DE4431297A1 - Monoklonaler Antikörper gegen CD44v6 - Google Patents
Monoklonaler Antikörper gegen CD44v6Info
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Description
Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper gegen ein Epitop, das vom
varianten Exon v6 des DC44-Gens kodiert wird.
Es wurde kürzlich gezeigt, daß die Expression von Varianten des Oberflächen-Glykoproteins
CD44 notwendig und hinreichend ist, um sogenanntes spontanes metastatisches
Verhalten sowohl in einer nicht-metastasierenden Pankreas-Adenokarzinom-Zellinie der
Ratte als auch in einer nicht-metastasierenden Fibrosarkom-Zellinie der Ratte auszulösen
(Günthert et al., 1991). Während die kleinste CD44-Isoform, die Standardform CD44s
(oder CD44std), in einer Reihe verschiedener Gewebe, darunter Epithelzellen, ubiquitär
exprimiert wird, werden bestimmte Spleißvarianten von CD44 (CD44v, CD44var) nur auf
einer Untergruppe von Epithelzellen expimiert. Die CD44-Varianten werden durch alternatives
Spleißen so erzeugt, daß die Sequenzen von 10 Exons (v1-v10) in CD44s komplett
ausgeschnitten werden, jedoch in den größeren Varianten in verschiedenen Kombinationen
vorkommen können (Screaton et al., 1992; Tölg et al., 1993; Hofmann et al., 1991). Die
Varianten unterscheiden sich dadurch, daß an einer bestimmten Stelle des extrazellulären
Teils des Proteins unterschiedliche Aminosäuresequenzen inseriert sind. Solche Varianten
konnten in verschiedenen menschlichen Tumorzellen und in menschlichem Tumorgewebe
nachgewiesen werden. So wurde kürzlich die Expression von CD44-Varianten im Verlauf
der kolorektalen Karzinogenese untersucht (Heider et al., 1993a). Die Expression von
CD44-Varianten fehlt in normalem menschlichen Kolonepithel, und nur eine schwache Expression
ist in den proliferierenden Zellen der Krypten nachweisbar. In späteren Stadien der
Tumorprogression, z. B. in Adenokarzinomen, exprimieren alle malignen Entartungen
Varianten von CD44. Gewebsexpression von variantem CD44 auf hohem Niveau konnte
auch in aggressiven Non-Hodgkin-Lymphomen gezeigt werden (Koopman et al., 1993).
Eine besondere Rolle insbesondere bei der metastatischen Ausbreitung scheint das
Exon v6 zu spielen (Rudy et al., 1993). Im Tiermodell konnten Antikörper gegen v6-spezifische
Epitope die Ansiedlung metastasierender Zellen und das Wachstum von Metastasen
verhindern (Seiter et al., 1993). In Kolonkarzinomen korreliert v6-Expression mit der Tumorprogression (Wielenga et al., 1993). In Magenkarzinomen ist die v6-Expression ein
wichtiger diagnostischer Marker bei der Differenzierung zwischen Tumoren vom intestinalen
und solchen vom diffusen Typ (Heider et al., 1993b). Die v6-Expression wurde in den
beiden letztgenannten Arbeiten mit Hilfe von Antikörpern gegen v6-spezifische Epitope
gemessen.
Monoklonale Antikörper gegen Epitope, die vom Exon v6 kodiert werden, sind im
Stand der Technik bekannt (Hofmann et al., 1991, Wielenga et al., 1993). Wegen des hohen
potentiellen Nutzens, den solche Antikörper in Diagnose und Therapie haben können,
besteht ein hoher Bedarf an Antikörpern mit verbesserten Eigenschaften.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen Antikörper bereitzustellen, der
gegenüber den bekannten v6-spezifischen Antikörpern signifikant bessere Eigenschaften
aufweist.
Diese Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden. Sie betrifft einen
monoklonalen Antikörper mit der Bezeichnung VFF-18. Die Erfindung berifft ferner
eine Hybridoma-Zellinie, die diesen Antikörper sezerniert, und die unter der Hinterlegungsnummer
DSM ACC2174 bei der DSM-Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt
wurde.
Der Antikörper wurde mit einem Verfahren gemäß Beispiel 1 hergestellt. Es liegt im
Können des Durchschnittsfachmanns, Derivate des erfindungsgemäßen Antikörpers herzustellen
oder, ausgehend von einer Sequenzanalyse dieses Antikörpers und/oder unter Verwendung
der Hybridoma-Zellinie, die diesen Antikörper produziert, rekombinante Antikörper
mit dem gleichen Idiotyp zu erzeugen, d. h. Antikörpermoleküle, die im Bereich der Antigen-
Bindungsstelle die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen wie der Antikörper VFF-18.
Solche Derivate oder rekombinanten Antikörpermoleküle sind daher ausdrücklich in die Erfindung
eingeschlossen.
Aus dem kompletten Immunoglobulin des VFF-18-Antikörpers können beispielsweise
Fab- oder F(ab′)₂-Fragmente oder andere Fragmente erzeugt werden (Kreitman et al.,
1993). Für diagnostische Verfahren können VFF-18-Antikörpermoleküle, Fragmente davon
oder rekombinante Antikörpermoleküle mit dem gleichen Idiotyp beispielsweise mit radioaktiven
Isotopen wie ¹³¹I, ¹¹¹In, 99mTc oder radioaktiven Verbindungen (Larson et al.,
1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), Enzymen wie Peroxidase oder alkalischer
Phosphatase (Catty et Raykundalia, 1989), mit Fluoreszenzfarbstoffen (Johnson, 1989) oder
Biotinmolekülen (Guesdon et al., 1979) verknüpft werden. Für therapeutische Anwendungen
können VFF-18- oder VFF-18-abgeleitete Antikörpermoleküle mit Toxinen (Vitetta et
al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Theuer et al., 1993), Zytostatika
(Schrappe et al., 1992), Prodrugs (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989) oder radioaktiven
Substanzen verknüpft werden. Der Antikörper kann ferner mit einem Zytokin oder einem
anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft sein, z. B. mit Tumornekrosefaktor
oder Interleukin-2.
Der Fachmann ist weiterhin in der Lage, nach Analyse der Aminosäuresequenz des
Antikörpers VFF-18 und/oder unter Verwendung der Hybridoma-Zellinie, die diesen Antikörper
produziert, insbesondere der darin enthaltenen genetischen Information, rekombinante
Antikörpermoleküle mit dem gleichen Idiotyp wie VFF-18 herzustellen. Entsprechende
Verfahren sind Stand der Technik. Solche rekombinanten Antikörpermoleküle können z. B.
humanisierte Mausantikörper (Shin et al., 1989; Güssow et Seemann, 1991), bispezifische
Antikörper (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989), single-chain-Antikörper (scFv, Johnson
et Bird, 1991), komplette oder fragmentarische Immunglobuline (Coloma et al., 1992);
Nesbit et al., 1992; Barbas et al., 1992), durch chain shuffling erzeugte Antikörper (Winter
et al., 1994), oder Fusionsproteine, beispielsweise single-chain-Antikörper/Toxin-Fusionsproteine
(Chaudhary et al., 1990; Friedman et al., 1993) sein.
Es liegt ebenfalls im Bereich des Könnens des Durchschnittsfachmanns, das exakte
Epitop von VFF-18 zu ermitteln und mit dessen Kenntnis äquivalente Antikörper mit der
gleichen Bindungsspezifität herzustellen. Dies kann beispielsweise durch Peptidbindungsstudien wie in Beispiel 2 geschehen, etwa durch Variation des Peptids Hu1. Solche Antikörper
sind daher ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von VFF-18- oder VFF-18-
abgeleiteten oder äquivalenten Antikörpermolekülen in Diagnostik und Therapie.
Diagnostische Verfahren können an sich bekannte Verfahren unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Antikörpermoleküle sein, z. B. Enzym-gekoppelte Immunoassays
(ELISA, Catty et Raykundalia, 1989), Radioimmunoassays (Catty et Murphy, 1989) immunhistochemische
Verfahren (Heider et al., 1993b) oder Western Blots. Solche Verfahren
können zweckmäßig mit aus dem Körper entnommenen Gewebeproben oder Körperflüssigkeiten,
beispielsweise aus Biopsien, durchgeführt werden. Die Untersuchungen können
qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ erfolgen.
Eine therapeutische Anwendung kann beispielsweise analog zu der Verwendung des
Antikörpers ASML1.1 (Seiter et al., 1993) erfolgen. Dabei kann die Applikation systemisch
oder topisch erfolgen, beispielsweise durch intravenöse (als Bolus oder Dauerinfusion), intraperitoneale,
intramuskuläre, subkutane o. a. Injektion/Infusion. Es können auch einzelne
Organe oder Glieder perfundiert werden. Protokolle für die Verabreichung von konjugierten
oder nichtkonjugierten Antikörpern (sei es als komplette Immunglobuline, Fragmente,
rekombinante chimäre Moleküle o. ä.) sind Stand der Technik (Mulshine et al., 1991; Larson
et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992, Press et al.,
1989; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears et al., 1982).
Die überlegenen Eigenschaften von VFF-18 gegenüber anderen anti-CD44v6-Antikörpern
zeigen die Beispiele 2 bis 4.
Fig. 1: Schematische Darstellung des GST-CD44(v3-v10)-Fusionsproteins. GST=Glutathion-S-transferase
von Schistosoma japonicum. v3-v10=variante Insertion von
Keratinozyten-CD44. Der Pfeil markiert eine Thrombin-Spaltstelle.
Fig. 2: Sequenzvergleich von Exon v6 des CD44-Gens zwischen Mensch und
Ratte. Die Sequenzen der Peptide Ra1 und Hu1, an die die Antikörper 1.1ASML (anti-
Ratte CD44v6) und VFF-18 (anti-human CD44v6) binden, sind fett hervorgehoben. Identische
Aminosäuren sind durch einen Stern gekennzeichnet.
Fig. 3: Bindung von CD44v6-spezifischen Antikörpern an synthetische Peptide.
Die Bindung der Antikörper an die Peptide wurde in einem ELISA bestimmt, bei dem die
Peptide immobilisiert und dann mit Antikörperlösungen inkubiert wurden. Nach entsprechenden
Waschschritten wurde gebundener Antikörper mit Peroxidase-konjugiertem anti-
Maus-IgG-Antikörper nachgewiesen. (A): Im ersten Experiment wurde die Bindung des für
Ratten-CD44v6 spezifischen Antikörpers 1.1ASML an das Peptid Ra1 (KWFEN EWQGK
NPPT) nachgewiesen. (B): In einem weiteren Versuch wurde ein zu Ra1 homologes Peptid
aus der humanen CD44v6-Sequenz synthetisiert. Verschiedene anti-human-CD44v6-Hybridomüberstände
wurden an dieses Peptid Hu1 (QWFGN RWHEG YRQT) gebunden.
Dabei zeigt sich, daß VFF-18 wesentlich besser an das Peptid bindet als die übrigen eingesetzten
Antikörper. (C): Für eine quantitative Evaluierung wurde dieses Experiment mit
verschiedenen Konzentrationen von gereinigten Antikörpern wiederholt. Auch hier zeigt
sich, daß VFF-18 eine höhere Bindungsaffinität als die anderen Antikörper aufweist.
Fig. 4: Bindung radioaktiv markierter Antikörper an Tumor-Zellen. Die drei Antikörper
VFF-7 (anti-v6), VFF-8 (anti-v5) und VFF-18 (anti-v6) wurden mit N-Succinimyl[2,3-³H]propionat radioaktiv markiert und für Bindungstests an verschiedenen Tumorzellinien
eingesetzt. Folgende Zellinien wurden dabei verwendet: CHO-CD44var: rekombinante
Hamsterzellinie (Chinese Hamster Ovary), die humanes variantes CD44 (Exons v3-v10)
an der Oberfläche exprimiert; HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO 205: humane
Kolonkarzinom-Linien; A431: humane Plattenepithelkarzinom-Linie. Gezeigt ist die spezifische
Bindung der Antikörper an die verschiedenen Zellinien. Während die Bindung der v6-
spezifischen Antikörper VFF-7 und VFF-18 an die rekombinante Zellinie CHO-DC44var in
der gleichen Größenordnung liegt, zeigen die Antikörper an den Tumorzellinien sehr unterschiedliches
Bindungsverhalten. In einigen Fällen beobachtet man nur VFF-18- und in geringerem
Umfang VFF-8-Bindung (HT-29, CaCo, COLO 205), bei den anderen Zellinien
bindet VFF-18 wesentlich besser als VFF-7.
Fig. 5: Nachweis von löslichen CD44-Varianten, die das Exon v6 enthalten, in
humanem Normalserum. In einem Sandwich-ELISA wurden die drei v6-spezifischen Antikörper
VFF-4, VFF-7 bzw. VFF-18 als Beschichtungsantikörper eingesetzt. In allen drei
Fällen wurde als Nachweisantikörper ein mit Peroxidase konjugierter CD44std-spezifischer
Antikörper (BU-52, std=standard) verwendet. Gezeigt ist das Signal von zwei verschiedenen
humanen Normalseren bei unterschiedlichen Verdünnungen in diesen Tests ((A) und
(B)). In beiden Fällen ist mit VFF-18 ein wesentlich stärkeres Signal zu beobachten als mit
den beiden anderen Antikörpern.
Fig. 6: Serumwerte von v6 enthaltenden CD44-Varianten. Mit zwei verschiedenen
ELISAs wurde der Gehalt an löslichem CD44var in Seren von 6 gesunden Spendern bestimmt. In einem Test wird VFF-7, im anderen VFF-18 als Beschichtungsantikörper verwendet;
beide Antikörper erkennen das Exon v6. Als Vergleichspräparat diente in beiden
Fällen eine in CHO-Zellen hergestellte rekombinante lösliche CD44-Variante (Exon v3-v10).
Der VFF-18-ELISA zeigt im Durchschnitt um 3,5mal höhere Werte an als der VFF-7-
ELISA. Dies bedeutet, daß das im Serum vorkommende lösliche CD44var von VFF-18 besser
erkannt wird als von VFF-7.
Die gesamte variante Region des HPKII-Typs von CD44v (Hofmann et al., 1991)
wurde aus menschlicher Keratinozyten-cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
amplifiziert. Die beiden PCR-Primer
5′-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3′,
Positionen 25-52, und 5′-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3′,
Positionen
1013-984 der LCLC97-varianten Region, wie von Hofman et al. beschrieben, enthielten
eine EcoRI-Erkennungsstelle, die benutzt wurde, um das PCR-Produkt direkt in den Vektor
pGEX-2T (Smith et al., 1988) zu klonieren. Das resultierende Konstrukt (pGEX CD44v
HPKII, v3-v10) kodiert für ein Fusionsprotein von ∼70 kD, bestehend aus Glutathion-S-
transferase von Schistosoma japonicum und den Exons v3-v10 von humanem CD44 (Fig. 1;
Heider et al., 1993a). Das Fusionsprotein wurde in E. coli exprimiert und anschließend über
Glutathion-Agarose affinitätsgereinigt (Smith et al., 1988).
Weibliche Balb/c-Mäuse wurden intraperitoneal mit dem affinitätsgereinigten Fusionsprotein
nach folgendem Schema immunisiert:
1. Immunisierung= 90 µg Fusionsprotein in komplettem Freund'schen Adjuvans,
2. und 3. Immunisierung= 50 µg Fusionsprotein in inkomplettem Freund'schen Adjuvans.
2. und 3. Immunisierung= 50 µg Fusionsprotein in inkomplettem Freund'schen Adjuvans.
Die Immunisierungen erfolgten im Abstand von jeweils 4 Wochen. 14 Tage nach der
letzten Immunisierung wurden die Tiere noch an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit jeweils
10 µg Fusionsprotein in PBS immunisiert. Am darauffolgenden Tag wurden Milzzellen
eines Tieres mit hohem Antikörpertiter mit P3.X63-Ag8.653-Mausmyelomzellen mit
Hilfe von Polyethylenglycol 4000 fusioniert. Die Hybridomzellen wurden dann in Mikrotiterplatten
in HAT-Medium selektioniert (Köhler et Milstein, 1975; Kearney et al., 1979).
Die Bestimmung des Antikörpertiters bzw. Serum bzw. das Screening der Hybridomüberstände
wurde mit Hilfe eines ELISAs durchgeführt. Bei diesem Test wurden zunächst
Mikrotiterplatten mit Fusionsprotein (GST-CD44v3-10) oder nur mit Glutathion-S-transferase
beschichtet. Anschließend wurde mit seriellen Verdünnen von Serumproben bzw.
Hybridomüberständen inkubiert und die spezifischen Antikörper mit Peroxidase-konjugierten
Antikörpern gegen Maus-Immunglobulin nachgewiesen. Hybridome, die nur mit
Glutathion-S-transferase reagierten, wurden verworfen. Die verbleibenden Antikörper wurden
zunächst in einem ELISA mit domänenspezifischen Fusionsproteinen (Exon v3, Exon
v5 + v6, Exon v6 + v7, Exon v8-v10) charakterisiert (Koopman et al., 1993). Ihre immunhistochemische
Reaktivität wurde an menschlichen Hautschnitten getestet. Der Antikörper
VFF-18 wurde dann über Bindung an das synthetische Peptid Hu1 (QWFGN
RWHEG YRQT) identifiziert. Die Sequenz von Hu1 ist ein Fragment des humanen CD44-
Exons v6.
Die Bindung CD44v6-spezifischer Antikörper an synthetische Peptide wurde in einem
ELISA bestimmt.
Lösungen | |
Beschichtungspuffer: | |
0,05 M Natriumcarbonat pH 9,6 | |
Assay-Puffer: | PBS (Phosphate Buffered Saline |
0,5% BSA (Rinderserumalbumin) | |
0,05% Tween 20 | |
Substratlösung: | Fa. Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg MD, USA; TMB Peroxidase Substrat: Peroxidase Lösung B (H₂O₂) 1 : 1 |
Die Peptide (50 µg/ml in Beschichtungspuffer) wurden an NUNC Maxisorp Immunoplatten
(1.1ASML) oder Acti-A-Platten der Fa. Bio Products (VFF-Antikörper) bei
4°C über Nacht immobilisiert. Bei den Acti-A-Platten wird das Peptid kovalent an die Platte
gebunden. Anschließend wurde mit PBS/0,05% Tween gewaschen, freie Adsorptionsstellen
an der Plattenoberfläche mit Assay-Puffer blockiert (1 Stunde bei Raumtemperatur), und
wiederum einmal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Acti-A-Platten wurden nach dem
Blockieren mit 10 mM Natriumborhydrid in 20 mM Natriumhydrogencarbonat, pH 9,0,
reduziert (1 Stunde bei Raumtemperatur schütteln) und anschließend dreimal mit
PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Dann wurden Hybridomüberstände bzw. Antikörperlösungen
in Assay-Puffer in Konzentrationen zwischen 0,02 und 10,0 µg/ml in die Näpfe
gegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur in einem Plattenschüttler inkubiert. Daran
schlossen sich drei Waschschritte mit PBS/0,05% Tween 20 an. Dann wurden 100 µl/Napf
mit Meerettichperoxidase konjugierter anti-Maus-IgG-Antikörper in einer geeigneten Verdünnung
in Assay-Puffer zugesetzt. Nach zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur am
Plattenschüttler wurde dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen und mit Substratlösung
gefärbt. Nach 10-15 min Entwicklung wurde mit 2 M Schwefelsäure gestoppt, und die
Absorption bei 450 nm (Referenz 690 nm) am Photometer gemessen.
In einem ersten Experiment wurde die Bindung des für Ratten-CD44v6-spezifischen
Antikörpers 1.1ASML an das Peptid Ra1 (KWFEN EWQGK NPPT) nachgewiesen
(Tabelle 1, Fig. 3(A)).
In einem weiteren Versuch wurde ein dem Ra1 homologes Peptid aus der humanen
CD44v6-Sequenz synthetisiert (Hu1, QWFGN RWHEG YRQT). Verschiedene anti-human-
CD44v6-Antikörper wurden an Hu1 gebunden. Dabei zeigt sich, daß VFF-18 eine
überraschend höhere Bindungsaffinität aufweist als alle anderen eingesetzten Antikörper
(Tabelle 2, Fig. 3(B)).
Zur quantitativen Evaluierung wurden außerdem gereinigte anti-human-CD44v6-
Antikörper in verschiedenen Konzentrationen an das Peptid Hu-1 gebunden. Auch hier zeigt
sich die deutlich bessere Bindungsaffinität im Vergleich mit den anderen Antikörpern
(Tabelle 3, Fig. 3(C)).
1 mCi N-Succinimidyl-[2,3-³H]-propionat ([³H]-NSP, Amersham 1 mCi/ml) wurden in einem
silikonisierten Probenröhrchen bei 0°C am Wasserstrahlvakuum bis fast zur Trockne
eingedamft. 15 µg Antikörper (1 mg/ml in PBS, pH 7,4) wurden eingesetzt und 48 Stunden
lang bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde überschüssiges [³H]-NSP durch Reaktion mit
30 µl 1M Glycin in PBS (20 min bei Raumtemperatur) abgefangen. Die Abtrennung des
markierten Antikörpers vom (³H]-Glycin erfolgte über eine Sephadex-G-25-M-Säule
(Säulenvolumen 15 ml), wobei als Laufpuffer PBS/0,5% BSA verwendet wurde. Der [³H)-
markierte Antikörper erscheint im Ausschlußvolumen. Die Menge an Antikörper wurde in
einem ELISA zur Detektion von Mäuseimmunglobulin bestimmt und die spezifische Aktivität
errechnet.
Die drei Antikörper VFF-7 (anti-v6), VFF-8 (anti-v5) und VFF-18 (anti-v6) wurden
mit N-Succinimidyl-[2,3-³H]propionat radioaktiv markiert und für Bindungstests an verschiedenen
Tumorzellinien eingesetzt. Folgende Zellinien wurden dabei verwendet: CHO-
CD44var: rekombinante Hamsterzellinie (Chinese Hamster Ovary), die humanes variantes
CD44 (Exons v3-v10) an der Oberfläche exprimiert; HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo,
COLO 205: humane Kolonkarzinom-Linien; A431: humane Plattenepithelkarzinom-Linie.
Die Zellen wurden in 12-Loch-Gewebekulturplatten angesetzt, über Nacht bei 37°C
im CO₂-Brutschrank inkubiert, anschließend einmal mit PBS gewaschen und mit Ethanol
fixiert (1 min bei Raumtemperatur). Dann wurde einmal mit Kulturmedium (RPMI
1640/10% fötales Kälberserum) gewaschen und der radioaktive Antikörper (250 000 dpm/Napf
in Kulturmedium) gebunden. Nach einer Inkubation von 25 Stunden bei Raumtemperatur
am Plattenschüttler wurde dreimal mit PBS/0,5% BSA gewaschen, die Zellen
mit 0,1 M NaOH/1% Triton X-100 solubilisiert und die Radioaktivität im Szintillationszähler
gemessen. Unspezifische Bindung wurde in Anwesenheit von einem 100fachen Überschuß
unmarkiertem Antikörper bestimmt. Die Bindung wurde auf eine einheitliche Zellzahl
(400 000 Zellen) bezogen. Nach Bestimmung der spezifischen Aktivität der Antikörper
kann die gebundene Antikörpermenge in fmol ausgedrückt werden.
Tabelle 4 und Fig. 4 zeigen die spezifische Bindung der Antikörper an die verschiedenen
Zellinien. Während die Bindung der v6-spezifischen Antikörper VFF-7 und
VFF-18 an die rekombinante Zellinie CHO-CD44var annähernd gleich ist, zeigen die Antikörper
an den Tumorzellen sehr unterschiedliches Bindungsverhalten. In einigen Fällen
beobachtet man nur VFF-18- und in geringerem Umfang VFF-8-Bindung (HT-29, CaCo,
COLO 205), bei den anderen Zellinien bindet VFF-18 wesentlich besser als VFF-7.
Lösungen | |
Beschichtungspuffer: | |
0,05 M Natriumcarbonat pH 9,6 | |
Assay-Puffer: | PBS (Phosphate Buffered Saline |
0,5% BSA (Rinderserumalbumin) | |
0,05% Tween 20 | |
Sample Diluent | Fa. Bender MedSystems, Wien, Österreich |
Substratlösung | Fa. Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA; TMB Peroxidase Substrat: Peroxidase-Lösung B (H₂O₂) 1 : 1 |
Mikrotiterplatten (Nunc-Immunoplate MaxiSorp F96) wurden mit 5 µg/ml eines der
CD44v6-spezifischen Antikörper beschichtet (Inkubation bei 4°C über Nacht). Anschließend
wurde mit PBS/0,05% Tween gewaschen, freie Adsorptionsstellen an der Plattenoberfläche
mit Assay-Puffer blockiert (1 Stunde bei Raumtemperatur), und wiederum einmal
mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Die Serumproben wurden dann mindestens 1 : 5
in Sample Diluent vorverdünnt und in seriellen 1 : 2-Verdünnungen in der Platte in Sample
Diluent weiterverdünnt. Anschließend wurden 50 µl/Napf mit Meerettichperoxidase konjugierter
anti-CD44std-Antikörper (Klon BU-52, The Binding Site, Birmingham) in einer
geeigneten Verdünnung (1 : 3000-1 : 10 000) in Assay-Puffer zugesetzt. Nach dreistündiger
Inkubation bei Raumtemperatur am Plattenschüttler wurde dreimal mit PBS/0,05% Tween
20 gewaschen und mit Substratlösung gefärbt. Nach 10-15 min Entwicklung wurde mit 2M
Schwefelsäure gestoppt, und die Adsorption bei 450 nm (Referenz 690 nm) am Photometer
gemessen.
Zur Quantifizierung wurde eine serielle Verdünnung in Assay-Puffer eines löslichen
CD44-Standardpräparates parallel zu den Serumproben aufgelegt. Dieses Präparat wurde
aus einem Überstand von rekombinanten Hamster-Zellen (CHO) aufgereinigt, die lösliches
CD44v3-v10 exprimieren. Bei CD44v3-v10 handelt es sich um eine humane CD44-Variante,
die durch die Exons v3 bis v10 kodierte Peptidsequenzen enthält.
Tabelle 5 und Fig. 5 zeigen den Nachweis von löslichen CD44-Varianten, die das
Exon v6 enthalten, in humanem Normalserum. In einem Sandwich-ELISA wurden die drei
v6-spezifischen Antikörper VFF-4, VFF-7 bzw. VFF-18 als Beschichtungsantikörper eingesetzt.
In allen drei Fällen wurde als Nachweisantikörper ein mit Peroxidase konjugierter
CD44std-spezifischer Antikörper (BU-52, std=standard) verwendet. Gezeigt ist das Signal
von zwei verschiedenen humanen Normalseren bei unterschiedlichen Verdünnungen in diesen
Tests. In beiden Fällen ((A) und (B)) ist mit VFF-18 ein wesentlich stärkeres Signal zu
beobachten als mit den beiden anderen Antikörpern.
Tabelle 6 und Fig. 6 zeigen Serumwerte von v6 enthaltenden CD44-Varianten. Mit
zwei verschiedenen ELISAs wurde der Gehalt an löslichem CD44var in Seren von 6 gesunden
Spendern bestimmt. In einem Test wurde VFF-7, im anderen VFF-18 als Beschichtungsantikörper
verwendet; beide Antikörper erkennen das Exon v6. Als Vergleichspräparat
diente in beiden Fällen eine in CHO-Zellen hergestellte rekombinante lösliche CD44-Variante
(Exon v3-v10). Der VFF-18-ELISA zeigt im Durchschnitt um 3,5mal höhere Werte an
als der VFF-7-ELISA. Dies bedeutet, daß das im Serum vorkommende lösliche CD44var im
Vergleich zum rekombinanten Protein von VFF-18 besser erkannt wird als von VFF-7.
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Claims (15)
1. Antikörper gegen ein Epitop innerhalb der Aminosäuresequenz, die durch das
variable Exon v6 des CD44-Gens kodiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß es der Antikörper
VFF-18 ist, der von der Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM
ACC2174 gebildet wird.
2. Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2174.
3. Antikörper-Derivat, erhältlich durch chemische oder enzymatische Modifikation
eines Antikörpers gemäß Anspruch 1.
4. Antikörper-Derivat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fragment
eines Antikörpers gemäß Anspruch 1 ist.
5. Antikörper-Derivat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fab-
oder ein F(ab′)₂-Fragment ist.
6. Antikörper-Derivat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper
mit einem anderen Molekül verknüpft ist.
7. Antikörper-Derivat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das andere
Molekül ein Polypeptid ist.
8. Antikörper-Derivat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper
mit einem radioaktiven Isotop verknüpft ist.
9. Rekombinanter Antikörper mit dem Idiotyp eines Antikörpers gemäß Anspruch
1.
10. Rekombinanter Antikörper nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es
ein chimärer, humanisierter, Einzelketten(single-chain)- oder durch chain shuffling erzeugter
Antikörper ist.
11. Antikörper, der das gleiche Epitop erkennt wie der Antikörper gemäß Anspruch
1.
12. Verwendung eines Antikörpers oder Antikörper-Derivats gemäß einem der Ansprüche
1 oder 3 bis 11 zu diagnostischen Verfahren außerhalb des menschlichen oder tierischen
Körpers.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ein
Enzym-gekoppelter Immunoassay oder ein Radioimmunoassay ist.
14. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ein
immunhistochemisches Verfahren ist.
15. Antikörper oder Antikörper-Derivat nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 11
zur pharmazeutischen Verwendung.
Priority Applications (33)
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---|---|---|---|
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KR1019960706939A KR100379217B1 (ko) | 1994-06-08 | 1995-06-02 | CD44v6에대한모노클로날항체 |
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ES95922496T ES2151603T3 (es) | 1994-06-08 | 1995-06-02 | Anticuerpo monoclonal contra cd44v6. |
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BR9507964A BR9507964A (pt) | 1994-06-08 | 1995-06-02 | Anticorpos monoclonais contra CD 44v6 |
AU27370/95A AU701885C (en) | 1994-06-08 | 1995-06-02 | Monoclonal antibody active against CD44v6 |
JP50035496A JP3387929B2 (ja) | 1994-06-08 | 1995-06-02 | CD44v6に対するモノクローナル抗体 |
DE59508864T DE59508864D1 (de) | 1994-06-08 | 1995-06-02 | MONOKLONALER ANTIKÖRPER GEGEN CD44v6 |
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