KR20220051246A

KR20220051246A - 완전 인간 번역 후 변형된 항-VEGF Fab를 사용한 당뇨병성 망막병증의 치료

Info

Publication number: KR20220051246A
Application number: KR1020227009810A
Authority: KR
Inventors: 스테판 조셉 파콜라; 세리 반 이브렌; 제시 아이. 유; 사미르 마간브하이 파텔; 아반티 아르빈드 가네카; 안토니 레이 오'베리; 킴 리스 어윈-팍; 다린 토마스 커티스
Original assignee: 리젠엑스바이오 인크.
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2022-04-26
Also published as: WO2021041373A1; JP2022545967A; WO2021041373A8; MX2022002366A; TW202122419A; US20220280608A1; IL290863A; AU2020336314A1; BR112022003811A2; CN114502197A; CA3149401A1; EP4021936A1

Abstract

인간 혈관 내피 성장 인자("hVEGF")에 대한 완전 인간 번역 후 변형(HuPTM) 단클론성 항체("mAb") 또는 mAb의 항원 결합 단편-예컨대, 완전 인간-당화된 (HuGly) 항-hVEGF 항원 결합 단편-을 당뇨병성 망막병증으로 진단된 인간 대상체의 눈(들)의 망막/유리체액에 전달하기 위한 조성물 및 방법이 기재되어 있다.

Description

완전 인간 번역 후 변형된 항-VEGF Fab를 사용한 당뇨병성 망막병증의 치료

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 2019년 8월 26일에 출원된 미국 가출원 제62/891,799호, 2019년 9월 18일에 출원된 미국 가출원 제62/902,352호 및 2020년 4월 2일에 출원된 미국 가출원 제63/004,258호에 대한 이익을 주장하며 이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.

전자적으로 제출된 서열 목록 참조

본 출원은 2020년 8월 12일에 생성되고 크기가 97,447 바이트인 "12656-127-228_Sequence_Listing.TXT"라는 제목의 텍스트 파일로 본 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.

1. 도입

인간 혈관 내피 성장 인자("hVEGF")에 대한 완전 인간 번역 후 변형(HuPTM) 단클론성 항체("mAb") 또는 mAb의 항원 결합 단편-예컨대, 예를 들어 완전 인간-당화된 (HuGly) 항-VEGF 항원 결합 단편-을 안구 질환, 특히 증가된 신생혈관형성, 예를 들어, 당뇨병성 망막병증 (DR)에 의해 야기된 안구 질환으로 진단된 인간 대상체의 눈(들)의 망막/유리체액에 전달하기 위한 조성물 및 방법이 기재되어 있다.

2. 배경

당뇨병성 안구 질환은 미국 노동 연령 성인의 시각 손상의 주요 원인이고; 40세 이상 성인 당뇨병 유병률은 대략 28.4%(성인 420만 명)이다 (AAO PPP Retina/Vitreous Panel, Hoskins Center for Quality Eye Care, "Diabetic retinopathy PPP - Updated 2017"). 미국 및 기타 선진국에서 당뇨병 발병률이 증가하고 있음을 감안할 때 당뇨병성 망막병증(DR)의 사회적 영향과 실명에 대한 영향은 증가할 것으로 예상된다. 망막 전문가는 망막이 진성 당뇨병의 다른 전신 합병증에 선행할 수 있는 당뇨병성 안구 질환의 예방, 진단 및 관리에 중요한 역할을 한다는 것을 알고 있다. 노동 연령 인구에서 시력을 위협하는 당뇨병 합병증을 제한할 수 있는 가능성은 공중 보건에 상당한 영향을 미칠 수 있다.

당뇨병성 망막병증은 당뇨병의 안과 합병증으로, 미세동맥류, 경성 삼출물, 출혈 및 비증식성 형태의 정맥 이상 및 신생혈관형성, 망막전 또는 유리체 출혈, 증식성 형태의 섬유맥관 증식을 특징으로 한다. 고혈당증은 미세혈관 망막 변화를 유도하여 시야가 흐려지고, 어두운 반점 또는 섬광이 발생하고, 갑작스러운 시력 상실이 발생한다(Cai & McGinnis, 2016, Journal of Diabetes Research, Vol. 2016, Article ID 3789217).

당뇨병성 망막병증은 경증의 비증식성 질환에서 중증의 증식성 질환까지 다양하다. 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR)의 가장 흔한 초기 임상적으로 보이는 징후는 미세동맥류 형성 및 망막내 출혈을 포함한다. 미세혈관 훼손은 망막 모세혈관 비관류, 면모 반점, 출혈 횟수 증가, 정맥 이상 및 망막내 미세혈관 이상을 유발한다. 질병 과정의 어느 단계에서나, 증가된 혈관 투과성은 망막 비후(부종) 및/또는 삼출물을 유발하여 중심 시력(VA)의 손실을 초래할 수 있다. 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR) 단계는 망막, 시신경 유두 또는 전방 분절에 새로운 혈관이 이차적으로 증식하면서 세동맥과 세정맥이 폐쇄되어 발생한다. 환자의 시력을 위협하고 긴급한 의료 또는 외과 개입이 필요한 DR의 일반적인 합병증은 중추 관련 당뇨병 황반 부종(CI-DME), 견인 망막 박리, 망막 상막 및 유리체 출혈을 포함한다. 이러한 합병증의 위험은 일반적으로 DR의 중증도가 증가함에 따라 증가하지만 DME는 DR의 모든 단계에서 존재할 수 있다(Aiello 등, 1994, N Engl J Med. 331(22):1480-1487). 당뇨병성 허혈과 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 포함한 혈관신생 인자의 후속 증식 사이의 연관성이 확립되었다.

1990년대의 획기적인 조기 치료 당뇨병 망막병증 연구(ETDRS)에서 기준선 심각한 NPDR을 가진 환자는 PDR로 진행될 위험이 대략 50%이고 고위험 PDR이 발생할 위험은 15%였다. 또한, 매우 심각한 NPDR을 가진 환자의 경우, 고위험 PDR로 악화될 위험이 1년 이내에 75%로 증가한다. 당뇨병 안과 연구에서 환자의 평균 연령이 약 50세임을 감안할 때, PDR로의 전환 및 이와 관련된 시력 위협 합병증을 피하면 수십 년 동안 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있다. 결과적으로, NPDR 및 비-고위험 PDR(경증에서 중등도 PDR)의 예방적 치료에 대한 결정은 망막 커뮤니티 내에서 진행 중인 논의이다.

3. 요약

VEGF에 대한 완전 인간 번역 후 변형 (HuPTM) 항체를 안구 질환, 특히 증가된 신생혈관형성, 예를 들어, 당뇨병성 망막병증 (DR)에 의해 야기된 안구 질환으로 진단된 환자 (인간 대상체)의 눈(들)에 있는 망막/유리체액에 전달하기 위한 조성물 및 방법이 기재되어 있다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 환자(인간 대상체)의 눈(들)의 망막하 공간에 VEGF에 대한 완전 인간 번역후 변형(HuPTM) 항체의 망막하 투여를 위한 조성물 및 방법이 본원에 기재된다. 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 재조합으로 생산된 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-중쇄 쌍, 인트라바디, 헤테로콘주게이트(heteroconjugate) 항체, 1가 항체, 전장 항체의 항원 결합 단편, 및 상기의 융합 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 항원 결합 단편에는 단일-도메인 항체 (중쇄 항체 (VHHs) 또는 나노바디의 가변 도메인), Fabs, F(ab')₂s, 및 전장 항-VEGF 항체 (바람직하게는, 전장 항-VEGF 단클론성 항체 (mAbs))의 scFvs (단쇄 가변 단편) (집합적으로 본원에서 "항원 결합 단편"으로 칭함)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, VEGF에 대한 완전 인간 번역 후 변형된 항체는 VEGF("HuPTMFabVEGFi")에 대한 단클론성 항체 (mAb)의 완전 인간 번역 후 변형된 항원 결합 단편이다. 추가의 바람직한 구현예에서, HuPTMFabVEGFi는 항-VEGF mAb("HuGlyFabVEGFi")의 완전 인간 당화된 항원 결합 단편이다. 대안적인 구현예에서, 전장 mAb가 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 전달은 유전자 요법을 통해 - 예를 들어, 항-VEGF 항원-결합 단편 또는 mAb (또는 초과당화된 유도체 (예를 들어, 도 3 참조)를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물을 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 환자(인간 대상체)의 눈(들) 내의 맥락막상 공간, 망막하 공간 (경유리체(transvitreal) 접근법으로부터 또는 맥락막상 공간을 통해 카테터(catheter)로), 망막내 공간, 유리체강 및/또는 공막의 외부 표면(즉, 공막 옆 투여) 투여하여, 인간 PTM, 예를 들어 인간-당화된, 이식유전자 유전자 생성물을 연속적으로 공급하는 영구적 저장소(depot)를 눈에서 생성함으로써 이루어질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이식유전자를 전달하기 위해 사용되는 바이러스 벡터는 인간 망막 세포 또는 광수용체 세포에 대해 향성(tropism)을 가져야 한다. 이러한 벡터는 비-복제 재조합 아데노 연관 바이러스 벡터("rAAV")를 포함할 수 있으며, 특히 AAV8 캡시드를 보유하는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물은 작제물 I이고, 작제물 I은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접하는 AAV8 역전된 말단 반복부; (2) a) CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 CB7 프로모터, b) 닭 β-액틴 인트론 및 c) 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호를 포함하는 조절 요소; 및 (3) 동일한 양의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 보장하는 자가-절단 퓨린(F)/F2A 링커에 의해 분리된 항-VEGF 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물은 작제물 II이고, 작제물 II는 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접하는 AAV2 역전된 말단 반복부; (2) a) CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 CB7 프로모터, b) 닭 β-액틴 인트론 및 c) 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호를 포함하는 조절 요소; 및 (3) 동일한 양의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 보장하는 자가-절단 퓨린(F)/F2A 링커에 의해 분리된 항-VEGF 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열.

특정 양태에서, 인간 망막 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 인간 대상체의 망막에 전달하는 것을 포함하는, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈 내의 맥락막상 공간, 망막하 공간(유리체절제가 있거나 유리체절제 없음), 망막내 공간, 유리체강 또는 공막의 외부 표면에 (예를 들어, 맥락막상 주사 (예를 들어, 마이크로니들이 있는 미량주입기와 같은 맥락막상 약물 전달 장치를 통해), 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는, 후극을 향해 맥락막상 공간을 통해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통한 외과적 절차), 또는 후측 공막옆 데포 절차 (예를 들어, 팁이 공막 표면에 직접 침착하여 삽입되고 유지될 수 있는 캐뉼라(cannula)를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통함)에 의해) 항-hVEGF 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 투여하여 상기 인간 대상체의 망막에 인간 망막 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 미량주입기의 사용에 의해 인간 망막 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 망막에 전달하는 것을 포함하는, 당뇨병성 망막병증(DR)을 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있다.

특정 양태에서, 본원은 인간 광수용체 세포 (예를 들어, 원추 세포 및/또는 간상 세포), 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포 (예를 들어, 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 광감성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교), 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 인간 대상체의 망막에 전달하는 것을 포함하는, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법을 기재한다. 특정 양태에서, 본원은 항-hVEGF 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 인간 대상체의 눈 내의 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강, 또는 공막의 외부 표면에 (예를 들어, 맥락막상 주사 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주사기를 통해), 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는, 후극을 향해 맥락막상 공간을 통해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통한 외과적 절차), 또는 후측 공막옆 데포 절차 (예를 들어, 팁이 공막 표면에 대해 직접 침작으로 삽입되고 유지될 수 있는 캐뉼라를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통함)에 의함), 외경계막 내의 인간 광수용체 세포 (예를 들어, 원추 세포 및/또는 간상 세포), 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포 (예를 들어, 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 광감성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교), 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함하는, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 기재되어 있다. 특정 양태에서, 본원은 약물 전달 장치, 예컨대 미량주사기의 사용에 의해, 외경계막에서 인간 광수용체 세포 (예를 들어, 원추 세포 및/또는 간상 세포), 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포 (예를 들어, 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 광감성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교),및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 인간 대상체의 망막에 전달하는 것을 포함하는, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 기재되어 있다.

특정 양태에서, 인간 망막 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 인간 대상체의 눈에 전달하는 것을 포함하는, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈에서 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강 또는 공막의 외부 표면에 (예를 들어, 맥락막상 주사 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주입기를 통해), 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 외과적 절차 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), 또는 후측 공막옆 데포 절차 (예를 들어, 그 팁이 삽입될 수 있고 공막 표면에 직접 침착으로 유지될 수 있는 캐뉼라를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통해)에 의해) hVEGF에 대한 항-hVEGF 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 투여하여 상기 인간 대상체의 눈에 인간 망막 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 미량주사기의 사용에 의해 인간 망막 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 눈에 전달하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 상기 인간 대상체의 눈에 외경계막 내의 인간 광수용체 세포 (예를 들어, 원추 세포 및/또는 간상 세포), 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포 (예를 들어, 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 광감성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교), 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 상기 인간 대상체의 눈에서 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강, 또는 공막의 외부 표면에 (예를 들어, 맥락막상 주사 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주사기를 통해), 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 외과적 절차 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), 또는 후측 공막옆 데포 절차 (예를 들어, 팁이 삽입될 수 있고 공막 표면에 직접 침착으로 유지될 수 있는 캐뉼라를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통해)에 의해) 항-hVEGF 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 투여함으로써 상기 인간 대상체의 눈에 외경계막에서 인간 광수용체 세포 (예를 들어, 원추 세포 및/또는 간상 세포), 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포 (예를 들어, 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 광감성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교), 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 상기 인간 대상체의 눈에 외경계막에서 인간 광수용체 세포 (예를 들어, 원추 세포 및/또는 간상 세포), 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포 (예를 들어, 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 광감성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교), 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 미량주사기의 사용에 의해 전달하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 상기 방법은 인간 망막 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 눈에 전달하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈에서 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강 또는 공막의 외부 표면에 (예를 들어, 맥락막상 주사 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주입기를 통해), 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 외과적 절차 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), 또는 후측 공막옆 데포 절차 (예를 들어, 팁이 삽입될 수 있고 공막 표면에 직접 침착으로 유지될 수 있는 캐뉼라를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통해)에 의해) hVEGF에 대한 항-hVEGF 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하여 상기 인간 대상체의 눈에 인간 망막 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 상기 인간 대상체의 눈에 외경계막에서 인간 광수용체 세포 (예를 들어, 원추 세포 및/또는 간상 세포), 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포 (예를 들어, 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 광감성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교), 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 상기 인간 대상체의 눈 내의 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강, 또는 공막의 외부 표면에 (예를 들어, 맥락막상 주사 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주사기를 통해), 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 외과적 절차 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), 또는 후측 공막옆 데포 절차 (예를 들어, 팁이 삽입될 수 있고 공막 표면에 직접 침착으로 유지될 수 있는 캐뉼라를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통해)에 의해) 항-hVEGF 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여함으로써 상기 인간 대상체의 눈에 외경계막 내의 인간 광수용체 세포 (예를 들어, 원추 세포 및/또는 간상 세포), 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포 (예를 들어, 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 광감성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교), 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 상기 방법은 인간 망막 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 망막에 전달하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 망막 내의 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강 또는 공막의 외부 표면에 (예를 들어, 맥락막상 주사 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주입기를 통해), 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 외과적 절차 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), 또는 후측 공막옆 데포 절차 (예를 들어, 그 팁이 삽입될 수 있고 공막 표면에 직접 침착으로 유지될 수 있는 캐뉼라를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통해)에 의해) hVEGF에 대한 항-hVEGF 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하여 상기 인간 대상체의 망막에 인간 망막 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 상기 인간 대상체의 망막에 외경계막 내의 인간 광수용체 세포 (예를 들어, 원추 세포 및/또는 간상 세포), 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포 (예를 들어, 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 광감성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교), 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 상기 인간 대상체의 망막 내의 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강, 또는 공막의 외부 표면에 (예를 들어, 맥락막상 주사 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주사기를 통해), 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 외과적 절차 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), 또는 후측 공막옆 데포 절차 (예를 들어, 그 팁이 삽입될 수 있고 공막 표면에 직접 침착으로 유지될 수 있는 캐뉼라를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통해)에 의해) 항-hVEGF 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여함으로써 상기 인간 대상체의 망막에 외경계막에서 인간 광수용체 세포 (예를 들어, 원추 세포 및/또는 간상 세포), 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포 (예를 들어, 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 광감성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교), 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성된 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, 상기 방법은 상기 인간 환자의 눈에 유리체절제를 수행하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 유리체절제는 부분 유리체절제이다.

특정 양태에서, 투여 단계는 유리체내 약물 전달 장치를 사용하여 유리체강 내로 재조합 바이러스 벡터를 주사하는 것이다. 특정 양태에서, 유리체내 약물 전달 장치는 미량주사기이다.

본원에는 인간 망막 세포에 의해 생성된 항-인간 혈관 내피 성장 인자(hVEGF) 항체, 예를 들어 항-hVEGF 항원 결합 단편이 기재되어 있다. 인간 VEGF(hVEGF)는 VEGF(VEGFA, VEGFB , VEGFC 또는 VEGFD) 유전자에 의해 인코딩되는 인간 단백질이다. hVEGF의 예시적인 아미노산 서열은 GenBank 수탁 번호 AAA35789.1에서 찾을 수 있다. hVEGF의 예시적인 핵산 서열은 GenBank 수탁 번호 M32977.1에서 찾을 수 있다.

본원에 기재된 방법의 특정 양태에서, 항원 결합 단편은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

본원에 기재된 방법의 특정 양태에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 17-19의 중쇄 CDR 1-3 또는 서열번호: 20, 18, 및 21을 포함한다.

본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 다음의 화학적 변형 중 하나 이상을 보유하지 않는다: 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화(pyroglutamation) (파이로 Glu). 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하고, 및 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)은 다음의 화학적 변형 중 하나 이상을 보유하지 않는다: 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu). 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 다음의 화학적 변형인 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하고, 및 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 아세틸화되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)은 다음의 화학적 변형 중 하나 이상을 보유하지 않는다: 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu). 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)은 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)은 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 및 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)은 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)은 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 및 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)은 아세틸화되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않고, 및 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서: (1) 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)는 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)은 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 및 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않고; 및 (2) 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하고, 및 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않으며, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서: (1) 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)은 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)은 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 및 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않으며; 및 (2) 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하고, 및 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 아세틸화되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 눈에 전달하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편은 α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유한다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈 내의 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강 또는 공막의 외부 표면에 (예를 들어, 맥락막상 주사 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주입기를 통해), 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 외과적 절차 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), 또는 후측 공막옆 데포 절차 (예를 들어, 팁이 삽입될 수 있고 공막 표면에 직접 침착으로 유지될 수 있는 캐뉼라를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통해)에 의해) hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 투여하여 상기 인간 대상체의 눈에, hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편, 여기서 항원 결합 단편은 α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하고, 이를 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 hVEGF에 대한 mAb의 당화된 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 눈에 전달하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편은 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는다 (즉, 본원에 사용된 "검출 가능한"은 하기 기재된 표준 검정에 의해 검출 가능한 수준을 의미함). 특정 구현예에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈에서 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강 또는 공막의 외부 표면에 (예를 들어, 맥락막상 주사 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주입기를 통해), 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 외과적 절차 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), 또는 후측 공막옆 데포 절차 (예를 들어, 그 팁이 삽입될 수 있고 공막 표면에 직접 침착으로 유지될 수 있는 캐뉼라를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통해)에 의해) hVEGF에 대한 당화된 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 투여하여 상기 인간 대상체의 눈에, hVEGF에 대한 mAb의 당화된 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함하되, 여기서 항원 결합 단편은 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈 내의 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강, 또는 공막의 외부 표면에, (예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여, 또는 후측 공막옆 데포 절차에 의해) hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편의 발현은 인간, 불멸화 망막-유래 세포에서 상기 발현 벡터로부터의 발현 시, α2,6-시알릴화된다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈 내의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막에 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주입기를 통해) hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 투여하거나 전달하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편의 발현은 인간, 불멸화 망막-유래 세포에서 상기 발현 벡터로부터의 발현 시, α2,6-시알릴화된다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막하 및/또는 망막내 공간에 (예를 들어, 맥락막상 공간을 통해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해) hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편의 발현은 인간, 불멸화 망막-유래 세포에서 상기 발현 벡터로부터의 발현 시 α2,6-시알릴화된다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈에서 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강, 또는 공막의 외부 표면에, (예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여, 또는 후측 공막옆 데포 절차에 의해) hVEGF에 대한 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편의 발현은 인간, 불멸화 망막-유래 세포에서 상기 발현 벡터로부터의 발현 시 α2,6-시알릴화되고, 상기 항원 결합 단편은 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는다

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막에 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주입기를 통해) hVEGF에 대한 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 투여하거나 전달하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편의 발현은 인간, 불멸화 망막-유래 세포에서 상기 발현 벡터로부터의 발현 시 α2,6-시알릴화되고, 상기 항원 결합 단편은 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 망막하 공간 및/또는 망막내에 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해) hVEGF에 대한 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편의 발현은 인간, 불멸화 망막-유래 세포에서 상기 발현 벡터로부터의 발현 시 α2,6-시알릴화되고, 상기 항원 결합 단편은 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 상기 방법은 상기 인간 대상체의 눈에서 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강, 또는 공막의 외부 표면에, (예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여, 또는 후측 공막옆 데포 절차에 의해) hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 항원 결합 단편을 방출하는 데포가 형성되도록 한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주입기를 통해) 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막에, hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하거나 전달하는 것을 포함하여, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 항원 결합 단편을 방출하는 데포가 형성되도록 한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막하 및/또는 망막내 공간에 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 항원 결합 단편을 방출하는 데포가 형성되도록 한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈에서 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강, 또는 공막의 외부 표면에, (예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여, 또는 후측 공막옆 데포 절차에 의해) hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편을 방출하는 데포가 형성되고, 상기 항원 결합 단편은 당화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주입기를 통해) 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막에, hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하거나 전달하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편은 당화되지만, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막하 및/또는 망막내 공간에 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편을 방출하는 데포가 형성되고, 상기 항원 결합 단편은 당화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 망막하 공간 및/또는 망막내 공간에 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 발현 벡터는 6.4 × 10¹¹ GC/mL의 농도에서 눈당 약 1.6 × 10¹¹ GC 또는 1.0 × 10¹² GC/mL의 농도에서 눈당 약 2.5 × 10¹¹ GC의 단일 용량으로 망막하 전달을 통해 투여된다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막하 및/또는 망막내 공간에 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 상기 항원 결합 단편을 방출하는 데포가 형성되고, 상기 항원 결합 단편은 당화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 망막하 및/또는 망막내 공간에 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 발현 벡터는 6.2 × 10¹¹ GC/mL의 농도에서 눈당 약 1.6 × 10¹¹ GC 또는 1.0 × 10¹² GC/mL의 농도에서 눈당 약 2.5 × 10¹¹ GC의 단일 용량으로 망막하 전달을 통해 투여된다. 특정 양태에서, 발현 벡터는 6.2 × 10¹¹ GC/mL의 농도에서 약 1.55 × 10¹¹ GC/눈 또는 1.0 × 10¹² GC/mL의 농도에서 눈당 약 2.5 × 10¹¹ GC의 단일 용량으로 망막하 전달을 통해 투여된다.

특정 양태에서, 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 양태에서, 발현 벡터는 AAV8 벡터이다.

본원에 기재된 방법의 특정 양태에서, 항원 결합 단편 이식유전자는 리더 펩티드를 인코딩한다. 리더 펩타이드는 본원에서 신호 펩타이드 또는 리더 서열로 또한 지칭될 수 있다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈에서 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강, 또는 공막의 외부 표면에, (예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여, 또는 후측 공막옆 데포 절차에 의해) hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, α2,6-시알릴화 글리칸을 함유하는 상기 항원 결합 단편을 방출하는 데포가 형성되고; 여기서 상기 재조합 벡터는, 배양물에서 PER.C6 또는 RPE 세포를 형질도입하는 데 사용될 때, 상기 세포 배양물에서 α2,6 시알릴화 글리칸을 함유하는 항원 결합된 단편의 생성을 초래한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)(특히, 습성 AMD)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주입기를 통해) 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막에, hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하거나 전달하는 것을 포함하여, α2,6-시알릴화 글리칸을 함유하는 상기 항원 결합 단편을 방출하는 데포가 형성되고; 상기 재조합 벡터는, 배양물에서 PER.C6 또는 RPE 세포를 형질도입하는 데 사용될 때, 상기 세포 배양물에서 α2,6 시알릴화 글리칸을 함유하는 항원 결합된 단편의 생성을 초래한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막하 및/또는 망막내 공간에 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, α2,6-시알릴화 글리칸을 함유하는 상기 항원 결합 단편을 방출하는 데포가 형성되고; 상기 재조합 벡터는, 배양물에서 PER.C6 또는 RPE 세포를 형질도입하는 데 사용될 때, 상기 세포 배양물에서 α2,6 시알릴화 글리칸을 함유하는 항원 결합된 단편의 생성을 초래한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈에서 맥락막상 공간, 망막하 공간, 망막내 공간, 유리체강, 또는 공막의 외부 표면에, (예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여, 또는 후측 공막옆 데포 절차에 의해) hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, α2,6-시알릴화 글리칸을 함유하는 상기 항원 결합 단편을 방출하는 데포가 형성되고; 상기 항원 결합 단편은 당화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않고; 여기서 상기 재조합 벡터는, 배양물에서 PER.C6 또는 RPE 세포를 형질도입하는데 사용될 때, 상기 세포 배양물에서 당화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는α-Gal 항원은 함유하지 않는 상기 항원 결합 단편의 생성을 초래한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막하 및/또는 망막내 공간에 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 항원 결합 단편이 당화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 데포가 형성되고; 여기서 상기 재조합 벡터는, 배양물에서 PER.C6 또는 RPE 세포를 형질도입하는데 사용될 때, 상기 세포 배양물에서 당화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는α-Gal 항원을 함유하지 않은 상기 항원 결합 단편의 생성을 초래한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되고, 이 방법은 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 상기 인간 대상체의 망막하 및/또는 망막내 공간에 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 것인, 맥락막상 공간을 통해 후극을 향해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해), hVEGF에 대한 mAb의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 항원 결합 단편이 당화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 데포가 형성되고; 여기서 상기 재조합 벡터는, 배양물에서 PER.C6 또는 RPE 세포를 형질도입하는데 사용될 때, 상기 세포 배양물에서 당화되나 검출 가능한 NeuGc 및/또는α-Gal 항원을 함유하지 않은 상기 항원 결합 단편의 생성을 초래한다.

본원에 기술된 방법의 특정 양태에서, 인간 대상은 > 69 ETDRS 글자(대략 Snellen 등가 20/40으로 또는 더 양호함)의 최적 교정 시력(BCVA)을 갖는다.

본원에 기재된 방법의 특정 양태에서, BCVA는 인간 대상체에서 치료될 눈의 BCVA이다.

본원에 기재된 방법의 특정 양태에서, 눈에 전달하는 것은 눈의 망막, 맥락막, 및/또는 유리체액에 전달하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 방법의 특정 양태에서, 항원 결합 단편은 C-말단에 1, 2, 3 또는 4개의 추가 아미노산을 포함하는 중쇄를 포함한다.

이러한 유전자 요법이 투여되는 대상채는 항-VEGF 요법에 반응하는 대상체이어야 한다. 특정 구현예에서, 방법은 망막병증(DR)으로 진단되고 항-VEGF 항체를 사용한 치료에 반응성인 것으로 확인된 환자를 치료하는 것을 포괄한다. 보다 구체적인 구현예에서, 환자는 항-VEGF 항원 결합 단편을 사용한 치료에 반응성이다. 특정 구현예에서, 환자는 유전자 요법으로 치료하기 전에 유리체내로 주사된 항-VEGF 항원 결합 단편을 사용한 치료에 반응성인 것으로 나타났다. 특정 구현예에서, 환자는 이전에 LUCENTIS^®(라니비주맙), EYLEA^®(아플리베르셉트) 및/또는 AVASTIN^®(베바시주맙)으로 치료받았고, 상기 LUCENTIS^®(라니비주맙), EYLEA^®(애플리버셉트) 및/또는 AVASTIN^®(베바시주맙) 중 하나 이상에 반응하는 것으로 밝혀졌다.

이러한 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물이 전달되는 대상체는 바이러스 벡터 또는 발현 작제물에서 이식유전자에 의해 인코딩된 항-hVEGF 항원 결합 단편에 반응해야 한다. 반응성을 결정하기 위해, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자 생성물(예를 들어, 세포 배양물, 생물반응기 등에서 생성됨)은 유리체내 주사와 같이 대상체에게 직접 투여될 수 있다.

본원에 기재된 방법의 특정 양태에서, 항원 결합 단편은 C-말단에 추가 아미노산을 포함하지 않는 중쇄를 포함한다.

본원에 기재된 방법의 특정 양태에서, 항원 결합 단편 분자의 집단을 생성하고, 여기서 항원 결합 단편 분자는 중쇄를 포함하고, 여기서 항원 결합 단편 분자의 집단의 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 또는 20% 미만은 중쇄의 C-말단에서 1, 2, 3, 또는 4개의 추가 아미노산을 포함한다. 본원에 기재된 방법의 특정 양태에서, 항원 결합 단편 분자의 집단을 생성하고, 여기서 항원 결합 단편 분자는 중쇄를 포함하고, 여기서 항원 결합 단편 분자의 집단의 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 또는 20% 미만이지만 0% 초과는 중쇄의 C-말단에서 1, 2, 3, 또는 4개의 추가 아미노산을 포함한다.

본원에 기재된 방법의 특정 양태에서, 항원 결합 단편 분자의 집단을 생성하고, 여기서 항원 결합 단편 분자는 중쇄를 포함하고, 여기서 항원 결합 단편 분자의 집단의 0.5-1%, 0.5%-2%, 0.5%-3%, 0.5%-4%, 0.5%-5%, 0.5%-10%, 0.5%-20%, 1%-2%, 1%-3%, 1%-4%, 1%-5%, 1%-10%, 1%-20%, 2%-3%, 2%-4%, 2%-5%, 2%-10%, 2%-20%, 3%-4%, 3%-5%, 3%-10%, 3%-20%, 4%-5%, 4%-10%, 4%-20%, 5%-10%, 5%-20%, 또는 10%-20%은 중쇄의 C-말단에서 1, 2, 3, 또는 4개의 추가 아미노산을 포함한다.

이식유전자에 의해 인코딩되는 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, HuGlyFabVEGFi는 hVEGF에 결합하는 항체의 항원 결합 단편, 예컨대 베바시주맙; 항-hVEGF Fab 모이어티 예컨대 라니비주맙; 또는 Fab 도메인 상에 추가의 당화 부위를 함유하도록 조작된 이러한 베바시주맙 또는 라니비주맙 Fab 모이어티를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 Courtois 등, 2016, mAbs 8: 99-112] 참조, 이는 전장 항체의 Fab 도메인 상에서 과당화된 베바시주맙의 유도체의 설명에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

이식유전자를 전달하기 위해 사용되는 재조합 벡터는 인간 망막 세포 또는 광수용체 세포에 대해 향성을 가져야 한다. 이러한 벡터는 비-복제 재조합 아데노 연관 바이러스 벡터("rAAV")를 포함할 수 있으며, 특히 AAV8 캡시드를 보유하는 것이 바람직하다. 그러나, 렌티바이러스 벡터, 백시니아(vaccinia) 바이러스 벡터, 또는 "네이키드(naked) DNA" 작제물로 지칭되는 비-바이러스 발현 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 바람직하게는, HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, HuGlyFabVEGFi, 이식유전자는 적절한 발현 조절 요소, 예를 들어 CB7 프로모터(닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서), RPE65 프로모터 또는 옵신 프로모터에 의해 제어되어야 하며, 벡터에 의해 구동된 이식유전자의 발현을 향상시키는 다른 발현 조절 요소 (예를 들어, 인트론 예컨대 닭 β-액틴 인트론, 마우스 (MVM) 인트론의 미세 마이러스, 인간 인자 IX 인트론 (예를 들어, FIX 말단절단된 인트론 1), β-글로빈 스플라이스 공여체/면역글로불린 중쇄 스플라이스 수용체 인트론, 아데노바이러스 스플라이스 공여체 /면역글로불린 스플라이스 수용체 인트론, SV40 후기 스플라이스 공여체 /스플라이스 수용체 (19S/16S) 인트론, 및 하이브리드 아데노바이러스 스플라이스 공여체/IgG 스플라이스 수용체 인트론 및 polyA 신호 예컨대 토끼 β-글로빈 polyA 신호, 인간 성장 호르몬 (hGH) polyA 신호, SV40 후기 polyA 신호, 합성 polyA (SPA) 신호, 및 소 성장 호르몬 (bGH) polyA 신호)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Powell 및 Rivera-Soto, 2015, Discov. Med., 19(102):49-57]을 참조한다.

유전자 요법 작제물은 중쇄 및 경쇄가 모두 발현되도록 설계되었다. 보다 구체적으로, 중쇄 및 경쇄는 약 동일한 양으로 발현되어야 하며, 즉 중쇄 및 경쇄는 중쇄 대 경쇄의 비율이 대략 1:1로 발현되어야 한다. 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 중쇄 및 경쇄가 절단가능한 링커 또는 IRES에 의해 분리되어 별도의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 발현되는 단일 작제물에서 조작될 수 있다. 예를 들어, 특정 리더 서열에 대해서는 섹션 5.2.4를 참조하고, 특정 IRES, 2A 및 본원에 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 기타 링커 서열에 대해서는 섹션 5.2.5를 참조한다.

특정 구현예에서, 유전자 요법 작제물은 제형 완충제 중 AAV 벡터 활성 성분의 냉동 멸균, 단일 사용 용액으로서 공급된다. 특정 구현예에서, 망막하 투여에 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 적합한 수성 완충제, 계면활성제 및 임의의 부형제를 포함하는 제형 완충제 중 재조합 (예를 들어, rHuGlyFabVEGFi) 벡터의 현탁액을 포함한다. 특정 구현예에서, 작제물은 둘베코의 인산염 완충 염수 및 0.001% 플루노닉 F68, pH = 7.4에서 제형화된다.

특정 구현예에서, 유전자 요법 작제물은 제형 완충제 중 AAV 벡터 활성 성분의 냉동 멸균, 단일 사용 용액으로서 공급된다. 특정 구현예에서, 맥락막상, 망막하, 공막옆, 유리체내, 결막하 및/또는 망막내 투여에 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 적합한 수성 완충제, 계면활성제 및 선택적 부형제를 포함하는 제형 완충제 중 재조합 (예를 들어, rHuGlyFabVEGFi) 벡터의 현탁액을 포함한다.

재조합 벡터의 치료적 유효량은 ≥ 0.1 mL 내지 ≤ 0.5 mL 범위의 부피, 바람직하게는 0.1 내지 0.30 mL (100 - 300 μl)의 부피, 및 가장 바람직하게는, 0.25 mL (250 μl)의 부피로 망막하 및/또는 망막내(예를 들어, 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 또는 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여에 의해)로 투여되어야 한다. 재조합 벡터의 치료적 유효량은 100 μl 이하의 부피, 예를 들어 50-100μl의 부피로 맥락막상(예를 들어, 맥락막상 주사에 의해) 투여되어야 한다. 재조합 벡터의 치료적 유효량은 500 μl 이하의 부피, 예를 들어 10-20 μl, 20-50 μl, 50-100 μl, 100-200 μl, 200-300 μl, 300-400 μl, 또는 400-500 μl의 부피로 공막의 외부 표면에(예를 들어, 후측 공막옆 데포 절차에 의해) 투여되어야 한다. 망막하 주사는 숙련된 망막 외과의가 수행하는 외과적 절차로, 국소 마취 하에 대상체를 대상으로 유리체절제 및 유전자 요법을 망막에 망막하 주사하는 것을 포함한다(예를 들어, Campochiaro 등, 2017, Hum Gen Ther 28(1):99-111, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 특정 구현예에서, 망막하 투여는 망막하 공간으로 약물을 주입하는 맥락막상 카테터를 사용하여 맥락상 공간, 예컨대 맥락상 공간을 통해 후극으로 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통해 수행되고, 여기서 작은 바늘은 망막하 공간 내로 주입된다(예를 들어, [Baldassarre 등, 2017, Subretinal Delivery of Cells via the Suprachoroidal Space: Janssen Trial. In: Schwartz 등 (eds) Cellular Therapies for Retinal Disease, Springer, Cham]; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/040635 A1 참조; 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 맥락막상 투여 절차는 눈의 맥락막상 공간에 약물을 투여하는 것을 포함하며, 일반적으로 미세바늘이 있는 미량주입기와 같은 맥락막상 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다(예를 들어, [Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23; Goldstein, 2014, Retina Today 9(5): 82-87] 참조, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 본원에 기재된 본 발명에 따른 맥락막상 공간에 발현 벡터를 침착시키기 위해 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 Clearside^® Biomedical, Inc.에 의해 제조된 맥락막상 약물 전달 장치(예를 들어, Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23 참조) 및 MedOne 맥락막상 카테터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 본 발명에 따른 맥락막상 공간을 통해 망막하 공간에 발현 벡터를 침착시키기 위해 사용될 수 있는 망막하 약물 전달 장치는 Janssen Pharmaceuticals, Inc.에 의해 제조된 망막하 약물 전달 장치를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/040635 A1 참조). 특정 구현예에서, 공막의 외부 표면에 대한 투여는 팁이 삽입될 수 있고 공막 표면에 직접 침착으로 유지될 수 있는 캐뉼라를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치에 의해 수행된다. 다양한 투여 방식에 대한 자세한 내용은 섹션 5.3.2를 참조한다. 맥락막상, 망막하, 공막옆, 유리체내, 결막하 및/또는 망막내 투여는 가용성 이식유전자 생성물을 망막, 유리체액 및/또는 안방수로 전달해야 한다. 망막 세포, 예를 들어 간상 세포, 원추 세포, 망막 색소 상피 세포, 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 신경절 및/또는 뮐러 세포에 의한 이식유전자 생성물(예를 들어, 인코딩된 항-VEGF 항체)의 발현은 망막, 유리체액, 및/또는 안방수의 이식유전자 생성물의 전달 및 유지를 초래한다. 특정 구현예에서, 3개월 동안 수양액 (눈의 전방)에서 0.110 μg/mL, 또는 유리체액에서 적어도 0.330 μg/mL의 Cmin에서 이식유전자 생성물의 농도를 유지하는 용량이 요구되며; 그 후, 1.70 내지 6.60 μg /mL 범위의 이식유전자 생성물의 유리체 Cmin 농도, 및/또는 0.567 내지 2.20 μg/mL 범위의 수성 Cmin 농도가 유지되어야 한다. 그러나 이식유전자 생성물이 지속적으로 생산되기 때문에 더 낮은 농도를 유지하는 것이 효과적일 수 있다. 이식유전자 생성물의 농도는 치료된 눈의 전방으로부터 유리체액 및/또는 방수의 환자 샘플에서 측정될 수 있다. 대안적으로, 유리체액 농도는 환자의 이식유전자 생성물의 혈청 농도를 측정하여 추정 및/또는 모니터링할 수 있으며 - 이식유전자 생성물에 대한 전신 노출 대 유리체 노출의 비율은 약 1:90,000이다. (예를 들어, 문헌[Xu L, 등, 2013, Invest. Opthal. Vis. Sci. 54: 1616-1624, p. 1621 및 표 5, p. 1623]에 보고된 라니비주맙의 유리체액 및 혈청 농도, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).

특정 구현예에서, 망막하 투여는 안구 투여를 위해 본원에 설명된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는, Altaviz에 의해 제조된 미세 부피 주입기 전달 시스템을 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다(도 9a 및 9b 참조)(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 제WO 2013/177215호, 미국 특허 출원 공개 번호 제2019/0175825호, 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2019/0167906호 참조). 미세 부피 주입기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2019/0167906호에 설명된 바와 같이 높은 힘 전달 및 개선된 정밀도를 제공하는 가스 구동 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 미세 부피 주입기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 유압 드라이브, 및 가스 동력 모듈 및 차례로 유체 전달을 제어하기 위한 저하중 활성화 레버를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 미세 부피 주입기 전달 시스템은 미세 부피 주입기에 사용될 수 있고 용량 안내가 있는 미세 부피 주입기이고, 예를 들어 맥락막상 바늘(예를 들어, Clearside^® 바늘), 망막하 바늘, 유리체내 바늘, 공막옆 바늘, 결막하 바늘, 및/또는 망막내 바늘과 함께 사용될 수 있다. 미세 부피 주입기 사용의 이점은 다음을 포함한다: (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀 주입 유량 제어 및 용량 안내를 갖기 때문), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 수술; (c) 10 μL 증분 복용량을 갖는 공압 구동; (d) 유리체절제 기계로부터의 절개; (e) 400 μL 주사기 용량; (f) 디지털 유도 전달; (g) 디지털 기록 전달; 및 (h) 진단 팁 (예를 들어, MedOne 38g 바늘 및 Dorc 41g 바늘이 망막하 전달을 위해 사용될 수 있는 반면, Clearside^® 바늘 및 Visionisti OY 어댑터가 망막하 전달에 사용될 수 있음).

본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 맥락막상으로 (예를 들어, 맥락막상 주사에 의해) 투여된다. 특정 구현예에서, 맥락막상 투여(예를 들어, 맥락막상 공간으로의 주사)는 맥락막상 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다. 맥락막상 약물 전달 장치는 눈의 맥락막상 공간에 약물을 투여하는 것을 포함하는 맥락막상 투여 절차에 종종 사용된다(예를 들어, Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23; Goldstein, 2014, Retina Today 9(5): 82-87; Baldassarre 등, 2017; 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 본원에 기재된 본 발명에 따른 맥락막상 공간에 재조합 벡터를 침착시키기 위해 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 Clearside^®Biomedical, Inc.에 의해 제조된 맥락막상 약물 전달 장치(예를 들어, Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23) 및 MedOne 맥락막상 카테터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 눈 투여를 위해 본명세서에 기재된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는 Altaviz에 의해 제조된 미세 부피 주입기 전달 시스템을 포함한다 (도 9a 및 9b 참조) (예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 제WO 2013/177215호, 미국 특허 출원 공개 번호 제2019/0175825호, 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2019/0167906호 참조). 미세 부피 주입기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 번호 제2019/0175825호 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2019/0167906호에 설명된 바와 같이 높은 힘 전달 및 개선된 정밀도를 제공하는 가스 구동 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 미세 부피 주입기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 유압 드라이브, 및 가스 동력 모듈 및 차례로 유체 전달을 제어하기 위한 저하중 활성화 레버를 포함할 수 있다. 미세 부피 주입기는 용량 안내 기능이 있는 미세 부피 주입기이며 예를 들어 맥락막상 바늘(예를 들어, Clearside^® 바늘) 또는 망막하 바늘과 함께 사용할 수 있다. 미세 부피 주입기 사용의 이점은 다음을 포함한다: (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀 주입 유량 제어 및 용량 안내를 갖기 때문), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 수술; (c) 10 μL 증분 복용량을 갖는 공압 구동; (d) 유리체절제 기계로부터의 절개; (e) 400 μL 주사기 용량; (f) 디지털 유도 전달; (g) 디지털 기록 전달; 및 (h) 진단 팁 (예를 들어, MedOne 38g 바늘 및 Dorc 41g 바늘이 망막하 전달을 위해 사용될 수 있는 반면, Clearside^® 바늘 및 Visionisti OY 어댑터가 맥락막상 전달에 사용될 수 있음). 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 Visionisti OY 에 의해 제조된 어댑터 (및 바람직하게는 또한 바늘 가이드)를 갖는 정상 길이의 피하주사 바늘을 포함하는 도구이고, 어댑터는 어댑터로부터 노출되는 바늘 팁의 길이를 제어함으로써 정상 길이의 경구주사 바늘로 바뀐다 (도 8 참조) (예를 들어, 미국 디자인 특허 번호 D878,575; 및 국제 특허 출원. 공개 번호 제WO/2016/083669호 참조). 특정 구현예에서, 맥락막상 약물 전달 장치는 1 밀리미터 30 게이지 바늘이 있는 주사기이다 (도 5 참조). 이 장치를 사용하여 주사하는 동안, 바늘이 공막의 기저부를 관통하고 약물을 함유하는 유체가 맥락막상 공간으로 들어가 맥락막상 공간이 확장된다. 결과적으로 주사하는 동안 촉각 및 시각적 피드백이 있다. 주사 후, 유체는 후방으로 흐르고 맥락막과 망막에서 주로 흡수된다. 그 결과 모든 망막 세포층과 맥락막 세포에서 치료 생성물이 생성된다. 이러한 유형의 장치 및 절차를 사용하면 합병증의 위험이 낮은 인오피스(in-office) 절차를 빠르고 쉽게 수행할 수 있다. 맥락막상 공간에 최대 100 μl의 부피를 주사할 수 있다.

특정 구현예에서, 유리체내 투여는 안구 투여를 위해 본원에 설명된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는, Altaviz에 의해 제조된 미세 부피 주입기 전달 시스템을 포함하는 유리체내 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다(도 9a 및 9b 참조)(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO 2013/177215호, 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호, 및 미국 특허 출원 공개 제2019/0167906호 참조). 미세 부피 주입기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호 및 미국 특허 출원 공개 제2019/0167906호에 설명된 바와 같이 높은 힘 전달 및 개선된 정밀도를 제공하는 가스 구동 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 미세 부피 주입기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 유압 드라이브, 및 가스 동력 모듈 및 차례로 유체 전달을 제어하기 위한 저하중 활성화 레버를 포함할 수 있다. 미세 부피 주입기는 용량 안내가 있는 미세 부피 주입기이며 예를 들어 유리체내 바늘과 함께 사용할 수 있다. 미세 부피 주입기 사용의 이점은 다음을 포함한다: (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀 주입 유량 제어 및 용량 안내를 갖기 때문), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 수술; (c) 10 μL 증분 복용량을 갖는 공압 구동; (d) 유리체절제 기계로부터의 절개; (e) 400 μL 주사기 용량; (f) 디지털 유도 전달; (g) 디지털 기록 전달; 및 (h) 진단 팁.

특정 구현예에서, 공막옆 투여는 안구 투여를 위해 본원에 설명된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는, Altaviz에 의해 제조된 미세 부피 주입기 전달 시스템을 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다(도 9a 및 9b 참조)(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 제WO 2013/177215호, 미국 특허 출원 공개 번호 제2019/0175825호, 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2019/0167906호 참조). 미세 부피 주입기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2019/0167906호에 설명된 바와 같이 높은 힘 전달 및 개선된 정밀도를 제공하는 가스 구동 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 미세 부피 주입기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 유압 드라이브, 및 가스 동력 모듈 및 차례로 유체 전달을 제어하기 위한 저하중 활성화 레버를 포함할 수 있다. 미세 부피 주입기는 용량 안내 기능이 있는 미세 부피 주입기이며 예를 들어 망막하 바늘과 함께 사용할 수 있다. 미세 부피 주입기 사용의 이점은 다음을 포함한다: (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀 주입 유량 제어 및 용량 안내를 갖기 때문), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 수술; (c) 10 μL 증분 복용량을 갖는 공압 구동; (d) 유리체절제 기계로부터 절개됨; (e) 400 μL 주사기 용량; (f) 디지털 유도 전달; (g) 디지털 기록 전달; 및 (h) 진단 팁.

특정 구현예에서, 복용량은 (예를 들어, 맥락막상 주사 (예를 들어, 맥락막상 약물 전달 장치 예컨대 마이크로니들이 있는 미량주사기를 통해), 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 또는 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여에 의해) ml당 게놈 카피 또는 환자의 눈에 투여된 게놈 카피의 수에 의해 측정된다. 특정 구현예에서, ml당 2.4 × 10¹¹개의 게놈 카피 내지 ml당 1 × 10¹³개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, ml당 2.4 × 10¹¹개의 게놈 카피 내지 ml당 5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 5 × 10¹¹개의 게놈 카피 내지 ml당 1 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 1 × 10¹²개의 게놈 카피 내지 ml당 5 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 5 × 10¹²개의 게놈 카피 내지 ml당 1 × 10¹³개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 2.4 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 1 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 5 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 1 × 10¹³개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 1 × 10⁹ 내지 1 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 3 × 10⁹ 내지 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 1 × 10⁹ 내지 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 1 × 10⁹ 내지 1 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 1 × 10⁹ 내지 5 × 10⁹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 6 × 10⁹ 내지 3 × 10¹⁰개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 4 × 10¹⁰ 내지 1 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 2 × 10¹¹ 내지 1 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 약 3 × 10⁹개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 1.2 × 10¹⁰개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 1 × 10¹⁰개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 4 × 10¹⁰개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 6 × 10¹⁰개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 2.4 × 10¹¹개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 1.6 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 6.2 × 10¹¹개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 1.6 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 6.4 × 10¹¹개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 1.55 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 6.2 × 10¹¹개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 약 1.0 × 10¹²에 상응함).

특정 구현예에서, 눈당 약 3.0 × 10¹³개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 최대 3.0 × 10¹³개의 게놈 카피가 투여된다.

특정 구현예에서, 눈당 약 6.0 × 10¹⁰개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 1.6 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 3 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 1.0 × 10¹²개의 게놈 카피/ml가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 ml당 약 2.5 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다.

특정 구현예에서, 눈당 약 6.0 × 10¹⁰개의 게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 1.6 × 10¹¹개의 게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 3.0 × 10¹³개의 게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 최대 3.0 × 10¹³개의 게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다.

특정 구현예에서, 눈당 약 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 3 × 10¹²개의 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 단일 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피가 이중 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 3.0 × 10¹³개의 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 최대 3.0 × 10¹³개의 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 ml당 약 2.5 × 10¹²개의 게놈 카피가 100 μl의 부피에서 눈당 단일 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 ml당 약 2.5 × 10¹²개의 게놈 카피가 이중 맥락막상 주사에 의해 투여되고, 각각의 주사는 100 μl의 부피내에 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "약"은 주어진 값 또는 범위의 ±10% 이내를 의미한다. 특정 구현예에서, 용어 "약"은 인용된 정확한 수를 포괄한다.

본 발명은 시간이 지남에 따라 소산되어 최고 및 최저 수준을 초래하는 VEGF 억제제의 고용량 볼러스(boluses)의 반복된 안구 주사를 포함하는 표준 치료 치료에 비해 몇 가지 이점이 있다. 항체를 반복적으로 주사하는 것과는 대조적으로, 이식유전자 생성물 항체의 수득된 발현은 보다 일관된 수준의 항체가 작용 부위에 존재할 수 있게 하고, 보다 적은 주사가 이루어질 필요가 있고 보다 적은 의사 방문을 초래하기 때문에 환자에게 덜 위험하고 보다 편리하다. 일관된 단백질 생산은 망막의 부종 반동이 발생할 가능성이 적기 때문에 더 나은 임상 결과로 이어질 수 있다. 또한, 이식유전자로부터 발현된 항체는 번역 중 및 번역 후에 존재하는 상이한 미세환경 때문에 직접 주입되는 것과 상이한 방식으로 번역 후 변형된다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 이는 상이한 확산, 생물활성, 분포, 친화성, 약동학 및 면역원성 특성을 갖는 항체를 생성하여, 작용 부위에 전달된 항체가 직접 주사된 항체와 비교하여 "바이오베터(biobetters)"가 되도록 한다.

또한, 생체내 이식유전자로부터 발현된 항체는 단백질 응집 및 단백질 산화와 같은 재조합 기술에 의해 생성된 항체와 관련된 분해 산물을 함유할 가능성이 없다. 응집은 높은 단백질 농도, 제조 장비 및 용기와의 표면 상호 작용, 특정 완충 시스템을 사용한 정제로 인한 단백질 생산 및 저장과 관련된 문제이다. 응집을 촉진하는 이러한 조건은 유전자 요법에서 도입 유전자 발현에 존재하지 않는다. 메티오닌, 트립토판 및 히스티딘 산화와 같은 산화는 또한 단백질 생산 및 저장과 관련이 있으며 스트레스를 받은 세포 배양 조건, 금속 및 공기 접촉, 완충제 및 부형제의 불순물로 인해 발생한다. 생체내 이식유전자로부터 발현된 단백질은 또한 스트레스를 받은 조건에서 산화될 수 있다. 그러나 인간과 많은 다른 유기체는 산화 스트레스를 감소시킬 뿐만 아니라 때때로 산화를 복구 및/또는 역전시키는 항산화 방어 시스템을 갖추고 있다. 따라서 생체 내에서 생성된 단백질은 산화된 형태가 아닐 가능성이 높다. 응집과 산화 모두 효능, 약동학(클리어런스(clearance) 및 면역원성에 영향을 미칠 수 있다.

이론에 얽매이지 않고, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 부분적으로 다음 원칙에 기초한다:

(i) 인간 망막 세포는 망막 세포에서 강력한 과정인 당화 및 티로신-O-황산화를 포함하여 분비된 단백질의 번역 후 처리를 위한 세포 기구를 소유한 분비 세포이다. (예를 들어, 망막 세포에 의한 당단백질의 생성을 보고하는 문헌[Wang 등, 2013, Analytical Biochem. 427: 20-28 및 Adamis 등, 1993, BBRC 193: 631-638]; 및 망막 세포에 의해 분비되는 티로신-황산화 당단백질의 생산을 보고하는 문헌 [Kanan 등, 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567 및 Kanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res.133:126-131]을 참조하며, 이들 각각은 인간 망막 세포에 의해 만들어진 번역 후 변형에 대해 그 전체가 참조로 포함됨).

(ii) 최신 기술 이해와 달리, 라니비주맙(및 베바시주맙과 같은 전장 항-VEGF mAb의 Fab 도메인)과 같은 항-VEGF 항원 결합 단편은 실제로 N-연결된 당화 부위를 보유한다. 예를 들어, 도 1은 C_H 도메인 (TVSWN¹⁶⁵SGAL) 및 C_L 도메인 (QSGN¹⁵⁸SQE) 내의 비-공통 아스파라기날 ("N") 당화 부위, 뿐만 아니라 라니비주맙의 V_H 도메인(Q¹¹⁵GT) 및 V_L 도메인(TFQ¹⁰⁰GT) 내의 당화 부위 (및 베바시주맙 Fab 내의 상응하는 부위)인 글루타민 ("Q") 잔기를 확인하는 것이다. (예를 들어, 문헌[Valliere-Douglass 등, 2009, J. Biol. Chem. 284: 32493-32506 및 Valliere-Douglass 등, 2010, J. Biol. Chem. 285: 16012-16022] 참조, 이들 각각은 항체에서 N-연결된 당화 부위의 확인을 위해 그 전체가 참고로 포함됨).

(iii) 그러한 비정규 부위는 일반적으로 항체 집단의 낮은 수준의 당화(예를 들어, 약 1-5%)를 초래하지만 기능적 이점은 눈과 같은 면역 특권이 있는 기관에서 중요할 수 있다(예를 들어, 문헌[van de Bovenkamp 등, 2016, J. Immunol. 196:1435-1441] 참조). 예를 들어 Fab 당화는 항체의 안정성, 반감기 및 결합 특성에 영향을 미칠 수 있다. 표적에 대한 항체의 친화도에 대한 Fab 당화의 효과를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 또는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)이 사용될 수 있다. 항체의 반감기에 대한 Fab 당화의 효과를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 기술이, 예를 들어 방사성 표지된 항체가 투여된 대상체에서 혈액 또는 기관 (예를 들어, 눈)에서의 방사능의 수준의 측정에 의해 사용될 수 있다. 항체의 안정성, 예를 들어 응집 또는 단백질 언폴딩 수준에 대한 Fab 당화의 효과를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어, 시차 주사 열량측정 (DSC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 예를 들어, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SEC-HPLC), 모세관 전기영동, 질량 분광분석, 또는 탁도 측정이 사용될 수 있다. 본원에 제공되는 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, HuGlyFabVEGFi 이식유전자는 비정규 부위에서 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 초과로 당화된다. 특정 구현예에서, Fab 집단으로부터의 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 초과의 Fab는 비정규 부위에서 당화된다. 특정 구현예에서, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 초과의 비정규 부위는 당화된다. 특정 구현예에서, 이들 비정규 부위에서의 Fab의 당화는 HEK293 세포에서 생산된 Fab의 이들 비정규 부위의 당화의 양보다 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 초과 더 크다.

(iv) 당화 부위에 추가하여, 라니비주맙 (및 베바시주맙의 Fab)과 같은 항-VEGF Fab는 CDR 내부 또는 근처에 티로신("Y") 황산화 부위를 함유하고; 라니비주맙의 V_H(EDTAVY⁹⁴Y⁹⁵) 및 V_L(EDFATY⁸⁶) 도메인에서 티로신-O-황산화 부위(및 베바시주맙의 Fab에서 상응하는 부위)를 확인하는 도 1 참조. (예를 들어, Yang 등, 2015, Molecules 20:2138-2164, esp. p. 2154를 참조하고, 이는 단백질 티로신 황산화를 거친 티로신 잔기를 둘러싼 아미노산의 분석을 위해 그 전체가 참고로 포함됨). "규칙"은 다음과 같이 요약할 수 있다: Y의 +5 내지 -5 위치 내에 E 또는 D가 있고 Y의 위치 -1이 중성 또는 산성 하전된 아미노산이지만 염기성 아미노산(예를 들어, 황산화를 없애는 R, K 또는 H)이 아닌 Y 잔기. 인간 IgG 항체는 N-말단 변형, C-말단 변형, 아미노산 잔기의 분해 또는 산화, 시스테인 관련 변이체 및 당화와 같은 많은 다른 번역 후 변형을 나타낼 수 있다(예를 들어,[Liu 등, 2014, mAbs 6(5):1145-1154] 참조).

(v) 인간 망막 세포에 의한 라니비주맙 또는 베바시주맙의 Fab 단편과 같은 항-VEGF Fab의 당화는 안정성, 반감기를 개선하고 이식유전자 생성물의 원치 않는 응집 및/또는 면역원성을 감소시킬 수 있는 글리칸의 추가를 초래할 것이다. (예를 들어, Fab 당화의 새로운 중요성에 대한 검토는 문헌[Bovenkamp 등, 2016, J. Immunol. 196: 1435-1441] 참조). 유의하게는, 본원에 제공된 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi에 첨가될 수 있는 글리칸은 2,6-시알산 (예를 들어, HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, HuGlyFabVEGFi에 혼입될 수 있는 글리칸을 도시하는 도 2 참조) 및 바이섹팅 GlcNAc을 함유하지만 NGNA (N-글리콜릴뉴라민산, Neu5Gc)을 함유하지 않는 고도로 프로세싱된 복합체-유형 바이안테너리(biantennary) N-글리칸이다. 이러한 글리칸은 라니비주맙 (이는 E. 콜라이(E. coli)에서 제조되고, 당화되지 않음) 또는 베바시주맙(이는 이러한 번역후 변형을 만드는데 필요한 2,6-시알릴트랜스퍼라제를 갖지 않는 CHO 세포에서 제조됨)에 존재하지 않고, CHO 세포 산물 바이섹팅 GlcNAc도 존재하지 않지만, 이들은 Neu5Ac (NANA) 대신 인간에 전형적이지 않은 (그리고 잠재적으로 면역원성인) 시알산으로서 Neu5Gc (NGNA)를 첨가한다. 예를 들어, 문헌[Dumont 등, 2015, Crit. Rev. Biotechnol. (초기 온라인, 2015년 9월 18일 온라인 공개, pp. 1-13, p. 5)]을 참조한다. 게다가, CHO 세포는 또한 대부분의 개체에 존재하는 항-α-Gal 항체와 반응하는 α-Gal 항원인 면역원성 글리칸을 생성할 수 있으며, 고농도에서는 과민증을 유발할 수 있다. 예를 들어 문헌[Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156]을 참조한다. 본원에 제공된 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi의 인간 당화 패턴은 이식유전자 생성물의 면역원성을 감소시키고 효능을 개선해야 한다.

(vi) 라니비주맙 또는 베바시주맙의 Fab 단편과 같은 항-VEGF Fab의 티로신-황산화(인간 망막 세포의 강력한 번역 후 과정)는 VEGF에 대한 결합력이 증가된 이식유전자 생성물을 초래할 수 있다. 실제로, 다른 표적에 대한 치료 항체 Fab의 티로신-황산화는 항원 및 활성에 대한 결합력을 극적으로 증가시키는 것으로 나타났다. (예를 들어, 문헌[Loos 등, 2015, PNAS 112: 12675-12680, 및 Choe 등, 2003, Cell 114: 161-170] 참조). 이러한 번역 후 변형은 라니비주맙(티로신 황산화에 필요한 효소를 보유하지 않는 숙주인 E. 콜라이에서 만들어짐)에는 존재하지 않으며 기껏해야 CHO 세포 생성물인 베바시주맙에서 과소 표현된다. 인간 망막 세포와 달리 CHO 세포는 분비 세포는 아니며 번역 후 티로신 황산화에 대한 제한된 능력을 가지고 있다. (예를 들어, 문헌[Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537, esp. discussion, p. 1537] 참조).

전술한 이유로 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi의 생산은 예를 들어, 형질도입된 망막 세포에 의해 생성된 완전-인간 번역후 변형된, 예를 들어, 인간-당화된, 황산화된 이식유전자 생성물을 연속적으로 공급하는 영구적인 데포를 눈에서 생성하기 위해 바이러스 벡터 또는 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, HuGlyFabVEGFi를 인코딩하는 다른 DNA 발현 작제물을 당뇨병성 망막병증 (DR)로 진단된 환자 (인간 대상체)의 눈(들)의 맥락막상 공간, 망막하 공간, 또는 공막의 외부 표면에 (예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여, 또는 후측 공막옆 데포 절차에 의해 투여함으로써 유전자 요법을 통해 달성되는 당뇨병성 망막증(DR) 치료를 위한 "바이오베터(biobetter)" 분자를 생성해야 한다. FabVEGFi에 위한 cDNA 작제물은 형질도입된 망막 세포에 의한 적절한 동시에 및 번역 후 처리(당화 및 단백질 황산화)를 보장하는 신호 펩티드를 포함해야 한다. 망막 세포에 의해 사용되는 이러한 신호 서열은 다음를 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

● MNFLLSWVHW SLALLLYLHH AKWSQA (VEGF-A 신호 펩티드) (서열번호: 5)

● MERAAPSRRV PLPLLLLGGL ALLAAGVDA (피불린-1 신호 펩티드) (서열번호: 6)

● MAPLRPLLIL ALLAWVALA (비트로넥틴 신호 펩티드) (서열번호: 7)

● MRLLAKIICLMLWAICVA (보체 인자 H 신호 펩티드) (서열번호: 8)

● MRLLAFLSLL ALVLQETGT (옵티신 신호 펩티드) (서열번호: 9)

● MKWVTFISLLFLFSSAYS (알부민 신호 펩티드) (서열번호: 22)

● MAFLWLLSCWALLGTTFG (키모트립시노겐 신호 펩티드) (서열번호: 23)

● MYRMQLLSCIALILALVTNS (인터류킨-2 신호 펩티드) (서열번호: 24)

● MNLLLILTFVAAAVA (트립시노겐-2 신호 펩티드) (서열번호: 25).

예를 들어, 문헌[Stern 등, 2007, Trends Cell. Mol. Biol., 2:1-17 및 Dalton & Barton, 2014, Protein Sci, 23: 517-525]을 참조하고, 이들 각각은 사용될 수 있는 신호 펩티드에 대한 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.

대안으로서, 또는 유전자 요법에 대한 추가 치료로서, HuPTMFabVEGFi 생성물, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi 당단백질이 재조합 DNA 기술에 의해 인간 세포주에서 생산될 수 있고, 유리체내 또는 망막하 주사에 의해 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 환자에게 투여될 수 있다. HuPTMFabVEGFi 생성물, 예를 들어 당단백질은 또한 당뇨병성 망막병증(DR) 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 재조합 당단백질 생산을 위해 사용될 수 있는 인간 세포주는 몇몇을 들자면, 비제한적으로 인간 배아 신장 293 세포 (HEK293), 섬유육종 HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7, 및 망막 세포주, PER.C6, 또는 RPE를 포함한다 (예를 들면, 문헌[Dumont 등, 2015, Crit. Rev. Biotechnol. (초기 온라인, 2015년 9월 18일 온라인 공개, pp. 1-13) "Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives"]은 HuPTMFabVEGFi 생성물, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi 당단백질의 재조합 생산을 위해 사용될 수 있는 인간 세포주의 검토를 위해 그 전문이 참조로 포함된다). 완전한 당화, 특히 시알릴화, 및 티로신-황산화를 보장하기 위해, 생산을 위해 사용되는 세포주는 숙주 세포가 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 (또는 α-2,3- 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 둘 다) 및/또는 망막 세포에서 티로신-O-황산화를 책임지는 TPST-1 및 TPST-2 효소를 공동-발현하도록 조작함으로써 향상될 수 있다.

다른 이용 가능한 치료의 전달이 수반되는 눈/망막에 대한 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi의 전달의 조합이 본원에 제공된 방법에 포함된다. 추가 치료는 유전자 요법 치료 전, 그와 동시에 또는 그에 이어서 투여될 수 있다. 본원에 제공된 유전자 요법과 조합될 수 있는 당뇨병성 망막병증(DR)에 대한 이용 가능한 치료에는 레이저 광응고, 베르테포르핀을 사용한 광역학 요법, 및 페갑타닙, 라니비주맙, 아플리베르셉트, 또는 베바시주맙을 포함하나 이에 제한되지 않는 항-VEGF 제제를 사용한 유리체내(IVT) 주사가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 생물의약품과 같은 항-VEGF 제제를 사용한 추가 치료는 "구제(rescue)" 요법으로 지칭될 수 있다.

소분자 약물과 달리, 생물의약품은 일반적으로 상이한 역가, 약동학 및 안전성 프로파일을 갖는 상이한 변형 또는 형태를 가진 많은 변이체의 혼합물을 포함한다. 유전자 요법 또는 단백질 요법 접근법에서 생산되는 모든 분자가 완전히 당화되고 황산염화되는 것은 필수적이지 않다. 오히려, 생산된 당단백질의 집단은 효능을 입증하기에 위해 2,6-시알릴화 및 황산화를 포함하는 충분한 당화(집단의 약 1% 내지 약 10%)를 가져야 한다. 본원에 제공된 유전자 요법 치료의 목표는 망막 변성의 진행을 늦추거나 정지시키고, 최소한의 개입/침습적 절차를 이용하여 시력 상실을 늦추거나 예방하는 것이다. 효능은 BCVA (최고 교정 시력), 안압, 슬릿 램프(slip lamp) 생체현미경검사, 간접적인 검안, SD-OCT (SD-광 간섭 단층촬영술), 망막전위도검사 (ERG)를 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 시력 상실, 감염, 염증 및 망막 박리를 비롯한 기타 안전 사건의 징후가 또한 모니터링될 수 있다. 망막 두께는 본원에 제공된 치료의 효능을 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 망막의 두께는 임상 판독(readout)으로서 사용될 수 있으며, 망막 두께에서 감소가 크거나 망막이 두꺼워지기 전의 기간이 길수록, 치료가 더 효율적이다. 망막 두께는 예를 들어 SD-OCT에 의해 결정될 수 있다. SD-OCT는 반사 시간 지연(echo time delay) 및 관심 물체로부터 반사된 후측 산란광의 크기를 결정하기 위해 낮은 간섭 간섭계(interferometry)를 사용하는 3차원 이미징 기술이다. OCT는 3 내지 15μm 축방향 해상도로 조직 샘플(예를 들어, 망막)의 층을 스캔하는 데 사용할 수 있으며, SD-OCT는 이전 형태의 기술보다 축방향 해상도 및 스캔 속도를 향상시킨다(Schuman, 2008, Trans. Am. Opthamol. Soc. 106:426-458). 망막 기능은 예를 들어 ERG에 의해 결정될 수 있다. ERG는 인간에서의 사용을 위해 FDA에 의해 승인된, 망막 기능의 비-침습적 전기생리학적 시험이며, 이는 눈의 광 감수성 세포 (간상 및 원추), 및 이들의 연결 신경절 세포, 특히 플래쉬 자극에 대한 그들의 반응을 검사한다.

바람직한 구현예에서, 항원 결합 단편은 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal을 함유하지 않는다. 본원에서 "검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal"이라는 문구는 당업계에 공지된 표준 검정 방법에 의해 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 모이어티를 의미한다. 예를 들어, NeuGc는 NeuGc를 검출하기 위한 방법에 대해 본원에 참조로 포함되어 있는 문헌[Hara 등, 1989, "Highly Sensitive Determination of N-Acetyl-and N-Glycolylneuraminic Acids in Human Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection." J. Chromatogr., B: Biomed. 377: 111-119]에 따른 HPLC에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, NeuGc는 질량 분광분석에 의해 검출될 수 있다. α-Gal은 ELISA (문헌[예를 들어, 문헌[Galili 등, 1998, "A sensitive assay for measuring alpha-Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody."Transplantation. 65(8):1129-32 참조]), 또는 질량 분광분석 (예를 들어, 문헌[Ayoub 등. 2013, "Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques."Landes Bioscience. 5(5): 699-710] 참조)에 의해 검출될 수 있다. 문헌[Platts-Mills 등, 2015, "Anaphylaxis to the Carbohydrate Side-Chain Alpha-gal" Immunol Allergy Clin North Am. 35(2): 247-260]에 인용된 것을 참조한다.

특정 양태에서, 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편(즉, VEGF에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 단편)이 또한 본원에 제공되고, 제2 아미노산 잔기(즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 하기 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 피로글루타민화(파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하고, 및 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하고, 및 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 아세틸화되지 않는다. 본원에 제공된 항-VEGF 항원 결합 단편은 본원에 기재된 본 발명에 따른 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

특정 양태에서, 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편이 본원에 제공되고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)은 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)은 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 및 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)은 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)은 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 및 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않는다. 본원에 제공된 항-VEGF 항원 결합 단편은 본원에 기재된 본 발명에 따른 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

특정 양태에서, 또한 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편이 본원에 제공되고 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않고, 및 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서: (1) 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)는 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)는 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 및 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않고; 및 (2) 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하고, 및 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않으며, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 여기서: (1) 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)는 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)는 다음의 화학적 변형인, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 보유하고, 및 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않고; 및 (2) 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 다음의 화학적 변형인, 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상을 보유하고, 및 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 아세틸화되지 않는다. 본원에 제공된 항-VEGF 항원 결합 단편은 본원에 기재된 본 발명에 따른 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

또 다른 고려되는 투여 경로는 후극을 향해 망막하 공간으로 주사하기 위해 맥락상 공간을 통해 삽입 및 터널링된 카테터를 갖는 망막하 약물 전달 장치를 사용하는, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여이고, 여기서 작은 바늘은 망막하 공간 내로 주사된다. 이러한 투여 경로는 유리체가 온전하게 유지될 수 있게 하고, 따라서, 더 적은 합병증 위험 (유전자 요법 배출의 더 적은 위험, 및 망막 박리 및 황반 구멍과 같은 합병증)이 존재하고, 유리체절제술 없이, 생성된 수포는 더 확산적으로 확산되어 망막의 더 많은 표면적이 더 작은 부피로 형질도입되도록 할 수 있다. 이 절차에 따른 백내장 유발 위험이 최소화되어 젊은 환자에게 바람직하다. 또한, 이 절차는 표준 경유리체 접근법보다 더 안전하게 중심와 아래 수포를 전달할 수 있으며, 이는 형질도입 대상 세포는 황반에 있는 중심 시력에 영향을 미치는 유전성 망막 질환 환자에게 바람직하다. 이 절차는 또한 다른 전달 경로에 영향을 미칠 수 있는 전신 순환에 존재하는 AAV에 대한 중화 항체(Nabs)가 있는 환자에게 유리하다. 또한, 이 방법은 표준 경유리체 접근법보다 망막 절개부위 밖으로 덜 탈출하는 수포를 생성하는 것으로 나타났다.

공막옆 투여는 안구 내 감염 및 망막 박리, 일반적으로 치료제를 눈에 직접 주사하는 것과 관련된 부작용의 위험을 피하는 추가 투여 경로를 제공한다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 인간 대상체의 눈의 망막하 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하되, 상기 발현 벡터는 6.2 × 10¹¹ GC/mL의 농도에서 눈당 약 1.6 × 10¹¹ GC 또는 1.0 × 10¹² GC/mL의 농도에서 눈당 약 2.5 × 10¹¹ GC의 단일 용량으로 망막하 전달을 통해 투여되고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터이다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 인간 대상체의 눈의 망막하 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하되, 상기 발현 벡터는 6.2 × 10¹¹ GC/mL의 농도에서 약 1.55 × 10¹¹ GC/눈 또는 1.0 × 10¹² GC/mL의 농도에서 눈당 약 2.5 × 10¹¹ GC의 단일 용량으로 망막하 전달을 통해 투여되고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터이다.

특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 인간 대상체의 눈의 망막하 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하되, 상기 발현 벡터는 6.4 × 10¹¹ GC/mL의 농도에서 눈당 약 1.6 × 10¹¹ GC 또는 1.0 × 10¹² GC/mL의 농도에서 눈당 약 2.5 × 10¹¹ GC의 단일 용량으로 망막하 전달을 통해 투여되고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터이다.

특정 양태에서, 제형 완충제 (pH=7.4)에서 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터 농도 6.2 × 10¹¹ GC/mL에서 1.6 × 10¹¹ GC 또는 1.0 × 10¹² GC/mL에서 2.5 × 10¹¹ GC를 포함하는 단일 용량 조성물이 본원에 제공되고, 상기 제형 완충제는 둘베코 인산염 완충 식염수 및 0.001% 플루노닉 F68을 포함하고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터이다.

특정 양태에서, 제형 완충제 (pH=7.4)에서 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터 농도 6.2 × 10¹¹ GC/mL에서 1.55 × 10¹¹ GC 또는 1.0 × 10¹² GC/mL에서 2.5 × 10¹¹ GC를 포함하는 단일 용량 조성물이 본원에 제공되고, 상기 제형 완충제는 둘베코 인산염 완충 식염수 및 0.001% 플루노닉 F68을 포함하고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 발현 벡터는 AAV8 벡터이다.

특정 양태에서, 제형 완충제 (pH=7.4)에서 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터 농도 6.4 × 10¹¹ GC/mL에서 1.6 × 10¹¹ GC 또는 1.0 × 10¹² GC/mL에서 2.5 × 10¹¹ GC를 포함하는 단일 용량 조성물이 본원에 제공되고, 상기 제형 완충제는 둘베코 인산염 완충 식염수 및 0.001% 플루노닉 F68을 포함하고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 발현 벡터는 AAV8 벡터이다.

특정 양태에서, 제형 완충제 (pH=7.4)에서 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터의 눈당 약 6.0Х 10¹⁰개의 게놈 카피, 눈당 1.6 × 10¹¹개의 게놈 카피, 눈당 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피, 눈당 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피, 또는 눈당 3.0 × 10¹²개의 게놈 카피를 포함하는 단일 용량 조성물이 본원에 제공되고, 상기 제형 완충제는 둘베코 인산염 완충 식염수 및 0.0001% 플루노닉 F68을 포함하고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 발현 벡터는 AAV8 벡터이다.

특정 구현예에서, 당뇨병성 망막병증(DR)이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 대상체는 DR이 있는 적어도 하나의 눈을 갖고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(1) 대상체의 ETDRS-DR 중증도 척도(DRSS) 수준 결정하는 단계, 및

(2) 대상체의 ETDRS-DRSS가 레벨 47, 53, 61 또는 65인 경우, 인간 대상체의 눈의 망막하 공간 또는 맥락막상 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계.

일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하거나 갖는 단계, 및 대상체가 10% 이하의 헤모글로빈 A1c의 혈청 수준을 갖는다는 것을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 방법은 대상체에서 망막병증의 증식성 단계로의 진행을 예방한다.

특정 구현예에서, 당뇨병성 망막병증이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 대상체는 중등도-중증도 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR)이 있는 적어도 하나의 눈을 갖고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(2) 대상체의 ETDRS-DRSS가 레벨 47인 경우, 인간 대상체의 눈의 망막하 공간 또는 맥락막상 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계.

특정 구현예에서, 당뇨병성 망막병증이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 대상체는 중증 NPDR이 있는 적어도 하나의 눈을 갖고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(2) 대상체의 ETDRS-DRSS가 레벨 53인 경우, 인간 대상체의 눈의 망막하 공간 또는 맥락막상 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계.

특정 구현예에서, 당뇨병성 망막병증이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 대상체는 중등도 비증식성 당뇨병성 망막병증(PDR)이 있는 적어도 하나의 눈을 갖고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(2) 대상체의 ETDRS-DRSS가 레벨 61인 경우, 인간 대상체의 눈의 망막하 공간 또는 맥락막상 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계.

특정 구현예에서, 당뇨병성 망막병증이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 대상체는 중등 PDR이 있는 적어도 하나의 눈을 갖고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(2) 대상체의 ETDRS-DRSS가 레벨 65인 경우, 인간 대상체의 눈의 망막하 공간 또는 맥락막상 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계.

ETDRS-DR 중증도 척도 (DRSS) 수준은 표준 4-전계(widefield) 디지털 입체적 안저 사진 또는 등가물을 사용하여 결정되고; 이들은 또한 문헌[Li 등, 2010, Retina Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010;51:3184-3192]에 따라 모노스코픽(monoscopic) 또는 입체 사진술, 또는 유사한 방법에 의해 측정될 수 있다.

본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 방법은 투여 단계 후에, 적외선 열화상 카메라를 사용하여 눈 표면의 온도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIR T530 적외선 열화상 카메라이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIR T420 적외선 열화상 카메라이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIR T440 적외선 열화상 카메라이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라는 Fluke Ti400 적외선 열화상 카메라이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIRE60 적외선 열화상 카메라이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라의 적외선 해상도는 75,000픽셀 이상이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라의 열 민감도는 30℃에서 0.05℃이하이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라의 시야(FOV)는 25°× 25° 이하이다.

3.1 예시적인 구현예

1. 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 눈의 망막하 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 발현 벡터는 6.2 × 10¹¹ GC/mL의 농도에서 눈당 약 1.6 × 10¹¹ GC 또는 1.0 × 10¹² GC/mL의 농도에서 눈당 약 2.5 × 10¹¹ GC의 단일 용량으로 망막하 전달을 통해 투여되고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터인, 방법.

2. 단락 1에 있어서, 상기 투여 단계는 망막하 약물 전달 장치를 이용하여 망막하 공간에 상기 발현 벡터를 주입하는, 방법.

3. 단락 1 내지 단락 2 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여 단계는 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 망막에 전달하는, 방법.

4. 단락 3에 있어서, 상기 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량은 상기 인간 대상체의 인간 망막 세포에 의해 생성되는, 방법.

5. 단락 4에 있어서, 상기 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량은 상기 인간 대상체의 외경계막에서 인간 광수용체 세포, 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포, 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성되는, 방법.

6. 단락 5에 있어서, 상기 인간 광수용체 세포는 원추 세포 및/또는 간상 세포인, 방법.

7. 단락 6에 있어서, 상기 망막 신경절 세포는 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 감광성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교세포인, 방법.

8. 단락 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 발현 벡터는 CB7 프로모터를 포함하는, 방법.

9. 단락 8에 있어서, 상기 발현 벡터는 작제물 II인, 방법.

10. 제형 완충액 (pH=7.4)에서 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터의 농도 6.2 × 10¹¹ GC/mL에서 1.6 × 10¹¹ GC 또는 농도 1.0 × 10¹² GC/mL에서 2.5 × 10¹¹ GC를 포함하는 단일 용량 조성물로서, 상기 제형 완충제는 둘베코 인산염 완충 식염수 및 0.001% 플루노닉 F68을 포함하고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터인, 단일 용량 조성물.

11. 단락 10에 있어서, 상기 발현 벡터는 작제물 II인, 조성물.

12. 단락 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 투여 단계 후에, 적외선 열화상 카메라를 사용하여 눈에 주입된 물질의 안구 주사 후 열 프로파일을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

13. 단락 12에 있어서, 상기 적외선 열화상 카메라는 FLIR T530 적외선 열화상 카메라인, 방법.

14. DR로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 눈의 망막하 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 눈당 약 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피의 발현 벡터는 이중 맥락막상 주사에 의해 투여되고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터인, 방법.

15. DR로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 눈의 망막하 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하되, 눈당 약 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피의 발현 벡터는 이중 맥락막상 주사에 의해 투여되고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터인, 방법.

16. 단락 14 내지 단락 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여 단계는 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 망막에 전달하는, 방법.

17. 단락 16에 있어서, 상기 항-hVEGF 항체의 치료학적 유효량은 상기 인간 대상의 인간 망막 세포에 의해 생성되는, 방법.

18. 단락 17에 있어서, 상기 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량은 상기 인간 대상체의 외경계막에서 인간 광수용체 세포, 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포, 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성되는, 방법.

19. 단락 18에 있어서, 상기 인간 광수용체 세포는 원추 세포 및/또는 간상 세포인, 방법.

20. 단락 19에 있어서, 상기 망막 신경절 세포는 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 감광성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교세포인, 방법.

21. 단락 14 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 발현 벡터는 CB7 프로모터를 포함하는, 방법.

22. 단락 21에 있어서, 상기 발현 벡터는 작제물 II인, 방법.

23. 단락 14 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여 단계 후에, 적외선 열화상 카메라를 사용하여 눈에 주입된 물질의 안구 주사 후 열 프로파일을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

24. 단락 23에 있어서, 상기 적외선 열화상 카메라는 FLIR T530 적외선 열화상 카메라인, 방법.

25. 제형 완충제 (pH=7.4)에서 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터의 눈당 약 6.0 × 10¹⁰개의 게놈 카피, 눈당 1.6 × 10¹¹개의 게놈 카피, 눈당 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피, 눈당 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피, 또는 눈당 3.0 × 10¹²개의 게놈 카피를 포함하는 단일 용량 조성물로서, 상기 제형 완충액은 둘베코 인산염 완충 식염수 및 0.0001% 플루노닉 F68을 포함하고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 그리고 발현 벡터는 AAV8 벡터인, 단일 용량 조성물.

26. 단락 16에 있어서, 상기 발현 벡터는 작제물 II인, 조성물.

27. 단락 1 내지 단락 9 및 단락 12 내지 단락 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 발현 벡터의 쉐딩(shedding)을 초래하지 않는, 방법.

28. 단락 1 내지 단락 9 및 단락 12 내지 단락 24 중 어느 하나에 있어서, 1000 미만, 500 미만, 100 미만, 50 미만 또는 10 미만의 발현 벡터 유전자 카피/5 μL는 투여 후 임의의 시점에 생물학적 유체에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능한, 방법.

29. 단락 1 내지 단락 9 및 단락 12 내지 단락 24 중 어느 하나에 있어서, 210개의 발현 벡터 유전자 카피/5 μL 이하는 투여 후 임의의 시점에 생물학적 유체에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능한, 방법.

30. 단락 1 내지 단락 9 및 단락 12 내지 단락 24 중 어느 하나에 있어서, 1000 미만, 500 미만, 100 미만, 50 미만 또는 10개 미만의 벡터 유전자 카피/5 μL는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14주까지 생물학적 유체에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능한, 방법.

31. 단락 1 내지 단락 9 및 단락 12 내지 단락 24 중 어느 하나에 있어서, 벡터 유전자 카피는 벡터의 투여 후 14주까지 생물학적 유체에서 검출 가능하지 않은, 방법.

32. 단락 28 내지 단락 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 유체는 눈물, 혈청 또는 소변인, 방법.

4. 도면의 간단한 설명
도 1. 베바시주맙 Fab(아래)에서 5개의 상이한 잔기를 나타내는 라니비주맙(위)의 아미노산 서열. 가변 및 불변 중쇄(V_H 및 C_H) 및 경쇄(V_L 및 V_C)의 시작은 화살표(→)로 표시되고, CDR은 밑줄이 그어져 있다. 비-공통 당화 부위("G부위") 티로신-O-황산화 부위("Y부위")가 표시된다.
도 2. HuGlyFabVEGFi에 부착할 수 있는 글리칸. (Bondt 등, 2014, Mol & Cell Proteomics 13.1: 3029-3039에서 수정).
도 3. 라니비주맙(위) 및 베바시주맙 Fab(아래)의 과당화된 변이체의 아미노산 서열. 가변 및 불변 중쇄(V_H 및 C_H) 및 경쇄(V_L 및 V_C)의 시작은 화살표(→)로 표시되고, CDR은 밑줄이 그어져 있다. 비-공통 당화 부위("G부위") 및 티로신-O-황산화 부위("Y부위")가 표시된다. 4개의 과당화된 변이체는 별표(*)로 표시된다.
도 4. AAV8-항 VEGFfab 게놈의 개략도
도 5. Clearside^® Biomedical, Inc.에서 제조한 맥락막상 약물 전달 장치
도 6. Janssen Pharmaceuticals, Inc에 의해 제조되고 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 후극부로 맥락막상 공간을 통해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치.
도 7a-7d. 후측 공막옆 데포 절차의 예시.
도 8. AAV 캡시드 1 - 9(서열번호: 41-51)의 클러스터 다중 서열 정렬. 다른 정렬된 AAV 캡시드의 해당 위치로부터 아미노산 잔기를 "동원(recruiting)"함으로써 AAV9 및 AAV8 캡시드에 대한 아미노산 치환(하단 행에 굵게 표시)을 만들 수 있다. "HVR"로 지정된 서열 영역 = 초가변 영역.
도 9a 및 9b. Altaviz에서 제조한 미세 부피 주입기 약물 전달 장치.
도 10a 및 10b. Visionisti OY에서 제조한 약물 전달 장치. 구체적으로, 도 10a는 30g의 짧은 피하 주사 바늘을 맥락막상/망막하 바늘로 전환할 수 있는 주사 어댑터를 도시한다. 장치는 어댑터의 원위에서 노출된 바늘 끝의 길이를 제어할 수 있다. 10 μL에서 조정할 수 있다. 이 장치는 맥락막상 전달 및/또는 ab-외부 망막하 전달을 조정할 수 있다. 도 8b는 뚜껑을 열린 상태로 유지하고 바늘을 전달을 위한 최적의 각도 및 깊이로 유지할 수 있는 바늘 어댑터 가이드를 도시한다. 바늘 어댑터가 안정화 장치에 잠겨 있다. 바늘 어댑터는 표준화되고 최적화된 인오피스 맥락막상 및/또는 망막하 주사를 위한 올인원 도구이다.

5. 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용

VEGF에 대한 완전 인간 번역 후 변형 (HuPTM) 항체를 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 환자 (인간 대상체)의 눈(들)의 망막/유리체액에 전달하기 위한 조성물 및 방법이 기재되어 있다. 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 재조합으로 생산된 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-중쇄 쌍, 인트라바디, 헤테로콘주게이트 항체, 1가 항체, 및 전장 항체의 항원 결합 단편, 및 상기의 융합 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 항원 결합 단편에는 단일-도메인 항체 (중쇄 항체 (VHHs) 또는 나노바디의 가변 도메인), Fab, 전장 항-VEGF 항체 (바람직하게는, 전장 항-VEGF 단클론성 항체 (mAbs))의 F(ab')₂s, 및 scFvs (단쇄 가변 단편) (집합적으로 본원에서 "항원 결합 단편"으로 칭함)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, VEGF에 대한 완전 인간 번역 후 변형된 항체는 VEGF("HuPTMFabVEGFi")에 대한 단클론성 항체 (mAb)의 완전 인간 번역 후 변형된 항원 결합 단편이다. 추가의 바람직한 구현예에서, HuPTMFabVEGFi는 항-VEGF mAb("HuGlyFabVEGFi")의 완전 인간 당화된 항원 결합 단편이다. 또한, 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2017/180936 (국제 특허 출원 번호 PCT/US2017/027529, filed April 14, 2017), 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2017/181021 (2017년 4월 14일자로 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2017/027650), 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO2019/067540 (2018년 9월 26일자로 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2018/052855), 각각은 본원에 기재된 본 발명에 따라 사용될 수 있는 조성물 및 방법에 대해서는 그 전체가 본원에 기재되어 있다. 대안적인 구현예에서, 전장 mAb가 사용될 수 있다. 전달은 유전자 요법을 통해 - 예를 들어, 항-VEGF 항원-결합 단편 또는 mAb (또는 과당화된 유도체)를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물을 당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 환자 (인간 대상체)의 눈(들) 내의 맥락막상 공간, 망막하 공간 (경유리체 접근법으로부터 또는 맥락막상 공간을 통해 카테터로), 망막내 공간, 유리체강, 및/또는 공막의 외부 표면 (즉, 공막옆 투여)에 투여하여, 인간 PTM, 예를 들어 인간-당화 이식유전자 생성물을 연속적으로 공급하는 영구적인 데포를 눈에서 생성함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어 섹션 5.3.2에 설명된 투여 방식을 참조한다.

특정 구현예에서, 환자는 유전자 요법으로 치료하기 전에 유리체내로 주사된 항-VEGF 항원 결합 단편을 사용한 치료에 반응성인 것으로 나타났다. 특정 구현예에서, 환자는 이전에 LUCENTIS^®(라니비주맙), EYLEA^®(아플리베르셉트) 및/또는 AVASTIN^®(베바시주맙)으로 치료받았고, 상기 LUCENTIS^®(라니비주맙), EYLEA^®(애플리버셉트) 및/또는 AVASTIN^®(베바시주맙) 중 하나 이상에 반응하는 것으로 밝혀졌다.

이러한 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물이 전달되는 대상체는 바이러스 벡터 또는 발현 작제물 내의 이식유전자에 의해 인코딩된 항-hVEGF 항원 결합 단편에 대해 반응성이어야 한다. 반응성을 결정하기 위해, 항-hVEGF 항원 결합 단편 이식유전자 생성물(예를 들어, 세포 배양물, 생물반응기 등에서 생성됨)은 유리체내 주사와 같이, 대상체에게 직접 투여될 수 있다.

이식유전자에 의해 인코딩되는 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, HuGlyFabVEGFi는, 비제한적으로, hVEGF에 결합하는 항체의 항원 결합 단편, 예컨대 베바시주맙; 항-hVEGF Fab 모이어티 예컨대 라니비주맙; 또는 Fab 도메인 상에 추가의 당화 부위를 함유하도록 조작된 이러한 베바시주맙 또는 라니비주맙 Fab 모이어티를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Courtois 등, 2016, mAbs 8: 99-112] 참조, 이는 전장 항체의 Fab 도메인 상에서 과당화된 베바시주맙의 유도체의 설명을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

이식유전자를 전달하기 위해 사용되는 재조합 벡터는 인간 망막 세포 또는 광수용체 세포에 대해 향성을 가져야 한다. 이러한 벡터는 비-복제 재조합 아데노 연관 바이러스 벡터("rAAV")를 포함할 수 있으며, 특히 AAV8 캡시드를 보유하는 것이 바람직하다. 그러나, 비제한적으로, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 또는 "네이키드 DNA" 작제물로 지칭되는 비-바이러스 발현 벡터를 포함하는 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 바람직하게는, HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, HuGlyFabVEGFi, 이식유전자는 적절한 발현 조절 요소, 예를 들어 CB7 프로모터(닭-β-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서), RPE65 프로모터 또는 옵신 프로모터에 의해 제어되어야 하며, 벡터에 의해 구동된 이식유전자의 발현을 향상시키는 다른 발현 조절 요소 (예를 들어, 인트론 예컨대 닭 β-액틴 인트론, 마우스 (MVM) 인트론의 미세 바이러스, 인간 인자 IX 인트론 (예를 들어, FIX 말단절단된 인트론 1), β-글로빈 스플라이스 공여체/면역글로불린 중쇄 스플라이스 수용체 인트론, 아데노바이러스 스플라이스 공여체/면역글로불린 스플라이스 수용체 인트론, SV40 후기 스플라이스 공여체 /스플라이스 수용체 (19S/16S) 인트론, 및 하이브리드 아데노바이러스 스플라이스 공여체/IgG 스플라이스 수용체 인트론 및 polyA 신호 예컨대 토끼 β-글로빈 polyA 신호, 인간 성장 호르몬 (hGH) polyA 신호, SV40 후기 polyA 신호, 합성 polyA (SPA) 신호, 및 소 성장 호르몬 (bGH) polyA 신호)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Powell 및 Rivera-Soto, 2015, Discov. Med., 19(102):49-57]을 참조한다.

바람직한 구현예에서, 유전자 요법 작제물은 중쇄 및 경쇄가 모두 발현되도록 설계되었다. 보다 구체적으로, 중쇄 및 경쇄는 대략 동일한 양으로 발현되어야 하며, 즉 중쇄 및 경쇄는 중쇄 대 경쇄의 비율이 대략 1:1로 발현되어야 한다. 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 중쇄 및 경쇄가 절단가능한 링커 또는 IRES에 의해 분리되어 별도의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 발현되는 단일 작제물에서 조작될 수 있다. 예를 들어, 특정 리더 서열에 대해서는 섹션 5.2.4 및 특정 IRES, 2A 및 본원에 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 기타 링커 서열에 대해서는 섹션 5.2.5를 참조한다.

특정 구현예에서, 유전자 요법 작제물은 제형 완충제 중 AAV 벡터 활성 성분의 냉동 멸균, 단일 사용 용액으로서 공급된다. 특정 구현예에서, 망막하 투여에 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 적합한 수성 완충제, 계면활성제 및 임의의 부형제를 포함하는 제형 완충제 중 재조합 (예를 들어, rHuGlyFabVEGFi) 벡터의 현탁액을 포함한다. 특정 구현예에서, 작제물은 둘베코의 인산염 완충 염수 및 0.001% 플루노닉 F68, pH = 7.4에서 제형화된다.

재조합 벡터의 치료적 유효량은 ≥ 0.1 mL 내지 ≤ 0.5 mL, 바람직하게는 0.1 내지 0.30 mL (100 - 300 μl) 범위의 부피로, 및 가장 바람직하게는, 0.25 mL (250 μl)의 부피로 망막하 및/또는 망막내(예를 들어, 경유리체 접근법을 통한 망막하 주사 (외과적 절차) 또는 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여에 의함)로 투여되어야 한다. 재조합 벡터의 치료적 유효량은 100 μl 이하의 부피로, 예를 들어 50-100μl의 부피로 맥락막상으로 투여(예를 들어, 맥락막상 주사에 의함) 되어야 한다. 재조합 벡터의 치료적 유효량은 500 μl 이하의 부피로, 예를 들어, 500 μl 이하의 부피로, 예를 들어, 10-20 μl, 20-50 μl, 50-100 μl, 100-200 μl, 200-300 μl, 300-400 μl, 또는 400-500 μl의 부피로 공막의 외부 표면에 투여되어야 한다. 망막하 주사는 국소 마취 하에서 대상체의 부분 유리체절제 및 망막 내로 유전자 요법을 주사하는 것을 포함하는, 숙련된 망막 외과의가 수행되는 외과적 절ㅊ차이다(예를 들어, Campochiaro 등, 2017, Hum Gen Ther 28(1):99-111, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 구체적인 구현예에서, 망막하 투여는 작은 바늘은 망막하 공간 내로 주사되는, 맥락상 공간을 통해 후극으로 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 사용하여 맥락막상 공간을 통해 수행된다(예를 들어, [Baldassarre 등, 2017, Subretinal Delivery of Cells via the Suprachoroidal Space:Janssen Trial. In: Schwartz 등 (eds) Cellular Therapies for Retinal Disease, Springer, Cham]; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/040635 A1 참조; 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 맥락막상 투여 절차는 눈의 맥락막상 공간에 약물을 투여하는 것을 포함하며, 일반적으로 미세바늘이 있는 미량주입기와 같은 맥락막상 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다(예를 들어, [Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23; Goldstein, 2014, Retina Today 9(5): 82-87] 참조, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 본원에 기재된 본 발명에 따른 맥락막상 공간 내에 발현 벡터를 침착시키기 위해 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 Clearside® Biomedical, Inc.에 의해 제조된 맥락막상 약물 전달 장치(예를 들어, [Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23] 참조)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 본 발명에 따른 맥락막상 공간을 통해 망막하 공간에 발현 벡터를 침착시키기 위해 사용될 수 있는 망막하 약물 전달 장치는 Janssen Pharmaceuticals, Inc.에 의해 제조된 망막하 약물 전달 장치를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/040635 A1 참조). 특정 구현예에서, 공막의 외부 표면에 대한 투여는 팁이 공막 표면에 대해 직접 침착으로 삽입될 수 있고 유지될 수 있는 캐뉼라를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치에 의해 수행된다. 상이한 투여 방식에 대한 자세한 내용은 섹션 5.3.2를 참조한다. 맥락막상, 망막하, 공막옆, 유리체내, 결막하 및/또는 망막내 투여는 가용성 이식유전자 생성물을 망막, 유리체액 및/또는 안방수로 전달해야 한다. 망막 세포, 예를 들어 간상 세포, 원추 세포, 망막 색소 상피 세포, 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 신경절 및/또는 뮐러 세포에 의한 이식유전자 생성물(예를 들어, 인코딩된 항-VEGF 항체)의 발현은 망막, 유리체액, 및/또는 안방수의 이식유전자 생성물의 전달 및 유지를 초래한다. 특정 구현예에서, 수양액 (눈의 전방)에서 0.110 μg/mL, 또는 유리체액에서 적어도 0.330 μg/mL의 C_min에서 이식유전자 생성물의 농도를 3개월 동안 유지하는 용량이 요구되며; 그 후, 1.70 내지 6.60 μg /mL 범위의 이식유전자 생성물의 유리체 C_min 농도, 및/또는 0.567 내지 2.20 μg/mL 범위의 수성 C_min 농도가 유지되어야 한다. 그러나 이식유전자 생성물이 지속적으로 생산되기 때문에, 더 낮은 농도를 유지하는 것이 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 이식유전자 생성물의 농도는 치료된 눈의 유리체액 및/또는 전방으로부터 방수의 환자 샘플에서 측정될 수 있다. 대안적으로, 유리체액 농도는 환자의 이식유전자 생성물의 혈청 농도를 측정함으로써 추정 및/또는 모니터링할 수 있다 - 이식유전자 생성물에 대한 전신 대 유리체 노출의 비율은 약 1:90,000이다. (예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Xu L, 등, 2013, Invest. Opthal. Vis. Sci. 54: 1616-1624, p. 1621 및 표 5 p. 1623]에 보고된 라니비주맙의 유리체액 및 혈청 농도).

벡터 이식유전자는 쉐딩 (표적 세포를 감염시키지 않고 대변 또는 체액을 통해 신체로부터 제거된 벡터의 방출), 가동화(이식유전자 복제 및 표적 세포 밖으로의 전달), 또는 생식선 전달(정액을 통한 자손으로의 유전자 전달)로부터 의도하지 않은 수용체로 확산되는 잠재력을 갖는다. 벡터 쉐딩은 예를 들어 정량적 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 눈물, 혈청 또는 소변과 같은 생물학적 유체에서 벡터 DNA를 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터의 투여 후 임의의 시점에서 생물학적 유체(예를 들어, 눈물, 혈청 또는 소변)에서 벡터 유전자 카피가 검출되지 않는다. 일부 구현예에서, 1000 미만, 500 미만, 100 미만, 50 미만 또는 10개 미만의 벡터 유전자 카피/5 μL는 투여 후 임의의 시점에 생물학적 유체(예를 들어, 눈물, 혈청 또는 소변)에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능하다. 특정 구현예에서, 210개의 벡터 유전자 카피/5 μL 이하가 혈청에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 1000 미만, 500 미만, 100 미만, 50 미만 또는 10개 미만의 벡터 유전자 카피/5 μL는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 주까지 생물학적 유체(예를 들어, 눈물, 혈청 또는 소변)에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능하다. 특정 구현예에서, 벡터의 투여 후 14주까지 혈청에서 벡터 유전자 카피가 검출되지 않는다.

본 발명은 시간이 지남에 따라 소산되어 최고 및 최저 수준을 초래하는 VEGF 억제제의 고용량 볼러스의 반복된 안구 주사를 포함하는 표준 케어 치료에 비해 몇 가지 이점이 있다. 항체를 반복적으로 주사하는 것과는 대조적으로, 이식유전자 생성물 항체의 지속적인 발현은 작용 부위에서 보다 일관된 수준의 항체가 존재할 수 있게 하고, 보다 적은 주사가 필요하도록 하여 보다 적은 의사 방문을 초래하기 때문에 환자를 위해 덜 위험하고 보다 편리하다. 일관된 단백질 생산은 망막의 부종 반동이 발생할 가능성이 적기 때문에 더 나은 임상 결과로 이어질 수 있다. 또한, 이식유전자로부터 발현된 항체는 번역 중 및 번역 후에 존재하는 상이한 미세환경 때문에 직접 주입되는 것과 상이한 방식으로 번역 후 변형된다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 이는 상이한 확산, 생물활성, 분포, 친화성, 약동학 및 면역원성 특징을 갖는 항체를 생성하여, 직접적으로 주사된 항체와 비교하여, 작용 부위에 전달된 항체가 "바이오베터"가 되도록 한다.

또한, 생체내 이식유전자로부터 발현된 항체는 단백질 응집 및 단백질 산화와 같은 재조합 기술에 의해 생성된 항체와 관련된 분해 산물을 함유할 가능성이 적다. 응집은 높은 단백질 농도, 제조 장비 및 용기와의 표면 상호 작용, 특정 완충 시스템을 사용한 정제로 인한 단백질 생산 및 저장과 관련된 문제이다. 응집을 촉진하는 이러한 조건은 유전자 요법에서의 이식유전자 발현에서는 존재하지 않는다. 메티오닌, 트립토판 및 히스티딘 산화와 같은 산화는 또한 단백질 생산 및 저장과 관련이 있으며, 스트레스가 가해진 세포 배양 조건, 금속 및 공기 접촉, 완충제 및 부형제의 불순물로 인해 발생한다. 생체내 이식유전자로부터 발현된 단백질은 또한 스트레스가 가해진 조건에서 산화될 수 있다. 그러나, 인간과 많은 다른 유기체는 항상화 시스템을 구비하여, 산화 스트레스를 감소시킬 뿐만 아니라, 때로는 또한 산화를 복구 및/또는 역전시킨다. 따라서, 생체 내에서 생성된 단백질은 산화된 형태가 아닐 가능성이 높다. 응집과 산화 모두는 역가, 약동학(클리어랜스) 및 면역원성에 영향을 미칠 수 있다.

이론에 얽매이지 않고, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 부분적으로 다음 원리에 기초한다:

(i) 인간 망막 세포는 망막 세포에서 강력한 과정인 당화 및 티로신-O-황산화를 포함하여 분비된 단백질의 번역 후 처리를 위한 세포 기구를 보유한 분비 세포이다. (예를 들어, 망막 세포에 의한 당단백질의 생성을 보고하는 문헌[Wang 등, 2013, Analytical Biochem. 427: 20-28 및 Adamis 등, 1993, BBRC 193: 631-638]; 및 망막 세포에 의해 분비되는 티로신-황산화 당단백질의 생산을 보고하는 문헌[Kanan 등, 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567 및 Kanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res.133:126-131]을 참조하며, 이들 각각은 인간 망막 세포에 의해 만들어진 번역 후 변형에 대해 그 전체가 참조로 포함됨).

(ii) 당업계의 이해와 달리, 라니비주맙과 같은 항-VEGF 항원 결합 단편(및 베바시주맙과 같은 전장 항-VEGF mAb의 Fab 도메인)은 사실상 N-연결된 당화 부위를 보유한다. 예를 들어, 라니비주맙의 V_H 도메인(Q¹¹⁵GT) 및 V_L 도메인(TFQ¹⁰⁰GT) 내의 당화 부위인 글루타민 ("Q") 잔기 (및 베바시주맙 Fab 내의 상응하는 부위)뿐만 아니라, C_H 도메인 (TVSWN¹⁶⁵SGAL) 및 C_L 도메인 (QSGN¹⁵⁸SQE) 내의 비-공통 아스파라기날(asparaginal) ("N") 당화 부위를 확인하는 도 1을 참고한다. (예를 들어, 문헌[Valliere-Douglass 등, 2009, J. Biol. Chem. 284: 32493-32506 및 Valliere-Douglass 등, 2010, J. Biol. Chem. 285: 16012-16022] 참조, 이들 각각은 항체에서 N-연결된 당화 부위의 확인을 위해 그 전체가 참고로 포함됨).

(iii) 그러한 비정규 부위는 일반적으로 항체 집단의 낮은 수준의 당화(예를 들어, 약 1-5%)를 초래하지만, 기능적 이점은 눈과 같은 면역학적 특권을 가진 장기에서 중요할 수 있다(예를 들어, 문헌[van de Bovenkamp 등, 2016, J. Immunol. 196:1435-1441] 참조). 예를 들어 Fab 당화는 항체의 안정성, 반감기 및 결합 특징에 영향을 미칠 수 있다. 표적에 대한 항체의 친화성에 대한 Fab 당화의 효과를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 또는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)이 사용될 수 있다. 항체의 반감기에 대한 Fab 당화의 효과를 결정하기 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어 방사성 표지된 항체가 투여된 대상체에서 혈액 또는 장기 (예를 들어, 눈)에서의 방사성활성의 수준의 측정에 의해 사용될 수 있다. 항체의 안정성, 예를 들어 응집 또는 단백질 언폴딩 수준에 대한 Fab 당화의 효과를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어, 시차 주사 열량측정 (DSC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 예를 들어, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SEC-HPLC), 모세관 전기영동, 질량 분광분석, 또는 탁도 측정이 사용될 수 있다. 본원에 제공되는 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, HuGlyFabVEGFi 이식유전자는 비정규 부위에서 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 초과로 당화된 Fab의 생산을 야기한다. 특정 구현예에서, Fab 집단으로부터의 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 초과의 Fab는 비정규 부위에서 당화된다. 특정 구현예에서, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 초과의 비정규 부위는 당화된다. 특정 구현예에서, 이들 비정규 부위에서 Fab의 당화는 HEK293 세포에서 생산된 Fab의 이들 비정규 부위의 당화의 양보다 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 초과로 더 크다.

(iv) 당화 부위에 추가하여, 라니비주맙(및 베바시주맙의 Fab)과 같은 항-VEGF Fab는 CDR 내부 또는 근처에 티로신("Y") 황산화 부위를 함유하고; 라니비주맙의 V_H(EDTAVY⁹⁴Y⁹⁵) 및 V_L(EDFATY⁸⁶) 도메인 내의 티로신-O-황산화 부위(및 베바시주맙의 Fab에서 상응하는 부위)를 확인하는 도 1 참고한다. (예를 들어, Yang 등, 2015, Molecules 20:2138-2164, 특히 p. 2154를 참조하고, 이는 단백질 티로신 황산화를 거친 티로신 잔기를 둘러싼 아미노산의 분석을 위해 그 전체가 참고로 포함됨). "규칙"은 다음과 같이 요약할 수 있다: Y의 +5 내지 -5 위치 내에 E 또는 D를 가진 Y 잔기, 및 Y의 위치 -1은 중성 또는 산성 하전된 아미노산이지만 황산화를 없애는 염기성 아미노산, 예를 들어, R, K 또는 H는 아님). 인간 IgG 항체는 N-말단 변형, C-말단 변형, 아미노산 잔기의 분해 또는 산화, 시스테인 관련 변이체 및 당화와 같은 많은 다른 번역 후 변형을 나타낼 수 있다(예를 들어,[Liu 등, 2014, mAbs 6(5):1145-1154] 참조).

(v) 인간 망막 세포에 의한 라니비주맙 또는 베바시주맙의 Fab 단편과 같은 항-VEGF Fab의 당화는 이식유전자 생성물의 안정성, 반감기를 개선하고 원치 않는 응집 및/또는 면역원성을 감소시킬 수 있는 글리칸의 추가를 초래할 것이다. (예를 들어, Fab 당화의 새로운 중요성에 대한 검토는 문헌[Bovenkamp 등, 2016, J. Immunol. 196: 1435-1441] 참조). 유의하게는, 본원에 제공된 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi에 첨가될 수 있는 글리칸은 2,6-시알산 (예를 들어, HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, HuGlyFabVEGFi 내로 혼입될 수 있는 글리칸을 도시하는 도 2 참조) 및 이등분 GlcNAc을 함유하지만 NGNA (N-글리콜릴뉴라민산, Neu5Gc)을 함유하지 않는 고도로 처리된 복합체-유형 바이안테너리 N-글리칸이다. 이러한 글리칸은 라니비주맙 (이는 E. 콜라이에서 제조되고, 당화되지 않음)에서 또는 베바시주맙(이러한 번역후 변형을 만드는데 필요한 2,6-시알릴트랜스퍼라제를 갖지 않으며, Neu5Ac (NANA) 대신 인간에 전형적이지 않은 (그리고 잠재적으로 면역원성인) 시알산으로서 Neu5Gc (NGNA)를 추가하지만 이등분 GlcNAc를 생산하지 않는 CHO 세포에서 제조됨)에서 존재하지 않는다. 예를 들어, 문헌[Dumont 등, 2015, Crit. Rev. Biotechnol. (초기 온라인, 2015년 9월 18일 온라인 공개, pp. 1-13, p. 5)]을 참조한다. 또한, CHO 세포는 면역원성 글리칸인 α-Gal 항원을 생산할 수 있으며, 이는 대부분의 개체에 존재하는 항-α-Gal 항체와 반응하고, 고농도에서는 과민증을 유발할 수 있다. 예를 들어 문헌[Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156]을 참조한다. 본원에 제공된 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi의 인간 당화 패턴은 이식유전자 생성물의 면역원성을 감소시키고 효능을 개선해야 한다.

(vi) 라니비주맙 또는 베바시주맙의 Fab 단편과 같은 항-VEGF Fab의 티로신-황산화 - 인간 망막 세포에서 강력한 번역 후 과정 -는 VEGF에 대해 결합력이 증가된 이식유전자 생성물을 초래할 수 있다. 사실상, 다른 표적에 대한 치료 항체 Fab의 티로신-황산화는 항원에 대한 결합 활성 및 활성을 극적으로 증가시키는 것으로 나타났다 (예를 들어, 문헌[Loos 등, 2015, PNAS 112: 12675-12680, 및 Choe 등, 2003, Cell 114: 161-170] 참조). 이러한 번역 후 변형은 라니비주맙(티로신-황산화에 필요한 효소를 보유하지 않는 숙주인 E. 콜라이에서 만들어짐) 상에 존재하지 않으며, 기껏해야 CHO 세포 생성물인 베바시주맙에서 불충분하게 나타난다. 인간 망막 세포와 달리, CHO 세포는 분비성 세포가 아니며 번역 후 티로신-황산화를 위해 제한된 능력을 가지고 있다. (예를 들어, 문헌[Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537, 특히 p. 1537]에서의 논의를 참조).

전술한 이유로 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi의 생산은 유전자 요법을 통해 - 예를 들어, 형질도입된 망막 세포에 의해 생산된 완전-인간 번역후 변형된, 예를 들어, 인간-당화된, 황산화된 이식유전자 생성물을 연속적으로 공급하는 영구적인 데포를 눈에서 생성하기 위해 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, HuGlyFabVEGFi를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물을 당뇨병성 망막병증 (DR)로 진단된 환자 (인간 대상체)의 눈(들) 내의 맥락막상 공간, 망막하 공간, 또는 공막의 외부 표면에 투여함으로써 (예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법을 통한 망막하 주사 (외과적 절차), 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여, 또는 후측 공막옆 데포 절차에 의함), 당뇨병성 망막병증(DR) 치료를 위한 "바이오베터(biobetter)" 분자를 생성해야 한다. FabVEGFi에 대한 cDNA 작제물은 형질도입된 망막 세포에 의한 적절한 동시 및 번역 후 처리(당화 및 단백질 황산화)를 보장하는 신호 펩티드를 포함해야 한다. 망막 세포에 의해 사용되는 이러한 신호 서열은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

● MNFLLSWVHW SLALLLYLHH AKWSQA (VEGF-A 신호 펩티드) (서열번호: 5)

● MAPLRPLLIL ALLAWVALA (비트로넥틴 신호 펩티드) (서열번호: 7)

● MRLLAKIICLMLWAICVA (보체 인자 H 신호 펩티드) (서열번호: 8)

● MRLLAFLSLL ALVLQETGT (옵티신 신호 펩티드) (서열번호: 9)

● MKWVTFISLLFLFSSAYS (알부민 신호 펩티드) (서열번호: 22)

● MYRMQLLSCIALILALVTNS (인터류킨-2 신호 펩티드) (서열번호: 24)

● MNLLLILTFVAAAVA (트립시노겐-2 신호 펩티드) (서열번호: 25).

예를 들어, 문헌[Stern 등, 2007, Trends Cell. Mol. Biol., 2:1-17 및 Dalton & Barton, 2014, Protein Sci, 23: 517-525]을 참조하고, 이들 각각은 사용될 수 있는 신호 펩티드에 대한 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.

대안으로서, 또는 유전자 요법에 대한 추가 치료로서, HuPTMFabVEGFi 생성물, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi 당단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 인간 세포주에서 생산될 수 있고, 유리체내 주사에 의해 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 환자에게 투여될 수 있다. HuPTMFabVEGFi 생성물, 예를 들어 당단백질은 또한 당뇨병성 망막병증(DR) 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 재조합 당단백질 생산을 위해 사용될 수 있는 인간 세포주는 몇몇 예를 들자면, 비제한적으로, 인간 배아 신장 293 세포 (HEK293), 섬유육종 HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7, 및 망막 세포주, PER.C6, 또는 RPE를 포함한다 (예를 들면, 문헌[Dumont 등, 2015, Crit. Rev. Biotechnol. (초기 온라인, 2015년 9월 18일 온라인 공개, pp. 1-13) "Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives"]은 HuPTMFabVEGFi 생성물, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi 당단백질의 재조합 생산을 위해 사용될 수 있는 인간 세포주의 검토를 위해 그 전문이 참조로 포함된다) 완전한 당화, 특히 시알릴화, 및 티로신-황산화를 보장하기 위해, 생산에 사용되는 세포주는 숙주 세포가 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 (또는 α-2,3- 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 둘 다) 및/또는 망막 세포에서 티로신-O-황산화의 원인이 되는 TPST-1 및 TPST-2 효소를 공동-발현하도록 조작함으로써 향상될 수 있다.

다른 이용 가능한 치료의 전달이 수반되는 눈/망막에 대한 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi의 전달의 조합은 본원에 제공된 방법에 포함된다. 추가 치료는 유전자 요법 치료 전, 그와 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 본원에 제공된 유전자 요법과 조합될 수 있는 당뇨병성 망막병증(DR)에 대한 이용 가능한 치료에는 레이저 광응고법, 베르테포르핀을 사용한 광역학 요법, 및 페갑타닙, 라니비주맙, 아플리베르셉트, 또는 베바시주맙을 포함하나 이에 제한되지 않는 항-VEGF 제제를 사용한 유리체내(IVT) 주사가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 생물의약품과 같은 항-VEGF 제제를 사용한 추가 치료는 "구제" 요법으로 지칭될 수 있다.

소분자 약물과 달리, 생물의약품은 일반적으로 상이한 역가, 약동학 및 안전성 프로파일을 갖는 변형 또는 형태가 다른 많은 변이체의 혼합물을 포함한다. 유전자 요법 또는 단백질 요법 접근법에서 생성된 모든 분자가 완전히 당화되고 황산염화되는 것이 필수적이지는 않다. 오히려, 생산된 당단백질의 집단은 효능을 입증하기에 위해 2,6-시알릴화 및 황산화를 포함하는, 충분한 당화(집단의 약 1% 내지 약 10%)를 가져야 한다. 본원에 제공된 유전자 요법 치료의 목표는 망막 변성의 진행을 늦추거나 저지하고, 최소한의 개입/침습성 절차로 시력 상실을 늦추거나 예방하는 것이다. 효능은 BCVA (최고 교정 시력), 안압, 슬릿 램프 생체현미경검사, 간접적인 검안, SD-OCT (SD-광 간섭 단층촬영), 망막전위도검사 (ERG)를 측정하여 모니터링할 수 있다. 시력 상실, 감염, 염증 및 망막 박리를 비롯한 기타 안전 사건의 징후 또한 모니터링할 수 있다. 망막 두께는 본원에 제공된 치료의 효능을 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 망막의 두께는 임상 판독으로서 사용될 수 있으며, 망막 두께의 감소가 크거나 망막이 두꺼워지기 전의 기간이 길수록 치료가 더 효과적이다. 망막 두께는 예를 들어 SD-OCT에 의해 결정될 수 있다. SD-OCT는 관심 물체로부터 반사된 후측 산란광의 에코 시간 지연 및 반사된 크기를 결정하기 위해 낮은 간섭 간섭계를 사용하는 3차원 이미징 기술이다. OCT는 3 내지 15μm 축방향 해상도로 조직 샘플(예를 들어, 망막)의 층을 스캔하는 데 사용할 수 있으며, SD-OCT는 이전 형태의 기술보다 축방향 해상도와 스캔 속도를 향상시킨다(Schuman, 2008, Trans. Am. Opthamol. Soc. 106:426-458). 망막 기능은 예를 들어, ERG에 의해 결정될 수 있다. ERG는 인간에서의 사용을 위해 FDA에 의해 승인된, 망막 기능의 비-침습적성 전기생리학적 시험이며, 이는 눈의 광 감수성 세포 (간상 및 원추), 및 그의 연결 신경절 세포, 특히 플래쉬 자극에 대한 그의 반응을 검사한다.

5.1 N-당화, 티로신 황산화 및 O-당화

본원에 기재된 방법에 사용된 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi의 항-VEGF 항원 결합 단편의 아미노산 서열(일차 서열)은 N-당화 또는 티로신 황산화가 일어나는 적어도 하나의 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편의 아미노산 서열은 적어도 하나의 N-당화 부위 및 적어도 하나의 티로신 황산화 부위를 포함한다. 이러한 부위는 아래에 자세히 설명되어 있다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편의 아미노산 서열은 적어도 하나의 O-당화 부위를 포함하며, 이는 상기 아미노산에 존재하는 하나 이상의 N-당화 부위 및/또는 티로신 황산화 부위에 추가될 수 있다.

5.1.1 N-당화

역 당화 부위

정규적인 N-당화 서열은 Asn-X-Ser(또는 Thr)인 것으로 당업계에 공지되어 있되, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. 그러나, 최근에 인간 항체의 아스파라긴(Asn) 잔기가 역 공통 모티프인 Ser(또는 Thr)-X-Asn의 맥락에서 당화될 수 있되, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음이 입증되었다. 문헌[Valliere-Douglass 등, 2009, J. Biol. Chem. 284:32493-32506; 및 Valliere-Douglass 등, 2010, J. Biol. Chem. 285:16012-16022]을 참조한다. 본원에 개시된 바와 같이, 그리고 최신 기술의 이해와 달리, 본원에 기재된 방법에 따라 사용하기 위한 항-VEGF 항원 결합 단편, 예를 들어, 라니비주맙은 이러한 역 공통 서열 중 몇 개를 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 Ser(또는 Thr)-X-Asn 서열을 포함하는 적어도 하나의 N-당화 부위(또한 본원에서 "역 N-당화 부위"로 지칭됨)를 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편의 사용을 포함하되, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 Ser(또는 Thr)-X-Asn 서열을 포함하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10개 초과의 N-당화 부위를 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편의 사용을 포함하되, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10개 초과의 역 N-당화 부위 뿐만 아니라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10개 초과의 비-공통 N-당화 부위 (본원의 아래에서 정의됨)를 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편의 사용을 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 하나 이상의 역 N-당화 부위를 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편은 각각 서열번호 1 및 2의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 라니비주맙이다. 또 다른 특정 구현예에서, 방법에 사용된 하나 이상의 역 N-당화 부위를 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편은 각각 서열번호 3 및 4의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 베바시주맙의 Fab를 포함한다.

비-공통 당화부위

역 N-당화 부위에 더하여, 최근에는 인간 항체의 글루타민(Gln) 잔기가 비-공통 모티프인 Gln-Gly-Thr의 맥락에서 당화될 수 있다는 것이 입증되었다. 문헌[Valliere-Douglass 등, 2010, J. Biol. Chem. 285:16012-16022]을 참조한다. 놀랍게도, 본원에 기재된 방법에 따라 사용하기 위한 항-VEGF 항원 결합 단편, 예를 들어 라니비주맙은 이러한 비-공통 서열 중 몇 개를 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 서열 Gln-Gly-Thr(본원에서 "비-공통 N-당화 부위"로도 지칭됨)을 포함하는 적어도 하나의 N-당화 부위를 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편의 사용을 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 Gln-Gly-Thr 서열을 포함하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10개 초과의 N-당화 부위를 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편의 사용을 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 하나 이상의 비-공통 N-당화 부위를 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편은 (각각 서열번호 1 및 2의 경쇄 및 중쇄를 포함하는) 라니비주맙이다. 또 다른 특정 구현예에서, 방법에 사용된 하나 이상의 비-공통 N-당화 부위를 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편은 (각각 서열번호 3 및 4의 경쇄 및 중쇄를 포함하는) 베바시주맙의 Fab를 포함한다.

조작된 N-당화 부위

특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산은 정상적으로HuGlyFabVEGFi와 연관된 것보다(예를 들어, 비변형된 상태의 항-VEGF 항원 결합 단편과 연관된 N-당화 부위의 수에 비해) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 초과의 N-당화 부위 (정규적인 N-당화 공통 서열, 역 N-당화 부위, 및 비-공통 N-당화 부위 포함함)를 포함하도록 변형된다. 특정 구현예에서, 당화 부위의 도입은, 상기 도입에 항원-결합 단편이 그의 항원인, VEGF에 결합하는 것에 영향을 주지 않는 한, 항원 결합 단편의 일차 구조 내 임의의 위치에 N-당화 부위(정규적인 N-당화 공통 서열, 역 N-당화 위치, 및 비-공통 N-당화 부위를 포함함)의 삽입에 의해 달성된다. 당화 부위의 도입은, 예를 들어, 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 단편이 유래되는 항체의 일차 구조에 새로운 아미노산을 부가함으로써 (즉, 전체적으로 또는 부분적으로 당화 부위가 첨가됨), 또는 N-당화를 생성하기 위해 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 단편이 유래되는 항체에 존재하는 아미노산을 돌연변이시킴으로써 (즉, 항원 결합 단편/항체에 아미노산이 첨가되지 않지만, 항원 결합 단편/항체의 선택된 아미노산이 돌연변이되어 N-당화 부위를 형성함) 달성될 수 있다. 당업자는 단백질의 아미노산 서열이 당업계에 공지된 접근법, 예를 들어 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 변형을 포함하는 재조합 접근법을 사용하여 쉽게 변형될 수 있음을 인식할 것이다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 항-VEGF 항원 결합 단편은 망막 세포에서 발현될 때 과당화될 수 있도록 변형된다. 예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로 포함된 문헌[Courtois 등, 2016, mAbs 8:99-112]를 참조한다. 특정 구현예에서, 상기 항-VEGF 항원-결합 단편은 라니비주맙 (각각 서열번호 1 및 2의 경쇄 및 중쇄 포함)이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 항-VEGF 항원-결합 단편은 베바시주맙의 Fab (각각 서열번호. 3 및 4의 경쇄 및 중쇄 포함)를 포함한다.

항-VEGF 항원 결합 단편의 N-당화

소분자 약물과 달리, 생물의약품은 일반적으로 상이한 역가, 약동학 및 안전성 프로파일을 갖는 상이한 변형 또는 형태를 가진 많은 변이체의 혼합물을 포함한다. 유전자 요법 또는 단백질 요법 접근법에서 생성된 모든 분자가 완전히 당화되고 황산화되는 것이 필수적이지는 않다. 오히려, 생산된 당단백질의 집단은 효능을 입증하기 위해 (2,6-시알릴화 포함) 충분한 당화 및 황산화를 가져야 한다. 본원에 제공된 유전자 요법 치료의 목표는 망막 변성의 진행을 늦추거나 저지하고 최소한의 개입/침습성 절차로 시력 상실을 늦추거나 예방하는 것이다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 항-VEGF 항원 결합 단편, 예를 들어, 라니비주맙은, 망막 세포에서 발현될 때, 그의 N-당화 부위의 100%에서 당화될 수 있다. 그러나, 당업자는 당화의 이점이 달성되기 위해 항-VEGF 항원 결합 단편의 모든 N-당화 부위가 N-당화될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 오히려, 당화의 이점은 N-당화 부위의 단지 일정 백분율만이 당화될 때, 및/또는 발현된 항원 결합 단편의 단지 일정 백분율만이 당화될 때 실현될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 항-VEGF 항원 결합 단편은, 망막 세포에서 발현될 때, 이용가능한 N-당화 부위의 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90%, 또는 90% - 100%에서 당화된다. 특정 구현예에서, 망막 세포에서 발현될 때, 본dmks에 기재된 방법에 따라 사용된 항-VEGF 항원 결합 단편의 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90%, 또는 90% - 100%가 이들의 이용 가능한 N-당화 부위 중 적어도 하나에서 당화된다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 항-VEGF 항원 결합 단편에 존재하는 부위의 적어도 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는, 항-VEGF 항원 결합 단편이 망막 세포에서 발현될 때 N-당화 부위에 존재하는 Asn 잔기(또는 다른 관련 잔기)에서 당화된다. 즉, 생성된 HuGlyFabVEGFi의 N-당화 부위의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 당화된다.

또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 항-VEGF 항원 결합 단편에 존재하는 부위의 적어도 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는, 항-VEGF 항원 결합 단편이 망막 세포에서 발현될 때 N-당화 부위에 존재하는 Asn 잔기(또는 다른 관련 잔기) 연결된 동일한 부착된 글리칸으로 당화된다. 즉, 생성된 HuGlyFabVEGFi의 N-당화 부위의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 동일한 부착된 글리칸으로 당화된다.

본원에 기재된 방법에 따라 사용된 항-VEGF 항원 결합 단편, 예를 들어, 라니비주맙이 망막 세포에서 발현될 때, 항원 결합 단편의 N-당화 부위는 다양한 상이한 글리칸으로 당화될 수 있다. 항원 결합 단편의 N-글리칸은 당업계에서 특성화되어 있다. 예를 들어, 문헌[Bondt 등, 2014, Mol. & Cell. Proteomics 13.11:3029-3039] (Fab-연관 N-글리칸의 개시내용에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)는 Fab 연관된 글리칸을 특징화하고, 항체의 Fab 및 Fc 부분이 별개의 당화 패턴을 포함하며, Fab 글리칸이 갈락토실화, 시알릴화, 및 이등분 (예를 들어, 이등분 GlcNAc를 가짐)에서 높지만 Fc 글리칸에 대해 푸코실화에서는 낮음을 입증한다. 문헌[Bondt, Huang 등, 2006, Anal. Biochem. 349:197-207] (Fab 연관 N-글리칸의 개시내용에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)은 Fab의 대부분의 글리칸이 시알릴화된다는 것을 발견하였다. 그러나 Huang에 의해 검사된 항체(뮤린 세포 배경에서 생성됨)의 Fab에서는, 확인된 시알산 잔기는 N-아세틸뉴라민산 ("Neu5Ac", 우세한 인간 시알산) 대신에 N-글리콜릴뉴라민산 ("Neu5Gc" 또는 "NeuGc") (인간에 자연적이지 않음)이었다. 또한, 문헌[Song 등, 2014, Anal. Chem.86:5661-5666](Fab 연관 N-글리칸의 개시내용에 대해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)은 상업적으로 입수가능한 항체와 연관된 N-글리칸의 라이브러리를 기술한다.

중요하게는, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 항-VEGF 항원 결합 단편, 예를 들어, 라니비주맙이 인간 망막 세포에서 발현될 때, 원핵 숙주 세포(예를 들어, E. 콜라이) 또는 진핵 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포)에서 시험관내 생산에 대한 필요성이 우회된다. 대신에, 본원에 기재된 방법(예를 들어, 항-hVEGF 항원-결합 단편을 발현하기 위한 망막 세포의 사용)의 결과로서, 상기 항-VEGF 항체-결합 단편의 N-당화 부위는 유리하게는 인간의 치료와 관련되고 그에 유익한 글리칸으로 장식된다. 이러한 이점은 항체/항원-결합 단편 생산에서 CHO 세포 또는 E. 콜라이가 이용될 때 얻을 수 없는데, 그 이유는 예를 들어, CHO 세포가 (1) 2,6 시알릴트랜스퍼라제를 발현하지 않고, 따라서 N-당화 동안 2,6-시알산을 첨가할 수 없고, (2) Neu5Ac 대신에 시알산으로서 Neu5Gc를 첨가할 수 있기 때문이고; E. 콜라이는 N-당화에 필요한 성분을 자연적으로 함유하지 않기 때문이다. 따라서, 한 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법에 사용되는 HuGlyFabVEGFi를 생성하기 위해 망막 세포에서 발현된 항-VEGF 항원-결합 단편은 단백질이 인간 망막 세포, 예를 들어, 망막 색소 세포에서 N-당화된 방식으로 당화되지만, 단백질이 CHO 세포에서 당화된 방식으로 당화되지 않는 것인. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법에 사용되는 HuGlyFabVEGFi를 생성하기 위해 망막 세포에서 발현된 항-VEGF 항원-결합 단편은 단백질이 인간 망막 세포, 예를 들어, 망막 색소 세포에서 N-당화되는 방식으로 당화되며, 여기서 이러한 당화는 원핵 숙주 세포를 사용하여, 예컨대, E. 콜라이를 사용하여 천연적으로 가능하지 않다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 HuGlyFabVEGFi, 예를 들어 라니비주맙은 인간 항체의 Fab와 연관된 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 별개의 N-글리칸을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 항체의 Fab와 연관된 상기 N-글리칸은 문헌[Bondt 등, 2014, Mol. & Cell. Proteomics 13.11:3029-3039, Huang 등, 2006, Anal. Biochem. 349:197-207, 및/또는 Song 등, 2014, Anal. Chem. 86:5661-5666]에 기재된 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 HuGlyFabVEGFi, 예를 들어 라니비주맙은 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 포함하지 않는다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 HuGlyFabVEGFi, 예를 들어, 라니비주맙은 2,6-연결된 시알산을 포함하는 글리칸으로 주로 당화된다. 특정 구현예에서, 2,6-연결된 시알산을 포함하는 HuGlyFabVEGFi는 폴리시알릴화되고, 즉, 하나 초과의 시알산을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 HuGlyFabVEGFi의 각각의 N-당화 부위는 2,6-연결된 시알산을 포함하는 글리칸을 포함하고, 즉, 상기 HuGlyFabVEGFi의 N-당화 부위의 100%는 2,6-연결된 시알산을 포함하는 글리칸을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 HuGlyFabVEGFi의 N-당화 부위의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 2,6-연결된 시알산을 포함하는 글리칸으로 당화된다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 HuGlyFabVEGFi의 N-당화 부위의 적어도 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90%, 또는 90% - 99%는 2,6-연결된 시알산을 포함하는 글리칸으로 당화된다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따른 망막 세포에서 발현된 항원 결합 단편(즉, HuGlyFabVEGFi, 예를 들어, 라니비주맙을 발생시키는 항원 결합 단편)의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 2,6-연결된 시알산을 포함하는 글리칸으로 당화된다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따른 망막 세포에서 발현된 항원 결합 단편(즉, HuGlyFabVEGFi, 예를 들어, 라니비주맙을 발생시키는 Fab)의 적어도 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90%, 또는 90% - 99%는 2,6-연결된 시알산을 포함하는 글리칸으로 당화된다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 시알산은 Neu5Ac이다. 이러한 구현예에 따르면, HuGlyFabVEGFi의 N-당화 부위의 단지 일정 백분율만이 2,6 시알화되거나 폴리시알릴화되는 경우, 나머지 N-당화는 별개의 N-글리칸을 포함할 수 있거나, 또는 N-글리신을 전혀 포함하지 않을 수 있다 (즉, 비당화된 채로 유지됨).

HuGlyFabVEGFi가 2,6 폴리시알릴화된 경우, 이는 다중 시알산 잔기, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10개 초과의 시알산 잔기를 포함한다. 특정 구현예에서, HuGlyFabVEGFi가 폴리시알릴화되는 경우, 이는 2-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 또는 40-50개의 시알산 잔기를 포함한다. 특정 구현예에서, HuGlyFabVEGFi가 폴리시알릴화되는 경우, 이는 2,6-연결된 (시알산)ⁿ을 포함하며, 여기서 n은 1-100의 임의의 수일 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 HuGlyFabVEGFi, 예를 들어, 라니비주맙은 이등분 GlcNAc을 포함하는 글리칸으로 주로 당화된다. 특정 구현예에서, 상기 HuGlyFabVEGFi의 각각의 N-당화 부위는 이등분 GlcNAc을 포함하는 글리칸을 포함하고, 즉, 상기 HuGlyFabVEGFi의 N-당화 부위의 100%는 이등분 GlcNAc을 포함하는 글리칸을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 HuGlyFabVEGFi의 N-당화 부위의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 이등분 GlcNAc을 포함하는 글리칸으로 당화된다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 HuGlyFabVEGFi의 N-당화 부위의 적어도 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90%, 또는 90% - 99%는 이등분 GlcNAc을 포함하는 글리칸으로 당화된다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따른 망막 세포에서 발현된 항원 결합 단편(즉, HuGlyFabVEGFi, 예를 들어, 라니비주맙을 발생시키는 항원 결합 단편)의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 이등분 GlcNAc을 포함하는 글리칸으로 당화된다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따른 망막 세포에서 발현된 항원 결합 단편(즉, HuGlyFabVEGFi, 예를 들어, 라니비주맙을 발생시키는 항원 결합 단편)의 적어도 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90%, 또는 90% - 99%는 이등분 GlcNAc을 포함하는 글리칸으로 당화된다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 HuGlyFabVEGFi, 예를 들어, 라니비주맙은 과당화되고, 즉, 자연 발생 N-당화 부위로부터 생성된 N-당화 이외에, 상기 HuGlyFabVEGFi는 HuGLiFabVEGFi를 생성하는 항원 결합 단편의 아미노산 서열에 존재하도록 조작된 N-글리칸을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 HuGlyFabVEGFi, 예를 들어 라니비주맙은 과당화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 포함하지 않는다.

항원 결합 단편을 포함하는 항체의 당화 패턴을 결정하기 위한 검정은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 히드라진분해는 글리칸을 분석하는 데 사용할 수 있다. 먼저, 다당류는 히드라진과의 인큐베이션에 의해 연관 단백질에서 방출된다(문헌[Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, UK]를 사용할 수 있음). 친핵체 히드라진은 다당류와 담체 단백질 사이의 글리코시드 결합을 공격하고 부착된 글리칸의 방출을 허용한다. N-아세틸기는 이 처리 동안 손실되며 재-N-아세틸화에 의해 재구성되어야 한다. 글리칸은 또한 PNGase F 및 Endo H와 같은 글리코시다제 또는 엔도글리코시다제와 같은 효소를 사용하여 방출될 수 있으며, 이는 히드라진보다 부반응이 적고 깨끗하게 절단된다. 유리 글리칸은 탄소 컬럼에서 정제할 수 있으며 후속적으로 형광단 2-아미노 벤즈아미드로 환원 말단에 표지될 수 있다. 표지된 다당류는 문헌[Royle 등, Anal Biochem 2002, 304(1):70-90]의 HPLC 프로토콜에 따라 GlycoSep-N 컬럼(GL Sciences)에서 분리될 수 있다. 생성된 형광 크로마토그램은 다당류 길이 및 반복 단위 수를 나타낸다. 구조적 정보는 개별 피크를 수집한 후 MS/MS 분석을 수행하여 수집할 수 있다. 이로써 단당류 조성 및 반복 단위의 서열을 확인할 수 있고, 추가적으로 다당류 조성의 균질성을 확인할 수 있다. 저분자량 또는 고분자량의 특정 피크는 MALDI-MS/MS로 분석할 수 있으며 그 결과는 글리칸 서열을 확인하는 데 사용할 수 있다. 크로마토그램의 각 피크는 특정 수의 반복 단위 및 단편, 예를 들어, 당 잔기로 구성된 중합체, 예를 들어, 글리칸에 해당한다. 크로마토그램은 따라서 중합체, 예를 들어, 글리칸, 길이 분포를 측정할 수 있다. 용출 시간은 중합체 길이를 나타내는 반면, 형광 강도는 각 중합체, 예를 들어, 글리칸에 대한 몰 존재비와 상관관계가 있다. 항원 결합 단편과 연관된 글리칸을 평가하는 다른 방법은 문헌[Bondt 등, 2014, Mol. & Cell. Proteomics 13.11:3029-3039, Huang 등, 2006, Anal. Biochem. 349:197-207, 및/또는 Song 등, 2014, Anal. Chem. 86:5661-5666]에 의해 기재된 것이다.

항체 (항원-결합 단편 포함)와 연관된 글리칸 패턴의 균질성 또는 이종성은, 당화 부위를 가로질러 존재하는 글리칸 길이 또는 크기 및 수 글리칸 둘 다에 관한 것이기 때문에, 관련 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 글리칸 길이의 측정 방법, 크기 및 유체역학적 반경을 사용하여 평가될 수 있다. 크기 배제, 순상, 역상, 음이온 교환 HPLC와 같은 HPLC와 모세관 전기영동을 통해 유체역학적 반경을 측정할 수 있다. 단백질에서 더 많은 수의 당화 부위는 더 적은 당화 부위를 갖는 담체에 비해 유체역학적 반경에서 더 큰 변화를 초래한다. 그러나 단일 글리칸 사슬을 분석할 때, 보다 제어된 길이로 인해 더 균질할 수 있다. 글리칸 길이는 히드라진분해, SDS PAGE, 및 모세관 겔 전기영동에 의해 측정될 수 있다. 또한, 균질성은 특정 당화 부위 사용 패턴이 더 넓은/더 좁은 범위로 변경됨을 의미할 수도 있다. 이러한 인자는 글리코펩티드 LC-MS/MS로 측정할 수 있다.

N-당화의 이점

N-당화는 본원에 기재된 방법에 사용된 HuGlyFabVEGFi에 수많은 이점을 부여한다. 이러한 이점은 E. 콜라이가 N-당화에 필요한 성분을 천연적으로 보유하지 않기 때문에, E. 콜라이에서 항원 결합 단편의 생성에 의해 얻을 수 없다. 또한, CHO 세포는 특정 글리칸 (예를 들어, 2,6 시알산 및 이등분 GlcNAc)의 첨가를 위해 필요한 성분이 결여되어 있고, CHO 세포는 글리칸, 예를 들어 인간에 전형적이지 않은 Neu5Gc를 첨가할 수 있기 때문에, 일부 이점은 예를 들어 CHO 세포에서 항체 생산을 통해 얻을 수 없다. 예를 들어, 문헌[Song 등, 2014, Anal. Chem. 86:5661-5666]을 참조한다. 따라서, 항-VEGF 항원 결합 단편, 예를 들어, 라니비주맙이 비정규 N-당화 부위(역 및 비-공통 당화 부위 모두를 포함함)를 포함한다는 본원에 기재된 발견으로 인해, 이러한 당화를 유발하는 방식의 VEGF 항원 결합 단편(따라서 항원 결합 단편과 관련된 개선된 이점)이 실현되었다. 특히, 인간 망막 세포에서 항-VEGF 항원 결합 단편의 발현은 그렇지 않으면 항원 결합 단편 또는 그의 모 항체와 연관되지 않을 유익한 글리칸을 포함하는 HuGlyFabVEGFi (예를 들어, 라니비주맙)의 생성을 초래한다.

그러한 비정규 당화 부위는 일반적으로 항체 집단의 낮은 수준의 당화(예를 들어, 1-5%)를 초래하지만 기능적 이점은 눈과 같은 면역학적 특권이 있는 장기에서 중요할 수 있다(예를 들어, 문헌[van de Bovenkamp 등, 2016, J. Immunol. 196:1435-1441] 참조). 예를 들어 Fab 당화는 항체의 안정성, 반감기 및 결합 특성에 영향을 미칠 수 있다. 표적에 대한 항체의 친화도에 대한 Fab 당화의 효과를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 또는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)이 사용될 수 있다. 항체의 반감기에 대한 Fab 당화의 효과를 결정하기 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술이, 예를 들어 방사성표지된 항체가 투여된 대상체에서 혈액 또는 장기 (예를 들어, 눈)에서의 방사성활성의 수준의 측정에 의해 사용될 수 있다. 항체의 안정성, 예를 들어 응집 또는 단백질 언폴딩 수준에 대한 Fab 당화의 효과를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어, 시차 주사 열량측정 (DSC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 예를 들어, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SEC-HPLC), 모세관 전기영동, 질량 분광분석, 또는 탁도 측정이 사용될 수 있다. 본원에 제공되는 HuGlyFabVEGFi 이식유전자는 비정규 부위에서 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 초과의 당화된 항원 결합 단편을 생성을 초래한다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편의 집단으로부터의 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 초과의 항원 결합 단편은 비정규 부위에서 당화된다. 특정 구현예에서, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 초과의 비정규 부위는 당화된다. 특정 구현예에서, 이들 비정규 부위에서의 항원 결합 단편의 당화는 HEK293 세포에서 생산된 항원 결합 단편의 이들 비정규 부위의 당화의 양보다 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 초과 더 크다.

본원에 기재된 방법에 사용된 HuGlyFabVEGFi 상의 시알산의 존재는 HuGlyFabVEGFi의 소거율(clearance rate), 예를 들어 유리체액으로부터의 소거율에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, HuGlyFabVEGFi의 시알산 패턴은 최적화된 소거율을 갖는 치료제를 생성하는데 사용될 수 있다. 항원 결합 단편 소거율을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Huang 등, 2006, Anal. Biochem. 349:197-207]을 참조한다.

또 다른 특정 구현예에서, N-당화에 의해 부여되는 이점은 감소된 응집이다. 점유된 N-당화 부위는 응집 경향이 있는 아미노산 잔기를 마스킹하여 응집을 감소시킬 수 있다. 이러한 N-당화 부위는 본원에 사용되는 항원 결합 단편에 고유하거나 본원에 사용되는 항원 결합 단편으로 조작되어, 발현될 때, 예를 들어 망막 세포에서 발현될 때, 응집이 덜 일어나는 HuGlyFabVEGFi를 생성할 수 있다. 항체의 응집을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로 포함된 문헌[Courtois 등, 2016, mAbs 8:99-112]를 참조한다.

또 다른 특정 구현예에서, N-당화에 의해 부여되는 이점은 감소된 면역원성이다. 이러한 N-당화 부위는 본원에 사용되는 항원 결합 단편에 고유하거나 본원에 사용되는 항원 결합 단편으로 조작되어, 예를 들어 망막 세포에서 발현될 때 면역원성이 덜 일어나는 HuGlyFabVEGFi를 생성할 수 있다.

또 다른 특정 구현예에서, N-당화에 의해 부여되는 이점은 단백질 안정성이다. 단백질의 N-당화는 단백질에 안정성을 부여하는 것으로 잘 알려져 있으며, N-당화로 인한 단백질 안정성을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sola 및 Griebenow, 2009, J Pharm Sci., 98(4): 1223-1245]을 참조한다.

또 다른 특정 구현예에서, N-당화에 의해 부여되는 이점은 변경된 결합 친화성이다. 항체의 가변 도메인 내의 N-당화 부위의 존재는 그의 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Bovenkamp 등, 2016, J. Immunol.196:1435-1441]을 참조한다. 항체 결합 친화성를 측정하기 위한 분석은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Wright 등, 1991, EMBO J. 10:2717-2723; 및 Leibiger 등, 1999, Biochem. J. 338:529-538]을 참조한다.

5.1.2 티로신 황산화

티로신 황산화는 Y의 +5에서 -5 위치 내에서 글루타메이트(E) 또는 아스파르테이트(D)를 가진 티로신(Y) 잔기에서 발생하며, Y의 위치 -1은 중성 또는 산성 하전된 아미노산이지만 황산화를 없애는 염기성 아미노산, 예를 들어, 아르기닌(R), 라이신(K), 또는 히스티딘(H)은 아니다. 놀랍게도, 본원에 기재된 방법에 따라 사용하기 위한 항-VEGF 항원 결합 단편, 예를 들어 라니비주맙은 티로신 황산화 부위를 포함한다(도 1 참조). 따라서, 본원에 기재된 방법은 적어도 하나의 티로신 황산화 부위를 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편, 예를 들어 HuPTMFabVEGFi의 사용을 포함하며, 이러한 항-VEGF 항원 결합 단편은 망막 세포에서 발현될 때 티로신 황산화될 수 있다.

중요하게도, 티로신 황산화 항원 결합 단편, 예를 들어 라니비주맙은 자연적으로 티로신 황산화에 필요한 효소를 보유하지 않는 E. 콜라이에서 생산될 수 없다. 또한, CHO 세포는 티로신 황산화에 대해 결핍되어 있으며 - 이들은 분비성 세포는 아니며 번역 후 티로신 황산화에 대한 제한된 능력을 가지고 있다. 예를 들어, [Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537]을 참조한다. 유리하게는, 본원에 제공된 방법은 망막 세포에서 항-VEGF 항원 결합 단편, 예를 들어 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 라니비주맙의 발현을 요구하며, 이는 분비성이며 티로신 황산화 능력을 갖는다. 참조 문헌[Kanan 등, 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567 및 Kanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131]는 망막 세포에 의해 분비되는 티로신-황화 당단백질의 생산을 보고한다.

티로신 황산화는 여러 가지 이유로 유리하다. 예를 들어, 표적에 대한 치료 항체의 항원 결합 단편의 티로신-황산화는 항원 및 활성에 대한 결합력을 극적으로 증가시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌[Loos 등, 2015, PNAS 112: 12675-12680, 및 Choe 등, 2003, Cell 114: 161-170] 참조 티로신 황산화 검출을 위한 분석은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Yang 등, 2015, Molecules 20:2138-2164]을 참조한다.

5.1.3 O-당화

O-당화는 효소에 의한 세린 또는 트레오닌 잔기에 대한 N-아세틸-갈락토사민을 첨가하는 것을 포함한다. 항체의 힌지 영역에 존재하는 아미노산 잔기는 O-당화될 수 있음이 입증되었다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 항-VEGF 항원 결합 단편, 예를 들어, 라니비주맙은 그의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함하고, 따라서 인간 망막 세포에서 발현될 때 O-당화될 수 있다. O-당화의 가능성은 예를 들어, E. 콜라이에서 생산된 항원-결합 단편과 비교하여, 본원에 제공된 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi에 또 다른 이점을 부여하는데, 이는 다시 E. 콜라이가 자연적으로 인간 O-당화에 사용된 것과 동등한 기구를 함유하지 않기 때문이다. (대신 E. 콜라이의 O-당화는 박테리아가 특정 O-당화 기구를 함유하도록 변형된 경우에만 입증되었다. 예를 들어, 문헌[Faridmoayer 등, 2007, J. Bacteriol. 189:8088-8098] 참조). 글리칸을 보유함으로써, O-당화된 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어 HuGlyFabVEGFi는 (상기 논의된 바와 같은) N-당화된 HuGlyFabVEGFi와 유리한 특성을 공유한다.

5.2 작제물 및 제형

본원에 제공되는 방법에 사용하기 위한 항-VEGF 항원 결합 단편 또는 항-VEGF 항원 결합 단편의 과당화된 유도체를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물가 제공된다. 본원에 제공되는 바이러스 벡터 및 기타 DNA 발현 작제물은 표적 세포(예를 들어, 망막 색소 상피 세포)에 이식유전자를 전달하기 위한 임의의 적합한 방법을 포함한다. 이식유전자의 전달 수단은 바이러스 벡터, 리포솜, 다른 지질-함유 복합체, 다른 거대분자 복합체, 합성 변형된 mRNA, 비변형된 mRNA, 소분자, 비-생물학적 활성 분자 (예를 들어, 금 입자), 중합된 분자 (예를 들어, 덴드리머), 네이키드 DNA, 플라스미드, 파아지, 트랜스포손, 코스미드, 또는 에피솜을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 표적화된 벡터, 예를 들어 망막 색소 상피 세포를 표적으로 하는 벡터이다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 사용을 위한 핵산을 제공하며, 핵산은 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터에 작동가능하게 연결된 HuGlyFabVEGFi를 인코딩한다: CB7 프로모터 (닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 루 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 닭 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터. 특정 구현예에서, HuPTMFabVEGFi는 CB7 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

특정 구현예에서, 본원은 하나 이상의 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)을 포함하는 재조합 벡터를 제공된다. 핵산은 DNA, RNA, 또는 DNA와 RNA의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, DNA는 프로모터 서열, 관심 유전자 (이식유전자, 예를 들어, 항-VEGF 항원 결합 단편)의 서열, 미번역 영역, 및 종결 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 관심 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드) 및 핵산 서열은 예를 들어 당업자에게 공지된 임의의 코돈 최적화 기술을 통해 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Quax 등, 2015, Mol Cell 59:149-161]에 의한 리뷰 참조).

특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 작제물 I이고, 여기서 작제물 I은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접하는 AAV8 역전된 말단 반복부; (2) a) CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 CB7 프로모터, b) 닭 β-액틴 인트론 및 c) 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호를 포함하는 조절 요소; 및 (3) 동일한 양의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 보장하는 자가-절단 퓨린(F)/F2A 링커에 의해 분리된, 항-VEGF 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열.

또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 작제물 II이고, 여기서 작제물 II은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접하는 AAV2 역전된 말단 반복부; (2) a) CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 CB7 프로모터, b) 닭 β-액틴 인트론 및 c) 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호를 포함하는 조절 요소; 및 (3) 동일한 양의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 보장하는 자가-절단 퓨린(F)/F2A 링커에 의해 분리된 항-VEGF 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 도 4에 예시되어 있다.

5.2.1 mRNA

특정 구현예에서, 본원에 제공되는 벡터는 관심 유전자(예를 들어, 이식유전자, 예를 들어, 항-VEGF 항원 결합 단편 모이어티)를 인코딩하는 변형된 mRNA이다. 망막 색소 상피 세포로의 이식유전자 전달을 위한 변형 및 비변형 mRNA의 합성은 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있는 문헌[Hansson 등, J. Biol. Chem., 2015, 290(9):5661-5672]에 교시되어 있다. 특정 구현예에서, 본원은 항-VEGF 항원 결합 단편 모이어티를 인코딩하는 변형된 mRNA를 제공한다.

5.2.2 바이러스 벡터

바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 (AAV, 예를 들어, AAV8), 렌티바이러스, 헬퍼 의존성 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 폭스바이러스, 일본 혈구응집소 바이러스 (HVJ), 알파바이러스, 백시니아 바이러스, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV)- 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 기반 벡터를 포함한다. 알파바이러스 벡터에는 셈리키 포레스트 바이러스 (SFV) 및 신드비스(sindbis) 바이러스 (SIN)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인간에서 복제-결핍되도록 변경된다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 하이브리드 벡터, 예를 들어 "무력(helpless)" 아데노바이러스 벡터에 배치된 AAV 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원은 제1 바이러스로부터의 바이러스 캡시드 및 제2 바이러스로부터의 바이러스 외피 단백질을 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다. 특정 구현예에서, 제2 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(VSV)이다. 보다 구체적인 구현예에서, 외피 단백질은 VSV-G 단백질이다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 HIV 기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공되는 HIV 기반 벡터는 적어도 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈으로부터 유래하고 env 유전자는 또 다른 바이러스로부터 유래된다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 단순 포진 바이러스 기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 단순 포진 바이러스 기반 벡터는 이들이 하나 이상의 즉시 초기(IE) 유전자를 포함하지 않도록 변형되어 이들을 비-세포독성이 되게 한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 MLV 기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공되는 MLV 기반 벡터는 바이러스 유전자 대신에 최대 8 kb의 이종 DNA를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 인간 렌티바이러스로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 비-인간 렌티바이러스로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 캡시드로 패키징된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 하기 요소 중 하나 이상을 포함한다: 긴 말단 반복부, 프라이머 결합 부위, 폴리퓨린 관, att 부위, 및 캡시드화 부위.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 알파바이러스 기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 알파바이러스 벡터는 재조합 복제 결함 알파바이러스이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 알파바이러스 벡터의 알파바이러스 레플리콘은 비리온 표면에 기능성 이종 리간드를 표시함으로써 특정 세포 유형을 표적으로 한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 AAV 기반 바이러스 벡터이다. 바람직한 구현예에서, 본원에 제공되는 바이러스 벡터는 AAV8 기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 AAV8 기반 바이러스 벡터는 망막 세포에 대한 향성을 유지한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공되는 AAV 기반 벡터는 AAV rep 유전자(복제를 위해 필요함) 및/또는 AAV cap 유전자(캡시드 단백질 합성을 위해 필요함)를 인코딩한다. 다중 AAV 혈청형이 확인되었다. 특정 구현예에서, 본원에 제공되는 AAV 기반 벡터는 AAV의 하나 이상의 혈청형으로부터의 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공되는 AAV 기반 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAVrh10 중 하나 이상으로부터의 캡시드 성분을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본원에 제공되는 AAV 기반 벡터는 AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAVrh10 혈청형 중 하나 이상으로부터의 성분을 포함한다.

특정 구현예에서, 본원은 조절 요소의 제어 하에 ITR에 플랭크된 이식유전자의 발현을 위한 발현 카세트 및 AAV8 캡시드 단백질의 아미노 산 서열을 갖거나 AAV8 캡시드 단백질의 아미노산 서열 (서열번호: 48)과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일한 한편, AAV8 캡시드의 생물학적 기능을 보유한 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 게놈을 포함하는 AAV8 벡터를 제공한다. 특정 구현예에서, 코딩된 AAV8 캡시드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 치환을 갖고 AAV8 캡시드의 생물학적 기능 유지하는 서열번호: 48의 서열을 갖는다. 도 8은 열 표지된 SUBS와의 비교에 기초하여 정렬된 서열 내의 특정 위치에서 치환될 수 있는 잠재적인 아미노산을 갖는 상이한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 비교 정렬을 제공한다. 따라서, 특정 구현예에서, AAV8 벡터는 천연 AAV8 서열 내의 해당 위치에 존재하지 않는 도 8의 SUBS 열에서 확인된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 치환을 갖는 AAV8 캡시드 변이체를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 AAV는 그 전체가 참고로 본원에 포함된 문헌[Zinn 등, 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068]에 기재된 Anc80 또는 Anc80L65이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 AAV는 하기 아미노산 삽입 중 하나를 포함한다: 각각이 그 전체적으로 참고로 본원에 포함된 미국 특허 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282호 및 미국 특허 출원 공개 제2016/0376323호에 기재된, LGETTRP 또는 LALGETTRP. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 AAV는 각각이 그 전체적으로 참고로 본원에 포함된 미국 특허 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282호 및 미국 특허 출원 공개 제2016/0376323호에 기재된 AAV.7m8이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 AAV는미국 특허 제9,585,971호에 개시된 임의의 AAV, 예컨대 AAV-PHP.B이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 AAV는 각각이 그 전체적으로 참고로 본원에 포함된 하기 특허 및 특허 출원 중 임의의 것에 개시된 AAV이다: 미국 특허 번호 7,906,111; 8,524,446; 8,999,678; 8,628,966; 8,927,514; 8,734,809; US 9,284,357; 9,409,953; 9,169,299; 9,193,956; 9458517; 및 9,587,282 US 특허 출원 공개 번호 2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; 및 국제 특허 출원 번호 PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335.

AAV8 기반 바이러스 벡터는 본원에 기재된 특정 방법에 사용된다. AAV 기반 바이러스 벡터의 핵산 서열 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드의 제조 방법은 예를 들어, 각각이 본원에 참조로 전체적으로 포함되어 있는 미국 특허 번호 7,282,199 B2, 미국 특허 번호 7,790,449 B2, 미국 특허 번호 8,318,480 B2, 미국 특허 번호 8,962,332 B2 및 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2014/076466에 교시되어 있다. 한 양태에서, 본원은 이식유전자(예를 들어, 항-VEGF 항원 결합 단편)을 인코딩하는 AAV(예를 들어, AAV8) 기반 바이러스 벡터를 제공한다. 특정 구현예에서, 본원은 항-VEGF 항원 결합 단편을 인코딩하는 AAV8 기반 바이러스 벡터를 제공한다. 보다 구체적인 구현예에서, 본원은 라니비주맙을 인코딩하는 AAV8 기반 바이러스 벡터를 제공한다.

특정 구현예에서, 단일 가닥 AAV(ssAAV)가 상기한대로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 자가-상보적 벡터, 예를 들어 scAAV가 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty 등, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Number 16, 페이지 1248-1254; 및 미국 특허 번호 6,596,535; 7,125,717; 및 7,456,683]를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 바이러스 벡터는 아데노바이러스 기반 바이러스 벡터이다. 재조합 아데노바이러스 벡터가 항-VEGF 항원 결합 단편에서의 전달을 위해 사용될 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 E1 결실이 있고, E3 결실이 있거나 없으며, 그리고 발현 카세트가 결실된 영역 내로 삽입된 1세대 벡터일 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 E2 및 E4 영역의 전체 또는 부분 결실을 포함하는 2세대 벡터일 수 있다. 헬퍼 의존성 아데노바이러스는 아데노바이러스 역전 말단 반복부 및 패키징 신호(phi)만을 보유한다. 이식유전자는 게놈을 대략 36 kb의 야생형 크기에 가깝게 유지하기 위해 스터퍼 서열(stuffer sequence)을 갖거나 갖지 않는 패키징 신호와 3'ITR 사이에 삽입된다. 아데노바이러스 벡터의 생산을 위한 예시적인 프로토콜은 문헌[Alba 등, 2005, "Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy," Gene Therapy 12:S18-S27]에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 바이러스 벡터는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터이다. 재조합 렌티바이러스 벡터가 항-VEGF 항원 결합 단편에서의 전달을 위해 사용될 수 있다. 작제물을 만들기 위해 4개의 플라스미드가 사용된다: 플라스미드를 함유하는 Gag/pol 서열, 플라스미드를 함유하는 Rev 서열, 플라스미드(즉, VSV-G)를 함유하는 외피 단백질, 패키징 요소 및 항-VEGF 항원 결합 단편 유전자를 갖는 시스 플라스미드.

렌티바이러스 벡터 생산을 위해, 4개의 플라스미드가 세포(즉, HEK293 기반 세포)에 공동 형질감염되어, 폴리에틸렌이민 또는 인산칼슘이 다른 것 중에서도 형질감염제로 사용할 수 있다. 이어서, 렌티바이러스를 상등액에서 수집한다 (렌티바이러스는 활성이 되기 위해 세포로부터 발아할 필요가 있고, 따라서 세포 수집이 필요하거나 이루어질 필요가 없음). 상등액이 여과되고(0.45μm), 이어서 염화마그네슘과 벤조나아제를 첨가한다. 추가 다운스트림 프로세스는 광범위하게 변할 수 있으며, 가장 GMP와 양립성인 TFF 및 컬럼 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 다른 것은 컬럼 크로마토그래피가 있거나 없이 초원심분리를 사용한다. 렌티바이러스 벡터의 생산을 위한 예시적인 프로토콜은 문헌[Lesch 등, 2011, "Production and purification of lentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviral vectors," Gene Therapy 18:531-538, and Ausubel 등, 2012, "Production of CGMP-Grade Lentiviral Vectors," Bioprocess Int. 10(2):32-43]에서 찾을 수 있고, 둘 다 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 벡터는 벡터가 관련 세포 (예를 들어, 생체내 또는 시험관내 망막 세포) 내로 도입시, 항-VEGF 항원-결합 단편의 당화된 및/또는 티로신 황산화된 변이체가 세포에 의해 발현되도록, 항-VEGF 항원 결합 단편(예를 들어, 라니비주맙)을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 발현된 항-VEGF 항원 결합 단편은 상기 섹션 5.1에 기재된 바와 같은 당화 및/또는 티로신 황산화 패턴을 포함한다.

5.2.3 유전자 발현의 프로모터 및 개질제

특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 유전자 전달 또는 유전자 발현을 조절하는 성분(예를 들어, "발현 조절 요소")을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 유전자 발현을 조절하는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 흡수 후 세포 내의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 이식유전자)의 국소화에 영향을 미치는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공되는 벡터는 예를 들어 폴리뉴클레오티드를 흡수한 세포를 검출하거나 선택하기 위해 검출 가능하거나 선택가능한 마커로서 사용될 수 있는 성분을 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 특정 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터는 이식유전자 발현이 치료 효능을 위해 원하는 대로 켜지고 꺼질 수 있도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 프로모터는 예를 들어, 저산소증 유도된 프로모터 및 약물 유도성 프로모터, 예를 들어 라파마이신 및 관련 제제에 의해 유도된 프로모터를 포함한다. 저산소증 유도성 프로모터는 HIF 결합 부위를 갖는 프로모터를 포함하며, 예를 들어 문헌[Schdel, 등, 2011, Blood 117(23):e207-e217 and Kenneth and Rocha, 2008, Biochem J. 414:19-29]를 참조하고, 이들 각각은 저산소증 유도성 프로모터의 교시를 위해 참고로 포함된다. 또한, 작제물에 사용될 수 있는 저산소증 유도성 프로모터는 에리트로포이에틴 프로모터 및 N-WASP 프로모터를 포함한다(에리트로포이에틴 프로모터의 개시내용에 대한 문헌[Tsuchiya, 1993, J. Biochem. 113:395] 및 N-WASP 프로모터의 개시내용에 대한 문헌[Biophysics Reports 9:13-21]를 참조하고, 이들 모두는 저산소증 유도 프로모터의 교시에 대해 참조로 포함됨). 대안적으로, 작제물은 약물 유도성 프로모터, 예를 들어 라파마이신 및 관련 유사체의 투여에 의해 유도될 수 있는 프로모터를 함유할 수 있다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO94/18317, WO 96/20951, WO 96/41865, WO 99/10508, WO 99/10510, WO 99/36553, 및 WO 99/41258, 및 미국 특허 번호 US 7,067,526(라파마이신 유사체 개시), 이들은 약물 유도성 프로모터의 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함됨). 특정 구현예에서, 프로모터는 저산소증 유도성 프로모터이다. 특정 구현예에서, 프로모터는 저산소증 유도성 인자(HIF) 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터는 HIF-1α 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터는 HIF-2α 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, HIF 결합 부위는 RCGTG 모티프를 포함한다. HIF 결합 부위의 위치 및 서열에 관한 세부사항은, 예를 들어, 문헌[Schdel, 등, Blood, 2011, 117(23):e207-e217]을 참조하고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 특정 구현예에서, 프로모터는 HIF 전사 인자 이외의 저산소증 유도 전사 인자에 대한 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 저산소증에서 우선적으로 번역되는 하나 이상의 IRES 부위를 포함한다. 저산소증 유도성 유전자 발현 및 이에 관련된 인자에 관한 교시에 대해서는, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Kenneth 및 Rocha, Biochem J., 2008, 414:19-29]를 참조한다.

특정 구현예에서, 프로모터는 CB7 프로모터이다(문헌[Dinculescu 등, 2005, Hum Gene Ther 16: 649-663]를 참조하고, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 구현예에서, CB7 프로모터는 벡터에 의해 구동된 이식유전자의 발현을 향상시키는 다른 발현 조절 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 다른 발현 조절 요소는 닭 β-액틴 인트론 및/또는 토끼 β-글로빈 polA 신호를 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터는 TATA 박스를 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터는 하나 이상의 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 프로모터 요소는 서로에 대해 역전되거나 이동될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터의 요소는 협력하여 기능하도록 위치된다. 특정 구현예에서, 프로모터의 요소는 독립적으로 기능하도록 위치된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인간 CMV 즉시 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 루 육종 바이러스 (RS) 긴 말단 반복, 및 랫트 인슐린 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공되는 벡터는 AAV, MLV, MMTV, SV40, RSV, HIV-1, 및 HIV-2 LTR로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 하나 이상의 조직 특이적 프로모터(예를 들어, 망막 색소 상피 세포 특이적 프로모터)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 RPE65 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 VMD2 프로모터를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 프로모터 이외의 하나 이상의 조절 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인핸서를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 억제자(repressor)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인트론 또는 키메라 인트론을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함한다.

5.2.4 신호 펩티드

특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 단백질 전달을 조절하는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 신호 펩티드를 포함한다. 신호 펩티드는 또한 본원에서 "리더 서열" 또는 "리더 펩티드"로 지칭될 수 있다. 특정 구현예에서, 신호 펩티드는 이식유전자 생성물(예를 들어, 항-VEGF 항원 결합 단편 모이어티)이 세포에서 적절한 패키징(예를 들어, 당화)을 달성하도록 한다. 특정 구현예에서, 신호 펩티드는 이식유전자 생성물(예를 들어, 항-VEGF 항원 결합 단편 모이어티)이 세포에서 적절한 국소화를 달성하도록 한다. 특정 구현예에서, 신호 펩티드는 이식유전자 생성물(예를 들어, 항-VEGF 항원 결합 단편 모이어티)이 세포로부터의 분비를 달성하도록 한다. 본원에 제공된 벡터 및 이식유전자와 관련하여 사용되는 신호 펩티드의 예는 표 1에서 찾을 수 있다.

5.2.5 폴리시스트론 메시지 - IRES 및 F2A 링커

내부 리보솜 유입 부위. 단인 작제물은 절단 가능한 링커 또는 IRES에 의해 분리된 중쇄 및 경쇄 둘 다를 인코딩하여 분리된 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드가 형질도입된 세포에 의해 발현되도록 조작될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 폴리시스트론성(예를 들어, 바이시스트론성) 메시지를 제공한다. 예를 들어, 바이러스 작제물은 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 요소(바이시스트론 벡터를 생성하기 위한 IRES 요소 사용의 예는 예를 들어, 문헌[Gurtu 등, 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm. 229(1):295-8]를 참조하고, 이는 그 전체가 참고로 본원에 포함됨)에 의해 분리된 중쇄 및 경쇄를 인코딩할 수 있다. IRES 요소는 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 번역을 시작한다. AAV에서 IRES의 사용은 예를 들어, 문헌[Furling 등, 2001, Gene Ther 8(11): 854-73]에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특정 구현예에서, 바이시스트론성 메시지는 이의 폴리뉴클레오티드(들)의 크기에 대한 제한이 있는 바이러스 벡터 내에 함유된다. 특정 구현예에서, 바이시스트론성 메시지는 AAV 바이러스 기반 벡터(예를 들어, AAV8 기반 벡터) 내에 함유된다.

퓨린-F2A 링커. 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 바이러스 벡터는 자가 절단 퓨린/F2A(F/F2A) 링커와 같은 절단 가능한 링커에 의해 분리된 중쇄 및 경쇄를 인코딩한다(문헌[Fang 등, 2005, Nature Biotechnology 23: 584-590 , and Fang, 2007, Mol Ther 15: 1153-9], 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).

예를 들어, 퓨린-F2A 링커는 중쇄 및 경쇄 코딩 서열을 분리하기 위해 발현 카세트에 통합될 수 있으며, 그 결과 다음 구조를 갖는 작제물이 생성된다:

리더 - 중쇄 - 퓨린 부위 - F2A 부위 - 리더 - 경쇄 - 폴리A.

아미노산 서열 LLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호: 26)를 갖는 F2A 부위는 자가 처리되어 최종 G 및 P 아미노산 잔기 사이에 "절단"이 발생한다. 사용할 수 있는 추가 링커에는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

● T2A:(GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P (서열번호: 27);

● P2A: (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (서열번호: 28);

● E2A: (GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (서열번호: 29);

● F2A: (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (서열번호: 30).

리보솜이 개방 판독 프레임에서 F2A 서열을 만나면, 펩티드 결합이 생략되어 번역이 종료되거나 다운스트림 서열(경쇄)의 계속된 번역을 야기한다. 이 자가 처리 서열은 중쇄의 C-말단 끝에서 일련의 추가 아미노산을 생성한다. 그러나 이러한 추가 아미노산은 그 다음에 F2A 부위 바로 직전에 그리고 중쇄 서열 후에 위치한 퓨린 부위에서 숙주 세포 퓨린에 의해 절단되고, 카복시펩티다제에 의해 추가로 절단된다. 생성된 중쇄는 C-말단에 포함된 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 추가의 아미노산을 가질 수 있거나, 이는 사용된 퓨린 링커의 서열 및 생체내에서 링커를 절단하는 카복시펩티다제에 따라 이러한 추가의 아미노산을 갖지 않을 수 있다 (예를 들어, 문헌[Fang 등, 17 April 2005, Nature Biotechnol. Advance Online Publication; Fang 등, 2007, Molecular Therapy 15(6):1153-1159; Luke, 2012, Innovations in Biotechnology, Ch 8, 161-186] 참조). 사용될 수 있는 퓨린 링커는 일련의 4가지 염기성 아미노산, 예를 들어 RKRR, RRRR, RRKR 또는 RKKR을 포함한다. 일단 이 링커가 카복시펩티다제에 의해 절단되면, 추가 아미노산이 남아서 추가 0, 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산이 중쇄의 C-말단에 남을 수 있고, 그 아미노산의 예는 R, RR, RK, RKR, RRR, RRK, RKK, RKRR, RRRR, RRKR, 또는 RKKR이다. 특정 구현예에서, 링커 중 하나는 카복시펩티다제에 의해 절단되면, 추가 아미노산이 남아 있지 않다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 작제물에 의해 생산된 항체, 예를 들어, 항원-결합 단편, 집단의 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 또는 20%, 또는 그 미만이지만 0% 초과가 절단 후 중쇄의 C-말단 상에 남아 있는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산을 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 작제물에 의해 생산된 항체, 예를 들어, 항원-결합 단편, 집단의 0.5-1%, 0.5%-2%, 0.5%-3%, 0.5%-4%, 0.5%-5%, 0.5%-10%, 0.5%-20%, 1%-2%, 1%-3%, 1%-4%, 1%-5%, 1%-10%, 1%-20%, 2%-3%, 2%-4%, 2%-5%, 2%-10%, 2%-20%, 3%-4%, 3%-5%, 3%-10%, 3%-20%, 4%-5%, 4%-10%, 4%-20%, 5%-10%, 5%-20%, 또는 10%-20%가 절단 후 중쇄의 C-말단 상에 남아 있는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산을 갖는다. 특정 구현예에서, 퓨린 링커는 서열 R-X-K/R-R를 가져서, 중쇄의 C-말단 상의 추가 아미노산은 R, RX, RXK, RXR, RXKR, 또는 RXRR이고, X는 임의의 아미노산, 예를 들어, 알라닌(A)이다. 특정 구현예에서, 추가 아미노산은 중쇄의 C-말단에 남아 있을 수 없다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 발현 카세트는 이의 폴리뉴클레오티드(들)의 크기에 대한 제한이 있는 바이러스 벡터 내에 함유된다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 AAV 바이러스 기반 벡터(예를 들어, AAV8 기반 벡터) 내에 함유된다.

5.2.6 미번역된 영역

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 미번역 영역(UTR), 예를 들어 3' 및/또는 5' UTR을 포함한다. 특정 구현예에서, UTR은 단백질 발현의 원하는 수준을 위해 최적화된다. 특정 구현예에서, UTR은 이식유전자의 mRNA 반감기에 대해 최적화된다. 특정 구현예에서, UTR은 이식유전자의 mRNA의 안정성을 위해 최적화된다. 특정 구현예에서, UTR은 이식유전자의 mRNA의 2차 구조를 위해 최적화된다.

5.2.7 역전된 말단 반복부

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 역전된 말단 반복부(ITR) 서열을 포함한다. ITR 서열은 바이러스 벡터의 비리온 내로 재조합 유전자 발현 카세트를 패키징하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, ITR는 AAV, 예를 들어, AAV8 또는 AAV2 로부터의 것이다 (참고, 예를 들어, Yan 등, 2005, J. Virol., 79(1):364-379; 미국 특허 번호 7,282,199 B2, 미국 특허 번호 7,790,449 B2, 미국 특허 번호 8,318,480 B2, 미국 특허 번호 8,962,332 B2 및 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2014/076466, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).

5.2.8 이식유전자

이식유전자에 의해 인코딩되는 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, HuGlyFabVEGFi는 VEGF에 결합하는 항체의 항원 결합 단편, 예컨대 베바시주맙; 항-VEGF Fab 모이어티 예컨대 라니비주맙; 또는 Fab 도메인 상에 추가의 당화 부위를 함유하도록 조작된 이러한 베바시주맙 또는 라니비주맙 Fab 모이어티를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 문헌[Courtois 등, 2016, mAbs 8: 99-112] 참조, 이는 전장 항체의 Fab 도메인 상에서 과당화된 베바시주맙의 유도체의 설명에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 망막 세포에서의 발현을 위한 적절한 발현 조절 요소에 의해 제어된다: 특정 구현에에서, 항-VEGF 항원-결합 단편 이식유전자는 경쇄 및 중쇄 cDNA 서열(각각의 서열번호: 10 및 11)의 베바시주맙 Fab 부분을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원-결합 단편 이식유전자는 라니비주맙 경쇄 및 중쇄 cDNA 서열 (각각의 서열번호: 12 및 13)을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원-결합 단편 이식유전자는 각각 서열번호: 3 및 4의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 베바시주맙 Fab를 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 3에 개시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 4에 개시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 3에 개시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 4에 개시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원-결합 단편 이식유전자는 각각 서열번호: 1 및 2의 경쇄 및 중쇄를 포함하는, 과당화된 라니비주맙을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 1에 개시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 2에 개시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 1에 개시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 2에 개시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩한다.

특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 다음의 돌연변이 중 하나 이상을 가진 서열번호: 3 및 4의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 과당화된 베바시주맙 Fab를 인코딩한다: L118N (중쇄), E195N (경쇄), 또는 Q160N 또는 Q160S (경쇄). 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 다음의 돌연변이 중 하나 이상을 가진 서열번호: 1 및 2의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 과당화된 라니비주맙을 인코딩한다: L118N (중쇄), E195N (경쇄), 또는 Q160N 또는 Q160S (경쇄). 항원 결합 단편 이식유전자 cDNA의 서열은 예를 들어 표 2에서 찾을 수 있다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편 이식유전자 cDNA의 서열은 표 1에 열거된 하나 이상의 신호 서열로 서열번호: 10 및 11 또는 서열번호: 12 및 13의 신호 서열을 치환함으로써 수득된다.

특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 항원 결합 단편을 인코딩하고 6개의 베바시주맙 CDR의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 항원 결합 단편을 인코딩하고 6개의 라니비주맙 CDR의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 라니비주맙(서열번호: 20, 18, 및 21)의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원-결합 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 라니비주맙(서열번호: 14-16)의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원-결합 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 베바시주맙(서열번호: 17-19)의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원-결합 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 베바시주맙(서열번호: 14-16)의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원-결합 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 라니비주맙(서열번호: 20, 18, 및 21)의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 라니비주맙(서열번호: 14-16)의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 베바시주맙(서열번호: 17-19)의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 베바시주맙(서열번호: 14-16)의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩한다.

특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩하되, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)은 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩하되, 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩하되, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩하되, 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 두번째 Q)는 아세틸화되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩하되, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)은 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩하고 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩하되, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩하되, 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩하되, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 제2 Q)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩하되, 여기서: (1) 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않고; (2) 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 제2 Q)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항원 결합 단편 이식유전자는 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 인코딩하되, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 제2 Q)는 아세틸화되지 않고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호 20의 중쇄 CDR1을 포함하되, 여기서: (1) 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않고; (2) 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 제2 Q)는 아세틸화되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

특정 양태에서, 본원은 또한 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 항원-VEGF 항원 결합 단편 및 이러한 항원-VEGF 항원 결합 단편을 인코딩하는 이식유전자를 제공하되, 여기서 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF(서열번호: 16)의 제2 Q)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하되, 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 제2 Q)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 제2 Q)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 제2 Q)는 아세틸화되지 않는다. 본원에 제공된 항-VEGF 항원 결합 단편 및 이식유전자는 본원에 기재된 본 발명에 따른 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

특정 양태에서, 본원은 또한 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편, 및 이러한 항원-VEGF 항원 결합 단편을 인코딩하는 이식유전자를 제공하되, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않는다. 본원에 제공된 항-VEGF 항원 결합 단편 및 이식유전자는 본원에 기재된 본 발명에 따른 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

특정 양태에서, 본원은 또한 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하는 항-VEGF 항원 결합 단편, 및 이러한 항원-VEGF 항원 결합 단편을 인코딩하는 이식유전자를 제공하되, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 제2 Q)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하되, 여기서: (1) 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않고; (2) 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 제2 Q)는 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 제2 Q)는 아세틸화되지 않는다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 서열번호: 14-16의 경쇄 CDR 1-3 및 서열번호: 20, 18, 및 21의 중쇄 CDR 1-3을 포함하되, 여기서: (1) 중쇄 CDR1의 제9 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 M)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR2의 제3 아미노산 잔기 (즉, WINTYTGEPTYAADFKR (서열번호 18)에서의 N)는 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 중쇄 CDR1의 마지막 아미노산 잔기 (즉, GYDFTHYGMN (서열번호 20)에서의 N)는 아세틸화되지 않고; (2) 경쇄 CDR1의 제8 및 제11 아미노산 잔기 (즉, SASQDISNYLN (서열번호 14)에서의 2개의 N) 각각은 산화, 아세틸화, 탈아미드화, 및 파이로글루타민화 (파이로 Glu) 중 하나 이상의 화학적 변형을 보유하고, 경쇄 CDR3의 제2 아미노산 잔기 (즉, QQYSTVPWTF (서열번호 16)에서의 제2 Q)는 아세틸화되지 않는다. 본원에 제공된 항-VEGF 항원 결합 단편 및 이식유전자는 본원에 기재된 본 발명에 따른 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화학적 변형(들) 또는 화학적 변형(들)의 결여(경우에 따라)는 질량 분광분석에 의해 결정된다.

5.2.9 작제물

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하기 요소를 다음 순서로 포함한다: a) 구성적 또는 저산소증 유도성 프로모터 서열, 및 b) 이식유전자(예를 들어, 항-VEGF 항원 결합 단편 모이어티)를 인코딩하는 서열. 특정 구현예에서, 이식유전자를 인코딩하는 서열은 IRES 요소에 의해 분리된 다중 ORF를 포함한다. 특정 구현예에서, ORF는 항-VEGF 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 도메인을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 이식유전자를 인코딩하는 서열은 F/F2A 서열에 의해 분리된 하나의 ORF에 다중 서브유닛을 포함한다. 특정 구현예에서, 이식유전자를 포함하는 서열은 F/F2A 서열에 의해 분리된 항-VEGF 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 도메인을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 다음 순서로 하기 요소: a) 구성적 또는 저산소증 유도성 프로모터 서열, 및 b) 이식유전자(예를 들어, 항-VEGF 항원 결합 단편 모이어티)를 인코딩하는 서열을 포함하되, 이식유전자는 VEGF의 신호 펩티드(서열번호: 5)를 포함하고, 이식유전자는 IRES 요소에 의해 분리된 경쇄 및 중쇄 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 다음 순서로 하기 요소: a) 구성적 또는 저산소증 유도성 프로모터 서열, 및 b) 이식유전자(예를 들어, 항-VEGF 항원 결합 단편 모이어티)를 인코딩하는 서열을 포함하되, 이식유전자는 VEGF의 신호 펩티드(서열번호: 5)를 포함하고, 이식유전자는 절단 가능한 F/F2A 서열에 의해 분리된 경쇄 및 중쇄 서열을 인코딩한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하기 요소를 다음 순서로 포함한다: a) 제1 ITR 서열, b) 제1 링커 서열, c) 구성적 또는 저산소증-유도성 프로모터 서열, d) 제2 링커 서열, e) 인트론 서열, f) 제3 링커 서열, g) 제1 UTR 서열, h) 이식유전자 (예를 들어, 항-VEGF 항원 결합 단편 모이어티)를 인코딩하는 서열, i) 제2 UTR 서열, j) 제4 링커 서열, k) 폴리 A 서열, l) 제5 링커 서열, 및 m) 제2 ITR 서열.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 다음 순서로 하기 요소: a) 제1 ITR 서열, b) 제1 링커 서열, c) 구성적 또는 저산소증-유도성 프로모터 서열, d) 제2 링커 서열, e) 인트론 서열, f) 제3 링커 서열, g) 제1 UTR 서열, h) 이식유전자 (예를 들어, 항-VEGF 항원 결합 단편 모이어티)를 인코딩하는 서열, i) 제2 UTR 서열, j) 제4 링커 서열, k) 폴리 A 서열, l) 제5 링커 서열, 및 m) 제2 ITR 서열을 포함하되, 여기서 이식유전자는 VEGF의 신호 펩티드(서열번호: 5)를 포함하고, 이식유전자는 절단 가능한 F/F2A 서열에 의해 분리된 경쇄 및 중쇄 서열을 인코딩한다

특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 작제물 I이고, 여기서 작제물 I은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접하는 AAV8 역전된 말단 반복부; (2) a) CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 CB7 프로모터, b) 닭 β-액틴 인트론 및 c) 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호를 포함하는 조절 요소; 및 (3) 동일한 양의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 보장하는 자가-절단 퓨린(F)/F2A 링커에 의해 분리된 항-VEGF 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열.

또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 작제물 II이고, 여기서 작제물 II은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접하는 AAV2 역전된 말단 반복부; (2) a) CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 CB7 프로모터, b) 닭 β-액틴 인트론 및 c) 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호를 포함하는 조절 요소; 및 (3) 동일한 양의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 보장하는 자가-절단 퓨린(F)/F2A 링커에 의해 분리된 항-VEGF 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열.

5.2.10 벡터의 제조 및 테스트

본원에 제공되는 바이러스 벡터는 숙주 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 제공되는 바이러스 벡터는 포유동물 숙주 세포, 예를 들어, A549 , WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, 293, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, 일차 섬유아세포, 간세포, 및 근아세포를 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 제공되는 바이러스 벡터는 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼 또는 햄스터의 숙주 세포를 사용하여 제조할 수 있다.

숙주 세포는 이식유전자를 인코딩하는 서열 및 연관된 요소 (즉, 벡터 게놈), 및 숙주 세포에서 바이러스를 생산하는 수단, 예를 들어 복제 및 캡시드 유전자 (예를 들어, AAV의 rep 및 cap 유전자)로 안정하게 형질전환된다. AAV8 캡시드를 갖는 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법에 대해서는, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제7,282,199 B2호의 상세한 설명의 섹션 IV를 참조한다. 상기 벡터의 게놈 카피 역가는 예를 들어 TAQMAN^® 분석에 의해 결정될 수 있다. 비리온은 예를 들어 CsCl₂ 침강에 의해 회수될 수 있다.

시험관내 검정, 예를 들어 세포 배양 검정을 본원에 기재된 벡터로부터의 이식유전자 발현을 측정하여, 예를 들어 벡터의 역가를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 배아 망막 세포로부터 유래된 세포주인 PER.C6^® 세포주 (Lonza), 또는 망막 색소 상피 세포, 예를 들어 망막 색소 표피 세포주 hTERT RPE-1 (ATCC^®로부터 입수가능함)이 이식유전자 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일단 발현되면, 발현된 생성물(즉, HuGlyFabVEGFi)의 특징이 결정될 수 있으며, HuGlyFabVEGFi와 연관된 당화 및 티로신 황산화 패턴의 결정을 포함한다. 당화 패턴 및 이를 결정하는 방법은 섹션 5.1.1에서 논의되지만, 티로신 황산화 패턴 및 이를 결정하는 방법은 섹션 5.1.2에서 논의된다. 또한, 세포-발현된 HuGlyFabVEGFi의 당화/황산화로 인한 이점은 당업계에 공지된 검정, 예를 들어 섹션 5.1.1 및 5.1.2에 기재된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.

5.2.11 조성물

본원에 기재된 이식유전자를 인코딩하는 벡터 및 적합한 담체를 포함하는 조성물이 기재되어 있다. 적합한 담체(예를 들어, 맥락막상, 망막하, 공막옆, 유리체내, 결막하 및/또는 망막내 투여용)는 당업자에 의해 용이하게 선택될 것이다.

특정 구현예에서, 유전자 요법 작제물은 제형 완충액 중 AAV 벡터 활성 성분의 냉동 멸균, 단일 사용 용액으로서 공급된다. 특정 구현예에서, 망막하 투여에 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 적합한 수성 완충제, 계면활성제 및 임의의 부형제를 포함하는 제형 완충제 중 재조합 (예를 들어, rHuGlyFabVEGFi) 벡터의 현탁액을 포함한다. 특정 구현예에서, 유전자 요법 작제물은 둘베코의 인산염 완충 염수 및 0.001% 플루노닉 F68, pH = 7.4에서 제형화된다.

5.3 유전자 요법

안구 질환, 특히 증가된 신생혈관형성에 의해 유발된 안구 질환을 갖는 인간 대상체에 이식유전자 작제물의 치료적 유효량을 투여하는 방법이 기재되어 있다. 보다 구체적으로, 특히, 맥락막상, 망막하, 공막옆, 유리체내, 결막하, 및/또는 망막내 투여(예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법을 통한 망막하 주사 (외과적 절차), 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여, 또는 후측 공막옆 데포 절차에 의함)를 위한 당뇨병성 망막병증 (DR)이 있는 환자에게 치료적 유효량의 이식유전자 작제물을 투여하는 방법이 기재되어 있다.

이식유전자 작제물의 치료적 유효량을 당뇨병성 망막병증으로 진단된 환자의 맥락막상, 망막하, 공막옆, 유리체내, 결막하, 및/또는 망막내 투여하기 위한 방법이 기재되어 있다 (예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법을 통한 망막하 주사 (외과적 절차), 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여에 의함).

이식유전자 작제물의 치료적 유효량의 맥락막상, 망막하, 공막옆, 유리체내, 결막하, 및/또는 망막내 투여 (예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법을 통한 망막하 주사 (외과적 절차), 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여, 또는 후측 공막옆 데포 절차에 의함)를 위한 방법 및 이식유전자 작제물의 치료적 유효량의 망막 색소 상피에 투여하는 방법이 또한 본원에 제공된다.

5.3.1 환자 집단의 표적화

본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 임의의 포유동물 예컨대 설치류, 가축 예컨대 개 또는 고양이, 또는 영장류, 예를 들어 비-인간 영장류일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 안구 질환, 특히 증가된 신생혈관형성에 의해 유발된 안구 질환으로 진단된 환자에게 투여하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 당뇨병성 망막병증(DR)으로 진단된 환자에게 투여하기 위한 것이다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 중증 당뇨병성 망막병증으로 진단된 환자에게 투여하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 약화된 당뇨병성 망막병증으로 진단된 환자에게 투여하기 위한 것이다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 중등도-중증 NPDR로 진단된 환자에게 투여하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 중증 NPDR로 진단된 환자에게 투여하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 경증 PDR로 진단된 환자에게 투여하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 중등도 PDR로 진단된 환자에게 투여하기 위한 것이다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 ETDRS-DRSS 수준이 47, 53, 61 또는 65인 환자에게 투여하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 ETDRS-DRSS 수준이 수준 47인 환자에게 투여하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 ETDRS-DRSS 수준이 수준 53인 환자에게 투여하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 ETDRS-DRSS 수준이 수준 61인 환자에게 투여하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 ETDRS-DRSS 수준이 수준 65인 환자에게 투여하기 위한 것이다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 여성이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 남성이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 임의의 연령일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 18세 이상이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 18 내지 89세이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 1형 진성 당뇨병에 이차적인 DR이 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 2형 진성 당뇨병에 이차적인 DR이 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 1형 또는 2형 진성 당뇨병에 이차적인 DR이 있는 18세 이상이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 1형 또는 2형 진성 당뇨병에 이차적인 DR이 있는 18 내지 89세이다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 가임 가능성이 없는 여성이다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 수정체(phakic)이다. 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 위수정체이다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 헤모글로빈 A1c ≤ 10%를 갖는다(실험실 평가에 의해 확인됨).

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 > 69 ETDRS 글자(대략 스넬렌(Snellen) 등가 20/40 또는 보다 양호함)의 치료될 눈의 최적 교정 시력(BCVA)을 갖는다.

(2) 대상체의 ETDRS-DRSS가 수준 47, 53, 61 또는 65인 경우, 인간 대상체의 눈의 망막하 공간 또는 맥락막상 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계.

(2) 대상체의 ETDRS-DRSS가 수준 47인 경우, 인간 대상체의 눈의 망막하 공간 또는 맥락막상 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계.

특정 구현예에서, 당뇨병성 망막병증이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 대상체는 중증 NPDR이 있는 적어도 하나의 눈을 갖고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(2) 대상체의 ETDRS-DRSS가 수준 53인 경우, 인간 대상체의 눈의 망막하 공간 또는 맥락막상 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계.

(2) 대상체의 ETDRS-DRSS가 수준 61인 경우, 인간 대상체의 눈의 망막하 공간 또는 맥락막상 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계.

특정 구현예에서, 당뇨병성 망막병증이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 대상체는 중등 PDR이 있는 적어도 하나의 눈을 갖고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(2) 대상체의 ETDRS-DRSS가 수준 65인 경우, 인간 대상체의 눈의 망막하 공간 또는 맥락막상 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계.

ETDRS-DR 중증도 척도 (DRSS) 수준은 표준 4-전계 디지털 입체적 안저 사진 또는 등가물을 사용하여 결정되고; 이들은 또한 문헌[Li 등, 2010, Retina Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010;51:3184-3192]에 따라 모노스코픽(monoscopic) 또는 입체 사진술, 또는 유사한 방법에 의해 측정될 수 있다.

5.3.2 복용량 및 투여 방식

재조합 벡터의 치료적 유효량은 ≥ 0.1 mL 내지 ≤ 0.5 mL, 바람직하게는 0.1 내지 0.30 mL (100 - 300 μl) 범위의 부피로, 가장 바람직하게는, 0.25 mL (250 μl)의 부피로 망막하 및/또는 망막내(예를 들어, 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 또는 맥락막상 공간을 통함)로 투여되어야 한다. 재조합 벡터의 치료적 유효량은 100 μl 이하의 부피, 예를 들어 50-100μl의 부피로 맥락막상(예를 들어, 맥락막상 주사에 의해) 투여되어야 한다. 재조합 벡터의 치료적 유효량은 500 μl 이하의 부피, 예를 들어, 500 μl 이하의 부피로, 예를 들어, 10-20 μl, 20-50 μl, 50-100 μl, 100-200 μl, 200-300 μl, 300-400 μl, 또는 400-500 μl의 부피로 공막의 외부 표면에 투여되어야 한다. 재조합 벡터의 치료적 유효량은 500 μl 이하의 부피, 예를 들어, 10-20 μl, 20-50 μl, 50-100 μl, 100-200 μl, 200-300 μl, 300-400 μl, 또는 400-500 μl의 부피의 2회 이상 주사로 공막의 외부 표면에 투여될 수 있다. 동일한 방문 동안 2회 이상의 주사를 투여할 수 있다.

특정 구현예에서, 재조합 벡터는 맥락막상으로 (예를 들어, 맥락막상 주사에 의해) 투여된다. 특정 구현예에서, 맥락막상 투여(예를 들어, 맥락막상 공간 내로의 주사)는 맥락막상 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다. 맥락막상 약물 전달 장치는 눈의 맥락막상 공간에 약물을 투여하는 것을 수반하는 맥락막상 투여 절차에 종종 사용된다(예를 들어, 문헌[Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23; Goldstein, 2014, Retina Today 9(5): 82-87; Baldassarre 등, 2017] 참조; 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 본원에 기재된 본 발명에 따른 망막하 공간에 발현 벡터를 침착시키기 위해 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 Clearside^® Biomedical, Inc.에 의해 제조된 맥락막상 약물 전달 장치(예를 들어, [Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23] 참조) 및 MedOne 맥락막상 카테터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

특정 구현예에서, 맥락막상 약물 전달 장치는 1 밀리미터 30 게이지 바늘을 갖는 주사기이다(도 5 참조). 이 장치를 사용하여 주사하는 동안, 바늘은 공막의 기저부를 관통하고 약물을 함유하는 유체가 맥락막상 공간으로 들어가 맥락막상 공간이 확장된다. 결과적으로, 주사하는 동안 촉각 및 시각적 피드백이 있다. 주사 후, 유체는 후방으로 흐르고 맥락막과 망막에서 주로 흡수된다. 그 결과 모든 망막 세포층과 맥락막 세포에서 이식유전자 단백질이 생성된다. 이러한 유형의 장치 및 절차를 사용하면 합병증의 위험이 낮은 인오피스 절차를 빠르고 쉽게 수행할 수 있다. 맥락막상 공간에 최대 100 μl의 부피를 주사할 수 있다.

특정 구현예에서, 재조합 벡터는 망막하 약물 전달 장치를 사용하여 맥락막상 공간을 통해 망막하 투여된다. 특정 구현예에서, 망막하 약물 전달 장치는 망막하 공간으로 약물을 전달하기 위해 외과적 절차 동안 안구 뒤쪽 주위로 맥락막상 공간을 통해 삽입되고 터널링되는 카테터이다(도 6 참조). 이러한 절차는 유리체가 온전하게 유지될 수 있게 하고, 따라서, 합병증 위험 (유전자 요법 배출의 더 적은 위험, 및 망막 박리 및 황반 구멍과 같은 합병증)이 거의 없고, 유리체절제술 없이, 생성된 수포는 더 확산적으로 분산되어, 망막의 더 많은 표면적이 더 작은 부피로 형질도입되도록 할 수 있다. 이 절차에 따른 백내장 유발 위험이 최소화되어 젊은 환자에게 바람직하다. 또한, 이 절차는 표준 경유리체 접근법보다 더 안전하게 중심와 아래 수포를 전달할 수 있으며, 이는 형질도입 대상 세포는 황반에 있는 중심 시력에 영향을 미치는 유전성 망막 질환 환자에게 바람직하다. 이 절차는 또한 다른 전달 경로(예컨대 맥락막상 및 유리체내)에 영향을 미칠 수 있는 전신 순환에 존재하는 AAV에 대한 중화 항체(Nabs)가 있는 환자에게 유리하다. 또한, 이 방법은 표준 경유리체 접근법보다 망막 절개부위 밖으로 덜 나가는 수포를 생성하는 것으로 나타났다. 본래 Janssen Pharmaceuticals, Inc.에 의해 제조되고 현재는 Orbit Biomedical Inc.에 의해 제조되는 망막하 약물 전달 장치(예를 들어, 문헌[Subretinal Delivery of Cells via the Suprachoroidal Space: Janssen Trial. In: Schwartz 등 (eds) Cellular Therapies for Retinal Disease, Springer, Cham; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/040635 A1] 참조)이 이러한 목적으로 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 재조합 벡터는 공막의 외부 표면에 투여된다(예를 들어, 팁이 공막 표면에 대해 직접 병치로 삽입되고 유지될 수 있는 캐뉼러를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치의 사용에 의함). 특정 구현예에서, 공막의 외부 표면에 대한 투여는 후측 공막 데포 절차를 사용하여 수행되고, 이는 안구를 구멍내지 않으면서 약물이 뭉툭한 팁의 곡선형 캐뉼라 내로 끌어당겨진 다음, 공막의 외부 표면과 직접 접촉하여 전달되는 것을 수반한다. 특히, 노출된 공막에 대한 작은 절개의 생성 후, 캐뉼러 팁이 삽입된다(도 7a 참조). 캐뉼러 샤프트의 곡선형 부분이 삽입되고, 캐뉼러 팁을 공막 표면에 직접 병치되도록 유지한다(도 7b-7d 참조). 캐뉼러를 완전히 삽입한 후(도 7d), 약물이 천천히 주사되는 한편, 약한 압력이 멸균 면봉을 이용하여 캐뉼러 샤프트의 상단과 측면을 따라 유지된다. 이 전달 방법은 안구 내 감염 및 망막 박리의 위험, 눈 내로 직접 치료제를 주사하는 것과 일반적으로 관련된 부작용을 피한다.

유리체액에서 적어도 0.330 μg/mL, 또는 방수 (눈의 전방)에서 0.110 μg/mL의 Cmin에서 이식유전자 생성물의 농도를 3개월동안 유지하는 용량이 요구되며; 그 후, 1.70 내지 6.60 μg /mL 범위의 이식유전자 생성물의 유리체 Cmin 농도, 및/또는 0.567 내지 2.20 μg/mL 범위의 방수 Cmin 농도가 유지되어야 한다. 그러나, 이식유전자 생성물이 (구성적 프로모터의 제어 하에 또는 저산소증 유도성 프로모터를 사용하는 경우 저산소 조건에 의해 유도되어) 연속적으로 생산되기 때문에, 더 낮은 농도의 유지가 효과적일 수 있다. 유리체액 농도는 유리체액 또는 전방으로부터 수집된 유체의 환자 샘플에서 직접 측정될 수 있거나, 또는 이식유전자 생성물의 혈청 농도를 측정함으로써 추정 및/또는 모니터링될 수 있다 - 이식유전자 생성물에 대한 전신 노출 대 유리체 노출의 비는 약 1:90,000이다. (예를 들어, 문헌[Xu L, 등, 2013, Invest. Opthal. Vis. Sci. 54: 1616-1624, at p. 1621 and Table 5 at p. 1623]에 보고된 라니비주맙의 유리체액 및 혈청 농도, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).

특정 구현예에서, 눈 투여를 위해 본원에 기재된 임의의 투영 경로에 사용될 수 있는 Altaviz에 의해 제조된 미세 부피 주입기 전달 시스템이 본원에 기재되어 있다(도 7a 및 7b 참조)(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/177215, 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906 참조). 미세 부피 주입기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호 및 미국 특허 출원 공개 제2019/0167906호에 설명된 바와 같이 높은 힘 전달 및 개선된 정밀도를 제공하는 가스 구동 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 미세 부피 주입기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 유압 드라이브, 및 가스 동력 모듈 및 차례로 유체 전달을 제어하기 위한 저하중 활성화 레버를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 미세 부피 주입기 전달 시스템은 미세 부피 주입기에 사용될 수 있고 용량 안내가 있는 미세 부피 주입기이고, 예를 들어 맥락막상 바늘(예를 들어, Clearside^® 바늘), 망막하 바늘, 유리체내 바늘, 공막옆 바늘, 결막하 바늘, 및/또는 망막내 바늘과 함께 사용될 수 있다. 미세 부피 주입기 사용의 이점은 다음과 같다: (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀 주입 유량 제어 및 용량 안내를 갖기 때문), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 수술; (c) 10 μL 증분 복용량을 갖는 공압 구동; (d) 유리체절제 기계로부터의 절개; (e) 400 μL 주사기 용량; (f) 디지털 유도 전달; (g) 디지털 기록 전달; 및 (h) 진단 팁 (예를 들어, MedOne 38g 바늘 및 Dorc 41g 바늘이 망막하 전달을 위해 사용될 수 있는 반면, Clearside^® 바늘 및 Visionisti OY 어댑터가 망막하 전달에 사용될 수 있음).

본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 맥락막상으로 (예를 들어, 맥락막상 주사에 의해) 투여된다. 특정 구현예에서, 맥락막상 투여(예를 들어, 맥락막상 공간으로의 주사)는 맥락막상 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다. 맥락막상 약물 전달 장치는 눈의 맥락막상 공간에 약물을 투여하는 것을 수반하는 맥락막상 투여 절차에 종종 사용된다(예를 들어, 문헌[Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23; Goldstein, 2014, Retina Today 9(5): 82-87; Baldassarre 등, 2017] 참조; 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 본원에 기재된 본 발명에 따른 맥락막상 공간에 재조합 벡터를 침착시키기 위해 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 Clearside® Biomedical, Inc.에 의해 제조된 맥락막상 약물 전달 장치(예를 들어, [Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23] 참조) 및 MedOne 맥락막상 카테터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 눈 투여를 위해 본명세서에 기재된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는 Altaviz에 의해 제조된 미세 부피 주입기 전달 시스템을 포함한다 (참고 도 7a 및 7b) (예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/177215, 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906 참조). 미세 부피 주입기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호 및 미국 특허 출원 공개 제2019/0167906호에 설명된 바와 같이 높은 힘 전달 및 개선된 정밀도를 제공하는 가스 구동 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 미세 부피 주입기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 유압 드라이브, 및 가스 동력 모듈 및 차례로 유체 전달을 제어하기 위한 저하중 활성화 레버를 포함할 수 있다. 미세 부피 주입기는 용량 안내 기능이 있는 미세 부피 주입기이며 예를 들어 맥락막상 바늘(예를 들어, Clearside^® 바늘) 또는 망막하 바늘과 함께 사용할 수 있다. 미세 부피 주입기 사용의 이점은 다음과 같다: (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀 주입 유량 제어 및 용량 안내를 갖기 때문), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 수술; (c) 10 μL 증분 복용량을 갖는 공압 구동; (d) 유리체절제 기계로부터의 절개; (e) 400 μL 주사기 용량; (f) 디지털 유도 전달; (g) 디지털 기록 전달; 및 (h) 진단 팁 (예를 들어, MedOne 38g 바늘 및 Dorc 41g 바늘이 망막하 전달을 위해 사용될 수 있는 반면, Clearside^® 바늘 및 Visionisti OY 어댑터가 맥락막상 전달에 사용될 수 있음). 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 Visionisti OY 에 의해 제조된 어댑터 (및 바람직하게는 또한 바늘 가이드)를 갖는 정상 길이의 피하주사 바늘을 포함하는 도구이고, 어댑터는 어댑터로부터 노출되는 바늘 팁의 길이를 제어함으로써 정상 길이의 경구주사 바늘로 바뀐다 (도 8 참조) (예를 들어, 미국 디자인 특허 번호 D878,575; 및 국제 특허 출원. 공개 번호 WO/2016/083669 참조). 특정 구현예에서, 맥락막상 약물 전달 장치는 1 밀리미터 30 게이지 바늘이 있는 주사기이다 (도 1 참조). 이 장치를 사용하여 주사하는 동안, 바늘이 공막의 기저부를 관통하고 약물을 함유하는 유체가 맥락막상 공간으로 들어가 맥락막상 공간이 확장된다. 결과적으로 주사하는 동안 촉각 및 시각적 피드백이 있다. 주사 후, 유체는 후방으로 흐르고 맥락막과 망막에서 주로 흡수된다. 그 결과 모든 망막 세포층과 맥락막 세포에서 치료 생성물이 생성된다. 이러한 유형의 장치 및 절차를 사용하면 합병증의 위험이 낮은 인오피스 절차를 빠르고 쉽게 수행할 수 있다. 맥락막상 공간에 최대 100 μl의 부피를 주사할 수 있다.

특정 구현예에서, 유리체내 투여는 안구 투여를 위해 본원에 설명된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는, Altaviz에 의해 제조된 미세 부피 주입기 전달 시스템을 포함하는 유리체내 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다(도 7a 및 7b 참조)(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO 2013/177215호, 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호, 및 미국 특허 출원 공개 제2019/0167906호 참조). 미세 부피 주입기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호 및 미국 특허 출원 공개 제2019/0167906호에 설명된 바와 같이 높은 힘 전달 및 개선된 정밀도를 제공하는 가스 구동 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 미세 부피 주입기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 유압 드라이브, 및 가스 동력 모듈 및 차례로 유체 전달을 제어하기 위한 저하중 활성화 레버를 포함할 수 있다. 미세 부피 주입기는 용량 안내가 있는 미세 부피 주입기이며 예를 들어 유리체내 바늘과 함께 사용할 수 있다. 미세 부피 주입기 사용의 이점은 다음과 같다: (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀 주입 유량 제어 및 용량 안내를 갖기 때문), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 수술; (c) 10 μL 증분 복용량을 갖는 공압 구동; (d) 유리체절제 기계로부터의 절개; (e) 400 μL 주사기 용량; (f) 디지털 유도 전달; (g) 디지털 기록 전달; 및 (h) 진단 팁. 특정 구현예에서, 망막하 투여는 안구 투여를 위해 본원에 설명된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는, Altaviz에 의해 제조된 미세 부피 주입기 전달 시스템을 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다(도 7a 및 7b 참조)(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO 2013/177215호, 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호, 및 미국 특허 출원 공개 제2019/0167906호 참조). 미세 부피 주입기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호 및 미국 특허 출원 공개 제2019/0167906호에 설명된 바와 같이 높은 힘 전달 및 개선된 정밀도를 제공하는 가스 구동 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 미세 부피 주입기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 유압 드라이브, 및 가스 동력 모듈 및 차례로 유체 전달을 제어하기 위한 저하중 활성화 레버를 포함할 수 있다. 미세 부피 주입기는 용량 안내 기능이 있는 미세 부피 주입기이며 예를 들어 망막하 바늘과 함께 사용할 수 있다. 미세 부피 주입기 사용의 이점은 다음과 같다: (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀 주입 유량 제어 및 용량 안내를 갖기 때문), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 수술; (c) 10 μL 증분 복용량을 갖는 공압 구동; (d) 유리체절제 기계로부터의 절개; (e) 400 μL 주사기 용량; (f) 디지털 유도 전달; (g) 디지털 기록 전달; 및 (h) 진단 팁 (예를 들어, MedOne 38g 바늘 및 Dorc 41g 바늘이 망막하 전달을 위해 사용될 수 있는 반면, Clearside^® 바늘 및 Visionisti OY 어댑터가 맥락막상 전달에 사용될 수 있음).

특정 구현예에서, 재조합 벡터는 공막의 외부 표면에 투여된다(예를 들어, 캐뉼러를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치의 사용에 의해, 팁은 공막 표면에 직접 인접하여 삽입되고 유지될 수 있음). 특정 구현예에서, 공막의 외부 표면에 대한 투여가 후측 공막 데포 절차를 사용하여 수행되고, 이는 안구를 구멍을 내지 않으면서 약물이 뭉툭한 팁의 곡선형 캐뉼라 내로 끌어당겨진 다음, 공막의 외부 표면과 직접 접촉하여 전달되는 것을 수반한다. 특히, 노출된 공막에 대한 작은 절개의 생성 후, 캐뉼러 팁이 삽입된다(도 7a 참조). 캐뉼러 샤프트의 곡선형 부분이 삽입되어 캐뉼러 팁이 공막 표면에 직접 배치되도록 유지한다(도 7b-7d 참조). 캐뉼러를 완전히 삽입한 후(도 7d), 약물이 천천히 주사되는 한편, 약한 압력이 멸균 면봉을 이용하여 캐뉼러 샤프트의 상단과 측면을 따라 유지된다. 이 전달 방법은 안구 내 감염 및 망막 박리의 위험, 눈 내로 직접 치료제를 주사하는 것과 일반적으로 관련된 부작용을 피한다. 특정 구현예에서, 공막옆 투여는 안구 투여를 위해 본원에 설명된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는, Altaviz에 의해 제조된 미세 부피 주입기 전달 시스템을 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다(도 7a 및 7b 참조)(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO 2013/177215호, 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호, 및 미국 특허 출원 공개 제2019/0167906호 참조). 미세 부피 주입기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 제2019/0175825호 및 미국 특허 출원 공개 제2019/0167906호에 설명된 바와 같이 높은 힘 전달 및 개선된 정밀도를 제공하는 가스 구동 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 미세 부피 주입기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 유압 드라이브, 및 가스 동력 모듈 및 차례로 유체 전달을 제어하기 위한 저하중 활성화 레버를 포함할 수 있다. 미세 부피 주입기는 용량 안내 기능이 있는 미세 부피 주입기이며 예를 들어 공막옆 바늘과 함께 사용할 수 있다. 미세 부피 주입기 사용의 이점은 다음과 같다: (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀 주입 유량 제어 및 용량 안내를 갖기 때문), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 수술; (c) 10 μL 증분 복용량을 갖는 공압 구동; (d) 유리체절제 기계로부터의 절개; (e) 400 μL 주사기 용량; (f) 디지털 유도 전달; (g) 디지털 기록 전달; 및 (h) 진단 팁.

특정 구현예에서, 투여량은 환자의 눈에 투여된 (예를 들어, 투여된 맥락막상로, 망막하로, 유리체내로, 공막옆로, 결막하로, 및/또는 망막내로 (예를 들어, 맥락막상 주사, 경유리체 접근법 (외과적 절차)를 통한 망막하 주사, 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여, 또는 후측 공막옆 데포 절차에 의함) 투여된) ml당 게놈 카피 또는 게놈 카피의 수에 의해 측정된다. 특정 구현예에서, ml당 2.4 × 10¹¹개의 게놈 카피 내지 ml당 1 × 10¹³개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, ml당 2.4 × 10¹¹개의 게놈 카피 내지 ml당 5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 5 × 10¹¹개의 게놈 카피 내지 ml당 1 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 1 × 10¹²개의 게놈 카피 내지 ml당 5 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 5 × 10¹²개의 게놈 카피 내지 ml당 1 × 10¹³개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 2.4 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 1 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 5 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, ml당 약 1 × 10¹³개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 1 × 10⁹ 내지 1 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 3 × 10⁹ 내지 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 1 × 10⁹ 내지 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 1 × 10⁹ 내지 1 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 1 × 10⁹ 내지 5 × 10⁹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 6 × 10⁹ 내지 3 × 10¹⁰개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 4 × 10¹⁰ 내지 1 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 2 × 10¹¹ 내지 1 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 약 3 × 10⁹개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 1.2 × 10¹⁰개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 1 × 10¹⁰개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 4 × 10¹⁰개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 6 × 10¹⁰개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 2.4 × 10¹¹개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 1.6 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 6.2 × 10¹¹개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 1.55 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 6.2 × 10¹¹개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 1.6 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 ml당 약 6.4 × 10¹¹개의 게놈 카피에 상응함). 또 다른 특정 구현예에서, 약 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다 (이는 250 μl의 부피에서 약 1.0 × 10¹²에 상응함).

특정 구현예에서, 눈당 약 6.0 × 10¹⁰개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 1.6 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 3 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 ml당 약 1.0 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 ml당 약 2.5 × 10¹²개의 게놈 카피가 투여된다.

특정 구현예에서, 눈당 약 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 3 × 10¹²개의 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피가 단일 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피가 이중 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 약 3.0 × 10¹³개의 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 최대 3.0 × 10¹³개의 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 ml당 약 2.5 × 10¹²개의 게놈 카피가 100 μl의 부피에서 단일 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 눈당 ml당 약 2.5 × 10¹²개의 게놈 카피가 이중 맥락막상 주사에 의해 투여되고, 각각의 주사는 100 μl의 부피이다.

본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "약"은 주어진 값 또는 범위의 ±10% 이내를 의미한다.

특정 구현예에서, 용어 "약"은 인용된 정확한 수를 포함한다.

특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라는 예를 들어 SCS 내에서 용액의 확산의 시각화를 허용하는 안구 표면의 열 프로파일의 변화를 검출하기 위해 체온보다 더 차가운 용액을 투여한 후 안구 표면의 열적 프로파일의 변화를 검출하기 위해 사용될 수 있고, 투여가 성공적으로 완료되었는지 여부를 잠재적으로 결정할 수 있다 이는 특정 구현예에서 투여되는 재조합 벡터를 함유하는 제형이 초기에 냉동되고, 실온 (68-72℉)이 되고, 투여 전에 단기간 (예를 들어, 적어도 30분) 동안 해동되고, 따라서 제형이 주사 시에 인간 눈보다 더 차갑기 때문이다 (약 92℉) (때때로는 심지어 실온보다 더 차가워진다). 약품은 일반적으로 해동 후 4시간 이내에 사용되며 가장 따뜻한 용액은 실온이다. 바람직한 구현예에서, 절차는 적외선 비디오로 비디오화된다.

적외선 열화상 카메라는 온도의 작은 변화를 감지할 수 있다. 그들은 렌즈를 통해 적외선 에너지를 포착하고 에너지를 전자 신호로 변환한다. 적외선은 에너지를 열화상으로 변환하는 적외선 센서 어레이에 집중된다. 적외선 열화상 카메라는 예를 들어 본원에 기재된 임의의 투여 경로, 예를 들어, 맥락막상 투여, 망막하 투여, 결막하 투여, 유리체내 투여, 또는 맥락막상 공간으로의 느린 주입 카테터를 사용하는 투여를 포함하는 눈에 대한 임의의 투여 방법에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIR T530 적외선 열화상 카메라이다. FLIR T530 적외선 열화상 카메라는 ±3.6℉의 정확도로 미세한 온도 차이를 포착할 수 있다. 카메라의 적외선 해상도는 76,800픽셀이다. 카메라는 또한 더 작은 시야를 캡처하는 24° 렌즈를 사용한다. 높은 적외선 해상도와 결합된 더 작은 시야는 작업자가 이미징하는 것에 대한 보다 상세한 열 프로파일에 기여한다. 그러나 다른 적외선 해상도 및/또는 다른 정도의 렌즈를 사용하여 약간의 온도 변화를 캡처하는 데 상이한 능력 및 정확도를 가진 다른 적외선 카메라를 사용할 수 있다.

특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIR T420 적외선 열화상 카메라이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIR T440 적외선 열화상 카메라이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라는 Fluke Ti400 적외선 열화상 카메라이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIRE60 적외선 열화상 카메라이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라의 적외선 해상도는 75,000픽셀 이상이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라의 열 감도는 30℃에서 0.05℃ 이하이다. 특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라의 시야(FOV)는 25°× 25°이하이다.

특정 구현예에서, 적외선 열화상 카메라와 함께 철 필터가 사용되어 안구 표면의 열 프로파일의 변화를 감지한다. 바람직한 구현예에서, 철 필터의 사용은 의사색상 이미지를 생성할 수 있으며, 가장 따뜻하거나 높은 온도 부분은 흰색으로 표시되고 중간 온도는 빨간색과 노란색으로, 가장 차갑거나 낮은 온도 부분은 검은색으로 표시된다. 특정 구현예에서, 다른 유형의 필터가 또한 열 프로파일의 유사 색상 이미지를 생성하는 데 사용될 수 있다.

각 투여 방법에 대한 열 프로파일은 다를 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, 성공적인 맥락막상 주사는 하기를 특징으로 할 수 있다: (a) 어두운 색상의 느리고 넓은 방사상 확산, (b) 시작 시 매우 어두운 색상, 및 (c) 주사액의 밝은 색으로의 점진적인 변화, 즉 밝은 색에 의해 나타나는 온도 구배. 한 구현예에서, 성공하지 못한 맥락막상 주사는 하기를 특징으로 할 수 있다: (a) 어두운 색의 퍼짐 없음, 및 (b) 분포 없이 주사 부위에 국한된 색의 미미한 변화. 특정 구현예에서, 작은 국부적 온도 강하는 안구 조직(고온)과 접촉하는 캐뉼러(저온)의 결과이다. 한 구체예에서, 성공적인 유리체내 주사는 하기를 특징으로 할 수 있다: (a) 어두운 색의 퍼짐 없음, (b) 주사 부위에 국한된 매우 어두운 색으로의 초기 변화, 및 (c) 전체 눈의 진한 색으로의 점진적이고 균일한 변화. 한 구현예에서, 안구외 유출은 하기를 특징으로 할 수 있다: (a) 눈의 외부 표면 상에서 외부에서 빠르게 흐르는 스트림, (b) 초기에 매우 어두운 색, 및 (c) 밝은 색으로의 빠른 변화.

5.3.3 샘플링 및 효능의 모니터링

시각 결함에 대한 본원에 제공된 치료 방법의 효과는 BCVA (최고 교정 시력), 안압, 슬릿 램프 생체현미경검사, 및/또는 간접적 검안로 측정할 수 있다. 외안구 운동도 평가할 수 있다. 안압 측정은 Tonopen 또는 Goldmann 압평 안압측정을 사용하여 수행할 수 있다. 슬릿 램프 검사에는 눈꺼풀/속눈썹, 결막/공막, 각막, 전방, 홍채, 수정체 및/또는 유리체의 평가가 포함될 수 있다.

특정 구현예에서, 시각 결함에 대한 본원에 제공된 방법의 효과는 본원에 기재된 방법에 의해 치료되는 인간 환자 눈이 치료 후(예를 들어, 치료 후 46-50주 또는 98-102주) 43 글자 초과의 BCVA를 달성하는지에 의해 측정될 수 있다. 43 글자의 BCVA는 대략 20/160 스넬렌 등가물에 해당한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료되는 인간 환자 눈이 치료 후(예를 들어, 치료 후 46-50주 또는 98-102주) 43 글자 초과의 BCVA를 달성한다.

특정 구현예에서, 시각 결함에 대한 본원에 제공된 방법의 효과는 본원에 기재된 방법에 의해 치료되는 인간 환자 눈이 치료 후(예를 들어, 치료 후 46-50주 또는 98-102주) 84 글자 초과의 BCVA를 달성하는지에 의해 측정될 수 있다. 84 글자의 BCVA는 대략적인 스넬렌 등가에 해당하는 20/20에 해당한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료되는 인간 환자 눈이 치료 후(예를 들어, 치료 후 46-50주 또는 98-102주) 84 글자 초과의 BCVA를 달성한다. BCVA 테스트는 ETDRS 차트를 사용하여 4미터 거리에서 수행할 수 있다. 시력이 저하된 참가자(4미터에서 20 글자 이상을 올바르게 읽을 수 없음)의 경우, BCVA 테스트는 1미터 거리에서 수행될 수 있다.

눈/망막에 대한 물리적 변화에 대한 본원에 제공된 치료 방법의 효과는 SD-OCT(SD-광간섭 단층촬영술)로 측정할 수 있다.

효능은 망막전위도검사(ERG)로 측정하여 모니터링할 수 있다.

본원에 제공된 치료 방법의 효과는 시력 상실, 감염, 염증 및 망막 박리를 비롯한 기타 안전 사건의 징후를 측정하여 모니터링할 수 있다.

망막 두께는 본원에 제공된 치료의 효능을 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 망막의 두께는 임상 판독으로서 사용될 수 있으며, 망막 두께의 감소가 크거나 망막이 두꺼워지기 전의 기간이 길수록 치료가 더 효과적이다. 망막 기능은 예를 들어 ERG에 의해 결정될 수 있다. ERG는 인간의 사용을 위해 FDA에 의해 승인된, 망막 기능의 비-침습성 전기생리학적 시험이며, 이는 눈의 광 감수성 세포 (간상 및 원추), 및 그의 연결 신경절 세포, 특히 플래쉬 자극에 대한 그의 반응을 검사한다. 망막 두께는 예를 들어 SD-OCT에 의해 결정될 수 있다. SD-OCT는 관심 물체로부터 반사된 후측 산란된 빛의 에코 시간 지연과 크기를 결정하기 위하여 낮은 간섭 간섭계(interferometry)를 사용하는 3차원 이미징 기술이다. OCT는 3 내지 15μm 축방향 해상도로 조직 샘플(예를 들어, 망막)의 층을 스캔하는 데 사용할 수 있으며 SD-OCT는 이전 형태의 기술보다 축방향 해상도와 스캔 속도를 향상시킨다(Schuman, 2008, Trans. Am. Opthamol. Soc. 106:426-458)

또한, 본원에 제공된 방법의 효과는 라쉬(Rasch)-점수 버전 (NEI-VFQ-28-R) (복합 점수; 활성 제한 도메인 점수; 및 사회-운동 기능 도메인 점수)인 National Eye Institute Visual Functioning Questionnaire의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정될 수 있다. 또한, 본원에 제공된 방법의 효과는 National Eye Institute Visual Functioning Questionnaire 25-항목 버전(NEI-VFQ-25)(복합 점수 및 정신 건강 하위척도 점수)의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정될 수 있다. 또한, 본원에 제공된 방법의 효과는 Macular Disease Treatment Satisfaction Questionnaire (MacTSQ) (복합 점수; 안전성, 효능, 및 불괘감 영역 점수; 및 정보 제공 및 편리 영역 점수)의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법의 효능은 약 4 주, 12 주, 6 개월, 12 개월, 24 개월, 36 개월, 또는 기타 원하는 시점에서의 시력 개선에 의해 반영된다. 특정 구현예에서, 시력의 개선은 BCVA의 증가, 예를 들어 1 글자, 2 글자, 3 글자, 4 글자, 5 글자, 6 글자, 7 글자, 8 글자, 9 글자, 10 글자, 11 글자, 또는 12 글자 초과까지의 증가를 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 시력의 개선은 기준선으로부터 시력의 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50% 초과의 증가를 특징으로 한다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법의 효능은 약 4주, 12주, 6개월, 12개월, 24개월, 36개월 또는 기타 원하는 시점에서 중심 망막 두께(CRT)의 감소, 예를 들어, 기준선으로부터 중심 망막 두께의 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50% 초과의 감소에 의해 반영된다.

특정 구현예에서, 치료 후 눈에 염증이 없거나 치료 후 눈에 염증이 거의 없다(예를 들어, 염증 수준이 기준선으로부터 10%, 5%, 2%, 1% 또는 그 미만까지 증가). 시각 결함에 대한 본 문서에 제공된 방법의 효과는 OptoKinetic Nystagmus(OKN)으로 측정할 수 있다.

이론에 얽매이지 않고 이 시력 스크리닝은 OKN 비자발적 반사의 원리를 사용하여 환자의 눈이 움직이는 표적을 따라갈 수 있는지 객관적으로 평가한다. OKN을 사용하면 테스터와 환자 사이에 구두 연락이 필요하지 않다. 따라서 OKN은 언어 전 및/또는 비언어적 환자의 시력을 측정하는 데 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, OKN은 1 개월령, 2 개월령, 3 개월령, 4 개월령, 5 개월령, 6 개월령, 7 개월령, 8 개월령, 9 개월령, 10 개월령, 11 개월령, 1 세, 1.5 세, 2 세, 2.5 세, 3 세, 3.5 세, 4 세, 4.5 세, 또는 5 세인 환자의 시력을 측정하기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, iPad는 환자가 iPad에서 움직임을 보고 있을 때 OKN 반사의 검출을 통해 시력을 측정하는 데 사용된다.

이론에 얽매이지 않고 이 시력 스크리닝은 OKN 비자발적 반사의 원리를 사용하여 환자의 눈이 움직이는 표적을 따라갈 수 있는지 객관적으로 평가한다. OKN을 사용하면 테스터와 환자 사이에 구두 연락이 필요하지 않다. 따라서 OKN은 언어 전 및/또는 비언어적 환자의 시력을 측정하는 데 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, OKN은 1.5 개월령, 2 개월령, 3 개월령, 4 개월령, 5 개월령, 6 개월령, 7 개월령, 8 개월령, 9 개월령, 10 개월령, 11 개월령, 1 세, 1.5 세, 2 세, 2.5 세, 3 세, 3.5 세, 4 세, 4.5 세, 또는 5 세인 환자의 시력을 측정하기 위해 사용된다. 또 다른 특정 구현예에서, OKN은 1-2 개월령, 2-3 개월령, 3-4 개월령, 4-5 개월령, 5-6 개월령, 6-7 개월령, 7-8 개월령, 8-9 개월령, 9-10 개월령, 10-11 개월령, 11 개월 내지 1 세, 1-1.5 세, 1.5-2 세, 2-2.5 세, 2.5-3 세, 3-3.5 세, 3.5-4 세, 4-4.5 세, 또는 4.5-5 세인 환자의 시력을 측정하기 위해 사용된다. 다른 특정 구현예에서, OKN은 6개월 내지 5세인 환자의 시력을 측정하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, iPad는 환자가 iPad에서 움직임을 보고 있을 때 OKN 반사의 검출을 통해 시력을 측정하는 데 사용된다.

인간 환자가 어린이인 경우, 시각 기능은 광운동성 안진(OKN) 기반 접근 방식 또는 수정된 OKN 기반 접근 방식을 사용하여 평가할 수 있다.

벡터 쉐딩은 예를 들어 정량적 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 눈물, 혈청 또는 소변과 같은 생물학적 유체에서 벡터 DNA를 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터의 투여 후 임의의 시점에서 소변에서 벡터 유전자 카피가 검출 가능하지 않다. 일부 구현예에서, 1000 미만, 500 미만, 100 미만, 50 미만 또는 10개 미만의 벡터 유전자 카피/5 μL는 투여 후 임의의 시점에 생물학적 유체(예를 들어, 눈물, 혈청 또는 소변)에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능하다. 특정 구현예에서, 210개의 벡터 유전자 카피/5 μL 이하가 혈청에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 1000 미만, 500 미만, 100 미만, 50 미만 또는 10개 미만의 벡터 유전자 카피/5 μL는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14까지 생물학적 유체(예를 들어, 눈물, 혈청 또는 소변)에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능하다. 특정 구현예에서, 벡터의 투여 후 14주차까지 시점에서 생물학적 유체(예를 들어, 눈물, 혈청 또는 소변)에서 벡터 유전자 카피가 검출 가능하지 않다. 일부 구현예에서, 벡터의 투여 후 임의의 시점에서 생물학적 유체(예를 들어, 눈물, 혈청 또는 소변)에서 벡터 유전자 카피가 검출 가능하지 않다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 치료된 환자는 Center Involved-Diabetic Macular Edema (CI-DME), 백내장, 신생혈관형성, 망막 박리, 당뇨병 합병증, 혈관 퇴행, 누출 영역 및/또는 망막 비관류 영역의 발달에 대해 모니터링된다. CI-DME, 백내장, 신생혈관형성, 망막 박리, 당뇨병 합병증, 혈관 퇴행, 누출 영역 및 망막 비관류 영역의 발달은 당업계에 공지되거나 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 대상체에서 발생한 당뇨병 합병증은 범망막 광응고술(PRP), 항-VEGF 요법 및/또는 외과적 개입이 필요할 수 있다. 당뇨병 합병증은 시력을 위협할 수 있다. 대상체에서 발생한 백내장은 수술이 필요할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 치료되는 환자의 활력 징후(예를 들어, 심박수, 혈압)가 모니터링될 수 있다.

본원에 기재된 치료 방법의 안전성은 당업계에 공지된 검정에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법의 안전성은 예를 들어, 글루코스, 혈액 요소 질소, 크레아티닌, 나트륨, 칼륨, 클로라이드, 이산화탄소, 칼슘, 총 단백질 알부민 총 빌리루빈, 직접적인 빌리루빈, 알칼리성 포스파타제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 및/또는 크레아틴 키나제의 수준의 혈청 화학 측정에 의해 평가된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법의 안전성은 예를 들어, 혈소판, 적혈구용적률, 헤모글로빈, 적혈구, 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 평균 혈구 부피, 평균 혈구 헤모글로빈 및/또는 평균 혈구 헤모글로빈 농도의 혈액학적 측정에 의해 평가된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법의 안전성은 소변 검사, 예를 들어 포도당, 케톤, 단백질 및/또는 혈액의 수준에 대한 딥스틱(dipstick) 테스트에 의해 평가된다(보증되는 경우, 현미경 평가가 완료될 수 있음). 특정 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법의 안전성은 응고 측정(예를 들어, 프로트롬빈 시간 및/또는 부분 트롬보플라스틴 시간) 또는 헤모글로빈 A1c의 측정에 의해 평가된다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법의 효과는 통계적 분석에 의해 결정된다. 통계적 추론은 양측 α = 0.2의 유의 수준에서 수행될 수 있다. 통계적 평가변수는 해당하는 80% 신뢰 구간으로 요약될 수 있다.

본원에 제공된 방법의 효과는 Fisher's Exact 테스트에 의해 결정될 수 있으며, 처리된 모집단은 처리되지 않은 모집단의 과거 반응률(예를 들어, 5%)에 대해 테스트된다.

5.4 조합 요법

본원에 제공된 치료 방법은 하나 이상의 추가 요법과 조합될 수 있다. 한 양태에서, 본원에 제공된 치료 방법은 레이저 광응고술과 함께 투여된다. 한 양태에서, 본원에 제공된 치료 방법은 베르테포르핀을 사용한 광역학 요법과 함께 투여된다.

한 양태에서, 본원에 제공된 치료 방법은 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, 인간 세포주에서 생성된 HuGlyFabVEGFi (Dumont 등, 2015(상동))을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항-VEGF 제제, 또는 다른 항-VEGF 제제 예컨대 페갑타닙, 라니비주맙, 아플리베르셉트, 또는 베바시주맙을 사용하는 유리체내 (IVT) 주사와 함께 투여된다.

추가 요법은 유전자 요법 치료 전, 그와 동시에 또는 후에 투여될 수 있다.

유전자 요법 치료의 효능은 표준 치료을 사용하는 구제 치료, 예를 들어, 비제한적으로 HuPTMFabVEGFi, 예를 들어, 인간 세포주에서 생성된 HuGlyFabVEGFi, 또는 페갑타닙, 라니비주맙, 아플리베르셉트, 또는 베바시주맙과 같은 다른 항-VEGF 제제를 포함하는 항-VEGF 제제를 사용하는 유리체내 주사의 제거 또는 감소에 의해 표시될 수 있다.

6. 실시예

6.1 실시예 1: 베바시주맙 Fab cDNA-기반 벡터

경쇄 및 중쇄 cDNA 서열(각각 서열번호 10 및 11)의 베바시주맙 Fab 부분을 포함하는 이식유전자를 포함하는 베바시주맙 Fab cDNA-기반 벡터를 제작하였다. 상기 이식유전자는 또한 표 1에 열거된 그룹으로부터 선택된 신호 펩티드를 포함하는 핵산을 포함하였다. 상기 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바이시스트론성 벡터를 형성하기 위해 IRES 요소 또는 2A 절단 부위에 의해 분리하였다. 선택적으로, 상기 벡터는 추가로는 저산소증-유도성 프로모터를 포함하였다.

6.2 실시예 2: 라니비주맙 cDNA-기반 벡터

라니비주맙 Fab 경쇄 및 중쇄 cDNA(각각 상기 신호 펩티드를 인코딩하지 않는, 서열번호12 및 13의 부분들)를 포함하는 이식유전자를 포함하는 라니비주맙 Fab cDNA-기반 벡터를 제작하였다. 상기 이식유전자는 또한 표 1에 열거된 그룹으로부터 선택된 신호 펩티드를 포함하는 핵산을 포함하였다. 상기 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바이시스트론성 벡터를 형성하기 위해 IRES 요소 또는 2A 절단 부위에 의해 분리하였다. 선택적으로, 상기 벡터는 추가로는 저산소증-유도성 프로모터를 포함하였다.

6.3 실시예 3: 하이퍼글리코실화된 베바시주맙 Fab cDNA-기반 벡터

하기의 돌연변이 중 하나 이상을 인코딩하는 서열로의 돌연변이를 갖는 경쇄 및 중쇄 cDNA 서열(각각 서열번호 10 및 11)의 베바시주맙 Fab 부분을 포함하는 이식유전자를 포함하는 고당화된 베바시주맙 Fab cDNA-기반 벡터를 제작하였다: L118N(중쇄), E195N(경쇄), 또는 Q160N 또는 Q160S(경쇄). 상기 이식유전자는 또한 표 1에 열거된 그룹으로부터 선택된 신호 펩티드를 포함하는 핵산을 포함하였다. 상기 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바이시스트론성 벡터를 형성하기 위해 IRES 요소 또는 2A 절단 부위에 의해 분리하였다. 선택적으로, 상기 벡터는 추가로는 저산소증-유도성 프로모터를 포함하였다.

6.4 실시예 4: 하이퍼글리코실화된 라니비주맙 cDNA-기반 벡터

하기의 돌연변이 중 하나 이상을 인코딩하는 서열에 돌연변이를 갖는 라니비주맙 Fab 경쇄 및 중쇄 cDNA(상기 신호 펩티드를 인코딩하지 않는, 각각 서열번호 12 및 13의 부분들)를 포함하는 이식유전자를 포함하는 고당화된 라니비주맙 Fab cDNA-기반 벡터를 제작하였다. 상기 이식유전자는 또한 표 1에 열거된 그룹에서 선택된 신호 펩티드를 포함하는 핵산을 포함하였다: L118N(중쇄), E195N(경쇄), 또는 Q160N 또는 Q160S(경쇄). 상기 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바이시스트론성 벡터를 형성하기 위해 IRES 요소 또는 2A 절단 부위에 의해 분리하였다. 선택적으로, 상기 벡터는 추가로는 저산소증-유도성 프로모터를 포함하였다.

6.5 실시예 5: 라니비주맙 기반 HuGlyFabVEGFi

라니비주맙 Fab cDNA-기반 벡터(실시예 2 참고)를 AAV8 배경의 PER.C6^®세포주(Lonza)에서 발현시켰다. 상기 생성된 생성물, 라니비주맙-기반 HuGlyFabVEGFi는 안정적으로 생산되는 것으로 판단하였다. HuGlyFabVEGFi의 N-당화는 히드라진 분해 및 MS/MS 분석에 의해 확인하였다. 예를 들어, Bondt 등., Mol. & Cell. Proteomics 13.11:3029-3039를 참조하였다. 글리칸 분석에 기초하여, HuGlyFabVEGFi는 N-당화되며, 2,6 시알산이 우세한 변형인 것임을 확인하였다. 상기 N-글리코실화된 HuGlyFabVEGFi의 유리한 특성은 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 판단하였다. 상기 HuGlyFabVEGFi는 증가된 안정성 및 이의 항원(VEGF)에 대해 증가된 친화성을 갖는 것으로 밝혀질 수 있다. 안정성 평가를 위한 방법의 경우 Sola 및 Griebenow, 2009, J Pharm Sci., 98(4): 1223-1245를 그리고, 친화성을 평가하기 위한 방법의 경우 Wright 등., 1991, EMBO J. 10:2717-2723 및 Leibiger 등 1999, Biochem. J. 338:529-538을 참고한다.

6.6 실시예 6: 당뇨병성 망막병증이 있는 참가자에서 작제물 II 유전자 요법의 공개군(open-label) 2a상 용량 평가

본 실시예는 당뇨병성 망막병증(DR)를 앓는 참가자에서 작제물 II 유전자 요법의 2a상 용량 평가에 대한 개요를 제공한다. DR에 대한 1회 유전자 요법 치료 후 작제물 II 이식유전자 산물의 지속적이고 안정적인 발현이 잠재적으로 현재 이용가능한 요법의 치료 부담을 감소시키는 한편, 유리한 이점 대 위험 프로파일과 함께 시력을 유지할 수 있을 것이다. 개념증명 연구의 현 입증은 DR를 앓는 참가자에게서 2가지 상이한 용량 수준의 작제물 II 유전자 요법의 안전성 및 효능을 평가하기 위해 의도된 것이다.

6.6.1 목적 및 평가변수

6.6.2 선정 기준

참가자는 본 연구에 적격자가 되기 위해서 하기의 모든 기준에 부합해야 한다. 모든 안구 기준은 상기 연구대상 눈을 참조하였다: (1) 1형 또는 2형 당뇨병에 부차적인 DR을 가진 ≥ 18 세의 남성 또는 여성. 참가자는 헤모글로빈 A1c가 ≤10%(선별에서 수득된 실험실 평가에 의해 또는 선별 이전 60일 이내의 일자가 기입된 문서로 기록된 실험실 보고서에 의해 확인됨)이어야 하고; (2) 상기 연구자에 의해 적절한 외과적 후보로 간주된 참가자; (3) 상기 연구자의 소견으로, 선별 후 적어도 6개월 동안, PRP 또는 항-VEGF 주사가 미뤄져도 안전할 수 있는 중등증-중증 NPDR, 중증 NPDR, 경증 PDR, 또는 중등증 PDR(CRC에 의해 결정된 표준 4-광 시야 디지털 입체 안저 사진기법을 사용하는 ETDRS-DRSS 수준 47, 53, 61, 또는 65)의 연구 대상 눈; (4) 연구자에 따르면, 상기 연구 대상의 눈에 시력 상실과 전형적으로 연관된, 하기를 포함하는, 고위험 특징의 증거가 없는 경우: (i) 시신경의 1-원판 부위 내에 새로운 혈관, 또는 시신경 원판에 덜 광범위한 새로운 혈관과 연관되거나 또는 다른 곳에 크기가 원판 부위의 절반 또는 그 이상인 새로운 혈관과 연관된 유리질 또는 망막앞 출혈, 및 (ii) 임상 시험에서 연구 대상 눈에 전안부(예를 들어, 홍채 또는 각도) 신생혈관형성의 증거가 없음; (5) 연구 대상 눈에서 > 69개 ETDRS 글자인 최상의-보정된 시력(BCVA)(대략적인 스넬렌 등가 20/40 또는 더 나은); 주의: 두 눈이 적격인 경우, 연구 대상 눈은 등록 이전에 상기 연구자에 의해 결정된 바와 같이 참가자의 시력이 더 나쁜 쪽 눈이어야 함; (6) 지난 6개월 이내에 유리체내 항-VEGF 또는 속효성 스테로이드 주사를 맞지 않은 경우, 그리고 선별 이전 3년 동안 문서기록된 주사가 10회 이하인 경우, 연구 대상 눈에서 CI-DME의 사전 이력은 허용 가능함; (7) 여성은 폐경후 ≥ 1 년이 경과되었거나 또는 외과 수술을 받아 불임이어야만 함. 그렇지 않다면, 여성은 선별 시 혈청 임신 테스트에서 음성이거나 1일 차(작제물 II 수술일)에 확증적인 소변; 임신 시험 결과가 음성이어야 하고, 연구 중에 추가적인 임신 테스트를 할 의지가 있어야 함; (8) 임신이 가능한 여성, 그의 남성 파트너 및 임신이 가능한 여성 파트너가 있는 성적으로 왕성한 남성 참가자는 선별부터 벡터 투여 후 24 주까지 매우 효과적인 피임법을 사용할 의지가 있어야 한다. 이 시점 후 피임의 중단은 담당 의사와 만드시 논의해야 함; (9) 모든 연구 절차를 준수할 의지가 있어야 하고 준수할 수 있어야 하며, 연구 기간 동안 시간을 낼 수 있어야 함; (10) 반드시 고지에 의한 동의서에 서명한 후 제출할 의지가 있어야 하고 그렇게 할 수 있어야 함.

6.6.3 탈락 기준

참가자는 다음의 기준 중 어느 것이라도 적용되는 경우, 본 연구에서 탈락된다: (1) 연구자가 판단한 바와 같이, 임상 시험에서 또는 다음의 역치, 하이델베르그 스펙트랄리스(Heidelberg Spectralis): 320 μm를 사용하는 연구 대상 눈의 중심영역 망막 내에 임의의 활성 CI-DME가 존재하는 경우; (2) 연구자에 따르면, DR 이외의 원인으로 인해 연구 대상 눈에 신생혈관이 형성된 경우; (3) 연구자가 판단한 바와 같이, 기준선 FA 상의 주변 망막, 또는 중심와 또는 유두황반 부위의 > 50%를 포함하는 연구 대상 눈에 허혈의 증거가 있는 경우; (4) 연구자가 판단한 바와 같이, 연구 대상 눈에, 임상 검사 시 시신경 창백 또는 기준선 FA에서 시신경 원판 신생혈관형성의 증거가 있는 경우; (5) 연구 대상 눈에 PRP의 임의의 증거 또는 문서로 기록된 이력이 있는 경우, 또는 연구 대상 눈에 후극부 밖에 초점 또는 그리드 레이저의 임의의 증거가 있는 경우; (6) 외과적 절차를 방해할 수도 있는 연구 대상 눈의 안구 또는 안구주위 감염이 있는 경우; (7) 선별 후 6개월 이내에 외과적 개입을 요구할 수 있는 연구 대상 눈의 임의의 안구 병태(유리질 출혈, 선정 기준에 부합하지 않는 백내장, 망막 견인, 망막전막 등) 또는 연구자의 소견으로, 참가자에게 위험을 증가시킬 수 있거나, 시력 상실을 예방 또는 치료하기 위해 연구 중에 의료 또는 외과적 개입을 요구하거나, 연구 절차 또는 평가를 방해할 수 있는, 연구 대상 눈의 임의의 병태가 있는 경우; (8) 연구 대상 눈에서 망막 박리가 활발하거나, 그와 같은 이력이 있는 경우; (9) 선별 당시 연구 대상 눈에 이식물이 존재하는 경우(안구내 수정체[IOL]은 제외됨); (10) 펜타캠 장치에 의해 스캐닝하고 CRC에 의해 검증한 결과, 펜타캠 핵 단계화 점수가 ≥1이거나, 또는 섹션 6.6.5(c)에 약술된 기타 기준선 백내장 기준에 부합하지 않는 경우; (11) 연구자에 의한 임상 시험에서 또는 CRC에 의해 결정된 수정체 영상화에서 문서로 기록된 기존 피질 또는 후측 피막밑 백내장이 있는 경우, 및/또는 CRC에 의한 결정에 따라, 핵 수정체 이미지 등급이 AREDS 수준 2(경증 핵 혼탁)보다 높은 경우; (12) 참가자의 녹내장 전문가와의 상담을 통해 또는 문서로 기록된 녹내장 수술 이력을 통해 평가된 바에 따르면, 연구 대상 눈의 녹내장이 진행된 경우(즉, 이차례 이상의 적가 치료 또는 예컨대, 튜브 또는 션트와 같은 개입에도 불구하고, 통제되지 않음); (13) 선별 이전 12 주 내에 연구 대상 눈에 안구내 수술을 한 이력이 있는 경우; 이트륨 알루미늄 석류석 피막절개술은 선별 이전 >10 주에 수행된 경우 허용됨; (14) 선별 이전 6개월 이내에, 항-VEGF 요법을 비롯한, 연구 대상 눈의 유리체내 요법의 이력이 있는 경우, 및 선별하기 전 3년 이내에 DME를 위한 연구 대상 눈의 10회 초과 사전 항-VEGF 또는 속효성 스테로이드 유리체내 주사가 문서화된 경우; (15) 선별 이전 6개월 내에 연구 대상 눈에 임의의 사전 유리체내 스테로이드를 주사한 경우, 선별 이전 12개월 내에 연구 대상 눈에 Ozurdex^®를 투여한 경우, 또는 선별 이전 36개월 내에 연구 대상 눈에 Iluvien^®을 투여한 경우; (16) 선별 이전 6개월 내에 임의의 사전 전신 항-VEGF 치료를 받았거나, 선별 후 향후 6개월 동안 전신 항-VEGF 요법을 사용할 계획이 있는 경우; (17) 망막 독성을 야기했던 것으로 알려진 요법, 또는 VA에 영향을 미칠 수 있거나 알려진 망막 독성이 있는 임의의 약물, 예를 들어, 클로로퀸 또는 하이드록시클로로퀸과의 동반 요법의 이력이 있는 경우; (18) 선별 이전 6개월 내에 심근경색증, 뇌혈관 사고, 또는 일과성 허혈 발작이 있었던 경우; (19) 최대 의료 치료에도 불구하고 통제되지 않는 고혈압(수축기 혈압 [BP] > 180 mmHg, 확장기 BP> 100 mmHg)이 있는 경우; 연구자 및/또는 일차 진료 의사에 의한 판단으로, BP가 180/100 mmHg 아래로 유지되고, 혈압강하 치료에 의해 안정화되는 경우, 상기 참가자는 적격성에 대한 심사를 다시 받을 수 있음을 유의해야 함; (20) 연구자의 소견으로, 본 연구의 참여가 불가능한 전신 병태(불량한 혈당 관리, 통제되지 않는 고혈압 등)가 있는 경우; (21) 연구자의 소견으로, 안구의 외과적 절차 또는 치유 과정을 방해할 수 있는 임의의 동반 치료를 받는 경우; (22) 선별 이전 5 년 안에 화학요법 및/또는 방사선이 필요하여 면역계를 위태롭게 할 수 있는 악성종양 또는 혈액성 악성종양의 이력이 있는 경우. 국한된 기저 세포 암종은 허용됨; (23) 연구자의 소견으로, 참가자의 안전성 또는 본 연구 중 모든 평가 및 추적을 완료할 수 있는 능력을 위태롭게 할 수 있는 중증, 만성, 또는 불안정한 의료 또는 심리적 병태가 있는 경우; (24) 선별 당시 다음의 실험실 값을 보인 임의의 참가자는 본 연구에서 탈락된다: (i) 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) / 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) > 2.5 Х 정상 상한치(ULN), (ii) 총 빌리루빈 > 1.5 Х ULN, 상기 참가자가 이전에 알려진 길버트 증후군의 병력이 있거나 총 빌리루빈의 < 35%인 접합된 빌리루빈을 나타내는 분별화된 빌리루의 이력이 있는 경우는 제외됨, (iii) 프로트롬빈 시간 > 1.5 Х ULN, 상기 참가자에 항응고제가 투여되는 경우는 제외됨. 항응고제가 투여되는 참가자는 현지 연구소에서 모니터링하고, 현지 관행에 따라 관리하여, 본 연구 절차를 위해 항응고제 요법을 중단하거나 쉬는 동안 투여함; 항응고제가 투여되는 참가자의 경우, 의료 모니터와의 상담이 필요함, (iv) 남성 참가자의 경우는 <10 g/dL의 헤모글로빈 및 여성 참가자의 경우는 < 9 g/dL, (v) 혈소판 <100 Х 103/μL, (vi) 예상된 사구체 여과율 < 30 mL/분/1.73 m²; (25) 투석 또는 신장 이식이 필요한 만성 신부전의 병력이 있는 경우; (26) 선별 이전 6개월 내에 집중적인 인슐린 치료(펌프 또는 다중 매일 주사)를 개시한 경우, 또는 선별 후 6개월 내에 개시할 계획이 있는 경우; (27) 의료 모니터에 의해 검증된 바와 같이, 상기 참가자를 위해 항응고제를 처방하는 의사 뿐만 아니라, 치료 연구자(즉, 망막 외과의사)의 소견으로, 작제물 II 투여를 위해 항응고 요법을 중단하는 것이 권고되지 않거나 또는 안전하지 않다고 간주되는 항응고 요법을 현재 투여받는 경우; (28) 작제물 II를 비롯한 임의의 다른 유전자 요법 연구에 참여한 경우, 등록 전 30 일 내에 또는 연구 대상 생성물의 5 반감기 이내에(어느 쪽이든 더 긴쪽으로) 임의의 연구대상 생성물을 투여받은 경우, 또는 등록 후 6개월 내에 연구 대상 생성물을 사용할 임의의 계획이 있는 경우; (29) 라니비주맙 또는 그것의 임의의 구성요소에 알려진 과민증이 있는 경우.

6.6.4 연구 개입

연구 개입은 연구 프로토콜에 따라 연구 참가자에게 투여될 의도가 있는 임의의 연구용 개입(들), 시판되는 생성물(들), 위약, 또는 의료 기기(들)로 정의된다.

적격 참가자는 작제물 II의 단일용량(용량 1) 또는 작제물 II의 단일 용량(용량 2)를 투여받도록 할당된다. 모든 참가자는 1일 차에 수술실에서 망막하 전달을 통해 연구 개입을 받는다.

이 연구의 참가자는 작제물 II(용량 1) 또는 작제물 II(용량 2)를 받기 위해 상호작용 응답 기술 시스템을 사용하여 스크리닝에서 무작위화(1:1)될 것이다.

6.6.5 사전 및 동반 요법

(a) 약물 및 요법

다음의 약물은 본 연구에 진입하기 전에 금지된다:

● 선별 이전 6개월 내에 연구 대상 눈에 임의의 사전 전신 또는 안구 항-VEGF 치료.

● 선별 이전 3년 내에 DME를 위해 연구 대상 눈에 10회 초과하는 사전, 문서로 기록된, 항-VEGF 또는 속효성 스테로이드 유리체내 주사.

● 선별 이전 6개월 내에 연구 대상 눈에 임의의 사전 유리체내 속효성 스테로이드 주사, 선별 이전 12개월 내에 연구 대상 눈에 Ozurdex의 투여, 또는 선별 이전 36개월 내에 연구 대상 눈에 Iluvien의 투여.

● 선별 이전 6개월 내에 집중적인 인슐린 치료(펌프 또는 다중 매일 주사)의 개시; 이와 같은 기준에 부합하는 참가자의 경우, 이들의 일차 진료 제공자 또는 다른 치료 제공자에 의해 권장되고 문서로 기록된 바 대로, 본 연구 중에 요법의 변형이 허용된다.

● 참가자는 연구자의 소견으로, 작제물 II 투여 또는 치유 과정을 방해할 수 있는 임의의 동반 치료를 반드시 사용하지 않았어야 한다.

● 참가자는 상기 참가자에게 항응고제를 처방하는 의사 뿐만 아니라, 치료 연구자(즉, 망막 외과의사)의 소견으로, 작제물 II 투여를 위한 항응고 요법의 중단이 권고되지 않거나 안전하지 않다고 간주되는 항응고 요법을 투여받는 것이 금지된다.

● 참가자는 등록 이전 30일 내에 또는 연구대상 생성물의 5 반감기 내에 임의의 연구대상 생성물을 반드시 사용하지 않았어야 한다.

다음의 동반 약물은 본 연구 중에 금지된다:

● 안구 당뇨병 합병증의 치료를 위해 섹션 6.6.5(b)에 기재된 상황일 때를 제외하고, 선별 후 6개월 동안 연구 대상 눈에 항-VEGF 요법.

● 본 연구 중에 집중적인 인슐린 치료(펌프 또는 다중 매일 주사)의 개시가 허용되지 않는다; 이전에 나타내 바와 같이, 치료의 개시가 선별 이전 적어도 6개월 전에 일어났다면, 본 연구 중 상기 치료 요법의 변형이 허용된다.

작제물 II를 투여받은 참가자를 위한 수술후 주의사항이 절차 매뉴얼에 기재되어 있다. 본 연구에서 사전 또는 동반 요법에 대한 다른 제한은 없다.

(b) 안구 당뇨병 합병증의 치료

안구 당뇨병의 모든 합병증은 각 연구 센터 SOC에 따라 관리될 것이다.

본 연구 중에, SOC마다 항-VEGF 치료를 요구하는 당뇨병성 합병증이 발병한 참가자에게 필요한 경우 요법이 시행될 수 있다. 필요하면, 상기 연구 센터는 FDA에서 승인받은 항-VEGF 요법을 직접 공급할 것이다. CI-DME의 발병이 반드시 AE로 기록되어야 하며, 투여된 항-VEGF 주사의 회수 및 모든 투여의 시기는 또한 공급원 문서 및 eCRF에 반드시 기록되어야 한다.

PRP SOC를 요구하는 당뇨병성 합병증이 발병한 참가자는 공급원 문서 및 eCRF에 기록된 PRP의 시간을 반드시 가져야 한다.

외과적 개입 SOC(공압 망막유착술, 냉동유착술, 또는 공막 돌용술 중 하나)을 요구하는 당뇨병성 합병증이 발병한 참가자는 공급원 문서 및 eCRF에 기록된 개입의 유형 및 개입의 시간을 반드시 가져야 한다.

(c) 백내장 형성에 대한 개입

선별

선별 방문 중에, 적격성을 판단하고 참가자의 기준선 백내장 상태를 수립하기 위해 일련의 평가가 완료될 것이다. 이들 평가에는 하기가 포함된다: (1)SOC마다 참가자의 증상을 평가하기; (2) 임상 시험을 수행하여 피질 백내장 또는 후측 피막밑 백내장의 임의의 징후가 존재하는지 여부를 결정하기; (3) 눈 펜타캠 핵 단계화 시스템으로 영상화하기; 및 (4) 표준화된 전안부 사진으로 참가의 확인을 위해 자의 수정체를 영상화하기(이것은 등급 매기기 및 연구 적격성을 위해 CRC에 제출될 것임). 선별 방문 시, 탈락 기준 #11에 부합하는 백내장이 있는 참가자는 등록되어서는 안 된다.

연구 중 백내장 평가 및 개입

본 연구 중, 백내장 외과의사가 하기 명시된 제거 기준에 부합하는 백내장의 존재여부를 확인하기 위해 계속 참가자를 평가할 것이다.

AE로 보고될, 의료적으로 권고된 백내장 추출의 기준은 하기와 같다: 망막 연구자는 당뇨병성 안구 질환 및/또는 일반적인 망막 상태를 안전하게 모니터하고 관리하기 위해 망막을 적절하게 관찰하거나 및/또는 영상화할 수 없다.

임의의 기준선후 방문 시 의료적으로 권고된 백내장 추출의 기준에 부합된 경우, 백내장 외과의사와 함께 연구 코디네이터에 의해 5 업무일 이내에 백내장 추출 수술을 위한 예정에 없던 방문이 계획될 것이다.

상기 참가자가 의료적으로 권고된 백내장 추출의 기준에 부합되지 않지만, 임의의 기준선후 방문 시 하기의 부차적 기준 중 2가지 이상에 부합되는 경우, 연구 코디네이터는 백내장 외과의사에 의해 10 업무일 이내에 수행될 백내장 추출 수술을 위해 상기 참가자에게 예정에 없던 방문 일정을 잡아줄 것이다. AE로 또한 보고될 부차적 기준은 하기와 같다:

● 시력 변화: 연구 중(기준선 또는 기준선 후)에 기록된 최상의 값에 비해, 상기 백내장 외과의사에 대해, 수정체에서 기준선으로부터의 변화와 또한 연관된 ≥ 5 ETDRS 글자의 BCVA 감소.

● 굴절 이동: (기준선에서 굴절 이상에 비해) 상기 백내장 외과의사에 대해, 수정체에서 기준선으로부터의 변화와 또한 연관된 임의의 연구 방문 시 기록된 BCVA 중 ≥ 1 디옵터의 굴절 이상의 변화.

● 구조적: 기준선으로부터 수정체 내의 혼탁화 증가를 반영하는, 펜타캠 핵 단계화 점수 상의 기준선에서의 > 1 등급의 변화.

● 참가자-보고: 참가자에 의해 보고된 기준선으로부터의 시각 기능 변화.

● CRC 영상화: CRC에 의해 결정된 바와 같이, 핵, 피질, 또는 후측 피막밑 규모(AREDS 백내장 규모[세부사항은 절차 매뉴얼을 참조])에서 기준선으로부터 > 1 등급/망막(subfield)의 변화.

단초점, 1-피스 아크릴 IOL이 본 연구에 사용하기 위해 선택한 수정체이다. 일부 사례에서, 원환체(난시-교정) IOL이 고려될 수 있으나, 단초점 IOL과 원환체 수정체 사이의 임의의 비용차는, 달리 후원자 및 의료 모니터에 의해 승인되지 않는 한, 참가자가 책임져야 할 몫이다. 다초점 또는 다른 고급 IOL는, 망막 병리에서의 임의의 변화를 정확하게 추적하는 능력을 감소시킬 수 있기에, 본 연구에서 배제된다. 실리콘 시신경 IOL은 임의의 후속 망막 절차를 복잡하게 만들 그것의 잠재성 때문에, 사용되지 않을 것이다. 백내장 외과의사가 참가자에게 최적의 수술후 VA 및 시각 기능을 제공할 가능성이 큰 권고를 제공할 수도 있다.

합병증을 제한하려는 의도의 수술후, SOC 프로토콜이 준수될 것이다. 선호되는 SOC 프로토콜에는 하기가 포함된합병증을 제한하려고 의도된 수술후 SOC 프로토콜이 준수될 것이다. 선호되는 SOC 프로토콜에는 하기가 포함된다: 1주 동안 1일 4회 플루오로퀴놀론의 적가, 1개월 동안 1일 2회 Ilevro(네파페낙(nepafenac))의 적가, 및 프레드니솔론 아세테이트로 1 주 동안은 1일 4회로 시작하여, 1주마다 1일 3회, 1일 2회 및, 최종적으로, 1일 1회로 줄여가는 스테로이드 줄이기. 참가자 안전성을 위해, 적절한 경우,그리고 의료 모니터의 승인을 받아, 대안적인 수술후 프로토콜이 사용될 수도 있다.

6.7 실시예 7: 당뇨병성 망막병증을 앓는 참가자에서 작제물 II 유전자 요법의 공개군 2a상 용량 평가

본 실시예는 실시예 6의 업데이트된 버전으로, 당뇨병성 망막병증(DR)을 앓는 참가자에서 작제물 II 유전자 요법의 2a상, 용량 평가의 개요를 제공한다. DR에 대한 1회용 유전자 요법 치료 후 작제물 II 이식유전자 산물의 지속적이고 안정적인 발현은 유리한 이점:위험 프로파일로 시력을 유지하면서, 현재 이용가능한 요법의 치료 부담을 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 현재의 개념증명 연구는 DR를 앓는 참가자에서 2가지 상이한 용량 수준의 작제물 II 유전자 요법의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 것이다.

6.7.1 목적 및 평가변수

6.7.2 선정 기준

참가자는 본 연구에 적격자가 되기 위해 하기의 모든 기준에 부합해야 한다. 모든 안구 기준은 연구 대상 눈을 참조한다: (1) 1형 또는 2형 당뇨병에 부차적인 DR를 가진 18-89 세의 남성 또는 여성. 참가자는 헤모글로빈 A1c가 (선별 시 수득된 실험실 평가에 의해 또는 선별 이전에 60일 내의 일자가 기입된 문서로 기록된 실험실 보고서에 의해 확인된 바와 같이) ≤10%이어야 함; (2) 연구자에 의해 적절한 외과적 후보로 간주된 참가자; (3) 연구자의 소견으로, 선별 후 적어도 6개월 동안 PRP 또는 항-VEGF 주사가 미뤄져도 안전하다고 보는 중등증-중증 NPDR, 중증 NPDR, 경증 PDR, 또는 중등증 PDR(CRC에 결정된 바와 같이, 표준 4-광 시야 디지털 입체 안저 사진을 사용한 ETDRS-DRSS 수준 47, 53, 61, 또는 65)를 보이는 연구 대상 눈; (4) 연구자에 따르면, 연구 대상 눈에, 하기를 비롯한, 시력 상실과 전형적으로 연관된 고위험 특징의 증거가 없는 경우: (i) 시신경의 1-원판 부위 내의 새로운 혈관, 또는 시신경 원판에 생긴 덜 광범위한 새로운 혈관 또는 다른 곳에 생긴 크기가 원판 부위의 절반 이상인 새로운 혈관과 연관된 유리질 또는 망막앞 출혈, 및 (ii) 임상 시험에서 연구 대상 눈에 전안부(예를 들어, 홍채 또는 각도) 신생혈관이 형성의 증거가 없음; (5) 연구 대상 눈에서 최상의-보정된 시력(BCVA)이 > 69 ETDRS 글자(대략적인 스넬렌 등가 20/40 또는 더 나은)인 경우; 주의: 양쪽 눈 모두 적격인 경우, 등록 이전에 연구자에 의해 결정되는 바와 같이, 연구 대상 눈은 참가자의 시력이 더 나쁜 쪽의 눈이 되어야 함; (6) 지난 6개월 내에 유리체내 항-VEGF 또는 속효성 스테로이드 주사가 투여되지 않았고, 선별 이전 3년에 걸쳐 문서로 기록된 주사가 10회 이하인 경우, 연구 대상 눈의 CI-DME의 사전 이력은 허용 가능함; (7) 임신 가능한 여성 파트너가 있는 성적으로 왕성한 남성 참가자는 선별 시기부터 벡터 투여 후 24주까지 의료적으로 허용된 형태의 파트너 피임과 함께 콘돔을 사용할 의지가 있어야 함; (9) 모든 연구 절차를 준수할 의지가 있고 이를 준수할 수 있어야 하며, 연구 기간 동안 시간을 낼 수 있어야 함; (10) 고지에 의한 동의서에 서명하여 이를 제공할 의지가 있고, 제공할 수 있어야 함.

6.7.3 탈락 기준

하기의 기준 중 어느 하나라도 적용되면 참가자는 본 연구에서 탈락된다: (1) 폐경후로 또는 수술을 받아 불임인 것으로 정의되지 않는, 임신 가능성이 있는 여성. 폐경후란 12개월 연속 생리가 없음으로 문서화된 것으로 정의된다. 수술 받은 불임 상태란 양측 난관 결찰/양측 나팔관 절제술, 양측 관 폐쇄성 절차, 자궁절제술, 또는 양측 난소절제를 겪은 것으로 정의됨; (2) 임상 시험에서 또는 다음의 역치, 하이델베르그 스펙트랄리스(Heidelberg Spectralis): 320 μm를 사용하는 연구 대상 눈의 중심영역 망막 내에, 연구자의 판단에 따라, 임의의 활성 CI-DME가 존재하는 경우; (3) 연구자에 따르면, DR 이외의 원인으로 연구 대상 눈에 신생혈관이 형성된 경우; (4) 연구자가 판단한 바와 같이, 기준선 FA 상의 주변 망막, 또는 중심와 또는 유두황반 부위의 > 50%를 포함하는 연구 대상 눈에 허혈의 증거가 있는 경우; (5) 연구자가 판단한 바아 같이, 연구 대상 눈에, 임상 검사 시 시신경 창백의 증거가 있는 경우; (6) 연구 대상 눈에 PRP의 임의의 증거 또는 문서로 기록된 이력이 있는 경우; (7) 외과적 절차를 방해할 수도 있는 연구 대상 눈의 안구 또는 안구주위 감염이 있는 경우; (8) 선별 후 6개월 이내에 외과적 개입을 요구할 수 있는 연구 대상 눈의 임의의 안구 병태(유리질 출혈, 선정 기준에 부합하지 않는 백내장, 망막 견인, 망막전막 등) 또는 연구자의 소견으로, 참가자에게 위험을 증가시킬 수 있거나, 시력 상실을 예방 또는 치료하기 위해 연구 중에 의료 또는 외과적 개입을 요구하거나, 연구 절차 또는 평가를 방해할 수 있는, 연구 대상 눈의 임의의 병태가 있는 경우; (9) 연구 대상 눈에서 망막 박리가 활발하거나, 그와 같은 이력이 있는 경우; (10) 선별 당시 연구 대상 눈에 이식물이 존재하는 경우(안구내 수정체[IOL]은 제외됨); (11) 유수정체 참가자의 경우, 펜타캠 장치에 의해 스캐닝하고 CRC에 의해 검증한 결과, 펜타캠 핵 단계화 점수가 ≥1이거나, 또는 섹션 6.7.5(c)에 약술된 기타 기준선 백내장 기준에 부합하지 않는 경우; (12) 참가자의 녹내장 전문가와의 상담을 통해 또는 문서로 기록된 녹내장 수술 이력을 통해 평가된 바에 따르면, 연구 대상 눈의 녹내장이 진행된 경우(즉, 이차례 이상의 적가 치료 또는 예컨대, 튜브 또는 션트와 같은 개입에도 불구하고, 통제되지 않음); (13) 선별 이전 12 주 내에 연구 대상 눈에 안구내 수술을 한 이력이 있는 경우; 이트륨 알루미늄 석류석(YAG) 피막절개술이 선별 이전 >10 주에 수행된 경우, 허용됨; (14) 선별 이전 6개월 이내에, 항-VEGF 요법을 비롯한, 연구 대상 눈의 유리체내 요법의 이력이 있는 경우 및 선별하기 전 3년 이내에 DME를 위한 연구 대상 눈의 10회 초과 사전 항-VEGF 또는 속효성 스테로이드 유리체내 주사가 문서화된 경우; (15) 선별 이전 6개월 내에 연구 대상 눈에 임의의 사전 유리체내 스테로이드를 주사한 경우, 선별 이전 12개월 내에 연구 대상 눈에 Ozurdex®를 투여한 경우, 또는 선별 이전 36개월 내에 연구 대상 눈에 Iluvien®을 투여한 경우; (16) 선별 이전 6개월 내에 임의의 사전 전신 항-VEGF 치료를 받았거나, 선별 후 향후 6개월 동안 전신 항-VEGF 요법을 사용할 계획이 있는 경우; (17) 망막 독성을 야기했던 것으로 알려진 요법, 또는 VA에 영향을 미칠 수 있거나 알려진 망막 독성이 있는 임의의 약물, 예를 들어, 클로로퀸 또는 하이드록시클로로퀸과의 동반 요법의 이력이 있는 경우; (18) 선별 이전 6개월 내에 심근경색증, 뇌혈관 사고, 또는 일과성 허혈 발작이 있었던 경우; (19) 최대 의료 치료에도 불구하고 통제되지 않는 고혈압(수축기 혈압 [BP] > 180 mmHg, 확장기 BP> 100 mmHg); 연구자 및/또는 일차 진료 의사에 의한 판단으로, BP가 180/100 mmHg 아래로 유지되고, 혈압강하 치료에 의해 안정화되는 경우, 상기 참가자는 적격성에 대한 선별심사를 다시 받을 수 있음을 유의해야 함; (20) 연구자의 소견으로, 본 연구의 참여가 불가능한 전신 병태(불량한 혈당 관리, 통제되지 않는 고혈압 등)가 있는 경우; (21) 연구자의 소견으로, 안구의 외과적 절차 또는 치유 과정을 방해할 수 있는 임의의 동반 치료를 받는 경우; (22) 선별 이전 5 년 안에 화학요법 및/또는 방사선이 필요하여 면역계를 위태롭게 할 수 있는 악성종양 또는 혈액성 악성종양의 이력이 있는 경우. 국한된 기저 세포 암종은 허용됨; (23) 연구자의 소견으로, 참가자의 안전성 또는 본 연구 중 모든 평가 및 추적을 완료할 수 있는 능력을 위태롭게 할 수 있는 중증, 만성, 또는 불안정한 의료 또는 심리적 병태가 있는 경우; (24) 선별 당시 다음의 실험실 값을 보인 임의의 참가자는 본 연구에서 탈락된다: (i) 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) / 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) > 2.5 Х정상 상한치(ULN), (ii) 총 빌리루빈 > 1.5 ХULN, 상기 참가자가 이전에 알려진 길버트 증후군의 병력이 있거나 총 빌리루빈의 < 35%인 접합된 빌리루빈을 나타내는 분별화된 빌리루빈의 이력이 있는 경우는 제외됨, (iii) 프로트롬빈 시간 > 1.5 Х ULN, 상기 참가자에 항응고제가 투여되는 경우는 제외됨. 항응고제가 투여되는 참가자는 현지 연구소에서 모니터링하고, 현지 관행에 따라 관리하여, 본 연구 절차를 위해 항응고제 요법을 중단하거나 쉬는 동안 투여함; 항응고제가 투여되는 참가자의 경우, 의료 모니터와의 상담이 필요함, (iv) 남성 참가자의 경우는 <10 g/dL의 헤모글로빈 및 여성 참가자의 경우는 < 9 g/dL, (v) 혈소판 <100 Х10³/μL, (vi) 예상된 사구체 여과율 < 30 mL/분/1.73 m²; (25) 투석 또는 신장 이식이 필요한 만성 신부전의 병력이 있는 경우; (26) 선별 이전 6개월 내에 집중적인 인슐린 치료(펌프 또는 다중 매일 주사)를 개시한 경우, 또는 선별 후 6개월 내에 개시할 계획이 있는 경우; (27) 의료 모니터에 의해 검증된 바와 같이, 상기 참가자를 위해 항응고제를 처방하는 의사 뿐만 아니라, 치료 연구자(즉, 망막 외과의사)의 소견으로, 작제물 II 투여를 위해 항응고 요법을 중단하는 것이 권고되지 않거나 또는 안전하지 않다고 간주되는 항응고 요법을 현재 투여받는 경우; (28) 작제물 II를 비롯한 임의의 다른 유전자 요법 연구에 참여한 경우, 등록 전 30일 내에 또는 연구 대상 생성물의 5 반감기 이내에(어느 쪽이든 더 긴쪽으로) 임의의 연구대상 생성물을 투여받은 경우, 또는 등록 후 6개월 내에 연구 대상 생성물을 사용할 임의의 계획이 있는 경우; (29) 라니비주맙 또는 그것의 임의의 구성요소에 알려진 과민증이 있는 경우.

6.7.4 연구 개입

적격 참가자는 작제물 II의 단일용량(용량 1) 또는 작제물 II의 단일 용량(용량 2)를 투여받도록 배정된다. 모든 참가자는 1일 차에 수술실에서 망막하 전달을 통해 연구 개입을 받는다.

본 연구의 참가자는 상호작용 반응 기술 시스템을 사용하여 선별 시점에 무작위로 선정(1:1)되어 작제물 II(용량 1) 또는 작제물 II(용량 2)를 투여받을 것이다.

6.7 .5. 사전 및 동반 요법

(a) 약물 및 요법

다음의 약물은 본 연구에 진입하기 전에 금지된다:

다음의 동반 약물은 본 연구 중에 금지된다:

● 안구 당뇨병 합병증의 치료를 위해 섹션 6.7.5(b)에 기재된 상황일 때를 제외하고, 선별 후 6개월 동안 연구 대상 눈에 항-VEGF 요법.

● 본 연구 중에 집중적인 인슐린 치료(펌프 또는 다중 매일 주사)의 개시는 허용되지 않는다; 이전에 나타내 바와 같이, 치료의 개시가 선별 이전 적어도 6개월 전에 일어났다면, 본 연구 중 상기 치료 요법의 변형이 허용된다.

(b) 안구 당뇨병 합병증의 치료

안구 당뇨병의 모든 합병증은 각 연구 센터 SOC마다 관리될 것이고, AE로 문서화되어야 한다.

본 연구 중에, SOC마다 항-VEGF 치료를 요구하는 당뇨병성 합병증이 발병한 참가자에게 필요한 경우, 요법이 시행될 수 있다. 필요하면, 상기 연구 센터는 FDA에서 승인받은 항-VEGF 요법을 직접 공급할 것이다. 투여된 항-VEGF 주사의 회수 및 모든 투여의 시기는 또한 공급원 문서 및 eCRF에 반드시 기록되어야 한다.

외과적 개입 SOC(공압 망막유착술, 냉동유착술, 또는 공막 돌용술 중 하나)를 요구하는 당뇨병성 합병증이 발병한 참가자는 공급원 문서 및 eCRF에 기록된 개입의 유형 및 개입의 시간을 반드시 가져야 한다.

(c) 백내장 형성에 대한 개입

유수정체 참가자에 대한 기준선 선별

선별 방문 중에, 적격성을 판단하고 오직 유수정체 참가자에 대한 참가자의 기준선 백내장 상태를 수립하기 위해 일련의 평가가 완료될 것이다. 이들 평가에는 하기가 포함된다: (1) SOC마다 참가자의 증상을 평가하기; (2) 임상 시험을 수행하여 백내장 연구자에 의해 임의의 임상적으로 유의한 백내장이 존재하는지 여부를 결정하기; (3) 눈 펜타캠 핵 단계화(PNS) 시스템으로 수정체 핵을 영상화하기. 본 연구에 포함시키는 경우, ≤1 의 펜타캠 등급이 허용 가능하다. 펜타캠 적격성은 상기 부위에서 결정되는 것이 좋고, 펜타캠 스캔은 검증을 위해 CRC에 제출되어야 함; 및 (4) 표준화된 적색 반사 전안부 사진으로 참가자의 수정체의 피질 및 후측 캡슐을 영상화하기(이것은 등급 매기기 및 연구 적격성의 확인을 위해 CRC에 제출될 것임). 피질 또는 후측 피막밑 수정체 이미지 등급이 ≥ 수준 2 AREDS(경증 혼탁)인 임의의 개체는 적격자가 아니다.

유수정체 참가자에 대한 연구 중 백내장 평가 및 개입

본 연구 중, 망막 연구자 및 백내장 연구자가 하기 명시된 제거 기준에 부합하는 백내장의 존재여부를 확인하기 위해 계속 참가자를 평가할 것이다.

AE로 보고될, 의료적으로 권고된 백내장 추출의 기준은 하기와 같다: 망막 연구자는 당뇨병성 안구 질환 및/또는 일반적인 망막 상태를 안전하게 모니터링하고 관리하기 위해 망막을 적절하게 관찰하거나 및/또는 영상화할 수 없다.

임의의 기준선후 방문 시 의료적으로 권고된 백내장 추출의 기준에 부합되는 경우, 백내장 연구자와 함께 연구 코디네이터에 의해 되도록 빠른 시일 내에 백내장 추출 수술을 위한 예정에 없던 방문이 계획될 것이다.

상기 참가자가 의료적으로 권고된 백내장 추출의 기준에 부합되지 않지만, 임의의 기준선후 방문 시 하기의 2가지 부차적 기준(하기의 BCVA 감소 또는 참가자-보고) 중 하나에 부합되는 경우, 연구 코디네이터는 확증적인 펜타캠 및 CRC-등급 수정체 사진(앞서 방문 시 아직 이용가능하지 않은 경우)을 획득하기 위해 되도록 빠른 시일 내로 상기 참가자에게 예정에 없던 방문 일정을 잡아주어야 한다:

1. BCVA 감소: 백내장 악화의 결과로 여겨지는, 본 연구 중 기록된 최상의 값(기준선 또는 기준선후)에 비해, BCVA의 > 5 ETDRS 글자의 감소.

2. 참가자-보고: 백내장 악화의 결과로 여겨지는, 참가자에 의해 보고된 생활방식 손상을 야기한 시각적 증상.

예정에 없던 방문 중에, ≥ 1 등급의 펜타캠 핵 단계화 또는 중등증 백내장(즉, 중앙 5 mm의 5% 관여)의 CRC-등급 피질 또는 후측 피막밑 적색 반사 수정체 영상화 시 기준선으로부터의 핵 경화증의 변화가 확인되는 경우, 백내장 추출에 대한 부차적인 기준이 충족된 것이다. 이것은 AE로 보고되어야 하고, 연구 코디네이터는 되도록 빠른 시일 내에 백내장 연구자에 의한 백내장 추출을 위해 예정에 없던 방문의 일정을 잡아야 한다.

합병증을 제한하려고 의도된 수술후 SOC 프로토콜이 준수될 것이다. 선호되는 SOC 프로토콜에는 하기가 포함된다: 1주 동안 1일 4회 플루오로퀴놀론의 적가, 1개월 동안 1일 2회 Ilevro(네파페낙)의 적가, 및 프레드니솔론 아세테이트로 1 주 동안은 1일 4회로 시작하여, 1주마다 1일 3회, 1일 2회 및, 최종적으로, 1일 1회로 줄여가는 스테로이드 줄이기. 참가자 안전성을 위해, 적절한 경우,그리고 의료 모니터의 승인을 받아, 대안적인 수술후 프로토콜이 사용될 수도 있다.

6.8 실시예 8: 중심 관여-당뇨병성 황반 부종(CI- DME )이 없는 당뇨병성 망막병증(DR)을 앓는 참가자에 1회 또는 2회의 맥락막상 공강 ( SCS ) 주사를 통해 전달된 작제물 II 유전자 요법의 효능, 안전성, 및 내약성을 평가하기 위한 2상 , 무작위 추출, 용량 증량, 관찰-제어 연구

6.8.1 목적 및 평가변수

6.8.2 선정 기준

본 연구에 투입되는 모든 참가자

평가된 시점에 수성 및 혈청 중 작제물 II TP 농도(ng/mL)가 치료 아암(arm) 및 연구 전반에 의해 설명적으로 요약될 것이다. 참가자는 본 연구에 적격자가 되기 위해 하기의 모든 기준에 부합해야 한다. 모든 안구 기준은 연구 대상 눈을 참조한다:

1. 1형 또는 2형 당뇨병에 부차적인 DR를 앓는 25~89세의 남성 또는 여성. 참가자는 헤모글로빈 A1c가 (두 번째 선별 방문 시 수득된 실험실 평가에 의해 또는 두 번째 선별 방문 이전 60일 내의 일자가 기입된 문서로 기록된 실험실 보고서에 의해 확인된 바와 같이) ≤10%이어야 한다.

2. 두 번째 선별 방문 이전 180일 내에 AAV8 NAbs에 대한 혈청 역가 결과가 음성이거나 또는 낮아야(≤300) 한다.

3. 연구자의 소견으로, 두 번째 선별 방문 후 적어도 6개월 동안 PRP 또는 항-VEGF 주사가 미뤄져도 안전하다고 보는 중등증-중증 NPDR, 중증 NPDR, 경증 PDR, 또는 중등증 PDR(CRC에 결정된 바와 같이, 표준 4-광 시야 디지털 입체 안저 사진을 사용한 ETDRS-DRSS 수준 47, 53, 또는 61)를 보이는 연구 대상 눈.

4. 연구자에 따르면, 연구 대상 눈에 하기를 비롯한 시력 상실과 전형적으로 연관된 고위험 특징의 증거가 없는 경우:

● 시신경의 1-원판 부위 내의 새로운 혈관

● 시신경 원판에 생긴 덜 광범위한 새로운 혈관 또는 다른 곳에 생긴 크기가 원판 부위의 절반 이상인 새로운 혈관과 연관된 유리질 또는 망막앞 출혈.

● 임상 시험에서 연구 대상 눈에 전안부(예를 들어, 홍채 또는 각도) 신생혈관형성의 증거가 없음.

5. 연구 대상 눈에서 최상의-보정된 시력(BCVA)이 > 69 ETDRS 글자(대략적인 스넬렌 등가 20/40 또는 더 나은)인 경우; 주의: 양쪽 눈 모두 적격인 경우, 등록 이전에 연구자에 의해 결정되는 바와 같이, 연구 대상 눈은 참가자의 시력이 더 나쁜 쪽의 눈이 되어야 한다.

6. 지난 6개월 내에 유리체내 항-VEGF 또는 속효성 스테로이드 주사가 투여되지 않았고, 두 번째 선별 방문 이전 3년에 걸쳐 문서로 기록된 주사가 10회 이하인 경우, 연구 대상 눈의 CI-DME의 사전 이력은 허용 가능하다.

7. 임신이 가능한 여성 파트너가 있는 성적으로 왕성한 남성 참가자는 두 번째 선별 방문으로부터 벡터 투여 후 24주까지 의료적으로 허용된 형태의 파트너 피임과 함께 콘돔을 사용할 의지가 있어야 한다.

8. 모든 연구 절차를 준수할 의지가 있고 이를 준수할 수 있어야 하며, 연구 기간 동안 시간을 낼 수 있어야 한다.

9. 고지에 의한 동의서에 서명하여 이를 제공할 의지가 있고, 제공할 수 있어야 한다.

48주 후 작제물 II로 전환하는 관찰 대조 아암 참가자

48주 후, 작제물 II를 사용한 치료로 전환하기로 선택한 라니비주맙 대조 아암의 참가자는 49주차에 방문 시 하기의 모든 기준에 부합해야 한다:

1. 연구 대상 눈은 무작위 추출 시 자격을 갖춘 눈이어야 한다.

2. 참가자가 전환될 코호트 요건에 대한 NAb 역가에 적합해야 한다.

3. 연구자의 소견으로, 참가자가 49주차에 라니비주맙에 대해 적절한 반응을 달성했어야 하고, 상기 연구자는 후원자와 상의 후 작제물 II로의 전환을 권고해야 한다.

4. 중등증-중증 NPDR, 중증 NPDR, 또는 경증 PDR(CRC에 의해 결정되는 바와 같이, 표준 4-광 시야 디지털 입체 안저 사진을 사용하는 ETDRS-DRSS 수준 47, 53, 또는 61)를 가진 연구 대상 눈.

5. 연구자에 따르면, 연구 대상 눈에, 하기를 비롯하여, 시력 상실과 전형적으로 연관된 고위험 특징의 증거가 없는 경우:

● 시신경의 1-원판 부위 내의 새로운 혈관, 또는 시신경 원판에 생긴 덜 광범위한 새로운 혈관 또는 다른 곳에 생긴 크기가 원판 부위의 절반 이상인 새로운 혈관과 연관된 유리질 또는 망막앞 출혈.

6. 임상 시험에서 연구 대상 눈에 전안부(예를 들어, 홍채 또는 각도) 신생혈관형성의 증거가 없음.

7. 연구 대상 눈에서 BCVA가 > 69 ETDRS 글자(대략적인 스넬렌 등가 20/40 또는 더 나은)인 경우.

8. 여성은 폐경후(적어도 12개월 연속 생리가 없는 것으로 정의됨)이거나 또는 수술을 받아(즉, 양측 난관 결찰/양측 나팔관 절제술, 양측 관 폐쇄성 절차, 자궁절제술, 또는 양측 난소절제) 불임이어야 한다. 그렇지 않으면, 여성은 1일 차에 음성 혈청 및 소변 임신 테스트를 해야 하고, 본 연구 중에 추가의 임신 테스트를 실행할 의지가 있어야 한다.

9. 모든 임신 가능한 여성(및 남성 파트너)은 매우 효과적인 피임 방법을 사용할 의지가 있어야 하고, 임신 가능한 여성과 성적 관계를 맺은 남성 참가자는 54주차부터 작제물 II 투여 후 24주차까지 콘돔을 사용할 의지가 있어야 한다.

6.8.3 탈락 기준

연구에 투입되는 모든 참가자

참가자는 다음의 기준 중 어느 하나라도 적용되면 본 연구에서 탈락된다:

1. 임신이 가능한 여성(즉, 폐경후가 아니거나 또는 수술을 받아 불임인 상태가 아닌 여성)은 본 임상 연구에서 탈락된다.

● 폐경후란 12개월 연속 생리가 없음으로 기록된 것으로 정의된다.

● 수술을 받아 불임인 상태는 양측 난관 결찰/양측 나팔관 절제술, 양측 관 폐쇄성 절차, 자궁절제술, 또는 양측 난소절제를 받은 것으로 정의된다.

2. 임상 시험에서 또는, CRC에 의해 평가된 SD-OCT에 의해 결정된 바와 같이, 다음의 역치를 사용하는 연구 대상 눈의 중심영역 망막 내에, 연구자에 의해 결정된 바와 같이, 임의의 활성 CI-DME가 존재하는 경우:

● 하이델베르그 스펙트랄리스(Heidelberg Spectralis): ≥320 μm

3. 연구자에 따르면, DR 이외의 다른 원인으로 인해 연구 대상 눈에서 신생혈관이 형성된 경우.

4. 연구자에 의해 결정된 바와 같이, 임상 시험에서 연구 대상 눈의 시신경 창백의 증거가 있는 경우.

5. 연구 대상 눈의 PRP 또는 망막 레이저의 임의의 증거 또는 문서로 기록된 이력이 있는 경우.

6. SCS 절차를 방해할 수 있는 연구 대상 눈의 안구 또는 안구주위 감염이 있는 경우.

7. 두 번째 선별 방문 후 6　개월 내에 외과적 개입(유리질 출혈, 백내장, 망막 견인, 망막전막 등)을 요구할 수 있는 연구 대상 눈의 임의의 안구 병태, 또는 연구자의 소견으로, 참가자에게 위험을 증가시킬 수 있거나, 시력 상실을 예방 또는 치료하기 위해 연구 중에 의료 또는 외과적 개입을 요구하거나, 연구 절차 또는 평가를 방해할 수 있는, 연구 대상 눈의 임의의 병태가 있는 경우.

8. 연구 대상 눈에서 망막 박리가 활발하거나, 그와 같은 이력이 있는 경우.

9. 두 번째 선별 방문 시 연구 대상 눈에 이식물이 존재하는 경우(안구내 수정체[IOL]은 제외됨).

10. 사전에 유리체 절제술을 받은 참가자인 경우.

11. 연구 대상 눈에 IOP > 23 mmHg으로 정의되며, 이차례 IOP-저하 약물로 제어되지 않는, 진행된 녹내장이 있는 경우, 녹내장을 치료하기 위한 임의의 침습 절차가 시행된 경우(예를 들어,　션트, 튜브, 또는 MIGS 디바이스; 그러나, 선택적 레이저 섬유주절제술 및 아르곤 레이저 섬유주 성형술은 허용됨), 또는 중심 주시를 침입하는 시야 손실이 있는 경우.

12. 두 번째 선별 방문 이전 12주 내에 연구 대상 눈의 안구내 수술의 이력이 있는 경우; 이트륨 알루미늄 석류석(YAG) 피막절개술는 두 번째 선별 방문 이전 >10 주에 수행된 경우, 허용된다.

13. 두 번째 선별 방문 이전 6개월 이내에, 항-VEGF 요법을 비롯한, 연구 대상 눈의 유리체내 요법의 이력이 있는 경우, 및 두 번째 선별 방문 전 3년 이내에연구 대상 눈에 10회를 초과하여 시행된 사전 항-VEGF 또는 속효성 스테로이드 유리체내 주사가 문서화된 경우.

14. 두 번째 선별 방문 이전 6개월 내에 연구 대상 눈에 임의의 사전 유리체내 스테로이드를 주사한 경우, 두 번째 선별 방문 이전 12개월 내에 연구 대상 눈에 Ozurdex®를 투여한 경우, 또는 두 번째 선별 방문 이전 36개월 내에 연구 대상 눈에 Iluvien®을 투여한 경우.

15. 두 번째 선별 방문 이전 6개월 내에 임의의 사전 전신 항-VEGF 치료를 받았거나, 두 번째 선별 방문 후 향후 48주 동안 전신 항-VEGF 요법을 사용할 계획이 있는 경우.

16. 망막 독성을 야기했던 것으로 알려진 요법, 또는 VA에 영향을 미칠 수 있거나 알려진 망막 독성이 있는 임의의 약물, 예를 들어, 클로로퀸 또는 하이드록시클로로퀸과의 동반 요법의 이력이 있는 경우.

17. 두 번째 선별 방문 이전 6개월 내에 심근경색증, 뇌혈관 사고, 또는 일과성 허혈 발작이 있었던 경우.

18. 최대 의료 치료에도 불구하고 통제되지 않는 고혈압(수축기 혈압 [BP] > 180 mmHg, 확장기 BP> 100 mmHg)이 있는 경우; 연구자 및/또는 일차 진료 의사에 의해 판단된 바와 같이, BP가 180/100 mmHg 아래로 유지되고, 혈압강하 치료에 의해 안정화되는 경우, 상기 참가자는 적격성에 대한 심사를 다시 받을 수 있음을 유의해야 한다.

19. 연구자의 소견으로, 본 연구의 참여가 불가능한 전신 병태(불량한 혈당 관리, 통제되지 않는 고혈압 등)가 있는 경우.

20. 연구자의 소견으로, 안구의 외과적 절차 또는 치유 과정을 방해할 수 있는 임의의 동반 치료를 받는 경우.

21. 두 번째 선별 방문 이전 5 년 안에 화학요법 및/또는 방사선이 필요하여 면역계를 위태롭게 할 수 있는 악성종양 또는 혈액성 악성종양의 이력이 있는 경우. 국한된 기저 세포 암종은 허용된다.

22. 연구자의 소견으로, 참가자의 안전성 또는 본 연구 중 모든 평가 및 추적을 완료할 수 있는 능력을 위태롭게 할 수 있는 중증, 만성, 또는 불안정한 의료 또는 심리적 병태가 있는 경우

23. 두 번째 선별 방문 시 다음의 실험실 값을 보인 임의의 참가자는 본 연구에서 탈락된다:

● 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) / 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) > 2.5 Х 정상 상한치(ULN).

● 총 빌리루빈 > 1.5 X ULN, 상기 참가자가 이전에 알려진 길버트 증후군의 병력이 있거나 총 빌리루빈의 < 35%인 접합된 빌리루빈을 나타내는 분별화된 빌리루빈의 이력이 있는 경우는 제외됨 .

● 프로트롬빈 시간 > 1.5 x ULN, 상기 참가자에 항응고제가 투여되는 경우는 제외됨.

● 남성 참가자의 경우는 <10 g/dL의 헤모글로빈 및 여성 참가자의 경우는 < 9 g/dL.

● 혈소판 <100 Х 10³/μL.

● 예상된 사구체 여과율 < 30 mL/분/1.73 m².

24. 투석 또는 신장 이식이 필요한 만성 신부전의 병력이 있는 경우.

25. 두 번째 선별 방문 이전 6개월 내에 집중적인 인슐린 치료(펌프 또는 다중 매일 주사)를 개시한 경우, 또는 1일 차 후 48주 내에 개시할 계획이 있는 경우.

26. 작제물 II를 비롯한 임의의 다른 유전자 요법 연구에 참여한 경우, 등록 전 30 일 내에 또는 연구 대상 생성물의 5 반감기 이내에(어느 쪽이든 더 긴쪽으로) 임의의 연구대상 생성물을 투여받은 경우, 또는 등록 후 6개월 내에 연구 대상 생성물을 사용할 임의의 계획이 있는 경우.

27. 라니비주맙 또는 그것의 임의의 구성요소에 알려진 과민증이 있는 경우.

48주 이후 작제물 II로 전환하는 관찰 대조 아암 참가자

48주 후, 작제물 II를 사용한 치료로 전환하기로 선택한 관찰 대조 아암의 참가자는, 당뇨병성 합병증에 대해 SOC로서 시행된 연구 대상 눈의 치료(즉,연구 대상 눈에 SOC를 받는 것은 49주차에 작제물 II로의 전환 시 배제될 것이 아니다) 이외에, 선별과 관련하여 명시된 임의의 탈락 기준에 부합하는 경우, 전환하기에 적합하지 않다.

6.8.4 시행된 연구 개입(들)

적격 참가자는 연구 대상 눈에 작제물 II의 단일 용량(용량 1 또는 용량　2)을 투여받도록 배정되거나, 또는 오직 관찰만을 위해 추적된다.

6.9 실시예 9: 피그에서 주사를 모니터하기 위한 열화상 카메라의 사용

FLIR T530 적외선 열화상 카메라를 사용하여 살아있는 피그의 안구 주사 후 열 프로파일을 특성화하였다. 대안적으로, FLIR T420, FLIR T440, Fluke Ti400 또는 FLIRE60 적외선 열화상 카메라가 사용된다. 실온 염수(68-72℉)의 맥락막상(도 6), 맥락막상, 유리체내, 및 안구외 유출 주사가 연구에서 평가되었다. 용량 부피는 냉장고에서 주사를 위한 실온까지 용액을 주입할 때마다 100 μL였다.

적외선 카메라 렌즈에서 안구 표면까지의 거리는 약 1피트로 설정되었다. 보기용 카메라의 수동 온도 범위는 ~80-90℉로 설정되었다. 영상화 조작자는 카메라를 잡고 비디오 녹화 중 주사 부위를 겨냥한 중앙 화면 커서를 설정하였다. 피그는 더 나은 시야를 위해 안구를 돌출시키기 위해 염수를 안구뒤 주사하고, 주사 부위의 공막을 노출시키기 위해 눈꺼풀을 자르고 다시 집어넣었다. 열 비디오 기록 동안 철제 필터를 사용하였다.

성공적인 맥락막상 주사는 하기를 특징으로 하였다: (a) 어두운 색상의 느리고 넓은 방사상 확산, (b) 시작 시 매우 어두운 색상, 및 (c) (c) 주사액의 밝은 색으로의 점진적인 변화, 즉 밝은 색에 의해 나타나는 온도 구배. 성공하지 못한 맥락막위 주사는 하기를 특징으로 할 수 있다: (a) 어두운 색의 퍼짐 없음, 및 (b) 주사 부위에 국한된 색의 미미한 변화. 성공적인 유리체내 주사는 하기를 특징으로 할 수 있다: (a) 어두운 색의 퍼짐 없음, (b) 주사 부위에 국한된 매우 어두운 색으로의 초기 변화, 및 (c) 시간이 지남에 따라 주사 후 발생하는 전체 눈의 진한 색으로의 점진적이고 균일한 변화. 안구외 유출은 하기를 특징으로 하였다: (a) 눈의 외부 상에서 외부에서 빠르게 흐르는 스트림, (b) 초기에 매우 어두운 색, 및 (c) 밝은 색으로의 빠른 변화.

6.10 실시예 10: 인간 환자에서 주사를 모니터하기 위한 열화상 카메라의 사용

당뇨병성 망막병증(DR)을 나타내는 대상체는 3 개월 동안 유리체액에서 적어도 0.330 μg/mL의 Cmin로 이식유전자 산물의 농도를 생성하기에 충분한 용량으로 (예를 들어, 망막하 투여, 맥락막상 투여 또는 유리체내 투여에 의해) 라니비주맙 Fab를 인코딩하는 AAV8을 투여한다. FLIR T530 적외선 열화상 카메라는 절차 중 주사를 평가하는 데 사용되며 주사 후 평가하여 투여가 성공적으로 완료되었는지 또는 투여 오용을 확인하는 데 사용할 수 있다. 대안적으로, FLIR T420, FLIR T440, Fluke Ti400 또는 FLIRE60 적외선 열화상 카메라가 사용된다. 치료 후, 대상체는 임상 효과의 징후 및 DR의 징후 및 증상의 개선에 대해 임상적으로 평가된다.

6.11 실시예 11: 작제물 II 유전자 치료의 효능, 안전성, 및 내약성을 평가하기 위한 단계 2, 무작위화 , 용량-증량, 관찰-제어 연구는 중추 관여된-당뇨병성 황반 부종 (CI- DME ) 없이 당뇨 망막병증 (DR)을 갖는 참가자에서의 1 또는 2개의 맥락막상 공간 (SCS) 주사를 통해 전달된다.

이 실시예는 실시예 8의 업데이트된 버전이며 당뇨병성 망막병증(DR)이 있는 참가자에서 작제물 II 유전자 요법의 2a상 용량 평가의 개요를 제공한다.

6.11.1 목적 및 평가변수

6.11.2 포함 기준

이 연구에 참여하려면 참가자가 다음 기준을 모두 충족해야 한다. 모든 안구 기준은 연구 안구를 참조한다:

1. 제1형 또는 제2형 당뇨병에 이차적인 DR이 있는 25-89세의 남성 또는 여성. 참가자의 헤모글로빈 A1c ≤ 10%(선별 방문 2에서 얻은 실험실 평가 또는 선별 방문 2 전 60일 이내의 문서화된 실험실 보고서에 의해 확인됨)을 가져야 한다.

2. 조사자의 의견으로, 방문 2를 스크리닝한 후 적어도 6개월 동안 PRP 또는 항-VEGF 주사가 안전하게 연기될 수 있는 중등도-중증 NPDR, 중증 NPDR, 또는 경증 PDR (CRC에 의해 결정된 바와 같은 표준 4-광시야 디지털 입체적인 안저 사진을 사용하는 ETDRS-DRSS 레벨 47, 53, 또는 61)을 갖는 연구 눈.

3. 조사자에 따르면 다음을 포함하여 일반적으로 시력 상실과 관련된 고위험 특성에 대한 연구 눈의 증거가 없다:

● 시신경의 1-디스크 영역 내의 새로운 혈관

● 시신경 유두의 덜 광범위한 새로운 혈관 또는 유두 면적의 절반 이상의 크기인 다른 곳의 새로운 혈관과 관련된 유리체 또는 망막앞 출혈.

● 임상 시험에서 연구 안구에서 안구 앞부분 (예를 들어, 홍채 또는 각) 신생혈관형성의 증거가 없다.

4. AAV8 NAb에 대해 음성 또는 낮은(≤ 300) 혈청 역가 결과가 있어야 한다.

5. ≥ 69 ETDRS 글자(대략 스넬렌 등가 20/40 이상)의 연구 눈에서의 최상의 교정 시력; 유의: 양쪽 눈이 적격인 경우, 연구 눈은 등록 전에 조사자에 의해 결정된 바와 같이 참가자의 더 나쁜-관찰 눈이어야 한다.

6. 연구 눈에서 CI-DME의 이전 병력은 유리체내 항-VEGF 또는 단기 작용 스테로이드 주사가 마지막 6개월 이내에 제공되지 않았고, 10회 이하의 문서화된 주사가 방문 2를 스크리닝하기 3년 전에 제공되었다면 허용가능하다.

7. 임신 가능성이 있는 여성 파트너를 갖는 경험적으로 활성인 남성 참여자는 벡터 투여 후 24주까지 스크리닝 방문 2로부터 의학적으로 허용되는 형태의 파트너 피임을 더한 콘돔을 사용하고자 할 것이다.

8. 모든 연구 절차를 기꺼이 따르고 준수할 수 있어야 하며 연구 기간 동안 사용할 수 있어야 한다.

9. 서명된 고지에 의한 동의를 제공할 의지와 능력이 있어야 한다.

6.11.3 제외 기준

참가자는 다음 기준 중 하나에 해당하는 경우 연구에서 제외된다:

1. 가임 잠재성의 여성(즉, 폐경후 또는 수술적으로 멸균되지 않은 여성)은 이 임상 연구에서 제외된다.

● 폐경 후는 월경이 없는 연속 12개월을 문서화하는 것으로 정의된다.

● 수술적 불임은 양측 난관 결찰/양측 나팔관절제, 양측 난관 폐쇄 절차, 자궁절제술, 또는 양측 난소절제을 받은 것으로 정의된다.

2. 하기 역치를 사용하여, CRC에 의해 평가된 SD-OCT에 의해 결정된 바와 같이, 임상 시험시 또는 연구 눈의 황반 중심부 두께(CST) 내에서 연구자에 의해 결정된 임의의 활성 CI-DME의 존재:

● 하이델베르그 스펙트랄리스(Heidelberg Spectralis): ≥ 320 μm

3. 조사자당, DR 이외의 원인으로 인한 연구 눈의 신생혈관형성.

4. 조사자에 의한 결정 시, 임상 시험에서 연구 눈의 시신경 창백에 대한 증거.

5. 연구 눈에서 PRP 또는 망막 레이저의 모든 증거 또는 문서화된 이력.

6. SCS 절차를 방해할 수 있는 연구 눈의 안구 또는 안구주위 감염.

7. 선별 방문 2 (유리체 출혈, 백내장, 망막 견인, 망막앞 막 등) 후 6개월 이내에 수술적 개입을 필요로 할 수 있는 연구 눈에서의 임의의 안구 병태, 또는 조사자의 의견에 있어서, 참가자에 대한 위험을 증가시킬 수 있거나, 시력 상실을 예방 또는 치료하기 위해 연구 동안 의학적 또는 외과적 개입 중 어느 하나를 필요로 하거나, 연구 절차 또는 평가를 방해할 수 있는 연구 눈의 임의의 병태.

8. 연구 눈에서 망막 박리의 활성 또는 이력.

9. 선별 방문 2에서 연구 눈에 이식물의 존재(안구내 수정체 제외).

10. 이전에 유리체절제 수술을 받은 참가자.

11. 2개의 IOP-저하 약물에 의해 제어되지 않는, IOP > 23 mmHg에 의해 정의된 바와 같은 연구 눈의 진전된 녹내장, 녹내장을 치료하기 위한 임의의 침습적 절차 (예를 들어, 션트, 튜브, 또는 MIGS 장치; 그러나, 선택적 레이저 섬유주절제술 및 아르곤 레이저 섬유주성형술이 허용됨), 또는 중앙 고정에 대한 시야 손실 침식.

12. 선별 방문 2 전 12주 이내에 연구 눈에서 안내 수술의 이력; 이트륨 알루미늄 석류석(YAG) 수정체낭절개는 선별 방문 2 이전에 수행된 경우 허용된다.

13. 선별 방문 2 전 6개월 이내에 항-VEGF 요법을 포함하는, 연구 눈에서의 유리체내 요법의 이력, 및 선별 방문 2 후 36개월 이내에 연구 눈에서의 10회 초과의 선행 항- VEGF 또는 단기 작용 스테로이드 유리체내 주사의 문서화.

14. 선별 방문 2 전 6개월 이내에 연구 눈에서의 임의의 이전의 유리체내 스테로이드 주사, 선별 방문 2 전 12개월 이내에 Ozurdex^®의 연구 눈에서의 투여, 또는 선별 방문 2 전 36개월 이내에 Iluvien^®의 연구 눈에서의 투여.

15. 선별 방문 2 후 다음 48주 동안 전신 항-VEGF 요법 이전 6개월 이내의 모든 이전의 전신 항-VEGF 치료 또는 사용할 계획.

16. 망막 독성을 야기한 것으로 알려진 요법의 이력, 또는 VA에 영향을 미칠 수 있는 임의의 약물 또는 알려진 망막 독성, 예를 들어 클로로퀸 또는 히드록시클로로퀸과의 병용 요법.

17. 선별 방문 2 전 6개월 이내에 심근 경색, 뇌혈관 사고 또는 일과성 허혈 발작.

18. 최대 의학적 치료에도 불구하고, 조절되지 않은 고혈압(수축기 혈압[BP] > 180 mmHg, 확장기 BP > 100 mmHHg); BP가 180/100mmHg 미만으로 되고, 조사자 및/또는 일차 진류 의사에 의해 결정된 바와 같이, 혈압강하 치료에 의해 안정화되는 경우, 참여자는 적격성에 대해 재스크리닝될 수 있다.

19. 조사자의 의견으로 연구 참여를 방해하는 전신 상태(불량 혈당 조절, 조절되지 않는 고혈압 등).

20. 조사자의 의견에 따라 안과 절차 또는 치유 과정을 방해할 수 있는 모든 동반 치료.

21. 선별 방문 2 전 5년 동안 화학요법 및/또는 방사선을 필요로 하는 면역계를 손상시킬 수 있는 요법 또는 혈액 악성 종양의 유무에 관계없이 악성 종양의 이력. 국소 기저 세포 암종은 허용될 것이다.

22. 조사자의 의견에 있어서, 연구에서 모든 평가 및 추적을 완료하는 참가자의 안전성 또는 능력을 손상시킬 수 있는 심각한, 만성, 또는 불안정한 의학적 또는 심리적 상태를 갖는다.

23. 선별 방문 2에서 다음 제외 실험실 값 중 하나를 충족한다.

● 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 및/또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) > 2.5 × 정상 상한 (ULN).

● 참가자가 이전에 길버트 증후군의 병력이 있고 결합 빌리루빈이 총 빌리루빈의 < 35%인 분획 빌리루빈이 없는 경우, 총 빌리루빈 > 1.5 × ULN.

● 참가자가 항응고제를 사용하지 않는 한 프로트롬빈 시간 > 1.5 × ULN.

● 남성 참가자의 경우 헤모글로빈 <10 g/dL 및 연성 참가자의 경우 < 9 g/dL.

● 혈소판 <100 × 10³/μL.

● 예상 사구체 여과율 < 30 mL/min/1.73 m².

24. 투석 또는 신장 이식이 필요한 만성 신부전의 이력.

25. 집중적인 인슐린 치료 (펌프 또는 매일 다수회 주사)의 개시가 선별 방문 2 전 6개월 이내에 또는 1일차의 48주 이내에 그렇게 하도록 계획된다.

26. 작제물 II를 포함하는 임의의 다른 유전자 치료 연구에서의 참여, 또는 등록 전 30일 이내에 임의의 조사 생성물의 수령 또는 조사 생성물의 5 반감기, 어느 쪽이든 더 길거나 또는 등록 후 6개월 이내에 조사 생성물을 사용하기 위한 임의의 계획.

27. 라니비주맙 또는 그 구성요소 중 임의의 것에 대한 알려진 과민증.

6.11.4 투여된 연구 개입(들)

적격한 참가자는 연구 눈에 작제물 II의 단일 용량(용량 1 또는 용량 2)을 받도록 할당되거나 관찰만을 위해 추적될 것이다. 작제물 II에 대한 정보는 다음과 같다.

6.11.5 벡터 쉐딩

혈액(혈청), 소변 및 눈물의 샘플링은 벡터 농도 측정을 위해 작제물 II 참가자에 대해 수행될 것이다. 샘플의 처리, 취급 및 배송에 대한 추가 정보는 Investigator Laboratory Manual을 참조한다.

이러한 생물학적 유체에서 수집된 쉐딩 데이터는 표적 환자 집단에서 작제물 II의 쉐딩 프로파일을 제공하고 치료받지 않은 개체에게 전염될 가능성을 추정하는 데 사용된다. 쉐딩은 정량적 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 측정될 것이다.

6.12 실시예 12: 사이노몰구스 원숭이에서 작제물 II의 독성 연구

사이노몰구스 원숭이에서 작제물 II는 미량주사기 장치를 사용하여 최대 3 × 10¹² GC/눈의 용량으로 맥락막상 투여되었다. 동물은 3개월 후에 평가되었다.

이 연구에서, 미량주사기는 작제물 II를 SCS 공간에 성공적으로 투여했으며 장치 또는 작제물 II의 사용과 관련된 관찰된 부작용 발견은 없었다. 망막 및 RPE/맥락막의 형질도입에 의해 결정된 광범위한 생체분포가 있었고, 방수 및 유리체액 모두에서 검출 가능한 TP(항-VEGF Fab)가 있었다. 이 연구에서 관찰된 역효과 수준(NOAEL)은 테스트된 최고 용량인 3 × 10¹²GC/눈이었다. 3-개월 비인간 영장류(NHP) 독성 연구의 모든 용량에서, 벡터 DNA가 간에서 검출되었으며, 이는 벡터가 맥락막상 주사 후 맥락막모세혈관을 통해 체순환계에 들어갈 수 있음을 나타낸다. 테스트한 최고 용량(3 × 10¹² GC/눈)에서, 추가적인 말초 조직(후두엽, 해마, 시상, 심장, 폐, 신장 및 난소)에서도 낮은 수준의 벡터 DNA가 검출되었다. 그러나 항-VEGF Fab의 혈청 농도 증가 또는 전신 독성의 임의의 증거는 없었다. 더욱이, 유전자 요법에서 흔히 볼 수 있는 관찰인 연구 종료 시 전혈에서의 벡터 DNA의 존재는 관찰된 말초 생체분포의 일부에 영향을 미쳤을 수 있다.

요약하면, NHP에서 맥락막상 투여의 경우, NOAEL은 테스트된 최고 용량인 3 × 10¹² GC/눈이었다. 간에서 벡터 DNA의 존재는 혈청 항-VEGF Fab의 증가가 없었기 때문에 의미가 알려지지 않았다. 최고 용량에서만, 낮은 수준의 벡터 DNA가 추가 말초 조직에서도 검출되었으며 벡터 DNA가 동일한 시점에 혈액에서 검출되었기 때문에 유의성이 알려지지 않았다. 따라서 말초 조직의 생체분포를 위해, 체중 기반 안전 여유가 사용되어 왔다. 최고 용량인 3 × 10¹² GC/눈 또는 1.5 × 10¹² GC/kg에서, 간에 있는 벡터 DNA와 상관관계가 있는 TP의 전신 농도 증가에 대한 증거나 관찰된 간 변화의 증거는 없었다. 따라서 인간의 경우, 최대 1.5 × 10¹¹ GC/kg의 용량이 허용되는 것으로 간주되고, 이는 3-개월 독성 연구에서 투여된 최고 용량보다 10배 낮은 용량과 동일하기 때문이다.

SCS 미량주사기 내에서, 100 μL의 단일 주입 부피가 인간에게 쉽게 투여될 수 있다. 각 마이크로니들은 바늘당 총 100 μL로 눈금이 매겨져 있다.

7. 등가물

본 발명이 그 특정 구현예를 참조하여 상세하게 설명되지만, 기능적으로 동등한 변형이 본 발명의 범위 내에 있다는 것이 이해될 것이다. 실제로, 본원에 도시되고 설명된 것들에 더하여 다양한 본 발명의 변형들이 전술한 설명 및 첨부 도면들로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위에 속하는 것으로 의도된다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음 청구범위에 포함되도록 의도된다.

본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 발행된 특허 및 기타 문서는 마치 각 개별 공보, 특허 출원, 발행된 특허 또는 기타 문서가 전체가 참조로 본원에 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENXBIO Inc. <120> TREATMENT OF DIABETIC RETINOPATHY WITH FULLY-HUMAN POST-TRANSLATIONALLY MODIFIED ANTI-VEGF Fab <130> 12656-127-228 <140> TBA <141> 2020-08-25 <150> US 62/891,799 <151> 2019-08-26 <150> US 62/902,352 <151> 2019-09-18 <150> US 63/004,258 <151> 2020-04-02 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ranibizumab Fab Amino Acid Sequence - light chain <400> 1 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe 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Claims

당뇨병성 망막병증 (DR)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 눈의 망막하 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 발현 벡터는 6.2 × 10¹¹ GC/mL의 농도에서 눈당 약 1.6 × 10¹¹ GC 또는 1.0 × 10¹² GC/mL의 농도에서 눈당 약 2.5 × 10¹¹ GC의 단일 용량으로 망막하 전달을 통해 투여되고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 그리고 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여 단계는 망막하 약물 전달 장치를 이용하여 망막하 공간에 발현 벡터를 주입하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여 단계는 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 망막에 전달하는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량은 상기 인간 대상체의 인간 망막 세포에 의해 생성되는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량은 상기 인간 대상체의 외부 제한 막에서 인간 광수용체 세포, 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포, 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성되는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 인간 광수용체 세포는 원추 세포 및/또는 간상 세포인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포는 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 감광성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교세포인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 CB7 프로모터를 포함하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 발현 벡터는 작제물 II인, 방법.
제형 완충제 (pH=7.4)에서 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터의 농도 6.2 × 10¹¹ GC/mL에서 1.6 × 10¹¹ GC 또는 농도 1.0 × 10¹² GC/mL에서 2.5 × 10¹¹ GC를 포함하는 단일 용량 조성물로서, 상기 제형 완충제는 둘베코 인산염 완충 식염수 및 0.001% 플루로닉 F68을 포함하고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 그리고 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터인, 단일 용량 조성물.
제10항에 있어서, 상기 발현 벡터는 작제물 II인, 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계 후에, 적외선 열화상 카메라를 사용하여 눈에 주입된 물질의 안구 주사 후 열 프로파일을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제12항에 있어서, 상기 적외선 열화상 카메라는 FLIR T530 적외선 열화상 카메라인, 방법.
DR로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 눈의 망막하 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 눈당 약 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피의 발현 벡터는 이중 맥락막상 주사에 의해 투여되고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 그리고 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터인, 방법.
DR로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 눈의 망막하 공간에 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 눈당 약 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피의 발현 벡터는 이중 맥락막상 주사에 의해 투여되고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 그리고 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터인, 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 투여 단계는 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 망막에 전달하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량은 상기 인간 대상체의 인간 망막 세포에 의해 생성되는, 방법.
제17항에 있어서, 상기 항-hVEGF 항체의 치료적 유효량은 상기 인간 대상체의 외부 제한 막에서 인간 광수용체 세포, 수평 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포, 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생성되는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 인간 광수용체 세포는 원추 세포 및/또는 간상 세포인, 방법.
제19항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포는 난쟁이 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 감광성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교세포인, 방법.
제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 CB7 프로모터를 포함하는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 발현 벡터는 작제물 II인, 방법.
제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계 후에, 적외선 열화상 카메라를 사용하여 눈에 주입된 물질의 안구 주사 후 열 프로파일을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 적외선 열화상 카메라는 FLIR T530 적외선 열화상 카메라인, 방법.
제형 완충제 (pH=7.4)에서 항-인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 항체를 인코딩하는 발현 벡터의 눈당 약 6.0 × 10¹⁰개의 게놈 카피, 눈당 1.6 × 10¹¹개의 게놈 카피, 눈당 2.5 × 10¹¹개의 게놈 카피, 눈당 5.0 × 10¹¹개의 게놈 카피, 또는 눈당 3.0 × 10 ¹² 개의 게놈 카피를 포함하는 단일 용량 조성물로서, 상기 제형 완충제는 둘베코 인산염 완충 식염수 및 0.0001% 플루로닉 F68을 포함하고, 상기 항-hVEGF 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 그리고 상기 발현 벡터는 AAV8 벡터인, 단일 용량 조성물.
제25항에 있어서, 상기 발현 벡터는 작제물 II인, 조성물.
제1항 내지 제9항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 발현 벡터의 쉐딩을 초래하지 않는, 방법.
제1항 내지 제9항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 1000 미만, 500 미만, 100 미만, 50 미만 또는 10 미만의 발현 벡터 유전자 카피/5 μL는 투여 후 임의의 시점에 생물학적 유체에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능한, 방법.
제1항 내지 제9항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 210개의 발현 벡터 유전자 카피/5 μL 이하는 투여 후 임의의 시점에 생물학적 유체에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능한, 방법.
제1항 내지 제9항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 1000 미만, 500 미만, 100 미만, 50 미만 또는 10개 미만의 벡터 유전자 카피/5 μL는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14주까지 생물학적 유체에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능한, 방법.
제1항 내지 제9항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 유전자 카피는 상기 벡터의 투여 후 14주까지 생물학적 유체에서 검출 가능하지 않은, 방법.
제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 유체는 눈물, 혈청 또는 소변인, 방법.