HU220168B - CD44v6 elleni monoklonális antitest, alkalmazása és előállítása, valamint az antitestet termelő hibridóma sejtvonal - Google Patents

CD44v6 elleni monoklonális antitest, alkalmazása és előállítása, valamint az antitestet termelő hibridóma sejtvonal Download PDF

Info

Publication number
HU220168B
HU220168B HU9603387A HU9603387A HU220168B HU 220168 B HU220168 B HU 220168B HU 9603387 A HU9603387 A HU 9603387A HU 9603387 A HU9603387 A HU 9603387A HU 220168 B HU220168 B HU 220168B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
vff
antibody molecule
molecule
antibodies
Prior art date
Application number
HU9603387A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9603387D0 (en
HUT76260A (en
Inventor
Günther R. Adolf
Erik Patzelt
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh.
Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19944431297 external-priority patent/DE4431297A1/de
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh., Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh. filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh.
Publication of HU9603387D0 publication Critical patent/HU9603387D0/hu
Publication of HUT76260A publication Critical patent/HUT76260A/hu
Publication of HU220168B publication Critical patent/HU220168B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70585—CD44
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2884—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD44
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány egy olyan epitóp elleni monoklonális antitestre vonatkozik, amelyet a CD44 gén v6 exon variánsa kódol, továbbá a belőle származó antitestmolekulákra, az antitest, illetve az antitestmolekulák diagnosztikában és terápiában való felhasználására, valamint az antitestet beemelő hibridóma sejtvonalra.
Nemrég kimutatták, hogy a CD44 felületi glikoprotein-variánsok expressziója szükséges és elégséges ahhoz, hogy ez mind a nem metasztatizáló patkánypankreász adenokarcinóma sejtvonalban, mind egy nem metasztatizáló patkány-fibroszarkóma sejtvonalban úgynevezett spontán metasztatikus viselkedést váltson ki [U. Günthert et al., Cell, 65, 13-24 (1991)]. Míg a legkisebb CD44-izoforma, a CD44s (vagy CD44std) standard forma egy sor különböző szövetben - például epiteliális sejtekben - ubikviter kifejeződik, addig a CD44 bizonyos hasítási variánsai (CD44v, CD44var) az epiteliális sejteknek csak egy alcsoportján fejeződnek ki. A CD44-variánsok váltakozó hasadással úgy képződnek, hogy a CD44s-ben 10 exon (vl-vlO) szekvenciái teljesen kihasadnak, ugyanakkor a nagyobb variánsokban különböző kombinációkban előfordulhatnak [G. R. Screaton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 12160-12164 (1992); C. Tőig et al., Nucl. Acids Rés., 21, 1225-1229 (1993); M. Hofmann et al., Cancer Rés., 51, 5292-5297 (1991)]. A variánsok abban különböznek egymástól, hogy a protein extracelluláris részének egy bizonyos helyén különböző aminosavszekvenciák vannak beépítve. Ilyen variánsokat tudtak kimutatni különböző emberi tumorsejtekben és emberi tumorszövetekben. Nemrég vizsgálták a CD44-variánsok expresszióját kolorektális karcinogenezisben is [K-H. Heider et al., J. Cell. Bioi., 120, 227-233 (1993a)]. A normál emberi vastagbélfedőhámban (epithelium) nem fejeződnek ki CD44-variánsok, és csak a crypták proliferáló sejtjeiben mutatható ki egy gyenge expreszszió. A tumorprogresszió késői stádiumaiban, például adenokarcinómában, a CD44 minden malignus elkorcsosult variánsa kifejeződik. Agresszív non-Hodgkinlimfómában is ki tudták mutatni a CD44-variánsok magas szintű szöveti kifejeződését [G. Koopman et al., J. Exp. Med., 177, 897-904 (1993)].
Úgy tűnik, hogy a v6 exon különleges szerepet tölt be a metasztatikus terjedésben [W. Rudy et al., Cancer Rés., 53, 1262-1268 (1993)]. Állatmodellben v6-specifikus epitópok elleni antitestekkel meg lehetett gátolni a metasztatizáló sejtek megtelepedését és a metasztázisok növekedését [S. Seiter et al., J. Exp. Med., 177, 443-455 (1993)]. Vastagbél-karcinómák esetén a v6expresszió a tumorprogresszióval [V. J. M. Wielanga et al., Cancer Rés., 53, 4754-4756 (1993)] van összefüggésben. Gyomorkarcinómák esetén a v6-expresszió fontos diagnosztikai marker az intesztinális és diffúz típusú tumorok megkülönböztetésénél [K-H. Heider, Cancer Rés., 53, 4197-4203 (1993b)]. Mindkét utóbb említett munkában a v6-expressziót v6-specifikus epitóp elleni antitestek segítségével mérték.
A v6 exon által kódolt epitópok elleni monoklonális antitestek ismertek e szakterületen [Hofmann et al., (1991); Wielanga et al., (1993); II. Salmi et al.: J. of
Cell Bioi. 122(2), 431-442 (1993); és D. Jackson et al.: Int. J. of Cancer 8, 110-115 (1994)]. A jelentős potenciális előnyök miatt, amelyet az ilyen antitestek nyújthatnak a diagnózisban és terápiában, komoly igény van javított tulajdonságokkal rendelkező antitestek iránt.
A találmány feladatát egy olyan antitest előállítása képezte, amely az ismert v6-specifikus antitestekkel szemben szignifikánsan jobb tulajdonságokat mutat fel.
Ezt a feladatot a találmánnyal meg tudtuk oldani. A találmány egy VFF-18 jelű antitestre vonatkozik. A találmány tárgyát képezi még egy olyan hibridóma sejtvonal, amely ezt az antitestet szekretálja, és amelyet DSM ACC2174 letéti számmal helyeztünk letétbe a DSM-Deutsche Sammlung fúr Mikroorganizmen und Zellkulturen GmbH-nál (D-38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 16, Németország) 1994. 06. 07-én.
A következőkben antitest vagy antitestmolekulák kifejezés alatt nemcsak teljes immunglobulinokat értünk, hanem azonos kötőspecifitású és kötőaffmitású anyagokat is, mint amilyenek a leírt antitestszármazékok és rekombináns antitestmolekulák.
A találmány szerinti VFF-18 antitestet az 1. példa szerinti eljárással állítjuk elő. Az antitestet megkaphatjuk még a letétbe helyezett hibridóma sejtvonal révén is. Egy átlagos szakember is képes a találmány szerinti antitest származékainak előállítására, vagy pedig ezen antitest szekvenciaanalíziséből kiindulva és/vagy az ezen antitestet termelő hibridóma sejtvonal alkalmazásával képes azonos idiotípusú rekombináns antitestmolekula előállítására, azaz olyan antitestmolekulák előállítására, amelyek az antigénkötő hely területén (complementarity-determining region=CDR) azonos aminosavszekvenciát tartalmaznak, mint a VFF-18 antitest. Ennélfogva magától értetődik, hogy az ilyen származékok és rekombináns antitestmolekulák is a találmány oltalmi köréhez tartoznak.
A teljes VFF-18 antitest immunglobulinból például Fab vagy F(ab’)2 fragmentumokat vagy más fragmentumokat állíthatunk elő [R. J. Kreitman, Cancer Rés., 53, 819-825 (1993)]. Diagnosztikai eljárások céljára a VFF-18 antitestmolekulákat, ezek fragmentumait vagy az azonos idiotípusú rekombináns antitestmolekulákat, például radioaktív izotópokkal - ilyenek a 131I, H1In, 99mTc - vagy radioaktív vegyületekkel [S. M. Larson et al., 1991; G. D. Thomas et al., 1989; S. C. Srivastava, (1988)], enzimekkel, mint a peroxidázok vagy alkalikus foszfatázok [D. Catty, C. Raykundalia; Antibodies, Vol. II., IRL Press Oxford (1989), 97-152. és 105-109. oldal], fluoreszcens színezékekkel [G. D. Johnson; Antibodies, Vol. II., IRL Press Oxford (1989), 179-200. és 180-189. oldal] vagy biotinmolekulákkal [J. I. Guesdon et al., J. Histochem. Cytochem., 27, 1131 (1979] kapcsolhatjuk össze. Terápiás alkalmazásához a VFF-18-at vagy a VFF-18-ból származó antitestmolekulákat toxinokkal [E. S. Vitetta et al., Cancer Rés., 51, 4052-4058 (1991); E. S. Vitetta, P. E. Thorpe, 1991; R. J. Kreitman et al., 1993; C. P. Theuer et al., Cancer Rés., 53, 340-347 (1993)], citosztatikumokkal [M. Schrappe et al., Cancer Rés., 52, 3838-3844 (1992)] gyógyszerelőtermékekkel (prodrug) [S-M.
HU 220 168 Β
Wang et al., Cancer Rés., 52, 4484-4491 (1991); P. D. Senter et al., Cancer Rés., 49, 5789-5792 (1989)] vagy radioaktív anyagokkal kapcsolhatjuk össze. Az antitestekhez ezenkívül citokint vagy más, immunmoduláló hatású polipeptidet, például tumomekrózis faktort (TNF) vagy interleukin-2-t (IL-2) is köthetünk.
Egy szakembernek módjában áll, hogy a VFF-18 antitest aminosavszekvenciájának analízise után és/vagy az ezen antitestet termelő hibridóma sejtvonal, de főképpen a benne foglalt genetikai információk felhasználásával, a VFF-18-cal azonos idiotípusú rekombináns antitestmolekulát állítson elő. A technika állása szerint a megfelelő eljárások rendelkezésre állnak. Ilyen rekombináns antitestek például humanizált antitestek [S-U. Shin et al., Methods Enzymol., 178, 459-476 (1989); D. Güssov G. Seemann, Methods Enzymol., 203, 99-121 (1991)], bispecifikus antitestek [L. M. Weiner et al., Cancer Rés., 49, 4062-4067 (1989); D. A. Goodwin, J. Nucl. Med. Bioi., 16, 645 (1989)], single-chain antitestek [scFv; S. Johnson, R. E. Bírd, Methods Enzymol., 203, 88-89 (1991)], teljes vagy fragmentált immunglobulinok [M. J. Coloma et al., J. Immunoi. Methods, 152, 89-104 (1992); M. Nesbit et al., J. Immunoi. Methods, 151, 201-208 (1992); C. F. Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 9339-9343 (1992)], vagy chain shuffling révén előállított antitestek [G. Winter et al., Ann. Rév. Immunoi., 12, 433-455 (1994)] lehetnek. Az antitestek humanizálására ma olyan módszereket használhatunk, mint a PCR (lásd például az EP-0368684 és EP-0438310 számú európai szabadalmi leírást és a WO 9207075 számon közzétett nemzetközi szabadalmi leírást) vagy a komputermodellezés (lásd például a WO 9222653 számon közzétett nemzetközi szabadalmi leírást). Előállíthatok például fúziós proteinek, ilyenek például a single-chain antitest/toxin fúziós proteinek [V. K. Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 1066 (1990); P. N. Friedmann, Cancer Rés., 53, 334-339 (1993)]. Az ilyen antitestmolekulák tehát ugyancsak a találmány oltalmi körébe tartoznak.
Egy átlagos tudású szakember ezenkívül meg tudja határozni az egzakt VFF-18 epitópot, és ennek az ismeretnek a birtokában képes arra, hogy azonos kötőspecificitással rendelkező azonos antitestet állítson elő. Ez például peptidekhez való kötődésük tanulmányozásával - mint a 2. példában - történhet, esetleg a Hűl peptid variálása révén. Az ilyen antitestek ennélfogva szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.
A találmány további tárgyát képezi a VFF-18 vagy a VFF-18-ból származó vagy az azonos antitestmolekulák alkalmazása a diagnosztikában és a terápiában.
A diagnosztikai eljárások olyan ismert eljárások lehetnek, amelyekben a találmány szerinti antitestmolekulákat használjuk, például ilyenek az enzimimmunassay-k (ELISA; D. Catty, C. Raykundalia, 1989), a radioimmunassay-k [D. Catty, G. Murphy, Antibodies, Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 77-96. oldal], az immunhisztokémiai eljárások (K-H. Heider et al., 1993b) vagy a Westem-blot-analízis. Ezekben az eljárásokban célszerűen a szervezetből vett szövetmintákat vagy testfolyadékokat - például biopsziákból - használjuk. A vizsgálatok kvalitatív, szemikvantitatív vagy kvantitatív vizsgálatok lehetnek. Az antitestet vagy az antitestmolekulákat ezekben a vizsgálatokban úgy alkalmazzuk, mint ahogyan például a technika állásának megfelelően ezt más v6-specifíkus antitestekre leírták (WO 9500851), ugyanakkor a találmány szerinti antitest vagy a találmány szerinti antitestmolekulák előnyös tulajdonságai az ilyen eljárásoknál jelentős javulást jelentenek.
A találmány szerinti antitestmolekulák az in vitro diagnosztikán kívül az in vivő diagnosztikában való felhasználásra is alkalmasak, különösképpen a tumordiagnosztikában. Amennyiben az antitestmolekula kimutatható jelzőt hordoz, úgy a jelző észlelése diagnosztikai célokat szolgálhat, mint például a tumor in vivő láthatóvá tételénél (imaging) vagy például a radioj elzéssel vezérelt sebészetben (radioguided surgery). A radioizotópokkal konjugált antitestek immunszcintigráfiában (imaging) való alkalmazásához egy sor előirat áll rendelkezésre, amelyeknek az alapján a szakember kivitelezheti a találmányt [A. G. Siccardi et al., Cancer Rés., 49, 3095-3103 (1989); A. M. Keenan et al., Cancer Rés., 47, 6093-6099 (1987); A. C. Perkins, Μ. V. Pimm, Eur. J. Nucl. Med., 19, 1054-1063 (1992); D. Colcher et al., Cancer Rés., 47, 4218-4224 (1987); C. H. Thompson et al., Láncét, 1984 (2): 1245-1247 (1984)].
A terápiás alkalmazás például az 1.1ASML antitest (S. Seiter et al., 1993) alkalmazásával analóg módon történhet, amikor is az alkalmazást szisztémásán vagy helyileg végezhetjük, például intravénás (fecskendővel vagy infúzióval), intraperitoneális, intramuszkuláris vagy szubkután injekcióval vagy infúzióval. Egyes szervek vagy testrészek perfúndálására is van lehetőség. A konjugált és nem konjugált antitestek beadásának előiratai rendelkezésre állnak a szakterületen [J. L. Mulshine et al., 1991, S. M. Larson et al., 1991; E. S. Vitetta, P. E. Thorpe, 1991; E. S. Vitetta et al., 1991; H. B. Breitz et al., J. Nucl. Med., 33, 1099-1112 (1992); O. W. Press et al., J. Clin. Oncol., 7, 1027-1038 (1989); L. M. Weiner et al., 1989; J. F. Chatal et al., Cancer Rés., 49, 3087-3094 (1989); H. F. Sears et al., Láncét, 1982 (1):762-765(1982)].
A VFF-18 más anti-CD44v6 antitestekét felülmúló kiváló tulajdonságait a 2-4. példákban ismertetjük.
Az alábbiakban az ábrák leírása következik.
Az 1. ábrán a GST-CD44 (v3-vl0) fúziós protein sematikus ábrája látható. GST=a Schisostoma japonicumból származó glutation-S-transzferáz; v3-vl0=keratinocita-CD44 váltakozó inszercióval. A nyíl egy trombin hasítási helyet jelöl.
A 2. ábrán az emberi és patkány-CD44 gén v6 exon szekvenciáinak összehasonlítása látható.
A 3. ábra a CD44v6-specifikus antitestek szintetikus peptidekhez való kötődését mutatja be. Az antitestek peptidekhez való kötődését ELISA-val határoztuk meg, amikor is a peptideket immobilizáltuk, majd az antitestoldatokkal inkubáltuk. Megfelelő mosási lépések után a megkötött antitesteket peroxidázzal konjugált antiegér-IgG antitesttel mutattuk ki. (A): Az első kísérletben a patkány-CD44v6-specifikus 1.1ASML antitest
HU 220 168 Β
Ral pepiidhez (KWFEN EWQGK NPPT) való kötődését mutattuk ki. (B): Egy további kísérletben a humán CD44v6-szekvenciából egy Ral-gyel homológ peptidet szintetizáltunk. Különböző anti-humán-CD44v6 hibridóma felülúszókat kötöttünk ezen Hűl pepiidhez (QWFGN RWHEG YRQT). Az ábrából megállapítható, hogy a VFF-18 lényegesen jobban kötődik a pepiidhez, mint a kísérletben részt vevő többi antitest. (C): Mennyiségi kiértékelés céljából a kísérletet különböző koncentrációjú tisztított antitestekkel ismételtük meg. 10 Itt is megmutatkozott, hogy a VFF-18 erősebb kötőaffinitással rendelkezik, mint a többi antitest.
A 4. ábra radioaktív jelzett antitestek tumorsejtekhez való kötődését mutatja be. Három antitestet - VFF - 7 (anti-v6), VFF- 8 (anti-v5) és VFF -18 (anti- 15 v6) - jeleztünk radioaktív N-szukcinimidil-[2,3-3H]propionáttal, és a jelzett antitesteket különböző sejtvonalakhoz adtuk kötési vizsgálatok végett. A következő sejtvonalakat használtuk: CHO-CD44var: rekombináns hörcsögsejtvonal (kínaihörcsög-petefészek=Chinese Hams- 20 tér Ovary), amely humán variáns CD44-et (v3-vl0 exonok) fejez ki a felületén; HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO-205: humán vastagbél karcinóma sejtvonalak; A431: laphámkarcinóma sejtvonal. Az ábra az antitestek specifikus kötődését mutatja be a kü- 25 lönböző sejtvonalakhoz. Míg a VFF-7 és VFF-18 v6specifikus antitestek azonos nagyságrendben kötődnek a CHO-CD44var rekombináns sejtvonalhoz, addig tumorsejtvonalakhoz való kötődésük terén az antitestek nagyon különböző viselkedést mutatnak. Néhány eset- 30 ben csak VFF-18-kötődés és csekélyebb mértékben VFF-8-kötődés volt megfigyelhető (HT-29, CaCo, COLO-205), a többi sejtvonalnál a VFF-18 lényegesen jobban kötődött, mint a VFF-7.
5. ábra: v6 exon tartalmú oldható CD44-variánsok kimutatása normál emberi szérumban. Három v6-specifikus antitestet - VFF-4, VFF-7, illetve VFF-18 használtunk fedő antitestként egy szendvics ELISA5 vizsgálatban. A kimutatást mindhárom esetben peroxidázzal konjugált CD44std-specifikus antitesttel (BU-52; std==standard) végeztük. Az ábrák [(A) és (B)] két különböző normál humán szérum szignálját mutatják a vizsgálatokban használt különböző hígításoknál. A VFF-18-cal mindkét esetben lényegesen erősebb szignál figyelhető meg, mint a két másik antitesttel.
6. ábra: v6-tartalmú CD44-variánsok szérumértékei. Hat egészséges donor szérumában két különböző ELISA-vizsgálattal határoztuk meg az oldható CD44vartartalmat. Az egyik vizsgálatban a VFF-7-et, a másikban a VFF-18-at használtuk fedő antitestként; mindkét antitest a v6 exont ismeri fel. Összehasonlító készítmény gyanánt mindkét esetben egy CHO sejtekben előállított rekombináns oldható CD44-variáns (v3-vl0) szolgált. A VFF-18-ELISA átlag három és félszer magasabb értéket mutat, mint a VFF-7-ELISA. Ez azt jelenti, hogy a szérumban előforduló oldható CD44var-t a VFF-18 jobban felismeri, mint a VFF-7.
A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük, azonban ezek a példák semmiképpen nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.
1. példa
A monoklonális VFF-18 antitest előállítása
A pGEX fúziós proteinek klónozása
Emberi keratinocita-cDNS-ből a HPKII típusú CD44v (M. Hofmann et al., 1991) teljes variánsszakaszát polimeráz-láncreakcióval (PCR-rel) sokszoroztuk. A két PCR primer, az
5’-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3’ és 5’-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3’
- a Hofmann és munkatársai szerinti LCLC97 variánsszakasz 25-52, illetve 1013-984 pozíciói - egy EcoRI felismerőhelyet tartalmaz, amelyet arra használtunk, hogy a PCR-terméket közvetlenül a pGEX-2T vektorba [D. B. Smith et al., Gene, 67, 31-40 (1988)] klónozzuk be. A kapott szerkezet (pGEX CD44v HPKII, v3-vl0) egy körülbelül 70 kD tömegű fúziósproteint kódol, amely a Schisostoma japonicum eredetű glutation-Stranszferázból és a humán CD44 v3-vl0 exonokból áll (1. ábra; K.-H. Heider et al., 1993a). A fúziós proteint E. coliban fejeztük ki, és ezután glutation-agaróz affinitásmódszerrel tisztítottuk [D. B. Smith et al., Gene 67, 31-40(1988)].
Immunizálás és szűrés (screening)
Az affinitással tisztított fúziós proteinnel nőstény
Balb/c egereket immunizáltunk a következő séma szerint:
1. immunizáló oltás: 90 pg fúziós protein komplett
Freund-adjuvánsban;
2. és 3. immunizáló oltás: 50 pg fúziós protein inkomplett Freund-adjuvánsban.
Az oltásokat mindig 4 hetes időközönként végeztük. Az utolsó oltás után 14 nappal az állatokat még három egymást követő napon 10-10 pg fúziós proteinnel - PBS-ben - immunizáltuk. A következő napon az egyik magas antitesttitert adó állat lépsejtjeit polietilénglikol 4000 segítségével P3.X63-Ag8.653 egérmielómasejtekkel fuzionáltuk. A hibridóma sejteket ezután mikrotitrálólemezeken HAT táptalajban szelektáltuk [G. Köhler, C. Milstein, Natúré, 265, 495 (1975); J. F. Keamey et al., J. Immunoi., 123, 1548 (1979)].
A szérum antitesttiterének a meghatározását, illetve a hibridóma felülúszók szűrését (screening) ELISA segítségével végeztük. Ennél a vizsgálatnál a mikrotitrálólemezeket először fúziós proteinnel (GSTCD44v3-vl0) vagy csak glutation-S-transzferázzal fedtük. Ezután a lemezeket a szérumminták, illetve hibridóma felülúszók sorozathígításaival inkubáltuk, és a specifikus antitestet peroxidázzal konjugált egér-immunglobulin elleni antitesttel mutattuk ki. Azokat a hibridómákat, amelyek csak glutation-S-transzferázzal reagáltak, eldobtuk. A fennmaradt antitesteket ezután egy ELISA-tesztben doménspecifikus fúziós proteinek4
HU 220 168 Β kel (v3 exon, v5+v6 exon, v6+v7 exon, v8-vl0 exon) vizsgáltuk meg (G. Koopman et al., 1993). Immunhisztokémiai reaktivitásukat emberi bőrmetszeteken teszteltük. A VFF-18-at ezután a Hűl szintetikus pepiidhez (QWFGN RWHEG YRQT) való kötődése révén azonosítottuk. A Hul-szekvencia a humán CD44v6 exon egy fragmentuma.
2. példa
CD44v6-specifikus antitestek kötődése szintetikus peptidekhez
A CD44v6-specifikus antitestek szintetikus peptidekhez való kötődését ELISA-tesztben határoztuk meg.
Oldatok:
Fedőpuffer: 0,05 M nátrium-karbonát; pH 9,6
Assay-puffer: PBS (foszfáttal pufferolt konyhasóoldat) 0,5% BSA (bovine serum albumin=marha-szérumalbumin) 0,05% Tween-20
Szubsztrátoldat: TMB-peroxidáz-szubsztrát: peroxidázoldat Β (H2O2) 1:1 (Kirkegaard, Perry Laboratories, Gaithersburg, Md., USA) (TMB=3,3 ’,5,5 ’-tetrametil-benzidin)
A peptideket (50 pg/ml fedőpuffer) NUNC Maxisorp lemezeken (1.1ASML) vagy BIOPRODUCTS-féle Acti-A lemezeken (VFF antitestek) immobilizáltuk 4 °C-on egy éjszakán át. Acti-A lemezek esetén a peptid kovalens kötéssel kötődik a lemezhez. A lemezeket ezután PBS/0,05% Tween-20-oldattal mossuk, a lemezek felületén lévő szabad adszorpciós helyeket assay-pufferrel blokkoljuk (1 óra szobahőmérsékleten), majd újból mosás következik PBS/0,05% Tween-20-oldattal. Az assay-pufferrel 0,02 és 10,0 pg/ml közötti koncentrációkra beállított hibridóma felülúszókat, illetve antitestoldatokat ezután bemérjük a tartályokba, és a lemezeket két órán át szobahőmérsékleten lemez rázógépen inkubáljuk. Ezután három mosási lépés következik PBS/0,05% Tween-20-oldattal, majd tartályonként 100 pl, assay-pufferrel megfelelően hígított torma-peroxidázzal konjugált antiegér-IgG antitestet mérünk be. Lemez rázógépen kétórás szobahőmérsékleten való inkubálás után a lemezeket háromszor mossuk PBS/0,05% Tween-20-oldattal, és szubsztrátoldattal festjük. A reakciót 10-15 perces kifejlesztés után 2 M kénsavval állítjuk le, és az abszorpciót 450 nm-en (referencia: 690 nm) fotométeren méijük.
Egy első kísérletben az 1.1ASML patkány-CD44v6specifikus antitest Ral pepiidhez (KWFEN EWQGK NPPT) való kötődését mutattuk ki [1. táblázat, 3(A) ábra].
1. táblázat
1.1ASML (pg/ml) Abszorpció
10,00 1,652
5,00 1,702
1.1ASML (pg/ml) Abszorpció
2,50 1,658
1,25 1,595
0,63 1,502
0,31 1,211
0,16 0,971
0,08 0,686
0,04 0,458
0,02 0,270
Egy további kísérletben egy Ral-gyel homológ peptidet szintetizáltunk a humán CD44v6-szekvenciából (Hűl, QWFGN RWHEG YRQT). Különböző antihumán CD44v6 antitesteket kötöttünk a Hul-hez. Kimutattuk, hogy a VFF-18 meglepően magasabb kötőaffinitást mutat, mint az összes többi részt vevő antitest [2. táblázat, 3(B) ábra].
2. táblázat
Antitest Abszorpció
VFF-2 0,067
VFF-4 1,333
VFF-7 0,199
VFF-18 2,384
Kvantitatív kiértékeléshez ezenkívül különböző koncentrációjú tisztított antihumán CD44v6 antitestet kötöttünk a Hűl pepiidhez. Ebben az összehasonlításban is megmutatkozott, hogy VFF-18 jelentősen jobb kötőaffinitással rendelkezik, mint a többi antitest [3. táblázat, 3(C) ábra].
3. táblázat
Antitest (pg/ml) VFF-4 VFF-7 VFF-18
10,000 1,225 0,247 2,320
3,333 1,404 0,226 2,550
1,111 0,853 0,094 2,483
0,370 0,336 0,054 2,426
0,123 0,163 0,028 1,359
0,041 0,086 0,025 0,615
0,014 0,048 0,021 0,266
0,005 0,036 0,031 0,095
0,002 0,021 0,021 0,061
3. példa
Radioaktív jelzett CD44v6-specifikus antitestek kötődése tumorsejtvonalakhoz Antitestek radioaktív jelzése 1 mCi N-szukcinimidil-[2,3-3H]propionátot ([3H]NSP; Amersham; 1 mCi/ml) szilikonozott mintavevő
HU 220 168 Β csövecskében 0 °C-on vízsugárvákuummal majdnem szárazra párolunk. Hozzáadunk 15 mg antitestet (1 mg/ml PBS-ben, pH 7,4) és 48 órán át 4 °C-on inkubáljuk. Ezután a feleslegben maradt [3H]-NSP-t 30 μΐ 1 M glicinnel (PBS-ben; 20 perc szobahőmérsékleten) reagáltatjuk. A jelzett antitestet a [3H]-glicintől Sephadex-G-25-Μ oszlopon (oszloptérfogat 15 ml) választjuk el, ahol futtatópufferként PBS/0,5% BSA-t használunk. A [3H] jelzett antitest a kizárási térfogatban jelenik meg. Az antitest mennyiségét egér-immunglobulinkimutatáshoz szolgáló ELISA-tesztben határozzuk meg, és kiszámítjuk a specifikus aktivitást.
Radioaktív jelzett antitestek kötődése tumorsejtekhez
Három antitestet - VFF-7 (anti-v6), VFF-8 (antiv5) és VFF-18 (anti-v6) - jeleztünk radioaktív Nszukcinimidil-[2,3-3H]propionáttal. A jelzett antitesteket kötési vizsgálat céljából különböző tumorsejtvonalakhoz adtuk. A következő sejtvonalakat használtuk: CHO-CD44var: rekombináns hörcsögpetefészek-sejtvonal (kínaihörcsög-petefészek=Chinese Hamster Ovary), amely humán variáns CD44-et (v3-vl0) fejez ki a felületén; HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO-205: humán vastagbélkarcinóma-sejtvonalak; A431: humán laphámkarcinóma-sejtvonal.
A sejteket 12-tartályos szövettenyésztő lemezekre vittük, egy éjszakán át 37 °C-on szén-dioxidos inkubátorban inkubáltuk, ezután egyszer mostuk PBS-sel, majd etanollal fixáltuk (1 perc szobahőmérsékleten). A sejteket ezután egyszer mostuk táptalajjal (RPMI 1640/10% fetális boijűszérum), majd a radioaktív antitestekhez (250 000 dpm/tartály táptalaj) való kötés következett. A lemezeket lemez rázógépen 25 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk, utána háromszor mostuk 0,5% BSA-tartalmú PBS-sel. A sejteket 1% Triton X-100tartalmú 0,1 M nátrium-hidroxiddal szolubilizáltuk, és a radioaktivitást szcintillációs számlálóban mértük. Az aspecifikus kötődést a jelzetlen antitest százszoros feleslegének jelenlétében határoztuk meg. A kötődést egységes sejtszámra (400 000 sejt) vonatkoztattuk. Az antitest specifikus aktivitásának meghatározása után a kötött antitest mennyisége fmol-ban fejezhető ki.
A 4. táblázat és a 4. ábra mutatja be az antitestek specifikus kötődését a különböző sejtvonalakhoz. Míg a VFF-7 és VFF-18 v6-specifikus antitestek kötődése a CHO-CD44var rekombináns sejtvonalhoz közel azonos, addig a különböző tumorsejtvonalakhoz az antitestek kötődési viselkedése nagymértékben különbözik. Néhány esetben csak VFF-18-kötődést, csekélyebb mértékben VFF-8-kötődést (HT-29, CaCo, COLO-205) figyeltünk meg, a többi sejtvonalnál a VFF-18 lényegesen jobban kötődött, mint a VFF-7.
4. táblázat
Scjtvonal VFF-7 (finol) VFF-8 (fmol) VFF-18 (fmol)
CHO-CD44var 33,50 68,42 46,52
HCT-116 1,44 11,08 20,22
Sejtvonal VFF-7 (fmol) VFF-8 (fmol) VFF-18 (fmol)
CX-1 0,19 2,20 9,48
HT-29 0,00 2,60 26,07
CaCo 0,03 2,81 12,57
COLO-205 0,00 0,32 2,88
A431 8,19 42,32 38,73
4. példa
ELISA-teszt oldható CD44v6 meghatározására szérumban
Oldatok:
Fedőpuffer: 0,05 M nátrium-karbonát; pH 9,6
Assay-puffer: PBS (foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat)
0,5% BSA (marha-szérumalbumin) 0,05% Tween-20
Mintahígító: Bender MedSystems, Wien, Ausztria
Szubsztrátoldat: TMB-peroxidáz-szubsztrát: peroxidázoldat Β (H2O2) 1:1 Kíerkegaard and Peny Laboratories (Gaithersburg, MD., USA) (TMB=3,3 ’ ,5,5 ’ -tetrametil-benzidin)
Mikrotitrálólemezeket (NUNC Immunoplate Maxisorp F96) fedünk 5 mg/ml-es CD44v6-specifikus antitesttel (inkubálás 4 °C-on egy éjszakán át). Ezután a lemezeket PBS/0,05% Tween-20-oldattal mossuk, a lemez felületén lévő szabad adszorpciós helyeket assaypufferrel blokkoljuk (1 óra szobahőmérsékleten), és egyszer újból mossuk PBS/0,05% Tween-20-oldattal. A szérummintákból ezután legalább 1:5 alaphígítást készítünk, majd a lemezen a mintahígítóval 1:2 sorozathígítással további hígításokat készítünk. Ezután a torma-peroxidázzal konjugált anti-CD44std antitest (BU-52 klón; The Binding Site, Birmingham) megfelelő hígításából (1:3000-1:10 000 assay-pufferben) tartályonként 50 μΐ-eket mérünk be. A lemezeket lemez rázógépen három órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd háromszor mossuk PBS/0,05% Tween-20oldattal, végül szubsztrátoldattal festjük. A szín kifejlesztése (10-15 perc) után a reakciót 2 M kénsavval állítjuk le, és az abszorpciót fotométeren, 450 nm-en (referencia: 690 nm) mérjük.
Mennyiségi meghatározáshoz egy oldható CD44standard készítmény sorozathígításait (assay-pufferben) párhuzamosan futtatjuk. Ezt a készítményt olyan rekombináns hörcsögsejtek (CHO) felülúszójából tisztítottuk, amelyek oldható CD44v3-vlO-et fejeznek ki. A CD44v3-vlO egy olyan humán CD44-variáns, amely v3-vl0 exonok által kódolt szekvenciákat tartalmaz.
Az 5. táblázatban és az 5. ábrán a v6 exont tartalmazó oldható CD44-variánsok normál emberi szérumban való kimutatását mutatjuk be. A három v6-specifikus VFF-4, VFF-7, illetve VFF-18 antitestet fedőantitestekként használtuk egy szendvics ELISA-tesztben. A kimutatáshoz, mindhárom esetben, egy peroxidázzal kon6
HU 220 168 Β jugált CD44std-specifikus antitestet (BU-52, std=standard) használtunk. Két különböző normál humán szérum szignáljait mutatjuk be a vizsgálatokban használt különböző hígításoknál. A VFF- 18-nál mind a két esetben [(A) és (B)] lényegesen erősebb szignált figyeltünk meg, mint a két másik antitesttel.
5./A. táblázat Szérum 1.
Hígítás VFF-4 VFF-7 VFF-18
1:5 0,406 0,417 3,143
1:10 0,378 0,289 3,055
1:20 0,296 0,179 2,630
1:40 0,207 0,072 1,778
1:80 0,109 0,062 1,084
1,160 0,050 0,030 0,594
1,320 0,026 0,008 0,318
1,640 0,012 0,007 0,159
5./B. táblázat Szérum 2.
Hígítás VFF-4 VFF-7 VFF-18
1:5 1,690 1,280 3,290
1:10 1,756 1,185 3,321
1:20 1,564 0,857 3,163
1:40 1,213 0,468 3,050
1:80 0,699 0,208 2,537
1,160 0,336 0,061 1,666
Hígítás VFF-4 VFF-7 VFF-18
1,320 0,138 0,014 0,988
1,640 0,054 0,018 0,546
A 6. táblázat és a 6. ábra v6-tartalmú CD44-variánsok szérumértékeit mutatja be. Hat egészséges donor szérumának oldható CD44var-tartalmát két különböző ELISA-teszttel határoztuk meg. Az egyik tesztben a VFF-7-et, a másikban a VFF - 18-at használtuk fedőantitest gyanánt; mindkét antitest felismeri a v6 exont. Összehasonlító készítményként mindkét esetben egy CHO sejtekben előállított rekombináns oldható CD44-variáns (v3-vl0 exon) szolgált. A VFF-18-ELISA átlagosan három és félszer magasabb értékeket adott, mint a VFF-7- ELISA. Ez azt jelenti, hogy a szérumban előforduló CD44var-t, a rekombináns proteinhez hasonlóan, a VFF-18 jobban felismeri, mint a VFF-7.
6. táblázat
Donor VFF-7 (ng/ml) VFF-18 (ng/ml) VFF-18/ /VFF-7
1. 18,2 75,9 4,17
2. 32,1 85,5 2,66
3. 22,4 87,6 3,91
4. 27,7 91,6 3,31
5. 26,8 98,3 3,67
6. 95,4 332 3,48
Középérték SD (standard eltérés) CV% 3,53 0,52 14,9
Szekvenciák jegyzéke
AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: nukleinsav (A) LEÍRÁS: „PCR primer” (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CAGGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG
A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 30bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: nukleinsav (A) LEÍRÁS: „PCRprimer” (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TGATAAGGAA CGATTGACAT TAGAGTTGGA
HU 220 168 Β
A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 14 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Lys Trp Phe Glu Asn Glu 1 5
Trp Gin Gly
Lys
Asn Pro Pro Thr
A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 14 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 42 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Trp Al a Asp Pro Asn Ser Thr Thr Glu Glu Al a Al a Thr Gin Lys Glu
1 5 10 15
Lys Trp Phe Glu As n Glu Trp G1 n Gly Ly s Asn Pro Pro Thr Pro Ser
20 25 30
Glu Asp Ser Hi s Va 1 Thr Glu Gly Thr Thr
35 40
A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 43 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gin 1 Al a Thr Pro Ser 5 Ser Thr Thr Glu Glu 10 Thr Al a Thr Gin Ly s 15 Glu
Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp Hi s Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro Arg
20 25 30
Glu Asp Ser Hi s Ser Thr Thr Gly Thr Al a Al a
35 40
HU 220 168 Β

Claims (19)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. A CD44 gén v6 variábilis exonja által kódolt aminosavszekvencián belül lévő epitóp elleni monoklonális antitest, amely a DSM ACC2174 letéti számú hibridóma sejtvonal által termelt VFF-18 antitest.
  2. 2. DSM ACC2174 letéti számú hibridóma sejtvonal.
  3. 3. Antitestmolekula, amely egy 1. igénypont szerinti antitest kémiai vagy enzimes módosításával előállított és azzal azonos kötőspecifitással vagy kötőaffinitással rendelkező antitestmolekula.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti antitestmolekula, amely az 1. igénypont szerinti antitest azonos kötőspecifítású vagy kötőaffmitású fragmentuma.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti antitestmolekula, amely egy Fab vagy F (ab’)2 fragmentum.
  6. 6. A 3. igénypont szerinti antitestmolekula, amely egy másik alkalmas molekulával van összekapcsolva.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti antitestmolekula, amely egy polipeptiddel van összekapcsolva.
  8. 8. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti antitestmolekula, amely egy radioaktív izotóppal van összekapcsolva.
  9. 9. Rekombináns antitestmolekula, amely egy 1. igénypont szerinti antitest idiotípusa.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti rekombináns antitestmolekula, amely kiméra, humanizált, egyláncú vagy chain-shuffling eljárással előállított antitestmolekula.
  11. 11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti rekombináns antitestmolekula, amely egy másik alkalmas molekulával vagy radioaktív izotóppal van összekapcsolva.
  12. 12. Antitestmolekula, amelynek epitópja azonos az 1. igénypont szerinti antitest epitópjával.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti antitestmolekula, melynek epitópja QWFGNRWHEGYRQT vagy WFGNRWHEGYR peptid.
  14. 14. Az 1. vagy 3-13. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy antitestmolekula alkalmazása emberi vagy állati szervezeten kívül végzett diagnosztikai eljárásban.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a diagnosztikai eljárás enzimimmunassay vagy radioimmunassay.
  16. 16. A 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a diagnosztikai eljárás immunhisztokémiai eljárás.
  17. 17. Az 1. vagy 3-13. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy antitestmolekula gyógyászati alkalmazása.
  18. 18. Az 1. vagy 3-13. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy antitestmolekula alkalmazása in vivő diagnosztika céljára szolgáló szer előállítására.
  19. 19. Eljárás a CD44-gén v6 variábilis exonja által kódolt aminosavszekvencián belül lévő epitóp elleni VFF-18 antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy a DSM ACC2174 letéti számú hibridóma sejtvonalat tenyésztjük, és a keletkezett antitestet a tenyészettől elválasztjuk.
HU9603387A 1994-06-08 1995-06-02 CD44v6 elleni monoklonális antitest, alkalmazása és előállítása, valamint az antitestet termelő hibridóma sejtvonal HU220168B (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4419913 1994-06-08
DE19944431297 DE4431297A1 (de) 1994-09-02 1994-09-02 Monoklonaler Antikörper gegen CD44v6
PCT/EP1995/002126 WO1995033771A1 (de) 1994-06-08 1995-06-02 MONOKLONALER ANTIKÖRPER GEGEN CD44v6

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9603387D0 HU9603387D0 (en) 1997-01-28
HUT76260A HUT76260A (en) 1997-07-28
HU220168B true HU220168B (hu) 2001-11-28

Family

ID=25937246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9603387A HU220168B (hu) 1994-06-08 1995-06-02 CD44v6 elleni monoklonális antitest, alkalmazása és előállítása, valamint az antitestet termelő hibridóma sejtvonal

Country Status (28)

Country Link
US (1) US5916561A (hu)
EP (1) EP0765343B1 (hu)
JP (2) JP3387929B2 (hu)
KR (2) KR100379217B1 (hu)
CN (1) CN1125083C (hu)
AT (1) ATE197592T1 (hu)
BG (1) BG64181B1 (hu)
BR (1) BR9507964A (hu)
CA (1) CA2192370A1 (hu)
CO (1) CO4410258A1 (hu)
CZ (1) CZ291274B6 (hu)
DE (1) DE59508864D1 (hu)
DK (1) DK0765343T3 (hu)
ES (1) ES2151603T3 (hu)
FI (1) FI964845A (hu)
GR (1) GR3035388T3 (hu)
HK (1) HK1011697A1 (hu)
HU (1) HU220168B (hu)
NO (1) NO317948B1 (hu)
NZ (1) NZ288224A (hu)
PL (1) PL190897B1 (hu)
PT (1) PT765343E (hu)
RO (1) RO118753B1 (hu)
RU (1) RU2204606C2 (hu)
SI (1) SI0765343T1 (hu)
SK (1) SK282649B6 (hu)
UA (1) UA58482C2 (hu)
WO (1) WO1995033771A1 (hu)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY24389A1 (es) * 1995-12-06 2001-10-25 Karlsruhe Forschzent Composición farmacéutica para el tratamiento de carcinoma de epitelio plano
AU1672097A (en) 1996-02-15 1997-09-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody that recognizes antigens present on the surface of endothelial cell of tumor vessel
DE19648209A1 (de) * 1996-11-21 1998-05-28 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Tumorzelldepletion CD34-positiver Zellen
DE19708713C2 (de) * 1997-03-04 2002-11-28 Boehringer Ingelheim Int Verwendung von anti-CD44 Antikörpern enthaltenden Präparationen zur Behandlung bestimmter Tumore und zur Unterdrückung von Immunreaktionen
EP1460132A1 (en) * 1998-06-08 2004-09-22 Fuso Pharmaceutical Industries Ltd. Antibodies with specific immunoreactivity to thyroid carcinoma cells
WO2000002922A1 (fr) * 1998-07-10 2000-01-20 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Anticorps specifique des domaines intracellulaires de la thyrosinephosphatase
US8048416B2 (en) 1999-10-08 2011-11-01 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US8071072B2 (en) * 1999-10-08 2011-12-06 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US7189397B2 (en) * 1999-10-08 2007-03-13 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20090004103A1 (en) * 1999-10-08 2009-01-01 Young David S F Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20080124327A1 (en) * 1999-10-08 2008-05-29 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US7947496B2 (en) * 1999-10-08 2011-05-24 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20050100542A1 (en) * 1999-10-08 2005-05-12 Young David S. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US6972324B2 (en) 2001-05-18 2005-12-06 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Antibodies specific for CD44v6
CA2443437A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antibodies specific for cd44v6
US20030103985A1 (en) * 2001-05-18 2003-06-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates
WO2003018044A1 (en) * 2001-08-24 2003-03-06 Stroemblad Staffan New drug
US20040126379A1 (en) * 2002-08-21 2004-07-01 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
WO2004024750A2 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Dyax Corporation Cd44-binding ligands
US20040120949A1 (en) * 2002-11-08 2004-06-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy
US20060140963A1 (en) * 2003-04-14 2006-06-29 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD59
EP1806365A1 (en) 2006-01-05 2007-07-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
EP2266593A1 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Karlsruher Institut für Technologie Use of CD44v6 in the treatment of ophthalmic diseases
WO2011020529A2 (en) * 2009-08-19 2011-02-24 Merck Patent Gmbh Antibodies for the detection of integrin complexes in ffpe material
CN102337298B (zh) * 2011-08-19 2013-11-06 黄开红 一种输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用
DK2886126T3 (en) 2013-12-23 2017-09-18 Exchange Imaging Tech Gmbh Nanoparticle conjugated to CD44-binding peptides
KR20210004961A (ko) * 2018-02-22 2021-01-13 아브마트 상하이 컴퍼니, 엘티디. 치료 항체 및 그의 용도
CN109593125A (zh) * 2018-12-12 2019-04-09 深圳市龙华区人民医院 基于***癌干细胞标志物cd44的抗原表位多肽cd44-p1及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2149635A1 (en) * 1992-11-20 1994-06-09 David Tarin Peptide corresponding to cd44 exon 6, antibodies specific for said peptide and use of these antibodies for diagnosis of tumors
ES2110764T3 (es) * 1993-06-18 1998-02-16 Biotie Therapies Oy Composiciones y metodos de diagnostico empleando anticuerpos monoclonales contra la cd44v6.
WO1995000851A1 (de) * 1993-06-22 1995-01-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Verfahren zur diagnose und analyse von tumoren

Also Published As

Publication number Publication date
NO965239L (no) 1996-12-06
PL190897B1 (pl) 2006-02-28
HU9603387D0 (en) 1997-01-28
CN1152925A (zh) 1997-06-25
BG101024A (en) 1997-09-30
FI964845A0 (fi) 1996-12-04
PL317536A1 (en) 1997-04-14
UA58482C2 (uk) 2003-08-15
JPH10501797A (ja) 1998-02-17
RU2204606C2 (ru) 2003-05-20
CA2192370A1 (en) 1995-12-14
JP3387929B2 (ja) 2003-03-17
CZ359196A3 (en) 1997-11-12
CO4410258A1 (es) 1997-01-09
DK0765343T3 (da) 2000-12-27
SI0765343T1 (en) 2001-02-28
NZ288224A (en) 1999-04-29
ATE197592T1 (de) 2000-12-15
NO965239D0 (no) 1996-12-06
KR970703368A (ko) 1997-07-03
JP2003034700A (ja) 2003-02-07
HK1011697A1 (en) 1999-07-16
EP0765343B1 (de) 2000-11-15
DE59508864D1 (de) 2000-12-21
AU701885B2 (en) 1999-02-11
BR9507964A (pt) 1997-09-02
CZ291274B6 (cs) 2003-01-15
SK282649B6 (sk) 2002-10-08
EP0765343A1 (de) 1997-04-02
SK154896A3 (en) 1997-08-06
CN1125083C (zh) 2003-10-22
BG64181B1 (bg) 2004-03-31
NO317948B1 (no) 2005-01-10
WO1995033771A1 (de) 1995-12-14
PT765343E (pt) 2001-02-28
AU2737095A (en) 1996-01-04
US5916561A (en) 1999-06-29
GR3035388T3 (en) 2001-05-31
RO118753B1 (ro) 2003-10-30
KR100379217B1 (ko) 2003-06-11
FI964845A (fi) 1996-12-04
HUT76260A (en) 1997-07-28
ES2151603T3 (es) 2001-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU220168B (hu) CD44v6 elleni monoklonális antitest, alkalmazása és előállítása, valamint az antitestet termelő hibridóma sejtvonal
EP1856153B1 (en) Ykl-40 monoclonal antibodies
ES2699753T3 (es) Mimótopos peptídicos de claudina 18.2 y sus usos
Oldberg et al. The partial amino acid sequence of bovine cartilage proteoglycan, deduced from a cDNA clone, contains numerous Ser-Gly sequences arranged in homologous repeats
EP0851870B1 (en) Colon cell and colon cancer cell associated nucleic acid molecules, protein and peptides
US6024955A (en) Peptides and monoclonal antibodies
US5879898A (en) Antibodies specific for peptide corresponding to CD44 exon 6, and use of these antibodies for diagnosis of tumors
CN115109160B (zh) 抗epcam抗体和双特异性抗体
WO1994012631A1 (en) Peptide corresponding to cd44 exon 6, antibodies specific for said peptide and use of these antibodies for diagnosis of tumors
KR100473824B1 (ko) 상피종의진단및치료방법
JP2001508052A (ja) ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）の診断および治療方法
CN115109164A (zh) 靶向epcam和cd3的双特异性抗体
RU2193779C2 (ru) Средство и способ лечения плоскоклеточного рака
KR102589409B1 (ko) Gpr87 결합 항체
MXPA96006108A (es) Anticuerpos monoclonales contra cd44v6
Léger et al. Isolation and characterization of a serologically defined tumour membrane antigen from a chemically‐induced rat sarcoma, HSN

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees