BG64181B1

BG64181B1 - Моноклонално антитяло срещу cd44v6

Info

Publication number: BG64181B1
Application number: BG101024A
Authority: BG
Inventors: Guenther R. Adolf; Erik Patzelt
Original assignee: Boehringer Ingelheim International Gmbh; Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh
Priority date: 1994-06-08
Filing date: 1996-12-03
Publication date: 2004-03-31
Also published as: NO965239L; PL190897B1; HU9603387D0; HU220168B; CN1152925A; BG101024A; FI964845A0; PL317536A1; UA58482C2; JPH10501797A; RU2204606C2; CA2192370A1; JP3387929B2; CZ359196A3; CO4410258A1; DK0765343T3; SI0765343T1; NZ288224A; ATE197592T1; NO965239D0

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася за моноклонално антитяло срещу епитоп, който се кодира от вариантния екзон v6 на гена за CD44, за изведена от него антитялова молекула, както и за приложение на антитялото, респективно на антитяловата молекула в диагностиката и терапията.

Предшестващо състояние на техниката

Наскоро беше показано, че експресията на варианти на повърхностния гликопротеин CD44 е необходима и достатъчна, за да предизвика така нареченото спонтанно образуване на метастази, както в неметастазираща шгьша фибросаркомна клетъчна линия, така и в неметастазираща клетъчна линия от плъши панкреатичен аденокарцином (Gunthert et al., 1991). Докато най-малката изоформа на CD44, стандартната форма CD44s (или CD44std) се експресира обилно в редица различни тъкани, в това число в епителните клетки, определени сплайсингови варианти на CD44 (CD44v, CD44var) се експресират само върху една подгрупа епителни клетки. Вариантите на CD44 се получават чрез алтернативен сплайсинг така, че напълно се изрязват последователностите на 10 екзона (vl-vlO) в CD44, макар че в по-големите варианти те могат да се явят в различни комбинации (Screaton et al., 1992; Tolg et al., 1993; Hofmann et al., 1991). Вариантите се различават по това, че на определено място в извънклетъчния участък на белтъка са включени различни аминокиселинни последователности. Такива варианти бяха доказани в различни човешки туморни клетки и човешка туморна тъкан. Така наскоро беше изследвана експресията на СО44-варианти в хода на колоректалната карциногенеза (Heider et al., 1993а). В нормалния човешки епител на дебелото черво липсва експресия на СО44-варианти, а в пролифериращите клетки на субепитела се установява само слаба експресия. В покъсни стадии на туморната прогресия, напр., в аденокарциномите, всяко злокачествено израждане експресира варианти на CD44. Високо ниво на тъканна експресия на вариантен CD44 беше показано също и в агресивни не-Ходчки нови лимфоми (Koopman et al., 1993).

Изглежда че екзон v6 играе по-специална роля, особено при разпространяването на метастазите (Rudy et al., 1993). В животински модул антитела срещу уб-специфичния епитоп възпрепятстват инвазията на метастазиращите клетки и растежа на метастазите (Seiter et al., 1993). В карциноми на дебелото черво експресията на v6 корелира с прогресията на тумора (Wielenga et al., 1993). При стомашни карциноми експресията на v6 представлява важен диагностичен маркер за правене на разлика между тумори от интестинален и такива от дифузен тип (Heider et al., 1993b). В последните две цитирани работи експресията на v6 се измерва с помощта на антитела срещу убспецифичния епитоп.

Моноклонални антитела срещу епитопа, който се кодира от екзон v6, са известни в областта на техниката (Hofman et al., 1991; Wielenga et al., 1993). Съществува голяма необходимост от антитела с подобрени свойства, поради голямата потенциална полза, която подобни антитела могат да имат в диагностиката и терапията.

Техническа същност на изобретението

Задача на изобретението е да осигури антитяло, което показва значително по-добри свойства от известните уб-специфични антитела.

Задачата е изпълнена съгласно изобретението, което се отнася до антитяло с означението VFF-18, до хибридомна клетъчна линия, която секретира това антитяло и е заведена под депозитен номер DSM АСС2174 в DMS GmbH (германска библиотека за микроорганизми и клетъчни култури) с адрес: Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Deutschland.

В следващото изложение под понятията антитяло или антитялова молекула да се разбират не само цели имуноглобулини, но и субстанции, еквивалентни с оглед на специфичността и афинитета на свързване, подобно на описаните производни на антителата и рекомбинантни антитялови молекули.

Антитялото от изобретението VFF-18 е получено съгласно метода, описан в пример 1. Антитялото може освен това да се изолира от произвеждащата го хибридомна клетъчна линия. Всеки специалист от средна величина е в състояние да получи производни на антитяло2 то на изобретението или като изхожда от анализ на последователността на това антитяло и/или като използва хибридомната клетъчна линия, която продуцира това антитяло, да получи рекомбинантни антитялови молекули със същия идиотип, т.е. антитялови молекули, които в областта на антигенсвързващото място (complementarity-determining region) показват същата аминокиселинна последователност като антитяло VFF-18. Поради това такива производни и рекомбинантни антитялови молекули изрично са включени в изобретението.

От пълния имуноглобулин на антитялото VFF-18 могат например да се получат Fabили Р(аЬ’)₂-фрагменти или други фрагменти (Kreitman et al., 1993). За диагностични цели е възможно антитяловата молекула VFF-18, фрагменти от нея или рекомбинантни антитялови молекули със същия идиотип да бъдат свързани, например с радиоактивен изотоп като ^13II, '“In, ^99mTc или радиоактивно съединение (Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989;· Srivastava, 1988), ензими като пероксидаза или алкална фосфатаза (Catty et Raykundalia, 1989), с флуоресцентни багрила (Johnson, 1989) или биотинови молекули (Guesdon et al., 1979). За терапевтично приложение е възможно VFF18 или изведените от VFF-18 антитялови молекули да бъдат свързани с токсини (Vitetta et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Theuer et al., 1993), цитостатици (Schrappe et al. 1992), продроги (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989) или радиоактивни субстанции. Освен това антитялото може да бъде свързано с цитокин или друг имуномодулаторен полипептид, например туморен некрозисен фактор или интерлевкин-2.

След анализ на аминокиселинната последователност на антитяло VFF-18 и/или чрез използване на хибридомната клетъчна линия, която произвежда това антитяло и особено на съдържащата се в нея генетична информация, специалистът е в състояние да получи рекомбинантни антитялови молекули със същия идиотип като VFF-8. Подходящи за това методи са достояние на техниката. Такива рекомбинантни антитялови молекули могат да бъдат например, хуманизирани антитела (Shin et al., 1989; Gussow et Seemann, 1991), биспецифичниантитела (Weiner etal., 1993; Goodwin, 1989), едноверижни (single chain) антитела (scFv, Johnson et Bird, 1991), цели имуноглобулини или фрагменти от тях (Coloma et al., 1992; Nesbit et al., 1992; Barbas et al., 1992) или антитела, получени чрез разместване на веригите (chain shuffling) (Winter et al., 1994). Хуманизирани антитела могат да бъдат получени например чрез “присаждане” на CDR (CDRgrafting) (ЕР 0239400). Скелетните (framework) области също могат да бъдат модифицирани (ЕР 0519596). За хуманизиране на антителата днес могат да се използват методи като PCR (виж напр. ЕР 0368684; ЕР 0438310; WO 9207075) или компютърно моделиране (виж напр., WO 9222653). Могат също така да се получат слети белтъци, например слети белтъци от типа едноверижно антитяло/токсин (Chaudhary et al., 1990; Friedman et al., 1993). Поради това такива антитялови молекули също са включени в изобретението.

В сферата на способностите на един специалист от средна величина е също така да идентифицира точния епитоп на VFF-18 и познавайки го да получи еквивалентни антитела със същата специфичност на свързване. Това може да стане например чрез изследвания върху свързването с пептиди, както в пример 2, чрез известно вариране на пептида Hui. Поради това такива антитела също са включени в изобретението.

Следващ аспект на изобретението е използването на VFF-18 или на антитялови молекули, изведени от или еквивалентни на VFF18 в диагностиката и терапията.

Диагностичните методи могат да бъдат по същество известни методи, които се прилагат с антитяловата молекула на изобретението, например ензимно свързани имуносорбентни тестове (ELISA, Catty et Raykundalia, 1989), paдиоимунологични тестове (Catty et Murphy, 1989), имунохистохимични методи (Heider et al., 1993b) или имунологични преноси (Western Blots). Тези методи могат по целесъобразност да бъдат провеждани с тъканни проби, взети от тялото или с телесни течности, например от биопсии. Изследванията могат да бъдат качествени, полукачествени или количествени. При това антитялото или антитяловата молекула могат да се включат например, както е описано в областта на техниката, за други уб-специфични антитела (WO 9500851), при което по-добрите свойства на антитялото на изобретението или на антитяловата молекула на изобретението означават едно значително подобрение на таки3 ва методи.

Заедно с диагностиката in vitro антитяловите молекули на изобретението са приложими също и да диагностика iv vivo, особено на тумори. Ако антитяловата молекула носи бе- 5 лег, който може да се детектира, това може да способства детекцията на белега за диагностични цели, например визуализиране на тумора in vivo (imaging) или например за радиохирургия (radioguided surgery). За употребата на 10 антитела, конюгирани с радиоактивни изотопи в имуносцинтиграфията (imaging), например има редица протоколи, на чиято основа специалистът може да изпълни изобретението (Siccardi et al., 1989; Keenan et al., 1987; Perkins et Pimm, 15 1992; Colcher et al., 1987; Thompson et al., 1984).

Едно терапевтично приложение може например да се осъществи аналогично на използването на антитяло 1.1ASML (Seiter et al., 1993). При това приложение може да бъде сис- 20 темно или локално, например чрез интравенозна (като bolus или продължителна инфузия), интраперитонеална, интрамускулна,субкутанна или друга инжекция/инфузия. Могат също да се перфузират отделни органи или крайни- 25 ци. Протоколи за приложението на конюгирани или неконюгирани антитела (било то като цели имуноглобулини, фрагменти, рекомбинантни химерни молекули или подобни) са достояние на техниката (Mulshine et al., 1991; Larson 30 et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992; Press et al., 1989; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears et al., 1982).

Примери от 2 до 4 показват свойствата, 35 по които VFF-18 превъзхожда други антиСО44у6-антитела.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 представя схематично слетия ₄θ белтък GST-CD44 (ν3-ν10), като GST е глутатион-Б-трансфераза от Schistosoma japonicum и v3-vl0 означава вариант на инсерция в кератиноцитен CD44. Стрелката маркира място за разкъсване от тромбин. 45

Фигура 2 представя сравняване на последователностите на екзон v6 на гена CD44 между човек и плъх. Последователностите на пептидите Rai и Hui, с които се свързват антителата 1.1ASML (анти-плъше CD44v6) и VFF- 50 18 (анти-човешко CD44v6), са удебелени. Идентичните аминокиселини са отбелязани със звезда.

Фигура 3 показва свързване на CD44v6специфичните антитела със синтетични пептиди. Свързването на антителата с пептидите се определя чрез ELISA, при която пептидите се имобилизират и след това се инкубират с разтворите на антителата. След подходящи стъпки на миене свързаното антитяло се доказва с антимише-^О-антитяло, конюгирано с пероксидаза. (А): В първия експеримент се установява свързването на антитялото 1.1ASML, специфично за плъши CD44v6, с пептида Rai (KWFEN EWQGK NPPT). (В): В следващ опит се синтезира пептид от човешката CD44v6последователност, хомоложен на Rai. С този пептид Hui (QWFGN RWHEG YRQT) се свързват различни хибридомни супернатанти срещу човешки CD44v6. При това се вижда, че VFF-18 се свързва значително по-добре с пептида, отколкото останалите използвани антитела. (С): За количествена оценка този експеримент се повтаря с различни концентрации от пречистени антитела. И тук се вижда, че VFF-18 проявява по-висока специфичност⁵*-на свързване, отколкото другите антитела.

Фигура 4 показва свързване на радио-^жактивно белязани антитела с туморни клетки?®⁶* Трите антитела VFF-7 (анти-νό), VFF-8 (ан-²^ th-v5) и VFF-18 (анти-νό) се бележат радио активно с N-сукцинимидил [2,3-³Н]пропионтат^ж~ и за тестовете на свързване се прибавят към²^ различни туморни клетъчни линии. Използват · ' се следните клетъчни линии: CHO-CD44var:pe- комбинантна клетъчна линия от хамстер' (Chinese Hamster Ovary), която експресира на повърхността човешки вариант на CD44 (екзони v3-vl0); НСТ-116, СХ-1, НТ-29, СаСо, COLO 205; човешки линии от карцином на дебелото черво; А431; човешка линия от карцином на плоския епител. Показано е специфичното свързване на антителата с различните клетъчни линии. Докато свързването на νόспецифичните антитела VFF-7 и VFF-18 с рекомбинантната клетъчна линия CHO-CD44var е от един и същи порядък, то по отношение на свързването с туморните клетъчни линии антителата показват твърде различно поведение на свързване. В някои случаи се наблюдава свързване само на VFF-18 и в по-ниска степен на VFF-8 (НТ-29, СаСо, COLO 205), докато с други клетъчни линии VFF-18 се свързва значително по-добре от VFF-7.

Фигура 5 показва доказване на разтво4 рими варианти на CD44, които съдържат екзона v6, в нормален човешки серум. В сандвичева ELISA трите νό-специфични антитела VFF4, VFF-7, респ. VFF-18 се използват като покриващи антитела. Във всички три случая като доказващо антитяло се прилага антитяло (BU52), специфично за CD44std (std = стандарт) и конюгирано с пероксидаза. Показан е сигналът от три различни нормални човешки серума при различни разреждания в тези тестове ((А) и (В)). И в двата случая се наблюдава значително по-силен сигнал с VFF-18, отколкото с другите две антитела.

Фигура 6 показва серумни стойности на СО44-варианти, съдържащи v6. С две различни ELISA се определя съдържанието на разтворим CD44var в серумите на 6 здрави донора. В единия тест като покриващо антитяло се използва VFF-7, а в другия VFF-18; двете антитела разпознават екзон v6. В двата случая като препарат за сравнение служи рекомбинантен разтворим вариант на CD44 (екзон v3vlO), получен в СНО-клетки. VFF-18-ELISA показва средно около 3,5 пъти по-високи стойности, отколкото VFF-7-ELISA. Това означава, че съдържащият се в серума разтворим CD44 се разпознава по-добре от VFF-18, отколкото от VFF-7.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1. Получаване на моноклонално антитяло VFF-18

Клониране на pGEX-слети белтъци

Цялата вариабилна област на CD44v, тип НРКП (Hofmann et al., 1991), се амплифицира от човешка кератиноцитна кДНК чрез полимеразна верижна реакция (PCR). Двата праймера за PCR 5’-CAGGCTGGGAGCCAAA TGAAGAAAATG-3’, позиции 25-32, и 5’-TGA TAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3’, позиции 1013-984 на вариабилната област LCLC97, както е описано от Hofmann et al., съдържат място, разпознаващо се от EcoRI, което се използва, за да се клонира продуктът от PCR директно във вектора pGEX-2T (Smith et al., 1988). Получената конструкция (pGEX CD44v HPKII, v3-vl0) кодира слят белтък от ~70 kA, състоящ се от глутатион-5-трансферазата на Schistosoma japonicum и екзони v3-vl0 на човешкия CD44 (Fig. 1; Heider et al. 1993a). Слетият белтък се експресира в Е. coli, след което се пречиства афинитетно на глутатион агароза (Smith et al., 1988).

Имунизации и скрининг

Женски Balb/с мишки се имунизират интраперитонеално с афинитетно пречистения слят белтък по следната схема:

1. Имунизация: 90 pg слят белтък в пъjjph адювант на Freund

2. е 3. Имунизация: 50 pg слят белтък в непълен адювант на Freund

Всички имунизации се извършват на интервал от 4 седмици. 14 дни след последната имунизация животните се имунизират още три последователни дни, всеки път с по 10 pg слят белтък в PBS. На следващия ден с помощта на полиетиленгликол 4000 Се прави фузия на далачни клетки от животно с висок титър на антитялото с миши миеломни клетки P3.X63Ag.B.653. След това хибридомните клетки се селекционират в микротитърни плаки в НАТсреда (Kohler et Milstein, 1975; Kearney et al., 1979).

Определянето на антитялото в серума, респ. скринингьт на хибридомните супернатанти, се провежда с помощта на ELISA. При този тест най-напред микротитърните плаки се покриват със слой слят белтък (GST-CD44v310) или само с глутатион-8-трансфераза. След това се инкубира със серийни разреждания на серумните проби, респ. на хибридомните супернатанти и специфичните антитела се доказват с антитела срещу миши имуноглобулин, конюгирани с пероксидаза. Хибридоми, които реагират само с глутатион-8-трансферазата, се изхвърлят. Останалите антитела преди всичко се характеризират в ELISA с доменспецифични слети белтъци (екзон v3, екзон v5 + v6, екзон v6 + v7, екзон v8 -10) (Koopman et al., 1993). Тяхната имунохистохимична peakтивоспособност се тества на срези от човешка кожа. След това антитяло VFF-18 се идентифицира по свързването му със синтетичния пептид Hui (QWFGN RWHEG YRQT). Последователността на Hui представлява фрагмент от екзон v6 на човешкия CD44.

Пример 2. Свързване на CD44v6-cneunфични антитела със синтетични пептиди

Свързването на СЦ44у6-специфични антитела със специфични пептиди се определя в ELISA.

Разтвори:

Покриващ буфер: 0,05 М натриев карбонат pH 9,6

Тест-буфер:

PBS (фосфатно буфериранасол) 0,5% BSA (говежди серумен албумин) 0,05% Tween 20 Субстратен разтвор: Fa. Kierkegaard &

Perry Laboratories, Gaihersburg, MD, USA; пероксидазен субстрат TMB: пероксидазен разтвор В (Н₂О₂) 1:1

Пептидите (50 mg/ml в покриващ буфер) се имоболизират през нощта на 4°С върху имуноплаки на NUNC Maxisorp (1.1ASML) или върху плаки Acti-A на Fa, Bio Products (VFF-антителата). При плаките Acti-A пептидът се свъразва ковалентно с плаката. Впоследствие се мие с PBS/0,05% Tween, свободните адсорбционни места върху повърхността на плаките се блокират с тест-буфер (1 h на стайна температура) и отново се промиват веднъж с PBS/0,05% Tween 20. След блокирането плаките Acti-A се редуцират с 10 тМ натриев бор10 хидрид в 20 шМ натриев хидрогенкарбонат, pH 9,0 (1 h клатене на стайна температура) и впоследствие се промиват три пъти с PBS/0,05% Tween 20. След това към ямките се прибавят хибридомни супернатанти респ., разтвори на антитела с тест-буфер в концентрации между 0,02 и 10 pg/ml и се инкубира 2 h на стайна температура в клатачка за плаки. Следват три миещи стъпки с PBS/0,05% Tween 20. След това се прибавят 100 ml/ямка антимише-IgGантитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян при подходящо разреждане в тест-буфер. След двучасова инкубация на стайна температура на клатачка за плаки се промива трикратно с PBS/0,05% Tween 20 и се оцветява със субстратен разтвор. След 10-15 min проявяване се стопира с 2 М сярна киселина и с фотометър се измерва абсорбцията при 450 nm (Referenz 690 nm).

В един първи експеримент се доказва свързването на антитялото 1.1ASML, специално за плъши CD44v6, с пептида Rai (KWFEN EWQGK NPPT) (таблица 1, фигура 3(A)).

ж. ЙЙК·.

·,ί£ “Ч,;

Таблица 1

1.1ASML	аБсорБии я
10,00	1,652
5,00	1,702
2,5	1,658
1,25	1,595
0,63	1,502
0,31	1,211
0,16	0,971
0,08	0,686
0,04	0,458
0,02	0,270

.V.

В следващ опит се синтезира пептид от последователността на човешки CD44v6 (Hui, QWFGN RWHEG YRQT), хомоложен на Rai. C Hui се свързват различни античовешки- 5	СО44у6-антитела. При това се оказва, че VFF18 проявява изненадващо по-висок афинитет на свързване, отколкото всички останали използвани антитела (таблица 2, фигура 3 (В)).
	Таблица 2.
антитяло	абсорбци я
VFF-2	0,067
OFF-4	1,333
VFF-7	0,199
VFF-18	2,384

Освен това за количествена оценка с пептида Hui се свързват пречистени античовешки-СО44у6-антитела в различни концентра ции. И тук се показва категорично по-добрият афинитет на свързване в сравнение с останалите антитела (таблица 3, фигура 3 (С)).

Таблица 3.

mg/ml	VFF-4	VFF-7	VFF-18
10,000	1,225	0,247	2,320
3,333	1.404	0,226	2,550
1,111	0,853	0,094	2,483
0,370	0,336	0,054	2.426
0,123	0,163	0,028	1,354
0,041	0,086	0,025	0,615
0,014	0,048	0,021	0,266
0,005	0,036	0,031	0,095
0,002	0,021	0,021	0,061

Пример 3. Свързване на радиоактивно белязани СО44у6-специфични антитела с туморни клетъчни линии

Радиоактивно бележене на антителата mCi Ь1-сукцинимидил-[2,3-³Н]-пропионат (PHJ-NSP, Amersham 1 mCi/ml) се изпарява в силиконизирана епруветка при 0°С на входна вакуумна помпа почти до сухо. Прибавят се 15 pg антитяло (1 mg/ml в PBS, pH 7,4№ и се инкубира в продължение на 48 h при 4°С. Впоследствие излишният [Ή] -NSP се улавя с 30 1 1 М глицин в PBS (20 min на стайна температура). Разделянето на белязаното антитяло от [³Н] -глицина се извършва на колона Sephadex-G-25-М (обем на колоната 15 ml), при което като елуиращ буфер се използва PBS/ 0,5% BSA. [³Н] -белязаното антитяло се появява в празния обем. Количеството антитяло се определя в ELISA чрез детекция на миши имуноглобулин и се изчислява специфичната активност.

Свързване на радиоактивно белязаните антитела с туморни клетки

Трите антитела VFF-7 (анти-νό), VFF-8 (анти-у5), VFF-18 (анти-уб) се бележат радиоактивно с N-сукцинимидил- [2,3-³Н] пропионат и в тестовете по свързване се прибавят към различни туморни клетъчни линии. При това се използват следните клетъчни линии: СНОCD44var рекомбинантна клетъчна линия от хамстер (Chinese Hamster Ovary), която експресира на повърхността човешки вариант на CD44 (екзони v3-vl0); НСТ-116, НТ-29, CaCo, COLO 205: човешки линии от карцином на дебелото черво; А431: човешка линия от карцином на плоския епител.

Клетките се посяват в 12-гнездови плаки за тъканни култури, инкубират се през нощ5 та на 37°С в СО₂-инкубатор, накрая се измиват веднъж с PBS и се фиксират с етанол (1 min на стайна температура). След това се промива веднъж с културална среда (RPMI 1640/ 10% фетален телешки серум) и се свързва ра10 диоактивното антитяло (250 000 dpm/ямка в културална среда). След инкубация 25 h при стайна температура на клатачка за плаки се промива три пъти с PBS/0,5 BSA, клетките се лизират с 0,1 М NaON/1% Triton Х-100 и 15 радиоактивността се измерва в сцинтилационен брояч. Неспецифичното свързване се определя в присъствието на 100-кратен излишък от небелязано антитяло. След определяне на специфичната активност на антителата свър20 заното количество антитяло може да се изрази във fmol (фемптомол). Таблица 4 и фигура 4 показват специфично свързване на антителата с различни клетъчни линии. Докато свързването на v625 специфичните антитела VFF-7 и VFF-18 срекомбинантната клетъчна линия CHO-CD44var е почти еднакво, то с туморните клетъчни линии антителата показват твърде различно поведение на свързване. В няколко случая се 30 наблюдава свързване само на VFF-18 и в помалка степен на VFF-8 (НТ-29, CaCo, COLO 205), при останалите клетъчни линии VFF-18 се свързва значително по-добре от VFF-7.

Таблица 4.

клетъчна линия	VFF-7 fmol	VFF-8 fmol	VFF-18 fmol
СНО CD44 var	33,50	68,42	46,52
НСТ-116	1,44	11,08	20,22
СХ-1	0,19	2.20	9.48
НТ-29	0,00	2,60	26,07
СаСо	0,03	2,81	12,57
COLO 205	0,00	0,32	2,88
А431	8,19	42,32	38,73

Пример 4. ELISA за определяне на разтворим CD44v6 в серума

Разтвори:

Покриващ буфер: 0,05 М натриев карбонат pH 9,6 5

Тест-буфер: PBS (фосфатно буферирана сол)

0,5% BSA (говежди серумен албумин) 0,05% Tween 20 10 Разредител за проби: Fa. Bender MedSystems, Wien, Osterreich

Субстратен разтвор: Fa. Kierkegaard & Perry Laboratories,

Gaithersburg MD, 15 USA; пероксидазен субстрат TMB: пероксидазен разтвор

В (Н₂О₂) 1:1

Микротитьрни плаки (Nunc-Immunoplate 20 MaxiSorp F96) се покриват с 5 μg/ml с едно от СЮ44у6-специфичните антитела (инкубация на 4°С през нощта). Впоследствие се промива с PBS/0,05% Tween, свободните адсорбционни места върху повърхността на плаките се бло- 25 кират с тест-буфер (1 h на стайна температура) и отново се промиват веднъж с PBS/0,05% Tween 20. След това серумните проби се разреждат предварително в разредителя за проби най-малко 1:5 и по-нататък се разреждат чрез 30 серийни разреждания 1:2 в плаката с разредителя за проби. След това в подходящо разреждане (1:3000-1:10000) се прибавят 50 pg/ ямка aHTH-CD44std антитяло (Кюп BU-52, The Bindung Site, Birmingham), конюгирано c пероксидаза от хрян. След тричасова инкубация при стайна температура на клатачка за плаки се промива три пъти с PBS/0,05 Tween 20 и се оцветява със субстратен разтвор. След 10-15 min проявяване се стопира с 2М сярна киселина и с фотометър се измерва абсорбцията при 450 nm (Referenz 690 пт).

За количествено измерване паралелно със серумните проби се залага серийно разреждане в тест-буфер на разтворим стандартен препарат на CD44. Този препарат се пречиства от супернатанта на рекомбинантни клетки от хамстер (СНО), които експресират разтворим CDv3-vl0. При CD44v3-vl0 става въпрос за човешки вариант на CD44, който съдържа пептидните последователности, кодирани от екзони v3 до vlO.

Таблица 5 и фигура 5 представляват доказването в нормален човешки серум на разтворими СО44-варианти, които съдържат екзон v6. В сандвичева ELISA трите v6специфични антитела, VFF-4, VFF-7, респ., VFF-18, се използват като покриващи антитела. Във всички три случая като детектиращо антитяло се използва антитяло, специфично за CD44std (BR-52, std = стандарт). Показан е сигналът от два различни нормални човешки серума при различни разреждания в тези тестове. В двата случая \(А) и (В)) с VFF-18 се наблюдава значително по-силен сигнал, отколкото с останалите две антитела.

Таблица 5А.

разреждане	VFF-4	VFF-7	VFF-18
ls5	0,406	0,417	3,143
lslO	0,378	0,289	3,055
ls2O	0,296	0,179	2,630
1:40	0,207	0,072	1,778
1;8О	0,109	0,062	1,084
1 : 160	0,050	0,030	0,594
18 320	0,026	0,008	0,318
1:640	0,012	0,007	0,159

Таблица 5В

разреждане	VFF-4	VFF-7	VFF-18
1:5	1,690	1,280	3,290
1:10	1,756	1,185	3,321
1:20	1,564	0,857	3,163
1:40	1,213	0,468	3,050
1:80	0,699	0,208	2,537
1:160	0,336	0,061	1,666
1:320	0,138	0,014	0,988
1:640	0,054	0,018	0,546

Таблица 6 и фигура 6 показват серумни стойности на СО44-варианти, съдържащи v6. С две различни ELISA се определя съдържанието на разтворим CD44var в серумите на 6 здрави 25 донора. В един тест се използва VFF-7, в друг VFF-18 като покриващо антитяло; двете антитела разпознават екзон νό. В двата случая като препарат за сравнение служи рекомбинантен разтворим вариант на CD44 (екзони v3vlO), получен в СНО-клетки. ELISA, прове--?. дена с VFF-18, показва средно около 3,5 пъти**& по-високи стойности, отколкото ELISA, npo-’Sfc ведена с VFF-7. Това означава, че съдържа-Ж щият се в серума разтворим CD44var в срав--2к нение с рекомбинантния белтък се разпознава^ по-добре от VFF-18, отколкото от VFF-7. Ж ^ц. <

>>·

ч·».

Таблица 6.

донор	VFF-7 ng/ml	VFF-18 ng/ml	VFF-18/VFF-7
1	18.2	75.9	4.17
2	32.1	85.5	2.66
3	22.4	87.6	3.91
4	27.7	91.6	3.31
5	26.8	98.3	3.67
6	95.4	332	3.48
средна стойност		3.53
SD			0,52
CV7.			14,97.

ПРОТОКОЛ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБША ИНФОРМАЦИЯ:

(i) ЗАЯВИТЕЛ:

(A) ИМЕ: Boheringer Ingelheim International GMBH (B) УЛИЦА: Binger Str.

(C) ГРАД: Ingelheim (E) СТРАНА: Deutschland (F) КОД: 55216 (G) ТЕЛЕФОН: 06132-772770 (H) ТЕЛЕФАКС: 06132-774377 (A) ИМЕ: Dr. Guenther Adolf (B) УЛИЦА: Stiftgasse (C) ГРАД: Wien (E) СТРАНА: Osterreich (F) КОД: A-1070 (A) ИМЕ: Dr. Erik Patzelt (B) УЛИЦА: Hans-Buchmueller-Gasse 8 (C) ГРАД: Punkersdorf (E) СТРАНА: Osterreich (F) КОД: A-3002 (G) ТЕЛЕФОН: 06132-772770 (H) ТЕЛЕФАКС: 06132-774377 (ii) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: МОНОКЛОНАЛНО АНТИТЯЛО

СРЕЩУ CD44v6 (iii) БРОЙ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: Ь (iv) ФОРМА ЗА КОМПЮТЪРНО ЧЕТЕНЕ» (A) ТИП СРЕДА» Флопи диск (B) КОМПЮТЪР» IBM РС-съвместим (C) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА» PC-DOS/MS-DOS (D) ПРОГРАМЕН ПРОДУКТ» Patentin Release #1.0,

Версия #1,30 (ЕРА) (2) ДАННИ ЗА SEQ ID ΝΟ»1» (i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА» (A) ДЪЛЖИНА» 27 Базови двойки (B) ТИП» никлеотид (C) ВЕРИЖНОСТ» едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ» линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП» предишната нуклеинова киселина (А) ОЗНАЧЕНИЕ» /desc « праймер за PCR (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА» SEQ ID N0:1:

CAGGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG (2) ДАННИ ЗА SEQ ID N0»2:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА» (A) ДЪЛЖИНА: 30 базови двойки (B) ТИП» ннклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ» линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: предишната нуклеинова киселина (А) ОЗНАЧЕНИЕ: /desc = праймер за PCR (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:2:

TGATAAGGAA CGATTGACAT TAGAGTTGGA (2) ДАННИ ЗА SEQ ID N0:3:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 14 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:3:

Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gin Gly Lys Asn Pro Pro Thr

10 (2) ДАННИ ЗА SEQ ID N0:4:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 14 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП! пептид (XX) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА» SEO ID N0:4»

Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr

10 (2) ДАННИ ЗА SEQ ID N0»5:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА!

(A) ДЪЛЖИНА: 42 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ» линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП» пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА» SEQ ID Ν0»5»

Тгр

Ala

Asp

Pro

Asn

Ser

Thr

Glu

Ala

Thr

Gin

1

5

10

Lys

Glu

Lys

Trp

Phe

Glu

Asn

Glu

Trp

Gin

Gly

Lys

Asn

Pro

15

20

25

Pro

Thr

Pro

Ser

Glu

Asp

Ser

His

Vai

Thr

Glu

Gly

Thr

35 40 (2) ДАННИ ЗА SEQ ID NOtbt (i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА» (А) ДЪЛЖИНА» 43 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (χί) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА» SEQ ID N0:6:

Sin

Ala

Thr

Pro

Ser

Thr

Siu

Glu

Thr

Ala

Thr

Gin

1

5

10

Lys

Siu

Sin

Trp

Phe

Sly

Asn

Arg

Trp

His

Siu

Sly

Tyr

Arg

15

20

25

Sin

Thr

Pro

Arg

Siu

Asp

Ser

His

Ser

Thr

Gly

Thr

Ala

35 40

Claims

Патентни претенции

1. Антитяло срещу епитоп в рамките на аминокиселинната последователност, която се кодира от вариабилния екзон v6 на гена за CD44, характеризиращо се с това, че е антитялото VFF-18, което се образува от хибридомната клетъчна линия с депозитен номер DSM АСС2174.
2. Хибридомна клетъчна линия с депозитен номер DSM АСС2174.
3. Антитялова молекула, получаваща се чрез химична или ензимна модификация на антитялото на претенция 1.
4. Антитялова молекула съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че е фрагмент от антитялото, посочено в претенция 1.
5. Антитялова молекула съгласно претенция 4, характеризираща се с това, че е Fabили Р(аЬ’)₂-фрагмент.
6. Антитялова молекула съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че антитялото е свързано с друга молекула.
7. Антитялова молекула съгласно претенция 6, характеризираща се с това, че дру- гата молекула е полипептид.
8. Антитялова молекула съгласно претенции от 3 до 5, характеризираща се с това, че е свързана с радиоактивен изотоп.
9. Рекомбинантна антитялова молекула с идиотипа на антитялото от претенция 1.
10. Рекомбинантна антитялова молекула съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че тя е химерна, хуманизирана, едноверижна (single chain) или получена чрез разместване на веригите (chain shuffling) антитялова молекула.
11. Рекомбинантна антитялова молекула съгласно претенции 9 или 10, характеризираща се с това, че е свързана с друга молекула или с радиоактивен изотоп.
12. Антитялова молекула, която разпознава същия епитоп, както антитялото от претенция 1.
13. Приложение на антитяло или на антитялова молекула съгласно една от претенциите 1 или 3 до 12 за диагностични методи извън човешкото или животинско тяло.
14. Приложение съгласно претенция 13, характеризиращо се с това, че методът е ензимно свързан имунологичен тест или радиоимунологичен тест.
15. Приложение съгласно претенция 13, характеризиращо се с това, че методът е имунохистохимичен метод.
16. Антитяло или антитялова молекула

Литература

Barbas CF, Вjor ling Е, Chioi

Jones Τ M, Zebedee S L, Presson M съгласно една от претенциите 1 или 3 до 12 за фармацевтично приложение.
17. Приложение на антитяло или антитялова молекула съгласно една от претенцииI те 1 или 3 до 12 за получаване на средство за диагностика in vivo.

Приложение: 6 фигури i F, Dunlop N, Cababa D,

A A, Nara P L, Norrby E,

Burton D R. Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vitro. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 891 9339-9343 (1992).

Breiz Η B, Weiden P L, Vanderheyden J-L, Appelbaum J W,

Bjorn MJ, Fer M F, Wolf S B, Ratcliff B A, Seiler C A, Foisie 0 C, Fischer D R, Schroff R W, Fritzberg A R, Abrams P G. Clinical experience with rhenium-lB6-labeled monoclonal antibodies for radioimmunotherapyi results of phase I trails. J. Nucl. Had, 33» 1099-1112 (1992).

Catty, D., Raykundalia, C. ELISA and related immunoassays. Ini Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press

Oxford (19B9), 97-152, s.S. 105-109.

Catty, D., Murphy, G. Immunoassays using radiolabels. Ini

Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II IRL Press Oxford (19Θ9), 7796.

Chatal J-F, Saccavini J-C, Gestin J-F, Thedrez P, Curtet C, Kremer M, Guerreau D, Nolibe D, Fumoleau P, Guillard Y. Biodistribution of indium-ill-labeled OC 125 monoclonal antibody intraperitoneally injected into patients operated on for ovarian carcinomas. Cancer Res. 49ι 30B7-30-94 (19Θ9).

Chaudhary V K, Batra J K, Galso M G, Willingham M D, Fitzgerald D J, Pastan 1. A rapid method of cloning functional variable-region antibody genes in Escherichia coli as singlechain immiunotoxins. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 871 1066 (1990).

Colcher D, Esteban, J, Carrasquillo j A, Sugarbaker, P, Reynolds J C, Bryant G, Larson S M, Schlom J. Complementation of intracavitary and intravenous asministration of a monoclonal antibody (B72.3) in patients with carcinoma. Cancer. /?«. 47s 4218-4224 (1987).

Coloma M J, Hastings A, Wims L A, Morrison S L. Novel vectors for the expression of antybody molecules using variable regions generated by polimerase chain reaction. J. Immunol. Methods 152s 89-104 (1992).

Friedmann P N, McAndrew SO, Gawlak S L, Chace D, Trail P A, Brown J P, Siegall C B. BR96 sFv-PE40, a potent single-chain immunotoxin that selectively kills carcinoma cells. Слпсег Res. 53s 334-339 (1993).

Goodwin D A, A new approach to the problem of targeting specific monoclonal antibodies to human tumors using anti-hapten chimeric antibodies. J. Nucl. Med. Biol. 16: 645 (19B9).

Gunthert, U., Hofmann, M., Rudy, W., Reber, S., Zoller,

M., Haussmann, I., Matzku, S., Wenzel, A., Ponta, H., and Herrlich, P. A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. Cell 65s 13-24 (1991).

Guesdon, J.I., Ternynck, T., Avrameas, S. J. His toe hem. Cytochem. 27: 1131 (1979).

Gussow D, Seemann G. Humanization of monoclonal antibodies. Methods Enzymol. 203: 99-121 (1991).

Heider, Κ.-H., Hofmann, M., Horst, E., van den Berg, F., Ponta, Η., Herrlich P., and Pals, S.T. A human homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps. J. Cell Biol. 120: 227-233 (1993a).

Heider, Κ.-H., Dammrich, J., Skroch-Angel, P., MullerHermelink, H-Κ., Vollmers, H-P., Herrlich, P., and Ponta, H. Differential expression of CD44 splice variants in intestinal and diffuse-type human gastric carcinomas and normal gastric mucosa. Cancer Res. 53: 4197-4203 (1993b).

Hofmann, M., Rudy W., Zoller, M., Tolg, C., Ponta, H., Herrlich, P., and Gunthert, U. CD44 splice variants confer metastatic behavoir in rats: homologous sequences are expressed in human tumor cell lines. Cancer Res. 51: 5292-5297 (1991).

Johnson, G. D. Immunofluorescence. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 179-200, s.S. 180189.

Johnson S, Bird R.E. Construction of single-chain derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coli. Methods Enzymol. 203: 88-98 (1991).

Kearney, J.F., Radbruch A,, Liesegang B., Rajewski K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J. Immunol. 123: 1548 (1979).

Keenan A. M, Weinstein J N, Carrasquillo J A, Bunn P A, Reynolids J C, Foon K A et al. Immunolymphoscintigraphy and the dose dependence of In-labeled T101 monoclonal antibody in patients with cutaneous T-cell lymphoma. Cancer Res. 47: 60936099 (1987).

Kohler, G., Milstein, C. Continous culture of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Nature 265: 495 (1975).

Koopman, G., Heider, Κ.-H., Horts, D., Adolf, G. R., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., Pals, S. T. Activated human lumphocytes and aggressive Non-Hodgkin's lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J. Exp. Med. 177: 897-904 (1993).

Kreitman R J, Hansen H J, Jones A L, FitzGerald D J P, Goldenberg D M, Pastan I . Pseudomonas exotoxin-based immunotoxins containing the antibody LL2 or LL2-Fab' induce

regression of subcutaneous human B-cell lymphoma in mice. Cancer Res. 53» 819-825 (1993). Larson S M, Cheung N-K V, Lei be 1 S A. Radioisotope Conjugates. Ini DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg).

Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 496-511 (1991).

Muishine, J L, Magnani J L, Linnoila R I* Applications of monoclonal antibodies in the treatment of solid tumors. Ini DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg). Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 563-588 (1991).

Nesbit M, Fu Z F, McDonald-Smith J, Steplewski Z, Production of functional monoclonal antibody recognizing human colorectal carcinoma cells from a baculovirus expression system. J. Immunol. Methods 151» 201-208 (1992).

Perkins A C, Pimm MV. A role for gamma scitigraphy in cancer immunology and immunotherapy. Eur. J. Nucl. Med. 19» 1054-1063 (1992).

Press 0 W, Eary J F, Badger C C, Martin P J, Appelbaum F R, Levy R, Miller R, Brown S, Nelp W B, Krohn K A, Fischer D, DeSantes K, Porter B, Kidd P, Thoma* E D, Bernsetein I D. Treatment of refractory Non-Hodgkin's lymphoma with radiolabeled. MB-1 (anti-CD37) antibody. J. Clin. Oncol. 7» 1027-1038 (19B9).

Rudy, W., Hofmann, M., Schwartz-Albeiz, R., Zoller, M., Heider, Κ.-H., Ponta, Н», Herrlich, P. The two major CD44 proteins expressed on a metastatic rat tumor cell line are derived from different splice variants: Each one individually suffices to confer metastatic behaviour. Cancer Res. 53» 12621268 (1993).

Schrappe M, Bumol T F, Apelgren L D, Briggs S L, Koppel G A, Markowitz D D, Mueller В M, Reisfeld R A. Long-term growth suppression of human glioma xenografts by chemoimmunoconjugates of 4-desacetylvinblastine-3-carboxyhydrazide and monoclonal antibody 9.2.27. Cancer Res. 52» 3Θ3Θ-3Β44 (1992).

Screaton, G.R., Bell, M.V., Jackson D.G., Cornelia, F.B., Gerth, (J., and Bell, J. I. Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively splised exons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. В9» 12160-12164 (1992).

Sears H F, Mattis J, Herlyn D, Hayry P, Atkinson B, Ernst C, Stepelwski Z, Koprowski H. Phase-I clinical trail of monoclonal antibody in treatment of gastrointestinal tumors. Lancet 1982 (l)i 762-765 (1982).

Seiter, S., Arch, R., Reber, S., Komitowski, D., Hofmann, M., Ponta, H., Herrlich, P., Matzku, S., Zoller, M. Prevention of tumor metastasis formation by anti-variant CD44. J. Exp. Med. 1771 443-455 (1993).

Senter P D, Schreiber G J, Hirschberg D L, Ashe S A, He 11 strom K E, He 11 strom I. Enhancement of the in vitro antitumor acitvities of phosphorilated mitomycin C and etoposide derivatives by monoclonal antibody-alkaline phosphatase conjugates. Cancer Res. 49» 5789-5792 (1989).

Shin S-U, Morrison S L. Production and properties of chimeric antibody molecules. Methods Enzymol. 178» 459-476 (1989).

Siccardi A G, Buraggi G L, Callegaro L, Colella A C, DeFilippi P G et al. Immunoscintigraphy of adenocarcinomas by means of radiolabeled F(ab')z fragments of an anticarc inoembryonic antigen monoclonal antibody! a multicenter study. Cancer Res. 49: 3095-3103 (1989).

Smith, D.B., Johnson, K.S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusion with glutathione S- transferase. Gene 67: 31-40 (19BB).

Srivastava S C (Hrsg). Radiolabeled monoclonal antibodies for imaging and therapy. Life Sciences Series A 152, Plenum New York (19ΘΘ).

Tolg, C. , Hofmann, 14., Herrlich, P., and Ponta H. Splicing choice from ten variant exons establishes CD44 variability. Nucleic Acids Res. 21: 1225-1229 (1993).

Theuer C P, Kreitman R J, FitzGerald D J, Pastan I.

Immunotoxins made with a recombinant form of pseudomonas exotoxin A that do not require proteolysis for activity^ Cancer Res. 53: 340-347 (1993).

Thomas G D, Dykes P W, Bradwell A R. Antibodies for tumor immunodetection and methods for antibody radiolabeling. In: Catyy D (Hrsg) Antibodies. IRL Press Oxford, 223-244 (19B9).

Thompson C H, Stacker S A, Salehi N, Lichtenstein M, Leyden M J, Andrews J T. Immunoscintigraphy for detection of lymph node metastases from breast cancer. Lancet 19B4 (2)i 12451247 (19B4).

Vitetta E S, Thorpe Ρ E. Immunotoxins. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biologic therapy of cancer. □. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 4Θ2-495 (1991).

Vitetta E S, Stone M, Amolt P, Fay J, May R, Till M, Newman J, Clark P, Collins R, Cunningham D, Ghetie V, Uhr J W, Thorpe Ρ E. Phase I immunotoxin trail in patients with B-cell lymphoma. Cancer Res. 51: 4052-4058. (1991).

Wang S-M, Chern J-W, Yeh M-Y, Ng J C, Tung E, Roffler Б

R. Specific activation of glucuronide prodrugs by antibody targeted enzyme conjugates for cancer therapy. Cancer Res. 52:

4484-4491 (1992).

Weiter, L M, 0'Dwyer J, Kitson J, Comis R L, Frankel A E

Bauer R J, Kopnrad M S, Groves E S. Phase I evaluation of an anti-breast carcinoma monoclonal antibody 260F9-rwcombinant ricin A chain immunoconjugate. Cancer Res. 49* 4062-4067 (19Θ9).

Wielenga, V.J.M., Heider, Κ.-H., Offerhaus, G. J. A.,

Adolf, 6. R., van den Berg, F. M., Ponta, H., Herrlich, P.,

Pals, S. T. Expression of CD44 variant proteins in human colorectal cancer is related to tumor progression. Cancer Re». 53* 4754-4756 (1993).

Winter, G., Griffith, A. D., Hawkins, R. E., Hoogenboom, j H. R. Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. χ Immunol. 12, 433-455 (1994).

GST