CZ291274B6

CZ291274B6 - Protilátka, rekombinantní protilátka, její pouľití a buněčná linie hybridomu

Info

Publication number: CZ291274B6
Application number: CZ19963591A
Authority: CZ
Inventors: Günther R. Adolf; Erik Patzelt
Original assignee: Boehringer Ingelheim International Gmbh; Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh
Priority date: 1994-06-08
Filing date: 1995-06-02
Publication date: 2003-01-15
Also published as: NO965239L; PL190897B1; HU9603387D0; HU220168B; CN1152925A; BG101024A; FI964845A0; PL317536A1; UA58482C2; JPH10501797A; RU2204606C2; CA2192370A1; JP3387929B2; CZ359196A3; CO4410258A1; DK0765343T3; SI0765343T1; NZ288224A; ATE197592T1; NO965239D0

Abstract

Protil tka proti epitopu v sekvenci aminokyselin, pro kterou je k dem variabiln exon v6 genu CD44, jde o protil tku VFF-18, produkovanou bun nou lini hybridomu DSM ACC2174. Sou st °e en tvo° rovn rekombinantn protil tka uveden ho typu, jej pou it a bun n linie hybridomu, produkuj c ho tuto protil tku.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká monoklonálních protilátek proti epitopu, pro nějž je kódem varianta genu CD44, exon v6. Protilátku je možno použít k diagnostickým a léčebným účelům. Vynález se rovněž týká buněčné linie hybridomu, která tuto protilátku produkuje.

Dosavadní stav techniky

V poslední době bylo prokázáno, že exprese variant povrchového glykoproteinu CD44 je nezbytná k vyvolání metastatického chování i vzniku nemetastazujícího adenokarcinomu slinivky břišní krysy v buněčné linii a také pro buněčnou linii nemetastazujícího fibrosarkomu krysy (Gůnthert a další, 1991). Nejmenší isoforma CD44 a standardní forma CD44s (označovaná také CD44std) je exprimována v celé řadě různých tkání, dochází v případě epithelových buněk k expresi variant CD44 (CD44v, CD44var) pouze u jedné podskupiny těchto buněk. Uvedené varianty se získávají z různých částí ta, že se sekvence deseti exonů (vl až v 10) z CD44s zcela vyjme, avšak u větších variant se ještě mohou vyskytovat různé jejich kombinace (Screaton a další, 1992, Tolg a další, 1993, Hofmann a další, 1991). Uvedené varianty se liší tím, že na určitém místě extracelulámí části bílkoviny jsou navíc zařazeny různé sekvence aminokyselin. Takové varianty je možno prokázat v různých lidských nádorových buňkách a tkáních.

V současné době byla prokázána exprese variant CD44 v průběhu vzniku karcinomu tlustého střeva a konečníku (Heider a další, 1993a). K expresi těchto variant v normálním epitelu lidského tlustého střeva vůbec nedochází, dochází pouze ke slabé expresi těchto látek v proliferujícich buňkách krypt. V pozdějších stadiích progrese nádoru, například adenokarcinomu dochází k expresi všech variant CD44, expresi těchto látek ve tkáních ve velkém množství bylo možno prokázat také u agresivního lymphomu, odlišného od Hodfkinova lymfomu (Koopman a další, 1993).

Zvláštní úlohu, zejména při šíření metastáz, pravděpodobně hraje exon v6 (Rudy a další, 1993). Na živočišném modelu bylo možno protilátkami proti tomuto exonu zabránit uhnízdění metastatických buněk a tím i vzniku metastáz (Seiter a další, 1993). V případě karcinomu tlustého střeva je exprese v6 v korelaci s progresí nádoru (Wielenga a další, 1993). U karcinomu žaludku je exprese této látky důležitým diagnostickým znakem pro odlišení od střevních nádorů a nádorů difuzního typu (Heider a další, 1993b). Exprese uvedené látky byla ve zmíněných literárních citacích měřena pomocí protilátek proti specifickému epitopu v6.

Monoklonální protilátky proti epitopu, pro nějž je kódem exon v6, jsou známé (Hofmann a další, 1991, Wielenga a další, 1993). Vzhledem k vysokým potenciálním požadavkům na takové protilátky, které mohou mít velký význam při diagnostice a léčení by bylo zapotřebí mít k dispozici protilátky s výhodnějšími vlastnostmi.

Vynález si klade za úkol navrhnout takovou protilátku, která by měla výhodnější vlastnosti ve srovnání se známými protilátkami, specifickými pro v6.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu tvoří protilátka proti epitopu v sekvenci aminokyselin, pro kterou je kódem variabilní exon v6 genu CD44, jde o protilátku VFF-18, produkovanou buněčnou linií hybridomu DSMACC2174. Protilátka byla uložena do veřejné sbírky mikroorganismů a buněčných kultur, DSM-Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschetroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, SRN, pod svrchu uvedeným číslem.

-1 CZ 291274 B6

V následujícím popisu se pod označením protilátka nebo molekula protilátky nerozumí pouze úplné imunoglobuliny, nýbrž také ekvivalentní látky, pokud jde o specifičnost vazby a afinitu, může tedy jít o deriváty protilátky a o rekombinantní molekuly protilátky.

Protilátku VFF-18 je možno získat způsobem, který je dále popsán v příkladu 1. Mimoto je možno protilátku získat ze svrchu uvedené buněčné linie hybridomu. Každý odborník může připravit deriváty protilátky na základě analýzy sekvence a/nebo při použití buněčné linie hybridomu, který protilátku produkuje a může tak získat rekombinantní molekulu protilátky téhož idiotypu, to znamená molekulu protilátky, která má v oblasti vazby na antigen (CDR) stejnou sekvenci aminokyselin jako protilátka VFF-18. Všechny takové deriváty a rekombinantní molekuly spadají do rozsahu vynálezu.

Z úplného imunoglobulinu protilátky VFF-18 je možno získat například fragmenty Fab F(ab')₂nebo jiné fragmenty (Kreitman a další, 1993). Pro diagnostické postupy je možno protilátku VFF-18 její fragmenty nebo rekombinantní molekuly stejného idiotypu vázat například na radioaktivní isotopy, jako ^l31I, ’ln, ⁹⁹Tc nebo na radioaktivní sloučeniny (Larson a další, 1991, Thomas a další, 1989, Srivastava, 1988), na enzymy, například peroxidázu nebo alkalickou fosfatázu (Catty a Raynkundalia, 1989), na fluorescenční barviva (Johnson, 1989) nebo na molekuly biotinu (Guesdon a další, 1979). Pro léčebné účely je možno protilátku VF-18 nebo odvozené molekuly vázat na toxiny (Vitetta a další, 1991, Vitatta a Thorpe, 1991, Kreitman a další, 1993, Theuer a další, 1993), na cytostatika (Schrappe a další, 1992), prekursory (Wang a další, 1992, Senter a další, 1989) nebo na radioaktivní látky. Mimoto může být protilátka spojena s cytokinem nebo jiným imunomodulačním polypeptidem, například faktorem nekrosy nádoru nebo interleukinem-2.

Odborník dále může podle analýzy sekvence aminokyselin protilátky VFF-18 a/nebo při použití buněčné linie hybridomu, která protilátku produkuje a zvláště na základě genetické informace připravit rekombinantní molekulu protilátky téhož idiotypu. Odpovídající postupy jsou již známé. Rekombinantní molekulou může být například humanisovaná protilátka (Shin a další, 1989, Gůssow a Seemann, 1991), bispecifícká protilátka (Weiner a další, 1993, Goodwin, 1989), protilátka s jednoduchým řetězcem (scFv, Johnson a Bird, 1991), úplné imunoglobuliny nebo jejich fragmenty (Coloma a další, 1992, Nesbit a další, 1992, Barbas a další, 1992) nebo protilátky, vytvořené modifikací řetězce (Winter a další, 1994). Humanizované protilátky je možno připravit například CDR-roubováním (EP 239 400). Také oblasti rámce mohou být modifikovány (EP 519 596). K humanizaci protilátek je v současné době možno použít například PCR (například EP368 684, EP 438 310, WO 92/07075) nebo modelování pomocí počítačem (například WO 92/22653). Je také možno získat složené bílkoviny, obsahující například protilátku s jednoduchým řetězcem a toxin (Chaudhary a další, 1990, Friedman a další, 1993). Takové molekuly protilátek rovněž spadají do rozsahu vynálezu.

Každý odborník může také určit přesný epitop VFF-18 a na jeho základě připravit ekvivalentní protilátky se stejnou specifičností vazby. Je to možno uskutečnit například sledováním vazby peptidů podle příkladu 2, například variacemi peptidů Hul. Takové protilátky rovněž spadají do rozsahu vynálezu.

Vynález se rovněž týká použití VFF-18 nebo odvozených nebo ekvivalentních molekul protilátek pro diagnostické a léčebné účely.

Diagnostické postupy mohou být známé postupy, prováděné při použití molekuly protilátky podle vynálezu, může například jít o imunologická sledování s použitím enzymu (ELISA, Catty a Raykundalia, 1989), radioimunologické zkoušky (Catty a Murphy, 1989), imunohistochemické zkoušky (Heider a další, 1993b) nebo o Western Blot. tyto postupy se obvykle provádějí na vzorcích tkání nebo tekutin, získaných například při biopsii. Zkoušky mohou být prováděny kvalitativně, semikvantitativně nebo kvantitativně. Protilátku je přitom možno použít tak, jak je

-2CZ 291274 B6 v literatuře popsáno pro jiné protilátky, specifické pro v6 (WO 95/00851), přičemž výhodné vlastnosti nových protilátek znamenají podstatné zlepšení těchto postupů.

Kromě diagnostiky in vitro je nové protilátka vhodná také pro diagnostiku in vivo, zvláště v případě nádorů. V případě, že molekula protilátky nese zjistitelnou značku, je možno tuto značku prokázat k diagnostickým účelům, je například možno nádor zobrazit nebo je možno značení využít například k chirurgickým účelům. Při použití radioaktivních isotopů pro značení protilátky pro imunitní scintigrafii, je možno postupovat podle řady známých způsobů (Siccardi a další, 1989, Keenen a další, 1987, Perkins a Pimm, 1992, Colcher a další, 1987, Thompson a další, 1984).

Protilátku je možno využít k léčebným účelům například obdobně jako protilátku 1.1ASML (Seiter a další, 1993). Podávání může být systemické nebo místní. Protilátku je možno podávat nitrožilně v injekci nebo infuzi, intraperitoneálně, nitrosvalově, podkožně a podobně. Je možno uskutečnit také promývání jednotlivých orgánů nebo končetin. Postupy pro použití konjugovaných nebo nekonjugovaných látek ve formě úplných imunoglobulinů, jejich fragmentů, rekombinantních chimémích molekul a podobně, jsou známé (Mulshine a další, 1991, Larson a další, 1991, Vitetta a Thorpe, 1991, Vitetta a další, 1991, Breitz a další, 1992, Press a další, 1989, Weiner a další, 1989, Chatal a další, 1989, Sears a další, 1982).

Výhodnější vlastnosti protilátky VFF-18 ve srovnání s jinými protilátkami proti CD44v6 jsou popsány dále v příkladech 2 až 4.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je schematicky znázorněna složená bílkovina GCT-CD44(v3-vlO). GST = glutathionS-transferáza z Schistosoma japonicum. v3-vl0 = možné včlenění různých variant do CD44 keratinocytů. Šipka označuje místo štěpení thrombinem.

Na obr. 2 je uvedeno srovnání sekvencí exonu v6 genu CD44 člověka a krysy. Sekvence peptidů Ral a Hul, na který jsou vázány protilátky 1.1ASML (proti CD44v6 kiysy) a VFF-18 (proti CD44v6 člověka) jsou vyznačeny tučným písmem. Totožné aminokyseliny jsou označeny hvězdičkou.

Na obr. 3 je uvedena vazba protilátek, specifických pro CD44v6 na syntetické peptidy. Vazba protilátek na tyto peptidy byla stanovena pomocí ELISA, peptidy byly immobilizovány a pak inkubovány s roztoky protilátek. Po odpovídajícím promytí byla vázaná protilátka stanovena pomocí protilátky proti IgG myši, konjugované a peroxidázou.

(A) : v prvním pokusu byla sledována vazba protilátky 1.1ASML, specifické proti CD44v6 kiysy na peptid Ral (KWFEN a EWQGK NPPT).

(B) : v dalším pokusu byl syntetizován peptid, homologní s peptidem Ral z lidské sekvence CD44v6. pak byly vázány na tento peptid Hul (QWFGN RWHEG YRQT) různé supematanty hybridomů, produkujících protilátky proti lidskému CD44v6. Bylo prokázáno, že na tento peptid se protilátka VFF-18 váže daleko lépe než ostatní použité protilátky.

(C) : Pro kvantitativní vyhodnocení byl uvedený pokus opakován při užití různých koncentrací čištěných protilátek. Také v tomto případě bylo prokázáno, že VFF-18 má vyšší afinitu pro vazbu než ostatní protilátky.

Na obr. 4 je znázorněna vazba radioaktivně značených protilátek na nádorové buňky. Tři protilátky, VFF-7 (proti v6), VFF-8 (proti v5) a VFF-18 (proti v6) byly radioaktivně označeny pomocí N-sukcinimyl/2,3-³H/propionátu a použity k vazbě na různé nádorové buněčné linie.

-3CZ 291274 B6

Byly použity následující buněčné linie: CHO-CD44var: rekombinantní buněčná linie vaječníku čínského křečka, u níž dochází na povrchu k expresi lidské varianty CD44 (exony v3 až vlO); HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO205: buněčné linie lidského karcinomu tlustého střeva; A431: buněčná linie lidského karcinomu plochých epithelových buněk. Je znázorněna specifická vazba protilátky na různé buněčné linie. Vazba protilátek VFF-7 a VFF-18, specifických pro v6, na rekombinantní buněčnou linii CHO-CD44var je přibližně téhož řádu, u nádorových buněčných linií se protilátky chovají zcela odlišně. V některých případech je možno pozorovat jenom vazbu VFF-18 a v malé míře vazbu VFF-8 (HT-29, CaCo, COLO205) u ostatních buněčných linií se VFF-18 váže podstatně lépe než VFF-7.

Na obr. 5 je znázorněn výsledek zkoušek na rozpustné varianty CD44, obsahující exon v6, v normálním lidském séru. Při sendvičové zkoušce ELISA byly použity tři protilátky, specifické pro v6, VFF-4, VFF-7 a VFF-18. Ve všech třech případech byla použita protilátka BU-52, specifická pro CD44std, konjugovaná a peroxidázou. Jsou znázorněny výsledky ze dvou normálních lidských sér při jejich různém zředění (zkouška A a zkouška Β). V obou případech je možno pro protilátku VFF-18 pozorovat podstatně silnější signály než pro obě zbývající protilátky.

Na obr. 6 jsou znázorněny hodnoty pro varianty CD44, obsahující v6, v krevním séru. Ve dvojím opakování zkoušky ELISA byl stanoven obsah rozpustného CD44var v séru šesti zdravých dárců. Při jedné zkoušce byla použita protilátka VFF-7, při druhé zkoušce protilátka VFF-18, obě protilátky rozpoznávají exon v6. Jako srovnávací preparát byl pro oba případy použit rekombinantní rozpustný CD44, a to varianta, získaná v buněčné linii CHO (exon v3 až vlO). je zřejmé, že při použití protilátky VFF-18 bylo možno získat průměrně 3,5x vyšší hodnoty než při použití protilátky VFF-7. To znamená, že rozpustnou variantu CD44var, přítomnou v krevním séru, je možno snadněji prokázat při použití protilátky VFF-18 než při použití VFF-7.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tvorba monoklonální protilátky VFF-18

Klonování pGEX-složených bílkovin

Celá variantní oblast HPKII-typu CD44v (Hofmann a další, 1991) byla amplifikována zcDNA lidských keratinocytů při použití PCR. Oba PCR primery, a to

5'-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3', polohy 25 až 52 a

5-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3', polohy 1013 až 984 variantní oblasti LCLC97 podle Hofmanna a dalších, obsahovaly místo působení enzymu EcoRI, které bylo použito pro klonování produktu PCR přímo ve vektoru pGEX-27 (Smith a další, 1988). Výsledná konstrukce pGEXCD44v HPKII, v3-vl0, bylo kódem pro složenou bílkovinu s molekulovou hmotností přibližně 70 000, tvořenou glutathion-S-transferázou ze Schistosoma japonicum a exonem v3-vl0 lidského CD44 (obr. 1, Heider a další, 1993a). Složená bílkovina byla uložena do E. coli a po expresi byla čištěna afinitní chromatografii na agarose s glutathionem (Smith a další, 1988).

-4CZ 291274 B6

Imunizace a řadové vyšetření

Myší samice Balb/c byly imunizovány intraperitoneálně afinitně čištěnou složenou bílkovinou podle následujícího schématu;

1. imunizace: 90mikrogramů složené bílkoviny v úplném Freundově pomocném prostředku,

2. a 3. imunizace: 50mikrogramů složené bílkoviny v neúplném Freundově pomocném prostředku.

Imunizace byly prováděny vždy v odstupu 4 týdnů. 14 dnů po poslední imunizaci byla zvířata ještě tři po sobě následující dny imunizována vždy při použití 10 mikrogramů složené bílkoviny vPBS. Následujícího dne byla provedena fúze slezinných buněk zvířete s vysokým titrem protilátek s buněčnou linií myšího myoelomu P3.X63-Ag8.653 při použití polyethylenglykolu4000. Buňky hybridomu pak byly podrobeny selekci na mikrotitračních plotnách v prostředí HAT (Kóhler a Miltein, 1975, Keamey a další, 1979).

Stanovení titru protilátek v krevním séru a sériové vyšetření supematantu hybridomu bylo prováděno při použití zkoušky ELISA. Při této zkoušce byly nejprve převrstveny mikrotitrační plotny složenou bílkovinou GCT-CD44v3-10 nebo pouze glutathion-S-transferázou. Pak byly plotny inkubovány se sériovým ředěním vzorků séra nebo se supematantem hybridomu a specifické protilátky byly prokazovány při použití protilátek proti imunoglobulinu myši, konjugovaných s peroxidázou. Hybridomy, které reagovaly pouze s glutathionem-S-transferázou byly odloženy. Zbývající protilátky byly charakterizovány pomocí zkoušky ELISA a byly prokazovány složené bílkoviny, specifické pro určité oblasti, jako exonv3, exonv5 + v6, exon v6 + v7 a exony v8 - vlO (Koopman a další, 1993). Imunohistochemická reaktivita těchto látek byla zkoumána na řetězech lidské pokožky. Protilátka VFF-18 pak byla identifikována vazbou na syntetický peptid Hul (QWFGN RWHEG YRQT). Sekvence Hul je fragmentem lidského exonu v6 z CD44.

Příklad 2

Vazba protilátek, specifických pro CD44v6 na syntetické peptidy

Vazba uvedených protilátek na syntetické peptidy byla stanovena zkouška ELISA.

Roztoky:

Roztok pro převrstvení: 0,05 M uhličitan sodný, pH 9,6

Roztok pro zkoušky: PBS (fyziologický roztok NaCl s fosfátovým pufrem) 0,5 % BSA (sérový albumin skotu) 0,05 % Tween 20

Roztok substrátu: Fa. Kierkegaard and Perry Laboratories, Gainthersburg, MD, USA,

Substrát pro peroxidázu TMB: roztok peroxidázy Β (H2O2) 1:1.

Peptidy (50 mikrogramů/ml v roztoku pro převrstvení) byly immobilizovány přes noc při teplotě 4 °C na plotnách NUNC Maxisorp (1.1ASML) nebo na plotnách Acti-A (Bio Products, protilátka VFF). V případě ploten Acti-A byl peptid kovalentně vázána na plotnu. Pak byly plotny promyty při použití PBS/0,05 % Tween, volná adsorpční místa na povrchu plotny byla blokována roztokem pro zkoušky (1 hodina při teplotě místnosti) a pak byly plotny opět promyty PBS/0,05 % Tween 20. Plotny Acti-A byly po blokování redukovány při použití 10 mM hydroborátu sodného ve 20 mM hydrogenuhličitanu sodného o pH9,0, (1 hodina při teplotě

-5CZ 291274 B6 místnosti za protřepávání) a pak byly 3x promyty při použití PBS/0,05 % Tween 20. Pak byly přidány supernatanty hybridomu nebo roztoky protilátek v roztoku pro zkoušky v koncentraci 0,02 až 10,0 mikrogramů/ml, načež byly plotny za protřepávání inkubovány 2 hodiny při teplotě místnosti. Pak byly plotny opět třikrát promyty při použití PBS/0,05 % Tween 20. Pak bylo do vyhloubení ploten přidáno 100 mikrolitrů protilátky proti IgG myši, konjugované s peroxidázou z křenu, v příslušném řádění v roztoku pro zkoušky. Po inkubaci 2 hodiny při teplotě místnosti za protřepávání byly plotny znovu třikrát promyty při použití PBS/0,05 % Tween 20 a barveny roztokem substrátu. Po 10 až 15 minutách vyvíjení ploten byla reakce zastavena přidáním 2M kyseliny sírové a pak byla fotometrem měřena absorpce při 450 nm (referenční zkouška při 690 nm).

V prvním pokusu byla sledována vazba protilátky 1.1ASML, specifické pro CD44v6 krysy na peptid Ral (K.WFEN EWQGK NPPT), výsledek je uveden v tabulce 1 a na obr. 3 A.

Tabulka 1

1.1ASML pg/ml	absorpce
10,00	1,652
5,00	1,702
2,50	1,658
1,25	1,595
0,63	1,502
0,31	1,211
0,16	0,971
0,08	0,686
0,04	0,458
0,02	0,270

V dalším pokusu byl syntetizován peptid, homologní peptidu Ral z lidské sekvence CD44v6 (Hul, QWFGN RWHEG YRQT). Pak byly na peptidu Hul navázány různé protilátky proti lidskému CD44v6. Bylo prokázáno, že protilátka VFF-18 má překvapivě vysokou afinitu pro vazbu ve srovnání se všemi ostatními protilátkami (tabulka 2, obr. 3B).

Tabulka 2

protilátka	absorpce
VFF-2	0,067
VFF-4	1,333
VFF-7	0,199
VFF-18	2,384

Pro kvantitativní vyhodnocení byly na peptid Hul vázány čištěné protilátky proti lidskému CD44v6 v různých koncentracích. Také v tomto případě bylo možno pozorovat pro VFF-18 podstatně vyšší afinitu vazby ve srovnání s ostatními protilátkami (tabulka 3, obr. 3C).

-6CZ 291274 B6

Tabulka 3

pg/ml protilátky	VFF-4	VFF-7	VFF-18
10,000	1,225	0,247	2,320
3,333	1,404	0,226	2,550
1,111	0,853	0,094	2,483
0,370	0,336	0,054	2,426
0,123	0,163	0,028	1,354
0,041	0,086	0,025	0,615
0,014	0,048	0,021	0,266
0,005	0,036	0,031	0,095
0,002	0,021	0,021	0,061

Příklad 3

Vazba radioaktivně značené specifické protilátky proti CD44v6 na nádorové buněčné linie

Radioaktivní značení protilátky mCi N-sukcinimidyl-/2,3-³H/propionátu (/³H/-NSP, Amersham, 1 mCi/ml) se v silikonizované zkumavce při teplotě 0 °C ve vodním vakuu odpaří téměř do sucha. Pak se přidá 15 mg protilátky (1 mg/ml vPBS o pH 7,4) a směs se inkubuje 48 hodin při teplotě 4 °C. Pak se přebytečný ³H-NSP odstraní reakcí s 30 mikrolitry 1M glycinu vPBS, 20minut při teplotě místnosti. Značená protilátka se od ³H-glycinu oddělí na sloupci Sephadex-G-25-M s obsahem 15 ml této látky, jako eluční činidlo se užije PBS s 0,5 % BSA. Množství protilátky se stanoví zkouškou ELISA pro detekci myšího imunoglobulinu a vypočítá se specifická účinnost.

Vazba radioaktivně značené protilátky na nádorové buňky

Tři protilátky VFF-7 (proti v6), VFF-8 (proti v5) a VFF-18 (proti v6) se radioaktivně označí při použití N-sukcinimidyl-/2,3-³H/propionátu a použije pro zkoušku na vazbu pro různé nádorové buněčné linie. Byly použity tyto buněčné linie: CHO-CD44var: rekombinantní linie vaječníkových buněk čínského křečka, u níž dochází na povrchu k expresi varianty lidského CD44 (exony v3-vl0); HCT-116, CX-l,HT-29, CaCo, COLO205: buněčné linie lidského karcinomu tlustého střeva; A431: buněčná linie lidského karcinomu epitelových buněk.

Buněčný materiál se naočkuje na plotny pro tkáňové kultury s 12 vyhodnoceními, inkubuje se přes noc při teplotě 37 °C v atmosféře oxidu uhličitého, pak se plotny promyjí PBS a materiál se fixuje ethanolem 1 minutu při teplotě místnosti. Pak se plotny omyjí živným prostředím RPMI 1640 s 10% fetálního telecího séra a naváže se radioaktivně značená protilátka, 250 000 dpm/vyhloubení plotny. Po inkubaci 25 hodin při teplotě místnosti za stálého protřepávání se plotny třikrát promyjí PBS/0,5 % BSA, buněčný materiál se solubilizuje působením 0,1 M NaOH s 1 % Tritonu X-100 a radioaktivita se měří pomocí scintilačního počítače. Nespecifická vazba se stanoví v přítomnosti stonásobného přebytku neznačené protilátky. Vazba se vztáhne na množství 400 000 buněk. Po stanovení specifické účinnosti protilátky je možno vázanou protilátku vyjádřit v fmol.

V tabulce 4 a na obr. 4 je uvedena specifická vazba protilátek na různé buněčné linie. V případě vazby protilátek VFF-7 a VFF-18, specifických pro v6 na rekombinantní buněčnou linii CHO-CD44var je vazba přibližně stejná, u dalších nádorových buněčných linií dochází ke značným rozdílům ve vazbě. V některých případech se váže pouze VFF-18 a v malém množství VFF-8 (HT-29, CaCo, COLO 205), u ostatních linií se VFF-18 váže podstatně lépe než VFF-7.

Tabulka 4

buněčná linie	VFF-7 fmol	VFF-8 fmol	VFF-18 fmol
CHO CD44var	33,50	68,42	46,52
HCT-116	1,44	11,08	20,22
CX-1	0,19	2,20	9,48
HT-29	0,00	2,60	26,07
CaCo	0,03	2,81	12,57
COLO 205	0,00	0,32	2,88
A431	8,19	42,32	38,73

Příklad 4

Zkouška ELISA pro stanovení rozpustného CD44v6 v séru

Roztoky:

roztok pro převrstvení: 0,05 M uhličitan sodný, pH 9,6 pufr pro zkoušku: PBS (fyziologický roztok NaCl s fosfátovým pufrem)

0,05 % Tween 20

0,5 % BSA (sérový albumin skotu) ředidlo pro vzorek: Fa. Bender MadSystems, Vídeň, Rakousko, roztok substrátu: Fa. Kierkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg MD, USA;

substrát pro TMB peroxidázu: roztok peroxidázy Β (H2O2), 1:1.

Mikrotitrační plotny (Nunc-Immunoplate MaxiSorp F96) se převrství specifickou protilátkou proti CD44v6 v množství 5 mikrogramů/ml a plotny se inkubují přes noc při teplotě 4 °C. Pak se promyjí PBS s 0,05 % Tween, volná adsorpční místa na povrchu plotny se blokují pufrem pro zkoušku při inkubaci 1 hodina při teplotě místnosti a pak se plotny znovu promyjí PBS s 0,05 % Tween 20. Vzorky séra se pak předběžně zředí ředidlem pro vzorek v poměru nejméně 1 : 5, načež se připraví zřeďovací řada v poměru 1 :2 přímo na plotně, vzorky se řadí ředidlem pro vzorek. Nakonec se přidá v množství 50 mikrolitrů/vyhloubení protilátka proti CD44sts, konjugovaná s peroxidázou z křenu (Klon BU-52, The Binding Site, Birmingham) ve vhodném zředění v pufru pro zkoušky, 1 : 3 000 až 1 : 10 000. Po inkubaci 3 hodiny při teplotě místnosti se plotny 3x promyjí PBS s 0,05% Tween 20 a barví se roztokem substrátu. Po vyvíjení 10 až 15 minut se reakce zastaví přidáním 2M kyseliny sírové, načež se měří fotometrem absorpce při 450 nm, referenční měření při 690 nm.

Pro kvantitativní stanovení se užije sériové řádění standardního preparátu CD44 v pufru pro zkoušky. Tento preparát se čistí ze supematantu rekombinantních buněk křečka CHO, u nichž dochází k expresi rozpustného CD44v3-vlO. Jde o lidskou variantu CD44, která obsahuje kódovou sekvenci pro peptid exonů v3 až vlO.

V tabulce 5 a na obr. 5 je uvedeno stanovení rozpustných variant CD44 s obsahem exonu v6 v normálním lidském séru. Při provádění sendvičové zkoušky Elisa se užijí tři protilátky, specifické proti v6, a to VFF-4, VFF-7, a VFF-18. Ve všech třech případech se použije

-8CZ 291274 B6 specifická protilátka proti CD44std (Bu-52), vázaná na peroxidázu. Uvedeny jsou výsledky pro dva odlišné vzorky normálního lidského séra v různém zředění. V obou případech A a B je možno dosáhnout při použití VFF-18 podstatně silnějšího signálu než v případě obou dalších protilátek.

Tabulka 5A

Sérum I

ředění	VFF-4	VFF-7	VFF-18
1:5	0,406	0,417	3,143
1:10	0,378	0,289	3,055
1:20	0,296	0,179	2,630
1:40	0,207	0,072	1,778
1:80	0,109	0,062	1,084
1:160	0,050	0,030	0,594
1:320	0,026	0,008	0,318
1:640	0,012	0,007	0,159

Tabulka 5B

Sérum 2

ředění	VFF-4	VFF-7	VFF-18
1:5	1,690	1,280	3,290
1:10	1,756	1,185	3,321
1:20	1,564	0,857	3,163
1:40	1,213	0,468	3,050
1:80	0,699	0,208	2,537
1:160	0,336	0,061	1,666
1:320	0,138	0,014	0,988
1:640	0,054	0,018	0,546

V následující tabulce 6 a na obr. 6 jsou uvedeny výsledky v séru pro varianty CD44, obsahující v6. Pomocí zkoušky ELISA ve dvojím opakování byl stanoven obsah rozpustného CD44var v séru šesti zdravých dárců. V jedné z těchto zkoušek byla použita protilátka VFF-7 a ve druhé protilátka VFF-18 pro převrstvení. Obě tyto protilátky rozpoznávají exon v6. Pro srovnání byla 25 v obou případech použita rekombinantní varianta rozpustného CD44, která byla získána z buněk

CHO (exon v3-vl0). Zkouška ELISA při použití protilátky VFF-18 poskytovala v průměru 3,5x vyšší hodnoty než v případě použití protilátky VFF-7. To znamená, že rozpustný CD44var, přítomný v krevním séru se snadněji prokazuje protilátka VFF-18 než protilátka VFF-7 ve srovnání s rekombinantní bílkovinou.

-9CZ 291274 B6

Tabulka 6

dárce	VFF-7 ng/ml	VFF-18ng/ml	VFF-18/VFF-7
1	18,2	75,9	4,17
2	32,1	85,5	2,66
3	22,4	87,6	3,91
4	27,7	91,6	3,31
5	26,8	98,3	3,67
6	95,4	332	3,48
průměr SD CV%			3,53 0,52 14,9%

Seznam literatury

Barbas C F, Bjčrling Ξ, Chiodi F, Dunloo N, Cababa D, Jcnes T Ní, Zebedee S L, Psrsson Ní A A. Nara P L, Ncrrby Ξ, Burton D R. Reoombinant human Fab Éagments neutraiize human type l immuncdenciency virus m vitro. Proč. Nati. Acad Sci. U.S.A. 89: 9339-9343 (1992).

Breitz Η B, Weiden P L, Vanderheyden J-L, Appeibaum J W, Bjom Ní J, Fer Ní r, Wolf S B, RatciiffB A, Seiler C A Foisie D C, Fisher D R, Schroc R W, Fritzberg A R, Abrams P G. Ciinical experience with rňenium-186-!abeied monoclonal anuoodies for radioimmuno±erapy: results ofphase I trials. J. NucL Med 33: 1099-1112 (1992).

Catty, D., Raykundaiia, C. ELISA and related immunoassays. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 97-152, s. S. 105-109.

Catty, D., Murpny, G. Inununoassays using radloíabels. In: Catty, D (Hrsg). Aritibcdies VaL II. IRL Press Oxford (1989), 77-96.

Chata! J-F, Saccavini J-C, Gestin J-F, Thédrez P, Curtet C, Kremer Ní, Guerreau D, Nauce D, Fumoieau P, Guiílard Y. Biodistrioution of indium-11 l-labeled OC 125 monocionai antibody intraperitoneally inieotsd inco patients operated on for ovarian carcinomas. Címar Res. 49: 3087-3094 (1989).

-10CZ 291274 B6

Chaudhary V K, Batra J K, Gajdo Ní G, WiHinghzm Ní C, Fitzgerald D I, Pastan I. A rapid method of cloning functionai variabie-region anúbody genes in Escherichia coti as singiechain immunotoxins. Proč. NatL Acad. Sel. U.S.A. 87: 1066 (1990).

Colcher D, Esteoan J, Carrasquillo J A, Sugarbaker P, Reynoids J C, Bryant G, Larson S Ní, Schiom J. Compiementadon of intracavitary and intravenous administration of a monocíonai antibody (B72.3) in pauents with carcinotna. CancerRes. 47:4218-4224 (1987).

Coloma Ní J, Hastings A. Wims L A, Níorrison S L. Novei vectors for the expression of antibody molecules using variabie regions generated by polymerase chain reacdon. J. Zmmunol. Methoas 152: 89-104 (1992).

Friedmann P N, NícAndrew S J, Gawiak S L, Chace D, Traii ? A, Brown J P, Siegail C B. BR96 sFv-PE40, a potem single-chain immunotoxin that selecdveiy Jciils carcinotna ceils. CancerRes. 53: 334-339 (1993).

Goodwin D A. A new aopoach to the probiem of targeting specinc monocionai anďoodies to human tumors using anti-hapten chimeric antibodies. Z NucL Med. Bioi. 16: S45 (1989).

Gunthert, U., Hoůnann, Ní., Rudy, W., Reber, S., Zóiler, Ní., HauBmann, I., Níatzku, S., Wenzel, A., Ponta, H., and Herriich, P. A new variant of giycaorotein CD44 confers metastatic potential to rat cardnoma ceils. Cell 65: 13-24 (1991).

Guesdon, J. L, Temynck, T., Avrameas, S. J. Histochem. Cytocnem. 27: 1131 (1979).

Gůssow D, Seemann G. Humanizaúon of monocionai antibodies. Methods Enzymol. 203: 99-121 (1991):

Heider, K.-H., Honnann, M., Horst, E., van den Berg, F., Ponta, H., Herriich, P., ar.d Pals,

S.T. A human homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps. 1 Cell BioL 120: 227-233 (1993a).

Heider, K-H., Dammrich, J., Skroch-Angel, P., Níiiller-Hermeiink, H-K., Voilmers, H-P., Herriich, P., and Ponta, H. DiSerential expression of CD44 spilce variants in intestinaí- and dinuse-type human gastric carcinomas and normál gastric mucosa. Cancer Res. 53: 41974203 (1993b).

-11 CZ 291274 B6

Hormann, NL, Rudy, W., Zčller, Ní, Tólg, C., Porna, H., Herriich P., and Gůnthert, U. CD44 spiice variants confer metastatic benavior in rats: homoloeous sequences are expressed in human tumor cell lineš. Cancer Res. 51:5292-5297 (1991).

Johnson, G. D. Immunofluorescence. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 179-200, s. S. 180-189.

Johnson S, Bírd R Ξ. Construcrion of single-chain derivatives of monocional antibodies and their producrion in Escherichia coli. Methods EnzymoL 203: 88-98 (1991).

Keamey, J.F., Radbruch A.. Liesegang 3., Raiewski K- A new mouše myeloma ceil line that has lost imunoglobulin expression but permits construction of anďoody-secreňng hybrid cell Unes. J. ImmunoL /23: 1548 (1979).

Keenan A M, Weinstein J N, Carrasquiilo J A, Bunn P A, Reynoids J C, Foon K A et al. Immunoiymphoscintizraphy and the dose dependence of ^:IlIn-Íabeied T101 monccionai antibody in patients with cutaneous T-cell iymphoma. Cancer Res. 47: 6093-6099 (1987).

Kónler, G„ NGlstein, C. Continous culture of íused celíš secredng antibody of prečenned speciňty. Nátuře 265:495 (i975) iCoopman, G., Heider, K.-H., Horts, E., Adoif G. R, van den Berg, F., Ponta. H., Herriich, ?., Pals, S. T. Acňvated human [ymphocytes and aggressive Non-Hodgkin's iymphomas ccpress a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J. Eac. Med. 177: .97-904 (1993).

Geitman R J Hansen H J, Jones A L, FiczGerald D J P, Goldenberg Ď Ní, Pastan L Rseu'.omonas exotoxin-based immunotoxins containing the antibody LL2 or 1.1.2-Fab¹ induce regression of subcutaneous human B-cell Iymphoma in mice. Cancer Res. 53: 819-825 (1993).

Larson S M, Cheung N-K V, Leibe: S A Radioisotope Conjugates. In: DeVira V T, Heilman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biologie therapy of cancer. J. B. Lippincott Cotnp., Philadeiphia, 496-511 (1991).

Mulshine J L, Níagnani J L, Linnoila R I: Appiications of monocional antibodies in the treaunent of solid tumors. In: DeVica V T, Heliman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Bioiogic therapy of cancer. J. 3. Lippincott Camp., Phiiadeiphia, 563-588 (1991).

-12CZ 291274 B6

Nesoit M, Fu Z F, McDonald-Snridt J, Steplewski Z, Curtis P J. Producdon of a funcdonal monocionai andbody recognizing human coiorectai carcinoma cails ftom a baculovirus expression systém. J. ImmunoL Methods 151:201-208 (1992).

Peridns A C, Pimm Ní V. A role for gamma sdndgrapny in cancer immunology and immunotherapy. Eur. J. Nud. Med. 19: 1054-1063 (1992).

Press O W, Eary J F, Badger C C, Martin P J, Appelbaum F R, Levý R, Miiler R. Brown S, Nelp W B, Krohn K A, Fisher D, DeSantes K, Porter B, Kidd P, Thomas E D, Bemstein I D. Treaunent of renzoory Non-Hodgkin's lymphoma with radiolabeied MB-1 (anti-CD37) andbody. J. Clin. OncoL 7: 1027-1038 (1989).

Rudy, W., Honnann, Ní., Scnwartz-Albiez, R., Zoller, M., Heider. K.-H., Ponta, H., HerrIích, P. Tne twa major CD44 proteins expressed on a metastadc rat tumor cell line are derived firom different solíce variants: Each one individually sužces to confer metastadc behaviour. Cancer Res. 53: 1262-1268 (1993).

Schrappe Ní, Bumol T F, Apeigren L D, Briggs S L, Koppel G A, Nfarkowitz D D, Mueller B M, Reisfeld R A. Long-tenn growth suppression of human giioma xenograíts by chemoimmunoconjugates of 4-desacetylvinbiasdne-j-C3rboxyhydrazide and monocionai andbody 9.2.27. CancerRes. 52:3838-3844 (1992).

Screaton, G.R., Bell, M.V., Jacácson, D.G., Camelis, F.B., Gerth, U., and Bell, J. I. Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 altematívely spliced exons. Proč. NaiL Acad. Sci. U.S.A. 89: 12160-12164 (1992).

Sears H F, Mattis J, Heriyn D, Háyry P, Aikinson. B, Ernst C, Stepiewsid Z, Koorowski H. Phase-I cíinical trial of monocionai andbody in treatment of gastrointestinal tumours. Lancet 1982 (I): 762-765 (1982).

Seňer, S., Arch, R., Reber, S., Komitowsld, D., Hofinann, M., Porna, H:, Herriich, P., Matzku, S., Zoller, M. Prevendon of tumor metastasis formadon by anti-varíant CD44. J. Exp. Med. 177:443-455 (1993).

Senter P D, Schreiber G J, Hirschberg D L, Ashe S A, Hellstróm K E, Hellstróm I. Enhancement of the in vitro and in vivo andtumor acdvities of phosphorylated mitomycin C

-13CZ 291274 B6 and etoposide derivatives by monocional antibody-alkaline phosphaiase coniugates. Cancer Res. 49: 5789-5792 (1989).

Shin S-U, Morrison S L. Producnon and propenies of chimeric antfoody molecuies. Λ/eihods Enzymol. 178:459-476 (1989).

Siccardi A G, Buraggj G L, Cailegaro L, Coleila A C, DeFiiippi P G et al. Immunoscintigraphy of adenocarcinomas by means of radiolabeled F(ab')₂ fragments of an anti-carcinoembryonic antigen monodonal antibody: a muiticenter study. Cancer ReL 49: 3095-3103 (1989).

Smith. D.B., Johnson, K.S. Single-step purincation of polypetides expressed in Escherichia coli as íusions with glutaihione S-transferase. Gene 67: 31-40 (1988).

Srivastava S C (Hrsg). Radiolabeled monocional anubodies for imaging and therapy. Lije Sciences SeriesA 152, Plenům New York (1988),

Tólg, C., Honnann, M., Herriich, P., and Pouta, H. Soíicing choice from ten variant exons estabiishes CD44 variability. Nucleic Acids. Res. 21: 1225-1229 (1993).

Theuer C P, Krettman R J, FitzGeraid D J, Pastan L Immunotoxins made with a reeombinant form of pseudomonas exotoxin A that do not require prateoiysis tor activity. Cancer Res. 53: 340-347 (1993).

Thomas G D, Dykes P W, Bradweil A R. Anubodies for tumour immunodetecrion and methods for antibody radioiabeling. In: Catty D (Hrsg.). Antibodies. IRL Press Oxford, 223244 (1989), 223-244.

Thompson C H,. Stacker S A, Šáleni N, Lichtenstein M, Leydea M J, Andrews IT. Immunoscintigraphy for detection of lymoh node metastases from breast cancer. Lancet 1984 (2): 1245-1247 (1984).

Vítetta E S, Thorpe P E. Immunotoxins. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biologie therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Phiiadeíphia, 482-495 (1991)

Vítetta E S, Stone M, Amíot P, Fay J. May R, Tiil M, Newman J, Clark P, Collins R, Cunningham D, Ghetie V, Uhr J W, Thorpe P E. Phase I inununotoxin trial in pacients with Bceil lymphoma. Cancer Res. 51:4052-4058 (1991).

-14CZ 291274 B6

Wang S-M, Chem J-W, Yen M-Y, Ng J C, Tung E, Roffler S R. Specinc acrivation of glucuronide prodrugs by antibody-targeted enzyme conjugates for canccr therapy. Cancsr Res. 52:4484-4491 (1992).

WeinerJ. M, OOwyer J, Kkson J, Comis R L, Franke! A E, Bauer R J, Kopnrad M S, Groves E S. Phase I evaiuation of an anti-breast carcinoma monodonal anďoody 260F9-recombinant ridn A chain innnunoconjugate. CancerRes. 49: 4062-4067 (1989).

Wieienga, V. J. M., Heider, K.-H., Offerhaus, G. J. A, Adolf, G. R., van den Berg, F. M., Ponu, H„ Henfich, P., Pala, S.T. Expression of CD44 variant proteins in hunian colorectai cancer is reiated to tumorprcgression. CancerRes. 53: 4754-4756 (1993).

Winter, G., Grimth, A D., Hawidns, R. E., Hoogenboom, H. R Making anticodies by phage dispiay technology. Ann. Rev. Immunal. 12.433-455 (1994).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Protilátka proti epitopu v sekvenci aminokyselin, pro kterou je kódem variabilní exon v6 genu CD44, kterou je protilátka VFF-18, produkovaná buněčnou linií hybridomu DSM ACC2174.

2. Buněčná linie hybridomu DSM ACC2174.

3. Molekula protilátky, získatelná chemickou nebo enzymatickou modifikací protilátky podle nároku 1, protilátka je modifikována na fragment ze skupiny Fab nebo F (ab')₂ nebo jiné fragmenty a/nebo vázána na molekulu ze skupiny radioaktivních isotopů, enzymů, fluorescenčních barviv, molekul biotinu, toxinů, cytostatických látek, prekursorů léčiv, cytokinů a/nebo imunomodulačních peptidů.

4. Molekula protilátky podle nároku 3, která je fragmentem protilátky, podle nároku 1.

5. Molekula protilátky podle nároku 4, která je fragmentem Fab nebo F(ab')₂.

6. Molekula protilátky podle nároku 3, v níž je protilátka vázána na další molekulu ze skupiny radioaktivních isotopů, enzymů, fluorescenčních barviv, molekul biotinu, toxinů, cytostatických látek, prekursorů léčiv, cytokinů a/nebo imunomodulačních peptidů.

7. Molekula protilátky podle nároku 6, v níž je další molekulou molekula cytokinů nebo imunomodulačního peptidů.

8. Molekula protilátky podle nároku 3, která je vázána na radioaktivní isotop.

9. Rekombinantní protilátka s idiotypem protilátky podle nároku 1.

-15CZ 291274 B6

10. Rekombinantní protilátka podle nároku 9, která je chimérní, humanisovaná nebo jde o protilátku s jednoduchým řetězcem nebo vytvořenou míšením řetězců.

11. Rekombinantní protilátka podle nároku 9 nebo 10, vázána na další molekulu ze skupiny 5 radioaktivních isotopů, enzymů, fluorescenčních barviv, molekul biotinu, toxinů, cjtostatických látek, prekurzorů léčiv, cytokinů a/nebo imunomodulačních peptidů.

12. Protilátka, její derivát nebo rekombinantní molekula protilátky, rozpoznávající tentýž epitop jako protilátka podle nároku 1, přičemž tento epitop obsahuje sekvenci aminokyselin

10 QWFGNRWHEGYRQT.

13. Použití protilátky nebo molekuly protilátky podle některého z nároků 1 nebo 3 až 12 pro diagnostické účely prováděné mimo lidský nebo živočišný organismus.

15 14. Použití podle nároku 13 při němž je diagnostickou metodou imunologická zkouška s použitím enzymu nebo radioimunologická zkouška.

15. Použití podle nároku 13, při němž je diagnostickým postupem imunohistochemická zkouška.

20

16. Protilátka nebo molekula protilátky podle některého z nároků 1 nebo 3 až 12 pro farmaceutické použití.

17. Použití protilátky nebo molekuly protilátky podle některého z nároků 1 nebo 3 až 12 pro výrobu prostředku pro diagnostiku nádorů in vivo.