JP2024517143A - ジストロフィン異常症の治療のためのマイクロジストロフィン遺伝子療法投与 - Google Patents

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Abstract

マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含む治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の投与によって、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びベッカー型筋ジストロフィーなどのジストロフィー異常症の症状を治療または改善する方法が提供される。【選択図】図１Ａ、図１Ｂ

Description

本発明は、導入遺伝子がマイクロジストロフィンをコードするＡＡＶ遺伝子療法ベクターなどの、遺伝子療法ベクターの用量投与による、ジストロフィン異常症の治療に関する。
ジストロフィン異常症と呼ばれる神経筋疾患のグループは、ＤＭＤ遺伝子における変異によって引き起こされる。各ジストロフィン異常症は別個の表現型を有し、全ての患者は、筋脱力及び最終的には重度の範囲にある心筋症に罹患している。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、重度のＸ連鎖性、進行性神経筋疾患であり、３，６００～９，２００の男性出生数におよそ１人に影響を及ぼす。障害は、ジストロフィンタンパク質の発現を廃止するジストロフィン遺伝子におけるフレームシフト変異によって引き起こされる。ジストロフィンタンパク質、骨格筋、ならびに最終的に心筋及び呼吸器筋（例えば、肋間筋及び横隔膜）の欠如により、変性し、早期死亡を引き起こす。進行性脱力症及び筋萎縮は、小児期に始まる。影響を受けた個人は、呼吸困難、呼吸器感染症、及び嚥下の問題を経験する。ほとんど全てのＤＭＤ患者が、心筋症を発症する。心臓併発によって度の増した肺炎は、最も頻繁な死因であり、これは３０年目の前に頻繁に生じる。
ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、ＤＭＤよりもより重症度の低い症状を有するが、それでも早期死亡につながる。ＤＭＤと比較して、ＢＭＤは、遅発性の骨格筋脱力を特徴とする。ＤＭＤ患者は１３歳以前に車椅子に依存しているが、ＢＭＤを有するものは１６歳以降に歩行を失い、車椅子を必要とする。ＢＭＤ患者はまた、首屈筋力の保存を示し、ＤＭＤを有するそれらのカウンターパートとは異なる。より軽度の骨格筋併発にもかかわらず、ＤＭＤ関連拡張型心筋症（ＤＣＭ）からの心不全は、罹患率の一般的な原因であり、ＢＭＤにおける最も一般的な死因であり、平均して４０代半ばに発生する。
ジストロフィンは、ＤＭＤ遺伝子によってコードされる細胞質タンパク質であり、細胞骨格アクチンフィラメントを膜タンパク質に連結するように機能する。通常、主に骨格筋及び心筋に局在し、より少ない量が脳で発現される、ジストロフィンタンパク質は、収縮性器官のアクチンを、各筋線維を取り囲む結合組織の層に連結することによって、筋線維収縮中に衝撃吸収材として作用する。筋肉において、ジストロフィンは、筋線維鞘膜の細胞質面に局在する。
ＤＭＤ遺伝子は、最大の既知のヒト遺伝子である。ＤＭＤまたはＢＭＤを引き起こす最も一般的な変異は、１つ以上のエクソンの大きな欠失変異（６０～７０％）であるが、重複変異（５～１０％）、及び単一ヌクレオチドバリアント（ＤＭＤを有する男性における病原性バリアントのおよそ２５～３５％、及びＢＭＤを有する男性における約１０～２０％を占める小さな欠失または挿入、単一塩基変化、及びスプライス部位変化を含む）もまた、病原性ジストロフィンバリアントを引き起こすことができる。ＤＭＤにおいて、変異は、多くの場合、早期終止コドン及び切断された、非機能的または不安定なタンパク質をもたらすフレームシフトにつながる。ナンセンスポイント変異もまた、同じ結果を有する早期終結コドンをもたらすことができる。ＤＭＤを引き起こす変異は、任意のエクソンに影響を及ぼすことができるが、エクソン２～２０及び４５～５５は、大きな欠失及び重複変異の一般的なホットスポットである。フレーム内欠失は、患者が切断された部分的に機能的なジストロフィンを発現する、より重症度の低いベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）をもたらす。
全長ジストロフィンは、その機能に寄与する多数のサブドメインを含む、大型（４２７ｋＤａ）タンパク質である。これらのサブドメインには、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて順番に、Ｎ末端アクチン結合ドメイン、中央のいわゆる「ロッド」ドメイン、システインリッチドメイン、及び最後にカルボキシ末端ドメインまたは領域が含まれる。ロッドドメインは、４個のプロリンリッチヒンジドメイン（略称Ｈ）と、以下の順序：第１のヒンジドメイン（Ｈ１）、３個のスペクトリン様反復（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）、第２のヒンジドメイン（Ｈ２）、１６個以上のスペクトリン様反復（Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９）、第３のヒンジドメイン（Ｈ３）、５個以上のスペクトリン様反復（Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４）、及び第４のヒンジドメイン（Ｈ４）（ＷＷドメインを含む）での２４個のスペクトリン様反復（略称Ｒ）と、から構成される。ロッドドメインの後には、システインリッチドメイン、及びＣＯＯＨ（Ｃ）－末端（ＣＴ）ドメインがある。
様々な希少疾患を潜在的に治療するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性遺伝子療法の使用における進歩により、ＡＡＶがＤＭＤ、ＢＭＤ、及び重症度のより低いジストロフィン異常症を治療するために使用することができるという希望及び関心が存在してきている。ＡＡＶベクターのペイロードサイズの制限のために、注目は、全長タンパク質の少なくともいくつかの機能を維持しながら、非必須サブドメインを排除するマイクロまたはミニジストロフィン、より小さいジストロフィンバージョンの作成に焦点を当ててきている。ＤＭＤの動物モデルであるｍｄｘマウスにおけるＡＡＶ媒介性マイクロジストロフィン遺伝子療法は、筋肉における効率的な発現、及び改善した筋肉機能を示すと報告された（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２７：４２１（２００９）を参照されたい）。
したがって、ＤＭＤまたはＢＭＤを含むジストロフィン異常症の症状の治療または改善のために治療上有効な投与量でマイクロジストロフィンをコードするＡＡＶベクターを投与し、好ましくは、治療用タンパク質に対する免疫応答を最小限に抑える方法に対する当該技術分野での必要性が存在する。
図２の組換えゲノムなどのマイクロジストロフィンをコードする核酸ゲノムを含むｒＡＡＶベクター粒子（ベクターから作製された、本明細書で使用される「構築物」は、一般に、マイクロジストロフィンを形成するジストロフィンタンパク質のサブユニットの配置を説明し、マイクロジストロフィンの発現を制御する調節エレメントを含み得、組換えＡＡＶ粒子及びＡＡＶ粒子にパッケージングされた組換えゲノムを産生するために使用されるシスプラスミドを含む）の投与によって、ジストロフィン異常症の症状を治療または改善する方法が提供される。薬理学試験に基づいて、例えば、実施例６、７、及び８（以下、セクション６．６、６．７、及び６．８）に記載されるように、遺伝子療法で使用するためのマイクロジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子構築物のための治療上有効な投与量及び使用の静脈内投与などの末梢投与を含む、投与によるそれを必要とする対象の治療方法が提供される。本明細書に記載のインビボ薬理学試験に基づいて、本開示のマイクロジストロフィン遺伝子療法を投与する方法は、投与の少なくとも１２週間後、２６週間後、または５２週間後、ジストロフィン異常症疾患の症状及びクレアチンキナーゼ活性などのバイオマーカー、腓腹筋における病変、筋肉における病変のＴ２緩和時間、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）スコア、ならびに可動性及び筋力、心機能及び肺機能の他のマーカーに改善をもたらす。
本明細書に記載の実施形態は、対象におけるジストロフィン異常症を治療する方法であり、方法は、対象に治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、マイクロジストロフィンタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端に
ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ
を有し、式中、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域またはβ－ジストログリカンに結合するその少なくとも一部分であり、ＣＴは、ジストロフィンのＣ末端領域の少なくとも一部分であり、その一部分は、α１－シントロフィン結合部位及び／またはα－ジストロブレビン結合部位を含む。特定の実施形態において、ＣＴドメインは、ジストロフィンのＣ末端の近位１９４個のアミノ酸（配列番号１６のアミノ酸配列）、または配列番号９２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２）のヒトジストロフィンアミノ酸残基３３６１～３５５４をコードするＣ末端の少なくとも近位部分、もしくはエクソン７０～７４によってコードされるＣ末端の少なくとも近位部分及びエクソン７５のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の最初の３６個のアミノ酸を含むか、またはそれらからなる。代替的に、ＣＴドメインは切断されており、配列番号８３のアミノ酸配列など、α１－シントロフィン結合部位を含むがα－ジストロブレビン結合部位を含まない。構築物は、筋肉特異的プロモーター配列などの調節配列を含み、ＳＰｃ５－１２プロモーター（配列番号３９）、あるいは代替的に、切断ＳＰｃ５－１２プロモーター（配列番号４０）またはＳＰｃ５－１２プロモーターバリアント、その変異体、もしくは転写的に活性な部分（例えば、改変Ｓｐｃ５－１２プロモーターＳｐｃ５ｖ１（配列番号９３）またはＳｐｃ５ｖ２（配列番号９４））、及び小ポリＡシグナル配列（配列番号４２）などのポリアデニル化シグナル配列が含まれる。特異的構築物としては、それぞれ配列番号２０及び配列番号８１のヌクレオチド配列をコードするマイクロジストロフィンを有するＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ５（図２を参照）が挙げられ、これらは調節配列に操作可能に連結され、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に隣接し、組換えゲノムを含む構築物全体が、それぞれ配列番号５３または８２のヌクレオチド配列を有する。組換えゲノムを含むｒＡＡＶ粒子は、実施形態において、ＡＡＶ８である。例えば、ｒＡＡＶ粒子または遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１（配列番号５３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ８）である。
特定の実施形態において、実施形態を含む、本明細書に開示されるマイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含む治療有効量のｒＡＡＶ粒子であるＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１は、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇを含む、５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー／ｋｇの用量で静脈内または筋肉内投与される。特定の実施形態において、本明細書に開示されるマイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含む治療有効量のｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含め、１×１０１４、１．１×１０１４、１．２×１０１４、１．３×１０１４、１．４×１０１４、１．５×１０１４、１．６×１０１４、１．７×１０１４、１．８×１０１４、１．９×１０１４、２×１０１４、２．１×１０１４、２．２×１０１４、２．３×１０１４、２．４×１０１４、２．５×１０１４、２．６×１０１４、２．７×１０１４、２．８×１０１４、２．９×１０１４、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で静脈内または筋肉内投与される。特定の実施形態において、治療有効量のｒＡＡＶ粒子（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む）は、用量１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇで静脈内投与される。他の実施形態において、治療有効量のｒＡＡＶ粒子（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む）は、用量２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇで静脈内投与される。さらに他の実施形態において、治療有効量のｒＡＡＶ粒子（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む）は、用量３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇで静脈内投与される。実施形態において、治療剤を投与される対象は、本明細書に開示されるマイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶ粒子の投与の前、同時、及び／またはそれに続くいずれかで、投与後の維持療法として含め、免疫抑制剤を予防的に投与される。免疫抑制剤には、コルチコステロイド、抗Ｃ３及びＣ５抗体などの抗補体剤、抗ＩＬ－６及び抗ＩＬ６Ｒ抗体などの抗サイトカイン抗体などの抗サイトカイン剤、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｃ５及び抗ＣＤ２０抗体の組み合わせ、ラパマイシン、またはイムリフィダーゼなどの抗ＩｇＧ療法が含まれる。実施形態において、併用免疫抑制レジメンは、マイクロジストロフィン、及び任意選択的に、経口シロリムス（ラパマイシン、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）としても知られる）の投与前及び後に、１日用量の経口プレドニゾロン、及び／または複数用量のエクリズマブ（抗Ｃ５抗体、ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標））を含む。
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、０．２ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．２ｇ／Ｌの一塩基性リン酸カリウム、１．２ｇ／Ｌの無水二塩基性リン酸ナトリウム、５．８ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、４０ｇ／Ｌのスクロース、及び０．０１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８を含むスクロース緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した改変ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む。
薬学的に許容される賦形剤を伴うことを含む、本明細書に提供されるマイクロジストロフィンをコードする組換えベクターを含む医薬組成物と、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、Ｘ連鎖性拡張型心筋症、ならびにＤＭＤまたはＢＭＤ女性キャリアなどの任意のジストロフィン異常症の治療を必要とする対象に、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇなどの５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー／ｋｇの投与量での静脈内投与を含む、本明細書に記載の遺伝子療法ベクター（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む）の投与によって、それを行う方法もまた、提供される。本明細書に記載の導入遺伝子または遺伝子カセットを含むｒＡＡＶ（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む）を投与することによって、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、Ｘ連鎖性拡張型心筋症などのジストロフィン異常症を治療するか、それらの症状を改善するか、またはそれらを管理する方法が提供され、それらを必要とする対象への投与によって、マイクロジストロフィンが筋肉（骨格筋、心筋、及び／または平滑筋を含む）に送達される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、静脈内または筋肉内を含む、全身に投与される。
開示される医薬組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、筋肉における炎症もしくは線維症及び／または筋肉変性の減少を必要とする対象においてそれを行う方法も提供される。
本発明は、マイクロジストロフィンベクターの構築及び作製、ならびに有効性を実証するインビトロ及びインビボでのアッセイを説明する以下の実施例によって例示される。
３．１ 本発明の実施形態
１．ジストロフィン異常症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に、治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を投与することを含み、
前記ｒＡＡＶ粒子が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、
前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー／ｋｇの用量で静脈内または筋肉内投与される、前記方法。
２．前記ＣＴが、ジストロフィンのＣ末端の近位１９４個のアミノ酸、または配列番号９２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２）のヒトジストロフィンアミノ酸残基３３６１～３５５４をコードするＣ末端の少なくとも近位部分、もしくはエクソン７０～７４によってコードされるＣ末端の少なくとも近位部分及びエクソン７５のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の最初の３６個のアミノ酸を含むか、またはそれらからなる、実施形態１に記載の方法。
３．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、実施形態１または２に記載の方法。
４．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号２０の核酸配列によってコードされる、実施形態３に記載の方法。
５．前記ＣＴが、配列番号８３のアミノ酸配列、または前記α１－シントロフィン結合部位を含むがジストロブレビン結合部位を含まないアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、実施形態１に記載の方法。
６．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号７９のアミノ酸配列を有する、実施形態１または５に記載の方法。
７．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号８１の核酸配列によってコードされる、実施形態６に記載の方法。
８．前記導入遺伝子が、前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードする前記核酸配列に操作可能に連結された、筋肉における発現を促進する転写調節エレメントをさらに含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．前記転写調節エレメントが、筋肉特異的プロモーターを含む、実施形態８に記載の方法。
１０．前記筋肉特異的プロモーターが、骨格筋、平滑筋、または心筋特異的プロモーターである、実施形態９に記載の方法。
１１．前記筋肉特異的プロモーターが、ＳＰｃ５－１２、またはその転写活性部分もしくは変異体である、実施形態９または１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記プロモーターが、配列番号３９の核酸配列からなる、実施形態１１に記載の方法。
１３．前記導入遺伝子が、前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードする前記核酸配列のポリアデニル化シグナル３’を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．前記導入遺伝子が、前記プロモーターと前記マイクロジストロフィンコード配列との間にイントロン配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記イントロン配列が、ＶＨ４イントロン配列（配列番号４１）である、実施形態１４に記載の方法。
１６．前記導入遺伝子が、配列番号５３の核酸配列を含む、実施形態１～４及び８～１３のいずれか１つに記載の方法。
１７．前記導入遺伝子が、配列番号８２の核酸配列を含む、実施形態１及び５～１３のいずれか１つに記載の方法。
１８．前記ｒＡＡＶ粒子が、配列番号７７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を有する、実施形態１～１７のいずれかに記載の方法。
１９．前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型である、実施形態１８に記載の方法。
２０．前記ジストロフィン異常症が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、またはＸ連鎖性拡張型心筋症である、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で投与される、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．前記医薬組成物が、静脈内投与される、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、クレアチンキナーゼ活性が、前記投与前のレベルと比較して、前記対象において低下した、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．クレアチンキナーゼ活性における前記低下が、０．５倍～１．５倍である、実施形態２３に記載の方法。
２５．クレアチンキナーゼ活性における前記低下が、３０００～１００００クレアチンキナーゼ単位／リットルである、実施形態２３に記載の方法。
２６．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象の腓腹筋における病変が、前記投与前の前記腓腹筋における前記病変と比較して、減少した、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．前記対象の腓腹筋における前記病変が、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して評価される、実施形態２６に記載の方法。
２８．投与後の腓腹筋における病変の前記減少が、前記投与前の前記腓腹筋における前記病変と比較して、約３～１０％である、実施形態２６～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象の腓腹筋体積が、前記投与前の前記腓腹筋体積と比較して、減少した、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．前記腓腹筋体積減少が、２０～１００ｍｍ３である、実施形態２９に記載の方法。
３１．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、筋肉における病変のＴ２緩和時間が、前記投与前の前記Ｔ２緩和時間と比較して、低下した、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．前記低下が、２～８ミリ秒である、実施形態３１に記載の方法。
３３．筋肉における前記病変が、腓腹筋における病変である、実施形態３１～３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象が、約－１～２の歩行スコアを示した、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後までに、前記対象が、約１の歩行スコアを示した、実施形態３４に記載の方法。
３６．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）スコアが、前記投与前の前記ＮＳＡＡスコアと比較して、増加した、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．前記増加が、０から１に、０から２に、または１から２に、である、実施形態３６に記載の方法。
３８．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象が、起立する、決定された距離を走行／歩行する、設定された階段数を上るのにかかる時間量が、減少した、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．前記決定された距離が、１０メートルである、実施形態３８に記載の方法。
４０．前記設定された階段数が、４である、実施形態３８～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．起立するのにかかる前記時間量における前記減少が、前記投与前と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、または３０％減少である、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．決定された距離を走行／歩行するのにかかる前記時間量における前記減少が、前記投与前と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、または３０％減少である、実施形態３８～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．設定された階段数を上るのにかかる前記時間量における前記減少が、前記投与前と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、または３０％減少である、実施形態３８～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象が、前記投与前の心機能と比較して、改善した前記心機能を示した、実施形態１～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象が、前記投与前の肺機能と比較して、改善した前記肺機能を示した、実施形態１～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．筋肉における炎症及び／または線維症の減少を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
前記対象に、治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を投与することを含み、
前記ｒＡＡＶ粒子が、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子発現カセットを含み、
前記マイクロジストロフィンタンパク質が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなり、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、ジストロフィンのＣ末端全体またはα１－シントロフィン結合部位及びジストロブレビン結合部位を含むＣＴの一部分を含み、
前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１キログラム当たり５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）の用量で静脈内または筋肉内投与され、
前記投与が、前記対象の前記筋肉への前記マイクロジストロフィンタンパク質の送達をもたらす、前記方法。
４７．筋肉変性の減少を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
前記対象に、治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を投与することを含み、
前記ｒＡＡＶ粒子が、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子発現カセットを含み、
前記マイクロジストロフィンタンパク質が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインを含むかまたはそれからなり、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、ジストロフィンのＣ末端全体またはα１－シントロフィン結合部位及びジストロブレビン結合部位を含むＣＴの一部分を含み、
前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１キログラム当たり５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）の用量で静脈内または筋肉内投与され、
前記投与が、前記対象の前記筋肉への前記マイクロジストロフィンタンパク質の送達をもたらす、前記方法。
４８．前記筋肉が、対象の横隔膜である、実施形態４６または４７に記載の方法。
４９．歩行の変化を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
前記対象に、治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を投与することを含み、
前記ｒＡＡＶ粒子が、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子発現カセットを含み、
前記マイクロジストロフィンタンパク質が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインを含むかまたはそれからなり、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、
前記治療有効量のｒＡＡＶ粒子が、１キログラム当たり５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）の用量で静脈内または筋肉内投与され、
前記対象の前記歩行が、前記投与前の前記対象の前記歩行と比較して、前記投与の１２週間後に変化する、前記方法。
５０．前記歩行を変化させることが、バランスにおける増加、ストライド長における変化、頭部動作における減少、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態４９に記載の方法。
５１．前記ＣＴが、ジストロフィンのＣ末端の近位１９４個のアミノ酸、または配列番号９２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２）のヒトジストロフィンアミノ酸残基３３６１～３５５４をコードするＣ末端の少なくとも近位部分、もしくはエクソン７０～７４によってコードされるＣ末端の少なくとも近位部分及びエクソン７５のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の最初の３６個のアミノ酸を含むか、またはそれらからなる、実施形態４６～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、実施形態４６～５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号２０の核酸配列によってコードされる、実施形態５２に記載の方法。
５４．前記ＣＴが、配列番号８３のアミノ酸配列、または前記α１－シントロフィン結合部位を含むが前記ジストロブレビン結合部位を含まないアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、実施形態４６～５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号７９のアミノ酸配列を有する、実施形態４６～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号８１の核酸配列によってコードされる、実施形態５５に記載の方法。
５７．前記導入遺伝子が、前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードする前記核酸配列に操作可能に連結された、筋肉における発現を促進する転写調節エレメントをさらに含む、実施形態４６～５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．前記転写調節エレメントが、筋肉特異的プロモーターを含む、実施形態５７に記載の方法。
５９．前記筋肉特異的プロモーターが、骨格筋、平滑筋、または心筋特異的プロモーターである、実施形態５８に記載の方法。
６０．前記筋肉特異的プロモーターが、ＳＰｃ５－１２、またはその転写活性部分もしくは変異体である、実施形態５８または５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．前記プロモーターが、配列番号３９の核酸配列からなる、実施形態５８に記載の方法。
６２．前記導入遺伝子が、前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードする前記核酸配列のポリアデニル化シグナル３’を含む、実施形態４６～６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．前記導入遺伝子が、前記プロモーターと前記マイクロジストロフィンコード配列との間にイントロン配列を含む、実施形態４６～６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．前記イントロン配列が、ＶＨ４イントロン配列（配列番号４１）である、実施形態６３に記載の方法。
６５．前記導入遺伝子が、配列番号５３の核酸配列を含む、実施形態４６～６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．前記導入遺伝子が、配列番号８２の核酸配列を含む、実施形態４６～６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．前記ｒＡＡＶ粒子が、配列番号７７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を有する、実施形態４６～６６のいずれかに記載の方法。
６８．前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型である、実施形態６７に記載の方法。
６９．前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で投与される、実施形態４６～６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．前記医薬組成物が、静脈内投与される、実施形態４６～６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．前記ＡＡＶ粒子の前記投与の前、同時、及び／または後に、前記対象に免疫抑制剤療法を予防的に投与することをさらに含む、実施形態１～７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．前記免疫抑制剤療法が、コルチコステロイド、抗Ｃ５抗体、抗ＩＬ６もしくは抗ＩＬ６Ｒ抗体、及び抗ＣＤ２０抗体、抗Ｃ５抗体と抗ＣＤ２０抗体との組み合わせ、ラパマイシン、イムリフィダーゼ、またはそれらの組み合わせである、実施形態７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．ジストロフィン異常症の治療を必要とする対象においてそれを行う際に使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含み、
前記ｒＡＡＶ粒子が、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子発現カセットを含み、
前記マイクロジストロフィンタンパク質が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインを含むかまたはそれからなり、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、
前記治療有効量のｒＡＡＶ粒子が、５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー／ｋｇの用量で静脈内または筋肉内投与される、前記医薬組成物。
７４．前記ＣＴが、ジストロフィンのＣ末端の近位１９４個のアミノ酸、または配列番号９２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２）のヒトジストロフィンアミノ酸残基３３６１～３５５４をコードするＣ末端の少なくとも近位部分、もしくはエクソン７０～７４によってコードされるＣ末端の少なくとも近位部分及びエクソン７５のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の最初の３６個のアミノ酸を含むか、またはそれらからなる、実施形態７３に記載の組成物。
７５．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、実施形態７３または７４に記載の組成物。
７６．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号２０の核酸配列によってコードされる、実施形態７５に記載の組成物。
７７．前記ＣＴが、配列番号８３のアミノ酸配列、または前記α１－シントロフィン結合部位を含むがジストロブレビン結合部位を含まないアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、実施形態７３に記載の組成物。
７８．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号７９のアミノ酸配列を有する、実施形態７３または７７に記載の組成物。
７９．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号８１の核酸配列によってコードされる、実施形態７８に記載の組成物。
８０．前記導入遺伝子が、前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードする前記核酸配列に操作可能に連結された、筋肉における発現を促進する転写調節エレメントをさらに含む、実施形態７３～７９のいずれか１つに記載の組成物。
８１．前記転写調節エレメントが、筋肉特異的プロモーターを含む、実施形態８０に記載の組成物。
８２．前記筋肉特異的プロモーターが、骨格筋、平滑筋、または心筋特異的プロモーターである、実施形態８１に記載の組成物。
８３．前記筋肉特異的プロモーターが、ＳＰｃ５－１２、またはその転写活性部分もしくは変異体である、実施形態８１または８２のいずれか１つに記載の組成物。
８４．前記プロモーターが、配列番号３９の核酸配列からなる、実施形態８３に記載の組成物。
８５．前記導入遺伝子が、前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードする前記核酸配列のポリアデニル化シグナル３’を含む、実施形態７３～８４のいずれか１つに記載の組成物。
８６．前記導入遺伝子が、前記プロモーターと前記マイクロジストロフィンコード配列との間にイントロン配列を含む、実施形態７３～８５のいずれか１つに記載の組成物。
８７．前記イントロン配列が、ＶＨ４イントロン配列（配列番号４１）である、実施形態８６に記載の組成物。
８８．前記導入遺伝子が、配列番号５３の核酸配列を含む、実施形態７３～７６及び８０～８５のいずれか１つに記載の組成物。
８９．前記導入遺伝子が、配列番号８２の核酸配列を含む、実施形態７３及び７７～８５のいずれか１つに記載の組成物。
９０．前記ｒＡＡＶ粒子が、配列番号７７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を有する、実施形態７３～８９のいずれかに記載の組成物。
９１．前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型である、実施形態９０に記載の組成物。
９２．前記ジストロフィン異常症が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、またはＸ連鎖性拡張型心筋症である、実施形態７３～９１のいずれか１つに記載の組成物。
９３．前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で投与される、実施形態７３～９２のいずれか１つに記載の組成物。
９４．前記医薬組成物が、静脈内投与される、実施形態７３～９３のいずれか１つに記載の組成物。
９５．前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、クレアチンキナーゼ活性が、前記投与前のレベルと比較して、前記対象において低下した、実施形態７３～９４のいずれか１つに記載の組成物。
９６．クレアチンキナーゼ活性における前記低下が、０．５倍～１．５倍である、実施形態９５に記載の組成物。
９７．クレアチンキナーゼ活性における前記低下が、３０００～１００００クレアチンキナーゼ単位／リットルである、実施形態９５に記載の組成物。
９８．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象の腓腹筋における病変が、前記投与前の前記腓腹筋における前記病変と比較して、減少した、実施形態７３～９７のいずれか１つに記載の組成物。
９９．前記対象の腓腹筋における前記病変が、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して評価される、実施形態９８に記載の組成物。
１００．投与後の腓腹筋における病変の前記減少が、前記投与前の前記腓腹筋における前記病変と比較して、約３～１０％である、実施形態９８～９９のいずれか１つに記載の組成物。
１０１．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象の腓腹筋体積が、前記投与前の前記腓腹筋体積と比較して、減少した、実施形態７３～１００のいずれか１つに記載の組成物。
１０２．前記腓腹筋体積減少が、２０～１００ｍｍ３である、実施形態１０１に記載の組成物。
１０３．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、筋肉における病変のＴ２緩和時間が、前記投与前の前記Ｔ２緩和時間と比較して低下した、実施形態７３～１０２のいずれか１つに記載の組成物。
１０４．前記低下が、２～８ミリ秒である、実施形態１０３に記載の組成物。
１０５．筋肉における前記病変が、腓腹筋における病変である、実施形態１０３～１０４のいずれか１つに記載の組成物。
１０６．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象が、約－１～２の歩行スコアを示した、実施形態７３～１０５のいずれか１つに記載の組成物。
１０７．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後までに、前記対象が、約１の歩行スコアを示した、実施形態１０６に記載の組成物。
１０８．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）スコアが、前記投与前の前記ＮＳＡＡスコアと比較して増加した、実施形態７３～１０７のいずれか１つに記載の組成物。
１０９．前記増加が、０から１に、０から２に、または１から２に、である、実施形態１０８に記載の組成物。
１１０．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象が、起立する、決定された距離を走行／歩行する、設定された階段数を上るのにかかる時間量が、減少した、実施形態７３～１０９のいずれか１つに記載の組成物。
１１１．前記決定された距離が、１０メートルである、実施形態１１０に記載の組成物。
１１２．前記設定された階段数が、４である、実施形態１１０～１１１のいずれか１つに記載の組成物。
１１３．起立するのにかかる前記時間量における前記減少が、前記投与前と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、または３０％減少である、実施形態１１０～１１２のいずれか１つに記載の組成物。
１１４．決定された距離を走行／歩行するのにかかる前記時間量における前記減少が、前記投与前と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、または３０％減少である、実施形態１１０～１１３のいずれか１つに記載の組成物。
１１５．設定された階段数を上るのにかかる前記時間量における前記減少が、前記投与前と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、または３０％減少である、実施形態１１０～１１４のいずれか１つに記載の組成物。
１１６．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象が、前記投与前の心機能と比較して、改善した前記心機能を示した、実施形態７３～１１５のいずれか１つに記載の組成物。
１１７．前記医薬組成物の前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、前記対象が、前記投与前の肺機能と比較して、改善した前記肺機能を示した、実施形態７３～１１６のいずれか１つに記載の組成物。
１１８．前記ＡＡＶ粒子の前記投与の前、同時、及び／または後に、前記対象に免疫抑制剤療法を予防的に投与することをさらに含む、実施形態７３～１１７のいずれか１つに記載の組成物。
１１９．前記免疫抑制剤療法が、コルチコステロイド、抗Ｃ５抗体、抗ＩＬ６もしくは抗ＩＬ６Ｒ抗体、及び抗ＣＤ２０抗体、抗Ｃ５抗体と抗ＣＤ２０抗体との組み合わせ、ラパマイシン、イムリフィダーゼ、またはそれらの組み合わせである、実施形態１１８に記載の組成物。
１２０．前記対象が、予防的免疫抑制レジメンを投与される、実施形態１～１１９のいずれか１つに記載の方法または組成物。
１２１．前記予防的免疫抑制レジメンが、（１）１日目から８週目までの１日用量の経口プレドニゾロン、（２）前記ｒＡＡＶの投与の前及び後のエクリズマブの注入、ならびに（３）１日目がｒＡＡＶ投与の日である、－７日から８週目までの毎日の経口シロリムスを含む、実施形態１２０に記載の方法または組成物。
１２２．経口プレドニゾロンが、１日目から８週目の終わりまで１ｍｇ／ｋｇ／日で投与され、１日目がｒＡＡＶ投与の日であり、次いで、安全性の懸念が特定されない場合、前記用量を９週目から１０週目まで０．５ｍｇ／ｋｇ／日に低下させ、次いで、安全性の懸念が特定されない場合、前記用量を１１週目から１２週目まで０．２５ｍｇ／ｋｇ／日に低下させる、実施形態１２１に記載の方法または組成物。
１２３．エクリズマブが、注入によって、（１）体重が１０～＜２０ｋｇの対象について、－９日、－２日、４日目、及び１２日目に６００ｍｇのエクリズマブ、（２）体重が２０ｋｇ～＜３０ｋｇの対象について、－１６日、－９日、－２日、及び１２日目に８００ｍｇのエクリズマブ、（３）体重が３０ｋｇ～＜４０ｋｇの対象について、－１６日、－９日、－２日、及び１２日目に９００ｍｇのエクリズマブ、ならびに（４）体重が４０ｋｇ以上の対象について、－３０日、－２３日、－１６日、－９日、－２日、及び１２日目に１２００ｍｇのエクリズマブが投与され、１日目がｒＡＡＶ投与の日である、実施形態１２１または１２２に記載の方法または組成物。
１２４．前記シロリムスが、－７日に３ｍｇ／ｍ２で、－６日から８週目まで各日に２用量に分割された１ｍｇ／ｍ２／日の用量で投与されて、８～１２ｎｇ／ｍｌの目標血中濃度を達成し、安全性試験が安定したままである場合、前記用量を９～１０週目に０．５ｍｇ／ｍ２／日に減少させ、安全性試験が安定したままである場合、前記用量を１１～１２週目に０．２５ｍｇ／ｍ２／日に減少させる、実施形態１２１～１２３のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１２５．治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
前記ｒＡＡＶ粒子が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、
前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー／ｋｇの用量で静脈内または筋肉内投与される、前記医薬組成物。
１２６．治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記ｒＡＡＶ粒子が、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、前記医薬組成物。
１２７．治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８粒子であり、配列番号５３のヌクレオチド配列を有する人工ゲノムを含む、前記医薬組成物。
１２８．前記薬学的に許容される担体が、０．２ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．２ｇ／Ｌの一塩基性リン酸カリウム、１．２ｇ／Ｌの無水二塩基性リン酸ナトリウム、５．８ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、４０ｇ／Ｌのスクロース、及び０．０１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８を含むスクロース緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した改変ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む、実施形態１２５～１２７に記載の方法。
１２９．ジストロフィン異常症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に実施形態１２５～１２８のいずれか１つに記載の医薬組成物を静脈内投与することを含む、前記方法。
１３０．前記ジストロフィン異常症が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、またはＸ連鎖性拡張型心筋症である、実施形態１２９に記載の方法。
１３１．前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１×１０１４、１．１×１０１４、１．２×１０１４、１．３×１０１４、１．４×１０１４、１．５×１０１４、１．６×１０１４、１．７×１０１４、１．８×１０１４、１．９×１０１４、２×１０１４、２．１×１０１４、２．２×１０１４、２．３×１０１４、２．４×１０１４、２．５×１０１４、２．６×１０１４、２．７×１０１４、２．８×１０１４、２．９×１０１４、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で投与される、実施形態１２９～１３０のいずれか１つに記載の方法。
１３２．前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で投与される、実施形態１２９～１３０のいずれか１つに記載の方法。
１３３．前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で投与される、実施形態１２９～１３０のいずれか１つに記載の方法。
１３４．前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で投与される、実施形態１２９～１３０のいずれか１つに記載の方法。
１３５．ジストロフィン異常症の治療、筋肉における炎症及び／または線維症の減少、筋肉変性の減少、あるいは歩行の変化を必要とする対象においてそれを行う際に使用するための医薬組成物であって、治療有効量のｒＡＡＶ粒子及び薬学的に許容される担体を含み、
前記ｒＡＡＶ粒子が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を含む人工ゲノムを含み、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、筋肉における発現を促進する調節エレメントに操作可能に連結され、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接しており、
前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１キログラム当たり５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）の用量で静脈内または筋肉内投与され、
前記投与することが、前記対象の筋肉に、５０ｎｇ／ｍｇ超のマイクロジストロフィンタンパク質をもたらす、前記医薬組成物。
１３６．ジストロフィン異常症の治療、筋肉における炎症及び／または線維症の減少、筋肉変性の減少、あるいは歩行の変化を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記方法が、
前記対象に、治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を投与することを含み、
前記ｒＡＡＶ粒子が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を含む人工ゲノムを含み、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、筋肉における発現を促進する調節エレメントに操作可能に連結され、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接しており、
前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１キログラム当たり５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）の用量で静脈内または筋肉内投与され、
前記投与することが、前記対象の筋肉における５０ｎｇ／ｍｇ超のマイクロジストロフィンタンパク質をもたらす、前記方法。
１３７．前記対象の筋肉における前記マイクロジストロフィンの量が、投与の５週間後、１０週間後、１２週間後、２０週間後、または２６週間後で、キャピラリベースのウェスタンアッセイ方法によって測定される、実施形態１３５または１３６に記載の組成物または方法。
１３８．前記ＣＴが、ジストロフィンのＣ末端の近位１９４個のアミノ酸、または配列番号９２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２）のヒトジストロフィンアミノ酸残基３３６１～３５５４をコードするＣ末端の少なくとも近位部分、もしくはエクソン７０～７４によってコードされるＣ末端の少なくとも近位部分及びエクソン７５のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の最初の３６個のアミノ酸を含むか、またはそれらからなる、実施形態１３５～１３７に記載の組成物または方法。
１３９．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、実施形態１３５～１３８のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１４０．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号２０の核酸配列によってコードされる、実施形態１３９に記載の組成物または方法。
１４１．前記ＣＴが、配列番号８３のアミノ酸配列、または前記α１－シントロフィン結合部位を含むがジストロブレビン結合部位を含まないアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、実施形態１３５～１３７に記載の組成物または方法。
１４２．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号７９のアミノ酸配列を有する、実施形態１３５、１３６、１３７、または１４１に記載の組成物または方法。
１４３．前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号８１の核酸配列によってコードされる、実施形態１４２に記載の組成物または方法。
１４４．転写調節エレメントが、筋肉特異的プロモーターを含む、実施形態１３５～１４３のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１４５．前記筋肉特異的プロモーターが、骨格筋、平滑筋、または心筋特異的プロモーターである、実施形態１４４に記載の組成物または方法。
１４６．前記筋肉特異的プロモーターが、ＳＰｃ５－１２、またはその転写活性部分もしくは変異体である、実施形態１４４または１４５のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１４７．前記プロモーターが、配列番号３９の核酸配列からなる、実施形態１４６に記載の組成物または方法。
１４８．前記導入遺伝子が、前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードする前記核酸配列のポリアデニル化シグナル３’を含む、実施形態１３５～１４７のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１４９．前記導入遺伝子が、前記プロモーターと前記マイクロジストロフィンコード配列との間にイントロン配列を含む、実施形態１３５～１４８のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１５０．前記イントロン配列が、ＶＨ４イントロン配列（配列番号４１）である、実施形態１４９に記載の組成物または方法。
１５１．前記導入遺伝子が、配列番号５３の核酸配列を含む、実施形態１３５～１４０及び１４４～１５０のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１５２．前記導入遺伝子が、配列番号８２の核酸配列を含む、実施形態１３５～１３７及び１４１～１５０のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１５３．前記ｒＡＡＶ粒子が、配列番号７７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を有する、実施形態１３５～１５２のいずれかに記載の組成物または方法。
１５４．前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型である、実施形態１５３に記載の組成物または方法。
１５５．前記ジストロフィン異常症が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、またはＸ連鎖性拡張型心筋症である、実施形態１３５～１５４のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１５６．前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で投与される、実施形態１３５～１５５のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１５７．前記医薬組成物が、静脈内投与される、実施形態１３５～１５６のいずれか１つに記載の組成物または方法。
ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン（ジストロブレビンを含むＣ末端ドメインを有する）とα１－シントロフィン結合部位（ならびにβ１－シントロフィン結合部位）との間の相互作用を示す、筋線維鞘の図である。少なくともジストロブレビン及びα１－シントロフィン結合部位を有するＲＧＸ－ＤＹＳ１は、ｎＮＯＳを部分的に動員して、筋線維鞘にα１－シントロフィンを介して固定することが想定される。Ｓｙｎ：シントロフィン、Ｄｂｒ：ジストロブレビン、ＣＲ：システインリッチドメイン、ｎＮＯＳ：神経型一酸化窒素合成酵素、ＤＧ：ジストログリカン、Ｈ：ヒンジ、Ｒ：スペクトル様反復、ＳＧ：サルコグリカン。 野生型ジストロフィンタンパク質とアクチン細胞骨格を有するジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）との間の相互作用を示す、筋線維鞘の図である。少なくともジストロブレビン及びα１－シントロフィン結合部位を有するＲＧＸ－ＤＹＳ１は、ｎＮＯＳを部分的に動員して、筋線維鞘にα１－シントロフィンを介して固定することが想定される。Ｓｙｎ：シントロフィン、Ｄｂｒ：ジストロブレビン、ＣＲ：システインリッチドメイン、ｎＮＯＳ：神経型一酸化窒素合成酵素、ＤＧ：ジストログリカン、Ｈ：ヒンジ、Ｒ：スペクトル様反復、ＳＧ：サルコグリカン。 ＡＡＶ組換えゲノムをもたらす遺伝子療法のためのシスプラスミドで使用するためのベクター遺伝子発現カセット（さもなければマイクロジストロフィン構築物または導入遺伝子と呼ばれる）を例示する。各構成要素及び完全導入遺伝子のＤＮＡ長が、各構築物について列挙される。ＳＰｃ５－１２：合成筋肉特異的プロモーター、ＣＴ１．５：α１－シントロフィン結合部位を含むがジストロブレビン結合部位を含まない、ＣＴドメイン（配列番号：８３）の１４０個のアミノ酸を含む切断／最小ＣＴドメイン、ＶＨ４：ヒト免疫グロビン重鎖可変領域イントロン、ＡＢＤ：アクチン結合ドメイン、Ｈ：ヒンジ、Ｒ：ロッド、ＣＲ：システインリッチドメイン、ＣＴ：Ｃ末端ドメイン、ｓｍＰＡ：小ポリＡ、ＡＢＤ：アクチン結合ドメイン１（ＡＢＤ１）。 ＡＡＶ－マイクロジストロフィンベクターを注射した腓腹筋組織から抽出されたジストロフィンに対するウェスタンブロット。レーン１～４＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料、レーン５～８＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ５を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料、及びレーン９～１２＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ３を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料。α１－アクチンは、各レーンにおける負荷対照として機能する。ｍｄｘ（レーン１３）は、未注射のｍｄｘマウスを示した。ジストロフィンブロットについて、マウス抗ジストロフィンモノクローナル抗体を使用した（１：１００希釈）。抗アルファ１－アクチンブロットについて、ポリクローナル抗体を１：１０，０００の希釈係数で使用し、二次（抗ウサギ）抗体を１：２０，０００で使用した。 ＡＡＶ－マイクロジストロフィンベクターを注射した腓腹筋組織から抽出されたジストロフィンに対するウェスタンブロット。レーン１～４＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料、レーン５～８＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ５を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料、及びレーン９～１２＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ３を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料。α１－アクチンは、各レーンにおける負荷対照として機能する。ｍｄｘ（レーン１３）は、未注射のｍｄｘマウスを示した。ジストロフィンブロットについて、マウス抗ジストロフィンモノクローナル抗体を使用した（１：１００希釈）。抗アルファ１－アクチンブロットについて、ポリクローナル抗体を１：１０，０００の希釈係数で使用し、二次（抗ウサギ）抗体を１：２０，０００で使用した。Ａからのタンパク質試料のウェスタンブロット分析におけるマイクロジストロフィンバンドの定量。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＡＶ－マイクロジストロフィンベクターを注射した腓腹筋組織から抽出されたジストロフィンに対するウェスタンブロット。レーン１～４＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料、レーン５～８＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ５を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料、及びレーン９～１２＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ３を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料。α１－アクチンは、各レーンにおける負荷対照として機能する。ｍｄｘ（レーン１３）は、未注射のｍｄｘマウスを示した。ジストロフィンブロットについて、マウス抗ジストロフィンモノクローナル抗体を使用した（１：１００希釈）。抗アルファ１－アクチンブロットについて、ポリクローナル抗体を１：１０，０００の希釈係数で使用し、二次（抗ウサギ）抗体を１：２０，０００で使用した。ｄｄＰＣＲによる腓腹筋におけるＡＡＶ－μ－Ｄｙｓベクターコピー数。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＡＶ－マイクロジストロフィンベクターを注射した腓腹筋組織から抽出されたジストロフィンに対するウェスタンブロット。レーン１～４＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料、レーン５～８＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ５を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料、及びレーン９～１２＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ３を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質試料。α１－アクチンは、各レーンにおける負荷対照として機能する。ｍｄｘ（レーン１３）は、未注射のｍｄｘマウスを示した。ジストロフィンブロットについて、マウス抗ジストロフィンモノクローナル抗体を使用した（１：１００希釈）。抗アルファ１－アクチンブロットについて、ポリクローナル抗体を１：１０，０００の希釈係数で使用し、二次（抗ウサギ）抗体を１：２０，０００で使用した。ＡＡＶ－μ－Ｄｙｓベクターコピー数によって正規化されたマイクロジストロフィンタンパク質バンドの定量。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 骨格筋（腓腹筋）におけるマイクロジストロフィン及び野生型（ＷＴ）ジストロフィンのｍＲＮＡ発現。全ＲＮＡを骨格筋から抽出し、ｃＤＮＡを合成した。マイクロジストロフィン、ＷＴ－ジストロフィン、及び内因性対照グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのコピー数を、デジタルＰＣＲ（Ｎａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｔｉｌｌａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。ＧＡＰＤＨによって正規化された相対的マイクロまたはＷＴ－ジストロフィンｍＲＮＡ発現。Ｂ６－ＷＴ骨格筋におけるＧＡＰＤＨに対するＷＴ－ジストロフィンの比を１とみなした。 骨格筋（腓腹筋）におけるマイクロジストロフィン及び野生型（ＷＴ）ジストロフィンのｍＲＮＡ発現。全ＲＮＡを骨格筋から抽出し、ｃＤＮＡを合成した。マイクロジストロフィン、ＷＴ－ジストロフィン、及び内因性対照グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのコピー数を、デジタルＰＣＲ（Ｎａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｔｉｌｌａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。単一の細胞における相対的マイクロまたはＷＴ－ジストロフィンｍＲＮＡ発現。マイクロまたはＷＴ－ジストロフィンｍＲＮＡ発現コピー数を、ＧＡＰＤＨ及び細胞当たりのゲノムコピー数によって正規化した。 骨格筋におけるアルファ－シントロフィン発現。ｍｄｘマウス及びマウスから抽出された腓腹筋を、記載されているように処置した。Ｂｌ６（未処置の野生型マウス）、ＲＧＸ－ＤＹＳ１（マウスＩＤ３５５３、及びマウスＩＤ３５８８）、ＲＧＸ－ＤＹＳ３（マウスＩＤ５、及びマウスＩＤ７）、及びＲＧＸ－ＤＹＳ５（マウスＩＤ９、及びマウスＩＤ１１）。筋組織溶解物からのシントロフィンに対するウェスタンブロット。 骨格筋におけるアルファ－シントロフィン発現。ｍｄｘマウス及びマウスから抽出された腓腹筋を、記載されているように処置した。Ｂｌ６（未処置の野生型マウス）、ＲＧＸ－ＤＹＳ１（マウスＩＤ３５５３、及びマウスＩＤ３５８８）、ＲＧＸ－ＤＹＳ３（マウスＩＤ５、及びマウスＩＤ７）、及びＲＧＸ－ＤＹＳ５（マウスＩＤ９、及びマウスＩＤ１１）。ウェスタンブロットバンドの定量。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００１。 骨格筋におけるアルファ－シントロフィン発現。ｍｄｘマウス及びマウスから抽出された腓腹筋を、記載されているように処置した。Ｂｌ６（未処置の野生型マウス）、ＲＧＸ－ＤＹＳ１（マウスＩＤ３５５３、及びマウスＩＤ３５８８）、ＲＧＸ－ＤＹＳ３（マウスＩＤ５、及びマウスＩＤ７）、及びＲＧＸ－ＤＹＳ５（マウスＩＤ９、及びマウスＩＤ１１）。全筋肉膜タンパク質からのシントロフィンに対するウェスタンブロット。 骨格筋におけるアルファ－シントロフィン発現。ｍｄｘマウス及びマウスから抽出された腓腹筋を、記載されているように処置した。Ｂｌ６（未処置の野生型マウス）、ＲＧＸ－ＤＹＳ１（マウスＩＤ３５５３、及びマウスＩＤ３５８８）、ＲＧＸ－ＤＹＳ３（マウスＩＤ５、及びマウスＩＤ７）、及びＲＧＸ－ＤＹＳ５（マウスＩＤ９、及びマウスＩＤ１１）。ウェスタンブロットバンドの定量。 骨格筋におけるｎＮＯＳ発現。ｎＮＯＳに対する免疫蛍光染色。 骨格筋におけるｎＮＯＳ発現。ｎＮＯＳに対するウェスタンブロット。 骨格筋におけるｎＮＯＳ発現。ウェスタンブロットバンドの定量。 マイクロジストロフィン遺伝子をコードするＡＡＶベクターによる衛星細胞の形質導入及び細胞再生の改善。ＡＡＶ－ＤＭＤ形質導入した衛星細胞のパーセンテージ。マイクロジストロフィンに対するプライマー及びプローブは、前述と同じだった。Ｂ６－ＷＴ骨格筋におけるＧＡＰＤＨに対するｐａｘ７の比を１とみなした。未処置のｍｄｘマウスとの比較として、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 マイクロジストロフィン遺伝子をコードするＡＡＶベクターによる衛星細胞の形質導入及び細胞再生の改善。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）画像における全衛星細胞計数。マイクロジストロフィンに対するプライマー及びプローブは、前述と同じだった。Ｂ６－ＷＴ骨格筋におけるＧＡＰＤＨに対するｐａｘ７の比を１とみなした。未処置のｍｄｘマウスとの比較として、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 マイクロジストロフィン遺伝子をコードするＡＡＶベクターによる衛星細胞の形質導入及び細胞再生の改善。ｄｄＰＣＲによって明らかにされた異なる群からの骨格筋におけるＰａｘ７ ｍＲＮＡ発現。マイクロジストロフィンに対するプライマー及びプローブは、前述と同じだった。Ｂ６－ＷＴ骨格筋におけるＧＡＰＤＨに対するｐａｘ７の比を１とみなした。未処置のｍｄｘマウスとの比較として、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＮＨＰにおけるＡＡＶ８及びＡＡＶ９の生体内分布及び導入遺伝子発現の比較を示す。固有のバーコードを有するＡＡＶ８及びＡＡＶ９パッケージングＣＡＧ－ＧＦＰカセットを個別に作製し、ほぼ等しい濃度で他のカプシドとともにプールして、１１８個のバーコード化ＡＡＶのライブラリーを生成した。このライブラリー（ＰＡＶＥ１１８）を、１．７７ｅ１３ＧＣ／ｋｇの用量で３匹のカニクイザルに静脈内投与した。投与の３週間後に様々なＮＨＰ組織から単離されたＤＮＡ及びＲＮＡを、相対的存在量について次世代配列（ＮＧＳ）分析に供した。非ヒト霊長類の骨格筋（それぞれＡ及びＢ）、心筋（それぞれＣ及びＤ）、及び肝臓（それぞれＥ及びＦ）におけるＡＡＶ８及びＡＡＶ９カプシドからのＤＮＡ及びＲＮＡレベルに有意差はなかった。 握力及びＥＤＬ筋のインビトロ筋力。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける筋肉機能を改善した。（Ａ及びＢ）５週目に握力を測定した。（Ａ）最大力、及び（Ｂ）各マウスの体重によって計算された正規化した前肢値。（Ｃ及びＤ）。ＥＤＬ筋のインビトロ筋力を６週目に行った。（Ｃ）絶対前肢及び（Ｄ）生成された最大の力を筋肉の断面積によって正規化したＥＤＬ筋の比筋力。野生型（ＷＴ）データは、試験施設における齢の一致したＨＣＤからのものだった。野生型ＨＣＤデータに対して＊＊＊ｐ＜０．００１、ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ｍｄｘビヒクル対照マウス及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける筋病理。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける骨格筋の炎症、変性、及び再生を減衰させた。炎症は、Ｈ＆Ｅ染色に基づいて評価した。黄色の破線は、組織内の炎症病巣の領域を表す。 ｍｄｘビヒクル対照マウス及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける筋病理。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける骨格筋の炎症、変性、及び再生を減衰させた。炎症は、Ｈ＆Ｅ染色に基づいて評価した。黄色の破線は、組織内の炎症病巣の領域を表す。ＴＡにおける炎症の割合を測定した。野生型ＨＣＤデータに対して＊＊＊ｐ＜０．００１。ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ｍｄｘビヒクル対照マウス及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける筋病理。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける骨格筋の炎症、変性、及び再生を減衰させた。炎症は、Ｈ＆Ｅ染色に基づいて評価した。黄色の破線は、組織内の炎症病巣の領域を表す。横隔膜における炎症の割合を測定した。野生型ＨＣＤデータに対して＊＊＊ｐ＜０．００１。ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ｍｄｘビヒクル対照マウス及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける筋病理。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける骨格筋の炎症、変性、及び再生を減衰させた。ＴＡ及び横隔膜における再生線維を、再生のマーカーである抗ｅＭＨＣ染色によって検査した。赤色の破線は、変性領域の面積を表す。 ｍｄｘビヒクル対照マウス及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける筋病理。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける骨格筋の炎症、変性、及び再生を減衰させた。ＴＡ及び横隔膜における再生線維を、再生のマーカーである抗ｅＭＨＣ染色によって検査した。赤色の破線は、変性領域の面積を表す。陽性線維をＴＡで計数し、その切片の総面積（ｍｍ２）にわたって正規化した（線維／ｍｍ２）。野生型ＨＣＤデータに対して＊＊＊ｐ＜０．００１。ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ｍｄｘビヒクル対照マウス及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける筋病理。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける骨格筋の炎症、変性、及び再生を減衰させた。ＴＡ及び横隔膜における再生線維を、再生のマーカーである抗ｅＭＨＣ染色によって検査した。赤色の破線は、変性領域の面積を表す。陽性線維を横隔膜で計数し、その切片の総面積（ｍｍ２）にわたって正規化した（線維／ｍｍ２）。野生型ＨＣＤデータに対して＊＊＊ｐ＜０．００１。ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ｍｄｘビヒクル対照マウス及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける筋病理。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける骨格筋の炎症、変性、及び再生を減衰させた。ＴＡ及び横隔膜における変性線維を抗ＩｇＭ染色によって検査した。赤色の破線は、変性領域の面積を表す。 ｍｄｘビヒクル対照マウス及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける筋病理。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける骨格筋の炎症、変性、及び再生を減衰させた。ＴＡ及び横隔膜における変性線維を抗ＩｇＭ染色によって検査した。赤色の破線は、変性領域の面積を表す。陽性線維をＴＡで計数し、その切片の総面積（ｍｍ２）にわたって正規化した（線維／ｍｍ２）。野生型ＨＣＤデータに対して＊＊＊ｐ＜０．００１。ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ｍｄｘビヒクル対照マウス及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける筋病理。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける骨格筋の炎症、変性、及び再生を減衰させた。ＴＡ及び横隔膜における変性線維を抗ＩｇＭ染色によって検査した。赤色の破線は、変性領域の面積を表す。陽性線維を横隔膜で計数し、その切片の総面積（ｍｍ２）にわたって正規化した（線維／ｍｍ２）。野生型ＨＣＤデータに対して＊＊＊ｐ＜０．００１。ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ｍｄｘビヒクル対照マウス及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける筋病理。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける骨格筋の炎症、変性、及び再生を減衰させた。ＴＡ組織切片の５つのランダム視野に対して、中心核形成パーセント（％）を行った。各視野において、中心核形成線維及び全線維を計数し、中心核形成線維（ＣＮＦ）の割合を計算した。ズーム領域（バー＝２００μｍ）を有する２０×でのＴＡ及び横隔膜の全ての代表的な画像。ＴＡ筋（ｎ＝３）について齢の一致したＢＬ１０野生型対照を、試験施設組織バンクから染色した。横隔膜について、齢の一致したＢＬ１０野生型ＨＣＤを使用した。野生型ＨＣＤデータに対して＊＊＊ｐ＜０．００１。ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ｍｄｘビヒクル対照マウス及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける筋病理。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおける骨格筋の炎症、変性、及び再生を減衰させた。横隔膜組織切片の５つのランダム視野に対して、中心核形成パーセント（％）を行った。各視野において、中心核形成線維及び全線維を計数し、中心核形成線維（ＣＮＦ）の割合を計算した。ズーム領域（バー＝２００μｍ）を有する２０×でのＴＡ及び横隔膜の全ての代表的な画像。ＴＡ筋（ｎ＝３）について齢の一致したＢＬ１０野生型対照を、試験施設組織バンクから染色した。横隔膜について、齢の一致したＢＬ１０野生型ＨＣＤを使用した。野生型ＨＣＤデータに対して＊＊＊ｐ＜０．００１。ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ２×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量でのｍｄｘマウスにおけるＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターＤＮＡ生体内分布。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与群（ｎ＝１２）から収集した組織及びビヒクル対照群（ｎ＝１１）から収集した肝臓を、ｄｄＰＣＲによって分析した。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与群におけるマウスから収集した全ての組織は、推定された定量下限（ＬＬＯＱ）（約０．０８ＧＣ／ｄｇ）を２～４ｌｏｇ上回り、ビヒクル対照群におけるマウスからの肝臓試料は、ほぼＬＬＯＱだった。ベクターゲノムコピーデータは、ＧＣ／ｄｇ（Ａ）及びＧＣ／μｇＤＮＡ（Ｂ）の両方で示した。ＥＤＬ：長趾伸筋、ＴＡ：前脛骨筋。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ウェスタンブロットによって測定された、ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスからの横隔膜、腓腹筋、及びＴＡ筋におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンレベル。バーは、ＢＬ１０野生型マウスとジャーマン・ショートヘアード・ポインター筋ジストロフィー（ＧＳＨＰＭＤ）イヌ筋溶解物の混合物から作製された標準曲線に基づいた平均ジストロフィンパーセント＋Ｓ．Ｄ．を示し、組織当たりｎ＝１０である。 免疫蛍光によるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン導入遺伝子の発現。マイクロジストロフィン／ジストロフィンにおける免疫蛍光を、ビヒクルまたはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与の６週間後にＴＡ及び横隔膜で行った。 免疫蛍光によるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン導入遺伝子の発現。マイクロジストロフィン／ジストロフィンにおける免疫蛍光を、ビヒクルまたはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与の６週間後にＴＡ及び横隔膜で行った。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ＴＡに、マイクロジストロフィンによって膜に局在化した９６％の線維をもたらした。ズーム領域を有する２０×でのＴＡ及び横隔膜の全ての代表的な画像（バー＝２００μｍ）。ＴＡ筋（ｎ＝３）について齢の一致したＢＬ１０野生型対照を、試験施設の組織バンクから染色した。横隔膜について、試験施設からの齢の一致したＢＬ１０野生型ＨＣＤを使用した。野生型に対して＊＊＊ｐ＜０．００１、ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 免疫蛍光によるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン導入遺伝子の発現。マイクロジストロフィン／ジストロフィンにおける免疫蛍光を、ビヒクルまたはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与の６週間後にＴＡ及び横隔膜で行った。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、横隔膜に、マイクロジストロフィンによって膜に局在化した８９．１％の線維をもたらした。ズーム領域を有する２０×でのＴＡ及び横隔膜の全ての代表的な画像（バー＝２００μｍ）。ＴＡ筋（ｎ＝３）について齢の一致したＢＬ１０野生型対照を、試験施設の組織バンクから染色した。横隔膜について、試験施設からの齢の一致したＢＬ１０野生型ＨＣＤを使用した。野生型に対して＊＊＊ｐ＜０．００１、ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 免疫蛍光によるジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）。ＤＡＰＣタンパク質：ジストロフィンを有するα１－シントロフィン、ジストロブレビン、ｎＮＯＳ－１、及びβ－ジストログリカンを、免疫蛍光によってＴＡ組織で測定した。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン陽性線維で局在化されたシントロフィン及びジストロブレビン発現を回復させ、β－ジストログリカン発現は部分的に回復した。ｎＮＯＳ発現は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスで検出可能であり、ビヒクル対照のｍｄｘマウスよりも高いが、野生型ほど強固ではなかった。ズーム領域（バー＝１００μｍ）を有する２０×でのＴＡの全ての代表的な画像。各群において、星印は同じ線維を示す。ＴＡ筋について齢の一致したＢＬ１０野生型対照（ｎ＝５）を、試験施設の組織バンクから染色した。 微細運動学的歩行分析からの歩行全体スコア。ｍｄｘマウスへのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与（群当たりｎ＝８～１０）の６週間後及び１２週間後に、自動歩行分析を行った。全歩行スコアにおいて、明確なｍｄｘマウスモデル効果は、投与の６週間後に観察され、投与の１２週間後にさらに大きく観察された。１２週目に、全歩行スコアは、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を１×１０１４、３×１０１４、及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で投与されたｍｄｘマウスにおいて有意に改善された。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（ＲＭ二元配置ＡＮＯＶＡ、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。 Ｔ２－磁気共鳴画像法。ビヒクルまたはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１のｍｄｘマウスへの投与の６及び１２週間後に、Ｔ２加重ＭＲＩを行った（群当たりｎ＝８～１０）。代表的な画像を示す。高強度病変は、黄色の矢印（６週）及び赤色の矢印（１２週）によって示される。 Ｔ２－磁気共鳴画像法。ビヒクルまたはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１のｍｄｘマウスへの投与の６及び１２週間後に、Ｔ２加重ＭＲＩを行った（群当たりｎ＝８～１０）。腓腹筋体積（ｍｍ３）を測定した。全てのデータは、合わせた両方の脚から得た。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（ＲＭ二元配置ＡＮＯＶＡ、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクル対照に対して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。 Ｔ２－磁気共鳴画像法。ビヒクルまたはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１のｍｄｘマウスへの投与の６及び１２週間後に、Ｔ２加重ＭＲＩを行った（群当たりｎ＝８～１０）。自動閾値分析を使用して得られた腓腹筋高強度パーセント（％）を測定した。全てのデータは、合わせた両方の脚から得た。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（ＲＭ二元配置ＡＮＯＶＡ、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクル対照に対して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。 Ｔ２－磁気共鳴画像法。ビヒクルまたはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１のｍｄｘマウスへの投与の６及び１２週間後に、Ｔ２加重ＭＲＩを行った（群当たりｎ＝８～１０）。腓腹筋病変におけるＴ２緩和時間（ミリ秒、ｍｓ）を測定した。全てのデータは、合わせた両方の脚から得た。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（ＲＭ二元配置ＡＮＯＶＡ、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクル対照に対して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。 Ｔ２－磁気共鳴画像法。ビヒクルまたはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１のｍｄｘマウスへの投与の６及び１２週間後に、Ｔ２加重ＭＲＩを行った（群当たりｎ＝８～１０）。非病変におけるＴ２緩和時間（ミリ秒、ｍｓ）を測定した。全てのデータは、合わせた両方の脚から得た。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（ＲＭ二元配置ＡＮＯＶＡ、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクル対照に対して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。 ６、９、及び１２週目の握力（体重に対して正規化）。握力測定は、ビヒクルまたはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与（群当たりｎ＝８～１０）が示された用量で投与された６、９、及び１２週間後に行われた。投与の６及び９週間後では、明確なｍｄｘマウスモデル効果は観察されなかった。投与の１２週間後に、野生型マウスとｍｄｘマウスとの間の差が認められたが、統計的有意性はなかった。１２週目に、握力は、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較して、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を３×１０１４及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で投与したｍｄｘマウスで有意に改善された。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：ｍｄｘビヒクル対照に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。 ７及び１２週目のクレアチンキナーゼ濃度。ビヒクルまたはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１のｍｄｘマウスへの投与の７及び１２週間後に、血清からＣＫ分析を行った（群当たりｎ＝８～１０）。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型に対して＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＲＭ二元配置ＡＮＯＶＡ、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクル対照に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。 ＢＬ１０野生型及びｍｄｘマウス（ビヒクルまたはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与）の肝臓及び筋肉組織におけるベクターＤＮＡの生体内分布。バーは平均値＋Ｓ．Ｄ．を示し、各組織について群当たりｎ＝５である。ＢＬ１０野生型マウス及びｍｄｘビヒクル対照マウスから収集した組織は、ベクターＤＮＡレベルを定量限界（ＢＱＬ＝５０コピー／μｇＤＮＡ）未満または検出限界（ＬＯＤ＝１１．９６コピー／μｇＤＮＡ）のいずれかで示した。 腓腹筋、横隔膜、及び心臓におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン／ジストロフィンタンパク質の発現。バーは、ＢＬ１０マウス及びＧＳＨＰＭＤイヌ筋肉溶解物の混合物から作製された標準曲線に基づいて、平均ジストロフィンパーセント＋Ｓ．Ｅを示す。ＢＬ１０野生型（ｎ＝１０）、ｍｄｘビヒクル対照（ｎ＝９）、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１ ｍｄｘ（用量群当たりｎ＝８～１０）。野生型に対して＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ビヒクル対照ｍｄｘマウスに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 腓腹筋、横隔膜、及び心臓におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン／ジストロフィンタンパク質の発現。横隔膜におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン／ジストロフィンタンパク質の代表的なウェスタンブロット。実線枠：野生型ジストロフィンの予想される分子位置、破線枠：血清からのＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン画像解析を行った予想される分子位置。 異なる濃度のＲＧＸ－ＤＹＳ１による処置の２６週試験からのマウスの体重を示す。 Ｔ２－磁気共鳴画像法を示す。異なる濃度のＲＧＸ－ＤＹＳ１による処置の２６週試験の１７週目におけるマウスのＭＲＩからの代表的な画像を示す。 Ｔ２－磁気共鳴画像法を示す。異なる濃度のＲＧＸ－ＤＹＳ１による処置の２６週試験の２６週目におけるマウスのＭＲＩからの代表的な画像を示す。 腓腹筋（Ａ）体積及び（Ｂ）病変のＭＲＩ結果を示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（反復測定（ＲＭ）二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。 （Ａ）Ｔ２時間－病変（％）及び（Ｂ）Ｔ２時間－非病変（％）のＭＲＩ結果を示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（反復測定（ＲＭ）二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。 ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１のｍｄｘマウスへの投与の６週間後、１７週間後、及び２６週間後での全歩行スコアを提供する。全歩行スコアでは、全ての時点で明確なｍｄｘマウスモデル効果が観察された。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（反復測定（ＲＭ）二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。 対照マウスまたは異なる濃度のＲＧＸ－ＤＹＳ１で処置したマウスにおける、１２週、１８週、及び２７週でのクレアチンキナーゼ濃度の例を示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（反復測定（ＲＭ）二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクルに対して＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。 処置群における９週、１７週、及び２６週での体重に対して正規化された握力に関する例示的なデータを示す。 ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける線維症及び炎症を示す。（Ａ）横隔膜の代表的なマッソントリクローム染色及びその定量（Ｃ）を示す。加えて、線維症を横隔膜及び心臓で測定した（Ｃ及びＤ）。横隔膜における炎症性細胞の代表的なＨ＆Ｅ画像（Ｂ）及びその定量（Ｅ）。炎症性細胞の数も、腓腹筋（Ｆ）で評価した。データは、倍率変化（対野生型）として表した。群当たり４～５匹の動物を使用した。野生型に対して＊ｐ＜０．０５、ｍｄｘビヒクル対照に対して＊ｐ＜０．０５。 ＢＬ１０野生型及びｍｄｘマウス（ビヒクルまたはＲＧＸ－ＤＹＳ１投与）の肝臓及び筋肉組織におけるベクターＤＮＡ生体内分布を示す。バーは、各組織について群当たりｎ＝５で平均値＋ＳＤを示す。野生型マウス及びｍｄｘビヒクル対照マウスから収集した組織は、ベクターＤＮＡレベルを定量レベル（ＢＱＬ）＝５０コピー未満またはＬＯＤ＝１１．９６コピーのいずれかで示した。ベクターＤＮＡレベル＜定量限界（ＬＯＱ）（５０コピー）は全て、平均計算ではゼロであると仮定した。 ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスでの、腓腹筋、横隔膜、及び心臓におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン／ジストロフィンタンパク質発現を示す。バーは、野生型マウスとジャーマン・ショートヘアード・ポインター筋ジストロフィー（ＧＳＨＰＭＤ）イヌ筋溶解物との混合物から作製された標準曲線に基づいた、平均ジストロフィンパーセント＋ＳＥＭを示す。ｎ＝７～１０／群。ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘとビヒクルｍｄｘ群との比較では、クラスカル・ワリス検定、続いて、ダンの事後多重比較検定を腓腹筋で使用し、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、多重比較のためのダネットの事後調整を横隔膜及び心臓で使用した。統計的有意性は、ｐ＜０．００２及びｂｐ＜０．００１で認められた（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘ対ビヒクル対照ｍｄｘマウス）。 免疫蛍光によるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現を示す。（Ａ）メロシン（筋線維のマーカー）を用いたマイクロジストロフィン／ジストロフィンにおける免疫蛍光を、ビヒクルまたはＲＧＸ－ＤＹＳ１投与の２６週間後に横隔膜組織で行った。筋線維鞘でのジストロフィン／マイクロジストロフィン線維のパーセント（Ｂ）及びジストロフィン／マイクロジストロフィン強度のパーセント（Ｃ）を測定した。ズーム領域を有する２０×での横隔膜の全ての代表的な画像（バー＝２００μｍ）。野生型に対して＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ビヒクル対照ｍｄｘに対して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。データを平均±ＳＤとして表す。 ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与が、比筋力を有意に増加させ、損傷に抵抗する横隔膜筋の能力を改善したことを示す。（Ａ）筋肉によって生成された最大のＢ力をその断面積に対して正規化することによって計算した横隔膜筋の比筋力（Ｎ／ｃｍ２）。図中のピンクの円及び矢じりは、期待される筋力値内だった外れ値を表す。（Ｂ）野生型またはｍｄｘマウスから単離された横隔膜筋を５回の伸張性収縮（ｅｃｃ）に供し、各収縮で測定された力を、第１の収縮中に生成された力のパーセンテージとして表した。データを平均±ＳＤとして表す。野生型に対して＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｍｄｘビヒクル対照に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与が、比筋力を増加させ、損傷に抵抗するＥＤＬ筋の能力を改善したことを示す。（Ａ）筋肉によって生成された最大の力をその断面積に対して正規化することによって計算した横隔膜筋の比筋力（Ｎ／ｃｍ２）。（Ｂ）野生型またはｍｄｘマウスから単離されたＥＤＬ筋を５回の伸張性収縮（ｅｃｃ）に供し、各収縮で測定された力を、第１の収縮中に生成された力のパーセンテージとして表した。データを平均±ＳＤとして表す。野生型に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｍｄｘビヒクル対照に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 炎症の有意な減少が、ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおいて観察されたことを示す。横隔膜（Ａ）及びＴＡ（Ｂ）の全切片における炎症性細胞の数を計数し、倍率変化（対野生型）として示した。野生型及びビヒクル対照ｍｄｘマウス（用量群当たりｎ＝４～５）及びＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウス（用量群当たりｎ＝４～５）を使用した。統計的有意性：野生型に対して＊ｐ＜０．０５、ｍｄｘビヒクル対照に対して＊ｐ＜０．０５。 野生型及びｍｄｘマウスから収集した横隔膜、腓腹筋、及び心筋における６週目のＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質発現を示す。組織中のタンパク質レベルを、キャピラリベースのウェスタンイムノアッセイによって測定した。バーは平均マイクロジストロフィンパーセント±ＳＥＭを示す。野生型マウス（ｎ＝３）及びビヒクル対照ｍｄｘマウス（ｎ＝５）は、いずれの定量可能なＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質レベルも示さず、定量レベル未満（ＢＬＱ）の全ての値（＜５ｎｇ／ｍｇタンパク質の定量レベル（ＬＯＱ））は、平均の計算においてゼロとして処理した。ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与されたｍｄｘマウス（用量群当たりｎ＝４～５）。 ＲＧＸ－ＤＹＳ３（μＤｙｓ－ＣＴ４８）と比較したＲＧＸ－ＤＹＳ１（μＤｙｓ－ＣＴ１９４）のマイクロジストロフィン安定性を、生細胞蛍光パルスチェイスイメージング（Ａ）、タンパク質ゲル蛍光（Ｂ）、及びシクロヘキシミドチェイス（Ｃ）方法による半減期決定によって測定して示す。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、及びＸ連鎖性拡張心筋症を含むが、これらに限定されない、ジストロフィン異常症の治療のために、例えば、筋肉細胞中で、発現のための調節エレメントに操作可能に連結されたマイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を有する組換えゲノム（及び組換えゲノムを有するｒＡＡＶを産生するためのシスプラスミド）を含む、遺伝子療法ベクター、特にＡＡＶベクターを投与する方法が提供される。導入遺伝子によってコードされるマイクロジストロフィンタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなり、式中、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４は、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴは、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、配列番号９２（ＵｎｉＰｒｏｔ－ＫＢ－Ｐ１１１５３２）のヒトジストロフィンアミノ酸残基３３６１～３３５４をコードするＣ末端の少なくとも近位部分、または配列番号１６のアミノ酸配列を含み得るかもしくはそれからなり得るか、あるいは代替的に、ＣＴは、配列番号８３を含むかまたはそれからなる切断ＣＴであり、マイクロジストロフィンは、配列番号１（ＲＧＸ－ＤＹＳ１）または配列番号７９（ＲＧＸ－ＤＹＳ５）のアミノ酸配列を有し得る。導入遺伝子は、例えば、ＳＰｃ５－１２（配列番号３９）などの筋肉特異的プロモーター、及び小ポリＡシグナル（配列番号４２）などのポリアデニル化シグナルを含む、調節配列をさらに含む。例示的な構築物（シスプラスミド及びＡＡＶゲノムを含む）は、例えば、図２に示され、（ＲＧＸ－ＤＹＳ１では配列番号５３及びＲＧＸ－ＤＹＳ５では配列番号８２）のヌクレオチド配列を有し得、ＩＴＲ配列（配列番号５３及び配列番号８２のヌクレオチド配列に見出されるようなＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む）を含み得る。遺伝子療法ベクターはＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型ベクターであり得る。特定の実施形態において、遺伝子療法ベクターは、配列番号５３のヌクレオチド配列（ＲＧＸ－ＤＹＳ１）を有する人工ゲノムを含むＡＡＶ８であり、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１と呼ばれ得る。
ｍｄｘマウス（以下の実施例６、７、及び８）で行われた薬理学試験に基づいて、本明細書に記載の導入遺伝子（ＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ５を含む）（実施形態において、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む）を含むｒＡＡＶの末梢（静脈内を含む）投与のための治療有効単回用量は、５×１０１３ＧＣ／ｋｇ～１×１０１５ＧＣ／ｋｇであり、その範囲内の投与量を含み、１×１０１４、１．１×１０１４、１．２×１０１４、１．３×１０１４、１．４×１０１４、１．５×１０１４、１．６×１０１４、１．７×１０１４、１．８×１０１４、１．９×１０１４、２×１０１４、２．１×１０１４、２．２×１０１４、２．３×１０１４、２．４×１０１４、２．５×１０１４、２．６×１０１４、２．７×１０１４、２．８×１０１４、２．９×１０１４、または３×１０１４ＧＣ／ｋｇが含まれる。本明細書に記載される導入遺伝子を含むかかる治療有効投与量のｒＡＡＶ（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む）の投与は、投与から１２週間、２６週間、５２週間、もしくはそれ以上の期間内に、クレアチンキナーゼ活性における低下、筋肉体積、筋肉病変における減少、歩行もしくは歩行スコア（ＮＳＡＡスコアなど）における改善、または強度もしくは可動性の他の尺度などのジストロフィン異常症疾患の１つ以上の指標の改善をもたらす。
したがって、本明細書において、ＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ５構築物を含む、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含む組換えゲノムを含む、ｒＡＡＶ８を含む、ｒＡＡＶを、それを必要とする、ヒト対象を含む、対象に投与する方法が提供及び記載され、投与は、５×１０１３ＧＣ／ｋｇ～１×１０１５ＧＣ／ｋｇの投与量での静脈内または他の末梢投与であり、その範囲内の投与量を含み、１×１０１４、１．１×１０１４、１．２×１０１４、１．３×１０１４、１．４×１０１４、１．５×１０１４、１．６×１０１４、１．７×１０１４、１．８×１０１４、１．９×１０１４、２×１０１４、２．１×１０１４、２．２×１０１４、２．３×１０１４、２．４×１０１４、２．５×１０１４、２．６×１０１４、２．７×１０１４、２．８×１０１４、２．９×１０１４、または３×１０１４ＧＣ／ｋｇが含まれる。また、本明細書に記載のマイクロジストロフィンをコードするｒＡＡＶの静脈内を含む末梢投与のために製剤化された医薬組成物も提供される。
５．１．定義
「ＡＡＶ」または「アデノ随伴ウイルス」という用語は、ウイルスのパルボウイルス科分類内のディペンドパルボウイルスを指す。ＡＡＶは、天然に存在する「野生型」ウイルスに由来するＡＡＶ、天然に存在するｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を含むカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来する及び／または天然に存在しないカプシドｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を含むカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶであり得る。後者の例には、改変した配列及び／または天然に存在するカプシドのアミノ酸配列内へのペプチド挿入を有するカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶが含まれる。
「ｒＡＡＶ」という用語は、「組換えＡＡＶ」を指す。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の一部または全てが異種配列で置換されているＡＡＶゲノムを有する。
「ｒｅｐ－ｃａｐヘルパープラスミド」という用語は、ウイルスのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子機能を提供し、機能的ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子配列を欠くｒＡＡＶゲノムからのＡＡＶの産生を補助するプラスミドを指す。
「ｃａｐ遺伝子」という用語は、ウイルスのカプシド被覆を形成するか、または形成するのを助けるカプシドタンパク質をコードする核酸配列を指す。ＡＡＶの場合、カプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３であり得る。
「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、ウイルスの複製及び産生に必要な非構造タンパク質をコードする核酸配列を指す。
「核酸」及び「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の組み合わせまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡ分子の類似体を含む。そのような類似体は、イノシンまたはトリチル化塩基を含むがこれらに限定されないヌクレオチド類似体を使用して生成され得る。そのような類似体はまた、例えば、ヌクレアーゼ耐性または細胞膜を通過する能力の増加などの分子に有益な属性を与える修された骨格を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含むことができる。核酸またはヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であり得、一本鎖部分及び二本鎖部分の両方を含有し得、三本鎖部分を含有し得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
本明細書に開示されるアミノ酸残基は、保存的置換によって改変して、全体的なポリペプチド構造及び／または機能を維持するか、または実質的に維持することができる。本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、疎水性アミノ酸（すなわち、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ｌｉｅ、及びＬｅｕ）は、他の疎水性アミノ酸で置換することができ、かさ高い側鎖を有する疎水性アミノ酸（すなわち、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ）は、かさ高い側鎖を有する他の疎水性アミノ酸で置換することができ、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸（すなわち、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、及びＬｙｓ）は、正に荷電した側鎖を有する他のアミノ酸で置換することができ、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸（すなわち、Ａｓｐ及びＧｌｕ）は、負に荷電した側鎖を有する他のアミノ酸で置換することができ、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸（すなわち、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、及びＧｌｎ）は、極性非荷電側鎖を有する他のアミノ酸で置換することができることを示す。
「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、互換的に使用される。対象は、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）または霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
「治療上機能的マイクロジストロフィン」という用語は、マイクロジストロフィンが、本明細書のセクション５．４に記載されている治療的有用性のためのアッセイのうちの１つ以上で、または本明細書のセクション５．５に記載されている治療方法の評価で、治療的有効性を示すことを意味する。
「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、互換的に使用される。対象は、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）または霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
「治療剤」という用語は、疾患または障害に関連する症状の治療、管理、または改善において使用され得る任意の薬剤を指し、疾患または障害は、導入遺伝子によって提供される機能に関連する。「治療有効量」は、標的疾患または障害の治療または管理において、それらを患う対象に投与したときに、標的疾患または障害の治療または管理に少なくとも１つの治療的利益を提供する薬剤の量（例えば、導入遺伝子によって発現される生成物の量）を指す。さらに、本発明の薬剤に関する治療有効量は、単独での、または他の治療剤と組み合わせた場合の薬剤の量が、疾患または障害の治療または管理において少なくとも１つの治療的利益を提供することを意味する。
「予防剤」という用語は、疾患または障害の進行の予防、その可能性の低減、その遅延、また緩慢化において使用することができる任意の薬剤を指し、疾患または障害は、導入遺伝子によって提供される機能に関連する。「予防有効量」は、標的疾患または障害の予防または遅延において、それらに素因がある対象に投与したときに、少なくとも１つの予防的利益を提供する予防剤の量（例えば、導入遺伝子によって発現される生成物の量）を指す。予防有効量はまた、標的疾患または障害の発生を予防、その可能性の低減、もしくはその遅延、または標的疾患もしくは障害の進行を緩慢化させるのに十分な薬剤の量、標的疾患もしくは障害の発症を遅延または最小化するのに十分な量、またはそれらの再発もしくは広がりを予防もしくは遅延させるのに十分な量を指し得る。予防有効量はまた、標的疾患または障害の症状の増悪を予防または遅延させるのに十分な薬剤の量を指し得る。さらに、本発明の予防剤に関する予防有効量は、単独での、または他の治療剤と組み合わせた場合の予防剤の量が、疾患または障害の予防または遅延において少なくとも１つの予防的利益を提供することを意味する。
本発明の予防剤は、標的疾患または障害の「素因がある」対象に投与され得る。疾患または障害の「素因がある」対象は、疾患または障害の発症に関連する症状を示すか、またはそのような疾患または障害の遺伝的構成、環境曝露、または他の危険因子を有するが、症状が疾患または障害として診断されるレベルにまだ達していない対象である。例えば、（導入遺伝子によって提供される）欠損遺伝子に関連する疾患の家族歴を有する患者は、それの素因があるものとして適する場合がある。さらに、原発性腫瘍の除去後に持続する潜伏腫瘍を有する患者は、腫瘍の再発の素因があるものとして適する場合がある。
「ＣｐＧアイランド」という用語は、ジヌクレオチドＣｐＧ（例えば、Ｃ（シトシン）塩基の直後にＧ（グアニン）塩基（ＣｐＧ）が続く）を高頻度で含むゲノムのこれらの特有な領域を意味し、したがって、ＣｐＧアイランドのＧ＋Ｃ含有量は、非アイランドＤＮＡのものよりも著しく高い。ＣｐＧアイランドは、ヌクレオチド長、ヌクレオチド組成、及びＣｐＧジヌクレオチドの頻度の分析によって特定することができる。任意の特定のヌクレオチド配列またはゲノムにおけるＣｐＧアイランド含有量は、以下の基準を使用して測定され得る：１００を超えるアイランドサイズ、５０．０％を超えるＧＣパーセント、及びセグメント中のＧ及びＣの数に基づいて予想される数に対する観察されたＣＧジヌクレオチド数の０．６を超える比（０．６を超えるＯｂｓ（観察）／Ｅｘｐ（予想））。
Ｏｂｓ／Ｅｘｐ ＣｐＧ＝ＣｐＧの数×Ｎ／（Ｃの数×Ｇの数）
式中、Ｎは配列の長さである。
かかる計算には、ｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ－ｗｅｂ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ．ｃｇｉ、ｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ－ｗｅｂ．ｃｐｇｉｓｌａｎｄｓ．ｕｓｃ．ｅｄｕ／、ｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ－ｗｅｂ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ｃｐｇｐｌｏｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、及びｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ－ｗｅｂ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／ｃｐｇ＿ｉｓｌａｎｄｓ．ｈｔｍｌなど、様々なソフトウェアツールが利用可能である。（Ｇａｒｄｉｎｅｒ－Ｇａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８７ Ｊｕｌ ２０；１９６（２）：２６１－８２、Ｌｉ ＬＣ ａｎｄ Ｄａｈｉｙａ Ｒ．ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ：ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＰＣＲｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００２ Ｎｏｖ；１８（１１）：１４２７－３１も参照されたい）。一実施形態において、ＣｐＧアイランドを特定するアルゴリズムは、ｗｗｗ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ．ｃｇｉに見出される。
５．２．マイクロジストロフィン導入遺伝子
５．２．１ 導入遺伝子によってコードされたマイクロジストロフィン
アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなるマイクロジストロフィンが、本発明の方法のために本明細書に提供される導入遺伝子によってコードされ、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、Ｃ末端ドメインである（及び配列番号８４を含む、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴドメインの少なくとも一部分を含む）。以下の表１は、これらの成分ための、特に全長ヒトＤＭＤタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＤＢ－１１５３２、参照により本明細書に組み込まれる）からのアミノ酸配列を有し、それらは表３及び４（野生型及びコドン最適化配列を含む）のヌクレオチド配列によってコードされる。
ＡＡＶベクターの典型的なパッケージングの制限を克服するために、臨床使用のために開発されたマイクロジストロフィン遺伝子の多くは、ＣＴドメインを欠いている。いくつかの研究者は、ＤＡＰＣが、組み立てるためにＣ末端ドメインさえ必要としないか、またはＣ末端が非必須であることを示している［Ｃｒａｗｆｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０００，１５０（６）：１３９９－１４０９、及びＲａｍｏｓ，Ｊ．Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ２０１９，２７（３）：１－１３］。しかしながら、ｍｄｘマウスの骨格筋におけるＣＴドメインのコイルドコイルモチーフのヘリックス１を含むマイクロジストロフィン遺伝子の過剰発現は、ＤＡＰ複合体のメンバーである動員α１－シントロフィン及びα－ジストロブレビンを増加させ、筋線維鞘膜に動員されたシグナル伝達タンパク質のためのモジュラーアダプターとして機能した［Ｋｏｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ２／９－ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ｈｅｌｉｘ１ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ α１－ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ α－ｄｙｓｔｒｏｂｒｅｖｉｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１．２２（１１）：ｐ．１３７９－８８］。マイクロジストロフィンのより長いバージョンの過剰発現はまた、より短いバージョンと比較して、ｍｄｘマウスにおける収縮誘発性筋肉損傷を延長することに対する筋肉抵抗性を改善した［Ｋｏｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．２０１１、同上］。ＣＴドメインは、ジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）の形成において役割を果たす（図１Ｂを参照）。
ジストロフィンのＣＴドメインは、ロッドドメイン内のものと同様のα－ヘリカルコイルドコイルを形成することが予測される２つのポリペプチド伸長を含む（以下の表１の配列番号１６に単一下線で示されるＨ１及び二重下線で示されるＨ２を参照されたい）。各コイルドコイルは、ロイシンが「ｄ」位置で優勢であるロイシンジッパーに認められるのと同様の保存された反復ヘプタド（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ）ｎを有する。このドメインは、ＣＣ（コイルドコイル）ドメインと名付けられている。ジストロフィンのＣＣ領域は、ジストロブレビンに対する結合部位を形成し、α１－シントロフィンと他のジストロフィン関連タンパク質との間の相互作用を調節し得る。
両シントロフィンアイソフォームである、α１－シントロフィン及びβ１－シントロフィンは、ジストロフィンエクソン７３及び７４における２つ以上の結合部位を介してジストロフィンと直接的に相互作用すると考えられる（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，ＪＢＣ２７０（１０）：４９７５－８（１９９５））。α１－及びβ１－シントロフィンは、ジストロフィンＣ末端ドメインに別々に結合し、α１－シントロフィンの結合部位は、少なくともアミノ酸残基３４４７～３４８１内に存在することが報告されており、一方、β１－シントロフィンの結合部位は、アミノ酸残基３４９５～３５３５内に存在すると報告されている（ＵｎｉＰｒｏｔＤＢ－１１５３２（配列番号９２）のＤＭＤタンパク質における番号付として、表１、配列番号１６、斜体も参照されたい）。アルファ１－（α１－）シントロフィン及びアルファ－シントロフィンは、全体を通して互換的に使用される。
本明細書に開示されるマイクロジストロフィンは、ｎＮＯＳ、ならびにアルファ－シントロフィン、アルファ－ジストロブレビン、及びベータ－ジストログリカンに結合し、動員することが見出された。ｎＮＯＳとの結合は、ｎＮＯＳに結合するジストロフィンのＣ末端ドメインを含むマイクロジストロフィンの文脈において、筋肉組織で発現されたマイクロジストロフィンを、適切な抗体で免疫染色することによって決定され、形質導入された筋肉組織の切片中の筋線維鞘内またはその付近のアルファ－シントロフィン、アルファ－ジストロブレビン、及びｎＮＯＳの各々を特定したことを意味する。以下の実施例４及び５を参照されたい。特定の実施形態において、マイクロジストロフィンタンパク質は、Ｃ末端ドメインを含まない同等のマイクロジストロフィン（しかし、さもなければ同じアミノ酸配列を有する、すなわち「参照マイクロジストロフィンタンパク質」である）と比較して、α１－シントロフィン、β－シントロフィン、及び／またはジストロブレビンとの「結合を増加させる」Ｃ末端ドメインを有し、ＤＡＰＣがＣ末端ドメインを有しない参照マイクロジストロフィンよりも大きな程度まで筋線維鞘に安定化または固定されることを意味し、それは、参照マイクロジストロフィンタンパク質（Ｃ末端ドメインを有しないか、またはＣＲドメインに近位の最小４８個のアミノ酸を有することを除いて、同じ配列及びジストロフィン成分を有する）で処置されたｍｄｘマウス筋肉と比較して、Ｃ末端ドメインを有するマイクロジストロフィンで処置されたｍｄｘマウス筋肉中のα１－シントロフィン、β－シントロフィン、α－ジストロブレビン、β－ジストログリカン、またはｎＮＯＳを含む１つ以上のＤＡＰＣ成分について筋肉切片の免疫染色または筋肉組織溶解物もしくは筋肉膜調製物のウェスタンブロット分析によって筋肉膜中の１つ以上のＤＡＰＣ成分のより高いレベルによって決定された（以下のセクション６．４及び６．５における実施例４及び５を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、ジストロフィンのＣ末端ドメインを含むマイクロジストロフィンは、Ｃ末端ドメインにα１－シントロフィン結合部位及び／またはジストロブレビン結合部位を含む。いくつかの実施形態において、α１－シントロフィン結合部位を含むＣ末端ドメインは、切断Ｃ末端ドメインである。α１－シントロフィン結合部位は、部分的には、α１－シントロフィンを介してｎＮＯＳを動員して、筋線維鞘に固定するように機能する（図１Ａ及び１Ｂを参照されたい）。
本明細書に記載の実施形態は、コイルドコイルモチーフのヘリックス１を含むＣＴドメインの全てまたは一部分を含むことができる。Ｃ末端配列は、ＤＭＤ遺伝子のエクソンのコード配列、特にエクソン７０～７４、及びエクソン７５の一部分（特に、エクソン７５によってコードされるアミノ酸配列の最初の３６個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列）によって、またはヒトＤＭＤタンパク質の配列、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２の配列（配列番号９２）（ＣＴは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２配列のアミノ酸３３６１～３５５４である）によって定義され得るか、あるいはジストロブレビン及び／またはα１－シントロフィンの結合部位を含むかまたはそれからなる（表１に示される、配列番号１６）。特定の実施形態において、ＣＴドメインは、ＤＭＤタンパク質の１９４個のＣ末端アミノ酸、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２（配列番号９２）のアミノ酸配列の残基３３６１～３５５４、エクソン７０～７４によってコードされるアミノ酸、及びＤＭＤ遺伝子のエクソン７５のヌクレオチド配列の最初の３６ヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列、または配列番号１６のアミノ酸配列からなるか、あるいはそれらを含む（表１を参照）。例えば、ＲＧＸ－ＤＹＳ１（また、μＤｙｓ－ＣＴ１９４）は、配列番号１６の１９４個のアミノ酸ＣＴ配列を有する。
他の実施形態において、Ｃ末端ドメインのアミノ酸配列は、切断され、ジストロブレビン及び／またはα１－シントロフィンに対する少なくとも結合部位を含む。特定の実施形態において、切断Ｃ末端ドメインは、アミノ酸配列ＭＥＮＳＮＧＳＹＬＮＤＳＩＳＰＮＥＳＩＤＤＥＨＬＬＩＱＨＹＣＱＳＬＮＱ（α１－シントロフィン結合部位）（配列番号８４）を含む。特定の実施形態において、切断Ｃ末端ドメインは、α１－シントロフィン結合部位を含み、結合部位は、アミノ酸配列ＭＥＮＳＮＧＳＹＬＮＤＳＩＳＰＮＥＳＩＤＤＥＨＬＬＩＱＨＹＣＱＳＬＮＱ（配列番号８４）を有する。特定の実施形態において、ＣＴドメイン配列は、配列番号８３のアミノ酸配列、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２ヒトＤＭＤ配列のアミノ酸３３６１～３５００（ＣＴ１４０もしくはＣＴ１．５と称される）を有する。例えば、ＲＧＸ－ＤＹＳ５（μＤｙｓ－ＣＴ１４０）は、配列番号８３のアミノ酸配列を有するＣＴドメインを有する。代替的な実施形態において、マイクロジストロフィンは、ＣＴドメインを欠いており（またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２ヒトＤＭＤ配列のアミノ酸３３６１～３４０８である、ＣＴ４８と呼ばれる、ＣＴドメインの最小４８個のアミノ酸を含む、配列番号９１）、ＡＢＤ１－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ３－Ｈ３－Ｌ４－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、例えばＲＧＸ－ＤＹＳ３（μＤｙｓ－ＣＴ４８）（図２、配列番号２）のように配置されるドメインを有し得る。実施形態において、例えば、ＲＧＸ－ＤＹＳ１などのマイクロジストロフィンは、例えば、本明細書において、実施例１１に記載されるように、組織培養におけるパルスチェイスアッセイによって決定されるとき、４８個のアミノ酸（配列番号９１）のＣＴ配列を有するＲＧＳ－ＤＹＳ３などのマイクロジストロフィンよりも１．５倍、２倍、２．５倍、または３倍長い半減期を有する。
ジストロフィンのＮＨ２末端及びロッドドメイン内の領域は、細胞骨格アクチンに直接結合するが、架橋しない。野生型ジストロフィンのロッドドメインは、スペクトリンの三重ヘリカル反復と同様の２４個の反復単位から構成される。この反復単位は、ジストロフィンタンパク質の大部分を占め、分子にβ－スペクトリンに類似した可撓性のロッド状構造を与えると考えられる。これらのα－ヘリカルコイルドコイル反復は、４つのプロリンリッチヒンジ領域によって中断される。２４番目の反復の最後には、ＷＷドメインが直後に続く第４のヒンジ領域がある［Ｂｌａｋｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍｕｓｃｌｅ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８２：２９１－３２９，２００２］。本明細書に開示されるマイクロジストロフィンは、Ｒ４～Ｒ２３を含まず、４つのヒンジ領域のうちの３つまたはその一部分のみを含む。いくつかの実施形態において、新たなアミノ酸残基またはリンカーは、マイクロジストロフィンに導入されない。
いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンは、Ｈ３（例えば、配列番号１、２、または７９）を含む。実施形態において、Ｈ３は、Ｎ末端からＣ末端への完全な内因性Ｈ３ドメイン、例えば、配列番号１１であることができる。別の言い方をすれば、いくつかのマイクロジストロフィン実施形態は、Ｈ３ドメインの断片を含まないが、Ｈ３ドメイン全体を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ３ドメインのＣ末端アミノ酸は、Ｈ３ドメインのＮ末端アミノ酸に直接結合（または共有結合）される。いくつかの実施形態において、Ｈ３ドメインのＮ末端アミノ酸に結合したＲ３ドメインのＣ末端アミノ酸は、Ｑである。いくつかの実施形態において、Ｒ３ドメインに結合したＨ３ドメインの５’アミノ酸は、Ｑである。
いかなる一理論にも束縛されることなく、完全なヒンジドメインは、誘導されるマイクロジストロフィンタンパク質に完全な活性を伝達するために、任意のマイクロジストロフィンにおいて適切であり得る。ジストロフィンのヒンジセグメントは、本来プロリンリッチであると認識されており、したがって、タンパク質産物に可撓性を付与し得る（Ｋｏｅｎｉｇ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ，２６５（６）：４５６０－４５６６，１９９０）。ヒンジの一部分の任意の欠失、特に１つ以上のプロリン残基の除去は、その可撓性を低下させ、したがって、ＤＡＰ複合体における他のタンパク質とのその相互作用を妨げることによって、その有効性を低下させ得る。
本明細書に開示されるマイクロジストロフィンは、ＣＲドメイン（配列番号１５において単一下線で表されるＺＺドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２ ａａ３３０７～３３５４）を含む）との、及びそれを含む野生型ジストロフィンＨ４配列（ＷＷドメインを含む）を含む。ＷＷドメインは、いくつかのシグナル伝達分子及び調節分子に見出されるタンパク質結合モジュールである。ＷＷドメインは、ｓｒｃホモロジー－３（ＳＨ３）ドメインと類似の手段でプロリンリッチ基質に結合する。この領域は、β－ジストログリカンとジストロフィンとの間の相互作用を媒介するが、それはβ－ジストログリカンの細胞質ドメインがプロリンリッチであるためである。ＷＷドメインは、ヒンジ４（Ｈ４領域）にある。ＣＲドメインは、α－アクチニンにおけるものと同様であり、細胞内Ｃａ２＋に結合することができる、２つのＥＦ－ハンドモチーフを含む。ＺＺドメインは、Ｚｎ２＋などの二価金属カチオンのための配位部位を形成することが予測されるいくつかの保存されたシステイン残基を含む。ＺＺドメインは、多くのタイプのジンクフィンガーと類似しており、核タンパク質及び細胞質タンパク質の両方に見出される。ジストロフィンのＺＺドメインは、Ｃａ２＋依存的な手段でカルモジュリンに結合する。したがって、ＺＺドメインは、機能的なカルモジュリン結合部位を表し得、他のジストロフィン関連タンパク質とのカルモジュリン結合に密接な関係を有し得る。
マイクロジストロフィン実施形態は、以下に示されるドメイン：ＡＢＤ１－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ３－Ｈ３－Ｌ４－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ（例えば、配列番号１、７９、または９１）またはＡＢＤ１－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ３－Ｈ３－Ｌ４－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ（例えば、配列番号２）に接続されたリンカー（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ４．１、及び／またはＬ４．２）またはその部分をさらに含むことができ、Ｌ１は、ＡＢＤ１をＨ１に結合することができる内因性リンカーＬ１（例えば、配列番号４）であることができる。Ｌ２は、Ｈ１をＲ１に結合することができる内因性リンカーＬ２（例えば、配列番号６）であることができる。Ｌ３は、Ｒ２をＲ３に結合することができる内因性リンカーＬ３（例えば、配列番号９）であることができる。
Ｌ４はまた、Ｈ３及びＲ２４を結合することができる内因性リンカーであることができる。いくつかの実施形態において、Ｌ４は、天然ジストロフィン配列においてＲ２４に先行する３つのアミノ酸、例えば、ＴＬＥ（配列番号１２）である。他の実施形態において、Ｌ４は、天然ジストロフィン配列におけるＲ２４に先行する４つのアミノ酸（配列番号１７）、またはＲ２４に先行する２つのアミノ酸（配列番号１８）であることができる。他の実施形態において、Ｈ３とＲ２４との間に、Ｌ４またはそれ以外のリンカーは存在しない。Ｈ３の５’末端において、上述のように、リンカーは存在せず、むしろＲ３は、Ｈ３、または代替的にＨ２に直接結合する。
具体的に記載されていない上記のマイクロジストロフィンの他のドメインの成分は、以下の表１に提供されるようなアミノ酸配列を有することができる。本明細書に提供されるドメインに関するアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２（ＤＭＤ＿ＨＵＭＡＮ）（配列番号９２）のジストロフィンアイソフォームに対応する。他の実施形態は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ａ０７５Ｂ６Ｇ３（Ａ０Ａ０７５Ｂ６Ｇ３＿ＨＵＭＡＮ）（参照により本明細書に組み込まれる）などの当該技術分野で既知の天然に存在する機能的ジストロフィンアイソフォームに由来するドメインを含むことができ、例えば、Ｒ２４は、配列番号１３のアミノ酸３におけるＱを置換したＲを有する。
追加の実施形態は、２０２０年１１月２７日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６２４８４に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Figure 2024517143000002
Figure 2024517143000003
Figure 2024517143000004
Figure 2024517143000005
Figure 2024517143000006
本開示はまた、各ドメイン及びリンカーの機能が実質的に維持される限り、及び／またはかかるバリアントを含むマイクロジストロフィンの治療有効性が実質的に維持される限り、これらの配列のバリアントも企図する。機能的活性は、（１）アクチン、β－ジストログリカン、α１－シントロフィン、α－ジストロブレビン、及びｎＮＯＳのうちの１つ、それらの組み合わせ、もしくは全てと結合すること、（２）動物モデル（例えば、本明細書に記載のｍｄｘマウスモデル）もしくはヒト対象における改善した筋肉機能、及び／または（３）動物モデルもしくはヒト患者における心臓保護もしくは心筋機能の改善を含む。特に、マイクロジストロフィンは、配列番号３、または配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＢＤ、配列番号５、または配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ１、配列番号７または配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＲ１、配列番号８または配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＲ２、配列番号１１または配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ３、配列番号１３または配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＲ２４、配列番号１４または配列番号１４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ４、配列番号１５もしくは９０または配列番号１５もしくは９０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＣＲ、配列番号１６もしくは８３または配列番号１６もしくは８３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＣＴ、あるいは配列番号８４を含むＣＴを含むことができる。上記に加えて、マイクロジストロフィンは、上記の位置に、以下のような配列を含むか、またはそれらからなるリンカーを含むことができる。配列番号４または配列番号４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ１、配列番号６または配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ２、配列番号９、または配列番号９と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ３、もしくは両方のＬ３残基に保存的置換を有するバリアント、及び配列番号１２、１７、もしくは１８、または配列番号１２、１７、もしくは１８と少なくとも５０％、少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ４。
表２は、本開示によるマイクロジストロフィン実施形態のアミノ酸配列を提供する。また、他の実施形態は、配列番号１（ＲＧＸ－ＤＹＳ１）、２（ＲＧＸ－ＤＹＳ３）、または７９（ＲＧＸ－ＤＹＳ５）によって定義されるマイクロジストロフィンの置換バリアントであることも企図される。例えば、保存的置換は、配列番号１、２、または７９に対して行うことができ、その機能的活性を実質的に維持する。実施形態において、マイクロジストロフィンは、配列番号１、２、または７９のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、例えば、以下にセクション５．４で開示される動物モデルにおけるインビトロアッセイまたはインビボアッセイのうちの１つ以上によって決定されるように、機能的マイクロジストロフィン活性を維持し得る。本開示のＲＧＸ－ＤＹＳ２及びＲＧＸ－ＤＹＳ４はまた、配列番号１を含むマイクロジストロフィンタンパク質をコードする。
Figure 2024517143000007
Figure 2024517143000008
Figure 2024517143000009
５．２．２ マイクロジストロフィンをコードする核酸組成物
本開示の別の態様は、本明細書に記載のマイクロジストロフィンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸である。かかる核酸は、上記のセクション５．２．１に詳述されるように、Ｎ末端からＣ末端にＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴのように配置されたドメインを有するマイクロジストロフィンをコードするヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列は、ドメインをコードする任意のヌクレオチド配列であることができる。ヌクレオチド配列は、適切な関連での発現のために、コドン最適化され得、及び／またはＣｐＧアイランドを枯渇され得る。特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号１、２または７９のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンをコードする。ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、または配列番号７９のマイクロジストロフィンを含む、マイクロジストロフィンをコードする任意の配列であることができ、そのヌクレオチド配列は、コードの縮重によって変化し得る。表３及び４は、ＤＭＤドメインをコードする例示的なヌクレオチド配列を提供する。表３は、成分のための野生型ＤＭＤヌクレオチド配列を提供し、表４は、本明細書における構築物（導入遺伝子、発現構築物、シスプラスミド、及び組換えＡＡＶゲノム）で使用されるＤＭＤ成分のためのヌクレオチド配列を提供し、以下のようにコドン最適化されている配列及び／またはＣｐＧアイランドの枯渇したＣｐＧが含まれる。
Figure 2024517143000010
Figure 2024517143000011
Figure 2024517143000012
Figure 2024517143000013
Figure 2024517143000014
Figure 2024517143000015
Figure 2024517143000016
いくつかの実施形態において、かかる組成物は、機能的活性を有するマイクロジストロフィンをコードする、配列番号２２もしくは５７、または配列番号２２もしくは５７と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＡＢＤ１をコードする核酸配列、配列番号２４もしくは５９、または配列番号２４もしくは５９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＨ１をコードする核酸配列、配列番号２６もしくは６１、または配列番号２６もしくは６１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ１をコードする核酸配列、配列番号２７もしくは６２、または配列番号２７もしくは６２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ２をコードする核酸配列、配列番号２９もしくは６４、または配列番号２９もしくは６４と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ３をコードする核酸配列、配列番号３０もしくは６５、または配列番号３０もしくは６５と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＨ３をコードする核酸配列、配列番号３２もしくは６７、または配列番号３２もしくは６７と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ２４をコードする核酸配列、配列番号３３もしくは６８、または配列番号３３もしくは６８と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＨ４をコードする核酸配列、配列番号３４、４７、もしくは６９、または配列番号３４、４７、もしくは６９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＣＲをコードする核酸配列、及び／または配列番号３５もしくは７０、または配列番号３５もしくは７０と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＣＴをコードする核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、かかる組成物は、配列番号２２もしくは５７、または配列番号２２もしくは５７と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号３のＡＢＤ１ドメインをコードする、ＡＢＤ１をコードする核酸配列、配列番号２４もしくは５９、または配列番号２４もしくは５９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号５のＨ１ドメインをコードする、Ｈ１をコードする核酸配列、配列番号２６もしくは６１、または配列番号２６もしくは６１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号７のＲ１ドメインをコードする、Ｒ１をコードする核酸配列、配列番号２７もしくは６２、または配列番号２７もしくは６２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号８のＲ２ドメインをコードする、Ｒ２をコードする核酸配列、配列番号２９もしくは６４、または配列番号２９もしくは６４と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１０のＲ３ドメインをコードする、Ｒ３をコードする核酸配列、配列番号３０もしくは６５、または配列番号３０もしくは６５と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１１のＨ３ドメインをコードする、Ｈ３をコードする核酸配列、配列番号３２もしくは６７、または配列番号３２もしくは６７と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１３のＲ２４ドメインをコードする、Ｒ２４をコードする核酸配列、配列番号３３もしくは６８、または配列番号３３もしくは６８と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１４のＨ４ドメインをコードする、Ｈ４をコードする核酸配列、配列番号３４、４７、もしくは６９、または配列番号３４、４７、もしくは６９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１５もしくは８９のＣＲドメインをコードする、ＣＲをコードする核酸配列、及び／または配列番号３５、７０もしくは８０、または配列番号３５、７０、もしくは８０と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１６もしくは８３のＣＴドメインをコードする、ＣＴをコードする核酸配列を含む。
上記に加えて、核酸組成物は、任意選択的に、上記の位置に以下の配列を含むか、またはそれらからなるリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む：配列番号２３もしくは５８、または配列番号２３もしくは５８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列からなるＬ１をコードする核酸配列（例えば、配列番号４のＬ１ドメインをコードする）、配列番号２５もしくは６０または配列番号２５もしくは６０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列からなるＬ２をコードする核酸配列（例えば、配列番号６のＬ２ドメインをコードする）、配列番号２８もしくは６３または配列番号２８もしくは６３と少なくとも５０％の同一性を有する配列からなるＬ３をコードし、配列番号９のＬ３ドメインもしくは両方のＬ３残基に保存的置換を有するバリアントをコードする核酸配列、及び配列番号１９、３１、３６、３７、３８、４６、もしくは６６または配列番号１９、３１、３６、３７、３８、４６、もしくは６６と少なくとも５０％、少なくとも７５％の配列同一性を有する配列からなるＬ４をコードする核酸配列（例えば、配列番号１２、１７、もしくは１８のＬ４ドメイン、またはＬ４残基のいずれかの保存的置換を有するバリアントをコードする）。
様々な実施形態において、核酸は、配列番号１、配列番号２、または配列番号７９のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンをコードするヌクレオチド配列を含む。実施形態において、核酸は、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号８１であるヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号１、配列番号２、または配列番号７９のマイクロジストロフィンをコードする）を含む。様々な実施形態において、マイクロジストロフィンをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０、２１、または８３（表５）のヌクレオチド配列またはその逆相補体と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有し得、治療上有効なマイクロジストロフィンをコードする。
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５．２．２．１ コドン最適化及びＣｐＧ枯渇
一態様において、マイクロジストロフィンカセットをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化ならびにＣｐＧジヌクレオチド及びＣｐＧアイランド枯渇によって改変される。マイクロジストロフィン導入遺伝子に対する免疫応答は、第１のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子療法臨床治験及びイヌモデルにおけるいくつかのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）－ミニジストロフィン遺伝子療法で証明されたように、ヒト臨床適用にとって懸念である［Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１０．３６３（１５）：ｐ．１４２９－３７、及びＫｏｒｎｅｇａｙ，Ｊ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｍｕｓｃｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＡＡＶ９ ｈｕｍａｎ ｍｉｎｉ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｖｅｃｔｏｒ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｏｇｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１０．１８（８）：ｐ．１５０１－８］。
ＡＡＶ指向性免疫応答は、ＡＡＶゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの数を低下させることによって阻害することができる［Ｆａｕｓｔ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＣｐＧ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｖａｄｅ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１３．１２３（７）：ｐ．２９９４－３００１］。ＣｐＧモチーフの導入遺伝子配列を枯渇させることは、導入遺伝子の非自己としての認識での先天性免疫の活性化におけるＴＬＲ９の役割を低下させ、したがって、安定した長期の導入遺伝子発現を提供し得る。［Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｐ．Ｗ．Ｌ．Ｔａｉ，ａｎｄ Ｇ．Ｇａｏ，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，２０１９．１８（５）：ｐ．３５８－３７８、及びＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．，Ｙ．Ｋ．Ｃｈａｎ，ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｖｅｒｓｕｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１９．１１（２）も参照されたい］。実施形態において、マイクロジストロフィンカセットは、ＣｐＧ枯渇とともにヒトコドン最適化される。コドン最適化及びＣｐＧ枯渇したヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ）を利用するＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓツールを含む、当該技術分野で既知の任意の方法によって設計され得る。本明細書に記載の配列番号２０、２１、５７～７２、８０、８１、及び１０１～１０３のヌクレオチド配列は、コドン最適化及びＣｐＧ枯渇した配列を表す。
低下した数のＣｐＧジヌクレオチド配列を有し、結果として、低下した数のＣｐＧアイランドを有するマイクロジストロフィン導入遺伝子が提供される。特定の実施形態において、マイクロジストロフィンヌクレオチド配列は、二（２）個未満のＣｐＧアイランド、または一（１）個のＣｐＧアイランド、もしくはゼロ（０）個のＣｐＧアイランドを有する。実施形態において、２個を超えるＣｐＧアイランドを有するマイクロジストロフィン導入遺伝子と比較して、抗薬物抗体力価によって測定したとき、低減した免疫原性を有する、２個未満、または１個のＣｐＧアイランド、または０個のＣｐＧアイランドを有するマイクロジストロフィン導入遺伝子が提供される。特定の実施形態において、配列番号２０、２１、または８１から本質的になるマイクロジストロフィンヌクレオチド配列は、ゼロ（０）個のＣｐＧアイランドを有する。他の実施形態において、マイクロジストロフィンコード配列が配列番号２０、２１、または８１からなり、プロモーターに操作可能に連結されたマイクロジストロフィン遺伝子から本質的になるマイクロジストロフィン導入遺伝子ヌクレオチド配列は、二（２）個未満のＣｐＧアイランドを有する。さらに他の実施形態において、マイクロジストロフィンコード配列が配列番号２０、２１、または８１からなり、プロモーターに操作可能に連結されたマイクロジストロフィン遺伝子から本質的になるマイクロジストロフィン導入遺伝子ヌクレオチド配列は、一（１）個のＣｐＧアイランドを有する。
５．３．遺伝子カセット及び調節エレメント
本発明の別の態様は、マイクロジストロフィンの発現を付与または増強するように設計された調節エレメントを含む核酸発現カセットに関する。本発明は、導入遺伝子の発現を増強または促進するために、プロモーターエレメントを含む調節エレメント、ならびに任意選択的にエンハンサーエレメント及び／またはイントロンを操作することをさらに伴う。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはまた、対象の標的細胞内で核酸（導入遺伝子）によってコードされたＲＮＡ及び／またはタンパク質産物の発現に影響を及ぼすことが当業者に知られているかかる調節制御エレメントを含む。調節制御エレメントは、組織特異的、すなわち、標的細胞／組織においてのみ活性（または実質的により活性またはより際立って活性）であり得る。
５．３．１ プロモーター
５．３．１．１ 組織特異的プロモーター
特定の実施形態において、ＡＡＶベクターの発現カセットは、標的組織における発現を可能にする、導入遺伝子に操作可能に連結された、プロモーターなどの調節配列を含む。プロモーターは、筋肉プロモーターであり得る。特定の実施形態において、プロモーターは、筋肉特異的プロモーターである。「筋肉特異的」、「筋肉選択的」、または「筋肉指向性」という語句は、かかるエレメントと筋肉細胞の細胞内環境との相互作用に起因して、筋肉細胞または組織におけるそれらの活性を適応させている核酸エレメントを指す。かかる筋肉細胞には、筋細胞、筋管、心筋細胞などが含まれ得る。心筋細胞、骨格筋細胞、及び平滑筋細胞などの異なる特性を有する特殊な形態の筋細胞が含まれる。様々な治療学は、導入遺伝子の筋肉特異的発現から利益を得ることができる。具体的には、送達される様々な形態の筋ジストロフィーを治療し、筋肉細胞における高い形質導入効率を可能にする遺伝子療法は、導入遺伝子が最も必要とされる細胞における導入遺伝子の発現を誘導する追加の利点を有する。心臓組織も、導入遺伝子の筋肉指向性発現の恩恵を受けるであろう。筋肉特異的プロモーターは、本発明の導入遺伝子に操作可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、筋肉特異的プロモーターは、ＳＰｃ５－１２プロモーター（配列番号３９）、筋クレアチンキナーゼミオシン軽鎖（ＭＬＣ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、デスミンプロモーター（配列番号１１９）、ＭＨＣＫ７プロモーター（配列番号１２０）、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ８プロモーター（配列番号１１５）、ＭＣＫプロモーター（またはその切断形態）（配列番号１２１）、アルファアクチンプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ガンマアクチンプロモーター、Ｅ－ｓｙｎプロモーター、心臓トロポニンＣプロモーター、トロポニンＩプロモーター、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリープロモーター、またはＰｉｔｘ３の眼形態のイントロン１内に存在する筋肉選択的プロモーターから選択される。
ＳＰｃ５－１２プロモーターとして知られる、合成プロモーターｃ５－１２（Ｌｉ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．２４１－２４５，ＭＡＲＣＨ １９９９）は、細胞型の制限された発現、具体的に筋肉細胞特異的な発現を有することが示されている。長さが３５０ｂｐ未満で、ＳＰｃ５－１２プロモーターは、ほとんどの内因性プロモーターよりも長さが短く、これは、治療用タンパク質をコードする核酸の長さが比較的長い場合に有利であり得る。
ベクターの長さをさらに短縮するために、調節エレメントは、本明細書に記載されるプロモーターのうちのいずれか１つの縮小型または短縮型（本明細書では「最小プロモーター」と称される）であることができる。最小プロモーターは、少なくとも全長型の転写活性ドメインを含み、したがって依然として発現を駆動することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、治療用タンパク質導入遺伝子に操作可能に連結した、筋肉特異的プロモーター、例えば、最小ＳＰｃ５－１２プロモーター（例えば、配列番号４０）の転写活性ドメインを含むことができる。実施形態において、治療用タンパク質は、本明細書に記載のマイクロジストロフィンである。本開示の最小プロモーターは、組織特異的手段で発現を調節することに寄与するプロモーター配列の部分を含み得るか、または含み得ない。
したがって、実施形態において、ＳＰｃ５－１２プロモーター（配列番号３９）またはＳＰｃ５－１２プロモーターバリアント、変異体、あるいはそれらの断片を有する遺伝子療法カセットが提供される。例えば、ＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ５（図２）は、Ｓｐｃ５－１２プロモーターを有する。これらのプロモーターの配列が表６に提供される。
いくつかの態様において、変更または変異される改変ＳＰｃ５－１２プロモーターが提供される。変異体ＳＰｃ５－１２プロモーターは、配列番号９３または配列番号９４の核酸配列を含むことができる。これらの固有のＳＰｃ５－１２プロモーター配列は、筋肉特異的発現を促進し、完全なゲノムで産生されるカプシドの収率を増加させることができる。したがって、実施形態において、変異体ＳＰｃ５－１２プロモーター（配列番号９３または９４）を含む遺伝子療法ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号９３のバリアントが提供される。いくつかの態様において、開示される核酸は、筋肉特異的プロモーター活性、配列番号９３と少なくとも８０％の配列同一性、ならびに特定の実施形態において、配列番号９３のヌクレオチド１２１～１２９及び１９７～２０９にわたって１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの態様において、開示される核酸は、筋肉特異的プロモーター活性、配列番号９３と少なくとも８５、９０、９５、または１００％の配列同一性、ならびにいくつかの実施形態において、配列番号９３のヌクレオチド１２１～１２９及び１９７～２０９にわたって１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。配列番号９３のバリアントは、配列番号９３だが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０個の核酸置換を有する配列であることができる。いくつかの態様において、バリアントのうちのいずれかは、配列番号９３のヌクレオチド１２１～１２９及び１９７～２０９にわたって１００％の配列同一性を保持し、筋肉特異的プロモーター活性を保持する。いくつかの態様において、配列番号９４のバリアントが提供される。いくつかの態様において、開示される核酸は、筋肉特異的プロモーター活性、配列番号９４と少なくとも８０％の配列同一性、ならびにいくつかの実施形態において、配列番号９４のヌクレオチド１１３～１３１及び１９１～２１２にわたって１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの態様において、開示される核酸は、筋肉特異的プロモーター活性、配列番号９４と少なくとも８５、９０、９５、または１００％の配列同一性、ならびにいくつかの実施形態において、配列番号９４のヌクレオチド１１３～１３１及び１９１～２１２にわたって１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。配列番号９４のバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０個の核酸置換を有する配列番号９４の配列であることができる。いくつかの態様において、バリアントのうちのいずれかは、配列番号９４のヌクレオチド１１３～１３１及び１９１～２１２にわたって１００％の配列同一性を保持し、筋肉特異的プロモーター活性を保持する。
代替的に、プロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ＣＢ７プロモーターであり得る。追加のプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター（配列番号５４）、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（配列番号５２）、ＲＰＥ６５プロモーター、オプシンプロモーター、ＴＢＧ（サイロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、またはＭＩＲ１２２プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態において、特に、導入遺伝子発現をオフにすることが望ましい場合には、誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性またはラパマイシン誘導性プロモーターが使用される。
Figure 2024517143000024
Figure 2024517143000025
Figure 2024517143000026
Figure 2024517143000027
Figure 2024517143000028
特定の実施形態において、プロモーターは、ＣＮＳ特異的プロモーターである。例えば、発現カセットは、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の遺伝子から単離されたプロモーター、ドーパミン－１受容体またはドーパミン－２受容体のプロモーターなどの任意のニューロンプロモーター、シナプシンプロモーター、ＣＢ７プロモーター（ニワトリβ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー）、ＲＳＶプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター（グリア原線維性酸性タンパク質）、ＭＢＰプロモーター（ミエリン塩基性タンパク質）、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ－１α、Ｕ８６プロモーター、ＲＰＥ６５プロモーターまたはオプシンプロモーター、誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、ならびにラパマイシン及び関連する薬剤によって誘導されるプロモーターなどの薬物誘導性プロモーターから選択されるプロモーターを含むことができる。
さらに他の実施形態において、発現カセットは、マイクロジストロフィン導入遺伝子を含む発現カセット内にタンデムで配置され得る複数のプロモーターを含むことができる。したがって、タンデムまたはハイブリッドプロモーターは、発現を増強する、及び／または発現を複数の組織タイプに指向させるために用いられ得（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年８月１５日に公開されたＰＣＴ国際公開第２０１９１５４９３９Ａ１号を参照されたい）、特に、２０２０年７月２４日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４３５７８号に開示されるＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、またはＬＭＴＰ２０である。
５．３．２ イントロン
特定の遺伝子発現カセットは、適切なスプライシング、したがって、マイクロジストロフィン発現を増強し得る、マイクロジストロフィンコード配列のイントロン、例えば、５’をさらに含む。したがって、いくつかの実施形態において、イントロンは、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする配列の５’末端に結合される。特に、イントロンヌクレオチド配列は、アクチン結合ドメインに結合したヌクレオチド配列に連結することができる。他の実施形態において、イントロンは、長さが１００ヌクレオチド未満である。
実施形態において、イントロンは、ＶＨ４イントロンである。ＶＨ４イントロン核酸は、以下の表７に示される配列番号４１を含むことができる。
Figure 2024517143000029
他の実施形態において、イントロンは、ヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン（β－グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン、またはβ－グロビン／ＩｇＧキメライントロンとしても知られている）である（表７、配列番号７５）。当業者に周知の他のイントロン、例えば、ニワトリβ－アクチンイントロン、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、ヒト第ＩＸ因子イントロン（例えば、ＦＩＸ切断イントロン１）、β－グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン、アデノウイルススプライスドナー／免疫グロブリンスプライスアクセプターイントロン、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）イントロン（表７、配列番号７６）が用いられ得る。
５．３．３ 他の調節エレメント
５．３．３．１ ポリＡ
本開示の別の態様は、マイクロジストロフィン導入遺伝子のコード領域の下流にポリアデニル化（ポリＡ）部位を含む発現カセットに関する。転写の終結をシグナル伝達し、ポリＡ尾部の合成を指向する任意のポリＡ部位は、本開示のＡＡＶベクターでの使用に好適である。例示的なポリＡシグナルは、以下に由来するが、これらに限定されない：ＳＶ４０後期遺伝子、ウサギβ－グロビン遺伝子、ウシ成長ホルモン（ＢＰＨ）遺伝子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子、及び合成ポリＡ（ＳＰＡ）部位。一実施形態において、ポリＡシグナルは、表８に示される配列番号４２を含む。
Figure 2024517143000030
５．３．４ ウイルスベクター
本開示によるマイクロジストロフィン導入遺伝子は、ヒト対象への遺伝子療法投与のためのＡＡＶベクターに含むことができる。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶウイルスカプシドと、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接する発現カセットを含むウイルスまたは人工ゲノムとを含むことができ、発現カセットは、マイクロジストロフィンを発現及び送達するために、ヒト筋肉またはＣＮＳ細胞における導入遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列に操作可能に連結されたマイクロジストロフィン導入遺伝子を含む。提供される方法は、本明細書に記載のマイクロジストロフィンの送達のための任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の産生、マイクロジストロフィンをコードする任意の単離された組換えＡＡＶ粒子を含む組成物の産生、または本明細書に記載のマイクロジストロフィンをコードする任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の投与を含む、マイクロジストロフィンによる治療に適している疾患または障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法における使用に好適である。したがって、ｒＡＡＶは、当該技術分野で既知である、任意の血清型、そのバリアント、改変、ハイブリッド、もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせ（「血清型」と総称される）であることができる。特定の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、筋肉組織に対する向性を有する。そして、他の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、肝臓に対する向性を有し、この場合、ＡＡＶで形質導入された肝臓細胞は、マイクロジストロフィン分泌性細胞のデポを形成し、マイクロジストロフィンを循環に分泌する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型からのカプシドタンパク質を有する。本明細書において、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ粒子中のＲＧＸ－ＤＹＳ１構築物（配列番号５３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶゲノム）及びＡＡＶ９カプシドを有するｒＡＡＶ粒子中のＲＧＸ－ＤＹＳ１構築物（組換えＡＡＶゲノム）が提供される。また、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ粒子中のＲＧＸ－ＤＹＳ５構築物（配列番号８２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶゲノム）及びＡＡＶ９カプシドを有するｒＡＡＶ粒子中のＲＧＸ－ＤＹＳ５構築物（組換えＡＡＶゲノム）が提供される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、及びＡＡＶ．ｈｕ３７などのＡＡＶ８またはＡＡＶ９と高い配列相同性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１のＡＡＶカプシド血清型またはその誘導体、改変、もしくはシュードタイプを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４のＡＡＶカプシド血清型またはその誘導体、改変、もしくはシュードタイプを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５のＡＡＶカプシド血清型またはその誘導体、改変、もしくはシュードタイプを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型またはその誘導体、改変、もしくはシュードタイプを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型またはその誘導体、改変、もしくはシュードタイプを有する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の誘導体、改変、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列（ＶＰ３のアミノ酸配列は、配列番号７７である）と少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一であるＡＡＶ８カプシドタンパク質を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質（アミノ酸配列配列番号７８）の誘導体、改変、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列と少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一であるＡＡＶ８カプシドタンパク質を有するカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列と少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、及びＡＡＶ．ｈｕ３７などのＡＡＶ８またはＡＡＶ９と高い配列相同性を有するＡＡＶカプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列と少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
代替的に、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のカプシドタンパク質、またはその誘導体、改変、もしくはシュードタイプを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ｒＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列と少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のカプシドタンパク質、またはその誘導体、改変、もしくはシュードタイプを含む。
例えば、ｒＡＡＶ粒子の集団は、２つ以上の血清型を含むことができ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子のうちの２つ以上、あるいはそれらの２つ以上の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８（その全体が参照により組み込まれる）に記載されるように、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５のカプシドを含む。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、同第９４５８５１７号、及び同第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている、以下のアミノ酸挿入：ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号８７）またはＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号８８）のうちの１つを有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、同第９，４５８，５１７号、及び同第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているＡＡＶ．７ｍ８のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，５８５，９７１号に開示されている任意のＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている任意のＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４－１）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１４／１７２６６９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている任意のＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶｒｈ．７４）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２５：４５０（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、ＡＡＶ２／５のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１７／０７０４９１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている任意のＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ２ｔＹＦ）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２９（９）：４１８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、ＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第８，６２８，９６６号、同第８，９２７，５１４号、同第９，９２３，１２０号及びＷＯ２０１６／０４９２３０（その各々は、参照によりその全体が組み込まれる）に開示されている任意のＡＡＶカプシド（例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６）を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）のうちのいずれかに開示されているＡＡＶを含む。米国特許第７，２８２，１９９号、同第７，９０６，１１１号、同第８，５２４，４４６号、同第８，９９９，６７８号、同第８，６２８，９６６号、同第８，９２７，５１４号、同第８，７３４，８０９号、同第９，２８４，３５７号、同第９，４０９，９５３号、同第９，１６９，２９９号、同第９，１９３，９５６号、同第９４５８５１７号、及び同第９，５８７，２８２号；米国特許出願第２０１５／０３７４８０３号、同第２０１５／０１２６５８８号、同第２０１７／００６７９０８号、同第２０１３／０２２４８３６号、同第２０１６／０２１５０２４号、同第２０１７／００５１２５７号；ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）のうちのいずれかに開示されるＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列と少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大で１００％同一のカプシドタンパク質を有する：米国特許第７，２８２，１９９号、同第７，９０６，１１１号、同第８，５２４，４４６号、同第８，９９９，６７８号、同第８，６２８，９６６号、同第８，９２７，５１４号、同第８，７３４，８０９号、同第９，２８４，３５７号、同第９，４０９，９５３号、同第９，１６９，２９９号、同第９，１９３，９５６号、同第９４５８５１７号、及び同第９，５８７，２８２号；米国特許出願第２０１５／０３７４８０３号、同第２０１５／０１２６５８８号、同第２０１７／００６７９０８号、同第２０１３／０２２４８３６号、同第２０１６／０２１５０２４号、同第２０１７／００５１２５７号；ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際出願公開第２００３／０５２０５１号（例えば、’０５１の配列番号２を参照されたい）、同第２００５／０３３３２１号（例えば、’３２１の配列番号１２３及び８８を参照されたい）、同第０３／０４２３９７号（例えば、’３９７の配列番号２、８１、８５、及び９７を参照されたい）、同第２００６／０６８８８８号（例えば、’８８８の配列番号１及び３～６を参照されたい）、同第２００６／１１０６８９号（例えば、’６８９の配列番号５～３８を参照されたい）、同第２００９／１０４９６４号（例えば、’９６４の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１を参照されたい）、同第２０１０／１２７０９７号（例えば、’０９７の配列番号５～３８を参照されたい）、ならびに同第２０１５／１９１５０８号（例えば、’５０８の配列番号８０～２９４を参照されたい）、ならびに米国出願公開第２０１５／００２３９２４号（例えば、’９２４の配列番号１、５～１０を参照されたい）（それらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際出願公開第２００３／０５２０５１号（例えば、’０５１の配列番号２を参照されたい）、同第２００５／０３３３２１号（例えば、’３２１の配列番号１２３及び８８を参照されたい）、同第０３／０４２３９７号（例えば、’３９７の配列番号２、８１、８５及び９７を参照されたい）、同第２００６／０６８８８８号（例えば、’８８８の配列番号１及び３～６を参照されたい）、同第２００６／１１０６８９号（例えば、’６８９の配列番号５～３８を参照されたい）、同第２００９／１０４９６４号（例えば、９６４の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１を参照されたい）、同第２０１０／１２７０９７号（例えば、’０９７の配列番号５～３８を参照されたい）、ならびに同第２０１５／１９１５０８号（例えば、’５０８の配列番号８０～２９４を参照されたい）、ならびに米国出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、’９２４の配列番号１、５～１０を参照されたい）に開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列と少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大で１００％同一のカプシドタンパク質を有する。
ＡＡＶ系ウイルスベクターの核酸配列、ならびに組換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドを作製する方法は、例えば、米国特許第７，２８２，１９９号、同第７，９０６，１１１号、同第８，５２４，４４６号、同第８，９９９，６７８号、同第８，６２８，９６６号、同第８，９２７，５１４号、同第８，７３４，８０９号、同第９，２８４，３５７、同第９，４０９，９５３号、同第９，１６９，２９９号、同第９，１９３，９５６号、同第９４５８５１７号、及び同第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、同第２０１５／０１２６５８８号、同第２０１７／００６７９０８号、同第２０１３／０２２４８３６号、同第２０１６／０２１５０２４号、同第２０１７／００５１２５７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号、同第２００３／０５２０５１号、同第２００５／０３３３２１号、同第０３／０４２３９７号、同第２００６／０６８８８８号、同第２００６／１１０６８９号、同第２００９／１０４９６４号、同第２０１０／１２７０９７号、及び同第２０１５／１９１５０８号、及び米国特許出願公開第２０１５／００２３９２４号に教示されている。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプＡＡＶカプシドである。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を産生し、使用するための方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ２８：１５８－１６７（２００２）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照されたい）。
特定の実施形態において、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）を使用することができる。特定の実施形態において、自己相補性ベクター、例えば、ｓｃＡＡＶを使用することができる（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ８，Ｎｕｍｂｅｒ１６，Ｐａｇｅｓ１２４８－１２５４、ならびに米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。モザイクＡＡＶ粒子は、ＡＡＶの異なる血清型からのウイルスカプシドタンパク質の混合物から構成される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸ベクター、及び（ｂ）ＡＡＶｘ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６）に由来するカプシドタンパク質から構成されるカプシドを含む。いくつかの追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ならびにＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質から構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質から構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子は、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ粒子である。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を産生し、使用するための方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ２８：１５８－１６７（２００２）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照されたい）。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質キメラを含むカプシドを含む。さらなる実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ｒＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ならびにＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。さらなる実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ならびにＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ならびにＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ、Ｂ、Ｅ、またはＦ ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＥ ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
以下の表９は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、及びＡＡＶ．ｈｕ３７カプシドタンパク質のアミノ酸配列、ならびにＡＡＶ２ ５’－及び３’ＩＴＲの核酸配列の例を提供する。
Figure 2024517143000031
Figure 2024517143000032
Figure 2024517143000033
Figure 2024517143000034
Figure 2024517143000035
Figure 2024517143000036
提供される方法は、導入遺伝子をコードする組換えＡＡＶの産生における使用のために好適である。特定の実施形態において、導入遺伝子は、本明細書に記載のマイクロジストロフィンである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノム（またはシスプラスミド）は、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆位末端反復、（２）ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択的にイントロンなどの、調節制御エレメント、ならびに（３）記載の導入遺伝子をコードする核酸配列、を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の構築物（シスプラスミドまたは組換えＡＡＶゲノム配列）は、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２またはＡＡＶ８逆位末端反復（ＩＴＲ）、（２）筋肉特異的ＳＰｃ５－１２プロモーター及び小ポリＡシグナルを含む、制御エレメント、ならびに（３）ＲＧＸ－ＤＹＳ１導入遺伝子（配列番号２０）またはＲＧＸ－ＤＹＳ５導入遺伝子（配列番号８１）のマイクロジストロフィンコード配列を含む、本明細書に記載のマイクロジストロフィンをコードする核酸を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の構築物（シスプラスミドまたは組換えＡＡＶゲノム）は、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２またはＡＡＶ８ ＩＴＲ、（２）ａ）筋肉特異的ＳＰｃ５－１２プロモーター、ｂ）小ポリＡシグナルを含む、制御エレメント、及び（３）Ｎ末端からＣ末端に、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含み、式中、ＣＴが、配列番号１６または８３のアミノ酸配列を有するＣＴを含む、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含む、マイクロジストロフィンカセット、を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の構築物は、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２またはＡＡＶ８ ＩＴＲ、（２）ａ）筋肉特異的ＳＰｃ５－１２プロモーター、ｂ）イントロン（例えば、ＶＨ４）、及びｃ）小ポリＡシグナルを含む、制御エレメント、ならびに（３）Ｎ末端からＣ末端に、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含み、式中、ＣＴが配列番号１６または８３のアミノ酸配列を有するＣＴを含む、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、ＡＢＤ１がＶＨ４に直接結合している、マイクロジストロフィンカセット、を含む。
特定の実施形態において、本明細書に記載の構築物は、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２ ＩＴＲ、（２）ａ）筋肉特異的ＳＰｃ５－１２プロモーター、及びｂ）小ポリＡシグナルを含む、制御エレメント、ならびに（３）配列番号２０のヌクレオチド配列によってコードされることを含む、配列番号１のアミノ酸配列を有するＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンをコードする核酸、を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の構築物は、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２ ＩＴＲ、（２）ａ）筋肉特異的ＳＰｃ５－１２プロモーター、及びｂ）小ポリＡシグナルを含む、制御エレメント、ならびに（３）配列番号８１のヌクレオチド配列によってコードされることを含む、配列番号７９のアミノ酸配列を有するＲＸＧ－ＤＹＳ５マイクロジストロフィンをコードする核酸、を含む。いくつかの実施形態において、Ｎ末端からＣ末端にＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含み、式中、ＣＴが、配列番号１６または８３のアミノ酸配列を有するＣＴを含む、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含む、マイクロジストロフィン発現カセットに隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む、本明細書に記載の構築物は、長さが４０００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチドであることができる。いくつかの実施形態において、かかる構築物（ＩＴＲ配列を含む組換えＡＡＶゲノム）は、長さが４９００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、４７００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４５００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、または４３００ヌクレオチド未満である。
本開示のいくつかの核酸実施形態は、以下の表１０に提供される配列番号５３、５５、または８２のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなるマイクロジストロフィンをコードするｒＡＡＶベクター（シスプラスミドまたは組換えＡＡＶゲノム）を含む。様々な実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、配列番号５３、５５、または８２のヌクレオチド配列またはその逆相補体と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、筋肉細胞における治療上有効なマイクロジストロフィンの発現に好適なｒＡＡＶベクターをコードする。実施形態において、配列番号５３、５５または８２のヌクレオチド配列を有する構築物は、組換えｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子中にある。実施形態において、組換えＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１である。
Figure 2024517143000037
Figure 2024517143000038
Figure 2024517143000039
Figure 2024517143000040
Figure 2024517143000041
Figure 2024517143000042
Figure 2024517143000043
Figure 2024517143000044
Figure 2024517143000045
Figure 2024517143000046
Figure 2024517143000047
Figure 2024517143000048
Figure 2024517143000049
Figure 2024517143000050
Figure 2024517143000051
５．３．５ ｒＡＡＶ粒子を作製する方法
本発明の別の態様は、本明細書に開示される分子を作製することを含む。いくつかの実施形態において、本発明に従う分子は、本明細書におけるカプシドタンパク質分子のうちのいずれかをコードする核酸配列を含むヌクレオチドを提供することと、カプシドタンパク質から構成されるカプシド被覆を有する対応するｒＡＡＶ粒子を調製するためのパッケージング細胞システムを使用することと、によって作製される。かかるカプシドタンパク質は、上記のセクション５．３．４に記載されている。いくつかの実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載のカプシドタンパク質分子の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する配列をコードし、カプシドタンパク質及び異種タンパク質またはそのドメインから挿入されたペプチドの生物学的機能を保持（または実質的に保持）する。いくつかの実施形態において、核酸は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質及び挿入されたペプチドの生物学的機能を保持（または実質的に保持）しながら、ＡＡＶ８カプシドタンパク質の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する配列をコードする。
カプシドタンパク質、被覆、及びｒＡＡＶ粒子は、当該技術分野で知られている技術によって生成され得る。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムは、ベクターへのパッケージングを許容するための少なくとも１つの逆位末端反復を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムは、ｃａｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子の発現及びスプライシングのためのｒｅｐ遺伝子をさらに含む。実施形態において、ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、パッケージング細胞によって提供され、ウイルスゲノムには存在しない。
いくつかの実施形態において、操作されたカプシドタンパク質をコードする核酸は、既存のカプシド遺伝子の代わりにＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドにクローニングされる。宿主細胞に一緒に導入される場合、このプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを、カプシド被覆としての修飾されたカプシドタンパク質にパッケージングすることを補助する。パッケージング細胞は、ＡＡＶゲノム複製、カプシド組み立て、及びパッケージングを促進するのに必要な遺伝子を保有する任意の細胞タイプであり得る。
多数の細胞培養ベースのシステムが、ｒＡＡＶ粒子の産生のための当該技術分野で知られており、そのうちのいずれかを使用して、本明細書に開示される方法を行うことができる。細胞培養ベースのシステムには、トランスフェクション、安定した細胞株産生、及びアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド、及びバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含むがこれらに限定されない、感染性ハイブリッドウイルス産生システムが含まれる。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のためのｒＡＡＶ産生培養は、（１）例えば、ヒト由来細胞株、哺乳動物細胞株、または昆虫由来細胞株を含む、好適な宿主細胞、（２）野生型または変異体アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスなど）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される、好適なヘルパーウイルス機能、（３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子及び遺伝子産物、（４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列及び任意選択的に調節エレメントに隣接する導入遺伝子（治療用導入遺伝子など）、ならびに（５）細胞増殖／生存及びｒＡＡＶ産生を支持する好適な培地及び培地成分（栄養素）を必要とする。
宿主細胞の非限定的な例には、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、及びそれらの誘導細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、初代線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、ＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ由来細胞、またはＳＦ－９などの昆虫由来細胞株（例えば、バキュロウイルス産生システムの場合）が含まれる。レビューについては、Ａｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０２：１０４５－１０５４（製造技術について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
一態様において、本明細書において、（ａ）昆虫細胞を含む細胞培養を提供することと、（ｂ）ｉ．パッケージングされるｒＡＡＶゲノム、ｉｉ．パッケージングのために十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及びｉｉｉ．パッケージングのために十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のバキュロウイルスベクターを細胞に導入することと、（ｃ）細胞培養に十分な栄養素を添加し、細胞培養を、ｒＡＡＶ粒子の産生を可能にする条件下で維持することと、を含む、ｒＡＡＶ粒子を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第１のバキュロウイルスベクターと、ｒＡＡＶゲノムをコードする第２のバキュロウイルスベクターと、を使用することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｒＡＡＶゲノムをコードするバキュロウイルスと、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現する昆虫細胞と、を使用することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするバキュロウイルスベクターと、ｒＡＡＶゲノムとを使用することを含む。いくつかの実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ－９細胞である。いくつかの実施形態において、昆虫細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする１つ以上の安定的に組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含むＳｆ－９細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、バキュロウイルス産生システムを使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス産生システムは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第１のバキュロウイルスと、ｒＡＡＶゲノムをコードする第２のバキュロウイルスと、を使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス産生システムは、ｒＡＡＶゲノムをコードするバキュロウイルスと、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現する宿主細胞と、を使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス産生システムは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子と、ｒＡＡＶゲノムとをコードするバキュロウイルスを使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス産生システムは、Ｓｆ－９細胞などの昆虫細胞を使用する。
当業者は、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）、及びｒＡＡＶゲノム（逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接する１つ以上の目的の遺伝子を含む）を細胞に導入して、ｒＡＡＶを産生またはパッケージングすることができる多数の方法を認識している。「アデノウイルスヘルパー機能」という語句は、ＡＡＶが細胞において効率的に増殖するように、細胞内で発現された（ＲＮＡまたはタンパク質として）多数のウイルスヘルパー遺伝子を指す。当業者は、アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含むヘルパーウイルスが、ＡＡＶ複製を促進し、本質的な機能を提供する特定の遺伝子が特定されている、例えば、ヘルパーが、かかるＡＡＶ遺伝子発現及び複製を促進する細胞環境への変化を誘導し得ることを理解する。本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムをコードする１つ以上のプラスミドベクターのトランスフェクションによって細胞に導入される。本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムをコードするウイルスベクター、例えば、ｒＨＳＶベクターを用いた形質導入によって細胞に導入することができる。本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムのうちの１つ以上は、ｒＨＳＶベクターを用いた形質導入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー遺伝子及びｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー遺伝子ならびにＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。
一態様において、本明細書において、（ａ）宿主細胞を含む細胞培養を提供することと、（ｂ）ｉ．パッケージングされるｒＡＡＶゲノム、ｉｉ．ｒＡＡＶ粒子をパッケージングするのに必要なヘルパー機能、ｉｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及びｉｖ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のｒＨＳＶベクターを細胞に導入することと、（ｃ）細胞培養に十分な栄養素を添加し、細胞培養を、ｒＡＡＶ粒子の産生を可能にする条件下で維持することと、を含む、ｒＡＡＶ粒子を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能をコードする１つ以上の内因性遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能をコードする１つ以上の異種遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能及びｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能、ならびにＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする１つ以上の安定的に組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含む。
一態様において、本明細書において、（ａ）哺乳動物細胞を含む細胞培養を提供することと、（ｂ）ｉ．パッケージングされるｒＡＡＶゲノム（例えば、配列番号５３のヌクレオチド配列を有する組換えＡＡＶゲノムを含む）、ｉｉ．ｒＡＡＶ粒子をパッケージングするのに必要なヘルパー機能、ｉｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及びｉｖ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを細胞に導入することと、（ｃ）細胞培養に十分な栄養素を添加し、細胞培養を、ｒＡＡＶ粒子の産生を可能にする条件下で維持することと、を含む、ｒＡＡＶ粒子を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ヘルパー機能は、アデノウイルス遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする１つ以上の安定的に組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含む。
ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、及び／またはｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミドまたはウイルスベクターを開発する分子生物学技術は、当該技術分野において一般的に知られている。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによるトランスフェクションによって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによるトランスフェクションによって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのプラスミドベクターによるトランスフェクションによって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによるトランスフェクションによって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのウイルスベクターによるトランスフェクションによって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによるトランスフェクションによって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、パッケージングに必要なアデノウイルスヘルパー機能、及びパッケージングされるｒＡＡＶゲノムは、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、ベクターを用いたトランスフェクションによって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、細胞を、３つのポリヌクレオチド：ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードするものと、パッケージングに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードするものと、パッケージングされるｒＡＡＶゲノムをコードするものとの混合物でトランスフェクションすることを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８ ｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７などのＡＡＶ８またはＡＡＶ９と高い配列相同性を有するカプシドタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、パッケージングされるｒＡＡＶゲノムをコードするベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９，ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のＡＡＶ血清型からである。
ベクターの任意の組み合わせを使用して、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子、及びｒＡＡＶゲノムを、ｒＡＡＶ粒子が産生またはパッケージングされる細胞に導入することができる。本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接する目的の遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムをコードする第１のプラスミドベクターと、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第２のベクターと、ヘルパー遺伝子をコードする第３のベクターと、を使用することができる。いくつかの実施形態において、３つのベクターの混合物が、細胞に共トランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、トランスフェクションと感染との組み合わせは、プラスミドベクターならびにウイルスベクターの両方を使用することによって使用される。
いくつかの実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにＡＡＶヘルパー遺伝子のうちの１つ以上は、細胞によって構成的に発現され、細胞にトランスフェクトまたは形質導入する必要はない。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のＡＡＶヘルパー遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｅ１ａを構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒＡＡＶゲノムをコードする安定した導入遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ｃａｐ、及びヘルパー遺伝子（例えば、Ｅｌａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、またはＶＡ遺伝子）は、任意のＡＡＶ血清型のものであることができる。同様に、ＡＡＶ ＩＴＲは、任意のＡＡＶ血清型のものであることができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型からの配列を有するハイブリッド血清型）からである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子からである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、もしくはＡＡＶ．ｈｕ３７、または他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型からの配列を有するハイブリッド血清型）からである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の産生のためのＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、異なる血清型からである。例えば、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２からであり、一方、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８からである。別の例では、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２からであり、一方、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９からである。
いくつかの実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型からの配列を有するハイブリッド血清型）からである。他の実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、同じ血清型からである。さらに他の実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、同じ血清型からであり、ｒｅｐ遺伝子は、少なくとも１つの改変タンパク質ドメインまたは改変プロモータードメインを含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの改変ドメインは、カプシド血清型とは異なる血清型のヌクレオチド配列を含む。ｒｅｐ遺伝子内の改変ドメインは、異なる血清型の断片からなるハイブリッドヌクレオチド配列であり得る。
ハイブリッドｒｅｐ遺伝子は、４ｋｂ超、４．１ｋｂ超、４．２ｋＢ超、４．３ｋｂ超、４．４ｋＢ超、４．５ｋｂ超、または４．６ｋｂ超のマイクロジストロフィン導入遺伝子を含むウイルスゲノムのパッケージングを含む、ｒＡＡＶ粒子の改善されたパッケージング効率を提供する。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの複製及び産生に必要な非構造タンパク質をコードする核酸配列からなる。ｒｅｐ遺伝子の転写は、ｐ５またはｐ１９プロモーターから開始して、それぞれ、２つの大きい（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８）及び２つの小さい（Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）非構造Ｒｅｐタンパク質を産生する。加えて、Ｒｅｐ７８／６８ドメインは、ＩＴＲ内の特定のＩＴＲ配列を認識するＤＮＡ結合ドメインを含む。４つのＲｅｐタンパク質は全て、ゲノム複製及び／またはカプシド形成で機能する共通のヘリカーゼ及びＡＴＰａｓｅドメインを有する（Ｍａｕｒｅｒ ＡＣ，２０２０，ＤＯＩ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０２０．０６９）。ｃａｐ遺伝子の転写は、配列がｒｅｐ遺伝子のＣ末端内にあるｐ４０プロモーターから開始し、ｒｅｐ遺伝子内の他のエレメントがｐ４０プロモーター活性を誘導し得ることが示唆されている。ｐ４０プロモータードメインは、転写因子結合エレメントであるＥＦ１Ａ、ＭＬＴＦ、及びＡＴＦ、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ結合エレメント（ＡＰ－１）、Ｓｐ１様エレメント（Ｓｐ１及びＧＧＴ）、ならびにＴＡＴＡエレメントを含む（Ｐｅｒｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ １９９７，７１（６）：４３００－４３０９）。いくつかの実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、改変ｐ４０プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ｐ４０プロモーターは、ＥＦ１Ａ結合エレメント、ＭＬＴＦ結合エレメント、ＡＴＦ結合エレメント、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ結合エレメント（ＡＰ－１）、Ｓｐ１様エレメント（Ｓｐ１またはＧＧＴ）、またはＴＡＴＡエレメントのうちのいずれか１つ以上で改変される。他の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、血清型１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、ｒｈ８、ｒｈ１０、ｒｈ２０、ｒｈ３９、ｒｈ．７４、ＲＨＭ４－１、またはｈｕ３７のものであり、ｐ４０プロモータードメインの部分またはエレメントは、血清型２に改変される。さらに他の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、血清型８または９のものであり、ｐ４０プロモータードメインの部分またはエレメントは、血清型２に改変される。
ＩＴＲは、Ａ及びＡ′相補配列、Ｂ及びＢ′相補配列、ならびにＣ及びＣ′相補配列を含み、Ｄ配列は、ｓｓＤＮＡゲノムと連続している。ＩＴＲの相補配列は、自己アニーリングによってヘアピン構造を形成する（Ｂｅｒｎｓ ＫＩ．Ｔｈｅ Ｕｎｕｓｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＶ Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ２０２０）。Ｄ配列は、Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）及び末端解離部位（ＴＲＳ）を含み、これらは一緒にＡＡＶ複製起源を構成する。ＩＴＲはまた、複製後のゲノムカプシド形成のためのパッケージングシグナルとして必要とされる。いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列及びｃａｐ遺伝子は、Ａ及びＡ′相補配列、Ｂ及びＢ′相補配列、Ｃ及びＣ′相補配列、またはＤ配列のうちの１つ以上が、カプシドとは異なる血清型からの配列を含むように改変され得ることを除いて、同じ血清型からである。いくつかの実施形態において、改変ＩＴＲ配列は、ｒｅｐ遺伝子と同じ血清型からである。他の実施形態において、ＩＴＲ配列及びｃａｐ遺伝子は、Ａ及びＡ’相補配列、Ｂ及びＢ’相補配列、Ｃ及びＣ’相補配列、またはＤ配列から選択されるＩＴＲ配列のうちの１つ以上が、カプシド（ｃａｐ遺伝子）と同じ血清型からであること、及びＩＴＲ配列のうちの１つ以上が、ｒｅｐ遺伝子と同じ血清型からであることを除いて、異なる血清型からである。
いくつかの実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、同じ血清型からであり、ｒｅｐ遺伝子は、改変Ｒｅｐ７８ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、ＡＴＰａｓｅドメイン、ヘリカーゼドメイン、ｐ５プロモータードメイン、Ｒｅｐ６８ドメイン、ｐ５プロモータードメイン、Ｒｅｐ５２ドメイン、ｐ１９プロモータードメイン、Ｒｅｐ４０ドメイン、またはｐ４０プロモータードメインを含む。他の実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、同じ血清型からであり、ｒｅｐ遺伝子は、異なる血清型からの少なくとも１つのタンパク質ドメインまたはプロモータードメインを含む。一実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子、ＡＡＶ８ ｃａｐ、及びハイブリッドＡＡＶ２／８ ｒｅｐを含む。別の実施形態において、ＡＡＶ２／８ ｒｅｐは、ｐ４０プロモータードメインまたはその一部分が血清型２ ｒｅｐからであることを除いて、血清型８ ｒｅｐを含む。他の実施形態において、ＡＡＶ２／８ ｒｅｐは、ｐ４０プロモータードメインまたはその一部分が血清型８ ｒｅｐからであることを除いて、血清型２ ｒｅｐを含む。いくつかの実施形態において、３つ以上の血清型を利用して、ハイブリッドｒｅｐ／ｃａｐプラスミドを構築し得る。
当該技術分野で既知の任意の好適な方法は、本明細書に開示される方法に従って、ｒＡＡＶ粒子の産生のために使用され得る細胞をトランスフェクトするために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、化学ベースのトランスフェクション方法を使用して細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態において、化学ベースのトランスフェクション方法は、リン酸カルシウム、高分岐化有機化合物（デンドリマー）、カチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、リポフェクションを使用する。いくつかの実施形態において、化学ベースのトランスフェクション方法は、カチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ））を使用する。いくつかの実施形態において、化学ベースのトランスフェクション方法は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用する。いくつかの実施形態において、化学ベースのトランスフェクション方法は、ＤＥＡＥデキストランを使用する。いくつかの実施形態において、化学ベースのトランスフェクション方法は、リン酸カルシウムを使用する。
標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、または当該技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実行され得る。前述の技術及び手順は、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、及び本明細書全体で引用及び論じられている様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載されているように、実行することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。具体的な定義が提供されない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、及び医薬的及び薬学的化学に関連して利用される命名法、ならびに実験室の手順及び技術は、当該技術分野でよく知られ、一般的に使用されるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、及び患者の送達、及び治療に使用できる。
ＡＡＶベースのウイルスベクターの核酸配列、及び組換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドを作製する方法は、例えば、ＵＳ７，２８２，１９９、ＵＳ７，７９０，４４９、ＵＳ８，３１８，４８０、ＵＳ８，９６２，３３２及びＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で教示されている。
配列番号５３または８２の構築物（ＲＧＸ－ＤＹＳ１またはＲＧＸ－ＤＹＳ５）を含む、本明細書に開示されるマイクロジストロフィンをコードする構築物（ゲノム）を含むｒＡＡＶ粒子の産生のための宿主細胞株が提供される。
好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、以下により詳細に考察されるように、治療及び予防適用において使用することができる導入遺伝子送達ベクターを提供する。
５．４．治療的有用性
治療有効性について、本明細書に開示されるマイクロジストロフィンをコードする、組換え遺伝子療法ベクター及び組換えＡＡＶゲノムを含む、構築物をアッセイする方法が提供される。方法には、本明細書に記載されるように、またはマイクロジストロフィンの活性及び有効性を試験するための当該技術分野で既知の任意の他の方法を使用する、インビトロ及び動物モデルにおけるインビボ試験の両方が含まれる。
５．４．１ インビトロアッセイ
５．４．１．１ 筋肉細胞のためのインビトロ感染システム
本明細書に開示される組換えベクター、例えばｒＡＡＶ粒子の感染性の試験方法が提供される。例えば、筋肉細胞における組換え遺伝子療法ベクターの感染性は、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞で試験することができる。いくつかの筋肉細胞株または心臓細胞株が利用され得、Ｔ００３４（ヒト）、Ｌ６（ラット）、ＭＭ１４（マウス）、Ｐ１９（マウス）、Ｇ－７（マウス）、Ｇ－８（マウス）、ＱＭ７（ウズラ）、Ｈ９ｃ２（２－１）（ラット）、Ｈｓ７４．Ｈｔ（ヒト）、及びＨｓ１７１．Ｈｔ（ヒト）細胞株が含まれるが、これらに限定されない。ベクターコピー数は、ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して評価され得、マイクロジストロフィン発現のレベルは、細胞中のマイクロジストロフィンｍＲＮＡのレベルを測定することによって試験され得る。
５．４．２ 動物モデル
本明細書に記載されるマイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターの有効性は、動物モデルに投与して、例えば、ｍｄｘマウス及び／またはゴールデンレトリーバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）モデルを使用することによって、変異したジストロフィンを置き換え、導入遺伝子発現の生体内分布、発現、及び治療効果を評価することによって試験され得る。治療効果は、例えば、マイクロジストロフィン導入遺伝子を受けている動物における筋力の変化を評価することによって評価し得る。より大型の哺乳動物ならびに非哺乳動物脊椎動物及び無脊椎動物を使用する動物モデルも使用して、本明細書に記載のベクターの前臨床治療有効性を評価することができる。したがって、本明細書に開示されるマイクロジストロフィンをコードするベクターの用量を、本明細書に開示される治療有効性を評価するための方法に従って有効であることが実証される量で含む、治療投与のための組成物及び方法が提供される。
５．４．２．１ ネズミモデル
遺伝子療法ベクターの有効性は、ＤＭＤのネズミモデルにおいて評価され得る。ｍｄｘマウスモデル（Ｙｕｃｅｌ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＤＭＤ：ｔｈｅ ｌｏｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ ｏｆ ｉｔ，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌｕｍｅ３，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：４（２０１８））は、エクソン２３にナンセンス変異を有し、早期終結コドン及び切断タンパク質（ｍｄｘ）をもたらす。ｍｄｘマウスは、同腹子対照と比較して、３倍高い血中レベルのピルビン酸キナーゼ活性を有する。ヒトＤＭＤ疾患と同様に、ｍｄｘ骨格筋は、活性筋線維壊死、細胞浸潤、広範囲の筋線維サイズ、及び多数の中央核化した再生筋線維を示す。この表現型は、横隔膜で増強され、進行性変性及び筋線維喪失を受け、筋等尺性収縮力におけるおよそ５倍の低下をもたらす。後肢筋における壊死及び再生は、およそ３～４週齢にピークに達するが、その後はプラトーになる。ｍｄｘマウス及び他のマウス背景（例えば、ＤＢＡ／２Ｊ）と交配したｍｄｘマウスにおいて、心駆出率の軽度であるが有意な減少が観察される（Ｖａｎ Ｗｅｓｔｅｒｉｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１５，２０，８８２３－８８５５）。心臓機能欠損を有するかかるＤＭＤモデルマウスを使用して、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターの心臓保護効果、または心臓機能の改善もしくは維持、または心臓機能障害の減衰を評価し得る。本明細書における実施例５～８は、マイクロジストロフィンをコードする遺伝子療法ベクターを評価するためのｍｄｘマウスモデルの使用を詳述する。
追加のｍｄｘマウスモデル：ｍｄｘ２ｃｖ、ｍｄｘ３ｃｖ、ｍｄｘ４ｃｖ、及びｍｄｘ５ｃｖ系統（Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景）を含む、異なる遺伝的背景における多数の代替バージョンが生成されている。これらのモデルは、化学変異誘発剤であるＮ－エチル－Ｎ－ニトロソウレアでマウスを処理することによって作製された。各系統は、異なる点突然変異を有する。全体として、ｍｄｘｃｖモデルにおける疾患表現型の提示には、ｍｄｘマウスと比較してほとんど差がない。追加のマウスモデルは、ｍｄｘ系統を様々なノックアウトマウスモデル（例えば、Ｍｙｏｄ１－／－，α－インテグリン７－／－、α－ジストロブレビン－／－、及びユートロフィン－／－）と交配させることによって作製されている。ＤＭＤを試験するために現在使用されている全てのマウスモデルは、Ｙｕｃｅｌ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＤＭＤ：ｔｈｅ ｌｏｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ ｏｆ ｉｔ，ｎｐｊ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌｕｍｅ３，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：４（２０１８）（参照により本明細書に組み込まれる）によって詳細に記載されている。
心機能
心機能における有効性の評価は、ｍｄｘマウスを含むマウスで測定することができる。血圧（ＢＰ）を測定するために、マウスは、麻酔面を一定にモニタリングし、体温を３６．５～３７．５８℃に維持しながら、１．５％イソフルオランを使用して鎮静化させる。心拍数を４５０～５５０拍／分に維持する。ＢＰカフを、尾の周りに配置し、次いで、尾を麻酔中の非侵襲的ＢＰモニタリングのためにセンサアセンブリ内に配置する。１０回の連続ＢＰ測定を行う。収縮期圧、拡張期圧、及び平均圧を含む尾ＢＰの定性的及び定量的測定は、分析ソフトウェアを使用してオフラインで行われる。例えば、Ｗｅｈｌｉｎｇ－Ｈｅｎｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１４、Ｕａｅｓｏｏｎｔｒａｃｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１４，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１２を参照されたい。
覚醒し、自由に移動するマウスのＥＣＧ波高及び間隔持続時間をモニタリングするために、ラジオテレメトリ装置が使用される。トランスミッタユニットが麻酔したマウスの腹腔に埋め込まれ、２つの電気リードは、リードＩＩ方向で心臓の頂点及び右肩峰の近くに固定される。マウスは、データ記録のためにコンピュータシステムに接続されたアンテナ受信機上のケージに単独で収容される。フィルタリングされていないＥＣＧデータは、３５日間、毎時１０秒間収集される。最初の７日間のデータは、外科的処置からの回復を可能にし、麻酔の効果が消失したことを確認するために処分される。データ波形及びパラメータは、ＤＳＩ分析パッケージ（ＡＲＴ３．０１及びＰｈｙｓｉｏｓｔａｔ４．０１）で分析され、測定値は、心拍数、ＥＣＧ波高、及び間隔持続時間を決定するためにコンパイルされ、平均化される。生のＥＣＧ波形は、２人の独立した観察者によって不整脈について細かく調べられる。
ピクロ・シリウスレッド染色を行って、治験マウスの心臓における線維症の程度を測定する。要するに、治験終了時、安楽死直後に、心筋を取り出し、後の処理のために１０％ホルマリンで固定する。心臓を切片化し、パラフィン切片をキシレン中で脱パラフィン化し、続いてワイゲルトのヘマトキシリンで８分間核染色する。次いで、それらを洗浄し、次いで、さらに３０分間、ピクロ・シリウスレッド（０．５ｇのシリウスレッドＦ３Ｂ、ピクリン酸の飽和水溶液）で染色する。切片はキシレンを３回交換してクリアにし、パーマウントで封入する。Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）顕微鏡を使用して５つのランダムなデジタル画像を取得し、Ｉｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）を使用して盲検分析を行う。動物を安楽死させるときに心臓穿刺を介して血液試料を採取し、収集した血清を筋肉ＣＫレベルの測定のために使用する。
５．４．２．２ イヌ
ほとんどのイヌの試験は、ゴールデンレトリーバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）モデル（Ｋｏｒｎｅｙｇａｙ，Ｊ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ ｇｏｌｄｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｋｅｌｅｔ Ｍｕｓｃｌｅ．２０１７；７：９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で行われる。ＧＲＭＤを有するイヌは、骨格及び心筋の表現型及び選択的筋肉併発－ＤＭＤのものをより密接に反映する重度の表現型、を有する進行性の致命的な疾患に罹患している。ＧＲＭＤイヌは、エクソンスキップ及びフレーム外ＤＭＤ転写物をもたらす単一のヌクレオチド変化を担持する。イヌにおける表現型の特徴には、血清ＣＫの上昇、ＥＭＧでのＣＲＤ、及び群化した筋線維壊死及び再生の組織病理学的証拠が含まれる。表現型の変動は、ヒトのように、ＧＲＭＤにおいて頻繁に観察される。ＧＲＭＤイヌは、罹患したイヌの表現型において役割を果たすように思われる奇異性筋肉肥大を発症し、歩行時のこわばり、関節の減少した運動範囲、及び開口障害が共通の特徴である。疾患の進行を評価するための客観的なバイオマーカーには、強縮性屈曲、脛骨足関節角度、伸張性収縮減少％、最大股関節屈曲角度、骨盤角度、頭蓋縫工筋周囲、及び大腿四頭筋重量が含まれる。
５．５．治療方法
機能的ジストロフィンを提供することによって治療することができる任意の筋ジストロフィー疾患についてヒト対象を治療する方法が提供される。ＤＭＤは、最も一般的なかかる疾患であるが、本明細書に提供されるマイクロジストロフィンを発現する遺伝子療法ベクターは、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋強直性筋ジストロフィー（スタイナート病）、顔面肩甲上腕疾患（ＦＳＨＤ）、肢帯型筋ジストロフィー、Ｘ連鎖性拡張心筋症、または眼咽頭筋ジストロフィーを治療するために投与することができる。本開示のマイクロジストロフィンは、本明細書に記載の任意のマイクロジストロフィンであり得、Ｎ末端からＣ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴの順序でドメインを有するものを含み、式中、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴは、α１－シントロフィン結合部位を含むジストロフィンのＣ末端領域の少なくとも一部分であり、特定の実施形態において、配列番号１６または配列番号８３である。実施形態において、マイクロジストロフィンは、配列番号１、２、または７９のアミノ酸配列を有する。マイクロジストロフィンをコードするベクターとしては、配列番号２０、２１、または８１の核酸配列を有するものが挙げられ、特定の実施形態において、構成的、筋肉特異的（骨格筋、平滑筋、及び心筋特異的を含む）発現、またはＣＮＳ特異的発現のための調節エレメント、及びポリＡ部位などの他の調節エレメントに操作可能に連結されている。かかる核酸は、ｒＡＡＶゲノムの文脈において、例えば、ＩＴＲ配列、特にＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に隣接し得る。特定の実施形態において、方法及び組成物は、それを必要とする対象に、配列番号５３、５５、または８２の核酸配列を有する構築物（組換えゲノム）を含むｒＡＡＶを投与することを含む。実施形態において、構築物または組換えゲノムは、ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子内にある。実施形態において、組換えＡＡＶは、ＡＡＢＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１である。実施形態において、患者は、ＤＭＤと診断されている、及び／またはそれと関連する症状（複数可）を有する。
本明細書の実施例６、７、及び８（以下、セクション６．６、６．７、及び６．８）を参照し、マウスにおける薬理学試験に基づいて、本明細書に記載のマイクロジストロフィンをコードする組換えゲノムを含むｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子を含むｒＡＡＶ粒子（例えば、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１）の１×１０１４ＧＣ／ｋｇまたは２×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量を含む、５×１０１３～１×１０１５ＧＣ／ｋｇの投与量での静脈内を含む、末梢投与による、機能的ジストロフィンによる治療に適しているＤＭＤまたはＢＭＤなどのジストロフィン異常症を有するヒト患者の治療方法が提供される。用量は、ｋｇ当たり１×１０８ベクターゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）～１×１０１５ＧＣ／ｋｇの範囲であることができる。いくつかの実施形態において、用量は、３×１０１３、１×１０１４、３×１０１４、５×１０１４ＧＣ／ｋｇであることができる。いくつかの実施形態において、用量は、１×１０１４、１．１×１０１４、１．２×１０１４、１．３×１０１４、１．４×１０１４、１．５×１０１４、１．６×１０１４、１．７×１０１４、１．８×１０１４、１．９×１０１４、２×１０１４、２．１×１０１４、２．２×１０１４、２．３×１０１４、２．４×１０１４、２．５×１０１４、２．６×１０１４、２．７×１０１４、２．８×１０１４、２．９×１０１４、または３×１０１４ＧＣ／ｋｇであることができる。治療有効用量は、単回投与量として投与され、静脈内または筋肉内投与され得る。代替的に、複数用量が、治療レジメンの過程（すなわち、数日、数週、数か月など）中に投与され得る。
投与量は治療上有効であり、１２週間、２６週間、５２週間、またはそれ以上を含む投与後の適切な時点で評価することができ、当該技術分野で既知であり本明細書に詳細に記載されているジストロフィン異常症の症状及び／またはバイオマーカーの改善または回復に関する評価を含む。マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターが、本明細書に記載される。かかるベクターは、ヒト筋肉細胞（骨格筋、平滑筋、及び／または心筋を含む）に対して向性を有するべきであり、非複製性ｒＡＡＶ、特にＡＡＶ８カプシドを担持するものを含むことができる。ＲＧＸ－ＤＹＳ１またはＲＧＸ－ＤＹＳ５の組換え構築物またはゲノムを有するベクターを含む組換えベクター（図２を参照）（ＡＡＶ８またはＡＡＶ９組換えベクター、例えば、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む）は、好ましくは、静脈内投与を含む、組換えベクターを血流に導入することによって、組換えベクターが筋肉組織またはＣＮＳに入るような任意の手段で投与することができる。
かかる遺伝子療法が投与される対象は、マイクロジストロフィンの筋肉への遺伝子療法媒介性送達に応答するものであることができる。特定の実施形態において、方法は、ＤＭＤまたは他の筋ジストロフィー病、例えば、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋強直性筋ジストロフィー（スタイナート病）、顔面肩甲上腕疾患（ＦＳＨＤ）、肢帯型筋ジストロフィー、Ｘ連鎖性拡張心筋症、もしくは眼咽頭筋ジストロフィーなどと診断されているか、またはそれらと関連する１つ以上の症状を有し、マイクロジストロフィンによる治療に応答性であると特定されたか、もしくはマイクロジストロフィンの遺伝子媒介性送達を伴う療法のための良好な候補と考えられる患者を治療することを包含する。具体的な実施形態において、患者は以前に合成バージョンのジストロフィンで治療されており、合成バージョンのジストロフィンのうちの１つ以上に応答することが見出されている。応答性を決定するために、合成バージョンのジストロフィン（例えば、ヒト細胞培養、バイオリアクターなどにおいて産生される）が対象に直接投与され得る。
任意のかかる組換えベクターの治療有効用量は、組換えベクターが筋肉（例えば、骨格筋または心筋）に入るような任意の手段で、好ましくは、組換えベクターを血流に導入することによって投与されるべきである。具体的な実施形態において、ベクターは、皮下、筋肉内、または静脈内投与される。筋肉内、皮下、または静脈内投与は、筋肉（骨格筋、心筋、及び／または平滑筋を含む）の細胞における可溶性導入遺伝子産物の発現をもたらすべきである。導入遺伝子産物の発現は、筋肉における導入遺伝子産物の送達及び維持をもたらす。代替的に、送達は、遺伝子療法送達及び肝臓におけるマイクロジストロフィンの発現をもたらし得、次いで、可溶性マイクロジストロフィン産物が、血流を通って、それがその治療効果を付与することができる筋肉に運ばれる。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む、本明細書に記載の遺伝子療法ベクターの投与は、筋肉組織を含む対象の組織におけるマイクロジストロフィン発現を、例えば、投与の１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、１０週間後、１２週間後、２０週間後、または２６週間後以内にもたらす。筋肉組織中のマイクロジストロフィンの量は、例えば、本明細書の実施例１２に記載される（及び実施例８に示される）ように、キャピラリベースのウェスタン免疫アッセイを含む、当該技術分野で既知の任意の方法によって測定され得る。実施形態において、遺伝子療法を投与することは、投与の５週間後、６週間後、１０週間後、１２週間後、２０週間後、または２６週間後以内を含み、マイクロジストロフィンをコードする遺伝子療法ベクターを投与された対象の筋肉における１０ｎｇ／ｍｇ、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、または１５０ｎｇ／ｍｇ超のマイクロジストロフィンタンパク質をもたらす。用量は、１×１０１４ＧＣ／ｋｇまたは２×１０１４ＧＣ／ｋｇを含む、５×１０１３ＧＣ／ｋｇ～１×１０１５ＧＣ／ｋｇで静脈内投与され得る。
静脈内、筋肉内、皮下、または肝臓投与に好適な医薬組成物は、生理学的に適合する水性緩衝液を含む製剤緩衝液中のマイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含む組換えベクターの懸濁を含む。製剤緩衝液は、多糖類、界面活性剤、ポリマー、または油のうちの１つ以上を含むことができる。開示される医薬組成物は、本明細書に開示されるマイクロジストロフィン、特にマイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターのうちのいずれかを含むことができ、開示される方法で使用することができる。
例えば、配列番号５３のヌクレオチド配列を有するＲＧＸ－ＤＹＳ１組換えゲノムを含む、ＲＧＸ－ＤＹＳ１をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶ８を含む、ｒＡＡＶを含む医薬組成物を、開示される方法で使用することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ベクター（マイクロジストロフィンをコードする組換えＡＡＶゲノム）を含む組換えアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）を含むことができる。ＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ５を含む、本明細書に開示されるマイクロジストロフィンをコードする組換えゲノムを含むｒＡＡＶ粒子、及び実施形態においてＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１は、０．２ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．２ｇ／Ｌの一塩基性リン酸カリウム、１．２ｇ／Ｌの無水二塩基性リン酸二ナトリウム、５．８ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、４０ｇ／Ｌのスクロース、及び０．０１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８を含むスクロース緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した改変ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で製剤化することができる。医薬組成物は、静脈内（ＩＶ）投与のための無菌の単回使用バイアル中の凍結懸濁液として供給することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ラテックスフリーのゴム栓及びフリップオフアルミニウムシールで密封されたＣｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ（登録商標）（ＣＺ）バイアルに充填することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１つの構成：１０ｍＬバイアル中の５．０ｍＬの送達可能な体積で利用可能であり得る。
実施形態において、免疫抑制剤予防は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１（または本明細書に開示される他のマイクロジストロフィンコードベクター）などの治療剤とともに投与される。例えば、Ｃｈｕ ａｎｄ Ｎｇ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２：，ａｒｔｉｃｌｅ６５８０３８（Ａｐｒｉｌ ２０２１）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。実施形態において、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、またはベタメタゾンなどのコルチコステロイドが、ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む、遺伝子療法送達の少なくとも１日前に開始して、最大１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、または１２週前に開始して投与される。その期間中の毎日の投与を含み、実施形態において、遺伝子療法投与の日に、それと同時を含む、コルチコステロイド投与を含み、次いで、実施形態において、最大１週、２週、３週、４週、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、または最大１年の間、毎日の投与を含む継続投与を含み、コルチコステロイドの用量は、経時的に一定に保持され得るか、または０まで徐々に低下され得る。特定の実施形態において、患者は、遺伝子療法送達前の１２週間、プレドニゾンまたはプレドニゾロン（例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ投与量の用量で）などの経口コルチコステロイドを投与され、次いで、同じ用量で翌年の間継続されるか、または用量は４週、８週、または１２週にわたって徐々に低下される。実施形態において、予防的免疫抑制レジメンは、対象のベースラインのグルココルチコイド用量１ｍｇ／ｋｇ／日に加えて、－１日（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与の前日）から８週目の終わりまで投与され、８週目に安全性の懸念がない場合、次いで９週目から１０週目まで０．５ｍｇ／ｋｇ／日で投与され、１０週目に安全性の懸念がない場合、次いで０．２５ｍｇ／ｋｇ／日で投与され、１２週目に安全性の懸念がない場合、追加のプレドニゾロンは投与されない。実施形態において、１日の総ステロイド用量（ベースラインレジメン用量及び免疫抑制剤用量）は、１日当たり６０ｍｇに相当する用量を超えない。患者はまた、遺伝子療法の投与日に、２時間または１時間以内を含め、アセトアミノフェン及びＨ１－抗ヒスタミンで前処置され得る。０日目は、遺伝子療法投与の日である。
代替的に、またはコルチコステロイド予防に加えて、患者は、予防的に非ステロイド性免疫抑制剤を投与され得る。免疫抑制剤は、遺伝子療法、例えば、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の投与の前、同時、及び／または後、例えば、遺伝子療法送達前に定期的を含む、遺伝子療法の少なくとも１日前、最大１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、または１２週前に投与され得、及び／または遺伝子療法の後に、例えば、最大１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、もしくは１２か月の間、または維持療法として無期限にさえ投与される。かかる免疫抑制剤としては、シクロスポリン、ラパマイシン、抗サイトカイン抗体治療としてサトラリズマブ、サリルマブ、シルツキシマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、オロキズマブ、ゲリリムズマブ、及びトシリズマブなどの抗ＩＬ－６またはＩＬ－６受容体抗体など、あるいはエクリズマブ、ラブリズマブ、もしくはテシドルマブなどに限定されない抗Ｃ５抗体、またはＮＧＭ６２１などの抗Ｃ３抗体を含む抗補体抗体が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る他の免疫抑制剤としては、例えば、リツキシマブ（リツキシマブ－ａｂｂｓ及びリツキシマブ－ａｒｒｘなどのそのバイオシミラー形態を含む）及びオビヌツズマブなどの抗ＣＤ２０抗体、ならびにエタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、ダクリズマブ、またはゴリムマブなどに限定されない抗ＴＮＦ－α抗体が挙げられる。実施形態において、予防的レジメンは、抗ＣＤ－２０抗体と抗Ｃ５抗体との組み合わせ、例えば、リツキシマブとエクリズマブまたはラブリズマブとの組み合わせである。一実施形態において、リツキシマブとエクリズマブまたはラブリズマブとの組み合わせは、遺伝子療法投与後に投与される。他の予防剤としては、イムリフィダーゼが挙げられる。実施形態において、マイクロジストロフィン療法と組み合わせて、マイクロジストロフィン導入遺伝子を含むＡＡＶベクターの投与前に、次いで投与の１２日後まで、エクリズマブの投与を伴う抗補体（抗Ｃ５）免疫抑制レジメンが提供される。エクリズマブは、対象の体重に応じてＩＶ注入によって投与される。１０ｋｇ～２０ｋｇ未満の対象について、６００ｍｇの用量が、－９日、－２日、４日目、及び１２日目に投与され、２０ｋｇ～３０ｋｇ未満の対象について、８００ｍｇが、－１６日、－９日、－２日、及び１２日目に投与され、３０ｋｇ～４０ｋｇ未満の対象について、９００ｍｇの用量が、－１６日、－９日、－２日、及び１２日目に投与され、４０ｋｇ超の対象について、１２００ｍｇの用量が、－３０日、－２３日、－１６日、－９日、－２日、及び１２日目に投与され、０日目は、マイクロジストロフィン遺伝子療法の投与日である。
他の実施形態において、遺伝子療法投与は、細胞内シグナル伝達及び代謝経路を遮断することによって、Ｔ細胞の増殖及び成熟を促進するサイトカインの能力を阻害する、シロリムス（ラパマイシンとしても知られる）の投与の免疫抑制レジメンとの組み合わせにある。実施形態において、遺伝子療法投与は、経口シロリムスと組み合わせて投与され、経口シロリムスは、－７日に３ｍｇ／ｍ２の負荷用量で、次いで、－６日目～８週目に、１日２回（ＢＩＤ）投与に分割された経口シロリムス１ｍｇ／ｍ２／日で、クロマトグラフィーアッセイを使用して、８～１２ｍｇ／ｍｌの目標血中濃度を有する。トラフモニタリングは、－２日、２日目、６日目、１２日目、及び１４日目、次いで必要に応じて実行され得る（０日目は、遺伝子療法投与の日である）。肝機能検査、血小板、及び他のいずれの関連する安全性検査測定値も安定している場合、シロリムスの１日用量は、９～１０週目の間５０％（０．５ｍｇ／ｍ２／日）減少させ、肝機能検査、血小板、及び他のいずれの関連する安全性検査測定値も安定している場合、シロリムスの１日用量は、１１～１２週の間５０％（０．２５ｍｇ／ｍ２／日）減少させることができ、その後、肝機能検査、血小板、及び他のいずれの関連する安全性検査測定値も安定している場合、１２週目以降、シロリムス投与を中止することができる。実施形態において、遺伝子療法とともに投与される免疫抑制レジメンは、上述のように、プレドニゾロン投与レジメン及び／またはエクリズマブ投与レジメン及び／またはシロリムス投与レジメンの組み合わせであることができる。一般に、患者は、予防的免疫抑制剤で前処置され、免疫抑制剤療法は、数日、数週、数か月、または数年の間を含み、遺伝子療法投与後に継続され得る。
本明細書に提供される遺伝子療法ベクターは、コルチコステロイド、ベータ遮断剤、及びＡＣＥ阻害剤を含む、筋ジストロフィーのための他の治療と組み合わせて投与され得る。
本明細書に記載の遺伝子療法投与は、筋ジストロフィーに関連する疾患パラメータ及び／または症状に改善をもたらすことができ、筋力の低下における増加または遅延化、筋肉変性、炎症、線維症、筋肉病変、及び以下に考察される他の臨床的エンドポイントの速度または程度における改善または遅延化が含まれるが、これらに限定されない。
開示される治療方法は、本明細書に記載される治療有効性を示す多くのエンドポイントのうちの１つをもたらすことができる。いくつかの実施形態において、エンドポイントは、開示されるマイクロジストロフィンのうちの１つをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶ粒子の投与後、６週間、１２週間、２４週間、３０週間、３６週間、４２週間、４８週間、１年間、２年間、３年間、４年間、または５年間モニタリングされ得る。
いくつかの実施形態において、クレアチンキナーゼ活性を、本明細書に開示される治療及び投与の方法の治療有効性におけるエンドポイントとして使用することができる。クレアチンキナーゼ活性は、当該投与前のレベル（クレアチンキナーゼ活性）と比較して、対象において減少し得る。いくつかの実施形態において、クレアチンキナーゼ活性は、治療前の対象におけるレベル（クレアチンキナーゼ活性のレベル）と比較して、またはジストロフィン異常症（例えば、自然史研究で特定された参照レベル）を有する非治療対象におけるレベル（クレアチンキナーゼ活性のレベル）と比較して、対象において減少し得る。マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶの投与後にヒト対象において測定されたクレアチンキナーゼ活性は、投与前の対象におけるクレアチンキナーゼ活性、治療されていないジストロフィン異常症を有する対象におけるクレアチンキナーゼ活性、ジストロフィン異常症を有しない対象におけるクレアチンキナーゼ活性、標準におけるクレアチンキナーゼ活性であり得る対照値に対するものであることができる。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む、本明細書に開示されるマイクロジストロフィン組換えゲノムを含むｒＡＡＶベクターの、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇを含む、５×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ～１×１０１５ゲノムコピー／ｋｇの投与量を含む、本明細書に開示の投与量で、静脈内を含む、末梢投与によって、ＤＭＤ及びＢＭＤを含むジストロフィン異常症を治療する方法が提供され、クレアチンキナーゼ活性は、ｒＡＡＶ治療剤の投与の少なくとも１２週間後、２６週間後、または５２週間後、０．５～１．５倍低下する。いくつかの実施形態において、クレアチンキナーゼ活性における低下は、対照または治療剤の投与前の対象で測定された値と比較して、１０００～１０，０００ユニット／リットルの低下であり得る。いくつかの実施形態において、投与後エンドポイントにおける１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００ユニット／リットルの量は、低下を示している。
いくつかの実施形態において、腓腹筋（または他の筋肉）における病変の減少は、本明細書に開示される治療及び投与の方法での治療有効性のエンドポイント尺度として使用することができる。腓腹筋における病変は、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶの当該投与前のレベル（腓腹筋における病変のレベル）と比較して、対象において減少し得る。いくつかの実施形態において、腓腹筋における病変は、ジストロフィン異常症を有する非治療対象における（腓腹筋における病変の）レベルと比較して、対象において減少し得る。腓腹筋における病変の比較は、標準に対するものであることができ、標準は、ジストロフィン異常症を有しない対象における病変またはジストロフィン異常症を有する非治療対象における病変を表す数字または数字のセットである。したがって、いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶの投与後の腓腹筋における病変の比較は、対照の対象に対するものであることができる。対照は、治療されていないジストロフィン異常症を有する対象の腓腹筋における投与前の対象の腓腹筋における病変、ジストロフィン異常症を有しない対象の腓腹筋における病変、または標準の腓腹筋における病変であることができる。
いくつかの実施形態において、対象の腓腹筋における病変は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して評価される。ＭＲＩは、筋肉、靭帯、及び腱を画像化するための良いツールであり得、したがって、筋肉障害は、ＭＲＩを使用して検出及び／または特性評価することができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む、本明細書に開示されるマイクロジストロフィン構築物を含むｒＡＡＶベクターの、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇを含む、５×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ～１×１０１５ゲノムコピー／ｋｇの投与量を含む、本開示の投与量で、静脈内を含む、末梢投与によって、ＤＭＤ及びＢＭＤを含む、ジストロフィン異常症を治療する方法が提供され、結果として、投与後の腓骨筋における病変の減少が、例えば、当該投与前の対象の腓骨筋における病変と比較して、約１～１００％、２～５０％、または３～１０％である。例えば、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶで治療された対象は、対照と比較して、病変における１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以上の減少を有することができる。
いくつかの実施形態において、腓腹筋体積（または任意の他の筋肉の筋肉体積）を、治療有効性のエンドポイントとして使用することができる。腓腹筋体積は、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を用いたｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１）の当該投与前のレベル（腓腹筋体積）と比較して、対象において減少し得る。いくつかの実施形態において、腓腹筋体積は、ジストロフィン異常症を有しない対象におけるレベル（腓腹筋体積）と比較して対象において減少し得る。いくつかの実施形態において、腓腹筋体積は、ジストロフィン異常症を有する非治療対象におけるレベル（腓腹筋体積）と比較して、対象において減少し得る。腓腹筋体積の比較は、標準に対するものであることができ、標準は、ジストロフィン異常症を有しない対象における体積またはジストロフィン異常症を有する非治療対象における体積を表す数字または数字のセットである。したがって、いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶの投与後の腓腹筋体積の比較は、対照に対するものであることができる。対照は、投与前の対象における腓腹筋体積、治療されていないジストロフィン異常症を有する対象における腓腹筋体積、ジストロフィン異常症を有しない対象における腓腹筋体積、または標準における腓腹筋体積であることができる。
いくつかの実施形態において、対象の腓腹筋体積は、ＭＲＩを使用して評価することができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む、本明細書に開示されるマイクロジストロフィン構築物を含むｒＡＡＶベクターの、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇを含む、５×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ～１×１０１５ゲノムコピー／ｋｇの投与量を含む、本開示の投与量で、静脈内を含む、末梢投与によって、ＤＭＤ及びＢＭＤを含む、ジストロフィン異常症を治療する方法が提供され、例えば、当該投与前の対象の腓骨筋体積と比較して、約１～１００％、２～５０％、または３～２０％の腓腹筋体積における減少をもたらす。いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの投与後の腓腹筋体積の減少は、対照と比較して、約２～４００ｍｍ３、５～２００ｍｍ３、または２０～１００ｍｍ３であることができる。例えば、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶで治療された対象は、対照と比較して腓腹筋体積に、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ｍｍ３以上の減少を有することができる。
いくつかの実施形態において、筋肉の脂肪画分が、本明細書に開示されるｒＡＡＶマイクロジストロフィンをコードする治療剤を投与する方法の治療有効性におけるエンドポイントとして使用することができる。筋肉は、骨盤帯及び大腿部における筋肉（大臀筋、大内転筋、大腿直筋、外側広筋、内側広筋、大腿二頭筋、半腱様筋、及び薄筋）であることができる。筋肉の脂肪画分は、本明細書に開示されるマイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶの当該投与前のレベル（筋肉の脂肪画分）と比較して、対象において減少し得る。いくつかの実施形態において、筋肉の脂肪画分は、ジストロフィン異常症を有する非治療対象における（筋肉の脂肪画分の）レベルと比較して、対象において減少し得る。筋肉の脂肪画分の比較は、標準に対するものであることができ、標準は、ジストロフィン異常症を有しない対象における脂肪画分の量もしくはパーセントまたはジストロフィン異常症を有する非治療対象における量もしくはパーセントを表す数字または数字のセットである。したがって、いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶの投与後の筋肉の脂肪画分の比較は、対照に対するものであることができる。対照は、投与前の対象における筋肉の脂肪画分、治療されていないジストロフィン異常症を有する対象における筋肉の脂肪画分、ジストロフィン異常症を有しない対象における筋肉の脂肪画分、または標準の筋肉の脂肪画分であることができる。
いくつかの実施形態において、対象の筋肉の脂肪画分は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて評価される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む、本明細書に開示されるマイクロジストロフィン構築物を含むｒＡＡＶベクターの、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、及び３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇを含む、５×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ～１×１０１５ゲノムコピー／ｋｇの投与量を含む、本開示の投与量で、静脈内を含む、末梢投与によって、ＤＭＤ及びＢＭＤを含む、ジストロフィン異常症を治療する方法が提供され、結果として、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの投与後の筋肉の脂肪画分の低下は、例えば、当該投与前の筋肉の脂肪画分と比較して、約１～１００％、２～５０％、または３～１０％であることができる。例えば、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶで治療された対象は、対照と比較して、筋肉の脂肪画分における１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以上の減少を有することができる。
いくつかの実施形態において、筋肉中の病変のＴ２緩和時間を、治療のためのエンドポイントとして使用することができる。筋肉は、任意の筋肉、例えば、腓腹筋であることができる。筋肉における病変のＴ２緩和時間は、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶの当該投与前のレベル（筋肉における病変のＴ２緩和時間）と比較して、対象において減少し得る。いくつかの実施形態において、筋肉における病変のＴ２緩和時間は、ジストロフィン異常症を有しない対象におけるレベル（筋肉における病変のＴ２緩和時間）と比較して、対象において減少し得る。いくつかの実施形態において、筋肉における病変のＴ２緩和時間は、ジストロフィン異常症を有する非治療対象におけるレベル（筋肉における病変のＴ２緩和時間）と比較して、対象において減少し得る。筋肉における病変のＴ２緩和時間の比較は、標準に対するものであることができ、標準は、ジストロフィン異常症を有しない対象の病変におけるＴ２緩和時間またはジストロフィン異常症を有する非治療対象の筋肉における病変のＴ２緩和時間を表す数字または数字のセットである。したがって、いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶの投与後の筋肉における病変のＴ２緩和時間の比較は、対照に対するものであることができる。対照は、投与前の対象の筋肉における病変のＴ２緩和時間、治療されていないジストロフィン異常症を有する対象の筋肉における病変のＴ２緩和時間、ジストロフィン異常症を有しない対象の筋肉における病変のＴ２緩和時間、または標準の筋肉における病変のＴ２緩和時間であることができる。
いくつかの実施形態において、対象の筋肉における病変のＴ２緩和時間は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して評価される。いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの投与後の筋肉における病変のＴ２緩和時間の減少は、対照と比較して、例えば、当該投与前の筋肉における病変のＴ２緩和時間と比較して、約１～１００％、５～５０％、または１０～３０％であることができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む、本明細書に開示されるマイクロジストロフィン構築物を含むｒＡＡＶベクターの、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、及び３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇを含む、５×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ～１×１０１５ゲノムコピー／ｋｇの投与量を含む、本開示の投与量で、静脈内を含む、末梢投与によって、ＤＭＤ及びＢＭＤを含む、ジストロフィン異常症を治療する方法が提供され、結果として、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの投与後の筋肉における病変の緩和時間の減少は、例えば、対照と比較して、約１～５００ミリ秒（ｍｓ）、１～４００ｍｓ、１～３００ｍｓ、１～２００ｍｓ、１～１００ｍｓ、１～５０ｍｓ、１～２５ｍｓ、１～１０ｍｓであることができる。いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの投与後の筋肉における病変のＴ２緩和時間の減少は、約２～８ｍｓであることができる。例えば、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶで治療された対象は、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、またはそれ以上のｍｓの対照と比較して、筋肉における病変のＴ２緩和時間の減少を有することができる。
いくつかの実施形態において、歩行スコアを治療のためのエンドポイントとして使用することができる。歩行スコアは、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの投与後に約－１～２であり得る。いくつかの実施形態において、歩行スコアは、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの投与後、約１であり得る。
いくつかの実施形態において、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）を、治療のためのエンドポイントとして使用することができる。治療した対象のＮＳＡＡは、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの投与前のＮＳＡＡと比較することができる。治療した対象のＮＳＡＡは、ジストロフィン異常症を有しない対象のＮＳＡＡと比較することができる。治療した対象のＮＳＡＡは、ジストロフィン異常症を有する非治療対象と比較することができる。治療した対象のＮＳＡＡを標準と比較することができ、標準は、ジストロフィン異常症を有しない対象におけるＮＳＡＡまたはジストロフィン異常症を有する非治療対象におけるＮＳＡＡを表すスコアまたはスコアのセットである。
いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶで治療された対象のＮＳＡＡは、当該投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、または上記のＮＳＡＡ比較のいずれかと比較して増加した。いくつかの実施形態において、増加は、０から１に、０から２に、または１から２に、であることができる。
いくつかの実施形態において、ＮＳＡＡで使用される１７項目のうちのいずれかは、治療の個々のエンドポイントとして使用することができる。起立、歩行、椅子からの起立、片脚（右）で起立、片脚（左）で起立、箱段の上り（最初に右脚）、箱段の上り（最初に左脚）、箱段の下り（最初に右脚）、箱段の下り（最初に左脚）、横たわりから座位、床から立ち上がり、頭部上げ、かかと立ち、跳躍、右脚跳び、左脚跳び、及び走行（１０ｍ）のうちのいずれかが治療のためのエンドポイントであることができる。これらの評価の各々は、当該技術分野で周知である。これらのエンドポイントのうちの１つ以上の改善は、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの投与後に認めることができる。当業者は、改善とみなされるものを理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶで治療された対象が起立する、決定された距離を走行／歩行する、及び／または設定された階段数を上るのにかかる時間量における減少を達成することができる。
マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶを投与された対象が決定された距離を走行／歩行するのにかかる時間量における減少は、対照、例えば、ｒＡＡＶの投与前に対象がかかった時間量と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０％、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態において、走行及び／または歩行する決定された距離は、１０メートルであることができる。
マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶを投与された対象が起立するのにかかる時間量における減少は、対照、例えば、ｒＡＡＶの投与前に対象がかかった時間量と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０％、またはそれ以上であり得る。
マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶを投与された対象が設定された階段数を上るのにかかる時間量における減少は、対照、例えば、ｒＡＡＶの投与前に対象がかかった時間量と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０％、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態において、設定された階段数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であることができるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、質問表を治療のためのエンドポイントとして使用することができる。例えば、小児転帰データ収集手段（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＰＯＤＣＩ）質問表を使用して、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶを用いた治療の前及び後に対象の機能的能力を定量することができる。
５．５．１ 心拍出量
骨格筋症状は、ＤＭＤを定義する特徴であると考えられるが、患者は、最も一般的には、呼吸不全または心不全で死亡する。ＤＭＤ患者は、収縮機能のために必要とされる心筋細胞中のジストロフィンの不存在に起因して、拡張型心筋症（ＤＣＭ）を発症する。これは細胞外カルシウムの流入につながり、プロテアーゼ活性化、心筋細胞死、組織壊死、及び炎症を引き起こし、最終的に脂肪の蓄積及び線維症をもたらす。このプロセスは、身体の大部分に血液を送り込むことに関与する、左心室（ＬＶ）に最初に影響を及ぼし、それはより厚くなり、したがって、より大きな作業負荷を経験する。萎縮性心筋細胞は、横紋の喪失、空胞化、断片化、及び核変性を示す。機能的には、萎縮及び瘢痕化は、ＬＶの構造的不安定性及び運動機能低下をもたらし、最終的に一般的なＤＣＭに進行する。ＤＭＤは、洞性頻拍、概日指数の低下、減少した心拍変動、短いＰＲ間隔、右心室肥大、Ｓ－Ｔセグメント低下、及びＱＴｃの延長などの様々なＥＣＧ変化と関連付けられ得る。
本明細書に提供される遺伝子療法治療（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１による投与を含む）は、ＤＭＤ及び他のジストロフィン異常症の進行を遅延、または阻止して、特に心機能障害の進行を低減もしくはそれを減弱し、及び／または心機能を維持または改善することができる。有効性は、連続的な心電図、及び連続的な非侵襲的イメージング試験（例えば、心エコー検査または心臓磁気共鳴画像法（ＣＭＲ））を使用して、治験集団の年齢及び疾患段階に適切である、心臓併発または心不全の徴候及び症状の定期的な評価によってモニタリングされ得る。ＣＭＲは、強制肺活量（ＦＶＣ）、強制呼気量（ＦＥＶ１）、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、ピーク呼気流量（ＰＥＦ）、咳嗽時最大呼気流速、左室駆出率（ＬＶＥＦ）、左室内径短縮率（ＬＶＦＳ）、炎症、及び線維症のベースラインからの変化をモニタリングするために使用され得る。ＥＣＧを使用して、伝導異常及び不整脈をモニタリングし得る。特に、ＥＣＧを使用して、ＰＲ間隔の正規化、Ｖ１におけるＲ波、Ｖ６におけるＱ波、心室再分極、下側壁及び／または上側壁におけるＱＳ波、右脚ブロックにおける伝導障害、ＱＴＣ、及びＱＲＳを評価し得る。
したがって、本明細書に開示されるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸を含む、遺伝子発現カセット及びウイルスベクターを含む組成物を含む組換えＡＡＶ組成物（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を含む）、ならびに、例えば、連続的な心電図、及び／または連続的な非侵襲的画像化試験（例えば、心エコー検査または心臓磁気共鳴画像化（ＣＭＲ））によって測定されるとき、ＬＶＥＦを４５％未満に減少させること及び／または機能の正常化（ＬＶＦＳ≧２８％）における低下を防止することによって、心機能を改善もしくは維持するか、または心機能の喪失を遅らせる、これらの組成物を投与する方法が提供される。測定は、未治療の対照または核酸組成物による治療前の対象と比較され得る。代替的に、本明細書に記載の核酸組成物及び核酸組成物の投与方法は、強制肺活量（ＦＶＣ）、強制呼気量（ＦＥＶ１）、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、ピーク呼気流量（ＰＥＦ）、咳嗽時最大呼気流速、左室駆出率（ＬＶＥＦ）、左室内径短縮率（ＬＶＦＳ）、炎症、及び線維症のベースラインからの変化をモニタリングすることによって評価される、心機能における改善、または心機能の喪失における低減をもたらす。ＥＣＧを使用して、伝導異常及び不整脈をモニタリングし得る。特に、ＥＣＧを使用して、ＰＲ間隔の正規化、Ｖ１におけるＲ波、Ｖ６におけるＱ波、心室再分極、下側壁及び／または上側壁におけるＱＳ波、右脚ブロックにおける伝導障害、ＱＴＣ、及びＱＲＳを評価し得る。
いくつかの実施形態において、心機能及び／または肺機能は、投与の治療有効性の評価のためのエンドポイントとして使用することができる。心機能及び／または肺機能は、当該投与前のレベル（心機能及び／または肺機能）と比較して、対象において改善または増加し得る。いくつかの実施形態において、心機能及び／または肺機能は、ジストロフィン異常症を有しない対象におけるレベル（心機能及び／または肺機能）と比較して、対象において改善または増加し得る。いくつかの実施形態において、心機能及び／または肺機能は、ジストロフィン異常症を有する非治療対象におけるレベル（心機能及び／または肺機能）と比較して、対象において低下し得る。心機能及び／または肺機能の比較は、標準に対するものであることができ、標準は、ジストロフィン異常症を有しない対象における心機能及び／または肺機能、あるいはジストロフィン異常症を有する非治療対象における心機能及び／または肺機能を表す数字または数字のセットである。したがって、いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を有するｒＡＡＶの投与後の心機能及び／または肺機能の比較は、対照に対するものであることができる。対照は、投与前の対象における心機能及び／または肺機能、治療されていないジストロフィン異常症を有する対象における心機能及び／または肺機能、ジストロフィン異常症を有しない対象における心機能及び／または肺機能、標準における心機能及び／または肺機能であることができる。
いくつかの実施形態において、心機能及び／または肺機能における改善または増加は、対照と比較して、例えば、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの投与前の対象と比較して１～１００％である。いくつかの実施形態において、心機能は、インピーダンス、電気的活動、及びカルシウム処理を使用して測定することができる。
５．５．２ 中枢神経系
ＤＭＤを有する一部の患者はまた、てんかん、学習及び認知障害、失読症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）などの神経発達障害、自閉症、及び／または強迫性障害、不安、もしくは睡眠障害などの精神障害を有し得る。
本明細書に開示される遺伝子療法治療の目標は、認知機能を改善するか、あるいはてんかん及び／または精神障害の症状を緩和することであり得る。有効性は、治験集団の年齢及び疾患段階に適切である、行動及び認知機能の定期的な評価によって、ならびに発作事象の定量及び定性することによって評価され得る。
したがって、組換えＡＡＶ組成物、ならびに認知機能を改善し、発作の発生もしくは重症度を低減し、ＡＤＨＤ、強迫性障害、不安、及び／または睡眠障害の症状を緩和するマイクロジストロフィン遺伝子療法組成物を投与する方法が提供される。
５．５．３ 患者の主要エンドポイント
組成物の投与量を、含む組成物の有効性、及び本明細書に記載の方法は、治療されている対象の臨床評価で評価され得る。患者の主要エンドポイントには、強制肺活量（ＦＶＣ）、強制呼気量（ＦＥＶ１）、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、ピーク呼気流量（ＰＥＦ）、咳嗽時最大呼気流速、左室駆出率（ＬＶＥＦ）、左室内径短縮率（ＬＶＦＳ）、ＮＳＡＡにおけるベースラインからの変化、上肢機能（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｕｐｐｅｒ Ｌｉｍｂ）（ＰＵＬ）スコアにおけるベースラインからの変化、及びブルック上肢スケール（Ｂｒｏｏｋｅ Ｕｐｐｅｒ Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ Ｓｃａｌｅ）スコア（Ｂｒｏｏｋｅスコア）におけるベースラインからの変化、握力、ピンチ力におけるベースラインからの変化、ＭＲＩによる心臓線維症スコアにおける変化、ＭＲＩによって評価された上腕（二頭部）筋肉脂肪及び線維症における変化、筋力計を使用した脚部強度の測定、歩行試験６分、歩行１０分、歩行分析－歩行の３Ｄ記録、免疫染色した生検切片の定量可能なイメージングを介したユートロフィン膜染色における変化、ならびに線維サイズと新生児型ミオシン陽性との組み合わせを測定（筋肉生検を介した）することによる再生線維における変化を含み得る。例えば、Ｍａｚｚｏｎｅ Ｅ ｅｔ ａｌ，Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，６－ｍｉｎｕｔｅ ｗａｌｋ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｔｉｍｅｄ ｉｔｅｍｓ ｉｎ ａｍｂｕｌａｎｔ ｂｏｙｓ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ２０（２０１０）７１２－７１６、Ａｂｄｅｌｒａｈｉｍ Ａｂｄｒａｂｏｕ Ｓａｄｅｋ，ｅｔ ａｌ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：Ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ（２０１７）Ｎｏｖ；９（１１）：５７３２－５７３９、Ｍａｇｒａｔｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｃａｒｄｉａｃ ＭＲＩ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＢＩＯＭＡＲＫＥＲＳ ＩＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ（２０１８）ＶＯＬ．１２，ＮＯ．１１、Ｐａｎｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｕｐｐｅｒ ｌｉｍｂ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：２４ ｍｏｎｔｈ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｄａｔａ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１８ Ｊｕｎ ２０；１３（６）：ｅ０１９９２２３を参照されたい。
６．１ 実施例１－シスプラスミドの挿入のためのマイクロジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子発現カセットの構築。
ＤＭＤ構築物は、コア骨格：５’（Ｎ末端）－ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－３’（Ｃ－末端）（図２）を有するマイクロジストロフィンをコードするが、Ｃ末端（ＣＴ）の存在及び長さで異なる。ＲＧＸ－ＤＹＳ１によってコードされるマイクロジストロフィンは、野生型ＤＭＤタンパク質Ｃ末端ドメイン（配列番号１６）の近位１９４個のアミノ酸をＣ末端として有し、マイクロジストロフィンをコードするＲＧＸ－ＤＹＳ３は、機能的シントロフィンまたはα－ジストロブレビン結合ドメインを伴わずに短いＣ末端（配列番号９１の４８個のアミノ酸）を有し、ＲＧＸ－ＤＹＳ５は、α１－シントロフィン結合部位を含むが、ジストロブレビン結合部位を含まないＣ末端ドメイン（配列番号８３）の１４０個のアミノ酸を有するマイクロジストロフィンをコードする（図１Ａ及び１Ｂを参照）。構築物は、Ｓｐｃ５－１２プロモーター（配列番号３９）及びｓｍＰＡ調節配列を含み、ＲＧＸ－ＤＹＳ３は、ＶＨ４イントロン配列（配列番号４１）を含む。ＩＴＲに隣接するシスプラスミドに全てクローニングした。ＤＭＤ遺伝子をコードする全てのＤＮＡ配列は、コドン最適化され、ＣｐＧを枯渇している。
６．１．１．ＲＧＸ－ＤＹＳ１、ＲＧＸ－ＤＹＳ３、及びＲＧＸ－ＤＹＳ５導入遺伝子の組換え操作
要約すると、Ｎ末端ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ－Ｃ末端（配列番号１のアミノ酸配列を有する）をコードする、図２に示されるＲＧＸ－ＤＹＳ１におけるマイクロジストロフィン構築物のヒトコドン最適化及びＣｐＧ枯渇したヌクレオチド配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して合成した。所望のＣ末端は、以下の２つのプライマーを使用して、部位特異的変異誘発によって作製した。５′：ＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＧＧＣＣＴＡＡＴＡＡＡＧＡＧＣ（配列番号４３）、３′：ＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧ（配列番号４４）。構築物は、合成筋肉プロモーター（例えば、ＳＰｃ５－１２、配列番号３９）、及び小ポリ（Ａ）シグナル配列（ｓｍ ｐＡ（配列番号４２）を含み、配列番号５３のヌクレオチド配列を有する。
構築物ＲＧＸ－ＤＹＳ３（図２）は、ＣＴドメインの小部分（４８個のアミノ酸、配列番号９１）とともに上記で詳述したＲＧＸ－ＤＹＳ１構築物のマイクロジストロフィンをコードするように操作した（配列番号２のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィン）。構築物は、マイクロジストロフィンコード配列の５’末端に、ＳＰｃ５－１２プロモーター、ｓｍ ｐＡポリＡ配列、及びのＶＨ４イントロンを含む。導入遺伝子構築物は、配列番号２１のヌクレオチド配列を有する。
構築物ＲＧＸ－ＤＹＳ５（図２）は、Ｃ末端ドメインが切断され、長さが１４０アミノ酸であることを除いて、ＤＹＳ１マイクロジストロフィンである、マイクロジストロフィンＤＹＳ５（配列番号７９のアミノ酸配列）をコードするように操作した（配列番号８３）。構築物は、ＳＰｃ５－１２プロモーター及びｓｍ ｐＡシグナル配列を含み、配列番号８２のヌクレオチド配列を有する。
プラスミドＲＧＸ－ＤＹＳ５は、プラスミドＲＧＸ－ＤＹＳ１におけるＤＹＳ１のＣ末端の長いバージョンを、Ｃ末端尾部の中間の長さのバージョンで置換することによって作製した。簡潔に述べると、ｇＢｌｏｃｋ－ＤＭＤ－１．５尾部を、ＥｃｏＲＶ及びＮｈｅＩ部位に隣接するＣ末端の中間バージョン、ならびにＲＧＸ－ＤＹＳ１プラスミドの重複配列の１７ｂｐを含む組み込みＤＮＡ技術から合成した。ソースプラスミドＲＧＸ－ＤＹＳ１を、制限酵素ＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、次いで、ｇＢｌｏｃｋ－ＤＭＤ１．５尾部と融合で連結した。最終プラスミドＲＧＸ－ＤＹＳ５を、酵素消化及びその後の配列決定によって確証した。ＲＧＸ－ＤＹＳ２及びＲＧＸ－ＤＹＳ４を同様に構築し、ＲＧＸ－ＤＹＳ１と同じマイクロジストロフィンタンパク質を各々コードし、ＲＧＸ－ＤＹＳ２は、プロモーターの下流にＶＨ４イントロンを含み、ＲＧＸ－ＤＹＳ４は、切断された筋肉特異的プロモーターを有した。
構築物は全て、ＩＴＲ（配列番号８２のヌクレオチド配列）に隣接して配置されるように、シスプラスミドに挿入した。ＲＧＸ－ＤＹＳ１カセットは、ＤＹＳ１マイクロジストロフィンをコードする配列番号２０のヌクレオチド配列を含み、ＲＧＸ－ＤＹＳ３カセットは、ＤＹＳ３マイクロジストロフィンをコードする配列番号２１のヌクレオチド配列を含み、ＲＧＸ－ＤＹＳ５カセットは、ＤＹＳ５マイクロジストロフィンをコードする配列番号８１のヌクレオチド配列を含む（表５も参照）。表１０は、ＲＧＸ－ＤＹＳ１（配列番号５３）、ＲＧＳ－ＤＹＳ３（配列番号５４）、及びＲＧＸ－ＤＹＳ５（配列番号８２）の人工ゲノム（小文字で示される隣接ＩＴＲ配列を含む）のヌクレオチド配列を提供する。
タンパク質の長さ及び発現は、Ｃ２Ｃ１２細胞における異なるプラスミドの発現及びウェスタンブロットで細胞溶解物をアッセイすることによって確証された。
ＲＧＸ－ＤＹＳ５のパッケージング効率を調べるために、ＲＧＸ－ＤＹＳ５は、ＨＥＫ２９３細胞を使用してＡＡＶ８ベクターにパッケージングし、ＡＡＶ８パッケージングしたベクターＲＧＸ－ＤＹＳ５の力価を、振とうフラスコ培養及び親和性精製後に決定した。平均力価は、これらのベンチトップ生産ランにおいて、ＡＡＶ８パッケージングしたＲＧＸ－ＤＹＳ１よりも高く、ＡＡＶ８パッケージングしたＲＧＸ－ＤＹＳ３と同等だった。（データは示さず。）
６．２ 実施例２：ｍｄｘマウスにおける構築物発現の比較試験
６．２．１ ウェスタンブロット、ｍＲＮＡ発現、及びＤＮＡベクターコピー数によるμ－Ｄｙｓ発現比較。
ＲＧＸ－ＤＹＳ１実験に関連する本実施例に記載されるデータ及び試料は、以下のセクション６．５（概念証明、実施例５）に記載の処置後に収集した（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したマウスｎ＝１３）。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ３及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ５ベクターのインビボ試験を、１３匹の雄Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ（ｍｄｘ）マウスで行った。ベクターは全て、５週間齢のｍｄｘマウスに２Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの投与量で尾静脈注射によって全身送達した（群１はｎ＝５、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ３、群２はｎ＝５、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ５、ｎ＝３、ｍｄｘ陰性（無投与）対照）。動物は、投与日に体重が１５．９ｇ～２２．０ｇの範囲だった。ベクター投与の６週間後に、血液を血清のために収集し、動物を安楽死させ、組織の収集のために剖検を行った。腓腹筋（Ｇａｓ）、前脛骨筋（ＴＡ）、横隔膜、上腕三頭筋、大腿四頭筋、心臓、肝臓、及び主要臓器を含む主要骨格筋を収集し、イソペンタン／液体窒素二重槽中でスナップ冷凍し、予備冷却したクライオチューブに入れた。
各動物について体重を週２回記録し、各群について体重の平均変化を計算した。１匹の動物を除き、７週の期間にわたって、予想どおり、全ての動物が体重を増加させた。
ＲＧＸ－ＤＹＳ１処置したマウスを用いた実験は、ＲＧＸ－ＤＹＳ３及びＲＧＸ－ＤＹＳ５処置したマウスでの実験とは異なる施設で行った。
処置したｍｄｘマウスから収集した腓腹筋からのマイクロジストロフィンタンパク質発現を、ウェスタンブロットによって検査した。簡単に述べると、２０～３０ｍｇの組織を、タンパク質溶解緩衝液（１５％のＳＤＳ、７５ｍＭのＴｒｉ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、プロテアーゼ阻害剤、２０％のグリセロール、５％のベータ－メルカプトエタノール）（Ｂｅａｄ Ｍｉｌｌ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ Ｂｅａｄ Ｒｕｐｔｏｒ１２，ＳＫＵ：１９０５０Ａ，ＯＭＮＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）中でホモジナイズした。ホモジナイズ後、試料を室温で、最高速度で５分間スピンダウンし、上清をタンパク質定量に供した。タンパク質ストック上清を、Ｑｕｂｉｔタンパク質アッセイキット（カタログ番号Ｑ３３２１１，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。ストック当たりの総タンパク質濃度を計算し、次いで２０μｇのタンパク質ストック上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした。ウェスタンブロットは、一次抗ジストロフィン抗体（ＭＡＮＥＸ１０１１Ｂ（１Ｃ７），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）を１：１０００希釈で使用して行い、アプライした二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とのヤギ抗マウスＩｇＧ２ａコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号６２－６５２０）だった。α１－アクチンは、ゲルの各レーンにおけるロード対照として機能する。抗α１－アクチンブロットでは、ウサギポリクローナル抗α１－アクチン抗体（ＰＡ５－７８７１５，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１：１０，０００の希釈係数で使用し、二次ヤギ抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号３１４６０）を１：２０，０００で使用した。タンパク質シグナルは、ＥＣＬプライムウェスタンブロッティング検出試薬（製造業者の指示に従う、ＡＭＥＲＳＨＡＭ，ＲＰＮ２２３２）を使用して検出し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって誘導されたデンシトメトリーによって定量した。
ウェスタンブロットの結果（図３Ａ）は、いくつかの観察を明らかにした：第１に、各マイクロジストロフィンタンパク質の推定サイズは、ゲルで観察されたその移動によく対応しており、例えば、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質は１４８ｋＤａであり、一方、ＲＧＸ－ＤＹＳ５及びＲＧＸ－ＤＹＳ３タンパク質のサイズは、それぞれ、１４２ｋＤａ及び１３２ｋＤａだった。第２に、バンドの強度は、腓腹筋組織に存在する各タンパク質で異なった。より長いバージョンのマイクロジストロフィンであるＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターは、最も強い導入遺伝子発現を示し、中間バージョンのＲＧＸ－ＤＹＳ５及びより短いバージョンのＲＧＸ－ＤＹＳ３（及び図３Ａ及び３Ｂ）が続いた。これらの３つの構築物間のマイクロジストロフィン発現レベルの差は、ＡＡＶベクターゲノムレベルにおける変動または異なる長さのマイクロジストロフィン構築物のタンパク質安定性のいずれかに起因し得る。
細胞当たりのゲノムコピーを解明するために、ｄｄＰＣＲを行って、それらの組織におけるＡＡＶ－マイクロジストロフィンベクターゲノムコピー数を検査し、二倍体細胞当たりの特定の組織における送達されたベクターのコピー数は、以下のように計算した：
Figure 2024517143000052
図３Ｃに示されるように、ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクター送達した組織は、実際に、ＲＧＸ－ＤＹＳ５（１７±４ＧＣ／細胞）及びＲＧＸ－ＤＹＳ３（１６±５ＧＣ／細胞）ベクター送達した組織よりも高いベクターゲノムコピー数（５０±１４ＧＣ／細胞）を有した（値はグルカゴンゲノムコピーに対して正規化した）。次いで、相対的マイクロジストロフィン発現を、ベクターコピー数と比較した。図４に示されるように、ＲＧＸ－ＤＹＳ１処置した筋肉（１．３３±０．３９）及びＲＧＸ－ＤＹＳ５処置した筋肉（１．７７４±０．４０）における相対的マイクロジストロフィンの発現は、ＲＧＸ－ＤＹＳ３処置した筋肉（０．７７±０．２２、ｐ＜０．０５、ｎ＝３～５）よりも全て有意に高かった。このデータは、ＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ５ベクターによって生成されたマイクロジストロフィンのより長いバージョン（Ｃ末端を有する）が、インビボで筋肉細胞におけるマイクロジストロフィンタンパク質の安定性をより良好にすることを示す。
加えて、未処置の野生型Ｂ６及びｍｄｘマウスでの骨格筋におけるμ型及び野生型（ＷＴ）ジストロフィンのｍＲＮＡ発現を、処置したマウスと比較して、ｄｄＰＣＲで測定した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＲＥＦ７４７０４，Ｑｉａｇｅｎ）を使用して筋肉組織から抽出した。ｃＤＮＡを、ＲＮＡｓｅ阻害剤を有する高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｒｅｆ４３７４９６６，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｂｙ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して合成した。ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して測定した。マイクロジストロフィン、ＷＴ－ジストロフィン、及び内因性対照グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのコピー数を、デジタルＰＣＲ（Ｎａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｔｉｌｌａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。マウスＷＴ－ジストロフィンに対するプライマー及びプローブ（ｍｍ０１２１６９５１＿ｍ１，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（セクション６．５（実施例５）の上記生体内分布試験にも記載されている）、及びマウスＧＡＰＤＨ（ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、市販されていた。図４Ａに示すように、ナイーブＢ６マウスにおける相対ＷＴ－ジストロフィン転写物は、１±０．６４であり、ｍｄｘマウスにおけるＷＴ－ジストロフィンｍＲＮＡ発現は、１．５５±０．７７だった（ｐ＝０．１５、ｎ＝４）。処置した動物における相対的マイクロジストロフィンｍＲＮＡは、以下だった：ＲＧＸ－ＤＹＳ１処置した筋肉、２２．６６±１１．６（ｐ＜０．０１、ｎ＝５）、ＲＧＸ－ＤＹＳ５処置、１６．８３±１１．０７（ｐ＝０．０６、ｎ＝３）、及びＲＧＸ－ＤＹＳ３処置した筋肉、１１．８７±７．９０（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。このデータは、ＲＧＸ－ＤＹＳ１、ＲＧＸ－ＤＹＳ５、及びＲＧＸ－ＤＹＳ３群におけるマイクロジストロフィンベクターの送達が全て、野生型レベルよりもはるかに高いマイクロジストロフィン転写物を生成したことを示した。さらに、ＧＡＰＤＨ正規化に加えて、マイクロジストロフィンｍＲＮＡのコピー数は、細胞当たりのＡＡＶベクターゲノムのコピー数に対して正規化し、ＷＴ－ジストロフィンｍＲＮＡは、細胞当たりのゲノムのコピー数（２コピー／細胞）に対して正規化した。図４Ｂに示されるように、全ての群は、ゲノムベース当たりで、本質的に同様のレベルのｍＲＮＡ発現を示した（ｎ＝３～５、ｐ＞０．０５）。これは、ＡＡＶ－マイクロジストロフィン導入遺伝子の発現を駆動する筋特異的ＳＰｃ５－１２プロモーターが、マウス骨格筋細胞における天然ジストロフィンプロモーターくらい強力であることを示した。
６．２．２ 免疫蛍光（ＩＦ）染色によるマイクロジストロフィン発現及びジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）会合
次に、免疫蛍光（ＩＦ）染色を行い、異なる群からの腓腹筋におけるジストロフィン、ならびにジストロブレビン、β－ジストログリカン、シントロフィン、及びｎＮｏｓを含むジストロフィン関連タンパク質複合体の発現を検査した。ＩＦ染色プロトコル及び適用した抗体は、上記のセクション６．２（実施例２）に既に記載されているとおりだった。ジストロフィンタンパク質及び検査したＤＡＰＣタンパク質は、未処置ｍｄｘ筋肉には全て存在しなかったが、それらは野生型Ｂ６筋膜に強く存在した。３つの処置群全てについて、マイクロジストロフィンタンパク質は、ほぼ１００％の筋線維で発現され、それらは、異なる処置群の間で区別できなかった。３つの処置群は、筋肉膜でジストロブレビン発現の回復を示し、非常に類似したパターンが観察された。β－ジストログリカン染色では、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１処置群における筋肉は、より均一でより強力なβ－ジストログリカン染色（発現）を示した（データは示さず）。
処置群間のより劇的な差は、シントロフィン染色で観察された。筋肉膜でのシントロフィンの発現は、より長い長さのマイクロジストロフィンを含むＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１群において大幅に増強され、ＲＧＸ－ＤＹＳ５及びＲＧＸ－ＤＹＳ３が続いた（データは示さず）。同じ傾向は、筋肉溶解物でのウェスタンブロット分析によってさらに実証された（図５Ａ）。シントロフィンに対するウェスタンブロットは、骨格筋組織溶解物（ｍｄｘ処置群及び未処置群の各々３匹からの腓腹筋組織、ならびに１匹の腓腹筋及び２匹の上腕三頭筋は、Ｂ６マウス群からのものだった）で行われた。ポリクローナル抗シントロフィン抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ１１１８７）を１：１０，０００で使用し、室温で１時間インキュベートした。α－アクチニンに対するウサギモノクローナル（ａｂ６８１６７，Ａｂｃａｍ）を、１：５０００希釈でアプライした。二次ヤギ抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号Ａ－１０６８５）をアプライした。ＷＴ筋肉における内因性対照アクチニン発現に対するシントロフィン発現の比は、ｍｄｘ群（０．８４±０．２２）と比較して、４．５６±０．７６（ｎ＝３、一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．００１）だった。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ５群における比は、それぞれ、２．７２±０．９７（ｎ＝３、ｍｄｘ群と比較してｐ＜０．０５）及び１．３５±０．０３だった（図５Ｂ）。骨格筋におけるシントロフィン発現のレベルを、ウェスタンブロットによって全筋肉膜抽出物で追加して検査した。Ｍｅｍ－Ｐｅｒ Ｐｌｕｓ膜タンパク質抽出キット（カタログ番号８９８４２，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、総骨格筋タンパク質を抽出した（ｍｄｘ処置群及び未処置群の各々からの腓腹筋組織、ならびにＢ６マウス群からの大腿四頭筋）。２０μｇの総膜タンパク質を各レーンにロードした（図５Ｃ）。ポリクローナル抗シントロフィン抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ１１１８７）を、１：１０，０００で、４℃で一晩インキュベートした。ロードする対照ポリクローナル抗アクチン（ＰＡ５－７８７１５，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１：１０，０００希釈で、４℃での一晩インキュベートのためにアプライした。図５Ｄに示されるように、ＷＴ筋肉が最高のシントロフィン発現レベルを示した総溶解物ウェスタン実験とはわずかに異なり、総膜タンパク質ウェスタンブロットは、ＲＧＸ－ＤＹＳ１群（０．８１±０．２６、ｎ＝３）で最も高い相対シントロフィン発現を示し、Ｂ６＿ＷＴ群（０．６６２３±０．０５、ｎ＝３）、ＲＧＸ－ＤＹＳ３群（０．５９±０．０８）、及びｍｄｘ群（０．３２±０．０７、ｎ＝３）が続いた。これらの結果は、マイクロジストロフィンベクターによって生成されたマイクロジストロフィンが、筋肉膜シントロフィン発現を回復することができ、長いバージョンのＲＧＸ－ＤＹＳ１は、より短いバージョンのＲＧＸ－ＤＹＳ３よりもシントロフィンを筋肉膜に固定する優れた能力を有したことを明確に示した。
ｎＮＯＳウェスタンブロットを、筋肉膜（腓腹筋組織／ｍｄｘ、及び大腿四頭筋／Ｂ６群）を使用して類似的に調製した。総筋肉膜タンパク質を、Ｍｅｍ－Ｐｅｒ Ｐｌｕｓ膜タンパク質抽出キット（カタログ番号８９８４２，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して抽出した。２０μｇの総膜タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの各レーンにロードした。ｎＮＯＳに対する一次抗体（ＳＣ－５３０２，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１：５００で使用し、ポリクローナル抗アクチン（ＰＡ５－７８７１５，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１：１０，０００希釈でアプライした。二次ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＨＲＰ（６２－６５２０，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をアプライした。ｎＮＯＳの発現に関して、ＩＦ染色後のＲＧＸ－ＤＹＳ１群とＲＧＸ－ＤＹＳ３群との画像間に顕著な差が観察された（図６Ａ）。しかしながら、ウェスタンブロットの結果は、ＲＧＸ－ＤＹＳ１群、ＲＧＸ－ＤＹＳ３群、及び未処置のｍｄｘ群（図６Ｂ～Ｃ）間に顕著な差を明らかにせず、ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターによるｎＮＯＳの回復が低かったことを示した。
全体として、ｍｄｘマウスにおけるＲＧＸ－ＤＹＳ１、ＲＧＸ－ＤＹＳ３、及びＲＧＸ－ＤＹＳ５ベクターの送達は全て、堅牢なマイクロジストロフィン発現及びジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）の回復をもたらした。より長いバージョンのＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターは、ＤＡＰＣの回復を、特にシントロフィン及びβ－ジストログリカンについて増強した。ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターによる膜ＤＡＰＣへのｎＮＯＳの回復能力は低かったが、ＩＦ染色では目視可能だった。
６．２．３ ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターによる衛星細胞の形質導入及び筋ジストロフィー性筋肉の再生の改善
骨格筋幹細胞、または衛星細胞（ＳＣ）は、通常、無活動であり、筋線維の基底層と筋線維鞘との間に局在する。成長中及び筋肉損傷後に、ＳＣの筋原性プログラムが活性化され、ＳＣは自己再生して、それらのプールを維持し、及び／または筋芽細胞を形成し、最終的には筋線維を形成する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、分化した筋線維の形質導入についてよく知られているため、衛星細胞もＡＡＶベクターによって形質導入できるか調査した。衛星細胞は小さくて非常にわずかな細胞質を有し、そのためこれらの細胞における導入遺伝子の発現を試験することは技術的に困難である。この点で、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）を適用して、ＡＡＶが衛星細胞を形質導入することができるか調べた。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）は、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）技術であり、同時にシグナル増幅及びバックグラウンドノイズ抑制を可能にし、単一細胞解離を有するインタクト組織において単一分子遺伝子発現を直接的に視覚化することを可能にする。未処置のｍｄｘマウス、ＲＧＸ－ＤＹＳ１処置ｍｄｘマウス、及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨格筋における３つのマイクロジストロフィンタンパク質（ＤＹＳ１、ＤＹＳ３、またはＤＹＳ５）及びＰａｘ７ ｍＲＮＡの共局在化。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）多重蛍光分析は、フルオロフォア、Ｏｐａｌ５７０（赤色）で標識したＡＡＶマイクロジストロフィンプローブ、及びフルオロフォア、Ｏｐａｌ５２０（緑色）で標識した、筋肉衛星細胞マーカー、ｐａｘ７を利用した。ＡＡＶ導入遺伝子及びＰａｘ７ ｍＲＮＡ発現のＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）多重蛍光分析は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）で行った。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）線維組織ミニキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４７０４）を使用して骨格筋から抽出し、ｃＤＮＡは、ＲＮａｓｅ阻害剤を伴う大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３７４９６６）を用いて合成した。マイクロジストロフィンｍＲＮＡ及び内因性対照ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの絶対コピー数を、デジタルＰＣＲ（Ｎａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｔｉｌｌａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。マイクロジストロフィンに対するプライマー及びプローブは、前述と同じだった。マウスｐａｘ７プライマー及びプローブセット（ＴａｑＭａｎ（商標）ＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３１６０３４）は、商業的に購入した。
マイクロジストロフィン形質導入された衛星細胞を計数し、衛星細胞形質導入率を計算した。ＡＡＶ－マイクロジストロフィン形質導入した骨格筋において、衛星細胞の形質導入率は２３±１．５％だった（図７Ａ）。これは、ＡＡＶベクターが、成熟筋線維よりもはるかに低い形質導入率だが、筋衛星細胞を形質導入することができたことを示した。
次いで、全ｐａｘ７＋衛星細胞数をＲＮＡｓｃｏｐｅ画像内で計数して、異なる治療群で衛星細胞数が同様であったか調べた。図７Ｂに示されるように、未処置ｍｄｘにおける画像当たりのｐａｘ７陽性細胞数は、３９．１２±１５．１４であり、野生型Ｂ６マウス及びＤＭＤベクター処置したマウスにおける陽性細胞数は、それぞれ、１１．８７±３．２３（８枚の画像をカウント、一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０００１）及び１４．６６±５．９１（１２枚の画像をカウント、一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０００１）だった。未処置ｍｄｘ筋肉における衛星細胞数の増加は、筋ジストロフィー性筋肉の再生的性質を示した。ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターを用いたマイクロジストロフィンの送達は、この病態を逆転させ、筋肉再生を緩和した。
ＲＮＡｓｃｏｐｅ技術分析に加えて、全筋肉ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成を行った。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）線維組織ミニキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４７０４）を使用して骨格筋から抽出し、ｃＤＮＡは、ＲＮａｓｅ阻害剤を伴う大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３７４９６６）を用いて合成した。試料は、マウスｐａｘ７特異的プライマー及びプローブセット（市販：それぞれ、ｍｍ０１３５４４８４＿ｍ１ Ｐａｘ７，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３１６０３４からのＴａｑＭａｎ（商標）ＭＧＢプローブ）を使用したｄｄＰＣＲに供した。マウスＧＡＰＤＨプライマー及びプローブセットを使用して、ＲＮＡ及びｃＤＮＡ入力を正規化した。マイクロジストロフィンｍＲＮＡ及び内因性対照ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの絶対コピー数を、デジタルＰＣＲ（Ｎａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｔｉｌｌａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡコピー数に対するｐａｘ７ ｍＲＮＡコピー数の比を群間で比較した（図７Ｃ）。予想されたように、ｍｄｘマウスにおけるｐａｘ７発現の相対発現は７．５６±３．１４であり、これはＷＴ－Ｂ６マウスよりもはるかに高かった（１±０．６８、ｎ＝５、一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．００１）。３つの異なるマイクロジストロフィンベクター処置群における相対ｐａｘ７発現は、大幅に減少した（ＲＧＸ－ＤＹＳ５で４．４０±１．５０（ｎ＝３、ｐ＝０．０６）、ＲＧＸ－ＤＹＳ３群で３．１２±０．７４（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）、ＲＧＸ－ＤＹＳ１で２．９８±０．６８（ｎ＝５、ｐ＜０．０１））。Ｐａｘ＋衛星細胞数は、ｍｄｘにおいて上昇し、このジストロフィンモデルにおける筋肉変性及び再生の活性サイクルと一致する。マイクロジストロフィン処置ｍｄｘマウスの衛星細胞におけるｐａｘ７ ｍＲＮＡ発現の低下は、本マイクロジストロフィンベクターが、筋肉再生の改善を通じて、筋ジストロフィー性筋肉における衛星細胞過形成を修正することを示す。
ＤＹＳ１処置は、衛星細胞計数及びＰａｘ７ ｍＲＮＡ発現の両方によって測定されるように、ｍｄｘにおける衛星細胞過形成を有意に低減する（図７Ｂ及び７Ｃ）。
６．３ 実施例３ ＡＡＶ９ ＲＮＡ／ＤＮＡと比較したＡＡＶ８試験
ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、全身送達を介して、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の骨格筋及び心筋において同様の形質導入効率を有する（図８Ａ～８Ｆ）。固有のバーコードを有するＡＡＶ８及びＡＡＶ９パッケージングＣＡＧ－ＧＦＰカセットを個別に作製し、ほぼ等しい濃度で他のカプシドとともにプールして、１１８個のバーコード化ＡＡＶのライブラリーを生成した。このライブラリー（ＰＡＶＥ１１８）を、１．７７ｅ１３ＧＣ／ｋｇの用量で３匹のカニクイザルに静脈内投与した。投与の３週間後に様々なＮＨＰ組織から単離されたＤＮＡ及びＲＮＡを、相対的存在量についてＮＧＳ分析に供した。ＮＨＰの骨格筋（それぞれ、図８Ａ及びＢ）、心筋（それぞれ、図８Ｃ及びＤ）、及び肝臓（それぞれ、図８Ｅ及びＦ）におけるＡＡＶ８及びＡＡＶ９カプシドからのＤＮＡ及びＲＮＡレベルに有意差はなかった。
６．４ 実施例４－インビトロ試験（ＤＭＤ患者由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））
ｍｄｘ／ＢＬ１０は、ＤＭＤの十分に確立されたマウスモデルであるが、ＤＭＤを有する患者における主要な死因である心筋症は、示されていないか、または表現型は、加齢時の軽度の心室拡張に限定されている（Ｙｕｃｅｌ ｅｔ ａｌ，２０１８）。最近の刊行物は、ＤＭＤ患者からのｉＰＳＣ由来心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ）を、拡張型心筋症のモデル化に使用することができることを示している（Ｌａｕｒｉｌａ ｅｔ ａｌ，２０１６、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１５）。
この試験は、患者由来のｉＰＳＣ－ＣＭを使用してＤＭＤのインビトロ心臓モデルを確立し、ジストロフィン欠損ヒト心筋細胞におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１の生物活性を評価することができる。誘導多能性幹細胞のための欧州銀行（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂａｎｋ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）（ＥＢｉＳＣ）から得られたＤＭＤ患者及び健康なドナーからのｉＰＳＣを、心筋細胞に分化させることができる。成熟した心筋細胞が生成されると、ＤＭＤ及び健康な対照ヒト細胞株の機能的表現型を特性評価することができる。
機能的表現型の確立時に、ＲＧＸ－ＤＹＳ１をＤＭＤ ｉＰＳＣ－ＣＭとともにインキュベートすることができる。ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクター（ＤＮＡ）及びＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンは、それぞれ、ｑＰＣＲ及び免疫細胞化学によって決定される。加えて、ＤＭＤ心筋細胞におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１の利点を評価するために、心機能エンドポイント（すなわち、インピーダンス、電気的活動、及びカルシウム処理）を評価することができる。
６．５ 実施例５－概念証明－ｍｄｘマウスにおける６週試験
６．５．１ ｍｄｘマウスにおける６週試験
ｍｄｘマウスにおけるＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の生物活性を評価するために、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を、５週間齢のｍｄｘ雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ、群当たりｎ＝１３）に、０（ビヒクル）または２×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で静脈内投与した。この試験には、以下のパラメータ及びエンドポイントが含まれた：死亡率、臨床観察、体重、前肢の握力、及び長趾伸筋（ＥＤＬ）に対するインビトロ力が含まれた。剖検（投与後６週間）では、組織の重量を含む、組織の肉眼的検査が行われた。筋肉組織は、筋肉病理学の評価のために別々に収集した。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現は、ウェスタンブロット及び免疫蛍光によって評価し、ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターＤＮＡ生体内分布も評価した。最後に、ＤＡＰＣタンパク質の発現及び局在化も、免疫蛍光を使用して、前脛骨筋（ＴＡ）及び横隔膜組織で評価した。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１は、２×１０１４ＧＣ／ｋｇで十分耐容された。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１関連の死亡または有害な臨床観察はなかった。１匹のマウスは、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与の３週間後に、水頭症のために安楽死させた。しかしながら、この所見は、水頭症がｍｄｘマウスで一般的に認められ、１２週薬理学試験においてビヒクル対照ｍｄｘマウスにも認められたため、試験物関連とはみなされなかった（Ｘｕ ｅｔ ａｌ，２０１５、実施例６）。
ｍｄｘマウスの自然史データ（Ｃｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ，２０１６）と一致して、ビヒクル対照ｍｄｘマウスにおける平均体重は、齢の一致した史的対照よりも有意に高かった（＋１１％）。また、絶対筋肉組織重量及び正規化筋肉組織重量は、試験施設（ＡＧＡＤＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）における野生型史的対照データ（ＨＣＤ）と比較して、有意に高かった（それぞれ、＋１８％～５３％、＋７％～＋３６％）。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおいて体重を減少させた（－１３％）が、これは、試験施設の野生型対照の史的データと同等だった。これに付随して、全ての骨格筋（横隔膜を含む）の絶対重量及び正規化重量は、ビヒクル対照ｍｄｘマウスよりも低かった（それぞれ－１７％～－２９％及び－４％～－１８％）。
筋肉機能は、５週目に握力によって評価し、ＥＤＬ筋のインビトロ力は、剖検（６週目）で評価した。ビヒクル対照ｍｄｘマウスは、齢の一致した史的野生型対照データと比較して、絶対前肢握力及び正規化前肢握力の有意な減少を示した。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較して、ｍｄｘマウスにおける絶対前肢握力及び正規化前肢握力を増加させ（それぞれ、＋１４．５％及び＋３３．７％）、これらのデータは、試験施設における史的野生型対照データに匹敵した。図９Ａ～９Ｄに示されるように、最大及び比筋力出力の両方が、野生型ＨＣＤと比較して、ビヒクル対照ｍｄｘマウスにおいて有意に減少した。これに対し、ｍｄｘマウスへのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較して、ＥＤＬ筋の最大及び比筋力出力に有意な増加をもたらした（それぞれ、＋２１％及び４７．２％）。握力を決定するために、マウスを前肢ワイヤーグリッドの上に優しく配置し、その前足のみに水平バーのうちの１つを握らせた。両方の前足が同じバーをしっかり握り、胴体が地面と垂直であり、バーと平行であることを確実にした後、握りを離すまで、マウスをグリッドの全長にわたって均一な力で着実に引き戻した。順応及び試験のための連続した５日間にわたる各動物における５回の良好な引っ張り。個々のマウスの最大強度の分析のために、単一の最高記録値（最大力）を計算した。正規化した強度（ＫＧＦ／ｋｇ）を体重に基づいて計算した。インビトロ力を決定するために、右後肢のＥＤＬ筋を各マウスから取り出し、２５℃でリンゲル溶液（ｐＨ７．４）を含む酸素化槽（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）に浸漬した。非疲労性単収縮を使用して、筋肉は力生成のための最適な長さに調整された。筋肉を電極で刺激して、２分間の休止間隔で分離した強縮を誘発した。その後の各強縮で、力が通常およそ２５０Ｈｚを生じるプラトーに達するまで、刺激周波数を２０、３０、または５０Ｈｚの段階で増加させた。筋肉の断面積は、筋肉量、線維長、及び組織密度に基づいて測定した。最後に、筋肉比筋力（ｋＮ／ｍ２）を断面積に基づいて計算した。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与が、ｍｄｘマウスにおける筋肉機能を改善するだけでなく、ジストロフィー性表現型を減弱するか調べるために、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおいて、試験の終了時（６週目）に、ＴＡ及び横隔膜において、筋病理（すなわち、炎症、変性、再生、及び中心核形成）を調べた。試験施設（ＡＧＡＤＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組織バンクからの野生型対照組織を、ＴＡ筋の比較器として使用し（ｎ＝２～３）、試験施設からの齢の一致した野生型ＨＣＤを、横隔膜で使用した。
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して炎症を検査した。筋肉中の再生線維及び変性線維は、それぞれ、胚性ミオシン重鎖（ｅＭＨＣ）及びＩｇＭの免疫染色によって決定した。筋肉再生の別の指標である中心核形成も、Ｈ＆Ｅ染色によって測定した。
図１０Ａ～１０Ｋに示されるように、ジストロフィー病理（炎症、変性、再生）は、野生型マウスと比較して、ビヒクル対照ｍｄｘマウスのＴＡ及び横隔膜において明らかだった。加えて、ビヒクル対照において、再生された線維として認識された中心核形成した線維（ＣＮＦ）は、史的野生型対照データよりも有意に高かった（ＴＡ：野生型で２．９２％対ｍｄｘで７０．８１％、横隔膜：野生型で１．４６％、ｍｄｘで４１．６３％）。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおけるジストロフィー変化を減弱させ（図１０Ａ～１０Ｋ）、炎症、再生、及び変性に有意な減少が、ＴＡ及び横隔膜組織の両方で観察され、試験施設における野生型ＨＣＤに類似していた。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与はまた、ｍｄｘマウスでＴＡ（－１８．４％）及び横隔膜（－４８．９％）におけるＣＮＦの割合を有意に減少させたが、両方の組織におけるＣＮＦの割合は、史的野生型対照データよりも高かった（図１０Ａ～１０Ｋ）。これらの観察は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与前のｍｄｘマウスにおける筋肉細胞複製の早期開始（約３週齢）、及びＤＭＤ患者とは異なり、ｍｄｘ－ＢＬ１０バックグラウンドマウスの優れた再生能力に起因する可能性が高い（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ，２００５）。
ｍｄｘマウスにおけるＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の形質導入の成功を確証するために、ＲＧＸ－ＤＹＳ１生体内分布（ベクターＤＮＡ）をｄｄＰＣＲによって検査し、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン（タンパク質）の導入遺伝子レベルを免疫蛍光及びウェスタンブロットによって決定した。ジストロフィンレベルも対照として測定した。
ベクターＤＮＡレベルは、全ての組織（肝臓、心臓、横隔膜、ＴＡ、ＥＤＬ、及び三頭筋）においてｄｄＰＣＲによって定量可能であり、全てのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与動物から収集された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。肝臓は最高のベクターＤＮＡレベルを有したが、レベル組織は同等だった。ビヒクル対照ｍｄｘマウスにおいて、各筋肉群について、他の全ての筋肉及びいくつかの選択された動物組織中の肝臓を分析して、ベクターＤＮＡレベルが存在しないか、または定量下限（ＬＬＯＱ）（～０．０８ｇｃ／ｄｇ）に近いことを確認した。
ウェスタンブロット分析のために、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスから収集した横隔膜、腓腹筋、及びＴＡ筋からタンパク質を抽出した。試料中のマイクロジストロフィンのレベルは、ＢＬ１０マウス及びジャーマン・ショートヘアード・ポインター筋ジストロフィー（ＧＳＨＰＭＤ）イヌ筋溶解物の混合物からのジストロフィンの測定から引き出された標準曲線に基づいて、正常なジストロフィンのパーセントとして計算した。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスは、ジストロフィンの割合として報告された、横隔膜で１５９．５％、腓腹筋で１９１．８％、及びＴＡ筋で２２５．２％のＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンの発現を示した（図１２）。横隔膜、腓腹筋、及びＴＡ筋におけるＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現は、６週目で全ての筋肉組織にわたるベクターＤＮＡの広範な分布と一致した。
筋線維中のＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現をさらに確証するために、免疫蛍光をＴＡ及び横隔膜で行った。投与の６週間後、ビヒクル対照ｍｄｘマウスは、非常にわずかな体細胞復帰変異体筋線維を除いて、ＴＡ及び横隔膜にジストロフィン陽性線維を有しなかった（すなわち、筋線維鞘膜でのジストロフィン発現がない）。これに対し、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスは、堅牢で正確なマイクロジストロフィン発現を、ＴＡ（９６％）及び横隔膜（８９．１％）筋組織の筋線維鞘膜で示した（図１３Ａ～１３Ｃ）。これらの結果は、野生型対照のものと同様だった。以前に報告されたように、均一なジストロフィン発現は、筋線維代謝回転を安定させ、ジストロフィー性筋肉における病理を減弱させるために必要とされる（ｖａｎ Ｗｅｓｔｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２０２０）。
ジストロフィン欠乏は、筋肉の反復収縮及び弛緩中に筋肉の完全性及び細胞シグナル伝達を維持することに関与する、ＤＡＰＣ全体の分解をもたらす（Ｓａｎｃａｒ ｅｔ ａｌ，２０１１、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ，２０１８）。したがって、ジストロフィンの不存在及びＤＡＰＣの不安定化は、筋肉損傷に対する感受性を増加させ、細胞内カルシウム流入を蓄積し、重度のジストロフィー表現型をもたらすと考えられる（Ｃｉｒａｋ ｅｔ ａｌ，２０１２）。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与がＤＡＰＣタンパク質の安定化を回復することもできるか評価するために、免疫蛍光を、ＴＡ及び横隔膜筋において、抗α１－シントロフィン、ジストロブレビン、ｎＮＯＳ－１、及びβ－ジストログリカンで行った（図１４）。
ビヒクル対照ｍｄｘマウスは、野生型対照と比較して、ＴＡ及び横隔膜における筋線維の筋線維鞘で、無視できる／検出できないＤＡＰＣタンパク質を示した。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、α１－シントロフィン（ＴＡで９／１０、横隔膜で１０／１０）及びジストロブレビン（ＴＡで８／１０、横隔膜で１０／１０）の筋線維鞘発現を、両方の組織で完全に回復させた。より重要なことに、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおけるα１－シントロフィン及びジストロブレビンの両方の発現は、抗ジストロフィン染色で共局在するようにみえ、野生型マウスと同様だった。これらの結果は、以前に報告されたように（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンのＣ末端ドメイン（ＣＴ１９４）が、α－ジストロブレビン及びα－シントロフィンを動員できることを実証した。筋線維鞘におけるβ－ジストログリカンの存在も、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較して、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおいて回復した。しかしながら、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスは、野生型と比較した場合、ＴＡにおいて、広い領域の堅牢な発現（６／１０）及び低い発現（４／１０）を示した。同様なパターンは、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスからの横隔膜組織においても認められた。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、筋線維鞘でｎＮＯＳの存在を完全に回復させるようには思えなかったが、ｎＮＯＳは、ＴＡ及び横隔膜の筋線維鞘で、ビヒクル対照ｍｄｘマウスよりも高いレベルで検出可能だった。まとめると、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ＴＡ及び横隔膜筋の筋線維鞘で、ＣＴドメインに特異的なタンパク質を含むＤＡＰＣタンパク質の発現を増加させ、筋線維の構造的完全性の改善を示唆した。
６．６．実施例６：ｍｄｘマウスにおける１２週薬理学試験
６．６．１ ｍｄｘマウスにおける１２週試験
単回ＩＶ注射後のｍｄｘマウスにおけるＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の薬理学を評価した。
ｍｄｘ雄マウスの群（群当たりｎ＝１０）に、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回ＩＶ注入を０（ビヒクル）、３×１０１３、１×１０１４、３×１０１４、または５×１０１４ＧＣ／ｋｇ（最大実行可能用量）で投与した。野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ）の追加の群を対照として含めた。以下のパラメータ及びエンドポイントが含まれた：死亡率、臨床観察、体重、インビボ筋肉機能（握力、自動歩行分析）、バイオマーカー（Ｔ２－ＭＲＩイメージング及び血清からのＣＫ）、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１生体内分布（ベクターＤＮＡ）、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現（タンパク質）、肉眼的検査、組織重量、及び***形成を含む組織病理学。インビボエンドポイント（握力、運動歩行分析、及びＴ２－ＭＲＩイメージング）は、６週目及び１２週目に行った。追加の時点（９週目）を加えて、握力測定を行った。ＣＫ分析のための血清を、インビボエンドポイントを調べた後の７週目、及び最終剖検で収集した。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与の１２週間後、動物を犠牲にし、末期剖検を行った。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１は、最大５×１０１４ＧＣ／ｋｇ用量まで十分に耐容され、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１に関連する死亡数はなかった。水頭症に起因する４匹の早期死亡があり、ビヒクル対照群の１匹の雄、３×１０１３ＧＣ／ｋｇを投与した２匹の雄、及び１×１０１４ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与した１匹の雄からなった。しかしながら、この所見は、水頭症がｍｄｘマウス表現型に関連しているため、試験品関連とはみなされなかった（Ｘｕ ｅｔ ａｌ，２０１５）。試験期間中にＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１関連の臨床的観察はなかった。
微細運動の運動学的歩行分析（インビボ機能試験）
微細運動の運動学的分析を使用して、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の機能的効果を実証した。簡単に説明すると、マウスの動作は、下側、右側、及び左側からの３つの異なる視界からの高速カメラ（３００フレーム／秒）を使用して捕捉した。次いで、歩行モードを使用した高精度運動学的解析方法（ＭｏｔｏＲａｔｅｒ、ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、微細運動スキル及び歩行特性を評価した。ビヒクル対照ｍｄｘマウスが、微細運動の運動学的分析を使用して観察される場合、表現型は、野生型マウスと比較して、股関節、膝、及び足首の増加した伸長、ならびに増加した全体的な股関節の高さ及び減少した前肢つま先クリアランスとして観察される下半身の姿勢に関連する。
図１５に示されるように、運動学的パラメータを単一のスコアに組み合わせた全歩行スコアは、ビヒクル対照ｍｄｘマウスにおいて、６週目に野生型マウスよりも有意に高く（野生型で０．７７対ビヒクル対照ｍｄｘで３．８４）、１２週目にビヒクル対照ｍｄｘマウスと野生型マウスとの間でより明確な差が認められた（野生型で－０．７７対ビヒクル対照ｍｄｘで４．２５）。６週目（１１～１２週齢）では、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の効果は、１×１０１４ＧＣ／ｋｇ及び３×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で顕著であり、５×１０１４ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１用量での全歩行スコアは、野生型のものと同様であった。１２週目（１７～１８週齢）では、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１用量での全歩行スコアが有意に改善され、野生型レベルに対して正規化された（野生型で－０．７７対１×１０１４、３×１０１４、５×１０１４ＧＣ／ｋｇでそれぞれ０．７６、０．５７、及び０．３０）。
Ｔ２－磁気共鳴画像法（バイオマーカー）
ＤＭＤ患者では、筋肉ＭＲＩは、筋肉損傷及び炎症を評価するための強力なツールとして出現している（Ｆｏｒｂｅｓ ｅｔ ａｌ，２０２０）。この試験では、投与の６及び１２週間後にＴ２マッピングＭＲＩを行い、腓腹筋病変（高強度）及び非病変（正常出現筋）における腓腹筋体積、高強度病変パーセント、及びＴ２緩和時間を評価した（図１６Ａ～１６Ｅ）。腓腹筋体積（両方の脚を組み合わせた）は、代償性肥大のために、６週目及び１２時間点の両方で、野生型マウスと比較して、ビヒクル対照ｍｄｘマウスにおいて有意に増加した。６週目に、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較して、３×１０１４及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で腓腹筋体積を減少させた。１２週目に、腓腹筋体積におけるＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の用量応答生物活性は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を３×１０１４及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で投与したｍｄｘマウスにおいて明確に観察された。
高強度病変は、筋肉浮腫のマーカーとして、両方の脚からの自動閾値分析に基づいて定量した。増加した高強度病変（病変％として表される）は、６及び１２週目に野生型対照と比較した場合、ビヒクル対照ｍｄｘで明確に観察された。６週目に、減少した病変は、３×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１用量で既に明らかであり、１×１０１４、３×１０１４、及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で有意に改善された。１２週目に、明確な差は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を１×１０１４、３×１０１４、及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で投与したｍｄｘマウスで認められ、野生型に匹敵した。
Ｔ２時間は、通常、浮腫、炎症、及びある程度の線維症の形成などの水環境変化を伴う病理学的過程において増加する（Ｈｏｇｒｅｌ ｅｔ ａｌ，２０１６、Ｗｏｋｋｅ ｅｔ ａｌ，２０１６）。したがって、Ｔ２緩和時間は、高強度病変及び正常に現れる腓腹筋（非病変）の両方について評価した（図１６Ｄ及びＥ）。野生型動物の画像には病変は観察されなかったが、図１６Ａに報告された低いパーセンテージは、バックグラウンドレベルとみなされるべきである。増加したＴ２緩和時間が、野生型と比較した場合、ビヒクル対照ｍｄｘマウスに両方の時点（６及び１２週目）で観察された。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおいて１×１０１４、３×１０１４、及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量でＴ２緩和時間を有意に減少させ、これらの時間は、６及び１２週目に野生型と同等だった。したがって、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与マウスでは、Ｔ２緩和時間は、１２週目までに＞１×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で野生型動物に匹敵した。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与マウスでは、Ｔ２緩和時間は、１２週目までに＞１×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で野生型動物に匹敵した。
握力（インビボ機能検査）
６及び９週目の握力測定は、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと野生型マウスとの間の違いを明確には明らかにしなかった（図１７）。１２週目に、ビヒクル対照ｍｄｘと野生型マウスとの間の握力の最小の差は、統計的有意性なしで認められた。３×１０１４及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量でＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスにおける握力は、ビヒクル対照のｍｄｘマウスと比較して、有意に増加した。これらの一貫性のない観察は、げっ歯類における握力試験が運動機能以外の様々な要因によって影響を受け得るという事実に起因する可能性が高い（Ｍａｕｒｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２００３、Ｎａｇａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ，２００８）。
クレアチンキナーゼ
予想されたように、平均ＣＫレベルは、７及び１２週目に野生型対照と比較して、ビヒクル対照ｍｄｘマウスにおいて、それぞれ２１倍及び３０倍高かった。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおいて、ＣＫレベルは、＞１×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で減少し、３×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で有意性に達した（図１８）。
ＲＧＸ－ＤＹＳ１生体内分布（ベクターＤＮＡ）
ＤＮＡベクターの生体内分布を、ｑＰＣＲ法を使用して評価した。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスからの腓腹筋、横隔膜、心臓、及び肝臓組織は、試験の終了時（１２週目）に高レベルのベクターＤＮＡを有した。全てのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１処置マウスの検査した組織においてベクターＤＮＡレベルの用量比例的な増加傾向が観察されたが、有意性に達しなかった（図１９）。肝臓は、全てのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与マウスにおいて、筋肉組織と比較して高いベクターＤＮＡレベルを有した。野生型ＢＬ１０マウス及びｍｄｘビヒクル対照マウスから収集した組織は、ベクターＤＮＡレベルを、定量限界（ＢＱＬ）＝５０コピー／μｇＤＮＡ未満または検出限界（ＬＯＤ）＝１１．９６コピー／μｇＤＮＡのいずれかで示した。
ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現（タンパク質）
ｍｄｘマウスにおけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現を調べるために、ウェスタンブロット分析を行った。
１２週目に、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を１×１０１４、３×１０１４、及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で投与したｍｄｘマウスは、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較した場合、３つの筋肉（腓腹筋、横隔膜、及び心臓）全てにおいて有意に高いＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現を示した（ｐ＜０．０５～０．００１）。最も低いＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１用量（３×１０１３ＧＣ／ｋｇ）では、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンレベルは、ビヒクル対照ｍｄｘマウスよりも高かったが、有意ではなかった。
全てのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおいて、心臓組織におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンの発現は、腓腹筋及び横隔膜と比較した場合に高かったが、腓腹筋及び横隔膜における発現は、概して同等だった（図２０Ａ及び２０Ｂ）。野生型マウスにおけるジストロフィンタンパク質発現と比較して、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を３×１０１４及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇで受けたｍｄｘマウスは、腓腹筋、横隔膜、及び心臓において有意に高いＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現を示した。
全体として、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスからの筋肉におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質の存在は、ベクターＤＮＡレベルの検出と一致した。全ての筋肉にわたるＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターＤＮＡレベルが各用量群において同等だったという事実にもかかわらず、心臓組織におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンは、腓腹筋及び横隔膜と比較した場合に概して高く、一方、腓腹筋及び横隔膜における発現は概して同等だった。
この試験では、ｍｄｘマウスへのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１のＩＶ投与後の最小有効用量は、現在、１×１０１４ＧＣ／ｋｇであると考えられており、これは、微細運動の運動学的歩行分析によって測定された筋肉機能における有意な改善及びＭＲＩによって測定された筋肉保存の改善に基づいている。
６．７ 実施例７：ｍｄｘマウスにおける２６週薬理学試験
単回ＩＶ注射後のｍｄｘマウスにおけるＲＧＸ－ＤＹＳ１の長期生物活性を評価した。
雄ｍｄｘマウスの群（群当たりｎ＝１０）に、ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回ＩＶ注射を、０（ビヒクル）、３×１０１３、１×１０１４、３×１０１４、または５×１０１４ＧＣ／ｋｇで投与した。野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ）の追加の群を対照として含めた。動物は、用量の２６週間後に安楽死させた。以下のパラメータ及びエンドポイントが含まれた：死亡率、臨床観察、毎週の体重、インビボ筋肉機能（６、９、１７、及び２６週目の握力、９、１７、及び２６週目の自動歩行分析）、バイオマーカー（６、１７、及び２６週目のＴ２－ＭＲＩイメージング、ならびに１７及び２６週目の血清からのＣＫ）、生体内分布（ベクターＤＮＡ）、導入遺伝子発現（タンパク質）、肉眼的検査、組織重量、ならびに***形成及び筋肉病理を含む組織病理学。
単回ＩＶ注射後のｍｄｘマウスにおけるＲＧＸ－ＤＹＳ１の長期有効性及びＤＭＤの関連モデルにおけるＲＧＸ－ＤＹＳ１の長期毒性も試験した。
ｍｄｘ雄マウスの群（時点ごとに群当たりｎ＝１０）に、ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回ＩＶ注射を、０（ビヒクル）、３×１０１３、１×１０１４、３×１０１４、または５×１０１４ＧＣ／ｋｇで投与した。野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ）の追加の群を対照として含めた。動物は、投与の２６週間後に犠牲にした。以下のパラメータ及びエンドポイントが含まれた：死亡率、臨床観察、握力、歩行分析、ＭＲＩ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）分析、毎週の体重、肉眼的検査、組織重量、及び***形成を含む組織病理学。
図２１は、試験で確かめられた体重の結果を示す。より低い平均体重が、≧３×１０１４ＧＣ／ｋｇで投与されたｍｄｘマウスで観察された。野生型マウスと最大１３週間でｍｄｘマウスに観察されたより高い体重を有するビヒクル対照ｍｄｘマウスとの間には、統計的差がある。２６週目の犠牲前の死亡が、遺伝子療法を介して送達されたヒトマイクロジストロフィンタンパク質、ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与された各マウス群で観察され、水頭症によって引き起こされた。
１７週目に、筋肉病変の発生を評価する筋肉の代表的な画像を、Ｔ２－磁気共鳴画像法を使用して得た（図２２）。病変は、ビヒクル処置、３×１０１３ＧＣ／Ｋｇ、及び１×１０１４ＧＣ／ｋｇを受けたマウスにおいて矢印で示される。３×１０１４または５×１０１４ＧＣ／ｋｇのＲＧＸ－ＤＹＳ１用量を受けているマウスにおいて、病変は認められないか、または少なくとも大幅に減少した病変が認められた。２６週目に、筋肉の代表的な画像をＴ２－磁気共鳴画像法を使用して再び得た（図２３）。病変は、ビヒクル処置、３×１０１３ＧＣ／Ｋｇ及び１×１０１４ＧＣ／ｋｇを受けたマウスにおいて矢印で示される。３×１０１４または５×１０１４ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１用量を受けているマウスにおいて、病変は認められないか、または少なくとも大幅に減少した病変が認められた。
図２４Ａ及び２４Ｂはまた、６週目、１７週目、及び２６週目でのＭＲＩ結果の分析を示し、腓腹筋体積（Ａ）、及び観察された高強度病変における変化（病変（％））（Ｂ）を示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（反復測定（ＲＭ）二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。ビヒクル対照マウスと比較して、結果として得られたＲＧＸ－ＤＹＳ１による処置は、全ての時点での筋肉体積及び病変の減少である。ＲＧＸ－ＤＹＳ１の用量が高いほど、より低い用量よりも良好に作用した。
図２５Ａ及び２５Ｂは、６週目、１７週目、及び２６週目でのＴ２時間－病変（％）（Ａ）、及びＴ２時間－非病変（％）（Ｂ）を示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（反復測定（ＲＭ）二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。一般に、より高い用量（３×１０１４または５×１０１４ＧＣ／ｋｇ）のＲＧＸ－ＤＹＳ１は、ビヒクル対照マウスと比較してより良好な結果を提供した。
歩行分析は、６週目、１７週目、及び２６週目に行った。図２６に示されるように、微細運動の運動学的歩行分析の明確な差が、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと野生型対照との間で９週目に観察され、他の全ての時点で継続した。９週目に、ビヒクル対照と比較して、全歩行スコアの用量関連の改善が、ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおいて、用量≧３×１０１３ＧＣ／ｋｇで示され、用量≧３×１０１４ＧＣ／ｋｇでの歩行スコアは、野生型マウスのものと同様だった（図２６）。１７週目に、≧３×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で歩行スコアにおける改善があった。２６週目に、歩行スコアにおける改善が、１×１０１４ＧＣ／ｋｇで観察され、≧３×１０１４ＧＣ／ｋｇでより明白だった。
ＤＭＤを有する患者では、ＣＫは、正常範囲と比較して顕著に上昇し、診断的価値を有する。さらに、最大血清ＣＫ活性は、通常、ＤＭＤにおいて２～５歳で観察され、疾患が進行するにつれて漸進的に低下する。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｈａｂｉｌ．Ｍｅｄ．４１：３０６－３１２（２０１７）。図２７は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１による処置は、ＣＫ濃度がビヒクル処置対照と比較して有意に減少したことを示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性：野生型ビヒクルに対して＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（反復測定（ＲＭ）二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、シダックの事後）、ｍｄｘビヒクルに対して＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（混合効果モデルＡＮＯＶＡ、ダネットの事後）。高用量（３×１０１４または５×１０１４ＧＣ／ｋｇ）処置マウスにおいて、ＣＫ濃度は、野生型対照マウスのものと同様だった。
図２８は、９週目、１７週目、及び２６週目での異なるマウス群における握力を示す。ビヒクル対照ｍｄｘにおける握力は、野生型と比較した場合、差は明らかでなかった。
ジストロフィー病理におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１の効果を評価するために、試験の最後（３２～３３週齢）に、筋肉組織（横隔膜、心臓、及び腓腹筋）を収集し、分析した。細胞外マトリクスにおける線維症（コラーゲンの蓄積）は、ＤＭＤの顕著な特徴である（Ｋｈａｒｒａｚ ｅｔ ａｌ，２０１４）。特に、ｍｄｘマウスにおける横隔膜は、重度の影響を受け、進行性筋線維変性及び付随する結合組織浸潤を有するＤＭＤ病理に非常によく似ている（Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９７、Ｓｗｉｄｅｒｓｋｉ ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ，２０２１）。予想されたように、ビヒクル対照ｍｄｘマウスは、マッソントリクローム染色によって測定されるように、野生型対照と比較した場合、横隔膜における増加した量の線維症を示した（図２９Ａ）。注目すべきことに、蓄積された線維症は、以前に報告された（Ｃｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ，２０１６、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１１）ように、ビヒクル対照ｍｄｘマウスの腓腹筋及び心臓で観察されたが、横隔膜と比較して相対的に非常に低かった（横隔膜における１６．８％と比較して、骨格筋及び心筋における３％未満）。ｍｄｘマウスにおけるＲＧＸ－ＤＹＳ１の投与は、検査した全ての筋肉組織で線維症の量に低下（ｐ＞０．０５）をもたらした。さらに、横隔膜における線維症の量は、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で有意に減少した（ｐ＜０．０５）。
増加した炎症は、野生型対照と比較した場合、ビヒクル対照ｍｄｘマウスの横隔膜（図２９Ｂ及びＥ）及び腓腹筋（図２９Ｆ）で顕著だった。炎症は、ビヒクルｍｄｘマウスを含む、いずれの動物における心臓でも明らかではなかった（図２９Ｄ）。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスでは、対照ビヒクルｍｄｘマウスと比較した場合、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで、横隔膜及び腓腹筋における炎症性細胞の数が有意に減少した。
加えて、ジストロフィー病理（再生、変性、線維症、及び中心核形成）が、３つの筋肉組織において、定性的評価（マニュアルでスコアリングされた）によって評価された。以下のマニュアルスコアリングスケールを使用した：０（正常）、１（最小）、２（軽度）、３（顕著）、及び４（重度）。
予想されたように、横隔膜筋のジストロフィー病理は、野生型対照（正常）と比較して、ビヒクル対照ｍｄｘマウスにおいて明らかだった（顕著～重度）。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスでは、再生（軽度～最小）及び変性（正常～顕著）における減少が、ビヒクル対照ｍｄｘマウス（顕著～重度）と比較して、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで観察された。線維症（最小～顕著）及び中心核形成（軽度～顕著）の重症度スコアは、ビヒクル対照ｍｄｘマウス（顕著～重度）と比較した場合、≧３×１０１４ＧＣ／ｋｇで低下した。
心臓では、ジストロフィー病理が野生型対照と比較して、ビヒクル対照ｍｄｘマウス（最小～顕著）で観察された。再生における減少は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおいて、≧３×１０１３ＧＣ／ｋｇ（正常～軽度）で観察された。３×１０１３ＧＣ／ｋｇでの変性及び線維症の重症度スコアは減少し（最小）、この効果は、ビヒクル対照ｍｄｘマウス（最小～顕著）と比較した場合、１×１０１４及び３×１０１４ＧＣ／ｋｇ（正常）でより明白だった。中心核形成の重症度スコアも、ビヒクル対照ｍｄｘマウス（軽度～顕著）と比較した場合、１×１０１４及び３×１０１４ＧＣ／ｋｇ（最小）でのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスで減少した。５×１０１４ＧＣ／ｋｇでのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１ ｍｄｘマウスにおける変性及び中心核形成での重症度スコアは、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較して、有意に低下しなかった（最小～顕著）。
腓腹筋のジストロフィー特性が、野生型対照と比較して、ビヒクル対照ｍｄｘマウス（最小～重度）において示された。５×１０１４ＧＣ／ｋｇでの１匹のマウス（顕著）を除いて、再生及び中心核形成は、ビヒクル対照ｍｄｘマウス（最小～顕著）と比較して、≧３×１０１３ＧＣ／ｋｇでのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウス（正常から軽度）で改善された。変性における減少は、３×１０１３ＧＣ／ｋｇ（最小から軽度）で観察され、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１効果は、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇ（正常から軽度）でより突出しており、これらの群（≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇ）における４匹中３匹のｍｄｘマウスは、変性を有しなかった。線維症の重症度スコアにおける低下は、≧３×１０１３ＧＣ／ｋｇ（最小）で観察され、≧３×１０１４ＧＣ／ｋｇ（正常～軽度）でより顕著であり、４匹中３匹のｍｄｘマウスは、３×１０１４及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇで線維症を有しなかった。
試験の終了時（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与から２６週間後）に、ｑＰＣＲ方法を使用したベクター生体内分布（図３０）、及び従来のウェスタンブロット分析を使用したＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質（図３１）の分析のために、筋肉組織を収集した。ベクターＤＮＡレベルは、試験の終了時に、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスからの腓腹筋、横隔膜、及び心臓組織において検出可能なままであった。全てのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与マウスの検査した組織において、ベクターＤＮＡレベルの用量比例的な増加傾向が観察された（図３０）。肝臓は、全てのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与マウスにおいて、筋肉組織と比較してより高いベクターＤＮＡレベルを有した。
１２週薬理学ｍｄｘマウス試験と同様に、マウス全長ジストロフィンタンパク質レベルが、野生型マウスからの横隔膜、腓腹筋、及び心筋中で検出された。ｍｄｘビヒクル対照マウスは、３つの筋肉全てにおいて、明らかなＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン及びジストロフィンタンパク質バンドを示さなかったが、極わずかなパーセントのジストロフィンがｍｄｘビヒクル対照マウスから報告され、これは、デンシトメトリー分析によって捕捉されたバックグラウンドイムノブロットシグナルの結果であり得た。
投与の２６週間後、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで投与したｍｄｘマウスにおいて測定された全ての筋肉は、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較した場合、持続的な有意に高いＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質発現を示したが、横隔膜におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現の増加は、１×１０１４ＧＣ／ｋｇでは統計的有意性に達しなかった（図３１）。３×１０１３ＧＣ／ｋｇでは、３つの全ての筋肉におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質発現は、ビヒクル対照ｍｄｘマウスよりも高かったが、その増加は、統計的有意性に達しなかった。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスからの各筋肉において、持続したＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質発現は、用量依存的にベクターＤＮＡを有する傾向を示した。各用量群における筋肉にわたってベクターＤＮＡレベルが類似しているにもかかわらず、心筋におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質の発現は、腓腹筋及び横隔膜筋と比較した場合、より高かった。
筋線維におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質の発現をさらに評価するために、横隔膜における抗ジストロフィン／マイクロジストロフィン及び抗メロシン（筋線維のマーカー）の共免疫蛍光を行った（図３２Ａ）。投与の二十六（２６）週間後、ビヒクル対照ｍｄｘマウスは、野生型対照と比較して、非常に少数の体細胞復帰変異体筋線維（１％未満）を除いて、横隔膜にジストロフィン陽性線維を有しなかった（すなわち、筋線維鞘膜でのジストロフィン発現がない）。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスでは、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較して、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン陽性筋線維の有意な増加（ｐ＜０．００１）が、１×１０１４ＧＣ／ｋｇでのｍｄｘマウスで観察された（５７％）。さらに、最高用量のＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１は、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン陽性筋線維の集団のほぼ完全な形質導入を達成した（３×１０１４及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇで、それぞれ９５．６％及び９８．０％）。加えて、メロシンでの共免疫蛍光は、ジストロフィン／マイクロジストロフィンの発現が筋線維鞘に限定されたことを明らかにした。
補完的エンドポイントとして、ジストロフィン／マイクロジストロフィンの強度を横隔膜組織で測定した（図３２Ｃ）。ジストロフィン／マイクロジストロフィン染色強度は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおいて、用量依存的に有意に増加した。このデータは、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質レベルがまた、ウェスタンブロット結果と一致して、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおいて用量依存的に増加したことを示した（図３１）。全体として、マイクロジストロフィン陽性線維の数及びマイクロジストロフィン染色の強度における明らかな増加は、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較して、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１が≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで投与されたｍｄｘマウスにおいて明らかである。
ｍｄｘマウスで行われたこの長期試験は、６週及び１２週薬理学試験で観察された筋肉機能及びジストロフィー病理に対するＲＧＸ－ＤＹＳ１の効果が、投与後２６週間持続したことを実証した。これらの結果と一致して、ベクターＤＮＡ及びＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質レベルは、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回投与後に維持された。
要約すると、２６週試験の結果は、水頭症による７匹のｍｄｘの早期死亡及び呼吸障害による１匹のｍｄｘの早期死亡を示す（３×１０１３、１×１０１４、３×１０１４、及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１で、それぞれ２匹、１匹、３匹、２匹のｍｄｘマウス）。より低い体重は、≧３×１０１４ＧＣ／ｋｇで観察された。有意な改善が、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで示された（高強度、病変におけるＴ２時間）。歩行分析は、２６週目に、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで改善、及び≧３×１０１４ＧＣ／ｋｇで有意な改善を示した。ＣＫ分析は、３×１０１３で低下、≧３×１０１４ＧＣ／ｋｇで有意な低下を示した。握力に野生型対照とビヒクル対照ｍｄｘとの間で明確な差はなかった。筋肉病理は、線維症が≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで有意に減少し（横隔膜及び心臓）、炎症／変性／再生が、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおいて、１×１０１４ＧＣ／ｋｇから減少したことを示した。１×１０１４ＧＣ／ｋｇが、筋肉病理データに基づいてＭＥＤであることが確証された。
６．８：実施例８：ｍｄｘマウスにおける６週薬理学試験
本試験の目的は、単回ＩＶ注射後のｍｄｘマウスにおけるＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の薬理学を評価することだった。ｍｄｘ雄マウスの群（群当たりｎ＝５）に、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回ＩＶ注射を０（ビヒクル）、３×１０１３、１×１０１４、または３×１０１４ＧＣ／ｋｇで投与した。野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ）の追加の群は、対照として単回ＩＶ注射を介してビヒクルを受けた。以下のパラメータ及びエンドポイントが含まれた：死亡率、臨床観察、体重、ＴＤ－ＮＭＲ（時間領域核磁気共鳴）による全身組成（脂肪、除脂肪質量、及び遊離体液）、インビトロ筋肉機能（比筋力及び伸張性収縮）、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現（タンパク質）、及び肉眼的検査。動物は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与の６週間後に犠牲にした。
投与された最高用量（３×１０１４ＧＣ／ｋｇ）まで、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１関連の死亡数または臨床徴候は観察されなかった。２匹のｍｄｘマウスは、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与の５週間後の水頭症に起因して安楽死させた。しかしながら、この所見は、水頭症がｍｄｘマウスで一般的に認められ、１２週薬理学試験においてビヒクル対照ｍｄｘマウスにも認められたため、試験品関連とはみなされなかった。
試験中に認められた平均体重において、野生型マウスまたはｍｄｘマウスの間に明確な差はなかった。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスでは、全ての群の平均体重はビヒクル対照ｍｄｘマウスと異なっておらず、ＴＤ－ＮＭＲによって測定された身体組成に差は検出されなかった。
ＲＧＸ－ＤＹＳ１がｍｄｘマウスに機能的利益を提供するか評価するために、筋肉の最大力産生能力（比筋力）及び損傷に抵抗する筋肉の能力（伸張性収縮）を、投与の６週間後に測定した（図３３Ａ～３３Ｂ、及び３４Ａ～３４Ｂ）。補完的なエンドポイントとして、横隔膜及びＥＤＬにおける回復スコアを計算した。回復スコアは、正常マウスとｍｄｘマウスとの間の相対的な欠損度を示し－それは、介入によって回復されている欠損の割合を提供する。回復スコアは、０％（介入が効果を有しない場合）から１００％（「処置された」標本が「正常」なものと同じパラメータ値を示す場合）の範囲である。
筋肉断面積に対して正規化した横隔膜比筋力では、野生型対照と比較して、ビヒクル対照ｍｄｘマウスにおいて有意に低かった（－４４％）。図３３Ａに示されるように、比筋力における用量依存的な改善が、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスに観察された。比筋力における有意な増加（ｐ＜０．０５）は、ビヒクル対照ｍｄｘと比較して、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで観察された。特定の筋力の回復スコアにおける用量依存的な増加は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスで観察された（表１１に示すように、３×１０１３、１×１０１４、及び３×１０１４ＧＣ／ｋｇで、それぞれ２６％、７０％、及び８２％）。
Figure 2024517143000053
ジストロフィー性筋肉は、伸張性収縮によって誘発される損傷に対してより感受性があり、反復ストレス後に力産生の喪失を示す（Ｐｅｔｒｏｆ ｅｔ ａｌ，１９９３）。予想されたように、ビヒクル対照ｍｄｘマウスは、野生型対照と比較して、５回の連続した伸張性収縮後に有意に大きい力損失を有した（ビヒクル対照ｍｄｘで１５％損失対野生型でわずか２％の損失）。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、対照ビヒクルｍｄｘマウスと比較した場合、１×１０１４及び３×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で収縮誘発性損傷に対する横隔膜筋の有意な保護をもたらした（それぞれ６．２％及び３．９％の損失）。１×１０１４及び３×１０１４ＧＣ／ｋｇでのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおける伸張性収縮力の回復スコアは、それぞれ５９％及び８２％だった（図３３Ｂ）。
図３４Ａに示されるように、ＥＤＬにおける比筋力もまた、野生型対照と比較して、ビヒクル対照ｍｄｘマウスにおいて有意に減少した（－１７％）（ｐ＜０．０５）。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおいて、ＥＤＬでの比筋力における増加（ｐ＞０．０５）は、１×１０１４ＧＣ／ｋｇで検出され、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較した場合、３×１０１４ＧＣ／ｋｇでより明白だった。１×１０１４及び３×１０１４ＧＣ／ｋｇでのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおける比筋力の回復スコアは、それぞれ４７％及び１３７％だった（表１２）。
Figure 2024517143000054
さらに、ビヒクル対照ｍｄｘマウスは、野生型対照と比較して有意に大きな力損失を有した（図３４Ｂ：ビヒクル対照ｍｄｘにおける３０％損失対野生型における１１．７％損失）。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較した場合、１×１０１４及び３×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で、収縮誘発性損傷に対するＥＤＬ筋の保護をもたらした（それぞれ１７．４％及び６．８％の損失）。また、伸張性収縮の回復スコアは、全てのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスで用量依存的な増加を示した（３×１０１３、１×１０１４、及び３×１０１４ＧＣ／ｋｇで、それぞれ４２％、９１％、及び１６９％）。
試験の終了時に、筋肉の病理学の評価のために横隔膜及びＴＡ筋を収集した。炎症性細胞数を、Ｈ＆Ｅ染色した画像から測定した。
ビヒクル対照ｍｄｘマウスにおいて、炎症性細胞数は、野生型対照と比較して、横隔膜及びＴＡで有意に増加した（ｐ＜０．０５）（図３５Ａ及び３５Ｂ）。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスでは、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較した場合、≧３×１０１３ＧＣ／ｋｇで横隔膜に、及び≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇでＴＡに、炎症性細胞数における有意な減少（ｐ＜０．０５）があった（横隔膜で－２２％～－３４％、ＴＡで－１７．５％～－２２％）。
横隔膜及びＴＡからの炎症性細胞の検査に加えて、定性的評価（マニュアルでスコアリング）を変性、再生、線維症、及び中心核形成について行った。以下のマニュアルスコアリングスケールを使用した：０（正常）、１（最小）、２（軽度）、３（顕著）、及び４（重度）。
横隔膜筋のジストロフィー病理－再生、変性、及び線維症－が、野生型対照（正常～軽度）と比較して、ビヒクル対照ｍｄｘマウス（最小～重度）で観察された。加えて、変性を除くジストロフィー性特徴が、野生型対照（正常～軽度）と比較して、ビヒクル対照ｍｄｘマウス（軽度～顕著）のＴＡ筋に観察された。注目すべきことに、ＴＡにおける変性は、ビヒクル対照ｍｄｘマウスを含む、いずれの動物においても観察されなかった。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおいて、再生に関する重症度スコアは、ビヒクル対照ｍｄｘマウス（軽度～重度）と比較して、横隔膜及びＴＡにおいて、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇ（正常～軽度）で減少した。変性は、１×１０１４ＧＣ／ｋｇ（最小～軽度）で横隔膜において改善された。線維症に関する重症度スコアにおける低下は、ビヒクル対照ｍｄｘマウス（軽度～重度）と比較して、横隔膜及びＴＡにおいて、≧３×１０１３（最小～顕著）及び≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇ（最小～軽度）で観察された。横隔膜（最小～軽度）及びＴＡ（軽度）における中心核形成がビヒクル対照ｍｄｘマウスで観察され、３×１０１４ＧＣ／ｋｇで横隔膜において変化は観察されず、この用量で、ＴＡにおける重症度スコアは、ビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較してわずかに減少した（最小～軽度）。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質レベルを、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンを認識するが、全長マウスジストロフィンは認識しない（アミノ酸３２１～４９４（エクソン８～１４）に対応するヒトジストロフィンに対して指向する）、モノクローナル抗体ＮＣＬ－ＤＹＳＢ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのクローン３４Ｃ５）を用いたキャピラリベースのウェスタンイムノアッセイ（実施例１２を参照）使用して、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスで測定した。アッセイは、実施例１２に記載されるように実行した。６週目に、全ての野生型及びビヒクル対照ｍｄｘマウスは、横隔膜、腓腹筋、及び心筋において定量可能なＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質発現を示さなかった。全てのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスが、３つ全ての筋肉において、用量依存的に定量可能なＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質レベルを示した。全ての用量レベルで、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質は、横隔膜及び腓腹筋よりも心筋においてより高いレベルで検出された。１×１０１４ＧＣ／ｋｇで、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質発現は、３×１０１３ＧＣ／ｋｇよりも７．３倍（横隔膜）、７．４倍（腓腹筋）、及び１．８倍（心筋）高かった。３×１０１４ＧＣ／ｋｇで、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質発現は、１×１０１４ＧＣ／ｋｇよりも２．４倍（横隔膜）、１．５倍（腓腹筋）、及び１．９倍（心筋）高かった（図３６）。
筋線維におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現をさらに確証するために、共免疫蛍光（メロシン／ジストロフィン）を横隔膜及びＴＡで行った（データは示さず）。ビヒクル対照ｍｄｘマウスは、横隔膜及びＴＡにジストロフィン陽性線維を有しなかった（すなわち、筋線維鞘膜でジストロフィン発現がない）。これに対し、ＴＡ及び横隔膜の筋線維鞘に正しく局在する増加したＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現が、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスにおいて、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで観察された。
要約すると、ｍｄｘマウスにおけるＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回用量は、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで、筋肉機能（比筋力及び伸張性収縮）における顕著な改善及びジストロフィー性筋肉病理における低減を提供した。加えて、用量依存的なマイクロジストロフィンタンパク質発現の増加が、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したｍｄｘマウスで観察された。したがって、この試験で生成されたデータに基づいて、最小有効用量（ＭＥＤ）は、１×１０１４ＧＣ／ｋｇであるとみなされた。
６．９薬理学試験の概要及び結論
一連のインビボ薬理学試験を、ＤＭＤのための生物学的に関連するモデルであるｍｄｘマウスを使用して行った。このＤＭＤネズミモデル（ｍｄｘ）は、ＤＭＤでヒトが経験する臨床的及び病理学的症状のうちの多くを示す（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ，２０１６）。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１をｍｄｘマウスに静脈内投与した場合、筋肉機能（２×１０１４ＧＣ／ｋｇでの握力及びインビトロ力測定、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇでの歩行分析）における改善は、投与の６週間後に明らかだった。さらに、自動歩行分析によって証明されるように、筋肉機能におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１の効果は、用量≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで投与の１２週間後により顕著だった。Ｔ２－ＭＲＩを用いたジストロフィー性病変の評価は、≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で改善を示し、これらの用量で野生型レベルに匹敵した。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与は、ｍｄｘマウスにおけるジストロフィー病理（炎症、変性、及び再生）を２×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で有意に減少させ、６または２６週間後にさらに評価して用量関係をさらに特性評価した。筋肉機能、バイオマーカー、及び病理におけるこれらのＲＧＸ－ＤＹＳ１効果は、増加したレベルのＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン及びベクターＤＮＡのレベルに関連していた。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与ｍｄｘマウスでは、骨格筋における高レベルのＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン及びＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターＤＮＡが、２×１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で投与の６週間後に既に観察された。さらに、非常に持続したＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン及びベクターＤＮＡレベルが、投与の１２週間後に骨格筋及び心筋で観察された。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与後の免疫蛍光によるＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンの追加検査は、野生型と同様のＴＡ及び横隔膜筋の筋線維鞘でのＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンの堅牢な正しい局在化を野生型と同様に確認した。均一なジストロフィン発現は、筋線維代謝回転を安定させ、ジストロフィー性筋肉における病理を減弱させるために必要とされる（ｖａｎ Ｗｅｓｔｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２０２０）。ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現に加えて、他のジストロフィン関連タンパク質もＴＡ及び横隔膜筋の筋線維鞘で回復されて正しく発現され、筋肉における改善した構造的完全性を示唆した。
要約すると、ＤＭＤ疾患の関連動物モデルにおけるＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回用量は、筋肉機能、筋肉損傷に関連するバイオマーカー、ジストロフィー性筋肉病理、及び他のジストロフィン関連タンパク質に顕著な利益を提供している。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１用量≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇでは、１２週試験において、微細運動の運動学的歩行分析によって測定された筋肉機能における有意な改善及びＭＲＩによって測定された筋肉保存における改善があった。６週ＰＯＣ試験における２×１０１４ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１用量では、筋肉機能における有意な改善に加えて、ジストロフィー病理及びＤＡＰＣタンパク質発現における有意な改善もあった。さらに、高レベルのベクターＤＮＡ及び増加したＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンタンパク質発現が、骨格及び心筋において用量≧１×１０１４ＧＣ／ｋｇで観察された。したがって、ＤＭＤ疾患のネズミモデルであるｍｄｘマウスへのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１のＩＶ投与後の最小有効用量は、現在、１×１０１４ＧＣ／ｋｇであるとみなされる。
６．１０ 実施例９：マウスにおける毒性試験
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の毒性は、ｍｄｘマウスにおける１２週及び２６週薬理学試験（非ＧＬＰ）の両方で評価されている。
６．１０．１ １２週ｍｄｘマウス毒性試験
薬理学試験のためのｍｄｘマウスにおける１２週試験で上述されたように、同じ試験プロトコルを毒性試験のために使用した（本明細書における実施例４）。ｍｄｘ雄マウスの群（群当たりｎ＝１０）に、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回ＩＶ注入を、０（ビヒクル）、３×１０１３、１×１０１４、３×１０１４、または５×１０１４ＧＣ／ｋｇで投与した。野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ）の追加の群を対照として含めた。動物は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与の１２週間後に犠牲にした。以下のパラメータ及びエンドポイントが含まれた：死亡率、臨床観察、体重、肉眼的検査、組織重量、及び***形成を含む組織病理学。
平均体重は、全ての投与群で、試験期間にわたって増加した。＞３×１０１４ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１用量を投与されたｍｄｘマウスの平均体重は、３週目以降からビヒクル対照ｍｄｘマウスと比較して有意に減少した。それらの体重は、野生型よりも低かったが、野生型マウスと２つの高用量（３×１０１４及び５×１０１４ＧＣ／ｋｇ）でＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与されたｍｄｘマウスとの間には、統計的差はなく、差は最小だった（１０％未満）。
剖検では、脳、下垂体、脊髄（頸部、胸部、及び腰部）、副腎、腎臓、肝臓、肺、下顎及び腸間膜リンパ節、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精嚢腺、精巣、ならびに精巣上体を収集し、顕微鏡によって検査した。最大５×１０１４ＧＣ／ｋｇの雄ｍｄｘマウスへのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回ＩＶ用量の投与は、雄生殖器官を含む、検査した組織におけるいずれの肉眼的病変、臓器重量差、または顕微鏡所見とも関連しなかった。
したがって、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１がｍｄｘマウスの群に投与された場合、最大無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、試験した最高用量である５×１０１４ＧＣ／ｋｇだった。
６．１０．２．ｍｄｘマウスにおける２６週毒性試験
毒性試験は、本明細書において実施例７に記載されるｍｄｘマウス薬理学試験における２６週に関連して行われた。ｍｄｘ雄マウスの群（時点ごとに群当たりｎ＝１０）にＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回ＩＶ注射を、０（ビヒクル）、３×１０１３、１×１０１４、３×１０１４、または５×１０１４ＧＣ／ｋｇで投与した。野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ）の追加の群を対照として含めた。動物は、投与の２６週間後に犠牲にした。以下のパラメータ及びエンドポイントが含まれた：死亡率、臨床観察、毎週の体重、肉眼的検査、組織重量、及び***形成を含む組織病理学。死亡率及び体重について結果が図２１に示される。
６．１１ 実施例１０－臨床治験プロトコル
６．１１．１ 試験理論的根拠
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、通常、青年期までに死亡につながる進行性筋脱力をもたらす、Ｘ連鎖型の筋ジストロフィーである。ＤＭＤは、世界中の３，６００～９，３００人の男性出産において約１人に影響を及ぼす（Ｍａｈ ｅｔ ａｌ，２０１４）。疾患は、Ｘ染色体上に局在し、筋細胞膜上のＤＡＰＣを介して骨格及び心臓の筋線維に構造的安定性を提供するタンパク質（ジストロフィン）をコードする、ＤＭＤ遺伝子における変異によって引き起こされる（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９８７）。ＤＭＤ遺伝子変異を有する患者における機能的ジストロフィンの欠如は、筋肉細胞の形質膜の安定性を低下させる。膜の不安定化は、膜脆弱性、壊死、炎症、及び進行性筋肉消耗に関与する、変化した機械的特性及び異常なシグナル伝達をもたらす（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ，２００９）。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１は、筋肉特異的プロモーターからマイクロジストロフィンを発現し、ＤＭＤ変異にかかわらず、ＤＭＤを有する患者における筋肉変性を潜在的に防止するように設計されたヒトマイクロジストロフィン発現カセットを含む、組換えアデノ随伴ウイルス８型である。
６．１１．２ 用量：
１×１０１４または２×１０１４ＧＣ／ｋｇ体重のＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の用量を、単回ＩＶ用量として投与する。
６．１１．３．試験設計：
これは、２用量レベルのＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の安全性、耐容性、ＰＤ（ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現レベル）、ＰＫ（ベクター濃度）、及び予備的臨床有効性を、５２週の試験期間にわたってＤＭＤを有する少なくとも６名の外来男性参加者において評価する、ヒトにおける最初の、多施設、第１／２相、非対照、非盲検、１回用量漸増及び用量拡大試験である。安全性が第１の焦点であり、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンの発現レベルに第２の焦点を有する。少なくとも６名の参加者が、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を単回用量レベルで受けるために登録される。参加者は、書面によるインフォームドコンセントが得られた時点で登録され、全ての治療前スクリーニング及びベースライン評価が完了した後にのみ介入を受ける。
この治験では、外部の独立データモニタリング委員会（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄａｔａ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＤＭＣ）及び治験依頼者の内部安全性委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＳＣ）の２つのグループが、治験から蓄積されたデータを評価する。ＩＤＭＣの主な役割は、定期的な間隔で安全性を評価することである。ＩＳＣの主な役割は、安全性を継続的にモニタリングすることである。
２つのコホートの参加者は、第１のコホートについて１×１０１４ＧＣ／ｋｇ、次いで第２のコホートについて２×１０１４ＧＣ／ｋｇで投与される。各用量コホートにおける第１の参加者は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を受けるために２０ｋｇ以下の体重でなければならず、各用量コホートにおける第２の参加者は、３０ｋｇ以下の体重でなければならず、各用量コホートの第３の参加者は、４０ｋｇ以下の体重でなければならない。用量漸増フェーズで開始し、最初の３名の適格な参加者は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回ＩＶ注入を１×１０１４ＧＣ／ｋｇ体重の用量で受けるようにコホート１に順次割り当てられ、投与は、少なくとも４週間ずらして行われる。安全性データは、参加者の各々が４週間のフォローアップを完了した後、ＩＳＣによってレビューされる。第３の参加者が投与後４週間追跡され、安全性データがＩＤＭＣ及びＩＳＣによってレビューされた後、後続の参加者が並行して投与され得る。ＩＳＣは、各参加者の安全性データのレビュー後に推奨を作成する。ＩＳＣが継続を推奨する場合、次の参加者に投与される。
コホート１における第３の投与された参加者が投与後４週間追跡された後、累積安全性データがＩＤＭＣによってレビューされる。ＩＤＭＣがこのより低い用量で安全性が許容されるとみなす場合、次の３名の適格な参加者がコホート２に順次割り当てられ、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の単回ＩＶ用量注入を２×１０１４ＧＣ／ｋｇ体重の用量で受ける。加えて、最大６名の追加の適格な参加者が、並行してコホート１の拡大に登録され得る。コホート２内の最初の３名の参加者の投与は、少なくとも４週間間隔でずらした方式で進行する。ＩＳＣ及びＩＤＭＣによる安全性データレビューは、コホート１について記載されるように進め、コホート２用量レベルで最大６名の追加の適格な参加者の拡大登録の検討が含まれる。
各参加者がＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の投与後１２週間を完了した後、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン発現レベルは、各投与コホートの最初の３名の参加者における筋肉生検で決定され、参加者は、機能検査によって臨床有効性について評価される。
１２週目の完了後、参加者は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の投与後５２週間、安全性及び有効性について引き続き評価される。試験の終了時に、全ての参加者は、長期フォローアップ試験に参加することが勧められる。
参加者は、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）リニアスコアを含む、検証された転帰尺度（ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ，２０１３、ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ，２０１８、Ｍｕｔｏｎｉ ｅｔ ａｌ，２０１９）を使用して、５２週間のフォローアップ期間を通して歩行機能、時限タスク、及び強度について評価される。追加の有効性転帰が測定され、起立する時間（ＴＴＳＴＡＮＤ）、１０メートル走行／歩行する時間（ＴＴＲＷ）、階段を４段上る時間（ＴＴＣＬＩＭＢ）、ミオメトリー、ならびにＭＲＩイメージングを使用した筋肉の評価、心機能及び肺機能、クレアチンキナーゼレベル、及び患者が報告した転帰が含まれる。
サンプルサイズ及び検出力計算：少なくとも６名の参加者が登録され、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の安全性及び耐容性を評価し、バイオマーカー及び臨床有効性エンドポイントに対するＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の効果を探究する。サンプルサイズは、いずれの統計的正当性にも基づかない。
統計的方法：全てのデータは、記述統計学を使用して要約される。カテゴリー変数は、頻度及びパーセンテージを使用して分析され、連続変数は、記述統計学（非見逃し観察の数、平均、標準偏差、中央値、最小、及び最大）を使用して要約される。被験者リスト化及びグラフ表示は、適切に提示される。
６．１１．４ 適格基準：
この試験の参加者は、臨床症状、該当する場合、家族歴に基づいたＤＭＤの診断を有し、免疫蛍光またはウェスタンブロットによるジストロフィン分析のための骨格筋生検、例えば、本明細書に記載のキャピラリベースのウェスタンイムノアッセイ、またはＤＭＤと一致する変異を示す遺伝子型によって確証された男性である。参加者は、補助具なしで少なくとも１００メートル歩行することができ、≧３秒かつ＜９秒で仰臥位から起立する（起立までの時間テスト［ＴＴＳＴＡＮＤ］）ことができなければならない。
６．１１．５ 組み入れ
男性参加者の親（複数可）または法定後見人（複数可）は、該当する場合、全ての試験関連手順の前に、書面によるインフォームドコンセント及び医療保険の相互運用性と説明責任に関する法律（Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｓｕｒａｎｃｅ Ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ａｃｃｏｕｎｔａｂｉｌｉｔｙ Ａｃｔ）（ＨＩＰＡＡ）の承認を提供しており、参加者は、地域の要件に従って書面または口頭の同意を与えるよう求められる。
参加者は少なくとも４歳かつ１２歳未満でなければならない。
参加者は、次のように定義されるＤＭＤの以前の診断を有する：ジストロフィン欠損を示す骨格筋生検のジストロフィン免疫蛍光及び／またはウェスタンブロット分析（例えば、キャピラリベースのウェスタンイムノアッセイ）、ならびに典型的なＤＭＤと一致する臨床像、あるいはリーディングフレームが「フレーム外」として予測することができ、臨床像が典型的なＤＭＤと一致するか、または完全なＤＭＤ遺伝子配列決定が、典型的なＤＭＤと一致する臨床像とともに、ジストロフィンタンパク質の産生を妨げる（すなわち、停止コドンの下流につながるナンセンス変異、欠失／重複）と予想される変化（点変異、重複、他）を示す、ＤＭＤ遺伝子内の特定可能な変異（１つ以上のエクソンの欠失／重複）。
スクリーニング来院で評価されるとき、参加者は、補助具なしで１００メートルを単独で歩行することができる。
参加者は、スクリーニング来院で評価されるとき、支援なしで、≧３秒かつ＜９秒でＴＴＳＴＡＮＤを完了することができる。
肝機能及び腎機能を含む臨床検査結果は、スクリーニング来院時の正常範囲内であるか、または異常な場合、治験責任医師の意見において、臨床的に重大ではない。
参加者が免疫の血清学的証拠の有無にかかわらず、麻疹、流行性口内炎、風疹、及び水痘のワクチンの２回用量を有していたことを示す文書が、スクリーニング来院時に提供される。
参加者は、スクリーニング来院前の少なくとも１２週間、全身性グルココルチコイドの安定した１日用量、≧０．５ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾンもしくはプレドニゾロン、または≧０．７５ｍｇ／ｋｇ／日のデフラザコルトを服用している。
参加者及び親（複数可）／後見人（複数可）は、予定された来院、試験介入投与計画、及び試験手順を遵守する意思があり、遵守することができる。
６．１１．６ 除外
以下の１つ以上に該当する場合、患者は除外される：
参加者が、ＰＩの意見において、試験における対象の安全性もしくは試験参加の成功、または試験結果の解釈を損なう可能性のある、重大なまたは不安定な医学的または心理学的状態を有する。
参加者が、症候性心筋症の証拠を有する。
参加者が、治験責任医師の意見において、試験への参加を妨げる重度の行動的または認知的な問題を有する。
参加者が、血清中に検出可能なＡＡＶ８全結合抗体を有する。
参加者が、機能検査（例えば、ＮＳＡＡ）に影響を与える可能性のあるいずれかの治癒していない傷害または手術を有する。
参加者が、自分の生涯において任意の治験中または市販の遺伝子療法製品を受けたことがある。
参加者が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウイルス感染症の病歴を有するか、あるいはＢ型肝炎（Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎表面抗体、Ｂ型肝炎コア抗体［ＩｇＧ］）、またはＣ型肝炎（Ｃ型肝炎抗体またはＨＣＶ ＲＮＡのいずれか）、またはＨＩＶ抗体についてスクリーニング検査で陽性を有する。
参加者が、臨床部門の従業員または試験の実施に関与した任意の他の個人の一等親の家族である。
参加者が、現在他の治験介入を受けているか、または予定された１日目の介入前の３か月以内に、いずれかのまたは他の治験介入を受けたことがある。
６．１１．７ 試験の目的及びエンドポイント
Figure 2024517143000056
６．１１．９ 生物分析アプローチ
筋肉生検－ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィン分布
免疫組織化学アッセイ及びウェスタンブロット（例えば、本明細書に記載されるキャピラリベースのウェスタンイムノアッセイ）を用いて、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンを発現する線維、及びその局在化を検出する。
免疫原性アッセイ
抗ＡＡＶ８抗体アッセイ
メソスケールプラットフォームを利用する電気化学発光ベースのアッセイは、血清中のＡＡＶ８に対する全抗体を検出するために検証され、それはＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１に対する潜在的な免疫応答をモニタリングするために使用される。このアッセイは、試験に割り当てる被験者の適格性を決定するためには使用されない。別のアッセイが、抗ＡＡＶ８抗体状態に基づいて、適格な被験者を特定するために検証されている。
ＥＬＩＳＰＯＴ
ＡＡＶ８カプシドタンパク質またはＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンのいずれかに指向された、ＲＧＸ－２０２に対する潜在的な細胞応答を検出するために、インターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイが開発される。
ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターアッセイ
ベクター排出
血液（または血清）及び尿中のＲＧＸ－ＤＹＳ１を測定するｑＰＣＲアッセイを開発して、投与後のＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターの排出を測定する。
筋肉生検における生体内分布
筋肉生検におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターＤＮＡを測定するｑＰＣＲアッセイは、投与後の標的組織へのベクター生体内分布を測定するために開発される。
６．１１．１０ 免疫抑制療法との併用
いくつかの態様において、本明細書に記載されるプロトコルは、免疫抑制療法と組み合わせることができる。プロトコルに使用されるベクターが炎症を生じ得る可能性があるため、遺伝子療法の前、療法中、または後に、抗炎症剤などの免疫抑制剤を投与することが有用であり得る。
ステロイド
臨床治験は、Ｔ細胞応答のバイオマーカーとして肝臓酵素レベルをモニタリングしており、応答に対抗するためにステロイド薬による免疫抑制を使用している。ＡＡＶベクターは、アデノウイルス及びレンチウイルスベクターと比較して、誘導性ＣＤ８＋Ｔ細胞で最も効率的ではなく、Ｔ細胞応答は、試験にわたって可変的であることが観察され、他の要因（例えば、血清型、ベクター設計、用量、投与経路、製造）が効果を現し得ることを示した（Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ，２０２０）。
長期間のステロイド使用に関連する副作用は多様であり、筋骨格障害、胃腸障害、代謝障害、神経障害、及び内分泌障害を含むが、これらに限定されない。アレルギー反応（例えば、過敏症、アナフィラキシー）も起こり得る。それにもかかわらず、ステロイドは現在、炎症及び抗ウイルスＣＤ８＋Ｔ細胞応答を相殺するために、全身、肝臓、及び眼のＡＡＶ遺伝子療法において広く使用されている（Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ，２０２０）。
予防的ＩＳレジメンを投与して、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１に対する潜在的な免疫応答を緩和することができる。
１日目に、１日用量の経口プレドニゾロンを参加者のベースラインのグルココルチコイドに追加することができ、目標は、安全性の懸念がなければ、１２週間後に参加者のベースラインのグルココルチコイドレジメンを再開することである。追加の経口プレドニゾロン投与レジメン／段階的漸減化は、以下のとおりであることができる：１日目～８週目の終わりまで１ｍｇ／ｋｇ／日。既往歴、身体検査、及び臨床試験を含む、参加者の臨床状態のレビューに基づいて、８週目に安全性の懸念がない場合、経口プレドニゾロン用量を、９週目～１０週目に０．５ｍｇ／ｋｇ／日に減少させることができる。既往歴、身体検査、及び臨床試験を含む、参加者の臨床状態のレビューに基づいて、１０週目に安全性の懸念がない場合、経口プレドニゾロン用量を、１１週目～１２週目に０．２５ｍｇ／ｋｇ／日に減少させることができる。既往歴、身体検査、及び臨床試験を含む、参加者の臨床状態のレビューに基づいて、１２週目に安全性の懸念がない場合、参加者のベースラインのグルココルチコイドレジメンを、試験の残りの期間、治験責任者の裁量によって再開することができる。最初の１２週間以内に安全性の懸念が発生した場合、ベースラインのグルココルチコイドレジメンに戻る前に、メディカルモニターに連絡し、ケースバイケースでＩＳレジメンを修正のために評価する。注：ベースラインで高用量の週末ステロイドレジメンを受けている参加者は、上記で詳述されている毎日の追加の経口プレドニゾロンレジメン／段階的漸減化とともに、それらの週末レジメンを継続すべきである。参加者の１日の総ステロイド用量（ベースラインレジメン＋試験処方の追加の経口プレドニゾロン）は、６０ｍｇのプレドニゾンに相当する用量を超えるべきではない。
エクリズマブ
ＤＭＤを有する患者における２つのＡＡＶ媒介性遺伝子療法試験は、ａＨＵＳに関連することを含む、補体障害と一致するＡＥを報告している。
エクリズマブは、補体タンパク質Ｃ５と高親和性で特異的に結合する長期作用性ヒト化モノクローナル抗体である（ＳＯＬＩＲＩＳ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０２０）。それは、Ｃ５のＣ５ａ及びＣ５ｂへの切断を阻害し、終末補体複合体Ｃ５ｂ－９の生成を妨げる。エクリズマブは、ａＨＵＳを有する患者における終末補体媒介性血栓性微小血管症を阻害する（ＳＯＬＩＲＩＳ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０２０；Ｌｅｇｅｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ，２０１３）。Ｃ５補体活性化及び続いて起こる補体媒介性ＡＥを緩和するために、エクリズマブは、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与前に予防的に開始し、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与後１２日目までに終了するように試験参加者に投与することができる。エクリズマブは、上記の言及されたＡＡＶ遺伝子療法試験において、治療及び補体媒介性有害反応の予防の両方として、ＤＭＤ患者で既に使用されてきている（Ｐｆｉｚｅｒ ｐｒｅｓｓ ｒｅｌｅａｓｅ，２０２０、Ｓｏｌｉｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｐｒｅｓｓ ｒｅｌｅａｓｅ，２０２０）。
エクリズマブは、小児患者において、重力供給方式、シリンジ型ポンプ、または注入ポンプを介して、１～４時間にわたるＩＶ注入として投与される。投与量は、参加者の体重に依存する（表１４）。エクリズマブ導入の特定のタイミング及び維持用量は、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与後およそ５～８日目におけるエクリズマブのピークレベルを確実にすることであり、これは、ＡＡＶ９遺伝子療法のそれらのＩＧＮＩＴＥ ＤＭＤ試験においてＳｏｌｉｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって報告された臨床データからのピーク補体活性に関連する時間枠である。エクリズマブの注入中になんらかの有害反応が発生した場合、注入を遅らせるか、または治験責任医師の裁量で停止することができる。参加者は、注入完了後少なくとも１時間、注入関連反応の徴候または症状についてモニタリングされなければならない。エクリズマブの１２日目投与後、補体レベルを定期的にモニタリングして、さらなる介入が必要な場合に臨床的意思決定を可能にすることができる。
Figure 2024517143000057
ａＨＵＳ単群プロスペクティブ治験で報告されているエクリズマブに関連する有害反応（≧２０％）は、頭痛、下痢、高血圧、上気道感染症、腹痛、嘔吐、鼻咽頭炎、貧血、咳、末梢浮腫、吐き気、***症、及び発熱である。生命を脅す致命的な髄膜炎菌感染症が、エクリズマブで治療された患者において発生しており、早期に認識及び治療されない場合、急速に生命を脅かすかまたは致命的になる可能性がある（ＳＯＬＩＲＩＳ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０２０）。
髄膜炎菌ワクチン
生命を脅かす致命的な髄膜炎菌感染症が、エクリズマブで治療された患者において発生しており、早期に認識及び治療されない場合、急速に生命を脅かすかまたは致命的になり得る（ＳＯＬＩＲＩＳ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０２０）。
介護者が以前の髄膜炎菌ワクチン接種の文書を提供している参加者は、再度ワクチン接種する必要はない。髄膜炎菌ワクチンを必要とする参加者、すなわち、以前にワクチン接種を受けていないか、またはワクチン接種を受けていることの文書を提供することができない参加者では、髄膜炎菌ワクチン過程が、特定の製品表示、小児の年齢、及びエクリズマブなどの補体阻害剤を服用している小児のための局所ワクチン接種実施に従って（例えば、ワクチン接種実施に関する米国疾病管理予防センター予防諮問委員会（ＵＳ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）に従って）、髄膜炎菌コンジュゲートもしくはＭｅｎＡＣＷＹワクチン、または血清群Ｂ髄膜炎菌ワクチンもしくはＭｅｎＢワクチンのいずれかで筋肉内投与される。ワクチン過程は、エクリズマブ投与開始の少なくとも２週間前までに完了しなければならない。
ワクチン接種は、髄膜炎菌感染症のリスクを低減するが、排除しない（ＳＯＬＩＲＩＳ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０２０）。参加者は、髄膜炎菌感染症の初期徴候についてモニタリングされ、感染が疑われる場合は直ちに評価されなければならない。重篤な髄膜炎菌感染症の治療を受けているいずれの参加者も、エクリズマブが中止されなければならない。
ワクチンの副作用は、典型的には軽度であり、注射部位反応（赤み、痛み、またはヒリヒリ感）、発熱または悪寒、筋肉または関節痛、頭痛、疲労、及び吐き気または下痢が含まれる。まれな場合、アナフィラキシー反応
シロリムス
シロリムスとの併用免疫抑制は、安全性及び有効性の両方で、ＡＡＶ及び／または導入遺伝子に対する免疫応答の影響を最小限に抑えるために多くのＡＡＶ遺伝子療法試験に含まれてきており、安全であり、十分に耐容性であるように思われる。シロリムスは、ラパマイシンとしても知られており、細胞内シグナル伝達及び代謝経路を遮断することによって、Ｔ細胞の拡大及び成熟を促進するサイトカインの能力を阻害する。また、移植後の免疫抑制においても一般的に使用されている（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，２０１６）。最後に、非臨床及び臨床試験は、シロリムスが調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の相対的な節約を提供し得ることを示唆し、これは、リバウンド免疫反応を伴わずに薬物の離脱を可能にし得る（Ｈｅｎｄｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ，２００９、Ｍａ ｅｔ ａｌ，２００９、Ｍｉｎｇｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ，２００７、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ，２０１４）。
プラセボで報告されたよりも高い発生率でシロリムスについて報告された最も一般的な（＞２０％）有害反応には、末梢浮腫、高脂血症、クレアチニン増加、便秘、腹痛、頭痛、疼痛、及び関節痛が含まれる（ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０２１）。一般に、免疫抑制療法は、日和見感染症に対する増加した感受性、ならびにリンパ腫及び他の悪性腫瘍の発症の可能性をもたらし得る（枠内警告を参照、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０２１）。
経口シロリムス投与レジメンは、以下のとおりである：－７日：３ｍｇ／ｍ２のシロリムスの負荷用量。－６日～８週目：シロリムス１ｍｇ／ｍ２／日は、１日２回（ＢＩＤ）投与に分割され、クロマトグラフィーアッセイを使用して目標血中濃度８～１２ｎｇ／ｍＬを有する。トラフモニタリングは、試験－２日、２日目、６日目、１２日目（必要な場合）、及び１４日目、その後、必要に応じて（ＰＲＮ）８週目まで生じる。９～１０週目：肝機能検査（ＬＦＴ）、血小板、及びいずれの他の関連する安全性検査も安定している場合、シロリムス用量を５０％減少させる。１１～１２週目：ＬＦＴ、血小板、及びいずれの他の関連する安全性検査も安定している場合、シロリムス用量をさらに５０％減少させる。１２週目以降：ＬＦＴ、血小板、及びいずれの他の関連する安全性検査も安定している場合、シロリムスを中止する。
シロリムス維持用量が調整されたら、参加者は、安全上の懸念で緊急用量調整を指示されない限り、濃度モニタリングによるさらなる投与量調整前の少なくとも４日間、新たな維持用量を継続すべきである。いずれの日に投与されるシロリムスの最大用量も、４０ｍｇを超えるべきではない。
シロリムスを含む、免疫抑制剤を受けている患者は、ポリオーマウイルス感染症を含む、日和見感染症に対して増加したリスクにある。免疫抑制された患者におけるポリオーマウイルス感染症は、重篤な、時には致命的な転帰を有し得る。これらには、主にＢＫウイルス感染に起因するポリオーマウイルス関連腎症（ＰＶＡＮ）、及びシロリムスを受けている患者で観察されているジョン・カニンガム（ＪＣ）ウイルス関連進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）が含まれる。シロリムストラフは、免疫抑制過程の期間中厳密にモニタリングされ、適切な用量調整が開始される。
スルファメトキサゾール及びトリメトプリム
ウイルスゲノムについてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ＰＣＲ検査を定期的に測定することができ、併用製品であるスルファメトキサゾール及びトリメトプリム（ＢＡＣＴＲＩＭ（商標）Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０２１、ＳＥＰＴＲＡ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２００６）を用いたｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（ＰＣＰ）予防は、週に３回（例えば、月曜日、水曜日、金曜日）、５ｍｇ／ｋｇの用量で、－７日に開始し、シロリムス中止まで継続して服用することができる。サルファアレルギーを有する参加者のため、代替医薬品は、ペンタミジン、ダプソン、及びアトバクオンを含むことができる。
６．１２ 実施例１１－マイクロジストロフィン安定性試験
本試験は、組織培養におけるパルスチェイスアッセイによって測定されたマイクロジストロフィンタンパク質の安定性を示す。
ＡＡＶ媒介性遺伝子療法は、ＤＭＤのための最も有望な治療戦略のうちの１つを代表する。ＡＡＶベクターの限定されたパッケージング容量のために、ジストロフィンコード配列は、マイクロジストロフィンを生成するために切断されなければならない。ジストロフィンにおける内部または末端の欠失は、ロッド及びヒンジ反復接合部での変化した倍率、またはより不安定な膜複合体をもたらすジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）との最適以下の相互作用のいずれかに起因して、不安定なタンパク質につながる可能性がある。マイクロジストロフィンは、カルボキシル末端（ＣＴ）ドメインの長さを増加させて設計されており、それらの安定性は、２つの異なるパルスチェイスアッセイを用いて組織培養において測定されている。
異なる長さのＣＴをコードする３つのマイクロジストロフィン構築物である構築物ＲＧＸ－ＤＹＳ１（μＤｙｓ－ＣＴ１９４をコードする）、構築物ＲＧＸ－ＤＹＳ５（μＤｙｓ－ＣＴ１４０をコードする）、及び構築物ＲＧＸ－ＤＹＳ３（μＤｙｓ－ＣＴ４８をコードする）を評価した。したがって、これらの構築物は、それぞれ、ＣＴドメインの１９４個のアミノ酸、１４０個のアミノ酸、及び４８個のアミノ酸を有するマイクロジストロフィンタンパク質をコードする（図２及び表１０を参照）。ＲＧＸ－ＤＹＳ１ゲノムを含むＡＡＶ８は、ＲＧＸ－ＤＹＳ５ゲノムまたはＲＧＸ－ＤＹＳ３ゲノムを含むＡＡＶ８と比較して、ｍｄｘマウスの骨格筋でより高いマイクロジストロフィンレベルを産生することができる。本試験では、マイクロジストロフィンの安定性は、Ｈａｌｏ－ＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＨａｌｏ－ＲＧＸ－ＤＹＳ３融合タンパク質をコードするプラスミドを用いたマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞のトランスフェクション、続いて蛍光パルスチェイス試験によって探究された。動態イメージング及び自動イメージング分析を用いて、Ｈａｌｏ－μＤｙｓ融合タンパク質蛍光シグナルの経時的な減衰を追跡して半減期を計算した。ＨａｌｏＴａｇ技術は、ＨａｌｏＴａｇ融合タンパク質が、蛍光基を有することができる特定の低分子リガンドに共有結合することを可能にする。したがって、特異的に標識されたＨａｌｏＴａｇ融合タンパク質は、細胞内で検出することができ、全細胞イメージングまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるタンパク質バンドのいずれかの蛍光定量によってインビトロで観察することができる。この方法は、その後、過剰な非蛍光リガンドで遮断することによって、パルスチェイス技術に適合させた。簡単に説明すると、タンパク質をＪａｎｅｌｉａＦｌｕｏｒ５４９ Ｈａｌｏｔａｇリガンドによって標識し、次いで、過剰な非蛍光競合リガンドによって遮断した。動態イメージングは、指数関数的減衰によってモデル化され、半減期（ｔ１／２）によって表された（図３７Ａ）。蛍光ゲルイメージングも、時点間の減衰を比較し、半減期（ｔ１／２）を計算することによってモデル化した（図３７Ｂ）。
結果は、Ｈａｌｏ－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の半減期が、Ｈａｌｏ－ＲＧＸ－ＤＹＳ３より１．８倍長く、マイクロジストロフィン安定性（パルスチェイス）に対するＣＴの寄与を示した。タンパク質ゲル蛍光によって測定した場合、Ｈａｌｏ－ＲＧＸ－ＤＹＳ１の半減期決定は、Ｈａｌｏ－ＲＧＸ－ＤＹＳ３の半減期の３倍だった。
並行して、シクロヘキシミドチェイスを使用して、ＣＴの異なる長さを有するマイクロジストロフィンタンパク質の転換率を決定した。改変ＨＥＫ２９３細胞は、ＲＧＸ－ＤＹＳ１（μＤｙｓ－ＣＴ１９４）、ＲＧＸ－ＤＹＳ５（μＤｙｓ－ＣＴ１４０）、及びＲＧＸ－ＤＹＳ３（μＤｙｓ－ＣＴ４８）をコードするプラスミドでトランスフェクトし、シクロヘキシミドで翻訳を停止し、様々な時点でマイクロジストロフィンレベルを、抗ジストロフィン抗体ベースのフローサイトメトリックアッセイを使用して測定した。正規化した強度を時間の関数としてプロットし、データを指数関数的減衰曲線にフィッティングさせて、半減期を計算した（図３７Ｃ）。
シクロヘキシミド－チェイスアッセイによって測定されたとき、ＲＧＸ－ＤＹＳ１によってコードされたマイクロジストロフィンの半減期は、ＲＧＸ－ＤＹＳ５によってコードされたマイクロジストロフィンよりも１．５倍長く、ＨＥＫ２９３細胞においてＲＧＸ－ＤＹＳ３によってコードされたマイクロジストロフィンよりも２．１倍長いことが測定された（図３８Ｃ）。タンパク質の安定性に影響を及ぼす因子を解読するために、ＢＶ／Ｓｆ９発現系からＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ３によってコードされた精製した組換えタンパク質を、融解温度測定のための示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）及びプロテアーゼ耐性検査におけるプロテアーゼＫ消化の連続希釈によってさらに特性評価した。データは、融解温度及びプロテアーゼ耐性が、ＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ３によってコードされた精製したマイクロジストロフィンについて同一であったことを示した。これは、ＲＧＸ－ＤＹＳ１（μＤｙｓ－ＣＴ１９４）によってコードされるマイクロジストロフィンにおけるより長いＣＴドメインによって得られる増加した安定性が、ＣＴドメインで組み立てられることが知られているジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーなどの細胞パートナーとの相互作用を介して生じることができることを示す。かかる相互作用は、融解温度及びプロテアーゼ耐性測定において精製したμＤｙｓタンパク質のみを含む試験管内では失われた。
結論として、マイクロジストロフィンタンパク質の半減期が、ＨａｌｏＴａｇ動態イメージング及びシクロヘキシミドチェイスフローサイトメトリーを使用して、蛍光パルスチェイスによって細胞培養で測定された。データは、マイクロジストロフィンにおける伸長したＣＴドメインがタンパク質半減期を約２倍増加させることができ、これら新規マイクロジストロフィンタンパク質の治療上の利益を改善することができることを示す。
６．１３ 実施例１２：ジストロフィン及びマイクロジストロフィンの定量のためのキャピラリベースのウェスタン方法
ＲＧＸ－ＤＹＳ１遺伝子療法の臨床評価を支援するために、キャピラリベースのウェスタンイムノアッセイ法によるジストロフィン（Ｄｙｓ）及びマイクロジストロフィン（μＤｙｓ）の定量方法が開発されている。
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１は、最適化されたヒトマイクロジストロフィン導入遺伝子及び筋肉における発現を増加させるように設計されたプロモーター（ＳＰｃ５－１２）を有する、血清型８（ＡＡＶ８）の組換えアデノ随伴ウイルスである。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与された対象における骨格筋及び心筋中のμＤｙｓレベルの定量は、遺伝子療法の治療効果を理解するための重要な要因である。
ＪＥＳＳ自動化（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅによる）を利用するキャピラリベースのウェスタン方法が、様々な種からの組織溶解物中の広い校正範囲にわたるμＤｙｓ及びＤｙｓの両方を定量するように開発及び検証された。自動化されたＪＥＳＳシステムは、迅速なランタイム、ブロッティングなし、負荷対照のための多重化、ならびに非常に少量の試料（１００倍少ない）及び抗体（５００倍少ない）の使用などの従来のウェスタンブロットを超える利点を提供する。
組換えμＤｙｓタンパク質（ＲＧＸ－ＤＹＳ１）を哺乳動物細胞において生成し、ＲＧＸ－ＤＹＳ１導入遺伝子産物の直接定量を可能にする参照標準として単離した。μＤｙｓタンパク質における校正曲線範囲は、サル方法で４．０～２００ｎｇ／ｍｇ、マウス方法で５．０～１６０ｎｇ／ｍｇだった。方法は、ＦＤＡによる生物分析的方法の検証（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）ガイダンスに概説された原則に従って、マウス及びサルの組織で検証された。サル組織方法の感度は、±３０％以内の全精度及び正確度で、４．０ｎｇ／ｍｇ（全組織溶解物）のμＤｙｓであることが実証され、マウス組織方法は、±２０％以内の精度及び正確度で、５．０ｎｇ／ｍｇ（全組織溶解物）のμＤｙｓであることが実証された。サル組織におけるジストロフィン検出の特異性はまた、様々な市販の抗体によって確証された。全体的に、結果は、キャピラリベースのウェスタン方法が、高感度、特異的、及び堅牢であることを示す。アッセイは、実施例８に記載される試験などの様々な前臨床試験を裏付けるμＤｙｓレベルを測定するために成功裏に使用されている。簡潔に説明すると、マウス筋肉組織溶解物試料は、凍結組織をいくつかの片（各々約２０～３０ｍｇ）に切断し、それらを溶解緩衝液とともにビーズベースの組織ホモジナイザーに配置することによって調製した。組織溶解物の総タンパク質濃度を測定した。次いで、既知の量の組換えμＤｙｓをナイーブマウス組織溶解物に添加する。定義した量の総タンパク質を、ＪＥＳＳ装置を使用してキャピラリ内でサイズ分離し、続いて、Ｄｙｓに対して特異的な一次マウスモノクローナル抗体（ＮＣＬ－ＤＹＳＢ）（及びμＤｙｓも認識する）及びアルファ－アクチニンに対して特異的なウサギポリクローナル抗体（ロード対照）とともにインキュベートする。次いで、二次抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体及び抗ウサギ－ＮＩＲ（近赤外線）抗体を添加し、最終的に、ルミノール／ペルオキシダーゼを特異的複合体の検出のために添加した。生成されたシグナル（化学発光［ＨＲＰ］及び蛍光［ＮＩＲ］）を複数の曝露時間で検出し、Ｃｏｍｐａｓｓソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）によって自動的に定量した。化学発光及びＮＩＲシグナルは、電気泳動図として、または仮想ウェスタンブロット様画像として表示された。電気泳動図は、キャピラリの長さに沿って検出された強度（秒当たり）、ならびに試料中に存在する特定の分析物（Ｄｙｓ、μＤｙｓ、及びアルファ－アクチニン）の量に直接比例する、曲線下面積（ＡＵＣ）（Ｃｏｍｐａｓｓ）の計算によって定量された自動検出されたピークを表示する。次いで、正規化した値またはμＤｙｓ ＡＵＣデータを、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（バージョン７．０）で、１／Ｙ＾２の加重関数を有する４－ＰＬ曲線フィッティングで分析した。最終濃度は、図３６のように、μＤｙｓをｎｇ／ｍｇ（全組織溶解物タンパク質の濃度）（ｎｇ／ｍｇタンパク質）で報告した。
参考文献
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Ｌｉ Ｘ，Ｅａｓｔｍａｎ ＥＭ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＲＪ，Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉ Ｒ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｕｓｃｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｅｘｃｅｅｄｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９；１７（３）：２４１－２４５．ｄｏｉ：１０．１０３８／６９８１
Ｌｉｍ ＫＲ，Ｍａｒｕｙａｍａ Ｒ，Ｙｏｋｏｔａ Ｔ．Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ．２０１７；１１：５３３－５４５．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１７ Ｆｅｂ ２８．ｄｏｉ：１０．２１４７／ＤＤＤＴ．Ｓ９７６３５
Ｌｉｎ Ｂ，Ｌｉ Ｙ，Ｈａｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｉｌａｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｕｓｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ．２０１５；８（５）：４５７－４６６．ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｍｍ．０１９５０５
Ｍａｈ ＪＫ，Ｋｏｒｎｇｕｔ Ｌ，Ｄｙｋｅｍａｎ Ｊ，Ｄａｙ Ｌ，Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ Ｔ，Ｊｅｔｔｅ Ｎ．Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ａｎｄ Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ．２０１４；２４（６）：４８２－４９１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｍｄ．２０１４．０３．００８
Ｍａｎｎｏ ＣＳ，Ｐｉｅｒｃｅ ＧＦ，Ａｒｒｕｄａ ＶＲ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｉｎ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ｂｙ ＡＡＶ－Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｉｍｐｏｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ａｐｐｅａｒｓ ｉｎ Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００６ Ｍａｙ；１２（５）：５９２．Ｒａｓｋｏ，Ｊｏｈｎ［ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｔｏ Ｒａｓｋｏ，Ｊｏｈｎ ＪＥ］； Ｒｕｓｔａｇｉ，Ｐｒａｄｉｐ Ｋ［ａｄｄｅｄ］］．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００６；１２（３）：３４２－３４７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ１３５８
Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＤＪ，Ｊａｍｅｓ ＫＡ，Ｍｉｌｌｅｒ ＬＡ，ｅｔ ａｌ．Ｕｓｅ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ ｉｎ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｃｏｈｏｒｔ ｏｆ ｂｏｙｓ ｗｉｔｈ ｄｕｃｈｅｎｎｅ ａｎｄ ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１０；２５（１１）：１３１９－１３２４．ｄｏｉ：１０．１１７７／０８８３０７３８１０３６２７６２
Ｍａｕｒｉｓｓｅｎ ＪＰ，Ｍａｒａｂｌｅ ＢＲ，Ａｎｄｒｕｓ ＡＫ，Ｓｔｅｂｂｉｎｓ ＫＥ．Ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｇｒｉｐ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌ Ｔｅｒａｔｏｌ．２００３；２５（５）：５４３－５５３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０８９２－０３６２（０３）０００７３－４
ＭｃＤｏｎａｌｄ ＣＭ，Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ ＥＫ，Ａｂｒｅｓｃｈ ＲＴ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ，ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１８；３９１（１０１１９）：４５１－４６１．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（１７）３２１６０－８
ＭｃＤｏｎａｌｄ ＣＭ，Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ ＥＫ，Ａｂｒｅｓｃｈ ＲＴ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｒｏｕｐ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｓｔｕｄｙ－－ａ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｔｈｅｒａｐｙ：ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｕｓｅｄ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ．２０１３；４８（１）：３２－５４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｕｓ．２３８０７
Ｍｅｙｅｒ ＯＡ，Ｔｉｌｓｏｎ ＨＡ，Ｂｙｒｄ ＷＣ，Ｒｉｌｅｙ ＭＴ．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｏｕｔｉｎｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｆｏｒｅ－ａｎｄ ｈｉｎｄｌｉｍｂ ｇｒｉｐ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｏｆ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ．Ｎｅｕｒｏｂｅｈａｖ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９７９；１（３）：２３３－２３６．
Ｍｏｅｎｓ Ｐ，Ｂａａｔｓｅｎ ＰＨ，Ｍａｒｅｃｈａｌ Ｇ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＥＤＬ ｍｕｓｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｍｄｘ ｍｉｃｅ ｔｏ ｄａｍａｇｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒｅｔｃｈ．Ｊ Ｍｕｓｃｌｅ Ｒｅｓ Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌ．１９９３ Ａｕｇ；１４（４）：４４６－５１．ｄｏｉ：１０．１００７／ＢＦ００１２１２９６．ＰＭＩＤ：７６９３７４７．
Ｍｏｏｒｗｏｏｄ Ｃ，Ｌｉｕ Ｍ，Ｔｉａｎ Ｚ，Ｂａｒｔｏｎ ＥＲ．Ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｅｃｃｅｎｔｒｉｃ ｆｏｒｃｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１３；（７１）：ｅ５００３６．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１３ Ｊａｎ ３１．ｄｏｉ：１０．３７９１／５００３６
Ｍｕｎｔｏｎｉ Ｆ，Ｄｏｍｉｎｇｏｓ Ｊ，Ｍａｎｚｕｒ ＡＹ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｔｅｇｏｒｉｓｉｎｇ ｔｒａｊｅｃｔｏｒｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｉｔｅｍ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１９；１４（９）：ｅ０２２１０９７．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１９ Ｓｅｐ ３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０２２１０９７
Ｎａｇａｒａｊｕ Ｋ，Ｗｉｌｌｍａｎｎ Ｒ； ＴＲＥＡＴ－ＮＭＤ Ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎｄ ｔｈｅ Ｗｅｌｌｓｔｏｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｃａｎｉｎｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ＤＭＤ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｗｏ ｅｘｐｅｒｔ ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ ｏｎ ”Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ”：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２７ｔｈ－２８ｔｈ ２００７ ａｎｄ Ｚｕｒｉｃｈ，Ｊｕｎｅ ３０ｔｈ－Ｊｕｌｙ １ｓｔ ２００８．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ．２００９；１９（７）：５０２－５０６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｍｄ．２００９．０５．００３
Ｏｚａｗａ Ｅ，Ｈａｇｉｗａｒａ Ｙ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍ．Ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９；１９０（１－２）：１４３－１５１．
Ｐｒａｔｔ ＳＪＰ，Ｘｕ Ｓ，Ｍｕｌｌｉｎｓ ＲＪ，Ｌｏｖｅｒｉｎｇ ＲＭ．Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ．ＢＭＣ Ｒｅｓ Ｎｏｔｅｓ．２０１３；６：２６２．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１３ Ｊｕｌ ９．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５６－０５００－６－２６２
Ｐｒｅｉｓｉｇ ＤＦ，Ｋｕｌｉｃ Ｌ，Ｋｒｕｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ ｖｉｄｅｏ ｇａｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２０１６；３１１：３４０－３５３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒ．２０１６．０４．０４４
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｍ，Ｅｃｈｉｇｏｙａ Ｙ，Ｆｕｋａｄａ ＳＩ，Ｙｏｋｏｔａ Ｔ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌｓ Ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓ．２０１６；３（１）：２９－４８．ｄｏｉ：１０．３２３３／ＪＮＤ－１５０１１３
Ｒｏｐａｒｓ Ｊ，Ｇｒａｖｏｔ Ｆ，Ｂｅｎ Ｓａｌｅｍ Ｄ，Ｒｏｕｓｓｅａｕ Ｆ，Ｂｒｏｃｈａｒｄ Ｓ，Ｐｏｎｓ Ｃ．Ｍｕｓｃｌｅ ＭＲＩ：Ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ？Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０２０；９４（３）：１１７－１３３．ｄｏｉ：１０．１２１２／ＷＮＬ．００００００００００００８８１１
Ｓａｄｏｕｌｅｔ－Ｐｕｃｃｉｏ ＨＭ，Ｒａｊａｌａ Ｍ，Ｋｕｎｋｅｌ ＬＭ．Ｄｙｓｔｒｏｂｒｅｖｉｎ ａｎｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｍｏｔｉｆｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９７；９４（２３）：１２４１３－１２４１８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．９４．２３．１２４１３
Ｓａｎｃａｒ Ｆ，Ｔｏｕｒｏｕｔｉｎｅ Ｄ，Ｇａｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｍｕｓｃｌｅ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｃａ（２＋）－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋ（＋）（ＢＫ）ｃｈａｎｎｅｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６（３８）：３３５０１－３３５１０．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１１．２２７６７８
Ｓｃａｌｌａｎ ＣＤ，Ｊｉａｎｇ Ｈ，Ｌｉｕ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ ｌｏｗ ＡＡＶ２ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｔｉｔｅｒｓ ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ．Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７（５）：１８１０－１８１７．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００５－０８－３２２９
Ｓｉｃｉｎｓｋｉ Ｐ，Ｇｅｎｇ Ｙ，Ｒｙｄｅｒ－Ｃｏｏｋ ＡＳ，Ｂａｒｎａｒｄ ＥＡ，Ｄａｒｌｉｓｏｎ ＭＧ，Ｂａｒｎａｒｄ ＰＪ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ：ａ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８９；２４４（４９１２）：１５７８－１５８０．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．２６６２４０４
Ｓｍｉｔｈ ＪＰ，Ｈｉｃｋｓ ＰＳ，Ｏｒｔｉｚ ＬＲ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＭＪ，Ｍａｎｄｌｅｒ ＲＮ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９５；６２（１－２）：１５－１９．ｄｏｉ：１０．１０１６／０１６５－０２７０（９５）０００４９－６
Ｔｕｒｋ Ｒ，Ｓｔｅｒｒｅｎｂｕｒｇ Ｅ，ｄｅ Ｍｅｉｊｅｒ ＥＪ，ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ ＧＪ，ｄｅｎ Ｄｕｎｎｅｎ ＪＴ，’ｔ Ｈｏｅｎ ＰＡ．Ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｄｘ ｍｉｃｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００５；６：９８．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２００５ Ｊｕｌ １３．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１６４－６－９８
Ｕａｅｓｏｏｎｔｒａｃｈｏｏｎ Ｋ，Ｓｒｉｎｉｖａｓｓａｎｅ Ｓ，Ｗａｒｆｏｒｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ａｓ ａ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｉｏｍａｒｋ Ｍｅｄ．２０１９；１３（１４）：１２０９－１２２５．ｄｏｉ：１０．２２１７／ｂｍｍ－２０１９－０２４２
ｖａｎ Ｗｅｓｔｅｒｉｎｇ ＴＬＥ，Ｌｏｍｏｎｏｓｏｖａ Ｙ，Ｃｏｅｎｅｎ－Ｓｔａｓｓ ＡＭＬ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｆｏｒｍ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｊ Ｃａｃｈｅｘｉａ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｍｕｓｃｌｅ．２０２０；１１（２）：５７８－５９３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｃｓｍ．１２５０６
Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ Ｃ，Ｔａｙｍａｎｓ ＪＭ，Ｃａｓｔｅｅｌｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｇａｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１０；１１：９２．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１０ Ａｕｇ ９．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２２０２－１１－９２
Ｗａｎｇ Ｂ，Ｌｉ Ｊ，Ｘｉａｏ Ｘ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０００；９７（２５）：１３７１４－１３７１９．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．２４０３３５２９７
Ｗｏｋｋｅ ＢＨ，Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｅｒｇｅｎ ＪＣ，Ｈｏｏｉｊｍａｎｓ ＭＴ，Ｖｅｒｓｃｈｕｕｒｅｎ ＪＪ，Ｎｉｋｓ ＥＨ，Ｋａｎ ＨＥ．Ｔ２ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ａｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ＤＭＤ ｂｕｔ ｎｏｔ ＢＭＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ．２０１６；５３（１）：３８－４３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｕｓ．２４６７９
Ｒｏｐａｒｓ Ｊ，Ｇｒａｖｏｔ Ｆ，Ｂｅｎ Ｓａｌｅｍ Ｄ，Ｒｏｕｓｓｅａｕ Ｆ，Ｂｒｏｃｈａｒｄ Ｓ，Ｐｏｎｓ Ｃ．Ｍｕｓｃｌｅ ＭＲＩ：Ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ？Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０２０；９４（３）：１１７－１３３．ｄｏｉ：１０．１２１２／ＷＮＬ．００００００００００００８８１１
Ｓａｄｏｕｌｅｔ－Ｐｕｃｃｉｏ ＨＭ，Ｒａｊａｌａ Ｍ，Ｋｕｎｋｅｌ ＬＭ．Ｄｙｓｔｒｏｂｒｅｖｉｎ ａｎｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｍｏｔｉｆｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９７；９４（２３）：１２４１３－１２４１８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．９４．２３．１２４１３
Ｓａｎｃａｒ Ｆ，Ｔｏｕｒｏｕｔｉｎｅ Ｄ，Ｇａｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｍｕｓｃｌｅ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｃａ（２＋）－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋ（＋）（ＢＫ）ｃｈａｎｎｅｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６（３８）：３３５０１－３３５１０．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１１．２２７６７８
Ｓｃａｌｌａｎ ＣＤ，Ｊｉａｎｇ Ｈ，Ｌｉｕ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ ｌｏｗ ＡＡＶ２ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｔｉｔｅｒｓ ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ．Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７（５）：１８１０－１８１７．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００５－０８－３２２９
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Ｔｕｒｋ Ｒ，Ｓｔｅｒｒｅｎｂｕｒｇ Ｅ，ｄｅ Ｍｅｉｊｅｒ ＥＪ，ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ ＧＪ，ｄｅｎ Ｄｕｎｎｅｎ ＪＴ，’ｔ Ｈｏｅｎ ＰＡ．Ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｄｘ ｍｉｃｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００５；６：９８．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２００５ Ｊｕｌ １３．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１６４－６－９８
Ｕａｅｓｏｏｎｔｒａｃｈｏｏｎ Ｋ，Ｓｒｉｎｉｖａｓｓａｎｅ Ｓ，Ｗａｒｆｏｒｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ａｓ ａ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｉｏｍａｒｋ Ｍｅｄ．２０１９；１３（１４）：１２０９－１２２５．ｄｏｉ：１０．２２１７／ｂｍｍ－２０１９－０２４２
ｖａｎ Ｗｅｓｔｅｒｉｎｇ ＴＬＥ，Ｌｏｍｏｎｏｓｏｖａ Ｙ，Ｃｏｅｎｅｎ－Ｓｔａｓｓ ＡＭＬ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｆｏｒｍ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｊ Ｃａｃｈｅｘｉａ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｍｕｓｃｌｅ．２０２０；１１（２）：５７８－５９３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｃｓｍ．１２５０６
Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ Ｃ，Ｔａｙｍａｎｓ ＪＭ，Ｃａｓｔｅｅｌｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｇａｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１０；１１：９２．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１０ Ａｕｇ ９．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２２０２－１１－９２
Ｗａｎｇ Ｂ，Ｌｉ Ｊ，Ｘｉａｏ Ｘ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０００；９７（２５）：１３７１４－１３７１９．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．２４０３３５２９７
Ｗｏｋｋｅ ＢＨ，Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｅｒｇｅｎ ＪＣ，Ｈｏｏｉｊｍａｎｓ ＭＴ，Ｖｅｒｓｃｈｕｕｒｅｎ ＪＪ，Ｎｉｋｓ ＥＨ，Ｋａｎ ＨＥ．Ｔ２ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ａｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ＤＭＤ ｂｕｔ ｎｏｔ ＢＭＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ．２０１６；５３（１）：３８－４３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｕｓ．２４６７９
本発明は、その具体的な実施形態を参照して詳細に説明されているが、機能的に均等である類型が本発明の範囲内であることが理解される。実際、本明細書に示す及び記載するものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。当業者は、単に慣習的な実験を使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識する、または確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本明細書で言及されている刊行物、特許及び特許出願は全て、個々の刊行物、特許または特許出願が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書における議論は、当該技術分野が直面している問題の本質をよりよく理解することを提供し、いかなる方法においても、先行技術に関する認めるものとして解釈されるべきではなく、また、本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願の「先行技術」を構成するという認めるものとして解釈されるべきではない。
本明細書で引用される特許出願及び刊行物を含む全ての参考文献は、各個々の刊行物または特許または特許出願が、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が、全ての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の多くの修正及び変形は、当業者に明らかであるように、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載の具体的な実施形態は、例としてのみ提供され、本発明は、添付の特許請求の範囲の条件、ならびにそのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲によってのみ制限されるべきである。

Claims (31)

  1. 治療を必要とする対象においてジストロフィン異常症の治療のために使用する医薬組成物であって、前記医薬組成物が、治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含み、
    前記ｒＡＡＶ粒子が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を含む人工ゲノムを含み、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、筋肉における発現を促進する調節エレメントに操作可能に連結され、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接しており、
    前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー／ｋｇの用量で静脈内または筋肉内投与される、前記医薬組成物。
  2. 前記ＣＴが、ジストロフィンのＣ末端の近位１９４個のアミノ酸、もしくは配列番号９２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２）のヒトジストロフィンアミノ酸残基３３６１～３５５４をコードするＣ末端の少なくとも近位部分、もしくはエクソン７０～７４によってコードされるＣ末端の少なくとも近位部分及びエクソン７５のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の最初の３６個のアミノ酸を含むか、またはそれらからなる、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号２０のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号７９のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号８１のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 筋肉特異的プロモーターが、ＳＰｃ５－１２またはその転写活性部分もしくは変異体である、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 前記プロモーターが、配列番号３９の核酸配列からなる、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 前記導入遺伝子が、前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列のポリアデニル化シグナル３’を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 前記人工ゲノムが、配列番号５３の核酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. 前記ジストロフィン異常症が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、またはＸ連鎖性拡張型心筋症である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. 前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で静脈内投与される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１であり、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で静脈内投与される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  15. 前記投与の１２週間後、２４週間後、１年後、または２年後までに、
    ａ．前記対象におけるクレアチンキナーゼ活性が、前記投与前のレベルと比較して、前記対象において０．５倍～１．５倍低下する、
    ｂ．前記対象の腓腹筋における病変が、前記投与前の前記腓腹筋における前記病変と比較して、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって評価されるときに３～１０％減少した、
    ｃ．前記対象の腓腹筋体積が、前記投与前の前記腓腹筋体積と比較して、２０～１００ｍｍ３減少した、
    ｄ．前記対象の腓腹筋における病変のＴ２緩和時間が、前記投与前の前記Ｔ２緩和時間と比較して、２～８ミリ秒低下した、
    ｅ．前記対象が、約－１～２の歩行スコアを示した、
    ｆ．前記対象におけるノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）スコアが、前記投与前の前記ＮＳＡＡスコアと比較して、０から１に、０から２に、もしくは１から２に増加した、
    ｇ．前記対象が、起立する、１０ｍ走行／歩行する、及び／または階段を４段上るのにかかる時間量が、少なくとも５％、１０％、２０％、もしくは３０％減少した、
    ｈ．前記対象が、前記投与前の心機能と比較して、改善した前記心機能を示した、及び／または
    ｉ．前記対象が、前記投与前の心機能と比較して、改善した肺機能を示した、請求項１～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 必要とする対象において筋肉における炎症及び／または線維症を減少させるために使用する医薬組成物であって、前記医薬組成物が、治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含み、
    前記ｒＡＡＶ粒子が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を含む人工ゲノムを含み、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、筋肉における発現を促進する調節エレメントに操作可能に連結され、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接しており、
    前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１キログラム当たり５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）の用量で静脈内または筋肉内投与され、
    前記投与が、前記対象の前記筋肉への前記マイクロジストロフィンタンパク質の送達をもたらす、前記医薬組成物。
  17. 必要とする対象において筋肉変性を減少させるために使用する医薬組成物であって、前記医薬組成物が、治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含み、
    前記ｒＡＡＶ粒子が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を含む人工ゲノムを含み、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、筋肉における発現を促進する調節エレメントに操作可能に連結され、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接しており、
    前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１キログラム当たり５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）の用量で静脈内または筋肉内投与され、
    前記投与が、前記対象の前記筋肉への前記マイクロジストロフィンタンパク質の送達をもたらす、前記医薬組成物。
  18. 必要とする対象において歩行を変化させるために使用する医薬組成物であって、前記医薬組成物が、治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子及び薬学的に許容される担体を含み、
    前記ｒＡＡＶ粒子が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を含む人工ゲノムを含み、式中、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４は、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴは、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、筋肉における発現を促進する調節エレメントに操作可能に連結され、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接しており、
    前記治療有効量のｒＡＡＶ粒子が、１キログラム当たり５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）の用量で静脈内または筋肉内投与され、
    前記対象の前記歩行が、前記投与前の前記対象の前記歩行と比較して、前記投与の１２週間後に変化する、前記医薬組成物。
  19. 必要とする対象において、ジストロフィン異常症の治療、筋肉における炎症及び／または線維症の減少、筋肉変性の減少、または歩行の変化のために使用する医薬組成物であって、前記医薬組成物が、治療有効量のｒＡＡＶ粒子及び薬学的に許容される担体を含み、
    前記ｒＡＡＶ粒子が、アミノ末端からカルボキシ末端にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴで配置されたジストロフィンドメインからなるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする導入遺伝子を含む人工ゲノムを含み、式中、ＡＢＤが、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１が、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１が、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２が、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３が、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３が、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４が、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４が、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲが、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴが、α１－シントロフィン結合部位を含むＣＴの少なくとも一部分を含み、筋肉における発現を促進する調節エレメントに操作可能に連結され、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接しており、
    前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１キログラム当たり５×１０１３～１×１０１５ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）の用量で静脈内または筋肉内投与され、
    前記投与することが、キャピラリベースのウェスタンアッセイによって決定されるとき、前記投与の１２週間後に、前記対象の筋肉組織における５０ｎｇ／ｍｇ超のマイクロジストロフィンタンパク質をもたらす、前記医薬組成物。
  20. 前記ＣＴが、ジストロフィンのＣ末端の近位１９４個のアミノ酸、もしくは配列番号９２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２）のヒトジストロフィンアミノ酸残基３３６１～３５５４をコードするＣ末端の少なくとも近位部分、もしくはエクソン７０～７４によってコードされるＣ末端の少なくとも近位部分及びエクソン７５のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の最初の３６個のアミノ酸を含むか、またはそれらからなる、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  21. 前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  22. 前記マイクロジストロフィンタンパク質が、配列番号２０の核酸配列によってコードされる、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 転写調節エレメントが、筋肉特異的プロモーターを含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 前記プロモーターが、配列番号３９の核酸配列からなる、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記人工ゲノムが、配列番号５３のヌクレオチド配列を含む、請求項１６～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  26. 前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型である、請求項１６～２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  27. 前記治療有効量の前記ｒＡＡＶ粒子が、１×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、２×１０１４ゲノムコピー／ｋｇ、または３×１０１４ゲノムコピー／ｋｇの用量で静脈内投与される、請求項１６～２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  28. 前記ＡＡＶ粒子の前記投与の前、同時、及び／または後に、前記対象に免疫抑制剤療法を予防的に投与することをさらに含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  29. 前記免疫抑制剤療法が、プレドニゾロン、エクリズマブ、もしくはシロリムス、またはそれらの組み合わせである、請求項２８に記載の医薬組成物。
  30. 治療有効量の組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）粒子、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物であって、前記ｒＡＡＶ粒子が、配列番号５３のヌクレオチド配列を含む人工ゲノムを含む組換えＡＡＶ８である、前記医薬組成物。
  31. 前記薬学的に許容される担体が、０．２ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．２ｇ／Ｌの一塩基性リン酸カリウム、１．２ｇ／Ｌの無水二塩基性リン酸ナトリウム、５．８ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、４０ｇ／Ｌのスクロース、及び０．０１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８を含むスクロース緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した改変ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
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