JP2022515338A - 遺伝子送達のための組み換えアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

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Abstract

遺伝子療法を改善するための組み換えＡＡＶベクター、ＡＡＶウイルスベクター、およびカプシドタンパク質、ならびにそれらの製造および使用のための方法が本明細書に提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／７７５，８７１号、２０１９年２月５日に出願された同第６２／８０１，１９５号、２０１９年６月１８日に出願された同第６２／８６３，１２６号、および２０１９年１０月１４日に出願された同第６２／９１４，８５６号に対する優先権を主張するものであり、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
参照による配列表の組み込み
本明細書に添えて電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＡＢＥＯ＿００２＿０４ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５、作成日：２０１９年１２月３日、ファイルサイズ：５５６ｋｂ）。
アデノ随伴ウイルスベクターは、遺伝子療法のための送達ベクターとして有望である。しかしながら、それらの治療有効性は、ベクターの送達効率または限定された組織指向性によって損なわれる。したがって、より良好な治療能力を有する新しいＡＡＶベクターに対する緊急の必要性がある。
本開示は、概して、遺伝子療法の分野に関し、具体的には、新規なカプシドタンパク質を有する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター粒子（ＡＡＶウイルスベクターとしても知られる）、その製造、および疾患または障害を処置または予防するための導入遺伝子を送達するためのその使用に関する。
ＡＩＭカプシドライブラリー構築のための戦略。 組織培養における形質導入効率の比較。ＨＥＫ２９３細胞を、ウェル当たり５０，０００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、５Ｅ＋５のＭＯＩで、ＡＡＶ９－ＧＦＰまたはＡＡＶ２１４－ＧＦＰウイルスを含有するカプシドを用いて形質導入した。画像は形質導入後４５時間に撮影された。 ２Ｅ＋１１個のＡＡＶ９またはＡＡＶ２１４ウイルスのウイルスゲノム（ｖｇ）を投与されたマウスの異なる組織における形質導入効率の比較。 ２Ｅ＋１１個のＡＡＶ９またはＡＡＶ２１４ウイルスのｖｇを投与されたマウスの脳における形質導入効率および発現レベルの比較。 ＡＡＶ投与後のマウスの網膜の走査型レーザー眼底検査撮像。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスには、網膜下（右眼）注射および硝子体内（左眼）注射の両方によって、標識されたＡＡＶ血清型が投与された。１μＬの５Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ（５Ｅ＋９ｖｇ／眼）のＡＡＶベクターを両方の投与方法で注射し、そして動物を１０日後に、ＨＲＡ２ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｌａｓｅｒ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｅ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、米国カリフォルニア州カールズバッド市）で撮像した。白内障が十分な観察を妨げた画像は図から省略した。 ＡＡＶ２０４－ＧＦＰを硝子体内投与したマウスの眼のＩＨＣ解析。 図４は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって霊長類においてＡＡＶ２０４またはＡＡＶ９形質導入によって媒介されるＧＦＰ発現を比較する。点線は、－ＲＴ平均プラス２または４標準偏差として計算されたバックグラウンドに対応する。 図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。 図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。 図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。 図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。 図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。 図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。 図６は、エクスビボで実施されたＮＨＰの眼の外植形質導入のＩＨＣ解析を示す。 中和抗体定量戦略。発光の欠如は、標的ＡＡＶが中和抗体によって結合されたことを示した。 図８は、ＡＡＶ２０４およびＡＡＶ９の異なる免疫原性を実証する。中和抗体価は、社内で開発されたプロセスを使用して得られた。ＡＡＶ９－ＬｕｃまたはｐＡ－ＡＡＶ２０４－Ｌｕｃのいずれかを、２５，０００のＭＯＩで様々な希釈の血清と共にインキュベートした。インキュベーションの後、ウイルス／血清混合物を、２０，０００個のＬｅｃ２細胞を含有するウェルに移し、そして細胞と共に２４時間インキュベートし、その後、発光を測定し、同じＭＯＩでウイルスのみで形質導入された細胞からの対照値と比較した。 図９は、気管内送達を介したＡＡＶ２０４またはＡＡＶ６（ＡＡＶ肺形質導入のベンチマーク）を使用した肺形質導入の比較を示す。 図１０Ａ～図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲアッセイ（図１０Ａ）および用量応答（図１０Ｂ）による、ＡＡＶ２０４を充填したＣＦＴＲΔＲ発現カセット処置に対する、ＣＦＴＲΔＲおよび完全長発現カセットの機能性を示す。図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲによってアッセイされた膜電位に関して、ＣＦＴＲΔＲ対完全長コドン最適化ＣＦＴＲ発現の比較を示す。タンパク質を発現するＡＡＶ２０４を用いて２９３個の細胞を形質導入し、蛍光の変化をモニターした。ベースラインを１分間読み取り、次いで５０μＭのフォルスコリンを細胞に添加した。 図１０Ａ～図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲアッセイ（図１０Ａ）および用量応答（図１０Ｂ）による、ＡＡＶ２０４を充填したＣＦＴＲΔＲ発現カセット処置に対する、ＣＦＴＲΔＲおよび完全長発現カセットの機能性を示す。図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲによってアッセイされた膜電位に関して、ＣＦＴＲΔＲ対完全長コドン最適化ＣＦＴＲ発現の比較を示す。タンパク質を発現するＡＡＶ２０４を用いて２９３個の細胞を形質導入し、蛍光の変化をモニターした。ベースラインを１分間読み取り、次いで５０μＭのフォルスコリンを細胞に添加した。 図１０Ａ～図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲアッセイ（図１０Ａ）および用量応答（図１０Ｂ）による、ＡＡＶ２０４を充填したＣＦＴＲΔＲ発現カセット処置に対する、ＣＦＴＲΔＲおよび完全長発現カセットの機能性を示す。図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲによってアッセイされた膜電位に関して、ＣＦＴＲΔＲ対完全長コドン最適化ＣＦＴＲ発現の比較を示す。タンパク質を発現するＡＡＶ２０４を用いて２９３個の細胞を形質導入し、蛍光の変化をモニターした。ベースラインを１分間読み取り、次いで５０μＭのフォルスコリンを細胞に添加した。 図１１Ａ～図１１Ｃは、ＡＡＶ２０４の培養したＣＦ患者の細胞を形質導入する能力（図１１Ａ）、ＣＦＴＲΔＲ発現、および細胞膜における適切な局在化（図１１Ｂ）、およびヒトＣＦ患者の細胞におけるＣＦＴＲ電流を回復させるＣＦＴＲΔＲの発現（図１１Ｃ）を示す。 図１１Ａ～図１１Ｃは、ＡＡＶ２０４の培養したＣＦ患者の細胞を形質導入する能力（図１１Ａ）、ＣＦＴＲΔＲ発現、および細胞膜における適切な局在化（図１１Ｂ）、およびヒトＣＦ患者の細胞におけるＣＦＴＲ電流を回復させるＣＦＴＲΔＲの発現（図１１Ｃ）を示す。 図１１Ａ～図１１Ｃは、ＡＡＶ２０４の培養したＣＦ患者の細胞を形質導入する能力（図１１Ａ）、ＣＦＴＲΔＲ発現、および細胞膜における適切な局在化（図１１Ｂ）、およびヒトＣＦ患者の細胞におけるＣＦＴＲ電流を回復させるＣＦＴＲΔＲの発現（図１１Ｃ）を示す。 図１２Ａは、嚢胞性線維症のマウスモデルに対して、ＣＦＴＲ導入遺伝子を含むＡＡＶ２０４粒子を鼻に投与することのインビボ効果を示す。 図１２Ｂは、異なるＣＦ患者の細胞におけるＡＡＶ２０４／ＣＦＴＲΔＲ処置（鼻の膜電位の増加による）治療の効果を示す。 図１３は、ウイルス粒子の静脈内投与の３０日後のＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスモデルにおけるＡＡＶ９－ＣＬＮ３ベクターおよびＡＡＶ２１４－ＣＬＮ３ベクターの生体内分布を示す。 図１４は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウス脳組織におけるＡＡＶ９－ＣＬＮ３ベクターおよびＡＡＶ２１４－ＣＬＮ３ベクターの発現を示す。 図１５は、形質導入されたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＬＡ発現の免疫ブロットを示す。 図１６は、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血漿、脳、肝臓、脊髄、心臓、腎臓、および眼のＧＬＡの酵素活性（超生理学的な）を示す。 図１７は、静脈内注射によるＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける脳、二頭筋、横隔膜、および肝臓におけるＧＡＡの酵素活性を示す。 図１８Ａ～図１８Ｂは、トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞内で発現された組み換えｈＧＡＡの免疫ブロット解析（図１８Ａ）および酵素解析（図１８Ｂ）を示す。 図１８Ａ～図１８Ｂは、トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞内で発現された組み換えｈＧＡＡの免疫ブロット解析（図１８Ａ）および酵素解析（図１８Ｂ）を示す。 図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。 図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。 図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。 図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。 図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。 図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。 図２０は、ＡＡＶ２０４（配列番号２）およびＡＡＶ６（配列番号６３）からのＶＰ１アミノ酸配列のアライメントを示す。 図２０は、ＡＡＶ２０４（配列番号２）およびＡＡＶ６（配列番号６３）からのＶＰ１アミノ酸配列のアライメントを示す。 図２１は、ＡＡＶ２１４（配列番号３）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３０）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８４）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３１）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３２）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３３）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号３４）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号４９）、ＡＡＶ９（配列番号７１）、およびＡＡＶ８（配列番号６７）からのＶＰ１タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。 図２１は、ＡＡＶ２１４（配列番号３）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３０）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８４）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３１）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３２）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３３）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号３４）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号４９）、ＡＡＶ９（配列番号７１）、およびＡＡＶ８（配列番号６７）からのＶＰ１タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。 図２１は、ＡＡＶ２１４（配列番号３）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３０）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８４）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３１）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３２）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３３）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号３４）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号４９）、ＡＡＶ９（配列番号７１）、およびＡＡＶ８（配列番号６７）からのＶＰ１タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。 図２２は、ＡＡＶ２１４（配列番号３５）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３６）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８５）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３７）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３８）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３９）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４０）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５０）、ＡＡＶ９（配列番号７２）、およびＡＡＶ８（配列番号６８）からのＶＰ２タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。 図２２は、ＡＡＶ２１４（配列番号３５）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３６）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８５）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３７）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３８）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３９）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４０）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５０）、ＡＡＶ９（配列番号７２）、およびＡＡＶ８（配列番号６８）からのＶＰ２タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。 図２２は、ＡＡＶ２１４（配列番号３５）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３６）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８５）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３７）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３８）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３９）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４０）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５０）、ＡＡＶ９（配列番号７２）、およびＡＡＶ８（配列番号６８）からのＶＰ２タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。 図２３は、ＡＡＶ２１４（配列番号４１）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号４２）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８６）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号４３）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号４４）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号４５）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４６）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５１）、ＡＡＶ９（配列番号７３）、およびＡＡＶ８（配列番号６９）からのＶＰ３タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。 図２３は、ＡＡＶ２１４（配列番号４１）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号４２）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８６）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号４３）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号４４）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号４５）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４６）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５１）、ＡＡＶ９（配列番号７３）、およびＡＡＶ８（配列番号６９）からのＶＰ３タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。 図２３は、ＡＡＶ２１４（配列番号４１）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号４２）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８６）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号４３）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号４４）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号４５）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４６）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５１）、ＡＡＶ９（配列番号７３）、およびＡＡＶ８（配列番号６９）からのＶＰ３タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。 図２４Ａは、筋肉内投与後の筋肉におけるＡＡＶ１１０ベクター粒子およびＡＡＶ９ベクター粒子によって送達されるＧＦＰ導入遺伝子の発現を示す。上のパネルは、白色の光で左右の脚を示し、全体的な組織構造を示している。下のパネルはＧＦＰ蛍光を示す。 図２４Ｂは、ＡＡＶ１１０粒子（ＩＴＣｏｒｄ１．１０）について、ＡＡＶ９と比較して、図２４Ａで得られた蛍光の定量的解析を提供する。 図２５Ａ～図２５Ｃは、筋肉内投与後にＡＡＶ１１０粒子（ＩＴＣｏｒｄ１．１０）によって送達される導入遺伝子の発現をＡＡＶ９に対して図示する。データは、筋肉におけるＡＡＶ１１０の発現が特に高いことを示す。 図２５Ａ～図２５Ｃは、筋肉内投与後にＡＡＶ１１０粒子（ＩＴＣｏｒｄ１．１０）によって送達される導入遺伝子の発現をＡＡＶ９に対して図示する。データは、筋肉におけるＡＡＶ１１０の発現が特に高いことを示す。 図２５Ａ～図２５Ｃは、筋肉内投与後にＡＡＶ１１０粒子（ＩＴＣｏｒｄ１．１０）によって送達される導入遺伝子の発現をＡＡＶ９に対して図示する。データは、筋肉におけるＡＡＶ１１０の発現が特に高いことを示す。 図２６Ａは、ＧＦＰを発現するＡＡＶ１１０およびＡＡＶ９粒子の筋肉内投与後のＧＦＰ発現を検出するための筋組織の免疫組織化学を示す。図は、ＡＡＶ９ベクター粒子（左下パネル）から発現されたＧＦＰ、ＡＡＶ１１０粒子（右下パネル）から発現されたＧＦＰ、および対照筋肉（上パネル）を示す。組織を抗ＧＦＰ抗体で染色した。 ＩＭ送達されたＡＡＶ２１４は、ＡＡＶ９より大きい筋肉面積を形質導入する。ラットの筋肉（大腿二頭筋）全体を、ＩＭ注射の１０日後に免疫組織化学によりＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ発現について解析した。固定凍結切片をＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ ｐＡｂでプローブした。ＡＡＶ２１４は、注射部位と一致する筋肉の上部部分にほぼ限定されたＡＡＶ９と比較して、著しくより大きい形質導入区域を示す。 図２７は、導入遺伝子として発現され、かつルシフェリンに曝露されたルシフェラーゼを示す生物発光画像を示す。データは、ＡＡＶ２１４投与の２８日後に得られた。 図２８は、ＡＡＶ２１４およびＡＡＶ９で静脈内に送達されたＳＭＮ－１タンパク質の筋肉発現を比較する。 図２９は、ＡＡＶ２１４対ＡＡＶ９のバリアントによって媒介される導入遺伝子としての心臓および二頭筋におけるＧＦＰの発現を示す。ｙ軸は、ゲノムＤＮＡのマイクログラム当たりのウイルスコピー数のｌｏｇ１０値を示す。 図３０は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の線図を示す。ＶＰ１特異的部分およびＶＰ２特異的部分は、ＶＰ３部分と共に示されており、これは産生されたＶＰ３タンパク質と同一である。ＡＡＶ２１４ ＶＰ３（配列番号４１）のアミノ酸配列が示され、また可変領域Ｉ－ＩＸが示されている。ＡＡＶ２１４に対する完全なＶＰ１タンパク質アミノ酸配列は、配列番号３として提供される。 図３１Ａ～図３１Ｃは、ＡＡＶ９中和抗体の生成の減少を実証する、ＡＡＶ２１４で処置された動物を図示する。図３１Ａは、ＡＡＶ９に対する中和抗体についてアッセイされた、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２１４のいずれかをＩＭによって投与された動物を示す。動物血清の、許容細胞型Ｌｅｃ２へのＡＡＶ９ルシフェラーゼベクターの形質導入を阻害する能力を測定することによって解析を実施した。形質導入の３日後、ルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした。各群は、対照、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２１４のいずれかに対して２匹または３匹のラットから成る。図３１Ｂおよび図３１Ｃは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ２０４に対する交差反応性を示す。図３１Ｂは、ＡＡＶ９チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。図３１Ｃは、ＡＡＶ２０４チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。 図３１Ａ～図３１Ｃは、ＡＡＶ９中和抗体の生成の減少を実証する、ＡＡＶ２１４で処置された動物を図示する。図３１Ａは、ＡＡＶ９に対する中和抗体についてアッセイされた、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２１４のいずれかをＩＭによって投与された動物を示す。動物血清の、許容細胞型Ｌｅｃ２へのＡＡＶ９ルシフェラーゼベクターの形質導入を阻害する能力を測定することによって解析を実施した。形質導入の３日後、ルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした。各群は、対照、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２１４のいずれかに対して２匹または３匹のラットから成る。図３１Ｂおよび図３１Ｃは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ２０４に対する交差反応性を示す。図３１Ｂは、ＡＡＶ９チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。図３１Ｃは、ＡＡＶ２０４チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。 図３１Ａ～図３１Ｃは、ＡＡＶ９中和抗体の生成の減少を実証する、ＡＡＶ２１４で処置された動物を図示する。図３１Ａは、ＡＡＶ９に対する中和抗体についてアッセイされた、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２１４のいずれかをＩＭによって投与された動物を示す。動物血清の、許容細胞型Ｌｅｃ２へのＡＡＶ９ルシフェラーゼベクターの形質導入を阻害する能力を測定することによって解析を実施した。形質導入の３日後、ルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした。各群は、対照、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２１４のいずれかに対して２匹または３匹のラットから成る。図３１Ｂおよび図３１Ｃは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ２０４に対する交差反応性を示す。図３１Ｂは、ＡＡＶ９チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。図３１Ｃは、ＡＡＶ２０４チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。
本開示による一部の実施形態は、以下により完全に記述される。しかしながら、本開示の態様は、異なる形態で具体化されてもよく、また本明細書に記載する実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完璧かつ完全であるように提供され、また本発明の範囲を当業者に完全に伝達することになる。本明細書の記述で使用される用語は、特定の実施形態の記述の目的のみのものであり、限定することを意図しない。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術的用語および科学的用語を含む）は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書に定義される用語などの用語は、本出願および関連技術の文脈においてその意味と一致する意味を有するものとして解釈されるべきであり、また本明細書に明示的に定義されない限り、理想化された意味または過度に形式的な意味で解釈されるべきでないことがさらに理解されるであろう。
文脈で別途示されない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴を任意の組み合わせで使用することができることが具体的に意図される。さらに、本開示はまた、実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略することができることも企図する。例証するために、本明細書が、複合体が構成成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと記載する場合、Ａ、Ｂ、もしくはＣ、またはそれらの組み合わせのいずれかを省略し、かつ単独でまたは任意の組み合わせで放棄することができることが具体的に意図される。
別段の明示的な指示がない限り、指定された一部の実施形態、特徴、および用語はすべて、列挙された実施形態、特徴、または用語、ならびにその生物学的同等物の両方を含むことを意図する。
参照による組み込み
本明細書に引用されるすべての参考文献、記事、刊行物、特許、特許刊行物、および特許出願は、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許刊行物、および特許出願に言及することは、世界中の任意の国で、有効な先行技術を構成する、または共通の一般知識の一部を形成するという承認または任意の形態の示唆として解釈するべきではない。
定義
本技術の実践は、別段の指示がない限り、当技術分野の技術範囲内の、有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組み換えＤＮＡの従来の技法を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ． （１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、およびＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＲＩ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照のこと。
本発明の記述および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段の指示を明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図する。本明細書で使用される場合、「本質的に～から成る」（および文法的変形）という移行句は、列挙された材料または工程、および列挙された実施形態の基本的な特徴および新規の特徴（複数可）に実質的に影響を与えないものを包含するものとして解釈されるべきである。それ故に、本明細書で使用される場合、「本質的に～から成る」という用語は、「含む」と同等のものとして解釈されるべきではない。「から成る」とは、微量元素より多い他の成分を排除すること、および本明細書に開示される組成物を投与するための実質的な方法工程を意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される態様は、本開示の範囲内である。
範囲を含むすべての数字表示（例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量など）は、１．０または０．１の増分で、適宜に、または代替的に、＋／－１５％、１０％、５％、２％の変動だけ、（＋）または（－）に変化する近似である。必ずしも明示的に記載されるわけではないが、すべての数字表示は、用語「約」が先行することが理解されるべきである。また、必ずしも明示的には記載されないが、本明細書に記載される試薬は単に例示的であり、またそのようなものと同等のものが当技術分野で公知であることも、理解されるべきである。量または濃度およびこれに類するものなどの測定可能な値を指すとき、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書に開示される任意の構成要素、範囲、用量形態等の選択を記述するために使用されるとき、「許容可能な」、「有効な」、または「十分な」という用語は、当該構成要素、範囲、用量形態等が開示される目的のために適切であることを意図する。
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうちの一つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせだけでなく、代替物（「または」）で解釈される場合、組み合わせの欠如を指し、かつ包含する。
具体的に列挙されない限り、「宿主細胞」という用語は、例えば、真菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞を含む真核宿主細胞を含む。真核宿主細胞の非限定的な例としては、サル、ウシ、ブタ、ネズミ、ラット、鳥類、爬虫類、およびヒト、例えば、ＨＥＫ２９３細胞および２９３Ｔ細胞が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、他の材料から実質的に遊離している分子もしくは生物学的物質または細胞物質を指す。
本明細書で使用される場合、「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために同じ意味で使用される。それ故に、この用語は、単鎖、二重鎖、または多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基およびピリミジン塩基もしくは他の天然塩基、化学的もしくは生化学的に修飾された塩基、非天然塩基、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成るポリマーを含むが、これらに限定されない。
「遺伝子」は、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードする能力を有する少なくとも一つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」、または代替的に、「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写されかつ翻訳されたときに生成されるアミノ酸配列（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される二工程プロセスおよび／または転写ｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。
「転写制御下」は、当技術分野でよく理解されている用語であり、かつポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与する、または転写を促進する要素に動作可能に連結していることに依存することを示す。「動作可能に連結された」は、ポリヌクレオチドが細胞内で機能することを可能にする様態で配設されることを意図する。一態様では、本発明は、下流配列に動作可能に連結されたプロモーターを提供する。
ポリヌクレオチドに適用される場合、「コードする」という用語は、その天然状態で、または当業者に周知の方法によって操作されたときに、ポリペプチドおよび／またはその断片に対するｍＲＮＡを産生するために転写することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、こうした核酸の補体であり、またコード化配列は、そこから推測することができる。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子または導入遺伝子などのコード配列の開始および転写速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である制御配列を意味する。プロモーターは、例えば、構成的、誘導的、抑制的、または組織特異的であってもよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子などの調節タンパク質および分子が結合しうる遺伝的要素を含有してもよい。非限定的な例示的なプロモーターとしては、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ユビキタスニワトリβアクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、小さい核ＲＮＡ（Ｕ１ａまたはＵ１ｂ）プロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、最小限のＭｅＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、またはＥＦＩプロモーターが挙げられる。
本明細書に提供される追加の非限定的な例示的なプロモーターとしては、ＥＦｌａ、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、Ａｃ５ポリヘドリン、Ｇａｌ１、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、Ｕｂｉ、およびα－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。こうしたプロモーターのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ転写の効率を増加または減少させるために改変されてもよいことが当技術分野で公知である。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １２：１３５－１４５（７ＳＫ、Ｕ６、およびＨ１プロモーターのＴＡＴＡボックスを修飾して、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写を廃止し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ｍＲＮＡ転写を刺激する）を参照のこと。合成由来プロモーターは、ユビキタスまたは組織特異的発現に使用されてもよい。さらに、その一部が上述のウイルス由来プロモーターは、本明細書に開示される方法、例えば、ＣＭＶ、ＨＩＶ、アデノウイルス、およびＡＡＶプロモーターにおいて有用である場合がある。実施形態では、プロモーターは、転写効率を増加させるためにエンハンサーと共に使用される。エンハンサーの非限定的な例としては、間質レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）エンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサーが挙げられる。
エンハンサーは、標的配列の発現を増加させる調節要素である。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能とエンハンサー機能との両方を提供する能力を有する配列を含有するポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスの長い末端反復は、プロモーター機能とエンハンサー機能との両方を含有する。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」、または「異種」であってもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に連結されるものである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指示されるように、遺伝子操作によって遺伝子に並置される（すなわち、分子生物学的技法）。本明細書に提供される方法、組成物、および構築物における使用のための連結されたエンハンサー／プロモーターの非限定的な例としては、ＰＤＥプロモーター＋ＩＲＢＰエンハンサーまたはＣＭＶエンハンサー＋Ｕ１ａプロモーターが挙げられる。当技術分野では、エンハンサーは、ある距離から、かつ内因性プロモーターまたは異種プロモーターの場所に対するその向きに関係なく動作することができることが理解される。それ故に、プロモーターからある距離で動作するエンハンサーは、それ故にベクター内のその場所、またはプロモーターの場所に対するその向きに関係なく、そのプロモーターに「動作可能に連結される」ことがさらに理解される。
「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の二つ以上のサブユニットの化合物を指すために、同じ意味で、かつその最も広い意味で使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されてもよい。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも二つのアミノ酸を含有する必要があり、またタンパク質またはペプチドの配列を含む、配列から本質的に成る、または配列から成ることができるアミノ酸の最大数には制限が設けられない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、ならびにＤおよびＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体、およびペプチド模倣体を含む、天然および／もしくは非天然または合成のアミノ酸のいずれかを指す。
本明細書で使用される場合、「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」という用語は、通常、新たに合成された分泌性ポリペプチドもしくは膜ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸配列を意図する。これは、ポリペプチドを、例えば、細胞膜を横切って、細胞膜の中へ、または核の中へと特定の細胞部位に方向付けるように作用する。実施形態では、シグナルペプチドは、局在化後に除去される。シグナルペプチドの例は、当技術分野で周知である。非限定的な例は、米国特許第８，８５３，３８１号、同第５，９５８，７３６号、および同第８，７９５，９６５号に記載されるものである。実施形態では、シグナルペプチドは、ＩＤＵＡシグナルペプチドとすることができる。
「同等の」または「生物学的同等の」という用語は、特定の分子、生物学的物質、または細胞物質を指す場合、同じ意味で使用され、また所望の構造または機能性を依然として維持する一方で、最小限の相同性を有するものを意図する。同等のポリペプチドの非限定的な例としては、参照ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチド、または参照ポリヌクレオチド（例えば、野生型ポリヌクレオチド）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードするされたポリペプチドが挙げられる。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、二つのペプチド間または二つの核酸分子間の配列類似性を指す。同一性パーセントは、比較目的で整列されてもよい各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列内の位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有される場合、分子は、その位置において同一である。配列間の同一性の程度は、配列によって共有される合致する位置の数の関数である。「無関係」または「非相同」配列は、本開示の配列のうちの一つと４０％未満の同一性、２５％未満の同一性しか共有していない。アライメントおよび配列同一性パーセントは、核酸配列またはアミノ酸配列について、本明細書に提供される当該核酸配列またはアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ－ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／において入手可能）へと、かつこれを使用してインポートすることによって、決定されてもよい。例えば、本明細書で見出されるタンパク質配列アライメント（例えば、図２０～図２３）を実施するために使用されるＣｌｕｓｔａｌＷパラメータは、Ｇｏｎｎｅｔ（タンパク質用）重みマトリクスを使用して生成された。実施形態では、本明細書で見出される核酸配列を使用して核酸配列アライメントを実施するために使用されるＣｌｕｓｔａｌＷパラメータは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＤＮＡ用）重みマトリクスを使用して生成される。
本明細書で使用される場合、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入であってもよい。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってもよい。保存的置き換え（保存的変異、保存的置換、または保存的変動とも呼ばれる）は、所与のアミノ酸を、類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、またはサイズ）を有する異なるアミノ酸へと変化させる、タンパク質におけるアミノ酸の置き換えである。本明細書で使用される場合、「保存的変動」は、別の生物学的に類似した残基によるアミノ酸残基の置き換えを指す。保存的変動の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなどの一つの疎水性残基の別のものに対する置換が、または一つの荷電残基または極性残基の別のものに対する置換、例えば、アルギニンのリジンに対する置換、アスパラギン酸に対するグルタミン酸の置換、アスパラギンに対するグルタミンの置換、およびこれに類するものが挙げられる。保存的置換のその例証的な例としては、アラニンのセリンへの変更、アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの変更、アスパラギン酸塩からグルタミン酸塩への変更、システインからセリンへの変更、グリシンからプロリンへの変更、ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの変更、リジンからアルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸塩への変更、フェニルアラニンからチロシン、セリンからトレオニンへの変更、トレオニンからセリンへの変更、トリプトファンからチロシンへの変更、チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変更、およびこれに類するものが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、インタクトなレプリコンを含む、本質的にインタクトなレプリコンから成る、またはインタクトなレプリコンから成る核酸を指し、これによりベクターは細胞内に定置されたときに、例えば、トランスフェクション、感染、または形質転換のプロセスによって、複製されてもよい。一旦細胞の内側に入ると、ベクターは染色体外（エピソーム）要素として複製される場合があり、または宿主細胞染色体の中へと組み込まれる場合があることが当技術分野で理解される。ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、改変バキュロウイルス、パポバウイルス、または別の方法で改変された自然発生ウイルスに由来する核酸を含んでもよい。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターとしては、ネイキッドＤＮＡ；カチオン性脂質と錯体を形成した、単独の、またはカチオン性ポリマーと組み合わせたＤＮＡ； アニオン性リポソームおよびカチオン性リポソーム；一部の事例ではリポソーム内に含有される、カチオン性ポリマー（不均一なポリリシン、画定された長さのオリゴペプチド、およびポリエチレンイミンなど）を用いて凝縮されたＤＮＡを含む、本質的にＤＮＡから成る、またはＤＮＡから成る、ＤＮＡ－タンパク質錯体および粒子；および ウイルスおよびポリリシン－ＤＮＡを含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る三重複合体の使用が挙げられる。
一般的な組み換え技法に関して、ポリヌクレオチドをその中へと動作可能に連結することができるプロモーターとクローニング部位との両方を含有するベクターは、当技術分野で周知である。こうしたベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写する能力を有し、またＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国カリフォルニア州サンタクララ市）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（米国ウィスコンシン州マディソン市）などの供給元から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかにおいて、発現を妨げる、または減少させる場合がある、過剰な、潜在的に不適切な代替的翻訳開始コドンまたは他の配列を削除するために、クローニングされた導入遺伝子の５’および／または３’非翻訳部分を除去、追加、または変更する必要がある場合がある。代替的に、コンセンサスリボソーム結合部位を、発現を強化するために、５’の開始コドンにすぐに挿入することができる。
「ウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロのいずれかで宿主細胞の中へと送達されるポリヌクレオチドを含有する組み換えによって産生されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、およびこれに類するもの挙げられる。セムリキ森林ウイルス系ベクターおよびシンドビスウイルス系ベクターなどのアルファウイルスベクターも、遺伝子療法および免疫療法で使用するために開発されている。例えば、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４－４３９およびＹｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３－８２７を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「組み換え発現系」または「組み換えベクター」という用語は、組み換えによって形成された、ある特定の遺伝的物質の発現のための遺伝子構築物または構築物を指す。
「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞へと運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含むリポソーム、ミセル生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；細菌；バキュロウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルス；バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、および真菌ベクター；および当技術分野で典型的に使用される他の組み換えビヒクルであり、これらは、様々な真核宿主および原核宿主における発現のために記述されており、また遺伝子療法だけでなく、単純なタンパク質発現にも使用されてもよい。また、標的抗体またはその断片も含む、本質的にこれらからも成る、またはこれらからも成るリポソームを、本明細書に開示される方法に使用することができる。細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、本明細書に記載されるタンパク質を細胞または細胞集団に直接導入することは、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技法によって行うことができ、代替的に本明細書に開示されるタンパク質の発現を増強および／または活性を促進することができる条件を洗練することは、他の非限定的な技法である。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞または組織に送達することができる。「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、「形質導入」、およびこれに類するものは、本明細書で使用される場合、導入に使用される方法に関わらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指す用語である（時として「導入遺伝子」とも称される）。こうした方法としては、ベクター媒介遺伝子導入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または様々な他のタンパク質ベースまたは脂質ベースの遺伝子送達複合体による）だけでなく、「ネイキッド」ポリヌクレオチドの送達を促進する技法（エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入のために使用される様々な他の技法）などの様々な周知の技法が挙げられる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内に安定的にまたは一時的に維持されてもよい。安定的な維持は、典型的に、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合する複製の起源を含有するか、または染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）もしくは核もしくはミトコンドリア染色体などの宿主細胞のレプリコンの中へと組み込むことを必要とする。数多くのベクターが、当技術分野で公知であり、かつ本明細書に記載されるように、哺乳類細胞への遺伝子の移動を媒介する能力を有することが知られている。
「プラスミド」は、典型的に染色体ＤＮＡから分離し、かつ染色体ＤＮＡから独立して複製する能力を有するＤＮＡ分子である。多くの場合、円形状でおよび二重鎖である。プラスミドは、微生物集団内の水平遺伝子導入のための機構を提供し、また典型的には、所与の環境的状態下で選択的優位性を提供する。プラスミドは、競合する環境的ニッチにおいて自然発生する抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を担持する場合があり、または代替的に、産生されたタンパク質は、類似の状況下で毒素として作用する場合がある。プラスミドベクターは、染色体外環状ＤＮＡ分子としてしばしば存在するが、プラスミドベクターは、ランダムまたは標的化された様態のいずれかで宿主染色体内に安定的に統合されるように設計される場合があり、またこうした組み込みは、円形プラスミドまたは宿主細胞への導入前に直線化されたプラスミドのいずれかを使用して達成される場合があることが当技術分野で知られている。
遺伝子工学で使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と呼ばれる。多くのプラスミドは、こうした使用のために市販されている。複製される遺伝子は、特定の抗生物質に対して細胞に耐性を持たせる遺伝子を含有するプラスミドのコピー、およびこの場所でのＤＮＡ断片の容易な挿入を可能にする、いくつかの一般的に使用される制限部位を含有する短い領域である、複数のクローニング部位（ＭＣＳ、またはポリリンカー）へと挿入される。プラスミドの別の主要な使用は、大量のタンパク質を作製することである。この場合、研究者らは、対象の遺伝子を担持するプラスミドを含有する細菌または真核細胞を成長させ、これを挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように誘導することができる。
アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＤＮＡウイルスベクターによって遺伝子導入が媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部、および導入遺伝子を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成るポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」という用語は、この名称と関連付けられ、かつディペンドパルボウイルス属、パルボウイルス科に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。アデノ随伴ウイルスは、共感染ヘルパーウイルスによってある特定の機能が提供される細胞でのみ成長する、単鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶの一般的な情報およびレビューは、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。様々な血清型が、遺伝子的なレベルでさえも、構造的および機能的に非常に密接に関連していることが周知なため、これらのレビューに記載される同じ原理がレビューの公表日以降に特徴付けられる追加的なＡＡＶ血清型にも適用可能であることが、完全に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．；およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照のこと）。例えば、すべてのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明白に呈し、かつすべてが、ＡＡＶ２で発現されるものなどの、三つの関連するカプシドタンパク質を持つ。関連度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーションを明らかにするヘテロ二本鎖解析、および「逆末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似自己アニーリングセグメントの存在によってさらに示唆される。類似の感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。このウイルスの複数の血清型は、遺伝子送達に適していることが知られており、すべての公知の血清型は、様々な組織タイプからの細胞に感染する可能性がある。少なくとも１１個の連続番号のＡＡＶ血清型が当技術分野で公知である。本明細書に開示される方法で有用な非限定的な例示的な血清型には、の１１個の血清型（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）、またはバリアント血清型（例えば、ＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ）のいずれかが含まれる。ＡＡＶ粒子は、三つの主要なウイルスタンパク質、ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る。実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、またはＡＡＶｒｈ７４を指す。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」は、一つ以上の異種核酸（ＨＮＡ）配列および一つ以上のＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成るベクターを指す。こうしたＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子産物およびｃａｐ遺伝子産物の機能性を提供する宿主細胞中に存在するとき、例えば、宿主細胞のトランスフェクションによって、複製することができ、かつ感染性ウイルス粒子の中へとパッケージングすることができる。実施形態では、ＡＡＶベクターは、プロモーター、少なくとも一つのタンパク質またはＲＮＡをコードし得る少なくとも一つの核酸、および／または感染性ＡＡＶ粒子の中へとパッケージングされる隣接するＩＴＲ内のエンハンサーおよび／またはターミネーターを含有する。カプシドで包まれた核酸部分は、ＡＡＶベクターゲノムと称される場合がある。ＡＡＶベクターを含有するプラスミドは、例えば、抗生物質耐性遺伝子等の製造目的のための要素も含有してもよいが、これらはカプシドで包まれておらず、それ故にＡＡＶ粒子の一部を形成しない。
本明細書で使用される場合、「ウイルスカプシド」または「カプシド」という用語は、ウイルス粒子のタンパク性シェルまたは被覆を指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシドで包み、保護し、輸送し、そして宿主細胞の中へと放出する機能を果たす。カプシドは一般的に、タンパク質のオリゴマー構造サブユニット（「カプシドタンパク質」）から成る。本明細書で使用される場合、「カプシドで包む」という用語は、ウイルスカプシド内に封入されることを意味する。ＡＡＶのウイルスカプシドは、三つのウイルスカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の混合物から構成される。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の混合物は、Ｓｏｎｎｔａｇ Ｆ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｎｅ ２０１０）．”Ａ ｖｉｒａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＡＡＶ２ ｃａｐｓｉｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１０７（２２）：１０２２０－５、およびＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０００）．”Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒ：ｔｈｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｖｉｒｉｏｎｓ”．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２７８（２）：３０１－８（その各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるように１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）または１：１：２０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比率でＴ＝１の正２０面体対称で配設された６０個のモノマーを含有する。
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも一つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシドで包まれたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。それ故に、ＡＡＶベクター粒子の産生は、ＡＡＶベクターの産生を必然的に含み、これによりＡＡＶベクター粒子内にベクターが含有される。
本明細書で使用される場合、ウイルスまたはプラスミドに関して「ヘルパー」という用語は、本明細書に開示されるＡＡＶベクターのうちのいずれか一つの複製およびパッケージングのために必要な追加的な構成要素を提供するために使用されるウイルスまたはプラスミドを指す。ヘルパーウイルスによってコードされる構成要素は、ビリオンアセンブリ、カプシド形成、ゲノム複製、および／またはパッケージングに必要とされる任意の遺伝子を含んでもよい。例えば、ヘルパーウイルスまたはプラスミドは、ウイルスゲノムの複製に必要な酵素をコードしてもよい。ＡＡＶ構築物での使用に適したヘルパーウイルスおよびプラスミドの非限定的な例としては、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）、またはヘルペスウイルス（ウイルス）が挙げられる。実施形態では、ｐＨＥＬＰプラスミドは、アンピシリン発現カセットがカナマイシン発現カセットと交換されるｐＨＥＬＰＫプラスミドであってもよく、ｐＨＥＬＰＫは、配列番号９２で示される配列を有する。
本明細書で使用される場合、パッケージング細胞（またはヘルパー細胞）は、ウイルスベクターを産生するために使用される細胞である。組み換えＡＡＶウイルスベクターの産生は、トランスで提供されるＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質だけでなく、ＡＡＶ複製を助けるアデノウイルスからの遺伝子配列も必要とする。一部の態様では、プラスミドを含有するパッケージング／ヘルパー細胞は、安定的に細胞のゲノムの中へと組み込まれる。他の態様では、パッケージング細胞は一時的にトランスフェクトされてもよい。典型的に、パッケージング細胞は、哺乳類細胞または昆虫細胞などの真核細胞である。
本明細書で使用される場合、レポータータンパク質は、プロモーターに動作可能に連結されて、プロモーターの発現（例えば、組織特異性および／または強度）をアッセイする、検出可能なタンパク質である。態様では、レポータータンパク質は、ポリペプチドに動作可能に連結されてもよい。態様では、レポータータンパク質は、ＤＮＡ送達方法のモニタリング、プロモーターおよびエンハンサー要素の機能的識別および特徴付け、翻訳および転写調節、ｍＲＮＡプロセシング、ならびにタンパク質タンパク質相互作用に使用されてもよい。レポータータンパク質の非限定的な例としては、βガラクトシダーゼ；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光タンパク質；ルシフェラーゼ；グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ；およびマルトース結合タンパク質が挙げられる。
「組成物」は、活性ポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくは抗体、ならびに別の化合物または組成物、不活性（例えば、検出可能な標識）もしくは活性（例えば、遺伝子送達ビヒクル）の組み合わせを意味することが意図される。
「医薬組成物」は、活性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体を、不活性もしくは活性の担体（固体支持体などの）と組み合わせを含むことが意図されており、組成物をインビトロ、インビボ、またはエクスビボでの診断または治療のための使用に適したものとする。
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水などの標準的な医薬担体、水、および油／水または水／油エマルションなどのエマルション、および様々なタイプの湿潤剤のいずれかを包含する。組成物はまた、安定剤および保存剤も含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ”ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ）を参照のこと。
診断または処置の「対象」は、細胞、または哺乳類もしくはヒトなどの動物である。対象は、特定の種に限定されず、また診断または処置の対象となる非ヒト動物、および感染または動物モデルの対象となる非ヒト動物を含み、サル、ネズミ、ラット、イヌ、またはウサギ種だけでなく、その他の家畜、スポーツ動物、またはペットが挙げられるがこれらに限定されない。実施形態では、対象はヒトである。
「組織」という用語は、本明細書では、生きているまたは死亡した生命体の組織、または生きているまたは死亡した生命体に由来するか、またはそれらを模倣するよう設計された任意の組織を指すために使用される。組織は、健康である、疾患を有する、かつ／または遺伝子変異を有する場合がある。生物学的組織は、任意の単一組織（例えば、相互接続されうる細胞の集まり）、または生命体の体の器官もしくは一部もしくは領域を作り上げている組織の群を含んでもよい。組織は、均質な細胞物質を含んでもよく、本質的に均質な細胞物質から成ってもよく、もしくは均質な細胞物質から成ってもよく、または例えば、肺組織、骨格組織、および／または筋組織を含むことができる胸郭を含む身体の領域に見られるような複合構造であってもよい。例示的な組織としては、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆道系、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓および腸に由来したものが挙げられ、その任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、対象における疾患を「処置すること」または疾患の「処置」は、（１）疾患にかかりやすい、または疾患の症状をまだ示さない対象において、症状または疾患が発生することを防止すること、（２）疾患を阻害するか、またはその発症を停止させること、または（３）疾患または疾患の症状の改善または退縮を引き起こすことを指す。当技術分野で理解されるように、「処置」は、臨床結果を含む、有益または望ましい結果を得るためのアプローチである。本技術の目的に対して、有益なまたは所望の結果には、一つ以上の症状の軽減または改善、状態（疾患を含む）の程度の減少、状態（疾患を含む）の安定化（すなわち、悪化しない）、状態（疾患を含む）の遅延または低速化、状態（疾患を含む）の進行、改善、または緩和、状態および寛解（部分または全体であるかに関わらず）（検出可能または検出不能であるかに関わらず）の一つ以上を含むことができるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を達成するのに十分な量を意味することを意図する。治療的または予防的適用の文脈では、有効量は、問題となっている状態のタイプおよび重症度、ならびに一般的な健康、年齢、性別、体重、および医薬組成物に対する耐性などの個々の対象の特徴に依存する。遺伝子療法の文脈では、実施形態では、有効量は、対象において欠損している遺伝子の部分的な機能または全機能の回復をもたらすのに十分な量である。他の一部の実施形態では、有効量のＡＡＶウイルス粒子は、対象の遺伝子の発現をもたらすのに十分な量である。実施形態では、有効量は、それを必要とする対象においてガラクトース代謝を増加させるために必要とされる量である。当業者は、これらの因子および他の因子に応じて適切な量を決定することができる。
実施形態では、有効量は、問題となる適用のサイズおよび性質に依存する。また、標的対象の性質および感度、ならびに使用の方法にも依存する。当業者は、これらの考慮事項およびその他の考慮事項に基づいて、有効量を決定することができることになる。有効量は、実施形態に応じて、組成物の１回以上の投与を含む、本質的にこれから成る、またはこれから成る場合がある。
本明細書で使用される場合、「投与する」または「投与」という用語は、動物またはヒトなどの対象への物質の送達を意味することを意図する。投与は、処置の過程全体を通して、１回の用量で、連続的に、または断続的に、実施することができる。最も有効な手段および投与量の投与を決定する方法は、当業者に公知であり、また治療に使用される組成物、治療の目的だけでなく、処置される対象の年齢、健康、または性別によって変化することになる。単回投与または複数回投与は、処置担当医によって、またはペットおよび他の動物の場合に、処置獣医師によって選択される用量レベルおよびパターンで実施することができる。
ＡＡＶの構造および機能
ＡＡＶは複製欠損パルボウイルスであり、その単鎖ＤＮＡゲノムの長さは約４．７ｋｂであり、二つの１４５－ヌクレオチド逆末端反復（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿ｌ８２９で提供され、ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２で提供され、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも部分は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９でそれぞれ提供され、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）；で提供され、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）で提供され、そしてＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）で提供される。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４３４，９２８号で提供される。米国特許第９，４３４，９２８号はまた、カプシドタンパク質の配列および自己相補的ゲノムも提供する。一態様では、ゲノムは自己相補的ゲノムである。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体統合を指示するｃｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。三つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ場所に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名される）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする二つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）の差次的スプライシングと結合した二つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの四つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ ７８、ｒｅｐ ６８、ｒｅｐ ５２、およびｒｅｐ ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製を最終的に担う複数の酵素特性を有する。
ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、かつ三つのカプシドタンパク質、ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。代替的なスプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、三つの関連するカプシドタンパク質の産生を担う。より具体的には、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質の各々が翻訳される単一ｍＲＮＡが転写された後、二つの異なる様式でスプライシングすることができ、すなわち、より長いまたはより短いイントロンのいずれかを切除することができ、結果として、ｍＲＮＡの二つのプール（２．３ｋｂおよび２．６ｋｂの長さのｍＲＮＡプール）が形成される。しばしば、より長いイントロンが好ましく、それ故に２．３ｋｂ長のｍＲＮＡを主要なスプライスバリアントと呼ぶことができる。この形態は、最初のＡＵＧコドンを欠いており、そこからＶＰ１タンパク質の合成が開始され、結果としてＶＰ１タンパク質合成の全体的なレベルが低減される。主要なスプライスバリアント内に残る最初のＡＵＧコドンは、ＶＰ３タンパク質の開始コドンである。しかしながら、同じオープンリーディングフレーム内のそのコドンの上流には、最適なコザック（翻訳開始）コンテキストに囲まれたＡＣＧ配列（コードするトレオニン）がある。これは、ＶＰ２タンパク質の低レベルの合成に寄与するが、これは実際には、Ｂｅｃｅｒｒａ ＳＰ ｅｔ ａｌ．，（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８５）．”Ｄｉｒｅｃｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂ ａｎｄ Ｃ：ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ＡＣＧ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．８２ （２３）：７９１９－２３、Ｃａｓｓｉｎｏｔｔｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８８）． ”Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅ：ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｉｎｏｒ ｓｐｌｉｃｅｄ ｍＲＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １”．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１６７（１）：１７６－８４、Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｊａｎｕａｒｙ １９９４）．”Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ；ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６８（１）：１７０－６、およびＴｒｅｍｐｅ ＪＰ，Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８８）．”Ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６２ （９）：３３５６－６３（その各々が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＶＰ１と同様に、追加的なＮ末端残基を有するＶＰ３タンパク質である。単一のコンセンサスポリＡ部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）でレビューされている。
各ＶＰ１タンパク質は、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、およびＶＰ３部分を含有する。ＶＰ１部分は、ＶＰ１タンパク質に特有のＶＰ１タンパク質のＮ末端部分である。ＶＰ２部分は、ＶＰ２タンパク質のＮ末端部分内にも見られるＶＰ１タンパク質内に存在するアミノ酸配列である。ＶＰ３部分およびＶＰ３タンパク質は、同じ配列を有する。ＶＰ３部分は、ＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質と共有されるＶＰ１タンパク質のＣ末端部分である。図３０を参照のこと。
ＶＰ３タンパク質はさらに、個別の可変表面領域Ｉ－ＩＸ（ＶＲ－Ｉ－ＩＸ）へと分けることができる。可変表面領域（ＶＲ）の各々は、ＤｉＭａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．８６（１２）：６９４７－６９５８，Ｊｕｎｅ ２０１２（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、特有の感染表現型（例えば、他のＡＡＶ血清型と比較して、抗原性の低下、形質導入の改善、および／または組織特異的な指向性）を特定の血清型に、単独で、または他のＶＲの各々の特異的なアミノ酸配列との組み合わせでのいずれかで与えることができる特定のアミノ酸配列を含む、または含有することができる。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な特有の特徴を持っている。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、またヒトおよび他の動物の自然感染は無症状かつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは数多くの哺乳類細胞に感染し、インビボで数多くの異なる組織を標的化する可能性を許容する。さらに、ＡＡＶはゆっくりと***する細胞および***しない細胞を形質導入し、そして転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として細胞の生涯にわたって本質的に持続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中にクローニングされたＤＮＡとして挿入され、これは組み換えゲノムの構築を実行可能にする。さらに、ＡＡＶの複製およびゲノムのカプシド形成を指示するシグナルは、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に収容されるため、ゲノムの内部のおよそ４．３ｋｂの一部またはすべて（複製および構造的カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）は、ＡＡＶベクターを生成するために外来ＤＮＡで置き換えられてもよい。ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質は、トランスで提供されてもよい。ＡＡＶの別の重要な特徴は、ＡＡＶが極めて安定で、かつ力強いウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活化するために使用される条件（５６℃～６５℃に数時間の間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存をより危険が少ないものにする。ＡＡＶは凍結乾燥さえもされうる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は重複感染に耐性がない。
複数の研究が、筋肉における長期（＞１．５年）の組み換えＡＡＶ媒介性タンパク質発現を実証してきた。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）；およびＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照のこと。また、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）、およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照のこと。さらに、筋肉は高度に血管新生されているため、組み換えＡＡＶ形質導入は、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）およびＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されるように、筋肉内注射後の全身循環に導入遺伝子産物が現れる結果をもたらす。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体のグリコシル化、折り畳み、および分泌に必要な細胞因子を持つことを実証し、筋肉が分泌されたタンパク質治療薬の安定した発現の能力を有することを示した。本発明の組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、治療用タンパク質（例えば、ＣＦＴＲ）をコードする核酸分子および核酸分子に隣接する一つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、およびＡＡＶ ｒｈ７４を含むがこれらに限定されない、組み換えウイルスを誘導することができる任意のＡＡＶ血清型由来であってもよい。シュードタイプのｒＡＡＶの産生は、例えば、国際特許公開公報第２００１０８３６９２号に開示されている。カプシド変異を有するｒＡＡＶなどの他のタイプのｒＡＡＶバリアントも意図されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照のこと。当技術分野では、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が公知である。
ＡＡＶベクター粒子、カプシドタンパク質、およびＡＡＶベクター
本明細書では、望ましい組織特異性を有し、かつ核酸を含む様々な治療ペイロードおよび疾患の処置において有用なタンパク質の送達において使用を見出すＡＡＶベクター粒子、ＡＡＶベクター、およびカプシドタンパク質が提供される。
ＡＡＶカプシドタンパク質
本開示は、高い遺伝子導入効率および組織指向性の増加の特性を持つＡＡＶ粒子を提供する。ＡＡＶベクターの送達は、現在のところ、ウイルスの天然指向性に基づいて、または標的組織への直接的な注射による組織標的化のための血清型選択の使用に依存している。治療上最大限の利益を達成するために全身送達が必要とされる場合、組織特異的プロモーターと組み合わせた組織標的化のために利用可能な唯一の選択肢は血清型選択である。そのため、現在利用可能なＡＡＶベクターの多くは、それ故に遺伝子療法に対して最適ではない。
本開示は、高い遺伝子導入効率、およびそれらを含むＡＡＶカプシド上の組織特異性の増加を与えるＡＡＶカプシドタンパク質配列を提供する。実施形態では、本明細書に提供されるＡＡＶカプシド配列は、図１に示すＡＡＶカプシド生成プラットフォームを使用して生成される。
実施形態では、ＶＰ１カプシドタンパク質は、表１に列挙されたアミノ酸配列のうちのいずれか一つ、または表１に列挙されたアミノ酸配列のうちのいずれか一つと比較して、変異、欠失、または追加された最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を有する配列を含む。態様では、最大２０個のアミノ酸、最大３０個のアミノ酸、または最大４０個のアミノ酸を、これらの配列と比較して変異させ、欠失させ、または追加してもよい。実施形態では、ＶＰ１カプシドタンパク質は、表１に列挙された核酸配列のうちのいずれか一つによってコードされ、または表１に列挙された核酸配列のうちのいずれか一つに対して、最大５個、最大１０個、最大３０個、または最大６０個のヌクレオチド変化を有する配列によってコードされる。
Figure 2022515338000001
実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ１タンパク質は、配列番号１～３、３０～３４、４９、もしくは８４のアミノ酸配列、または最高で１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の配列番号１～３、３０～３４、４９、もしくは８４とは異なるアミノ酸を有する配列を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る。また、これらのＶＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供される。実施形態では、ＶＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５、１８～２３、４７、８２、および９８の配列、または配列番号１５、１８～２３、４７、８２、および９８に対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る。
実施形態では、ＡＡＶカプシド配列はＡＡＶ－１１０カプシドタンパク質（配列番号１）、ＡＡＶ２０４カプシドタンパク質（配列番号２）、ＡＡＶ２１４カプシドタンパク質（配列番号３）、またはＡＡＶ ＩＴＢ１０２＿４５カプシドタンパク質（配列番号４９）である。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２１４カプシドタンパク質のバリアントである。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３０）、ＡＡＶ－２１４－ＡＢ（配列番号８４）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３１）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３２）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３３）、またはＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号３４）である。
例示的なＶＰ２タンパク質およびＶＰ３タンパク質に対する配列が、表２および表３に提供される。ＶＰ２配列およびＶＰ３配列を考慮すると、ＶＰ１部分は、完全なＶＰ１タンパク質配列とのアライメントによって決定されてもよい。
Figure 2022515338000002
ＩＴＢ１０２＿４５に対する例示的な核酸は、配列番号４７である。他のカプシドＶＰ２部分に対する例示的な核酸は、ＶＰ１カプシドタンパク質核酸の対応する部分に由来する場合がある。
Figure 2022515338000003
ＡＡＶ２１４、ＡＡＶ２１４ｅ、ＡＡＶ２１４ｅ８、ＡＡＶ２１４ｅ９、ＡＡＶ２１４ｅ１０のＶＰ３タンパク質は、同じアミノ酸（配列番号４１）および核酸（配列番号２４）配列を有する。
実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ２タンパク質は、配列番号３５～４０、５０、もしくは８５のうちのいずれか一つのアミノ酸配列、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の配列番号３５～４０、５０、もしくは８５とは異なるアミノ酸を有する配列を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る。また、これらのＶＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供される。実施形態では、ＶＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４７の配列、または配列番号４７に対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る。
実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ３タンパク質は、配列番号１７、４１～４６、５１、もしくは８６のアミノ酸配列、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の配列番号１７、４１～４６、５１、もしくは８６とは異なるアミノ酸を有する配列を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る。また、これらのＶＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供される。実施形態では、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６、２４～２９、４８、および８３の配列、または配列番号１６、２４～２９、４８、および８３に対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る。
実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質はキメラタンパク質である。実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３部分は、本明細書に開示される異なるＡＡＶカプシドタンパク質からのＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３部分で置き換えられてもよい。
実施形態では、アミノ酸１２９のロイシン残基、アミノ酸５８６のアスパラギン残基、およびアミノ酸７２３のグルタミン酸残基を含むＡＡＶカプシドタンパク質が本明細書に提供され、ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸位置に対して番号付けされる。一部の事例では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の事例では、これらのアミノ酸は、他のカプシドタンパク質へと導入されてもよい。
実施形態では、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、およびＶＰ３部分を含むＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質が本明細書に提供され、ＶＰ１部分は、アミノ酸１２９にロイシン（Ｌ）残基を含み、ＶＰ２部分は、アミノ酸１５７にトレオニン（Ｔ）残基またはアスパラギン（Ｎ）残基を、またアミノ酸１６２にリジン（Ｋ）残基またはセリン（Ｓ）残基を含み、ＶＰ３部分は、アミノ酸２２３にアスパラギン（Ｎ）残基を、アミノ酸２２４にアラニン（Ａ）残基を、アミノ酸２７２にヒスチジン（Ｈ）残基を、アミノ酸４１０にトレオニン（Ｔ）残基を、アミノ酸７２４にヒスチジン（Ｈ）残基を、またアミノ酸７３４にプロリン（Ｐ）残基を含み、ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置は、配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対して番号付けされる（すなわち、ＶＰ１カプシドサブユニット番号付け）。
実施形態では、ＶＰ１部分は、アミノ酸２４にアスパラギン酸（Ｄ）残基またはアラニン（Ａ）残基をさらに含み、ＡＡＶカプシドタンパク質におけるアミノ酸位置は、配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対して番号付けされる。実施形態では、ＶＰ２部分は、（ｉ）アミノ酸１４８におけるプロリン（Ｐ）残基、（ｉｉ）アミノ酸１５２に挿入されたアルギニン（Ｒ）残基、（ｉｉｉ）アミノ酸１６８におけるアルギニン（Ｒ）残基、（ｉｖ）アミノ酸１８９におけるイソロイシン（Ｉ）残基、および（ｖ）アミノ酸２００におけるセリン（Ｓ）残基のうちの一つ以上をさらに含み、ＡＡＶカプシドタンパク質におけるアミノ酸位置は、配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対して番号付けされる。
実施形態では、開示されたＶＰ３部分カプシドタンパク質における一つ以上の可変領域Ｉ～ＩＸ（図３０を参照のこと）は、除去され、かつ代替的な領域と置き換えられてもよい。適切な代替案は、以下の表に特定される。これらに対する場所だけでなく、追加的な代替案の同一性も、図３０に示すように、配列番号４１とのアライメントによって識別される場合がある。実施形態では、一つ以上のＶＲは、１、２、または３個のアミノ酸の挿入を有してもよい。実施形態では、一つ以上のＶＲは、１、２、または３個のアミノ酸の欠失を有してもよい。
Figure 2022515338000004
本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質のうちのいずれか一つをコードする核酸を提供する。本開示はまた、本明細書に開示される核酸のうちのいずれか一つを含むベクターも提供する。
実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９血清型である。代替的な血清型または改変されたカプシドウイルスは、ニューロン指向性を最適化するために使用することができる。代替的なベクターとしては、標準的なＡＡＶ９より高いニューロン指向性のための改変されたＡＡＶ９血清型ベクター、例えば、Ｃｒｅ－ｌｏｘ組み換えシステムを使用してニューロン標的化ベクターを特定するＰＨＰ．Ｂが挙げられる。代替的に、ＡＡＶ９ ＰＨＰ．Ｂは、肝臓指向性を減少させるために、アスパラギンからリジンへのＶＰ１の修飾アミノ酸４９８を有する。いくつかのアミノ酸を変異させたＡＡＶｒｈ７４のさらなるバリアントを、脳を含む非常に広範な組織指向性のために使用することができる。
ＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターは、対象における核酸の発現の制御に関与する要素（複数可）を含むＡＡＶベクター粒子の中へとカプシド形成される核酸だけでなく、カプシド形成を促進するためにＩＴＲも供給する。実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、対象の細胞内で発現されるときに、疾患または障害を処置するために有効である、少なくとも一つの異種核酸（ＨＮＡ）配列を含む。実施形態では、ＨＮＡ配列は導入遺伝子を含む。実施形態では、ＡＡＶベクターは、少なくとも一つのＩＴＲ配列および少なくとも一つの導入遺伝子を含む。実施形態では、導入遺伝子は、治療用タンパク質または治療用ＲＮＡをコードする。
実施形態では、宿主細胞における導入遺伝子発現の制御は、プロモーター配列およびポリＡ部位を含むＡＡＶベクター内に含有される調節要素によって調節されてもよい。実施形態では、ＡＡＶベクターはまた、シグナルペプチドもコードしてもよい。実施形態では、ＡＡＶベクターは、５’および３’逆末端反復（ＩＴＲ）を有する。５’ＩＴＲはプロモーターの上流に位置し、これはまた導入遺伝子の上流である。実施形態では、５’および３’ＩＴＲは、同じ配列を有する。実施形態では、それらは異なる配列を有する。実施形態では、本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’の向きに、第一の（５’）ＩＴＲ、プロモーター、導入遺伝子、ポリＡ部位、および第二の（３’）ＩＴＲを含んでもよい。
実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号８８（ｐＡ＿ＣＦ１）、配列番号８９（ｐＡ＿ＣＦ３）、配列番号９０（ｐＡ＿ＣＦ５）、または配列番号９１（ｐＡ＿ＣＦ７）に示すヌクレオチド配列を有する。これらのベクターは、以下の構成成分を含有する：
Figure 2022515338000005
実施形態では、ＨＮＡ（例えば、導入遺伝子を含むＨＮＡ）は、構成的プロモーターに動作可能に連結される。構成的プロモーターは、当技術分野で公知の任意の構成的プロモーターとすることができ、かつ／または本明細書に提供される。実施形態では、構成的プロモーターは、ラウス肉腫（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ハイブリッドニワトリベータアクチンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、ｍＭｅＰ４１８プロモーター、ｍＭｅＰ４２６プロモーター、最小限のＭｅＣＰ２プロモーター、ＣＡＧプロモーター、またはＥＦ１プロモーターを含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る。こうしたプロモーターのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ転写の効率を増加または減少させるために改変されてもよいことが当技術分野で公知である。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １２：１３５－１４５（７ＳＫ、Ｕ６、およびＨ１プロモーターのＴＡＴＡボックスを修飾して、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写を廃止し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ｍＲＮＡ転写を刺激する）を参照のこと。実施形態では、ＨＮＡ配列は、組織特異的対照プロモーター、または誘導性プロモーターに動作可能に連結される。実施形態では、組織特異的対照プロモーターは、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、皮膚特異的プロモーター、筋特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、眼特異的プロモーター（例えば、ＶＭＤ２、またはｍＲｈｏプロモーター）である。
実施形態では、プロモーターは、配列番号９６（マウスＵ１プロモーター）または配列番号９７（Ｈ１プロモーター）の配列を有するポリヌクレオチドを含んでもよく、本質的にこれらから成ってもよく、またはこれらから成ってもよい。実施形態では、プロモーターは、Ｕ１ａまたはＵ１ｂプロモーター、ＥＦ１プロモーター、またはＣＢＡ（ニワトリベータアクチン）である。実施形態では、プロモーターは、表５に列挙された核酸配列のうちのいずれか一つ、または表５に列挙された核酸配列のうちのいずれか一つに対して、最大５個、最大１０個、または最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含んでもよく、本質的にこれらから成ってもよく、またはこれらから成ってもよい。
Figure 2022515338000006
実施形態では、ＨＮＡ配列は、追加的な調節要素に動作可能に連結される。追加的な調節要素は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）とすることができる。実施形態では、ＡＡＶベクターは、ベクター産生目的のために細菌宿主におけるベクターの成長および培養に適した調節構成成分を含んでもよい。例えば、ベクターは、抗生物質耐性のための遺伝子、および細菌内のプラスミドの維持だけでなく、細菌中のタンパク質発現を制御するための関連調節要素を含んでもよい。
実施形態では、ＨＮＡ配列は、ポリＡ部位に動作可能に連結される。ポリアデニル化部位は、ＭｅＣＰ２ポリ－Ａ部位、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリ－Ａ部位、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ－Ａ部位、ＳＶ４０ポリ－Ａ部位、ＳＰＡ４９ポリ－Ａ部位、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリ－Ａ部位、ｓＮＲＰポリ－Ａ部位、またはＴＫ６５ポリ－Ａ部位を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る。例示的なＳＰＡ４９ポリ－Ａ配列は、Ｏｓｔｅｄｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（Ｆｅｂ．２２，２００５）１０２：２９５２－２９５７（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
異種核酸（ＨＮＡ）
本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、一つ以上の異種核酸（ＨＮＡ）を標的組織に感染させ、かつ送達する。実施形態では、ＨＮＡ配列は転写され、かつ任意に、標的組織の細胞内で翻訳される。
一部の事例では、ＨＮＡはアンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする。ＣＲＩＳＰＲ技術は、改変のために生細胞のゲノムを標的とするために使用されてきた。Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲシステムを通して遺伝子修復を媒介するために標的組織および細胞に効率的に送達される必要がある大きい酵素であり、現在のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子補正プロトコルは、多くの欠点に悩まされている。Ｃａｓ９の長期間の発現は、宿主の免疫応答を引き出すことができる。追加的なガイドＲＮＡは、パッケージングの制約に起因して、別個のベクターを介して送達されてもよい。実施形態では、ＨＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質またはその均等物をコードする。
実施形態では、ＨＮＡは、天然タンパク質の活性の減少または削除から生じる、疾患または障害を処置するために対象の細胞において発現される場合がある、タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。それ故に、実施形態では、導入遺伝子は、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）、運動ニューロン１の生存、テロメア（ＳＭＮ１）、アルカリホスファターゼ、関連する生体鉱物化（ＡＬＰＬ、ＴＮＡＬＰとしても知られる）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、グルコシルセラミダーゼベータ（ＧＢＡ１）、イズロニダーゼアルファ－Ｌ－（ＩＤＵＡ）、シトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶメンバー２（ＣＹＰ４Ｖ２）、レチノスキシン１（ＲＳ１）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、ロドプシン（Ｒｈｏ）、またはセロイドリポフスチン症、ニューロン、１（ＣＬＮ１）から選択されるタンパク質をコードしてもよい。
実施形態では、導入遺伝子はＣＦＴＲをコードする。実施形態では、ＣＦＴＲは、変異配列、コドン最適化配列、および／またはＣＦＴＲの短縮配列を含む。例示的な適切なＣＦＴＲ配列は、米国特許公開第２０１１００３５８１９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される。実施形態では、ＣＦＴＲは、アミノ酸７０８～７５９の欠失（ＣＦＴＲΔＲ）を含む。Ｏｓｔｅｄｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（Ｆｅｂ．２２，２００５）１０２：２９５２－２９５７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
実施形態では、導入遺伝子は、配列番号４（コドン最適化ＣＦＴＲΔＲ）もしくは配列番号９３（完全長コドン最適化ＣＦＴＲ）の配列を有する核酸、または配列番号４もしくは９３に対して最大５個、最大１０個、または最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成る。実施形態では、導入遺伝子は、配列番号９５（ＣＦＴＲΔＲ）もしくは配列番号９４（完全長ＣＦＴＲ）の配列、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の配列番号９４もしくは９５とは異なるアミノ酸を有する配列を有するアミノ酸を含む、本質的にこれらから成る、またはこれらから成るタンパク質をコードする。
実施形態では、導入遺伝子は、ＣＬＮ３リソソーム／エンドソーム膜貫通タンパク質、バッテニン（ＣＬＮ３）タンパク質、アルファガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、または酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする。
実施形態では、ＧＡＡタンパク質は、配列番号５、６、もしくは７のヌクレオチド配列、または配列番号５、６、もしくは７に対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列によってコードされる。実施形態では、ＧＡＡタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の配列番号８とは異なるアミノ酸を有する配列を含む。
実施形態では、ＧＬＡタンパク質は、配列番号９もしくは１０のヌクレオチド配列、または配列番号９もしくは１０に対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列によってコードされる。実施形態では、ＧＬＡタンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の配列番号１１とは異なるアミノ酸を有する配列を含む。
実施形態では、ＣＬＮ３タンパク質は、配列番号１２もしくは１３のヌクレオチド配列、または配列番号１２もしくは１３に対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列によってコードされる。実施形態では、ＣＬＮ３タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の配列番号１４とは異なるアミノ酸を有する配列を含む。
実施形態では、導入遺伝子は、表４に列挙された核酸配列のうちのいずれか一つ、または表４のＤＮＡ配列のうちのいずれか一つに対して、最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含む。実施形態では、導入遺伝子は、表４に列挙されたアミノ酸配列のうちのいずれか一つ、または表４に列挙されたアミノ酸配列のうちのいずれか一つとは異なる最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を有する配列をコードする。
Figure 2022515338000007
Figure 2022515338000008
実施形態では、導入遺伝子は、配列番号９９～１３３のうちのいずれか一つに記載される核酸配列、または配列番号９９～１３３のうちのいずれか一つに対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含む。実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１３４～１５１のうちのいずれか一つに記載されるアミノ酸配列、または配列番号１３４～１５１のアミノ酸配列のうちのいずれか一つとは異なる最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を有する配列をコードする。
実施形態では、異種核酸はレポータータンパク質、例えば、蛍光タンパク質をコードする。
ＡＡＶウイルスベクターを産生する方法
ＡＡＶウイルスベクターを産生するために、様々なアプローチを使用してもよい。実施形態では、パッケージングは、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドおよび細胞株を使用することによって達成される。ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドは、ウイルスベクター産生を促進する要素および配列を含有する。別の態様では、ヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株のゲノムの中へと安定的に組み込まれ、これによりパッケージング細胞株はヘルパープラスミドによる追加的なトランスフェクションを必要としない。
実施形態では、細胞は、パッケージングまたはヘルパー細胞株である。実施形態では、態様では、ヘルパー細胞株は真核細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞または２９３Ｔ細胞である。実施形態では、ヘルパー細胞は酵母細胞または昆虫細胞である。
実施形態では、細胞は、テトラサイクリン活性化因子タンパク質をコードする核酸、およびテトラサイクリン活性化因子タンパク質の発現を調節するプロモーターを含む。実施形態では、テトラサイクリン活性化因子タンパク質の発現を調節するプロモーターは、構成的プロモーターである。実施形態では、プロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）またはＣＭＶプロモーターである。
ヘルパープラスミドは、例えば、複製能力のないＡＡＶをパッケージングするために必要とされるすべてのビリオンタンパク質をトランス内にコードする、および高力価で複製能力のないＡＡＶをパッケージングする能力を有するビリオンタンパク質を産生するための、複製能力のないウイルスゲノムに由来する少なくとも一つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列を、複製能力のあるＡＡＶの産生を伴わずに含んでもよい。
ＡＡＶをパッケージングするためのヘルパープラスミドは当技術分野で公知であり、例えば、米国特許公開第２００４／０２３５１７４ Ａ１号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。その中で記載されるように、ＡＡＶヘルパープラスミドは、ヘルパーウイルスＤＮＡ配列として、非限定的な例として、それらのそれぞれのオリジナルのプロモーターによってまたは異種プロモーターによって制御される、Ａｄ５遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡを含有してもよい。ＡＡＶヘルパープラスミドは、蛍光タンパク質などのマーカータンパク質の発現用の発現カセットを追加的に含有して、所望の標的細胞のトランスフェクションの単純な検出を可能にする場合がある。
本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶヘルパープラスミドのうちのいずれか一つ、および本明細書に開示されるＡＡＶベクターのうちのいずれか一つを用いてパッケージング細胞株をトランスフェクトすることを含む、ＡＡＶ粒子を生成する方法を提供する。実施形態では、ＡＡＶヘルパープラスミドおよびＡＡＶベクターは、パッケージング細胞株へと共トランスフェクトされる。実施形態では、細胞株は、哺乳類細胞株、例えば、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である。本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶベクターおよび／またはＡＡＶ粒子のうちのいずれか一つを含む細胞を提供する。
医薬組成物
本開示は、本明細書に記載されるＡＡＶベクター、ＡＡＶカプシド、および／またはＡＡＶ粒子のうちのいずれか一つを含む医薬組成物を提供する。典型的に、ＡＡＶ粒子は治療のために投与される。
本明細書に記載されるように、医薬組成物は、薬理学の技術分野で公知のまたは開発された任意の方法によって製剤化されてもよく、この方法には、活性成分（例えば、ウイルス粒子または組み換えベクター）を賦形剤または他の副成分と接触させ、産物を用量単位に分けるか、またはパッケージングすることが含まれるが、これらに限定されない。本開示のウイルス粒子は、所望の特徴、例えば、安定性の増加、細胞トランスフェクションの増加、徐放性または遅延放出、生体分布または指向性、インビボでのコードされたタンパク質の調節または強化された翻訳、およびインビボでのコードされたタンパク質の放出プロファイルを有して製剤化されてもよい。
このように、医薬組成物は、生理食塩水、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ナノ粒子模倣体、またはこれらの組み合わせをさらに含んでもよい。実施形態では、医薬組成物はナノ粒子として製剤化される。実施形態では、ナノ粒子は自己組織化核酸ナノ粒子である。
本開示による医薬組成物は、単一単位用量として、および／または複数の単一単位用量として、バルクで調製、パッケージング、および／または販売されてもよい。活性成分の量は、対象に投与されることになる活性成分の投与量、および／またはこうした用量の好都合な割合（例えば、こうした用量の１／２または１／３など）と概して等しい。本発明の製剤は、各々が共に、ウイルスベクターの安定性を増加させ、ウイルスベクターによる細胞トランスフェクションまたは形質導入を増加させ、ウイルスベクターをコードするタンパク質の発現を増加させ、かつ／またはウイルスベクターをコードするタンパク質の放出プロファイルを変更する量である、一つ以上の賦形剤を含むことができる。実施形態では、医薬組成物は賦形剤を含む。賦形剤の非限定的な例としては、溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
実施形態では、医薬組成物は凍結防止剤を含む。「凍結防止剤」という用語は、凍結中に物質への損傷を減少または除去する能力を有する薬剤を指す。凍結防止剤の非限定的な例としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース、ラフィノース、および／またはマンニトールが挙げられる。
治療方法
本開示は、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物のうちのいずれか一つを対象に投与することを含む、本質的に対象に投与することから成る、または対象に投与することから成る、障害を予防または処置する方法を提供する。
実施形態では、障害は、ＣＮＳ障害、皮膚障害、肺障害、筋肉障害、肝臓障害、または眼疾患（または網膜疾患）である。実施形態では、障害は嚢胞性線維症である。
実施形態では、障害は、低ホスファターゼ症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、劣性ジストロフィー性表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、リソソーム蓄積障害（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、およびベッカー型筋ジストロフィーを含む）、若年性バッテン病、乳児バッテン病、常染色体優性障害、筋ジストロフィー、ビエッティの結晶性ジストロフィー、網膜分離症（例えば、変性、遺伝性、牽引性、滲出性）、血友病Ａ、血友病Ｂ、多発性硬化症、糖尿病、ファブリー病、ポンペ病、神経セロイドリポフスチン症１（ＣＬＮ１）、ＣＬＮ３疾患（または若年性神経セロイドリポフスチン症）、ゴーシェ病、癌、関節炎、筋消耗、心臓病、内膜過形成、レット症候群、てんかん、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー症候群（ＭＰＳ ＩＨ）、スライ症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群Ａ（ムコ多糖症ＩＩＩＡまたはＭＰＳＩＩＩＡ）、サンフィリッポ症候群Ｂ（ムコ多糖症ＩＩＩＢまたはＭＰＳＩＩＩＢ）、サンフィリッポ症候群Ｃ、サンフィリッポ症候群Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群、クラッベ病、フェニルケトン尿症、脊髄性大脳性運動失調症、ＬＤＬ受容体欠損症、高アンモニア血症、貧血、関節炎、またはアデノシンデアミナーゼ欠損症である。
本明細書に開示される特定の導入遺伝子に加えて、公知の活性酵素配列が、機能的酵素活性を送達するための導入遺伝子として使用されてもよい。
嚢胞性線維症の処置のための課題のうちの一つは、ウイルス粒子内のＣＦＴＲ遺伝子のパッケージングにおけるサイズ制限、および肺細胞へのウイルス粒子の送達の困難である。本開示のＡＡＶ粒子は、効率的にパッケージングされ、かつより良好な肺指向性を有するＣＦＴＲ導入遺伝子構築物を提供することによって、これらの問題を解決する。したがって、実施形態では、本開示は、嚢胞性線維症を処置するための組成物および方法を提供する。
実施形態では、障害はＣＬＮ３疾患である。ＣＬＮ３疾患または若年性神経セロイドリポフスチン症は、ＣＬＮ３遺伝子の常染色体劣性遺伝突然変異によって引き起こされるリソソーム蓄積症である。ＣＬＮ３疾患は、中枢神経系（ＣＮＳ）が大きな影響を受け、行動の問題、視力喪失、および他の認知障害をもたらす進行性神経変性疾患である。
実施形態では、障害はファブリー病である。ファブリー病は、糖脂質産物、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）、およびリソソーム中のｌｙｓｏ－Ｇｂ３の蓄積をもたらすアルファガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）活性の欠損によって引き起こされるＸ連鎖リソソーム蓄積障害である。疾患提示は高度に不均一であるが、通常、末梢神経栄養疼痛、被角血管腫、発汗の減少、角膜ジストロフィー、および消化管合併症の頻繁な発作を含む。疾患が進行するにつれ、患者は心筋症、腎機能不全、脳血管疾患に罹患し、そのすべてがファブリー病患者の寿命短縮の主因である。男性は、ＧＬＡ遺伝子に突然変異を有する重症度が最も高い患者の集団であるが、女性患者も症状を示すものの誤診されることが多いことが次第に明らかになっている。酵素補充療法（ＥＲＴ）は、現在のところ、ファブリー病を処置するための唯一のＦＤＡに承認された治療法であり、比較的大量の組み換えタンパク質の隔週の注射を必要とする。ＥＲＴは心臓、腎臓、および血管系におけるＧｂ３の蓄積を減少させるが、主としてＣＮＳに効率的に入ることができないことに起因して、ファブリー病のすべての症状を完全に処置することができない。遺伝子療法戦略が研究されており、その多くが糖脂質の蓄積を補正する点で大いに有望であることを示しているが、多くはＣＮＳに効率的に入ることができず、またＧＬＡ補充中にしばしば見られる免疫応答に苦しんでいる。
実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶウイルスベクターは、ＥＲＴに応答しない患者、またはＥＲＴがすべての症状に対処することができない場合に、ファブリー病を処置するために使用される。実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶウイルスベクターは、すでにＥＲＴを投与された患者におけるファブリー病を処置するために使用される。
実施形態では、障害はポンペ病である。ポンペ病は、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性の欠損によって引き起こされるリソソーム蓄積障害であり、リソソーム内のグリコーゲンの蓄積をもたらす。この疾患は、主に平滑筋および横紋筋組織の両方に影響を与える筋ジストロフィーの形態として現れるとともに中枢神経系（ＣＮＳ）にも影響を与え、早期死亡を伴う。酵素補充療法（ＥＲＴ）は、現在のところ、ポンペ病を処置するための唯一のＦＤＡに承認された治療法であり、比較的大量の組み換えタンパク質の隔週の注射を必要とする。ＥＲＴは、典型的には治療を行わない場合には２歳までに死亡する乳児型ポンぺ病患者の死亡率を著しく減少させるが、主にＣＮＳに効率的に入ることができないこと、およびＧＡＡタンパク質に対する免疫応答がもたらされることに起因して、ポンぺ病のすべての症状を完全に改善することはできない。遺伝子療法戦略が研究されており、その多くが、グリコーゲン蓄積およびポンペ病のその他の症状を補正する点で大いに有望であることを示している。ほとんどが、ＧＡＡ補充中に見られる重度の免疫応答に悩まされている。これまでの研究は、肝臓に特異的な発現が動物をＧＡＡタンパク質に耐性を与え、かつ体液性応答を著しく減少させることができることを実証している。
実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶウイルスベクターは、すでにＥＲＴを投与された患者、例えば、ＥＲＴに応答しない患者、またはＥＲＴが患者のすべての症状に対処できない場合に、ポンペ病を処置するために使用される。
実施形態では、癌は固形癌、例えば、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、***癌、口腔癌、肝臓癌、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺癌、非黒色腫皮膚癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、小細胞肺腫瘍、または甲状腺である。
実施形態では、障害は眼疾患である。眼は免疫特権組織である。治療上の利益のためには、非常に少数のウイルスのみが必要である。実施形態では、眼疾患は光受容体およびＲＰＥ細胞に影響を及ぼす。一部の実施形態では、眼疾患は、網膜色素変性症（例えば、常染色体劣性（ＳＰＡＴＡ７遺伝子、ＬＲＡＴ遺伝子、ＴＵＬＰ１遺伝子）、常染色体優性（ＡＩＰＬ１遺伝子）、およびＸ連鎖（ＲＰＧＲ遺伝子））、ベストロフィン－１（ＢＥＳＴ－１）遺伝子における変異に関係する眼障害（例えば、卵黄様黄斑ジストロフィー、加齢黄斑変性、常染色体優性硝子体網脈絡膜症、緑内障、白内障）、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ；アリール－炭化水素相互作用タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）遺伝子、錐体－ロッドジストロフィー（ＣＲＤ；ＡＢＣＡ４遺伝子）、シュタルガルト病（ＡＢＣＡ４遺伝子）、先天性脈絡膜欠如（ＣＨＭ遺伝子）、アッシャー症候群（ＭＹＯ７Ａ遺伝子、ＣＤＨ２３遺伝子； ＵＳＨ２Ａ遺伝子； ＣＬＲＮ１遺伝子）、網膜分離症（ＲＳ１遺伝子）、ビエッティの結晶性ジストロフィー（ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子）または色覚異常（ＣＮＧＡ３遺伝子、ＣＮＧＢ３遺伝子、ＧＮＡＴ２遺伝子、ＰＤＥ６Ｃ遺伝子、またはＰＤＥ６Ｈ遺伝子）を含む、本質的にこれらから成る、もしくはこれらから成る。
実施形態では、対象は哺乳類、例えば、ヒトである。特定の態様では、ヒトは、ヒトの幼児であり、例えば、３歳未満、２歳未満、または１歳未満である。
本明細書に開示される処置および予防の方法は、治療または予防のための患者を特定し、かつ選択するために、適切な診断技法と組み合わせられてもよい。例えば、本明細書に開示される障害、例えば、嚢胞性線維症を処置または予防する方法は、対象の障害に関連する遺伝子変異または欠失を特定するために遺伝子検査を実施する工程をさらに含んでもよい。実施形態では、障害、例えば、嚢胞性線維症を処置または予防する方法は、障害に関連する変異を担持している、または障害を発症するリスクが高い（例えば、遺伝性因子に基づいて）と以前に特定された対象に投与することを含む。
本開示は、宿主細胞中のタンパク質のレベルを増加させる方法を提供し、宿主細胞を、本明細書に開示されるＡＡＶ粒子のうちのいずれか一つと接触させることを含み、ＡＡＶ粒子は、タンパク質をコードするＨＮＡ配列を含む、本明細書に開示されるＡＡＶベクターのうちのいずれか一つを含む。実施形態では、タンパク質は治療用タンパク質である。実施形態では、宿主細胞は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボである。実施形態では、宿主細胞は対象に由来する。実施形態では、対象は、正常な対象におけるタンパク質のレベルおよび／または機能性と比較して、タンパク質のレベルおよび／または機能性の減少をもたらす障害に罹患する。
実施形態では、タンパク質のレベルは、宿主細胞内で約１×１０－７ｎｇ、約３×１０－７ｎｇ、約５×１０－７ｎｇ、約７×１０－７ｎｇ、約９×１０－７ｎｇ、約１×１０－６ｎｇ、約２×１０－６ｎｇ、約３×１０－６ｎｇ、約４×１０－６ｎｇ、約６×１０－６ｎｇ、約７×１０－６ｎｇ、約８×１０－６ｎｇ、約９×１０－６ｎｇ、約１０×１０－６ｎｇ、約１２×１０－６ｎｇ、約１４×１０－６ｎｇ、約１６×１０－６ｎｇ、約１８×１０－６ｎｇ、約２０×１０－６ｎｇ、約２５×１０－６ｎｇ、約３０×１０－６ｎｇ、約３５×１０－６ｎｇ、約４０×１０－６ｎｇ、約４５×１０－６ｎｇ、約５０×１０－６ｎｇ、約５５×１０－６ｎｇ、約６０×１０－６ｎｇ、約６５×１０－６ｎｇ、約７０×１０－６ｎｇ、約７５×１０－６ｎｇ、約８０×１０－６ｎｇ、約８５×１０－６ｎｇ、約９０×１０－６ｎｇ、約９５×１０－６ｎｇ、約１０×１０－５ｎｇ、約２０×１０－５ｎｇ、約３０×１０－５ｎｇ、約４０×１０－５ｎｇ、約５０×１０－５ｎｇ、約６０×１０－５ｎｇ、約７０×１０－５ｎｇ、約８０×１０－５ｎｇ、または約９０×１０－５ｎｇのレベルまで増加する。
本開示は、本明細書に開示される有効量のＡＡＶウイルスベクター粒子のうちのいずれか一つと細胞を接触させることを含む、対象の遺伝子を対象内の細胞に導入する方法を提供し、粒子は、対象の遺伝子を含む、本明細書に開示されるＡＡＶベクターのうちのいずれか一つを含有する。
投与量および投与
最も有効な手段および投与量の投与を決定する方法は、当業者に公知であり、また治療のために使用される組成物、治療の目的、および処置される対象によって変化することになる。単回投与または複数回投与は、処置担当医によって選択される用量レベルおよびパターンで実施することができる。投与量は、投与経路によって影響される場合があることが留意される。薬剤の適切な投与剤形および投与の方法は、当技術分野で公知である。こうした適切な投与量の非限定的な例は、１投与当たり１０９個ほど少ない数から１０１７個ほど多い数までのベクターゲノムとすることができる。
本明細書に記載される方法の実施形態では、対象に投与されるウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ）の数は、約１０９～約１０１７個の範囲である。具体的には、一部の実施形態では、約１０１０～約１０１２、約１０１１～約１０１３、約１０１１～約１０１２、約１０１１～約１０１４、約５×ｌ０１１～約５×１０１２、または約１０１２～約１０１３個のウイルス粒子が対象に投与される。ヒトの眼への投与については、約１×１０１０ｖｇ／眼の総用量を使用してもよく、またマウスの眼に対しては、５×１０９ｖｇ／眼の総用量を使用してもよい。動物における有効性／安全性をモニターするために、非侵襲的なインビボ撮像技法を使用することができ、これには、走査型レーザー眼底検査（ＳＬＯ）、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、多光子顕微鏡、フルオレセイン血管造影が挙げられるが、これらに限定されない。
実施形態では、ＡＡＶ粒子は、対象内の遺伝子欠損を修復する。実施形態では、順調に処置された細胞、組織、器官、または対象における、修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの修復されていない標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する比率は、少なくとも、約１．５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１０００：１、約１０，０００：１、または約１００，０００：１、または約１，０００，０００：１である。修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量または比率は、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＰＣＲ、シーケンシング、マススペクトロメトリー、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、次世代シーケンシング、免疫ブロット、およびＥＬＩＳＡを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。
実施形態では、ウイルス粒子は、対象に、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは眼周囲、経口、直腸内、経粘膜的、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、胸膜内、局所的、リンパ管内、嚢内で導入され、こうした導入はまた、動脈内、心臓内、脳室下、硬膜外、脳内、側脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、腹腔内、子宮内、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。実施形態では、ウイルス粒子は、非限定的な例としては、例えば、肺、眼、またはＣＮＳなど、所望の標的組織に送達される。実施形態では、ウイルス粒子の送達は全身的である。嚢内投与経路は、脳室の脳脊髄液の中へと薬物を直接的に投与することを含む。これは、大槽の中への直接注射によって、または永久的に位置する管を介して実施することが可能である。
眼疾患（または眼障害）を眼内で処置するために、涙腺（ＬＧ）投与、局所的点眼、角膜への基質内投与、前房内投与（前眼房）、硝子体内投与、網膜下投与、全身投与、またはこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない、当業者に公知の複数の投与方法がある。遺伝的眼障害の８０％は光受容体内で生じる。少量の遺伝子療法の硝子体内送達は、外来患者のクリニックで行うことができる。
本開示のＡＡＶベクター、ＡＡＶ粒子、または組成物の投与は、処置の過程全体を通して、１回の用量で、連続的に、または断続的に、実施することができる。実施形態では、本開示のＡＡＶベクター、ＡＡＶ粒子、または組成物は、注射、注入、または移植によって非経口的に投与される。
実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、脳および頸椎に対して強化された指向性を示す。実施形態では、本開示のウイルス粒子は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、網膜下注射および硝子体内注射による高い網膜指向性を示す。実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、例えば、錐体、ロッド、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）などの複数の眼細胞タイプを標的とする。実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、天然血清型に対する中和抗体を逃れ、それ故に潜在的な再投与を可能にする。さらなる態様では、本開示のＡＡＶ粒子および組成物は、処置される障害に対する他の公知の処置と組み合わせて投与されてもよい。
キット
本明細書に記載される薬剤、ベクター、または組成物は、実施形態では、治療、診断、または研究用途におけるそれらの使用を容易にするために、医薬または診断または研究キットへと組み立てられてもよい。実施形態では、本開示のキットは、本明細書に記載されるように、改変されたＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ粒子、宿主細胞、単離された組織、組成物、または医薬組成物のうちのいずれか一つを含む。
実施形態では、キットはさらに、使用のための取り扱い説明を含む。具体的には、こうしたキットは、意図される用途およびこれらの薬剤の適切な使用を記述する取り扱い説明とともに、本明細書に記載される一つ以上の薬剤を含んでもよい。例として、実施形態では、キットは、キットの一つ以上の構成要素を混合するため、ならびに／または試料を単離および混合し、かつ対象に適用するための取り扱い説明を含んでもよい。実施形態では、キット内の薬剤は、特定の用途および薬剤の投与方法に適した医薬製剤および投与量の状態にある。研究目的のキットは、様々な実験を実施するための適切な濃度または量の成分を含有してもよい。
キットは、本明細書に記載される方法の使用を容易にするように設計されてもよく、また多くの形態を取ることができる。キットの組成物の各々は、該当する場合、液体形態（例えば、溶液）で、または固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供されてもよい。特定の事例では、組成物のうちの一部は、例えば、キットと共に提供されてもよく、または提供されなくてもよい、適切な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）の添加によって、構成可能であってもよく、またはそうでなければ処理可能（例えば、活性形態）であってもよい。実施形態では、組成物は、保存溶液（例えば、凍結保存溶液）中で提供されてもよい。保存溶液の非限定的な例としては、ＤＭＳＯ、パラホルムアルデヒド、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カナダ、バンクーバー）が挙げられる。実施形態では、保存溶液は、ある量のメタロプロテアーゼ阻害剤を含有する。
実施形態では、キットは、本明細書に記載される構成要素のうちの任意の一つ以上を、一つ以上の容器内に含有する。それ故に、実施形態では、キットは、本明細書に記載される薬剤を収容する容器を含んでもよい。薬剤は、液体、ゲル、または固体（粉末）の形態であってもよい。薬剤は、滅菌して調製され、シリンジ内にパッケージングされ、かつ冷蔵されて出荷されてもよい。代替的に、これらは、保存のためにバイアルまたは他の容器に収容されてもよい。第二の容器は、滅菌して調製された他の薬剤を有してもよい。代替的に、キットは、シリンジ、バイアル、管、または他の容器内に、予め混合され、かつ出荷される活性薬剤を含んでもよい。キットは、シリンジ、局所適用装置、またはＩＶ針管およびバッグなどの、薬剤を対象に投与するために必要とされる構成要素のうちの一つ以上またはすべてを有してもよい。
本発明は上記の実施形態と併せて記述されているが、前述の記述および実施例は、本発明の範囲を例証することを意図しており、限定することを意図していないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点、および修正は、本発明が関連する当業者に明らかであろう。
加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の観点で記述される場合、当業者は、それによって、本発明が、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点でも記述されることを認識するであろう。
実施例
［実施例１］
［カプシド生成プラットフォーム］
本明細書に提供される一部のＡＡＶカプシド配列（例えば、ＡＡＶ２０４、ＡＡＶ１１０）は、図１に示すＡＡＶカプシド生成プラットフォームを使用して生成される。簡潔に述べると、プラットフォームは、ＤＮａｓｅ Ｉ断片化工程、およびアセンブリおよび増幅工程を含み、最終的にキメラカプシドライブラリーの形成をもたらす。本明細書に提供される他のＡＡＶカプシド配列（例えば、ＡＡＶ２１４）は、合理的な設計によって生成される。
これらの方法論を使用して生成されたカプシドタンパク質を、既知のＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列とアライメントすることによって解析した。ＡＡＶ２０４（配列番号２）およびＡＡＶ６（配列番号６３）からのＶＰ１タンパク質配列の配列アライメントを図２０に示す。ＡＡＶ２１４、ＡＡＶ２１４Ａ、ＡＡＶ２１４ｅ、ＡＡＶ２１４ｅ８、ＡＡＶ２１４ｅ９、ＡＡＶ２１４ｅ１０、ＡＡＶ２１４ＡＢ、およびＡＡＶ ＩＴＢ１０２＿４５のＶＰ１アミノ酸配列の配列アライメントを、図２１に提供する。ＡＡＶ２１４、ＡＡＶ２１４Ａ、ＡＡＶ２１４ｅ、ＡＡＶ２１４ｅ８、ＡＡＶ２１４ｅ９、ＡＡＶ２１４ｅ１０、ＡＡＶ２１４ＡＢ、およびＡＡＶ ＩＴＢ１０２＿４５のＶＰ２アミノ酸配列の配列アライメントを、図２２に提供する。ＡＡＶ２１４、ＡＡＶ２１４Ａ、ＡＡＶ２１４ｅ、ＡＡＶ２１４ｅ８、ＡＡＶ２１４ｅ９、ＡＡＶ２１４ｅ１０、ＡＡＶ２１４ＡＢ、およびＡＡＶ ＩＴＢ１０２＿４５のＶＰ１アミノ酸配列の配列アライメントを、図２３に提供する。
ウイルスベクターは、当技術分野で公知の標準的な三重トランスフェクション法を使用して作製されてもよい。簡潔に述べると、ウイルスカプシドタンパク質、ヘルパータンパク質（例えば、必須ウイルスＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質）、ならびに対象の導入遺伝子をそれぞれ発現する三つの別個のプラスミドは、接着細胞または懸濁液２９３細胞へとトランスフェクトされ、そしてウイルス粒子は、その後、超遠心分離またはクロマトグラフィーを使用して採取され、続いて透析濾過／限外濾過および末端の滅菌濾過が行われる。例えば、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．４０－４６ ａｔ ４４（Ｎｏｖ．２０１８）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２５，ｐｐ．２６１－６８ ａｔ ２６２、およびＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．２０７９－９１（その各々はその全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
［実施例２］
［ＡＡＶ２１４ウイルスベクターおよびＡＡＶ２０４ウイルスベクターの特徴付け］
異なる標的組織におけるＡＡＶ２１４ウイルスベクターまたはＡＡＶ２０４ベクターの形質導入の効率を、下記に記述するように評価した。
ＥＧＦＰ導入遺伝子（ＡＡＶ２１４－ＧＦＰ）を含むＡＡＶ２１４ウイルスベクター、およびＥＧＦＰ導入遺伝子（ＡＡＶ９－ＧＦＰ）を含むＡＡＶ９ウイルスベクターの形質導入効率をインビトロで評価した。ＨＥＫ２９３細胞を、ウェル当たり５０，０００個の細胞で９６ウェルプレートに播種した。細胞を、５Ｅ＋５のＭＯＩでＡＡＶ２１４－ＧＦＰまたはＡＡＶ９－ＧＦＰを用いて形質導入した。形質導入の４５時間後に撮影された画像は、ＨＥＫ２９３細胞においてＡＡＶ２１４－ＧＦＰの形質導入効率がより高いことを明らかにした（図２Ａ）。本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、「ＧＦＰ」はＥＧＦＰを指すことに留意されたい（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｃ’ｎ．２２７（３）：７０７－１１を参照のこと）。
形質導入効率をインビボで試験するために、１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、２００μＬのＴＭＮ２００（２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、および０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）中の２Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ２１４－ＧＦＰまたはＡＡＶ９－ＧＦＰを静脈内（ＩＶ）注射によって投与した。１３日後、マウスを安楽死させ、内臓（脳、脊髄（頸部および腰部）、座骨神経、眼、心臓、腎臓、肝臓、肺、精巣、脾臓、および筋肉）の組織サンプルを収集し、かつＧＦＰ遺伝子コピー数推定のために絶対ｑＰＣＲアプローチを使用して総ＤＮＡを単離し、解析した。得られたＡＡＶ生体分布データを、統計解析用のＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してプロットした。対数変換されたデータに対して実施された非対のｔ検定では、試験したほとんどの組織においてＡＡＶ９－ＧＦＰとＡＡＶ２１４－ＧＦＰとの形質導入効率間に統計的有意差は示されなかった（ｐ＜０．０５）。しかしながら、座骨神経および筋肉の場合、ＡＡＶ２１４－ＧＦＰを投与した動物から単離された総ＤＮＡのマイクログラム当たりの検出されたウイルスＤＮＡコピー数の平均値は高く、またＡＡＶ９－ＧＦＰを投与した動物とは統計的に有意に異なっていた（座骨神経：４．１倍、ｐ＝０．０２２８；筋肉：３倍、ｐ＝０．０１２５）（図２Ｂ）。
脳サンプルを二つの半部へと分割して、同じ実験を繰り返した。一つの半部を全ＤＮＡ単離に使用し、その後絶対ｑＰＣＲを使用した生体分布解析を行った。残りの半部は、総ＲＮＡ単離、ＤＮａｓｅ処理、ｃＤＮＡへの変換、およびｑＰＣＲ解析に使用されて、ＥＧＦＰ遺伝子発現レベルを定量化した。得られたＡＡＶ生体分布データおよび導入遺伝子発現データを、統計解析用のＰｒｉｓｍソフトウェアを使用してプロットした。対数変換されたデータに対して実施された非対のｔ検定では、脳組織において、ＡＡＶ９－ＧＦＰとＡＡＶ２１４－ＧＦＰとの形質導入効率間（ｐ＝０．７６６８）、または発現レベル間（ｐ＝０．０７０９）に統計的有意差は示されなかった（図２Ｃ）。
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、網膜下（右眼）および硝子体内（左眼）の両方の注射により、ＡＡＶ２０４－ＧＦＰ、ＡＡＶ１１０－ＧＦＰ、およびＡＡＶ２１４－ＧＦＰを含むＡＡＶウイルスベクターの組を投与した。１μＬの５Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ（５Ｅ＋９ｖｇ／眼）のＡＡＶベクターを両方の投与方法で注射し、そして動物を１０日後に、ＨＲＡ２ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｌａｓｅｒ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｅ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、米国カリフォルニア州カールズバッド市）で撮像した。白内障が十分な観察を妨げた画像は解析から省略した。眼底検査撮像により、試験されたウイルスはすべて、網膜下腔へと投与された場合に網膜細胞をトランスフェクトする能力を有することが明らかになった。しかしながら、ＡＡＶ２０４およびＡＡＶ１１０のみが、硝子体内送達によって媒介される網膜細胞の強化された形質導入を示した（図３Ａ）。ＡＡＶ２０４－ＧＦＰを硝子体内投与したマウスの眼の免疫組織化学解析は、光受容体、ＲＰＥ、ミュラーグリア細胞、網膜神経節細胞、および双極細胞を含む様々なタイプの網膜細胞においてＧＦＰ発現を実証した（図３Ｂ）。
ＡＡＶ２０４－ＧＦＰおよびＡＡＶ９－ＧＦＰは、各々約２ｋｇと秤量された２．５～３歳のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に髄腔内注射（１Ｅ＋１３ｖｇ）および／または硝子体内注射（１．５Ｅ＋１２ｖｇ）によって投与される。４週間後、動物を安楽死させ、そしてＧＦＰ発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した。データ解析は、ＡＡＶ２０４－ＧＦＰ媒介送達は、脳および脊髄の特定の区域を含む、アッセイされた組織のほとんどでＧＦＰ発現の強化をもたらすことを示した。図４を参照のこと。硝子体内投与（眼当たり１．５Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ２０４－ＧＦＰ）したカニクイザルの眼を、走査型レーザー眼底検査（ＳＬＯ）によって評価し、従来の免疫化学染色方法を使用して、ＧＦＰ、ロドプシン、およびゲノムＤＮＡについて切片化し、そして解析した。図５Ａおよび図５Ｂに示すように、ＡＡＶ２０４－ＧＦＰの投与は、眼の周囲網膜および中心窩領域におけるベクターの有意な形質導入をもたらした。ＡＡＶ２０４によって送達されるＧＦＰの強化された発現は、光受容体、ＲＰＥ、双極細胞、および神経節細胞を含む網膜細胞において見られた（図５Ｂ）。かなりの数のロッドおよび錐体を黄斑内に形質導入した（図５Ｃ）。
ＡＡＶ２０４ベクターは、ＲＰＥ特異的プロモーターと組み合わせて、タンパク質を特異的に発現することもできる。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２）プロモーターによって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示す（配列番号１５９）。２．５×１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターを硝子体内に投与し、そして発現を１４日目および２８日目（犠牲）にモニターした。走査型レーザー眼底検査（ＳＬＯ）撮像を１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に実施した。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。
また、ＡＡＶ２０４－ＧＦＰは、非ヒト霊長類の外植片培養でも評価された。カニクイザルの網膜を、動物が人道的に安楽死させてから１時間以内に眼から単離した。網膜を解剖して約５×５ｍｍの切片とし、そしてトランスウェルインサート培養ディッシュ内で培養した。単離の１日後、外植片を培養培地中でＡＡＶ２０４－ＧＦＰで形質導入し、そして形質導入後１週間インキュベートした。標準的な免疫組織化学のために、外植片を固定し、埋め込み、そして切片化した。切片をＧＦＰ（緑色）およびロドプシン（赤色）について染色し、そして蛍光顕微鏡を使用して撮像した。切片は、ＡＡＶ２０４－ＧＦＰ形質導入後の光受容体層において有意なＧＦＰ発現を示した（図６）。
ＡＡＶ２０４ベクターの免疫原性を、中和抗体アッセイを使用して評価した（図７）。ＡＡＶ９カプシドから成るＡＡＶ９－Ｌｕｃウイルスおよびホタルルシフェラーゼ発現カセット、またはＡＡＶ２０４カプシドから成るＡＡＶ２０４－Ｌｕｃウイルスおよびホタルルシフェラーゼ発現カセットのいずれかを、ＡＡＶ９処理したヒト対象由来の血清（処理後６０日）の様々な希釈物と共に、２５，０００のＭＯＩでインキュベートした。インキュベーション後、ウイルス／血清混合物を、２０，０００個のＬｅｃ２細胞を含有するウェルに移した。血清処理した細胞を２４時間インキュベートし、次いで放射した発光を測定し、そして同じＭＯＩで未処理ウイルスを用いて形質導入された細胞からの対照値と比較した。結果は、ＡＡＶ２０４ベクター粒子は、ＡＡＶ９ベクター粒子と比較して免疫原性が減少したことを示した（図８を参照のこと）。
［実施例３］
［ＡＡＶ２０４ウイルスベクターによって送達されたＣＦＴＲ導入遺伝子を使用した、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の変異によって引き起こされる欠陥の改善］
コドン最適化ＣＦＴＲ導入遺伝子をコードする核酸を含有するＡＡＶ２０４ベクター粒子（すなわち、配列番号４に記載され、かつ完全長ＣＦＴＲのアミノ酸７０８～７５９を欠くタンパク質をコードする、核酸配列を含むＣＦＴＲΔＲの遺伝子）を、５’から３’へと、５’ＩＴＲ、マウスＵ１ａプロモーター（配列番号９６）、ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子、合成ポリＡ配列（４９ｂｐ）、および３’ＩＴＲを有する、ｐＡ－ＣＦ３プラスミド（配列番号８９）を使用して調製した。結果として得られた粒子を使用して、以下に記述するように、ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子を細胞またはマウスのいずれかの中へと送達した。
インビトロアッセイ：ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子を含むＡＡＶ２０４ウイルスベクターを使用して、Ｌｅｃ２細胞を形質導入した。ＦＬＩＰＲアッセイを使用して、ＡＡＶ２０４－ＣＦＴＲΔＲウイルスベクターによって送達されるＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子の機能性を測定した。結果は、導入遺伝子を欠く対照ＡＡＶ２０４ウイルスベクターを用いてトランスフェクトされた細胞と比較して、細胞をＡＡＶ２０４－ＣＦＴＲΔＲウイルスベクターを使用して形質導入したときに、公知のＣＦＴＲ塩素チャネルの開栓剤であるフォルスコリンによる刺激によってヒトＣＦＴＲ（ｈＣＦＴＲ）イオンチャネル機能が回復したことを示している。さらに、塩素特異的な電流シグナルは、対照と比較すると、ＡＡＶ２０４－ＣＦＴＲΔＲウイルスベクターを使用して形質導入された細胞において、ベースラインと比較して３．５倍増加した。図１０Ａ、左パネルを参照のこと。ＣＦＴＲの選択的阻害剤である、ＣＦＴＲｉｎｈ－１７２（４－［［４－オキソ－２－チオキソ－３－［３トリフルオロメチル）フェニル］－５－チアゾリジニリデン］メチル］安息香酸）（Ｔｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｃｒｉｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｆｔｒｉｎｈ－１７２＿３４３０において入手可能）を用いたプレインキュベーションは、ＣＦＴＲΔＲの存在下でのフォルスコリンで誘導された膜電位の変化を防止する。図１０Ｂを参照のこと。これらの結果は、ＣＦＴＲΔＲ発現カセットの機能性を実証する。
膜電位アッセイを実施して、ＣＦＴＲΔＲ発現カセットの機能性が、トランスフェクションに使用されるＡＡＶ２０４－ＣＦＴＲΔＲウイルスの量に依存したかどうかを評価した。図１０Ｂを参照のこと。結果は、ＣＦＴＲΔＲの存在下での膜電位の変化が、実際に導入遺伝子を送達するウイルス粒子の用量に依存していたことを示す。我々はまた、ＡＡＶ２０４を使用して完全長ＣＦＴＲも発現し、そしてフォルスコリンに応答して増加した蛍光を得た。（図１０Ｃ）。また、ウェスタンブロットによって、ＡＡＶ２０４からの発現が完全に処理された完全長ＣＦＴＲおよびＣＦＴＲΔＲ（データは示さず）をもたらすことも確認した。これらのデータは、いずれかのタンパク質のＡＡＶ２０４送達が、インビトロで塩素チャネル機能を回復することを確認するものである。
マウスモデルを使用するインビボアッセイ：ルシフェラーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２０４ウイルスベクターを、マウスに気管内投与した。生物発光撮像（ＢＬＩ）を使用して、ＡＡＶ６と比較して、ルシフェラーゼ発現によって反映される肺細胞を形質導入するＡＡＶ２０４ウイルスベクターの能力を評価した。図９の上のパネルは、ＡＡＶ２０４ウイルスベクターによって媒介されるルシフェラーゼ発現が、ＡＡＶ６ウイルスベクターと比較して約３．５倍高いことを示す。図９の下のパネルは、左肺および右肺におけるエクスビボＢＬＩによって示される発現（肝臓または腎臓ではほとんどまたは全く発現しない）を例証する。これらの結果は、ＡＡＶ２０４ウイルスベクターが、マウスの特定の組織におけるレポーター導入遺伝子の発現の強化を促進する能力を有することを実証している。
ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子を含むＡＡＶ２０４ベクター粒子の有効性を、「Ｆ５０８ｄｅｌ」と称される嚢胞性線維症のマウスモデルにおいて試験した。これらのマウスは、ヒトにおいて最も一般的なＣＦＴＲ変異であり、ＣＦ患者の約９０％に影響を及ぼす、単一のアミノ酸Ｆ５０８の欠失を含む変異ＣＦＴＲ遺伝子を担持する（例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（Ｆｅｂ．１０，２０１６）１１（２）：ｅ０１４９１３１を参照のこと）。ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子またはルシフェラーゼ導入遺伝子含むＡＡＶ２０４ベクター粒子を、野生型マウスおよびＦ５０８ｄｅｌマウスに鼻腔内投与した。鼻電位差（ＮＰＤ）を測定し、ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子の機能性を決定した。図１２Ａに示されるように、ＡＡＶ２０４－ＣＦＴＲベクター粒子を投与されたマウスは、ルシフェラーゼ導入遺伝子（ＡＡＶ２０４－Ｌｕｃ）を含有する対照ベクターを投与されたマウスと比較して、修正されたフォルスコリン刺激電流を示した。
ヒト患者細胞を使用するアッセイ：嚢胞性線維症に罹患している患者から単離されたヒト気道細胞へのｈＣＦＴＲの送達を媒介し、かつこれらの細胞における塩素輸送を修正するＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子を含むＡＡＶ２０４ベクター粒子の能力を評価した。ＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶ２０４ベクター粒子を頂端区域および基底外側区画に適用したとき、ＡＡＶ２０４は、嚢胞性線維症患者から単離されたヒト鼻上皮および気管支上皮（ＨＮＥおよびＨＢＥ）細胞を形質導入し、そして空気－液体界面培養物中に維持した。図１１Ａを参照のこと。これらの細胞において、ＣＦＴＲΔＲタンパク質が膜局在化した。図１１Ｂの左パネルを参照のこと。図１１Ｂの右パネルは、膜局在化を例証するウェスタンブロットを示す。
ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子を含むＡＡＶ２０４ベクター粒子の機能性を、下記に記述されるように評価した。結果は、ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子を含むＡＡＶ２０４ベクターの形質導入後に、嚢胞性線維症患者に由来するヒト鼻上皮細胞の外植片培養においてＣＦＴＲ電流が回復したことを示す。図１１Ｃを参照のこと。また、ＡＡＶ粒子が、極性上皮の表面間のイオンの動きを測定するために当業者に公知のウッシングチャンバーを使用して膜貫通コンダクタンスの変化を測定することによって、ヒト嚢胞性線維症患者から単離された鼻細胞および気管支細胞においてＣＦＴＲ機能を回復させることが可能かどうかも試験した。簡潔に述べると、ウッシングチャンバーでは、上皮の頂端表面および基底外側表面は、対称的な塩溶液を含有する二つの別個のチャンバーに面する。上皮を横切るイオン輸送は、二つのチャンバー間に電位差を発生する。そうでない場合、電位差を作り出すことになる拡散力は、上皮を横切る短絡電流（Ｉｓｃ）を印加することによって、積極的に相殺される。これにより、当技術分野で周知のように、この電流の変化（ΔＩｓｃ）および嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスの計算によって測定される、刺激後の積極的な輸送によるイオンの移動が可能となる。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ（Ｊｕｌｙ ２００４）３：１２３－１２６、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（Ｆｅｂ．１０，２０１６）１１（２）：ｅ０１４９１３１を参照のこと。図１２Ｂに示すように、ＣＦＴＲΔＲが形質導入されるとき、フォルスコリン刺激され、ＣＦＴＲｉｎｈ－１７２阻害された電流は、ビヒクルと比較して６～７μＡ／ｃｍ２へと回復した。
まとめると、我々の結果は、ＡＡＶ２０４が高発現の機能性ＣＦＴＲの効率的な送達を媒介し、さらにマウスモデルおよびヒト患者細胞の外植片培養において、インビトロで細胞内のＣＦＴＲ機能を回復させることを示している。これらの結果は、ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子を含むＡＡＶ２０４粒子の嚢胞性線維症における治療の潜在能力を実証する。
［実施例４］
［ＡＡＶ２１４ベクターによって送達される最適化されたＣＬＮ３導入遺伝子を使用するＣＬＣＬＮ３疾患によって生じた欠陥の改善］
全身投与後にＣＮＳ組織に対する指向性が増強されたＡＡＶカプシド（ＡＡＶ２１４）、およびＣＮＳおよび体細胞組織における生体分布および発現を改善するための最適化されたＣＬＮ３（配列番号１２２の核酸配列を含む）導入遺伝子カセットが開発され、かつ機能性について試験された。ＡＡＶ９をベンチマークとして使用して、ＣＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおいてＣＬＮ３（ＣＬＮ３Δｅｘ７／８）のエクソン７およびエクソン８にわたる１．０２ｋｂセグメントを欠く若年性神経セロイドリポフスチン症のマウスモデルにおけるＡＡＶ２１４の指向性および最適化されたＣＬＮ３導入遺伝子カセットの生体分布を評価した。このＣＬＮ３欠失は、変異したＣＬＮ３対立遺伝子のおよそ８５％で発生し、かつ運動障害、グリア活性化、およびリソソーム蓄積物質の進行性蓄積を含む、ヒト疾患に関連する多くの疾患表現型を反復するものである。
Figure 2022515338000009
ＣＬＮ３導入遺伝子（それぞれＡＡＶ９－ＣＬＮ３およびＡＡＶ２１４－ＣＬＮ３）を各々含むＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４ウイルスベクターを、野生型マウスに２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ（ウイルスベクターゲノム／キログラム）の用量で静脈内投与した。表６を参照のこと。３０日後、動物を人道的に犠牲にし、そして生体分布解析のために組織を採取し、ＣＮＳおよび脊髄（頸部および腰部）の一次領域を含むいくつかの異なる器官へのベクター粒子の送達を評価した。対数変換されたデータのｔ検定解析では、試験されたほとんどの組織について、生体分布値におけるＡＡＶ２１４－ＣＬＮ３とＡＡＶ９－ＣＬＮ３との間の統計的有意差は示されなかった（図１３を参照のこと）。しかしながら、ＡＡＶ２１４－ＣＬＮ３を使用する座骨神経は、ＡＡＶ９と比較して統計的に生体分布が優位に（ｐ＝０．０００１）高いこと（７４４％）を実証し、一方で脾臓はＡＡＶ９－ＣＬＮ３を用いてより良好に形質導入された（ｐ＜０．０００１）。より長い期間にわたって発現および用量応答を評価する現在の研究は、全身投与を介してＣＬＮ３発現カセットをＣＮＳ組織に効果的に送達するためＡＡＶ２１４－ＣＬＮ３を使用することができることを示す。
ＣＬＮ３導入遺伝子の発現を、脳の左半球から単離された総ＲＮＡを使用してＲＴｑＰＣＲによって評価した。対数変換されたデータの一元配置分散分析は、ＡＡＶ９－ＣＬＮ３ＣＬＣＬＮ３対ＡＡＶ２１４－ＣＬＮ３投与動物の平均ＣＬＮ３発現値における統計的有意差を示さなかった（ｐ＝０．４４８９）。しかしながら、試験されたウイルスベクターは両方とも、対照より高いＣＬＮ３発現レベルを産生した（ｐ＜０．０００１；図１４）。
要約すると、これらの結果は、ＣＬＮ３疾患のマウスモデルにおいて全身投与を介して投与された場合、最適化されたＣＬＮ３発現カセットを含む新規のＡＡＶ２１４ウイルスベクターが、ＣＮＳを含むほとんどの組織において、ＡＡＶ９と同等の指向性を実証することを示した。これらの結果は、本明細書に記載される最適化されたＣＬＮ３導入遺伝子を含むＡＡＶ２１４ベクターを、ＣＬＮ３疾患の予防および処置に使用することができることを示す。
［実施例５］
［ＡＡＶ２１４ベクターによって送達される最適化されたＧＬＡ導入遺伝子を使用するファブリー病によって生じた欠陥の改善］
ＣＢｈプロモーター、ＣＢＡ－ＭＶＭハイブリッドイントロン、天然ＧＬＡ導入遺伝子配列、およびＴＫ６５ポリＡ部位を含むＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４ウイルスベクターを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＩＶ注射によって投与した（表７を参照のこと）。血漿サンプル中の予想されるトランスジェニックＧＬＡタンパク質サイズは、免疫ブロッティングによって確認された（図１５）。ＧＬＡ酵素活性を、血漿、脳、脊髄、心臓、腎臓、肝臓、および眼において評価した。対数変換されたＧＬＡ酵素活性値に対して実施された統計解析では、すべてのＡＡＶ２１４－ＧＬＡ形質導入サンプルが、対照と比較して、統計的に有意に高いＧＬＡ活性を有していたことが示された（ｐ＜０．０００１）。また、ＧＬＡ酵素活性は、ＡＡＶ２１４－ＧＬＡにおいて形質導入された血漿、脳、および脊髄組織において、ＡＡＶ９－ＧＬＡと比較して、統計的に有意に高かった（図１６）。要約すると、ＧＬＡ酵素活性の解析は、複数の標的組織、特にＣＮＳ組織へのＡＡＶ２１４構築物の有効な形質導入を示し、ファブリー病を有する対象におけるＡＡＶ２１４ベクターの治療的利益を実証している。
Figure 2022515338000010
野生型動物における１０日間の試験後、ＡＡＶ９ウイルスベクターまたはＡＡＶ２１４ウイルスベクターを介したＧＬＡ導入遺伝子の全身投与に由来する急性毒性効果は観察されなかった。この実験で処置された動物は、処置に起因するいかなる悪作用も呈しなかった。全身投与後のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４の標的組織、特にＣＮＳ、心臓、および腎臓への有効な送達は、ファブリー病に関連する重要な標的組織へ安全に形質導入する能力を実証する。
［実施例６］
［ＡＡＶ２１４ベクターによって送達される最適化されたＧＡＡ導入遺伝子を使用するポンペ病によって生じた欠陥の改善］
ＣＢｈプロモーター、ＣＢＡ－ＭＶＭハイブリッドイントロン、コドン最適化ＧＡＡ導入遺伝子配列、およびＢＧＨポリＡ部位を含むＡＡＶ９－ＧＡＡベクターおよびＡＡＶ２１４－ＧＡＡベクターを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内投与した（表８を参照）。導入遺伝子が標的組織に有効に送達されたかどうかを判定するために、ＧＡＡ酵素活性タンパク質を、処置したマウスからの脳、脊髄、横隔膜、二頭筋、肝臓、および血漿で試験した。ＧＡＡ酵素活性の対数変換された値の一元配置分散分析は、対照動物と比較して、投与された動物のすべての試験された組織において、統計的に有意に高いＧＡＡ活性を有していたこと（ｐ＜０．００２）を明らかにした。ＡＡＶ９がわずかな利点を有していた血漿（ｐ＝０．００１８）を除き、ＡＡＶ２１４を投与した組織とＡＡＶ９を投与した組織との間には、酵素活性に統計的有意差は示されなかった（図１９Ａ～Ｅ）。ＧＡＡ酵素活性の解析により、血液脳関門を通過する能力、および二頭筋および横隔膜などのポンぺ病の処置に重要な組織への形質導入を含む、複数の標的組織へのＡＡＶ２１４構築物の有効な形質導入を確認した（図１９）。これらの結果は、本明細書に記載される最適化されたＧＡＡ発現カセットを含むＡＡＶ２１４ウイルスベクターの単一の静脈内注射が、標的組織への修正されたＧＡＡ導入遺伝子の送達を達成するのに十分である場合があることを示唆している。野生型動物における１０日間の試験後、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ２ｌ４ベクターを介したＧＡＡ導入遺伝子の全身投与に由来する急性毒性効果は観察されなかった。
図１９Ｆは、ＡＡＶ送達されたＧＡＡによる根底にある分子病理の修復を示す。コドン最適化ヒトＧＡＡでパッケージされたＡＡＶカプシドで静脈内で処置されたｇａａ－／－マウスからのグリコーゲン解析。グリコーゲン含有量は、アミログルコシダーゼ処置後のグルコースの放出によって間接的に測定された。遊離グルコースを、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて測定し、そしてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘで解析した。データは、ｇａａ－／－ビヒクル対照処置動物の％として提示される。データは、ＡＡＶ送達ＧＡＡによって得られたグリコーゲンレベルの減少を示す。ＡＡＶ９と同じ程度有効に機能するＡＡＶ２１４を有するすべての標的組織において、グリコーゲンクリアランスが観察された。
これらのデータは、特に筋肉および末梢神経系（ＰＮＳ）発現を有するＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４の全身送達が、ポンペ病に関連する重要な標的組織に安全に形質導入する能力と、ＧＡＡ機能性を回復する能力との両方を実証することを確認する。
Figure 2022515338000011
［実施例７］
［ＡＡＶ１１０ベクター粒子は、高度に特異的な筋指向性を示す］
ＡＡＶ１１０カプシドタンパク質をコードするｐＡＡＶ１１０プラスミド（ＩＴＣｏｒｄ１．１０プラスミドとも呼ばれる）を使用してＡＡＶ１１０粒子を調製した。ＣＢｈプロモーター、ＣＢＡ－ＭＶＭハイブリッドイントロン、ＥＧＦＰ導入遺伝子配列、およびＢＧＨポリＡ部位を含むＡＡＶ１１０－ＧＦＰウイルスベクターを、Ｃ５７Ｂｌ／６野生型マウスに単一の注射で各脚（大腿二頭筋）へと投与した（合計で１×１０１１ｖｇ、５×１０１２ｖｇ／ｋｇと同等）。動物の別の群に、比較のために同等の量のＡＡＶ９－ＧＦＰウイルスベクターを投与した。
ＧＦＰ発現は、脚の筋肉を蛍光について撮像することによって評価された。図２４Ａ。データは、ＡＡＶ１１０－ＧＦＰウイルスベクターを投与された左脚および右脚の両方が高レベルのＧＦＰを発現し、ＡＡＶ１１０カプシドに対する筋指向性を確立したことを示した。対照的に、ＡＡＶ９－ＧＦＰベクター粒子は、実質的に少ない筋肉発現を提供した（図２４Ｂ）。
ＡＡＶ１１０－ＧＦＰまたはＡＡＶ９－ＧＦＰの筋肉内投与によって誘発された他の組織におけるＧＦＰ導入遺伝子分布を評価するために、器官のパネルにおいて導入遺伝子生体分布（ＢＤ）を調べた。図２５を参照のこと。このデータから、ＡＡＶ１１０形質導入は、主に筋肉だけでなく、座骨神経および脾臓でも発生することが確認される。ＡＡＶ９とは対照的に、ＡＡＶ１１０は脳、腎臓、眼、肺、心臓、肝臓、および精巣において生体分布をほとんど示さないか、または全く示さない。いずれの場合も、ＢＤは導入遺伝子のＡＡＶ９筋肉内送達で得られたものよりも約３％以下であった。
筋組織の免疫組織化学解析により、ＡＡＶ１１０の筋肉における高レベルのＧＦＰ発現が確認され、ＡＡＶ９ではより低かった（図２６）。このデータは、優れた筋肉指向性およびＡＡＶ１１０による発現を確認するものである。
［実施例８］
［ＡＡＶ２１４ベクター粒子は、ＩＭ投与およびＩＶ投与後、筋肉において高レベルの発現を提供する］
Ｕ１ａプロモーター（ＡＡＶ２１４－Ｌｕｃ）によって駆動されるＡＡＶ２１４カプシドタンパク質およびルシフェラーゼ発現カセットを含むＡＡＶウイルスベクターを生成した。ＡＡＶ２１４－Ｌｕｃを、各筋肉内に５×１０１２ｖｇ／ｋｇの用量で、１筋肉当たり総体積０．１ｍＬで、成人野生型ラットの右脚に投与した。左脚は未処置であった。発現を測定するために、筋肉をルシフェリンに曝露し、そして放射した光を測定した。下記の表のデータは、注射された筋肉では投与後２８日目に高発現を示すが、未処置の筋肉では示さないことを示している。図２７は、組織におけるルシフェラーゼ活性を示し、発現酵素の活性を示している。
Figure 2022515338000012
類似の結果が、ＣＢｈプロモーターによって駆動された、異なる導入遺伝子、コドン最適化ＳＭＮ－１（運動ニューロン１の生存）（脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）で欠陥がある）を用いて得られた。静脈内投与されたＡＡＶ２１４－ＳＭＮ１ウイルスベクター粒子の能力を、静脈内投与したときにＳＭＮ－１を発現するＡＡＶ９－ＳＭＮ１ベクター粒子と比較した。図２８は、若年の野生型マウスの感染後の、前脛骨筋組織におけるＳＭＮ１の発現を示す。データは、ＡＡＶ２１４ベクター粒子が、ビヒクルと比較して少なくとも１０～３０％の増加で発現の改善を提供すること、および静脈内に送達されたときに筋形質導入に適していることを示す。
筋組織を形質導入するためのＡＡＶ２１４ウイルスベクターとＡＡＶ９ウイルスベクターとの比較は、ＩＭ送達したＡＡＶ２１４がＡＡＶ９より大きい筋肉区域に形質導入することができることを示す。ラットの筋肉（大腿二頭筋）全体を、ＩＭ注射の１０日後に免疫組織化学によりＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ発現について解析した。固定凍結切片をＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ ｐＡｂでプローブした。ＡＡＶ２１４は、注射部位と一致する筋肉の上部部分にほぼ限定されたＡＡＶ９と比較して、著しくより大きい形質導入区域を示す。（図２６Ｂ）。
［実施例９］
［ＡＡＶ２１４に由来するカプシドタンパク質を含有するＡＡＶベクター粒子は、ＩＶ投与後、筋肉において高発現を呈する］
ＡＡＶ２１４ ＶＰ１タンパク質を、そのＮ末端を、既知のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０）由来のアミノ酸配列と交換することによって改変し、それによって下記の表に示すバリアントを産生する。次いで、ＡＡＶウイルスベクター粒子を、本質的に実施例１に記述されるように、新たに誘導されたカプシドタンパク質の各々を用いて調製し、そして静脈内投与後の筋肉を形質導入する能力を評価した。我々は、各ウイルスベクターが脚および心臓に良好な筋肉の形質導入を与えることを見出した（図２９）。対数変換された生体分布データの一元配置分散分析では、試験されたウイルスベクターの平均生体分布値における統計的有意差（ｐ＞０．０５）は明らかにされなかった。
Figure 2022515338000013
［実施例１０］
［カプシド誘導された交差中和抗体産生］
ＡＡＶ２０４およびＡＡＶ２１４は、ＡＡＶ９ ｎＡｂとの交差反応性が限定的、または非常に低く、またｎＡｂｓ産生のＡＡＶ９との交差反応を誘導する可能性も低い。
我々は、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２１４のいずれかをＩＭによって投与した動物の、ＡＡＶ９に対する中和抗体を産生する能力を試験した。（図３１Ａ）。動物血清の、許容細胞型Ｌｅｃ２へのＡＡＶ９ルシフェラーゼベクターの形質導入を阻害する能力を測定することによって解析を実施した。形質導入の３日後、ルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした。各群は、対照、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２１４のいずれかに対して２匹または３匹のラットから成る。有利なことに、ＩＭによってＡＡＶ２１４を注射された動物は、ＡＡＶ９に対する交差反応性免疫応答を示さず、これは、自然発生的または過去の投与のいずれかでＡＡＶ９に対する既存の免疫を有する患者を含むことに起因して、より大きな患者集団を可能にする可能性がある。
類似のデータを、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において得た。ＡＡＶ９の髄腔内（ＩＴ）投与されたＮＨＰおよび静脈内（ＩＶ）投与されたＮＨＰの両方で、ＡＡＶ９に対するｎＡｂが発現した（図３１Ｂ）。ＩＴ投与された動物血清は、他の試験されたウイルス（ＡＡＶ２０４、ＡＡＶ２１４、およびＡＡＶ６）に対してはるかにより高い交差反応性を示した。しかしながら、２匹の動物にＡＡＶ２０４を髄腔内に加えて硝子体内経路（ＩＴ＋ＩＶ）によって投与し、交差反応性において類似した差が明らかになったため、投与経路はｎＡｂｓの発生差に有意な影響を与えないと考えられる（図３１Ｃ；ＮＨＰ－２およびＮＨＰ－３を参照のこと）。さらに、硝子体内（ＩＶＴ）のみでＡＡＶ２０４投与した動物（図３１Ｃ；ＮＨＰ－４を参照のこと）は、ＩＴ＋ＩＶＴ処置した動物（ＮＨＰ－３）と類似の交差反応性を示した。発現した交差反応性の差異は、ｎＡｂが産生されたＡＡＶカプシドタンパク質エピトープの同一性によって説明されうる。両方のＡＡＶ９を投与された動物の血清サンプルは、ＡＡＶ２０４に対する低い反応性を示し（図３１Ｂ）、また３匹のＡＡＶ２０４処置された動物のうち２匹は、ＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４に対する非常に低い反応性を実証し、適合性の高い可能性を示唆した（図３１Ｃ）。対照的に、ＡＡＶ６は、すべてのＡＡＶ２０４を投与した動物において高い交差反応性を明らかにした（図３１ＢおよびＣ）。
代替的な実施形態
１．配列番号３、３０～３４、４９、もしくは８４と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用。
２．アミノ酸配列が、配列番号３、３０～３４、４９、または８４と少なくとも８０％の同一性を有する、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
３．アミノ酸配列が、配列番号３、３０～３４、４９、または８４と少なくとも９０％の同一性を有する、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
４．アミノ酸配列が、配列番号３、３０～３４、４９、または８４と少なくとも９５％の同一性を有する、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
５．アミノ酸配列が、配列番号３、３０～３４、４９、または８４と少なくとも９９％の同一性を有する、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
６．アミノ酸配列が、配列番号３、３０～３４、４９、または８４を含む、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
７．アミノ酸配列が、ＡＡＶカプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３部分を含み、かつＶＰ３部分が配列番号４１の配列を有する、実施形態１～６のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
８．ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号３、３０～３４、４９、または８４と少なくとも７０％、８０％、９０％、または９９％同一である、実施形態７に記載のポリヌクレオチド。
９．ポリヌクレオチドが、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ファージ、またはウイルスベクター内に含有される、実施形態１～８のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
１０．実施形態１～８のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
１１．配列番号３、３０～３４、４９、または８４と少なくとも７０％、８０％、９０％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＡＡＶカプシドタンパク質。
１２．配列番号２、３、３０～３４、４９、または８４の配列を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質。
１３．（ｉ）実施形態１１または１２に記載のＡＡＶカプシドタンパク質と、
（ｉｉ）ＡＡＶベクターと、を含む、ＡＡＶウイルスベクター。
１４．ＡＡＶベクターが、異種核酸を含む、実施形態１３に記載のＡＡＶウイルスベクター。
１５．異種核酸が、導入遺伝子である、実施形態１４に記載のＡＡＶウイルスベクター。
１６．導入遺伝子が、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、ＣＬＮ３タンパク質、アルファガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、または酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする、実施形態１３～１５に記載のＡＡＶウイルスベクター。
１７．導入遺伝子が、配列番号５、６、７、９、１０、１２、および１３のうちのいずれか一つと少なくとも７０％、８０％、９０％、または９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態１５に記載のＡＡＶウイルスベクター。
１８．導入遺伝子が、配列番号４、５、８、１１、および１４のうちのいずれか一つと少なくとも７０％、８０％、９０％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、実施形態１５に記載のＡＡＶウイルスベクター。
１９．異種核酸が、プロモーターに動作可能に連結される、実施形態１３～１８に記載のＡＡＶウイルスベクター。
２０．プロモーターが、組織特異的対照プロモーター、または構成的プロモーターである、実施形態１９に記載のＡＡＶウイルスベクター。
２１．プロモーターが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ハイブリッドニワトリベータアクチンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＥＦ１プロモーター、ユビキタスニワトリβアクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、Ｕ１ｂプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、最小限のＭｅＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、ＥＦｌａプロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトのβアクチンプロモーター、ＴＲＥプロモーター、Ａｃ５プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、Ｇａｌ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＧＤＳプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、Ｕｂｉプロモーター、またはα－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである構成的プロモーターである、実施形態２０に記載のＡＡＶウイルスベクター。
２２．プロモーターが、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、皮膚特異的プロモーター、筋特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、または眼特異的プロモーターである、組織特異的対照プロモーターである、実施形態１０に記載のＡＡＶウイルスベクター。
２３．異種核酸が、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡをコードする、実施形態１４に記載のＡＡＶウイルスベクター。
２４．異種核酸が、ポリペプチドをコードする、実施形態１４に記載のＡＡＶウイルスベクター。
２５．異種核酸が、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、ＣＬＮ３タンパク質、アルファガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、または酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする、実施形態１４に記載のＡＡＶウイルスベクター。
２６．異種核酸が、ＣＦＴＲをコードする、実施形態２５に記載のＡＡＶウイルスベクター。
２７．ＣＦＴＲが、配列番号４によってコードされるアミノ酸配列を含む、またはこれから成る、実施形態２６に記載のＡＡＶウイルスベクター。
２８．異種核酸が、配列番号５、８、１１、および１４のうちのいずれか一つと少なくとも７０％、８０％、９０％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、実施形態１５に記載のＡＡＶウイルスベクター。
２９．異種核酸が、配列番号４、５、６、７、９、１０、１２、および１３のうちのいずれか一つと少なくとも７０％、８０％、９０％、または９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態１５に記載のＡＡＶウイルスベクター。
３０．異種核酸が、レポータータンパク質をコードする、実施形態１８に記載のＡＡＶウイルスベクター。
３１．対象において対象の遺伝子を細胞へと導入する方法であって、細胞を、有効量の実施形態１３～３０のいずれか一つに記載のＡＡＶウイルスベクターと接触させることを含む、方法。
３２．ＡＡＶウイルスベクターが、対象に、経口、直腸内、経粘膜的、吸入、経皮、非経口、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、胸膜内、脳内、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内、眼周囲、局所的、リンパ管内、嚢内、髄腔内、または硝子体内で導入される、実施形態３１に記載の方法。
３３．対象が哺乳類である、実施形態３１または３２に記載の方法。
３４．対象がヒトである、実施形態３１～３３に記載の方法。
３５．細胞は、体細胞である、実施形態３１～３４に記載の方法。
３６．体細胞が、神経細胞、網膜細胞、筋細胞、上皮細胞、肺細胞、肝臓細胞、幹細胞、または皮膚細胞である、実施形態３５に記載の方法。
３７．実施形態１～８のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、実施形態１１もしくは１２に記載のＡＡＶカプシドタンパク質、または実施形態１３～３０のいずれか一つに記載のＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物。
３８．治療有効量の実施形態３７に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、障害を処置する方法。
３９．障害が、ＣＮＳ障害、皮膚障害、肺障害、筋肉障害、肝臓障害、または網膜障害である、実施形態３８に記載の方法。
４０．障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ファブリー病、ポンペ病、ＣＬＮ３病（または若年性神経セロイドリポフスチン症）、劣性ジストロフィー性表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、若年性バッテン病、常染色体優性障害、筋ジストロフィー、血友病Ａ、血友病Ｂ、多発性硬化症、糖尿病、ゴーシェ病、癌、関節炎、筋消耗、心臓病、内膜過形成、てんかん、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー症候群、スライ症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群Ａ（ムコ多糖症ＩＩＩＡまたはＭＰＳＩＩＩＡ）、サンフィリッポ症候群Ｂ（ムコ多糖症ＩＩＩＢまたはＭＰＳＩＩＩＢ）、サンフィリッポ症候群Ｃ、サンフィリッポ症候群Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群、クラッベ病、フェニルケトン尿症、バッテン病、脊髄性大脳性運動失調症、ＬＤＬ受容体欠損症、高アンモニア血症、関節炎、黄斑変性、網膜色素変性症、神経セロイドリポフスチン症１（ＣＬＮ１）、またはアデノシンデアミナーゼ欠損症である、実施形態３８または３９に記載の方法。
４１．障害が、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、劣性ジストロフィー性表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、ファブリー病、ポンペ病、ＣＬＮ３疾患（または若年性神経セロイドリポフスチン症）、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、若年性バッテン病、およびデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、またはベッカー型筋ジストロフィーである、実施形態３８に記載の方法。
４２．障害が、癌であり、癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、***癌、口腔癌、肝臓癌、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺癌、非黒色腫皮膚癌、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、小細胞肺癌、または甲状腺癌である、実施形態３８に記載の方法。
４３．対象が哺乳類である、実施形態３７～４２に記載の方法。
４４．対象がヒトである、実施形態４３に記載の方法。
４５．実施形態１～８のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、実施形態１０に記載の細胞、実施形態１２または１３に記載のＡＡＶカプシドタンパク質、および／または実施形態１３～３０のいずれか一つに記載のＡＡＶウイルスベクターを含むキット。
４６．実施形態１～８のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、およびヘルパー細胞を含む、ＡＡＶパッケージングシステム。
４７．ヘルパー細胞が、酵母細胞、哺乳類細胞、または昆虫細胞である、実施形態４６に記載のＡＡＶパッケージングシステム。
４８．ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸であって、ＡＡＶカプシドタンパク質が、アミノ酸１２９におけるロイシン残基、アミノ酸５８６におけるアスパラギン残基、およびアミノ酸７２３におけるグルタミン酸残基を含み、ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置が、配列番号２のアミノ酸配列内のアミノ酸位置に対して番号付けされる、核酸。
４９．コードされたＡＡＶカプシドアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、実施形態４８に記載の核酸。
５０．コードされたＡＡＶカプシドアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である、実施形態４８に記載の核酸。
５１．核酸配列が、配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％同一である、実施形態４８に記載の核酸。
５２．核酸配列が、配列番号１５のヌクレオチド配列と１００％同一である、実施形態４８に記載の核酸。
５３．実施形態４８～５２に記載の核酸を含むベクター。
５４．実施形態４８～５２に記載の核酸によってコードされるＡＡＶカプシドタンパク質。
５５．タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態５４に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
５６．実施形態５４または５５に記載の核酸によってコードされるＡＡＶカプシドタンパク質と、異種核酸を含むＡＡＶベクターと、を含む、ＡＡＶウイルスベクター。
５７．異種核酸が、構成的プロモーターに動作可能に連結される、実施形態５６に記載のＡＡＶウイルスベクター。
５８．異種核酸が、ポリペプチドをコードする、実施形態５６または５７に記載のＡＡＶウイルスベクター。
５９．異種核酸が、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＲＮＡｉをコードする、実施形態５６または５７に記載のＡＡＶウイルスベクター。
６０．ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態５６に記載のＡＡＶウイルスベクター。
６１．ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、およびＶＰ３部分を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸であって、ＶＰ３部分が可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸを含み、
（ａ）ＶＲ－ＩＩは、アミノ酸配列ＤＮＮＧＶＫ（配列番号５４）を含み、
（ｂ）ＶＲ－ＩＩＩは、アミノ酸配列ＮＤＧＳ（配列番号５５）を含み、
（ｃ）ＶＲ－ＩＶは、アミノ酸配列ＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号５６）を含み、
（ｄ）ＶＲ－Ｖは、アミノ酸配列ＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＡ（配列番号５７）を含み、
（ｅ）ＶＲ－ＶＩは、アミノ酸配列ＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧ（配列番号５８）を含み、
（ｆ）ＶＲ－ＶＩＩは、アミノ酸配列ＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶ（配列番号５９）を含み、
（ｇ）ＶＲ－ＶＩＩＩは、アミノ酸配列ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩ（配列番号６０）を含み、かつ
（ｈ）ＶＲ－ＩＸは、アミノ酸配列ＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦ（配列番号６１）を含む、核酸。
６２．ＶＲ－Ｉ領域が、ＳＡＳＴＧＡＳ（配列番号５２）を含む、実施形態６１に記載の核酸。
６３．ＶＲ－Ｉ領域が、ＮＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号５３）またはＳＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号８７）を含む、実施形態６１に記載の核酸。
６４．ＶＰ３部分が、
（ｉ）アミノ酸２２３におけるアスパラギン（Ｎ）、
（ｉｉ）アミノ酸２２４におけるアラニン（Ａ）残基、
（ｉｉｉ）アミノ酸４１０におけるトレオニン（Ｔ）残基、
（ｉｖ）アミノ酸７２４におけるヒスチジン残基、および
（ｖ）アミノ酸７３４におけるプロリン（Ｐ）残基、のうちの一つ以上をさらに含み、
ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置は、配列番号３のアミノ酸配列内のアミノ酸位置に対して番号付けされる、実施形態６１～６３に記載の核酸。
６５．コードされたＡＡＶカプシドアミノ酸配列が、配列番号３、３０、３１、３２、３３、３４、４９、または８４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、実施形態６１～６４に記載の核酸。
６６．コードされたＡＡＶカプシドアミノ酸配列が、配列番号３、３０、３１、３２、３３、３４、４９、または８４のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である、実施形態６１～６５に記載の核酸。
６７．核酸配列が、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、４７、８２、または９８から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９９％同一である、実施形態６１～６６に記載の核酸。
６８．核酸配列が、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、４７、８２、または９８から選択されるヌクレオチド配列と１００％同一である、実施形態６１に記載の核酸。
６９．実施形態６１～６８に記載の核酸を含むベクター。
７０．実施形態６１～６８に記載の核酸によってコードされるＡＡＶカプシドタンパク質。
７１．タンパク質が、配列番号３、３０、３１、３２、３３、３４、４９、または８４のアミノ酸配列を含む、実施形態７０に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
７２．実施形態６１～６８に記載の核酸によってコードされるＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶベクターと、を含み、ＡＡＶベクターが異種核酸を含む、ＡＡＶウイルスベクター。
７３．異種核酸が、構成的プロモーターに動作可能に連結される、実施形態７２に記載のＡＡＶウイルスベクター。
７４．異種核酸がポリペプチドをコードする、実施形態７２または７３に記載のＡＡＶウイルスベクター。
７５．異種核酸が、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＲＮＡｉをコードする、実施形態７２または７３に記載のＡＡＶウイルスベクター。
７６．ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号３、３０、３１、３２、３３、３４、４９、または８４のアミノ酸配列を含む、実施形態７２～７５に記載のＡＡＶウイルスベクター。
７７．ＶＰ１部分、ＶＰＶＰ２部分、およびＶＰ３部分を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸であって、ＶＰ３部分が可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸを含み、
（ａ）ＶＲ－ＩＩは、アミノ酸配列ＳＡＳＴＧＡＳ（配列番号５２）を含み、
（ｂ）ＶＲ－ＩＩは、アミノ酸配列ＤＮＮＮＧＶＫ（配列番号５４）を含み、
（ｃ）ＶＲ－ＩＩＩは、アミノ酸配列ＮＤＧＳ（配列番号５５）を含み、
（ｄ）ＶＲ－ＩＶは、アミノ酸配列ＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号５６）を含み、
（ｅ）ＶＲ－Ｖは、アミノ酸配列ＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＡ（配列番号５７）を含み、
（ｆ）ＶＲ－ＶＩは、アミノ酸配列ＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧ（配列番号５８）を含み、
（ｇ）ＶＲ－ＶＩＩは、アミノ酸配列ＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶ（配列番号５９）を含み、
（ｈ）ＶＲ－ＶＩＩＩは、アミノ酸配列ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩ（配列番号６０）を含み、かつ
（ｉ）ＶＲ－ＩＸは、アミノ酸配列ＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦ（配列番号６１）を含む、核酸。
７８．ＶＰ３部分が、
（ｉ）アミノ酸２２３におけるアスパラギン（Ｎ）、
（ｉｉ）アミノ酸２２４におけるアラニン（Ａ）残基、
（ｉｉｉ）アミノ酸４１０におけるトレオニン（Ｔ）残基、
（ｉｖ）アミノ酸７２４におけるヒスチジン残基、および
（ｖ）アミノ酸７３４におけるプロリン（Ｐ）残基、のうちの一つ以上をさらに備え、
ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置が、配列番号３のアミノ酸配列内のアミノ酸位置に対して番号付けされる実施形態７７に記載の核酸。
７９．ＶＰ３部分が、配列番号４１の配列を有する、実施形態７７または７８に記載の核酸。
８０．コードされたＡＡＶカプシドアミノ酸配列のＶＰ１部分およびＶＰ２部分が、配列番号３、３１、３２、３３、または３４のＶＰ１部分およびＶＰ２部分のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、実施形態７７～７９に記載の核酸。
８１．コードされたＡＡＶカプシドアミノ酸配列が、配列番号３、３１、３２、３３、または３４のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である、実施形態７７～８０に記載の核酸。
８２．核酸配列が、配列番号１８、２０、２１、２２、または２３から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９９％同一である、実施形態７７～８１に記載の核酸。
８３．核酸配列が、配列番号１８、２０、２１、２２、または２３から選択されるヌクレオチド配列と１００％同一である、実施形態７７～８２に記載の核酸。
８４．実施形態５７～８３に記載の核酸を含むベクター。
８５．実施形態７７～８３に記載の核酸によってコードされるＡＡＶカプシドタンパク質。
８６．タンパク質が、配列番号３、３１、３２、３３、または３４のアミノ酸配列を含む、実施形態８５に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
８７．実施形態８８に記載の核酸によってコードされるＡＡＶカプシドタンパク質と、異種核酸を含むＡＡＶベクターと、を含む、ＡＡＶウイルスベクター。
８８．異種核酸が、構成的プロモーターに動作可能に連結される、実施形態８７に記載のＡＡＶウイルスベクター。
８９．異種核酸がポリペプチドをコードする、実施形態８７または８８に記載のＡＡＶウイルスベクター。
９０．異種核酸が、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＲＮＡｉをコードする、実施形態８７または８８に記載のＡＡＶウイルスベクター。
９１．ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号３、３１、３２、３３、または３４のアミノ酸配列を含む、実施形態８７～９０に記載のＡＡＶウイルスベクター。
９２．ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、およびＶＰ３部分を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸であって、ＶＰ１部分が、アミノ酸１２９においてロイシン（Ｌ）残基を含み、ＶＰ２部分が、アミノ酸１５７においてトレオニン（Ｔ）残基またはアスパラギン（Ｎ）残基を含み、またアミノ酸１６２においてリジン（Ｋ）残基またはセリン（Ｓ）残基を含み、かつＶＰ３部分がアミノ酸２２３においてアスパラギン（Ｎ）残基を含み、アミノ酸２２４においてアラニン（Ａ）残基を含み、アミノ酸２７２においてヒスチジン（Ｈ）残基を含み、アミノ酸４１０においてトレオニン（Ｔ）残基を含み、アミノ酸７２４においてヒスチジン（Ｈ）残基を含み、そしてアミノ酸７３４においてプロリン（Ｐ）残基を含み、ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置が、配列番号３のアミノ酸配列内のアミノ酸位置に対して番号付けされる、核酸。
９３．ＶＰ３部分が、可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸを含み、
（ａ）ＶＲ－ＩＩは、アミノ酸配列ＳＡＳＴＧＡＳ（配列番号５２）を含み、
（ｂ）ＶＲ－ＩＩは、アミノ酸配列ＤＮＮＮＧＶＫ（配列番号５４）を含み、
（ｃ）ＶＲ－ＩＩＩは、アミノ酸配列ＮＤＧＳ（配列番号５５）を含み、
（ｄ）ＶＲ－ＩＶは、アミノ酸配列ＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号５６）を含み、
（ｅ）ＶＲ－Ｖは、アミノ酸配列ＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＡ（配列番号５７）を含み、
（ｆ）ＶＲ－ＶＩは、アミノ酸配列ＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧ（配列番号５８）を含み、
（ｇ）ＶＲ－ＶＩＩは、アミノ酸配列ＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶ（配列番号５９）を含み、
（ｈ）ＶＲ－ＶＩＩＩは、アミノ酸配列ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩ（配列番号６０）を含み、かつ
（ｉ）ＶＲ－ＩＸは、アミノ酸配列ＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦ（配列番号６１）を含む、実施形態９２に記載の核酸。
９４．ＶＰ１部分が、アミノ酸２４においてアスパラギン酸（Ｄ）またはアラニン（Ａ）残基をさらに含み、ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置が、配列番号３のアミノ酸配列内のアミノ酸位置に対して番号付けされる、実施形態９２または９３に記載の核酸。
９５．ＶＰ２部分が、
（ｉ）アミノ酸１４８におけるプロリン（Ｐ）残基、
（ｉｉ）アミノ酸１５２において挿入されたアルギニン（Ｒ）残基、
（ｉｉｉ）アミノ酸１６８におけるアルギニン（Ｒ）残基、
（ｉｖ）アミノ酸１８９におけるイソロイシン（Ｉ）残基、および
（ｖ）アミノ酸２００におけるセリン（Ｓ）残基、のうちの一つ以上をさらに備え、
ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置が、配列番号３のアミノ酸配列内のアミノ酸位置に対して番号付けされる、実施形態９２～９４に記載の核酸。
９６．コードされたＡＡＶカプシドアミノ酸配列が、配列番号３１、３２、３３、または３４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、実施形態９２～９６に記載の核酸。
９７．コードされたＡＡＶカプシドアミノ酸配列が、配列番号３１、３２、３３、または３４のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である、実施形態９２に記載の核酸。
９８．核酸配列が、配列番号２０、２１、２２、または２３から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９９％同一である、実施形態９２に記載の核酸。
９９．核酸配列が、配列番号２０、２１、２２、または２３から選択されるヌクレオチド配列と１００％同一である、実施形態９８に記載の核酸。
１００．実施形態９２～９９に記載の核酸を含むベクター。
１０１．実施形態９２～９９に記載の核酸によってコードされるＡＡＶカプシドタンパク質。
１０２．タンパク質が、配列番号３１、３２、３３、または３４のアミノ酸配列を含む、実施形態１０１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
１０３．実施形態１０１または１０２に記載の核酸によってコードされるＡＡＶカプシドタンパク質と、異種核酸を含むＡＡＶベクターと、を含む、ＡＡＶウイルスベクター。
１０４．異種核酸が、構成的プロモーターに動作可能に連結される、実施形態１０３に記載のＡＡＶウイルスベクター。
１０５．異種核酸が、ポリペプチド、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＲＮＡｉをコードする、実施形態１０３または１０４に記載のＡＡＶウイルスベクター。

Claims (28)

  1. ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、およびＶＰ３部分を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸であって、前記ＶＰ３部分が可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸを含み、
    （ａ）ＶＲ－ＩＩは、アミノ酸配列ＤＮＮＧＶＫ（配列番号５４）を含み、
    （ｂ）ＶＲ－ＩＩＩは、アミノ酸配列ＮＤＧＳ（配列番号５５）を含み、
    （ｃ）ＶＲ－ＩＶは、アミノ酸配列ＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号５６）を含み、
    （ｄ）ＶＲ－Ｖは、アミノ酸配列ＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＳＮＦＡＷＴＡ（配列番号５７）を含み、
    （ｅ）ＶＲ－ＶＩは、アミノ酸配列ＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧ（配列番号５８）を含み、
    （ｆ）ＶＲ－ＶＩＩは、アミノ酸配列ＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶ（配列番号５９）を含み、
    （ｇ）ＶＲ－ＶＩＩＩは、アミノ酸配列ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩ（配列番号６０）を含み、かつ
    （ｈ）ＶＲ－ＩＸは、アミノ酸配列ＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦ（配列番号６１）を含む、核酸。
  2. 前記ＶＲ－Ｉ領域が、ＮＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号５３）またはＳＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号８７）を含む、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記ＶＲ－Ｉ領域が、ＳＡＳＴＧＡＳ（配列番号５２）を含む、請求項１または２に記載の核酸。
  4. 前記ＶＰ３部分が、配列番号４１の配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸。
  5. 前記コードされるＡＡＶカプシドアミノ酸配列が、配列番号３０または配列番号８４のアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％同一である、請求項２に記載の核酸。
  6. 前記コードされるＡＡＶカプシドアミノ酸配列が、配列番号３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項３に記載の核酸。
  7. 前記核酸配列が、配列番号１８～２３から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、請求項４に記載の核酸。
  8. 前記核酸配列が、配列番号１８～２３から選択されるヌクレオチド配列と１００％同一である、請求項７に記載の核酸。
  9. 請求項１～８に記載の核酸を含むベクター。
  10. 請求項１～８に記載の核酸によってコードされるＡＡＶカプシドタンパク質。
  11. 前記タンパク質が、配列番号３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  12. 請求項１～８に記載の核酸によってコードされる前記ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶベクターと、を含むＡＡＶウイルスベクターであって、前記ＡＡＶベクターが５’から３’の方向に、
    （ａ）第一のＡＡＶ逆末端反復、
    （ｂ）プロモーター、
    （ｃ）異種核酸、
    （ｄ）ポリＡテール、および
    （ｅ）第二のＡＡＶ逆末端反復を含む、ＡＡＶウイルスベクター。
  13. 前記異種核酸が、構成的プロモーターに動作可能に連結される、請求項１２に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  14. 前記異種核酸が、ポリペプチドをコードする、請求項１２に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  15. 異種核酸が、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＲＮＡｉをコードする、請求項１２に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  16. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  17. （ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３４のアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシドタンパク質と、
    （ｉｉ）ＡＡＶベクターであって、前記ＡＡＶベクターが５’から３’の方向に、
    （ａ）第一のＡＡＶ逆末端反復、
    （ｂ）プロモーター、
    （ｃ）異種核酸、
    （ｄ）ポリＡテール、および
    （ｅ）第二のＡＡＶ逆末端反復と、を備える、ＡＡＶウイルスベクター。
  18. 前記異種核酸が、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡをコードする、請求項１２または１７に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  19. 前記異種核酸が、ポリペプチドをコードする、請求項１２または１７に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  20. 前記異種遺伝子配列が、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、ＣＬＮ３タンパク質、アルファガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、または酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする、請求項１９に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  21. 異種配列が、ＣＦＴＲをコードする、請求項２０に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  22. 前記ＣＦＴＲが、配列番号４によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  23. 前記異種遺伝子配列が、配列番号５、８、１１、および１４のうちのいずれか一つと少なくとも７０％、８０％、９０％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項１９に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  24. 前記異種遺伝子配列が、配列番号４、５、６、７、９、１０、１２、および１３のうちのいずれか一つと少なくとも７０％、８０％、９０％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１９に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  25. 前記プロモーターが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ハイブリッドニワトリベータアクチンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＥＦ１プロモーター、ユビキタスニワトリβアクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、Ｕ１ｂプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、最小限のＭｅＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、ＥＦｌａプロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトのβアクチンプロモーター、ＴＲＥプロモーター、Ａｃ５プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、Ｇａｌ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＧＤＳプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、Ｕｂｉプロモーター、またはα－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである、請求項１２または１７に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  26. 請求項１２～２５のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスベクターを対象に投与することを含む、疾患または障害を処置する方法。
  27. 前記ＡＡＶウイルスベクターが、前記対象に、経口、直腸内、経粘膜的、吸入、経皮、非経口、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、胸膜内、脳内、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内、もしくは眼周囲、局所的、リンパ管内、嚢内、髄腔内、または硝子体内で投与される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記疾患または障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ファブリー病、ポンペ病、ＣＬＮ３病（または若年性神経セロイドリポフスチン症）、劣性ジストロフィー性表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、若年性バッテン病、常染色体優性障害、筋ジストロフィー、血友病Ａ、血友病Ｂ、多発性硬化症、糖尿病、ゴーシェ病、癌、関節炎、筋消耗、心臓病、内膜過形成、てんかん、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー症候群、スライ症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群Ａ（ムコ多糖症ＩＩＩＡまたはＭＰＳＩＩＩＡ）、サンフィリッポ症候群Ｂ（ムコ多糖症ＩＩＩＢまたはＭＰＳＩＩＩＢ）、サンフィリッポ症候群Ｃ、サンフィリッポ症候群Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群、クラッベ病、フェニルケトン尿症、バッテン病、脊髄性大脳性運動失調症、ＬＤＬ受容体欠損症、高アンモニア血症、関節炎、黄斑変性、網膜色素変性症、神経セロイドリポフスチン症１（ＣＬＮ１）、またはアデノシンデアミナーゼ欠損症である、請求項２６に記載の方法。
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3635009A1 (en) 2017-06-07 2020-04-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
US20210082541A1 (en) * 2019-08-31 2021-03-18 Wyatt Technology Corporation Measuring attributes of a viral gene delivery vehicle sample via separation
CN113025618B (zh) * 2019-12-24 2024-02-06 朗信启昇(苏州)生物制药有限公司 一种x连锁遗传性视网膜劈裂症的基因治疗方案与应用
WO2021163357A2 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene therapy vectors for treating heart disease
AU2021218411A1 (en) 2020-02-13 2022-10-06 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene therapy vectors for treating heart disease
WO2021183895A1 (en) * 2020-03-13 2021-09-16 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of fabry disease with aav gene therapy vectors
CN115552021A (zh) * 2020-04-27 2022-12-30 4D分子治疗有限公司 用于肺递送的腺相关变体、制剂和方法
EP4103211A4 (en) * 2020-04-27 2023-08-23 4D Molecular Therapeutics Inc. CODON OPTIMIZED GLA GENES AND USES THEREOF
GB202010981D0 (en) * 2020-07-16 2020-09-02 Ucl Business Ltd Gene therapy for neuromuscular and neuromotor disorders
EP4203989A2 (en) * 2020-09-03 2023-07-05 Rampart Bioscience, Inc. Soluble alkaline phosphatase constructs and expression vectors including a polynucleotide encoding for soluble alkaline phosphatase constructs
CN114507692A (zh) * 2020-11-16 2022-05-17 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 用于治疗法布里病的腺相关病毒载体及其用途
EP4298227A1 (en) * 2021-02-26 2024-01-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited Composition and methods for the treatment of fabry disease
WO2022245919A1 (en) * 2021-05-18 2022-11-24 Abeona Therapeutics Inc. Methods and compositions for treating ocular diseases and disorders
EP4367251A1 (en) 2021-07-08 2024-05-15 Tenaya Therapeutics, Inc. Optimized expression cassettes for gene therapy
CN114181318B (zh) * 2021-11-08 2023-08-01 四川大学 一种组织特异性表达穿透血脑屏障的idua融合蛋白的重组腺相关病毒及应用
CA3237987A1 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treatment of mucopolysaccharidosis iiia
CN114381465B (zh) * 2021-12-22 2024-01-16 苏州诺洁贝生物技术有限公司 优化的cyp4v2基因及其用途
WO2023202637A1 (en) * 2022-04-19 2023-10-26 Shanghai Vitalgen Biopharma Co., Ltd. Recombinant aav vectors for treating neurodegenerative disorders
CN115029360A (zh) * 2022-05-30 2022-09-09 上海勉亦生物科技有限公司 用于治疗粘多糖贮积症iiia型的转基因表达盒
WO2023240236A1 (en) * 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders
WO2023246734A1 (en) * 2022-06-21 2023-12-28 Skyline Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Recombinant aav for the gene therapy of sma disease
KR20240000814A (ko) * 2022-06-24 2024-01-03 연세대학교 산학협력단 망막색소상피에 특이적으로 작동하는 CRISPR/Cas 복합체를 유효성분으로 포함하는 망막질환 치료용 약학조성물
WO2024054864A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective heart disease therapies
WO2024074142A1 (en) * 2022-10-08 2024-04-11 Lingyi Biotech Co., Ltd. Polynucleotides for the treatment of disease associated with gcase deficiency
CN115960177B (zh) * 2022-10-09 2023-07-07 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用
WO2024117285A1 (ko) * 2022-11-28 2024-06-06 (주)지뉴인텍 Pde6b 유전자가 포함된 아데노바이러스 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 유전성 망막질환 예방 또는 치료용 조성물
CN116622750B (zh) * 2023-06-01 2024-05-31 上海勉亦生物科技有限公司 优化的人法布里转基因表达盒及其用途

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7638120B2 (en) * 2000-03-14 2009-12-29 Thomas Jefferson University High transgene expression of a pseudotyped adeno-associated virus type
EP2826860B1 (en) * 2010-04-23 2018-08-22 University of Massachusetts CNS targeting AAV vectors and methods of use thereof
RS60207B1 (sr) * 2011-04-22 2020-06-30 Univ California Adeno-povezani virioni virusa sa varijantama kapsida i postupci za njihovu primenu
US10577627B2 (en) * 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
KR20240063169A (ko) * 2014-11-21 2024-05-10 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 중추 신경계에 표적화된 aav 벡터
IL305149A (en) * 2016-07-26 2023-10-01 Biomarin Pharm Inc Novel adeno-associated virus capsid proteins

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