RO118753B1

RO118753B1 - ANTICORP RECOMBINANT ACTIV ÎMPOTRIVA CD44v6

Info

Publication number: RO118753B1
Application number: RO96-02287A
Authority: RO
Inventors: Ingelheim International Gmbh Boehringer; Karlsruhe Gmbh Forschungszentrum
Original assignee: Adolf Gunther R.; Patzelt Erik
Priority date: 1994-06-08
Filing date: 1995-06-02
Publication date: 2003-10-30
Also published as: NO965239L; PL190897B1; HU9603387D0; HU220168B; CN1152925A; BG101024A; FI964845A0; PL317536A1; UA58482C2; JPH10501797A; RU2204606C2; CA2192370A1; JP3387929B2; CZ359196A3; CO4410258A1; DK0765343T3; SI0765343T1; NZ288224A; ATE197592T1; NO965239D0

Abstract

Invenţia se referă la un anticorp împotriva unui epitop cuprins în secvenţa de aminoacizi codificată de exonul 6 variabil al genei CD44, la o linie celulară hibridom, la un derivat de anticorp care se poate obţine prin modificarea chimică sau enzimatică a acestui anticorp, la un anticorp recombinant cu idiotipul acestui anticorp, la o compoziţie farmaceutică care cuprinde ca ingredient activ anticorpul sau un derivat al acestui anticorp şi la utilizarea unui anticorp sau a unei molecule de anticorp în metode de diagnosticare in vivo sau în afara corpului uman sau animal. ŕ

Description

Invenția se referă la un anticorp monoclonal activ împotriva unui epitop, care este codificat de varianta Exon 6 variabil a genei CD44, la molecule de anticorp derivate din acesta precum și la utilizarea anticorpului respectiv precum și a moleculei de anticorp în diagnosticare și terapie.

Sunt cunoscuți anticorpi monoclonali împotriva epitopilor, care se codifică de Exonul 6 variabil (v6). (Hofmann M., Rudy W., ZoIlerM., Tolg C., Ponta H., Herrlich P., and Gunthert U. CD44 splice variants confer metastatic behavior in rats: homologous sequences are expresed in human tomor cell lines. Cancer Res.51:5292-5297 1991; Wielenga, 1993). Din cauza folosului potențial ridicat, pe care astfel de anticorpi le-ar putea avea în diagnoză și în terapie, există o necesitate ridicată de anticorpi cu proprietăți îmbunătățite.

S-a dovedit recent, că expresia de variante ale glicoproteinei de suprafață CD44 este necesară și suficientă pentru a declanșa o comportare așa zisă spontană metastatică, atât într-o linie de celule de adenocarcinom de pancreas care nu este în curs de metastază a șobolanului, cât și într-o linie de celule de fibrosarcom care nu este în curs de metastază a șobolanului (Gunthert U., Hofmann M„ Rudy VI/., ReverS., ZoIlerM., HauBmann I., Matzku S., Wenzel A., Ponta H., and Herrlich P. A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potențial to rat carcinoma cells. Cell 65: 13-24 (1991). în timp ce cea mai mică izoformă CD44, forma standard CD44s (sau CD44std) este exprimată ubicvitarian într-un șir de țesuturi diverse, din care celule epiteliale, anumite variante de împreunare de CD44 (CD44v, CD44 var) sunt exprimate numai într-o subgrupă de celule epiteliale. Variantele CD44 se obțin prin împreunare alternativă în așa fel, încât secvențe de 10 Exoni (v1-v10) sunt decupate complet în CD44s, totuși în variantele mai mari pot apare în diferite combinații (Screaton G.R., Beli M.V., Jackson D.G., Cornelis F.B., Gerth U., și Beli J.l. Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:12160-12164,1992, lolg și colab., 1993, Hofmann și cola., 1991). Variantele se deosebesc prin aceea că într-un loc anumit al părții extracelulare a proteinei sunt înserate diferite secvențe de amino acizi. Astfel de variante au putut să fie confirmate în diferite celule tumorale umane și în țesuturi tumorale umane. Astfel, s-a cercetat recent expresia variantelor de CD44 în cursul genezelor carcinoamelor colorectale (Heider K.-H., Hofmann M„ Horst E., van den Berg F., Ponta H., Herrlich P., and Pals, S.T. A human homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps. J. Cell Biol. 120:227233 (1993a). Expresia variantelor CD44 lipsește în epiteliul de colon uman normal și se poate dovedi numai o expresie slabă în celulele în curs de proliferare ale criptelor. în stadiile mai târzii ale dezvoltării tumorilor, de exemplu, în carcinoamele de adenom, toate degenerările maligne exprimă variante de CD44. Expresii în țesuturi ale variantelor de CD44 la nivel superior s-au putut dovedi în limfomenele agresive Non-Hodgkin (Koopman G., Heider K.-H., Horts E., Adolf G.R., van den Berg F., Ponta H., Herrlich P., Pals, S.T. Activated human lymphocytes and aggressive Non-Hodgkin’s lymphomas express a homologue ot the rat metastasis-associated variant of CD44. J. Exp. Med. 177:897-904 (1993).

Se pare că Exon v6 joacă un rol deosebit mai ales la extinderea metastatică (Rudy W., Hofmann M., Schwartz-AlbiezR., ZoIlerM., HeiderK.-H., Ponta H., Herrlich P, The two major CD44 proteins expressed on a metastatic rat tumor cell line are derived from different splice variants: Each one individuallv suffices to confer metastatic behaviour. Cancer Res. 53:1262-1268 (1993). în modelul animal anticorpii au putut să acționeze împotriva epitopilor specifici și să împiedice stabilirea celulelor în curs de metastază și creșterea metastazelor (SeiterS., Arch R., ReberS., Komitowski D., Hofmann M., Ponta H., Herrlich P., Matzku S., ZoIlerM. Prevention of tumormetastasis formation byanti-variant CD44. J. Exp. Med. 177: 443-455 (1993). în carcinoamele de colon expresia v6 se corelează cu progresul tumorii

R0118753 Β1 (Wielenga V.J.M., Heider K.-H., Offerhaus G.J.A, AdolfG.R., van den Berg F.M., Ponta H., 50

Herrlich P., Pals S.T. Expression of CD44 variant proteins in human colorectal cancer is related to tumor progression. Cancer Res. 53:4754-4756 (1993). în carcinoamele de stomac expresia v6 este un marcator de diagnosticare important la diferențierea dintre tumori de tip intestinal de cele de tip difuz. (Heider K.-H., Dămmrich J., Skroch-Angel P., MullerHermelink, H-Κ., Vollmers H-P., Herrlich P., and Ponta H. Differential expression of CD44 55 splice variants in intestinal-and diffuse-type human gastric carcinomas and normal gastric mucosa. Cancer Res. 53:4197-4203 (1993b). Expresia v6 a fost măsurată în ambele lucrări menționate ultimele cu ajutorul anticorpilor împotriva epitopilor specifici v6.

Problema pe care o rezolvă invenția este să pună la dispoziție un anticorp împotriva unui epitop cuprins în secvența de aminoacizi codificată de exonul 6 variabil al genei CD44, 60 la linia celulară Hybridoma cu numărul de depozitare DSM ACC2174, la un derivat de anticorp, la un anticorp recombinant cu ediotipul anticorpului, la o compoziție farmaceutică cu acest anticorp și la utilizarea unui anticorp sau a unei molecule de anticorp.

Anticorpul împotriva unui epitop cuprins în secvența de aminoacizi codificată de exonul 6 variabil al genei CD44 este anticorpul VFF-18 produs de către linia celulară 65 hibridom cu numărul de depozitare DSM ACC2174.

Linia celulară hibridom are numărul de depozitare DSM ACC2174.

Derivatul de anticorp este obținut prin modificarea chimică sau enzimatică a unui anticorp VFF-18.

Anticorpul recombinant care are ediotipul unui anticorp VFF-18. 70

Compoziția farmaceutică care cuprinde ca ingredient activ un anticorp sau un derivat de anticorp.

Utilizarea unui anticorp sau a unei molecule de anticorp în metodele de diagnosticare în afara corpului uman sau animal, sau pentru prepararea unei substanțe pentru diagnosticare in vivo. 75

Scopul invenției de față este să pună la dispoziție un anticorp, care să aibe proprietăți îmbunătățite în mod semnificativ față de anticorpii specifici v6 cunoscuți. Acest scop a putut să fie atins cu invenția de față. Ea se referă la un anticorp cu denumirea VFF-18. Invenția se mai referă la o linie de celule Hybridoma, care secernează acest anticorp și care a fost depusă sub numărul de depunere DSM ACC2174 la DSM - Colecția Germană pentru Micro- 80 organisme și Culturi de Celule GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germania.

în cele ce urmează prin noțiunea de anticorp și molecule de anticorpi se înțelege nu numai imunoglobuline complete, ci și substanțe echivalente în ceea ce privește specificitatea de legare și afinitatea, cum ar fi derivații de anticorpi descriși și moleculele de anticorpi 85 recombinante.

Anticorpul VFF-18, conform invenției, s-a obținut printr-un procedeu conform exemplului 1. Anticorpul mai poate fi obținut din linia de celule Hybridoma depusă. Specialistul obișnuit în materie știe să obțină derivați ai anticorpului conform invenției sau, pornind de la o analiză secvențială a acestui anticorp și/sau cu utilizarea liniei de celule Hybridoma, care 90 produce acești anticorpi, să producă molecule de anticorpi recombinante cu același idiotip, adică molecule de anticorpi, care prezintă în zona de legătură a antigenului (complementaryty determining regions, CDR) aceeași secvență de aminoacid ca anticorpul VFF-18. Astfel de derivați și molecule de anticorpi recombinante sunt de aceea cuprinse în mod clar în invenția de față. 95

Din imunoglobulina completă a anticorpului VFF-18 se pot obține, de exemplu, fragmente Fab sau F(ab’)₂ sau alte fragmente. (Kreitman R.J., Hansen H.J., Jones A.L.,

FitzGerald D.J.P., Goldenberg D.M., Pastan I. Pseudomonas exotoxin-based immunotoxins

RO 118753 Β1 contai ning the antibody LL2 or LL2-Fab’ induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma in mice. Cancer Res. 53:819-825 (1993). Pentru procedee de diagnosticare se pot lega molecule de anticorpi VFF-18, fragmente din acestea sau molecule de anticorpi recombinante cu același idiotip, de exemplu cu izotopiradioactivi cum ar fi ¹³¹l, ¹¹¹ln, ^mTc sau compuși radioactivi (Larson S.M., Cheung N-K, Leibel S.A. Radioisotope Conjugates. In: DeVita V.T., Hellman S., Rosenberg S.A. (Hrsg.). Biologic therapy of cancer. J.B. Lippincott Comp., Philadelphia, 496-511 (1991); Thomas G.D., Dykes P.W., Bradwell A.R. Antibodies for tumour immunodetextion and methods for antibody radiolabeling. In: Catty D. (Hrsg.). Antibodies. IRL Press Oxford, 223-244 (1989), 223-244; Srivastava S.C. (Hrsg). Radiolabeled monoclonal antibodies for imaging and therapy. Life Sciences Series A 152, Plenum New York (1989)), enzime cum ar fi peroxidaza sau fosfatazaalcalină (Catty D., Raykundalia, C. ELISA and related immunoassays. In: Catty D. (Hrsg). Antibodies Voi. II. IRL Press Oxford (1989), 97-152, s. S. 105-109) cu substanțe colorante de fluorescentă (Johnson G.D. Immunofluorescence. In: Catty D. (Hrsg). Antibodies Voi. II IRL Press Oxford (1989), 179-200, s. S. 180-189) sau molecule de biotină (Guesdon J.I., Ternyynck T., Avrameas S. J. Histochem. Cytochem. 27:1131 (1979). Pentru aplicări terapeutice molecule de anticorpi derivate din VFF18 sau VFF-18 se pot lega cu toxine (Vitetta E.S., Stone M., AmlotP., FayJ., MayR., TilIM., NewmanJ., ClarkP., CollinsR., Cunningham D., Ghetie V, UhrJ. W„ Thorpe P.E. Phase I immunotoxin trial in patients withB-cell lymphom. Cancer Res. 51: 4052-4058 (1991); Vitetta E. S, Thorpe P.E. Immunotoxins. In: De Vita V.T., Hellman S., Rosenberg S.A. (Hrsg.). Biologic therapy of cancer. J.B. Lippincott Comp., Philadelphia, 482-495 (1991); Kreitman R.J., Hansen H.J., Jones A.L., FitzGerald D.J.P., Goldenberg D.M., Pastan I. Pseudomonas exotoxin-based immunotoxins containing the antibody LL2 or LL2-Fab’ induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma in mice. Cancer Res. 53:819-825(1993); TheuerC.P., Kreitman R.J., FitzGerald D.J., Pastan I. Immunotoxins made with a recombinant form of pseudomonas exotoxin A that donot require proteolysis foractivity. Cancer Res. 53:340-3471, (1993), Cytostatica (Schrappe M., Bumol T.F., Apelgren L.D., Briggs S.L., KoppelG.A., Markowirz D.D., MuellerB.M., Reisfeld R.A. Long-term growth suppression of human glioma xenografts by chemoimmunoconjugates of4-desacetylvinblastine-3-carboxyhydrazide and monoclonal antibody 9.2.27. Cancer Res. 52:3838-3844, (1992), Prodrugs (Wang S-M, Chern J_W, Yeh M-Y, Ng J.C., Tung E. Roffler S.R. Specific activation of glucuronide prodrugs by antibody-targeted enzyme conjugates for cancer therapy. Cancer Res. 52: 4484-4491 (1992); Senter P. D., SchreiberG.J., Schreiber G.J., Hirschberg D.L., AsheS.A., Hellstrom I. Enhancement of the in vitro and in vivo antitumor activities of phosphorylated mitomycin C and etoposide derivatives by monoclonalantibody-alkaline phosphatase conjugates. Cancer Res. 49:57895792 (1989) sau cu substanțe radioactive. Anticorpul mai poate fi legat cu o citochină sau cu o altă polipeptidă imunomodulatoare, de exemplu, cu un factor de necroză a tumorii sau cu interleuchină-2.

Specialistul în materie mai are posibilitatea, după analiza secvenței de amino acid a anticorpului VFF-18 sau/și cu utilizarea liniei de celule Hybridoma, care produce acest anticorp, să producă molecula de anticorp recombinantă mai ales a informației genetice conținută în acesta, cu același idiotip ca VFF-18. în stadiul tehnic actual se găsesc asemenea procedee. Astfel de molecule de anticorpi pot fi, de exemplu, anticorpi umanizați (Shin S-U, Morrison S.L. Production and properties of chimeric antibody molecules. Methods Enzymol. 178:459-476, (1989); Gussow D., Seemann G. Humanization of monoclonal antibodies. Methods Enzymol. 203:99-121 (1991), anticorpi bispecifici (WeinerL.M., ODwyerJ., Comis R.L., Frankel A.E., Bauer R.J., Kopnrad M.S., Groves E.S. Phase I evaluation of an antibreast carcinoma monoclonal antibody 260F9-recombinant ricin A chain immunoconjugate.

R0118753 Β1

Cancer Res. 49:4062-4067 (1989); Goodwin D.A. A newappoach tothe problem oftargeting specificmonoclonalantibodies to human tumors using anti-hapten chimeric antibodies. J.

Nuci. Med. Biol. 16:645 (1989), anticorpi single-chain (cu un singur lanț) (scFv, Johnson S., 150

Bird R.E. Construction of single-chain derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coli. Methods Enzymol. 203:88-98 (1991), imunoglobuline complete sau fragmente (Coloma M.J., Hastings A., Wims L.A., Morrison S.L. Novei vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated bypolymerase chain reaction. J. Imunol. Methods 152: 89-104 (1992); Nesbit M., Fu Z F, McDonald-Smith J., 155

Steplewski Z, CurtisP.H. Production of a funcțional monoclonal antibody recognizing human colorectal carcinoma cells from a baculovirus expression system. J. Immunol. Methods 151: 201-208 (1992); Barbas C.F., Bjorling E., Chiodi F., Dunlop N., Cababa D., Jones T.M., Zebedee S.L., PerssonMAA, Nara P.L., NorrbyE., Burton D.R. Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 160 U.S.A. 89:9339-9343 (1992), sau anticorpi obținuți prin chain shuffling (amestecare de lanț) (Winter G., Griffith A.D., Hawkins R.E., Hoogenboom H. R. Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994). Anticorpi umanizați se pot obține, de exemplu, prin grefă CDR (EP 0239400). Se pot modifica și regiuni din structură (EP 0519596). Pentru umanizarea de anticorpi se pot aplica azi metode cum ar fi, PCR 165 (vezi, de exmeplu, EP 0368684 și 0438310; WO 9207075) sau modelare cu computerul (vezi, de exemplu, WO 9222653). Se pot produce și proteine de fuziune, de exemplu, anticorpi cu un singur lanț/ proteine de fuziune cu toxine (Chaudhary V.K. Batra J. K., Galdo M. G., Willingham M. C., Fitzgerald D.J., Pastan I. A rapid method of cloning funcțional variable-region antibody genes in Escherichia coli as single-chain immunotoxins. Proc. Natl. 170 Acad Sci. U.S.A. 87:1066(1990); Friedman P. N„ McAndrew S.J., GawlakS.L, Chace D., Trail P.A., Brown J.P., Siegall C.B. BR96 sFv-PE40, a potent single-chain immunotoxin that selectively kills carcinoma cells. Cancer Res. 53:334-339 (1993).

De aceea, astfel de molecule de anticorpi sunt, de asemenea, incluse în invenție.

De asemenea, specialistul în materie este în măsură să stabilească epitopul exact 175 al VFF-18 și cu această cunoaștere să producă anticorpi echivalenți cu aceeași specificitate de legare. Acest lucru poate avea loc, de exemplu, prin studii de legare a peptidelor ca în exemplul 2, de exemplu, prin variația peptidei Hui. Astfel de anticorpi sunt de aceea, de asemenea, incluși în invenție.

Un alt aspect al invenției este utilizarea VFF-18 sau a moleculelor de anticorpi 180 derivate din VFF-18 sau echivalente pentru diagnosticare și terapie.

Metodele de diagnosticare pot fi procedee cunoscute în sine cu utilizarea de molecule de anticorpi, conform invenției, de exemplu, imunoteste cuplate cu enzime (ELISA, Catty et Raykundalia, 1989), radioimunoteste (Catty et Murphy, 1989), procedee imunohistochimice (Heider și colab., 1993b) sau Western Blots. Astfel de procedee pot fi realizate 185 în mod adecvat cu probe de țesuturi sau lichide din corp, prelevate de exemplu din biopsii. Cercetările pot avea loc calitativ, semicantitativ sau cantitativ. Anticorpul sau molecula de anticorp se poate folosi în acest caz așa cum s-a descris în stadiul tehnic actual pentru alți anticorpi v6-specifici (W09500851), proprietățile avantajoase ale anticorpilor, conform invenției, sau a moleculei de anticorp, conform invenției, însemnând o îmbunătățire semnificativă 190 a unor astfel de procedee.

Pe lângă diagnosticarea in vitro, moleculele de anticorpi, conform invenției, se pretează și diagnosticări in vivo, mai ales a tumorilor. Dacă molecula de anticorp poartă o denumire detectabilă, atunci o detectare a denumirii poate avea loc pentru scopuri diagnostice, de exemplu, vizualizarea tumorii in vivo, sau, de exemplu, pentru chirurgie pe bază de unde 195

RO 118753 Β1 radio. Pentru utilizarea anticorpilor conjugați cu izotoni radioactivi, de exemplu, pentru imunoscintigrafie (Imaging) există o serie de protocoale, pe baza cărora specialistul în materie poate realiza invenția (Siccardi A.G., Buraggi G.L., Callegaro L., Colella A.C., DeFilippi P.G. și colab. Immunoscintigraphy of adenocarcinomas bymeans of radiolabeled F(ab)₂ fragments of an anti-carcino-embryonic antigen monoclonal antibody: a multicenter study. Cancer Res. 49:3095-3103 (1989); Keenan A.M., Weinstein J.N., Carrasquillo J.A., Bunn P.A., Reynolds J.C., Foon K.A. și colab. Immunolymphoscintigraphy and the dose dependence of ¹¹¹ln-labeled T101 monoclonal antibody in patients with cutanoeous T-cell lymphoma. Cancer Res. 47:6093-6099 (1987); PerkinsA.C., Pimm M.V. A role forgamma scintigraphy in cancer immunology and immunotherapy. Eur. J. Nuci. Med. 19: 1054-1063 (1992); ColcherD., EstebanJ., Carrasquillo J.A., Sugarbaker P., Reynolds J.C., BryantG., Larson S.M., Schlom J. Complementation of intracavitary and intravenous administration of a monoclonal antibody (B72.3) in patients eith carcinoma. Cancer Res. 47: 4218-4224 (1987); Thompson C.H., StackerS.A., SalehiN., Lichtenstein M., Leyden M.J., Andrews J.T. Immunoscintigraphy for detection of lymph node metastases from breast cancer. Lancet 1984 (2): 1245-1247(1984).

O aplicare terapeutică poate avea loc, de exemplu, în mod analog cu utilizarea de anticorpi 1.1ASML (Seiter și colab., 1993). în acest caz aplicarea poate avea loc sistemic sau topic, de exemplu, prin injectare/infuzie intravenoasă (ca pilulă mare sau ca infuzie de durată), interaperitoneală, intramusculară, subcutanată sau altfel de injectare/infuzie. Se pot face perfuzii asupra unui singur organ sau membru. în stadiul tehnic actual se găsesc procese-verbale pentru administrarea de anticorpi conjugați sau neconjugați (fie că sunt sub formă de imunoglobuline, fragmente, molecule armonizate recombinante și altele asemănătoare). (Mulshine J.L. Magnani J.L., Linnoila R.I.: Applications of monoclonal antibodies in the treatment of solid tumors. In: DeVita V.T., Hellman S., Rosenberg S.A. (Hrsg.). Biologic therapy of cancer. J.B. Lippincott Comp., Philadelphia, 563-588 (1991); Larson S.M., Cheung N-K V., Leibel S.A. Radioisotope Conjugates. In: DeVita V.T., Hellman S., Rosenberg S.A. (Hrsg.). biologic therapy of cancer. J.B. Lippincott Comp., Philadelphia, 496511 (1991); Vitetta E.S. Thorpe P.E. Immunotoxins. In: DeVita V.T., Hellman S., Rosenberg S.A. (Hrsg.). Biologic therapy of cancer. J.B. Lippincott Comp., Philadelphia, 482-495 (1991); Vitetta E.S., Stone M., Amlot P., Fay J., May R., TUI M., Newman J., Clark P., Collins R., Cunningham D., Ghetie V., UhrJ.W., Thorpe P.E. Phase I immunotoxin trial in patients eith B-cell lymphoma. Cancer Res. 51: 4052-4058 (1991); Breitz H.B., Weiden P.L., Vanderheyden J.L., Appelbaum J.W., Bjorn M.J., FerM F, Wolf S.B., Ratcliff B.A., Seiler C.A. Foisie D.C., FisherD.R., Schroff R.W., Fritzberg A.R., Abrams P.G. Clinical experience with rhenium-186-labeled monoclonal antibodies for radioimmunotherapy: results of phase Itrials. J. Nuci. Med. 33: 1099-1112 (1992); Press O.W., EaryJ.F., BadgerC.C., Martin P.J., Appelbaum F.R., Levy R., MillerR., Brown S., Nelp W.B., Krohn K.A., FisherD., DeSantes K., Porter B., Kodd P., Thomas E.D. Bernstein I. D. Treatment of refractory Non-Hodgkin’s lymphoma with radiolabeled MB-1 (anti-CD37)antibody. J.CIin.Oncol. 7:1027-1038 (1989); Weiner L.M., O’DwyerJ., Kitson J. Comis R.L., Frankel A.E., Bauer R.J., Kopnrad M.S., Groves E.S. Phase I evaluation of anti-breast carcinoma monoclonal antibody 260F9recombinant ricin A chain immunoconjugate. Cancer Res. 49:4062-4967 (1989); ChatalJ-F, Saccavini J-C, Gestin J-F, Thedrez P., Curtet C., Kremer M, Guerreau D., Nolie D., Fumoleau P., Guillard Y. Biodistribution of indium-111-labeled OC 125 monoclonal antibody intraperitoneally injected into patients operated on for ovarian carcinomas. Cancer Res. 49: 3087-3094 (1989); Sears Η. F, Mattis J., Herlyn D., Hăyry P., Atkinson B., Ernst C., Steplewski Z., Koprowski H., Phase-I clinical trial of monoclonal antibody in treatment of gastrointestinal tumours . Lancet 1082 (1): 762-765 (1982).

RO 118753 Β1

Proprietățile superioare ale VFF-18 față de alți anticorpi anti-CD44 v6 sunt arătate în exemplele 2 până la 4.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

în continuare, se prezintă 4 exemple de realizare a invenției în legătură cu figurile, care reprezintă:

- fig.1, reprezentare schematică a proteinei de fuziune GST-CD44(v3-v10). GST = Glutation-S-transferază a Schistosomei Japonicum. V3-v10 = inserții variate de cheratinozite -CD44. Săgeata marchează un loc de scindare a trombinei.

- fig.2, comparația secvențelor de Exon v6 ale genei CD44 între om și șobolan. Secvențele peptidelor Ral și Hui, se leagă la anticorpii 1.1AS;L (anti-șobolan CD44v6) și VFF-18 (Anti-uman CD44v6), sunt evidențiate îngroșat. Aminoacizii identici sunt marcați printr-o steluță.

- fig.3, legătura dintre anticorpii specifici CD44v6 la peptide sintetice. Legătura anticorpilor cu peptide a fost determinată într-un ELISA, în care peptidele au fost imobilizate și apoi s-au incubat cu soluții de anticorpi. După treptele corespunzătoare de creștere s-a dovedit că anticorpii legați cu peroxidază-anticorpi IgG anti-șoarece conjugat. (A): în prima experimentare s-a dovedit legătura anticorpului specific pentru șobolani CD44v6 1.1ASML la peptidă Ral (KWFEN EWQGK NPPT). (B): într-o altă încercare s-a sintetizat o peptidă omoloagă la Ral din secvența umană CD44v6. S-au legat la această peptidă Hui (QWFGN RWHEG YRQT) diferiți supernatanți de hybridom CD44v6 anti-uman. în acest caz s-a observat, că VFF-18 se leagă mult mai bine de peptidă decât ceilalți anticorpi folosiți. (C): pentru o evaluare cantitativă s-a repetat acest experiment cu diferite concentrații de anticorpi purificați și aici se dovedește că VFF-18 are o afinitate de legătură superioară față de alți anticorpi.

- fig.4, legarea anticorpilor marcați radioactiv la celule tumorale. Cei trei anticorpi VFF-7 (anti-v6) VFF-8 (anti-v5) și VFF-18 (anti-v6) s-au marcat radioactiv cu Nsuccimil/2,3³H/ proponiat și s-au folosit pentru teste de legătură la diferite linii de celule tumorale. în acest caz s-au utilizat următoarele linii celulare: CHO-CD44var: linie de celule recombinante de hârciog (Chinese Hamster Ovary), variantele umane CD44 (Exon v3-v10) exprimate la suprafață; HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO 205: linii de carcinom de colon umane; A431: linie de carcinom epitelial în plăci uman. Se dovedește legătura specifică a anticorpilor la diferitele linii celulare. Pe când legătura anticorpilor specifici v6 VFF-7 și VFF18 la liniile de celule recombinante CHO-CD44 var se află în aceeași ordine de mărime, anticorpii la liniile de celule tumorale arată o comporare de legare foarte diferită. în unele cazuri se observă numai VFF-18 și în măsură mai mică legătura VFF-7 (HT-29, CaCo, COLO 205), la alte linii de celule VFF-18 leagă mult mai bine decât VFF-7.

- fig.5, demonstrarea variantelor de CD44 solubile, care conțin Exon v6 în serul normal uman. într-un ELISA-Sandwich s-au folosit cei trei anticorpi v6 specifici VFF-4, VFF-7 resp. VFF-18 ca anticorpi de acoperire sub formă de strat. în toate cele trei cazuri s-a utilizat ca anticorp de demonstrare un anticorp CD44 std-specific conjugat cu peroxidază (BU-52, std = standard). în aceste teste se arată semnalul a două seruri normale umane la diferite diluări în aceste teste (A) și (B). în ambele cazuri se observă un semnal mult mai intens cu VFF-18 decât cu ceilalți doi anticorpi.

- fig.6, valori de ser ale variantelor CD44 conținând v6. Cu două ELISA diferite s-a determinat conținutul în CD44 var în seruri de la 6 donatori sănătoși. într-un test s-a utilizat VFF-7 în celălalt VFF-18 ca anticorp aplicat în strat; ambii anticorpi recunosc Exon v6. Ca preparat de comparație a folosit în ambele cazuri o variantă CD44 recombinantă obținută în celule CHO (Exon v3-v10). VFF-18-ELISA arată în medie valori de 3,5 ori mai ridicate decât VFF-7-ELISA. Aceasta înseamnă că CD44 var solubil existent în ser se recunoaște mai bine de către VFF-18 decât de către VFF-7.

245

250

255

260

265

270

275

280

285

290

RO 118753 Β1

Exemplul 1 . Obținerea anticorpilor monoclonali VFF-18

Clonarea proteinelor de fuziune pGEX întreaga regiune variantă a tipului HPKII de CD44v (Hofmann și colab., 1991) s-a amplificat din cheratinocite umane cADN prin reacție în lanț a polimerazei (PCR). Cei doi PCR-primeri S'-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAATG-S', pozițiile 25-52 și 5'TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3', pozițiile 1013-984 ale regiunii variante LCC97, așa cum se descrie de către Hofmann și colab., au conținut un loc de recunoaștere EcoRI, care a fost folosit, pentru a clona produsul PCR direct în vectorul pGEX-2T (Smith D.B., Johnson K.S. single-step purification of polypetides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67:31-40 (1988). Constructul rezultat (pGEX CD44v HPKII, v3-v107 codifică pentru o proteină de fuziune de circa 70 kD, constând din Glutation-S-transferază de Schistosoma japonicum și din Exoni v3-v10 de CD44 umani (fig.1; Heider K-H, Hofmann M., Horst E., van den Berg F., Ponta H., Herrlich P. And Pals S.T. A human homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps. J. Cell Biol. 120-233 (1933a). Proteina de fuziune a fost exprimată în E.coli și apoi s-a purificat prin afinitate peste Glutation-Agaroză (Smith și colab., 1988).

Imunizare și sitare

Șoareci femei Balb/c au fost imunizate intraperitoneal cu proteină de fuziune purificată prin afinitate după schema următoare:

1- a imunizare: 90 pg proteină de fuziune în substanță auxiliară

Freund completă

2- a și a 3-a imunizare: 50 pg proteină de fuziune în substanță auxiliară

Freund incompletă

Imunizările au avut loc în intervale de câte 4 săptămâni. 14 zile după ultima imunizare animalele au fost imunizate încă 3 zile consecutiv cu câte 10 pg proteină de fuziune în PBS. în ziua următoare, celule de splină ale unui animal s-au fuzionat cu un titru ridicat de anticorp cu P3.X63-Ag8.653-celule de mielom de șoarece cu ajutorul polietilenglicolului 4000. Celulele de Hybridom s-au selecționat apoi în plăci de microtitru în mediu HAT (Kohler și Milstein, 1975; Kearney și colab., 1979).

Determinarea titrului de anticorp în ser respectiv sitarea supernatanților de Hybridom s-au realizat cu ajutorul unui ELISAs. La acest test plăcile de microtitrare s-au acoperit mai întâi cu proteină de fuziune (GST-CD44v3-10) sau numai cu Glutation-S-transferază. Apoi s-a incubat cu diluări repetate de probe de ser respectiv cu supernatanți de Hybridom și s-au detectat anticorpii specifici cu anticorpi conjugați cu peroxidază împotriva imunoglobinei de șoarece. Hybridomii, care au reacționat numai cu Glutation-S-transferază, au fost aruncați. Anticorpii rămași au fost caracterizați mai întâi într-un ELISA cu proteine de fuziune specifice pentru domeniile respective (Exon v3, Exon v5 + v6, Exon v6 + v7, Exon v8 - v10) (Koopman și colab., 1993). Reactivitatea lor imunhistochimică a fost testată la tăieturi de piele umană. Anticorpul VFF-18 a fost identificat prin legare la pepdita sintetică Hui (QWFGN RWHEG YRQT). Secvența din Hui este un fragment al CD44-Exonului v6.

Exemplul 2. Legarea anticorpilor CD44v6 specifici la peptide sintetice

Legarea anticorpilor CD44v6 specifici la peptide sintetice a fost determinată într-un test ELISA

Soluții:

Tampon de acoperire: carbonat de sodiu 0,05 M, pH=9,6

Tampon de testare: PBS (Phosphat buffered saline = soluție de sare tamponată cu fosfat)

0,5% BSA (albumină de ser de vită)

0,05% Tween 20

RO 118753 Β1

Soluție de substrat Fa. Kierkagaard & Perry laboratories, Gaithersburg MD, SUA; TMB substrat de peroxidază: soluție de peroxidază B (H₂O₂) 1 :1

Peptidele (50 pg/ml în tamponul de acoperire) s-au imobilizat pe NUNC maxisorbimunoplăci (1.1ASML) sau Acti-A-plăci ale Fa. Bio Products (anticorpi VFF) la 4°C peste noapte. La Acti-A-plăci peptidă se leagă covalent de placă. Apoi, s-a spălat cu PBS/0,05% Tween, locurile de adsorbție libere s-au blocat la suprafața plăcilor cu tampon de testare (o oră la temperatura camerii) și s-au spălat încă odată cu PBS/0,05 % Tween 20. Acti-Aplăcile s-au redus după blocare cu 10 mM borhidrură de sodiu în 20 mM carbonat acid de sodiu, pH= 9,0 (s-au agitat la temperatura camerei o oră) și apoi s-au spălat de trei ori cu PBS/0,05 % Tween. Apoi, supranatanții de Hybridom, respectiv soluțiile de anticorpi în tampon de testare în concentrații între 0,02 și 10,0 pg/ml s-au pus în vase și s-au incubat două ore la temperatura camerei într-un dispozitiv de agitare a plăcilor. După aceasta au urmat trei trepte de spălare cu PBS/0,05 % Tween 20. Apoi, s-au adăugat 100 pm/vas anticorpi IgG-anti-șoarece conjugați cu peroxidază de hrean într-o diluție adecvată în tampon de testare. După o incubare de două ore la temperatura camerei s-a spălat suprafața dispozitivului de agitare a plăcilor de trei ori cu PBS/0,05 % Tween 20 și s-a colorat cu soluție de substrat. După 10-15 min dezvoltarea s-a stopat cu acid sulfuric 2M, și absorbția s-a măsurat la 450 nm (referință 690 nm) la fotometru.

într-o primă experimentare s-a demonstrat legătura anticorpuli 1.1AS;L specific pentru șobolani-CD44v6 la peptidă Ral (KWFEN EWQGK NPPT) (Tabelul 1, fig.3 (A)).

Tabelul 1

345

350

355

360

365

1.1 ASML pg/ml	Absorbția
10,0	1,652
5,00	1,702
2,50	1,658
1,25	1,595
0,63	1,502
0,31	1,211
0,16	0,971
0,08	0,686
0,04	0,458
0,02	0,270

370

375 într-o altă încercare s-a sintetizat o peptidă omologă lui Ral din secvența umană CD44v6 (Hui, QWFGN RWHEG YRQT). S-au legat diferiți anticorpi anti-umani CD44v6. la Hui. în acest caz se dovedește, că VFF-18 prezintă o afinitate de legare surprinzător mai ridicată decât toți anticorpii folosiți (tabelul 2, fig.3 (B)).

Tabelul 2

380

Anticorp	Absorbția
VFF-2	0,067
VFF-4	1,333
VFF-7	0,199
VFF-18	2,386

385

RO 118753 Β1

Pentru evaluarea cantitativă s-au legat în afară de acești anticorpi purificați antiuman-CD44v6 în diferite concentrații la peptida Hui și în acest caz se arată afinitatea de legătură mai bună, în mod clar, în comparație cu ceilalți anticorpi (tabelul 3, fig.3 (C)).

Tabelul 3

pg/ml anticorp	VFF-4	VFF-7	VFF-18
10,000	1,225	0,247	2,320
3,333	1,404	0,226	2,550
1,111	0,853	0,094	2,483
0,370	0,336	0,054	2,426
0,123	0,163	0,028	1,354
0,041	0,086	0,025	0,615
0,014	0,048	0,021	0,266
0,005	0,036	0,031	0,095
0,002	0,021	0,021	0,061

Exemplul 3. Legarea anticorpilor marcați specifici CD44v6 la linii de celule tumorale Marcarea radioactivă a anticorpilor

1mCi N-succinimidil-/2,3-³H/-propionat (^HANSP, Amersham 1 mCi/ml) s-au evaporat într-un capilar de probe siliconizat la 0°C în vid cu jet de apă până aproape la sec. S-au adăugat 15 pg de anticorpi (1 mg/ml în PBS, pH=7,4) și s-au incubat 48 h la 4°C. Apoi, s-au captat ^HANSP prin reacție cu 30 pl glicină 1M în PBS (20 min la temperatura camerei). Separarea anticorpului marcat de ^HAglicină a avut loc pe o coloană Sephadex-G25-M (volumul coloanei 15 ml), utilizându-se ca tampon curgător PBS/0,5% BSA. Anticorpul marcat ^H/ apare în volumul de evacuare. Cantitatea de anticorp a fost determinată într-un test ELISA pentru detectarea imunoglobulinei de șoarece și s-a calculat activitatea specifică.

Legarea anticorpilor radiomarcați la celule tumorale

Cei trei anticorpi VFF-7 (anti-v6), VFF-8 (anti-v5) și VFF-18 (anti-v6) au fost marcați radioactiv cu N-succinimidil-/2,3-³H/proponiat și s-au folosit pentru testul de legare la diferite linii de celule tumorale. Următoarele linii de celule au fost utilizate în acest caz: CHO-CD44 var: linia de celule de hârciog recombinantă (Chinese Hamster Ovary), variantele umane CD44 (Exons v3-v10) exprimate la suprafață; HCT-116, CX-1, HT-29, CaCO, COLO 205: linii de carcinom de colon umane; A431: linia de carcinom de epiteliu în plăci umane.

Celulele au fost puse în plăci pentru culturi de țesuturi cu 12 găuri, au fost incubate peste noapte la 37°C în incubator cu CO₂, apoi s-au spălat odată cu PBS și s-au fixat cu etanol (1 min la temperatura camerei). Apoi, s-au spălat odată cu mediu de cultură (serfetal de vițel RPM11640/10%) și s-a legat anticorpul radioactiv (250000 dpm/vas în mediu de cultură). După o incubare de 25 h la temperatura camerei pe dispozitivul de scuturare cu plăci s-a spălat de trei ori cu PBS/0,5 % BSA, celulele s-au solubilizat cu 0,1 M NaOH/1% Triton X-100 și radioactivitatea s-a măsurat în contorul de scintilație. Legarea nespecifică a fost determinată în prezența unui exces de 100 de ori de anticorpi nemarcați. După determinarea activității specifice a anticorpilor, cantitatea de anticorpi legați poate fi exprimată în fmol.

RO 118753 Β1

435

Tabelul 4 și fig.4 arată legarea specifică a anticorpilor la diferite linii de celule. Pe când legarea anticorpilor VFF-7 specifică pentru v6 și VFF-18 la linia de celule recombinantă CHO-CD44 var a fost aproape identică, anticorpii arată la legătura cu liniile de celule tumorale comportamente diferite de legătură. în unele cazuri se observă numai o legătură cu VFF-18 și în măsură redusă o legătură cu VFF-8 (HT-29, CACo, COLO 205), la celelalte linii de celule VFF-18 se leagămult mai bine decât VFF-7.

Tabelul 4

Linia de celule	VFF-7 fmol	VFF-8 fmol	VFF-18 fmol
CHO CD44var	33,50	68,42	46,52
HCT-116	1,44	11,08	20,22
CX-1	0,19	2,20	9,48
HT-29	0,00	2,60	26,07
CaCo	0,03	2,81	12,57
COLO 205	0,00	0,32	2,88
A431	8,19	42,32	38,37

Exemplul 4. ELISA pentru determinarea CD44 v6 solubil în ser

440

445

Soluții:

Tampon de acoperire: 0,05 M carbonat de sodiu pH=9,6

PBS (soluție sărată tamponată cu fosfat)

0,5% BSA (albumină de ser de vită)

0,05% Tween 20

450

Diluant de probă:

Soluție de substrat:

>

Fa.Bender MedSystem, Viena, Austria Fa. Kierkegaard & Perry laboratories, GAITHESSBURG MD, SUA; TMB substrat de

455 peroxidază: soluție de peroxidază B (H₂O₂)1:1

Plăci de microtitru (imunoplacă Nune MaxiSorp F96) s-au acoperit cu 5 pg/ml dintr-un anticorp specific pentru CD44v6 (incubarea la 4°C peste noapte). Apoi, s-a spălat cu PBS/0,05 % Tween, locurile de adsorbție libere s-au blocat la suprafața plăcilor cu tampon de testare (o oră la temperatura camerei) și s-a spălat încă odată cu PBS/0,05% Tween 20. Probele de ser au fost apoi prediluate cu Sample Diluent (=diluant de probă) cel puțin 1:5 și s-au diluat mai departe în diluări în serii 1:2 în placă în Sample Diluent. Apoi, s-au adăugat 50 μΙ/vas anticorpi anti-CD44std conjugați cu peroxidază de hrean (clon BU-52, The Binding Dite, Birmingham) într-o diluție adecvată (1:3000 -1:10000) în tamponul de testare. După incubare de trei ore la temperatura camerei pe dispozitivul de agitare cu plăci s-a spălat de trei ori cu PBS/0,05% Tween 20 și s-a colorat cu soluție de substrat. După o dezvoltare de 10-15 min s-a stopat cu acid sulfuric, și absorbția s-a măsurat la 450 nm (referință 690 nm)

460

465 la fotometru.

Pentru cuantificare s-a efectuat o diluare în serie în tampon de testare a unui preparat CD44-standard în paralel cu probele de ser. Acest preparat s-a purificat dintr-un supernatant de celule de hârciog recombinante (CHO), care exprimă CD44v3-v10 solubil CD44v3v10 se referă la o variantă umană CD44, care conține prin Exoni v3 până la v10 secvențe codificate de peptidă.

470

RO 118753 Β1

Tabelul 5 și fig.5 arată dovedirea de variante solubile de CD44, care conțin Exon v6, în ser normal uman. într-un sandwich ELISA s-au introdus cei trei anticorpi specifici la v6, VFF-4, VFF-7 resp. VFF-18 ca anticorpi de acoperire. în toate cele trei cazuri s-a utilizat drept anticorp de demonstrare un anticorp specific la CD44std 8BU-52 std = standard) conjugat cu peroxidază. Se arată semnalul a două seruri diferite umane normale la diferite diluări în aceste testări. în ambele cazuri ((A) și (B)) se observă cu VFF-18 un semnal mult mai puternic decât cu ceilalți doi anticorpi.

Tabelul 5A

Serul 1

Dilutia >	VFF-4	VFF-7	VFF-18
1:5	0,406	0,417	3.143
1:10	0,378	0,289	3,055
1:20	0,296	0,179	2,630
1:40	0,207	0,072	1,778
1:80	0,109	0,062	1,084
1:160	0,050	0,030	0,594
1:320	0,026	0,008	0,318
1:640	0,012	0,007	0,159

Tabelul 5B

Serul 2

Dilutia	VFF-4	VFF-7	VFF-18
1:5	1,690	1,280	3,290
1:10	1,756	1,185	3,321
1:20	1,564	0,857	3,163
1:40	1,213	0,468	3,050
1:80	0,699	0,208	2,537
1:160	0,336	0,061	1,666
1:320	0,138	0,014	0,988
1:640	0,054	0,018	0,546

Tabelul 6 și fig.6 arată variante de CD44 care conțin v6. Cu două ELISA diferite s-a determinat conținutul în CD44 var solubil în serurile a 6 donatori sănătoși. într-un test s-a utilizat ca anticorp de acoperire VFF-7, în celălalt VFF-18; ambii anticorpi recunosc pe Exon v6. Ca preparat de comparație s-a folosit în ambele cazuri o variantă CD44 (Exon v3-v10) solubilă recombinantă obținută în celule CHO. VFF-18-ELISA arată în medie valori de 3,5 ori mai mari decât VFF-7-ELISA. Aceasta înseamnă că CD44 var solubil care apare în ser se recunoaște de către VFF-18 în comparație cu proteina recombinantă mai bine decât de către VFF-7.

R0118753 Β1

515

Tabelul 6

Donator	VFF-7 ng/ml	VFF-18 ng/ml	VFF-18/VFF-7
1	18,2	75,9	4,17
2	32,1	85,5	2,66
3	22,4	87,6	3,91
4	27,7	91,6	3,31
5	26,8	98,3	3,67
6	95,4	3,32	3,48
Valoarea medie SD CV%			3,53 0,52 14,9%

520

525

PROTOCOL DE SECVENȚE (1) DATE GENERALE:

(I) TITULAR: 530 (A) NUMELE: Boehringer Ingelheim Internațional GMBH (B) STRADA: Binger Str.

(C) LOCALITATEA: Ingelheim (E) ȚARA: Germania (F) COD POȘTAL: 55216535 (G) TELEFON: 06132-772770 (H) TELEFAX: 06132-774377 (A) NUMELE: Dr. Guenther Adolf (B) STRADA: Stiftgasse 15-17/10540 (C) LOCALITATEA: Viena (E) AUSTRIA (F) CODUL POȘTAL: A-1070

PantentlnRelease # (A) NUMELE: Dr. Erik Patzelt545 (B) STRADA: Hans-Buchmueller-Gasse 8 (C) LOCALITATEA: Punkersdorf (E) ȚARA: Austria (F) COD POȘTAL: A-3002 (ii) DENUMIREA INVENȚIEI: Anticorp monoclonal împotriva CD44v6 550 (iii) NUMĂRUL DE SECVENȚE: 6 (iv) CAPACITATEA DE CITIRE LA COMPUTER (A) PURTĂTOR DE DATE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) SISTEM DE EXPLOATARE: PC-DOS/MS-DOS 555 (D) PROGRAM DE AUTOMIZARE (SOFTWARE):

1.0, version # 1,30 (EPA)

RO 118753 Β1 (2) INDICAȚII LA SEQ ID NO: 1:

(I) CARACTERISTICA SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 27 perechi de baze (B) FELUL: Nucleotidă (C) FORMA LINIEI: Linie individuală (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) FELUL MOLECULEI: Acid nucleic divers (A) DESCRIERE: /desc=”PCR Primer” (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 1: CAGGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG (2) INDICAȚII LA SEQ ID NO: 2:

(I) CARACTERISTICA SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 30 perechi de baze (B) FELUL: Nucleotidă (C) FORMA LINIEI: Linie individuală (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) FELUL MOLECULEI: acid nucleic divers (A) DESCRIERE: /dese = “PCR Primer” (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 2: TGATAAGGAA CGATTGACAT TAGAGTTGGA (2) INDICAȚII LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERISTICA SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 14 amino acizi (B) FELUL: Amino acid (C) FORMA LINIEI: Linie individuală (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) FELUL MOLECULEI: Peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 3

Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gin Gly Lys Asn Pro Pro Thr 1 5 10 (2) INDICAȚII LA SEQ ID NO: 4: (I) și (ii) ca mai sus la No 3; (xi): Gin Trp Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Cin Thr

5 10 (2) INDICAȚII LA SEQ ID NO: 5:

(I) CARACTERISTICA FRECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 42 Amino acizi (B) FELUL: Amino acid (C) FORMA LINIEI: Linie individuală (ii) FELUL MOLECULEI: Peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 5:

Trp Ala Asp Pro Asn Ser Thr Thr Glu Glu Ala Ala Thr Gin Lys Glu

10 15

Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Cin Gly Lys Asn Pro Pro Thr Pro Ser

25 30

Glu Asp Ser His Val Thr Glu Gly Thr Thr

40

RO 118753 Β1 (2) INDICAȚII LA SEQ ID NO: 6:

(I) CARACTERISTICA SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 43 de amino acizi (B) FELUL: Amino acid (C) FORMA LINIEI: Linie individuală (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) FELUL MOLECULEI: Peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 6:

Gin Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys Glu 15 10 15

Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro Arg 20 25 30

605

610

615

Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala Ala

Claims

Revendicări

620

1. Anticorp împotriva unui epitop cuprins în secvența de aminoacizi codificată de exonul 6 variabil al genei CD44, caracterizat prin aceea că, el este anticorpul VFF-18 produs de către linia celulară hibridom cu numărul de depozitare DSM ACC2174.
2. Linie celulară hibridom cu numărul de depozitare DSM ACC2174.
3. Derivat de anticorp care se poate obține prin modificarea chimică sau enzimatică 625 a unui anticorp, conform revendicării 1.
4. Derivat de anticorp, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, el este un fragment al unui anticorp, conform revendicării 1.
5. Derivat de anticorp, conform revendicării 4, caracterizat prin aceea că, el este un fragment Fab sau un fragment F (ab’)₂. 630
6. Derivat de anticorp, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, anticorpul este legat de o altă moleculă.
7. Derivat de anticorp, conform revendicării 6, caracterizat prin aceea că, cealaltă moleculă este o polipeptidă.
8. Derivat de anticorp, conform cu oricare dintre revendicările 3 până la 5, carac- 635 terizat prin aceea că, el este legat de un izotop radioactiv.
9. Derivat de anticorp care recunoaște același epitop ca și anticorpul conform revendicării 1.
10. Anticorp recombinant cu idiotipul unui anticorp, conform revendicării 1.
11. Anticorp recombinant, conform revendicării 9, caracterizat prin aceea că, el este 640 un derivat de anticorp himeric, umanizat, sau cu un singur lanț sau este un derivat de anticorp obținut prin amestecarea de lanțuri (chain shuffling).
12. Anticorp recombinant, conform revendicării 9 sau 10, caracterizat prin aceea că, el este legat de o altă moleculă sau de un izotop radioactiv.
13. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că ea cuprinde ca ingredient 645 activ un anticorp sau un derivat de anticorp conform cu oricare dintre revendicările 1 sau 3 până la 12.
14. Utilizarea unui anticorp sau a unei molecule de anticorp, conform uneia din reven- dicările 1 sau 3 până la 12 pentru metodele de diagnosticare în afara corpului uman sau animal. 650

655

RO 118753 Β1
15. Utilizarea, conform revendicării 14, caracterizată prin aceea că metoda este un imunotest cuplat cu o enzimă sau un radioimunotest.
16. Utilizarea, conform revendicării 14, caracterizat prin aceea că metoda este o metodă imunohistochimică.
17. Utilizarea unui anticorp sau a unei molecule de anticorp, conform uneia din revendicările 1 sau 3 până la 11 pentru prepararea unei substanțe pentru diagnosticarea in vivo. Președintele comisiei de examinare: biochim. Crețu Adina