CN116970648A - 新型aav衣壳改造株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改造rAAV载体以改进其视网膜组织嗜性和感染、表达能力，并降低其免疫原性的方法，以及通过该方法所获得的载体及其用途。

Description

新型AAV衣壳改造株及其用途
本发明属于基因治疗领域。具体地，本发明涉及一种改造AAV载体以改进其视网膜组织嗜性和感染、表达能力的方法，以及通过该方法所获得的载体及其用途。
背景技术
目前全球因遗传性视网膜疾病(inherited retinal diseases，IRDs)致盲的人数约有1500万，约占总人口的0.02％。遗传性视网膜病变种类众多，例如视网膜劈裂症等，迄今为止已发现超过200个致病基因。
AAV载体是当前最有应用前景的基因治疗载体之一，因其几乎没有致病性并且被除去了整合到被感染细胞的基因组上的能力，并且相对于很多载体而言，AAV载体因致病性低从而也拥有更低的免疫原性。目前已经有数种基于AAV载体的基因治疗药物在某些国家和地区上市，例如2012年在欧洲上市用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症的rAAV(重组AAV)产品Glybera(通用名alipogene tiparvovec)，2017年上市用于治疗视网膜失调症的rAAV产品Luxturna，和2019年在美国上市用于治疗脊髓性肌萎缩症的Zolgensma(通用名Onasemnogene abeparvovec)。对于IRD，基于AAV载体的基因药物同样是非常有前景的治疗方案。已知AAV 1，4，5，7，8和9型都能够通过视网膜下腔或局部给药去转导视网膜色素上皮细胞或光感受器细胞，但通过IVT(玻璃体腔)给药，转导效率大大降低。
现有专利技术已有多种改进AAV病毒对视网膜组织的感染效率的尝试。例如，中国专利CN107012171B涉及一种AAV2.7m8，由已知血清型AAV2改造而来，其将AAV2衣壳蛋白VP1的第588氨基酸位置替换为11个氨基酸的视网膜组织靶向肽，改变了AAV2病毒衣壳结合HSPG受体的传统能力。然而，作为现有技术中高剂量AAV2.7m8玻璃体给药依然并不能有效转导视网膜组织，尤其是视网膜色素上皮(RPE)和感光细胞。
发明概述
本发明提供了改进rAAV载体的方法，其特征在于，在野生型AAV2序列的基础上，进行氨基酸残基的修饰(例如，但不限于，取代、缺失和/或添加)，使得改造后的AAV2载体与靶细胞表面受体的亲和力提高。因而在一个优选的实施方案中，所述方法是改造AAV2衣壳蛋白的方法。在一个更优选的实施方案中，所述方法是改造AAV2衣壳蛋白VP1，使其具备以下氨基酸突变位点：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F和S501A。在另一个更优选的实施方案中，所述方法是改造AAV2衣壳蛋白VP1，使其具备以下氨基酸突变位点：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y444F,Y500F,S501A和Y730F。在另一个更优选的实施方案中，所述方法是改造AAV2衣壳蛋白VP1，使其具备以下氨基酸突变位点：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F和S501A，同时在位点587(N)和588(R)之间***氨基酸序列LALGDVTRPA。
本发明还提供了新型rAAV载体，具体而言，本发明提供了VP1衣壳蛋白经过改造优化的腺相关病毒(AAV)血清型及其相应的重组腺相关病毒载体，其特征在于经改造的VP1衣壳蛋白具有如SEQ ID NO:1-3任一项所示的氨基酸序列。
本发明还提供了通过本发明的方法改进得到的新型rAAV载体，其特征在于具有经改造的VP1衣壳蛋白，所述VP1衣壳蛋白具有如SEQ ID NO:1-3任一项所示的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，所述新血清型是AAV2的变体。在本发明的一些实施方案中，所述衣壳改造株是结合HSPG受体。在本发明的另一些实施方案中，所述衣壳改造株不结合或基本不结合HSPG受体。在本发明的一个优选的实施方案中，新血清型的rAAV载体能有效转导视网膜组织(尤其是RPE和感光细胞)，转导效率显著提高。在一些实施方案中，新血清型的rAAV载体的受体结合特性、细胞/组织嗜性和转导效率不同于基于野生型AAV(例如，野生型AAV2)的rAAV载体或其他现有技术中已知的rAAV载体。在一些实施方案中，新血清型的rAAV载体的不同于野生型AAV(例如，野生型AAV2)的受体结合特性、细胞/组织嗜性和转导效率是被氨基酸序列的修饰(例如，取代、缺失和/或添加)所赋予的。
在本发明的一些实施方案中，新血清型的rAAV载体对视网膜组织的体外转导效率提升了至少5倍或至少10倍，优选提升了至少15倍，更优选提升了至少20倍，最优选提升了至少30-50倍。在本发明的一些实施方案中，所述转导效率提升表现为被感染的细胞比例增加和/或被感染的组织中总体外源基因表达量提高。在本发明的一些优选的实施方案中，所述转导效率提升在感染后第1天，感染后第2天，感染后第3天，感染后第4天，感染后第5天，感染后第6天，感染后第7天，感染后第8天，感染后第9天或感染后第10天即以可以被检测的方式出现。在本发明的一些优选的实施方案中，所述转导效率提升在感染组织后持续到感染后第1周，感染后第2周，感染后第3周，感染后第4周，感染后第5周，感染后第6周，感染后第7周，感染后第8周，感染后第3个月，感染后第4个月，感染后第5个月，感染后第6个月，感染后第7个月，感染后第8个月，感染后第9个月，感染后第10个月，感染后第11个月，感染后第12个月。
在一些实施方案中，本发明的新血清型的rAAV载体即使在低剂量时也能有效穿透视网膜组织的内节层，抵达RPE层，并在视网膜脉络膜全网层分布和感染，所述穿透、分布和感染视网膜脉络膜全网层的能力提升了至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少80倍、至少100倍。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的新血清型的rAAV载体具有大幅提高的对AAV中和抗体的抗性。在一些更优选的实施方案中，本发明的新血清型的rAAV载体能够耐受或抵抗5倍更高或10倍更高浓度的AAV中和抗体。在一些更优选的实施方案中，本发明的新血清型的rAAV载体能够耐受或抵抗20倍更高浓度的AAV中和抗体。在一些更优选的实施方案中，本发明的新血清型的rAAV载体能够耐受或抵抗30倍更高或50倍更高浓度的AAV中和抗体。
在一些方面，本发明提供了用于基因治疗应用的rAAV载体。在一些方面，本发明进一步提供了将用于基因治疗应用的rAAV载体递送至个体的视网膜细胞的方法和治疗眼病的方法。
在一些方面中，本发明提供了分离的核酸分子，其编码AAV衣壳蛋白，所述AAV衣壳蛋白具有如SEQ ID NO:1-3任一项所示的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，所述分离的核酸分子包含选自SEQ ID NO：4-6的序列。在本发明的一些实施方案中，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO：4-6具有70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上序列同一性的序列。在一些实施方案中，提供了所述分离的核酸分子的片段。在某些实施方案中，分离的核酸分子片段不编码氨基酸序列为SEQ ID NO：8的肽。
在本发明的某些方面，提供了包含任意前述经改造的VP1衣壳蛋白的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含可药用辅料。在一些实施方案中，提供了这样的组合物，其包含一种或多种本发明的VP1衣壳蛋白和生理相容性载体。在一些优选的实施方案中，提供了这样的组合物，其中的VP1衣壳蛋白以存在于完整病毒颗粒中的形式存在于组合物中。
在本发明的某些方面中，提供了包含前述经改造的VP1衣壳蛋白的rAAV载体。在一些实施方案中，提供了包含rAAV载体的组合物。在某些实施方案中，所述包含rAAV载体的组合物还包含可药用辅料。还提供了rAAV载体，其中所述rAAV载体包含一种或更多种本发明的分离的AAV衣壳蛋白。
在发明的一些方面中，提供了宿主细胞，其包含具有选自SEQ ID NO:4-6的序列的核酸分子。在一些实施方案中，提供了包含宿主细胞和培养基的组合物。在一些实施方案中，提供了包含宿主细胞和冷冻保存剂的组合物。
根据本发明的一些方面，提供了向个体递送外源基因的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向对象施用任意前述rAAV载体，其中所述rAAV载体包含至少一种外源基因，并且其中所述rAAV载体感染所述个体的靶组织的细胞。在一些实施方案中，个体选自小鼠、大鼠、兔、狗、猫、绵羊、猪和非人灵长类。在一个实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，所述至少一种外源基因是蛋白质编码基因。在某些实施方案中，经静脉内、透皮、眼内、鞘内、脑内、经口、肌内、皮下、鼻内或通过吸入向个体施用所述rAAV载体。在某些实施方案中，通过滴眼、眼内注射、结膜下注射、前房内注射、玻璃体内注射或视网膜下注射向个体施用所述rAAV载体。
在一些实施方案中，接受rAAV载体施用的个体曾经接受rAAV载体施用和/或被AAV感染。在一些实施方案中，接受rAAV载体施用的个体体内具有AAV预存免疫。在一些优选的实施方案中，接受rAAV载体施用的个体体内具有AAV中和抗体，并且处于中和滴度，从而基于野生型AAV的rAAV载体或其他已有的rAAV载体由于被抗体中和而无法到达和/或感染靶组织。在一些优选的实施方案中，接受rAAV载体施用的个体体内具有AAV中和抗体，并且处于中和滴度，或5倍中和滴度，或10倍中和滴度，或20倍中和滴度，或30倍中和滴度，或50倍中和滴度，从而基于野生型AAV的rAAV载体或其他已有的rAAV载体由于被抗体中和而无法到达和/或感染靶组织。
在本发明的另一些方面中，提供了用于产生本发明的rAAV载体的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含容纳有具有SEQ ID NO：4-6中任一序列的分离核酸的容器。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于产生rAAV的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含至少一个容纳有重组AAV载体的容器，其中所述重组AAV载体包含外源基因。
在另一些方面中，本发明涉及将基于AAV的载体用于递送基因、治疗、预防和研究目的的用途。在一些方面中，本发明涉及这样的AAV新血清型，其已经显示出独特的组织/细胞型嗜性和/或特异性，优选地，所述嗜性和/或特异性是视网膜嗜性和/或特异性，更优选地，所述嗜性是RPE和/或感光细胞嗜性和/或特异性。在一些实施方案中，基于所述AAV新血清型的以与腺病毒载体类似的水平在动物组织中实现稳定的体细胞基因转移(例如，高达几乎100％的体内组织转导，可能依赖于靶组织和载体剂量)并且不存在或基本不存在载体相关毒性。
在另一个方面中，本发明的rAAV载体可用在用于将转基因递送至个体的方法中。所述方法通过将本发明的rAAV施用于个体来进行，其中所述rAAV包含至少一种外源基因。在一些实施方案中，所述rAAV载体靶向个体的预定组织。
在一个实施方案中，所述rAAV载体包含具有选自SEQ ID NO：1-3任一项的氨基酸序列的AAV衣壳蛋白VP1。
在一些实施方案中，所述外源基因表达报告基因，所述报告基因任选地是报告酶(如β-半乳糖苷酶)、荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)或荧光蛋白(如GFP、DsRed等)。
在一个实施方案中，所述rAAV载体的靶组织是视网膜。在一些实施方案中，所述rAAV载体可转导RPE和/或感光细胞。
在一些实施方案中，所述rAAV以每个对象1010、1011、1012、1013、1014或1015个基因组拷贝的剂量施用。在一些实施方案中，所述rAAV以1010、1011、1012、1013或1014个基因组拷贝/千克体重的剂量施用。所述rAAV可以通过任何途径施用。例如，其在一些实施方案中可以静脉内施用，其在另一些实施方案中可以通过玻璃体内注射施用。
根据本发明的另一个方面，提供了用于产生本发明的rAAV载体的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个容纳有重rAAV载体的容器，至少一个容纳有rAAV包装组件的容器，以及用于构建和包装重组AAV的说明书。
rAAV载体包装组件可包括表达至少一种rep基因和/或至少一种cap基因的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞通过外源引入表达至少一种rep基因和/或至少一种cap基因。在一些实施方案中，所述宿主细胞通过已经被整合入内源表达***的外源基因表达至少一种rep基因和/或至少一种cap基因。在一些实施方案中，所述宿主细胞是HEK293T细胞。在另一些实施方案中，所述宿主细胞表达影响含有重组AAV载体的rAAV产生的至少一种辅助病毒基因产物。优选地，所述至少一种cap基因可编码本发明优选的衣壳蛋白。
在另一些实施方案中，rAAV包装组件包括辅助病毒，任选地其中所述辅助病毒是腺病毒或疱疹病毒。
rAAV载体及其中的组件可包括本文所述的任何元件。例如，在一些实施方案中，所述rAAV载体包含外源基因。
在本发明的一些方面中，提供了药物组合物，其包含：如上所述的具有任意前述经改造的VP1衣壳蛋白的rAAV载体；和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲液。
在本发明的另一些方面中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有具有任意前述经改造的VP1衣壳蛋白的rAAV载体的容器。在一些实施方案中，所述试剂盒的容器是注射器。
在本发明的另一些方面中，提供了如上所述的本发明的rAAV载体、药物组合物和/或试剂盒的用途，用于制备治疗疾病的药物。在一些实施方案中，所述疾病是眼部疾病。在一些实施方案中，所述疾病是视网膜相关疾病。在一些优选的实施方案中，所述疾病是IRD。在一些实施方案中，所述药物被制备为适于通过全身施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部施用、局部接触、腹膜内施用或病灶内施用。在一些优选的实施方案中，所述药物被制备为适于通过滴眼、眼内注射、结膜下注射、前房内注射、玻璃体内注射或视网膜下注射的方式施用。在一些实施方案中，所述药物用于治疗曾经接受过rAAV载体治疗和/或曾经天然感染过AAV的个体。在一些实施方案中，所述药物用于治疗体内具有AAV中和抗体的个体，所述AAV中和抗体达到中和滴度从而基于野生型AAV的rAAV载体或其他已有的rAAV载体由于被抗体中和而无法到达和/或感染靶组织。在一些优选的实施方案中，所述药物用于治疗体内具有AAV中和抗体的个体，所述AAV中和抗体达到中和滴度，或5倍中和滴度，或10倍中和滴度，或20倍中和滴度，或30倍中和滴度，或50倍中和滴度，从而基于野生型AAV的rAAV载体或其他已有的rAAV载体由于被抗体中和而无法到达和/或感染靶组织。
附图说明
图1所示为本发明的RC-C08,RC-C15和RC-C18三个血清型的制备及衣壳分析：A-C分别为三种血清型质粒图谱(Snapgene绘制)；D：三种血清型表达的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的分子量大小和组分比例，通过VP1抗体在Western Blot中检测。
图2所示为本发明的RC-C08、RC-C15和RC-C18血清型与现有血清型AAV2 WT、AAV2.7m8的产毒效率比较。图2A、2B分别是在贴壁的293T和悬浮293细胞中包装获得的5种血清型的病毒产量统计柱状图。
图3所示为本发明三种血清型与作为对照的现有技术已知两种血清型的体外生物活性比较(TU)。A-E所示分别为AAV2 WT、AAV2.7m8、RC-C08、RC-C15和RC-C18五种血清型携带外源基因(EGFP)以多个浓度梯度在培养的293T细胞中感染表达结果统计，图3F为综合分析比较五种血清型的VG/TU比值。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,****:p<0.0001,ns:无统计学显著性差异。
图4所示为RC-C08与AAV2,AAV2.7m8,AAV-DJ血清型的体外转导活性比较。A-H展示了在4种不同细胞中的GFP阳性细胞百分比和平均荧光强度的统计结果柱状图。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,****:p<0.0001,ns:无统计学显著性差异。
图5所示为RC-C08与AAV2.7m8,AAV-DJ血清型在小鼠眼睛中经IVT给药后的转导效率差异性比较。A、D分别为活体自发荧光和视网膜铺片的显微镜下所见的图片。B-C和E-F为两种检测中荧光面积和荧光强度统计柱状图。
图6所示为RC-C08，RC-C15，RC-C15三种新血清型以及AAV2和AAV2.7m8两种对照血清型在不同细胞系中的转导活性差异性验证。A-F展示了在3种不同细胞中的GFP阳性细胞百分比和平均荧光强度的统计结果柱状图。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,****:p<0.0001,ns:无统计学显著性差异。
图7所示为RC-C08血清型与现有血清型体内短期(2周)转导活性比较。A为活体荧光检查镜下所见眼底自发的荧光信号，B-D分别为三个血清型(低剂量组)感染后的总荧光面积，平均荧光强度和总荧光强度的统计柱状图。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,****:p<0.0001,ns:无统计学显著性差异。
图8所示为RC-C08与AAV2.7m8体内组织分布及长期活性验证的比较。A、D分别为活体自发荧光(5周)和冰冻切片荧光(6周)的显微镜下所见的图片。B-C和E-F为两种检测中相对荧光面积和总荧光强度统计柱状图。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,****:p<0.0001,ns:无统计学显著性差异。
图9所示为RC-C08及其变体耐受人源中和抗体的病毒活性比较。A-E所示分别为AAV2WT、AAV2.7m8、RC-C08、RC-C15和RC-C18五种血清型被多个浓度的中和抗体的抑制率曲线和IC50值，图9F为综合分析比较五种血清型的逃逸或耐受中和抗体的能力。
图10所示为RC-C08及其变体RC-C15两种血清型在小鼠眼组织内的转导效率比较。A和B分别为两种血清型感染一定时间后活体荧光检查镜下所见的图片，C和D分别为两种血清型感染后不同时间点的荧光面积或总荧光强度的统计分析柱状图。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,****:p<0.0001,ns:无统计学显著性差异。
发明详述
如本申请中所述，发明人长期研究rAAV载体作为基因药物用于治疗眼部疾病，并在此过程中令人惊奇地发现：在基于AAV2的rAAV载体衣壳蛋白中改造引入至少包含以下的氨基酸残基修饰：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F和S501A(残基位置编号以天然AAV2的VP1蛋白氨基酸序列编号为参照)将使得被改造的rAAV载体对视网膜组织的嗜性增强和/或组织特异性增强和/或转导效率大大增加。因此，在第一方面，本发明提供了改造基于AAV2的rAAV载体的方法，其中所述rAAV载体用于将外源基因递送至个体的局部组织(例如，眼部组织，例如，视网膜)并且包含外源基因序列和反向末端重复序列(ITR)，所述方法包括向所述rAAV载体的衣壳蛋白中引入以下氨基酸修饰：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F和S501A。在另一些实施方案中，所述改造方法基于本发明的另一方面，即在前述9个位点突变的基础上，进一步引入Y444F和Y730F修饰。在此外的另一些实施方案中，所述改造方法基于本发明的另一方面，即在前述9个位点突变的基础上，进一步在残基位点587(N)和588(R)之间***氨基酸序列LALGDVTRPA。在一些优选的实施方案中，前述改造引入氨基酸突变的方法，是通过改变AAV的cap基因的核酸序列使其编码纳入所需修饰的氨基酸序列而实现的。在一些优选的实施方案中，改变基因的核酸序列是通过本领域公知的一种或多种分子克隆手段实现的。
在一个方面，本发明提供了提高基于AAV2的rAAV载体在递送至眼部组织(例如，视网膜)后的转导效率的方法，所述方法包括用本发明第一个方面的改造方法改造rAAV载体。在一个优选的实施方案中，本发明提供了提高基于AAV2的rAAV载体在递送至视网膜色素上皮细胞后的转导效率的方法，所述方法包括用本发明第一个方面的改造方法改造rAAV载体。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了提高基于AAV2的rAAV载体在递送至视网膜感光细胞后的转导效率的方法，所述方法包括用本发明第一个方面的改造方法改造rAAV载体。
在一个方面，本发明提供了提高基于AAV2的rAAV载体在递送至眼部组织(例如，视网膜)后的感染比例的方法，所述方法包括用本发明第一个方面的改造方法改造rAAV载体。在一个优选的实施方案中，本发明提供了提高基于AAV2的rAAV载体在递送至视网膜色素上皮细胞后的感染比例的方法，所述方法包括用本发明第一个方面的改造方法改造rAAV载体。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了提高基于AAV2的rAAV载体在递送至视网膜感光细胞后的感染比例的方法，所述方法包括用本发明第一个方面的改造方法改造rAAV载体。
在一个方面，本发明提供了提高基于AAV2的rAAV载体在递送至眼部组织(例如，视网膜)后的外源基因表达量的方法，所述方法包括用本发明第一个方面的改造方法改造rAAV载体。在一个优选的实施方案中，本发明提供了提高基于AAV2的rAAV载体在递送至视网膜色素上皮细胞后的外源基因表达量的方法，所述方法包括用本发明第一个方面的改造方法改造rAAV载体。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了提高基于AAV2的rAAV载体在递送至视网膜感光细胞后的外源基因表达量的方法，所述方法包括用本发明第一个方面的改造方法改造rAAV载体。
在一个方面，本发明提供了降低基于AAV2的rAAV载体的免疫原性的方法，所述方法包括用本发明第一个方面的改造方法改造rAAV载体。在一个方面，本发明提供了提升基于AAV2的rAAV载体的耐受或抵抗个体中预存免疫(例如，但不限于，中和抗体)的方法，所述方法包括用本发明第一个方面的改造方法改造rAAV载体。
在一个方面，本发明提供了通过本发明的方法改造的基于AAV2的rAAV载体，其中所述rAAV载体用于将外源基因递送至个体的局部组织(例如，眼部组织，例如，视网膜)并且包含外源基因序列和反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，经改造的rAAV载体具有改造的衣壳蛋白序列。在一些实施方案中，经改造的rAAV载体的衣壳蛋白相比于野生型AAV2的衣壳蛋白包含以下氨基酸序列修饰：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F和S501A。在一些实施方案中，经改造的rAAV载体的衣壳蛋白相比于野生型AAV2的衣壳蛋白包含以下氨基酸序列修饰：Y444F,Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F,S501A和Y730F。在一些实施方案中，经改造的rAAV载体的衣壳蛋白相比于野生型AAV2的衣壳蛋白包含以下氨基酸序列修饰：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F和S501A，并且在残基位点587(N)和588(R)之间***氨基酸序列LALGDVTRPA。在一些实施方案中，经改造的rAAV载体的衣壳蛋白VP1包含如SEQ ID NO:1-3任一项所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述被改造的rAAV载体(i)对视网膜组织的嗜性提高；(ii)对视网膜组织的特异性提高；(iii)在视网膜组织细胞中的感染效率提高；(iv)在视网膜组织细胞中的外源基因表达量增加；和/或(v)免疫原性降低。在一些优选的实施方案中，所述被改造的rAAV载体的免疫原性降低，从而能够耐受或抵抗更高的针对AAV的预存免疫。在一些优选的实施方案中，所述更高是5倍更高、10倍更高、20倍更高、30倍更高或50倍更高。在一些实施方案中，所述预存免疫是中和抗体。在一些实施方案中，所述预存免疫是T细胞免疫。
在一些实施方案中，本发明提供了一种cap基因，其编码如SEQ ID NO:1-3任一项所示的氨基酸序列。在一些进一步的实施方案中，本发明的cap基因具有如SEQ ID NO:4-6任一项所示的核酸序列。
在一个方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含本发明的前述任一种或多种rAAV载体，并任选地包含一种或多种药学上可接受的辅料。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物可通过全身施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部施用、局部接触、腹膜内施用或病灶内施用的方式来向个体给药。在一些实施方案中，所述组合物可通过滴眼、眼内注射、结膜下注射、前房内注射、玻璃体内注射或视网膜下注射的方式来向个体给药。
在一个方面，本发明提供了前述任一种或多种rAAV载体或组合物在制备药物中的用途。在一些实施方案中，所述药物用于治疗眼部疾病。在一些实施方案中，所述药物可通过全身施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部施用、局部接触、腹膜内施用或病灶内施用的方式来向个体给药。在一些实施方案中，所述药物可通过滴眼、眼内注射、结膜下注射、前房内注射、玻璃体内注射或视网膜下注射的方式来向个体给药。
在一个方面，本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括向患有疾病的个体施用通过本发明的方法改造的rAAV载体，或本发明的rAAV载体。在一些优选的实施方案中，所述疾病是眼部疾病。在一些更优选的实施方案中，所述疾病是视网膜病变引起的疾病。在一些更优选的实施方案中，所述疾病是IRD。
I.现有技术
中国专利公告号CN107012171B涉及一种由已知血清型AAV2改造的变体，被命名为AAV2.7m8。其将AAV2衣壳蛋白VP1的第588氨基酸位置替换为11个氨基酸的视网膜组织靶向肽，改变了AAV2病毒衣壳结合HSPG受体的传统能力。所述专利通过引用方式以其整体并入本文，并且本文特别列出AAV2.7m8的衣壳蛋白序列如SEQ ID NO:7所示。AAV2.7m8代表了目前现有技术当中对于rAAV载体向眼部尤其是视网膜进行递送以高效表达外源基因的尝试。本文在此仅出于研究目的引用该变体，如无特别说明，将其与野生型AAV2共同作为现有技术对照，以验证本发明的方法和载体是否相对于现有技术获得了显著改进。除本节外，本文全文中对其的引用也将通过例如“AAV2.7m8”、“CN107012171B”的标注予以说明。
II.定义
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。
术语“编码”指核酸中的特定的核苷酸序列的内在特性，其作为用于在生物学过程中合成具有确定核苷酸序列(例如rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列和源自其的生物学特性的其他聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物***中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA的转录模板)都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，指包含氨基酸残基的聚合物序列。如无特别说明，本文中均使用遵照IUPAC-IUB生物化学命名联合委员会(Joint Commissionon Biochemical Nomenclature(JCBN))定义的氨基酸的单字母和三字母代码。单字母X是指二十种氨基酸中的任一种。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由一种以上核苷酸序列编码。氨基酸序列中的突变可如下命名：亲本氨基酸的单字母代码，接着是位置编号，之后是变体氨基酸的单字母代码。例如，将第464位的谷氨酰胺(Q)突变为缬氨酸(V)表示为“Q464V”。
“同源”是指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的百分比同一性。当涉及核酸或其片段时，术语“基本上同源”表示当与另一核酸(或其互补链)进行带有适当的核苷酸***或缺失的最佳比对时，在约90至100％的比对序列中存在核苷酸序列同一性。当涉及多肽或其片段时，术语“基本上同源”表示当与另一多肽进行带有适当的空位、***或缺失的最佳比对时，在约90至100％的比对序列中存在核苷酸序列同一性。术语“高度保守”意指至少80％的同一性，优选至少90％的同一性，并且更优选超过97％的同一性。在一些情况下，高度保守可指100％的同一性。同一性是本领域技术人员通过例如使用本领域技术人员已知的算法和计算机程序容易确定的。
如本文所述，使用多种公共或商业可得的多序列比对程序(例如，可通过因特网上的Web服务器访问的“Clustal W”)中的任一种来进行核酸或多肽序列之间的比对。或者，也可以使用Vector NTI实用程序。本领域中还已知有许多可用于测量核苷酸序列同一性的算法，包括上述程序中所包含的算法。作为另一个实例，可以使用BLASTN来比较多核苷酸序列，BLASTN提供了对查询序列和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。类似的程序可用于比较氨基酸序列，例如“Clustal X”程序、BLASTP。通常，以默认设置使用这些程序中的任一个，但是本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。或者，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，其提供至少如参照算法和程序所提供的同一性或比对水平。比对可用于识别两种蛋白质或肽之间的对应氨基酸。“对应氨基酸”是蛋白质或肽序列中已与另一蛋白质或肽序列的氨基酸比对的氨基酸。对应氨基酸可以相同或不同。作为不同氨基酸的对应氨基酸可称为变体氨基酸。
或者，对于核酸，可以通过以下过程来确定同源性：在同源区域之间形成稳定双链体的条件下使多核苷酸杂交，然后用单链特异性核酸酶消化并对经消化的片段进行大小测定。基本上同源的DNA序列可以在例如严格条件(如针对该特定体系所确定的条件)下的Southern杂交实验中鉴定。确定适当的杂交条件在本领域的技术范围内。
额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
如本文所使用的术语“分离的”是指人工获得或产生的。如本文关于核酸所使用的术语“分离的”一般是指：(i)通过例如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)在体外扩增的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)通过切割和凝胶分离纯化的；或者(iv)通过例如化学合成法合成的。分离的核酸是可以容易地通过本领域公知的重组DNA技术操作的核酸。因此，载体中所包含的其中5’和3’限制性位点已知或者已经公开了聚合酶链式反应(PCR)引物序列的核苷酸序列被认为是分离的，但是在其天然宿主中以其天然状态存在的核酸序列并不是。分离的核酸可以是基本上纯化的，但不需要如此。例如，在克隆或表达载体中分离的核酸不是纯的，因为其可仅包含微小百分比的其所存留的细胞中的物质。然而，这样的核酸也是分离的，如该术语在本文中所使用的那样，因为其可通过本领域普通技术人员已知的标准技术容易地操作。如本文关于蛋白质或肽所使用的术语“分离的”通常是指人工获得或产生的蛋白质或肽(例如，通过化学合成，通过重组DNA技术等)。在一些实施方案中，分离了本发明的蛋白质和核酸。
“宿主细胞”是指任何容纳有或能够容纳目的物质的细胞。宿主细胞通常是哺乳动物细胞。宿主细胞可以用作AAV辅助构建体、AAV小基因质粒、附属功能载体或与重组AAV产生相关的其他转移DNA的接受者。该术语包括已经被转染的原始细胞的后代。因此，本文所使用的“宿主细胞”可以指已经用外源DNA序列转染过的细胞。应当理解，由于自然、偶然或故意突变，单个亲代细胞的后代在形态方面或者在基因组或总DNA互补物方面可能不一定与原始亲本完全相同。
在一些方面中，本发明提供了经转染的宿主细胞。术语“转染”或“转化”或“转导”指通过其来将外源核酸转移入或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代个体细胞及其后代。“感染”是一种特定形式的“转染”或“转化”或“转导”，其中外源核酸借助病原体(例如病毒)转移入或引入宿主细胞。“感染”的细胞是已用病原体例如病毒(例如慢病毒)转染、转化或转导的细胞。
涉及病毒效价使用的术语“转导单位(TU)”意指如功能测定法中测得的导致功能性转基因产物产生的感染性重组AAV载体颗粒的数目。
术语“载体基因组(vg)”可指一个或多个多核苷酸，其包含载体(例如病毒载体)的一组多核苷酸序列。载体基因组可衣壳化于病毒颗粒中。取决于特定的病毒载体，载体基因组可包含单链DNA、双链DNA或单链RNA或双链RNA。载体基因组可包含与特定病毒载体相关联的内源序列和/或通过重组技术***特定病毒载体的任何异源序列。例如，重组AAV载体基因组可包含至少一个ITR序列，其位于启动子、填充片段、外源基因和多聚腺苷酸化序列的侧翼。完全的载体基因组可包含载体的多核苷酸序列的完全组。在一些实施方案中，病毒载体的感染效力可以通过VG/TU来衡量。适于测量的方法是本领域已知的。
术语“感染复数(MOI)”含义是感染发生时病毒与细胞数量的比值。虽然该比值可能因病毒和细胞种类的不同、甚至是培养条件等因素的影响而不同，但本领域技术人员可以容易地通过公知和常规的方法测定某种病毒对某种细胞的MOI，以达到实验目的。
如本文所使用的术语“细胞系”是指在体外能够持续或延长生长和***的细胞群。通常，细胞系是来源于单个祖细胞的克隆群体。在本领域中还已知，在这种克隆群体的储存或转移期间，核型可以发生自发或诱导的变化。因此，来源于所提及的细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同，并且所提及的细胞系包括这些变体。
还可以用向AAV提供辅助功能物的载体(例如，辅助载体)来转染细胞。提供辅助功能物的载体可以提供腺病毒功能物，包括例如E1a、E1b、E2a、E4ORF6。提供这些功能物的腺病毒基因的序列可以从任何已知的腺病毒血清型获得，例如血清型2、3、4、7、12和40，并且还包括本领域已知的任何目前已鉴定的人类型。因此，在一些实施方案中，所述方法包括用表达AAV复制、AAV基因转录和/或AAV包装所需的一个或更多个基因的载体来转染细胞。
如本文所使用的，当提及基因工程或分子克隆技术时，术语“载体”指可以向目的细胞转移基因序列的任何核酸分子和/或核酸/蛋白质复合体，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人造染色体、病毒、病毒体等，并且优选地当其与宿主细胞内适当的控制元件或生物活性分子相互作用时能够复制。因此，该术语包括克隆和表达载剂以及病毒载体。在一些优选的实施方案中，载体当中待转移的基因序列(一般称为，外源基因序列)位于启动子的转录控制下，并在宿主细胞中合适的时机和环境下被转录、并最终表达得到蛋白。术语“有效定位”，“控制下”或“转录控制下”是指启动子位于与核酸相关的正确位置和取向上以控制RNA聚合酶起始和基因的表达。
术语“有效连接”意指指定的各组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系。
术语“调控序列”或“表达控制序列”是指这样的核酸序列，其诱导、抑制或以其它方式控制与之有效连接的编码核酸序列的蛋白质转录。调控序列可以是例如起始序列、增强子序列、内含子序列和启动子序列等。
术语“表达载体或构建体”是指含有其中部分或全部核酸编码序列能够被转录的核酸的任何类型的遗传构建体。在一些实施方案中，表达包括核酸的转录，例如，由经转录的基因产生生物活性多肽产物或抑制性RNA(例如，shRNA、miRNA、miRNA抑制物)。
III.rAAV载体
如本文中所用，术语“腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)”因在腺病毒制品中发现而得名。AAV是微小病毒科(Parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA。AAV是复制缺陷型非包膜病毒，其在细胞中的复制一般依赖于第二种病毒如腺病毒、HPV或疱疹病毒的存在，或者辅助因素提供辅助功能蛋白。目前没有发现AAV在人类中引起疾病，并因而，AAV仅在人体内诱导非常轻微的免疫应答。AAV可以感染***细胞，也可感染非***细胞。基于血清型2的原型AAV载体为无毒且稳定的基因转移提供了概念证明，但是在许多主要靶组织中表现出的基因转移效率不足。在一些方面中，本发明试图通过提供具有独特组织靶向能力的新型AAV来克服这个缺点，以用于基因治疗和研究应用。
尽管如上所述，目前没有发现AAV在人类中引起疾病，并因而，AAV仅在人体内诱导非常轻微的免疫应答，但曾经被AAV感染或曾接受过rAAV基因治疗的个体，仍然可能在其体内留存有针对AAV的特异性免疫应答，即预存免疫。所述预存免疫可能是B细胞免疫(中和抗体)，也可能是T细胞免疫。并且所述预存免疫可能是交叉性的，即由第一种AAV血清型引发的预存免疫也可能针对在后的第二种AAV。预存免疫的存在仍然是病毒载体作为基因治疗工具的一个明显障碍。
最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的“反向末端重复序列”(inverted terminal repeat,ITR)，呈回文-发卡结构。基因组中有两个大开放阅读框(ORF)，分别编码Rep和Cap基因。
ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site，RBS)和末端解链位点trs(terminal resolution site)，能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用。在本发明的实施方案中，可以使用本领域已知的任何血清型的ITR序列。在一些优选的实施方案中，本发明使用来自AAV血清型2的ITR序列。
AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，Rep基因区和Cap基因区。
Rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs和GAGY重复基序特异性结合，启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序和/或GAGY重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，启动分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40具有ATP依赖的DNA解旋酶活性，但没有结合DNA的功能。
Cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。实例性的AAV2 VP1的序列可参见NCBI Reference Sequence YP_680426，即本申请SEQ ID NO:8，其他血清型的VP1蛋白野生型序列，或任何血清型的野生型VP2、VP3蛋白序列均可以本领域技术人员已知的方式从生物信息学数据库(例如NCBI Genbank等)之中容易地查到。
如本文中所用，术语“重组AAV(rAAV)载体”是人们随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，将野生型AAV病毒进行重组改造得到的一种高效的外源基因转移工具，即rAAV载体。rAAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带待转运的外源基因表达框。AAV病毒包装需要的Rep和Cap蛋白不纳入rAAV载体基因组，而通过其他外源质粒提供，由此降低了Rep和Cap基因包装入rAAV载体可能带来的危害。
本发明的改进rAAV载体的方法，其特征在于，在野生型AAV2序列基础上，进行氨基酸残基的修饰(例如，但不限于，取代、缺失和/或添加)，使得改造后的AAV2载体与靶细胞表面一个或多个受体的亲和力变化。因而在一个优选的实施方案中，所述方法是改造AAV2衣壳蛋白的方法。在一个更优选的实施方案中，所述方法是改造AAV2衣壳蛋白VP1，使其具备以下氨基酸突变位点：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F和S501A。在另一个更优选的实施方案中，所述方法是改造AAV2衣壳蛋白VP1，使其具备以下氨基酸突变位点：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y444F,Y500F,S501A和Y730F。使其具备以下氨基酸突变位点：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F和S501A，同时在587N和588R之间***氨基酸序列LALGDVTRPA。
本发明的AAV衣壳蛋白包括具有如SEQ ID NO:1-3中任一所示氨基酸序列的任何蛋白质以及与其基本上同源的任何蛋白质。在一些实施方案中，本发明提供了这样的分离衣壳蛋白，其与具有如SEQ ID NO:1-3中任一所示序列的蛋白质基本上同源，但是不具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(即，野生型AAV2的衣壳蛋白VP1)。
编码AAV衣壳蛋白的本发明的分离核酸分子包括具有如SEQ ID NO:4-6中任一所示序列的任何核酸分以及具有与其基本上同源之序列的任何核酸分子。在一些优选的实施方案中，所述核酸分子是cap基因。在一些实施方案中，本发明提供了这样的分离核酸，其与具有如SEQ ID NO:4-6中任一所示序列的核酸分子基本上同源，但是不编码具有如SEQ IDNO:8所示氨基酸序列的蛋白质(即，野生型AAV2的衣壳蛋白VP1)。
编码AAV衣壳序列的分离核酸分子的片段可用于构建编码期望衣壳序列的核酸。片段可以具有任意适当的长度。在一些实施方案中，编码AAV衣壳序列的分离核酸的片段(即，一部分)可用于构建编码期望衣壳蛋白序列的核酸。片段可以具有任意适当的长度(例如，至少6个、至少9个、至少18个、至少36个、至少72个、至少144个、至少288个、至少576个、至少1152个、至少1728个或更多个核苷酸的长度)。通过将包含编码变体氨基酸之区域的核酸序列的片段并入编码已知AAV血清型的核酸序列中，重组cap序列可以被构造为编码具有所需氨基酸修饰的变体衣壳蛋白。所述片段可以通过任何合适的方法并入，包括使用，例如，定点诱变。
在一些实施方案中，衣壳蛋白是由AAV cap基因编码的结构蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三种衣壳蛋白：病毒体蛋白1至3(VP1、VP2和VP3)，所有的这些蛋白可以由单一cap基因表达。因此，在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3蛋白共享共同核心序列。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3的分子量分别为约87kDa、约72kDa和约62kDa。在一些实施方案中，翻译后，衣壳蛋白在病毒基因组周围形成球形60聚体(mer)蛋白质壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组，递送基因组和与宿主相互作用。在一些方面中，衣壳蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。在一些实施方案中，VP1衣壳蛋白对于经包装的rAAV载体的组织嗜性是关键的。在一些实施方案中，AAV的组织嗜性通过衣壳蛋白中发生的突变而增强或改变。
在一些方面中，本发明描述了野生型AAV血清型的变体。在一些实施方案中，所述变体具有改变的组织嗜性。在一些实施方案中，本文所述的AAV变体包含在cap基因内的氨基酸变化，例如但不限于，取代、缺失(即删除)、添加(即***)。在一些实施方案中，氨基酸变化仅发生在VP1衣壳蛋白中；在一些实施方案中，氨基酸变化仅发生在VP1和VP2衣壳蛋白中；在一些实施方案中，氨基酸变化仅发生在VP1和VP3衣壳蛋白中；在一些实施方案中，氨基酸变化发生在全部3种衣壳蛋白中。
在一些实施方案中，本发明的AAV变体可用于将基因治疗递送至眼组织。因此，在一些实施方案中，本文所述的AAV变体可用于治疗眼部疾病。眼部疾病可以是遗传起源的，其通过遗传或体细胞突变获得。在一些优选的实施方案中，本发明的rAAV载体可用于将基因治疗递送至人视网膜组织(例如，RPE和/或感光细胞)细胞，从而本发明的rAAV载体可用于治疗视网膜病变。
在一些方面中，本发明提供了分离的rAAV。获得rAAV的方法是本领域公知的。现有技术中对rAAV载体具有相对成熟的包装***，这便于规模化生产rAAV载体。
本领域已知许多方法用于包装生产rAAV载体，目前常用的rAAV载体包装***主要包括三质粒共转染***、腺病毒作为辅助病毒的***、单纯疱疹病毒(Herpes simplexvirus type 1，HSV1)作为辅助病毒的包装***、以及基于杆状病毒的包装***。每种包装***都各具特点，本领域技术人员可以根据需要做出合适的选择。用于产生rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物都需要：1)合适的宿主细胞，包括例如源自人的细胞系如HEK-293T细胞，或源自昆虫的细胞系(对于杆状病毒生产***的情况而言)；2)合适的辅助病毒功能，其由野生型或突变体腺病毒(如温度敏感的腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；3)AAV rep和cap基因和基因产物；4)外源基因，其侧翼有至少一个AAV ITR序列，并优选地处于有效连接的启动子的驱动之下；和5)合适的培养体系，以支持rAAV生产。本领域中已知的合适培养基可用于产生rAAV载体。
“外源基因”意指源自与其比较的或引入或整合入的核酸/载体/宿主细胞等的其余基因在基因型上截然不同的核酸序列片段。例如，通过基因工程技术引入不同细胞类型的多核苷酸是外源基因，其编码并表达外源多肽)。类似地，并入病毒载体的细胞序列(例如基因或其部分)是相对于所述载体的外源基因序列。本领域技术人员能够理解，在大多数情况下，引入外源基因是基于被引入处实质上缺乏该基因和/或其功能，因而在所需的情况下将其引入，并带来该基因的数量和/或功能的实质性改变(例如，显著增加)。在本文中，如无特别说明，如按照上下文所理解的，术语“外源基因”与“目的基因(gene of interest，GOI)”表示相同含义并可以互换地使用。在一个优选的实施方案中，本发明的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白基因。其作为一种本领域常用的报告基因，在真核细胞中表达产生绿色荧光蛋白，后者在合适波长的激发下发出绿色荧光，从而使得实验人员以可检测的方式获取其表达的面积和/或数量，从而直接地评估例如细胞群体的转导效率、感染效率、表达效率，单个细胞的转导结果、蛋白表达位置，等等。检测绿色荧光蛋白的方法是本领域公知的，所需试剂/仪器也是本领域容易获得(例如，商购)的。
要在宿主细胞中培养以将rAAV载体包装在AAV衣壳中的组件可以反式地提供给宿主细胞。或者，任何一种或更多种所需组件(例如，重组AAV载体基因组、rep序列、cap序列和/或辅助功能物)可以通过稳定的宿主细胞提供，所述稳定的宿主细胞使用本领域技术人员已知的方法而被改造成包含一种或更多种所需组件。例如，可以产生这样的稳定宿主细胞，其来源于293细胞(其包含在组成型启动子控制下的E1辅助功能物)，但是包含在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。另外的稳定宿主细胞也可以由本领域技术人员产生。
三质粒转染包装***因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的rAAV载体包装***，也是目前国际上主流的生产***。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染***在rAAV载体大规模制备中的应用。
IV.治疗方法
术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。用于本文时，“预防”包括对疾病或特定疾病的症状的发生或发展的阻止或抑制。
可以根据本领域已知的任何合适的方法将rAAV以组合物递送至对象。可以将rAAV(优选悬浮于生理相容的载体中(例如，以组合物))施用于对象，例如，宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类(例如，猕猴)。
考虑到rAAV的应用目的，本领域技术人员可以容易地选择合适的药用辅料。例如，一种合适的辅料包括盐水，其可以用多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)进行配制。其他示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。辅料的选择不是本发明的限制。
任选地，本发明的组合物还可以包含其他常规药用成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
可药用辅料的制剂是本领域技术人员公知的，用于在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适给药和治疗方案的开发也是如此。
以足够的量施用rAAV以转染期望组织的细胞，并提供足够的基因转移和表达水平而没有过度的不良作用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于。
实现特定“治疗效果”所需的rAAV病毒体的剂量(例如，基因组拷贝/每千克体重(GC/kg)的剂量单位)将根据多个因素而变化，包括但不限于：rAAV病毒体施用途径、达到治疗效果所需的基因或RNA表达水平、被治疗的特定疾病或病症以及基因或RNA产物的稳定性。本领域技术人员可以基于上述因素以及本领域公知的其他因素容易地确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的rAAV病毒体剂量范围。
rAAV的有效量是足以靶向感染动物、靶向期望组织的量。在一些实施方案中，rAAV的有效量是足以产生稳定的体细胞转基因动物模型的量。有效量将主要取决于例如对象的物种、年龄、重量、健康和待靶向的组织的因素，因此可以在动物和组织之间变化。例如，rAAV的有效量一般是包含约109至1016个基因组拷贝的约1ml至约100ml的溶液。在一些实施方案中，以每个对象1010、1011、1012、1013、1014或1015个基因组拷贝的剂量施用rAAV。在一些实施方案中，以每kg 1010、1011、1012、1013或1014个基因组拷贝的剂量施用rAAV。在一些情况下，约1011至1012个rAAV基因组拷贝的剂量是合适的。
通常，这些制剂可以包含至少约0.1％或更多的活性化合物，尽管活性成分的百分比当然可以变化并且可以方便地为总制剂的重量或体积的约1％或2％至约70％或80％或更高。自然地，每种治疗上有用的组合物中的活性化合物的量可以以这样的方式准备，以使得在任何给定单位剂量的化合物中将获得合适的剂量。制备这样的药物制剂的技术人员将考虑例如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑因素，因此，多种剂量和治疗方案可能是期望的。
在一些实施方案中，期望经眼内递送本文公开的经适当配制的药物组合物中的基于rAAV的治疗性构建体。在一些实施方案中，一种优选的施用方式是通过玻璃体内注射。
适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。分散体也可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备。在普通储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。在许多情况下，所述形式为无菌的并且流动性达到容易注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须被保藏以免受微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。预防微生物的作用可通过多种抗菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。对于施用可注射水溶液，例如，如果需要的话，溶液可以适当地进行缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，可使用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。
无菌可注射溶液通过如下制备：将所需量的活性rAAV与本文列举的多种其他成分(根据需要)并入合适的溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过将多种无菌活性成分并入无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂包含基础分散介质和来自上述列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分与任何另外的所期望成分的粉末。
本文公开的rAAV组合物也可以被配制成中性或盐形式。可药用盐包括与无机酸(例如，盐酸或磷酸)或者如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等这样的有机酸形成的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐也可以来源于无机碱，例如，钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物，以及例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。配制后，将以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效的量施用溶液。所述制剂易于以多种剂型(例如可注射溶液、药物释放胶囊等)施用。
制剂对于引入本文公开的核酸或rAAV构建体的可药用制剂可以优选地是，例如，脂质体。
或者，可以使用rAAV的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定和可重复的方式捕获物质。为了避免由于细胞内聚合物过载引起的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计这样的超微颗粒(尺寸约0.1μm)。预期使用满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒。
V.组合物和试剂盒
在优选的实施方案中，本文所述的rAAV和药用辅料以组合物的形式存在。在优选的实施方案中，所述组合物是药物组合物。在优选的实施方案中，所述药物组合物包含
所述组合物或药物组合物可被组装成药物或诊断或研究试剂盒以促进其在治疗、诊断或研究应用中的使用。试剂盒可以包含容纳有本发明的组分的一个或更多个容器和使用说明书。具体地，这样的试剂盒可以包含本文所述的一种或更多种药剂以及描述这些药剂的预期应用和适当用途的说明书。在某些实施方案中，试剂盒中的药剂可以是适用于特定应用和适用于药剂施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可以包含适当浓度或量的组分以用于进行多种实验。
在本发明的另一些方面中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有具有任意前述经本发明的方法改造的重组AAV载体，或本发明的重组AAV载体，或本发明的药物组合物，及其容器。在一些实施方案中，所述试剂盒的容器是注射器。
VI.制药用途
在本发明的另一些方面中，提供了如上所述的本发明的重组AAV、药物组合物和/或试剂盒的用途，用于制备治疗疾病的药物。在一些优选的技术方案中，所述疾病是眼部疾病，例如视网膜病。在一些更优选的技术方案中，所述疾病是IRD。在一些实施方案中，所述药物被制备为适于通过全身施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部施用、局部接触、腹膜内施用或病灶内施用。在一些优选的实施方案中，所述药物被制备为适于通过滴眼、眼内注射、结膜下注射、前房内注射、玻璃体内注射或视网膜下注射的方式施用。
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，但仅旨在帮助本领域技术人员理解本发明，而不构成对本发明实施方案的任何限制。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。虽然已作出详细标注，但实施例中未详尽记载具体条件的实验方法，系按照本领域公知的常规技术，或按照试剂/试剂盒生产厂商所提供的说明书进行操作。
如无特别说明，以下实施例中的“野生型AAV2”、“基于野生型AAV2的rAAV载体”、“AAV2”、“AAV2 WT”表示相同的含义并可互换地使用，表示基于天然AAV2血清型重组产生的rAAV载体，其具有与野生型AAV2相同氨基酸序列的、未经任何人工方法改造的衣壳蛋白。
实施例1：RC-C08，RC-C15，RC-C18三种血清型的质粒构建和病毒包装及衣壳分子量的检测
实验过程：
1)Cap基因的序列设计和获取：经过发明人长期对AAV2衣壳蛋白VP1序列和空间结构的研究，发现对其特定区域进行定向合理设计，从而改变与不同受体结合的基序，可以调节衣壳蛋白与不同受体的亲和力。而根据发明人的检索和前期实验，发现在眼部组织尤其是视网膜组织中，与AAV相互作用并辅助其进入细胞的受体具有与其他组织不同的表达谱，因而前述对衣壳蛋白受体亲和力的调节可能有助于优化病毒颗粒在眼部组织尤其是视网膜组织当中的组织嗜性和/或特异性，进而优化外源基因的转导效率和表达效率。因而，在上述发现的基础上，发明人设计了新的血清型RC-C08、RC-C15和RC-C18。
RC-C08血清型的衣壳蛋白VP1的序列如SEQ ID NO:1所示，包含9个突变位点Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F和S501A，相应cap基因的序列如SEQID NO:4所示。RC-C15血清型的衣壳蛋白VP1在RC-C08的基础上再增加了Y444F和Y730F两个突变位点，而RC-C18血清型的衣壳蛋白VP1在RC-C08的基础上还在587N和588R之间***氨基酸序列LALGDVTRPA。RC-C15/C18的衣壳蛋白VP1的序列分别如SEQ ID NO:2和3所示，相应cap基因的序列分别如SEQ ID NO:5和6所示。
为获取上述设计的病毒，委托上海朗晶生物科技有限公司对RC-C08/C15/C18血清型的Cap基因分别进行了基因合成，同时增加上下游克隆序列，T-A克隆到pUC57载体中，作为后续扩增模板。所得载体分别命名为pUC-RC-C08/C15/C18 serotype Cap。
使用如下表1所示PCR反应体系扩增目的基因片段用于后续克隆步骤：
表1
其中正向引物序列为：5’-gacgtcagacgcggaagcttcgatc-3’，反向引物序列为：5’-gctgtttaaacgcccgggctgtag-3’。
PCR扩增程序参见表2：
表2
2)用1％Agarose gel(Genescript)进行电泳，用相应的DNA maker(Takara)作为对照，验证PCR产物是否正确，割取在预期的约2.2K bp位置处的凝胶条带，使用QIAquickGel Extraction Kit(QIAGEN)试剂盒，参照说明书操作回收剩下的PCR产物，用Nano-300测定产物浓度，得到其浓度为86ng/μl。
3)按如下表3所示反应体系将pRC载体进行双酶切(37℃酶切2h)：
表3
4)用1％琼脂糖进行电泳，用相应的DNA maker作为对照，验证酶切产物是否正确，割取在预期的约2.2K bp位置处的凝胶条带，参照QIAquick Gel Extraction Kit说明书回收剩下的PCR产物，用Nano-300测定产物浓度，浓度为20ng/μl。
5)按如下表4所示反应体系将上述纯化产物进行连接(50℃连接1h)：
表4
6)参照Stbl3 Chemically Competent Cell(唯地)说明书，将连接产物转化至Stbl3感受态细胞。
7)挑取LB(Kana)平板上的单克隆到事先加有200μl LB(Kana)培养基的无菌1.5mL管中，37℃，250rpm，培养3h后，按如下表5所示反应体系进行Colony PCR筛选阳性克隆：
表5
Colony PCR程序如表6所示：
表6
8)琼脂糖凝胶电泳鉴定
菌液PCR验证三种重组克隆(每个克隆挑选5个单菌落)，所有菌落验证的结果均是阳性
9)选取其中菌检阳性克隆(#1#2#3)进行测序。
10)测序结果经比对正确后，使用TIANGEN EndoFree Maxi Plasmid Kit(天根DP117)试剂盒，按照说明书进行质粒提取。
11)抽提结束后根据如下表7所示反应体系，利用两个BamHI位点对质粒进行酶切鉴定(37℃酶切1h)：
表7
测序结果表明本发明的RC-C08/RC-C15/RC-C18血清型的Cap基因序列分别成功构建到了AAV2的pRC载体上，得到命名为pRC-C08、pRC-C15和pRC-C18的三种血清型质粒(Snapgene绘制的质粒图谱参见图1A、图1B和图1C)。
随后，发明人将新构建的上述三种血清型质粒进行病毒包装，使用VP1的特异性抗体(可以检测传统意义上的AAV2衣壳的三个蛋白，即VP1、VP2和VP3)在蛋白质免疫印迹(变性凝胶电泳)中检测了上述5种血清型的衣壳蛋白的表达大小和组分的比例。同时，本检测中采用已经包装的野生型AAV2和AAV2.7m8病毒作为实验对照组(后续实验同样采用此两者或其中之一作为对照组，详见后文)。检测结果如附图1D所示，可以看到，对于RC-C08、RC-C15和RC-C18这三种衣壳蛋白经改造的血清型，其衣壳的分子量大小和三种组分蛋白的比例(VP1：VP2:VP3)，与现有的血清型(野生型AAV2和AAV2 7m8)相比，差异不显著。
实施例2：RC-C08、RC-C15和RC-C18与现有血清型产毒效率的比较
病毒的包装方法(贴壁细胞)：
第一步进行细胞传代，当10cm培养皿中HEK-293T细胞汇合度达到90％后(悬浮293细胞密度达到5E6/ml方可进行质粒转染包装)，按照1：3进行传代，培养24h后细胞汇合度达到80％，可进行质粒转染；第二步为配制转染体系，对于每个10cm培养皿，按照以下体系进行转染混合物配制：减血清培养基Opti-MEM(Gibco)500μl，HLP质粒(Genescript合成)15μg，RC质粒7.5μg，GOI质粒7.5μg，PEIpro(Polyplus)22.5μl；第三步转染流程：将转染混合物逐滴加入10cm培养皿各个不同区域，轻轻十字摇匀；第四步包装培养：将转染后细胞转移至二氧化碳培养箱，37度培养72h；最后一步收毒：转染后72h，用细胞上清将细胞吹起，离心收集细胞沉淀；加入裂解液37度摇床裂解1h，水平转子4000rpm离心10min收集上清，0.45μm针式过滤器过滤之后按10μl体积分装，进行病毒出毒检测。
悬浮293F细胞包装AAV的方法：1.293F悬浮细胞培养2-4天后，取样计数细胞的密度和活率。当细胞密度大于5×106cells/ml，细胞活率大于90％，则进行稀释传代处理，用37℃水浴锅里预热好的新鲜DynamisTM Medium(Gibco)培养基稀释处理细胞，保持细胞密度在N×105cells/ml(N范围5-9)。放入37℃，5％CO2，120rpm恒温摇床中培养；用于转染的细胞要在复苏后至少4代后，且处于对数生长期，活率在90％以上且密度大概为2×106cells/mL。转染当天，取样计数细胞密度和活率。用37℃水浴锅里预热好的新鲜DynamisTM Medium培养基，转染液的配制(30mL体系)：(1)把60μg质粒(1×106cells/μg)按比例(辅助质粒：衣壳质粒：目的基因质粒＝2：1：0.3)加入1.5mL DynamisTM Medium培养基中(2)质粒稀释液中加入60μL的Fecto VIR-AAV转染试剂(PolyPlus)，立即用斡旋仪震荡3秒混匀，室温静置30min。将转染液逐滴加入到细胞培养液，细胞培养液可加入抗生素300ul PS(终浓度到1％)和30ul 10％P188(终浓度0.01％)，中，培养瓶放回摇床，37℃，5％CO2，120rpm继续培养。转染72h后裂解细胞，细胞样本处理方式与贴壁细胞保持一致，通过实时定量PCR检测细胞中的病毒基因拷贝数(vg)。
其中，包装过程中使用的GOI(gene of interest，目的基因)质粒为EGFP质粒，其包含由CAG启动子驱动的绿色荧光蛋白编码基因EGFP，作为荧光报告基因，并且还在EGFP两侧各包含一个ITR序列，由此提供了rAAV载体的基因组。
AAV病毒滴度检测方法：
标准品制备：选择GOI质粒的单一酶切位点，酶切后切胶进行线性DNA回收，回收产物用Nanodrop(Thermo公司)测DNA浓度，按照公式c(copy/μl)＝质粒浓度(ng/μl)*(1e-9)*阿伏伽德罗常数/(660g/mol*质粒碱基对数)计算拷贝数，将质粒稀释至1e9 copy/μl，分装后冻存于-80度。
标准品稀释：取一支分装的标准品，用ddH2O梯度稀释至1e8，1e7，1e6，1e5，1e4，1e3，1e2 copy/μl，作为标准品模板。
样品制备和稀释：按照以下体系配制混合物，Benzonase(Merk)2.5U，MgCl2终浓度2mM，病毒5μl，补ddH2O至49μl，轻轻混匀离心后，37度处理1h，85度处理20min；然后加入1μl10mg/ml蛋白酶K(Merk)，轻轻振荡混匀，离心后55度处理10min，85度处理20min；最后将处理完成样品(10倍稀释样品)再稀释100倍和500倍，获得1000和5000倍稀释样品，将1000和5000倍稀释样品作为待测模板。
qPCR反应和滴度计算方法如下：
配制体系(20μl)：2X Probe Premix 10μl，10uM hGHpA-F(5’-CACAATCTTGGCTCACTG-3’)和hGHpA-R(5’-CTGGAATCCCAACAACTC-3’)引物各0.4μl，hGHpA(5’-TTCAAGCGATTCTCCTGCCTC-3’)探针引物0.8μl，50X ROX II(Takara)0.4μl，模板2μl，补水至20μl；按照程序：95度5min；随后95度5s，60度30S，40个循环完成检测，输出数据后，滴度(VG/ml)＝输出结果*稀释倍数*1000；
如附图2所示：在贴壁的293T和悬浮293细胞中进行5种血清型的病毒包装，测试不同血清的病毒产量。从图2A中可看出与AAV2野生型病毒相比，AAV2.7m8，RC-C08，RC-C15和RC-C18的贴壁包装产量差异在5倍以内。即，本发明的RC-C08，RC-C15和RC-C18与具备靶向性的血清型AAV2.7m8相比差异不显著。而在图2B所示意的结果中，当在悬浮293细胞中采用相同的三质粒PEI瞬转包装方法进行上述五种病毒的包装时，所得五种病毒的产量尽管显示出了与293T细胞(图2A)中相类似的差异趋势，但差异小于2倍，且没有统计学显著性。
实施例3：RC-C08、RC-C15和RC-C18新血清型体外生物活性的比较
流式检测AAV病毒TU的步骤如下：
1.准备待感染的贴壁培养的293T细胞，和纯化的AAV2、AAV2.7m8、RC-C08、RC-C15及RC-C18五种血清型的病毒。
2.Day1细胞铺板：HEK293T细胞消化脱落后，以1000rpm离心5min收集细胞，重悬计数，按照HEK293T 1E+4/孔铺于96孔板。
3.Day2病毒感染：细胞铺板24h后计数；
完全培养基梯度稀释AAV，按照如下稀释倍数依次稀释10倍：
1×10-2＝990μL of diluent+10μL of stock
1×10-3＝900μL of diluent+100μL of previous dilution
1×10-4＝900μL of diluent+100μL of previous dilution
1×10-5＝900μL of diluent+100μL of previous dilution
1×10-6＝900μL of diluent+100μL of previous dilution
1×10-7＝900μL of diluent+100μL of previous dilution
取出过夜培养的细胞，从孔中吸出完全培养基后，加入100μL含有梯度稀释的病毒的培养基(每个稀释倍数加8孔)：放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养72小时。
5.Day5拍照消化细胞：72小时后，弃去培养基，向细胞加入100μL PBS洗涤细胞并弃去PBS，加入20μL Trypsin，置于37℃培养箱中消化3min，加入80μL含10％FBS的DMEM(FBS购自Gibco，DMEM购自Hyclone)终止消化，流式检测病毒荧光情况。
6.导出数据，FlowJo V10分析处理流式结果，生成excel文件，用Graphpad Prism9作柱状图。
结果分析：如附图3所示，RC-C08和RC-C15病毒的TU与AAV2、AAV2.7m8接近，在293T中检测到的感染活性均显著优于RC-C18(图3A-3E)，其中RC-C08具有最低的VG/TU值(该数值越低，代表在相同vg下，病毒的体外转导活性强)，与AAV2、AAV2.7m8等现有已知血清型相比，RC-C08在体外的转导活性最强，其次是RC-C15，与AAV2.7m8相比，而RC-C18突变体血清的活性在293T中最弱(图3F)。上述结果表明，本发明的突变体RC-C08与AAV2野生型病毒相比在体外转导活性上具有显著的优势。
实施例4：RC-C08与AAV2、AAV2.7m8和AAV-DJ三种现有血清型体外转导效率比较AAV病毒体外转导活性流程如下：
病毒侵染能力的测定方法
1.细胞：HEK293T(ATCC；CRL-11268)，CHO(ATCC；CRL-2092)，ARPE19(ATCC；CRL-2302)，661w(Lonza)四种。其中661W是来自小鼠的感光细胞系，人源的感光细胞系由于很难获得而无法设计在实验中。
2.病毒AAV2，AAV2.7m8，AAV-DJ，RC-C08四种血清型。
3.病毒在体外感染确定的感染复数：HEK293T MOI＝200，CHO MOI＝2000，661wMOI＝200，ARPE19 MOI＝1000。
4.Day1细胞铺板：培养中的HEK293T细胞，661w细胞，CHO细胞和ARPE19细胞经胰酶消化脱落后，1000rpm离心5min收集细胞，计数，铺于96孔板，每孔细胞数按照以下数量铺种：HEK293T 1E+4，CHO 1E+4，661w 5E+3，ARPE19 1E+4。
5.Day2病毒感染：细胞铺板24h后计数，按照所计数目加入所需MOI的病毒。
6.Day5拍照消化细胞：弃去培养基后向细胞加入100μL PBS洗涤细胞并弃去PBS，加入20μL Trypsin(Gibco)，置于37℃培养箱中消化，消化充分后加入80μL含10％的DMEM终止消化，将细胞吹打均匀，流式检测病毒荧光情况。
7.导出数据，通过FlowJo分析处理流式结果，生成excel文件，用graphpad作柱状图。
RC-C08组在HEK293T，661w和CHO中的GFP荧光百分比和平均荧光强度(MFI)均显著高于AAV2，AAV2.7m8和AAV-DJ组；AAV2.7m8在ARPE19细胞中的GFP荧光百分比和平均荧光强度(MFI)显著高于AAV2，AAV-DJ和RC-C08组。
根据现有公开文献记载的特性，AAV-DJ血清型在体外的转导活性在现有血清型中最强，尤其是在293T细胞的转导活性，因此我们将RC-C08与AAV2(野生型)、AAV2.7m8和AAV-DJ血清型进行了不同细胞的体外感染效率比较。结果表明，如图4所示，从图4A-4D的统计结果显示RC-C08在HEK293T和CHO细胞中的GFP荧光百分比和平均荧光强度(MFI)的数值显著高于AAV2，AAV2.7m8和AAV-DJ组，并且由于四个重组病毒均采用了相同的荧光报告基因***(EGFP)，所以MFI数值反映了RC-C08感染的细胞经FACS检测的单细胞平均荧光强度是其他三个病毒的3倍以上，表明在293T和CHO细胞上，RC-C08的转导活性最强。由此可见，与野生型AAV及其他已知的体外高转导活性的变体病毒(AAV2.7m8和AAV-DJ)相比，RC-C08新血清型具有显著增加的体外细胞侵染活性。在鼠感光细胞(661w)中也得到了类似结论，如图4G-4H的统计结果所显示的，RC-C08组的荧光百分比和平均荧光强度(MFI)显著高于AAV2，AAV2.7m8和AAV-DJ等现有技术载明的血清型。然而在视网膜色素上皮细胞(ARPE19)中，感染活性统计结果显示AAV2.7m8组的荧光百分比和MFI的数值显著高于AAV2、AAV-DJ和RC-C08血清型组(参见图4E-4F)。由此可见，与野生型AAV及已知的高转导活性的AAV血清型相比，RC-C08在对视网膜组织中的感光细胞具有显著增加的转导活性，而对例如ARPE19的色素上皮细胞侵染性下降。
实施例5：RC-C08血清型与AAV2.7m8,AAV-DJ血清型体内转导效率差异性比较
准备6只C57 WT小鼠，每组随机分配两只，将制备好的RC-C08-EGFP，AAV2.7m8-EGFP,AAV-DJ-EGFP三种血清型滴度稀释至E11 vg/ml，采用玻璃体腔内(IVT)注射的给药方式，每只小鼠的左眼(OS)，右眼(OD)分别给药2μl，分别在给药后Day40和Day60，通过进行活体自发荧光(AF)的检查和视网膜铺片检查评估体内转导效率。
其中，活体自发荧光检测(AF)的实验步骤如下：将表观检查正常的6-8周龄的C57小鼠(集萃生物)核对好耳标后，双眼眼表滴加散瞳，随后使用舒泰混合液(Virbac,BN7T78)按照60mg/kg的剂量麻醉小鼠，双眼眼表滴加表面麻醉剂，眼表涂上凝胶佩戴角膜接触镜；将海海德堡SPECTRALIS光学相干断层扫描仪(OCT)检查设备的HRA控制面板设置为IR模式，对焦小鼠眼底直至图像清晰，然后切换至FA模式，调节SENS值至107，调节焦距至能清晰看到视网膜的血管，降低SENS值至100，开始进行照片的拍摄。
视网膜铺片步骤如下：小鼠眼球摘除后，4％多聚甲醛固定30min；固定完成后的小鼠眼球浸泡在PBS中清洗去除残余固定液；体式显微镜(LEICA S9)下，将小鼠眼球沿角巩膜边缘靠近巩膜一侧剪开；去除角膜和晶体后，左手持镊子固定视神经，右手持镊子沿视神经将视网膜推出视杯；沿视网膜边缘将视网膜剪开呈花瓣状；用镊子将视网膜转移至载玻片上展平，DAPI染核；在视网膜上滴加抗荧光淬灭封片剂，载玻片边缘点涂少许指甲油用于固定；盖上盖玻片镜检。使用life EVOS M700进行视网膜组织的全景扫描拍照，绿色荧光通道拍摄，自动拼接及组合。
AF检测结果如图5A-5C所示。根据图5A可知，三种血清型均可以通过IVT给药的方式，到达视网膜脉络膜组织，并表达绿色荧光蛋白。进一步通过ImageJ 1.8.0灰度扫描分析AF检查的照片，得到小鼠眼底相对荧光面积(图5B)以及统计计算出总荧光强度(图5C)，从统计结果中可以发现RC-C08血清型通过IVT给药后40天和60天的荧光强度均显著高于对照组(AAV2.7m8和AAV-DJ血清型)。显示，随着时间推移，AAV2.7m8血清型病毒在眼组织的表达持续增强，AAV-DJ血清型表达强度显著下降，而实验组RC-C08在给药40天后就达到了高峰，Day40的总荧光强度是实验对照组的8-10倍，并且无论是总荧光强度还是荧光相对面积都没有随时间减弱，始终维持了较高的持续性表达。
视网膜铺片结果参见附图5D-5F。在图5D中，可以清晰的发现RC-C08病毒IVT给药后40天和60天的视网膜组织中的荧光蛋白分布的面积及总强度均显著高于对照组(AAV2.7m8和AAV-DJ血清型)，这与图5A中观察到的现象一致。图5E和图5F显示了Day40和Day60的对比，随着给药后时间推移，AAV2.7m8血清型病毒在眼组织的表达在Day60较Day40表现出了一定程度的增强，AAV-DJ血清型在视网膜组织中的表达强度则呈现下降趋势，而本发明的RC-C08血清型的总荧光强度和荧光面积显著增加，给药60天后的检查结果与Day40相比，视网膜组织中的总荧光强度和荧光分布面积都显著提升了。实验组与对照组的对比与图5B-5C也基本一致。
实施例6：RC-C08，RC-C15，RC-C18三种新血清型在不同细胞系中的体外转导活性比较
将制备的***目的基因EGFP的RC-C08,RC-C15以及RC-C18三个本发明改造的血清型，分别在体外测试感染活性的差异，同样选择了AAV2 WT和AAV2.7m8病毒作为实验对照组。在293T中测试了MOI为20和100，在ARPE19中待检测的病毒的MOI为40和200，661W的感染复数是1000和5000，其培养和感染方法参照前述实施例。体外感染72h后，通过流式细胞仪对绿色荧光的阳性细胞进行定量分析和检测，使用FlowJo官方软件对获取的数据进行分析，得到如图6A-6F所示的分析数据。
分析统计结果表明RC-C08血清型在293T和ARPE19细胞中获得的GFP荧光百分比和平均荧光强度显著高于对照组AAV2和AAV2.7m8，而RC-C18在293T和ARPE19中GFP荧光百分比显著低于AAV2和AAV2.7m8(图6A-6D)，还发现RC-C08，RC-C15和RC-C18三个变体血清型在661w细胞中获得的GFP荧光百分比均显著高于AAV2-EGFP和AAV2.7m8，显著性差异分别为p＜0.0001，p＜0.01和p＜0.001(图6E)。由此可见，相比现有技术记载的血清型，RC-C18表现出了感光细胞特异性，同时RC-C08和RC-C15与AAV2.7m8血清型相比，感光细胞的转导效率差异显著。
实施例7：RC-C08血清型在体内转导活性验证，评估玻璃体(IVT)给药2周的短期效果
提前1周准备12只C57野生型小鼠，随机分配至A-D四组，分别为AAV2对照组高剂量组、AAV2对照组低剂量组、AAV2.7m8对照组低剂量组和RC-C08实验组低剂量组(参见图7A中给药方案标注)，每组分配3只小鼠。左右眼玻璃体分别注射给药，高剂量组给药4E8 vg病毒，低剂量给药4E7 vg。在给药2周后，对实验组所有小鼠左右眼进行活体自发荧光的检测，检测方法参照前述实施例。
如图7A所示，可以观察到，A和D两组的小鼠眼球进行活体荧光检查时，能够检测到眼底自发的荧光信号，D组(即RC-C08组)的荧光信号更强，6只眼睛中有5只检测到强信号，即与A组对照组AAV2高剂量给药组相比，RC-C08给药组的转导活性显著更强。进一步通过ImageJ分析软件进行统计，如图7B-7C所示的数据统计，从总荧光面积以及平均荧光强度的分析结果表明，RC-C08血清型所获得的上述指标达到对照组AAV2和AAV2.7m8的三倍左右，进一步分析眼底总荧光强度与对照组相比，RC-C08低剂量给药组提高了10倍左右(图7D)；表明低剂量给药2周后，新血清型的体内转导活性显著强于现有血清型。
实施例8：RC-C08与AAV2.7m8在体内眼组织分布及长期活性的比较
将CRO公司购买的6-8周龄的6只C57小鼠分为AB两组，每组随机分配3只。A组给药AAV2.7m8，B组3只小鼠双眼给药RC-C08血清型，均为左右眼分别玻璃体注射给药，给药剂量为2E9 vg病毒。在给药5周后，进行活体自发荧光检测。给药后第6周，将上述6只小鼠的左右眼取出，按照中国专利公告号CN107012171B中记载的方法进行眼球组织的冰冻切片，在相同的曝光强度下进行视网膜组织的荧光拍照检查。
自发荧光检测方法步骤参照前述实施例。
冰冻切片荧光拍照简单操作流程如下：挑选出眼球切片形态好的片子；PBS浸泡清洗三次，每次5min，去除组织表面OCT包埋液；用组化笔将组织圈出，平放在湿盒上；DAPI用PBS1：2000稀释后滴加在组织上染色5min；PBS浸泡清洗三次，每次5min；眼球组织上滴加抗荧光淬灭封片剂，载玻片边缘点涂少许指甲油用于固定；盖上盖玻片镜检，绿色和蓝色两个荧光通道进行拍照，图形重叠后，将小图(10X)拼接成完整的大图。
自发荧光检测结果如图8A-8C所示。AAV2.7m8和RC-C08两种血清型均可以通过IVT给药方式在靶细胞中表达绿色荧光蛋白，从而，通过活体荧光检测设备拍照捕获了较强的荧光信号。同时，RC-C08血清型的体内转导效率显著高于对照病毒，并且B组的三只小鼠6只眼睛的荧光信号接近，表明RC-C08血清型的在眼内组织中的持续表达的稳定性高。进一步通过ImageJ分析软件分析，荧光强度和荧光区域面积的统计分析结果(图8B-8C)显示，RC-C08血清型的相对荧光面积是AAV2.7m8的三倍多，总荧光强度与对照组相比也提高了3-4倍；
冰冻切片结果如图8D-8F所示。图8D显示，AAV2.7m8现有血清型IVT给药后，组织分布局限，该血清型并不能穿透视网膜组织进入到RPE层，并且荧光强度较弱，而RC-C08给药组的6只眼睛的视网膜组织基本是全层分布，并且荧光亮度远超对照组，图8E-8F的统计数据与荧光图片的结果保持一致。
实施例9：RC-C08、RC-C15和RC-C18血清型耐受人源中和抗体的活性比较
中和抗体耐药性实验方法：
1.铺板：96孔板HEK-293T细胞铺板，通过细胞计数仪进行计数，每孔铺5E3个细胞，待细胞汇合度达到30％-40％，进行病毒感染；
2.病毒稀释：感染前对单孔细胞计数，根据公式V(μl)＝MOI*细胞数/病毒滴度*1000，计算每个孔所需病毒体积，以DMEM完全培养基作为稀释液对病毒进行稀释；抗体(静注人免疫球蛋白PH4，山东泰邦，浓度5％)稀释：通过4倍倍比方式以DMEM完全培养基作为稀释液进行抗体稀释，获得稀释度为1(抗体原液)、1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024、1：4096和0(DMEM完全培养基)的抗体液；
3.病毒和抗体共孵育：将抗体和病毒以体积比1：1进行混匀，置于37度培养箱过夜孵育；
4.病毒感染：感染前进行单孔细胞计数，计算并记录实际MOI，每个孔加入100μl病毒和抗体混合液，每种样品每个梯度2个重复孔，感染后将孔板置于37度二氧化碳培养箱培养。
5.流式检测(Cytoflex，Beckman)：感染后72h，去除细胞上清，用PBS洗细胞一次，胰酶充分消化后加入含10％FBS的DMEM终止反应，随后进行流式检测，输出结果通过FlowJo软件分析荧光细胞百分比。
如图9所示，稀释比例小代表加入抗体的量大，IC50的稀释比例数值越低代表血清型越难被抗体中和，AAV2，AAV2.7m8，RC-C08，RC-C15和RC-C18血清型在293T中对应的的IC50稀释比例分别为1：404.1，1：579.2，1：106.7，1：26.72和1：25.64(见图9A-9E)，由此可见，RC-C08，RC-C15和RC-C18抵抗中和抗体的能力远远高于现有技术中已知的AAV2和AAV2.7m8，实验中5个血清型按照逃逸或耐受中和抗体的能力由强到弱依次为RC-C18，RC-C15，RC-C08，AAV2，AAV2.7m8。
实施例10：RC-C08及其变体RC-C15在小鼠眼组织内的转导效率比较
鉴于图6A，6C所示，记载了RC-C15在体外293T和ARPE19体外感染实验，统计结果显示与RC-C08血清型相比，没有产生显著性的体外转导活性的提升，因此设计了新的动物实验进行体内转导效率和病毒稳定性的评估。每个血清型给药3只小鼠的左右眼，给药剂量为4E8vg，随后分别在感染后2周和4周两个时间点进行活体荧光检查(AF)。
从图10A的照片可以看到RC-C08血清型IVT给药后2周，表达强度达到高峰，而4周后有三只眼睛的表达强度显著下降，同样如图10B展示的AF结果表明RC-C15血清型在2周有较强的荧光信号(强度弱于RC-C08组)，随着时间的推移，在4周的活体荧光拍照结果显示6只眼睛中有三只的荧光强度较2周时显著提高，并且此三只眼底自发荧光信号值强于4周的RC-C08给药组。
进一步使用ImagJ分析眼底照的荧光总面积(图10C)和荧光强度(图10D)，统计结果显示2周时RC-C08组的荧光强度和面积高于RC-C15组，尽管在4周检查时，RC-C15组的荧光整体强度高于RC-C08组，但由于组间个体的差异，没有显著的统计学意义，但是从眼底自发荧光检测的图片直观展现了RC-C15血清型在小鼠眼组织中表现出的目的基因表达量的稳定性好于RC-C08给药组。
以上说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此以相同的程度引入作为参考，就如同明确和单独地说明以其整体引入每一单个出版物、专利或专利申请作为参考一样。本发明的所述方法、药物组合物和试剂盒的多种修改和变形对本领域技术人员而言显而易见而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合具体实施方案描述了本发明，但应理解它能够进一步修改，所要求的发明不应不适当地限于这类具体实施方案。实际上，对本领域技术人员而言显而易见的是，所述用于实施本发明的方式的多种修改旨在处于本发明的范围之内。本申请旨在涵盖本发明的任何变形、用途或改编，其通常遵循本发明的原理，且包括处于本发明所属领域内的已知惯例内，且可应用于前文所示基本特征的这类对本公开的偏离。
序列表：
SEQ ID NO:1RC-C08 VP1蛋白序列
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SEQ ID NO:2RC-C15 VP1蛋白序列
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYFLSRTNTPSGTTTQSRLQFSVAGPSNMAVQGRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRFLTRNL*
SEQ ID NO:3RC-C18 VP1蛋白序列
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVTTTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSVAGPSNMAVQGRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLALGDVTRPARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSINVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRFLTRNL*
SEQ ID NO:4RC-C08 cap基因序列
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctGTGgccggaCCGagtAACATGGCGGTCcagGGTaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaaTTCGCGtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa
SEQ ID NO:5RC-C15 cap基因序列
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtatTTCttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctGTGgccggaCCGagtAACATGGCGGTCcagGGTaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaaTTCGCGtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagaTTCctgactcgtaatctgtaa
SEQ ID NO:6RC-C18 cap基因序列
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcaCcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtatTACttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctGTGgccggaCCGagtAACATGGCGGTCcagGGTaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaaTTCGCGtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacCTAGCACTCGGCGACGTAACAAGACCTGCTaggcaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctAttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagaTTCctgactcgtaatctgtaa
SEQ ID NO:7AAV2.7m8 VP1蛋白序列
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLALGETTRPARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
SEQ ID NO:8野生型AAV2的VP1蛋白序列
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL

Claims (25)

1.一种改造基于腺相关病毒血清型2的重组腺相关病毒载体方法，包括步骤：
(a)改造衣壳蛋白VP1，使其包含以下氨基酸突变位点：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F和S501A；
(b)改造衣壳蛋白VP1，使其包含以下氨基酸突变位点：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y444F,Y500F,S501A和Y730F；
或
(c)改造衣壳蛋白VP1，使其具备以下氨基酸突变位点：Q464V,A467P,D469N,I470M,R471A,D472V,S474G,Y500F和S501A，同时在587N和588R之间***氨基酸序列LALGDVTRPA，
其中，所述重组腺相关病毒载体包含所述衣壳蛋白VP1，并在其基因组中包含外源基因。
2.权利要求1的方法，其特征在于，所述改造衣壳蛋白VP1的步骤是通过改变VP1的编码基因cap的核酸序列并表达cap基因获得包含被改造序列的VP1蛋白而实现的。
3.由权利要求1或2的方法获得的重组腺相关病毒载体。
4.分离的VP1衣壳蛋白，其特征在于包含如SEQ ID NO:1-3任一项所示的氨基酸序列。
5.核酸分子，其编码如权利要求3所述的组腺相关病毒载体的VP1衣壳蛋白，或编码权利要求4所述的VP1衣壳蛋白。
6.权利要求5的核酸分子，其包含如SEQ ID NO:4-6任一项所示的或与其具有70％同一性的核酸序列。
7.重组腺相关病毒载体，其包含：
(i)如权利要求4所述的VP1衣壳蛋白；和
(ii)可在感染后表达的外源基因。
8.如权利要求7所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述(ii)的外源基因编码治疗性蛋白。
9.如权利要求7所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述(ii)的外源基因是报告基因。
10.如权利要求9所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述(ii)的外源基因是绿色荧光蛋白基因。
11.药物组合物，其包含权利要求3、7或8所述的重组腺相关病毒载体。
12.权利要求11的药物组合物，其特征在于，所述药物的给药方式是全身途径或局部途径给药。
13.权利要求11的药物组合物，其特征在于，所述药物的给药方式是静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用或病灶内施用。
14.权利要求9的药物组合物，其特征在于，所述药物的给药方式是滴眼、眼内注射、结膜下注射、前房内注射、玻璃体内注射或视网膜下注射。
15.权利要求3、7或8所述的重组腺相关病毒载体，或权利要求11-14的药物组合物，在制备疾病的治疗药物中的用途。
16.权利要求15所述的用途，其中所述疾病是眼部疾病。
17.权利要求15所述的用途，其中所述疾病是视网膜相关疾病，例如，IRD。
18.权利要求15所述的用途，其中所述治疗药物的给药方式是静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用或病灶内施用。
19.权利要求15所述的用途，其中所述治疗药物的给药方式是滴眼、眼内注射、结膜下注射、前房内注射、玻璃体内注射或视网膜下注射。
20.权利要求15所述的用途，其中所述药物用于治疗曾经接受过rAAV载体治疗和/或曾经天然感染过AAV的个体。
21.宿主细胞，其包含权利要求5或6所述的核酸分子。
22.宿主细胞，其包含权利要求3、7或8所述的重组腺相关病毒载体。
23.权利要求21的宿主细胞，其还包含额外的一种或多种用于腺相关病毒包装的载体。
24.产生能够表达外源基因序列的重组腺相关病毒载体的方法，所述方法包括步骤：
(i)将以下引入细胞：
(a)权利要求5或6所述的核酸分子，
(b)携带所述外源基因序列的载体，和
(c)额外的一种或多种重组用于腺相关病毒包装的载体；
然后
(ii)在所述细胞中表达由所述核酸分子和所述用于腺相关病毒包装的载体编码的病毒蛋白质，其容纳携带所述外源基因序列的载体形成病毒颗粒，从而产生含有所述外源基因序列的重组腺相关病毒；
任选地
(iii)收集所述重组腺相关病毒。
25.权利要求24的方法，其中所述细胞是HEK-293细胞或源自HEK-293细胞，且所述细胞是贴壁生长或悬浮生长。
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