MX2013012384A - Variones de virus adeno-asociados con capside variante y sus metodos de uso. - Google Patents

Variones de virus adeno-asociados con capside variante y sus metodos de uso.

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MX2013012384A
MX2013012384A MX2013012384A MX2013012384A MX2013012384A MX 2013012384 A MX2013012384 A MX 2013012384A MX 2013012384 A MX2013012384 A MX 2013012384A MX 2013012384 A MX2013012384 A MX 2013012384A MX 2013012384 A MX2013012384 A MX 2013012384A
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Ryan R Klimczak
James T Koerber
John G Flannery
Deniz Dalkara Mourot
Meike Visel
Leah C Byrne
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Univ California
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Abstract

La presente invención proporciona viriones de virus adeno-asociados (AAV) con proteína cápsida alterada, en donde los viriones AAV exhiben mayor infectividad de células retinales, cuando se administran a rayes de inyección intravítrea, comparado con AAV de tipo silvestre. La presente descripción además proporciona métodos para suministrar un producto de gen a una célula retinal en un individuo, y métodos para tratar enfermedades oculares.

Description

V1RI0NES DE VIRUS APENO-ASOCIADO CON CAPSIDE VARIANTE Y SUS METODOS DE USO REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense N.° 61 /478,355, presentada el 22 de abril de 201 1 , que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
DECLARACIÓN CON RELACIÓN A I NVESTIGACIÓN CON FINANCI AMIENTO FEDERAL Esta invención se hizo con el apoyo del gobierno conforme a la concesión N.° EY016994-02 y EY1 018241 otorgadas por el Instituto Nacional del Ojo del Instituto Nacional de Salud. El gobierno tiene determinados derechos con respecto a la invención.
Antecedentes Los fotorreceptores son las primeras neuronas en la retina en recibir y procesar la información visual, convirtiendo la radiación electromagnética visible en respuestas hiperpolarizadas mediante fototransducción. La mayoría abrumadora de enfermedades retinianas heredadas tienen como resultado la pérdida de estas células, ya sea de forma directa, como en mutaciones dominantes que afectan el plegamiento de proteínas a la rodopsina, o de forma indirecta, tal como en mutaciones recesivas que afectan las vías de reciclado retiniano en el epitelio pigmentario retinal (RPE).
El AAV pertenece a la familia Parvoviridae y al género dependovirus, cuyos miembros requieren la infección conjunta con un virus auxiliar tal como el adenovirus para promover la replicación y el AAV establece una infección latente en la ausencia de un auxiliar. Los viriones están compuestos de una cápside icosahédrica de 25 nm que comprende un genoma de DNA monocatenario de 4.9 kb con dos marcos de lectura abiertos: rep y cap. El gene rep no estructural codifica cuatro proteínas reguladoras esenciales para la replicación viral, mientras que cap codifica tres proteínas estructurales (VP1-3) que unidas forman un armazón de cápside de 60 meros. Esta cápside viral media la capacidad de los vectores de AAV de superar varias de las barreras biológicas de la transducción viral, que incluye la unión del receptor de superficie celular, endocitosis, tráfico intracelular y desempaquetamiento en el núcleo.
Bibliografía: Publicación de patente estadounidense N.° 2005/0053922; publicación de patente estadounidense N.°2009/0202490; Allocca et al. (2007) J. Virol. 81:11372; Boucas et al. (2009) J. Gene Med. 11:1103.
Breve descripción de la invención La presente descripción proporciona viriones del virus adenoasociado (AAV) con proteína de cápside alterada, donde los viriones de AAV exhiben una mayor infectividad de una célula de la retina, cuando se administra mediante inyección intravítrea, en comparación con el AAV de tipo salvaje. La presente descripción proporciona además métodos de administración de un producto génico a una célula de la retina en un individuo y métodos para tratar la enfermedad ocular.
Breve descripción de los dibujos La Figura 1 proporciona un modelo tridimensional representativo de AAV2 que contiene un heptámero aleatorio que sigue al aminoácido 587.
La Figura 2 describe mayores niveles de transducción intravítrea mediante la variante AAV2 7M8 (derecha), con respecto a AAV2 (izquierda).
La Figura 3 proporciona imágenes de fluorescencia representativas de crioimágenes de retinas que muestran la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) que resulta de 7M8 que lleva el gene de GFP bajo el control del promotor CAG ampliamente extendido (izquierda) o un promotor Rho específico del fotorreceptor (derecha).
La Figura 4 describe las células fotorreceptoras GFP+ por millón de células de retina contadas por citometría de flujo, luego de la transducción mediante 7M8 o mediante 7M8 que tiene 4 mutaciones de tirosina (7m8.4YF).
La Figura 5 proporciona una secuencia de aminoácidos AAV2 VP1 (SEQ I D NO: 1 ).
La Figura 6 proporciona secuencias de aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 570-61 0 de AAV2 (Figura 5) de la proteína VP 1 de la cápside de AAV de varios serotipos de AAV.
Las Figuras 7A-I describen mejoras estructurales en Rs 1 h-I-retina de ratón después de la transferencia génica.
Las Figuras 8A-D describen el rescate funcional de las ondas A y B del electrorretinograma luego de la admi nistración del gene RS 1 .
Las Figuras 9A-E describen mejoras sostenidas en el espesor de la retina , medido a los 1 0 meses luego del tratamiento con 7m8-rho-RS 1 .
La Fig ura 1 0 proporciona una secuencia de aminoácidos de retinosquisina.
La Figura 1 1 proporciona una secuencia de aminoácidos del factor neurotrófico derivado del cerebro.
La Fig ura 1 2 proporciona una secuencia de aminoácidos de RPE65.
Las Figuras 1 3A-C proporcionan la secuencia de nucleótidos de la construcción 7m8-rho-RS 1 .
La Figura 14 proporciona una secuencia de aminoácidos de periferina-2.
La Figura 1 5 proporciona una secuencia de aminoácidos de periferina.
La Figura 16 proporciona una secuencia de aminoácidos de la proteína 1 que interactúa por regulador de la GTPasa de retinitis pigmentaria.
Las Figuras 17A-C proporcionan un alineamiento de secuencias de aminoácidos de regiones del bucle IV (bucle GH) de la proteína de la cápside del AAV. Los sitios de inserción se muestran en negrita y subrayado.
Las Figuras 18A-C proporcionan un alineamiento de secuencias de aminoácidos de regiones del bucle GH de la proteína de la cápside del AAV, con inserciones de péptidos heterólogos.
La Figura 1 9 proporciona una imagen de fondo de fluorescencia que muestra la expresión GFP en la retina primaria central 9 semanas luego de la administración de 7m8que lleva el GFP bajo el control de un promotor connexin36.
Definiciones El término "célula de retina" se puede referir en la presente a cualquiera de los tipos de célula que comprende la retina, tal como células ganglionares de la retina, células amacrinas, células horizontales, células bipolares y células fotorreceptoras que incluyen bastones y conos, células Müller gliales y epitelio pigmentario de la retina.
"AAV" es una abreviatura para el virus adenoasociado, y puede ser utilizado para referirse al propio virus o a derivados de este. El término cubre todos los subtipos y tanto a las formas de origen natural como a las recombinantes, excepto cuando se requiere de otra forma. La abreviatura "rAAV" se refiere al virus adenoasociado recombinante, también denominado vector AAV recombínante (o "vector rAAV").EI término "AAV" incluye AAV de tipo 1 (AAV-1), AAV de tipo 2 (AAV-2), AAV de tipo 3 (AAV-3), AAV de tipo 4 (AAV-4), AAV de tipo 5 (AAV-5), AAV de tipo 6 (AAV-6), AAV de tipo 7 (AAV-7), AAV de tipo 8 (AAV-8), AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV primate, AAV no primate y AAV ovino. "AAV primate" se refiere al AAV que infecta a primates, "AAV no primate" se refiere al AAV que infecta a mamíferos no primates, "AAV bovino" se refiere al AAV que infecta a mamíferos bovinos, etc.
Las secuencias genómicas de varios serotipos de AAV, así como las secuencias de las repeticiones terminales (TR) nativas, proteínas Rep y subunidades de la cápside se conocen en la técnica. Tales secuencias pueden encontrarse en la bibliografía o en bases de datos públicas tales como GenBank. Véase, por ejemplo, los números de registro de GenBank NC_002077 (AAV-1), AF063497 (AAV-1), NC_001401 (AAV-2), AF043303 (AAV-2), NC_001729 (AAV-3), NC_001829 (AAV-4), U89790 (AAV-4), NC_006152 (AAV-5), AF513851 (AAV-7), AF513852 (AAV-8) y NC_006261 (AAV-8); las descripciones de las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia para enseñar sobre secuencias de ácidos nucleicos del AAV y de aminoácidos. Véase también, por ejemplo, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73:1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Morís et al. (2004) Virology 33:375- 383; las publicaciones de patentes internacionales WO 00/28061 , WO 99/61601 , WO 98/1 1244; y la patente estadounidense 6.1 56.303.
Un "vector rAAV" tal como se usa en la presente se refiere a un vector AAV que comprende una secuencia de polinucleótidos no de origen de AAV (es decir, un polinucleótido heterólogo a AAV), típicamente una secuencia de interés para la transformación genética de una célula. En general, el polinucleótido heterólogo se encuentra flanqueado por al menos una, y generalmente por dos, secuencias de repetición terminal invertida (ITR). El término vector de rAAV comprende ambas partículas del vector rAAV y los plásmidos del vector rAAV. Un vector rAAV puede ser mbnocatenario (ssAAV) o autocomplementario (scAAV).
Un "virus AAV" o "partícula viral AAV" o "partícula de vector rAAV" se refiere a una partícula viral compuesta de al menos una proteína de la cápside de AAV (típicamente por todas las proteínas de la cápside de un AAV de tipo salvaje) y un vector de rAAV de polinucleótido encapsidado.Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido diferente del genoma de AAV de tipo salvaje tal como un transgén que va a ser administrado en una célula de mam ífero), típicamente se refiere como una "partícula del vector de rAAV" o simplemente un "vector de rAAV". Por lo tanto, la producción de la partícula de rAAV incluye necesariamente la producción del vector de rAAV, dado que tal vector se encuentra contenido dentro de una partícula de rAAV.
"Empaquetamiento" se refiere a una serie de eventos intracelulares que tienen como resultado la unión y encapsidación de una partícula de AAV.
Los genes "rep" y "cap" del AAV se refieren a secuencias de polinucleótidos que codifican la replicación y encapsidación de proteínas de virus adenoasociados. Los rep y cap del AAV se refieren en la presente como "genes de empaquetamiento" del AAV.
Un "virus auxiliar" para AAV se refiere a un virus que permite que el AAV (por ejemplo, AAV de tipo salvaje) sea replicado y empaquetado por una célula de mamífero. Una variedad de tales virus auxiliares para AAV son conocidos en la técnica, e incluyen adenovirus, herpesvirus y poxvirus tales como vaccinia.Los adenovirus abarcan una cantidad de diferentes subgrupos, aunque el adenovirus de tipo 5 del subgrupo C es el que se utiliza más comúnmente. Una gran cantidad de adenovirus de origen humano, no humano, mam ífero y aviar son conocidos y se encuentran disponibles en depósitos tales como el ATCC. Los virus de la familia del herpes incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (HSV) y virus Epstein-Barr (EBV), así como citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorrabia (PRV); que también se encuentran disponibles en depósitos tales como ATCC.
"La o las funciones del virus auxiliar" se refiere a la o las funciones codificadas en un genoma de virus auxiliar que permite la replicación y empaquetamiento del AAV (junto con otros requerimientos para la replicación y empaquetamiento descritos en la presente). Tal como se describe en la presente, la "función del virus auxiliar" se puede proporcionar en una cantidad de maneras, que incluye proporcionar el virus auxiliar o proporcionar, por ejem plo, secuencias de pol inucleótidos que codifican la o las funciones requeridas a una célula productora en trans. Por ejemplo, un plásmido y otro vector de expresión que comprende secuencias de nucleótidos que codifican una o más proteínas adenovirales se transfecta en una célula productora junto con un vector de rAAV.
Un virus o partícula viral "infecciosa" es una que com prende una cápside viral un ida de forma competente y es capaz de admin istrar un componente polinucleótido en una célula para la cual la especie viral es trópica. El térm ino no necesariamente implica cualq uier capacidad del virus de replicación . Los ensayos para contar partícu las virales infecciosas se describen en otra parte en esta descripción y en la técnica. La infectividad viral se puede expresar como la relación de partículas virales infecciosas con respecto a partículas virales totales. Los métodos para determinar la relación de la partícula viral infecciosa con respecto a la partícula viral total se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Grainger et al . (2005) Mol. Ther. 1 1 : S337 (describiendo un ensayo de titulación infeccioso de TCI D50); y Zolotukhin et al . ( 1 999) Gene Ther. 6: 973. Véase también los Ejemplos.
Un virus "com petente a la replicación" (por ejemplo, un AAV competente a la replicación) se refiere a un virus fenotípicamente de tipo salvaje que es infeccioso, y también es capaz de replicarse en una célula infectada (es decir, en presencia de un virus auxiliar o funciones de virus auxil iar) . En el caso de AAV, la competencia de la replicación generalmente req uiere la presencia de genes de em paquetamiento de AAV funcionales. En general, los vectores de rAAV tal como se describen en la presente son incompetentes a la replicación en células mamíferas (especialmente en células humanas) en virtud de la falta de uno o más genes de empaquetamiento de AAV. Típicamente, tales vectores de rAAV carecen de toda secuencia de empaquetamiento de genes de AAV para minimizar la posibilidad de que los AAV con competencia de replicación se generen por recombinación entre genes de empaquetamiento de AAV y un vector de rAAV entrante. En muchas modalidades, las preparaciones del vector de rAAV tal como se describen en la presente son aquellas que contienen muy pocos, o ninguno, AAV con competencia de replicación (rcAAV, también denominado RCA) (por ejemplo, menos de alrededor de 1 rcAAV por 1 02 de partículas rAAV, menos de alrededor de 1 rcAAV por 104 de partículas rAAV, menos de alrededor de 1 rcAAV por 108 de partículas rAAV, menos de alrededor de 1 rcAAV por 1012 de partículas rAAV, o sin rcAAV).
El término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que incluye desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de estos. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, y pueden ser interrumpidos por componentes no nucleótidos. De estar presentes, las modificaciones a la estructura del nucleótido se pueden impartir antes o después del ensamblado del polímero. El término polinucleótido, tal como se usa en la presente, se refiere de manera intercambiable a moléculas monocatenarias y de doble cadena. A menos que se especifique o se requiera de otro modo, toda modalidad de la invención descrita en la presente que sea un polinucleótido abarca tanto la forma de doble cadena como cada una de las dos formasmonocatenarias complementarias conocidas o de las que se predice que constituyen la forma de doble cadena.
Las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos pueden realizarse en condiciones de "rigurosidad" diferente. Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son muy conocidas y se encuentran publicadas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989, la cual se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Por ejemplo, véase la página 7.52 de Sambrook et al. Ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de aumento de rigurosidad):temperaturas de incubación de 25 °C, 37°C, 50°C y 68°C; concentraciones de amortiguador de 1 0 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0, 1 x SSC (donde 1 x SSC es NaCI 0, 1 5 M y amortiguador de citrato 15 mM ) y sus equivalentes utilizando otros sistemas de amortiguación; concentraciones de formamida de 0%, 25%, 50% y 75%; tiempos de incubación desde 5 minutos a 24 horas; 1 , 2, o más etapas de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1 , 2 o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0, 1 x SSC o agua desionizada. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación a 50°C o más y 0, 1 xSSC (cloruro de sodio 15 mM/citrato de sodio 1 ,5 mM).Otro ejemplo de las condiciones de hibridación rigurosas es la incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende: formamida al 50%, 1 ? SSC (NaCI 150 m , citrato de sodio de 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 9/??^ß DNA de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado, seguido de lavado de los filtros en 0,1 * SSC a alrededor de 65°C.Como otro ejemplo, las condiciones de hibridación rigurosas comprenden: prehibridación desde 8 horas a toda la noche a 65 °C en una solución que comprende 6X de citrato de una sola concentración (SSC) (1X SSC es NaCI 0,15 M, citrato de Na 0,015 M; pH 7,0), 5X de solución de Denhardt, pirofosfato de sodio al 0,05% y DNA de esperma de arenque 100 pg/ml; hibridación durante 18-20 horas a 65°C en una solución que contiene 6X SSC, 1X de solución de Denhardt, TRNA de levadura 100 pg/ml y pirofosfato de sodio al 0,05% ; y lavado de filtros a 65°C durante 1 h en una solución que contiene 0,2X SSC y SDS al 0,1%dodecil sulfato sódico).
Las condiciones de hibridación rigurosas son condiciones de hibridación que son al menos tan rigurosas como las condiciones representativas anteriores. Otras condiciones de hibridación rigurosas son conocidas en la técnica y también pueden ser empleadas para identificar ácidos nucleicos de esta modalidad particular de la invención.
"Tm" es la temperatura en grados Celsius en el que 50% de un dúplex polinucleotido hecho de cadenas complementarias unidas por hidrógeno en dirección anti-paralela por emparejamiento de base Watson-Crick se disocian en cadenas simples en condiciones del experimento. Tm se puede predecir de acuerdo con una fórmula estándar, tal como: Tm = 81 ,5 + 16,6 log[X+] + 0,41 (%G/C) - 0,61 (%F) - 600/L donde [X+] es la concentración de cationes (usualmente ion de sodio, Na+) en mol/L; (%G/C) es el número de residuos G y C como un porcentaje del total de residuos en el dúplex; (%F) es el porcentaje de formamida en solución (peso/vol); y L es el número de nucleótidos en cada cadena del dúplex.
Un polinucleótido o polipéptido tiene un determinado porcentaje de "identidad de secuencia" con respecto a otro polinucleótido o polipéptido, lo que significa que, cuando se encuentra alineado, ese porcentaje de bases o aminoácidos son los mismos cuando se comparan las dos secuencias. La similitud entre secuencias se puede determinar en un número de diferentes maneras. Para determinar la identidad de secuencia, las secuencias se pueden alinear utilizando los métodos y programas de computadora que incluyen BLAST, disponibles en el sitio web ncbi. nlm . nih.gov/BLAST/. Otro algoritmo de alineamiento es FASTA, disponible en el paquete de Genetics Computing Group (GCG), de Madison , Wisconsin , EUA, una subsidiaria propiedad de Oxford Molecular Group, Inc. Otras técnicas para el alineamiento se describen en Methods in Enzymology, vol. 266:Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis ( 1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc. , una sección de Harcourt Brace & Co. , San Diego, California, EUA. Los programas de alineamiento que permiten espacios en la secuencia son de particular interés. El Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite espacios en alineamientos de secuencia. Véase Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Además, se puede utilizar el programa GAP que utiliza el método de alineamiento de Needleman y Wunsch para alinear secuencias. Véase J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) Es de interés el programa Bestfit que usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 ( 1 981 ) para determinar la identidad de secuencia. La pena por la generación de espacio generalmente variará entre 1 y 5, usualmente entre 2 y 4 y en muchas modalidades será 3. La pena por la extensión de espacio generalmente oscilará entre alrededor de 0,01 y 0,20 y en muchas ocasiones será 0, 10. El programa tiene parámetros predeterminados por las secuencias ingresadas para ser comparadas. Preferentemente, la identidad de secuencia se determina utilizando los parámetros por defecto determinados por el programa. Este programa se encuentra disponible del paquete Genetics Computing Group (GCG), de Madison, Wisconsin, EUA.
Otro programa de interés es el algoritmo FastDB. Se describe FastDB en Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, páginas 1 27-149, 1988, Alan R. Liss, Inc. El porcentaje de identidad de secuencia se calcula por FastDB basándose en los siguientes parámetros: Penalización por mal emparejamiento: 1 ,00; Penalización por hueco: 1 ,00; Penalización por tamaño de hueco: 0,33; y Penalización de unión: 30,0.
Un "gene" se refiere a un polinucleótido que contiene al menos un marco de lectura abierto que es capaz de codificar una proteína particular luego de ser transcrita y traducida.
Un "producto génico" es una molécula que resulta de la expresión de un gene particular. Los productos de genes incluyen, por ejemplo, un polipéptido, un aptámero, un RNA de interferencia, un mRNA y similares.
Un "RNA pequeño de interferencia" o "RNA de interferencia corto" es un dúplex de RNA de nucleotidos que se dirige a un interés génico (un "gen objetivo"). Un "dúplex de RNA" se refiere a la estructura formada por el emparejamiento complementario entre dos regiones de una molécula de RNA. Se dice que siRNA se "dirige" a un gene porque la secuencia de nucleotidos de la parte dúplex del siRNA es complementaria con una secuencia de nucleotidos del gene objetivo. En algunas modalidades, la longitud del dúplex de siRNA es de menos de 30 nucleotidos. En algunas modalidades, el dúplex puede tener 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 , 20, 19, 1 8, 17, 16, 1 5, 14, 1 3, 12, 1 1 o 10 nucleotidos de longitud. En algunas modalidades, la longitud del dúplex es de 19-25 nucleotidos de longitud. La parte dúplex del RNA del siRNA puede ser parte de una estructura de horquilla. Además de la parte dúplex, la estructura horquilla puede contener una parte bucle posicionada entre las dos secuencias que forman el dúplex. El bucle puede variar en longitud. En algunas modalidades el bucle tiene 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12 o 1 3 nucleótidos de longitud. La estructura de horquilla también puede contener 3' o 5' partes que sobresalen. En algunas modalidades, la parte que sobresale es una saliente de 3' o 5' de 0, 1 , 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud.
Un "RNA horquillado corto", o shRNA, es una estructura de polinucleótidos que puede hacerse para expresar un RNA de interferencia tal como siRNA.
"Recombinante", tal como se aplica a un polinucleotido significa que el polinucleotido es el producto de varias combinaciones de clonación, etapas de restricción o ligación y otros procedimientos que tienen como resultado una estructura que es diferente de un polinucleotido encontrado en la naturaleza. Un virus recombinante es una partícula viral que comprende un polinucleotido recombinante. Los términos incluyen respectivamente réplicas de la estructura de polinucleótidos original y la progenie de la estructura del virus original.
Un "elemento de control" o "secuencia de control" es una secuencia de nucleótidos implicada en una interacción de moléculas que contribuye a la regulación funcional de un polinucleotido, que incluye la replicación, duplicación, transcripción, empalme, translación o degradación del polinucleotido. La regulación puede afectar la frecuencia, velocidad o especificidad del proceso, y puede ser de naturaleza aumentativa o inhibitoria. Los elementos de control conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, secuencias regulatorias transcripcionales tales como promotores y potenciadores. Un promotor es una región de DNA capaz de, en determinadas condiciones, unir RNA polimerasa e iniciar la transcripción de una región de codificación generalmente ubicada corriente abajo (en la dirección 3') del promotor.
"Unido de forma operativa" se refiere a la yuxtaposición de elementos genéticos, donde los elementos se encuentran en una relación que les permite funcionar en la forma esperada. Por ejemplo, un promotor está unido de forma operativa a una región codificante si el promotor ayuda a iniciar la transcripción de la secuencia codificante. Puede haber residuos intervinientes entre el promotor y la región codificante siempre y cuando esta relación funcional se mantenga.
Un "vector de expresión" es un vector que comprende una región que codifica un polipéptido de interés, y se utiliza para efectuar la expresión de la proteína en una célula objetivo deseada. Un vector de expresión también comprende elementos de control unidos de forma operativa a la región codificante para facilitar la expresión de la proteína en el objetivo. A la combinación de elementos de control y un gene o genes a los que están unidos de forma operativa para la expresión a veces se le denomina "cásete de expresión", un gran número de los cuales se conocen y se encuentran disponibles en la técnica o se pueden construir fácilmente a partir de componentes que están disponibles en la técnica.
"Heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta de aquella del resto de la entidad a la que se le está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido introducido mediante técnicas de ingeniería genética en una plásmido o vector derivado de una especie diferente es un polinucleótido heterólogo. Un promotor quitado de su secuencia codificante nativa y unido de forma operativa a una secuencia codificante con la que no se encuentra unido de forma natural es un promotor heterologo. Por lo tanto, por ejemplo, un rAAV que incluye un ácido nucleico heterólogo codificando un producto génico heterólogo es un rAAV que incluye un ácido nucleico que normalmente no está incluido en un AAV de origen natural, de tipo salvaje, y el producto génico heterólogo codificante es un producto génico que normalmente no se codifica por un AAV de origen natural, de tipo salvaje.
Los términos "alteración genética" y "modificación genética" (y variantes gramaticales de estas), se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a un proceso donde un elemento genético (por ejemplo, un polinucleótido) se introduce en una célula de otra forma diferente a la mitosis o meiosis. El elemento puede ser heterólogo a la célula, o puede ser una copia adicional o versión mejorada de un elemento que ya se encuentra presente en la célula. La alteración genética se puede efectuar, por ejemplo, mediante la transfección de una célula con un plásmido recombinante u otro polinucleótido mediante cualquier proceso conocido en la técnica, tal como la electroporación, precipitación de fosfato de calcio o cuando se le pone en contacto con un complejo de polinucleótido-liposoma. La alteración genética también se puede efectuar, por ejemplo, mediante transducción o infección con un virus o vector viral de DNA o de RNA. Generalmente, el elemento genético se introduce en un cromosoma o mini cromosoma en la célula; pero cualquier alteración que cambia el fenotipo y/o genotipo de la célula y su progenie se encuentra incluida en este término.
Se dice que una célula se altera, transduce, modifica genéticamente o se transforma "de forma estable" con una secuencia genética si la secuencia se encuentra disponible para realizar su función durante un cultivo extendido de la célula in vitro. Generalmente, dicha célula se altera "de forma hereditaria" (modificada genéticamente) dado que se introduce una alteración genética lo que también es heredable por progenie de la célula alterada.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente y se refieren a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Asimismo los términos comprenden un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, fosforilación o conjugación con un componente de marcado. Los polipéptidos tales como polipéptidos anti-angiogénicos, polipéptidos neuroprotectores y similares, cuando se discuten en el contexto de administrar un producto génico a un sujeto mam ífero, y composiciones de este, se refieren al polipéptido intacto respectivo, o a cualquier fragmento o derivado diseñado genéticamente de este, lo que retiene la función bioquímica deseada de la proteína intacta. De manera similar, las referencias a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos anti-angiogénicos, ácidos nucleicos que codifican polipéptidos neuroprotectores y otros ácidos nucleicos similares para utilizar en la administración de un producto génico a un sujeto mam ífero (al que se le puede hacer referencia como "transgenes" que van a ser administrados a una célula receptora), que incluye polinucleótidos que codifican el polipéptido intacto o cualquier fragmento o derivado diseñado genéticamente que posee la función bioquímica deseada.
Un plásmido "aislado", ácido nucleico, vector, virus, virión, célula hospedadora u otra sustancia se refiere a la preparación de la sustancia desprovista de al menos algunos de los otros componentes que también pueden estar presentes donde la sustancia o una sustancia similar ocurre de forma natural o a partir de la cual se prepara inicialmente. Por lo tanto, por ejemplo, una sustancia aislada puede prepararse utilizando una técnica de purificación para enriquecerla con una mezcla fuente. El enriquecimiento se puede medir sobre una base absoluta, tal como peso por volumen de solución, o se puede medir con respecto a una segunda y potencialmente ¡nterceptora sustancia presente en la mezcla fuente. Los enriquecimientos de las modalidades de la presente descripción son cada vez más aislados. Un plásmido, ácido nucleico, vector, virus, célula hospedadora u otra sustancia aislada en algunas modalidades se purifica, por ejemplo, de alrededor de 80% a alrededor de 90% pura, al menos alrededor de 90% pura, al menos alrededor de 95% pura, al menos alrededor de 98% pura, o al menos alrededor de 99%, o más, pura.
Tal como se usa en la presente, los términos "tratamiento", "tratar" y similares se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o síntoma o de esta y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o total de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que ocurra la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o en riesgo de contraer la enfermedad pero que no ha sido diagnosticado que la tiene aún; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, ocasionar la regresión de la enfermedad.
Los términos "individual", "hospedador", "sujeto" y "paciente" se utilizan de manera intercambiable en la presente, y se refieren a un mam ífero que incluye, de modo no taxativo, primates humanos y no humanos, que incluyen simios y humanos; animales mamíferos para el deporte (por ejemplo, caballos); animales mamíferos de granja (por ejemplo, ovejas, cabras, etc. ); mascotas mamíferas (perros, gatos, etc.); y roedores (por ejemplo, ratones, ratas, etc.).
Antes de describir la presente invención en más detalle, se deberá entender que esta invención no está limitada a las modalidades particulares descritas, ya que estas pueden evidentemente variar. También debe entenderse que la terminolog ía usada en la presente tiene el fin de describir solamente modalidades particulares y no pretende ser limitativa ya que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Donde se proporciona un intervalo de valores, se deberá entender que cada valor intermedio, hasta la décima de la unidad de menor límite salvo que el contexto claramente establezca lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, están comprendidos dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en los intervalos más pequeños y también están comprendidos dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyan cualesquiera o ambos límites incluidos también se incluyen en la invención.
A menos que se indique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado según lo entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Si bien en la práctica o prueba de la presente invención también se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones que se mencionan en la presente se incorporan a la misma mediante esta referencia para divulgar y describir los métodos y/o materiales en relación con los cuales se citan las publicaciones.
Debe observarse que tal como se usa aquí y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la", incluyen los referentes plurales salvo que se exprese claramente lo contrario en el contexto. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un virión AAV recombinante" incluye una pluralidad de dichos viriones y la referencia a "la célula fotorreceptora" incluye la referencia a una o más células fotorreceptoras y equivalentes de estas conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Además se observa que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esto pretende servir como base antecedente para el uso de dicha terminolog ía exclusiva tal como "solamente", "únicamente" y similares con relación a la enumeración de los elementos de las reivindicaciones o el uso de una limitación "negativa".
Se entiende que algunas características de la invención que, a los efectos de la claridad, se describen en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una sola modalidad. De manera inversa, diversas características de la invención que, a efectos de brevedad, se describen en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las modalidades pertenecientes a la invención se encuentran específicamente comprendidas dentro de la presente invención y se describen en la presente como si cada combinación estuviese individual y específicamente descrita. Además, todas las subcombinaciones de las varias modalidades y elementos de estas también se encuentran específicamente comprendidas dentro de la presente y se describen en la presente como si cada dicha subcombinacion estuviese individual y específicamente descrita en la presente.
Las publicaciones que se analizan en la presente se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Ningún contenido de la presente debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder a dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser distintas de las fechas de publicación reales, las cuales puede ser necesario que se confirmen de manera independiente.
Descripción detallada La presente descripción proporciona viriones del virus adenoasociado (AAV) con proteína de cápside alterada, donde los viriones de AAV exhiben una mayor infectividad de una célula de la retina, cuando se administra mediante inyección intravítrea, en comparación con el AAV de tipo salvaje cuando se administra mediante inyección intravítrea. La presente descripción proporciona además métodos de administración de un producto génico a una célula de la retina en un individuo y métodos para tratar la enfermedad ocular.
La célula de la retina puede ser un fotorreceptor (por ejemplo, bastones; conos), una célula ganglionar de la retina (RGC), una célula de Müller (una célula glial de Müller), una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal o una célula epitelial pigmentada de la retina (RPE).
Polipéptidos de la cápside del AAV variantes La presente descripción proporciona una proteína de la cápside del AAV variante, donde la proteína de la cápside del AAV variante comprende una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en un sitio de inserción en el bucle GH o bucle IV de la proteína de la cápside, con respecto a la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, y donde la proteína de la cápside variante, cuando está presente en un virión del AAV, confiere una mayor infectividad de una célula de la retina en comparación con la infectividad de la célula de la retina mediante un virión AAV que comprende la proteína de la cápside AAV parental correspondiente. En algunos casos, la célula de la retina es una célula fotorreceptora (por ejemplo, bastones; conos). En otros casos, la célula de la retina es una RGC. En otros casos, la célula de la retina es una célula de RPE. En otros casos, la célula de la retina es una célula de Müller. Otras células de la retina incluyen células amacrinas, células bipolares y células horizontales. En la presente, también se hace referencia a una "inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos "como una "inserción de péptido" (por ejemplo, una inserción de péptido heterólogo). Una "proteína de cápside del AAV parental correspondiente" se refiere a una proteína de la cápside del AAV del mismo serotipo de AAV, sin la inserción del péptido.
El sitio de inserción se encuentra en el bucle GH, o en el bucle IV, de la proteína de la cápside de AAV, por ejemplo, en una parte accesible al solvente del bucle GH , o del bucle IV, de la proteína de la cápside de AAV. Para el bucle GH/bucle IV de la cápside de AAV, véase, por ejemplo, van Vliet et al . (2006) Mol. Ther. 14 : 809; Padrón et al . (2005) J. Virol. 79: 5047; y Shen et al . (2007) Mol. Ther. 1 5 : 1 955. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar dentro de los aminoácidos 41 1 -650 de una proteína de la cápside de AAV, tal como se describe en las Figuras 1 7A y 1 7B. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar dentro de los ami noácidos 570-61 1 de AAV2, dentro de los aminoácidos 571 -61 2 de AAV1 , dentro de los aminoácidos 560-601 deAAV5, dentro de los aminoácidos 571 a 612 de AAV6, dentro de los aminoácidos 572 a 61 3 de AAV7, dentro de los aminoácidos 573 a 61 4 de AAV8, dentro de los aminoácidos 571 a 61 2 de AAV9, o dentro de los aminoácidos 573 a 614 de AAV1 0, tal como se describe en la Figura 6.
En algunos casos, se i nsertan desde alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 am inoácidos en un sitio de inserción en el bucle G H o el bucle IV de la proteína de la cápside con respecto a una proteína de la cápside del AAV parental correspondiente. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 587 y 588 de AAV2 , o en las posiciones correspondientes de la subunidad de la cápside de otro serotipo del AAV. Debe notarse q ue el sitio de inserción 587/588 se basa en una proteína de la cápside de la AAV2. Se pueden insertar de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en un sitio correspondiente en un serotipo de AAV que no sea AAV2 (por ejemplo, AAV8, AAV9, etc. ) . Los expertos en la técnica sabrán, basándose en una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la cápside de varios serotipos de AAV, donde se ubicaría un sitio de inserción "correspondiente a los aminoácidos 587-588 de AAV2" en una proteína de la cápside de cualquier serotipo dado. Las secuencias correspondientes a los aminoácidos 570-61 1 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 (véase la Figura 5) en varios serotipos de AAV se muestran en la Figura 6. Véase, por ejemplo, N.° de registro GenBankNP_049542 para AAV1 ; N .° de registro GenBankAAD13756 para AAV5; N .° de registro GenBankAAB95459 para AAV6; N.° de registro GenBankYP_0771 78 para AAV7; N.° de registro GenBankYP_077180 para AAV8; N.° de registro GenBank AAS99264 para AAV9 y N.° de registro GenBank AAT46337 para AAV10.
En algunas modalidades, el sitio de inserción es un solo sitio de inserción entre dos aminoácidos adyacentes ubicados entre los aminoácidos 570-614 de VP 1 de cualquier serotipo de AAV, por ejemplo, el sitio de inserción se encuentra entre dos aminoácidos adyacentes ubicados en los aminoácidos 570-610, aminoácidos 580-600, aminoácidos 570-575, aminoácidos 575-580, aminoácidos 580-585, aminoácidos 585-590, aminoácidos 590-600, o aminoácidos 600-614, de VP1 de cualquier serotipo o variante de AAV. Por ejemplo, el sitio de inserción puede encontrarse entre los aminoácidos 580 y 581 , los aminoácidos 581 y 582, aminoácidos 583 y 584, aminoácidos 584 y 585, aminoácidos 585 y 586, aminoácidos 586 y 587, aminoácidos 587 y 588, aminoácidos 588 y 589, o aminoácidos 589 y 590. El sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 575 y 576, aminoácidos 576 y 577, aminoácidos 577 y 578, aminoácidos 578 y 579, o aminoácidos 579 y 580. El sitio de inserción puede encontrarse entre los aminoácidos 590 y 591 , los aminoácidos 591 y 592, los aminoácidos 592 y 593, aminoácidos 593 y 594, aminoácidos 594 y 595, aminoácidos 595 y 596, aminoácidos 596 y 597, aminoácidos 597 y 598, aminoácidos 598 y 599, o aminoácidos 599 y 600.
Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 587 y 588 de AAV2, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV1 , entre los aminoácidos 575 y 576 de AAV5, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV6, entre los aminoácidos 589 y 590 de AAV7, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV8, entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV9, o entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV1 0.
Como otro ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 450 y 460 de una proteína de la cápside de AAV, tal como se muestra en la Figura 17A. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar en (por ejemplo, inmediatamente en el extremo N) el aminoácido 453 de AAV2, en el aminoácido 454 de AAV1 , en el aminoácido 454 de AAV6, en el aminoácido 456 de AAV7, en el aminoácido 456 de AAV8, en el aminoácido 454 de AAV9, o en el aminoácido 456 de AAV1 0, tal como se muestra en la Figura 1 7A.
En algunas modalidades, una proteína de la cápside incluye un bucle GH que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o 1 00 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos establecida en la Figura 1 8A-C.
Péptidos de inserción Tal como se mencionó anteriormente, se inserta un péptido de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos de longitud en el bucle GH de una cápside del AAV. El péptido de inserción tiene una longitud de 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9 aminoácidos, 1 0 aminoácidos u 1 1 aminoácidos.
El péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las fórmulas que se establecen a continuación.
Por ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de alrededor de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula I : Y i Y2 1 X2X3X4X5X6X7 Y3Y4 donde: cada uno de -Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; X, , si está presente, se selecciona de Leu, Asn y Lys; X2 se selecciona de Gly, Glu, Ala y Asp; X3 se selecciona de Glu, Thr, Gly y Pro; X4 se selecciona de Thr, Me, Gln y Lys; X5 se selecciona de Thr y Ala; X6 se selecciona de Arg, Asn y Thr; X7, si está presente, se selecciona de Pro y Asn.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de alrededor de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud , donde el péptido de inserción es de la Fórmula lia: Y i Y2X 1 X2X3X4X5X6X7 Y3Y4 donde: cada uno de Y! -Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; cada uno de - X4 es cualquier aminoácido; X5 es Thr; X6 es Arg; y X7 es Pro.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de alrededor de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula llb: Y 1 Y2X 1 X2X3X4X5 5X7 Y3Y4 donde: cada uno de Y 1 -Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; X , si está presente, se selecciona de Leu y Asn; X2, si está presente, se selecciona de Gly y Glu; X3 se selecciona de Glu y Thr; X4 se selecciona de Thr e Me; X5 es Thr; X6 es Arg; y X7 es Pro.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula III: Yi Y 2X1 ?2?ß? ? 5 5 7 Y3 Y4 donde: cada uno de Y -Y4l si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; X , si está presente, es Lys; X2 se selecciona de Ala y Asp; X3 se selecciona de Gly y Pro; X4 se selecciona de Gln y Lys; X5 se selecciona de Thr y Ala; Xe se selecciona de Asn y Thr; X7, si está presente, es Asn.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula IV: Y i Y2X 1 X2X3X4X5X6X7 Y3Y4 donde: cada uno de Y1 -Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; X^ si está presente, es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Leu, Asn, Arg , Ala, Ser y Lys; X2 es un aminoácido con carga negativa o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Gly, Glu, Ala, Val, Thr y Asp; X3 es un aminoácido con carga negativa o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Glu, Thr, Gly, Asp o Pro; X4 se selecciona de Thr, Me, Gly, Lys, Asp y Gln; X5 es un aminoácido polar, un alcohol (un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo libre), o un aminoácido hidrofóbico, o se selecciona de Thr, Ser, Val y Ala; X6 es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Arg , Val, Lys, Pro, Thr y Asn; y X7, si está presente, es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Pro, Gly, Phe, Asn y Arg.
Como ejemplos no taxativos, el péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos que se selecciona de LGETTRP (SEQ ID N0:13), NETITRP (SEQ ID N0:14), KAGQANN (SEQ ID N0:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59) y STGKVPN (SEQ ID NO:60).
En algunos casos, el péptido de inserción tiene de 1 a 4 aminoácidos espaciadores (Y1-Y4) en el extremo amino y/o en el extremo carboxilo de cualquiera de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59) y STGKVPN (SEQ ID NO:60). Los aminoácidos espaciadores adecuados incluyen, de modo no taxativo, leucina, alanina, glicina y serina.
Por ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: LALGETTRPA (SEQ ID NO:45); LANETITRPA (SEQ ID NO:46), LAKAGQANNA (SEQ ID NO:47), LAKDPKTTNA (SEQ ID NO:48), LAKDTDTTRA (SEQ ID NO:61), LARAGGSVGA (SEQ ID NO:62), LAAVDTTKFA (SEQ ID NO:63) y LASTGKVPNA (SEQ ID NO:64). Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: AALGETTRPA (SEQ ID NO:49); AANETITRPA (SEQ ID NO:50), AAKAGQANNA (SEQ ID NO:51) y AAKDPKTTNA (SEQ ID NO:52). Como aun otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: GLGETTRPA (SEQ ID NO:53); GNETITRPA (SEQ ID NO:54), GKAGQANNA (SEQ ID NO:55) y GKDPKTTNA (SEQ ID NO:56). Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción comprende uno de KDTDTTR (SEQ I D NO:57), RAGGSVG (SEQ I D NO:58), AVDTTKF (SEQ I D NO:59) y STGKVPN (SEQ ID NO:60), flanqueado en el extremo C mediante AA y en el extremo N mediante A; o comprende uno de KDTDTTR (SEQ I D NO:57), RAGGSVG (SEQ I D NO: 58), AVDTTKF (SEQ I D NO:59) y STGKVPN (SEQ I D NO:60) flanqueado en el extremo C mediante G y en el extremo N mediante A.
En algunas modalidades, una cápside de AAV variante no incluye otras sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos salvo una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en el bucle GH o en el bucle IV con respecto a una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente. En otras modalidades, una cápside de AAV variante incluye de 1 a alrededor de 25 inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en comparación con la proteína de la cápside de AAV parental, además de una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en el bucle GH o en el bucle IV con respecto a una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente. Por ejemplo, en algunas modalidades, una cápside de AAV variante incluye de 1 a alrededor de 5, de alrededor de 5 a alrededor de 10, de alrededor de 10 a alrededor de 1 5, de alrededor de 15 a alrededor de 20 o de alrededor de 20 a alrededor de 25 inserciones, eliminaciones o sustituciones en comparación con la proteína de la cápside de AAV parental, además de una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en el bucle GH o en el bucle IV con respecto a una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.
En algunas modalidades, un polipéptido de la cápside variante no incluye uno, dos, tres o cuatro de las siguientes sustituciones de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F y Y730F.
En algunas modalidades, un polipéptido de cápside variante de la presente comprende, además de un péptido de inserción como se describe anteriormente, una, dos, tres o cuatro de las siguientes sustituciones de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F y Y730F.
En algunas modalidades, un polipéptido de la cápside de AAV variante es una cápside quimérica, por ejemplo, la cápside comprende una parte de una cápside de AAV de un primer serotipo de AAV y una parte de una cápside de AAV de un segundo serotipo; y comprende una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV con respecto a una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.
En algunas modalidades, una proteína de la cápside variante comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5; y una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV con respecto a una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.
En algunas modalidades, una proteína de la cápside variante se encuentra aislada, por ejemplo, purificada. En algunos casos, una proteína de la cápside variante está incluida en un vector de AAV, el cual también se proporciona. Tal como se describe en detalle más adelante, se puede incluir una proteína de la cápside variante en un virión de AAV recombinante.
Virión de AAV recombinante La presente descripción proporciona un virión adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende: a) una proteína de la cápside del AAV variante donde la proteína de la cápside del AAV variante comprende una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en un sitio de inserción en el bucle GH o bucle IV de la proteína de la cápside, con respecto a la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, y donde la proteína de la cápside variante, confiere una mayor infectividad de una célula de la retina en comparación con la infectividad de la célula de la retina mediante un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente; y b) un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican un producto génico. En algunos casos, la célula de la retina es una célula fotorreceptora (por ejemplo, bastones y/o conos). En otros casos, la célula de la retina es una célula RGC. En otros casos, la célula de la retina es una célula de RPE. En otros casos, la célula de la retina es una célula Müller. En otros casos, las células de la retina pueden incluir células amacrinas, células bipolares y células horizontales. En la presente, tam bién se hace referencia a una "inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 am inoácidos "como una "inserción de péptido" (por ejemplo, una inserción de péptido heterólogo). Una "proteína de cápside del AAV parental correspondiente" se refiere a una proteína de la cápside del AAV del mismo serotipo de AAV, sin la inserción del péptido.
El sitio de inserción se encuentra en el bucle G H , o en el bucle IV, de la prote ína de la cápside de AAV, por ejemplo, en una parte accesible al solvente del bucle GH , o del bucle IV, de la proteína de la cápside de AAV. Para el bucle G H véase, por ejemplo , van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14 : 809; Padrón et al . (2005) J. Virol. 79:5047; y Shen et al . (2007) Mol. Ther. 1 5: 1 955. Por ejemplo, el sitio de inserción se encuentra dentro de los aminoácidos 570-61 1 de AAV2 , dentro de los aminoácidos 571 -61 2 de AAV1 , dentro de los ami noácidos 560-601 de AAV5, dentro de los aminoácidos 571 a 61 2 de AAV6, dentro de los aminoácidos 572 a 61 3 de AAV7, dentro de los aminoácidos 573 a 614 de AAV8, dentro de los aminoácidos 571 a 61 2 de AAV9, o dentro de los aminoácidos 573 a 614 de AAV10.
De alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos están insertados en un sitio de inserción en el bucle GH o el bucle IV de la proteína de la cápside con respecto a una proteína de la cápside del AAV parental correspondiente. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los ami noácidos 587 y 588 de AAV2 , o en las posiciones correspondientes de la subunidad de la cápside de otro serotipo del AAV. Debe notarse q ue el sitio de inserción 587/588 se basa en una proteína de la cápside de la AAV2. Se pueden insertar de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en un sitio correspondiente en un serotipo de AAV que no sea AAV2 (por ejemplo, AAV8, AAV9, etc. ). Los expertos en la técnica sabrán, basándose en una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la cápside de varios serotipos de AAV, dónde se ubicaría un sitio de inserción "correspondiente a los aminoácidos 587-588 de AAV2"en una proteína de la cápside de cualquier serotipo dado. Las secuencias correspondientes a los aminoácidos 570-61 1 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 (véase la Figura 5) en varios serotipos de AAV se muestran en la Figura 6.
En algunas modalidades, el sitio de inserción es un solo sitio de inserción entre dos aminoácidos adyacentes ubicados entre los aminoácidos 570-614 de VP1 de cualquier serotipo de AAV, por ejemplo, el sitio de inserción se encuentra entre dos aminoácidos adyacentes ubicados en los aminoácidos 570-614, aminoácidos 580-600, aminoácidos 570-575, aminoácidos 575-580, aminoácidos 580-585, aminoácidos 585-590, aminoácidos 590-600, o aminoácidos 600-610, de VP1 de cualquier serotipo o variante de AAV. Por ejemplo, el sitio de inserción puede encontrarse entre los aminoácidos 580 y 581 , los aminoácidos 581 y 582, aminoácidos 583 y 584, aminoácidos 584 y 585, aminoácidos 585 y 586, aminoácidos 586 y 587, am inoácidos 587 y 588, aminoácidos 588 y 589, o aminoácidos 589 y 590. El sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 575 y 576, aminoácidos 576 y 577, aminoácidos 577 y 578, aminoácidos 578 y 579, o aminoácidos 579 y 580. El sitio de inserción puede encontrarse entre los aminoácidos 590 y 591 , los aminoácidos 591 y 592, los aminoácidos 592 y 593, aminoácidos 593 y 594, aminoácidos 594 y 595, aminoácidos 595 y 596, aminoácidos 596 y 597, aminoácidos 597 y 598, aminoácidos 598 y 599, o aminoácidos 599 y 600.
Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 587 y 588 de AAV2, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV1 , entre los aminoácidos 575 y 576 de AAV5, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV6, entre los aminoácidos 589 y 590 de AAV7, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV8, entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV9, o entre los aminoácidos 589 y 590 de AAV10.
Péptidos de inserción Tal como se mencionó anteriormente, un virión de rAAV de la presente comprende un péptido de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos de longitud insertado en el bucle GH de una cápside del AAV. El péptido de inserción tiene una longitud de 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9 aminoácidos, 1 0 aminoácidos u 1 1 aminoácidos.
El péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las fórmulas que se establecen a continuación.
Por ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de alrededor de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula I: Yi Y 2X1 ?2? 3X4X5X6X7 ?3?4 donde: cada uno de Y1-Y4 , si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; Xi , si está presente, se selecciona de Leu, Asn y Lys; X2 se selecciona de Gly, Glu, Ala y Asp; X3 se selecciona de Glu, Thr, Gly y Pro; X4 se selecciona de Thr, lie, Gln y Lys; X5 se selecciona de Thr y Ala; X6 se selecciona de Arg, Asn y Thr; X7, si está presente, se selecciona de Pro y Asn.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de alrededor de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud , donde el péptido de inserción es de la Fórmula lia: Y 1 Y2X 1 2 3X4X5 6X7 Y3Y4 donde: cada uno de Y1-Y4 , si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; cada uno de X1 - X es cualquier aminoácido; X5 es Thr; X6 es Arg; y X7 es Pro.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de alrededor de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula llb: Y i Y?X 1 X2X3X4X5X6X7 Y3Y4 donde: cada uno de Y1 -Y4 , si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; Xi , si está presente, se selecciona de Leu y Asn; X2 , si está presente, se selecciona de Gly y Glu; X3 se selecciona de Glu y Thr; X4 se selecciona de Thr e Me; X5 es Thr; X6 es Arg; y X7 es Pro.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula III: Y 1 Y2X 1 X2 3X4X5 5 7 Y3Y4 donde: cada uno de Y1-Y4 , si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; Xi , si está presente, es Lys; X2 se selecciona de Ala y Asp; X3 se selecciona de Gly y Pro; X4 se selecciona de Gln y Lys; X5 se selecciona de Thr y Ala; X6 se selecciona de Asn y Thr; X7 , si está presente, es Asn.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula IV: Y 1 Y2X 1 X2X3 4X5 5X7 Y3Y4 donde: cada uno de Yi -Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; Xi , si está presente, es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Leu, Asn, Arg, Ala, Ser y Lys; X2 es un aminoácido con carga negativa o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Gly, Glu, Ala, Val, Thr y Asp; X3 es un aminoácido con carga negativa o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Glu, Thr, Gly, Asp o Pro; X4 se selecciona de Thr, He, Gly, Lys, Asp y Gln; X5 es un aminoácido polar, un alcohol (un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo libre), o un aminoácido hidrofóbico, o se selecciona de Thr, Ser, Val y Ala; X6 es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Arg, Val, Lys, Pro, Thr y Asn; y X7, si está presente, es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Pro, Gly, Phe, Asn y Arg.
Como ejemplos no taxativos, el péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos que se selecciona de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59) y STGKVPN (SEQ ID NO:60).
En algunos casos, el péptido de inserción tiene de 1 a 4 aminoácidos espaciadores (??-?^ en el extremo amino y/o en el extremo carboxilo de cualquiera de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59) y STGKVPN (SEQ ID NO:60). Los aminoácidos espaciadores adecuados incluyen, de modo no taxativo, leucina, alanina, glicina y serina.
Por ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: LALGETTRPA (SEQ ID NO:45); LANETITRPA (SEQ ID NO:46), LAKAGQANNA (SEQ ID NO:47), LAKDPKTTNA (SEQ ID NO:48), LAKDTDTTRA (SEQ ID NO:61), LARAGGSVGA (SEQ I D NO:62), LAAVDTTKFA (SEQ I D NO:63) y LASTGKVPNA (SEQ I D NO:64). Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: AALGETTRPA (SEQ ID NO:49); AANETITRPA (SEQ ID NO:50), AAKAGQANNA (SEQ I D NO:51 ) y AAKDPKTTNA (SEQ ID NO:52). Como aun otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: GLGETTRPA (SEQ ID NO:53); GNETITRPA (SEQ ID NO:54), GKAGQANNA (SEQ I D NO:55) y GKDPKTTNA (SEQ I D NO:56). Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción comprende uno de KDTDTTR (SEQ I D NO:57), RAGGSVG (SEQ I D NO:58), AVDTTKF (SEQ I D NO:59) y STGKVPN (SEQ I D NO:60), flanqueado en el extremo C mediante AA y en el extremo N mediante A; o comprende uno de KDTDTTR (SEQ I D NO: 57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58) , AVDTTKF (SEQ ID NO:59) y STGKVPN (SEQ ID NO:60) flanqueado en el extremo C mediante G y en el extremo N mediante A.
En algunas modalidades, una cápside de virión de rAAV no incluye otras sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos salvo una inserción de alrededor de 7 aminoácidos a alrededor de 10 aminoácidos en el bucle GH o en el bucle IV con respecto a una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente. En otras modalidades, una cápside de virión de rAAV incluye de 1 a alrededor de 25 inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en comparación con la proteína de la cápside de AAV parental, además de una inserción de alrededor de 7 aminoácidos a alrededor de 10 aminoácidos en el bucle GH o en el bucle IV con respecto a una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente. Por ejemplo, en algunas modalidades, una cápside de virión de rAAV incluye de 1 a alrededor de 5, de alrededor de 5 a alrededor de 1 0, de alrededor de 1 0 a alrededor de 1 5, de alrededor de 15 a alrededor de 20 o de alrededor de 20 a alrededor de 25 inserciones, eliminaciones o sustituciones en comparación con la proteína de la cápside de AAV parental, además de una inserción de alrededor de 7 aminoácidos a alrededor de 10 aminoácidos en el bucle GH o en el bucle IV con respecto a una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.
En algunas modalidades, una cápside de virión de rAAV no incluye una, dos, tres o cuatro de las siguientes sustituciones de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F y Y730F.
En algunas modalidades, un polipéptido de la cápside variante de la presente comprende, además de un péptido de inserción como se describe anteriormente, una, dos, tres o cuatro de las siguientes sustituciones de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F y Y730F.
En algunas modalidades, una cápside del virión del rAAV de la presente es una cápside quimérica, por ejemplo, la cápside comprende una parte de una cápside de AAV de un primer serotipo de AAV y una parte de una cápside de AAV de un segundo serotipo; y comprende una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV con respecto a una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente comprende una proteína de la cápside que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5; y una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV con respecto a una proteína de la cápside del AAV parental correspondiente.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente comprende una proteína de la cápside que incluye un bucle GH que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 % , al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o 1 00 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos establecida en la Figura 18A-C.
Un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 1 5 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula de la retina en comparación con la infectividad de la célula de la retina mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente.
En algunos casos, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula de la retina, cuando se administra mediante inyección intravitrea, en comparación con la infectividad de la célula de la retina mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, cuando se administra mediante inyección intravitrea.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 1 0 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula fotorreceptora (bastón o cono), en comparación con la infectividad de la célula fotorreceptora mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente.
En algunos casos, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula fotorreceptora (bastón o cono), cuando se administra mediante inyección intravitrea, en comparación con la infectividad de la célula fotorreceptora mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, cuando se administra mediante inyección intravitrea.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una RGC, en comparación con la infectividad de la RGC mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente.
En algunos casos, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 1 5 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una RGC, cuando se administra mediante inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la RGC mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, cuando se administra mediante inyección intravítrea.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 1 0 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula de RPE, en comparación con la infectividad de la célula de RPE mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente.
En algunos casos, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula de RPE, cuando se administra mediante inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula de RPE mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, cuando se administra mediante inyección intravítrea.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula de Müller, en comparación con la infectividad de la célula de Müller mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 1 0 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula de Müller, cuando se administra mediante inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula de Müller mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, cuando se administra mediante inyección intravítrea.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 1 0 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula bipolar, en comparación con la infectividad de la célula bipolar mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula bipolar, cuando se administra mediante inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula bipolar mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, cuando se administra mediante inyección intravítrea.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 1 5 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula amacrina, en comparación con la infectividad de la célula amacrina mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 1 0 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula amacrina, cuando se administra mediante inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula amacrina mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, cuando se administra mediante inyección intravítrea.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula horizontal, en comparación con la infectividad de la célula horizontal mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente.
En algunas modalidades, un virión del rAAV del sujeto exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula horizontal, cuando se administra mediante inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula horizontal mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, cuando se administra mediante inyección intravítrea.
En algunos casos, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la capacidad de atravesar la membrana limitante interna (IL ) de al menos 10 veces, al menos 1 5 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces, en comparación con la capacidad de un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente de atravesar la I LM.
En algunos casos, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la capacidad de atravesar la membrana limitante interna (I LM) de al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces, cuando se administra mediante inyección intravítrea, en comparación con la capacidad de un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente de atravesar la ILM , cuando se administra mediante inyección intravítrea.
Un virión del rAAV de la presente puede atravesar la ILM y también puede atravesar las capas celulares, incluyendo las células de Müller, las células amacrinas, etc. , para llegar a las células fotorreceptoras y/o a las células de RPE. Por ejemplo, un virión del rAAV de la presente, cuando se administra mediante inyección intravítrea, puede atravesar la I LM y también puede atravesar las capas celulares, incluyendo las células de Müller, las células amacrinas, etc. , para llegar a las células fotorreceptoras y/o a las células de RPE.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente infecta selectivamente una célula de la retina, por ejemplo, un virión del rAAV de la presente infecta una célula de la retina con especificidad de 10 veces, 1 5 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces o más de 50 veces más que una célula que no es de la retina, por ejemplo, una célula fuera del ojo. Por ejemplo, en algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente infecta selectivamente una célula de la retina, por ejemplo, un virión del rAAV de la presente infecta una célula fotorreceptora con especificidad de 10 veces, 1 5 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces o más de 50 veces más que una célula que no es de la retina, por ejemplo, una célula fuera del ojo.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente infecta selectivamente una célula fotorreceptora, por ejemplo, un virión del rAAV de la presente infecta una célula fotorreceptora con especificidad de 1 0 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces o más de 50 veces más que una célula no fotorreceptora presente en el ojo, por ejemplo, una célula ganglionar de la retina, una célula de Müller, etc.
En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente exhibe un aumento de la infectividad de al menos 10 veces, al menos 1 5 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o más de 50 veces de una célula fotorreceptora, cuando se administra mediante inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula fotorreceptora mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, cuando se administra mediante inyección intravítrea.
Productos génicos Un virión del rAAV de la presente comprende un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico. En algunas modalidades, el producto génico es un RNA de interferencia. En algunas modalidades, el producto génico es un aptámero. En algunas modalidades, el producto génico es un polipéptido. En algunas modalidades, el producto génico es una nucleasa específica del sitio que proporciona la inactivación específica del sitio de la función del gene.
RNA de interferencia Cuando el producto génico es un RNA de interferencia (RNAi), el RNAi adecuado incluye RNAi que disminuye el nivel de un factor apoptótico o angiogénico en una célula. Por ejemplo, un RNAi puede ser un shRNA o siRNA que reduce el nivel de un producto génico que induce o promueve la apoptosis de una célula. Los genes cuyos productos génicos inducen o promueven la apoptosis se denominan en la presente "genes pro-apoptóticos" y los productos de dichos genes (mRNA; proteína) se denominan "productos génicos pro-apoptóticos". Los productos génicos pro-apoptóticos incluyen, por ejemplo, los productos génicos Bax, Bid, Bak y Bad. Véase, por ej . , la patente estadounidense N. 0 7,846,730.
Los RNAs de interferencia también podrían ir en contra de un producto angiogénico, por ejemplo, VEGF (por ejemplo, Cand5; véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense N.° 2011/0143400; publicación de patente estadounidense N.° 2008/0188437; y Reich et al. (2003) Mol. Vis. 9:210), VEGFR1 (por ejemplo, Sirna-027, véase, por ejemplo, Kaiser et al. (2010) Am. J. Ophthalmol. 150:33; y Shen et al. (2006) Gene Ther. 13:225) o VEGFR2 (Kou et al. (2005) Biochem. 44:15064). Véase también, las patentes estadounidenses N.° 6,649,596, 6,399,586, 5,661,135, 5,639,872 y 5,639,736; y las patentes estadounidenses N° 7,947,659 y 7,919,473.
Aptámeros Cuando el producto génico es un aptámero, los ejemplos de aptámeros de interés incluyen un aptámero contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Véase, por ejemplo, Ng et al. (2006) Nat. Rev. Drug Discovery 5:123; y Lee et al. (2005) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102:18902. Por ejemplo, un aptámero de VEGF puede comprender la secuencia de nucleótidos 5'-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3' (SEQ ID NO:17). También es adecuado para su uso un aptámero específico de PDGF, por ejemplo, E10030; véase, por ejemplo, Ni y Hui (2009) Ophthalmologica 223:401; y Akiyama et al. (2006) J. Cell Physiol. 207:407).
Polipéptidos Cuando el producto génico es un polipéptido, el polipéptido es generalmente un polipéptido que mejora la función de una célula de la retina, por ejemplo, la función de una célula bastón o cono, una célula ganglionar de la retina, una célula de Müller, una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal o una célula epitelial pigmentaria de la retina. Los ejemplos de polipéptidos incluyen polipéptidos neuroprotectores (por ejemplo, GDNF, CNTF, NT4, NGF y NTN); polipéptidos anti-angiogénicos (por ejemplo, un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular soluble (VEGF); un anticuerpo de unión a VEGF; un fragmento de anticuerpo de unión a VEGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF de cadena simple); endostatina; tumstatina; angiostatina; un polipéptido Flt soluble (Lai et al. (2005) Mol. Ther. 12:659); una proteína de fusión Fe que comprende un polipéptido Flt soluble (véase, por ejemplo, Pechan et al. (2009) Gene Ther. 16: 10); factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF); un receptor de Tie-2 soluble; etc. ); inhibidor del tejido de metaloproteinasas-3 (TIMP-3); una opsina sensible a la luz, por ejemplo, una rodopsina; polipéptidos anti-apoptóticos (por ejemplo, Bcl-2, Bcl-Xl) y similares. Los polipéptidos adecuados incluyen, de modo no taxativo, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF); factor de crecimiento de fibroblastos 2; neurturina (NTN); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor de crecimiento de nervios (NGF); neurotrofina-4 (NT4); factor neurotrófico derivado del cerebro (BDN F; por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o 100 % de identidad de secuencias de aminoácidos con una extensión contigua de alrededor de 200 aminoácidos a 247 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 1 1 (SEQ I D NO: 1 1 )); factor de crecimiento epidérmico; rodopsina; inhibidor de la apoptosis unido a X y sonic hedgehog.
Las opsinas sensibles a la luz adecuadas incluyen, por ejemplo, una opsina sensible a la luz, como se describe en la publicación de patente estadounidense N.° 2007/0261 127 (por ejemplo, ChR2; Chop2); publicación de patente estadounidense N.° 2001 /0086421 ; publicación de patente estadounidense N.° 2010/001 5095 y Diester et al. (201 1 ) Nat. Neurosci. 14:387.
Los polipéptidos adecuados también incluyen retinosquisina (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una extensión contigua de alrededor de 200 aminoácidos a 224 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 10 (SEQ I D NO: 10). Los polipéptidos adecuados incluyen, por ejemplo, la proteína 1 que interactúa con el regulador de GTPasa de retinitis pigmentaria (RGPR) (véase, por ejemplo, N.° de acceso GenBank Q96KN7, Q9EPQ2 y Q9GLM3) (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una extensión contigua de alrededor de 1 150 aminoácidos a alrededor de 1200 aminoácidos, o de alrededor de 1200 aminoácidos a 1286 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 16 (SEQ ID NO:21 ); periferina-2 (Prph2) (véase, por ejemplo, N .° de acceso GenBank NP_000313 (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una extensión contigua de alrededor de 300 aminoácidos a 346 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 14 (SEQ I D NO: 1 9) y Travis et al. (1991 ) Genomics 10:733); periferina (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o 1 00 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una extensión contigua de alrededor de 400 aminoácidos a alrededor de 470 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 15 (SEQ I D NO:20); una proteína específica del epitelio pigmentario de la retina (RPE65), (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o 1 00 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una extensión contigua de alrededor de 200 aminoácidos a 247 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 12 (SEQ I D NO: 1 2)) (véase, por ejemplo, GenBank AAC39660; y Morimura et al. ( 1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:3088) y similares.
Los polipéptidos adecuados también incluyen: CHM (coroideremia (proteína escolta Rab 1 )), un polipéptido que, cuando es defectuoso o está ausente, provoca coroideremia (véase, por ejemplo, Donnelly et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3: 1017; y van Bokhoven et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3: 1 041 ); y el homólogo de Crumbs 1 (CRB 1 ), un polipéptido que, cuando es defectuoso o está ausente, provoca amaurosis congénita de Leber y retinitis pigmentaria (véase, por ejemplo, den Hollander et al. ( 1 999) Nat. Genet. 23:217; y N .° de acceso GenBank CAM23328).
Los polipéptidos adecuados también incluyen polipéptidos que, cuando son defectuosos o están ausentes, provoca acromatopsia, donde dichos polipéptidos incluyen, por ejemplo, la subunidad alfa de los canales regulados por cGMP fotorreceptora del cono (CNGA3) (véase, por ejemplo, N .° de acceso GenBank NP_001289 y Booij et al. (201 1 ) Ophthalmology 1 18: 160-167); subunidad beta de los canales de cationes regulados por cGMP fotorreceptora del cono (CNGB3) (véase, por ejemplo, Kohl et al. (2005) Eur J Hum Genet. 13(3):302); proteína de unión de nucleótido de guanina (proteína G), polipéptido de actividad transductora alfa 2 (GNAT2) (ACHM4) y ACHM5; y polipéptidos que, cuando son defectuosos o están ausentes, provocan varias formas de daltonismo (por ejemplo, L-opsina, M-opsina y S-opsina). Véase, Mancuso et al. (2009) Nature 461 (7265):784-787.
Endonucleasas específicas del sitio En algunos casos, un producto génico de interés es una endonucleasa específica del sitio que proporciona inactivación específica del sitio de la función del gene, por ejemplo, cuando la endonucleasa inactiva un alelo asociado a una enfermedad de la retina. Por ejemplo, cuando un alelo dominante codifica una copia defectuosa de un gene que, cuando es de tipo salvaje, es una proteína estructural de la retina y/o proporciona una función normal de la retina, una endonucleasa específica del sitio se puede dirigir al alelo defectuoso y puede inactivar el alelo defectuoso.
Además de inactivar un alelo defectuoso, también se puede usar una nucleasa específica del sitio para estimular la recombinación homologa con un DNA del donante que codifica una copia funcional de la proteína codificada por el alelo defectuoso. Por lo tanto, por ejemplo, se puede usar un virión del rAAV de la presente para administrar tanto una endonucleasa específica del sitio que inactiva un alelo defectuoso, y se puede usar para administrar una copia funcional del alelo defectuoso, dando como resultado la reparación del alelo defectuoso, proporcionando así la producción de una proteína funcional de la retina (por ejemplo, retinosquisina funcional, RPE65 funcional, periferina funcional, etc. ). Véase, por ejemplo, Li et al. (201 1 ) Nature 475:217. En algunas modalidades, un virión del rAAV de la presente comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una endonucleasa específica del sitio y una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una copia funcional de un alelo defectuoso, donde la copia funcional codifica una proteína funcional de la retina. Las proteínas funcionales de la retina incluyen, por ejemplo, retinosquisina, RPE65, proteína 1 que interactúa con el regulador de GTPasa de retinitis pigmentaria (RGPR), periferina, periferina-2 y similares.
Las endonucleasas específicas del sitio que son adecuadas para su uso incluyen, por ejemplo, nucleasas de dedo de cinc (ZFN); y nucleasas efectoras tipo activador de transcripción (TALEN), donde dichas endonucleasas específicas del sitio no son de origen natural y se modifican para dirigirse a un gene específico. Dichas nucleasas específicas del sitio pueden diseñarse genéticamente para cortar ubicaciones específicas dentro de un genoma, y así el extremo de unión no homólogo puede reparar la ruptura mientras se insertan o retiran varios nucleotidos. Dichas endonucleasas específicas del sitio (también denominadas "INDEL") sacan la proteína de la estructura e inactivan eficazmente el gene. Véase, por ej. , la publicación de patente estadounidense N .° 201 1 /0301 073.
Secuencias reguladoras En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un producto génico de interés está unida operativamente a un promotor constitutivo. En otras modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un producto génico de interés está unida operativamente a un promotor inducible. En algunos casos, una secuencia de nucleotidos que codifica un producto génico de interés está unido operativamente a un elemento regulador específico del tejido o específico del tipo celular. Por ejemplo, en algunos casos, una secuencia de nucleotidos que codifica un producto génico de interés está unida operativamente a un elemento regulador específico del fotorreceptor (por ejemplo, un promotor específico del fotorreceptor), por ejemplo, un elemento regulador que otorga expresión selectiva del gene unido operativamente en una célula fotorreceptora. Los elementos reguladores específicos del fotorreceptor adecuados incluyen, por ejemplo, un promotor de rodopsina, un promotor de rodopsina cinasa (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); un promotor del gene beta de la fosfodiesterasa (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9: 1015); un promotor del gene de la retinitis pigmentaria (Nicoud et al. (2007) mencionado anteriormente); un potenciador del gene de la proteína de unión al retinoide interfotorreceptor (I RBP) (Nicoud et al. (2007) mencionado anteriormente); un promotor del gene I RBP (Yokoyama et al. ( 1 992) Exp Eye Res. 55:225).
Composiciones farmacéuticas La presente descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende: a) un virión del rAAV de la presente, como se describe anteriormente; y b) un portador, diluyente, excipiente o amortiguador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el portador, diluyente, excipiente o amortiguador farmacéuticamente aceptable es adecuado para su uso en un humano.
Dichos excipientes, portadores, diluyentes y amortiguadores incluyen cualquier agente farmacéutico que se puede administrar sin toxicidad excesiva. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, de modo no taxativo, líquidos como agua, solución salina, glicerol y etanol. Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden incluir allí, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. De manera adicional, dichos vehículos pueden contener sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias amortiguadoras del pH y similares. En la técnica se conoce una amplia variedad de excipientes farmacéuticamente aceptables y no necesitan describirse en detalle en la presente. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se han descrito ampliamente en varias publicaciones, que incluyen, por ejemplo, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20a edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H .C. Ansel et al. , eds. , 7a ed. , Lippincott, Williams, & Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al. , eds. , 3a ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.
Métodos de administración de un producto génico a una célula de la retina y métodos de tratamiento La presente descripción proporciona un método para administrar un producto génico a una célula de la retina en un individuo, el método comprende administrar al individuo un virión del rAAV de la presente, como se describe anteriormente. El producto génico puede ser un polipéptido o un RNA de interferencia (por ejemplo, un shRNA, un siRNA y similares), un aptámero o una endonucleasa específica del sitio, como se describe anteriormente. La administración de un producto génico a una célula de la retina puede proporcionar el tratamiento de una enfermedad de la retina. La célula de la retina puede ser un fotorreceptor, una célula ganglionar de la retina, una célula de üller, una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal o una célula epitelial pigmentada de la retina. En algunos casos, la célula de la retina es una célula fotorreceptora, por ejemplo, una célula bastón o cono.
La presente descripción proporciona un método para tratar una enfermedad de la retina, el método comprende administrar a un individuo que lo necesita una cantidad eficaz de un virión del rAAV de la presente, como se describe anteriormente. Un virión del rAAV de la presente se puede administrar mediante inyección intraocular, mediante inyección intravítrea o mediante cualquier otro modo o vía de administración conveniente. Otros modos o vías de administración convenientes incluyen, por ejemplo, intravenoso, intranasal, etc.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" estará comprendida en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante experimentación y/o ensayos clínicos. Por ejemplo, para la inyección in vivo, es decir, inyección directamente en el ojo, una dosis terapéuticamente eficaz será de entre alrededor de 1 06 y alrededor de 1015 de los viriones del rAAV, por ejemplo, de alrededor de 1 08 y 1012 de los viriones del rAAV. Para la transducción in vitro, una cantidad eficaz de viriones del rAAV que se debe administrar a las células será de entre alrededor de 108 y alrededor de 1013de los viriones del rAAV. Un experto en la técnica puede establecer fácilmente otras dosificaciones eficaces mediante ensayos de rutina que establecen curvas de respuesta a la dosis.
En algunas modalidades, se puede emplear más de una administración (por ej. , dos, tres, cuatro o más administraciones) para alcanzar el nivel deseado de expresión génica durante un período de varios intervalos, por ejemplo, diariamente, semanalmente, mensualmente, anualmente, etc.
Las enfermedades oculares que se pueden tratar utilizando un método de la presente incluyen, de modo no taxativo, neurorretinopatía macular aguda, enfermedad de Behcet, neovascularización coroidal, uveítis diabética, histoplasmosis, degeneración macular; tal como degeneración macular aguda, degeneración macular no exudativa relacionada con la edad y degeneración macular exudativa relacionada con la edad, edema, tal como edema macular, edema macular cistoide y edema macular diabética, coroiditis multifocal, traumatismo ocular que afecta un sitio o ubicación ocular posterior, tumores oculares, trastornos retiñíanos, tales como oclusión de la vena central de la retina, retinopatía diabética (incluyendo retinopatía diabética proliferativa), vitrorretinopatía proliferativa (PVR), enfermedad de la obstrucción arterial de la retina, desprendimiento de la retina, enfermedad retiniana uveítica, oftalmía simpática, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (VKH), difusión uveal, una afección ocular posterior provocada o influenciada por un tratamiento láser ocular, afecciones oculares posteriores provocadas o influenciadas por una terapia fotodinámica, fotocoagulación, retinopatía de radiación, trastornos de membrana epirretiniana, obstrucción de la vena central de la retina, neuropatía óptica isquémica anterior, disfunción retiniana diabética que no es retinopatía, retinosquisis, retinitis pigmentaria, glaucoma, síndrome de Usher, distrofia de conos y bastones, enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus); degeneración macular hereditaria, degeneración coriorretiniana, amaurosis congénita de Leber; ceguera nocturna estacionaria congénita, coroideremia, síndrome de Bardet-Biedl, telangiectasia macular, neuropatía óptica hereditaria de Leber, retinopatía de la prematuridad y trastornos de la visión del color, incluyendo acromatopsia, protanopia, deuteranopsia y tritanopia.
Acidos nucleicos y células hospedadoras La presente descripción proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside del virus adeno-asociado (AAV) variante de la presente como se describe anteriormente, donde la proteina de la cápside del AAV variante comprende una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV con respecto a una proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, y donde la proteína de la cápside variante, cuando está presente en un virión del AAV, proporciona una mayor infectividad de una célula de la retina en comparación con la infectividad de la célula de la retina mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente. Un ácido nucleico aislado de la presente puede ser un vector del AAV, por ejemplo, un vector del AAV recombinante.
Péptidos de inserción Una proteína de la cápside del AAV variante codificada por un ácido nucleico de la presente tiene un péptido de inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos de longitud insertado en el bucle GH de una cápside del AAV. El péptido de inserción tiene una longitud de 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9 aminoácidos, 1 0 aminoácidos u 1 1 aminoácidos.
El péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las fórmulas que se establecen a continuación.
Por ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de alrededor de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula I : Y i Y2X 1X2 3 5 5X7 Y3Y4 donde: cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; X , si está presente, se selecciona de Leu, Asn y Lys; X2 se selecciona de Gly, Glu, Ala y Asp; X3 se selecciona de Glu, Thr, Gly y Pro; X se selecciona de Thr, lie, Gln y Lys; X5 se selecciona de Thr y Ala; X6 se selecciona de Arg, Asn y Thr; X7 , si está presente, se selecciona de Pro y Asn.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula Ha: ?? Y2X1 X2X3X X5X6X7Y3Y4 donde: cada uno de ??-?4 , si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; cada uno de ^- X es cualquier aminoácido; X5 es Thr; X6 es Arg; y X7 es Pro.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula llb: Y 1 Y2 1X2 3X4X5X6 7 Y3Y4 donde: cada uno de Y1-Y4 , si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; Xi , si está presente, se selecciona de Leu y Asn ; X2, si está presente, se selecciona de Gly y Glu ; X3 se selecciona de Glu y Thr; X4 se selecciona de Thr e He; X5 es Thr; X6 es Arg ; y X7 es Pro.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de 5 a 1 1 aminoácidos de longitud , donde el péptido de inserción es de la Fórmula III ; Yi Y 2 1 X 2X3X4X5X5X7 Y 3 Y4 donde: cada uno de Y-¡ -Y4 , si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu , Gly, Ser y Thr; Xi , si está presente, es Lys; X2 se selecciona de Ala y Asp; X3 se selecciona de Gly y Pro; X4 se selecciona de Gln y Lys; X5 se selecciona de Thr y Ala; X6 se selecciona de Asn y Thr; X7 , si está presente, es Asn .
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de la Fórmula IV: ?? Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4 donde: cada uno de Y i -Y , si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; XL si está presente, es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Leu, Asn, Arg, Ala, Ser y Lys; X2 es un aminoácido con carga negativa o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Gly, Glu, Ala, Val, Thr y Asp; X3 es un aminoácido con carga negativa o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Glu, Thr, Gly, Asp o Pro; X4 se selecciona de Thr, lie, Gly, Lys, Asp y Gln; X5 es un aminoácido polar, un alcohol (un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo libre), o un aminoácido hidrofóbico, o se selecciona de Thr, Ser, Val y Ala; X6 es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Arg, Val, Lys, Pro, Thr y Asn; y X7, si está presente, es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga, o se selecciona de Pro, Gly, Phe, Asn y Arg.
Como ejemplos no taxativos, el péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos que se selecciona de LGETTRP (SEQ I D NO: 13), NETITRP (SEQ ID NO: 14), KAGQANN (SEQ ID NO: 1 5), KDPKTTN (SEQ ID NO: 16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58) , AVDTTKF (SEQ I D NO:59) y STGKVPN (SEQ ID NO:60).
En algunos casos, el péptido de inserción tiene de 1 a 4 aminoácidos espaciadores (?t -?^ en el extremo amino y/o en el extremo carboxilo de cualquiera de LGETTRP (SEQ ID NO: 13), NETITRP (SEQ ID NO: 14), KAGQANN (SEQ ID NO: 15), KDPKTTN (SEQ ID NO: 16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO: 58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59) y STGKVPN (SEQ I D NO:60). Los aminoácidos espaciadores adecuados incluyen, de modo no taxativo, leucina, alanina, glicina y serina.
Por ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: LALGETTRPA (SEQ ID NO:45); LANETITRPA (SEQ I D NO:46), LAKAGQANNA (SEQ I D NO:47), LAKDPKTTNA (SEQ ID NO:48), LAKDTDTTRA (SEQ I D NO:61 ), LARAGGSVGA (SEQ ID NO:62), LAAVDTTKFA (SEQ ID NO:63) y LASTGKVPNA (SEQ ID NO:64). Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: AALGETTRPA (SEQ I D NO:49); AANETITRPA (SEQ ID NO:50), AAKAGQANNA (SEQ ID NO:51 ) y AAKDPKTTNA (SEQ ID NO:52). Como aun otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: GLGETTRPA (SEQ ID NO:53); GNETITRPA (SEQ I D NO:54), GKAGQANNA (SEQ ID NO:55) y GKDPKTTNA (SEQ I D NO:56). Como otro ejemplo, en alg unos casos, un péptido de inserción comprende uno de KDTDTTR (SEQ I D NO: 57), RAGGSVG (SEQ I D NO: 58) , AVDTTKF (SEQ ID NO:59) y STGKVPN (SEQ I D NO:60) , flanq ueado en el extremo C mediante AA y en el extremo N mediante A; o comprende uno de KDTDTTR (SEQ I D NO: 57) , RAGGSVG (SEQ I D NO: 58), AVDTTKF (SEQ I D NO: 59) y STG KVPN (S EQ I D NO:60) flanqueado en el extremo C mediante G y en el extremo N mediante A.
Se puede usar un vector del AAV recombinante de la presente para generar un virión del AAV recombi nante de la presente, como se describe anteriormente. Por lo tanto, la presente descripción proporciona un vector del AAV recom binante que, cuando se introduce a una célula adecuada , puede proporcionar la producción de un virión del AAV recombinante de la presente.
La presente invención proporciona además células hospedadoras, por ejemplo, células hospedadoras aisladas (genéticamente modificadas) , que comprenden un ácido nucleico de la presente. Una célula hospedadora de la presente puede ser una célula aislada, por ejemplo, una célula en cultivo ¡n vitro. U na célula hospedadora de la presente es útil para producir un virión del rAAV de la presente, como se describe a continuación . Cuando se usa una célula hospedadora de la presente para producir un virión del rAAV de la presente, se denomina "célula em paq uetadora". En algunas modalidades, una célula hospedadora de la presente se modifica genéticamente de forma estable con un ácido nucleico de la presente. En otras modal idades, una célula hospedadora de la presente se modifica genéticamente de forma transitoria con un ácido nucleico de la presente.
Se introduce un ácido nucleico de la presente de forma estable o transitoria a una célula hospedadora, utilizando las técnicas establecidas, que incluyen, de modo no taxativo, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfeccion mediada por liposomas y similares. Para la transformación estable, un ácido nucleico de la presente en general incluirá además un marcador seleccionable, por ejemplo, cualquiera de varios marcadores seleccionables conocidos, tal como resistencia a neomicina y similares.
Se genera una célula hospedadora de la presente introduciendo un ácido nucleico de la presente a cualquiera de una variedad de células, por ejemplo, células de mam ífero, que incluyen, por ejemplo, células de murino y células de primate (por ejemplo, células de humano). Las células de mamífero adecuadas incluyen, de modo no taxativo, células y líneas celulares primarias, donde las líneas celulares adecuadas incluyen, de modo no taxativo, células 293, células COS, células HeLa, células Vero, fibroblastos de ratón 3T3, fibroblastos C3H 10T1 /2, células CHO y similares. Los ejemplos no taxativos de células hospedadoras adecuadas incluyen, por ejemplo, células HeLa (por ejemplo, American Type Culture Collection (ATCC) N.° CCL-2), células CHO (por ejemplo, ATCC N° CRL9618, CCL61 , CRL9096), células 293 (por ejemplo, ATCC N° CRL-1573), células Vero, células NI H 3T3 (por ejemplo, ATCC N.° CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por ejemplo, ATCC N.° CCL10), células PC 12 (ATCC N.° CRL1721 ), células COS, células COS-7 (ATCC N.° CRL1651), células RAT1, células L de ratón (ATCC N.° CCLI.3), células embrionarias de riñon humano (HEK) (ATCC N.° CRL1573), células HLHepG2 y similares. También se puede elaborar una célula hospedadora de la presente utilizando un baculovirus para infectar células de insecto, tales como, células Sf9, que producen AAV (véase, por ejemplo, la patente estadounidense N.° 7,271,002; solicitud de patente estadounidense 12/297,958).
En algunas modalidades, una célula hospedadora genéticamente modificada de la presente incluye, además de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside del AAV variante, como se describe anteriormente, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas rep del AAV. En otras modalidades, una célula hospedadora de la presente además comprende un vector del rAAV. Se puede generar un virión del rAAV utilizando una célula hospedadora de la presente. Se describen métodos de generar un virión del rAAV en, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense N.° 2005/0053922 y la publicación de patente estadounidense N.° 2009/0202490.
Ejemplos Los siguientes ejemplos se proponen para proporcionarle a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completa sobre cómo realizar y usar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención, ni pretenden describir que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos que se llevaron a cabo. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura se expresa en grados Ceisius y la presión es la atmosférica o cercana a esta. Se pueden utilizar abreviaturas estándar, por ejemplo, pb, par/es de base/s; kb, kilobase/s; pl, picolitro/s; s o seg, segundo/s; min, minuto/s; h o hr, hora/s; aa, aminoácido/s; kb, kilobase/s; pb, par/es de base/s; nt, nucleótido/s; i.m., intramuscular/mente; i.p., intraperitoneal/mente; s.c, subcutánea/mente; y similares.
Ejemplo 1: Variante de AAV con mayor transducción de células de la retina El enfoque utilizado fue crear una genoteca de expresión de péptidos introduciendo un único sitio AvrW en el genoma AAV2 de tipo salvaje entre el aminoácido 587 y 588 mediante mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se usó una inserción de 21 nucleótidos aleatorios, 7mero For, para sintetizar las inserciones de DNA de doble cadena, junto con el cebador antisentido 7mero Rev. Las inserciones de DNA de doble cadena resultantes se clonaron en el sitio AvrW del genoma luego de la digestión con Nhe\, produciendo una genoteca de expresión de 7mero diversos que luego se empaquetó (Perabo et al . , 2003; Muller et al. , 2003) . El virus se generó, de modo que cada genoma viral se empaquetara o encapsidara dentro de la variante de la prote ína de la cápside que codifica el genoma. En este sentido, las mejoras funcionales identificadas a través de la selección pueden estar ligadas a la secuencia del genoma que codifica esta mejora de la función conten ida dentro de la cápside viral .
Esta genoteca se sometió a la selección positiva dentro de los ratones rho-GFP (Wensel et al . (2005) Vision Res. 45: 3445). En resumen , en una ronda de selección , se inyectaron intravítreamente ratones rho-GFP adultos con 2µ?_ de solución salina tamponada con fosfato (PBS) dializada , genoteca purificada con iodixanol con una titulación genóm ica de aproximadamente 1 x 1 01 2 genomas virales (vg)/mL. Se pasó una aguja desechable de calibre 30 1 /2 ultrafina a través de la esclerótica del ojo del animal , en el ecuador y cerca del limbo, en la cavidad vitrea. La inyección de 2 µ? del virus se realizó con observación directa de la aguja en el centro de la cavidad vitrea . Una semana después de la inyección los ojos se enuclearon y las retinas se separaron util izando una luz, tratam iento con proteasa de la papa ína, seguido de aislam iento de poblaciones fotorreceptoras mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . Luego, los viriones satisfactorios se amplificaron por PCR a partir de las posteriores extracciones genóm icas y además se clonaron y reempaquetaron para inyección .
Se realizaron iteraciones adicionales de esta selección , lim itando el conj unto de variantes a un subconjunto con las mutaciones más permisivas. Luego de tres iteraciones, se realizó una ronda de PCR propensa a error, para crear una generación adicional de variantes para la selección. En total, este proceso se repitió durante dos generaciones. En este sentido, este proceso de evolución dirigida creó variantes del AAV que permite los fotorreceptores a través de la aplicación de selección positiva e indujo la mutagénesis, similar al proceso de evolución natural.
Posteriormente, los genes cap de cincuenta variantes se secuenciaron para determinar las variantes más prominentes y satisfactorias para lograr mutaciones permisivas para transducción intravítrea de fotorreceptores. De los 50 clones, 46 dieron secuencias legibles de una inserción 7mero. Increíblemente, casi dos tercios de clones contenían el mismo motivo 7mero distinto (~588LGETTRP~; SEQ ID NO: 13). Curiosamente, la siguiente variante más prominente (~588NETITRP~; SEQ ID NO: 14) también contenía un motivo flanqueante similar que consiste en un residuo de arginina con carga positiva entre un residuo de treonina polar y prolina no polar (TRP).
Tabla 1 Tabia 1 La secuenciación de variantes aisladas a partir de evolución dirigida revela un alto grado de convergencia en las genotecas de virus. Todas las variantes derivadas de la genoteca AAV2 7mero, donde aproximadamente 64 % de las variantes conten ían el mismo motivo 7mero (~588LGETTRP~ (SEQ I D NO: 1 3)).
Entre las secuencias de inserción 7mero, había preferencias moderadas en posiciones particu lares, por ejemplo, u n aminoácido con carga positiva en la posición 1 ; un ami noácido con carga negativa en la posición 2; un alcohol (por ejemplo, un aminoácido que tiene un grupo alcohol (un g rupo h idroxilo libre) , tal como Thr o Ser) en la posición 5.
Las inserciones 7mero se flanquearon mediante los espaciadores, como se m uestra en la Tabla 2: Tabla 2 Clon Frecuencia ~588LALGETTRPA~ (SEQ ID NO: 45) 31 ~588LANETITRPA~ (SEQ ID NO: 46) 5 ~588LAKAGQANNA~ (SEQ ID NO: 47) 3 ~588LAKDPKTTNA~ (SEQ ID NO: 48) 2 ~b8tíLAKDTDTTRA~ (SEQ ID NO: 61) 2 ~588LARAGGSVGA~ (SEQ ID NO: 62) 1 ~b8BLAAVDTTKFA~ (SEQ ID NO: 63) 1 ~b8ULASTGKVPNA~ (SEQ ID NO: 64) 1 Figura 1. Modelo de la cápside tridimensional representativo de AAV2 que contiene un heptámero aleatorio (se muestra en anaranjado) luego del aminoácido 587. Esta área de la cápside del AAV2 posi blemente participa en la u nión al receptor de la superficie celu lar.
En vista del alto grado de convergencia de la genoteca de la selección descrita anteriormente, se clonó una forma recombinante de AAV2 ~588LG ETTRP~ (SEQ I D NO: 1 3; llamada 7M8) y em paquetó el vector con un transgene scCAG-GFP para visualizar su perfil de transduccion. Tres semanas luego de la inyección intravítrea en ratones adultos, se observó una fuerte expresión de varios tipos celulares, incluyendo células ganglionares de retina (RGC) y células de Müller. Cabe destacar que se observó la transduccion de fotorreceptores en las retinas inyectadas con 7M8, tal como se observó mediante la expresión de GFP en los núcleos de la capa nuclear exterior (ON L) (flechas rojas) y en segmentos exteriores (Figura 2 , flecha azu l) , mientras q ue AAV2 no mostró expresión fotorreceptora discernible.
Figura 2 La variante de AAV2 7M8 (derecha) demuestra mayores niveles de transducción fotorreceptora intravítrea con respecto a AAV2 (izquierda) . Microscopía confocal de secciones transversales de la retina tres semanas luego de la inyección i ntravítrea de 2p L de 1 x1 012 vg/mL de AAV2 7M8 y AAV2 scCAG GFP en ratones adultos. Las flechas rojas (superior) denotan los núcleos fotorreceptores y las flechas azules (superior) denotan los segmentos exteriores fotorreceptores.
En vista de estos aumentos en la transducción de las células de la retina , se realizó un i ntento de aumentar la especificidad de la expresión a través del uso de un transgene ss Rho-eGFP que contiene un promotor de rodopsina específica del fotorreceptor para resolver mejor las eficacias de transducción , específicamente en los fotorreceptores (Figura 3) . De hecho, el uso de u n promotor Rho específico del fotorreceptor limitó la expresión de G FP a los fotorreceptores. Se realizó un intento de mejorar la eficacia de la transducción de 7M8 combinando un enfoq ue de diseño racional para el enfoque de evolución dirigida anterior. Por lo tanto, se mutagenizaron cuatro residuos de tirosina expuestos en la superficie a fenilalaninas en la cápside 7M8 (Y273F, Y444F, Y500F y Y730F) que anteriormente había demostrado aumentar la infectividad fotorreceptora (Petrs-Silva et al. , 2009) . Curiosamente, la adición de mutaciones disminuyó la cantidad de fotorreceptores transducidos en comparación con el virus original, tal como se muestra mediante FACS de los fotorreceptores GFP(+) de retinas infectadas con 7m8 o 7m8-4YF (Figura 4).
Figura 3. Las imágenes de fluorescencia representativas de crioimágenes de retinas que muestran la expresión de GFP que resulta de 7M8 que lleva el gene de GFP bajo el control del promotor CAG ampliamente extendido (izquierda) o un promotor Rho específico del fotorreceptor (derecha).
Figura 4. Células fotorreceptoras de GFP(+) por millón de células de la retina, según el conteo de la citometría de flujo. 7m8 transduce más de 2x la cantidad de fotorreceptores en comparación con 7m8 que tiene 4 mutaciones de tirosina (superior).
Ejemplo 2: Tratamiento de retinosquisis Utilizando la construcción de expresión 7m8-rho-RS1, se administró una proteína retinosquisina funcional (RS1) a ratones que carecían de retinosquisina (ratones que carecían de Rs1h; Rs1h es el homólogo de ratón del RS1 humano). El vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de retinosquisina funcional con control transcripcional de un promotor de rodopsina. Ver las Figuras 13A-C, donde la secuencia de nucleótidos en negrita y subrayada (nucleótidos 4013-4851) son el promotor de rodopsina; y los nucleótidos 4866-5540 (donde las secuencias de inicio atg y fin tga se muestran en negrita) codifican una proteína RS1 humana.
La construcción 7m8-rho-RS1 se administró intravítreamente a ratones Rs1h-/- en P15. Se generaron ratones Rs1h-/- a través de la interrupción dirigida del exón 3 del gene Rs1h, como se describe (Weber et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99:6222). Los ratones Rs1h-/-carecen del producto de la proteína Rs1h, tienen un ERG electronegativo (por ejemplo, una onda b reducida con conservación relativa de la onda a) y división de las capas de la retina, algo similar a lo que se observa en pacientes humanos con retinosquisis. La inyección del vector 7m8-rho-RS1 en Rsli - provocó niveles altos de expresión de RS1 panretiniana de los fotorreceptores en la retina. La expresión de RS1 provocó una mejora de la morfología retiniana con una disminución de la cantidad y tamaño de las cavidades en la retina, como se observa en la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) para imagenología (Figuras 7A-I), un rescate de la onda b de ERG (Figuras 8A-D) y conservación estructural a largo plazo de la retina (Figuras 9A-E).
Figuras 7A-I. Imágenes de SD-OCT de alta resolución representativas de las retinas inyectadas con 7m8-rho-GFP (columna izquierda), 7m8-rho-RS1 (columna central) o animales de tipo salvaje no inyectados (columna derecha). Se tomaron imágenes del fondo a través de la capa nuclear interna de la retina superior y excluyen otras capas (FIG. 7A-C). Se tomaron imágenes transversales de la retina superior (FIG. 7D-F) e inferior (FIG. 7G-I) usando la cabeza del nervio óptico como punto de referencia.
La retina RS1 no tratada aumenta el espesor total cuando se mide desde la membrana limitante interna (ILM) hasta los fotorreceptores, a medida que evoluciona la patología debido a que la esquisis divide la retina interna. Este proceso es distinto al observado en la mayoría de las enfermedades degenerativas retinianas (RDD) que no forman esquisis, pero presentan muerte de células fotorreceptoras progresiva en la INL y adelgazamiento de la retina y pérdida de la amplitud de ERG concomitante. En RS1 , la ONL se afina ya que los fotorreceptores mueren de esta enfermedad, pero esto es distinto del cambio de espesor global de la retina. En general, se cree que una terapia satisfactoria de RS 1 devolvería el espesor global de la retina al tipo salvaje y mejoraría la pérdida fotorreceptora en la ONL. En la mayoría de las RDD que no son Rs 1 , la pérdida de fotorreceptores, marcada por el afinamiento de ONL, se compara con una disminución del resultado fisiológico de la retina, según se mide mediante la amplitud de ERG. RS 1 es uno de los pocos ejemplos de una enfermedad retiniana donde la patología aumenta el espesor de la retina con pérdida de la amplitud de erg concomitante. En resumen, el reestablecimiento del producto génico RS 1 , una retiniano extracelular, afina la retina y la lleva al espesor del tipo salvaje y la amplitud de erg vuelve a los niveles casi normales a medida que se resuelve la esquisis.
La Figura 8A muestra una comparación de rescate funcional de ojos Rs1 -/- no tratados con los ojos inyectados con AAV2-rho-RS1 , 7m8-rho-GFP y 7m8-rho-RS 1 de un mes (izquierda) y 4 meses (derecha) luego de la inyección. Un mes luego de la inyección, 7m8-rho-RS1 provocó un rescate considerable de la amplitud de onda b de ERG, mientras que AAV2-rho. RS 1 fue estadísticamente indistinguible de los ojos no tratados.
Luego de 4 meses, la amplitud de 7m8-rho-RS1 aumenta adicionalmente hacia la amplitud de tipo salvaje (derecha) . La Fig ura 8B muestra que las trazas de ERG representativas de ojos inyectados con 7m8-rho-RS 1 presentan una mejor amplitud de la onda a y la onda b y una forma de onda más parecida a los ojos de tipo salvaje, en comparación con los ojos inyectados con 7m8-rho-G FP. La Figura 8C muestra q ue la am plitud de la onda b escotópica de campo total que resulta de un estímulo de alta intensidad ( 1 log cd x s/m2) se registró mensualmente comenzando un mes luego de la" inyección a P 1 5 para cada afección . Se registraron tres respuestas y se promediaron para cada ojo en cada momento.
Se trazaron las amplitudes de onda b de ERG promedio en función del tiem po después de la inyección . Se usó n=7 para ambas condiciones. La Figura 8D muestra un anál isis de las respuestas de ERG en condiciones escotópicas (trazas superiores, intervalo de estímulo de -3 a 1 log cd x s/m2) y fotópicas (trazas inferiores, intervalo de -0.9 a 1 .4 log cd x s/m2) indica una mejora de la función de bastones y conos durante un intervalo de intensidades de estím ulos.
Figuras 9A-E. Mejoras sostenidas en el espesor retiniano medido a los 1 0 meses luego del tratamiento con 7m8-rho-RS 1 . Imágenes de SD-OCT transversales representativas de retinas tratadas con a) 7m8-rho-RS 1 (FI G . 9A) o b) 7m8-rho-GFP (FI G . 9B) 10 meses luego de la inyección centrada en la cabeza del nervio óptico. Las medidas de c) espesor retiniano (FIG . 9C) , d) espesor de ON L (FIG. 9D) y e) y espesor del segmento interno y externo (FIG. 9E) se trazan en función de la distancia desde la cabeza del nervio óptico.
Ejemplo 3: Variante de AAV utilizada para administrar una proteína a las células de la retina en monos Se generó un virión del AAV2 recombinante (7m8 que lleva GFP bajo el control de un promotor de connexin36). El virión del AAV2 recombinante incluyó una variante de la cápside del AAV2 con una inserción del péptido LALGETTRPA entre los aminoácido 587 y 588 de la cápside del AAV2, y GFP bajo el control transcripcional de un promotor de connexin36, que se expresa en las interneuronas. El virión del rAVV2 se inyectó intravítreamente en el ojo de un mono. Los datos se muestran en las Figuras 18A-C.
La Figura 19 proporciona una imagen de fondo de fluorescencia que muestra la expresión de GFP en la parte posterior de la retina 9 semanas luego de la administración de 7m8 que lleva el GFP bajo el control de un promotor de connexin36. En comparación con el serotipo AAV2 parental (Yin et al, IOVS 52(5); 2775), se observó un nivel de expresión más alto en el anillo foveal, y se observó fluorescencia visible en la retina central fuera de la fovea.
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Si bien la presente invención fue descrita con referencia a las modalidades específicas de esta, los expertos en la técnica deberán entender que pueden realizarse varios cambios y que pueden sustituirse los equivalentes sin apartarse del verdadero espíritu y alcance de la invención. Además, se pueden realizar varias modificaciones para adaptar una situación, material, composición de materia, proceso, paso o pasos del proceso particular al objetivo, espíritu y alcance de la presente invención. Se pretende que dichas modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (27)

REIVINDICACIONES
1 . Un virión del virus adenoasociado recombínante (rAAV) que comprende: a)una proteína de la cápside del AAV variante, donde la proteína de la cápside del AAV variante comprende una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en el bucle GH de la proteína de la cápside, con respecto a una proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, y donde la proteína de la cápside variante confiere una mayor infectividad de una célula de la retina en comparación con la infectividad de la célula de la retina mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside AAV parental correspondiente; y b) un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico.
2. El virión del rAAV de la reivindicación 1 , donde la inserción es un péptido de la Fórmula I , Fórmula l ia, Fórmula I I I o Fórmula IV.
3. El virión del rAAV de la reivindicación 2, donde la inserción comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de LGETTRP (SEQ I D NO: 1 3), NETITRP (SEQ I D NO: 14), KAGQANN (SEQ I D NO: 1 5), KDPKTTN (SEQ ID NO: 16), KDTDTTR (SEQ I D NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ I D NO:59) y STGKVPN (SEQ I D NO:60).
4. El virión del rAAV de la reivindicación 1 , donde la célula de la retina es un fotorreceptor, una célula ganglionar de la retina, una célula de Müller, una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal o una célula epitelial pigmentada de la retina.
5. El virión del rAAV de la reivindicación 1 , donde el sitio de inserción está entre los aminoácidos 587 y 588 de AAV2, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV1 , entre los aminoácidos 575 y 576 de AAV5, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV6, entre los aminoácidos 589 y 590 de AAV7, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV8, entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV9, o entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV10.
6. El virión del rAAV de la reivindicación 1 , donde el virión del rAAV muestra un aumento de la infectividad de al menos 10 veces de una célula de la retina en comparación con la infectividad de la célula de la retina mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente.
7. El virión del rAAV de la reivindicación 1 , donde el virión del rAAV muestra un aumento de la infectividad de al menos 50 veces de una célula de la retina en comparación con la infectividad de la célula de la retina mediante un virión del AAV que comprende la proteína de la cápside del AAV parental correspondiente.
8. El virión del rAAV de la reivindicación 1 , donde el producto génico es un RNA de interferencia o un aptámero.
9. El virión del rAAV de la reivindicación 1 , donde el producto génico es un polipéptido.
10. El virión del rAAV de la reivindicación 7, donde el polipéptido es un polipéptido neuroprotector, un polipéptido anti-angiogénico o un polipéptido que mejora la función de una célula de la retina.
1 1 . Una composición farmacéutica que comprende: a) un virión del virus adeno-asociado recombinante de la reivindicación 1 ; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
1 2. Un método para administrar un producto génico a una célula de la retina en un individuo, el método comprende administrar al individuo un virión del virus adeno-asociado recombinante (rAAV) de acuerdo con la reivindicación 1 .
1 3. El método de la reivindicación 1 1 , donde el producto génico es un polipéptido.
14. El método de la reivindicación 1 1 , donde el producto génico es un RNA de interferencia corto o un aptámero.
15. El método de la reivindicación 13, donde el polipéptido es un factor neuroprotector, un polipéptido anti-angiogénico, un factor anti-apoptótico o un polipéptido que mejora la función de una célula de la retina.
16. El método de la reivindicación 1 3, donde el polipéptido es un factor neurotrófico derivado de células gliales, factor de crecimiento de fibroblastos 2, neurturina, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento de nervios, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor de crecimiento epidérmico, rodopsina, inhibidor de la apoptosis unido a X, retinosquisina, RPE65, proteína 1 que interactúa con el regulador de GTPasa de retinitis pigmentaria, periferina, periferina-2, una rodopsina o sonic hedgehog.
17. Un método para tratar una enfermedad retiniana, el método comprende administrar a un individuo que lo necesita una cantidad eficaz de un virión del virus adeno-asociado recombinante (rAAV), de acuerdo con la reivindicación 1 .
18. El método de la reivindicación 17, donde dicha administración es mediante inyección intraocular.
1 9. El método de la reivindicación 17, donde dicha administración es mediante inyección intravítrea.
20. El método de la reivindicación 1 7, donde la enfermedad ocular es glaucoma, retinitis pigmentaria, degeneración macular, retinosquisis, amaurosis congénita de Leber, retinopatía diabética, acromatopsia o daltonismo.
21 . Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside del virus adeno-asociado (AAV) variante, donde la proteína de la cápside del AAV variante comprende una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos en el bucle GH de la proteína de la cápside con respecto a una proteína de la cápside del AAV parental correspondiente, y donde la proteína de la cápside variante, cuando está presente en un virión del AAV, proporciona una mayor infectividad del virión del AAV de una célula de la retina.
22. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 21 , donde el sitio de inserción está entre los aminoácidos 587 y 588 de AAV2, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV1 , entre los aminoácidos 575 y 576 de AAV5, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV6, entre los aminoácidos 589 y 590 de AAV7, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV8, entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV9, o entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV10.
23. Una célula hospedadora aislada modificada genéticamente que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 21 .
24. Una proteína de la cápside del virus adeno-asociado (AAV) variante, donde la proteína de la cápside del AAV variante comprende una inserción de alrededor de 5 aminoácidos a alrededor de 1 1 aminoácidos, donde la inserción de aminoácidos está en el bucle GH de una cápside del AAV nativo, donde la inserción es un péptido de la Fórmula I , Fórmula l ia, Fórmula I I I o Fórmula IV.
25. La proteína de la cápside del AAV variante de la reivindicación 24, donde la inserción comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de LGETTRP (SEQ I D NO: 1 3), NETITRP (SEQ ID NO: 14), KAGQANN (SEQ I D NO: 15), KDPKTTN (SEQ I D NO: 16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ I D NO:59) y STGKVPN (SEQ I D NO:60).
26. La proteína de la cápside del AAV variante de la reivindicación 24, donde el sitio de inserción está entre los aminoácidos 587 y 588 de AAV2, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV1 , entre los aminoácidos 575 y 576 de AAV5, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV6, entre los aminoácidos 589 y 590 de AAV7, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV8, entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV9, o entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV10.
27. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la cápside del AAV variante de la reivindicación 24.
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