会編、生化学実験講座６、「細
胞骨格の構造と機能」、489-503頁、東京化学同人、東
京、1986)を５〜１０：１の割合で混合し、５０％(w／
v)ポリエチレングリコール１５００を含む７５mＭ Ｈep
es(Boehringer Mannheim GmbH,W.，Germany)(１ml)を添
加して融合させた。細胞融合したハイブリドーマはＨＡ
Ｔ培地により選択した。
たは４０μgのhＣＴ−オボアルブミンまたはhＣＴ−Ｋ
ＬＨを供与し、３日後にマウスより脾臓を取り出した。
脾細胞とミエローマ細胞(ＰＡＩ)(新井孝夫ら：単クロ
ーン性抗体、日本生化学会編、生化学実験講座６、「細
胞骨格の構造と機能」、489-503頁、東京化学同人、東
京、1986)を５〜１０：１の割合で混合し、５０％(w／
v)ポリエチレングリコール１５００を含む７５mＭ Ｈep
es(Boehringer Mannheim GmbH,W.，Germany)(１ml)を添
加して融合させた。細胞融合したハイブリドーマはＨＡ
Ｔ培地により選択した。
【００１５】Ｅ．抗ヒトカルシトニン抗体を産生するハ
イブリドーマの選択およびクローニング 抗ヒトカルシトニン抗体産生ハイブリドーマは、ヒトカ
ルシトニンを抗原とする酵素標識抗体法(ＥＬＩＳＡ)に
よってスクリーニングした。１μg／mlのヒトカルシト
ニンペプチドを含む５０mＭ炭酸水素ナトリウム溶液(p
Ｈ９.６)(５０μl)を９６ウエルのマイクロタイタープ
レート(COSTAR, CAT.No.3590)に入れ、４℃で１２時間
放置した。対照として、抗原を含まない対照溶液(５０
μl)を用いて同様の処理を行った。各ウエルから抗原溶
液および対照溶液を除いた後、各ウエルの表面を２５％
ブロックエース(雪印乳業株式会社)溶液(２００μl)に
より室温で１時間処理してブロッキングした。ブロッキ
ング剤を除き、各ウエルを０.０５％(v／v)のＴween ２
０を含むＰＢＳ(ＰＢＳ−Ｔween)(２００μl)で３回洗
浄した。洗浄液を除去した後、１次抗体を含む試料溶液
(５０μl)を各ウエルに入れ、室温で２時間放置して抗
原抗体反応を行わせた。次に試料溶液を除去し、ＰＢＳ
−Ｔweenで４回洗浄した後、プレート上の抗原に結合し
た１次抗体を検出するために、１次抗体に対する３００
０倍希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識２次抗体(B
io-Rad Laboratories)を含むＰＢＳ−Ｔween(５０μl)
を各ウエルに入れて抗原抗体反応を行わせた。室温で２
時間放置した後、酵素標識２次抗体溶液を除去し、ＰＢ
Ｓ−Ｔween(２００μl)で各ウエルを４回洗浄した。１
次抗体に結合した２次抗体を検出するために、０.４％
(w／v)のo-フェニレンジアミンと０.０１４％(v／v)の
３０％過酸化水素水を含む１００mＭクエン酸ナトリウ
ム溶液(pＨ４.５)(２００μl)を各ウエルに入れ、発色
反応を行った。１５分後に６Ｎ硫酸(５０μl)を加えて
反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー(Model
3550，Bio-Rad Laboratories)で４９０nmの吸光度を測
定した。抗原を吸着させた各ウエルの吸光度と対照の吸
光度の差を、その抗原に対する試料抗体の結合活性とし
た。ＥＬＩＳＡにおいてはペプチド抗原はプレートに直
接結合しており、抗原が溶液内で遊離状態にある場合と
比較すると構造的な変性を受けている可能性がある。そ
こで、遊離の抗原に対する結合性を検討するために、吸
収実験を行った。即ち、試料抗体溶液に種々の濃度の競
合ペプチドを添加し、４℃で一晩反応させた後、予め５
０ngのヒトカルシトニンでコーティングしたＥＬＩＳＡ
プレートを用いてＥＬＩＳＡを実施した。培養上清に抗
ヒトカルシトニン抗体活性が認められたウェルのハイブ
リドーマを、限界希釈法によってクローニングした。１
ウェルのハイブリドーマに対して２回のクローニングを
実施した。ハイブリドーマは１５％の牛胎児血清を含む
ＤＭＥＭ培地中で培養した。
イブリドーマの選択およびクローニング 抗ヒトカルシトニン抗体産生ハイブリドーマは、ヒトカ
ルシトニンを抗原とする酵素標識抗体法(ＥＬＩＳＡ)に
よってスクリーニングした。１μg／mlのヒトカルシト
ニンペプチドを含む５０mＭ炭酸水素ナトリウム溶液(p
Ｈ９.６)(５０μl)を９６ウエルのマイクロタイタープ
レート(COSTAR, CAT.No.3590)に入れ、４℃で１２時間
放置した。対照として、抗原を含まない対照溶液(５０
μl)を用いて同様の処理を行った。各ウエルから抗原溶
液および対照溶液を除いた後、各ウエルの表面を２５％
ブロックエース(雪印乳業株式会社)溶液(２００μl)に
より室温で１時間処理してブロッキングした。ブロッキ
ング剤を除き、各ウエルを０.０５％(v／v)のＴween ２
０を含むＰＢＳ(ＰＢＳ−Ｔween)(２００μl)で３回洗
浄した。洗浄液を除去した後、１次抗体を含む試料溶液
(５０μl)を各ウエルに入れ、室温で２時間放置して抗
原抗体反応を行わせた。次に試料溶液を除去し、ＰＢＳ
−Ｔweenで４回洗浄した後、プレート上の抗原に結合し
た１次抗体を検出するために、１次抗体に対する３００
０倍希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識２次抗体(B
io-Rad Laboratories)を含むＰＢＳ−Ｔween(５０μl)
を各ウエルに入れて抗原抗体反応を行わせた。室温で２
時間放置した後、酵素標識２次抗体溶液を除去し、ＰＢ
Ｓ−Ｔween(２００μl)で各ウエルを４回洗浄した。１
次抗体に結合した２次抗体を検出するために、０.４％
(w／v)のo-フェニレンジアミンと０.０１４％(v／v)の
３０％過酸化水素水を含む１００mＭクエン酸ナトリウ
ム溶液(pＨ４.５)(２００μl)を各ウエルに入れ、発色
反応を行った。１５分後に６Ｎ硫酸(５０μl)を加えて
反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー(Model
3550，Bio-Rad Laboratories)で４９０nmの吸光度を測
定した。抗原を吸着させた各ウエルの吸光度と対照の吸
光度の差を、その抗原に対する試料抗体の結合活性とし
た。ＥＬＩＳＡにおいてはペプチド抗原はプレートに直
接結合しており、抗原が溶液内で遊離状態にある場合と
比較すると構造的な変性を受けている可能性がある。そ
こで、遊離の抗原に対する結合性を検討するために、吸
収実験を行った。即ち、試料抗体溶液に種々の濃度の競
合ペプチドを添加し、４℃で一晩反応させた後、予め５
０ngのヒトカルシトニンでコーティングしたＥＬＩＳＡ
プレートを用いてＥＬＩＳＡを実施した。培養上清に抗
ヒトカルシトニン抗体活性が認められたウェルのハイブ
リドーマを、限界希釈法によってクローニングした。１
ウェルのハイブリドーマに対して２回のクローニングを
実施した。ハイブリドーマは１５％の牛胎児血清を含む
ＤＭＥＭ培地中で培養した。
【００１６】Ｆ．マウス腹水由来のモノクローナル抗体
の生産と精製 マウス生体内の免疫活性を減少させて腹水の生成を容易
にする目的で、Ｂalb／cマウス(雄、８週令)の腹腔内に
２,６,１０,１４−テトラメチルペンタデカン(１ml)を
投与した。約１０日後、１０7個のハイブリドーマを含
むＤＭＥＭ溶液(０.５ml)をマウス腹腔内に投与した。
約２週間後に腹水を採取し、１０００ｘｇで遠心して細
胞を除去した。得られた上清から、プロテインＡカラム
(Bio-Rad Laboratories Co. Ltd)によるアフィニティー
クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製
した。
の生産と精製 マウス生体内の免疫活性を減少させて腹水の生成を容易
にする目的で、Ｂalb／cマウス(雄、８週令)の腹腔内に
２,６,１０,１４−テトラメチルペンタデカン(１ml)を
投与した。約１０日後、１０7個のハイブリドーマを含
むＤＭＥＭ溶液(０.５ml)をマウス腹腔内に投与した。
約２週間後に腹水を採取し、１０００ｘｇで遠心して細
胞を除去した。得られた上清から、プロテインＡカラム
(Bio-Rad Laboratories Co. Ltd)によるアフィニティー
クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製
した。
【００１７】Ｇ．抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗
体の性質 ４０μgのｈＣＴ−ＫＬＨ抗原で免疫したマウス１匹と
４０μgのｈＣＴ−オボアルブミン抗原で免疫したマウ
ス１匹より得た脾細胞を用いて細胞融合を行った結果、
１１株の抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマをクローニングすることができた。これら
のうち、ｈＣＴ−ＫＬＨ抗原由来のハイブリドーマクロ
ーンをハイブリドーマＫＣＴ１〜８と、そしてｈＣＴ−
オボアルブミン抗原由来のハイブリドーマクローンをハ
イブリドーマＯＣＴ１〜３と命名し、また、それらが産
生するモノクローナル抗体をそれぞれＭＡb ＫＣＴ１〜
８およびＭＡb ＯＣＴ１〜３と命名した。腹水から得た
抗体についてサブクラスを決定すると、１種類のモノク
ローナル抗体ＭＡb ＯＣＴ３のみがＩgＧ2bタイプであ
り、他のモノクローナル抗体はすべてＩgＧ1タイプであ
った。
体の性質 ４０μgのｈＣＴ−ＫＬＨ抗原で免疫したマウス１匹と
４０μgのｈＣＴ−オボアルブミン抗原で免疫したマウ
ス１匹より得た脾細胞を用いて細胞融合を行った結果、
１１株の抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマをクローニングすることができた。これら
のうち、ｈＣＴ−ＫＬＨ抗原由来のハイブリドーマクロ
ーンをハイブリドーマＫＣＴ１〜８と、そしてｈＣＴ−
オボアルブミン抗原由来のハイブリドーマクローンをハ
イブリドーマＯＣＴ１〜３と命名し、また、それらが産
生するモノクローナル抗体をそれぞれＭＡb ＫＣＴ１〜
８およびＭＡb ＯＣＴ１〜３と命名した。腹水から得た
抗体についてサブクラスを決定すると、１種類のモノク
ローナル抗体ＭＡb ＯＣＴ３のみがＩgＧ2bタイプであ
り、他のモノクローナル抗体はすべてＩgＧ1タイプであ
った。
【００１８】ヒトカルシトニンの種々のフラグメントを
用いて、得られたモノクローナル抗体のエピトープをＥ
ＬＩＳＡ法によって決定した(表２および表３)。
用いて、得られたモノクローナル抗体のエピトープをＥ
ＬＩＳＡ法によって決定した(表２および表３)。
【表２】合成ｈＣＴフラグメントに対するモノクローナル抗体の反応性(ＥＬＩＳＡ) モノクローナル抗体(ＭＡb) KCT1 KCT2 KCT3 KCT4 KCT5 KCT6 KCT7 KCT8 OCT1 OCT2 OCT3 hCT( 1-32)： ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ hCT( 1-10)： − − − − − − − − ＋ ± − hCT(11-20)： − ＋ ＋ − − − ＋ − − − ＋ hCT(21-32)： − − − ＋ ＋ ＋ − ＋ − − − hCT( 1-22)： ± ＋ ＋ − − − ＋ − ＋ ＋ ＋ hCT(11-32)： ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − − ＋
【表３】 合成ｈＣＴフラグメントに対するモノクローナル抗体の反応性(吸収実験) モノクローナル抗体(ＭＡb) KCT1 KCT2 KCT3 KCT4 KCT5 KCT6 KCT7 KCT8 OCT1 OCT2 OCT3 hCT( 1-32)： ± ＋ ＋ ＋ ＋ ± ＋ ＋ ± ＋ ＋ hCT( 1-10)： − − − − − − − − ＋ ＋ − hCT(11-20)： − ± ＋ − − − ± − − − ＋ hCT(21-32)： − − − ＋ ＋ ± − ＋ − − − hCT( 1-22)； − ＋ ＋ − − − ＋ − ± ＋ ＋ hCT(11-32)； ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ± ＋ ＋ − − ＋ その結果、ヒトカルシトニンをグルタルアルデヒドでＫ
ＬＨに結合したものを抗原として免疫したマウスから
は、主にヒトカルシトニンの中央部分とＣ末端を認識す
るモノクローナル抗体が得られた(ＭＡb ＫＣＴ１〜Ｋ
ＣＴ８)。それに対して、ヒトカルシトニンをＥＤＣで
オボアルブミンに結合したものを抗原として免疫したマ
ウスからは、主にヒトカルシトニンのＮ末端部分を認識
するモノクローナル抗体が得られた(ＭＡb ＯＣＴ１お
よびＯＣＴ２)。これは架橋試薬によってペプチド−担
体タンパク質の構造が異なるためと考えられる。また、
Ｎ末端をエピトープとする抗体は、更に２つに分類され
ることがわかった。ＭＡb ＯＣＴ１はヒトカルシトニン
のＮ末端部分のアミノ酸配列を含むペプチド、hＣＴ(1-
10)およびhＣＴ(1-22)と結合し、エピトープはＮ末端ア
ミノ酸配列の１０残基の中にあると推定された。一方、
ＭＡb ＯＣＴ２はhＣＴ(1-10)とは結合しないが、hＣＴ
(1-22)とは結合した。吸収実験を行なうとＭＡb ＯＣＴ
２のヒトカルシトニンに対する結合活性はhＣＴ(1-10)
によって吸収されることから、この抗体は遊離のhＣＴ
(1-10)とは結合することができるが、ＥＬＩＳＡプレー
トに結合させたhＣＴ(1-10)とは結合することができな
いことがわかり、明らかにＭＡb ＯＣＴ１とは性質が異
なることが判明した。また、ＭＡb ＫＣＴ１はヒトカル
シトニンhＣＴ(1-32)およびhＣＴ(11-32)とのみ結合
し、hＣＴ(1-10)、hＣＴ(11-20)、hＣＴ(21-32)のいず
れとも結合せず、エピトープはhＣＴ(11-20)とhＣＴ(21
-32)の境界付近にあると推定された。
ＬＨに結合したものを抗原として免疫したマウスから
は、主にヒトカルシトニンの中央部分とＣ末端を認識す
るモノクローナル抗体が得られた(ＭＡb ＫＣＴ１〜Ｋ
ＣＴ８)。それに対して、ヒトカルシトニンをＥＤＣで
オボアルブミンに結合したものを抗原として免疫したマ
ウスからは、主にヒトカルシトニンのＮ末端部分を認識
するモノクローナル抗体が得られた(ＭＡb ＯＣＴ１お
よびＯＣＴ２)。これは架橋試薬によってペプチド−担
体タンパク質の構造が異なるためと考えられる。また、
Ｎ末端をエピトープとする抗体は、更に２つに分類され
ることがわかった。ＭＡb ＯＣＴ１はヒトカルシトニン
のＮ末端部分のアミノ酸配列を含むペプチド、hＣＴ(1-
10)およびhＣＴ(1-22)と結合し、エピトープはＮ末端ア
ミノ酸配列の１０残基の中にあると推定された。一方、
ＭＡb ＯＣＴ２はhＣＴ(1-10)とは結合しないが、hＣＴ
(1-22)とは結合した。吸収実験を行なうとＭＡb ＯＣＴ
２のヒトカルシトニンに対する結合活性はhＣＴ(1-10)
によって吸収されることから、この抗体は遊離のhＣＴ
(1-10)とは結合することができるが、ＥＬＩＳＡプレー
トに結合させたhＣＴ(1-10)とは結合することができな
いことがわかり、明らかにＭＡb ＯＣＴ１とは性質が異
なることが判明した。また、ＭＡb ＫＣＴ１はヒトカル
シトニンhＣＴ(1-32)およびhＣＴ(11-32)とのみ結合
し、hＣＴ(1-10)、hＣＴ(11-20)、hＣＴ(21-32)のいず
れとも結合せず、エピトープはhＣＴ(11-20)とhＣＴ(21
-32)の境界付近にあると推定された。
【００１９】これらの結果を表４および図１にまとめ
る。
る。
【表４】 抗ｈＣＴモノクローナル抗体の精製結果 No. クローン名 アイソタイプ エピトープ 精製量(mg) １ ＫＣＴ１ ＩｇＧ１,κ hＣＴ(11-20)−hＣＴ(21-32) ８.７ ２ ＫＣＴ２ ＩｇＧ１,κ hＣＴ(11-20) ２１.８ ３ ＫＣＴ３ ＩｇＧ１,κ hＣＴ(11-20) １.８ ４ ＫＣＴ４ ＩｇＧ１,κ hＣＴ(21-32) ２０.３ ５ ＫＣＴ５ ＩｇＧ１,κ hＣＴ(21-32) ９.６ ６ ＫＣＴ６ ＩｇＧ１,κ hＣＴ(21-32) １３.６ ７ ＫＣＴ７ ＩｇＧ１,κ hＣＴ(11-20) １２.１ ８ ＫＣＴ８ ＩｇＧ１,κ hＣＴ(21-32) ２５.２ ９ ＯＣＴ１ ＩｇＧ１,κ hＣＴ(1-10) ３０.２ 10 ＯＣＴ２ ＩｇＧ１,κ hＣＴ(1-10) ３０.８ 11 ＯＣＴ３ ＩｇＧ２ｂ,κ hＣＴ(11-20) ２０.５ 本発明に係る上記のハイブリドーマＯＣＴ１およびＯＣ
Ｔ２(それぞれ、ＭＡbＯＣＴ１およびＯＣＴ２を産生す
る)は、平成３年(１９９１)９月２６日に工業技術院微
生物工業技術研究所に国内寄託され、平成４年(１９９
２)９月９日に国際寄託に移管され、受託番号として、
それぞれ微工研条寄第４００１号(ＦＥＲＭ ＢＰ−４０
０１)および第４００２号(ＦＥＲＭ ＢＰ−４００２)を
取得している。
Ｔ２(それぞれ、ＭＡbＯＣＴ１およびＯＣＴ２を産生す
る)は、平成３年(１９９１)９月２６日に工業技術院微
生物工業技術研究所に国内寄託され、平成４年(１９９
２)９月９日に国際寄託に移管され、受託番号として、
それぞれ微工研条寄第４００１号(ＦＥＲＭ ＢＰ−４０
０１)および第４００２号(ＦＥＲＭ ＢＰ−４００２)を
取得している。
【００２０】実施例２ モノクローナル抗体によるサン
ドイッチ法の構築 ＭＡb ＫＣＴ２およびＯＣＴ２を用いてサンドイッチ法
を構築し、その検出感度について検討した。ＭＡb ＯＣ
Ｔ２の標識は、Biotinilation kit(Amersham Internati
onal plc)を用いてビオチンにより行った。ＥＬＩＳＡ
プレートの各ウエルを１０μg／mlのＭＡb ＫＣＴ２(１
次抗体)(５０μl)により予め４℃で一晩処理してコーテ
ィングした。次に、種々の濃度のヒトカルシトニンを含
む１０％のブロックエース溶液またはカルシトニンを含
まない血清(SCANTIBODIES LABORATORY, INC.)(５０μl)
を各ウエルに添加して１５℃で５時間反応させた後、
０.３μg／mlのビオチン標識ＭＡb ＯＣＴ２(２次抗体)
を各ウエルに添加して４℃で１５時間反応させた。２次
抗体を検出するために、Vecstain Elite ABCキット(Vec
tor Laboratories,Inc.)と３,３',５,５'−テトラメチ
ルベンチジン(ＴＭＢ)Microwell Peroxidase Substrate
System(Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.)を用
いて発色反応を行い、酵素反応停止後に４５０nmの吸光
度を測定した。その結果、ＭＡb ＫＣＴ２−ＭＡb ＯＣ
Ｔ２の組合わせにおけるサンドイッチアッセイ法は、約
４pg／mlの濃度の血中ヒトカルシトニンを検出すること
ができることがわかった(図２)。
ドイッチ法の構築 ＭＡb ＫＣＴ２およびＯＣＴ２を用いてサンドイッチ法
を構築し、その検出感度について検討した。ＭＡb ＯＣ
Ｔ２の標識は、Biotinilation kit(Amersham Internati
onal plc)を用いてビオチンにより行った。ＥＬＩＳＡ
プレートの各ウエルを１０μg／mlのＭＡb ＫＣＴ２(１
次抗体)(５０μl)により予め４℃で一晩処理してコーテ
ィングした。次に、種々の濃度のヒトカルシトニンを含
む１０％のブロックエース溶液またはカルシトニンを含
まない血清(SCANTIBODIES LABORATORY, INC.)(５０μl)
を各ウエルに添加して１５℃で５時間反応させた後、
０.３μg／mlのビオチン標識ＭＡb ＯＣＴ２(２次抗体)
を各ウエルに添加して４℃で１５時間反応させた。２次
抗体を検出するために、Vecstain Elite ABCキット(Vec
tor Laboratories,Inc.)と３,３',５,５'−テトラメチ
ルベンチジン(ＴＭＢ)Microwell Peroxidase Substrate
System(Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.)を用
いて発色反応を行い、酵素反応停止後に４５０nmの吸光
度を測定した。その結果、ＭＡb ＫＣＴ２−ＭＡb ＯＣ
Ｔ２の組合わせにおけるサンドイッチアッセイ法は、約
４pg／mlの濃度の血中ヒトカルシトニンを検出すること
ができることがわかった(図２)。
【００２１】実施例３ 甲状腺髄様癌患者の血清の分析 甲状腺髄様癌患者の血清中のヒトカルシトニン濃度は著
しく上昇することが知られている。そこで、患者の血清
を高速分子篩クロマトグラフィーで分画し、市販のＲＩ
Ａキットおよび種々の抗体を組合せたサンドイッチアッ
セイ法によって分析を試みた。ヒト血清は、Shodex PRO
TEIN KW-803カラム(８mm×３０cm、２本組)による高速
分子篩クロマトグラフィーによって分画した。送液シス
テムは、Waters 600E Multisolvent Delivery Systemを
用いた。カラムは予め、０.２ＭＮaＣlを含む０.１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液(pＨ７.０)で平衡化した。試料血清
(１００μl)をカラムに注入し、１.０ml／分の流速で展
開した。２８０nmの吸光度をWaters 484 Tunable Absor
bance Detectorでモニターし、結果をWaters 741Data M
oduleによって記録した。溶出液を０.５mlずつ分取し、
その５０μlをＥＬＩＳＡに、１０μlをＲＩＡにそれぞ
れ用いた。ＲＩＡキットはバクスター株式会社より購入
した。一部の実験では、２次抗体としてヒトカルシトニ
ン抗血清(ダコ・ジャパン株式会社)を用いた。ＨＰＬＣ
の分子量決定用タンパク質マーカーはオリエンタル酵母
工業(株)より購入した。分子量マーカーとして、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ(Mw290,000)、乳酸デヒドロゲ
ナーゼ(Mw 142,000)、エノラーゼ(Mw 67,000)、アデニ
ル酸キナーゼ(Mw 32,000)、シトクロムＣ(Mw 12,400)を
用いた。患者の血清について高速分子篩クロマトグラフ
ィーを行って得た画分をＲＩＡキットで分析すると、モ
ノマーヒトカルシトニンのピーク以外にも大きな分子量
の領域に未分離のピークを含めて５つのピークが認めら
れた(図３)。これらのピークは各画分を還元すると消失
したことから(データは示していない)、ヒトカルシトニ
ンの重合体か、または他の蛋白質とカルシトニンの結合
体と考えられる。一方、同一画分をＭＡb ＫＣＴ２−Ｍ
Ａb ＫＣＴ８によるサンドイッチアッセイ法で分析する
と、同様にヒトカルシトニンのピーク、およびそれより
も大きな分子量の領域に４つのピークが検出された。Ｒ
ＩＡキットによる分析と比較すると、ＭＡb ＫＣＴ２−
ＭＡb ＫＣＴ８によるサンドイッチアッセイ法による分
析では、ＲＩＡで検出される高分子領域のピークのうち
の１つが検出されないことがわかった。次に、２次抗体
をカルシトニンのＮ末端を認識するＭＡb ＯＣＴ２に変
更したサンドイッチアッセイ法(ＭＡb ＫＣＴ２−ＭＡb
ＯＣＴ２)によって同様な分析を行うと、ＲＩＡおよび
ＭＡb ＫＣＴ２−ＭＡb ＫＣＴ８アッセイで最も高分子
領域に検出されるピークを検出しないことがわかった。
これに対して、２次抗体を市販のポリクローナル血清を
用いてサンドイッチアッセイを試みると、検出されるピ
ークの種類とパターンはＲＩＡの結果とほぼ同様であっ
た。これらの結果は、モノクローナル抗体を適切に選択
することにより、モノマーヒトカルシトニンのみを検出
しうるサンドイッチアッセイ法を構築することができる
ことを示唆するものである。
しく上昇することが知られている。そこで、患者の血清
を高速分子篩クロマトグラフィーで分画し、市販のＲＩ
Ａキットおよび種々の抗体を組合せたサンドイッチアッ
セイ法によって分析を試みた。ヒト血清は、Shodex PRO
TEIN KW-803カラム(８mm×３０cm、２本組)による高速
分子篩クロマトグラフィーによって分画した。送液シス
テムは、Waters 600E Multisolvent Delivery Systemを
用いた。カラムは予め、０.２ＭＮaＣlを含む０.１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液(pＨ７.０)で平衡化した。試料血清
(１００μl)をカラムに注入し、１.０ml／分の流速で展
開した。２８０nmの吸光度をWaters 484 Tunable Absor
bance Detectorでモニターし、結果をWaters 741Data M
oduleによって記録した。溶出液を０.５mlずつ分取し、
その５０μlをＥＬＩＳＡに、１０μlをＲＩＡにそれぞ
れ用いた。ＲＩＡキットはバクスター株式会社より購入
した。一部の実験では、２次抗体としてヒトカルシトニ
ン抗血清(ダコ・ジャパン株式会社)を用いた。ＨＰＬＣ
の分子量決定用タンパク質マーカーはオリエンタル酵母
工業(株)より購入した。分子量マーカーとして、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ(Mw290,000)、乳酸デヒドロゲ
ナーゼ(Mw 142,000)、エノラーゼ(Mw 67,000)、アデニ
ル酸キナーゼ(Mw 32,000)、シトクロムＣ(Mw 12,400)を
用いた。患者の血清について高速分子篩クロマトグラフ
ィーを行って得た画分をＲＩＡキットで分析すると、モ
ノマーヒトカルシトニンのピーク以外にも大きな分子量
の領域に未分離のピークを含めて５つのピークが認めら
れた(図３)。これらのピークは各画分を還元すると消失
したことから(データは示していない)、ヒトカルシトニ
ンの重合体か、または他の蛋白質とカルシトニンの結合
体と考えられる。一方、同一画分をＭＡb ＫＣＴ２−Ｍ
Ａb ＫＣＴ８によるサンドイッチアッセイ法で分析する
と、同様にヒトカルシトニンのピーク、およびそれより
も大きな分子量の領域に４つのピークが検出された。Ｒ
ＩＡキットによる分析と比較すると、ＭＡb ＫＣＴ２−
ＭＡb ＫＣＴ８によるサンドイッチアッセイ法による分
析では、ＲＩＡで検出される高分子領域のピークのうち
の１つが検出されないことがわかった。次に、２次抗体
をカルシトニンのＮ末端を認識するＭＡb ＯＣＴ２に変
更したサンドイッチアッセイ法(ＭＡb ＫＣＴ２−ＭＡb
ＯＣＴ２)によって同様な分析を行うと、ＲＩＡおよび
ＭＡb ＫＣＴ２−ＭＡb ＫＣＴ８アッセイで最も高分子
領域に検出されるピークを検出しないことがわかった。
これに対して、２次抗体を市販のポリクローナル血清を
用いてサンドイッチアッセイを試みると、検出されるピ
ークの種類とパターンはＲＩＡの結果とほぼ同様であっ
た。これらの結果は、モノクローナル抗体を適切に選択
することにより、モノマーヒトカルシトニンのみを検出
しうるサンドイッチアッセイ法を構築することができる
ことを示唆するものである。
【図１】 ヒトカルシトニンのエピトープとそれに特異
的なモノクローナル抗体の関係を示す模式図である。
的なモノクローナル抗体の関係を示す模式図である。
【図２】 ＭＡb ＫＣＴ２−ＭＡb ＯＣＴ２を用いてサ
ンドイッチ法によりヒトカルシトニンを測定した結果を
示すグラフである。
ンドイッチ法によりヒトカルシトニンを測定した結果を
示すグラフである。
【図３】 種々の抗体を組合せてサンドイッチ法により
甲状腺髄様癌患者の血清を調べた結果を示すグラフであ
る。
甲状腺髄様癌患者の血清を調べた結果を示すグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/74 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 松下 功 大阪府大阪市中央区平野町４丁目１番２ 号 大阪瓦斯株式会社内 (56)参考文献 Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 88 ［２］（1988）ｐ．113−125 Ｇｅｎｅ 59［２−３］（1987）ｐ. 223−230 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ. 134［１］（1990）ｐ．87−94 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＯＩＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒトカルシトニンのＮ末端部分を特異的
に認識するモノクローナル抗体であって、ハイブリドー
マＯＣＴ１(ＦＥＲＭ ＢＰ−４００１)により産生され
るモノクローナル抗体ＭＡb ＯＣＴ１およびハイブリド
ーマＯＣＴ２(ＦＥＲＭ ＢＰ−４００２)により産生さ
れるモノクローナル抗体ＭＡb ＯＣＴ２からなる群から
選択されるモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ヒトカルシトニンのＮ末端部分を特異的
に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞株であって、モノクローナル抗体ＭＡb ＯＣＴ１
を産生するハイブリドーマＯＣＴ１(ＦＥＲＭ ＢＰ−４
００１)およびモノクローナル抗体ＭＡb ＯＣＴ２を産
生するハイブリドーマＯＣＴ２(ＦＥＲＭ ＢＰ−４００
２)からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3263587A JP2955082B2 (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | ヒトカルシトニンのｎ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体 |
| US07/958,083 US5330909A (en) | 1991-10-11 | 1992-10-08 | Monoclonal antibody specifically recognizing N-terminal portion of human calcitonin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3263587A JP2955082B2 (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | ヒトカルシトニンのｎ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05103689A JPH05103689A (ja) | 1993-04-27 |
| JP2955082B2 true JP2955082B2 (ja) | 1999-10-04 |
Family
ID=17391623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3263587A Expired - Lifetime JP2955082B2 (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | ヒトカルシトニンのｎ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5330909A (ja) |
| JP (1) | JP2955082B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
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|---|---|---|---|---|
| JP4037933B2 (ja) * | 1996-12-24 | 2008-01-23 | 大阪瓦斯株式会社 | 抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体 |
| US5993811A (en) * | 1997-02-03 | 1999-11-30 | Biology Associates, Llc | Method and compositions for preventing and treating the systemic inflammatory response syndrome including sepsis |
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| FR2943788B1 (fr) | 2009-03-24 | 2016-12-30 | Hopitaux Paris Assist Publique | Procede de prediction d'un reflux vesico ureteral de haut grade chez les enfants avec une premiere infection urinaire febrile |
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2525592B1 (ja) * | 1982-04-26 | 1984-09-14 | Pasteur Institut | |
| US4689220A (en) * | 1984-02-16 | 1987-08-25 | Unigene Laboratories, Inc. | Immunization by immunogenic implant |
-
1991
- 1991-10-11 JP JP3263587A patent/JP2955082B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-10-08 US US07/958,083 patent/US5330909A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ ５９［２−３］（１９８７）ｐ．２２３−２３０ |
| Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８８［２］（１９８８）ｐ．１１３−１２５ |
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．１３４［１］（１９９０）ｐ．８７−９４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5330909A (en) | 1994-07-19 |
| JPH05103689A (ja) | 1993-04-27 |
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