JP2022514112A - 複製欠損型ウイルスベクター及びウイルスの感染性を測定するための方法 - Google Patents

複製欠損型ウイルスベクター及びウイルスの感染性を測定するための方法 Download PDF

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Abstract

複製欠損型ウイルス及びウイルスベクターの感染性を測定するための改善された方法を、本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルスは組換えＡＡＶである。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１５日出願の米国特許仮出願第６２／７４５，８５９号の優先権を主張し、当該出願の全体が本明細書に援用される。
背景
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクター系の使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非***細胞にも***細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えｒＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的化し、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。
複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法をより広く後期臨床段階及び商業的使用に採用できるようになる前に、組換えウイルス粒子を大規模生産するための新たな方法を開発する必要がある。限界希釈エンドポイント解析による感染力価の絶対的定量化（ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイとしても知られる）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換えウイルス（例えば、ＡＡＶ）調製物の感染性を測定するための標準的な方法となっている。ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイは、ＡＡＶベクター調製物の感染性を確認するのに有用ではあるが、アッセイ変動性が大きい（幾何変動係数が最大２００％）ため、製品適合性、比較性、及び安定性の支持に対する適用性が制限される。したがって、複製欠損型ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を含む組成物の感染性を測定するためのより正確な方法が必要とされている。
概要
本開示は、ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、標的細胞へのウイルス粒子の接種を可能にする条件下で、当該標的細胞を当該試験組成物及び当該参照組成物に接触させる工程と、細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、当該試験組成物及び参照組成物を接種された当該標的細胞からそれぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、当該試験核酸試料及び当該参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、標的細胞は、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物と接触される。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、１０倍未満の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または８倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、平行線モデルを用いて参照試料に対する試験試料の感染性を計算する工程を含む。いくつかの実施形態において、核酸試料中のＶＧＣ及びＴＣＧＣはポリメラーゼ連鎖反応によって決定される。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応は定量的ポリメラーゼ連鎖反応である。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応はデジタルポリメラーゼ連鎖反応である。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は複製欠損型ウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子は、ＡＡＶ、アデノウイルス、ワクシニア、またはレンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子はレトロウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子はＡＡＶ粒子、例えば組換えＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞はＨｕｈ－７細胞である。
本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～６のうちの１つのヌクレオチド配列を含む約１５～約４０個のヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは検出可能に標識され、このとき検出可能な標識はポリヌクレオチドに共有結合している。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は蛍光標識である。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、及びＲＯＸのうちの１つ以上を含む。
本開示は、目的ポリヌクレオチドを生成する方法であって、本明細書で説明される１つ以上のポリヌクレオチドを用いて、生物学的試料からのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応に供する工程を含む、方法を提供する。
本開示は、本明細書で説明される１つ以上のポリヌクレオチドを含む試料中のｒＡＡＶを検出するためのキットを提供する。
本開示は、ウイルス粒子を含む参照試料の感染性に対するウイルス粒子を含む試験試料の感染性を決定するためのキットであって、（ａ）ウイルス配列を増幅可能であり、任意選択でプローブを伴う、順方向及び逆方向プライマー、（ｂ）標的細胞ゲノム配列を増幅可能であり、任意選択でプローブを伴う、順方向及び逆方向プライマー、ならびに（ｃ）ウイルス参照試料のうちの１つ以上を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ウイルス配列を増幅可能であり、任意選択でプローブを伴う、順方向及び逆方向プライマーは、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞のゲノム配列を増幅可能であり、任意選択的にプローブを伴う、順方向及び逆方向プライマーは、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含む。
本開示はさらに、異なる条件下でのウイルス粒子の組成物の相対的感染性を決定するための方法であって、第１及び第２の条件セットの下で、標的細胞にウイルス粒子を含む当該組成物を接種する工程と、当該接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、当該第１及び第２の条件セットの下で接種された標的細胞から、それぞれ第１及び第２の核酸試料を単離する工程と、当該第１及び第２の核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程とを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は以下を提供する。
［１］ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、
［ａ］標的細胞に前記試験組成物及び参照組成物を別々に接種する工程と、
［ｂ］前記接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、
［ｃ］前記試験組成物及び参照組成物を接種された前記標的細胞から、それぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、
［ｄ］前記試験核酸試料及び前記参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と、を含む、前記方法。
［２］ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、
［ａ］前記試験組成物及び参照組成物の系列希釈物を調製する工程と、
［ｂ］標的細胞に前記試験組成物及び参照組成物の前記系列希釈物を別々に接種する工程と、
［ｃ］前記接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、
［ｄ］前記試験組成物及び参照組成物を接種された前記標的細胞から、それぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、
［ｅ］前記試験核酸試料及び前記参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と、を含む、前記方法。
［３］前記系列希釈物が、１０倍未満の希釈物である、［２］に記載の方法。
［４］前記系列希釈物が、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または８倍の希釈物である、［２］に記載の方法。
［５］前記系列希釈物が、２倍の希釈物である、［２］に記載の方法。
［６］前記系列希釈物が、少なくとも２種類の希釈物、少なくとも３種類の希釈物、少なくとも５種類の希釈物、または少なくとも１０種類の希釈物を含む、［２］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］前記系列希釈物が、２～２０種類の希釈物を含む、［２］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［８］平行線モデルを用いて、前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を計算する工程をさらに含む、［２］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を計算する前記工程が、
［ａ］試験組成物及び参照組成物の各希釈度についてのＶＧＣ：ＴＣＧＣ比を計算することと、
［ｂ］前記試験組成物及び参照組成物についての対数希釈度に対し対数ＶＧＣ：ＴＣＧＣ比をプロットすることと、
［ｃ］共通の傾きを用いて、前記試験組成物及び参照組成物のデータポイントを試験組成物及び参照組成物の線にフィットさせることと、
［ｄ］前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を
Figure 2022514112000001
として計算することと
を含む、［８］に記載の方法。
［１０］変動係数（ｃｖ）が、約１００％未満、約５０％未満、または約２５％未満である、［１］～［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］標的細胞に接種する前記工程が、ウイルス粒子の存在下で前記標的細胞を
［ａ］約５分から約３日の間、
［ｂ］約１２時間から約３６時間の間、
［ｃ］約１８時間から約３０時間の間、
［ｄ］約１時間、約２時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、もしくは約３６時間、
「ｅ」約１日、もしくは約１．５日、もしくは約２日、または
［ｆ］約２４時間
にわたってインキュベートすることを含む、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］核酸組成物中の前記ＶＧＣ及びＴＣＧＣがポリメラーゼ連鎖反応によって決定される、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］前記ポリメラーゼ連鎖反応が定量的ポリメラーゼ連鎖反応である、［１２］に記載の方法。
［１４］前記ポリメラーゼ連鎖反応がデジタルポリメラーゼ連鎖反応である、［１２］に記載の方法。
［１５］前記ウイルス粒子が複製欠損型ウイルスである、［１］～［１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］前記複製欠損型ウイルスが、ＡＡＶ、アデノウイルス、ワクシニア、またはレンチウイルスである、［１５］に記載の方法。
［１７］前記複製欠損型ウイルスがレトロウイルスである、［１５］に記載の方法。
［１８］前記複製欠損型ウイルスがＡＡＶである、［１５］に記載の方法。
［１９］前記ＡＡＶが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である、［１８］に記載の方法。
［２０］前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、［１９］に記載の方法。
［２１］前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、［２０］に記載の方法。
［２２］前記標的細胞が、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞である、［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２３］前記標的細胞がＨｕｈ－７細胞である、［２２］に記載の方法。
［２４］前記試験組成物及び前記参照組成物が同じ力価を有し、前記力価がミリリットル当たりのゲノムコピー（ＧＣ）として測定される、［１］～［２３］のいずれか１つに記載の方法。
［２５］前記試験組成物及び前記参照組成物が異なる力価を有し、前記力価がミリリットル当たりのゲノムコピー（ＧＣ）として測定される、［１］～［２３］のいずれか１つに記載の方法。
［２６］前記試験組成物の前記力価が、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子である、［２４］または［２５］に記載の方法。
［２７］前記参照組成物の前記力価が、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子である、［２４］～［２６］のいずれか１つに記載の方法。
［２８］０、１、２、３、４、または５つの置換を含む、以下のヌクレオチド配列：
Figure 2022514112000002
を含む約１５～約４０個のヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレオチド。
［２９］約１５～約４０個のヌクレオチドを有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～６のうちの１つのヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
［３０］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～６のうちの１つのヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
［３１］（ｉ）［２８］～［３０］のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに共有結合している検出可能な標識とを含む、組成物。
［３２］前記検出可能な標識が蛍光標識である、［３１］に記載の組成物。
［３３］前記検出可能な標識が、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、及びＲＯＸのうちの１つ以上を含む、［３２］に記載の組成物。
［３４］順方向プライマー及び逆方向プライマーの対であって、前記順方向プライマー及び逆方向プライマーがそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２のポリヌクレオチド配列を含む、前記対。
［３５］順方向プライマー及び逆方向プライマーの対であって、前記順方向プライマー及び逆方向プライマーがそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び５のポリヌクレオチド配列を含む、前記対。
［３６］プローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せであって、前記順方向プライマー、逆方向プライマー、及びプローブが、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、及び３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む、前記組合せ。
［３７］プローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せであって、前記順方向プライマー、逆方向プライマー、及びプローブが、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５、及び６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む、前記組合せ。
［３８］目的ポリヌクレオチドを生成する方法であって、［３４］または［３５］に記載の順方向プライマー及び逆方向プライマーの対を用いて、生物学的試料からのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応に供する工程を含む、前記方法。
［３９］目的ポリヌクレオチドを生成する方法であって、［３６］または［３７］に記載のプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せを用いて、生物学的試料からのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応に供する工程を含む、前記方法。
［４０］試料中のｒＡＡＶを検出するためのキットであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３からなる群より選択される１つ以上のポリヌクレオチドを含む、前記キット。
［４１］試料中のｒＡＡＶを検出するためのキットであって、［３４］に記載の順方向プライマー及び逆方向プライマーの対を含む、前記キット。
［４２］試料中のｒＡＡＶを検出するためのキットであって、［３６］に記載のプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せを含む、前記キット。
［４３］参照試料の感染性に対するｒＡＡＶ試験試料の感染性を決定するためのキットであって、［３４］に記載の順方向プライマー及び逆方向プライマーの対を含む、前記キット。
［４４］［３５］に記載の順方向プライマー及び逆方向プライマーの対をさらに含む、［４３］に記載のキット。
［４５］参照組成物の感染性に対するｒＡＡＶ試験組成物の感染性を決定するためのキットであって、［３６］に記載のプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せを含む、前記キット。
［４６］［３７］に記載のプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せをさらに含む、［４５］に記載のキット。
［４７］ｒＡＡＶ参照組成物をさらに含む、［４０］～［４６］のいずれか１つに記載のキット。
［４８］以下の工程を含む、異なる条件下でのウイルス粒子の組成物の相対的感染性を決定するための方法：
［ａ］第１及び第２の条件セットの下で、標的細胞にウイルス粒子を含む前記組成物を接種する工程と、
［ｂ］前記接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、
［ｃ］前記第１及び第２の条件セットの下で接種された標的細胞から、それぞれ第１及び第２の核酸試料を単離する工程と、
［ｄ］前記第１及び第２の核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程。
［４９］前記第１及び第２の条件セットが、同じ標的細胞を使用する、［４８］に記載の方法。
［５０］前記第１及び第２の条件セットが、異なる標的細胞を使用する、［４８］に記載の方法。
［５１］前記異なる標的細胞が異なる遺伝子修飾を含む、［５０］に記載の方法。
［５２］前記異なる標的細胞が、前記標的細胞のうちの１つに遺伝子修飾が存在することを除いて同一である、［５０］に記載の方法。
［５３］標的細胞に接種する前記工程が、標的細胞に前記組成物の系列希釈物を接種することを含む、［４９］～［５２］のいずれか１つに記載の方法。
［５４］前記系列希釈物が、２倍の希釈物である、［５３］に記載の方法。
［５５］標的細胞に接種する前記工程が、標的細胞に前記組成物の系列希釈物を接種することを含む、［５３］または［５４］に記載の方法。
［５６］平行線モデルを用いて、前記第１及び第２の条件セットの下で、前記組成物の相対的感染性を計算する工程をさらに含む、［５３］～［５５］のいずれか１つに記載の方法。
［５７］前記第１及び第２の条件セットの下で、前記組成物の相対感染性を計算する前記工程が、
［ａ］前記第１及び第２の条件セットの各希釈度についてのＶＧＣ：ＴＣＧＣ比を計算することと、
［ｂ］前記第１及び第２の条件セットについての対数希釈度に対する対数ＶＧＣ：ＴＣＧＣ比をプロットすることと、
［ｃ］共通の傾きを用いて、前記第１及び第２の条件セットのデータポイントを第１及び第２の条件の線にフィットさせることと、
［ｄ］前記第２の条件に対する前記第１の条件の下での感染性を
Figure 2022514112000003
として計算することとを含む、［５６］に記載の方法。
［５８］変動係数（ｃｖ）が、約１００％未満、約５０％未満、または約２５％未満である、［５３］～［５７］のいずれか１つに記載の方法。
［５９］核酸組成物中の前記ＶＧＣ及びＴＣＧＣがポリメラーゼ連鎖反応によって決定される、［５３］～［５８］のいずれか１つに記載の方法。
［６０］前記ポリメラーゼ連鎖反応が定量的ポリメラーゼ連鎖反応である、［５９］に記載の方法。
［６１］前記ポリメラーゼ連鎖反応がデジタルポリメラーゼ連鎖反応である、［５９］に記載の方法。
［６２］前記ウイルス粒子が複製欠損型ウイルスである、［４８］～［６１］のいずれか１つに記載の方法。
［６３］前記複製欠損型ウイルスが、ＡＡＶ、アデノウイルス、ワクシニア、またはレンチウイルスである、［６２］に記載の方法。
［６４］前記複製欠損型ウイルスがレトロウイルスである、［６２］に記載の方法。
［６５］前記複製欠損型ウイルスがＡＡＶである、［６２］に記載の方法。
［６６］前記ＡＡＶが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である、［６５］に記載の方法。
［６７］前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、［６６］に記載の方法。
［６８］前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、［６７］に記載の方法。
［６９］少なくとも１つの条件セットの下での前記標的細胞が、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞を含む、［４８］～［６８］のいずれか１つに記載の方法。
［７０］少なくとも１つの条件セットの下での前記標的細胞がＨｕｈ－７細胞を含む、［２２］または［６９］に記載の方法。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することによって生成される、組成物の感染性を決定する工程を含み、このとき、ｒＡＡＶ粒子を単離するための方法は、１つ以上の処理ステップを含む。いくつかの実施形態において、処理は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、無菌濾過のうちの少なくとも１つである。さらなる実施形態において、処理は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、及び無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを含む。いくつかの実施形態において、処理は、収集した細胞培養物の遠心分離を含まない。
本開示は、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む医薬組成物を生成するための方法であって、不純物を含むフィードから、（ａ）遠心分離、深層濾過、タンジェンシャルフロー濾過、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上によってｒＡＡＶ粒子を単離する工程と、本明細書で開示される方法を用いて当該ｒＡＡＶ粒子の感染性を決定する工程と、当該単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化して医薬組成物を生成する工程とを含む、方法を提供する。
本開示は、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む医薬単位薬用量を生成するための方法であって、不純物を含むフィードから、（ａ）遠心分離、深層濾過、タンジェンシャルフロー濾過、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上によってｒＡＡＶ粒子を単離する工程と、本明細書で開示される方法を用いて当該ｒＡＡＶ粒子の感染性を決定する工程と、当該単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化する工程とを含む、方法を提供する。
本明細書で説明される組成物及び方法のさらなる他の特徴及び利点は、添付の図面と共に読めば、以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。
相対的感染性の方法のワークフロー。 平行線モデルを用いた相対的感染性の計算。
詳細な説明
本明細書では、複製欠損型ウイルス、例えばＡＡＶベクターを含む組成物の感染性を決定するための方法が提供される。本発明者らは、驚くべきことに、本明細書で開示される方法が精度を著しく改善することを見出した。詳細には、本明細書で開示される方法は、感染性を測定するための現在の標準であるＴＣＩＤ５０アッセイを上回る著しい利点を提供する。このような利点としては、精度の改善、再現性の改善、及び少ない試料処理によるより迅速な結果が挙げられる。本明細書で開示される方法は、精度及びスピードが改善されることにより、複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）を含む医薬組成物の開発及び生産での様々な応用例に適したものとなる。例えば、本明細書で開示される方法は、異なる賦形剤を含む及び／または異なる条件下で異なる時間の間保管された多数の試料の感染性を迅速かつ非常に正確に比較することを可能にするため、製剤開発で使用するのに非常に適している。また、本明細書で開示される方法は、例えばロット放出アッセイで、医薬的薬用量の生物学的活性を決定することにも非常に適している。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明される方法は、複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物の感染性のわずかな差異を検出及び定量化することが可能である。いくつかの実施形態において、当該方法は、参照標準物質の希釈系列と平行して、複製欠損型ウイルス試験試料の希釈系列を接着細胞に感染させることを含む。いくつかの実施形態において、希釈系列は、２倍、３倍、または５倍の希釈系列である。感染期間の後は、細胞を洗浄し、収集し、ＰＣＲ（例えば、ｄｄＰＣＲ）に供して細胞内に存在するウイルスベクターＤＮＡを定量化する。各希釈物で回収されたウイルスベクターＤＮＡの量を使用して、参照標準物質に対する試料の感染性を計算する。本明細書で説明される方法は、複製欠損型ウイルスを含む組成物の異なるバッチの感染性を比較するために、そして、分解による感染性の変化を定量化するために使用することができる。また、本明細書で説明される方法は、プロセス及び製剤開発を支持するためのプラットフォーム方法として異なるプロジェクトにわたり、異なるヒト細胞に感染する複製欠損型ウイルスベクターの能力を比較するために、組換え操作されたバリアントにおける感染性の改善を評価するために、ウイルス感染動態を探索するために、またはバリアントの活性（例えば、異なるカプシドを含むバリアントの活性）を評価するために使用することができる。本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルスベクターはＡＡＶである。当業者は、本明細書で説明される方法は、ウイルス組成物による感染性改善のための条件をスクリーニング及び同定するために、例えば、複製欠損ウイルスの組成物による感染に許容的な細胞をスクリーニング及び同定するために使用することができることを理解する。１つの実施形態において、本明細書で説明される方法は、異なる細胞株におけるウイルス調製物の相対的感染性を決定するために使用することができる。１つの実施形態において、本明細書で説明される方法は、遺伝子修飾を含む（例えば、導入遺伝子を含む）細胞株のバリアントに対するウイルス調製物の相対的感染性を決定するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明される方法は、限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６を含めた任意のｒＡＡＶ血清型、ならびにこれらの派生物、修飾物、またはシュードタイプに適している。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ８粒子の感染性を測定するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ８派生物粒子、ｒＡＡＶ８修飾物粒子、またはｒＡＡＶ８シュードタイプ粒子の感染性を測定するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ９粒子の感染性を測定するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ９派生物粒子、ｒＡＡＶ９修飾物粒子、またはｒＡＡＶ９シュードタイプ粒子の感染性を測定するために使用される。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
例えば、組成物中の成分の量、組成物中の成分の濃度、流量、ｒＡＡＶ粒子収量、フィード体積、塩濃度、類似の値、及びこれらの範囲を修飾し、本明細書で提供される方法で用いられる「約」とは、例えば、濃縮物もしくは使用溶液を作製するために使用される典型的な測定及び取扱い手順によって；これらの手順における偶発性のエラーによって；組成物の作製もしくは方法の実行に用いられる製造、供給源、もしくは成分の純度の違いによって；及び類似の考慮事項によって生じ得る、数値的量のバリエーションを意味する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物が老化することによって相違する量も包含する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物を混合または処理することによって相違する量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかにかかわらず、請求項は、その量の等価物を含む。いくつかの実施形態において、「約」という用語は、示された数または範囲よりも約１０～２０％多いまたは少ない範囲を意味する。さらなる実施形態において、「約」とは、示された数または範囲のプラスマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％」は９％～１１％の範囲を示す。
本明細書で使用する場合、「複製欠損型」という用語は、完全かつ有効な複製が不可能なウイルスベクターを意味する。複製欠損型ウイルスは、変異体であるか、またはウイルスゲノムの複製、もしくはウイルス粒子の合成及び集成に不可欠な１つ以上の機能が欠損している。複製欠損型ウイルスは、欠損している遺伝子産物を発現する相補的な細胞株で増殖させることができる。しかし、正常な標的細胞内では、複製欠損型ウイルスはウイルス遺伝子産物を発現することができるが、複製して感染性の後代ウイルス粒子を形成することはない。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルスまたはウイルスベクターは、ウイルスもしくはベクター変異体であるか、またはウイルスゲノム複製に不可欠な１つ以上の機能が欠損している。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルスまたはウイルスベクターは、ウイルスもしくはベクター変異体であるか、またはウイルス粒子の合成及び集成に不可欠な１つ以上の機能が欠損している。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルスまたはウイルスベクターは、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターであり、例えば、レンチウイルスまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルスまたはウイルスベクターは、アデノウイルスもしくはアデノウイルスベクター、ＨＳＶもしくはＨＳＶベクター、またはインフルエンザウイルスもしくはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルスまたはウイルスベクターは、ＡＡＶウイルスまたはウイルスベクターである。複製欠損型ウイルスベクターは、当業者に知られており、例えば、米国特許第７１９８７８４号、第９４０８９０５号、第９８６２９３１号、第８０６７１５６号、米国特許出願公開第２０１５０２９１９３５号、第２０１２０２２０４９２号、第２０１８０２９１３５１号、及び第２０１７０１７５１３７号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている通りである。
「ＡＡＶ」とはアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）の省略形であり、このウイルス自体またはその修飾物、派生物、もしくはシュードタイプを意味するように使用することができる。当該用語は、別段に要求される場合を除いて、全てのサブタイプ、ならびに天然の形態及び組換え形態両方を包含する。省略形「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴ウイルスを意味する。「ＡＡＶ」という用語は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶ、ならびにこれらの修飾物、派生物、またはシュードタイプを含む。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染するＡＡＶを意味し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳類に感染するＡＡＶを意味し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳類に感染するＡＡＶを意味する、などとなる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６の派生物、修飾物、またはシュードタイプである。
ＡＡＶ粒子に適用される「組換え」とは、ＡＡＶ粒子が、本質的にＡＡＶ粒子とは異なるＡＡＶ粒子コンストラクトをもたらす１つ以上の手順の生成物であることを意味する。
組換えアデノ随伴ウイルス粒子「ｒＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に送達させる導入遺伝子）を含むカプシド化ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターとから構成されるウイルス粒子を意味する。ｒＡＡＶ粒子は、任意の修飾物、派生物、またはシュードタイプを含めた任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ１０、またはこれらの派生体／修飾物／シュードタイプ）とすることができる。このようなＡＡＶ血清型及び派生物／修飾物／シュードタイプ、ならびにこのような血清型／派生物／修飾物／シュードタイプを生成する方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照）。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。
本開示のｒＡＡＶ粒子は、任意の血清型、または血清型の任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、もしくはその他のｒＡＡＶ粒子、またはこれらの２つ以上の組合せである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される２つ以上の血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６カプシドタンパク質から選択される２つ以上の血清型の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプからなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプの血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
本明細書で使用する場合、「デジタルＰＣＲ」または「ｄＰＣＲ」という用語は、試料を多数の小さなサブ試料に分割し、次にこれらをそれぞれＰＣＲ増幅反応に供する任意のＰＣＲ法を意味する。ＰＣＲ増幅後、標的特異的ＰＣＲ最終生成物を含むサブ試料（陽性反応）及び標的特異的ＰＣＲ最終生成物を含まないサブ試料（陰性反応）の比率は、個々のサブ試料中に標的特異的ＰＣＲ最終生成物が存在するかまたは存在しないかを検出することによって決定される。出発試料中の標的配列のコピー数及び濃度は、ポアソン分布を考慮して、正及び負のサブ試料反応の比から計算される。デジタルＰＣＲは、従来のＰＣＲとは異なり、最初の試料の標的濃度を決定するために実施される増幅サイクルの数に依存しないため、標的核酸を定量化するために不確実な指数データに依存するのを排除し、絶対的な定量化をもたらす。本明細書で使用する場合、「デジタルドロップレットＰＣＲ」は、最初の試料がいくつかの液滴に再分割されるデジタルＰＣＲ法に関係する。いくつかの実施形態において、デジタルＰＣＲ反応は、１回のｄＰＣＲ反応で複数の標的配列の定量化を可能にするマルチプレックスＰＣＲである。いくつかの実施形態において、ｄＰＣＲ反応は、初期試料がサブ試料を構成するいくつかの液滴に再分割されるデジタルドロップレットＰＣＲ（商標）またはｄｄＰＣＲ（商標）反応である。
「参照標準物質」、「参照標準物質」、「または参照組成物」という表現は、ウイルス粒子を産生するために利用される十分に特徴付けられたベクターの試料を意味し、これらの表現は全体において互換的に使用される。参照標準物質は、臨床的材料を代表するもしくは他の方法で認定されたものであり得、または一貫した方式でウイルス粒子を産生することが特徴付けられている。例えば、参照標準物質は、内部または外部の信頼できる供給源から選択され得る。
本明細書で使用する場合、「精製すること」、「精製」、「分離」、「分離すること」、「分離」、「単離する」、「単離すること」、または「単離」という用語は、ターゲット生成物と１つ以上の不純物とを含む試料からのｒＡＡＶ粒子に対する純度の程度を高めることを意味する。典型的には、ターゲット生成物の純度の程度は、試料から少なくとも１つの不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって高められる。いくつかの実施形態において、試料中のｒＡＡＶの純度の程度は、本明細書で説明される方法を使用することにより、試料から１つ以上の不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって増加する。
本開示及び請求項で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数形を含む。
諸実施形態が「～を含む」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」及び／または「本質的に～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。また、諸実施形態が「本質的に～からなる」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。
「及び／または」という用語は、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの表現で使用される場合、Ａ及びＢの両方、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、ならびにＢ（単独）を含むように意図されている。同様に、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
本開示の実施形態がマルクーシュグループまたはその他の代替のグループに関して説明される場合、本開示の方法は、全体として挙げられたグループ全体を包含するだけでなく、グループの各メンバーも個別に包含し、メイングループの全ての可能なサブグループも包含し、さらにグループメンバーの１つ以上不在のメイングループも包含する。また、本開示の方法は、本開示の方法におけるグループメンバーのいずれかの１つ以上が明示的に除外されることも想定している。
ウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法
いくつかの実施形態において、本開示は、ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、標的細胞へのウイルス粒子の接種を可能にする条件下で当該標的細胞を当該試験組成物及び当該参照組成物に接触させる工程と、細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、当該試験組成物及び参照組成物を接種された当該標的細胞からそれぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、当該試験核酸試料及び当該参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と、を含む、方法を提供する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、試験または参照組成物中のウイルス粒子が標的細胞に感染した結果、標的細胞にウイルスゲノムが導入される。接種後に細胞外のウイルス粒子を除去することで、感染によって標的細胞に導入されなかったウイルスゲノムが除去される。いくつかの実施形態において、標的細胞は、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物と接触される。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または８倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍未満の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍～１０倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子の存在下で約５分から約３日の間にわたって標的細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、核酸試料中のＶＧＣ及びＴＣＧＣは、ポリメラーゼ連鎖反応によって、任意選択でデジタルポリメラーゼ連鎖反応によって、決定される。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、平行線モデルを用いて参照試料に対する試験試料の感染性を計算する工程を含む。平行線法は、１つ以上の試験物質をその相対的力価に基づいて参照物質と比較するためのロバストな生物統計学的解析法である（Ｆｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｇｒｉｆｆｉｎ ＆ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．１９５２）；Ｗａｒｄｌａｗ，Ａ．Ｃ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ ２１０（Ｗｉｌｅｙ １９８６）（２０００））。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は複製欠損型ウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子はＡＡＶ粒子、例えば組換えＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．ｅＢ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞はＨｕｈ－７細胞である。
いくつかの実施形態において、本開示は、ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、当該試験組成物及び参照組成物の系列希釈物を調製する工程と、標的細胞へのウイルス粒子の接種を可能にする条件下で当該標的細胞を当該試験組成物及び当該参照組成物に接触させる工程と、細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、当該試験組成物及び参照組成物を接種された当該標的細胞からそれぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、当該試験核酸試料及び当該参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または８倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍未満の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍～１０倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子の存在下で約５分から約３日の間にわたって標的細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、核酸試料中のＶＧＣ及びＴＣＧＣは、ポリメラーゼ連鎖反応によって、任意選択でデジタルポリメラーゼ連鎖反応によって、決定される。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、平行線モデルを用いて参照試料に対する試験試料の感染性を計算する工程を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は複製欠損型ウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子はＡＡＶ粒子、例えば組換えＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞はＨｕｈ－７細胞である。
いくつかの実施形態において、参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための本明細書で開示される方法は、標的細胞に別々に当該試験組成物及び参照組成物を接種する工程と、接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、当該試験組成物及び参照組成物を接種された当該標的細胞からそれぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、当該試験核酸試料及び当該参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程とを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物と接触される。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または８倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍未満の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍～１０倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子の存在下で約５分から約３日の間にわたって標的細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、核酸試料中のＶＧＣ及びＴＣＧＣは、ポリメラーゼ連鎖反応によって、任意選択でデジタルポリメラーゼ連鎖反応によって、決定される。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、平行線モデルを用いて参照試料に対する試験試料の感染性を計算する工程を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は複製欠損型ウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子はＡＡＶ粒子、例えば組換えＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞はＨｕｈ－７細胞である。
いくつかの実施形態において、参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための本明細書で開示される方法は、当該試験組成物及び参照組成物の系列希釈物を調製する工程と、標的細胞に当該試験組成物及び参照組成物の当該系列希釈物を接種する工程と、接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、当該試験組成物及び参照組成物を接種された当該標的細胞からそれぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、当該試験核酸試料及び当該参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と、を含む。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または８倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍未満の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍～１０倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子の存在下で約５分から約３日の間にわたって標的細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、核酸試料中のＶＧＣ及びＴＣＧＣは、ポリメラーゼ連鎖反応によって、任意選択でデジタルポリメラーゼ連鎖反応によって、決定される。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、平行線モデルを用いて参照試料に対する試験試料の感染性を計算する工程を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は複製欠損型ウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子はＡＡＶ粒子、例えば組換えＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞はＨｕｈ－７細胞である。
本明細書で開示される方法は、複製欠損型ウイルス粒子を含む試験試料の相対的感染性を決定するために使用することができる。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子は、ＡＡＶ、アデノウイルス、ワクシニア、またはレンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子はレトロウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子はＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子は組換えＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子は、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子である。
いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物は、遺伝子的に同一の単離されたウイルス粒子を含む。遺伝子的に同一の単離されたウイルス粒子は、同一または実質的に同一のゲノムと、同一または実質的に同一のウイルスポリペプチドとを含むことを理解されたい。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物は、別々に単離されたまたは単離後に別々に処理された、遺伝子的に同一のウイルス粒子を含む。したがって、当業者は、本開示の方法が、異なるバッチで生成された遺伝子的に同一の単離されたウイルス粒子の感染性を比較するために使用され得ることを理解する。いくつかの実施形態において、遺伝子的に同一の単離されたウイルス粒子の異なるバッチは、同じプロセスを用いて作製されている。いくつかの実施形態において、遺伝子的に同一の単離されたウイルス粒子の異なるバッチは、異なる上流及び／または下流プロセスを用いて作製されている。いくつかの実施形態において、異なる上流プロセスは、異なる宿主細胞、異なる培養基、異なる組織培養プロセス、及び異なる収集プロセスのうちの１つ以上を使用している。いくつかの実施形態において、異なる下流プロセスは、異なる精製ステップ、異なる緩衝液、異なる処理温度、異なる製剤緩衝液、及び異なる保管温度のうちの１つ以上を使用している。いくつかの実施形態において、遺伝子的に同一の単離されたウイルス粒子の異なるバッチは、異なる時間期間の間保管されている。
いくつかの実施形態において、試験組成物中及び参照組成物中に含まれるウイルス粒子は、遺伝子的に同一ではない。いくつかの実施形態において、試験ウイルス粒子及び参照ウイルス粒子は異なるゲノムを含む。いくつかの実施形態において、試験ウイルス粒子及び参照ウイルス粒子は異なるウイルスポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、試験ウイルス粒子及び参照ウイルス粒子は、異なるアミノ酸配列を有する１つ以上のカプシドポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物は、遺伝子的に同一のｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質を含む遺伝子的に同一のｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質またはＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む遺伝子的に同一のｒＡＡＶ粒子を含む。
本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物は、標的細胞をウイルス粒子に接触させる前に、希釈される。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物は、標的細胞をウイルス粒子に接触させる前に、系列希釈される。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物は、同じ希釈係数を用いて系列希釈される。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物は、１０未満の希釈係数で系列希釈される。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物は、希釈係数１．５、２、３、４、５、６、７、８、または９で系列希釈される。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物は、希釈係数２で系列希釈される。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、または９倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は２倍である。
本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、少なくとも２種類の希釈物、少なくとも３種類の希釈物、少なくとも５種類の希釈物、または少なくとも１０種類の希釈物を含む。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、２～２０種類の希釈物を含む。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、２～３０種類の希釈物を含む。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、３種類の希釈物、４種類の希釈物、５種類の希釈物、６種類の希釈物、７種類の希釈物、８種類の希釈物、９種類の希釈物、１０種類の希釈物、１５種類の希釈物、または２０種類の希釈物を含む。
当業者は、本明細書で開示される方法が、どのようにウイルス組成物以外の変数が感染プロセスの効力に影響を及ぼすかを決定することにも適していることを理解する。したがって、本明細書では、異なる条件下でのウイルス粒子の組成物の相対的感染性を決定するための方法が提供される。１つの実施形態において、本明細書で開示される方法は、第１及び第２の条件セットの下で、標的細胞にウイルス粒子を含む組成物を接種する工程と、当該接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、当該第１及び第２の条件セットの下で接種された標的細胞から、それぞれ第１及び第２の核酸試料を単離する工程と、当該第１及び第２の核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程とを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の条件セットは、異なる標的細胞を使用する。いくつかの実施形態において、第１及び第２の条件セットは、異なる遺伝子修飾を含む異なる標的細胞を使用する。いくつかの実施形態において、第１及び第２の条件セットは、標的細胞のうちの１つに遺伝子修飾が存在することを除いて同一である異なる標的細胞を使用する。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は導入遺伝子の存在である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の条件セットは、異なる組織タイプを代表する標的細胞を使用する。いくつかの実施形態において、第１及び第２の条件セットは、親細胞株に由来する異なる系統である標的細胞を使用する。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ウイルス組成物の系列希釈物と接触される。いくつかの実施形態において、ウイルス組成物の系列希釈物は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または８倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍未満の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍～１０倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子の存在下で約５分から約３日の間にわたって標的細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、核酸試料中のＶＧＣ及びＴＣＧＣは、ポリメラーゼ連鎖反応によって、任意選択でデジタルポリメラーゼ連鎖反応によって、決定される。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、平行線モデルを用いて参照試料に対する試験試料の感染性を計算する工程を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は複製欠損型ウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子はＡＡＶ粒子、例えば組換えＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、異なる条件のうちの少なくとも１つは、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、及びＡ５４９細胞の群から選択される標的細胞の使用を含む。いくつかの実施形態において、異なる条件のうちの少なくとも１つは、Ｈｕｈ－７細胞を標的細胞として使用することを含む。
当技術分野で、試験試料及び参照試料中のウイルス粒子による感染に感受性であることが知られている任意の細胞または細胞株が、本明細書で説明される方法で用いる標的細胞として機能し得る。いくつかの実施形態において、標的細胞は接着細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は浮遊細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、哺乳類細胞を使用する。いくつかの実施形態において、標的細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞はＨｕｈ－７細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、またはベロ細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、昆虫細胞、例えばＳＦ－９細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ＨＥＫ２９３細胞を使用する。
標的細胞は、当業者に知られている任意の好適な培地中で維持することができる。このような培地としては、限定されるものではないが、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨが生産する培地が挙げられ、これには変法イーグル培地（ＭＥＭ）及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）が含まれる。いくつかの実施形態において、培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＤｙｎａｍｉｓ（商標）培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地、またはＥｘｐｉ２９３（商標）発現培地を含む。いくつかの実施形態において、培地は、Ｄｙｎａｍｉｓ（商標）培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む細胞培養物を使用する。いくつかの実施形態において、培地は、動物成分フリー培地である。いくつかの実施形態において、培地は、血清を含む。いくつかの実施形態において、培地は、ウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態において、培地は、無グルタミン培地である。いくつかの実施形態において、培地は、グルタミンを含む。いくつかの実施形態において、培地には、栄養素、塩、緩衝剤、及び添加物（例えば、消泡剤）のうちの１つ以上が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、グルタミンが補充される。いくつかの実施形態において、培地には、血清が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、ウシ胎児血清が補充される。
本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、標的細胞は血清飢餓細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ウイルス粒子に接触させる前に２４時間血清飢餓状態にする。
本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、標的細胞は、マルチウェルプレート、例えば９６ウェルまたは３８４ウェルプレート内のウイルス粒子に接触させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、９６ウェルプレートで実施される。マルチウェルプレートを使用することで、同じアッセイで同じ接種反応の２連、３連またはさらに多連の使用が可能になることを理解されたい。
本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子が標的細胞に進入するのに適した条件下で、ウイルス粒子の存在下で標的細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子の存在下で約５分から約３日の間にわたって標的細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子の存在下で約１２時間から約３６時間の間にわたって標的細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子の存在下で約１８時間から約３０時間の間にわたって標的細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子の存在下で約１時間、約２時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、または約３６時間にわたって標的細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子の存在下で約１日、約１．５日、または約２日間にわたって標的細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞に接種する工程は、ウイルス粒子の存在下で約２４時間にわたって標的細胞をインキュベートすることを含む。
本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程は、接種された標的細胞を溶解せずに細胞外のウイルス粒子を除去するのに適した任意の緩衝液に、細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、リン酸緩衝食塩水、またはダルベッコリン酸緩衝食塩水で洗浄される。
当業者に知られている任意の方法を使用して、接種された細胞から核酸試料を単離することができる。いくつかの実施形態において、核酸試料は、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）を処理するのに適した市販のシステム及び試薬を用いて単離される。好適なシステム及び試薬としては、Ｅｘｔｒａｃｔａ（商標）ＤＮＡ Ｐｒｅｐ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ ９６ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、及びＧｅｎＥｌｕｔｅ ９６ Ｗｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔが挙げられる。
いくつかの実施形態において、核酸試料はＤＮＡ試料である。いくつかの実施形態において、核酸試料はＲＮＡ試料である。
当業者に知られている任意の方法を使用して、核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定することができる。いくつかの実施形態において、ＶＧＣ：ＴＧＣＧ比は、次世代シークエンシング、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、またはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）によって決定される。いくつかの実施形態において、ＶＧＣ：ＴＧＣＧ比は、ｑＰＣＲによって決定される。いくつかの実施形態において、ＶＧＣ：ＴＧＣＧ比は、ｄＰＣＲによって、例えば液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって決定される。いくつかの実施形態において、ＶＧＣ：ＴＧＣＧ比を決定するために使用されるＰＣＲ（例えば、ｄＰＣＲ）反応は、マルチプレックスＰＣＲ反応である。いくつかの実施形態において、マルチプレックスＰＣＲ（例えば、ｄＰＣＲ）反応は、ウイルスゲノム特異的反応及び標的細胞ゲノム特異的反応を含む。
当業者は、ｑＰＣＲまたはｄＰＣＲを用いて試料中のウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）数または濃度を決定するために、任意のウイルスゲノム特異的配列がＰＣＲによる増幅の標的にされ得ることを理解している。同様に、ｑＰＣＲまたはｄＰＣＲを用いて試料中の標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）数または濃度を決定するために、任意の標的細胞ゲノム特異的配列がＰＣＲによる増幅の標的にされ得る。試料中のウイルスゲノムまたは標的細胞ゲノム特異的配列のコピー数または濃度を決定するための順方向プライマー、逆方向プライマー、プローブの組合せを設計するためのソフトウェアツールは当業者に周知されており、オンラインで、例えば、Ｔａｋａｒａ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、及びＢｉｏＲａｄのウェブサイトで入手可能である。これらのソフトウェアツールはいずれも、本明細書に開示される方法に従って、試料中のウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）及び標的細胞ゲノムコピー数または濃度を決定するためのプライマー及びプローブを設計するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、ウイルスゲノム特異的配列標的は、ウサギベータ－グロビンポリＡエレメントである。いくつかの実施形態において、ウサギベータ－グロビンポリＡエレメント内の標的配列を増幅可能な順方向プライマー及び逆方向プライマーは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２のヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施形態において、ウサギベータ－グロビンポリＡエレメント内の標的配列を検出可能な順方向プライマー、逆方向プライマー、及びプローブは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、及び３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、プローブはさらに、オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合した第１の蛍光標識及び３’末端に共有結合した第２の蛍光標識を含む。いくつかの実施形態において、第１の蛍光標識はＦＡＭであり、第２の蛍光標識はＴＡＭＲＡである。
いくつかの実施形態において、標的細胞ゲノム特異的配列標的は、ヒトアルブミン遺伝子である。いくつかの実施形態において、ヒトアルブミン遺伝子内の標的配列を増幅可能な順方向プライマー及び逆方向プライマーは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び５のヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施形態において、ヒトアルブミン遺伝子内の標的配列を検出可能な順方向プライマー、逆方向プライマー、及びプローブは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５、及び６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、プローブはさらに、オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合した第１の蛍光標識及び３’末端に共有結合した第２の蛍光標識を含む。いくつかの実施形態において、第１の蛍光標識はＦＡＭであり、第２の蛍光標識はＴＡＭＲＡである。
いくつかの実施形態において、本開示は、参照組成物の感染性に対する試験組成物の感染性を決定するための方法であって、試験核酸試料及び参照核酸試料で決定されたウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比から当該参照組成物に対する当該試験組成物の感染性を計算する工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される方法は、平行線モデルを用いて参照組成物に対する試験組成物の感染性を計算する工程を含む。いくつかの実施形態において、参照組成物に対する試験組成物の感染性を計算する工程は、試験組成物及び参照組成物の各希釈度についてＶＧＣ：ＴＣＧＣ比を計算することと、試験組成物及び参照組成物について対数希釈度に対する対数ＶＧＣ：ＴＣＧＣ比をプロットすることと、共通の傾きを用いて、試験組成物及び参照組成物のデータポイントを試験組成物及び参照組成物の直線にフィットさせることと、参照組成物に対する試験組成物の感染性を真数（（切片（試験試料）－切片（参照試料）／共通の傾き）として計算することとを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される相対的感染性を決定するための方法の再現性及び精度は、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイの再現性及び精度よりも高い。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される方法による相対的感染性測定値の変動係数（ｃｖ）は、約１００％未満、約５０％未満、または約２５％未満である。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される方法による相対的感染性測定値の変動係数（ｃｖ）は、約２５％未満である。
いくつかの実施形態において、本開示は、参照組成物の感染性に対する試験組成物の感染性を決定するための方法であって、当該試験組成物及び当該参照組成物が同じ力価を有する、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、参照組成物の感染性に対する試験組成物の感染性を決定するための方法であって、当該試験組成物及び当該参照組成物が異なる力価を有する、方法を提供する。いくつかの実施形態において、力価は、ミリリットル当たりのウイルスゲノムコピー（ＧＣ）として測定される。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物はｒＡＡＶ粒子を含む。
本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ～約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のものである。
本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、少なくとも約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、少なくとも約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、少なくとも約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のものである。
本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ～約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のものである。
本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、少なくとも約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、少なくとも約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、少なくとも約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、参照組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のものである。
本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ～約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のものである。
本明細書で説明される方法のいくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、少なくとも約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、少なくとも約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、少なくとも約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、試験組成物の力価及び参照組成物の力価は、少なくとも約５×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のものである。
本明細書で開示される方法は、任意のＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子の感染性を評価するのに使用することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプのｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質キメラを含むカプシドを含む。
ｒＡＡＶ粒子
提供される方法は、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の生成における使用、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子を含む組成物の生成における使用、または疾患もしくは障害の治療を必要とする対象における当該疾患もしくは障害を治療するための方法であって、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の投与を含む、方法における使用に適している。そのため、ｒＡＡＶは、当技術分野で知られている任意の血清型、修飾物、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含むｒＡＡＶ粒子の集団、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７，ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子のうちの２つ以上を含む集団、あるいはこれらの２つ以上の組合せ）とすることができる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ｒＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８（参照によりその全体が援用される）で説明されているように、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５のカプシドを含む。ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているように、アミノ酸挿入物：ＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰのうちの１つを有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９，４５８，５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が明細書に援用される）で説明されているように、ＡＡＶ．７ｍ８のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，５８５，９７１号で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶＰＨＰ．Ｂを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４－１を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１４／１７２６６９（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ ｒｈ．７４を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０（これらの各々は、参照によりその全体が援用される）で説明されているように、ＡＡＶ２／５のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１７／０７０４９１（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ２ｔＹＦを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．２９（９）：４１８（参照によりその全体が援用される）で説明されているようなＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第８，６２８，９６６号、第ＵＳ８，９２７，５１４号、第ＵＳ９，９２３，１２０号、及びＷＯ２０１６／０４９２３０で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６を含む（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、５～１０を参照）（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下で開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対し、少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、５～１０を参照）。
ＡＡＶベースウイルスベクターの核酸配列、ならびに組換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドを作製する方法は、例えば、以下で教示されている：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号、第ＷＯ２００３／０５２０５１号、第ＷＯ２００５／０３３３２１号、第ＷＯ０３／０４２３９７号、第ＷＯ２００６／０６８８８８号、第ＷＯ２００６／１１０６８９号、第ＷＯ２００９／１０４９６４号、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号。
提供される方法は、導入遺伝子をコードする組換えＡＡＶの生成で使用するのに適している。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は表１Ａ～１Ｃからのものである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復と、（２）調節制御要素、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロンと、（３）導入遺伝子をコードする核酸配列とを含む、ベクターを含む。インタクトなまたは実質的にインタクトなモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現させるための他の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復と、（２）調節制御要素、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロンと、（３）抗体の軽鎖Ｆａｂ及び重鎖Ｆａｂ、または少なくとも重鎖または軽鎖Ｆａｂ、ならびに任意選択で重鎖Ｆｃ領域をコードする核酸配列とを含む、ベクターを含む。インタクトまたは実質的にインタクトなｍＡｂを発現させるためのさらに他の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素を含むベクターを含む：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復；（２）調節制御エレメント、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロン；ならびに（３）以下のものの重鎖Ｆａｂをコードする核酸配列：抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ－６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ－００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ－３０１及びＰＲＸ－００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ及びサリルマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ－５（例えば、メポリズマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７ ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ｐＫａｌ ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デンソマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ＊）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ラムパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）；任意選択で、治療抗体のネイティブ形態と同じアイソタイプのＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧアイソタイプアミノ酸配列ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４、またはこれらの修飾Ｆｃ；ならびに以下のものの軽鎖をコードする核酸配列：抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ－６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５もしくは抗ＥＮＧ（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ－００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ－３０１及びＰＲＸ－００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ及びサリルマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ－５（例えば、メポリズマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７ ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ｐＫａｌ ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デンソマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ラムパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）。このとき、重鎖（Ｆａｂ及び任意選択でＦｃ領域）ならびに軽鎖は、自己切断フリン（Ｆ）／Ｆ２Ａまたはフレキシブルリンカーによって分離され、重鎖及び軽鎖ポリペプチドが等しい量で発現するのを確実にする。
（表１Ａ）
Figure 2022514112000004
Figure 2022514112000005
Figure 2022514112000006
Figure 2022514112000007
（表１Ｂ）
Figure 2022514112000008
Figure 2022514112000009
Figure 2022514112000010
（表１Ｃ）
Figure 2022514112000011
Figure 2022514112000012
いくつかの実施形態において、本明細書では、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。より具体的な実施形態において、本明細書では、ラニビズマブをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＩＤＵＡをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＩＤＳをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＬＤＬＲをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＴＰＰ１をコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｌｔ－１）の非膜結合型スプライスバリアントをコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノスキシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合体をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプＡＡＶカプシドである。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。
ある特定の実施形態において、１本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）を使用することができる。ある特定の実施形態において、自己相補的ベクター、例えばｓｃＡＡＶを使用することができる（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｕｍｂｅｒ １６：１２４８－１２５４；ならびに米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、及び第７，４５６，６８３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照）。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。モザイクＡＡＶ粒子は、ＡＡＶの異なる血清型からのウイルスカプシドタンパク質の混合物から構成される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ならびにＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸ベクターと、（ｂ）ＡＡＶｘ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６）に由来するカプシドタンパク質から構成されるカプシドとを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質から構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質から構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子は、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ粒子である。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。さらなる実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ｒＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。さらなる実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
ｒＡＡＶ粒子を単離するための方法
いくつかの実施形態において、本開示は、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む医薬組成物を生成するための方法であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離する工程と、当該単離されたｒＡＡＶ粒子のゲノム力価を決定する工程と、本明細書で開示される方法を用いて当該単離されたｒＡＡＶ粒子の感染性を決定する工程と、当該単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化して医薬組成物を生成する工程とを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む医薬組成物を生成するための方法は、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離する工程と、本明細書で開示される方法を用いて当該単離されたｒＡＡＶ粒子の感染性を決定する工程と、当該単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化して医薬組成物を生成する工程とを含む。
いくつかの実施形態において、本開示はさらに、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む医薬的単位薬用量を生成するための方法であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離する工程と、当該単離されたｒＡＡＶ粒子のゲノム力価を決定する工程と、本明細書で開示される方法を用いて当該単離されたｒＡＡＶ粒子の感染性を決定する工程と、当該単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化する工程とを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む医薬的単位薬用量を生成するための方法は、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離する工程と、本明細書で開示される方法を用いて当該単離されたｒＡＡＶ粒子の感染性を決定する工程と、当該単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化する工程とを含む。
単離されたｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で知られている方法を用いて単離することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、下流処理、例えば、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、無菌濾過、またはこれらの任意の組合せ（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法にしたがって生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
ｒＡＡＶ粒子の生成方法については、形質移入、安定細胞株生成、及び感染性ハイブリッドウイルス生成系（アデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド、及びバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む）を含めた多数の方法が当技術分野で知られている。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためのｒＡＡＶ生成培養物はいずれも、（１）好適な宿主細胞（バキュロウイルス系の場合では、例えば、ヒト由来細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞及びその派生物（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））、哺乳類細胞株（例えば、ベロ）、または昆虫由来細胞株（例えば、ＳＦ－９）を含む）；（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；（３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；（４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）；ならびに（５）ｒＡＡＶ生成を支持するための好適な培地及び培地構成成分を必要とする。当技術分野で知られている好適な培地をｒＡＡＶベクターの生成に使用することができる。このような培地としては、限定されるものではないが、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び米国特許第６，７２３，５５１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているようなＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含めたＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨが生産する培地が挙げられる。
ｒＡＡＶ生成培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適した様々な条件下で（広い温度範囲にわたり、様々な長さの時間で、など）ルーチン的に成長させることができる。当技術分野で知られているように、ｒＡＡＶ生成培養物は、好適な付着依存性容器（例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリア、及び充填床または流動床バイオリアクター）中で培養することができる付着依存性の培養物を含む。また、ｒＡＡＶベクター生成培養物は、浮遊適応性の宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞も含むことができ、これらは、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、及びＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含めた様々な方法で培養することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞である。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、高密度細胞培養物を含む。いくつかの実施形態において、培養物は、約１×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌ～約３０×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌの総細胞密度を有する。いくつかの実施形態において、細胞の約５０％超が生細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、またはＳＦ－９細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞である。
提供される方法の追加の実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、ｒＡＡＶ粒子を含む浮遊培養物を含む。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、哺乳類細胞または昆虫細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨＥＫ２９３細胞の培養物を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の生成のための方法は、ｒＡＡＶを生成可能な細胞を含む細胞培養物を準備することと、当該細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を添加することと、当該ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを包含する。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸またはその塩を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）、プロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）、またはこれらの組合せを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２０１９年８月９日に出願された“ＳＣＡＬＡＢＬＥ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＡＡＶ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ”という表題の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／４５９２６号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているように生成される。
組換えＡＡＶ粒子は、インタクトな宿主細胞から培地中へのｒＡＡＶ粒子放出を引き起こすことが当技術分野で知られている条件下で細胞が培養されることを条件に、宿主細胞を含む生成培養物を収集することにより、または生成培養物から消費培地を収集することにより、ｒＡＡＶ生成培養物から収集することができる。また、組換えＡＡＶ粒子は、生成培養物の宿主細胞を溶解することによってｒＡＡＶ生成培養物から収集することもできる。細胞を溶解する好適な方法も当技術分野で知られており、例えば、複数の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流動化、ならびに化学物質（例えば、界面活性剤及び／またはプロテアーゼ）による処理が挙げられる。
収集時に、ｒＡＡＶ生成培養物は、以下：（１）宿主細胞タンパク質；（２）宿主細胞ＤＮＡ；（３）プラスミドＤＮＡ；（４）ヘルパーウイルス；（５）ヘルパーウイルスタンパク質；（６）ヘルパーウイルスＤＮＡ；ならびに（７）培地構成成分（例えば、血清タンパク質、アミノ酸、トランスフェリン、及び他の低分子量タンパク質を含む）のうちの１つ以上を含むことができる。ｒＡＡＶ生成培養物はさらに、生成物関連不純物、例えば、不活性なベクター形態、空のウイルスカプシド、凝集したウイルス粒子またはカプシド、ミスフォールドしたウイルスカプシド、分解されたウイルス粒子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、宿主細胞デブリを除去するように清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、一連の深層フィルターによる濾過によって清澄化される。また、清澄化は、当技術分野で知られている他の様々な標準的技法により、例えば、遠心分離、または当技術分野で知られている０．２ｍｍ以上の細孔サイズの任意の酢酸セルロースフィルターによる濾過により、達成することができる。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、遠心分離によって清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物の清澄化は、遠心分離を含まない。
いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、濾過を用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、深層濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化はさらに、深層濾過及び無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、１つ以上の異なる濾過媒体を含むフィルタートレインを用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つ以上の深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体及び１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、深層フィルター媒体は、多孔質深層フィルターである。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及び無菌グレード濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及びＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、深層フィルターに接触させる前に前処理される。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物に塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物に化学凝集剤を添加することを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、深層フィルターに接触させる前に前処理されない。
いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、２０１９年４月２７日に出願された“ＳＣＡＬＡＢＬＥ ＣＬＡＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＡＡＶ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ”という表題のＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２９５３９号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている濾過によって清澄化される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、生成培養物中に存在する高分子量ＤＮＡを消化するようにヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））またはエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のエンドヌクレアーゼ）で処理される。ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ消化は、当技術分野で知られている標準的な条件下でルーチン的に実施することができる。例えば、ヌクレアーゼ消化は、周囲温度から３７℃までの範囲の温度の最終濃度１～２．５単位／ｍｌのベンゾナーゼ（登録商標）で、３０分～数時間の間実施される。
無菌濾過は、無菌グレードフィルター媒体を用いた濾過を包含する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．８μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、１．２μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。さらなる実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ（商標）ＰＶＤＦ膜０．４５μｍ、またはＳａｒｔｏｇｕａｒｄ（登録商標）ＰＥＳ １．２μｍ＋０．２μｍの名目孔径の組合せである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍである。
いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、クロマトグラフィー媒体、例えば、アフィニティークロマトグラフィー媒体に適用される前に、タンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）を介して濃縮される。ＴＦＦ限外濾過を用いたウイルスの大規模用濃度は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）で説明されている。清澄化フィードのＴＦＦ濃度により、技術的に管理可能な量の清澄化フィードをクロマトグラフィーにかけることが可能になり、また、長い再循環時間を必要とせずにカラムをより合理的にサイジングすることが可能になる。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２倍から少なくとも１０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも１０倍から少なくとも２０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２０倍から少なくとも５０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、約２０倍に濃縮される。また、当業者は、透析濾過を介して清澄化されたフィードから小分子不純物（例えば、培地成分、血清アルブミン、または他の血清タンパク質を含む細胞培養不純物）を除去するためにＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、小分子不純物を除去するために透析濾過に供される。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約３から約１０の間の透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約５透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。また、当業者は、精製処理における次のステップを実施する前に緩衝液の交換が望ましい場合における精製プロセスの任意のステップでＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される清澄化されたフィードからｒＡＡＶを単離するための方法は、緩衝液を交換するためのＴＦＦの使用を含む。
アフィニティークロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、タンジェンシャルフロー濾過に供されて清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。好適なアフィニティークロマトグラフィー媒体は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂、及びＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂が挙げられる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂である。
アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーは、最終濃縮及び研磨ステップとしてアフィニティークロマトグラフィーの後に使用される。好適なアニオン交換クロマトグラフィー媒体は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＮ－荷電アミノもしくはイミノ樹脂、例えば、ＰＯＲＯＳ ５０ ＰＩ、または任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、３級もしくは４級アミン、または当技術分野で知られているＰＥＩベース樹脂が挙げられる（米国特許第６，９８９，２６４号；Ｂｒｕｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ６（５）：６７８－６８６（２００２）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：２０７９－２０９１（２０００））。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アミンを含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換媒体は、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー樹脂である。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートポリマーまたはスチレン－ジビニルベンゼンポリマーを含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＤＥＡＥ－１アドバンストコンポジットカラム（ジエチルアミノ）、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）、ＣＩＭ（登録商標）ＤＥＡＥ、及びＣＩＭ（登録商標）ＥＤＡディスク（エチレンジアミノ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）である。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ ＱＡ（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｓｌｏｖｅｎｉａ）である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＢＩＡ ＣＩＭ（登録商標）ＱＡ－８０（カラム体積８０ｍＬ）である。当業者は、ｒＡＡＶが樹脂との結合を保ちながら不純物（限定されるものではないが、上流精製ステップによって導入され得る不純物を含む）が除去されるように、好適なイオン強度の洗浄緩衝液が特定され得ることを理解することができる。
いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーは、２０１９年６月１３日に出願された“Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”という表題の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３７０１３号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている方法に従って実施される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物中のベクターゲノム力価、カプシド力価、及び／または完全なカプシド：空のキャプシドの比を決定することを含む。いくつかの実施形態において、ベクターゲノム力価は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）またはドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって決定される。いくつかの実施形態において、カプシド力価は、血清型特異的ＥＬＩＳＡによって決定される。いくつかの実施形態において、完全なカプシド：空のカプシドの比は、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）または透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって決定される。
いくつかの実施形態において、ベクターゲノム力価、カプシド力価、及び／または完全なカプシド：空のカプシドの比は、分光測光法により、例えば、２６０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定することにより、及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定することにより、決定される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の吸光度を測定する前に変性されない。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の吸光度を測定する前に変性される。いくつかの実施形態において、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度は、分光光度計を用いて決定される。いくつかの実施形態において、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度は、ＨＰＬＣを用いて決定される。いくつかの実施形態において、吸光度はピーク吸光度である。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定するためのいくつかの方法が、当技術分野で知られている。単離された組換えｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価及びカプシド力価を決定する方法は、２０１９年４月２７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／２９５４０号（表題：“Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｉｅｓ ａｎｄ ｆｕｌｌ／ｅｍｐｔｙ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”）で開示されており、当該出願の全体が参照により本明細書に援用される。
追加の実施形態において、本開示は、本明細書で開示される方法に従って生成された、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される」という用語は、１つ以上の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏ送達または接触に適した、生物学的に許容される製剤、気体、液体、もしくは固体、またはこれらの混合物を意味する。「医薬的に許容される」組成物は、生物学的または他の点で望ましくないものではない材料であり、例えば、この材料は、実質的な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与することができる。したがって、このような医薬組成物は、例えば、本開示の方法に従って単離されたｒＡＡＶを対象に投与する際に使用することができる。このような組成物としては、医薬投与またはｉｎ ｖｉｖｏでの接触または送達と適合性である、溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、エマルジョン（例えば、水中油または油中水）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散及び懸濁媒体、コーティング、等張性及び吸収の促進剤または遅延剤が挙げられる。水性及び非水性の溶媒、溶液、及び懸濁液は、懸濁剤及び増粘剤を含むことができる。このような医薬的に許容される担体としては、錠剤（コーティングされたまたはコーティングされていない）、カプセル（ハードまたはソフト）、マイクロビーズ、粉末、顆粒、及び結晶が挙げられる。補足活性化合物（例えば、防腐剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、及び抗真菌剤）も、組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、本明細書で記載のように、または当業者に知られているように、特定の投与経路または送達経路と適合性であるように製剤化することができる。したがって、医薬組成物には、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、または賦形剤が含まれる。本発明のｒＡＡＶ粒子ならびに方法及び使用に適切な医薬組成物及び送達系は、当技術分野で知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）２０ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（１９９３），Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ ａｎｄ Ｓｔｏｋｌｏｓａ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （１９８０），Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２５３－３１５を参照）。
いくつかの実施形態において、組成物は、医薬単位用量である。「単位用量」とは、治療される対象のための単位薬用量として適した物理的に別々の単位を意味する。各単位は、任意選択で医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル、または充填剤）と共に所定の量を含み、１回以上の用量で投与されたときに所望の効果（例えば、予防または治療効果）をもたらすように計算される。単位剤形は、例えば、アンプル及びバイアル内にあってもよく、これらは液体組成物、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥状態の組成物を含むことができ、例えば、無菌液体担体をｉｎ ｖｉｖｏでの投与または送達の前に添加してもよい。個々の単位剤形は、多回用量キットまたは容器に含めることができる。組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）配列、プラスミド、ベクターゲノム、及び組換えウイルス粒子、ならびにこれらの医薬組成物は、投与を容易にし、薬用量を均一にするために、単一または複数の単位用量形態でパッケージ化することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ９である。
ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態において、本開示は単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される単離されたポリヌクレオチドは、ウサギベータ－グロビンポリＡエレメントを含む組換えウイルスまたはウイルスベクターのゲノムコピー数を検出または決定するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される単離されたポリヌクレオチドは、ヒトアルブミン遺伝子を含むヒト標的細胞のゲノムコピー数を検出または決定するのに有用である。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される単離されたポリヌクレオチドは、０、１、２、３、４、または５つの置換を含む、以下のヌクレオチド配列：
Figure 2022514112000013
を含む約１５～約４０個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される単離されたポリヌクレオチドは、約１５～約４０個のヌクレオチドを有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～６のうちの１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～６のうちの１つのヌクレオチド配列からなる。
いくつかの実施形態において、本開示は、（ｉ）本明細書で説明されるポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ポリヌクレオチドに共有結合している検出可能な標識とを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は蛍光標識である。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、及びＲＯＸのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～６のうちの１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、順方向プライマー及び逆方向プライマーの対であって、当該順方向プライマー及び逆方向プライマーがそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２のポリヌクレオチド配列を含む、対を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、順方向プライマー及び逆方向プライマーの対であって、当該順方向プライマー及び逆方向プライマーがそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び５のポリヌクレオチド配列を含む、対を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、プローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せであって、当該順方向プライマー、逆方向プライマー、及びプローブが、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、及び３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む、組合せを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、プローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せであって、当該順方向プライマー、逆方向プライマー、及びプローブが、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５、及び６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む、組合せを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明される単離されたオリゴヌクレオチドはプローブであり、このとき、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び６から選択されるヌクレオチド配列からなる。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるプローブは検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、ポリヌクレオチドに共有結合することができる。検出可能な標識は、蛍光標識、例えば、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、及びＲＯＸとすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるプローブは、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、及びＲＯＸからなる群より選択される１つ以上の共有結合した蛍光標識を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるプローブは、５’末端に共有結合した第１の蛍光標識及び３’末端に共有結合した第２の蛍光標識を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるプローブは、蛍光レポーター及び消光色素を含む二重標識プローブである。いくつかの実施形態において、消光剤は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介してレポーターによって蛍光を消光可能である。いくつかの実施形態において、消光剤は、静的消光を介してレポーターによって蛍光を消光可能である。いくつかの実施形態において、蛍光レポーターは、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、及びＲＯＸからなる群より選択され、消光剤はＴＡＭＲＡである。
本明細書では、ウサギベータ－グロビンポリＡエレメントまたはヒトアルブミン遺伝子内の標的配列を増幅可能な順方向プライマー及び逆方向プライマーの組合せが提供される。いくつかの実施形態において、ウサギベータ－グロビンポリＡエレメント内の標的配列を増幅可能な順方向プライマー及び逆方向プライマーは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２のヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施形態において、ヒトアルブミン遺伝子内の標的配列を増幅可能な順方向プライマー及び逆方向プライマーは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び５のヌクレオチド配列からなる。
本明細書では、ｑＰＣＲまたはｄＰＣＲ反応でウサギベータ－グロビンポリＡエレメントまたはヒトアルブミン遺伝子内の標的配列を検出可能なプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せが提供される。いくつかの実施形態において、ウサギベータ－グロビンポリＡエレメント内の標的配列を検出可能な順方向プライマー、逆方向プライマー、及びプローブは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、及び３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ヒトアルブミン遺伝子内の標的配列を検出可能な順方向プライマー、逆方向プライマー、及びプローブは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５、及び６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、プローブはさらに、オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合した第１の蛍光標識及び３’末端に共有結合した第２の蛍光標識を含む。いくつかの実施形態において、第１の蛍光標識はＦＡＭであり、第２の蛍光標識はＴＡＭＲＡである。
いくつかの実施形態において、本開示は、目的ポリヌクレオチドを生成する方法であって、本明細書で説明される順方向プライマー及び逆方向プライマーの対を用いて、生物学的試料からのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応に供する工程を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、目的ポリヌクレオチドを生成する方法であって、本明細書で説明されるプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せを用いて、生物学的試料からのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応に供する工程を含む、方法を提供する。
キット
いくつかの実施形態において、本開示は、試料中のｒＡＡＶを検出するためのキットであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３からなる群より選択される１つ以上のポリヌクレオチドを含む、キットを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、試料中のｒＡＡＶを検出するためのキットであって、本明細書で説明される順方向プライマー及び逆方向プライマーの対を含む、キットを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、試料中のｒＡＡＶを検出するためのキットであって、本明細書で説明されるプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せを含む、キットを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、参照組成物の感染性に対するｒＡＡＶ試験組成物の感染性を決定するためのキットであって、本明細書で説明されるプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せを含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、キットはさらに、ｒＡＡＶ参照組成物を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、異なる条件下でのウイルス粒子の組成物の相対的感染性を決定するためのキットであって、本明細書で説明されるプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せを含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、キットはさらに、ｒＡＡＶ参照組成物を含む。
実施例１．相対的感染性はｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶベクターの感染性の差を定量化するための信頼できる方法である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ感染性を測定する方法は、ＡＡＶ遺伝子療法製品の製品適合性、比較性、及び安定性を支持するために依拠されている。ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイは、ＡＡＶウイルスベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ感染性の測定に最も一般的に使用されている方法の１つであるが、アッセイ変動性が非常に大きいという難点がある。例えば、ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイを用いたｒＡＡＶ２及びｒＡＡＶ９の参照標準物質の感染性測定値は、それぞれ１９１％の幾何ＣＶ（ＳＤ＝０．４６ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬ）及び２０９％幾何ＣＶ（ＳＤ＝０．４９ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬ）となった。アッセイの変動性が大きければ、ＴＣＩＤ５０は、異なるベクター調製物間の感染性の差、または分解の結果としての感染性の変化を測定する上で信頼できないツールとなる。
ＡＡＶベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ感染性のわずかな差異を検出及び定量化することが可能な相対的感染性の方法が開発された。この方法の概略図を図１及び図２に示す。正確な相対的感染性の測定値を提供するには、試験試料及び参照標準物質におけるベクターゲノム濃度を正確に定量化することが重要である。また、既知の生物学的活性または感染性を有する十分に特徴付けられた参照標準物質を使用することも重要である。
簡潔に述べると、１日目に、２つの９６ウェルＥｄｇｅプレートに４０，０００～５０，０００細胞／ウェルのＨｕＨ－７細胞を播種した。２日目に、細胞を一晩血清飢餓状態にした。３日目に、０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含む培地で試験試料及び参照標準物質の系列希釈物を２連で調製し、希釈した試験試料及び参照標準物質を細胞に移し、３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。４日目に、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ウェルをＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）（タンパク質分解酵素及びコラーゲン分解酵素の細胞剥離溶液）で処理し、細胞をペレット化し、細胞ペレットからＤＮＡを抽出した。マルチプレックスｄｄＰＣＲ反応をセットアップして、ＤＮＡ試料中のウイルスゲノムコピー数及び標的細胞ゲノムコピー数を決定した。ウサギグロビンポリＡ特異的プライマー／プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３）を使用してウイルスゲノムコピー数を決定した。ヒトアルブミン特異的プライマー／プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６）を使用して標的細胞ゲノムコピー数を決定した。図２に示すように、平行線モデルを用いて相対的感染性を決定した。
アッセイの線形性、正確性、及び精度を評価するため、１００％のｒＡＡＶ粒子を含む出発組成物を参照物質として用いて、２００％、１５０％、１２５％、１００％、７５％、または５０％のｒＡＡＶ８粒子を含む試験組成物の相対的感染性を測定した。以下に示す結果は、９回の異なる実行にわたって収集したものである（Ｎ＝２０）。
Figure 2022514112000014
強制分解後の相対的感染性の比較６０℃で１０分間インキュベートしたｒＡＡＶ試料の相対的感染性を測定した。未処置試料（－８０℃で保管）の相対的感染性も対照として測定した。６０℃でインキュベートした試料において観察された相対的感染性は３７５％（標準誤差４２％）であった。未処置対照の相対的感染性は９９％（標準誤差６％）であった。したがって、本明細書で説明される相対的感染性の方法は、強制分解時の感染性の変化を検出可能である。相対的感染性は、凝集によるＧＣ含有粒子の取り込みの増加により、増加したと考えられる。
異なるｒＡＡＶベクター間の相対的感染性の比較。異なるペイロードを含むＡＡＶ９及びＡＡＶ８ベクターの相対的感染性を測定した。得られた結果を以下に示す。異なる組換えベクターに対し異なるｄｄＰＣＲ法を使用した。
Figure 2022514112000015
複数のバッチにおける相対的感染性の比較。同じ組換えＡＡＶ８ベクターの複数のバッチの相対的感染性を測定した。得られた結果を以下に示す。
Figure 2022514112000016
本明細書で説明されるｉｎ ｖｉｔｒｏの相対的感染性の方法は、ＡＡＶベクターの感染性のわずかな差異を検出可能である。相対的感染性の方法は、５０～２００％の相対的感染性から線形性、正確、かつ精密である。相対的感染性の方法は、５０～２００％の相対的感染性から線形性、正確、かつ精密である。また、相対的感染性の方法により、異なる調製物、生成物、及びＡＡＶカプシド血清型における感染性を比較するための有用なツールがもたらされる。
実施例２．ｉｎ ｖｉｔｒｏで異なる細胞に感染するＡＡＶベクターの能力の比較。
本明細書で開示されるｉｎ ｖｉｔｒｏ相対的感染性を測定する方法は、ウイルス感染に許容的な細胞のスクリーニング及び同定、ならびにウイルス感染に対する細胞の感受性を調節する因子の同定にも有用である。１つの実施形態において、ウイルス感染に許容的な細胞及び条件をスクリーニングまたは同定するために、既知の生物学的活性または感染性を有する単一のＡＡＶベクターまたは参照標準物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ相対的感染性が、本明細書に開示される方法を用いて異なる細胞基質上で平行して測定される。
ヒト接着ＨＥＫ２９３細胞株の異なるバリアントの比較。１日目に、９６ウェルのＥｄｇｅプレートに、３０，０００細胞／ウェルのヒト接着ＨＥＫ２９３細胞株の異なるバリアントを播種した。２日目に、細胞を一晩血清飢餓状態にした。３日目に、０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含む培地で単一のＡＡＶ８ベクター参照標準物質の系列希釈物を２連で調製し、希釈した参照標準物質を細胞に移し、３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。４日目に、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ウェルをＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）（タンパク質分解酵素及びコラーゲン分解酵素の細胞剥離溶液）で処理し、細胞をペレット化し、細胞ペレットからＤＮＡを抽出した。マルチプレックスｄｄＰＣＲ反応をセットアップして、ＤＮＡ試料中のウイルスゲノムコピー数及び標的細胞ゲノムコピー数を決定した。ウサギグロビンポリＡ特異的プライマー／プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３）を使用してウイルスゲノムコピー数を決定した。ヒトアルブミン特異的プライマー／プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６）を使用して標的細胞ゲノムコピー数を決定した。図２に示すように、平行線モデルを用いて相対的感染性を決定した。得られた結果を以下に示す。
Figure 2022514112000017
この結果は、相対的感染性の方法により、ウイルス感染に対する細胞の感受性を調節する細胞修飾及び因子を同定するための有用なツールがもたらされることを実証するものである。
本開示の方法は、現在最も実用的で好ましい実施形態であると考えられるものと共に説明してきたが、本開示に包含される方法は、開示された実施形態に限定されるべきではなく、逆に、添付の請求項の趣旨及び範囲に含まれる様々な変更及び同等のアレンジを網羅するように意図されていることを理解されたい。
本明細書で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、及びアクセッション番号／データベースの配列（ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の両方を含む）は、各々の個別の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号／データベースの配列が、具体的かつ個別に参照によって援用されるのと同程度に、あらゆる目的において、参照によりこれらの全体が本明細書に援用される。

Claims (70)

  1. ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、
    a.標的細胞に前記試験組成物及び参照組成物を別々に接種する工程と、
    b.前記接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、
    c.前記試験組成物及び参照組成物を接種された前記標的細胞から、それぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、
    d.前記試験核酸試料及び前記参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と
    を含む、前記方法。
  2. ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、
    a.前記試験組成物及び参照組成物の系列希釈物を調製する工程と、
    b.標的細胞に前記試験組成物及び参照組成物の前記系列希釈物を別々に接種する工程と、
    c.前記接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、
    d.前記試験組成物及び参照組成物を接種された前記標的細胞から、それぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、
    e.前記試験核酸試料及び前記参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と
    を含む、前記方法。
  3. 前記系列希釈物が、１０倍未満の希釈物である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記系列希釈物が、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または８倍の希釈物である、請求項２に記載の方法。
  5. 前記系列希釈物が、２倍の希釈物である、請求項２に記載の方法。
  6. 前記系列希釈物が、少なくとも２種類の希釈物、少なくとも３種類の希釈物、少なくとも５種類の希釈物、または少なくとも１０種類の希釈物を含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記系列希釈物が、２～２０種類の希釈物を含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 平行線モデルを用いて、前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を計算する工程をさらに含む、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を計算する前記工程が、
    a.試験組成物及び参照組成物の各希釈度についてのＶＧＣ：ＴＣＧＣ比を計算することと、
    b.前記試験組成物及び参照組成物についての対数希釈度に対し対数ＶＧＣ：ＴＣＧＣ比をプロットすることと、
    c.共通の傾きを用いて、前記試験組成物及び参照組成物のデータポイントを試験組成物及び参照組成物の線にフィットさせることと、
    d.前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を
    Figure 2022514112000018
    として計算することと
    を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 変動係数（ｃｖ）が、約１００％未満、約５０％未満、または約２５％未満である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 標的細胞に接種する前記工程が、ウイルス粒子の存在下で前記標的細胞を
    a.約５分から約３日の間、
    b.約１２時間から約３６時間の間、
    c.約１８時間から約３０時間の間、
    d.約１時間、約２時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、もしくは約３６時間、
    e.約１日、もしくは約１．５日、もしくは約２日、または
    f.約２４時間
    にわたってインキュベートすることを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 核酸組成物中の前記ＶＧＣ及びＴＣＧＣがポリメラーゼ連鎖反応によって決定される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記ポリメラーゼ連鎖反応が定量的ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ポリメラーゼ連鎖反応がデジタルポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記ウイルス粒子が複製欠損型ウイルスである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記複製欠損型ウイルスが、ＡＡＶ、アデノウイルス、ワクシニア、またはレンチウイルスである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記複製欠損型ウイルスがレトロウイルスである、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記複製欠損型ウイルスがＡＡＶである、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記ＡＡＶが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記標的細胞が、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記標的細胞がＨｕｈ－７細胞である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記試験組成物及び前記参照組成物が同じ力価を有し、前記力価がミリリットル当たりのゲノムコピー（ＧＣ）として測定される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記試験組成物及び前記参照組成物が異なる力価を有し、前記力価がミリリットル当たりのゲノムコピー（ＧＣ）として測定される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記試験組成物の前記力価が、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子である、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
  27. 前記参照組成物の前記力価が、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子である、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. ０、１、２、３、４、または５つの置換を含む、以下のヌクレオチド配列：
    Figure 2022514112000019
    を含む約１５～約４０個のヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレオチド。
  29. 約１５～約４０個のヌクレオチドを有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～６のうちの１つのヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  30. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～６のうちの１つのヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
  31. （ｉ）請求項２８～３０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに共有結合している検出可能な標識とを含む、組成物。
  32. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記検出可能な標識が、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、及びＲＯＸのうちの１つ以上を含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. 順方向プライマー及び逆方向プライマーの対であって、前記順方向プライマー及び逆方向プライマーがそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２のポリヌクレオチド配列を含む、前記対。
  35. 順方向プライマー及び逆方向プライマーの対であって、前記順方向プライマー及び逆方向プライマーがそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び５のポリヌクレオチド配列を含む、前記対。
  36. プローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せであって、前記順方向プライマー、逆方向プライマー、及びプローブが、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、及び３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む、前記組合せ。
  37. プローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せであって、前記順方向プライマー、逆方向プライマー、及びプローブが、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５、及び６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む、前記組合せ。
  38. 目的ポリヌクレオチドを生成する方法であって、請求項３４または３５に記載の順方向プライマー及び逆方向プライマーの対を用いて、生物学的試料からのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応に供する工程を含む、前記方法。
  39. 目的ポリヌクレオチドを生成する方法であって、請求項３６または３７に記載のプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せを用いて、生物学的試料からのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応に供する工程を含む、前記方法。
  40. 試料中のｒＡＡＶを検出するためのキットであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３からなる群より選択される１つ以上のポリヌクレオチドを含む、前記キット。
  41. 試料中のｒＡＡＶを検出するためのキットであって、請求項３４に記載の順方向プライマー及び逆方向プライマーの対を含む、前記キット。
  42. 試料中のｒＡＡＶを検出するためのキットであって、請求項３６に記載のプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せを含む、前記キット。
  43. 参照試料の感染性に対するｒＡＡＶ試験試料の感染性を決定するためのキットであって、請求項３４に記載の順方向プライマー及び逆方向プライマーの対を含む、前記キット。
  44. 請求項３５に記載の順方向プライマー及び逆方向プライマーの対をさらに含む、請求項４３に記載のキット。
  45. 参照組成物の感染性に対するｒＡＡＶ試験組成物の感染性を決定するためのキットであって、請求項３６に記載のプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せを含む、前記キット。
  46. 請求項３７に記載のプローブ、順方向プライマー、及び逆方向プライマーの組合せをさらに含む、請求項４５に記載のキット。
  47. ｒＡＡＶ参照組成物をさらに含む、請求項４０～４６のいずれか１項に記載のキット。
  48. 以下の工程を含む、異なる条件下でのウイルス粒子の組成物の相対的感染性を決定するための方法：
    a.第１及び第２の条件セットの下で、標的細胞にウイルス粒子を含む前記組成物を接種する工程と、
    b.前記接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、
    c.前記第１及び第２の条件セットの下で接種された標的細胞から、それぞれ第１及び第２の核酸試料を単離する工程と、
    d.前記第１及び第２の核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程。
  49. 前記第１及び第２の条件セットが、同じ標的細胞を使用する、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記第１及び第２の条件セットが、異なる標的細胞を使用する、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記異なる標的細胞が、異なる遺伝子修飾を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記異なる標的細胞が、前記標的細胞のうちの１つに遺伝子修飾が存在することを除いて同一である、請求項５０に記載の方法。
  53. 標的細胞に接種する前記工程が、標的細胞に前記組成物の系列希釈物を接種することを含む、請求項４９～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記系列希釈物が、２倍の希釈物である、請求項５３に記載の方法。
  55. 標的細胞に接種する前記工程が、標的細胞に前記組成物の系列希釈物を接種することを含む、請求項５３または請求項５４に記載の方法。
  56. 平行線モデルを用いて、前記第１及び第２の条件セットの下で、前記組成物の相対的感染性を計算する工程をさらに含む、請求項５３～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記第１及び第２の条件セットの下で、前記組成物の相対感染性を計算する前記工程が、
    a.前記第１及び第２の条件セットの各希釈度についてのＶＧＣ：ＴＣＧＣ比を計算することと、
    b.前記第１及び第２の条件セットについての対数希釈度に対し対数ＶＧＣ：ＴＣＧＣ比をプロットすることと、
    c.共通の傾きを用いて、前記第１及び第２の条件セットのデータポイントを第１及び第２の条件の線にフィットさせることと、
    d.前記第２の条件に対する前記第１の条件の下での感染性を
    Figure 2022514112000020
    として計算することと
    を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 変動係数（ｃｖ）が、約１００％未満、約５０％未満、または約２５％未満である、請求項５３～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 核酸組成物中の前記ＶＧＣ及びＴＣＧＣがポリメラーゼ連鎖反応によって決定される、請求項５３～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記ポリメラーゼ連鎖反応が定量的ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記ポリメラーゼ連鎖反応がデジタルポリメラーゼ連鎖反応である、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記ウイルス粒子が複製欠損型ウイルスである、請求項４８～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記複製欠損型ウイルスが、ＡＡＶ、アデノウイルス、ワクシニア、またはレンチウイルスである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記複製欠損型ウイルスがレトロウイルスである、請求項６２に記載の方法。
  65. 前記複製欠損型ウイルスがＡＡＶである、請求項６２に記載の方法。
  66. 前記ＡＡＶが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 少なくとも１つの条件セットの下での前記標的細胞が、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞を含む、請求項４８～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 少なくとも１つの条件セットの下での前記標的細胞がＨｕｈ－７細胞を含む、請求項２２または６９に記載の方法。
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