CN115335529A - 用于递送kh902(康柏西普)的重组腺相关病毒及其用途 - Google Patents

用于递送kh902(康柏西普)的重组腺相关病毒及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开的多个方面涉及在细胞或受试者中编码抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)剂的重组腺病毒(例如，rAAV2.7m8‑KH902)。在一些实施方案中，本文所述的组合物可用于治疗患有与血管生成或异常的VEGF活性/信号传导相关的疾病的受试者。

Description

用于递送KH902(康柏西普)的重组腺相关病毒及其用途
相关申请
本申请根据35 U.S.C.119(e)要求于2019年11月26日提交的题为“RECOMBINANTADENO-ASSOCIATED VIRUS FOR DELIVERY OF KH902(CONBERCEPT)AND USES THEREOF”(“用于递送KH902(康柏西普)的重组腺相关病毒及其用途”)的美国临时申请序列号62/940,288的申请日的权益，其全部内容通过引用并入本文。
发明背景
KH902是一种目前正在进行用于抗VEGF治疗的临床试验的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受体融合蛋白。目前抗VEGF治疗的挑战包括需要重复注射以维持抗VEGF药物的功效和长效制剂。因此，需要开发用于将抗VEGF剂长期递送至所靶向的细胞和/或组织中的新方法。
发明内容
本公开的多个方面涉及用于将抗VEGF剂(例如，KH902)递送至细胞和/或组织(例如，受试者的细胞)的重组腺相关病毒(rAAV)。本公开部分基于经工程化以递送抗VEGF剂(例如，KH902)的rAAV。
在一些方面，本文公开的rAAV包括含有编码转基因表达盒的核酸的AAV衣壳(例如，AAV2.7m8衣壳)，所述表达盒包含侧翼是AAV反向末端重复(ITR)的抗血管内皮生长因子(例如，抗VEGF)剂的核酸序列。在一些实施方案中，抗-VEGF剂是人VEGF诱饵受体。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体2的细胞外结构域3和4。
在一些实施方案中，抗VEGF剂是人VEGF受体融合蛋白。在一些实施方案中，人VEGF受体融合蛋白包含与人VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，人VEGF受体融合蛋白包含与免疫球蛋白的Fc部分融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，其中人VEGF受体融合蛋白包含与免疫球蛋白的Fc部分融合的人VEGF受体3的细胞外结构域3和4。在一些实施方案中，人VEGF受体融合蛋白包含与人VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合，并进一步与免疫球蛋白的Fc部分融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、90％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其部分。
在一些实施方案中，人VEGF受体融合蛋白包含与免疫球蛋白的Fc部分融合的人VEGF受体。在一些实施方案中，抗VEGF剂是KH902。在一些实施方案中，转基因包含与SEQ IDNO:1所示的核酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、90％、99％或100％同一性的核酸序列，或其密码子优化的变体。
在一些实施方案中，抗VEGF受体(例如，VEGF诱饵受体)能够结合抗血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PlGF)。
在一些实施方案中，分离的核酸(例如，表达盒)进一步包含有效连接至转基因的启动子。在一些实施方案中，启动子包含巨细胞病毒(CMV)早期增强子。在一些实施方案中，启动子是嵌合巨细胞病毒(CMV)/鸡β-肌动蛋白(CB)启动子。
在一些实施方案中，表达盒(例如，表达盒中的转基因)包含一个或多个内含子。在一些实施方案中，至少一个内含子位于启动子和编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的核酸序列之间。在一些实施方案中，表达盒(例如，表达盒中的转基因)包含Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列位于内含子和编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的转基因之间。
在一些实施方案中，表达盒(例如，表达盒中的转基因)包含3'非翻译区(3'UTR)。在一些实施方案中，表达盒(例如，表达盒中的转基因)进一步包含一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，一个或多个miRNA结合位点位于转基因的3'UTR中。在一些实施方案中，至少一个miRNA结合位点是免疫细胞相关的miRNA结合位点。在一些实施方案中，免疫细胞相关的miRNA选自：miR-15a、miR-16-1、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-21、miR-29a/b/c、miR-30b、miR-31、miR-34a、miR-92a-1、miR-106a、miR-125a/b、miR-142-3p、miR-146a、miR-150、miR-155、miR-181a、miR-223和miR-424、miR-221、miR-222、let-7i、miR-148和miR-152。
在一些实施方案中，ITR是具有选自AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3ITR、AAV4 ITR、AAV5ITR和AAV6 ITR的血清型的腺相关病毒ITR。
在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸包括与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少80％、90％、99％或100％同一性的核酸序列，或其部分。
在一些实施方案中，如本公开所述的分离的核酸位于质粒上。在一些实施方案中，所述质粒包含与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同一性的核酸序列，或其部分。
在一些方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：(i)rAAV衣壳蛋白，其为AAV2.7m8，和(ii)分离的核酸，其在5'至3'的顺序上包含：(a)5'AAV ITR；(b)CMV增强子；(c)CBA启动子；(d)鸡β-肌动蛋白内含子；(e)Kozak序列；(f)编码抗VEGF剂的转基因，其中所述抗VEGF剂由SEQ ID NO:1中的核酸序列编码；(g)兔β-珠蛋白polyA信号尾；和(h)3'AAV ITR。
在一些实施方案中，AAV2.7m8对眼组织具有嗜性(tropism)。在一些实施方案中，眼组织包括眼神经元、视网膜、巩膜、脉络膜、视网膜、玻璃体、黄斑、中心小凹(fovea)、视盘(optic disc)、晶状体、瞳孔、虹膜、房水、角膜、结膜睫状体或视神经。
在一些实施方案中，rAAV是单链AAV(ssAAV)。
包含本文所述的rAAV的宿主细胞也在本公开的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或昆虫细胞。
本公开的另一个方面涉及包含如本文所述的rAAV的药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，将药物组合物配制用于玻璃体内注射、静脉内注射、瘤内注射或肌内注射。
在一些方面，本公开涉及抑制有此需要的受试者中的VEGF活性的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的rAAV、宿主细胞或药物组合物。
在一些方面，本公开涉及向有此需要的受试者递送抗VEGF剂的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的rAAV、宿主细胞或药物组合物。
在一些方面，本公开涉及治疗有此需要的受试者中的血管新生相关疾病(neovascularization associated disease)、血管生成相关疾病(angiogenesisassociated disease)或VEGF相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的rAAV、宿主细胞或药物组合物。
在一些方面，rAAV的递送导致至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的VEGF活性抑制。
在一些实施方案中，受试者是非人类哺乳动物。在一些实施方案中，非人类哺乳动物是小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人类灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，受试者被诊断为或怀疑患有血管生成相关疾病或VEGF相关疾病。在一些实施方案中，所述疾病是肿瘤、癌症、视网膜病变、湿性年龄相关性黄斑变性(wetage related macular degeneration，wAMD)、黄斑水肿、脉络膜血管新生或角膜血管新生。在一些实施方案中，施用是全身施用，例如静脉内注射。在一些实施方案中，施用是直接施用至眼组织，例如玻璃体内注射、眼内注射或外用施用。
在一些实施方案中，施用导致将转基因递送至眼组织。在一些实施方案中，眼组织包括眼神经元、视网膜、巩膜、脉络膜、视网膜、玻璃体、黄斑、中心小凹、视盘、晶状体、瞳孔、虹膜、房水、角膜、结膜睫状体或视神经。
附图详细说明
图1A-1C显示了rAAV-CBA-KH902载体和序列。所表达的rAAV载体表达分泌的KH902(康柏西普(Conbercept))，并由CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)盒驱动。还在起始密码子的5'处设计了Kozak序列以增强翻译起始。显示了质粒的图谱(图1A)和读取链序列(图1B，SEQ ID NO:3)。包含5'-ITR和3'-ITR并由5'-ITR和3'-ITR包围的序列被包装到AAV病毒体中(图1C)。
图2显示了经AAV2.7m8-KH902感染的RPE-条件培养基的蛋白质印迹分析。对每条泳道上方标示的指定条件下的15μl ARPE-19-(左)或hTERT-RPE1-(右)条件培养基进行PAGE。半干转移后，用抗VEGFR1抗体(R&D Systems BAF321)对膜进行印迹。每个印迹包括20ng KH902药物(最后一条泳道)作为参考。
图3A-3C显示了AAV2.7m8-KH902载体的体外功能验证。在KH902存在下，经VEGF刺激(25ng/mL)的HUVEC的血管生成或增殖能力；或用AAV2.7m8-KH902或对照GFP载体感染的RPE细胞的条件培养基(1:10稀释)。分别通过管形成测定(图3A和3B)或通过CCK-8活性(图3C)来定量抗VEGF活性。*，p<0.01；**，p<0.001；***，p<0.0001。
图4A-4B显示了在氧诱导的视网膜病变小鼠模型中对rAAV2.7m8-KH902的评估。图4A显示了用rAAV2.7m8-Egfp(左栏)和5:1比例的rAAV2.7m8-KH902:rAAV2-Egfp混合物(右栏)注射并在解剖后立即成像的眼的明场图像。同一行中的眼来自同一只动物，因此，注射了rAAV2.7m8-Egfp的眼可作为个体动物内病理诱导程度的对照。图4B显示了来自代表性小鼠的眼的荧光成像，然后将其平封(flat-mounted)并进行异凝集素-B4染色。阳性转导区域由EGFP表达标记。rAAV2.7m8-KH902未降低正常的血管发育，且只些许影响动脉瘤结节的形成。
图5显示了经rAAV处理的眼出现病变的百分比。对图4A-4B中小鼠眼的水肿或挽救进行评分。实验组：n＝7。
图6A-6D显示了激光激光诱导的脉络膜血管新生后的rAAV2.7m8-KH902处理。图6A显示了用不同浓度的rAAV2.7m8-KH902处理激光损伤诱导的CNV。小鼠眼在rAAV注射前5天受损。rAAV2.7m8-EGFP用作阴性对照。rAAV2.7m8-KH902以三种不同的剂量注射：未稀释(3E9 vg/眼)、1:10稀释(3E8 vg/眼)和1:20稀释(1.5E8 vg/眼)。点代表平均值±SEM。图6B显示了在AAV2.7m8-KH902处理后对炎症细胞向眼中浸润的检测。用rAAV2.7m8-EGFP(对照)或5:1比例的rAAV.2.7m8-KH902和rAAV-2.7m8-EGFP(rAAV2.7m8-KH902，3E9 vg/眼)处理小鼠。一般免疫细胞(CD4，左栏)、血小板(CD41，中栏)或抗原呈递细胞(II类MHC，右栏)的细胞标志物用于检测浸润的免疫细胞。异凝集素B4(IB4)用于检测内皮细胞；外核层(ONL)；内核层(INL)；神经节细胞层(GCL)。图6C显示了在不同剂量的AAV2.7m8-KH902处理后对炎症细胞浸润的检测。通过玻璃体内注射3E9 vg/眼的AAV2.7m8-EGFP或3E8 vg/眼或3E9 vg/眼的5:1比例的包装有KH902和EGFP的AAV2.7m8对小鼠进行处理。显示了针对一般免疫细胞(CD4)、血小板(CD41)、抗原呈递细胞(II类MHC)、EGFP、内皮细胞(IB4和PECAM1)和KH902(VEGFR1)的细胞标志物。图6D显示了在以(3E9 vg/眼)玻璃体内注射AAV2.7m7-KH902后小鼠视网膜中KH902的定量。每两周一次地收集经注射的眼，进行RNA提取和cDNA文库构建准备。通过ddPCR对转录物进行定量。Y轴，针对看家基因gusb进行标准化的相对KH902转录水平。X轴，注射后周数。n＝2-3；平均值±SD。
发明详述
在一些方面，本公开涉及用于将血管抗血管内皮生长因子(抗-VEGF)剂(例如，VEGF受体融合蛋白，例如KH902)持续地长期递送至细胞和/或组织的组合物和方法(例如，受试者的细胞和/或组织)。本公开部分基于具有AAV衣壳(例如AAV2.7m8)的重组腺相关病毒(rAAV)，所述AAV衣壳含有经工程化以表达编码抗VEGF剂(例如，VEGF受体融合蛋白，例如KH902)的转基因的核酸或其变体。
重组腺相关病毒(rAAV)
在一些方面，本公开提供了分离的腺相关病毒(AAV)。如本文关于AAV使用的，术语“分离的”是指经人工产生或获得的AAV。可以使用重组方法产生分离的AAV。此类AAV在本文中被称为“重组AAV”。重组AAV(rAAV)优选具有组织特异性靶向能力，从而将rAAV的转基因特异性递送至一种或多种预定组织(例如眼组织)。AAV衣壳是确定这些组织特异性靶向能力(例如，组织嗜性)的重要因素。因此，可以选择具有适合于被靶向组织的衣壳的rAAV。
获得具有所需衣壳蛋白的重组AAV的方法是本领域公知的。(参见，例如，US 2003/0138772，其内容通过引用以其整体并入本文)。通常，这些方法包括培养含有编码AAV衣壳蛋白的核酸序列；功能性rep基因；包含AAV反向末端重复(ITR)和转基因的重组AAV载体；和允许将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中的足够辅助功能的宿主细胞。在一些实施方案中，衣壳蛋白是由AAV的cap基因编码的结构蛋白。AAV包含三种衣壳蛋白，即病毒体蛋白1至3(命名为VP1、VP2和VP3)，所有这些蛋白均通过可变剪接从单个cap基因转录。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3的分子量分别为约87kDa、约72kDa和约62kDa。在一些实施方案中，在翻译后，衣壳蛋白在病毒基因组周围形成球形的60-mer蛋白壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组、递送基因组并与宿主相互作用。在一些方面，衣壳蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有对眼组织或肌肉组织的嗜性。在一些实施方案中，眼组织包括眼神经元、视网膜、巩膜、脉络膜、视网膜、玻璃体、黄斑、中心小凹、视盘、晶状体、瞳孔、虹膜、房水、角膜、结膜睫状体或视神经。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白靶向眼细胞类型(例如，感光细胞、视网膜细胞等)。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有对光感受器(例如，感光细胞)的嗜性。在一些实施方案中，具有对感光细胞的嗜性的AAV衣壳蛋白是AAV7m8衣壳蛋白。“7m8衣壳蛋白”是指具有氨基酸***的AAV衣壳蛋白，所述氨基酸***包含位于衣壳蛋白的溶剂暴露的GH环中的7-mer氨基酸序列“LGETTRP”(SEQ ID NO:11)。通常，7m8衣壳蛋白可以是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9等的包含7-mer氨基酸***的衣壳蛋白。在本公开的范围内，可以将7-mer氨基酸序列***任何AAV血清型衣壳蛋白中以形成“7m8”衣壳蛋白。在一些实施方案中，7m8衣壳蛋白除了“LGETTRP”(SEQ ID NO:11)氨基酸***外，还包含一个或多个氨基酸取代、***、缺失或其任何组合。
在一些实施方案中，7-mer氨基酸序列***在AAV2衣壳蛋白的GH环之间(例如，AAV2衣壳蛋白的氨基酸位置587和588之间，例如NCBI参考序列号中所示。在一些实施方案中，具有氨基酸***的AAV2衣壳蛋白称为AAV2.7m8，并且由例如Dalkara等人(2013)Science Translational Medicine,5(189):189RA76描述。AAV2.7m8的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。编码AAV2.7m8的示例性核酸序列如SEQ ID NO:14所示。
AAV2衣壳蛋白的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示：
Figure BDA0003764787640000081
AAV2.7m8衣壳蛋白的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示(7-mer***以粗体显示)：
Figure BDA0003764787640000082
Figure BDA0003764787640000091
AAV2.7m8衣壳蛋白的示例性核酸编码序列如SEQ ID NO:14所示：
Figure BDA0003764787640000092
Figure BDA0003764787640000101
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.hr、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV.PHP的AAV血清型，以及上述任何一者的变体。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有源自非人类灵长类动物的血清型，例如AAVrh8血清型。在一些实施方案中，衣壳蛋白具有AAV血清型6(例如，AAV6衣壳蛋白)、AAV血清型8(例如，AAV8衣壳蛋白)、AAV血清型2(例如，AAV2衣壳蛋白)、AAV血清型5(例如，AAV5衣壳蛋白)或AAV血清型9(例如，AAV9衣壳蛋白)。在一些实施方案中，具有所需组织嗜性的AAV衣壳蛋白可以选自从哺乳动物(例如，来自受试者的组织)分离的AAV衣壳蛋白。
在一些实施方案中，本公开的rAAV包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白含有包含编码抗VEGF剂(例如，KH92)的转基因的核酸。在一些实施方案中，本公开的rAAV包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的rAAV含有与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有100％同一性、至少99％同一性、至少98％同一性、至少97％同一性、至少96％同一性、至少95％同一性、至少94％同一性、至少93％同一性、至少92％同一性、至少91％同一性、至少90％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性、至少75％同一性、至少70％同一性、至少65％同一性、至少60％同一性、至少55％同一性或至少50％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的rAAV是单链AAV(ssAAV)。如本文所用，ssAAV是指在单独的链上具有转基因表达盒的编码序列和互补序列并且包装到不同的病毒衣壳中的rAAV。
待在宿主细胞中培养以将rAAV载体包装在AAV衣壳中的组分可以反式提供给宿主细胞。或者，任何一种或多种所需组分(例如，重组AAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可以使用本领域技术人员已知的方法由经工程化以包含一种或多种所需组分的稳定宿主细胞提供。最合适地，这样的稳定宿主细胞含有在诱导型启动子控制下的所需组分。然而，一种或多种所需组分可以在组成型启动子的控制之下。在讨论适用于转基因的调控元件时，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在另一个可选方案中，选定的稳定宿主细胞可以包含在组成型启动子控制下的一种或多种选定组分和在一个或多个诱导型启动子控制下的一种或多种其他选定组分。例如，可以产生稳定的宿主细胞，其衍生自293细胞(其含有在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但其包含在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可以产生其他稳定的宿主细胞。
在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含编码转基因(例如，KH902)或递送抗VEGF剂的rAAV(例如，AAV2.7m8-KH902)的编码序列。“宿主细胞”是指含有或能够含有感兴趣的物质的任何细胞。宿主细胞通常是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞、角质形成细胞、角膜细胞和/或肿瘤细胞。宿主细胞可用作AAV辅助构建体、AAV小基因质粒、附属功能载体或与重组AAV产生相关的其他转移DNA的接受者。所述术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用的“宿主细胞”可以指已经用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，由于自然的、偶然的或有意的突变，单个亲本细胞的后代在形态学或在基因组或总DNA互补物上不一定与原始亲本完全相同。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是神经元、感光细胞、色素性视网膜上皮细胞或神经胶质细胞。
可以使用任何合适的遗传元件(载体)将产生本公开的rAAV所需的重组AAV载体、rep序列、cap序列和辅助功能递送至包装宿主细胞。选定的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文所述的那些。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y。类似地，产生rAAV病毒体的方法是公知的，并且对合适方法的选择不是对本公开的限制。参见，例如，K.Fisher等人,J.Virol.,70:520-532(1993)和美国专利号5,478,745。
在一些实施方案中，可以使用三重转染方法(详细描述在美国专利号6,001,650中)产生重组AAV。通常，重组AAV是通过用待包装进AAV颗粒的AAV载体(包含侧翼为ITR元件的转基因)、AAV辅助功能载体和附属功能载体转染宿主细胞而产生的。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(例如，rep和cap)，其对于生产性AAV复制和封装而言以反式起作用。优选地，AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体生产，而不产生任何可检测的野生型AAV病毒体(例如，含有功能性rep和cap基因的AAV病毒体)。适用于本公开的载体的非限制性实例包括pHLP19，其描述在美国专利号6,001,650中，以及pRep6cap6载体，其描述在美国专利号6,156,303中，两者的全部内容通过引用并入本文。附属功能载体编码用于非AAV衍生的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，AAV依赖于这些功能进行复制(例如，“附属功能”)。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于参与AAV基因转录激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以源自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(1型单纯疱疹病毒除外)和牛痘病毒。
在一些方面，本公开提供了转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞摄取外源DNA，当外源DNA已被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术通常是本领域已知的。参见，例如，Graham等人(1973)Virology,52:456、Sambrook等人(1989)MolecularCloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York、Davis等人(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier和Chu等人(1981)Gene 13:197。此类技术可用于将一种或多种外源核酸，例如核苷酸整合载体和其他核酸分子引入合适的宿主细胞。
如本文所用，术语“重组细胞”是指外源DNA片段，例如导致生物活性多肽转录或生物活性核酸如RNA产生的DNA片段被引入其中的细胞。
如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒体等，当其与合适的控制元件结合时能够复制，并且其能够在细胞之间转移基因序列。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如rAAV载体、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、指环病毒载体(anellovirus vector)(例如，如US20200188456A1中所述的指环病毒载体)等。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物，以及病毒载体。在一些实施方案中，有用的载体预期是其中待转录的核酸片段位于启动子的转录控制下的那些载体。
编码转基因的核酸
本公开的多个方面涉及抗VEGF剂。本公开部分涉及编码抗血管内皮生长因子(抗-VEGF)蛋白的核酸。血管内皮生长因子(VEGF)，最初称为血管通透因子(vascularpermeability factor，VPF)，是一种由细胞产生的信号蛋白，可刺激血管的形成。VEGF是生长因子的一个子家族，即胱氨酸结生长因子的血小板衍生生长因子家族。它们是重要的信号传递蛋白，参与血管发生(胚胎循环***的从头形成)和血管生成(血管从预先存在的脉管***生长)。VEGF的正常功能是在胚胎发育期间产生新血管，在损伤后产生新血管，在运动后产生肌肉，和产生绕过阻塞的血管的新血管(侧支循环)。然而，异常的VEGF活性/信号传导会导致各种疾病，例如血管疾病。
抗血管内皮生长因子治疗，也称为抗VEGF治疗或抗VEGF药物治疗，是使用阻断血管内皮生长因子活性的药物。抗VEGF剂的非限制性实例包括VEGF受体融合蛋白(例如，KH902)、单克隆抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab))、抗体衍生物(例如雷珠单抗(ranibizumab，Lucentis))或抑制被VEGF刺激的酪氨酸激酶的口服可利用的小分子(例如，拉帕替尼(lapatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、阿西替尼(axitinib)和帕唑帕尼(pazopanib))。
在一些实施方案中，编码抗VEGF剂的核酸是分离的核酸。在一些实施方案中，本公开的分离的核酸包含编码抗VEGF剂的转基因。在一些实施方案中，抗VEGF剂靶向(例如，特异性结合)人VEGF受体。VEGF受体是血管内皮生长因子(VEGF)的受体。VEGF受体有3种主要亚型，编号为1、2和3。血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的信号传导蛋白，参与许多生物学途径(例如，血管发生和血管生成)。VEGF受体具有由7个免疫球蛋白样结构域(例如，细胞外结构域1-7)组成的细胞外部分、单个跨膜区和包含***的酪氨酸激酶结构域的细胞内部分。在一些实施方案中，抗VEGF剂靶向(例如，特异性结合)胎盘衍生生长因子(PlGF)。
在一些实施方案中，抗VEGF剂是人VEGF诱饵受体或其部分。“诱饵受体”是指能够识别和结合配体(例如，VEGF)，但在结构上不能发出信号或激活目标受体复合物的受体。它充当抑制剂，结合配体并阻止其与其常规受体结合。在一些实施方案中，VEGF诱饵受体包含VEGF受体1和/或VEGF受体2的一个或多个细胞外结构域。在一些实施方案中，抗VEGF剂是人VEGF诱饵受体融合蛋白。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体融合蛋白包含多于一个的选自融合在一起的VEGF受体1和/或VEGF受体2的细胞外结构域。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体融合蛋白包含第一部分，所述第一部分包括与VEGF受体2融合的VEGF受体1，其进一步与包含不同蛋白的第二部分(例如，免疫球蛋白的Fc部分)融合。VEGF诱饵受体和VEGF诱饵受体融合蛋白先前已经描述，参见例如WO2007112675和EP1767546B1，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含结合VEGF的蛋白的细胞外结构域。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体1的细胞外结构域。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体2的细胞外结构域。在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体2的细胞外结构域3和4。
在一些实施方案中，人VEGF诱饵受体是人VEGF受体融合蛋白。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含选自VEGF受体1或VEGF受体2的细胞外结构域，和一个或多个选自VEGF受体1或VEGF受体2的第二细胞外结构域。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含VEGF受体1的细胞外结构域2和VEGF受体2的细胞外结构域3。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含VEGF受体1的细胞外结构域2和VEGF受体2的细胞外结构域3和4。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与VEGF受体2的细胞外结构域3融合，并进一步与VEGF受体1的细胞外结构域4融合的VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与VEGF受体1的细胞外结构域2融合，并进一步与VEGF受体2的细胞外结构域3融合的VEGF受体2的细胞外结构域1。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与VEGF受体2的细胞外结构域3融合，并进一步与VEGF受体2的细胞外结构域4融合，并进一步与VEGF受体2的细胞外结构域5融合的VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与VEGF受体2的细胞外结构域3融合，并进一步与VEGF受体2的细胞外结构域4融合，并进一步与VEGF受体1的细胞外结构域5融合的VEGF受体1的细胞外结构域2。在一些实施方案中，VEGF诱饵受体的融合的细胞外结构域通过接头彼此连接。在一些实施方案中，VEGF诱饵受体的融合的细胞外结构域彼此直接连接。
此外，本文所述的任何VEGF受体融合蛋白可以与另一蛋白融合。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与另一蛋白融合以提供二聚化或多聚化特性的VEGF受体(例如，本文所述的任何VEGF诱饵受体或VEGF诱饵受体融合蛋白)的部分。为融合蛋白提供二聚化或多聚化特性的蛋白的非限制性实例是免疫球蛋白的Fc部分。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白包含与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体(例如，本文所述的任何VEGF诱饵受体或VEGF诱饵受体融合蛋白)的部分。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白(例如，本文所述的VEGF诱饵受体或VEGF诱饵受体融合蛋白)与其他部分(例如，Fc结构域)直接融合。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白(例如，VEGF受体诱饵)通过接头与其他部分融合。
合适的接头是本领域已知的。(参见，例如，Chen等人,Fusion protein linkers:property,design and functionality,Adv Drug Deliv Rev.2013Oct；65(10):1357-69)。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白进一步与免疫球蛋白的Fc部分融合。在一些实施方案中，VEGF受体融合蛋白是KH902。KH902又名康柏西普(例如，US20100272719A1，全部内容通过引用并入本文)，是一种诱饵受体蛋白，其通过血管内皮生长因子(VEGF)受体1和VEGF受体2细胞外结构域与人免疫球蛋白的Fc区融合而构建得到。KH902的大小为约142kD。康柏西普介导的VEGF和胎盘生长因子(PIGF)(其可以诱导血管新生)阻断已在临床试验(包括3期试验)中被证明可有效治疗湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)，参见例如Liu等人,AJO,2019年8月17日，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。KH902的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示(VEGF受体1的细胞外结构域2以粗体表示；VEGF受体2的细胞外结构域3以下划线表示；VEGF受体2的细胞外结构域4以斜体和粗体表示；Fc结构域以斜体和下划线表示)。
Figure BDA0003764787640000161
Figure BDA0003764787640000171
在一些实施方案中，抗VEGF剂包含SEQ ID NO:5的部分。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:6所示的VEGF受体1的细胞外结构域2的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:7所示的VEGF受体2的细胞外结构域3和4的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:8所示的与VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:9所示的与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗VEGF剂包含与如SEQ ID NO:10所示的与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体2的细胞外结构域3和4的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
VEGF受体1的细胞外结构域2的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示：
Figure BDA0003764787640000181
VEGF受体2的细胞外结构域3和4的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示：
Figure BDA0003764787640000182
与VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示：
Figure BDA0003764787640000183
与Fc部分融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示：
Figure BDA0003764787640000184
Figure BDA0003764787640000191
与Fc部分融合的VEGF受体2的细胞外结构域3和4的示例性氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示：
Figure BDA0003764787640000192
在一些实施方案中，分离的核酸包含与SEQ ID NO:1所示的核酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。KH902的示例性编码序列如SEQ ID NO:1所示。
Figure BDA0003764787640000193
Figure BDA0003764787640000201
本文所述的任何抗VEGF剂和/或它们的组合可以由本文的分离的核酸表达。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码VEGF受体1的细胞外结构域2的第一区域和编码VEGF受体2的细胞外结构域3和4的第二区域。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的第一区域，以及编码与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体2的细胞外结构域3和4的第二区域。在一些实施方案中，第一区域可以位于任何合适的位置。第一区域可以位于第二区域的上游。例如，第一区域可以位于第二区域的第一个密码子和所述第一个密码子上游的2000个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的第一个密码子和所述第一个密码子上游的1000个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的第一个密码子和所述第一个密码子上游的500个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的第一个密码子和所述第一个密码子上游的250个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的第一个密码子和所述第一个密码子上游的150个核苷酸之间。在其他实施方案中，第一区域可以位于第二区域的下游。第一区域可以位于第二区域的最后一个密码子和所述最后一个密码子下游的2000个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的最后一个密码子和所述最后一个密码子下游的1000个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的最后一个密码子和所述最后一个密码子下游的500个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的最后一个密码子和所述最后一个密码子下游的250个核苷酸之间。第一区域可以位于第二区域的最后一个密码子和所述最后一个密码子下游的150个核苷酸之间。
在一些实施方案中，核酸还可以包含第三区域。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码VEGF受体1的细胞外结构域2的第一区域，编码VEGF受体2的细胞外结构域3和4的第二区域，以及编码与VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的第三区域。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的第一区域，编码与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体2的细胞外结构域3和4的第二区域，以及编码与VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合、并进一步与免疫球蛋白的Fc部分融合的VEGF受体1的细胞外结构域2的第三区域。在一些实施方案中，第三区域位于第一区域的第一个密码子的上游。在一些实施方案中，第三区域位于第一区域的最后一个密码子和第二区域的第一个密码子之间。在一些实施方案中，第三区域位于第二区域的最后一个密码子的下游。
在一些实施方案中，本文公开的分离的核酸的各个区域是用于表达本文所述的抗-VEGF剂或抗-VEGF剂的组合的表达盒。在一些实施方案中，多顺反子表达构建体包含两个或更多个表达盒，其编码一种或多种本文所述的抗VEGF剂或抗VEGF剂的组合。
在一些实施方案中，多顺反子表达构建体包含以不同方式定位的表达盒。例如，在一些实施方案中，提供了多顺反子表达构建体，其中第一表达盒(例如，编码第一抗VEGF剂或其部分的表达盒)定位于邻近第二表达盒(例如，编码第二抗-VEGF剂或其部分的表达盒)。在一些实施方案中，提供了多顺反子表达构建体，其中第一表达盒包含内含子，并且第二表达盒位于第一表达盒的内含子内。在一些实施方案中，位于第一表达盒的内含子内的第二表达盒包含启动子和编码与所述启动子有效连接的基因产物的核酸序列。
在不同的实施方案中，提供了多顺反子表达构建体，其中表达盒以不同方式定向。例如，在一些实施方案中，提供了多顺反子表达构建体，其中第一表达盒与第二表达盒处于相同的方向。在一些实施方案中，提供了多顺反子表达构建体，其包含处于相反方向的第一表达盒和第二表达盒。
如本文所用的与表达盒有关的术语“方向”是指给定盒或结构的方向特征。在一些实施方案中，表达盒含有编码核酸序列的启动子5'，并且编码核酸序列的转录从有义链的5'末端运行至3'末端，使其成为定向盒(例如5'-启动子/(内含子)/编码序列-3')。由于实际上所有表达盒在这个意义上都是定向的，本领域技术人员可以容易地确定给定表达盒相对于第二核酸结构(例如，第二表达盒、病毒基因组)的方向，或者，如果盒包含在AAV构建体中，则相对于AAV ITR。
例如，如果给定的核酸构建体在构型5'-启动子1/编码序列1---启动子2/编码序列2-3'中包含两个表达盒，
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表达盒处于相同方向，箭头表示每个盒的转录方向。对于另一个示例，如果给定的核酸构建体包含的有义链在构型5'-启动子1/编码序列1---编码序列2/启动子2-3'中包含两个表达盒，
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则表达盒彼此处于相反方向，并且如箭头所示，表达盒的转录方向相反。在这个示例中，显示的链包含启动子2和编码序列2的反义链。
对于另一个示例，如果表达盒包含在AAV构建体中，则所述盒可以与AAV ITR处于相同方向，或相反方向。AAV ITR是定向的。例如，如果ITR和表达盒均位于相同的核酸链上，则3'ITR将与上述示例的启动子1/编码序列1表达盒处于相同方向，但与5'ITR处于相反方向。
大量证据表明，与仅含一个顺反子的表达***相比，多顺反子表达构建体通常不能达到最佳表达水平。使用包含两个或更多个启动子元件的多顺反子表达构建体实现的低于标准表达水平的推测原因之一是启动子干扰现象(参见，例如，Curtin JA,Dane AP,Swanson A,Alexander IE,Ginn SL.Bidirectional promoter interference betweentwo widely used internal heterologous promoters in a late-generationlentiviral construct.Gene Ther.2008Mar；15(5):384-90；和Martin-Duque P,JezzardS,Kaftansis L,Vassaux G.Direct comparison of the insulating properties of twogenetic elements in an adenoviral vector containing two different expressioncassettes.Hum Gene Ther.2004Oct；15(10):995-1002；两篇参考文献均通过引用并入本文以公开启动子干扰现象)。已经提出了多种策略来克服启动子干扰的问题，例如，通过产生多顺反子表达构建体，所述构建体仅含一个启动子以驱动由内部核糖体进入位点分隔的多个编码核酸序列的转录，或通过将包含其自身启动子的顺反子与转录绝缘体元件(transcriptional insulator element)分隔开。然而，所有克服启动子干扰的建议策略都面临着其自身的一系列问题。例如，单个启动子驱动的多顺反子表达通常会导致顺反子的表达水平不均匀。此外，一些启动子不能有效地被分离，并且分离元件与一些基因转移载体如一些逆转录病毒载体不兼容。
在本发明的一些实施方案中，提供了一种多顺反子表达构建体，其允许有效表达由第一启动子驱动的第一编码核酸序列和由第二启动子驱动的第二编码核酸序列，而不使用转录绝缘体元件。本文提供了此类多顺反子表达构建体的多种构型，例如，含有包含内含子的第一表达盒和位于内含子内并且与第一盒处于相同或相反方向的第二表达盒的表达构建体。其他构型在本文别处更详细地描述。
在一些实施方案中，提供了允许两个或更多个编码核酸序列有效表达的多顺反子表达构建体。在一些实施方案中，多顺反子表达构建体包含两个表达盒。在一些实施方案中，如本文提供的多顺反子表达构建体的第一表达盒包含第一RNA聚合酶II启动子，并且第二表达盒包含第二RNA聚合酶II启动子。在一些实施方案中，如本文提供的多顺反子表达构建体的第一表达盒包含RNA聚合酶II启动子，并且第二表达盒包含RNA聚合酶III启动子。
在一些实施方案中，所提供的多顺反子表达构建体是重组AAV(rAAV)构建体。
在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸包含抗VEGF剂(例如，KH902)的经密码子优化的核酸序列。可通过本领域已知的方法实现对核酸编码序列的密码子优化以优化在靶细胞(例如哺乳动物细胞)中的表达。
“核酸”序列是指DNA或RNA序列。在一些实施方案中，本公开的蛋白和核酸是分离的。如本文所用，术语“分离的”意指人工产生的。如本文所用，关于核酸，术语“分离的”意指：(i)通过例如聚合酶链式反应(PCR)在体外扩增；(ii)通过克隆重组产生；(iii)纯化的，如通过裂解和凝胶分离；(iv)通过例如化学合成合成。分离的核酸是易于通过本领域公知的重组DNA技术操作的核酸。因此，包含在其中5'和3'限制性位点已知或聚合酶链式反应(PCR)引物序列已公开的载体中的核苷酸序列被认为是分离的，但以其天然状态存在于其天然宿主中的核酸序列不是。分离的核酸可以是基本上纯化的，但不是必须的。例如，在克隆或表达载体中分离的核酸不是纯的，因为它可能仅占其所在细胞中物质的很小百分比。然而，这样的核酸是分离的，正如本文所用的术语，因为它很容易通过本领域普通技术人员已知的标准技术进行操作。如本文关于蛋白或肽所使用的，术语“分离的”是指已从其自然环境中分离或人工产生(例如，通过化学合成、通过重组DNA技术等)的蛋白或肽。
在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸和rAAV包含一种或多种以下结构特征(例如，控制或调控序列)：长的鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、延伸的CBA内含子、Kozak序列、抗-VEGF剂(例如KH902)或密码子优化的编码抗VEGF剂(例如KH902)变体的核酸序列、一个或多个microRNA结合位点和兔β-珠蛋白(RBG)poly A序列。在一些实施方案中，一个或多个前述控制序列与编码抗-VEGF剂(例如，KH902)的核酸序列有效连接。
如本文所用，当核酸序列(例如，编码序列)和调控序列以将核酸序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制下的方式共价连接时，称它们为“有效连接”。如果希望将核酸序列翻译成功能性蛋白，如果在5'调控序列中启动子的诱导导致编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接的性质不会(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的RNA转录物被翻译成蛋白的能力，则称两个DNA序列为有效连接。因此，如果启动子区域能够影响该DNA序列的转录，从而得到的转录物可被翻译成所需的蛋白或多肽，则启动子区域将与核酸序列有效连接。类似地，当两个或更多个编码区以它们从共同启动子的转录导致两个或更多个已在阅读框内翻译的蛋白的表达的方式连接时，它们是有效连接的。
在一些实施方案中，转基因包含编码与启动子有效连接的抗-VEGF剂(例如，KH902)的核酸序列。“启动子”是指由细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列，为启动基因的特异性转录所需。短语“有效连接”、“有效定位”、“在控制下”或“在转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向以控制RNA聚合酶的起始和基因的表达。
通常，启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。
组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地带有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地带有CMV增强子)[参见，例如，Boshart等人,Cell,41:521-530(1985)]、嵌合巨细胞病毒嵌合巨细胞病毒(CMV)/鸡β-肌动蛋白(CB)启动子(CBA启动子)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子[Invitrogen]。在一些实施方案中，启动子是RNApol II启动子。在一些实施方案中，启动子是嵌合巨细胞病毒嵌合巨细胞病毒(CMV)/鸡β-肌动蛋白(CB)启动子(CBA启动子)。在一些实施方案中，启动子是RNA pol III启动子，例如U6或H1。
由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫氨酸(MT)启动子、***(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子***(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、四环素抑制***(Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))、四环素诱导***(Gossen等人,Science,268:1766-1769(1995)，另见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))、RU486诱导***(Wang等人,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等人,Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导***(Magari等人,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。在本上下文中可能有用的其他类型的诱导型启动子是受特定生理状态调节的那些，这些生理状态例如温度、急性期、细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中。
在一些实施方案中，调控序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调控序列(例如，启动子、增强子等)是本领域公知的。示例性组织特异性调控序列包括但不限于以下组织特异性启动子：视网膜劈裂蛋白近端启动子(retinoschisin proximalpromoter)、光感受器间类视黄醇结合蛋白增强子(interphotoreceptor retinoid-binding protein enhancer，RS/IRBPa)、视紫红质激酶(RK)、肝特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、胰岛素启动子、胰高血糖素启动子、生长抑素启动子、胰多肽(PPY)启动子、突触蛋白-1(Syn)启动子、肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结蛋白(desmin，DES)启动子、α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子或心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子。其他示例性启动子包括β-肌动蛋白启动子、乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人,Gene Ther.,3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)启动子，Arbuthnot等人,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996))、骨骨钙素启动子(Stein等人,Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997))；骨唾液蛋白启动子(Chen等人,J.BoneMiner.Res.,11:654-64(1996))、CD2启动子(Hansal等人,J.Immunol.,161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链启动子；T细胞受体α-链启动子、神经元如神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)启动子(Andersen等人,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))、神经丝轻链基因启动子(Piccioli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))以及神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等人,Neuron,15:373-84(1995))，以及其他对技术人员来说显而易见的启动子。
在一些实施方案中，组织特异性启动子是眼特异性启动子。眼特异性启动子的实例包括视网膜劈裂蛋白近端启动子、光感受器间类视黄醇结合蛋白增强子(RS/IRBPa)、视紫红质激酶(RK)、RPE65和人视锥细胞视蛋白启动子(human cone opsin promoter)。
在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CB)启动子。鸡β-肌动蛋白启动子可以是短的鸡β-肌动蛋白启动子或长的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子(例如，鸡β-肌动蛋白启动子)包含增强子序列，例如巨细胞病毒(CMV)增强子序列。CMV增强子序列可以是短的CMV增强子序列或长的CMV增强子序列。在一些实施方案中，启动子包含长的CMV增强子序列和长的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子包含短的CMV增强子序列和短的鸡β-肌动蛋白启动子。然而，本领域技术人员知晓，短的CMV增强子可以与长的CB启动子一起使用，并且长的CMV增强子可以与短的CB启动子一起使用(反之亦然)。
本文所述的分离的核酸还可包含一个或多个内含子。在一些实施方案中，至少一个内含子位于启动子/增强子序列和转基因之间。在一些实施方案中，内含子是合成的或人工的(例如异源的)内含子。合成内含子的实例包括衍生自SV-40的内含子序列(称为SV-40T内含子序列)和衍生自鸡β-肌动蛋白基因的内含子序列。在一些实施方案中，本公开所述的转基因包含一个或多个(1、2、3、4、5个或更多个)人工内含子。在一些实施方案中，一个或多个人工内含子位于启动子和编码抗VEGF剂(例如，KH902)的核酸序列之间。
在一些实施方案中，本文所述的转基因包含Kozak序列。Kozak序列是包含共有序列GCC(A/G)CC(SEQ ID NO:4)的核酸基序，其存在于真核mRNA中并且在蛋白翻译的起始中起作用。在一些实施方案中，Kozak序列位于内含子和编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因之间。
本公开所述的分离的核酸可以编码进一步包含聚腺苷酸化(poly A)序列的转基因。在一些实施方案中，包含poly A序列的转基因是兔β-珠蛋白(RBG)poly A序列，
在一些实施方案中，转基因包含3'-非翻译区(3'-UTR)。在一些实施方案中，本公开涉及分离的核酸，其包含编码抗-VEGF剂(例如，KH902)的转基因和一个或多个miRNA结合位点。不希望受到任何特定理论的束缚，将miRNA结合位点并入基因表达构建体允许在表达相应miRNA的细胞和组织中调节转基因表达(例如，抑制转基因表达)。在一些实施方案中，将一个或多个miRNA结合位点并入转基因允许转基因表达以细胞类型特异性方式脱靶。在一些实施方案中，一个或多个miRNA结合位点位于转基因的3'非翻译区(3'-UTR)中，例如在编码抗VEGF剂(例如，KH902)的核酸序列的最后一个密码子和poly A序列之间。
在一些实施方案中，转基因包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5个或更多个)miRNA结合位点，其使抗VEGF剂(例如，KH902)的表达从免疫细胞(例如，抗原呈递细胞(APC)，例如巨噬细胞、树突细胞等)脱靶。并入免疫相关miRNA的miRNA结合位点可以使转基因(例如，KH902)表达从抗原呈递细胞脱靶，从而减少或消除受试者针对转基因产物产生的(细胞和/或体液)免疫应答，例如在US 2018/0066279中所述，其全部内容通过引用并入本文。
在一些方面，本公开涉及分离的核酸，其包含编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因和一个或多个miRNA结合位点。不希望受到任何特定理论的束缚，将miRNA结合位点并入基因表达构建体允许在表达相应miRNA的细胞和组织中调节转基因表达(例如，抑制转基因表达)。在一些实施方案中，将一个或多个miRNA结合位点并入转基因允许转基因表达以细胞类型特异性方式脱靶。在一些实施方案中，一个或多个miRNA结合位点位于转基因的3'非翻译区(3'UTR)中，例如在编码一种或多种GM3S蛋白的核酸序列的最后一个密码子与polyA序列之间。
在一些实施方案中，转基因包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5个或更多个)miRNA结合位点，其使抗-VEGF剂(例如，KH902)表达从肝细胞脱靶。例如，在一些实施方案中，转基因包含一个或多个miR-122结合位点。
在一些实施方案中，转基因包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5个或更多个)miRNA结合位点，其使一种或多种GM3S蛋白的表达从免疫细胞(例如，抗原呈递细胞(APC)，例如巨噬细胞、树突细胞等)脱靶。免疫相关miRNA的miRNA结合位点的并入可以使转基因表达从抗原呈递细胞脱靶，从而减少或消除受试者中针对转基因产物产生的(细胞和/或体液)免疫应答，例如US2018/0066279中所述，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，“免疫细胞相关miRNA”是优先在免疫***的细胞如抗原呈递细胞(APC)中表达的miRNA。在一些实施方案中，免疫细胞相关miRNA是在免疫细胞中表达的miRNA，与非免疫细胞(例如，对照细胞，如HeLa细胞、HEK293细胞、间充质细胞等)相比，其在免疫细胞中的表达水平表现高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。在一些实施方案中，免疫细胞相关miRNA在其中表达的免疫***的细胞(免疫细胞)是B细胞、T细胞、杀伤T细胞、辅助T细胞、γδT细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、血管内皮细胞或其他免疫细胞。在一些实施方案中，免疫***的细胞是表达一种或多种以下标志物的B细胞：B220、BLAST-2(EBVCS)、Bu-1、CD19、CD20(L26)、CD22、CD24、CD27、CD57、CD72、CD79a、CD79b、CD86、chB6、D8/17、FMC7、L26、M17、MUM-1、Pax-5(BSAP)和PC47H。在一些实施方案中，免疫***的细胞是表达一种或多种以下标志物的T细胞：ART2、CD1a、CD1d、CD11b(Mac-1)、CD134(OX40)、CD150、CD2、CD25(白细胞介素2受体α)、CD3、CD38、CD4、CD45RO、CD5、CD7、CD72、CD8、CRTAM、FOXP3、FT2、GPCA、HLA-DR、HML-1、HT23A、Leu-22、Ly-2、Ly-m22、MICG、MRC OX 8、MRCOX-22、OX40、PD-1(程序性死亡-1)、RT6、TCR(T细胞受体)、Thy-1(CD90)和TSA-2(胸腺共享Ag-2(Thymic shared Ag-2))。在一些实施方案中，免疫细胞相关miRNA选自：miR-15a、miR-16-1、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-21、miR-29a/b/c、miR-30b、miR-31、miR-34a、miR-92a-1、miR-106a、miR-125a/b、miR-142-3p、miR-146a、miR-150、miR-155、miR-181a、miR-223和miR-424、miR-221、miR-222、let-7i、miR-148和miR-152。在一些实施方案中，本文所述的转基因包含一个或多个针对miR-142的结合位点。
在一些实施方案中，分离的核酸包含反向末端重复。本公开的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(AAV)载体(rAAV载体)。在一些实施方案中，如本公开所述的分离的核酸包含含有第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)的区域(例如，第一区域)，或其变体。分离的核酸(例如，重组AAV载体)可以被包装到衣壳蛋白中并施用于受试者和/或递送至选定的靶细胞。“重组AAV(rAAV)载体”通常至少由转基因及其调控序列以及5'和3'AAV反向末端重复(ITR)组成。转基因可包含编码例如蛋白(例如，抗VEGF剂，例如KH902)的区域和/或表达控制序列(例如poly-A尾)，如本公开中别处所述。
通常，ITR序列的长度为约145bp。优选地，在分子中使用编码ITR的基本上完整的序列，尽管允许对这些序列进行某种程度的微小修饰。修饰这些ITR序列的能力在本领域的技术范围内。(参见，例如，教科书如Sambrook等人,"Molecular Cloning.A LaboratoryManual",2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher等人,JVirol.,70:520 532(1996))。本公开中使用的这样的分子的一个实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中选定的转基因序列和相关的调控元件的侧翼是5'和3'AAV ITR序列。AAVITR序列可以从任何已知的AAV中获得，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施方案中，分离的核酸进一步包含含有第二AAV ITR的区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)。在一些实施方案中，编码转基因的分离的核酸的侧翼是AAV ITR(例如，在方向5'-ITR-转基因-ITR-3'上)。在一些实施方案中，AAV ITR选自AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4ITR、AAV5 ITR和AAV6 ITR。
在一些实施方案中，如本文所述的分离的核酸(例如，rAAV载体)从5'至3'顺序包含：5'AAV ITR、CMV增强子、CBA启动子、内含子(例如，鸡β肌动蛋白内含子)、Kozak序列、编码抗VEGF剂(例如KH902)的转基因、兔β-珠蛋白poly A和3'AAV ITR。分离的核酸序列的示例性序列如SEQ ID NO:2所示。在一些实施方案中，核酸序列包含与如SEQ ID NO:2(Kozak序列以下划线表示；KH902编码序列以粗体表示)所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列：
Figure BDA0003764787640000301
Figure BDA0003764787640000311
Figure BDA0003764787640000321
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此外，包含本文所述的分离的核酸的质粒也在本公开的范围内。pAAV-CBA-KH902的示例性全质粒序列如SEQ ID NO:3所示。在一些实施方案中，质粒包含与如SEQ ID NO:3所示的核酸序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列：
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Figure BDA0003764787640000351
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在一些实施方案中，本文所述的抗VEGF剂(例如，KH902)可以通过非病毒平台递送至受试者。在一些实施方案中，本文所述的抗VEGF剂(例如，KH902)可以通过封闭端线性双链体DNA(ceDNA)递送至受试者。先前已经描述了转基因(例如，抗-VEGF剂，例如KH902)的递送，参见例如WO2017152149，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，具有不对称末端序列(例如，不对称间断自互补序列)的核酸形成封闭端线性双链体DNA结构(例如，ceDNA)，在一些实施方案中，其与目前可用的基因递送载体相比表现出降低的免疫原性。在一些实施方案中，ceDNA在天然条件下的表现与线性双链体DNA相同，并且在变性条件下转化为单链环状DNA。不希望受到任何特定理论的束缚，在一些实施方案中，ceDNA可用于将转基因(例如，抗VEGF剂，例如KH902)递送至受试者。
AAV介导的转基因向眼组织的递送
本公开的多个方面涉及包含含有衣壳蛋白(例如，AAV2.7m8)和编码转基因的核酸的重组AAV的组合物，其中所述转基因包含编码抗VEGF剂(例如，KH902)的核酸序列。在一些实施方案中，核酸进一步包含AAV ITR。
rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)和包含本文所述的rAAV的组合物可以根据本领域已知的任何合适方法以组合物形式递送至受试者。例如，rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)，优选悬浮于生理学上相容的载体中(例如，在组合物中)，可以施用于受试者，即宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类动物(例如，猕猴)。在一些实施方案中，宿主动物不包括人。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，如本文所述的rAAV的施用导致转基因(例如，KH902)向眼组织的递送。可以通过例如眼内注射、视网膜下注射、外用施用(例如滴眼剂)或通过注射至哺乳动物受试者的眼中(例如，玻璃体内注射)来将rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)递送至哺乳动物受试者的眼组织。如本文所用，“眼组织”是指源自眼或包含在眼中的任何组织。眼组织的非限制性实例包括神经元、视网膜(例如，感光细胞)、巩膜、脉络膜、视网膜、玻璃体、黄斑、中心小凹、视盘、晶状体、瞳孔、虹膜、房水、角膜(例如，角质细胞、角膜内皮细胞、角膜基底细胞、角膜翼细胞和角膜鳞状细胞)、结膜睫状体和视神经。视网膜位于眼的后部，并且包含感光细胞。这些感光细胞(例如，视杆细胞、视锥细胞)通过辨别颜色来赋予视觉灵敏度(visual acuity)，以及视野中的对比度。
或者，可以通过肌内注射或通过施用至哺乳动物受试者的血流中来将rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)递送至哺乳动物受试者。可以通过注射至静脉、动脉或任何其他血管导管中来施用至血流中。rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)的肌内施用的非限制性示例性方法包括肌内(IM)注射和血管内肢体输注。在一些实施方案中，通过分离的肢体灌注将rAAV施用至血流中，这是外科领域中公知的技术，所述方法基本上使技术人员能够在施用rAAV病毒体之前将肢体从体循环中分离出来。分离的肢体灌注技术的一种变化形式描述在美国专利号6,177,403中，其可以被技术人员用于将病毒体施用至分离的肢体的脉管***中，以潜在地增强向肌细胞或组织的转导。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)或组合物(例如，含有rAAV的组合物)通过玻璃体内注射施用。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)或组合物(例如，含有rAAV的组合物)通过眼内注射施用。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)或组合物(例如，含有rAAV的组合物)通过视网膜下注射施用。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)或组合物(例如，含有rAAV的组合物)通过静脉内注射施用。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)或组合物(例如，含有rAAV的组合物)通过肌内注射施用。在一些实施方案中，如本公开中所述的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)或组合物(例如，含有rAAV的组合物)通过瘤内注射施用。
在一些实施方案中，施用如本文所述的分离的核酸和/或rAAV导致VEGF(例如，VEGF活性)的抑制。在一些实施方案中，如本文所述的分离的核酸和/或rAAV的施用导致眼组织中VEGF(例如，VEGF活性)的抑制。可以通过任何合适的已知方法(例如，HUVEC血管生成测定、视网膜血管发育测定、视网膜水肿测定、激光损伤诱导的脉络膜新生血管(CNV)等)来测量VEGF抑制的程度。在一些实施方案中，接受了抗VEGF剂(例如，注射了本文所述的分离的核酸和/或rAAV)的受试者中的VEGF(例如，VEGF活性)活性与未经注射的受试者或接受所述抗VEGF剂之前的同一受试者相比，被抑制至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少100％。在一些实施方案中，未经注射的受试者或接受抗VEGF剂之前的受试者中的VEGF(例如，VEGF活性)比接受了抗VEGF剂施用(例如，注射了本文所述的分离的核酸和/或rAAV)的受试者高至少2％、至少5％、至少10％、至少15％，至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少100％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少10至50倍(例如，10倍、20倍、30倍、40倍或50倍)、至少50至100倍(例如，50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍)。在一些实施方案中，抗VEGF剂(例如，本文所述的分离的核酸和/或rAAV)的施用导致VEGF(例如，VEGF活性)被抑制长于1天、长于2天、长于3天、长于4天、长于5天、长于6天、长于7天、长于1周(例如，8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天)、长于2周(例如，15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天)、长于3周(例如，22天、23天、24天、25天、26天、27天或28天)、长于4周(例如，29天、30天、40天、50天、60天、100天或更多)、长于1个月(例如，5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周)、长于2个月(例如，2个月至2.5个月之间、2个月至3个月之间、2个月至4个月之间、2个月至5个月之间、2个月至6个月之间、2个月至7个月之间、2个月至8个月之间、2个月至9个月之间、2个月至10个月之间、2个月至11个月之间、2个月至12个月之间)、长于3个月(例如，3个月至4个月之间、3个月至5个月之间、3个月至6个月之间、3个月至7个月之间、3个月至8个月之间、3个月至9个月之间、3个月至10个月之间、3个月至11个月之间、3个月至12个月之间)、长于4个月(例如，4个月至5个月之间、4个月至6个月之间、4个月至7个月之间、4个月至8个月之间、4个月至9个月之间、4个月至10个月之间、4个月至11个月之间、4个月至12个月之间)、长于5个月(例如，5个月至6个月之间、5个月至7个月之间、5个月至8个月之间、5个月至8个月之间、5个月至9个月之间、5个月至10个月之间、5个月至11个月之间、5个月至12个月之间)、长于6个月(例如6个月至7个月之间、6个月至8个月之间、6个月至9个月之间、6个月至10个月之间、6个月至11个月之间、6个月至12个月之间)、长于7个月(例如，7个月至8个月之间、7个月至9个月之间、7个月至10个月之间、7个月至11个月之间、7个月至12个月之间)、长于8个月(例如，8个月至9个月之间、8个月至10个月之间、8个月至11个月之间、8个月至12个月之间)、长于9个月(例如，9个月至10个月之间、9个月至11个月之间、9个月至12个月之间)、长于10个月(例如，10个月至11个月之间、11个月至12个月之间)、长于11个月(例如，11个月至12个月之间)、长于12个月(例如，12至15个月之间、12至18个月之间、12至21个月之间、12-2个月之间)、长于1年(例如，1至1.5年之间)、长于2年、长于3年、长于4年、长于5年、长于10年、长于15年、长于20年或更长。
本公开的组合物可以包含单独的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)，或与一种或多种其他病毒(例如，编码具有一种或多种不同转基因的第二rAAV)组合的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的rAAV，每种具有一种或多种不同的转基因。
在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载体。鉴于rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)所针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体。例如，一种合适的载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)一起配制。其他示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、右旋糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。载体的选择不是对本发明的限制。
任选地，除了rAAV(例如rAAV2.7m8-KH902)和载体之外，本公开的组合物还可以包含其他常规药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚、对氯苯酚和泊洛沙姆(非离子表面活性剂)如
Figure BDA0003764787640000421
F-68。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
以足以转染所需组织的细胞并提供足够水平的基因转移和表达而没有过度的副作用的量施用rAAV(例如rAAV2.7m8-KH902)或组合物(例如，含有rAAV的组合物)。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至所选器官(例如，玻璃体内递送至眼)、眼内注射、视网膜下注射、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、静脉内、肌内、皮下、皮内、瘤内和其他胃肠外施用途径。如果需要，可以将施用途径组合。
实现特定“治疗效果”所需的rAAV病毒体的剂量，例如，以基因组拷贝数/每千克体重(GC/kg)表示的剂量单位，将基于多个因素而有所不同，包括但不限于：rAAV病毒体的施用途径、实现治疗效果所需的基因或RNA表达水平、正在治疗的特定疾病或病症以及基因或RNA产物的稳定性。基于上述因素以及本领域公知的其他因素，本领域技术人员可以容易地确定rAAV病毒体剂量范围以治疗患有特定疾病或病症的患者。
rAAV或组合物(例如，含有本文所述的分离的核酸或rAAV的组合物)的有效量是足以靶向感染动物、靶向目标组织(例如，肌组织、眼组织等)的量。在一些实施方案中，在退行性疾病的症状前阶段向受试者施用有效量的rAAV。在一些实施方案中，在表现出退行性疾病的一种或多种体征或症状后，向受试者施用rAAV或组合物。在一些实施方案中，有效量将主要取决于诸如物种、年龄、体重、受试者的健康和待靶向的组织等因素，因此可以在动物和组织之间变化。例如，rAAV的有效量通常在约1ml至约100ml溶液的范围内，所述溶液含有约106至1016个基因组拷贝(例如，1x 106至1x 1016，包括端点)。在一些实施方案中，rAAV的有效量范围在1x109至1x1014个rAAV基因组拷贝之间。在一些情况下，约1011至1012个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在一些实施方案中，约1011至1013个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在一些实施方案中，约1011至1014个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在一些实施方案中，约1011至1015个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在一些实施方案中，约1012至1014个rAAV基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，约1013至1014个rAAV基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，约1x 1012、约1.1x 1012、约1.2x1012、约1.3x 1012、约1.4x 1012、约1.5x 1012、约1.6x 1012、约1.7x 1012、约1.8x 1012、约1.9x 1012、约1x 1013、约1.1x 1013、约1.2x 1013、约1.3x 1013、约1.4x 1013、约1.5x 1013、约1.6x 1013、约1.7x 1013、约1.8x 1013、约1.9x 1013或约2.0x 1014个载体基因组(vg)拷贝/千克(kg)体重是合适的。在一些实施方案中，约4x 1012至2x 1013个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在一些实施方案中，通过静脉内施用的约1.5x 1013vg/kg的剂量是合适的。在某些实施方案中，1012-1013个rAAV基因组拷贝对靶组织(例如，眼)是有效的。在某些实施方案中，1013-1014个rAAV基因组拷贝对靶组织(例如，眼)是有效的。
在一些实施方案中，将rAAV注射至受试者。在其他的实施方案中，通过外用施用(例如，滴眼剂)将rAAV施用至受试者。在一些实施方案中，rAAV的有效量是足以在受试者的靶组织(例如眼)中表达有效量的抗VEGF剂(例如KH902)的量。
在一些实施方案中，通过注射递送的rAAV(例如，递送编码抗VEGF剂的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)的有效量是以足以在靶组织中表达有效量的抗VEGF剂(例如，KH902)的量。在一些实施方案中，递送有效量的编码抗-VEGF剂的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)足以通过合适的施用途径(例如，眼内注射、i.v.注射、腹膜内注射和肌内注射)向受试者每眼递送10μg至10mg或介于之间的任何中间值的抗-VEGF剂(例如，KH902)。在一些实施方案中，编码抗-VEGF剂(例如，KH902)的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)足以向受试者每眼递送20μg至5mg或介于之间的任何中间值的抗VEGF剂(例如，KH902)。在一些实施方案中，编码抗VEGF剂(例如，KH902)的rAAV足以向受试者每眼递送10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg、10mg或更多的抗VEGF剂(例如，KH902)。
在一些实施方案中，将编码抗-VEGF剂的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)每天一次、每周一次、每两周一次、每个月一次、每2个月一次、每3个月一次、每6个月一次、一年一次或受试者的一生一次地施用给受试者。
在一些实施方案中，通过外用施用如滴眼剂递送的rAAV(例如，递送编码抗VEGF剂(例如，KH902)的rAAV的有效量是以足以在靶组织中表达有效量的抗VEGF剂(例如，KH902)的量。在一些实施方案中，将含有编码的rAAV的滴眼剂每周一次、每个月一次、每3个月一次、每6个月一次或每年一次地施用给受试者。
在一些实施方案中，滴眼剂包含的编码抗VEGF剂的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)足以递送浓度为1mg/ml至20mg/ml的抗VEGF剂。在一些实施方案中，滴眼剂包含的编码抗VEGF剂的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)足以递送浓度为2.5mg/ml至10mg/ml的抗VEGF剂。在一些实施方案中，滴眼剂包含的编码抗VEGF剂的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)足以递送浓度为1mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml或20mg/ml的抗VEGF剂。在一些实施方案中，滴眼剂以0.01ml、0.02ml、0.03ml、0.04ml、0.05ml、0.06ml、0.07ml、0.08ml、0.09ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml或0.5ml来施用。
rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)或组合物(例如，包含本文所述的rAAV的组合物)的有效量也可以取决于施用方式。例如，在一些情况下，通过基质内施用或皮下注射靶向眼部(例如，角膜)组织可能需要与通过另一种方法(例如，全身施用，外用施用)不同(例如，更高或更低)的剂量。因此，在一些实施方案中，注射是基质内注射(IS)。在一些实施方案中，注射是外用施用(例如，外用施用至眼)。在一些情况下，施用多个剂量的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)。
在一些实施方案中，配制rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)组合物以减少组合物中AAV颗粒的聚集，尤其是在存在高rAAV浓度(例如，～1013GC/mL或更高)的情况下。减少rAAV聚集的方法是本领域公知的，并且包括例如添加表面活性剂、调节pH、调节盐浓度等(参见，例如，Wright FR,等人,Molecular Therapy(2005)12,171–178，其内容通过引用并入本文。)
药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制，以及开发用于在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适的给药和治疗方案，是本领域技术人员公知的。
通常，这些制剂可以含有至少约0.1％或更多的活性化合物，尽管活性成分的百分比当然可以变化并且可以方便地在总制剂重量或体积的约1或2％至约70％或80％或更多之间。自然地，每种在治疗上有用的组合物中的活性化合物的量都可以以使得在任何给定的化合物单位剂量中都将获得合适的剂量的方式制备。诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑等因素将由制备此类药物制剂的本领域技术人员考虑，因此，多种剂量和治疗方案可能是期望的。
在某些情况下，希望通过玻璃体内、眼内、视网膜下、皮下、胰内、鼻内、胃肠外、静脉内、肌内、鞘内、经口、腹膜内或吸入之一来递送本文公开的合适配制的药物组合物中的基于rAAV的治疗构建体。在一些实施方案中，可以使用如美国专利号5,543,158；5,641,515和5,399,363(每一个均通过引用以其整体并入本文)中描述的施用方式来递送rAAV。在一些实施方案中，优选的施用方式是通过门静脉注射。
适合注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和在油中制备分散液。在一般储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。在许多情况下，所述形式是无菌的，并且流动性达到容易注射的程度。它必须在制造和储存条件下保持稳定，并且其保存必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和/或植物油。合适的流动性可以例如通过使用包衣剂例如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需粒径和通过使用表面活性剂来保持。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖类或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，引起可注射组合物的延长吸收。
例如，对于可注射水性溶液的施用，如果需要，可以将溶液适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这个方面，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，一个剂量可以溶解在1mL的等渗NaCl溶液中，然后添加到1000mL的皮下灌注液中或在建议的输注部位注射，(参见，例如，"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版,第1035-1038和1570-1580页)。根据宿主的情况，一定会出现一些剂量上的变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定针对个体宿主的合适剂量。
通过将所需量的活性rAAV与本文列举的各种其他成分(根据需要)并入合适溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散液是通过将各种经灭菌的活性成分并入含有基础分散介质和来自上述列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。
本文公开的rAAV组合物也可配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，其与无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。通过配制，溶液将以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用。所述制剂易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。
如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣剂、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。补充活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用给宿主时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。
诸如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等递送媒介物可用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，rAAV载体递送的转基因可以被配制用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中递送。
此类制剂可优选用于引入本文公开的核酸或rAAV构建体的药学上可接受的制剂。脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的。目前，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制备物作为潜在药物载体的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。
脂质体已成功用于许多通常对通过其他步骤进行的转染具有抗性的细胞类型。此外，脂质体不受，而DNA长度的限制对基于病毒的递送***来说是典型的。脂质体已被有效用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入各种培养的细胞系和动物。此外，已经完成了数项成功的检查脂质体介导的药物递送有效性的临床试验。
脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV)的磷脂形成。MLV通常具有25nm至4μm的直径。MLV的超声处理导致形成直径在200至
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范围内的小的单层囊泡(SUV)，其核心中含有水性溶液。
或者，可以使用rAAV的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定且可重复的方式捕获物质。为避免因细胞内聚合物超载而产生的副作用，此类超细颗粒(尺寸为约0.1μm)应使用能够在体内降解的聚合物进行设计。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒。
除了上述递送方法之外，还考虑将以下技术作为将rAAV组合物递送至宿主的替代方法。超声导入法(即超声)已在美国专利号5,656,016中使用和描述为提高药物渗透进入和通过循环***的速率和功效的装置。考虑的其他药物递送替代方案是骨内注射(美国专利号5,779,708)、微芯片装置(美国专利号5,797,898)、眼科制剂(Bourlais等人,1998)、透皮基质(美国专利号5,770,219和5,783,208)和反馈控制的递送(美国专利号5,697,899)。
在一些实施方案中，本文所述的抗VEGF剂(例如，KH902)通过ceDNA递送至受试者。包含编码抗VEGF剂(例如，KH902)的ceDNA的任何组合物也在本公开的范围内。在一些实施方案中，编码抗VEGF剂(例如，KH902)的ceDNA及其组合物可以使用本文所述的任何合适方法施用给受试者。在一些实施方案中，通过注射递送的编码抗-VEGF剂(例如，KH902)的ceDNA的有效量是足以在靶组织中表达有效量的抗-VEGF剂(例如，KH902)的量。在一些实施方案中，有效量的编码抗VEGF剂(例如，KH902)的ceDNA的递送足以通过合适的施用途径(例如，眼内注射、i.v.注射、腹膜内注射和肌内注射)向受试者每眼递送10μg至10mg或介于之间的任何中间值的抗-VEGF剂(例如，KH902)。在一些方面，本公开涉及知晓向受试者施用AAV的一种潜在副作用是受试者中对AAV的免疫应答，包括炎症。在一些实施方案中，受试者在施用如本文所述的一种或多种rAAV之前被免疫抑制。
如本文所用，“免疫抑制的”或“免疫抑制”是指受试者中免疫应答的激活或功效降低。可以使用一种或多种(例如，多种，例如2、3、4、5或更多种)药剂在受试者中诱导免疫抑制，所述药剂包括但不限于利妥昔单抗(rituximab)、甲基***龙(methylprednisolone)、***龙、西罗莫司(sirolimus)、免疫球蛋白注射液、***(prednisone)、甲强龙(Solu-Medrol)、兰索拉唑(Lansoprazole)、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、甲氨蝶呤及其任意组合。在一些实施方案中，免疫抑制方案包括施用西罗莫司、***龙、兰索拉唑、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑或其任意组合。
在一些实施方案中，本公开描述的方法进一步包括在受试者被施用rAAV(例如，本公开所述的rAAV或药物组合物)之前在受试者中诱导免疫抑制(例如，施用一种或多种免疫抑制剂)的步骤。在一些实施方案中，在向受试者施用rAAV之前的约30天至约0天之间(例如，施用rAAV前的30天之内的任何时间，包括端点)，对受试者进行免疫抑制(例如，在受试者中诱导免疫抑制)。在一些实施方案中，将受试者用免疫抑制剂(例如，利妥昔单抗、西罗莫司和/或***)预处理至少7天。
在一些实施方案中，本公开中描述的方法进一步包括向被施用本公开的rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)或包含rAAV的药物组合物的受试者共同施用或预先施用药剂。在一些实施方案中，所述药剂选自米格鲁他(Miglustat)、开浦兰(Keppra)、兰索拉唑(Prevacid)、氯硝西泮(Clonazepam)及其任何组合。在一些实施方案中，可以以任何顺序将rAAV(例如，用于KH902的rAAV)和额外药剂递送至受试者。在一些实施方案中，将rAAV(例如，用于KH902的rAAV)和额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)同时递送至受试者。在一些实施方案中，将rAAV(例如，用于KH902的rAAV)和额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)共同施用给受试者(例如，在一种组合物中或在不同组合物中)。在一些实施方案中，rAAV(例如，用于KH902的rAAV)在额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)之前递送。在一些实施方案中，rAAV(例如，用于KH902的rAAV)在额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)之后递送。在一些实施方案中，以不同频率将rAAV(例如，用于KH902的rAAV)和额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)递送至受试者，例如，受试者每个月、每两个月、每六个月、每年、每两年、每三年、每5年或更长时间地接受rAAV(例如，用于KH902)，但每天、每周、每两周、每个月、每天两次、每天三次或每周两次地接受额外药剂(例如，米格鲁他、开浦兰、兰索拉唑、氯硝西泮)。
在一些实施方案中，在施用rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)或药物组合物期间和/或之后维持受试者的免疫抑制。在一些实施方案中，在施用rAAV或药物组合物之后将受试者免疫抑制(例如，施用一种或多种免疫抑制剂)1天至1年之间的时间。
治疗与VEGF和/或血管生成相关的疾病的方法
本公开的多个方面涉及rAAV(例如，rAAV2.7m8-KH902)介导的将编码抗VEGF剂(例如，KH902)的转基因递送至受试者(例如，受试者中的细胞)的方法。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。非人哺乳动物的非限制性实例是小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类动物。
在一些实施方案中，本公开涉及一种抑制有此需要的受试者中的VEGF活性的方法。在一些实施方案中，本公开描述的方法可用于治疗患有或怀疑患有与VEGF相关的疾病的受试者。如本文所用，“与VEGF相关的疾病”是指与异常VEGF活性/信号传导相关的一组疾病。VEGF是一种由细胞产生的信号蛋白，其可刺激血管的形成。VEGF是一种已知的诱导血管生成的因子。在一些实施方案中，本公开描述的方法可用于治疗患有或怀疑患有血管生成相关疾病的受试者。如本文所用，血管生成相关疾病是指与异常的血管生成相关的疾病。非限制性示例性血管生成相关疾病包括血管生成依赖性癌症，包括例如血管生成相关眼病、实体瘤(例如，肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、头颈癌、结肠癌、黑色素瘤)、血源性肿瘤如白血病、转移性肿瘤、良性肿瘤(例如，血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、颗粒性结膜炎和化脓性肉芽肿)、类风湿性关节炎、银屑病、虹膜红变(rubeosis)、斯特奇-韦伯综合征(Osier-Webber Syndrome)、心肌血管生成、斑块血管新生、毛细血管扩张、血友病性关节或血管纤维瘤。
在一些实施方案中，血管生成相关眼病包括但不限于糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼和晶状体后纤维增生、流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏症、接触镜超戴症、特应性角膜炎、上部角膜缘角膜炎(superiorlimbic keratitis)、翼状胬肉干燥性角膜炎(pterygium keratitis sicca)、干燥综合征、红斑痤疮、小水泡病(phylectenulosis)、梅毒、分枝杆菌感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、蚕食性角膜溃疡(Mooren ulcer)、Terrien角膜边缘性变性、边缘性角质层分离、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、多动脉炎、创伤、韦格纳结节病、巩膜炎、史蒂文斯-约翰逊综合征(Steven'sJohnson disease)、类天疱疮放射状角膜切开术、和角膜移植排斥、镰状细胞贫血、肉样瘤、弹性假黄色瘤、Paget病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉闭锁性病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分枝杆菌感染、莱姆病、***性红斑狼疮、早产儿视网膜病变、Eales病、***、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、假定眼组织胞浆菌病(presumed ocular histoplasmosis)、Bests病、近视、视盘先天性小凹(optic pits)、Stargardt病、睫状体扁平部炎、慢性视网膜脱离、高粘滞综合征、弓形体病、创伤或激光术后并发症。
如本文所用，术语“治疗”是指将包含抗VEGF剂(例如，KH902)的组合物应用或施用于患有与异常VEGF活性或血管生成相关的症状或疾病或具有对与异常VEGF活性或血管生成相关的疾病的易感性的受试者，目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响病症、疾病的症状或对与异常的VEGF活性或血管生成相关的疾病的易感性。在一些实施方案中，施用抗VEGF剂导致VEGF活性与参考值相比降低2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。测量VEGF活性的方法是本领域已知的。非限制性示例性参考值可以是相同受试者在接受抗VEGF剂治疗之前的VEGF活性。在一些实施方案中，施用抗VEGF剂导致血管生成与参考值相比减少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。测量血管生成的方法是本领域已知的。非限制性示例性参考值可以是相同受试者在接受抗VEGF剂治疗之前的血管生成水平。
缓解与异常VEGF活性或血管生成相关的疾病包括延迟疾病的发展或进展，或降低疾病严重程度。缓解疾病并不一定需要治愈性结果。如本文所用，“延迟”疾病(例如与异常VEGF活性或血管生成相关的疾病)的发展意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疾病的进展。这种延迟可以是不同的时间长度，取决于疾病的病史和/或正在接受治疗的个体。“延迟”或减轻疾病发展或延迟疾病发作的方法是当与不使用该方法相比时，降低在给定时间范围内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或降低在给定时间范围内的症状程度的方法。此类比较通常基于临床研究，使用的受试者数量足以给出统计学上显著的结果。
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域公知的标准临床技术来检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法检测到的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，与异常VEGF活性或血管生成相关的疾病的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
实施例
实施例1：AAV2.7m8递送康柏西普(KH902)
康柏西普(KH902)是一种抗VEGF治疗剂，其通过重组腺相关病毒通过玻璃体内施用(或其他途径)被递送至视网膜。独特的设计是包含由CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子调节盒驱动的KH902转基因的单链AAV载体基因组(图1A-1C)。在KH902起始密码子的上游设计了Kozak序列以增强翻译(图1C)。当顺式质粒(图1A)通过反式质粒(trans-plasmid)共转染或通过稳定整合被递送至表达AAV Rep和Cap基因以及强制性辅助基因的包装细胞系中时，包括反向末端重复序列(ITR)并且被其侧接的序列被包装到AAV2.7m8衣壳病毒体中。
将细胞用所得的表达分泌的KH902的ssAAV2.7m8-KH902病毒体感染或转导，其通过标准蛋白质印迹分析检测(图2)。用包装在AAV2.7m8衣壳中的ssAAV-KH902转导视网膜色素上皮(RPE)细胞系，导致KH902的蛋白表达与在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中生产的康柏西普药物具有相似的分子量。该数据表明，rAAV-KH902载体可以被包装到不同的AAV衣壳中，并且当感染至细胞中时，可以有效地分泌KH902。
来自用rAAV2.7m8-KH902感染的RPE细胞的条件培养基强烈抑制血管生成，如血管内皮生长因子(VEGF)诱导的肾小管生成(图3A和3B)的减少和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以与康柏西普药物相同的方式增殖(CCK-8，图3C)所示。该数据表明，用rAAV-KH902感染的细胞可以在体外表达和分泌功能性抗血管生成KH902。
实施例2：玻璃体内注射AAV2.7m8-KH902可有效递送KH902以预防小鼠中氧诱导的 视网膜病变和血管形成
在出生后(PN)1-3天通过玻璃体内注射用载体处理新生小鼠。分别将每只小鼠的一只眼用包装Egfp转基因的载体(rAAV2.7m8-Egfp)处理，另一只眼用包装KH902转基因的载体(rAAV2.7m8-KH902)和rAAV2.7m8-Egfp的5:1比例混合物处理。在所有情况下，总剂量为每只眼1.5E9 vg，体积为1μL。然后将小鼠保持在70％氧气下直至PN 7，并置于常氧条件下(20-21％氧气)直至PN 11。在PN 18处死小鼠，并收获和观察眼(图4A-4B)。然后通过目视检查对所处理的眼的病理学进行评分并评分(图5)。仅用rAAV-Egfp处理的眼可以指示高氧诱导的程度，并作为病理学变化性的内部对照。应该注意的是，没有水肿并不意味着高氧不能诱导视网膜病变，经rAAV2.7m8-KH902处理的眼中存在水肿也不意味着载体是无效的。血管病理学的挽救取决于动脉瘤结节是否存在。
在作为阴性对照的经rAAV2.7m8-Egfp处理的眼中，由于过度增殖和血管动脉瘤结节的形成而观察到血管病理学(图4A)。用rAAV2-KH902处理的眼有效地预防了病理学(图4B，右小图)，并且还在一定程度上减少了血管发育(图6B，右小图)。同样，rAAV2.7m8-KH902有效地预防了血管病理学(图5)。然而，rAAV2.7m8-KH902似乎也能有效地阻止正常血管发育，其中转导是最高的。因此，这些小鼠出现水肿的频率更高(图5)。据推测，在发育过程中对主要血管的强烈抑制似乎导致小局部区域的血管出芽(vascular sprouting)。
该数据表明，AAV2.7m8-KH902是用于预防和可能逆转脉络膜血管新生的一种潜在可行的基因治疗平台。
实施例3：rAAV2.7m8-KH902的功效和毒性
在激光损伤治疗模型中研究了rAAV-KH902的功效。在整个15天的注射后观察窗口中观察到，激光损伤后用1:10稀释(3E8 vg/眼)的AAV2.7m8-KH902处理能够将脉络膜血管新生(CNV)的百分比降低至与未稀释载体(3E9vg/眼)相似的程度。重要的是，可以在不引起由KH902治疗引起的血管炎样表型的情况下实现这一结果。
rAAV-KH902功效通过被激光损伤并随后在损伤后5天用3E9(未稀释)、3E8(1:10稀释)和1.5E8(1:20稀释)vg/眼的剂量的rAAV2.7m8-KH902处理的小鼠眼中剩余CNV的百分比来定量(图6A)。损伤后20天，3E9 vg/眼剂量后剩余CNV的百分比为49％，而3E8和1.5E8剂量下分别有71％和74％的CNV剩余。3E8和1.5E8剂量在处理后15天(损伤后20天，图6A)减少CNV的能力相对相等。
高剂量的AAV-KH902在眼中引起“血管炎”效应，其自身表现为免疫细胞浸润到视网膜中。3E9 vg/眼剂量的AAV2.7m8-KH902可以在注射后4周引起血管炎。取横截面并在免疫荧光显微镜下评估，以鉴定浸润到经转导的视网膜中的细胞类型。图6B显示了AAV2.7m8-KH902处理后，视网膜神经节细胞层中的免疫细胞浸润和血小板聚集。随后，将较低剂量(1:10稀释，3E8vg/眼)的rAAV2.7m8-KH902与3E9 vg/眼剂量平行评估其通过免疫荧光显微镜在平面封固载玻片中引起血管炎的能力。用一系列免疫细胞标志物对视网膜进行染色(图6C)。如预期，3E8没有导致浸润，并且与在该剂量下观察到的血管炎表型缺乏相一致。
此外，在rAAV2.7m8-KH902注射后评估KH902表达水平，以衡量转基因功效的动力学、CNV减少和转基因诱导的血管表型。进行ddPCR以定量KH902在经AAV2.7m8-KH902(3E9vg/眼)处理的眼中的相对表达(图6D)。KH902表达在第1周和第8周之间约翻了一倍，其水平在第6周时似乎达到稳态。
等同方案
尽管本文已经描述和说明了本发明的若干实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文描述的功能和/或获得本文描述的结果和/或本文描述的一个或多个优点的各种其他装置和/或结构，并且，这些变化和/或修改中的每一个均被认为是在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置都是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明教导使用的一个或多个特定应用。本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验确定本文描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。因此，应当理解，前述实施方案仅作为示例呈现，并且在所附权利要求及其等同方案的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文描述的每个单独的特征、***、物品、材料和/或方法。此外，如果这样的特征、***、物品、材料和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、***、物品、材料和/或方法的任何组合都包括在本发明的范围内。
除非明确相反指出，否则本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个(种)”应理解为表示“至少一个(种)”。
如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示由如此结合的要素中的“一个或两个”，即在一些情况下要素共同存在，以及在其他情况下分开存在。除了“和/或”从句所具体标识的要素之外，可以任选存在其他要素，而不论与具体标识的那些要素相关还是不相关，除非明确相反指出。因此，作为一个非限制性实例，当与诸如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的提及在一个实施方案中可以是指A且无B(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，是指B且无A(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，是指A和B两者(任选地包括其他要素)；等等。
如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上文所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含许多要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选的其他未列出的项。只有明确相反地指出的术语，例如“仅一个”或“唯一一个”，或者当在权利要求中使用时，“由……组成”将指的是包含许多要素或要素列表中的唯一一个要素。一般而言，在排他性术语之前，如“任一”、“之一”、“仅一个”或“唯一一个”，本文所用的术语“或”仅应解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个，而不是两个”)。“基本上由……组成”在用于权利要求时，应具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个要素的列表，短语“至少一个”应理解为表示从要素列表中任何一个或多个要素中选择的至少一个要素，但不一定包括要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一个要素，并且不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许任选地存在短语“至少一个”所指要素列表内所具体标识的要素之外的要素，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地“A或B中的至少一个”；或等同地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以是指至少一个，任选地包括多于一个A但不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个B但不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个A，以及至少一个，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)；等等。
在权利要求书中以及在上述说明书中，所有过渡短语，如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”等应理解为开放式的，即表示包括但不限于。只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中所述。
在权利要求中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等顺序术语来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一权利要求要素的任何优先权、优先级或顺序或方法的动作执行的时间顺序，而是仅用作标签以将具有特定名称的一个权利要求要素与具有相同名称(但用于顺序术语)的另一个要素区分开来以区分权利要求要素。
序列表
<110> 马萨诸塞大学（University of Massachusetts）
成都康弘生物科技有限公司（Chengdu Kanghong Biotechnology Co. Ltd）
<120> 用于递送KH902(康柏西普)的重组腺相关病毒及其用途
<130> U0120.70127WO00
<140> 尚未指定
<141> 与上述内容同时提供
<150> US 62/940,288
<151> 2019-11-26
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 1
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatcta gttccggagg tagacctttc gtagagatgt acagtgaaat ccccgaaatt 120
atacacatga ctgaaggaag ggagctcgtc attccctgcc gggttacgtc acctaacatc 180
actgttactt taaaaaagtt tccacttgac actttgatcc ctgatggaaa acgcataatc 240
tgggacagta gaaagggctt catcatatca aatgcaacgt acaaagaaat agggcttctg 300
acctgtgaag caacagtcaa tgggcatttg tataagacaa actatctcac acatcgacaa 360
accaatacaa tcatagatgt ggttctgagt ccgtctcatg gaattgaact atctgttgga 420
gaaaagcttg tcttaaattg tacagcaaga actgaactaa atgtggggat tgacttcaac 480
tgggaatacc cttcttcgaa gcatcagcat aagaaacttg taaaccgaga cctaaaaacc 540
cagtctggga gtgagatgaa gaaatttttg agcaccttaa ctatagatgg tgtaacccgg 600
agtgaccaag gattgtacac ctgtgcagca tccagtgggc tgatgaccaa gaagaacagc 660
acatttgtca gggtccatga aaaacctttt gttgcttttg gaagtggcat ggaatctctg 720
gtggaagcca cggtggggga gcgtgtcaga atccctgcga agtaccttgg ttacccaccc 780
ccagaaataa aatggtataa aaatggaata ccccttgagt ccaatcacac aattaaagcg 840
gggcatgtac tgacgattat ggaagtgagt gaaagagaca caggaaatta cactgtcatc 900
cttaccaatc ccatttcaaa ggagaagcag agccatgtgg tctctctggt tgtgtatgtc 960
ccaccgggcc cgggcgacaa aactcacaca tgcccactgt gcccagcacc tgaactcctg 1020
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 1080
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 1140
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1200
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1260
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<211> 4011
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<210> 3
<211> 6832
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 3
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180
atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480
caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540
tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 600
gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 660
tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 720
ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 780
gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 840
aaagcgaagc gcgcggcggg cggggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc cgtgccccgc 900
tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg 960
agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt 1020
gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg 1080
gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggctcc 1140
gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt 1200
gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg 1260
aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg 1320
gtcgggctgc aaccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg 1380
ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg 1440
caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg 1500
cgcggcggcc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt 1560
ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg tgcggagccg 1620
aaatctggga ggcgccgccg caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg gtgcggcgcc 1680
ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc 1740
cctctccagc ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg 1800
gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat 1860
gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat 1920
tttggcaaag aattcgccac catggtcagc tactgggaca ccggggtcct gctgtgcgcg 1980
ctgctcagct gtctgcttct cacaggatct agttccggag gtagaccttt cgtagagatg 2040
tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc 2100
cgggttacgt cacctaacat cactgttact ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc 2160
cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg 2220
tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa gcaacagtca atgggcattt gtataagaca 2280
aactatctca cacatcgaca aaccaataca atcatagatg tggttctgag tccgtctcat 2340
ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta 2400
aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac ccttcttcga agcatcagca taagaaactt 2460
gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg agtgagatga agaaattttt gagcacctta 2520
actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg 2580
ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc agggtccatg aaaaaccttt tgttgctttt 2640
ggaagtggca tggaatctct ggtggaagcc acggtggggg agcgtgtcag aatccctgcg 2700
aagtaccttg gttacccacc cccagaaata aaatggtata aaaatggaat accccttgag 2760
tccaatcaca caattaaagc ggggcatgta ctgacgatta tggaagtgag tgaaagagac 2820
acaggaaatt acactgtcat ccttaccaat cccatttcaa aggagaagca gagccatgtg 2880
gtctctctgg ttgtgtatgt cccaccgggc ccgggcgaca aaactcacac atgcccactg 2940
tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 3000
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 3060
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 3120
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 3180
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 3240
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 3300
tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgccta 3360
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 3420
aacaactaca aggccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 3480
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 3540
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 3600
acgcgtggta cctctagagt cgacccgggc ggcctcgagg acggggtgaa ctacgcctga 3660
ggatccgatc tttttccctc tgccaaaaat tatggggaca tcatgaagcc ccttgagcat 3720
ctgacttctg gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa tagtgtgttg gaattttttg 3780
tgtctctcac tcggaagcaa ttcgttgatc tgaatttcga ccacccataa tacccattac 3840
cctggtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc tagtgatgga 3900
gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 3960
ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gccttaatta 4020
acctaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 4080
acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 4140
caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg cgccctgtag 4200
cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 4260
cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 4320
tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 4380
cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 4440
gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 4500
aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc 4560
gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa 4620
caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 4680
atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 4740
taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 4800
cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 4860
aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 4920
aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 4980
tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 5040
ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 5100
catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 5160
aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 5220
ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 5280
gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc 5340
aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 5400
gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 5460
gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 5520
gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 5580
gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 5640
gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 5700
atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 5760
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 5820
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 5880
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 5940
ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 6000
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 6060
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 6120
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 6180
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 6240
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 6300
gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 6360
tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 6420
ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 6480
gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 6540
gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc 6600
cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 6660
ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 6720
cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 6780
ggaaacagct atgaccatga ttacgccaga tttaattaag gccttaatta gg 6832
<210> 4
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 其中n是腺嘌呤或胞嘧啶
<400> 4
gccncc 6
<210> 5
<211> 552
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 5
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu
20 25 30
Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
65 70 75 80
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
85 90 95
Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
100 105 110
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val
115 120 125
Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val
130 135 140
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn
145 150 155 160
Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg
165 170 175
Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr
180 185 190
Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys
195 200 205
Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg
210 215 220
Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu
225 230 235 240
Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu
245 250 255
Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu
260 265 270
Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu
275 280 285
Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro
290 295 300
Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val
305 310 315 320
Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala
325 330 335
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
340 345 350
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
355 360 365
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
370 375 380
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
385 390 395 400
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
405 410 415
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
420 425 430
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
435 440 445
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
450 455 460
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
465 470 475 480
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
485 490 495
Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
500 505 510
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
515 520 525
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
530 535 540
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550
<210> 6
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu
20 25 30
Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
65 70 75 80
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
85 90 95
Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
100 105 110
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val
115 120 125
<210> 7
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
1 5 10 15
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
20 25 30
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
35 40 45
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
50 55 60
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
65 70 75 80
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
85 90 95
Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser
100 105 110
Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr
115 120 125
Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro
130 135 140
Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met
145 150 155 160
Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn
165 170 175
Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr
180 185 190
Val Pro Pro
195
<210> 8
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu
20 25 30
Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
65 70 75 80
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
85 90 95
Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
100 105 110
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val
115 120 125
Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val
130 135 140
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn
145 150 155 160
Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg
165 170 175
Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr
180 185 190
Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys
195 200 205
Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg
210 215 220
Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu
225 230 235 240
Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu
245 250 255
Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu
260 265 270
Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu
275 280 285
Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro
290 295 300
Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val
305 310 315 320
Pro Pro
<210> 9
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu
20 25 30
Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
65 70 75 80
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
85 90 95
Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
100 105 110
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gly
115 120 125
Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 10
<211> 425
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
1 5 10 15
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
20 25 30
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
35 40 45
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
50 55 60
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
65 70 75 80
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
85 90 95
Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser
100 105 110
Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr
115 120 125
Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro
130 135 140
Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met
145 150 155 160
Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn
165 170 175
Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr
180 185 190
Val Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro
195 200 205
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
210 215 220
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
225 230 235 240
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
245 250 255
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
260 265 270
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
275 280 285
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
290 295 300
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
305 310 315 320
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
325 330 335
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
340 345 350
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
355 360 365
Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
370 375 380
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
385 390 395 400
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
405 410 415
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
420 425
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro
1 5
<210> 12
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435 440 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450 455 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545 550 555 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
580 585 590
Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610 615 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
675 680 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
690 695 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
705 710 715 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 13
<211> 745
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Thr
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435 440 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450 455 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545 550 555 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Glu
580 585 590
Thr Thr Arg Pro Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595 600 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610 615 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625 630 635 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645 650 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660 665 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675 680 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690 695 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Ile Asn Val
705 710 715 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725 730 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740 745
<210> 14
<211> 2238
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 14
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctatgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480
aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540
tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600
aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660
gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcacc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780
tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840
tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900
aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960
aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020
caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080
tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140
aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200
cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260
cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320
tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380
cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440
ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500
tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560
ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620
atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680
gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740
accaacctcc agagaggcaa cctagcactc ggcgaaacaa caagacctgc taggcaagca 1800
gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt cttccaggca tggtctggca ggacagagat 1860
gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag attccacaca cggacggaca ttttcacccc 1920
tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa caccctcctc cccagattct catcaagaac 1980
accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc 2040
acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac 2100
agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac acttccaact acaacaagtc tattaatgtg 2160
gactttactg tggacactaa tggcgtgtat tcagagcctc gccccattgg caccagatac 2220
ctgactcgta atctgtaa 2238

Claims (45)

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：含有编码转基因表达盒的核酸的腺相关病毒(AAV)衣壳，
其中所述AAV衣壳是AAV2.7m8；且
其中所述转基因包含编码抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的核酸序列，所述转基因表达盒的侧翼是AAV反向末端重复(ITR)。
2.如权利要求1所述的rAAV，其中所述抗VEGF剂是人VEGF诱饵受体。
3.如权利要求2所述的rAAV，其中所述人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体1的细胞外结构域2。
4.如权利要求2所述的rAAV，其中所述人VEGF诱饵受体包含人VEGF受体2的细胞外结构域3和4。
5.如权利要求2-4中任一项所述的rAAV，其中所述VEGF诱饵受体能够结合抗血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PlGF)。
6.如权利要求1或2所述的rAAV，其中所述抗VEGF剂是人VEGF受体融合蛋白。
7.如权利要求6所述的rAAV，其中所述人VEGF受体融合蛋白包含与人VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。
8.如权利要求6所述的rAAV，其中所述人VEGF受体融合蛋白包含与免疫球蛋白的Fc部分融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。
9.如权利要求6所述的rAAV，其中所述人VEGF受体融合蛋白包含与免疫球蛋白的Fc部分融合的人VEGF受体3的细胞外结构域3和4。
10.如权利要求6所述的rAAV，其中所述人VEGF受体融合蛋白包含与人VEGF受体2的细胞外结构域3和4融合，并进一步与免疫球蛋白的Fc部分融合的人VEGF受体1的细胞外结构域2。
11.如权利要求10所述的rAAV，其中所述抗VEGF剂包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、90％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其部分。
12.如权利要求1-11中任一项所述的rAAV，其中所述抗VEGF剂是KH902。
13.如权利要求10-12所述的rAAV，其中所述转基因包含与SEQ ID NO:1的核酸序列或其密码子优化的变体具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、90％、99％或100％同一性的核酸序列。
14.如权利要求2-11中任一项所述的rAAV，其中所述VEGF诱饵受体能够结合抗血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PlGF)。
15.如权利要求1-12中任一项所述的rAAV，其中所述表达盒进一步包含有效连接至所述转基因的启动子。
16.如权利要求15所述的rAAV，其中所述启动子包含巨细胞病毒(CMV)早期增强子。
17.如权利要求16所述的rAAV，其中所述启动子是嵌合巨细胞病毒(CMV)/鸡β-肌动蛋白(CB)启动子。
18.如权利要求1-17中任一项所述的rAAV，其中所述表达盒包含一个或多个内含子。
19.如权利要求18所述的rAAV，其中至少一个内含子位于所述启动子和编码所述抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的核酸序列之间。
20.如权利要求1-19中任一项所述的rAAV，其中所述表达盒包含Kozak序列。
21.如权利要求20所述的rAAV，其中所述Kozak序列位于所述内含子和编码所述抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂的转基因之间。
22.如权利要求1-21中任一项所述的rAAV，其中所述表达盒包含3'非翻译区(3'UTR)。
23.如权利要求1-22中任一项所述的rAAV，其中所述表达盒进一步包含一个或多个miRNA结合位点。
24.如权利要求23所述的rAAV，其中所述一个或多个miRNA结合位点位于所述转基因的3'UTR中。
25.如权利要求23或24所述的rAAV，其中至少一个miRNA结合位点是免疫细胞相关的miRNA结合位点。
26.如权利要求25所述的rAAV，其中免疫细胞相关的miRNA选自：miR-15a、miR-16-1、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-21、miR-29a/b/c、miR-30b、miR-31、miR-34a、miR-92a-1、miR-106a、miR-125a/b、miR-142-3p、miR-146a、miR-150、miR-155、miR-181a、miR-223和miR-424、miR-221、miR-222、let-7i、miR-148和miR-152。
27.如权利要求1-26中任一项所述的rAAV，其中AAV ITR具有选自AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR和AAV6 ITR的血清型。
28.如权利要求1-27中任一项所述的rAAV，其包含与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少80％、90％、99％或100％同一性的核酸序列。
29.如权利要求1-28中任一项所述的rAAV，其中所述rAAV是单链AAV(ssAAV)。
30.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：
(i)rAAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白为AAV2.7m8；和
(ii)核酸，其在5'至3'的顺序上包含：
(a)5'AAV ITR；
(b)CMV增强子；
(c)CBA启动子；
(d)鸡β-肌动蛋白内含子；
(e)Kozak序列；
(f)编码抗VEGF剂的转基因，其中所述抗VEGF剂由SEQ ID NO:1中的核酸序列编码；
(g)兔β-珠蛋白polyA信号尾；和
(h)3'AAV ITR。
31.一种宿主细胞，其包含权利要求1-30中任一项所述的rAAV。
32.如权利要求31所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或昆虫细胞。
33.一种药物组合物，其包含权利要求1-30中任一项所述的rAAV或权利要求31-32中任一项所述的宿主细胞。
34.如权利要求33所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
35.如权利要求33或34所述的药物组合物，其中配制所述药物组合物以用于玻璃体内注射、静脉内注射、瘤内注射或肌内注射。
36.一种抑制有此需要的受试者中的VEGF或PlGF活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-30中任一项所述的rAAV、权利要求31或32所述的宿主细胞，或权利要求33-35中任一项所述的药物组合物。
37.一种向有此需要的受试者递送抗VEGF剂的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-30中任一项所述的rAAV、权利要求31或32所述的宿主细胞，或权利要求33-35中任一项所述的药物组合物。
38.一种治疗有此需要的受试者中的血管新生相关疾病、血管生成相关疾病或VEGF相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-30中任一项所述的rAAV、权利要求31或32所述的宿主细胞，或权利要求33-35中任一项所述的药物组合物。
39.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人类哺乳动物。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述非人类哺乳动物是小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人类灵长类动物。
41.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述受试者被诊断为或怀疑患有血管生成相关疾病或VEGF相关疾病。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述血管生成相关疾病或VEGF相关疾病是肿瘤、癌症、视网膜病变、湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)、黄斑水肿、脉络膜血管新生或角膜血管新生。
44.如权利要求36-43中任一项所述的方法，其中所述施用是全身施用，任选地，其中所述施用是静脉内注射。
45.如权利要求36-43中任一项所述的方法，其中所述施用是直接施用至眼组织，任选地，其中所述直接施用是玻璃体内注射、眼内注射或外用施用。
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