JP2792651B2 - ヒト膵臓癌に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒト膵臓癌に対するモノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，一般的には新規なハイブリドーマ細胞系に
関する。より詳細には，ヒト膵臓癌細胞との反応性を有
するモノクローナル抗体を産生するモノクローナル細胞
系に関する。
関する。より詳細には，ヒト膵臓癌細胞との反応性を有
するモノクローナル抗体を産生するモノクローナル細胞
系に関する。
（従来の技術） アメリカ合衆国において，癌腫は最も一般的な死亡原
因の第２位に位置している。膵臓の癌腫は８番目に多い
形態の癌であり，アメリカ合衆国では癌腫による死亡原
因中第４位である。膵臓癌の発生率は，ほとんどの工業
国で過去20年間着実に増加し続けており，疫学上の問題
が増大する特徴を示している。
因の第２位に位置している。膵臓の癌腫は８番目に多い
形態の癌であり，アメリカ合衆国では癌腫による死亡原
因中第４位である。膵臓癌の発生率は，ほとんどの工業
国で過去20年間着実に増加し続けており，疫学上の問題
が増大する特徴を示している。
膵臓癌の予後は，現時点では非常に悪く，全ての癌の
中で最も低い５年生存率を示す。このような予後は，主
として診断の遅れから生じるものであり，一部は初期症
状が他のより一般的な腹部の病気と同じであるという事
実による。膵臓癌の診断は，しばしば病気がかなり進行
した後に必然的に実施される試験的な外科手術に依存す
る。
中で最も低い５年生存率を示す。このような予後は，主
として診断の遅れから生じるものであり，一部は初期症
状が他のより一般的な腹部の病気と同じであるという事
実による。膵臓癌の診断は，しばしば病気がかなり進行
した後に必然的に実施される試験的な外科手術に依存す
る。
膵臓癌の初期診断に有効な手段の開発に実質的な努力
が向けられている。それにもかかわらず，最終的な診断
は，しばしば試験的な外科手術に依存しており，この手
術は早期処置が効果的であり得る時点を過ぎて病気が進
行した後に必然的に実施される。様々な形態の癌腫を早
期診断するのに有望なある方法は，癌腫細胞の表面に存
在する抗原と呼ばれる特異的な生化学的成分の同定であ
る。癌腫細胞表面に存在する抗原を特異的に認識し，該
抗原に結合する抗体は，特に悪性癌腫の診断および処置
のための強力な手段を提供する可能性がある。腫瘍特異
的細胞表面抗原は，いくつかのメラノーマ，結腸および
生殖腺の悪性リンパ腫について同定されている。
が向けられている。それにもかかわらず，最終的な診断
は，しばしば試験的な外科手術に依存しており，この手
術は早期処置が効果的であり得る時点を過ぎて病気が進
行した後に必然的に実施される。様々な形態の癌腫を早
期診断するのに有望なある方法は，癌腫細胞の表面に存
在する抗原と呼ばれる特異的な生化学的成分の同定であ
る。癌腫細胞表面に存在する抗原を特異的に認識し，該
抗原に結合する抗体は，特に悪性癌腫の診断および処置
のための強力な手段を提供する可能性がある。腫瘍特異
的細胞表面抗原は，いくつかのメラノーマ，結腸および
生殖腺の悪性リンパ腫について同定されている。
このように，膵臓の腫瘍細胞表面に存在する細胞表面
マーカーと，このような細胞表面マーカーを特異的に認
識する抗体とに対する切実な要求が久しく存在する。こ
のようなマーカーおよび対応する抗体は，膵臓癌腫の早
期発見だけでなく，膵臓癌腫の処置においても同様に有
効である。本発明はこれらの要求を満足させ，関連する
利点をも提供するものである。
マーカーと，このような細胞表面マーカーを特異的に認
識する抗体とに対する切実な要求が久しく存在する。こ
のようなマーカーおよび対応する抗体は，膵臓癌腫の早
期発見だけでなく，膵臓癌腫の処置においても同様に有
効である。本発明はこれらの要求を満足させ，関連する
利点をも提供するものである。
（発明の要旨） 本発明は，抗体がヒト膵臓癌腫（HPC）細胞に対して
特異的に反応することを特徴とするモノクローナル抗体
を提供する。HPC細胞上の細胞表面マーカーを認識し，
該マーカーに結合するこれらのモノクローナル抗体は,H
PCの診断および処置に有利に用いられ得る。
特異的に反応することを特徴とするモノクローナル抗体
を提供する。HPC細胞上の細胞表面マーカーを認識し，
該マーカーに結合するこれらのモノクローナル抗体は,H
PCの診断および処置に有利に用いられ得る。
本発明によれば,HPC細胞表面上の抗原性マーカーと特
異的に反応するモノクローナル抗体が提供される。
異的に反応するモノクローナル抗体が提供される。
本発明のモノクローナル抗体調製物は，ヒト膵臓癌
（HPC）細胞の表面マーカーとは特異的に反応するが，
リンパ腫細胞，肝臓細胞および腎臓細胞とは反応しな
い。
（HPC）細胞の表面マーカーとは特異的に反応するが，
リンパ腫細胞，肝臓細胞および腎臓細胞とは反応しな
い。
本発明のさらに別の局面によれば,HPC細胞表面マーカ
ーに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞系が提供される。好適な
ハイブリドーマ細胞系は,ATCC受託番号がそれぞれHB931
8およびHB9319で同定されるS3-41およびS3-53と命名さ
れたハイブリドーマ細胞系であり，これらの細胞系によ
りモノクローナル抗体が産生される。
ーに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞系が提供される。好適な
ハイブリドーマ細胞系は,ATCC受託番号がそれぞれHB931
8およびHB9319で同定されるS3-41およびS3-53と命名さ
れたハイブリドーマ細胞系であり，これらの細胞系によ
りモノクローナル抗体が産生される。
HPCとの反応性を有する本発明のMabの製造方法は，永
久増殖性細胞系と，予めHPC細胞または誘導細胞で免役
した動物由来の脾細胞と，を融合することにより調製さ
れ，該Mabを分泌し得るハイブリドーマを培養する工
程，およびその培養物から該Mabを回収する工程を包含
する。
久増殖性細胞系と，予めHPC細胞または誘導細胞で免役
した動物由来の脾細胞と，を融合することにより調製さ
れ，該Mabを分泌し得るハイブリドーマを培養する工
程，およびその培養物から該Mabを回収する工程を包含
する。
HPCに特異的である本発明のMabの製造方法は，上記の
ハイブリドーマをマウスに注射する工程，および該マウ
スの血清由来の悪性腹水から該Mabを回収する工程を包
含する。
ハイブリドーマをマウスに注射する工程，および該マウ
スの血清由来の悪性腹水から該Mabを回収する工程を包
含する。
本発明は，以下に述べるように,HPC腫瘍細胞に対する
抗体についての新規なマーカーを提供する。本発明のあ
る局面においては,HPCを検出するためにモノクローナル
抗体がインビトロでのイムノアッセイに用いられる。
抗体についての新規なマーカーを提供する。本発明のあ
る局面においては,HPCを検出するためにモノクローナル
抗体がインビトロでのイムノアッセイに用いられる。
本発明の別の局面においては，ある検出可能な標識と
結合させたモノクローナル抗体は，インビボにおいてHP
Cを検出するためのイメージング試薬として有効であ
る。
結合させたモノクローナル抗体は，インビボにおいてHP
Cを検出するためのイメージング試薬として有効であ
る。
哺乳類動物の身体内のHPCを検出するまたはその所在
を確認する本発明の方法は，（ａ）該哺乳類動物に上記
のモノクローナル抗体を投与する工程；および（ｂ）こ
の投与されたMabを検出するまたはその所在を確認する
工程を含有する。
を確認する本発明の方法は，（ａ）該哺乳類動物に上記
のモノクローナル抗体を投与する工程；および（ｂ）こ
の投与されたMabを検出するまたはその所在を確認する
工程を含有する。
さらに，ある毒性物質と結合させると，このようなモ
ノクローナル抗体はHPCの治療的処置に対して有効であ
る。
ノクローナル抗体はHPCの治療的処置に対して有効であ
る。
HPCを有する患者に対して治療的処置を行う本発明の
方法は，毒性物質と結合させた上記のモノクローナル抗
体を，治療上有効な量で該患者に投与することを包含す
る。
方法は，毒性物質と結合させた上記のモノクローナル抗
体を，治療上有効な量で該患者に投与することを包含す
る。
本発明の別の局面は，本発明の抗体と反応する細胞表
面マーカーに関する。これらのマーカーは，該マーカー
を有する細胞の特徴付け，および該マーカーの機能に対
する作用物質および拮抗物質の設計に有用である。S3-4
1抗体に対して反応性を有する抗原は，インテグリン（i
ntegrin）上位群のメンバーである。
面マーカーに関する。これらのマーカーは，該マーカー
を有する細胞の特徴付け，および該マーカーの機能に対
する作用物質および拮抗物質の設計に有用である。S3-4
1抗体に対して反応性を有する抗原は，インテグリン（i
ntegrin）上位群のメンバーである。
HPC細胞上で発現される本発明のある細胞表面マーカ
ーは,SDS-PAGEにおいて，還元条件下では約205kdおよび
約125kdの見かけの分子量を，そして非還元条件下では
約185kdおよび約150kdの見かけの分子量を有する２成分
であり；そしてMab S3-41との反応性を有する。
ーは,SDS-PAGEにおいて，還元条件下では約205kdおよび
約125kdの見かけの分子量を，そして非還元条件下では
約185kdおよび約150kdの見かけの分子量を有する２成分
であり；そしてMab S3-41との反応性を有する。
HPC細胞上で発現される本発明の別の細胞表面マーカ
ーは,SDS-PAGEにおいて，還元条件下では約140kdの見か
けの分子量を，そして非還元条件下では約125kdの見か
けの分子量を有する単一成分で構成され；そしてMab S3
-53との反応性を有する。
ーは,SDS-PAGEにおいて，還元条件下では約140kdの見か
けの分子量を，そして非還元条件下では約125kdの見か
けの分子量を有する単一成分で構成され；そしてMab S3
-53との反応性を有する。
本発明におけるペプチドは，ポリシアリル化ペプチ
ド，およびその脱シアリル化型および部分的脱シアリル
化型のペプチドであって，該ポリシアリル化ペプチドは
モノクローナル抗体S3-41との反応性を有し，かつ以下
の特徴を有する： 分子量をSDS-PAGEにより測定すると，還元条件下では
約205kdであり，そして非還元条件下では約190kdであ
る； endoFによる処理に対して感受性を有し，該処理によ
って195kdの糖タンパクを生じる； endoHに対する感受性を欠いている； NAによる処理に対して感受性を有し，該処理によって
95kdのペプチドを生じる； endoNによる処理に対して感受性を有し，該処理によ
って95kdのペプチドを生じる；そして Ｎ−末端がブロック化されている。
ド，およびその脱シアリル化型および部分的脱シアリル
化型のペプチドであって，該ポリシアリル化ペプチドは
モノクローナル抗体S3-41との反応性を有し，かつ以下
の特徴を有する： 分子量をSDS-PAGEにより測定すると，還元条件下では
約205kdであり，そして非還元条件下では約190kdであ
る； endoFによる処理に対して感受性を有し，該処理によ
って195kdの糖タンパクを生じる； endoHに対する感受性を欠いている； NAによる処理に対して感受性を有し，該処理によって
95kdのペプチドを生じる； endoNによる処理に対して感受性を有し，該処理によ
って95kdのペプチドを生じる；そして Ｎ−末端がブロック化されている。
モノクローナル抗体S3-41との反応性を有する本発明
の糖タンパクは以下の特徴を有する： 分子量をSDS-PAGEにより測定すると，還元条件下では
約125kdであり，そして非還元条件下では約190kdであ
る； endoFによる処理に対して感受性を有し，該処理によ
って105kdの糖タンパクを生じる； endoHによる処理に対して感受性を有し，該処理によ
って約115kdの糖タンパクを生じる； NAによる処理に対して感受性を有し，該処理によって
120kdのペプチドを生じる；そして アミノ末端がＦ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｎ−
Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−Ｄである。
の糖タンパクは以下の特徴を有する： 分子量をSDS-PAGEにより測定すると，還元条件下では
約125kdであり，そして非還元条件下では約190kdであ
る； endoFによる処理に対して感受性を有し，該処理によ
って105kdの糖タンパクを生じる； endoHによる処理に対して感受性を有し，該処理によ
って約115kdの糖タンパクを生じる； NAによる処理に対して感受性を有し，該処理によって
120kdのペプチドを生じる；そして アミノ末端がＦ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｎ−
Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−Ｄである。
本発明のヘテロダイマー複合体は,SDS-PAGEによる分
子量が400であり，ゲル濾過による分子量が500kdであ
り,S3-41と免疫反応を行なうヘテロダイマー複合体であ
って，以下の特徴を有する： α鎖およびポリシアリル化β鎖；またはα鎖，および
脱シアリル化または部分的に脱シアリル化された形のβ
鎖を含む； 該α鎖のＮ−末端がＦ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｘ−Ｅ−Ｄ
−Ｎ−Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−Ｄである； 該β鎖のＮ−末端がブロック化されている。
子量が400であり，ゲル濾過による分子量が500kdであ
り,S3-41と免疫反応を行なうヘテロダイマー複合体であ
って，以下の特徴を有する： α鎖およびポリシアリル化β鎖；またはα鎖，および
脱シアリル化または部分的に脱シアリル化された形のβ
鎖を含む； 該α鎖のＮ−末端がＦ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｘ−Ｅ−Ｄ
−Ｎ−Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−Ｄである； 該β鎖のＮ−末端がブロック化されている。
（発明の構成） 本発明の他の特徴および利点は，実施例により本発明
の原理を説明する以下の詳細な記述から明らかとなる。
の原理を説明する以下の詳細な記述から明らかとなる。
1.定義 “HPCと反応性を有するモノクローナル抗体（Mab）”
は，ヒト膵臓癌腫（HPC）細胞上で発現される抗原と免
疫反応し得る免疫グロブリンの均一な集団を意味する。
いずれの細胞表面にも存在する多数の抗原があり得るこ
と，そして換言すれば,HPC細胞に存在するあるレセプタ
ーが他の悪性または正常な細胞型上にも生じ得るという
ことが知られている。さらに，このような抗原は，実際
に多くの抗原決定基を有する。本発明の抗体はこれら決
定基の１つまたはそれ以上に対するものであり得る。HP
Cに関連するいかなる特徴的な抗原も，必須である抗原
決定基を提供し得る。
は，ヒト膵臓癌腫（HPC）細胞上で発現される抗原と免
疫反応し得る免疫グロブリンの均一な集団を意味する。
いずれの細胞表面にも存在する多数の抗原があり得るこ
と，そして換言すれば,HPC細胞に存在するあるレセプタ
ーが他の悪性または正常な細胞型上にも生じ得るという
ことが知られている。さらに，このような抗原は，実際
に多くの抗原決定基を有する。本発明の抗体はこれら決
定基の１つまたはそれ以上に対するものであり得る。HP
Cに関連するいかなる特徴的な抗原も，必須である抗原
決定基を提供し得る。
免疫グロブリンは（全てのタンパクのように），その
アミノ酸組成および環境に依存して，酸性，塩基性，ま
たは中性の形で存在し得る。そして，糖または脂質のよ
うな他の分子と結合して見出され得る。本発明の免疫グ
ロブリンは,HPC関連抗原と選択的に反応する能力が残っ
ている限りは，この点に関しての状態にかかわらず，定
義の範囲内にある。
アミノ酸組成および環境に依存して，酸性，塩基性，ま
たは中性の形で存在し得る。そして，糖または脂質のよ
うな他の分子と結合して見出され得る。本発明の免疫グ
ロブリンは,HPC関連抗原と選択的に反応する能力が残っ
ている限りは，この点に関しての状態にかかわらず，定
義の範囲内にある。
“細胞”または“細胞系”は，明らかにその子孫であ
ることが示される細胞を意味する。細胞の増殖および成
長の間に，細胞または細胞系はそれらの遺伝的構成にお
いて一定の状態を完全には維持できないかもしれない。
実際，これらの子孫は親細胞からある方法で区別し得
る。ここで述べる細胞が，上で定義したように,HPCと反
応性を有するMabについての分泌能力の特徴を維持する
限り，それらは定義内に包含されると考えられる。
ることが示される細胞を意味する。細胞の増殖および成
長の間に，細胞または細胞系はそれらの遺伝的構成にお
いて一定の状態を完全には維持できないかもしれない。
実際，これらの子孫は親細胞からある方法で区別し得
る。ここで述べる細胞が，上で定義したように,HPCと反
応性を有するMabについての分泌能力の特徴を維持する
限り，それらは定義内に包含されると考えられる。
“永久増殖性細胞系”は，細胞培養において実際的な
目的において（つまり，決められていない回数の移植行
った場合において），永久に維持され得る細胞系を意味
する。それはまた，通常の非形質転換細胞系に融合させ
ると，その融合産物にそれ自身の永久増殖的な特徴を与
えうるに違いない。この通常の非形質転換細胞系は，通
常単一細胞培養としては数日または数週間を越えては生
育できない。
目的において（つまり，決められていない回数の移植行
った場合において），永久に維持され得る細胞系を意味
する。それはまた，通常の非形質転換細胞系に融合させ
ると，その融合産物にそれ自身の永久増殖的な特徴を与
えうるに違いない。この通常の非形質転換細胞系は，通
常単一細胞培養としては数日または数週間を越えては生
育できない。
A.一般的記述 以下の実施例には,HPC細胞抗原と反応性を有するモノ
クローナル抗体を産生する特異的なハイブリドーマ細胞
系の調製を述べる。しかし,HPC細胞抗原と反応性を有す
る特異的Mabsの別の実施態様を得るために別の方法が用
いられ得るということが理解され得る。
クローナル抗体を産生する特異的なハイブリドーマ細胞
系の調製を述べる。しかし,HPC細胞抗原と反応性を有す
る特異的Mabsの別の実施態様を得るために別の方法が用
いられ得るということが理解され得る。
ハイブリドーマの調製法は，当該技術分野で一般的に
よく知られている。一般的に言うと，このようなハイブ
リドーマ細胞系は，永久増殖性細胞系と，所望の抗体を
産生するために適当に免疫化したＢリンパ球細胞系と
の，適当な条件下での融合を包含する工程により調製さ
れる。このように用いられる永久増殖性細胞系はしばし
ばネズミ起源のものであるが，ラット，ウシ，イヌ，ヒ
ト起源などを包含するいずれの他の哺乳類種起源でも代
わりに採用し得る。永久増殖性細胞系は非常にしばしば
腫瘍起源，特にミエローマ細胞起源であるが，例えば，
エプステイン バール ウイルス（Epstein Barr Viru
s）で形質転換した正常細胞も包含され得る。ここで
は，どの永久増殖性細胞も、本発明のハイブリドーマの
調製に用いられ得る。
よく知られている。一般的に言うと，このようなハイブ
リドーマ細胞系は，永久増殖性細胞系と，所望の抗体を
産生するために適当に免疫化したＢリンパ球細胞系と
の，適当な条件下での融合を包含する工程により調製さ
れる。このように用いられる永久増殖性細胞系はしばし
ばネズミ起源のものであるが，ラット，ウシ，イヌ，ヒ
ト起源などを包含するいずれの他の哺乳類種起源でも代
わりに採用し得る。永久増殖性細胞系は非常にしばしば
腫瘍起源，特にミエローマ細胞起源であるが，例えば，
エプステイン バール ウイルス（Epstein Barr Viru
s）で形質転換した正常細胞も包含され得る。ここで
は，どの永久増殖性細胞も、本発明のハイブリドーマの
調製に用いられ得る。
抗体を分泌し得る細胞（例えば，脾臓細胞または末梢
血リンパ球）が，融合パートナーとして用いられた。細
胞を誘導しようとする動物を，ヒト膵臓癌腫細胞の全懸
濁液で，間隔をあけて免疫化した。あるいは，細胞抽出
物または精製抗原が免疫化に用いられ得る。
血リンパ球）が，融合パートナーとして用いられた。細
胞を誘導しようとする動物を，ヒト膵臓癌腫細胞の全懸
濁液で，間隔をあけて免疫化した。あるいは，細胞抽出
物または精製抗原が免疫化に用いられ得る。
永久増殖性細胞およびリンパ系細胞を，融合剤として
ポリエチレングリコールを用いる標準的でよく知られた
技術に従って融合させ，ハイブリドーマを形成させた。
あるいは，融合はエレクトロフュージョンにより実施し
得る。ハイブリドーマは，上清またはタンパク（所望の
細胞または抗原と反応性を有する腹水より精製した）を
分析することにより，適当なモノクローナル抗体分泌に
ついて選択される。このような分析技術には，特に,ELI
SA,RIAウェスタンブロッティング，または免疫沈降法が
包含される。
ポリエチレングリコールを用いる標準的でよく知られた
技術に従って融合させ，ハイブリドーマを形成させた。
あるいは，融合はエレクトロフュージョンにより実施し
得る。ハイブリドーマは，上清またはタンパク（所望の
細胞または抗原と反応性を有する腹水より精製した）を
分析することにより，適当なモノクローナル抗体分泌に
ついて選択される。このような分析技術には，特に,ELI
SA,RIAウェスタンブロッティング，または免疫沈降法が
包含される。
本発明においては，最初にHPC細胞に対して反応性を
有する抗体の産生についてハイブリドーマを選択した。
代わりに,HPC細胞抽出物または精製抗原を選択に用いる
こともできた。モノクローナル抗体をさらに特徴づける
ために，種々のHPC細胞系，他の腫瘍細胞系および他の
種々の正常，悪性および非悪性のヒト病組織との反応性
を,ELISA,RIA,免疫沈降，組織学的染色法（間接的イム
ノペルオキシダーゼまたは間接的免疫螢光染色を包含す
る）のような標準的な分析方法を用いて調べた。本発明
のハイブリドーマは，全てのヒト膵臓癌細胞系と一般的
に高い反応性を有するモノクローナル抗体を生産するこ
とが見出された。これらのハイブリドーマはまた，他の
腫瘍に由来する細胞と高い反応性を示し，特に胃腸およ
び尿生殖器の管起源の腫瘍に由来する細胞と著しく高い
反応性を示した。さらに，これらのハイブリドーマは，
いくつかの正常組織とある程度の反応性を示したが,Mab
は肝臓および腎臓のような主要臓器とは無視できるほど
の反応性しか示さなかった。明らかに，抗体が標的とし
ている抗原は,HPC細胞上では高く発現されているが，他
の細胞型では中程度かまたはそれ以下でしか発現されて
いない。
有する抗体の産生についてハイブリドーマを選択した。
代わりに,HPC細胞抽出物または精製抗原を選択に用いる
こともできた。モノクローナル抗体をさらに特徴づける
ために，種々のHPC細胞系，他の腫瘍細胞系および他の
種々の正常，悪性および非悪性のヒト病組織との反応性
を,ELISA,RIA,免疫沈降，組織学的染色法（間接的イム
ノペルオキシダーゼまたは間接的免疫螢光染色を包含す
る）のような標準的な分析方法を用いて調べた。本発明
のハイブリドーマは，全てのヒト膵臓癌細胞系と一般的
に高い反応性を有するモノクローナル抗体を生産するこ
とが見出された。これらのハイブリドーマはまた，他の
腫瘍に由来する細胞と高い反応性を示し，特に胃腸およ
び尿生殖器の管起源の腫瘍に由来する細胞と著しく高い
反応性を示した。さらに，これらのハイブリドーマは，
いくつかの正常組織とある程度の反応性を示したが,Mab
は肝臓および腎臓のような主要臓器とは無視できるほど
の反応性しか示さなかった。明らかに，抗体が標的とし
ている抗原は,HPC細胞上では高く発現されているが，他
の細胞型では中程度かまたはそれ以下でしか発現されて
いない。
抗原に由来するHPC細胞との選択的反応性のために，
モノクローナル抗体はHPCおよび他の癌腫の診断および
治療の両方に有効である。さらに，これらモノクローナ
ル抗体は，特に，肝臓および腎臓に対して非反応性であ
るため，治療に用いられても，これらの重要な臓器を標
的にする危険性が比較的少ない。
モノクローナル抗体はHPCおよび他の癌腫の診断および
治療の両方に有効である。さらに，これらモノクローナ
ル抗体は，特に，肝臓および腎臓に対して非反応性であ
るため，治療に用いられても，これらの重要な臓器を標
的にする危険性が比較的少ない。
本発明の抗体は，細胞膜の調製に免疫沈降および／ま
たはアフィニティクロマトグラフィーを用いる該抗体に
反応する細胞表面マーカーの調製にも有用である。以下
に記載するS3-41抗体と反応するマーカーは，インテグ
リンの上位群のメンバーであり，細胞外マトリックスへ
の結合を媒介する機能を有する。従って，マーカーは悪
性細胞に含有され，転移および定着する。
たはアフィニティクロマトグラフィーを用いる該抗体に
反応する細胞表面マーカーの調製にも有用である。以下
に記載するS3-41抗体と反応するマーカーは，インテグ
リンの上位群のメンバーであり，細胞外マトリックスへ
の結合を媒介する機能を有する。従って，マーカーは悪
性細胞に含有され，転移および定着する。
B.実施例 以下の実施例は，望ましいモノクローナル抗体用の起
源として役立つハイブリドーマ，およびこのように生産
された抗体の調製方法を例示する。記述されている方法
は，有利に使用され得る典型的な方法であるが，当業者
に公知の別の方法も代わりに用いられ得る。このよう
に，これら実施例は本発明を説明する事を意図するもの
であり，本発明を限定することを意図するものではな
い。
源として役立つハイブリドーマ，およびこのように生産
された抗体の調製方法を例示する。記述されている方法
は，有利に使用され得る典型的な方法であるが，当業者
に公知の別の方法も代わりに用いられ得る。このよう
に，これら実施例は本発明を説明する事を意図するもの
であり，本発明を限定することを意図するものではな
い。
実施例１ ハイブリドーマ細胞系の調製 HPC細胞系と反応性を有するネズミのMabは,Kohlerお
よびMilstein,Nature 256:495（1975）の標準的な方法
に実質的に従って生産した。簡単に述べると,COLO 357
およびそのサブクローンのような標準的なHPC細胞系を
用いて抗原調製物を得た。好ましくは,FGと呼ばれる細
胞系の細胞が用いられた（Kajiji,S.M.,ヒト膵臓癌にお
ける内部腫瘍形性の多様性，博士論文,Brown Universit
y（1984））。抗原を発現している他の膵臓細胞系（例
えば,BxPC-3（ATCC No.CRL1687）が用いられ得る。細胞
を単層培養で増殖させ,EDTA処理により集めた。簡単に
述べると，集密的な単層を37℃で20分間,10mM EDTAおよ
び0.02％KCLを含有するPBSでインキュベートした。遊離
した細胞を集め,1000×ｇで10分間遠心し，そして冷PBS
で２回洗浄した。あるいは,Balb/c無胸腺ヌードマウス
内で増殖したFG異種移植片から細胞懸濁液を得た。
よびMilstein,Nature 256:495（1975）の標準的な方法
に実質的に従って生産した。簡単に述べると,COLO 357
およびそのサブクローンのような標準的なHPC細胞系を
用いて抗原調製物を得た。好ましくは,FGと呼ばれる細
胞系の細胞が用いられた（Kajiji,S.M.,ヒト膵臓癌にお
ける内部腫瘍形性の多様性，博士論文,Brown Universit
y（1984））。抗原を発現している他の膵臓細胞系（例
えば,BxPC-3（ATCC No.CRL1687）が用いられ得る。細胞
を単層培養で増殖させ,EDTA処理により集めた。簡単に
述べると，集密的な単層を37℃で20分間,10mM EDTAおよ
び0.02％KCLを含有するPBSでインキュベートした。遊離
した細胞を集め,1000×ｇで10分間遠心し，そして冷PBS
で２回洗浄した。あるいは,Balb/c無胸腺ヌードマウス
内で増殖したFG異種移植片から細胞懸濁液を得た。
２〜４ヶ月齢の正常Balb/cマウスを，約５×106〜５
×108細胞／注射液量／マウスを含有する0.5mlの注射を
腹腔内に一週間間隔で６回注射して免疫した。最終の注
射の３日後，マウスを殺して脾臓を摘出した。この脾臓
を別々のペトリ皿中の無血清ダルベッコの最小必須培地
（DMEM）に移して洗浄した。脾臓細胞をゴムのポリスマ
ンを用いて繊維状脾臓性夾膜をおだやかに掻き砕いた。
この細胞懸濁液を15mlの遠沈管に入れ,1000×ｇで10分
間遠心分離した。次いで，このペレットを無血清DMEMで
２回洗浄した。
×108細胞／注射液量／マウスを含有する0.5mlの注射を
腹腔内に一週間間隔で６回注射して免疫した。最終の注
射の３日後，マウスを殺して脾臓を摘出した。この脾臓
を別々のペトリ皿中の無血清ダルベッコの最小必須培地
（DMEM）に移して洗浄した。脾臓細胞をゴムのポリスマ
ンを用いて繊維状脾臓性夾膜をおだやかに掻き砕いた。
この細胞懸濁液を15mlの遠沈管に入れ,1000×ｇで10分
間遠心分離した。次いで，このペレットを無血清DMEMで
２回洗浄した。
洗浄した脾臓細胞およびP3X63Ag8ミエローマ細胞をKo
hlerおよびMilstein（前出）の方法に従って融合させ
た。用いた永久増殖性細胞系の融合パートナーは，ネズ
ミのミエローマ細胞系P3X63Ag8（ATCC受託番号No.T1B
9）であった。これらミエローマ細胞を５×105細胞/ml
の密度にまで増殖させ,1000×ｇで10分間遠心分離する
ことにより集めた。この細胞ペレットを無血清DMEMで２
回洗浄した。最後に，脾臓細胞およびP3X63Ag8ミエロー
マ細胞を,50mlの遠沈管中で7:1の割合で混合し，遠心分
離（1000gで10分間）によりペレットとした。このペレ
ットを穏やかにほぐし,1mlの35％ポリエチレングリコー
ル（PEG）溶液を細胞上で穏やかに泡立てた。１分後,10
％ウシ胎児血清（FCS）（ギブコ，グランドアイランド,
NY）を含有するDMEM1mlを細胞懸濁液に添加し，穏やか
に混合した。
hlerおよびMilstein（前出）の方法に従って融合させ
た。用いた永久増殖性細胞系の融合パートナーは，ネズ
ミのミエローマ細胞系P3X63Ag8（ATCC受託番号No.T1B
9）であった。これらミエローマ細胞を５×105細胞/ml
の密度にまで増殖させ,1000×ｇで10分間遠心分離する
ことにより集めた。この細胞ペレットを無血清DMEMで２
回洗浄した。最後に，脾臓細胞およびP3X63Ag8ミエロー
マ細胞を,50mlの遠沈管中で7:1の割合で混合し，遠心分
離（1000gで10分間）によりペレットとした。このペレ
ットを穏やかにほぐし,1mlの35％ポリエチレングリコー
ル（PEG）溶液を細胞上で穏やかに泡立てた。１分後,10
％ウシ胎児血清（FCS）（ギブコ，グランドアイランド,
NY）を含有するDMEM1mlを細胞懸濁液に添加し，穏やか
に混合した。
その後,10％FCSを含有するDMEM10mlを添加してPEGを
希釈し，細胞を再びペレットにした。ハイブリドーマ融
合産物を含む細胞ペレットを30mlヒポキサンチン−アミ
ノプテリン−チミジン（HAT）培地（アミノプテリンは
シグマケミカルCo.,セントルイス,MO;ヒポキサンチンお
よびチミジンはCalbiochem.ラジョラ,CAから入手）に再
懸濁した。
希釈し，細胞を再びペレットにした。ハイブリドーマ融
合産物を含む細胞ペレットを30mlヒポキサンチン−アミ
ノプテリン−チミジン（HAT）培地（アミノプテリンは
シグマケミカルCo.,セントルイス,MO;ヒポキサンチンお
よびチミジンはCalbiochem.ラジョラ,CAから入手）に再
懸濁した。
次いで，この細胞懸濁液を,1ml当り２×106個の胸腺
細胞（フィーダー細胞）を含有するHAT培地400mlと合わ
せた。この内容物を，滅菌した96ウェルプレート（コス
ター，ケンブリッジ,MA）に分注し，直ちに37℃の恒温
器に入れた。消費された培地は,1週間後に,HAT培地を含
有する新鮮な胸腺細胞で置き換えた。この型のプロトコ
ルを用いると，成功裏にハイブリドーマ培養物が得ら
れ,10％FCSを含有する新鮮なDMEMを定期的に添加するこ
とにより維持され得る。
細胞（フィーダー細胞）を含有するHAT培地400mlと合わ
せた。この内容物を，滅菌した96ウェルプレート（コス
ター，ケンブリッジ,MA）に分注し，直ちに37℃の恒温
器に入れた。消費された培地は,1週間後に,HAT培地を含
有する新鮮な胸腺細胞で置き換えた。この型のプロトコ
ルを用いると，成功裏にハイブリドーマ培養物が得ら
れ,10％FCSを含有する新鮮なDMEMを定期的に添加するこ
とにより維持され得る。
HPC細胞と反応性を有するモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマを選択した。培養物がマイクロタイ
ターのウェル表面の75〜100％を覆うほどの細胞密度に
達した後，ハイブリドーマからの培地を，標準的なELIS
Aのプロトコルを用いて，抗HPC抗体の存在について選択
した（Schultz,Cancer Res.44:5914（1984））。簡単に
述べると,96ウェルのミニプレート（ダイナテックマイ
クロタイタープレート，アメリカンサイエンティフィク
プロダクツ，マゴーパーク,IL）の底で乾燥させた腫瘍
細胞を標的として用いた。使用する抗原で覆った96ウェ
ルのプレートのウェルをpH8.0の緩衝液Ａ（150mM NaCl,
0.2％ Tween20および0.01％チメロサールを含有する20m
Mトリス）ですすいだ。緩衝液Ｂ（0.1％ウシ血清アルブ
ミンを含有する緩衝液Ａ）で1:2に希釈したハイブリド
ーマ上清をウェルに添加し，特異的な抗体と結合するよ
うに室温で１時間インキュベートした。特異的に結合し
た抗体を，緩衝液Ａで洗浄することによって過剰のハイ
ブリドーマ上清が無くなるまですすいだ穴に，西洋ワサ
ビのペルオキシダーゼ結合ラビット抗マウス免疫グロブ
リン（バイオラッド，リッチモンド,CA）を添加するこ
とにより検出した。室温で１時間インキュベートした後
に２次抗体をデカンテーションし，ウェルを緩衝液Ａで
洗浄し,50μl/ウェルの基質溶液（4mg 0−フェニレンジ
アミン（シグマChem.Co.,セントルイス,MO）および４μ
ｌの30％過酸化水素を含有する10mlの80mMクエン酸−リ
ン酸緩衝液）を添加した。このプレートを室温で30分間
暗所にてインキュベートし，各ウェルに25μｌの4M硫酸
を加えることにより呈色反応を停止させた。特異的に結
合した抗体を,30分以内にELISAスキャナーＣモデルEL31
0（バイオテクインスツルメンツ，ウィヌースキー,VT）
で0D490における吸光度を測定することにより検出し
た。反応性は以下のように分類した： A4900.15,−；A490＝0.15〜0.3,1＋；A490＝0.3〜0.
6,2＋；A490＝0.6〜1.2,3＋；A4901.2,4＋。免役した
FG細胞との反応性は有するが，リンパ芽球細胞721-P細
胞との反応性は有さないハイブリドーマを，以下の実施
例IIの方法に従いHPCの凍結切片との反応性についてさ
らに選択した。HPCの凍結切片との反応性は有するが，
正常なヒト肝臓，腎臓および肺とは反応性を有さないハ
イブリドーマのみを選択した。以後の研究のために，選
択した２つのハイブリドーマ細胞系をそれぞれS3-41お
よびS3-53と名付けた。
するハイブリドーマを選択した。培養物がマイクロタイ
ターのウェル表面の75〜100％を覆うほどの細胞密度に
達した後，ハイブリドーマからの培地を，標準的なELIS
Aのプロトコルを用いて，抗HPC抗体の存在について選択
した（Schultz,Cancer Res.44:5914（1984））。簡単に
述べると,96ウェルのミニプレート（ダイナテックマイ
クロタイタープレート，アメリカンサイエンティフィク
プロダクツ，マゴーパーク,IL）の底で乾燥させた腫瘍
細胞を標的として用いた。使用する抗原で覆った96ウェ
ルのプレートのウェルをpH8.0の緩衝液Ａ（150mM NaCl,
0.2％ Tween20および0.01％チメロサールを含有する20m
Mトリス）ですすいだ。緩衝液Ｂ（0.1％ウシ血清アルブ
ミンを含有する緩衝液Ａ）で1:2に希釈したハイブリド
ーマ上清をウェルに添加し，特異的な抗体と結合するよ
うに室温で１時間インキュベートした。特異的に結合し
た抗体を，緩衝液Ａで洗浄することによって過剰のハイ
ブリドーマ上清が無くなるまですすいだ穴に，西洋ワサ
ビのペルオキシダーゼ結合ラビット抗マウス免疫グロブ
リン（バイオラッド，リッチモンド,CA）を添加するこ
とにより検出した。室温で１時間インキュベートした後
に２次抗体をデカンテーションし，ウェルを緩衝液Ａで
洗浄し,50μl/ウェルの基質溶液（4mg 0−フェニレンジ
アミン（シグマChem.Co.,セントルイス,MO）および４μ
ｌの30％過酸化水素を含有する10mlの80mMクエン酸−リ
ン酸緩衝液）を添加した。このプレートを室温で30分間
暗所にてインキュベートし，各ウェルに25μｌの4M硫酸
を加えることにより呈色反応を停止させた。特異的に結
合した抗体を,30分以内にELISAスキャナーＣモデルEL31
0（バイオテクインスツルメンツ，ウィヌースキー,VT）
で0D490における吸光度を測定することにより検出し
た。反応性は以下のように分類した： A4900.15,−；A490＝0.15〜0.3,1＋；A490＝0.3〜0.
6,2＋；A490＝0.6〜1.2,3＋；A4901.2,4＋。免役した
FG細胞との反応性は有するが，リンパ芽球細胞721-P細
胞との反応性は有さないハイブリドーマを，以下の実施
例IIの方法に従いHPCの凍結切片との反応性についてさ
らに選択した。HPCの凍結切片との反応性は有するが，
正常なヒト肝臓，腎臓および肺とは反応性を有さないハ
イブリドーマのみを選択した。以後の研究のために，選
択した２つのハイブリドーマ細胞系をそれぞれS3-41お
よびS3-53と名付けた。
実施例２ モノクローナル抗体反応性の特徴付け A.ヒト腫瘍組織との反応性 モノクローナル抗体の反応性を，以下のような間接的
なイムノペルオキシダーゼ染色により調べた。クリオト
ームで切断した凍結組織の２〜４μｍ切片を，ゼラチン
で覆ったスライドグラス上にマウントし，風乾し，そし
てTaylor,Arch,Pathol.Lab.Med.102:113（1970）の方法
を用いてただちに間接的イムノペルオキシダーゼ分析で
検査した。簡単に述べると，ハンクス平衡塩溶液（ギブ
コ，グランドアイランド,N.Y.）およびリン酸緩衝生理
食塩水（PBS;10mMリン酸ナトリウム,0.15M NaCl,pH7.
0）中で１回洗浄した後，切片を室温で順次以下の溶液
でインキュベートした：希釈緩衝液（５％正常ヤギ血清
および１％ウシ血清アルブミンを含有するPBS）で15分
間；ハイブリドーマ上清または適当なアイソタイプが一
致した対照との1:2希釈物で１時間;5％正常ヒト血清を
含有する,1:50に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ
結合ヤギ抗マウスIg抗血清（Bio-Rad,Richmond.CA）で
１時間；そして最後に基質緩衝液（0.6mg/mlの3,3−ジ
アミノベンジジン,0.015％H2O2を含有する10mMトリス,p
H7.4）で15分間インキュベートした。インキュベーショ
ンの間にHBSSおよびPBSでの洗浄を行った。切片を１％
メチレンブルーで対比染色し，エタノールで段階的に脱
水し,Histo-Clear（National Diagnotids,Somerville,N
J）中で洗浄し,Pro-Texx（Lerner Laboratories,New Ha
ven,CT）にマウントし，光学顕微鏡で調べた。
なイムノペルオキシダーゼ染色により調べた。クリオト
ームで切断した凍結組織の２〜４μｍ切片を，ゼラチン
で覆ったスライドグラス上にマウントし，風乾し，そし
てTaylor,Arch,Pathol.Lab.Med.102:113（1970）の方法
を用いてただちに間接的イムノペルオキシダーゼ分析で
検査した。簡単に述べると，ハンクス平衡塩溶液（ギブ
コ，グランドアイランド,N.Y.）およびリン酸緩衝生理
食塩水（PBS;10mMリン酸ナトリウム,0.15M NaCl,pH7.
0）中で１回洗浄した後，切片を室温で順次以下の溶液
でインキュベートした：希釈緩衝液（５％正常ヤギ血清
および１％ウシ血清アルブミンを含有するPBS）で15分
間；ハイブリドーマ上清または適当なアイソタイプが一
致した対照との1:2希釈物で１時間;5％正常ヒト血清を
含有する,1:50に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ
結合ヤギ抗マウスIg抗血清（Bio-Rad,Richmond.CA）で
１時間；そして最後に基質緩衝液（0.6mg/mlの3,3−ジ
アミノベンジジン,0.015％H2O2を含有する10mMトリス,p
H7.4）で15分間インキュベートした。インキュベーショ
ンの間にHBSSおよびPBSでの洗浄を行った。切片を１％
メチレンブルーで対比染色し，エタノールで段階的に脱
水し,Histo-Clear（National Diagnotids,Somerville,N
J）中で洗浄し,Pro-Texx（Lerner Laboratories,New Ha
ven,CT）にマウントし，光学顕微鏡で調べた。
表１に，ハイブリドーマ細胞系S3-41およびS3-53によ
り生産されたモノクローナル抗体と65種類の異なる腫瘍
との反応性についてまとめる。表１に示されるように,S
3-41は一般的に膵臓の胃腸への管，泌尿生殖器管，およ
び頭部と頸部の腫瘍の癌腫にのみ反応性を有していた。
さらに，実質的に全ての例において,S3-41 Mabによる染
色は，腫瘍の病巣付近の基底膜と明らかに関連してお
り，上皮基質界面における細胞の基底表面が片側だけ特
徴的に染色される。染色された肺癌腫，メラノーマおよ
び乳癌組織のいくつかの場合においても，反応性は基底
膜に限られていた。
り生産されたモノクローナル抗体と65種類の異なる腫瘍
との反応性についてまとめる。表１に示されるように,S
3-41は一般的に膵臓の胃腸への管，泌尿生殖器管，およ
び頭部と頸部の腫瘍の癌腫にのみ反応性を有していた。
さらに，実質的に全ての例において,S3-41 Mabによる染
色は，腫瘍の病巣付近の基底膜と明らかに関連してお
り，上皮基質界面における細胞の基底表面が片側だけ特
徴的に染色される。染色された肺癌腫，メラノーマおよ
び乳癌組織のいくつかの場合においても，反応性は基底
膜に限られていた。
Mab S3-53は，腺房細胞型の膵臓癌腫を包含する検査
した７種の膵臓の悪性腺癌のそれぞれと反応した。Mab
S3-53は試験した腫瘍組織に広範囲の反応性を示した。
さらに，組織内の大部分の腫瘍細胞に対するS3-53の反
応性は一般的に強かった。腫瘍細胞基底膜もいくつかの
場合において染色された。
した７種の膵臓の悪性腺癌のそれぞれと反応した。Mab
S3-53は試験した腫瘍組織に広範囲の反応性を示した。
さらに，組織内の大部分の腫瘍細胞に対するS3-53の反
応性は一般的に強かった。腫瘍細胞基底膜もいくつかの
場合において染色された。
B.ヒト細胞系との反応性 培養におけるパネル中の細胞系に対するMabの反応性
をSchultz,Cancer Res.44:5914（1984）の方法に従い，
実施例１で詳細に述べたようにELISA反応により調べ
た。
をSchultz,Cancer Res.44:5914（1984）の方法に従い，
実施例１で詳細に述べたようにELISA反応により調べ
た。
96ウェルのマイクロプレートの底で乾燥させた細胞を
ELISAの標的として用いた。西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合ヤギ抗マウスIg抗血清（Bio-Rad,Richmond,CA）
を二次抗原として用いた。
ELISAの標的として用いた。西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合ヤギ抗マウスIg抗血清（Bio-Rad,Richmond,CA）
を二次抗原として用いた。
Mab S3-41およびS3-53の反応性を表２に示す。両方の
Mabは，試験した10種類のHPC細胞系の大半と反応性を有
していた。さらに，両者は肺癌，皮膚癌および胃腸と尿
生殖器管腫瘍に由来する細胞系と特に強い反応性を示し
た。S3-53は，メラノーマ，グリア芽細胞腫および神経
芽細胞系を包含する神経芽細胞腫起源の腫瘍細胞系につ
いて，中程度から強い陽性を示した。両抗原は，血液型
AB＋,A＋,B＋,O＋およびＯ−のヒト赤血球細胞，正常な
２倍体繊維芽細胞および白血球またはリンパ球細胞系と
は，一般的に反応性がなかった。
Mabは，試験した10種類のHPC細胞系の大半と反応性を有
していた。さらに，両者は肺癌，皮膚癌および胃腸と尿
生殖器管腫瘍に由来する細胞系と特に強い反応性を示し
た。S3-53は，メラノーマ，グリア芽細胞腫および神経
芽細胞系を包含する神経芽細胞腫起源の腫瘍細胞系につ
いて，中程度から強い陽性を示した。両抗原は，血液型
AB＋,A＋,B＋,O＋およびＯ−のヒト赤血球細胞，正常な
２倍体繊維芽細胞および白血球またはリンパ球細胞系と
は，一般的に反応性がなかった。
C.悪性でないヒト病組織との反応性 炎症性膵臓，良性腫瘍および増殖性上皮細胞とのMab
の反応性を，上記のＡ項の方法に従い，凍結組織切片の
間接的なイムノペルオキシダーゼ染色により調べた。Ma
b S3-41およびMab S3-53の両者は，慢性膵炎組織の管細
胞とある程度の反応性を示した。Mab S3-53は，常に別
々の領域において染色を行うが，試験した悪性ではない
いずれの病組織をも染色するという点で，広い反応性を
有していた。表３はこの組織のパネルで調べた結果を示
す。
の反応性を，上記のＡ項の方法に従い，凍結組織切片の
間接的なイムノペルオキシダーゼ染色により調べた。Ma
b S3-41およびMab S3-53の両者は，慢性膵炎組織の管細
胞とある程度の反応性を示した。Mab S3-53は，常に別
々の領域において染色を行うが，試験した悪性ではない
いずれの病組織をも染色するという点で，広い反応性を
有していた。表３はこの組織のパネルで調べた結果を示
す。
D.健常な成人および胎児組織との反応性 健常な成人および胎児の新鮮な凍結組織とMabとの反
応性は，上記Ａ項の方法に従って，間接的なイムノペル
オキシダーゼ染色により調べた。抗体は調べた正常組織
のほとんど大部分と反応しなかった。しかし,Mab S3-41
は食道，子宮頸部，および大腸の基底上皮層または基底
膜，足底表皮，***組織および回腸上皮とある程度の反
応性を示した。正常な重層上皮の増殖している細胞層に
よるS3-41抗原の制限された発現，および上皮細胞基質
界面におけるS3-41抗原の局在は，この分子が引き続い
て起こる悪性への転換で再発現する上皮細胞の初期分化
抗原（おそらく，細胞の接着に関与している）であり得
ることを示唆する。さらに,S3-41抗原は，皮膚に関連し
た他の疾病（例えば，乾癬および基底細胞癌）の診断お
よび治療に用いるのに有効であり得る。そして，該S3-4
1抗原は表皮細胞生物学を研究するための有益な細胞表
面マーカーであることが証明され得る。
応性は，上記Ａ項の方法に従って，間接的なイムノペル
オキシダーゼ染色により調べた。抗体は調べた正常組織
のほとんど大部分と反応しなかった。しかし,Mab S3-41
は食道，子宮頸部，および大腸の基底上皮層または基底
膜，足底表皮，***組織および回腸上皮とある程度の反
応性を示した。正常な重層上皮の増殖している細胞層に
よるS3-41抗原の制限された発現，および上皮細胞基質
界面におけるS3-41抗原の局在は，この分子が引き続い
て起こる悪性への転換で再発現する上皮細胞の初期分化
抗原（おそらく，細胞の接着に関与している）であり得
ることを示唆する。さらに,S3-41抗原は，皮膚に関連し
た他の疾病（例えば，乾癬および基底細胞癌）の診断お
よび治療に用いるのに有効であり得る。そして，該S3-4
1抗原は表皮細胞生物学を研究するための有益な細胞表
面マーカーであることが証明され得る。
Mab S3-53は，成人および胎児の膵臓の腺房，胎児膵
臓の管，および検査した1/3の肝臓の実質および胆汁管
の細胞と反応した。該Mab S3-53は，食道，胃および小
腸，子宮頸部，子宮，***，胎児および成人の肺実質細
胞，胎児の腎臓，脳皮質と中程度に反応し，そして成人
小脳内の分子層およびプルキニエ細胞とも反応した。基
底膜を含む足底表皮の全層も強く染色された。
臓の管，および検査した1/3の肝臓の実質および胆汁管
の細胞と反応した。該Mab S3-53は，食道，胃および小
腸，子宮頸部，子宮，***，胎児および成人の肺実質細
胞，胎児の腎臓，脳皮質と中程度に反応し，そして成人
小脳内の分子層およびプルキニエ細胞とも反応した。基
底膜を含む足底表皮の全層も強く染色された。
表４に，試験したこのパネルの結果をまとめる。
E.細胞表面との反応性 Mabにより認識される抗原が反応性のある組織の細胞
表面上で発現していたかどうかを決定するために，生存
しているHPC細胞を，次のような間接的免疫螢光分析に
より,Mabを用いて調べた。
表面上で発現していたかどうかを決定するために，生存
しているHPC細胞を，次のような間接的免疫螢光分析に
より,Mabを用いて調べた。
カバーガラス上で集塊にまで増殖させた細胞を冷HBSS
で一度洗浄し,0.1mlの1:2ハイブリドーマ上清を４℃に
て１時間重層し，冷HBSSで洗浄し，そして,1:50フルオ
レセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスIg抗血清
（Tago,Burlin-game,CA）を４℃にて１時間重層した。
洗浄し,3％パラホルムアルデヒド中で固定した後，細胞
を80％グリセロール,1mg/ml p−フェニレンジアミン,20
0mMトリス,pH8.5,に重層し,Zeiss螢光顕微鏡で調べて撮
影した。
で一度洗浄し,0.1mlの1:2ハイブリドーマ上清を４℃に
て１時間重層し，冷HBSSで洗浄し，そして,1:50フルオ
レセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスIg抗血清
（Tago,Burlin-game,CA）を４℃にて１時間重層した。
洗浄し,3％パラホルムアルデヒド中で固定した後，細胞
を80％グリセロール,1mg/ml p−フェニレンジアミン,20
0mMトリス,pH8.5,に重層し,Zeiss螢光顕微鏡で調べて撮
影した。
Mab S3-41およびS3-53を用いると，いずれの場合にも
原形質膜が明瞭に染色される。このことは，細胞表面構
造が認識されることを示している。両者は，細胞集団全
体を染色し，連続的な線状の膜パターンを示した。
原形質膜が明瞭に染色される。このことは，細胞表面構
造が認識されることを示している。両者は，細胞集団全
体を染色し，連続的な線状の膜パターンを示した。
実施例３ 抗原の免疫化学的特徴 Mabにより認識される抗原の化学的性質を評価するた
めに,HPC細胞を,L−〔3H〕−ロイシンまたは〔3H〕−グ
ルコサミンとインキュベートすることにより，そのいず
れかで放射標識し，界面活性剤で可溶化し，そして次の
ようにMab免疫吸着剤による免疫沈降に供した。
めに,HPC細胞を,L−〔3H〕−ロイシンまたは〔3H〕−グ
ルコサミンとインキュベートすることにより，そのいず
れかで放射標識し，界面活性剤で可溶化し，そして次の
ようにMab免疫吸着剤による免疫沈降に供した。
プロテイン−Ａ−セファロース（Pharmacia,Uppsala,
Sweden）の10％懸濁液10μｌを,0.3mlのPORT緩衝液（10
mMトリス,pH8.5,0.15MNaCl,0.5％Tween20,0.1％Renex3
0,2.5mMアジ化ナトリウム,0.1％オボアルブミン）中で,
5μｌのウサギ抗マウスIg抗体（Accurate Chemicals,We
stbury,NY）を用いて,4℃にて１時間インキュベートし
た。PORT緩衝液で２度洗浄し,1mlのハイブリドーマ上清
とともに４℃にて１時間インキュベートし，そしてPORT
緩衝液で２度洗浄した後に，ビーズを，放射標識した細
胞抽出液（１〜２×107cpm）とともに,4℃にて一夜イン
キュベートした。この免疫吸着剤を,PORT緩衝液（10mM
トリス,pH8.5,0.15MNaCl,0.5％Tween20,0.1％Renex30,
2.5mMアジ化ナトリウム）で８度洗浄し，結合した抗原
をLaemmli緩衝液（Nature227:680（1970））中に溶出し
た。この試料をSDS-PAGEスラブゲル上で分析し，フルオ
ログラフィーで視覚化した。
Sweden）の10％懸濁液10μｌを,0.3mlのPORT緩衝液（10
mMトリス,pH8.5,0.15MNaCl,0.5％Tween20,0.1％Renex3
0,2.5mMアジ化ナトリウム,0.1％オボアルブミン）中で,
5μｌのウサギ抗マウスIg抗体（Accurate Chemicals,We
stbury,NY）を用いて,4℃にて１時間インキュベートし
た。PORT緩衝液で２度洗浄し,1mlのハイブリドーマ上清
とともに４℃にて１時間インキュベートし，そしてPORT
緩衝液で２度洗浄した後に，ビーズを，放射標識した細
胞抽出液（１〜２×107cpm）とともに,4℃にて一夜イン
キュベートした。この免疫吸着剤を,PORT緩衝液（10mM
トリス,pH8.5,0.15MNaCl,0.5％Tween20,0.1％Renex30,
2.5mMアジ化ナトリウム）で８度洗浄し，結合した抗原
をLaemmli緩衝液（Nature227:680（1970））中に溶出し
た。この試料をSDS-PAGEスラブゲル上で分析し，フルオ
ログラフィーで視覚化した。
SDS-PAGE分析の最初の結果は,Mab S3-41が,205kdおよ
び135kdの２鎖のタンパク抗原をそれぞれ認識すること
を示した。両バンドでは，〔3H〕−グルコサミンを取り
込んでいたので，グリコシル化されていることがわかっ
た。ある場合には,150kdおよび185kdのさらに２つのバ
ンドが認められた。しかし,S3-41バンドにより共沈降し
た116kdのバンドは非特異的であった。なぜならそれ
は，対照の免疫吸着剤で前吸収させることによって除去
できたためである。Mab S3-53は，高度にグリコシル化
された140kdのタンパクを認識した。
び135kdの２鎖のタンパク抗原をそれぞれ認識すること
を示した。両バンドでは，〔3H〕−グルコサミンを取り
込んでいたので，グリコシル化されていることがわかっ
た。ある場合には,150kdおよび185kdのさらに２つのバ
ンドが認められた。しかし,S3-41バンドにより共沈降し
た116kdのバンドは非特異的であった。なぜならそれ
は，対照の免疫吸着剤で前吸収させることによって除去
できたためである。Mab S3-53は，高度にグリコシル化
された140kdのタンパクを認識した。
代謝的に標識したHPCの免疫沈降により，各モノクロ
ーナル抗体により認識される抗原決定基はタンパク分子
が保持していることが示された。これらのタンパクもま
たグリコシル化されており，従って，認識されるエピト
ープが，これらの分子のタンパク部分または糖部分のい
ずれかにより表現されているかどうかを決定することが
残されている。
ーナル抗体により認識される抗原決定基はタンパク分子
が保持していることが示された。これらのタンパクもま
たグリコシル化されており，従って，認識されるエピト
ープが，これらの分子のタンパク部分または糖部分のい
ずれかにより表現されているかどうかを決定することが
残されている。
実施例４ S3-41抗原の特徴 S3-41で免疫沈降する抗原の確認により，それは,2鎖
のヘテロダイマー（細胞付着レセプターのインテグリン
に属するもののうちの１つである）であることが証明さ
れる。それは，非共有的に結合した２つの糖ペプチドを
含み，ここでは，それらはgp205およびgp125と命名され
ている。このgp125は，他のインテグリンのα鎖のアナ
ログであり,gp205ペプチドは他のインテグリンのβ鎖の
アナログであり，ポリシアリル化されていることが示さ
れた。この２鎖の抗原は，上皮細胞の基底側部の表面に
のみ発現することが示されており，明らかに付着性を有
する。
のヘテロダイマー（細胞付着レセプターのインテグリン
に属するもののうちの１つである）であることが証明さ
れる。それは，非共有的に結合した２つの糖ペプチドを
含み，ここでは，それらはgp205およびgp125と命名され
ている。このgp125は，他のインテグリンのα鎖のアナ
ログであり,gp205ペプチドは他のインテグリンのβ鎖の
アナログであり，ポリシアリル化されていることが示さ
れた。この２鎖の抗原は，上皮細胞の基底側部の表面に
のみ発現することが示されており，明らかに付着性を有
する。
インテグリンは一般に，そのα鎖が高い相同性を持つ
ヘテロダイマーであり，β鎖における相違により種々の
インテグリンが亜科として存在する。インテグリンの特
徴についての総説は,Hynes,R.0.によりCell（1987）48:
459〜554に，そしてRuoslahti,E.らにより，Science（1
987）238:491〜497において発表されている。
ヘテロダイマーであり，β鎖における相違により種々の
インテグリンが亜科として存在する。インテグリンの特
徴についての総説は,Hynes,R.0.によりCell（1987）48:
459〜554に，そしてRuoslahti,E.らにより，Science（1
987）238:491〜497において発表されている。
細胞表面付着レセプターのインテグリンのクラスは,C
AMを命名されたもう１つのタイプとは異なる。このCAM
はモノマーであり，コントロール要素として，ポリシア
リル化に用いられる。S3-41が結合するインテグリン
は，そのポリシアリル化により，他の既知のインテグリ
ンと区別される。インテプシンという名は，この抗原に
対して提唱されたものである。
AMを命名されたもう１つのタイプとは異なる。このCAM
はモノマーであり，コントロール要素として，ポリシア
リル化に用いられる。S3-41が結合するインテグリン
は，そのポリシアリル化により，他の既知のインテグリ
ンと区別される。インテプシンという名は，この抗原に
対して提唱されたものである。
A.抗原の分布，およびαおよびβ鎖の分子量 S3-41を用いたヒト表皮断面の免疫学的な組織の解析
により，染色が基底膜の近くに集中しており，上部細胞
層は，除々に反応性がなくなっていることがわかる。従
って，その発現は細胞表面のこの特定の部分に制限され
る。
により，染色が基底膜の近くに集中しており，上部細胞
層は，除々に反応性がなくなっていることがわかる。従
って，その発現は細胞表面のこの特定の部分に制限され
る。
FG-met2膵臓癌腫細胞が試験基質として用いられた。
肺癌腫系列および正常のヒトのカラチノサイト（carati
nocyte）短期培養物においては，同一の結果が得られ
た。
肺癌腫系列および正常のヒトのカラチノサイト（carati
nocyte）短期培養物においては，同一の結果が得られ
た。
FG-met2膵臓癌腫細胞の培養物を，標準法に基づき，
125I−ヨウ素化ナトリウムを使い，放射性ヨウ素により
表面標識化した。これらの標識化された細胞の界面活性
剤を用いた溶解物をS3-41を用いて免疫沈降させ，その
免疫沈降物を，還元条件下において，そして非還元条件
下においてポリアクリルアミドゲルにかけた。還元条件
下において,205kdのバンドが検出され，非還元条件下に
おいては,190kdのところに単一のバンドが現れた。これ
は，ここでgp205と命名されるインテプシンのβ鎖を示
している。
125I−ヨウ素化ナトリウムを使い，放射性ヨウ素により
表面標識化した。これらの標識化された細胞の界面活性
剤を用いた溶解物をS3-41を用いて免疫沈降させ，その
免疫沈降物を，還元条件下において，そして非還元条件
下においてポリアクリルアミドゲルにかけた。還元条件
下において,205kdのバンドが検出され，非還元条件下に
おいては,190kdのところに単一のバンドが現れた。これ
は，ここでgp205と命名されるインテプシンのβ鎖を示
している。
非還元条件下では150kdのバンドに，そして還元条件
下においては125kdのバンドに移動したα鎖は，細胞を
〔35S〕−メチオニンまたはトリチウムで標識したグル
コサミンで代謝的に標識したときにのみ検出可能であっ
た。表面標識した細胞から125kd/150kdのバンドが欠落
しているのは，ヨウ素化の手法によると思われる。
下においては125kdのバンドに移動したα鎖は，細胞を
〔35S〕−メチオニンまたはトリチウムで標識したグル
コサミンで代謝的に標識したときにのみ検出可能であっ
た。表面標識した細胞から125kd/150kdのバンドが欠落
しているのは，ヨウ素化の手法によると思われる。
gp205およびgp125の成分が細胞表面でお互いに非共有
結合で結合していることは，次のことにより立証され
る。つまり,FG-met2細胞（ヒト膵臓癌腫系列）を膜不透
過性架橋剤,DTSSP,で処理し，そして，界面活性剤で細
胞を溶解することにより立証される。このことにより,S
DS-PAGEに400kdのバンドが生じる。この400kdのバンド
は，調製物を還元することにより消失し,205kdと125kd
とに置き換わる。なぜなら,DTSSPが可逆的に架橋するた
めである。このgp205およびgp125の非共有結合複合体
は，さらに,FG-met2（あらかじめ〔35H〕−メチオニン
で標識されている）からの免疫沈降したタンパクにより
認められた。この免疫沈降物は，ゲル濾過分析により，
分子量約500kdを示した。（見かけの分子量の不一致
は，測定に使用した方法による。） B.gp205およびgp125の精製 表面タンパクは，肺アデノ癌腫細胞系のUCLA-P3およ
びFG-metの両者から単離された。
結合で結合していることは，次のことにより立証され
る。つまり,FG-met2細胞（ヒト膵臓癌腫系列）を膜不透
過性架橋剤,DTSSP,で処理し，そして，界面活性剤で細
胞を溶解することにより立証される。このことにより,S
DS-PAGEに400kdのバンドが生じる。この400kdのバンド
は，調製物を還元することにより消失し,205kdと125kd
とに置き換わる。なぜなら,DTSSPが可逆的に架橋するた
めである。このgp205およびgp125の非共有結合複合体
は，さらに,FG-met2（あらかじめ〔35H〕−メチオニン
で標識されている）からの免疫沈降したタンパクにより
認められた。この免疫沈降物は，ゲル濾過分析により，
分子量約500kdを示した。（見かけの分子量の不一致
は，測定に使用した方法による。） B.gp205およびgp125の精製 表面タンパクは，肺アデノ癌腫細胞系のUCLA-P3およ
びFG-metの両者から単離された。
上記細胞は,50g湿重量および20g湿重量を得るのに充
分な量にまでそれぞれ増殖させた。洗浄後，これらの細
胞を２％Renex30を含むTBS等容量で溶菌し,4℃にて10,0
00×ｇで30分間遠心分離し，−70℃で保存した。
分な量にまでそれぞれ増殖させた。洗浄後，これらの細
胞を２％Renex30を含むTBS等容量で溶菌し,4℃にて10,0
00×ｇで30分間遠心分離し，−70℃で保存した。
その溶菌液を連続的にセファロースカラムに通し，そ
して１または２個の連続的なS3-41免疫吸着カラムに５
〜10ml/hrの割合で通した。0.1％Renex30を含むTBS,pH
8.5で洗浄後,S3-41カラムを，逆向きにし,3倍容量のTBS
（pH8.5;1.0％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド
を含む）で洗浄し，そして，結合した物質を50mMジエチ
ルアミン（pH11.5;150mM NaCl,1.0％ｎ−オクチルβ−
Ｄ−グルコピラノシドを含む）で溶出させた。溶出した
物質は1.5mlのエッペンドルフ管に集めた。このエッペ
ンドルフ管には,pHを急激に約8.5にまで下げるため,0.1
MトリスHCl pH6.8,150mM NaCl,および１％ｎ−オクチル
β−Ｄ−グルコピラノシドを含む。溶出物はSDS-PAGEに
かけ銀染色またはクマシーブルーによる染色を行って検
出し，ピークに相当しタンパクを含む溶出部分をプール
し，濃縮した。
して１または２個の連続的なS3-41免疫吸着カラムに５
〜10ml/hrの割合で通した。0.1％Renex30を含むTBS,pH
8.5で洗浄後,S3-41カラムを，逆向きにし,3倍容量のTBS
（pH8.5;1.0％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド
を含む）で洗浄し，そして，結合した物質を50mMジエチ
ルアミン（pH11.5;150mM NaCl,1.0％ｎ−オクチルβ−
Ｄ−グルコピラノシドを含む）で溶出させた。溶出した
物質は1.5mlのエッペンドルフ管に集めた。このエッペ
ンドルフ管には,pHを急激に約8.5にまで下げるため,0.1
MトリスHCl pH6.8,150mM NaCl,および１％ｎ−オクチル
β−Ｄ−グルコピラノシドを含む。溶出物はSDS-PAGEに
かけ銀染色またはクマシーブルーによる染色を行って検
出し，ピークに相当しタンパクを含む溶出部分をプール
し，濃縮した。
C.精製抗体の特徴 上記のように精製されたgp205およびgp125に対応する
抗原は，標準的な方法を用いて,N末端からアミノ酸配列
決定が行われた。gp125断片は，次のＮ末端配列を有し
ていた： Ｆ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｎ−Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｋ
−Ｙ−Ｇ−Ｄ この配列は，他のインテグリンにおけるα鎖のＮ末端
配列と広範囲にわたり相同性を有することを示す。これ
は第３図から明らかである。第３図はgp205,gp125,およ
び他のインテグリンに由来するα鎖のＮ末端配列を比較
したものである。この図の左側の欄には，これらのＮ末
端配列がアミノ酸の１文字コードによって表されてい
る。ダッシュ記号は最上段の配列と同じ残基であること
を示し，空白は配列の情報が欠けていることを示す。図
の右側の欄に示された各インテグリンの概語は以下のと
おりである:FNR−フィブロネクチンレセプター（Argrav
erら,1987）;VLA-1〜−４（Takadaら,1987a）;Mac-1（S
pringerら,1985）;p150,95（Millerら,1987）;LFA-1（S
pringerら,1985）；血小板IIb−IIIa（Ponczら,1987）;
VNR-ビトロネクチンレセプター（Suzukiら,1986）;PS−
ミバエの位置特異的抗原（Leptinら,1987）。PS以外の
すべての配列はヒト由来のものである。
抗原は，標準的な方法を用いて,N末端からアミノ酸配列
決定が行われた。gp125断片は，次のＮ末端配列を有し
ていた： Ｆ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｎ−Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｋ
−Ｙ−Ｇ−Ｄ この配列は，他のインテグリンにおけるα鎖のＮ末端
配列と広範囲にわたり相同性を有することを示す。これ
は第３図から明らかである。第３図はgp205,gp125,およ
び他のインテグリンに由来するα鎖のＮ末端配列を比較
したものである。この図の左側の欄には，これらのＮ末
端配列がアミノ酸の１文字コードによって表されてい
る。ダッシュ記号は最上段の配列と同じ残基であること
を示し，空白は配列の情報が欠けていることを示す。図
の右側の欄に示された各インテグリンの概語は以下のと
おりである:FNR−フィブロネクチンレセプター（Argrav
erら,1987）;VLA-1〜−４（Takadaら,1987a）;Mac-1（S
pringerら,1985）;p150,95（Millerら,1987）;LFA-1（S
pringerら,1985）；血小板IIb−IIIa（Ponczら,1987）;
VNR-ビトロネクチンレセプター（Suzukiら,1986）;PS−
ミバエの位置特異的抗原（Leptinら,1987）。PS以外の
すべての配列はヒト由来のものである。
このgp205のβ鎖は，明らかにＮ末端のところでブロ
ックされている。
ックされている。
D.ツニカマイシン存在下における〔35S〕−メチオニン
を使用した代謝標識 ツニカマイシン（Ｎ結合グリコシレーションの阻害
剤）の存在下での固有的に〔35S〕−メチオニンで標識
された細胞の界面活性剤を用いた溶解物のMab S3-41に
よる間接的な免疫沈降およびそれに続く還元条件下での
SDS-PAGEによる分析により,2つの主要なバンド190kdお
よび100kdの存在が明らかになった。
を使用した代謝標識 ツニカマイシン（Ｎ結合グリコシレーションの阻害
剤）の存在下での固有的に〔35S〕−メチオニンで標識
された細胞の界面活性剤を用いた溶解物のMab S3-41に
よる間接的な免疫沈降およびそれに続く還元条件下での
SDS-PAGEによる分析により,2つの主要なバンド190kdお
よび100kdの存在が明らかになった。
FG細胞の半集密的培養物に１μg/mlのツニカマイシン
を加え,37℃にて10〜12時間インキュベートを行った。
この細胞を次に,3％FCSと１μg/mlツニカマイシンとを
含みメチオニンを含まないRPMI培地中で1mCiの〔35S〕
−メチオニンにより，さらに12時間パルス標識した。ツ
ニカマイシンの不存在下で〔35S〕−メチオニンで同様
に標識したコントロールのフラスコを調製した。代謝的
に標識された細胞を前述の方法で回収し,RIPA溶解用緩
衝液を使用して溶解させた。細胞溶解物を４℃にて100,
000×ｇで45分間遠心分離して清澄化させ，−70℃で保
存した。
を加え,37℃にて10〜12時間インキュベートを行った。
この細胞を次に,3％FCSと１μg/mlツニカマイシンとを
含みメチオニンを含まないRPMI培地中で1mCiの〔35S〕
−メチオニンにより，さらに12時間パルス標識した。ツ
ニカマイシンの不存在下で〔35S〕−メチオニンで同様
に標識したコントロールのフラスコを調製した。代謝的
に標識された細胞を前述の方法で回収し,RIPA溶解用緩
衝液を使用して溶解させた。細胞溶解物を４℃にて100,
000×ｇで45分間遠心分離して清澄化させ，−70℃で保
存した。
E.二次元ゲル分析 免疫沈降は，細胞の溶解物と免疫吸着剤〔Mabをセフ
ァロース4B-CLビーズ（Pharmacia,Uppsala,Sweden）に
活性化CNBrで結合させて調製した〕とを一夜インキュベ
ートすることにより行われた。室温にて,8M尿素中で溶
出した後，サンプルを二次元電気泳動にかけた。この二
次元電気泳動では，非平衡pH電気泳動（NEPHGE）がチュ
ーブで一次元的に行われ，それに続いて7.5％アクリル
アミドスラブゲルでのSDS-PAGEが行われる。ゲルに2,5
−ジフェニルオキサゾールを浸み込ませ，乾燥し，−70
℃でKodak XAR−5 X線フィルムに指示された時間だけ感
光させた。その結果得られた移動パターンを第１図に示
す。
ァロース4B-CLビーズ（Pharmacia,Uppsala,Sweden）に
活性化CNBrで結合させて調製した〕とを一夜インキュベ
ートすることにより行われた。室温にて,8M尿素中で溶
出した後，サンプルを二次元電気泳動にかけた。この二
次元電気泳動では，非平衡pH電気泳動（NEPHGE）がチュ
ーブで一次元的に行われ，それに続いて7.5％アクリル
アミドスラブゲルでのSDS-PAGEが行われる。ゲルに2,5
−ジフェニルオキサゾールを浸み込ませ，乾燥し，−70
℃でKodak XAR−5 X線フィルムに指示された時間だけ感
光させた。その結果得られた移動パターンを第１図に示
す。
F.ポリシアリル化インテグリンβ鎖としてのgp205の特
徴 糖鎖を切断する種々の酵素で,gp205およびgp125を単
独でまたは両者を一緒にして処理した。
徴 糖鎖を切断する種々の酵素で,gp205およびgp125を単
独でまたは両者を一緒にして処理した。
EndoFおよびEndoHは,Nに結合した複合オリゴ糖を切断
する。その結果は,gp205にはこのようなオリゴ糖が１個
または２個，そして,gp125には３個または４個含まれる
という事柄に一致する。
する。その結果は,gp205にはこのようなオリゴ糖が１個
または２個，そして,gp125には３個または４個含まれる
という事柄に一致する。
EndoF:205kd→195kd EndoH:205kd→205kd 125kd→105kd 125kd→115kd ノイラミニダーゼ（NA）は，複合Ｎ結合糖およびポリ
シアリル鎖を切断する。endo-N−アセチルノイラミニダ
ーゼ（EndoN）は，α−2,8結合直鎖シアル酸ホモポリマ
ーとしてのみポリシアリレートを切断する。その結果
は,gp205がポリシアリル化インテグリンのβ鎖であるこ
とと一致していた。
シアリル鎖を切断する。endo-N−アセチルノイラミニダ
ーゼ（EndoN）は，α−2,8結合直鎖シアル酸ホモポリマ
ーとしてのみポリシアリレートを切断する。その結果
は,gp205がポリシアリル化インテグリンのβ鎖であるこ
とと一致していた。
NA:205kd→95kd EndoN:205kd→95kd,150kd 125→120kd これらの結果は,gp205が，β結合によってシアリル化
が行われている高度にポリシアリル化されたβインテグ
リン鎖であることと一致する。（ほとんどのインテグリ
ンβ鎖は，分子量95〜125kdを有する。） G.レクチンへの結合 放射標識された細胞溶解物をレンチルレクチン−アガ
ロースビーズ（Vector Labs,Burlingame,CA）を用いて
前吸着させたとき,S3-41と反応性のある抗原が除去され
た。抗原が除去されていることは，ビーズ上清の免疫沈
降およびそれに続くSDS-PAGEにより示された。放射標識
されたライゼートを小麦胚アグルチニン−アガローズビ
ーズ（E.Y.Labs.,San Mateo,CA）により同様に処理を行
ってもS3-41抗原は除去されなかった。つまり,S3-41と
反応性のあるこの抗原は，特異的にレンチルレクチンに
結合したが，小麦胚アグルチニンとは結合しなかった。
が行われている高度にポリシアリル化されたβインテグ
リン鎖であることと一致する。（ほとんどのインテグリ
ンβ鎖は，分子量95〜125kdを有する。） G.レクチンへの結合 放射標識された細胞溶解物をレンチルレクチン−アガ
ロースビーズ（Vector Labs,Burlingame,CA）を用いて
前吸着させたとき,S3-41と反応性のある抗原が除去され
た。抗原が除去されていることは，ビーズ上清の免疫沈
降およびそれに続くSDS-PAGEにより示された。放射標識
されたライゼートを小麦胚アグルチニン−アガローズビ
ーズ（E.Y.Labs.,San Mateo,CA）により同様に処理を行
ってもS3-41抗原は除去されなかった。つまり,S3-41と
反応性のあるこの抗原は，特異的にレンチルレクチンに
結合したが，小麦胚アグルチニンとは結合しなかった。
H.抗原のゲル濾過 放射標識した細胞の界面活性剤による溶解物を小麦胚
アグルチニン−セファロースカラム（E.Y.Labs,サンメ
テオ,CA）に吸着させた。通過液をレンチルレクチン−
セファロースカラムに吸着させた。洗浄後，吸着物は２
％α−メチルマンノシド（シグマケミカルCo.,セントル
イス）を加えることにより溶出させた。溶出物は，セフ
ァロース６カラムを装着したFPLC装置（ファーマシア，
ウプサラ，スウェーデン）を用いて,0.15M NaCl,1mM Ca
Cl2,1mM MgCl2・6H2O,0.02％アジ化ナトリウムおよび0.
1％レネックス30を含有する10mMトリス（pH8.0）の存在
下で，ゲル濾過に供した。分子量基準を平行させて流し
た。1ml画分を採集し（約40画分），これら画分をS3-41
抗体による免疫沈降に供した。免疫沈降物のSDS-PAGE分
析によると，以下の分子種が，示した画分においてS3-4
1と反応性があった： FPLC画分に対応する推定分子量は，右側の欄に示されて
いる。これらの推定分子量がSDS-PAGEで測定した分子量
を越えているので,S3-41抗原は，多量体として，おそら
く205kd成分と125kd成分との会合によって形成されたヘ
テロダイマーとして存在しているはずである。遊離の12
5kd成分が過剰に存在することも，画分31〜36に由来の
免疫沈降物によって示唆された。
アグルチニン−セファロースカラム（E.Y.Labs,サンメ
テオ,CA）に吸着させた。通過液をレンチルレクチン−
セファロースカラムに吸着させた。洗浄後，吸着物は２
％α−メチルマンノシド（シグマケミカルCo.,セントル
イス）を加えることにより溶出させた。溶出物は，セフ
ァロース６カラムを装着したFPLC装置（ファーマシア，
ウプサラ，スウェーデン）を用いて,0.15M NaCl,1mM Ca
Cl2,1mM MgCl2・6H2O,0.02％アジ化ナトリウムおよび0.
1％レネックス30を含有する10mMトリス（pH8.0）の存在
下で，ゲル濾過に供した。分子量基準を平行させて流し
た。1ml画分を採集し（約40画分），これら画分をS3-41
抗体による免疫沈降に供した。免疫沈降物のSDS-PAGE分
析によると，以下の分子種が，示した画分においてS3-4
1と反応性があった： FPLC画分に対応する推定分子量は，右側の欄に示されて
いる。これらの推定分子量がSDS-PAGEで測定した分子量
を越えているので,S3-41抗原は，多量体として，おそら
く205kd成分と125kd成分との会合によって形成されたヘ
テロダイマーとして存在しているはずである。遊離の12
5kd成分が過剰に存在することも，画分31〜36に由来の
免疫沈降物によって示唆された。
I.パルス−チェイスによる生合成的な研究 指数関数的に増殖しているFG細胞の単細胞懸濁液を，
メチオニンを含まない培地（アービン サイエンティフ
ィック，サンタアナ,CA）中で37℃にて１時間繁殖さ
せ，次いで〔35S〕−メチオニン（1295Ci/mM NENリサー
チプロダクツ，ボストン,MA）を1.0〜15mCi/3×107細胞
/mlの濃度で用いて,10分間パルス標識した。５×106個
の細胞を含む部分を採取（この時が時間の起点となる）
した後，残りの細胞は,10mM非標識Ｌ−メチオニン（シ
グマケミカルCo.,セントルイス,MO）を含む冷たいトリ
ス緩衝液（pH7.5）で３回洗浄した。標識された細胞は,
10mM非標識メチオニンを含む完全培地に再懸濁し,37℃
にて振盪器上でインキュベートした。所定の異なる時点
で一部を採取し，細胞を遠心分離し，そしてRIPA溶解緩
衝液中で以前記述したように抽出した。
メチオニンを含まない培地（アービン サイエンティフ
ィック，サンタアナ,CA）中で37℃にて１時間繁殖さ
せ，次いで〔35S〕−メチオニン（1295Ci/mM NENリサー
チプロダクツ，ボストン,MA）を1.0〜15mCi/3×107細胞
/mlの濃度で用いて,10分間パルス標識した。５×106個
の細胞を含む部分を採取（この時が時間の起点となる）
した後，残りの細胞は,10mM非標識Ｌ−メチオニン（シ
グマケミカルCo.,セントルイス,MO）を含む冷たいトリ
ス緩衝液（pH7.5）で３回洗浄した。標識された細胞は,
10mM非標識メチオニンを含む完全培地に再懸濁し,37℃
にて振盪器上でインキュベートした。所定の異なる時点
で一部を採取し，細胞を遠心分離し，そしてRIPA溶解緩
衝液中で以前記述したように抽出した。
〔35S〕−メチオニンにより10分間パルス標識した後,
150kdの弱いバンドが追跡時間の起点において検出され
た。この150kd成分は，追跡の15分後に，明瞭に目視す
ることができた。追跡の次の45分以内に，プロセッシン
グを受けているようであり,135kd成分の出現が見られ
た。205kd分子および135kd分子の両方が，追跡の４時間
後から20時間後まで検出することができた。現在のとこ
ろ,2つの型のS3-41抗原間に前駆体／生成物の関係が存
在するかどうかは明白ではない。150kd分子の翻訳後プ
ロセッシングにより135kdサブユニットが生じるようで
あるが，このような説明に束縛されることは望まない。
さらに,205kd成分は,135kd成分がさらにプロセッシング
されるか，あるいは150kd前駆体が別のプロセッシング
を受けることによって生じ得る。あるいは，該成分が,M
ab S3-41によって認識されないそれ自身の前駆体分子を
有することも有り得，このことはS3-41抗原が非共存結
合によって結合した２つの異なるサブユニットを含むヘ
テロダイマーであることを示唆している。
150kdの弱いバンドが追跡時間の起点において検出され
た。この150kd成分は，追跡の15分後に，明瞭に目視す
ることができた。追跡の次の45分以内に，プロセッシン
グを受けているようであり,135kd成分の出現が見られ
た。205kd分子および135kd分子の両方が，追跡の４時間
後から20時間後まで検出することができた。現在のとこ
ろ,2つの型のS3-41抗原間に前駆体／生成物の関係が存
在するかどうかは明白ではない。150kd分子の翻訳後プ
ロセッシングにより135kdサブユニットが生じるようで
あるが，このような説明に束縛されることは望まない。
さらに,205kd成分は,135kd成分がさらにプロセッシング
されるか，あるいは150kd前駆体が別のプロセッシング
を受けることによって生じ得る。あるいは，該成分が,M
ab S3-41によって認識されないそれ自身の前駆体分子を
有することも有り得，このことはS3-41抗原が非共存結
合によって結合した２つの異なるサブユニットを含むヘ
テロダイマーであることを示唆している。
実施例５ S3-53抗原の付加的な生化学的特徴 A.非還元条件下における分子のプロフィル 〔35S〕−メチオニンで標識したFG-met2細胞は,S3-53
を用いた免疫沈降に供し，非還元条件下でSDS-PAGEによ
り分析した。S3-53抗体は，これらの条件下において,12
5kdの単一バンドとして移動した。
を用いた免疫沈降に供し，非還元条件下でSDS-PAGEによ
り分析した。S3-53抗体は，これらの条件下において,12
5kdの単一バンドとして移動した。
B.125Iによる外部からの放射標識 FG-met2細胞培養物の表面を，125I標識ヨウ化ナトリ
ウムを用いてヨウ素化し，該培養物の界面活性剤による
溶解物を,S3-53を用いた免疫沈降に供した。この沈殿し
た抗原は，還元条件下におけるSDS-PAGEで140kdの単一
種として移動した。
ウムを用いてヨウ素化し，該培養物の界面活性剤による
溶解物を,S3-53を用いた免疫沈降に供した。この沈殿し
た抗原は，還元条件下におけるSDS-PAGEで140kdの単一
種として移動した。
標識された無機の硫酸塩またはリン酸塩で抗体を代謝
的に標識した場合にも，同様の結果が得られた。
的に標識した場合にも，同様の結果が得られた。
C.ツニカマイシンの存在下における〔35S〕−メチオニ
ンによる代謝的標識 S3-41に代えてS3-53を用いること以外は，実施例４の
Ｄ項における方法に従う。S3-53は，還元条件下におけ
るSDS-PAGEで100kdの単一バンドとして免疫沈降した。
ンによる代謝的標識 S3-41に代えてS3-53を用いること以外は，実施例４の
Ｄ項における方法に従う。S3-53は，還元条件下におけ
るSDS-PAGEで100kdの単一バンドとして免疫沈降した。
D.二次元ゲル分析 S3-41に代えてS3-53を用いること以外は，実施例４の
Ｅ項における方法に従う。得られた泳動パターンを第２
図に示す。
Ｅ項における方法に従う。得られた泳動パターンを第２
図に示す。
E.解糖系酵素による処理 S3-53により認識される抗体は，放射標識した細胞溶
解物の免疫沈降によって単離する。免疫沈降物は種々の
エキソ型およびendo型解糖系酵素で処理する。処理後，
沈降した抗原の見かけの移動度はSDS-PAGE系で測定す
る。解糖系酵素は,O−結合またはＮ−結合したグリカン
の別々の部分を除去することにより,S3-53抗原の見かけ
の分子量を変化させることが特徴である。得られた結果
は以下のように要約することができる：酵素 処理後の見かけの分子量 Endo H 140kd NA 135kd Endo N 140kd F.レクチンへの結合 S3-41に代えてS3-53を用いること以外は実施例４のＧ
項の方法に従う。放射標識した溶解物をレンチルレクチ
ン−アガロースビーズに予め吸着させた際には,S3-53に
対して反応性を有する抗原を除去した。該溶解物を小麦
胚アグルチニン−アガロースビーズに予め吸着させた際
には，抗原を除去しなかった。抗原が除去されているこ
とは，ビーズの上清の免疫沈降，続いてSDS-PAGEにより
示した。従って,S3-53と反応性を有する抗原は，小麦胚
アグルチニンではなく，レンチルレクチンと特徴的に結
合する。
解物の免疫沈降によって単離する。免疫沈降物は種々の
エキソ型およびendo型解糖系酵素で処理する。処理後，
沈降した抗原の見かけの移動度はSDS-PAGE系で測定す
る。解糖系酵素は,O−結合またはＮ−結合したグリカン
の別々の部分を除去することにより,S3-53抗原の見かけ
の分子量を変化させることが特徴である。得られた結果
は以下のように要約することができる：酵素 処理後の見かけの分子量 Endo H 140kd NA 135kd Endo N 140kd F.レクチンへの結合 S3-41に代えてS3-53を用いること以外は実施例４のＧ
項の方法に従う。放射標識した溶解物をレンチルレクチ
ン−アガロースビーズに予め吸着させた際には,S3-53に
対して反応性を有する抗原を除去した。該溶解物を小麦
胚アグルチニン−アガロースビーズに予め吸着させた際
には，抗原を除去しなかった。抗原が除去されているこ
とは，ビーズの上清の免疫沈降，続いてSDS-PAGEにより
示した。従って,S3-53と反応性を有する抗原は，小麦胚
アグルチニンではなく，レンチルレクチンと特徴的に結
合する。
G.S3-53抗原の生合成 方法は実施例４のＩ項に述べた通りである。パルス−
チェイスにる生合成実験は，〔35S〕−メチオニンで10
分間パルス標識した後,120kd前駆体分子の存在を明らか
にした。追跡後15分の時点では，少量の140kd S3-53抗
原も，目視することができた。これらの分子は両方と
も，追跡後60分間まで存在を確認できた。しかしなが
ら,140kd分子だけが追跡後４時間から追跡後20時間まで
検出することができた。従って,120kd成分は,S3-53抗原
の140kd成分に対する前駆体として役立っている。
チェイスにる生合成実験は，〔35S〕−メチオニンで10
分間パルス標識した後,120kd前駆体分子の存在を明らか
にした。追跡後15分の時点では，少量の140kd S3-53抗
原も，目視することができた。これらの分子は両方と
も，追跡後60分間まで存在を確認できた。しかしなが
ら,140kd分子だけが追跡後４時間から追跡後20時間まで
検出することができた。従って,120kd成分は,S3-53抗原
の140kd成分に対する前駆体として役立っている。
実施例６ HPCの治療的処置 HPCを保持することが判明した患者を,HPC細胞との反
応性を有し，かつリシンのような毒性物質，または細胞
障害性薬剤と結合させたモノクローナル抗体で治療す
る。このモノクローナル抗体複合体は，生理学的に受容
されるキャリア溶液（例えば，リン酸緩衝食塩水）で，
静脈内投与，筋肉内投与，腹腔内投与などを行なう。投
与量は患者の体重により決定され，好ましくは約0.1mg/
kg体重〜約40mg/kg体重の範囲内で，そして通常は患者
の体重1kg当たり約1mg〜約10mgの範囲内である。あるい
は，投与量は標準的なELISA,ラジオイメージング，また
は他の方法によって定量的に腫瘍の程度を評価すること
により決定される。感染から回復する患者の能力を高め
るために必要とされる間隔で治療を繰り返す。
応性を有し，かつリシンのような毒性物質，または細胞
障害性薬剤と結合させたモノクローナル抗体で治療す
る。このモノクローナル抗体複合体は，生理学的に受容
されるキャリア溶液（例えば，リン酸緩衝食塩水）で，
静脈内投与，筋肉内投与，腹腔内投与などを行なう。投
与量は患者の体重により決定され，好ましくは約0.1mg/
kg体重〜約40mg/kg体重の範囲内で，そして通常は患者
の体重1kg当たり約1mg〜約10mgの範囲内である。あるい
は，投与量は標準的なELISA,ラジオイメージング，また
は他の方法によって定量的に腫瘍の程度を評価すること
により決定される。感染から回復する患者の能力を高め
るために必要とされる間隔で治療を繰り返す。
実施例７ HPC腫瘍のイメージング HPC細胞との反応性を有するモノクローナル抗体は，
当該分野に公知の方法（例えば,Larsonら,Journal of C
linical Investigation 72:2101（1983）；これは参照
文献としてここに採用する）によりHPCの所在と程度と
を決定するのに利用される。モノクローナル抗体は，好
ましくは放射性ヨウ素化により，または当該分野に公知
の他の放射標識技術（例えば、ジエチレントリアミン５
酢酸（DTPA）のようなキレート化剤を用いたキレート
化）により放射標識するか；あるいは常磁性を有する試
薬，化学発光を行なう基質，または酵素反応の成分で標
識する。放射標識されたモノクローナル抗体は，精製さ
れ，そして成分で標識する。標識モノクローナル抗体の
キャリア（例えば，リン酸緩衝食塩水）溶液が患者に静
脈内注射される。適当な投薬量は約100μｇから50mgの
範囲内である。抗体との反応性を有する抗原決定基を持
つ細胞が集中している身体の領域へ該抗体が移動するに
は時間がかかる。ある組織における放射性同位元素の濃
度は，当該分野に公知の全身イメージング技術（例え
ば,Rainsburyら,Lancet,1983年10月22日,934（1983）を
参照されたい；これは参照文献としてここに採用する）
によるか；あるいは生検組織または抽出した体液をシン
チレーションカウンターで評価することによって，決定
するかまたは地図化することができる。非放射性標識を
用いた場合には他の適当なモニター手段（例えば，核磁
気共鳴検出器または分光光度計）を用いる。放射能レベ
ルが高い領域は，本発明の細胞表面マーカーを有する細
胞（例えば,HPC）の存在を示している。
当該分野に公知の方法（例えば,Larsonら,Journal of C
linical Investigation 72:2101（1983）；これは参照
文献としてここに採用する）によりHPCの所在と程度と
を決定するのに利用される。モノクローナル抗体は，好
ましくは放射性ヨウ素化により，または当該分野に公知
の他の放射標識技術（例えば、ジエチレントリアミン５
酢酸（DTPA）のようなキレート化剤を用いたキレート
化）により放射標識するか；あるいは常磁性を有する試
薬，化学発光を行なう基質，または酵素反応の成分で標
識する。放射標識されたモノクローナル抗体は，精製さ
れ，そして成分で標識する。標識モノクローナル抗体の
キャリア（例えば，リン酸緩衝食塩水）溶液が患者に静
脈内注射される。適当な投薬量は約100μｇから50mgの
範囲内である。抗体との反応性を有する抗原決定基を持
つ細胞が集中している身体の領域へ該抗体が移動するに
は時間がかかる。ある組織における放射性同位元素の濃
度は，当該分野に公知の全身イメージング技術（例え
ば,Rainsburyら,Lancet,1983年10月22日,934（1983）を
参照されたい；これは参照文献としてここに採用する）
によるか；あるいは生検組織または抽出した体液をシン
チレーションカウンターで評価することによって，決定
するかまたは地図化することができる。非放射性標識を
用いた場合には他の適当なモニター手段（例えば，核磁
気共鳴検出器または分光光度計）を用いる。放射能レベ
ルが高い領域は，本発明の細胞表面マーカーを有する細
胞（例えば,HPC）の存在を示している。
（発明の要約） ヒトの膵臓癌細胞と特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生する新規なハイブリドーマ細胞系について述
べられている。このハイブリドーマ細胞系を調製するた
めに抗原調製物を生産する方法，および膵臓癌細胞を包
含するヒト細胞との反応性を有するモノクローナル抗体
を選別し，精製し，そして特徴付けする方法が開示され
ている。本発明の抗体が特異的に反応する抗原の特徴付
けが行われている。
抗体を産生する新規なハイブリドーマ細胞系について述
べられている。このハイブリドーマ細胞系を調製するた
めに抗原調製物を生産する方法，および膵臓癌細胞を包
含するヒト細胞との反応性を有するモノクローナル抗体
を選別し，精製し，そして特徴付けする方法が開示され
ている。本発明の抗体が特異的に反応する抗原の特徴付
けが行われている。
第１図はS3-41をFG細胞の放射標識抽出物と反応させる
ことにより得られた免疫沈降物の２次元ゲル分析を示す
図；第２図はS3-53をFG細胞の放射標識抽出物と反応さ
せることにより得られた免疫沈降物の２次元ゲル分析を
示す図；第３図は種々のインテグリンα鎖のＮ−末端配
列の比較を示す図である。
ことにより得られた免疫沈降物の２次元ゲル分析を示す
図；第２図はS3-53をFG細胞の放射標識抽出物と反応さ
せることにより得られた免疫沈降物の２次元ゲル分析を
示す図；第３図は種々のインテグリンα鎖のＮ−末端配
列の比較を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，４［１］ （1985） Ｐ．77 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，42 ［２］ （1985） Ｐ．601−608 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (18)
- 【請求項１】ATCC受託番号HB9318のハイブリドーマ細胞
系により産生されるモノクローナル抗体S3-41と免疫反
応し、SDS-PAGEにおける分子量が400kd、ゲル濾過にお
ける分子量が500kdである、ヘテロダイマーのタンパク
質複合体であって、実質的に： ａ）該ヘテロダイマーの一方がSDS-PAGEにおけるみかけ
の分子量が還元条件下では約205kd、非還元条件下では
約190kdである、第一の糖ペプチドであって、グリコシ
ダーゼendoFおよびノイラミニダーゼによる処理に対し
ては感受性を示し、endoHによる処理に対しては感受性
を欠いている、第一の糖ペプチド；および ｂ）該ヘテロダイマーの他方がSDS-PAGEにおけるみかけ
の分子量が還元条件下では約125kd、非還元条件下では
約150kdである、第二の糖ペプチドであって、グリコシ
ダーゼendoF、ノイラミニダーゼおよびendoHによる処理
に対して感受性を示す、第二の糖ペプチド； からなるヘテロダイマーのタンパク質複合体を含む、単
離されたヒト膵臓癌細胞抗原。 - 【請求項２】前記第二の糖ペプチドが、アミノ酸配列Ｆ
−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｎ−Ｖ−Ｉを含有す
る、請求項１に記載の単離されたヒト膵臓癌細胞抗原。 - 【請求項３】SDS-PAGEにおけるみかけの分子量が還元条
件下では約205kd、非還元条件下では約190kdである糖ペ
プチドであって、グリコシダーゼendoFおよびノイラミ
ニダーゼによる処理に対しては感受性を示し、endoHに
よる処理に対しては感受性を欠いている糖ペプチドを含
む、単離されたヒト膵臓癌細胞抗原。 - 【請求項４】SDS-PAGEにおけるみかけの分子量が還元条
件下では約125kd、非還元条件下では約150kdである糖ペ
プチドであって、グリコシダーゼendoF、endoH、および
ノイラミニダーゼによる処理に対して感受性を示す糖ペ
プチドを含む、単離されたヒト膵臓癌細胞抗原。 - 【請求項５】上皮基質界面における腫瘍病巣付近の基底
膜に存在し、ATCC受託番号HB9318のハイブリドーマ細胞
系により産生されるモノクローナル抗体S3-41との結合
特性を有するヒト膵臓癌細胞抗原に対して免疫反応性を
有する、モノクローナル抗体。 - 【請求項６】請求項１〜４のいずれかに記載のヒト膵臓
癌細胞抗原に対して免疫反応性を有する、モノクローナ
ル抗体。 - 【請求項７】前記モノクローナル抗体がIgG1クラスであ
る、請求項５に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項８】モノクローナル抗体S3-41である、請求項
７に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項９】請求項５〜８のいずれかに記載のモノクロ
ーナル抗体を分泌し得るハイブリドーマ細胞系。 - 【請求項１０】ATCC受託番号HB9318を有する、請求項９
に記載のハイブリドーマ細胞系。 - 【請求項１１】モノクローナル抗体を生産する方法であ
って、請求項９または10に記載のハイブリドーマ細胞系
を培養する工程を含有する、方法。 - 【請求項１２】請求項11に記載の方法により産生され
る、モノクローナル抗体。 - 【請求項１３】モノクローナル抗体を生産する方法であ
って、請求項９または10に記載のハイブリドーマ細胞系
をマウスに注射し、腹水を形成する工程、および該マウ
スの該腹水から該モノクローナル抗体を回収する工程を
包含する方法。 - 【請求項１４】請求項13に記載の方法により産生され
る、モノクローナル抗体。 - 【請求項１５】哺乳類の身体内でのヒト膵臓癌細胞抗原
を検出するためのイメージング試薬であって、請求項５
〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含み、こ
こで、該モノクローナル抗体が標識される、イメージン
グ試薬。 - 【請求項１６】正常ではない上皮組織の存在をインビト
ロで検出する方法であって、以下の工程： ａ）抗原と抗体とが結合するために十分な条件下で、組
織試料を請求項５〜８のいずれかに記載のモノクローナ
ル抗体と接触させる工程； ｂ）該組織試料に結合した該モノクローナル抗体を位置
づける工程；および ｃ）該モノクローナル抗体が結合した位置が該組織試料
の正常ではない上皮組織の存在を示すことを決定する工
程、を包含する方法。 - 【請求項１７】前記モノクローナル抗体が、免疫蛍光に
より位置づけられる、請求項16に記載の方法。 - 【請求項１８】ヒト膵臓癌を有する患者を治療するため
の薬学的組成物であって、毒性物質または細胞障害性薬
剤と結合させた、有効量の請求項５〜８のいずれかに記
載のモノクローナル抗体を含む、組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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