CN118202060A - 用于重组aav生产的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了编码辅助功能的重组多核苷酸和辅助质粒，其适合用于重组AAV颗粒的生产中。本文还提供了用于产生rAAV颗粒的方法。
Description
技术领域
本公开涉及编码辅助功能的重组多核苷酸以及其在生产重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法中的用途。
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年10月5日提交的美国申请号63/252,585和2022年3月16日提交的美国申请号63/320,335的权益，所述申请各自以引用的方式整体并入本文。
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背景技术
基于重组腺相关病毒(AAV)的载体目前是开发中的使用最广泛的基因治疗产品。rAAV载体***的优选用途部分是由于缺乏与野生型病毒相关联的疾病、AAV转导非***细胞和***细胞的能力以及在临床试验中观察到的所得的长期稳健的转基因表达，并且表明在基因疗法适应症中具有巨大的递送潜力。此外，不同的天然存在的和重组的rAAV载体血清型专门靶向不同的组织、器官和细胞，并且帮助逃避对所述载体的任何预先存在的免疫力，从而扩大了基于AAV的基因疗法的治疗应用。在复制缺陷型病毒(例如，基于AAV的基因疗法)可以更广泛地应用于后期临床阶段和商业用途之前，需要开发用于大规模生产重组病毒颗粒的新方法。
因此，本领域需要提高用于大规模生产rAAV颗粒的方法的生产率和产量。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种分离的重组多核苷酸，其包含以下中的一种或多种：a)编码腺病毒E2A DNA结合蛋白(DBP)的核苷酸序列，其可操作地连接至第一启动子和第一polyA信号；b)编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列，其可操作地连接至第二启动子和第二polyA信号；以及c)编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列，其中所述分离的重组多核苷酸不包含编码腺病毒ITR序列、L3 23K内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒E2ADBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列编码VA RNA I和VA RNA II。
在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒E2ADBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列，其中编码腺病毒E2ADBP的核苷酸序列和编码腺病毒E4 ORF6和ORF7的核苷酸序列处于相反的5’至3’方向。
在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸是包含细菌复制起点和选择性标记基因的质粒。
在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、41、42、43或51具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、41、42、43或51的核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包含本文所述的分离的重组多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞、细胞或PerC6细胞。
在一个方面，本公开提供了一种生产本文所述的分离的重组多核苷酸的方法，其包括在合适的条件下孵育本文所述的宿主细胞。
在一个方面，本公开提供了一种生产重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，其包括培养能够生产rAAV颗粒的细胞，其中所述细胞包含：i)编码AAV衣壳蛋白的多核苷酸；ii)编码功能性rep基因的多核苷酸；iii)包含有包含至少一个AAV反相末端重复序列(ITR)和编码基因产物的非AAV核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非AAV核酸序列可操作地连接至指导基因产物在靶细胞中表达的序列；以及iv)包含足够的辅助功能以允许在允许将基因组包装到AAV衣壳中的条件下将基因组包装到AAV衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸独立地构成本文所述的分离的重组多核苷酸。
在一个方面，本公开提供了一种生产rAAV颗粒的方法，其包括：a)提供包含细胞的细胞培养物；b)将一种或多种多核苷酸引入到细胞中，所述一种或多种多核苷酸包含：i)编码AAV衣壳蛋白的多核苷酸；ii)编码功能性rep基因的多核苷酸；iii)包含有包含至少一个AAV反相末端重复序列(ITR)和编码基因产物的非AAV核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非AAV核酸序列可操作地连接至指导基因产物在靶细胞中表达的序列；以及iv)包含足够的辅助功能以允许在允许将基因组包装到AAV衣壳中的条件下将基因组包装到AAV衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸独立地构成本文所述的分离的重组多核苷酸；以及c)将细胞培养物维持在允许生产rAAV颗粒的条件下。
在一些实施方案中，本公开提供了：
[1.]一种分离的重组多核苷酸，其包含以下中的一种或多种：
a)编码腺病毒E2A DNA结合蛋白(DBP)的核苷酸序列，其可操作地连接至第一启动子和第一polyA信号；
b)编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列，其可操作地连接至第二启动子和第二polyA信号；以及
c)编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列，
其中所述分离的重组多核苷酸不包含编码腺病毒ITR序列、L323K内切蛋白酶、L5pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列；
[2.]如[1]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含：
a)编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列；
b)编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列以及编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列；
c)编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列；
d)编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列；
e)编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列；
f)编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列；或
g)编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列；
[3.]如[1]所述的分离的重组多核苷酸，其包含编码腺病毒E2ADBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列，其中编码腺病毒E2ADBP的核苷酸序列和编码腺病毒E4 ORF6和ORF7的核苷酸序列处于相反的5’至3’方向；
[4.]如[1]至[3]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；
[5.]如[1]至[3]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1；
[6.]如[1]至[5]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中腺病毒E2A DBP包含与SEQ ID NO:45具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；
[7.]如[1]至[5]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中腺病毒E2A DBP包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
[8.]如[1]至[7]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；
[9.]如[1]至[7]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:8；
[10.]如[1]至[9]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含与SEQ ID NO:46具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；
[11.]如[1]至[9]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
[12.]如[1]至[11]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒VA RNAI的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[13.]如[1]至[11]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒VA RNAI的核苷酸序列编码VA RNA I和VA RNA II，并且任选地包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[14.]如[1]至[13]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子和第二启动子是不同的启动子；
[15.]如[1]至[14]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子是腺病毒E2A启动子、CMV启动子或CMV衍生性启动子；
[16.]如[15]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子是腺病毒E2A启动子；
[17.]如[16]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E2A启动子包含与SEQID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[18.]如[16]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E2A启动子包含SEQ IDNO:2的核苷酸序列；
[19.]如[15]至[18]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒E2A启动子和E2A DBP的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:3或4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[20.]如[15]至[18]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒E2A启动子和E2A DBP的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3或4；
[21.]如[15]至[18]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒E2A启动子和E2A DBP的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:22或23具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[22.]如[15]至[18]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒E2A启动子和E2A DBP的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22或23；
[23.]如[1]至[14]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子是诱导型启动子；
[24.]如[1]至[23]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第二启动子是腺病毒E4启动子、CMV启动子或CMV衍生性启动子；
[25.]如[24]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第二启动子是腺病毒E4启动子；
[26.]如[25]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E4启动子包含与SEQID NO:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[27.]如[25]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E4启动子包含SEQ IDNO:5的核苷酸序列；
[28.]如[1]至[23]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第二启动子是诱导型启动子；
[29.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[30.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列；
[31.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[32.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列；
[33.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其还包含编码博卡病毒(Boca virus)NP1和NS2多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至第三启动子和第三polyA信号；
[34.]如[33]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码博卡病毒NP1和NS2多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；
[35.]如[33]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码博卡病毒NP1和NS2多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:12；
[36.]如[33]至[35]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第三启动子是CMV启动子；
[37.]如[33]至[35]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[38.]如[33]至[35]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列；
[39.]如[33]至[38]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[40.]如[33]至[38]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列；
[41.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其还包含编码腺相关病毒(AAV)组装激活蛋白(AAP)的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至第三启动子和第三polyA信号；
[42.]如[41]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码AAV AAP的核苷酸序列与SEQID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[43.]如[41]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码AAV AAP的核苷酸序列包含SEQ ID NO:15；
[44.]如[41]至[43]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第三启动子是CMV启动子；
[45.]如[41]至[44]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[46.]如[41]至[44]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列；
[47.]如[41]至[46]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[48.]如[41]至[46]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列；
[49.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其还包含编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至第三启动子和第三polyA信号；
[50.]如[49]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[51.]如[49]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:18；
[52.]如[49]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E1A多肽包含与SEQ IDNO:51具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；
[53.]如[49]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E1A多肽包含SEQ IDNO:51的氨基酸序列；
[54.]如[49]至[53]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第三启动子是CMV启动子；
[55.]如[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:19具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[56.]如[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列；
[57.]如[49]至[56]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[58.]如[49]至[56]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列；
[59.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4100k/六邻体组装多肽的所述N末端缺失对应于SEQ ID NO:21的核苷酸序列；
[60.]如[59]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和E2A DBP的核苷酸序列包含与SEQID NO:22具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[61.]如[59]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和E2A DBP的核苷酸序列包含SEQ IDNO:22；
[62.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含其起始密码子中的突变的L4 100k/六邻体组装多肽和E2A DBP的核苷酸序列；
[63.]如[62]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含其起始密码子中的突变的L4 100k/六邻体组装多肽和E2A DBP的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[64.]如[62]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含其起始密码子中的突变的L4 100k/六邻体组装多肽和E2A DBP的核苷酸序列包含SEQ ID NO:23；
[65.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4100k/六邻体组装多肽的所述N末端缺失涵盖L4 100k/六邻体组装的起始密码子，但不涵盖所述L4 22K/33K多肽的起始密码子；
[66.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4100k/六邻体组装多肽的全部或一部分是缺失的而不破坏L4 22K/33K起始密码子；
[67.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]以及[45]至[50]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码E2A启动子、L422K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4 100k/六邻体组装的所述N末端缺失从L4 100k/六邻体组装的起始密码子开始并且在紧邻L4 22K/33K启动子处结束；
[68.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]以及[59]至[67]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:25、27、29、31或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[69.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]以及[59]至[67]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:25、27、29、31或33的核苷酸序列；
[70.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]以及[59]至[69]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:26、28、30、32或34具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[71.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]以及[59]至[69]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:26、28、30、32或34的核苷酸序列；
[72.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列；
[73.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列；
[74.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列；
[75.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列和编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列；
[76.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列；
[77.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列；
[78.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列；
[79.]如[1]至[78]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸是包含细菌复制起点和选择性标记基因的质粒；
[80.]如[79]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述细菌复制起点是ColE1起点；
[81.]如[79]或[80]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述选择性标记基因是药物抗性基因；
[82.]如[81]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述选择性标记基因是卡那霉素抗性基因；
[83.]如[1]至[82]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:37-42或43具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[84.]如[1]至[82]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:37-42或43的核苷酸序列；
[85.]如[1]至[82]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；
[86.]如[1]至[82]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列；
[87.]一种宿主细胞，其包含如[1]至[86]中任一项所述的分离的重组多核苷酸；
[88.]如[87]所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞；
[89.]如[87]所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞；
[90.]如[87]所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞；
[91.]如[87]所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞；
[92.]如[87]所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞、细胞或PerC6细胞。
[93.]一种生产如[1]至[86]中任一项所述的分离的重组多核苷酸的方法，其包括在合适的条件下孵育如[87]至[92]中任一项所述的宿主细胞；
[94.]如[93]所述的方法，其包括在合适的条件下孵育如[88]或[89]所述的宿主细胞；
[95.]一种生产重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，其包括培养能够生产rAAV颗粒的细胞，其中所述细胞包含
i.编码AAV衣壳蛋白的多核苷酸；
ii.编码功能性rep基因的多核苷酸；
iii.包含有包含至少一个AAV反相末端重复序列(ITR)和编码基因产物的非AAV核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非AAV核酸序列可操作地连接至指导基因产物在靶细胞中表达的序列；
iv.包含足够的辅助功能以允许在允许将基因组包装到AAV衣壳中的条件下将基因组包装到AAV衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸独立地构成如[1]至[86]中任一项所述的分离的重组多核苷酸；
[96.]如[95]所述的方法，其中包含足够的辅助功能的所述一种或多种多核苷酸包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列；
[97.]一种生产rAAV颗粒的方法，其包括
a)提供包含细胞的细胞培养物；
b)将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中，所述多核苷酸包含：
i.编码AAV衣壳蛋白的多核苷酸；
ii.编码功能性rep基因的多核苷酸；
iii.包含有包含至少一个AAV反相末端重复序列(ITR)和编码基因产物的非AAV核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非AAV核酸序列可操作地连接至指导基因产物在靶细胞中表达的序列；和
iv.包含足够的辅助功能以允许在允许将基因组包装到AAV衣壳中的条件下将基因组包装到AAV衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸独立地构成如[1]至[86]中任一项所述的多核苷酸；以及
c)将细胞培养物维持在允许生产rAAV颗粒的条件下；
[98.]如[97]所述的方法，其中包含足够的辅助功能的所述一种或多种多核苷酸包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列；
[99.]如[97]或[98]所述的方法，其包括将编码AAV衣壳蛋白和功能性rep基因的多核苷酸引入到细胞中；
[100.]如[97]至[99]中任一项所述的方法，其中通过转染将一种或多种多核苷酸引入到细胞中；
[101.]如[95]至[100]中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞；
[102.]如[95]至[100]中任一项所述的方法，其中所述细胞是昆虫细胞；
[103.]如[95]至[100]中任一项所述的方法，其中所述细胞是HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞、细胞或PerC6细胞；
[104.]如[95]至[100]中任一项所述的方法，其中所述细胞是HEK293细胞；
[105.]如[95]至[104]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物是悬浮培养物或贴壁培养物；
[106.]如[95]至[105]中任一项所述的方法，其还包括回收rAAV颗粒。
[107.]如[95]至[105]中任一项所述的方法，其中所述方法与参考方法相比生产更多的以GC/ml测量的rAAV颗粒，所述参考方法使用包含辅助功能且包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列的多核苷酸；
[108.]如[95]至[105]中任一项所述的方法，其中所述方法与参考方法相比生产至少约两倍的以GC/ml测量的rAAV颗粒，所述参考方法使用包含辅助功能且包含SEQ IDNO:44的核苷酸序列的多核苷酸；
[109.]如[95]至[105]中任一项所述的方法，其中所述方法与参考方法相比生产包含更多完整衣壳的rAAV颗粒群体，所述参考方法使用包含辅助功能且包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列的多核苷酸；
[110.]如[95]至[109]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约20,000升之间的体积。
[111.]如[95]至[110]中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白；
[112.]如[95]至[110]中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8、AAV9、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1或AAV.hu37血清型的衣壳蛋白；
[113.]如[95]至[110]中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白；
[114.]如[95]至[110]中任一项所述的方法，其中所述基因产物是多肽或双链RNA核酸；
[115.]如[114]所述的方法，其中所述基因产物是多肽；
[116.]如[115]所述的方法，其中所述基因产物是抗VEGF Fab、抗激肽释放酶抗体、抗TNF抗抗体、微小肌营养不良蛋白(microdystrophin)、微型肌营养不良蛋白(minidystrophin)、艾杜糖苷酶(IDUA)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、三肽基肽酶1(TPP1)或VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体；
[117.]如[115]所述的方法，其中所述基因产物是γ-肌聚糖、Rab护卫蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道β3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同种型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)、阿柏西普(aflibercept)、巴登氏病蛋白(battenin，CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、肌营养不良蛋白、肌微管素1(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6P酶)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、运动神经元生存蛋白(survival motor neuron，SMN1)、运动神经元生存蛋白(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白(dysferlin)、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合物。
[118.]如[115]所述的方法，其中所述基因产物是肌营养不良蛋白或微小肌营养不良蛋白；
[119.]如[114]所述的方法，其中所述基因产物是微小RNA。
当结合附图阅读时，本文所述的组合物和方法的另一些其他特征和优点将从以下具体实施方式变得更加清楚。
附图说明
图1.pAdDeltaF6参考辅助质粒。
图2.辅助质粒编号1图谱。
图3.辅助编号1改善AAV滴度。示出了相对于使用pAdDeltaF6原始/旧辅助和克隆1-P8获得的滴度，rAAV生产滴度的倍数变化。
图4.辅助质粒编号2图谱。
图5.辅助编号2质粒改善AAV滴度。示出了相对于使用pAdDeltaF6原始/旧辅助和克隆1获得的滴度，rAAV生产滴度的倍数变化。
图6.E4变体的筛选。示出了相对于使用包含完整E4的辅助获得的滴度，rAAV生产滴度的倍数变化。
图7.辅助编号3质粒图谱。
图8.辅助编号3进一步改善AAV滴度。示出了相对于使用pAdDeltaF6原始/旧辅助和克隆1(5e6)获得的滴度，rAAV生产滴度的倍数变化。
图9.辅助编号3进一步改善AAV滴度。示出了相对于使用pAdDeltaF6原始/旧辅助和克隆1(5e6)获得的滴度，rAAV生产滴度的倍数变化。
图10.将博卡病毒基因NP1和NS2添加到辅助质粒编号2中。
图11.添加博卡病毒辅助基因未改善AAV滴度。示出了相对于使用pAdDeltaF6原始/旧辅助和克隆1获得的滴度，rAAV生产滴度的倍数变化。
图12.将AAP添加至辅助编号3。
图13.辅助质粒编号4图谱。
图14.添加AAP和E1A对病毒滴度的影响。示出了相对于使用pAdDeltaF6原始/旧辅助和克隆1获得的滴度，rAAV生产滴度的倍数变化。
图15.六邻体组装和L4 22K/33K序列中的突变对AAV滴度的影响。示出了相对于使用新辅助编号3和克隆1获得的滴度，rAAV生产滴度的倍数变化。
具体实施方式
在一个方面，本文提供了编码适合用于生产重组AAV颗粒的辅助功能的改进的重组多核苷酸和质粒。在一些实施方案中，重组多核苷酸和质粒编码以下中的一种或多种：腺病毒E2A DNA结合蛋白、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VARNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸和质粒不包含编码腺病毒ITR序列、L323K内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸和质粒小于先前可用的编码适合用于生产重组AAV颗粒的辅助功能的多核苷酸和质粒。在一些实施方案中，本文所述的改进的多核苷酸和质粒在重组AAV颗粒的生产中的使用导致rAAV产量增加。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。为促进对所公开方法的理解，下文定义多个术语和短语。
“AAV”是腺相关病毒的缩写，并且可用于指代病毒本身或其修饰、衍生物或假型。除了另外要求的情况外，所述术语覆盖所有亚型以及天然存在和重组形式两者。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒。术语“AAV”包括AAV类型1(AAV1)、AAV类型2(AAV2)、AAV类型3(AAV3)、AAV类型4(AAV4)、AAV类型5(AAV5)、AAV类型6(AAV6)、AAV类型7(AAV7)、AAV类型8(AAV8)、AAV类型9(AAV9)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV和绵羊AAV及其修饰、衍生物或假型。“灵长类动物AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV，等。
应用于AAV颗粒的“重组”意指AAV颗粒是产生与自然界中的AAV颗粒不同的AAV颗粒构建体的一种或多种程序的产物。
重组腺相关病毒颗粒“rAAV颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸rAAV载体基因组组成的病毒颗粒，所述载体基因组包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，诸如待递送到哺乳动物细胞的转基因)。rAAV颗粒可以是任何AAV血清型，包括任何修饰、衍生物或假型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10或其衍生物/修饰/假型)。此类AAV血清型和衍生物/修饰/假型，以及生产此类血清型/衍生物/修饰/假型的方法是本领域已知的(参见例如，Asokan等人,Mol.Ther.20(4):699-708(2012)。
本公开的rAAV颗粒可以是任何血清型或血清型的任何组合(例如包含两种或更多种血清型例如包含rAAV2、rAAV8和rAAV9颗粒中的两种或更多种的rAAV颗粒群)。在一些实施方案中，rAAV颗粒是rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10或其他rAAV颗粒或其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，rAAV颗粒是rAAV8或rAAV9颗粒。
在一些实施方案中，rAAV颗粒具有选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16或其衍生物、修饰或假型组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV8、AAV9或其衍生物、修饰或假型的血清型的AAV衣壳蛋白。
术语“细胞培养物”是指在生物反应器、滚瓶、多层培养瓶(hyperstack)、微球、大球、烧瓶等中贴壁或悬浮生长的细胞，以及上清液或悬浮液本身的组分，包括但不限于rAAV颗粒、细胞、细胞碎片、细胞污染物、胶体颗粒、生物分子、宿主细胞蛋白、核酸和脂质以及絮凝剂。术语“细胞培养物”也涵盖大规模方法，诸如生物反应器，包括悬浮培养物和在搅拌的生物反应器中附着于微载剂或大载剂生长的贴壁细胞。本公开涵盖用于大规模和小规模生产蛋白质的细胞培养程序。在一些实施方案中，术语“细胞培养物”是指悬浮生长的细胞。在一些实施方案中，术语“细胞培养物”是指在搅拌的生物反应器中附着于微载剂或大载剂上生长的贴壁细胞。在一些实施方案中，术语“细胞培养物”是指灌注培养物中生长的细胞。在一些实施方案中，术语“细胞培养物”是指交替切向流(ATF)支持的高密度灌注培养物中生长的细胞。
如本文所用，术语“纯化(purifying/purification)”、“分离(separate/separating/separation)”或“分离(isolate/isolating/isolation)”是指提高包含靶产物和一种或多种杂质的样品中的靶产物例如rAAV颗粒和rAAV基因组的纯度。通常，通过从样品中(完全或部分地)去除至少一种杂质来提高靶产物的纯度。在一些实施方案中，通过使用本文所述的方法从样品中(完全或部分地)去除一种或多种杂质来增加样品中rAAV的纯度。
修饰例如本文提供的方法中采用的组合物中成分的量、组合物中成分的浓度、流速、rAAV颗粒产量、进料体积、盐浓度和类似值及其范围的“约(about)”，是指可例如在以下情况下出现的数值数量变化：通过用于制备浓缩物或使用溶液的典型测量和处理程序；通过这些程序中的无意错误；通过用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度方面的差异；以及类似的考虑因素。术语“约”还涵盖由于具有特定初始浓度的组合物或混合物的老化而不同的量。术语“约”还涵盖由于混合或加工具有特定初始浓度的组合物或混合物而不同的量。无论是否被术语“约”限定，权利要求书都包括数量的等效物。在一些实施方案中，术语“约”是指大于或小于所指示的数字或范围大约10％-20％的范围。在其他实施方案中，“约”是指所指示的数字或范围加或减10％。例如，“约10％”表示9％至11％的范围。
除非上下文另外明确规定，否则如本公开和权利要求书所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数形式。
应理解无论在本文中将实施方案用语言“包含”来描述的情况如何，都提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语描述的另外相似的实施方案。还应理解无论在本文中将实施方案用语言“基本上由……组成”来描述的情况如何，都提供以“由……组成”的术语描述的另外相似的实施方案。
如本文中诸如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
在以马库什组(Markush group)或替代方案的其他分组来描述本公开的实施方案的情况下，所公开的方法不仅涵盖作为整体列出的整个组，而且还涵盖单独列出的组的每个成员和主组的所有可能的子组，并且还包括缺少一个或多个组成员的主组。所公开的方法还设想在所公开的方法中明确排除任何组成员中的一个或多个。
重组多核苷酸
在一些实施方案中，本公开提供了一种分离的重组多核苷酸，其编码能够促进在宿主细胞(例如，HEK细胞)中生产重组AAV颗粒的一种或多种辅助功能。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含以下中的一种或多种：(a)编码腺病毒E2A DNA结合蛋白(DBP)的核苷酸序列；(b)编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列；以及(c)编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II。在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸不包含编码腺病毒ITR序列、L3 23K内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒ITR序列、L3 23K内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列是pAdDeltaF6的对应核苷酸序列。在一些实施方案中，编码蛋白质或多肽(例如，E2A DBP或E4 ORF6和ORF7)或RNA(例如，VA RNA I)的核苷酸序列包含启动子，所述启动子可操作地连接至包含所述蛋白质或多肽的编码区或RNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码蛋白质或多肽的核苷酸序列包含启动子和polyA信号，其可操作地连接至包含编码区的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的分离的多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的多核苷酸包含编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列和编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的多核苷酸包含编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的多核苷酸包含编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VARNA I的核苷酸序列编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II。在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸不包含编码腺病毒ITR序列、L3 23K内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒ITR序列、L3 23K内切蛋白酶、L5pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列是pAdDeltaF6的对应核苷酸序列。在分离的重组多核苷酸的一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和编码腺病毒E4 ORF6和ORF7的核苷酸序列处于相反的5'至3'方向。在分离的重组多核苷酸的一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和编码腺病毒E4 ORF6和ORF7的核苷酸序列处于相同的5'至3'方向。
在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列，其中编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和编码腺病毒E4 ORF6和ORF7的核苷酸序列处于相反的5'至3'方向，并且其中分离的重组多核苷酸不包含编码腺病毒ITR序列、L323K内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II。
腺病毒E2A DNA结合蛋白
在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2ADBP的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，腺病毒E2ADBP多肽包含与SEQ ID NO:45具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E2A DBP多肽包含与SEQ ID NO:45具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E2A DBP多肽包含与SEQ ID NO:45具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E2A DBP多肽包含与SEQ ID NO:45具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E2A DBP多肽包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2ADBP的核苷酸序列可操作地连接至启动子和polyA信号。
在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:45具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E2ADBP多肽包含与SEQ ID NO:45具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E2A DBP多肽包含与SEQ ID NO:45具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E2A DBP多肽包含与SEQ ID NO:45具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E2A DBP多肽包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列可操作地连接至启动子和polyA信号。
在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列可操作地连接至腺病毒E2A启动子。在一些实施方案中，腺病毒E2A启动子包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E2A启动子包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E2A启动子包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列可操作地连接至不是腺病毒E2A启动子的启动子。
在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子和任选地polyA信号的核苷酸序列从3'至5'涵盖腺病毒E2A启动子、腺病毒L4 22K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因、编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和任选地polyA信号。在一些实施方案中，腺病毒E2A启动子、腺病毒L4 22K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因、编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和任选的polyA信号的相对方向与pAdDeltaF6中相同。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2ADBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:3具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子和polyA信号的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子和polyA信号的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子和polyA信号的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子和polyA信号的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子和polyA信号的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列从3'至5'涵盖腺病毒E2A启动子、腺病毒L4 22K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因、编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列，其中所述腺病毒L4 100k/六邻体组装基因包含L4 100k/六邻体组装多肽的N末端缺失。在一些实施方案中，N末端缺失不影响L4 100k/六邻体组装启动子。在一些实施方案中，N末端缺失对应于SEQ ID NO:21的序列。在一些实施方案中，腺病毒E2A启动子、腺病毒L4 22K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因和编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列的相对方向与pAdDeltaF6中相同。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:22具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ IDNO:22具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:22具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2ADBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和腺病毒E2A启动子还包含可操作地连接的polyA信号。
在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列从3'至5'涵盖腺病毒E2A启动子、腺病毒L4 22K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因、编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列，其中所述腺病毒L4 100k/六邻体组装基因包含L4 100k/六邻体组装多肽的起始密码子突变。在一些实施方案中，腺病毒E2A启动子、腺病毒L4 22K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因和编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列的相对方向与pAdDeltaF6中相同。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQID NO:23具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:23具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:23具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2ADBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和腺病毒E2A启动子还包含可操作地连接的polyA信号。
在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列从3'至5'涵盖腺病毒E2A启动子、腺病毒L4 22K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因、编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列，其中所述腺病毒L4 22K/33K基因包含L422K/33K多肽的起始密码子突变。在一些实施方案中，腺病毒E2A启动子、腺病毒L4 22K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因和编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列的相对方向与pAdDeltaF6中相同。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:24具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2ADBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:24具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:24具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:24具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2ADBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和腺病毒E2A启动子还包含可操作地连接的polyA信号。
在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列从3'至5'涵盖腺病毒E2A启动子、腺病毒L4 22K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因、编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4 100k/六邻体组装基因包含L4100k/六邻体组装多肽的N末端缺失，所述N末端缺失涵盖L4100k/六邻体组装多肽的起始密码子，但不涵盖L4 22K/33K多肽的起始密码子。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列从3'至5'涵盖腺病毒E2A启动子、腺病毒L422K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因、编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4 100k/六邻体组装基因包含L4 100k/六邻体组装多肽的N末端缺失，其中所述L4100k/六邻体组装多肽的全部或一部分是缺失的而不破坏所述L4 22K/33K起始密码子。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列从3'至5'涵盖腺病毒E2A启动子、腺病毒L4 22K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因、编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4 100k/六邻体组装基因包含L4 100k/六邻体组装多肽的N末端缺失，所述N末端缺失涵盖L4 100k/六邻体组装多肽的起始密码子，但不涵盖L4 22K/33K启动子。在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的可操作地连接至腺病毒E2A启动子的核苷酸序列从3'至5'涵盖腺病毒E2A启动子、腺病毒L4 22K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因、编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4 100k/六邻体组装基因包含L4 100k/六邻体组装多肽的N末端缺失，所述N末端缺失从L4100k/六邻体组装多肽的起始密码子处开始并且在紧邻L4 22K/33K启动子处结束。在一些实施方案中，腺病毒E2A启动子、腺病毒L422K/33K基因、腺病毒L4 100k/六邻体组装基因和编码腺病毒E2ADBP的核苷酸序列的相对方向与pAdDeltaF6中相同。在一些实施方案中，编码腺病毒E2ADBP的核苷酸序列和腺病毒E2A启动子还包含可操作地连接的polyA信号。
在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列可操作地连接至CMV立即早期启动子。在一些实施方案中，编码腺病毒E2ADBP的核苷酸序列可操作地连接至工程化CMV立即早期启动子或其转录活性片段或部分。
在一些实施方案中，编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子。
腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽
在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列包含与SEQ IDNO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E4ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:8具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含与SEQ ID NO:46具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含与SEQ ID NO:46具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含与SEQ ID NO:46具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含与SEQ ID NO:46具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列可操作地连接至启动子和polyA信号。
在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:46具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含与SEQ ID NO:46具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含与SEQ ID NO:46具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含与SEQ ID NO:46具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E4ORF6和ORF7多肽包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列可操作地连接至启动子和polyA信号。
在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列可操作地连接至腺病毒E4启动子。在一些实施方案中，腺病毒E4启动子包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E4启动子包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E4启动子包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列可操作地连接至不是腺病毒E4启动子的启动子。
在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列可操作地连接至CMV立即早期启动子。在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列可操作地连接至工程化CMV立即早期启动子或其转录活性片段或部分。
在一些实施方案中，编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子。
腺病毒VA RNA
在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:54具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:54具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:54具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列包含SEQ ID NO:54。
在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA II的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:55具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA II的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:55具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA II的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:55具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA II的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:55具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA II的核苷酸序列包含SEQ ID NO:55。
在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列包含与SEQID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列包含与SEQ IDNO:9具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I和VARNA II的核苷酸序列包含SEQ ID NO:9。
编码E2A DBP、E4 ORF6/7和VA RNA的多核苷酸
在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II。在一些实施方案中，表达腺病毒E2A DBP的启动子和表达腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的启动子是相同的。在一些实施方案中，表达腺病毒E2A DBP的启动子和表达腺病毒E4ORF6和ORF7多肽的启动子是不同的。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:10具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:56具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:56具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:56具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:56具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:56的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:57具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:57具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:57具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:57具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:57的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:25具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:25具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:25具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:25具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:26具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:26具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:26具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:27具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:27具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:27具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:27具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:28具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:28具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:28具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:29具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:29具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:29具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:29具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:30具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:30具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:30具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:30具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:31具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:31具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:31具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:31的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:32具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:32具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:32具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:32具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:33具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:33具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:33具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:33的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:34具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:34具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:34具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:34具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:34的核苷酸序列。
博卡病毒NP1和NS2多肽
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和任选地VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸还包含编码博卡病毒NP1和NS2多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码博卡病毒NP1和NS2多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。在一些实施方案中，编码博卡病毒NP1和NS2多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:12具有至少90％同一性。在一些实施方案中，编码博卡病毒NP1和NS2多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性。在一些实施方案中，编码博卡病毒NP1和NS2多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:12具有至少98％同一性。在一些实施方案中，编码博卡病毒NP1和NS2多肽的核苷酸序列包含SEQID NO:12。在一些实施方案中，博卡病毒NP1和NS2多肽包含与SEQ ID NO:52具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，博卡病毒NP1和NS2多肽包含与SEQ ID NO:52具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，博卡病毒NP1和NS2多肽包含与SEQ ID NO:52具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，博卡病毒NP1和NS2多肽包含与SEQ ID NO:52具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，博卡病毒NP1和NS2多肽包含SEQID NO:52的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码博卡病毒NP1和NS2多肽的核苷酸序列包含CMV启动子。在一些实施方案中，编码博卡病毒NP1和NS2多肽的核苷酸序列包含工程化CMV立即早期启动子。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列、编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列以及博卡病毒NP1和NS2多肽的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:13具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:13具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列、编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列以及博卡病毒NP1和NS2多肽的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:14具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:14具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
腺相关病毒组装激活蛋白
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和任选地VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸还包含编码腺相关病毒(AAV)组装激活蛋白(AAP)的核苷酸序列。技术人员理解，AAV AAP ORF与野生型病毒中的AAV衣壳ORF重叠，因此存在AAV血清型特异性AAP，例如对应于AAV血清型1至13的AAP 1至13。Sonntag等人,Journal ofVirology,85:12686-12697(2011)。在一些实施方案中，AAP是AAP 1、AAP 2、AAP 3B、AAP 4、AAP 5、AAP 6、AAP 7、AAP 8、AAP 9、AAP 10、AAP 11、AAP 12或AAV 13。在一些实施方案中，AAP同种型与所产生的重组AAV的衣壳同种型相匹配。在一些实施方案中，AAP是AAP 8。在一些实施方案中，AAP是AAP 9。在一些实施方案中，AAP包含与SEQ ID NO:53具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAP包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码AAV AAP的核苷酸序列与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。在一些实施方案中，编码AAV AAP的核苷酸序列与SEQ IDNO:15具有至少90％同一性。在一些实施方案中，编码AAV AAP的核苷酸序列与SEQ ID NO:15具有至少95％同一性。在一些实施方案中，编码AAV AAP的核苷酸序列与SEQ ID NO:15具有至少98％同一性。在一些实施方案中，编码AAV AAP的核苷酸序列包含SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，AAV AAP包含与SEQ ID NO:53具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAVAAP包含与SEQ ID NO:53具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV AAP包含与SEQ ID NO:53具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV AAP包含与SEQ ID NO:53具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV AAP包含SEQID NO:53的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码AAV AAP的核苷酸序列包含CMV启动子。在一些实施方案中，编码AAV AAP的核苷酸序列包含工程化CMV立即早期启动子。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列、编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列以及腺相关病毒(AAV)组装激活蛋白(AAP)的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:16具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列、编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列以及腺相关病毒(AAV)组装激活蛋白(AAP)的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:17具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:17具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:17具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
腺病毒E1A多肽
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I和任选地VA RNA II的核苷酸序列的本文所述的分离的重组多核苷酸还包含编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。在一些实施方案中，编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:18具有至少90％同一性。在一些实施方案中，编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:18具有至少95％同一性。在一些实施方案中，编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:18具有至少98％同一性。在一些实施方案中，编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，腺病毒E1A多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E1A多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E1A多肽包含与SEQ IDNO:51具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E1A多肽包含与SEQID NO:51具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒E1A多肽包含SEQID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列包含CMV启动子。在一些实施方案中，编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列包含工程化CMV立即早期启动子。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列、编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列以及腺病毒E1A多肽的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:19具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:19具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:19具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:19具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列、编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II的核苷酸序列以及腺病毒E1A多肽的本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:20具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:20具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的重组多核苷酸包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列。
质粒
在一些实施方案中，本公开提供了一种质粒，其包含本文所述的重组多核苷酸，其中所述质粒编码能够促进AAV颗粒在宿主细胞(例如，HEK细胞)中产生的一种或多种辅助功能。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含以下中的一种或多种：(a)编码腺病毒E2A DNA结合蛋白(DBP)的核苷酸序列；(b)编码腺病毒E4ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列；以及(c)编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II。在一些实施方案中，质粒不包含编码腺病毒ITR序列、L3 23K内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列。在一些实施方案中，质粒是细菌质粒。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含能够使质粒在细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌宿主细胞)中繁殖的细菌复制起点。在一些实施方案中，细菌复制起点是ColE1起点。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含选择性标记基因。在一些实施方案中，选择性标记基因是药物抗性基因。在一些实施方案中，选择性标记基因是卡那霉素抗性基因。在一些实施方案中，选择性标记基因是氨苄青霉素抗性基因。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含细菌复制起点和选择性标记基因。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含本文所述的重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含本文所述的重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含本文所述的重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列和编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含本文所述的重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列和编码腺病毒VARNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含本文所述的重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含本文所述的重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含本文所述的重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VARNA I的核苷酸序列编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II。在一些实施方案中，质粒不包含编码腺病毒ITR序列、L3 23K内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒ITR序列、L3 23K内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列是pAdDeltaF6的对应核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含本文所述的重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:25-34、58或59具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:25-34、58或59的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒的长度小于15,000bp。在一些实施方案中，本文所述的质粒的长度小于12,000bp。在一些实施方案中，本文所述的质粒的长度是在9,000至12,000bp之间。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:35具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:35具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:35具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:35具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:35的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:36具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:36具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:36具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:36具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:36的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:37具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:37具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:37具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:38具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:38具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:38具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:38具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:38的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:39具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:39具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:39具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:39具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:39的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:40具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:40具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:40具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:40具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:40的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:41具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:41具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:41具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:42具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:42具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:42具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:42具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:42的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:43具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:43具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:43具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:43具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列。
宿主细胞
在一些实施方案中，本公开提供了一种宿主细胞，其包含本文所述的重组多核苷酸或质粒。在一些实施方案中，宿主细胞是能够繁殖本文所述的重组多核苷酸或质粒的原核细胞。在一些实施方案中，原核宿主细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，原核宿主细胞是大肠杆菌。在一些实施方案中，宿主细胞是能够生产重组AAV颗粒的真核细胞。在一些实施方案中，真核宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞是HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞、CAP细胞或PerC6细胞。
在一些实施方案中，本文所述的宿主细胞包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含以下中的一种或多种：(a)编码腺病毒E2A DNA结合蛋白(DBP)的核苷酸序列；(b)编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列；以及(c)编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II。在一些实施方案中，重组多核苷酸不包含编码腺病毒ITR序列、L3 23K内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列。在一些实施方案中，质粒是细菌质粒。
在一些实施方案中，本文所述的宿主细胞包含本文所述的质粒，所述质粒包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ IDNO:11具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQID NO:11具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQID NO:11的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的宿主细胞包含本文所述的质粒，所述质粒包含与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ ID NO:37具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQ IDNO:37具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含与SEQID NO:37具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQID NO:37的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的宿主细胞包含本文所述的质粒，所述质粒包含与SEQ ID NO:10、11、25-34、58或59具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:10、11、25-34、58或59的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的宿主细胞包含本文所述的质粒，所述质粒包含与SEQ ID NO:35-43具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的质粒包含SEQ ID NO:35-43的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了一种生产本文所述的重组多核苷酸或本文所述的质粒的方法，其包括在合适的条件下孵育本文所述的宿主细胞以生产重组多核苷酸或质粒。在一些实施方案中，宿主细胞是能够繁殖本文所述的质粒的原核细胞。在一些实施方案中，原核宿主细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，原核宿主细胞是大肠杆菌。在一些实施方案中，重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:10、11、25-34、58或59具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸包含SEQ ID NO:10、11、25-34、58或59的核苷酸序列。在一些实施方案中，质粒包含与SEQ ID NO:35-43具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，质粒包含SEQID NO:35-43的核苷酸序列。
生产重组病毒颗粒的方法
在一个方面，本公开提供了一种在真核宿主细胞中生产重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，所述方法通过使用本文所述的重组多核苷酸或质粒来提供一种或多种辅助功能，所述辅助功能能够促进重组AAV颗粒产生。在一些实施方案中，方法还包括回收rAAV颗粒。
在一些实施方案中，本文所述的生产rAAV的方法包括使用重组多核苷酸或质粒，所述重组多核苷酸或质粒包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸或质粒包含与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸或质粒包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸或质粒包含与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸或质粒包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的生产rAAV的方法包括使用重组多核苷酸或质粒，所述重组多核苷酸或质粒包含与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸或质粒包含与SEQ ID NO:37具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸或质粒包含与SEQ ID NO:37具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸或质粒包含与SEQ ID NO:37具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸或质粒包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的生产rAAV的方法包括使用重组多核苷酸或质粒，所述重组多核苷酸或质粒包含与SEQ ID NO:10、11、25-34、58或59具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸或质粒包含SEQ ID NO:10、11、25-34、58或59的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的生产rAAV的方法包括使用重组多核苷酸或质粒，所述重组多核苷酸或质粒包含与SEQ ID NO:35-43具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸或质粒包含SEQ ID NO:35-43的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了一种生产重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，其包括培养能够生产rAAV颗粒的细胞，其中所述细胞包含：(i)编码AAV衣壳蛋白的多核苷酸；(ii)编码功能性rep基因的多核苷酸；(iii)包含有包含至少一个AAV反相末端重复序列(ITR)和编码基因产物的非AAV核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非AAV核酸序列可操作地连接至指导基因产物在靶细胞中表达的序列；以及(iv)包含足够的辅助功能以允许在允许将基因组包装到AAV衣壳中的条件下将基因组包装到AAV衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸独立地构成本文所述的重组多核苷酸或本文所述的质粒。在一些实施方案中，包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II。在一些实施方案中，包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸包含与SEQ ID NO:35-43具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸包含与SEQ ID NO:10、11、25-34、58或59具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，方法还包括回收rAAV颗粒。在一些实施方案中，细胞包含编码cap和rep基因的一种多核苷酸、本文公开的编码包装所需的腺病毒辅助功能(例如，腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)的一种多核苷酸以及编码待包装的rAAV基因组的一种多核苷酸。在一些实施方案中，rAAV颗粒是AAV8或AAV9颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，细胞培养物包含适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。在一些实施方案中，细胞培养物具有约400升与约5,000升之间的体积。
在一些实施方案中，本公开提供了一种生产重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，其包括：(a)提供包含细胞的细胞培养物；(b)将一种或多种多核苷酸引入到细胞中，所述一种或多种多核苷酸包含：(i)编码AAV衣壳蛋白的多核苷酸；(ii)编码功能性rep基因的多核苷酸；(iii)包含有包含至少一个AAV反相末端重复序列(ITR)和编码基因产物的非AAV核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非AAV核酸序列可操作地连接至指导基因产物在靶细胞中表达的序列；以及(iv)包含足够的辅助功能以允许在允许将基因组包装到AAV衣壳中的条件下将基因组包装到AAV衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中所述包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸独立地构成本文所述的重组多核苷酸或本文所述的质粒；以及(c)将细胞培养物维持在允许生产rAAV颗粒的条件下。在一些实施方案中，包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸包含编码腺病毒E2A DBP的核苷酸序列、编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒VA RNA I/II基因的核苷酸序列；在一些实施方案中，编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列编码腺病毒VA RNA I和VA RNA II。在一些实施方案中，包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸包含与SEQ ID NO:35-43具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸包含与SEQ ID NO:10、11、25-34、58或59具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，方法还包括回收rAAV颗粒。在一些实施方案中，引入到细胞中的一种或多种多核苷酸包含以下三种多核苷酸的混合物：编码cap和rep基因的一种多核苷酸、本文公开的编码包装所需的腺病毒辅助功能(例如，腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)的一种多核苷酸以及编码待包装的rAAV基因组的一种多核苷酸。在一些实施方案中，rAAV颗粒是AAV8或AAV9颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，细胞培养物包含适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。在一些实施方案中，细胞培养物具有约400升与约5,000升之间的体积。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括将编码AAV衣壳蛋白和功能性rep基因的多核苷酸引入到细胞中。
在一些实施方案中，通过转染将一种或多种多核苷酸引入到细胞中。
在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，细胞是HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞、CAP细胞或PerC6细胞。在一些实施方案中，细胞是HEK293细胞。
在一些实施方案中，细胞培养物是悬浮培养物或贴壁培养物。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。
在一些实施方案中，细胞培养物具有约50升与约20,000升之间的体积。
在一些实施方案中，与参考方法相比，本文所述的方法生产更多的以GC/ml测量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，参考方法使用包含辅助功能且包含SEQ ID NO:35的核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，参考方法使用包含辅助功能且包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，与参考方法相比，本文公开的方法生产至少多约10％的以GC/ml测量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，与参考方法相比，本文公开的方法生产至少多约10％的以GC/ml测量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，与参考方法相比，本文公开的方法生产至少多约20％的以GC/ml测量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，与参考方法相比，本文公开的方法生产至少多约30％的以GC/ml测量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，与参考方法相比，本文公开的方法生产至少多约40％的以GC/ml测量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，与参考方法相比，本文公开的方法生产至少多约50％的以GC/ml测量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，与参考方法相比，本文公开的方法生产至少多约70％的以GC/ml测量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，与参考方法相比，本文公开的方法生产至少多约90％的以GC/ml测量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，与参考方法相比，本文公开的方法生产至少约两倍的以GC/ml测量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，与参考方法相比，本文公开的方法生产至少约三倍的以GC/ml测量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，与参考方法相比，本文公开的方法生产至少约四倍的以GC/ml测量的rAAV颗粒。
在一些实施方案中，与参考方法相比，方法产生包含更多完整衣壳的rAAV颗粒群体。在一些实施方案中，参考方法使用包含辅助功能且包含SEQ ID NO:35的核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，参考方法使用包含辅助功能且包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8、AAV9、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1或AAV.hu37血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码基因产物的转基因。在一些实施方案中，基因产物是多肽或双链RNA分子。在一些实施方案中，基因产物是多肽。在一些实施方案中，转基因编码抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、Fc-融合多肽、免疫粘附素、免疫球蛋白、工程化蛋白质、蛋白质片段或酶。在一些实施方案中，转基因包含调节元件，其可操作地连接至编码基因产物的多核苷酸。
在一些实施方案中，基因产物是抗VEGF Fab、抗激肽释放酶抗体、抗TNF抗抗体、微小肌营养不良蛋白、微型肌营养不良蛋白、艾杜糖苷酶(IDUA)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、三肽基肽酶1(TPP1)或VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体。在一些实施方案中，基因产物是γ-肌聚糖、Rab护卫蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道β3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同种型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)、阿柏西普、巴登氏病蛋白(CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、肌营养不良蛋白、肌微管素1(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6P酶)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、运动神经元生存蛋白(SMN1)、运动神经元生存蛋白(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合物。在一些实施方案中，基因产物是肌营养不良蛋白或微小肌营养不良蛋白。在一些实施方案中，基因产物是微小RNA。
在一些实施方案中，本文所述的方法增加了rAAV颗粒的生产，同时保持或改善了rAAV颗粒和包含所述rAAV颗粒的组合物的质量属性。在一些实施方案中，rAAV颗粒和包含所述rAAV颗粒的组合物的质量通过确定以下来评估：rAAV颗粒的浓度(例如，GC/ml)、包含rAAV基因组拷贝的颗粒的百分比；没有基因组的颗粒的比率、rAAV颗粒的感染性、rAAV颗粒的稳定性、残留宿主细胞蛋白的浓度或残留宿主细胞核酸(例如，宿主细胞基因组DNA、编码rep和cap基因的质粒、编码辅助功能的质粒、编码rAAV基因组的质粒)的浓度。在一些实施方案中，通过本文所述的方法生产的rAAV颗粒或包含所述rAAV颗粒的组合物的质量与通过参考方法生产的rAAV颗粒或组合物的质量相同，所述参考方法使用包含SEQ ID NO:35或44的核苷酸序列的辅助质粒。在一些实施方案中，通过本文所述的方法生产的rAAV颗粒或包含所述rAAV颗粒的组合物的质量比通过参考方法生产的rAAV颗粒或组合物的质量更好，所述参考方法使用包含SEQ ID NO:35或44的核苷酸序列的辅助质粒。。
用于生产rAAV颗粒的许多基于细胞培养物的***是本领域已知的，所述***中的任一种都可用于实施本文所述的方法。用于生产rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养需要：(1)合适的宿主细胞，包括例如人衍生细胞系，诸如HeLa、A549或HEK293细胞及其衍生物(HEK293T细胞、HEK293F细胞)，或哺乳动物细胞系，诸如Vero，羊水细胞衍生细胞，诸如细胞、CHO细胞或CHO衍生细胞；(2)合适的辅助病毒功能，由野生型或突变型腺病毒(诸如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；(3)AAV rep和cap基因以及基因产物；(4)由AAV ITR序列侧接的转基因(诸如治疗性转基因)；以及(5)支持rAAV生产的合适的培养基和培养基组分。
技术人员知道可将AAV rep和cap基因、AAV辅助基因(例如，腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)和rAAV基因组(包含由反向末端重复序列(ITR)侧接的一个或多个感兴趣基因)引入到细胞中以生产或包装rAAV的许多方法。短语“腺病毒辅助功能”是指在细胞中表达的多种病毒辅助基因(如RNA或蛋白质)，从而使AAV在细胞中高效生长。技术人员理解辅助病毒(包括腺病毒和单纯疱疹病毒(HSV))促进AAV复制，并且已鉴定出提供基本功能的某些基因，例如，辅助基因可诱导细胞环境发生变化，所述变化促进这种AAV基因的表达和复制。在本文所述的方法的一些实施方案中，通过转染编码AAV rep和cap基因、辅助基因和rAAV基因组的一种或多种质粒载体来将AAV rep和cap基因、辅助基因和rAAV基因组引入到细胞中。
开发编码AAV rep和cap基因、辅助基因和/或rAAV基因组的质粒或病毒载体的分子生物学技术是本领域通常已知的。在一些实施方案中，AAV rep和cap基因由一种质粒载体编码。在一些实施方案中，AAV辅助基因(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)由一种质粒载体编码。在一些实施方案中，E1a基因或E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将剩余的AAV辅助基因引入到细胞中。在一些实施方案中，E1a基因和E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种质粒载体的转染来将E4基因、E2a基因和VA基因引入到细胞中。在一些实施方案中，一种或多种辅助基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种质粒载体的转染来将一种或多种辅助基因引入到细胞中。在一些实施方案中，辅助基因由宿主细胞稳定表达。在一些实施方案中，AAV rep和cap基因由一种病毒载体编码。在一些实施方案中，AAV辅助基因(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)由一种病毒载体编码。在一些实施方案中，E1a基因或E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将剩余的AAV辅助基因引入到细胞中。在一些实施方案中，E1a基因和E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将E4基因、E2a基因和VA基因引入到细胞中。在一些实施方案中，一种或多种辅助基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将一种或多种辅助基因引入到细胞中。在一些实施方案中，通过使用一种或多种多核苷酸(例如，载体)转染来将AAV rep和cap基因、包装所必需的腺病毒辅助功能以及待包装的rAAV基因组引入到细胞中。在一些实施方案中，本文所述的方法包括使用以下三种多核苷酸的混合物转染细胞：编码cap和rep基因的一种多核苷酸、编码包装所必需的腺病毒辅助功能(例如，腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)的一种多核苷酸以及编码待包装的rAAV基因组的一种多核苷酸。在一些实施方案中，AAV cap基因是AAV8或AAV9 cap基因。在一些实施方案中，AAV cap基因是AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB或AAV.7m8 cap基因。在一些实施方案中，AAV cap基因编码与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，编码待包装的rAAV基因组的载体包含由AAV ITR侧接的感兴趣基因。在一些实施方案中，AAV ITR来自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型。
载体的任何组合都可用于将AAV rep和cap基因、AAV辅助基因和rAAV基因组引入到其中待生产或包装rAAV颗粒的细胞中。在本文所述的方法的一些实施方案中，可使用编码rAAV基因组(所述rAAV基因组包含由AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的感兴趣基因)的第一质粒载体、编码AAV rep和cap基因的第二载体以及编码辅助基因的第三载体。在一些实施方案中，将三种载体的混合物共转染到细胞中。
在一些实施方案中，通过使用质粒载体以及病毒载体两者来使用转染和感染的组合。
在一些实施方案中，rep和cap基因以及AAV辅助基因中的一种或多种由细胞组成性表达，并且不需要被转染或转导到细胞中。在一些实施方案中，细胞组成性表达rep和/或cap基因。在一些实施方案中，细胞组成性表达一种或多种AAV辅助基因。在一些实施方案中，细胞组成性表达E1a。在一些实施方案中，细胞包含编码rAAV基因组的稳定转基因。
在一些实施方案中，AAV rep、cap和辅助基因(例如Ela基因、E1b基因、E4基因、E2a基因或VA基因)可以是任何AAV血清型。类似地，AAV ITR也可以是任何AAV血清型。例如，在一些实施方案中，AAV ITR来自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型(例如，带有来自多于一种血清型的序列的杂合血清型)。在一些实施方案中，AAV cap基因来自AAV9或AAV8 cap基因。在一些实施方案中，AAV cap基因来自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型(例如，带有来自多于一种血清型的序列的杂合血清型)。在一些实施方案中，用于生产rAAV颗粒的AAV rep和cap基因来自不同的血清型。例如，rep基因来自AAV2，而cap基因来自AAV9。
可以使用本领域已知的任何合适的培养基来根据本文所述的方法生产重组病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)。这些培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括如美国专利号6,723,551中所述的改良伊格尔培养基(Modified Eagle Medium，MEM)、杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)和Sf-900 IISFM培养基，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，培养基包括来自Invitrogen/ThermoFisher的DynamisTM培养基、FreeStyleTM293表达培养基或Expi293TM表达培养基。在一些实施方案中，培养基包括DynamisTM培养基。在一些实施方案中，本文所述的方法使用包括无血清培养基、无动物组分培养基或化学成分确定的培养基的细胞培养。在一些实施方案中，培养基是无动物组分培养基。在一些实施方案中，培养基包含血清。在一些实施方案中，培养基包含胎牛血清。在一些实施方案中，培养基是无谷氨酰胺的培养基。在一些实施方案中，培养基包含谷氨酰胺。在一些实施方案中，培养基补充有营养素、盐、缓冲剂和添加剂(例如消泡剂)中的一种或多种。在一些实施方案中，培养基补充有谷氨酰胺。在一些实施方案中，培养基补充有血清。在一些实施方案中，培养基补充有胎牛血清。在一些实施方案中，培养基补充有泊洛沙姆(poloxamer)，例如P 188Bio。在一些实施方案中，培养基是基础培养基。在一些实施方案中，培养基是进料培养基。
重组病毒(例如，rAAV)生产培养物可常规地在适合于所利用的特定宿主细胞的各种条件下(在广泛温度范围内、改变时间长度等)生长。如本领域中已知的，病毒生产培养物包含悬浮适应性宿主细胞，诸如HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CAP细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞和SF-9细胞，它们可以多种方式进行培养，包括例如旋转瓶、搅拌罐生物反应器和一次性***，诸如波浪袋***。用于生产rAAV颗粒的许多悬浮培养物是本领域已知的，包括例如在美国专利号6,995,006、9,783,826和在美国专利申请公开号20070111312和20120122155中公开的培养物，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
本领域已知生产重组病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)的任何细胞或细胞系可用于本文所述的任一种方法中。在一些实施方案中，本文所述的生产重组病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)或增加重组病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)生产的方法使用HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如，HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CAP细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、LLC-MK细胞、MDCK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、PK15细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、BHK细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞。在一些实施方案中，本文所述的方法使用哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本文所述的方法使用昆虫细胞，例如SF-9细胞。在一些实施方案中，本文所述的方法使用适于在悬浮培养物中生长的细胞。在一些实施方案中，本文所述的方法使用适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。
在一些实施方案中，本文所述的细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，本文所述的大规模悬浮细胞培养物包含适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞培养物包含无血清培养基、无动物组分培养基或化学成分确定的培养基。在一些实施方案中，本文所述的细胞培养物包含无血清培养基。在一些实施方案中，悬浮适应性细胞在摇瓶、旋转瓶、细胞袋或生物反应器中进行培养。
在一些实施方案中，本文所述的细胞培养物包含无血清培养基、无动物组分培养基或化学成分确定的培养基。在一些实施方案中，本文所述的细胞培养物包含无血清培养基。
在一些实施方案中，本文所述的大规模悬浮培养细胞培养物包括高密度细胞培养物。在一些实施方案中，培养物的总细胞密度为约1x10E+06个细胞/ml与约30x10E+06个细胞/ml之间。在一些实施方案中，超过约50％的细胞是活细胞。在一些实施方案中，细胞是HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如，HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CAP细胞或SF-9细胞。在其他实施方案中，细胞是HEK293细胞。
本文所述的方法可用于生产包含来自任何AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的rAAV颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV8和AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV8或AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV8衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV9衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV9衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB或AAV.7m8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含镶嵌衣壳。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型rAAV颗粒。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。
rAAV颗粒
所提供的方法适用于生产任何分离的重组AAV颗粒。因此，rAAV可以是本领域已知的任何血清型、修饰或衍生物，或本领域已知的其任何组合(例如，包含两种或更多种血清型，例如包含rAAV2、rAAV8和rAAV9颗粒中的两种或更多种的rAAV颗粒群)。在一些实施方案中，rAAV颗粒是AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7,AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV颗粒或其两种或更多种的组合。
在一些实施方案中，rAAV颗粒具有来自选自AAV1、AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其衍生物、修饰或假型的AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与例如选自AAV1、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的例如VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV1、AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与例如选自AAV1、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的例如VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含如Zinn等人,2015,Cell Rep.12(6):1056-1068中所述的Anc80或Anc80L65的衣壳，所述文献以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，rAAV包含如美国专利号9,193,956；9458517；和9,587,282以及美国专利申请公开号2016/0376323中所述的具有氨基酸***LGETTRP或LALGETTRP之一的衣壳，所述申请各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含如美国专利号9,193,956；9,458,517；和9,587,282以及美国专利申请公布号2016/0376323中所述的AAV.7m8的衣壳，所述专利中的每一种以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号9,585,971中公开的任何AAV衣壳，诸如AAVPHP.B。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号9,840,719和WO 2015/013313中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV.Rh74和RHM4-1，所述专利中的每一种以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含WO 2014/172669中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV rh.74，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含如Georgiadis等人,2016,Gene Therapy 23:857-862和Georgiadis等人,2018,Gene Therapy 25:450中所述的AAV2/5的衣壳，所述文献中的每一种以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含WO 2017/070491中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV2tYF，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含如Puzzo等人,2017,Sci.Transl.Med.29(9):418中所述的AAVLK03或AAV3B的衣壳，所述文献以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号8,628,966；US 8,927,514；US 9,923,120和WO 2016/049230中公开的任何AAV衣壳，诸如HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15或HSC16，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在其他实施方案中，rAAV颗粒包含对肌肉组织具有增强的向性的衣壳，此类衣壳通过将含有RGD的肽***到感兴趣的亲代衣壳中而被工程化。此类示例性衣壳是AAVMYO(AAV9-RGDLGLS,MyoAAV.1A(AAV9-RGDLTTP)和MyoAAV1C(AAV9-RGDLSTP)(在AAV9的残基Q588之后***的肽)。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含PCT国际公开号WO2019/207132、WO2020/206189、WO2021/072197、WO2021/050974、WO2021/077000和WO 2022/020616中公开的任何AAV衣壳。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含在以下任何专利和专利申请中公开的AAV衣壳，所述专利和专利申请各自以引用的方式整体并入本文：美国专利号7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公开号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；以及国际专利申请公开号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与以下任何专利和专利申请中公开的AAV衣壳的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的衣壳蛋白，所述专利和专利申请各自以引用的方式整体并入本文：7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公开号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；和国际专利申请号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335。
在一些实施方案中，rAAV颗粒具有在国际申请公开号WO 2003/052051(参见例如SEQ ID NO:2)、WO 2005/033321(参见例如SEQ ID NO:123和88)、WO 03/042397(参见例如SEQ ID NO:2、81、85和97)、WO 2006/068888(参见例如SEQ ID NO:1和3-6)、WO 2006/110689(参见例如SEQ ID NO:5-38)、WO2009/104964(参见例如SEQ ID NO:1-5、7、9、20、22、24和31)、W0 2010/127097(参见例如SEQ ID NO:5-38)和WO 2015/191508(参见例如SEQ IDNO:80-294)和美国申请公开号20150023924(参见例如SEQ ID NO:1、5-10)中公开的衣壳蛋白，所述专利各自的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV衣壳的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的衣壳蛋白，所述AAV衣壳在国际申请公开号WO 2003/052051(参见例如SEQID NO:2)、WO 2005/033321(参见例如SEQ ID NO:123和88)、WO 03/042397(参见例如SEQID NO:2、81、85和97)、WO 2006/068888(参见例如SEQ ID NO:1和3-6)、WO 2006/110689(参见例如SEQ ID NO:5-38)、WO2009/104964(参见例如SEQ ID NO:1-5、7、9、20、22、24和31)、W0 2010/127097(参见例如SEQ ID NO:5-38)和WO 2015/191508(参见例如SEQ ID NO:80-294)和美国申请公开号20150023924(参见例如SEQ ID NO:1、5-10)中公开。
基于AAV的病毒载体的核酸序列以及制备重组AAV衣壳和AAV衣壳的方法在例如美国专利号7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公开号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；国际专利申请号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335；WO 2003/052051、WO 2005/033321、WO 03/042397、WO 2006/068888、WO 2006/110689、WO2009/104964、W0 2010/127097和WO 2015/191508，以及美国申请公开号20150023924中有所教导。
所提供的方法适用于生产编码转基因的重组AAV。在某些实施方案中，转基因来自表1A至表1C。在一些实施方案中，rAAV基因组包含载体，所述载体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)polyA信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码转基因的核酸序列。在用于表达完整或基本上完整的单克隆抗体(mAb)的其他实施方案中，rAAV基因组包含载体，所述载体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)polyA信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码抗体的轻链Fab和重链Fab或至少重链或轻链Fab以及任选地重链Fc区的核酸序列。在用于表达完整或基本上完整的mAb的其他实施方案中，rAAV基因组包含有包含以下组分的载体：(1)侧接表达盒的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)poly A信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码以下的核酸序列：抗VEGF(例如赛伐珠单抗(sevacizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)和溴珠单抗(brolucizumab))、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALK1(例如阿斯万卡单抗(ascrinvacumab))、抗C5(例如特斯多鲁单抗(tesidolumab)和依库丽单抗(eculizumab))、抗CD105(例如卡罗妥昔单抗(carotuximab))、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗(adalimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)和戈利木单抗(golimumab))、抗RGMa(例如伊莱单抗(elezanumab))、抗TTR(例如NI-301和PRX-004)、抗CTGF(例如帕姆雷单抗(pamrevlumab))、抗IL6R(例如沙曲利珠单抗(satralizumab)和沙利姆单抗(sarilumab))、抗IL4R(例如杜匹鲁单抗(dupilumab))、抗IL17A(例如依克珠单抗(ixekizumab)和苏金单抗(secukinumab))、抗IL-5(例如美泊利单抗(mepolizumab))、抗IL12/IL23(例如乌司奴单抗(ustekinumab))、抗CD19(例如尼比珠单抗(inebilizumab))、抗ITGF7 mAb(例如依托珠单抗(etrolizumab))、抗SOST mAb(例如罗莫珠单抗(romosozumab))、抗pKal mAb(例如拉那利尤单抗(lanadelumab))、抗ITGA4(例如那他珠单抗(natalizumab))、抗ITGA4B7(例如维多珠单抗(vedolizumab))、抗BLyS(例如贝利木单抗(belimumab))、抗PD-1(例如纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab))、抗RANKL(例如地诺单抗(densomab))、抗PCSK9(例如阿罗洛单抗(alirocumab)和依洛尤单抗(evolocumab))、抗ANGPTL3(例如依维苏单抗(evinacumab)*)、抗OxPL(例如E06)、抗fD(例如兰帕珠单抗(lampalizumab))或抗MMP9(例如安达昔单抗(andecaliximab))的重链Fab；任选地，具有与治疗性抗体的天然形式相同的同种型的Fc多肽，诸如IgG同种型氨基酸序列IgG1、IgG2或IgG4或其修饰的Fc；以及抗VEGF(例如赛伐珠单抗、兰尼单抗、贝伐珠单抗和溴珠单抗)、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALK1(例如阿斯万卡单抗)、抗C5(例如特斯多鲁单抗和依库丽单抗)、抗CD105或抗ENG(例如卡罗妥昔单抗)、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗、英夫利昔单抗和戈利木单抗)、抗RGMa(例如伊莱单抗)、抗TTR(例如NI-301和PRX-004)、抗CTGF(例如帕姆雷单抗)、抗IL6R(例如沙曲利珠单抗和沙利姆单抗)、抗IL4R(例如杜匹鲁单抗)、抗IL17A(例如依克珠单抗和苏金单抗)、抗IL-5(例如美泊利单抗)、抗IL12/IL23(例如乌司奴单抗)、抗CD19(例如尼比珠单抗)、抗ITGF7 mAb(例如依托珠单抗)、抗SOST mAb(例如罗莫珠单抗)、抗pKal mAb(例如拉那利尤单抗)、抗ITGA4(例如那他珠单抗)、抗ITGA4B7(例如维多珠单抗)、抗BLyS(例如贝利木单抗)、抗PD-1(例如纳武单抗和派姆单抗)、抗RANKL(例如地诺单抗)、抗PCSK9(例如阿罗洛单抗和依洛尤单抗)、抗ANGPTL3(例如依维苏单抗)、抗OxPL(例如E06)、抗fD(例如兰帕珠单抗)或抗MMP9(例如安达昔单抗)的轻链；其中所述重链(Fab和任选地Fc区)和所述轻链由自裂解的弗林蛋白酶(furin)(F)/F2A或柔性接头分隔，确保表达等量的所述重链多肽和所述轻链多肽。
在用于表达mRNA(诸如在miRNA和shRNA结构中在指导RNA(反义链)和/或过客RNA(有义链)的情况下的反义RNA)的其他实施方案中，rAAV基因组包含载体，所述载体包含以下组分：(1)侧接表达盒的AAV反向末端重复序列；(2)调节元件，诸如a)启动子/增强子，b)polyA信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码mRNA的核酸序列。在一些实施方案中，转基因(编码mRNA的核酸序列)包含微小RNA、shRNA或U7-snRNA编码序列或由其组成。
表1A
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表1B
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表1C
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在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码抗VEGF Fab的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码抗VEGF Fab的基于rAAV8的病毒载体。在更具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码兰尼单抗的基于rAAV8的病毒载体。在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码艾杜糖苷酶(IDUA)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码IDUA的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码IDS的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码低密度脂蛋白受体(LDLR)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码LDLR的基于rAAV8的病毒载体。在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码三肽基肽酶1(TPP1)蛋白的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码TPP1的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体的rAAV病毒载体。在一些实施方案中，rAAA颗粒是编码以下的rAAV病毒载体：γ-肌聚糖、Rab护卫蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道β3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同种型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)、阿柏西普、巴登氏病蛋白(CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、肌营养不良蛋白、微小肌营养不良蛋白、肌微管素1(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖6磷酸酶(G6P酶)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、运动神经元生存蛋白(SMN1)、运动神经元生存蛋白(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合物。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型AAV衣壳。在一些实施方案中，所述假型AAV衣壳是rAAV2/8或rAAV2/9假型AAV衣壳。用于生产和使用假型rAAV颗粒的方法是本领域已知的(参见例如Duan等人,J.Virol.,75:7662-7671(2001)；Halbert等人,J.Virol.,74:1524-1532(2000)；Zolotukhin等人,Methods 28:158-167(2002)；以及Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075-3081,(2001)。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白是来自选自AAV1、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16的AAV血清型的2种或更多种AAV衣壳蛋白的嵌合体。
在某些实施方案中，可使用单链AAV(ssAAV)。在某些实施方案中，可使用自互补载体，例如scAAV(参见例如，Wu,2007,Human Gene Therapy,18(2):171-82；McCarty等人,2001,Gene Therapy,第8卷,第16期,第1248-1254页；以及美国专利号6,596,535；7,125,717；和7,456,683，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV8或AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV8或AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV8衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV9衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV9衣壳蛋白。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含镶嵌衣壳。镶嵌AAV颗粒由来自不同AAV的血清型的病毒衣壳蛋白的混合物组成。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含镶嵌衣壳，所述镶嵌衣壳含有选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含镶嵌衣壳，所述镶嵌衣壳含有选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVhu.37、AAVrh.20和AAVrh.74的血清型的衣壳蛋白。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型rAAV颗粒。在一些实施方案中，假型rAAV颗粒包含(a)包含AAV ITR的核酸载体和(b)包含衍生自AAVx(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16)的衣壳蛋白的衣壳。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型rAAV颗粒，所述假型rAAV颗粒包含选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8和AAVrh.10、AAVhu.37、AAVrh.20以及AAVrh.74的AAV血清型的衣壳蛋白。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含含有AAV8衣壳蛋白的假型rAAV颗粒。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含由AAV9衣壳蛋白组成的假型rAAV颗粒。在一些实施方案中，假型rAAV8或rAAV9颗粒是rAAV2/8或rAAV2/9假型颗粒。用于生产和使用假型rAAV颗粒的方法是本领域已知的(参见例如Duan等人,J.Virol.,75:7662-7671(2001)；Halbert等人,J.Virol.,74:1524-1532(2000)；Zolotukhin等人,Methods 28:158-167(2002)；以及Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075-3081,(2001)。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8衣壳蛋白和来自选自以下的AAV血清型的一种或多种AAV衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8衣壳蛋白和来自选自以下的AAV血清型的一种或多种AAV衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、rAAVrh10、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVhu.37、AAVrh.20和AAVrh.74。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9衣壳蛋白和选自以下的一种或多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9衣壳蛋白和选自以下的一种或多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVhu.37、AAVrh.20和AAVrh.74。
用于分离rAAV颗粒的方法
在一些实施方案中，本公开提供了用于生产重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，所述方法包括从包含杂质的进料(例如，rAAV生产培养物)中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文所述的用于生产重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法包括(a)从包含杂质的进料(例如，rAAV生产培养物)中分离rAAV颗粒，以及(b)配制分离的rAAV颗粒以生产制剂。
在一些实施方案中，本公开还提供了用于生产药物单位剂量的包含分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的制剂的方法，所述方法包括从包含杂质的进料(例如，rAAV生产培养物)中分离rAAV颗粒，以及配制分离的rAAV颗粒。
分离的rAAV颗粒可以使用本领域已知的方法来分离。在一些实施方案中，分离rAAV颗粒的方法包括下游处理，例如像收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如，通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、无菌过滤或其任何组合。在一些实施方案中，下游加工包括以下中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种：收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱和无菌过滤。在一些实施方案中，下游加工包括收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如通过深度过滤)、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，下游加工包括澄清收获的细胞培养物、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，下游加工包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，澄清收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，下游加工不包括离心。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，分离根据本文所述的方法生产的rAAV颗粒的方法包括收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如，通过深度过滤)、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如，整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，分离本文所述的rAAV颗粒的方法包括收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如，通过深度过滤)、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如，整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，分离根据本文所述的方法生产的rAAV颗粒的方法包括澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如，整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，分离本文公开的rAAV颗粒的方法包括澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如，整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，分离根据本文所述的方法生产的rAAV颗粒的方法包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如，整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，分离本文所述的rAAV颗粒的方法包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如，整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，方法不包括离心。在一些实施方案中，澄清收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9血清型的衣壳蛋白。
用于生产rAAV颗粒的许多方法是本领域已知的，包括转染、稳定的细胞系生产以及包括腺病毒-AAV杂合体、疱疹病毒-AAV杂合体和杆状病毒-AAV杂合体的感染性杂合病毒生产***。用于生产rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物全部都需要：(1)合适的宿主细胞，包括例如人衍生细胞系，诸如HeLa、A549或HEK293细胞及其衍生物(HEK293T细胞、HEK293F细胞)，哺乳动物细胞系，诸如Vero和羊水细胞衍生细胞，诸如CAP细胞，或昆虫衍生细胞系诸如SF-9(在杆状病毒生产***的情况下)；(2)合适的辅助病毒功能，其由野生型或突变型腺病毒(诸如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；(3)AAV rep和cap基因以及基因产物；(4)由AAV ITR序列侧接的转基因(诸如治疗性转基因)；以及(5)支持rAAV生产的合适的培养基和培养基组分。在一些实施方案中，合适的辅助病毒功能由本文所述的重组多核苷酸或本文所述的质粒提供。本领域已知的合适的培养基可用于生产rAAV载体。这些培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括如美国专利号6,723,551中所述的改良伊格尔培养基(Modified Eagle Medium，MEM)、杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)和Sf-900 IISFM培养基，所述专利以引用的方式整体并入本文。
rAAV生产培养物可常规地在适合于所利用的特定宿主细胞的各种条件下(在广泛温度范围内、改变时间长度等)生长。如本领域中已知的，rAAV生产培养物包括可在合适的粘附依赖性容器，例如像滚瓶、中空纤维过滤器、微载剂和填充床或流化床生物反应器中培养的粘附依赖性培养物。rAAV载体生产培养物还可包含悬浮适应性宿主细胞，诸如HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CAP细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞，它们可以多种方式进行培养，包括例如旋转瓶、搅拌罐生物反应器和一次性***，诸如波浪袋***。在一些实施方案中，细胞是HEK293细胞。在一些实施方案中，所述细胞是适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。用于生产rAAV颗粒的许多悬浮培养物是本领域已知的，包括例如在美国专利号6,995,006、9,783,826和在美国专利申请公开号20120122155中公开的培养物，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，所述rAAV生产培养物包括高密度细胞培养物。在一些实施方案中，所述培养物的总细胞密度为约1x10E+06个细胞/ml与约30x10E+06个细胞/ml之间。在一些实施方案中，超过约50％的细胞是活细胞。在一些实施方案中，细胞是HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如，HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CAP细胞或SF-9细胞。在其他实施方案中，细胞是HEK293细胞。在其他实施方案中，所述细胞是适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。
在所提供方法的另外的实施方案中，所述rAAV生产培养物包含有包含rAAV颗粒的悬浮培养物。用于生产rAAV颗粒的许多悬浮培养物是本领域已知的，包括例如在美国专利号6,995,006、9,783,826和在美国专利申请公开号20120122155中公开的培养物，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，悬浮培养物包括哺乳动物细胞的培养物或昆虫细胞的培养物。在一些实施方案中，悬浮培养物包括HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CAP细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞的培养物。在一些实施方案中，悬浮培养物包括HEK293细胞的培养物。
在一些实施方案中，用于生产rAAV颗粒的方法涵盖提供包含能够生产rAAV的细胞的细胞培养物；向细胞培养物中添加组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂至约0.1mM与约20mM之间的最终浓度；以及将细胞培养物保持在允许生产rAAV颗粒的条件下。在一些实施方案中，HDAC抑制剂包含短链脂肪酸或其盐。在一些实施方案中，HDAC抑制剂包含丁酸盐(例如丁酸钠)、丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)、丙酸盐(例如丙酸钠)或其组合。
在一些实施方案中，rAAV颗粒如WO 2020/033842中所公开生产，所述文献以引用的方式整体并入本文。
可通过收获包含宿主细胞的生产培养物或从生产培养物中收获废培养基(spentmedia)来从rAAV生产培养物中收获重组AAV颗粒，前提是要在本领域已知的条件下培养细胞以使rAAV颗粒从完整的宿主细胞释放到培养基中。还可通过裂解生产培养物的宿主细胞来从rAAV生产培养物中收获重组AAV颗粒。裂解细胞的合适方法也是本领域已知的，并且包括例如多次冷冻/解冻循环、超声处理、微流化和使用化学物质诸如洗涤剂和/或蛋白酶处理。
在收获时，rAAV生产培养物可含有以下中的一种或多种：(1)宿主细胞蛋白；(2)宿主细胞DNA；(3)质粒DNA；(4)辅助病毒；(5)辅助病毒蛋白；(6)辅助病毒DNA；和(7)培养基组分，包括例如血清蛋白、氨基酸、转铁蛋白和其他低分子量蛋白。rAAV生产培养物还可含有产物相关的杂质，例如无活性载体形式、空的病毒衣壳、聚集的病毒颗粒或衣壳、错误折叠的病毒衣壳、降解的病毒颗粒。
在一些实施方案中，澄清rAAV生产培养物收获物以去除宿主细胞碎片。在一些实施方案中，所述生产培养物收获物通过经由一系列深度过滤器的过滤来澄清。还可通过本领域已知的多种其他标准技术来实现澄清，诸如离心或通过本领域已知的0.2mm或更大孔径的任何乙酸纤维素过滤器的过滤。在一些实施方案中，澄清收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，所述生产培养物收获物通过离心来澄清。在一些实施方案中，澄清生产培养物收获物不包括离心。
在一些实施方案中，使用过滤澄清收获的细胞培养物。在一些实施方案中，澄清收获的细胞培养物包括深度过滤。在一些实施方案中，澄清收获的细胞培养物还包括深度过滤和无菌过滤。在一些实施方案中，使用包括一种或多种不同过滤介质的过滤器系列澄清收获的细胞培养物。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括一种或多种深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括两种深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括无菌过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括2种深度过滤介质和无菌过滤介质。在一些实施方案中，深度过滤器介质是多孔深度过滤器。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括20MS、/>C0HC和无菌级过滤器介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括20MS、/>C0HC和/>2XLG 0.2μm。在一些实施方案中，在使收获的细胞培养物与深度过滤器接触之前对其进行预处理。在一些实施方案中，所述预处理包括将盐添加到收获的细胞培养物中。在一些实施方案中，所述预处理包括将化学絮凝剂添加到收获的细胞培养物中。在一些实施方案中，在使收获的细胞培养物与深度过滤器接触之前不对其进行预处理。
在一些实施方案中，通过公开于WO 2019/212921中的过滤来澄清生产培养物收获物，所述文献以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，使用核酸酶(例如)或核酸内切酶(例如来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸内切酶)处理rAAV生产培养物收获物，以消化生产培养物中存在的高分子量DNA。核酸酶或核酸内切酶消化可常规地在本领域已知的标准条件下进行。例如，核酸酶消化在最终浓度为1-2.5个单位/ml/>温度在环境温度至37℃范围内，时间段为30分钟至若干个小时下进行。
无菌过滤涵盖使用无菌级过滤器介质的过滤。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是0.2或0.22μm的孔过滤器。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质包括聚醚砜(PES)。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质包括聚偏氟乙烯(PVDF)。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有0.8μm的预过滤器和0.2μm的最终滤膜的亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有1.2μm的预过滤器和0.2μm的最终滤膜的亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是0.2或0.22μm的孔过滤器。在其他实施方案中，所述无菌级过滤器介质是0.2μm的孔过滤器。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是2XLG 0.2μm、DuraporeTMPVDF膜0.45μm或/>PES1.2μm+0.2μm标称孔径组合。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是/>2XLG 0.2μm。
在一些实施方案中，在将澄清的进料施加到色谱介质例如亲和色谱介质之前，将其经由切向流过滤(“TFF”)进行浓缩。Paul等人,Human Gene Therapy 4:609-615(1993)已描述了使用TFF超滤的大规模病毒浓缩。澄清进料的TFF浓缩使得经受色谱法的澄清进料的体积在技术上可以控制，并且可使柱得以更合理地设定大小，而无需漫长的再循环时间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少两倍与至少十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少十倍与至少二十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少二十倍与至少五十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩约二十倍。本领域普通技术人员还将认识到，TFF还可用于经由渗滤从所述澄清进料中去除小分子杂质(例如包含培养基组分、血清白蛋白或其他血清蛋白的细胞培养物污染物)。在一些实施方案中，对澄清进料进行渗滤以去除小分子杂质。在一些实施方案中，所述渗滤包括使用约3倍与约10倍之间的渗滤体积的缓冲液。在一些实施方案中，所述渗滤包括使用约5倍渗滤体积的缓冲液。本领域普通技术人员还将认识到，TFF还可用于纯化过程中的任何步骤，其中期望在执行纯化过程的下一步骤之前交换缓冲液。在一些实施方案中，本文所述的用于从澄清进料中分离rAAV的方法包括使用TFF以交换缓冲液。
亲和色谱可用于从组合物中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，亲和色谱用于从澄清进料中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，亲和色谱用于从已经过切向流过滤的澄清进料中分离rAAV颗粒。合适的亲和色谱介质是本领域已知的，并且包括但不限于AVBSepharoseTM、POROSTMCaptureSelectTMAAVX亲和树脂、POROSTMCaptureSelectTMAAV9亲和树脂和POROSTMCaptureSelectTMAAV8亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTMCaptureSelectTMAAV9亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTMCaptureSelectTMAAV8亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTMCaptureSelectTMAAVX亲和树脂。
阴离子交换色谱可用于从组合物中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，在亲和色谱后使用阴离子交换色谱作为最终浓缩和抛光步骤。合适的阴离子交换色谱介质是本领域已知的，并且包括但不限于UNOsphereTMQ(Biorad,Hercules,Calif.)和N带电荷的氨基或亚氨基树脂，例如像POROSTM50PI或任何DEAE、TMAE、叔胺或季胺或本领域已知的PEI基树脂(美国专利号6,989,264；Brument等人,Mol.Therapy 6(5):678-686(2002)；Gao等人,Hum.GeneTherapy 11:2079-2091(2000))。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质包含季胺。在一些实施方案中，所述阴离子交换介质是整体式阴离子交换色谱树脂。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质包括甲基丙烯酸缩水甘油酯-二甲基丙烯酸乙二醇酯或苯乙烯-二乙烯基苯聚合物。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质选自由CIMmultusTMQA-1高级复合柱(季胺)、CIMmultusTMDEAE-1高级复合柱(二乙氨基)、QA盘(季胺)、/>DEAE和/>EDA盘(乙烯二氨基)组成的组。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质是CIMmultusTMQA-1高级复合柱(季胺)。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质是/>QA盘(季胺)。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质是CIM QA(BIA Separations，Slovenia)。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质是BIA/>QA-80(柱体积为80mL)。本领域普通技术人员可理解的是，可确定具有合适离子强度的洗涤缓冲液，使得rAAV保持与树脂的结合，同时杂质(包括但不限于可能由上游纯化步骤引入的杂质)被除去。
在一些实施方案中，阴离子交换色谱是根据WO 2019/241535中公开的方法进行的，所述文献以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，一种分离rAAV颗粒的方法包括确定包含分离的rAAV颗粒的组合物中的载体基因组滴度、衣壳滴度和/或完整衣壳与空衣壳的比率。在一些实施方案中，载体基因组滴度由定量PCR(qPCR)或数字PCR(dPCR)或液滴数字PCR(ddPCR)确定。在一些实施方案中，衣壳滴度由血清型特异性ELISA确定。在一些实施方案中，完整衣壳与空衣壳的比率通过分析型超速离心法(AUC)或透射电子显微镜(TEM)确定。
在一些实施方案中，载体基因组滴度、衣壳滴度和/或完整衣壳与空衣壳的比率通过分光光度法，例如通过测量组合物在260nm处的吸光度；并测量组合物在280nm处的吸光度来确定。在一些实施方案中，rAAV颗粒在测量组合物的吸光度之前未变性。在一些实施方案中，rAAV颗粒在测量组合物的吸光度之前变性。在一些实施方案中，使用分光光度计测定组合物在260nm和280nm处的吸光度。在一些实施方案中，使用HPLC测定组合物在260nm和280nm处的吸光度。在一些实施方案中，吸光度是峰值吸光度。用于测量组合物在260nm和280nm处的吸光度的几种方法是本领域已知的。WO 2019/212922中公开了确定包含分离的重组rAAV颗粒的组合物的载体基因组滴度和衣壳滴度的方法，所述专利以引用的方式整体并入本文。
在另外的实施方案中，本公开提供了包含根据本文所述的方法生产的分离的rAAV颗粒的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是包含药学上可接受的载剂的药物组合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指适用于一种或多种施用途径、体内递送或接触的生物学上可接受的制剂，其为气态、液态或固态或其混合物。“药学上可接受的”组合物是在生物学上或其他方面不是不期望的材料，例如可向受试者施用所述材料而不会引起实质的不期望的生物学效应。因此，这种药物组合物可用于例如向受试者施用根据所公开的方法分离的rAAV。此类组合物包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳剂(例如水包油或油包水)、悬浮液、糖浆、酏剂、分散和悬浮介质、包衣、等渗剂和吸收促进剂或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。此类药学上可接受的载剂包括片剂(包衣的或未包衣的)、胶囊(硬或软的)、微珠、粉末、颗粒和晶体。也可将补充活性化合物(例如防腐剂、抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)掺入组合物中。如本文所列出或本领域技术人员已知的，可将药物组合物配制为与特定的施用或递送途径相容。因此，药物组合物包括适用于通过各种途径施用的载剂、稀释剂或赋形剂。适用于本发明的rAAV颗粒以及方法和用途的药物组合物和递送***是本领域已知的(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2003)第20版,MackPublishing Co.,Easton,Pa.；Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)第18版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.；The Merck Index(1996)第12版,Merck PublishingGroup,Whitehouse,N.J.；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(1993),Technonic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,Pa.；Ansel和Stoklosa,PharmaceuticalCalculations(2001)第11版,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,Md.；以及Poznansky等人,Drug Delivery Systems(1980),R.L.Juliano编,Oxford,N.Y.,第253-315页)。
在一些实施方案中，所述组合物是药物单位剂量。“单位剂量”是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的实体上离散单位；每个单位含有任选地与药物载剂(赋形剂、稀释剂、媒介物或填充剂)缔合的预定数量，该数量经过计算以便当以一个或多个剂量施用时，可产生所需的作用(例如预防性或治疗性作用)。单位剂型可在例如安瓿和小瓶内，所述单位剂型可包括液体组合物或处于冷冻干燥或冻干状态的组合物；例如，可在体内施用或递送之前添加无菌液体载剂。各别单位剂型可包括在多剂量药盒或容器中。重组载体(例如，AAV)序列、质粒、载体基因组和重组病毒颗粒及其药物组合物可以单个或多个单位剂型包装，以便于剂量的施用和均匀性。在一些实施方案中，组合物包含rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV衣壳血清型是AAV8。在一些实施方案中，所述AAV衣壳血清型是AAV9。
实施例
实施例1.改进的辅助质粒的开发。
质粒pAdDeltaF6由宾夕法尼亚大学的James M.Wilson博士及其同事构建。pAdDeltaF6的大小为15770bp。质粒含有对AAV复制重要的腺病毒基因组区域，即E2A(DNA结合蛋白)、E4和VA RNAI，但不含有其他腺病毒复制基因。质粒衍生自Ad5的E1、E3缺失分子克隆(pBHG10，其为基于pBR322的质粒)。在Ad5 DNA中引入缺失以去除不必要的腺病毒基因的表达，并且将腺病毒DNA的量从32kb减少到12kb(图1A)。最后，用卡那霉素抗性基因置换氨苄青霉素抗性基因以得到pAdDeltaF6(图1B)。AAV载体生产所必需的E2A、E4和VA RNAI腺病毒基因的功能元件保留在该质粒中。腺病毒E1必需基因功能由HEK293细胞提供。还有一些残留基因/元件是由pBHG10的部分消化产生的。这些包括图谱中的无启动子L3 23K/病毒内切蛋白酶、L4 100K/六邻体组装基因、L4 pVIII/六邻体相关前体和L5 pVI/纤维基因。图1C)。在pAdDeltaF6质粒中，这些基因由于其启动子MLP(主要晚期启动子)的缺失而无法转录。Biasiotto等人,Int.J.Mol.Sci.,16:2893-2912；doi:10.3390/ijms16022893(2015)。由于这些基因中的一些(包括L4 100K和L4 pVIII)与E2A区域重叠，因此这些基因的缺失可能会如下所述在辅助质粒顺序重新配置期间影响必需辅助蛋白E2A的产生。此外，存在具有其位于该区域的自身完整的启动子的L4 22K/33K基因。该基因编码参与腺病毒5包装的L422K和L4 33K蛋白。L4 22K/33K基因的启动子也与E2A区域重叠。因此，启动子的缺失可能会影响E2A的产生。质粒图谱中存在部分腺病毒反向末端重复序列，其也是由pBHG10的部分消化产生的。然而，由于腺病毒5DNA复制的必需DNA聚合酶基因(E2区)的缺失，预期不会生成感染性腺病毒。DNA质粒测序由Qiagen Genomic Services执行，并且揭示了与参考序列pAdDeltaF6 p1707FH-Q的以下重要功能元件100％同源：E4 ORF6 3692-2808bp；E2A DNA结合蛋白11784-10194bp；VA RNAI区12426-13378bp。作为制造过程的一部分，所述序列在Aldevron处得到确认。
新辅助质粒编号1新辅助质粒编号1(图2)是基于Ad5序列构建的，其中E2A和E4方向被重新配置为双向表达。其背后的基本原理是避免来自E4强启动子的可能干扰，其可能导致位于下游的E2A启动子的表达降低。新辅助质粒编号1基因由Genscript合成，并且克隆到可从Genscript免费获得的pUC57载体的EcoRI/NotI位点中。在该新设计的质粒中，一些非必需的残留基因(Ad5结构基因)和元件被去除，所述元件包括E4启动子旁边的ITR序列(Ad5反向末端重复序列)、L3 23K/病毒内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和L4 pVIII/六邻体相关前体序列。在另一个方面，保留了L4 33K/L4 100K六邻体组装基因，因为E2A转录起始位点(TSS)位于该区域，并且它们的去除可能会影响E2A表达。通过将VA RNAII掺入VA RNAI来进一步修饰病毒相关(VA)RNA。已知VA RNA刺激受感染细胞中的病毒蛋白合成并通过调节先天细胞反应来拮抗干扰素诱导的细胞防御***(Ma等人,Journal of Virology,1996年8月,第5083-5099页)。新质粒的大小为11,484bp。
新辅助质粒编号1提高了AAV滴度，并且在不同的转基因上表现良好，如图3所示。使用克隆1、2、3、4和5HEK293衍生的宿主细胞评估rAAV生产滴度。
新辅助质粒编号2新辅助质粒编号2(图4)是基于新辅助质粒编号1设计的。在该新设计中，通过顺序缺失对E4区域进行了切割，并研究了缺失对AAV生产的影响。基于表明E4Orf 1和2的缺失提高了AAV滴度的结果，使E4 Orf 1和2缺失(数据未显示)。本领域已知控制E4区的启动子在腺病毒感染的早期阶段是有活性的，并且持续到晚期。E4区域具有转录和编码7种不同蛋白质的潜力，所述蛋白质是由该启动子生成的单个初级转录物(Orf1、2、3、3/4、4、6、6/7)的差异剪接产生的。该转录物的差异剪接模式在病毒感染阶段期间发生变化，一些仅出现在早期阶段，而其他则出现在晚期(Dix等人,Journal of GeneralVirology(1995),76,1051-1055)。据报道，Orf1、Orf2、Orf3、Orf4、Orf6和Orf6/7的编码蛋白产物存在于受感染细胞中，但Orf3/4除外，Orf3/4可能不存在或表达低于检测限(等人,Gene278(2001)1-23)。Orf1编码的蛋白在晚期表达，并靶向在细胞信号传导和信号转染中发挥作用的细胞蛋白家族。没有关于由Orf2编码的E4产物的功能信息。此外，E4 Orf2缺失的Ad5突变体即将生长至野生型水平(/>等人,Gene 278(2001)1-23)。Orf1和2的缺失不影响AAV生产，但会提高其滴度，这表明E4 Orf1和2并不是必需的(图5)。使用克隆1、2、4和6HEK293衍生的宿主细胞来评估rAAV生产滴度。
新辅助质粒编号3在辅助质粒编号3设计期间，通过顺序缺失对E4区域进行进一步切割。筛选具有E4天然启动子和CMV启动子的不同E4变体用于AAV生产(图6)。仅具有E4Orf6-7的那些E4变体给出最高滴度。E4 Orf3-4进一步从辅助编号2中去除以生成辅助编号3(图7)。为了进一步解释去除Orf3和Orf4背后的基本原理，Orf3和Orf6似乎可以部分或全部弥补彼此的缺陷。Orf3和Orf6具有冗余功能，并且独立地扩大病毒DNA复制、晚期病毒蛋白合成、宿主蛋白合成的关闭，并且防止病毒基因组形成多联体(等人,Gene278(2001)1-23)。E4 Orf4还通过经由其与丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A)相互作用来抑制E1A介导的E4启动子反式激活，从而下调E4转录，所述丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A)是一种在许多细胞过程中发挥重要作用的酶。在感染的早期阶段期间，可能需要这种自动调节环路来限制E4基因产物的细胞毒性作用，其中E4 Orf4可通过半胱天冬酶激活来以细胞系特异性方式诱导细胞凋亡。因此，进一步去除E4 Orf5导致防止这种细胞毒性作用(/>等人,Gene278(2001)1-23)。
辅助编号3提高了AAV滴度，包括AAV8和AAV9以及不同的转基因(图8和图9)。使用克隆1和克隆4HEK293衍生的宿主细胞评估rAAV生产滴度。
新辅助质粒编号4研究了向新辅助质粒添加其他基因以进一步提高AAV滴度的可能性。探索了掺入来自博卡病毒辅助的选定基因(据报道所述选定基因对AAV生产具有积极影响(Wang等人,Molecular Therapy:Methods&Clinical DevelopmentVol.11December2018))、在CMV启动子下添加E1A基因和AAP(衍生自反式质粒的组装激活蛋白)的拷贝。将博卡病毒选定基因NP1和NS2基因添加到辅助质粒编号2(图10)对AAV滴度没有影响(图11)。本领域已知，AAV衣壳所编码的组装激活蛋白在反式表达时可以提供增加的衣壳蛋白稳定性(Maurer等人,2018,Cell Reports 23,1817-1830；Maurer等人,JournalVirology,2019第93卷第7期e02013-18)。添加AAV8的反式表达的AAP基因(图12)对AAV滴度具有负面影响(图14)。已知E1A通过增强rep基因启动子P5和P19的转录以及激活E2A和E4腺病毒启动子来启动AAV病毒复制。还已知E1A控制宿主细胞周期以适应AAV病毒DNA复制。过表达E1A的潜在缺点是已知它稳定p53，这可能会导致细胞凋亡。这可以通过E1B55K和E4Orf6蛋白来克服，所述蛋白质将与p53形成复合物并导致其降解(Matsushita等人,Journal of General Virology(2004),85,2209-2214；Meier等人,Viruses2020,12,662；)。将CMV启动子控制下的E1A拷贝添加至辅助质粒编号3以创建辅助质粒编号4(图13)。E1A的位置位于E4和VA RNA I/II之间。结果表明，辅助编号4进一步提高了AAV滴度，如图14所示。使用克隆1和4HEK293衍生的宿主细胞评估rAAV生产滴度。
新辅助质粒编号5、编号6、编号7、编号8和编号9已知E2A、E4和VA RNA I/II微小RNA是AAV生产的必需辅助组分(Meier等人,Viruses 2020,12,662；doi:10.3390/v12060662)。在当前的辅助质粒编号1-4中，L4 100K/六邻体组装和L4 22K/33K保留在辅助质粒编号3中，因为它们的基因位于E2A启动子和E2A开放阅读框之间。该区域可能很重要，因为两个E2A转录起始位点(TSS)位于该区域，如Donovan-Banfield等人的长读直接RNA测序研究所记录的(Communication Biology(2020)3:124)。为了测试是否可以在维持高滴度的同时去除这两个序列，基于辅助编号3生成了几个突变(表2)。所有这些突变的分析表明，辅助编号5和辅助编号8给出了与辅助质粒编号3类似的滴度或比之更高的滴度(图15)。使用克隆1和4HEK293衍生的宿主细胞评估rAAV生产滴度。在辅助质粒编号5中，将编码的六邻体组装的N末端区域去除，而在辅助质粒编号8中，六邻体组装区域的起始密码子发生突变。在另一个方面，L4 22K/33K起始密码子发生突变的所有突变体均显示出滴度降低，这表明L422K/33K可能对AAV生产很重要。这些发现与L4 22K缺失的报道效果一致，所述L4 22K缺失导致E2A(DBP)表达在后期阶段持续增加，并且随后对E4表达具有负面影响(Wu等人,Journal of Virology(2012)p.10474-10483；Guimet等人,Journal of Virology(2013)p.7688-7699)。
新的辅助质粒还改善了产生的rAAV颗粒的质量。与使用在转染过程中转移至200L生产生物反应器的原始辅助执行的生产运行相比，使用辅助编号5转染过程执行的编码转基因A的病毒载体生产导致完整衣壳％显著增加(比较36.2％至71.9％完整，如通过AUC测量的)。
表2.基于辅助质粒编号3的六邻体组装和L4 22K/33K基因的突变
| 质粒 | 大小 | 六邻体组装 | L4 22K/33K |
| 辅助编号5 | 8.2Kb | 部分缺失 | |
| 辅助编号6 | 8.2Kb | 部分缺失 | 突变(终止密码子) |
| 辅助编号7 | 10.0Kb | 突变(终止密码子) | |
| 辅助编号8 | 10.0Kb | 突变(终止密码子) | |
| 辅助编号9 | 10Kb | 突变(终止密码子) | 突变(终止密码子) |
尽管所公开的方法已经结合当前被认为是最实际和优选的实施方案来描述，但是应当理解，本公开所涵盖的方法不限于所公开的实施方案，而是相反，旨在覆盖包括在所附权利要求书的精神和范围内的各种修改和等效安排。
所有出版物、专利、专利申请、互联网站点和登录号/数据库序列(包括本文引用的多核苷酸和多肽序列)出于所有目的在此以引用的方式整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、互联网站点或登录号/数据库序列具体地且单独地被指示为以引用的方式并入。
Claims (119)
1.一种分离的重组多核苷酸，其包含以下中的一种或多种：
a)编码腺病毒E2A DNA结合蛋白(DBP)的核苷酸序列，其可操作地连接至第一启动子和第一polyA信号；
b)编码腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的核苷酸序列，其可操作地连接至第二启动子和第二polyA信号；以及
c)编码腺病毒VA RNA I的核苷酸序列，
其中所述分离的重组多核苷酸不包含编码腺病毒ITR序列、L323K内切蛋白酶、L5 pVI/纤维和/或L4 pVIII/六邻体相关前体的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含：
a)编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列、编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列以及编码所述腺病毒VA RNA I的所述核苷酸序列；
b)编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列和编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列；
c)编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列和编码所述腺病毒VA RNA I的所述核苷酸序列；
d)编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列和编码所述腺病毒VA RNA I的所述核苷酸序列；
e)编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列；
f)编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列；或
g)编码所述腺病毒VA RNA I的所述核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的分离的重组多核苷酸，其包含编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列、编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列以及编码所述腺病毒VARNA I的所述核苷酸序列，其中编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列和编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7的所述核苷酸序列处于相反的5’至3’方向。
4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒E2ADBP的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
5.如权利要求1至3中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒E2ADBP的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:1。
6.如权利要求1至5中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E2A DBP包含与SEQ ID NO:45具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求1至5中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E2A DBP包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
8.如权利要求1至7中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒E4ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
9.如权利要求1至7中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒E4ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:8。
10.如权利要求1至9中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含与SEQ ID NO:46具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
11.如权利要求1至9中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
12.如权利要求1至11中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒VARNA I的所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
13.如权利要求1至11中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒VARNA I的所述核苷酸序列编码VA RNA I和VA RNA II，并且任选地包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
14.如权利要求1至13中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子和第二启动子是不同的启动子。
15.如权利要求1至14中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子是腺病毒E2A启动子、CMV启动子或CMV衍生性启动子。
16.如权利要求15所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子是腺病毒E2A启动子。
17.如权利要求16所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E2A启动子包含与SEQID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
18.如权利要求16所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E2A启动子包含SEQ IDNO:2的核苷酸序列。
19.如权利要求15至18中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒E2A启动子和E2A DBP的所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO:3或4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
20.如权利要求15至18中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒E2A启动子和E2A DBP的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:3或4。
21.如权利要求15至18中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒E2A启动子和E2A DBP的所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO:22或23具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
22.如权利要求15至18中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒E2A启动子和E2A DBP的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:22或23。
23.如权利要求1至14中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子是诱导型启动子。
24.如权利要求1至23中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第二启动子是腺病毒E4启动子、CMV启动子或CMV衍生性启动子。
25.如权利要求24所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第二启动子是腺病毒E4启动子。
26.如权利要求25所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E4启动子包含与SEQID NO:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
27.如权利要求25所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E4启动子包含SEQ IDNO:5的核苷酸序列。
28.如权利要求1至23中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第二启动子是诱导型启动子。
29.如权利要求1至28中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
30.如权利要求1至28中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
31.如权利要求1至28中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
32.如权利要求1至28中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
33.如权利要求1至28中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其还包含编码博卡病毒NP1和NS2多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至第三启动子和第三polyA信号。
34.如权利要求33所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述博卡病毒NP1和NS2多肽的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
35.如权利要求33所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述博卡病毒NP1和NS2多肽的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:12。
36.如权利要求33至35中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第三启动子是CMV启动子。
37.如权利要求33至35中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
38.如权利要求33至35中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列。
39.如权利要求33至38中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
40.如权利要求33至38中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
41.如权利要求1至28中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其还包含编码腺相关病毒(AAV)组装激活蛋白(AAP)的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至第三启动子和第三polyA信号。
42.如权利要求41所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述AAV AAP的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
43.如权利要求41所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述AAV AAP的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:15。
44.如权利要求41至43中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第三启动子是CMV启动子。
45.如权利要求41至44中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
46.如权利要求41至44中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
47.如权利要求41至46中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
48.如权利要求41至46中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
49.如权利要求1至28中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其还包含编码腺病毒E1A多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至第三启动子和第三polyA信号。
50.如权利要求49所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒E1A多肽的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
51.如权利要求49所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述腺病毒E1A多肽的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:18。
52.如权利要求49所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E1A多肽包含与SEQ IDNO:51具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
53.如权利要求49所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒E1A多肽包含SEQ IDNO:51的氨基酸序列。
54.如权利要求49至53中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第三启动子是CMV启动子。
55.如权利要求49至54中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:19具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
56.如权利要求49至54中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
57.如权利要求49至56中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
58.如权利要求49至56中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列。
59.如权利要求1至27、33至36、41至44以及49至54中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和所述E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4 100k/六邻体组装多肽的所述N末端缺失对应于SEQ ID NO:21的核苷酸序列。
60.如权利要求59所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和所述E2A DBP的所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO:22具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
61.如权利要求59所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和所述E2A DBP的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:22。
62.如权利要求1至27、33至36、41至44以及49至54中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含其起始密码子中的突变的L4 100k/六邻体组装多肽和所述E2A DBP的核苷酸序列。
63.如权利要求62所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含其起始密码子中的突变的L4 100k/六邻体组装多肽和所述E2A DBP的所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
64.如权利要求62所述的分离的重组多核苷酸，其中编码所述E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含其起始密码子中的突变的L4 100k/六邻体组装多肽和所述E2A DBP的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:23。
65.如权利要求1至27、33至36、41至44以及49至54中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和所述E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4 100k/六邻体组装多肽的所述N末端缺失涵盖L4 100k/六邻体组装的起始密码子，但不涵盖所述L4 22K/33K多肽的起始密码子。
66.如权利要求1至27、33至36、41至44以及49至54中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和所述E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4 100k/六邻体组装多肽的全部或一部分是缺失的而不破坏所述L4 22K/33K起始密码子。
67.如权利要求1至27、33至36、41至44和49至54以及45至50中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述E2A启动子、L4 22K/33K多肽和启动子、包含N末端缺失的L4 100k/六邻体组装多肽和所述E2A DBP的核苷酸序列，其中所述L4 100k/六邻体组装的所述N末端缺失从L4 100k/六邻体组装的起始密码子开始并且在紧邻所述L4 22K/33K启动子处结束。
68.如权利要求1至27、33至36、41至44和49至54以及59至67中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:25、27、29、31或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
69.如权利要求1至27、33至36、41至44和49至54以及59至67中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:25、27、29、31或33的核苷酸序列。
70.如权利要求1至27、33至36、41至44和49至54以及59至69中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:26、28、30、32或34具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
71.如权利要求1至27、33至36、41至44和49至54以及59至69中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:26、28、30、32或34的核苷酸序列。
72.如权利要求1至71中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列、编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列以及编码所述腺病毒VA RNA I的所述核苷酸序列。
73.如权利要求1至71中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列和编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列。
74.如权利要求1至71中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列和编码所述腺病毒VA RNA I的所述核苷酸序列。
75.如权利要求1至71中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列和编码所述腺病毒VA RNAI的所述核苷酸序列。
76.如权利要求1至71中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列。
77.如权利要求1至71中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列。
78.如权利要求1至71中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码所述腺病毒VA RNA I的所述核苷酸序列。
79.如权利要求1至78中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸是包含细菌复制起点和选择性标记基因的质粒。
80.如权利要求79所述的分离的重组多核苷酸，其中所述细菌复制起点是ColE1起点。
81.如权利要求79或权利要求80所述的分离的重组多核苷酸，其中所述选择性标记基因是药物抗性基因。
82.如权利要求81所述的分离的重组多核苷酸，其中所述选择性标记基因是卡那霉素抗性基因。
83.如权利要求1至82中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:37-42或43具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
84.如权利要求1至82中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:37-42或43的核苷酸序列。
85.如权利要求1至82中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
86.如权利要求1至82中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。
87.一种宿主细胞，其包含如权利要求1至86中任一项所述的分离的重组多核苷酸。
88.如权利要求87所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
89.如权利要求87所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
90.如权利要求87所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
91.如权利要求87所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
92.如权利要求87所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞、CAP细胞或PerC6细胞。
93.一种生产如权利要求1至86中任一项所述的分离的重组多核苷酸的方法，其包括在合适的条件下孵育如权利要求87至92中任一项所述的宿主细胞。
94.如权利要求93所述的方法，其包括在合适的条件下孵育如权利要求88或权利要求89所述的宿主细胞。
95.一种生产重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，其包括培养能够生产所述rAAV颗粒的细胞，其中所述细胞包含
i.编码AAV衣壳蛋白的多核苷酸；
ii.编码功能性rep基因的多核苷酸；
iii.包含有包含至少一个AAV反相末端重复序列(ITR)和编码基因产物的非AAV核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非AAV核酸序列可操作地连接至指导所述基因产物在靶细胞中表达的序列；以及
iv.包含足够的辅助功能以允许在允许将所述基因组包装到所述AAV衣壳中的条件下将所述基因组包装到所述AAV衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中包含足够的辅助功能的所述一种或多种多核苷酸独立地构成如权利要求1至86中任一项所述的分离的重组多核苷酸。
96.如权利要求95所述的方法，其中包含足够的辅助功能的所述一种或多种多核苷酸构成所述分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列、编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列以及编码所述腺病毒VARNA I的所述核苷酸序列。
97.一种生产rAAV颗粒的方法，其包括
a)提供包含细胞的细胞培养物；
b)将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中，所述一种或多种多核苷酸包含：
i.编码AAV衣壳蛋白的多核苷酸；
ii.编码功能性rep基因的多核苷酸；
iii.包含有包含至少一个AAV反相末端重复序列(ITR)和编码基因产物的非AAV核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非AAV核酸序列可操作地连接至指导所述基因产物在靶细胞中表达的序列；以及
iv.包含足够的辅助功能以允许在允许将所述基因组包装到所述AAV衣壳中的条件下将所述基因组包装到所述AAV衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中包含足够的辅助功能的所述一种或多种多核苷酸独立地构成如权利要求1至86中任一项所述的多核苷酸，以及
c)将所述细胞培养物维持在允许生产所述rAAV颗粒的条件下。
98.如权利要求97所述的方法，其中包含足够的辅助功能的所述一种或多种多核苷酸构成所述分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码所述腺病毒E2A DBP的所述核苷酸序列、编码所述腺病毒E4 ORF6和ORF7多肽的所述核苷酸序列以及编码所述腺病毒VARNA I的所述核苷酸序列。
99.如权利要求97或权利要求98所述的方法，其包括将编码AAV衣壳蛋白和功能性rep基因的多核苷酸引入到所述细胞中。
100.如权利要求97至99中任一项所述的方法，其中通过转染将所述一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中。
101.如权利要求95至100中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
102.如权利要求95至100中任一项所述的方法，其中所述细胞是昆虫细胞。
103.如权利要求95至100中任一项所述的方法，其中所述细胞是HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞或PerC6细胞。
104.如权利要求95至100中任一项所述的方法，其中所述细胞是HEK293细胞。
105.如权利要求95至104中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物是悬浮培养物或贴壁培养物。
106.如权利要求95至105中任一项所述的方法，其还包括回收所述rAAV颗粒。
107.如权利要求95至105中任一项所述的方法，其中所述方法与参考方法相比生产更多的以GC/ml测量的rAAV颗粒，所述参考方法使用包含辅助功能且包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列的多核苷酸。
108.如权利要求95至105中任一项所述的方法，其中所述方法与参考方法相比生产至少约两倍的以GC/ml测量的rAAV颗粒，所述参考方法使用包含辅助功能且包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列的多核苷酸。
109.如权利要求95至105中任一项所述的方法，其中所述方法与参考方法相比生产包含更多完整衣壳的rAAV颗粒群体，所述参考方法使用包含辅助功能且包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列的多核苷酸。
110.如权利要求95至109中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约20,000升之间的体积。
111.如权利要求95至110中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAVMYO、MyoAAV.1A、MyoAAV1C、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。
112.如权利要求95至110中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8、AAV9、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1或AAV.hu37血清型的衣壳蛋白。
113.如权利要求95至110中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。
114.如权利要求95至110中任一项所述的方法，其中所述基因产物是多肽或双链RNA分子。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述基因产物是多肽。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述基因产物是抗VEGF Fab、抗激肽释放酶抗体、抗TNF抗抗体、微小肌营养不良蛋白、微型肌营养不良蛋白、艾杜糖苷酶(IDUA)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、三肽基肽酶1(TPP1)或VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体。
117.如权利要求115所述的方法，其中所述基因产物是γ-肌聚糖、Rab护卫蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道β3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同种型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)、阿柏西普、巴登氏病蛋白(CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、肌营养不良蛋白、肌微管素1(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6P酶)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、运动神经元生存蛋白(SMN1)、运动神经元生存蛋白(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合物。
118.如权利要求115所述的方法，其中所述基因产物是肌营养不良蛋白或微小肌营养不良蛋白。
119.如权利要求114所述的方法，其中所述基因产物是微小RNA。
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