PL190897B1

PL190897B1 - Przeciwciało monoklonalne przeciwko CD44v6 i linia komórkowa hybrydoma

Info

Publication number: PL190897B1
Application number: PL317536A
Authority: PL
Inventors: Günther R. Adolf; Erik Patzelt
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int; Karlsruhe Forschzent
Priority date: 1994-06-08
Filing date: 1995-06-02
Publication date: 2006-02-28
Also published as: NO965239L; HU9603387D0; HU220168B; CN1152925A; BG101024A; FI964845A0; PL317536A1; UA58482C2; JPH10501797A; RU2204606C2; CA2192370A1; JP3387929B2; CZ359196A3; CO4410258A1; DK0765343T3; SI0765343T1; NZ288224A; ATE197592T1; NO965239D0; KR970703368A

Abstract

1. Przeciwcialo monoklonalne przeciwko CD44v6, znamienne tym, ze jest przeciwcialem VFF-18 wytwarzanym przez linie komórkowa hybrydoma o numerze depozytu DSM ACC2174. 2. Linia komórkowa hybrydoma o numerze depozytu DSM ACC2174. 3. Przeciwcialo okreslone w zastrz. 1 do zastosowan farmaceutycznych. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne, przeciwko CD44v6, epitopowi kodowanemu przez odmianę egzonu v6 genu CD44 oraz linia komórkowa hybrydoma.

Ostatnio wykazano, że ekspresja odmian glikoproteiny powierzchniowej CD44 jest niezbędna i wystarczająca do powodowania tzw. spontanicznego metastatycznego zachowania szczurzej linii komórkowej gruczolakoraka trzustki, która normalnie nie wywołuje przerzutów, podobnie jak linii komórkowej szczurzego mięsaka włóknistego, która również nie wywołuje przerzutów (Guenter i in., 1991). Podczas gdy najmniejsza izoforma CD44, postać standardowa CD44s (albo CD44std), jest wyrażana w różnych tkankach, w tym w komórkach nabłonkowych, pewne odmiany związane ze składaniem transkryptu CD44 (CD44v, CD44var) są wyrażane wyłącznie w podrodzaju komórek nabłonkowych. Odmiany CD44 wytwarzane są przez alternatywne składanie transkryptu w mechanizmie całkowitego wycięcia sekwencji egzonów (v1-v10) CD44, ale mogą pojawiać się w większych odmianach w różnych kombinacjach (Screaton i in., 1992; Toelg i in., 1993; Hofmann i in., 1991). Odmiany różnią się sekwencjami aminokwasowymi wprowadzonymi w pewne miejsca zewnątrzkomórkowej części białka. Odmiany takie można wykryć w różnych komórkach nowotworów ludzkich, jak również w różnych ludzkich tkankach nowotworowych. Ostatnio badana była ekspresja odmian CD44 w przebiegu karcynogenezy okrężnicy i odbytu (Heider i in., 1993a). Ekspresja odmian CD44 jest nieobecna w normalnym nabłonku ludzkiej okrężnicy i jedynie słaba ekspresja jest wykrywalna w proliferujących komórkach krypt. W późniejszych etapach progresji guza, tzn. w raku gruczołowym, we wszystkich nowotworach wyrażane są odmiany CD44. Ekspresja tkankowa odmian CD44 na znacznym poziomie ma miejsce w agresywnych chłoniakach nie-Hodgkinowskich (Koopman i in., 1993).

Wydaje się, że egzon v6 odgrywa szczególną rolę, zwłaszcza w rozsiewie przerzutów nowotworowych (Rudy i in., 1993). W modelu zwierzęcym, przeciwciała przeciwko epitopom swoistym dla v6 mogą zapobiec zagnieżdżaniu się komórek przerzutowych i wzrostowi przerzutów (Seiter i in., 1993). W rakach okrężnicy, ekspresja v6 koreluje z progresją nowotworu (Wielenga i in., 1993). W rakach żołądka, ekspresja v6 jest ważnym markerem diagnostycznym umożliwiającym odróżnienie nowotworów typu jelitowego od nowotworów typu rozsianego (Heider i in., 1993b). W tych ostatnich dwóch publikacjach, ekspresję v6 określono stosując przeciwciała przeciwko epitopom swoistym dla v6.

Przeciwciała monoklonalne przeciwko epitopom kodowanym przez egzon v6 są znane w stanie techniki (Hofmann i in. 1991; Wielenga i in., 1993). Z powodu wielkiego potencjału przydatności jaki mają te przeciwciała w diagnostyce i terapii, istnieje wielkie zapotrzebowanie na przeciwciała o ulepszonych właściwościach.

Niniejszy wynalazek ma na celu dostarczenie przeciwciała o znacznie lepszych właściwościach w porównaniu ze znanymi przeciwciałami swoistymi dla v6.

Cel ten osiągnięto w niniejszym wynalazku. Przeciwciało według wynalazku oznaczone jest jako VFF-18, jest skierowane przeciwko CD44v6 i jest wytwarzane przez linię komórkową hybrydoma o numerze depozytu DSM ACC2174. Wynalazek dotyczy też linii komórkowej hybrydoma, wydzielającej to przeciwciało i zdeponowanej pod numerem DSM ACC2174, w DSM - Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy.

W zakres wynalazku wchodzi też przeciwciało określone jak powyżej do zastosowań farmaceutycznych.

Przeciwciało VFF-18 wytworzono sposobem według przykładu 1. Przeciwciało może być również uzyskane ze zdeponowanej linii komórkowej hybrydoma. Można też wytworzyć pochodne przeciwciała wychodząc od analizy sekwencji przeciwciała i/lub stosując linię komórkową hybrydoma wytwarzającą to przeciwciało, a także wytworzyć rekombinowaną cząsteczkę przeciwciała o tym samym idiotypie, tzn. cząsteczkę przeciwciała o tej samej sekwencji aminokwasowej regionu miejsca wiążącego antygen (regiony określające komplementarność - CDR) co przeciwciało VFF-18.

Przykładowo, fragmenty Fab albo F(ab')2 albo inne fragmenty mogą być wytworzone z kompletnych immunoglobulin przeciwciała VFF-18 (Kreitman i in., 1993). Do procedur diagnostycznych, cząsteczki przeciwciała VFF-18, ich fragmenty albo rekombinowane cząsteczki przeciwciała o tym samym idiotypie, przykładowo, mogą być sprzęgane z izotopami radioaktywnymi, takimi jak I,

111

In, Tc albo związkami radioaktywnymi (Larson i in., 1991; Thomas i in., 1989; Srivastava, 1988), enzymami, takimi jak peroksydaza albo fosfataza alkaliczna (Catty i Raykundalia, 1989), barwnikami fluorescencyjnymi (Johnson, 1989) albo z cząsteczkami biotyny (Guesdon i in., 1979). Do zastosowań leczniczych, VFF-18 albo cząsteczki przeciwciała uzyskane z VFF-18 mogą być sprzęgane

PL 190 897 B1 z toksynami (Vitetta i in., 1991; Vitetta i Thorpe, 1991; Kreitman i in., 1993; Theuer i in., 1993), z cytostatykami (Schrappe i in., 1992), prolekami (Wang i in., 1992; Senter i in., 1989) albo substancjami radioaktywnymi. Ponadto, przeciwciało może być sprzęgnięte z cytokiną albo peptydem immunomodulującym, przykładowo, z czynnikiem martwicy nowotworu albo interleukiną-2.

Ponadto, po analizie sekwencji aminokwasowej przeciwciała VFF-18 i/lub zastosowaniu linii komórkowej hybrydoma wytwarzającej to przeciwciało, zwłaszcza przez analizę informacji genetycznej zawartej w tych komórkach, można wytworzyć rekombinowaną cząsteczkę przeciwciała o tym samym idiotypie co VFF-18. Sposoby uzyskania takich cząsteczek stanowią część stanu techniki. Przykładowo, takimi rekombinowanymi przeciwciałami mogą być przeciwciała humanizowane (Shin i in., 1989; Gussow i Seemann, 1991), przeciwciała o podwójnej swoistości (Weiner i in., 1993; Goodwin, 1989), przeciwciała jednołańcuchowe (scFv, Johnson i Bird, 1991), immunoglobuliny kompletne lub ich fragmenty (Coloma i in., 1992; Nesbit i in., 1992; Barbas i in., 1992), albo przeciwciała wytworzone przez wymieszanie łańcuchów („chain shuffling, Winter i in., 1994). Przeciwciała humanizowane mogą być wytwarzane, przykładowo, przez „przeszczepianie CDR (EP 0239400). Regiony zrębowe mogą być również modyfikowane (EP 0519596). Obecnie, w celu humanizowania przeciwciał można zastosować metody, takie jak PCR (np. EP 0368684; EP0438310; WO 9207075) albo modelowanie komputerowe (np. WO 9222653). Mogą być również wytwarzane białka fuzyjne, np. białka fuzyjne przeciwciała jednołańcuchowego/toksyny (Chaudhary i in., 1990; Friedman i in., 1993).

Po zidentyfikowaniu dokładnego epitopu VFF-18 można też wytworzyć przeciwciała równoważne o tej samej swoistości wiązania. Dokładny epitop może być określony przez badania wiązania peptydu, jak w przykładzie 2, np. przez zmienianie sekwencji peptydu Hu1.

Przeciwciało VFF-18 przeznaczone do zastosowań farmaceutycznych, w tym do diagnostyki i leczenia, wchodzi także w zakres niniejszego wynalazku. Metody diagnostyczne z zastosowaniem przeciwciała według wynalazku, mogą być oparte na znanych procedurach, np. na enzymatycznych testach immunologicznych (ELISA, Catty i Raykundalia, 1989), testach radioimmunologicznych (Catty i Murphy, 1989), metodach immunohistochemicznych (Heider i in., 1993b) albo metodzie western blot. Odpowiednio, w metodach tych można wykorzystać próbki tkanek albo płynów uzyskanych z ciała, przykładowo, przez biopsję. Analizy takie mogą być jakościowe, półilościowe albo ilościowe. Przeciwciało według wynalazku może być stosowane tak jak to opisano w stanie techniki w odniesieniu do innych swoistych w stosunku do v6 przeciwciał (WO 9500851), ale polepszone właściwości przeciwciała według wynalazku stanowią znaczące ulepszenie tych procesów.

Oprócz diagnostyki in vitro, przeciwciało według wynalazku jest również odpowiednie do diagnostyki in vivo, zwłaszcza nowotworów. Jeżeli cząsteczka przeciwciała posiada wykrywalny znacznik, może on być wykrywany w celu diagnostycznym, np. do uwidaczniania nowotworów in vivo albo w chirurgii kierowanej radiologicznie. Do zastosowania przeciwciał połączonych z izotopami radioaktywnymi w celu scyntygrafii immunologicznej (obrazowania), przykładowo, istnieje wiele procedur, dzięki którym wynalazek można wprowadzić do praktyki (Siccardi i in., 1989; Keenan i in., 1987; Perkins i Pimm, 1992; Colcher i in., 1987; Thompson i in., 1984).

Przeciwciało według wynalazku może być stosowane terapeutycznie, np. analogicznie do zastosowania przeciwciała ASML1.1 (Seiter i in., 1993). Cząsteczka przeciwciała może być podawana układowo albo miejscowo, np. przez wstrzyknięcie lub infuzję dożylną (w bolusie lub we wlewie ciągłym), dootrzewnową, domięśniową albo podskórną. Również pojedyncze narządy albo kończyny mogą być perfundowane. Protokoły stosowania przeciwciał koniugowanych i niekoniugowanych (kompletnych immunoglobulin, fragmentów, rekombinowanych cząsteczek przeciwciał itp) można znaleźć w stanie techniki (Mulshine i in., 1991; Larson i in., 1991; Vitetta i Thorpe, 1991; Vitetta i in., 1991; Breitz i in., 1992; Press i in., 1989; Weiner i in., 1989; Chatal i in., 1989; Sears i in., 1982).

Doskonałe właściwości VFF-18 w porównaniu z innymi przeciwciałami przeciwko CD44v6 są przedstawione w przykładach 2 do 4.

Figury

Figura 1: Schemat białka fuzyjnego GST-CD44(v3-v10). GST = S-transferaza glutationowa Schistosoma japonicum. v3-v10 = wstawki odmian CD44 keratynocytów. Strzałki pokazują miejsce cięcia przez trombinę.

Figura 2: Porównanie sekwencji egzonu v6 genu CD44 człowieka i szczura. Wytłuszczono sekwencje peptydów Ra1 i Hu1, rozpoznawanych przez przeciwciała, odpowiednio, 1.1ASML (przeciwko szczurzym CD44v6) albo VFF-18 (przeciwko ludzkim CD44v6). Aminokwasy identyczne zaznaczono gwiazdkami.

PL 190 897 B1

Figura 3: Wiązanie przeciwciał swoistych wobec CD44v6 z peptydami syntetycznymi. Wiązanie przeciwciał z peptydami oznaczano w teście ELISA, w którym peptydy unieruchamiano i inkubowano z roztworami przeciwciał. Po odpowiednich etapach płukania, związane przeciwciało wykrywano przeciwciałem przeciwko mysim IgG, sprzężonym z peroksydazą. (A): W pierwszym doświadczeniu, wykazano wiązanie przeciwciała 1.1ASML swoistego wobec szczurzego CD44v6, z peptydem Ra1 (KWFEN EWQGK NPPT). (B): W dalszym doświadczeniu, syntetyzowano peptyd homologiczny do Ra1, ale pochodzący z ludzkiej sekwencji CD44v6. Z peptydem tym, zwanym Hu1 (QWFGN RWHEG YRQT), wiązano różne supernatanty hybrydoma wytwarzającej przeciwciało przeciwko ludzkiej CD44v6. Stwierdzono, że VFF-18 wiąże peptyd znacznie lepiej niż inne badane przeciwciała. (C): Do badań ilościowych, doświadczenie powtórzono z różnymi stężeniami oczyszczonych przeciwciał. Również w tym doświadczeniu można zauważyć, że VFF-18 wykazuje wyższe powinowactwo wiązania w porównaniu z innymi przeciwciałami.

Figura 4: Wiązanie radioaktywnego przeciwciała z komórkami nowotworowymi. 3 przeciwciała VFF-7 (przeciwko v6), VFF-8 (przeciwko v5) i VFF-18 (przeciwko v6) znakowano radioaktywnie N-sukcynimidylo-[2,3-³H]propionianem i stosowano do badań wiązania z różnymi liniami komórkowymi nowotworów. Zastosowano następujące linie komórkowe: CHO-CD44var: rekombinowaną linię komórkową chomika (jajnik chomika chińskiego) wyrażającą odmianę ludzkiego CD44 (egzony v3-v10) na powierzchni komórki; HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO 205: ludzkie linie raka okrężnicy; A431: linia ludzkiego raka łuskowatokomórkowego. Wykazano swoiste wiązanie przeciwciał z różnymi liniami komórkowymi. Aczkolwiek wiązanie przeciwciał VFF-7 i VFF-18 swoistych wobec v6 z rekombinowaną linią komórkową CHO-CD44var było tej samej wielkości, przeciwciała wykazywały różne zachowanie wobec nowotworowych linii komórkowych. W pewnych przypadkach obserwowano wiązanie wyłącznie VFF-18 i w mniejszym stopniu VFF-8 (HT-29, CaCo, COLO 205), podczas gdy w innych przypadkach VFF-18 wiązało się znacznie lepiej niż VFF-7.

Figura 5: Wykrywanie rozpuszczalnych odmian CD44 zawierających egzon v6 w normalnej surowicy ludzkiej. Trzy przeciwciała swoiste wobec v6: VFF-4, VFF-7 i VFF-18, odpowiednio, stosowano jako przeciwciała opłaszczające w kanapkowym teście ELISA. We wszystkich trzech przypadkach, związane z peroksydazą przeciwciało swoiste wobec CD44std (BU-52, std = standard) stosowano jako przeciwciało wykrywające. W testach tych ((A) i (B)), pokazano sygnał dwóch różnych normalnych surowic ludzkich w różnych rozcieńczeniach. W obu przypadkach, obserwowano znacznie silniejszy sygnał z VFF-18 w porównaniu z dwoma innymi przeciwciałami.

Figura 6: Poziomy odmian CD44 zawierających v6 w surowicy. Zawartość rozpuszczalnych CD44var w surowicach 6 zdrowych dawców oznaczano dwoma różnymi testami ELISA. W jednym teście jako przeciwciało opłaszczające zastosowano VFF-7, podczas gdy w drugim zastosowano VFF-18. Oba przeciwciała rozpoznają egzon v6. W obu przypadkach, rozpuszczalna odmiana CD44 (egzony v3-v10) wytworzona w komórkach CHO, służyła jako kontrola. Średnio, w teście ELISA VFF-18 wykazało 3,5-krotnie wyższe wartości w porównaniu z ELISA VFF-7. Oznacza to, że obecne w surowicy CD44var jest lepiej rozpoznawane przez VFF-18 niż przez VFF-7.

Przykłady

P r z y k ł a d 1:

Wytwarzanie przeciwciała monoklonalnego VFF-18

Klonowanie białek fuzyjnych pGEX

Kompletny region odmiany CD44v typu HPKII (Hofmann i in., 1991) amplifikowano w reakcji łańcuchowej polimerazy (PGR) z cDNA ludzkich keratynocytów. Dwa startery, które zastosowano (5'-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3', pozycje 25-52, oraz 5'-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3', pozycje 1013-984 regionu odmiany LCLC97, jak opisane przez Hofmanna i in.) zawierały miejsce rozpoznawane przez EcoRI, które wykorzystano do klonowania produktu PCR bezpośrednio do wektora pGEX-2T (Smith i in., 1988). Uzyskany konstrukt (pGEX CD44v HPKII, v3-v10) koduje białko fuzyjne wielkości około 70 kDa, zawierające transferazę glutationu S Schistosoma japonicum oraz egzony v3-v10 ludzkiego CD44 (Fig. 1; Heider i in., 1993a). Białko fuzyjne uzyskano przez ekspresję w E. coli i oczyszczano przez chromatografię powinowactwa na agarozie glutationowej (Smith i in., 1988).

PL 190 897 B1

Immunizacja i przesiewanie

Samice myszy Balb/c immunizowano dootrzewnowo białkiem fuzyjnym oczyszczonym przez powinowactwo, według następującego schematu:

1. immunizacja: 90 g białka fuzyjnego w kompletnym adiuwancie Freunda,

2. i 3. immunizacja: 50 g białka fuzyjnegow niekompletnym adiuwancie Freunda.

Immunizacje wykonywano w odstępach 4 tygodniowych. 14 dni po ostatniej immunizacji zwierzęta dodatkowo immunizowano 10 pg białka fuzyjnego w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) przez trzy kolejne dni. W kolejny dzień, splenocyty myszy o wysokim mianie przeciwciał, poddano fuzji z komórkami szpiczaka mysiego P3.X63-Ag8.653, stosując glikol polietylenowy 4000. Komórki hybrydoma selekcjonowano na płytkach do mikromiareczkowania w pożywce HAT (Kohler i Milstein, 1975; Kearney i in., 1979).

Określenie miana przeciwciał w surowicy albo przesiewanie supernatantów hybrydoma przeprowadzono stosując ELISA. W teście tym, płytki do mikromiareczkowania opłaszczono uprzednio białkiem fuzyjnym (GST-CD44v3-10) albo S-transferazą glutationową. Następnie, komórki inkubowano z szeregiem rozcieńczeń próbek surowicy albo supernatantów hodowli hybrydoma, zaś swoiste przeciwciała były wykrywane przeciwciałami przeciwko mysim immunoglobulinom, sprzężonymi z peroksydazą. Hybrydoma reagujące z wyłącznie z S-transferazą glutationową usuwano. Pozostałe przeciwciała charakteryzowano stosując białka fuzyjne swoiste dla domen (egzon v3, egzon v5+v6, egzon v6+v7, egzon v8-v10) (Koopman i in., 1993). Następnie, badano aktywność immunohistochemiczną tych przeciwciał na skrawkach skóry ludzkiej. Przeciwciało VFF-18 zidentyfikowano przez wiązanie syntetycznego peptydu Hu1 (QWFGN RWHEG YRQT). Sekwencja Hu1 jest fragmentem egzonu v6 ludzkiego CD44.

P r z y k ł a d 2:

Wiązanie przeciwciał swoistych wobec CD44v6 z peptydami syntetycznymi

Wiązanie przeciwciał swoistych wobec CD44v6 z peptydami syntetycznymi badano w teście ELISA.

Roztwory:

Bufor do opłaszczania: 0,05 M węglan sodu, pH 9,6

Bufor testowy: PBS (roztwór soli buforowany fosforanem)

0,5% BSA (albumina surowicy bydlęcej)

0,05% Tween-20

Roztwór substratu: Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA;

substrat peroksydaza TMB: roztwór peroksydazy B (H2O2) 1:1.

Peptydy (50 pg/ml w buforze do opłaszczania) unieruchamiano na płytkach immunologicznych Maxisorp NUNC (1.1ASML) albo na płytkach Acti A f-my Bio Products (przeciwciała VFF) w 4°C przez noc. W przypadku płytek Acti A peptyd związany jest z płytką kowalencyjnie. Następnie, płytki płukano PBS/0,05% Tween-20, miejsca wolne od adsorpcji na powierzchni płytek blokowano buforem testowym (przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej), a następnie płukano ponownie PBS/0,05% Tween20. Płytki Acti A redukowano 10 mM borowodorku sodu w 20 mM wodorowęglanu sodu, pH 9,0 (wytrząsanie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej), a następnie płukano trzykrotnie. Następnie, dodawano do studzienek roztwór supernatantu z hybrydoma albo przeciwciała w buforze testowym w stężeniach, odpowiednio, pomiędzy 0,02 i 10,0 pg/ml i wytrząsano przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie, płytki płukano trzykrotnie PBS/0,05% Tween-20. Następnie, dodawano 100 pl/studzienkę peroksydazy chrzanowej sprzężonej z przeciwciałem przeciwko mysim IgG w odpowiednim rozcieńczeniu w buforze testowym. Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej na wytrząsarce, płytki płukano trzykrotnie i dodawano do studzienek roztworu substratu. Po 10-15 minutach wywoływanie przerywano 2 M kwasem siarkowym i mierzono absorbcję przy długości fali 450 nm (długość fali referencyjnej 690 nm) w fotometrze.

W pierwszym doświadczeniu stwierdzono wiązanie przeciwciała 1.1ASML, swoistego wobec szczurzego CD44v6 z peptydem Ra1 (KWFEN EWQGK NPPT) (Tabela 1, Figura 3 (A)).

PL 190 897 B1

T a b e l a 1

1.1 ASML g/ml	Absorbcja
10,00	1,652
5,00	1,702
2,50	1,658
1,25	1,595
0,63	1,502
0,31	1,211
0,16	0,971
0,08	0,686
0,04	0,458
0,02	0,270

W dalszym doświadczeniu, zsyntetyzowano peptyd pochodzący z sekwencji ludzkiego CD44v6, homologiczny do Ra1 (Hu1, QWFGN RWHEG YRQT). Różne przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD44v6 wiązały Hu1. Nieoczekiwanie stwierdzono, że VFF-18 wykazuje znacznie większe powinowactwo wiązania z tym peptydem w porównaniu z innymi badanymi przeciwciałami (Tabela 2, Figura 3 (B)).

T a b e l a 2

Przeciwciało	Absorbcja
VFF-2	0,067
VFF-4	1,333
VFF-7	0,199
VFF-18	2,384

Do badań ilościowych, oczyszczone przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD44v6 w różnych stężeniach, wiązano z peptydem Hu1. I ponownie obserwowano istotnie wyższe powinowactwo wiązania VFF-18 w porównaniu z innymi przeciwciałami (Tabela 3, Figura 3 (C)).

T a b e l a 3

P/ciało pg/ml	VFF-4	VFF-7	VFF-18
10,00	1,225	0,247	2,320
3,333	1,404	0,226	2,550
1,111	0,853	0,094	2,483
0,370	0,336	0,054	2,426
0,123	0,163	0,028	1,354
0,041	0,086	0,025	0,615
0,014	0,048	0,021	0,266
0,005	0,036	0,031	0,095
0,002	0,021	0,021	0,061

PL 190 897 B1

P r z y k ł a d 3:

Wiązanie znakowanych radioaktywnie przeciwciał swoistych wobec CD44v6 z nowotworowymi liniami komórkowymi

Znakowanie radioaktywne przeciwciał mCi N-sukcymidylo-[2,3-³H]-propionianu ([³H]-NSP, Amersham, 1 mCi/ml) odparowano w silikonowanej probówce w 0°C pod próżnią prawie do suchości. Dodano 15 pg przeciwciała (1 mg/ml w PBS, pH 7,4) i inkubowano przez 48 godzin w 4°C. Następnie, nadmiar [³H]-NSP zobojętniono przez reakcję z 30 μΙ 1 M glicyny w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Znakowane przeciwciało oddzielono od [³H]-glicyny przez zastosowanie kolumny Sephadex G-25-M (objętość kolumny 15 ml) i PBS/0,05% BSA jako bufora do elucji. Przeciwciało znakowane [³H] pojawiło się w objętości opuszczającej kolumnę. Ilość przeciwciała oznaczono stosując ELISA do wykrywania mysich immunoglobulin oraz obliczono aktywność właściwą.

Wiązanie znakowanego przeciwciała z komórkami nowotworowymi znakowane przeciwciała: VFF-7 (anty-v6), VFF-8 (anty-v5) i VFF-18 (anty-v6) znakowano radioaktywnie N-sukcymidylo-[2,3-³H]-propionianem i stosowano do badania wiązania z różnymi liniami komórek nowotworowych. Stosowano poniższe linie komórkowe: CHO-CD44var - rekombinowaną linię komórek chomika (jajnika chomika chińskiego) ekspresjonującą na powierzchni odmianę ludzkiego CD44 (egzony v3-v10); HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO 205: ludzkie linie raka okrężnicy; A431: ludzka linia raka łuskowatokomórkowego.

Komórki wysiano w 12-studzienkowych płytkach hodowlanych i inkubowano przez noc w 37°C w inkubatorze z CO₂, płukano PBS i utrwalano etanolem (przez 1 minutę w temperaturze pokojowej). Następnie płukano je dwukrotnie pożywką hodowlaną (RPMI 1640/10% płodowa surowica cielęca) i dodawano przeciwciało znakowane radioaktywnie (250000 dpm/studzienkę w pożywce hodowlanej). Po inkubacji przez 25 godzin w temperaturze pokojowej na wytrząsarce, płytki płukano trzykrotnie PBS/0,5% BSA, komórki solubilizowano 0,1 M NaOH/1% Triton X-100 i mierzono radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym. Wiązanie nieswoiste określono w obecności 100-krotnego nadmiaru przeciwciała nieznakowanego. Wiązanie odniesiono do wystandaryzowanej liczby komórek (400000). Po określeniu aktywności właściwej przeciwciał, ilość związanego przeciwciała można wyrazić w fmolach.

W Tabeli 4 i na Figurze 4 przedstawiono wiązanie swoistego przeciwciała z różnymi liniami komórkowymi. Podczas gdy wiązanie przeciwciał swoistych wobec v6, VFF-7 i VFF-18, z rekombinowaną linią komórkową CHO-CD44var było tego samego rzędu wielkości, przeciwciała wykazywały zasadniczo różne zachowanie się względem linii komórek nowotworowych. W pewnych przypadkach obserwowano wyłącznie wiązanie VFF-18 i, w mniejszym stopniu VFF-8 (HT-29, CaCo, COLO 205), podczas gdy w innych przypadkach VFF-18 wiązało się znacznie lepiej niż VFF-7.

T a b e l a 4

Linia komórkowa	VFF-7 fmol	VFF-8 fmol	VFF-18 fmol
CHO CD44var	33,50	68,42	46,52
HCT-116	1,44	11,08	20,22
CX-1	0,19	2,20	9,48
HT-29	0,00	2,60	26,07
CaCo	0,03	2,81	12,57
COLO 205	0,00	0,32	2,88
A431	8,19	42,32	38,73

P r z y k ł a d 4:

ELISA do określania rozpuszczalnego Cd44v6 w surowicy

Roztwory:

Bufor do opłaszczania: 0,05 M węglan sodu, pH 9,6

Bufor testowy: PBS (roztwór soli buforowany fosforanem)

0,5% BSA (albumina surowicy bydlęcej) 0,05% Tween-20

Rozcieńczalnik próbek: Bender MedSystems,Wiedeń, Austria

PL 190 897 B1

Roztwór substratu: Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA;

substrat peroksydaza TMB: roztwór peroksydazy B (H2O2) 1:1.

Płytki do mikromiareczkowania (Nunc-Immunoplate MaxiSorp F96) opłaszczano 5 pg/ml przeciwciała swoistego wobec CD44v6 (inkubacja w 4°C przez noc). Następnie, płytki płukano PBS/0,05% Tween-20, wolne od adsorpcji miejsca na powierzchni płytek blokowano buforem testowym (1 godzina w temperaturze pokojowej), a następnie płytki płukano ponownie. Próbki surowicy wstępnie rozcieńczano 1:5 w rozcieńczalniku do próbek, a następnie rozcieńczano 1:2 w kolejnych studzienkach. Następnie dodano 50 μΙ/studzienkę peroksydazy chrzanowej sprzężonej z przeciwciałem przeciwko CD44std (klon BU-52, The Binding Site, Birmingham) w odpowiednim rozcieńczeniu (1:3000-1:10000) w buforze testowym. Po trzech godzinach inkubacji na wytrząsarce w temperaturze pokojowej, płytki płukano trzykrotnie i dodano roztworu substratu. Po 10-15 minutach wywoływanie przerywano dodaniem 2 M kwasu siarkowego i mierzono absorbcję przy długości fali 450 nm (długość fali referencyjna 690 nm) w fotometrze.

Do obliczeń, przygotowano równolegle do próbek surowicy, seryjne rozcieńczenia standardu CD44 w buforze testowym. Preparat ten został oczyszczony z supernatantu z hodowli rekombinowanych komórek chomika (CHO) wyrażających rozpuszczalną postać CD44v3-v10. CD44v3-v10 jest odmianą ludzkiego CD44, zawierającą egzony v3-v10.

W Tabeli 5 i na Figurze 5 przedstawiono obecność rozpuszczalnej odmiany CD44 zawierającej egzon v6 w normalnej ludzkiej surowicy. 3 przeciwciała swoiste wobec v6: VFF-4, VFF-7 i VFF-18 zastosowano w kanapkowym teście ELISA. We wszystkich trzech przypadkach, jako przeciwciało wykrywające zastosowano sprzęgnięte z peroksydazą przeciwciało swoiste wobec CD44std (BU-52, std = standard). Przedstawiono sygnał dwóch różnych normalnych ludzkich surowic w różnych rozcieńczeniach ((A) i (B)). W obu przypadkach obserwowano znacznie silniejszy sygnał, gdy stosowano VFF-18 w porównaniu z pozostałymi przeciwciałami.

T a b e l a 5 A

Surowica 1

Rozcieńczenie	VFF-4	VFF-7	VFF-18
1:5	0,406	0,417	3,143
1:10	0,378	0,289	3,055
1:20	0,296	0,179	2,630
1:40	0,207	0,072	1,778
1:80	0,109	0,062	1,084
1:160	0,050	0,030	0,594
1:320	0,026	0,008	0,318
1:640	0,012	0,007	0,159

T a b e l a 5 B

Surowica 2

Rozcieńczenie	VFF-4	VFF-7	VFF-18
1:5	1,690	1,280	3,290
1:10	1,756	1,185	3,321
1:20	1,564	0,857	3,163
1:40	1,213	0,468	3,050
1:80	0,699	0,208	2,537
1:160	0,336	0,061	1,666
1:320	0,138	0,014	0,98
1:640	0,054	0,018	0,546

PL 190 897 B1

W Tabeli 6 i na Figurze 6 przedstawiono poziomy odmiany CD44 zawierającej v6 w surowicach. Zawartość rozpuszczalnego CD44var w surowicach sześciu zdrowych dawców oznaczano dwoma różnymi testami ELISA. W jednym teście jako przeciwciało opłaszczające stosowano VFF-7, podczas gdy w drugim VFF-18. W obu przypadkach, jako kontrola służyła rekombinowana rozpuszczalna odmiana CD44 (egzon v3-v10) wytworzona w komórkach CHO. Średnio, ELISA VFF-18 wykazywał 3,5-krotnie wyższe wartości w porównaniu z ELISA VFF-7. Określono to przez porównanie wyników z białkiem rekombinowanym. Rozpuszczalne CD44var, występujące w surowicy jest lepiej rozpoznawane przez VFF-18 niż przez VFF-7.

T ab ela 6

Dawca	VFF-7 ng/ml	VFF-18 ng/ml	VFF-18/VFF-7
1	18,2	75,9	4,17
2	32,1	85,5	2,66
3	22,4	87,6	3,91
4	27,7	91,6	3,31
5	26,8	98,3	3,67
6	95,4	332	3,48
wartość śr.			3,53
SD			0,52
CV%			14,9%

LITERATURA

Barbas C F, Bjorling E, Chiodi F, Dunlop N, Cababa D, Jones T M, Zebedee S L, Persson M A A, Nara P L, Norrby E, Burton D R. Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 9339-9343 (1992).

Breitz H B, Weiden P L, Vanderheyden J-L, Appelbaum J W, Bjorn M J, Fer M F, Wolf S B, Ratcliff B A, Seiler C A, Foisie D C, Fisher D R, Schroff R W, Fritzberg A R, Abrams P G. Clinical experience with rhenium-186-labeled monoclonal antibodies for radioimmunotherapy: results of phase I trials. J. Nucl. Med. 33: 1099-1112 (1992).

Catty, D., Raykundalia, C. ELISA and related immunoassays. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 97-152, pp105-109.

Catty, D., Murphy, G. Immunoassays using radiolabels. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), pp77-96.

Chatal J-F, Saccavini J-C, Gestin J-F, Thedrez P, Curtet C, Kremer M, Guerreau D, Nolibe D, Fumoleau P, Guillard Y. Biodistribution of Indium-111-labeled OC 125 monoclonal antibody intraperitoneally injected into patients operated on for ovarian carcinomas. Cancer Res. 49: 3087-3094 (1989).

Chaudhary V K, Batra J K, Galdo M G, Willingham M C, Fitzgerald D J, Pastan I. A rapid method of cloning functional variable-region antibody genes in Escherichia coli as single-chain immunotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 1066 (1990).

Colcher D, Esteban J, Carrasquillo J A, Sugarbaker P, Reynolds J C, Bryant G, Larson S M, Schlom J. Complementation of intracavitary and intravenous administration of a monoclonal antibody (B72.3) in patients with carcinoma. Cancer Res. 47: 4218-4224 (1987).

Coloma M J, Hastings A, Wims L A, Morrison S L. Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction. J. Immunol. Methods 152: 89-104 (1992).

Friedmann P N, McAndrew S J, Gawlak S L, Chace D, Trail P A, Brown J P, Siegall C B. BR96 sFv-PE40, a potent single-chain immunotoxin that selectively kills carcinoma cells. Cancer Res. 53: 334-339 (1993).

Goodwin D A. A new appoach to the problem of targeting specific monoclonal antibodies to human rumors using anti-hapten chimeric antibodies. J. Nucl. Med. Biol. 16: 645 (1989).

PL 190 897 B1

Gunthert, U., Hofmann, M., Rudy, W., Reber, S., Zoller, M., Haubmann, L, Matzku, S., Wenzel, A., Ponta, H., and Herrlich, P. A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. Cell 65: 13-24 (1991).

Guesdon, J. L, Ternynck, T., Avrameas, S. J. Histochem. Cytochem. 27: 1131 (1979).

Gussow D, Seemann G. Humanization of monoclonal antibodies. Methods Enzymol, 203: 99121 (1991):

Heider, K.-H., Hofmann, M., Horst, E., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., and Pals, S.T. A human homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps. J. Cell Biol. 120: 227-233 (1993a).

Heider, K-H., Dammrich, J., Skroch-Angel, P., Muller-Hermelink, H-K., Vollmers, H-P., Herrlich,

P., and Ponta, H. Differential expression of CD44 splice variants in intestinal- and diffuse-type human gastric carcinomas and normal gastric mucosa. Cancer Res. 53: 4197-4203(1993b).

Hofmann, M., Rudy, W., Zoller, M., Tolg, C., Ponta, H., Herrlich P., and Gunthert, U. CD44 splice variants confer metastatic behavior in rats: homologous sequences are expressed in human rumor cell lines. Cancer Res. 51: 5292-5297 (1991).

Johnson, G. D. Immunofluorescence. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 179-200, pp 180-189.

Johnson S, Bird R E. Construction of single-chain derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coli. Methods Enzymol. 203: 88-98 (1991).

Kearney, J.F., Radbruch A., Liesegang B., Rajewski K. A new mouse myeloma cell line that has lost imunoglobulin expression but permits construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J. Immunol. 123: 1548 (1979).

Keenan A M, Weinstein J N, Carrasquillo J A, Bunn P A, Reynolds J C, Foon K A et al. Immunolymphoscintigraphy and the dose dependence of ¹¹¹ln-labeled T101 monoclonal antibody in patients with cutaneous T-cell lymphoma. Cancer Res. 47: 6093-6099 (1987).

Kohler, G., Milstein, C. Continous culture of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Nature 265: 495 (1975)

Koopman, G., Heider, K.-H., Horts, E., Adolf, G. R., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich,

P., Pals, S. T. Actviated human lymphocytes and aggressive Non-Hodgkin's lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J. Exp. Med. 177: 897-904 (1993).

Kreitman R J Hansen H J, Jones A L, FitzGerald D J P, Goldenberg D M, Pastan I. Pseudomonas exotoxin-based immunotoxins containing the antibody LL2 or LL2-Fab' induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma in mice. Cancer Res. 53: 819-825 (1993).

Larson S M, Cheung N-K V, Leibel S A. Radioisotope Conjugates. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Eds.). Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 496-511 (1991).

Mulshine J L, Magnani J L, Linnoila R I: Applications of monoclonal antibodies in the treatment of solid tumors. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Eds.). Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, pp 563-588 (1991).

Nesbit M, Fu Z F, McDonald-Smith J, Steplewski Z, Curtis P J. Production of a functional monoclonal antibody recognizing human colorectal carcinoma cells from a baculovirus expression system. J. Immunol. Methods 151: 201-208 (1992).

Perkins A C, Pimm M V. A role for gamma scintigraphy in cancer immunology and immunotherapy. Eur. J. Nucl. Med. 19; 1054-1063 (1992).

Press O W, Eary J F, Badger C C, Martin P J, Appelbaum F R, Levy R, Miller R, Brown S, Nelp W B, Krohn K A, Fisher D, DeSantes K, Porter B, Kidd P, Thomas E D, Bernstein I D. Treatment of refractory Non-Hodgkin's lymphoma with radiolabeled MB-1 (anti-CD37) antibody. J. Clin. Oncol. 7: 1027-1038 (1989).

Rudy, W., Hofmann, M., Schwartz-Albiez, R., Zoller, M., Heider, K.-H., Ponta, H., Herrlich, P. The two major CD44 proteins expressed on a metastatic rat tumor cell line are derived from different splice variants: Each one individually suffices to confer metastatic behaviour. Cancer Res. 53: 12621268 (1993).

Schrappe M, Bumol T F, Apelgren L D, Briggs S L, Koppel G A, Markowitz D D, Mueller B M, Reisfeld R A. Long-term growth suppression of human glioma xenografts by chemoimmunoconjugates of 4-desacetylvinblastine-3-carboxyhydrazide and monoclonal antibody 9.2.27. Cancer Res. 52: 3838-3844 (1992).

PL 190 897 B1

Screaton, G.R., Bell, M.V., Jackson, D.G., Cornelis, F.B., Gerth, U., and Bell, J. I. Genomie structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 12160-12164 (1992).

Sears H F, Mattis J, Herlyn D, Hayry P, Atkinson B, Ernst C, Steplewski Z, Koprowski H. Phase-I clinical trial of monoclonal antibody in treatment of gastrointestinal tumours. Lancet 1982 (1): 762-765 (1982).

Seiter, S., Arch, R., Reber, S., Komitowski, D., Hofmann, M., Ponta, H:, Herrlich, P., Matzku, S., Zoller, M. Prevention of rumor metastasis formation by anti-variant CD44. J. Exp. Med. 177: 443455 (1993).

Senter P D, Schreiber G J, Hirschberg D L, Ashe S A, Hellstrom K E, Hellstrom I. Enhancement of the in vitro and in vivo antitumor activities of phosphorylated mitomycin C and etoposide derivatives by monoclonal antibody-alkaline phosphatase conjugates. Cancer Res. 49: 57895792 (1989).

Shin S-U, Morrison S L. Production and properties of chimeric antibody molecules. Methods Enzymol. 178: 459-476 (1989).

Smith, D.B., Johnson, K.S. Single-step purification of polypetides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67: 31-40 (1988).

Srivastava S C (Hrsg). Radiolabeled monoclonal antibodies for imaging and therapy. Life Sciences Series A 152, Plenum New York (1988).

Tolg, C., Hofmann, M., Herrlich, P., and Ponta, H. Splicing choice from ten variant exons establishes CD44 variability. Nucleic Acids. Res. 21: 1225-1229 (1993).

Theuer C P, Kreitman R J, FitzGerald D J, Pastan I. Immunotoxins made with a recombinant form of pseudomonas exotoxin A that do not require proteolysis for activity. Cancer Res. 53: 340347 (1993).

Thompson C H, Stacker S.A, Salehi N, Lichtenstein M, Leyden M J, Andrews J T. Immunoscintigraphy for detection of lymph node metastases from breast cancer. Lancet 1984 (2): 1245-1247(1984).

Thomas G D, Dykes P W, Bradwell A R. Antibodies for tumour immunodetection and methods for antibody radiolabeling. In: Catty D (Ed.). Antibodies. IRL Press Oxford, (1989), pp223-244.

Vitetta E S, Thorpe P E. Immunotoxins. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Eds.). Biologictherapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 482-495 (1991).

Vitetta E S, Stone M, Amlot P, Fay J, May R, Till M, Newman J, Clark P, Collins R, Cunningham D, Ghetie V, Uhr J W, Thorpe P E. Phase I immunotoxin trial in patients with Bcell lymphoma. Cancer Res. 51: 4052-4058 (1991).

Wang S-M, Chern J- W, Yeh M-Y, Ng J C, Tung E, Roffler S R. Specific activation of glucuronide prodrugs by antibody-targeted enzyme conjugates for cancer therapy. Cancer. Res. 52: 4484-4491 (1992).

Weiner L M, O'Dwyer J, Kitson J, Comis R L, Frankel A E, Bauer R J, Kopnrad M S, Groves E S. Phase I evaluation of an anti-breast carcinoma monoclonal antibody 260F9-recombinant ricin A chain immunoconjugate. Cancer Res. 49: 4062-4067 (1989).

Wielenga, V. J. M., Heider, K.-H., Offerhaus, G. J. A., Adolf, G. R., van den Berg, F. M., Ponta, H., Herrlich, P., Pals, S.T. Expression of CD44 variant proteins in human colorectal cancer is related to tumor progression. Cancer Res. 53: 4754-4756 (1993).

Winter, G., Griffith, A. D., Hawkins, R. E., Hoogenboom, H. R. Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994).

Claims

1. Przeciwciało monoklonalne przeciwko CD44v6, znamienne tym, że jest przeciwciałem VFF-18 wytwarzanym przez linię komórkową hybrydoma o numerze depozytu DSM ACC2174.

2. Linia komórkowa hybrydoma o numerze depozytu DSM ACC2174.

3. Przeciwciało określone w zastrz. 1 do zastosowań farmaceutycznych.