TW202400803A - 載體化抗補體抗體與補體劑及其投與 - Google Patents

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Abstract

本發明描述用於將結合於C3或C5之完全人類轉譯後修飾之治療性單株抗體或其抗原結合片段遞送至人類個體以治療眼適應症，尤其AMD的組合物及方法。亦提供用於將hCHL1遞送至人類個體以治療眼適應症，尤其AMD的組合物及方法。編碼該抗體之核苷酸序列在靶向眼組織細胞用於表現轉殖基因之rAAV載體中遞送。

Description

載體化抗補體抗體與補體劑及其投與
描述組合物及方法，其用於遞送完全人類轉譯後修飾(HuPTM)蛋白，包括結合於C3或C5之治療性單株抗體(「mAb」)。亦描述針對經診斷患有老年性黃斑部病變(AMD)之人類個體的結合於C3或C5的治療性mAb之HuPTM抗原結合片段，例如治療性mAb之完全人類醣基化(HuGly) Fab。亦描述用於將hCFHL1遞送至經診斷患有AMD之人類個體的組合物及方法。
已顯示治療性mAb有效治療多種疾病及病況。然而，由於此等藥劑僅在短時間週期內有效，因此通常需要重複注射較長持續時間，由此對患者形成相當大的治療負擔。
補體系統為增強微生物及受損細胞之清除、促進發炎及攻擊病原體之細胞膜的免疫系統之關鍵元件。三個生物化學路徑活化補體系統：1)典型補體系統，2)替代補體路徑，及3)凝集素路徑。
老年性黃斑部病變(AMD)引起進行性及永久性視覺障礙。存在兩種形式之AMD：乾性AMD及濕性AMD。乾性AMD佔1.96億全球AMD病例之約85-90%。補體系統之過度活化為AMD之重要驅動因素。亦存在繼發於老年性黃斑部病變(AMD)之地圖狀萎縮(GA)的超過一百萬患者亦可得益於抵抗眼中之過度活性補體的干預。
需要減輕患有AMD之患者之治療負擔的更有效治療。玻璃體內藥物已成為患者的一種有前景的藥物投與模式，因為其可向目標組織提供大量藥物，從而消除全身毒性之風險。減少或消除對定期經眼投與之需求將減輕患者負擔且改良療法。
藉由基因療法遞送之治療性抗體及其他蛋白質具有優於注射或輸注之治療性抗體的數種優勢，該等注射或輸注之治療性抗體隨時間推移而耗散，從而產生峰值含量及谷值含量。與反覆注射抗體或蛋白質相反，轉殖基因產物抗體或蛋白質之持續表現使作用位點處存在之抗體或蛋白質含量更一致，風險更低且對於患者而言更方便，因為需要進行的注射次數更少。此外，由於在轉譯期間及之後存在不同微環境，自轉殖基因表現之抗體及其他蛋白質係以不同於直接注射之抗體的方式經轉譯後修飾。在不受任何特定理論束縛的情況下，此導致抗體具有不同的擴散、生物活性、分佈、親和力、藥物動力學及免疫原性特性，使得與直接注射之抗體相比，遞送至作用位點之抗體為「生物改良劑(biobetter)」。另外，諸如抗C3或抗C5抗體或補體因子H樣蛋白之因子(參見Clark等人, 2014, J. Immunol. 193:4962)可抑制眼中之補體活化及隱結沈積，以抑制、減少乾性AMD之進展。因此，本文提供用於抗C3或抗C5基因療法及補體因子H樣(CFHL)蛋白療法，尤其重組AAV基因療法之組合物及方法，其經設計在投與用於治療乾性AMD及與其相關之地圖狀萎縮或減少其進展的rAAV組合物20天、30天、40天、50天、60天或90天內，靶向眼且產生用於表現抗C3或抗C5抗體(包括可伐利單抗(crovalimab)或依庫珠單抗(eculizumab))或其抗原結合片段或產生治療性或預防性含量(在眼組織及在其他實施例中於血清中)之抗體的CFHL1蛋白的轉殖基因儲存物。
描述組合物及方法，其用於將抗C3或抗C5或治療性mAb之抗C3或抗C5抗原結合片段(例如治療性mAb之完全人類醣基化Fab (HuGlyFab))或hCFHL-1蛋白(例如完全人類醣基化CFHL-1)經眼或全身遞送至經診斷患有AMD或其他指示用治療性抗C3或抗C5 mAb或CFHL-1蛋白治療的病況的患者(人類個體)。治療性mAb之此類抗原結合片段包括Fab、F(ab')2或scFv (單鏈可變片段)(在本文中統稱為「抗原結合片段」)。如本文所用之「HuPTM Fab」可包括mAb之其他抗原結合片段。在一替代實施例中，可使用全長mAb。另外，亦可使用抗體之scFv形式。遞送可有利地經由基因療法實現，例如藉由向診斷患有經指示用治療性抗C3或抗C5 mAb或CFHL-1治療之病況的個體投與編碼治療性抗C3或抗C5 mAb或其抗原結合片段或CFHL蛋白(或前述之高醣基化衍生物)之病毒載體或其他DNA表現構築體，以在患者之眼中或在替代實施例中肝臟及/或肌肉中形成持久儲存物，向一或多個眼組織連續供應HuPTM mAb或該治療性mAb之抗原結合片段，例如人類醣基化轉殖基因產物，或肽，該mAb或其抗原結合片段或肽在該一或多個眼組織中發揮其治療或預防作用。
提供基因療法載體，尤其rAAV基因療法載體，當向人類個體投與時，其使得抗C3或抗C5抗體或CFHL-1蛋白得以表現，以例如在投與編碼抗C3或抗C5抗體或CFHL-1蛋白之載體後20、30、40、50、60或90天實現諸如眼房液、玻璃狀液之眼組織中或血清中之最大或穩態濃度。
用於遞送轉殖基因之重組載體包括非複製型重組腺相關病毒載體(「rAAV」)。在實施例中，AAV類型具有對以下眼組織之向性：包括例如視網膜細胞、RPE、脈絡膜、布魯赫膜(Bruch's membrane；BrM)及其上皮細胞、脈絡膜毛細管層及其上皮細胞、感光細胞(視桿及視錐)及視網膜神經節細胞。AAV類型可為例如AAV之AAV8、AAV9、AAV3B或AAVrh73 (或其變體)亞型。然而，可使用其他病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、痘瘡病毒載體或稱為「裸DNA」構築體之非病毒表現載體。轉殖基因之表現可受組成性表現元件(諸如CAG啟動子)或組織特異性表現控制元件(尤其作為眼組織、肝臟及/或肌肉特異性控制元件之元件，例如 表 1及 表 1a之一或多個元件)控制。
在某些實施例中，由轉殖基因編碼之HuPTM mAb或HuPTM抗原結合片段可包括但不限於結合於C3之治療性抗體(尤其NGM621)或結合於C5之治療性抗體(包括可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗(ravulizumab)或特度魯單抗(tesidolumab))的全長或抗原結合片段，結構參見例如 圖 1A至 圖 1C且胺基酸序列參見 圖 2A至 圖 2G及 表 7。在其他實施例中，提供CFHL-1之HuPTM。在其他實施例中，提供重組AAV載體，其包含編碼以下抗體的轉殖基因：可在用於乾性AMD之臨床前評定之非人類動物模型，諸如非人類靈長類動物(食蟹獼猴)、大鼠或小鼠模型中用作抗C5結合抗體(包括依庫珠單抗或雷武珠單抗)之替代物的BB5.1抗體或用作抗C3結合抗體(諸如NGM621)之替代物的抗C3.105B9。
用於治療性抗體之基因療法構築體經設計，以使得重鏈及輕鏈皆得以表現。重鏈及輕鏈之編碼序列可在單一構築體中經工程改造，其中重鏈及輕鏈藉由可裂解連接子或IRES分開，從而表現分開的重鏈及輕鏈多肽。在特定實施例中，連接子為弗林蛋白酶T2A連接子(SEQ ID NO: 143或144)。在某些實施例中，編碼序列編碼Fab或F(ab') 2或scFv。在某些實施例中，表現抗體之全長重鏈及輕鏈。在其他實施例中，構築體表現重鏈及輕鏈可變域經由可撓性、不可裂解連接子(諸如GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53))連接的scFv。在某些實施例中，構築體自N端表現NH 2-V L-連接子-V H-COOH或NH 2-V H-連接子-V L-COOH。在某些實施例中，構築體自N端編碼NH 2-V L-GGGGSGGGGSGGGGS-V H-COOH或NH 2-V H-GGGGSGGGGSGGGGS-V L-COOH。
另外，自轉殖基因活體內表現之抗體或其他蛋白質不太可能含有與由重組技術產生之抗體或其他蛋白質相關的降解產物，諸如蛋白質聚集及蛋白質氧化。由於高蛋白質濃度、與製造設備及容器之表面相互作用以及利用某些緩衝液系統之純化，與蛋白質產生及儲存相關之問題為聚集。在基因療法之轉殖基因表現中不存在此等促進聚集之條件。諸如甲硫胺酸、色胺酸及組胺酸氧化之氧化亦與蛋白質產生及儲存相關，且由加壓細胞培養條件、金屬及空氣接觸以及緩衝劑及賦形劑中之雜質引起。自轉殖基因活體內表現之蛋白質亦可在壓力條件下氧化。然而，人類及許多其他生物體均配備有抗氧化防禦系統，其不僅降低氧化壓力，且有時亦修復及/或逆轉氧化。因此，活體內產生之蛋白質不太可能呈氧化形式。聚集及氧化均可能影響效力、藥物動力學(清除率)及免疫原性。
在人類個體之眼組織細胞中產生HuPTM mAb、HuPTM Fab或HuPTM scFv或HuPTM CFHL-1將產生用於經由基因療法實現之疾病治療的「生物改良」分子，該基因療法例如藉由將編碼全長HuPTM mAb或治療性mAb之HuPTM Fab或HuPTM scFv或者CFHL-1的病毒載體或其他DNA表現構築體投與至經診斷患有該mAb或CFHL-1蛋白適用之疾病適應症的患者(人類個體)，以在該個體中形成持久儲存物，從而連續供應藉由個體之經轉導細胞產生的人類醣基化、硫酸化轉殖基因產物。用於HuPTMmAb或HuPTM Fab或HuPTM scFv之cDNA構築體應包括確保藉由經轉導人類細胞進行適當共轉譯及轉譯後加工(醣基化及蛋白質硫酸化)的信號肽。
作為基因療法之替代方案或除基因療法以外之治療，可藉由重組DNA技術在人類細胞株中產生全長HuPTM mAb或HuPTM Fab或HuPTM scFv或CHFL-1蛋白，且可向患者投與醣蛋白。
本文所提供之方法涵蓋組合療法，其涉及向患者全身遞送全長HuPTM抗C3或抗C5 mAb或HuPTM抗C3或抗C5 Fab或scFv或CFHL-1蛋白，同時投與其他可用治療。可在基因療法治療之前、同時或之後投與其他治療。此類其他治療可包括但不限於使用治療性mAb之輔助療法。
亦提供製造病毒載體，尤其基於AAV之病毒載體的方法。在特定實施例中，提供產生重組AAV之方法，其包含培養含有人工基因體之宿主細胞，該人工基因體包含：由AAV ITR側接之順式表現卡匣，其中該順式表現卡匣包含編碼治療性抗體之轉殖基因，該轉殖基因可操作地連接於將控制轉殖基因於人類細胞中之表現的表現控制元件；不具有AAV ITR之反式表現卡匣，其中該反式表現卡匣編碼AAV rep及殼體蛋白，該AAV rep及殼體蛋白可操作地連接於驅動該AAV rep及殼體蛋白於培養物中之該宿主細胞中之表現且反式供應rep及cap蛋白的表現控制元件；足以准許藉由AAV殼體蛋白複製及包裝人工基因體的腺病毒輔助功能；及自該細胞培養物回收殼體包裹該人工基因體之重組AAV。
亦提供投與及製造方法。
描述了用於將完全人類轉譯後修飾(HuPTM)之治療性單株抗體(mAb)或治療性抗C3或抗C5 mAb之HuPTM抗原結合片段(例如治療性mAb之完全人類醣基化Fab (HuGlyFab)或scFv)或CFHL-1之HuPTM型式全身性遞送至經診斷患有AMD (包括乾性AMD)或其他經指示用治療性mAb治療之適應症的患者(人類個體)的組合物及方法。遞送可經由基因療法有利地實現，例如藉由將編碼治療性mAb或其抗原結合片段(或其中任一者之高醣基化衍生物)或hCFHL-1之病毒載體或其他DNA表現構築體投與至經診斷患有經指示用治療性mAb治療之病況的患者(人類個體)，以在患者之組織或器官(尤其眼，但在實施例中，肝臟或肌肉)中形成持久儲存物，從而連續向個體之眼組織供應HuPTM mAb或治療性mAb之抗原結合片段或hCFHL-1 (例如人類醣基化轉殖基因產物)，該mAb或其抗原結合片段在該等眼組織中發揮治療作用。
在某些實施例中，由轉殖基因編碼之HuPTM mAb或HuPTM抗原結合片段為(但不限於)結合C5 (尤其可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗或特度魯單抗)(此等抗體之Fab部分之重鏈及輕鏈胺基酸序列(亦參見 表 7)分別參見 圖 2A 至圖 2D)及C3 (尤其NGM621) (NGM621之Fab部分之重鏈及輕鏈胺基酸序列參見 圖 2E(及 表 7))的HuPTM mAb或HuPTM之全長或抗原結合片段。hCHFL-1之胺基酸序列(SEQ ID NO: 23)亦參見 表 7。
本文所提供之組合物及方法以在眼組織中(例如在玻璃狀液或眼房液或視網膜組織、RPE、BrM及/或脈絡膜中)或在血清中之一含量，自例如個體之眼(包括視網膜組織)或肝臟/肌肉中的病毒基因體儲存物全身性遞送抗C5抗體或其抗原結合片段，尤其可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗或特度魯單抗抗體，或抗C3抗體或其抗原結合片段，尤其NGM621或hCFHL-1，該含量以治療或預防方式有效治療或改善AMD或其他可用hCFHL-1蛋白之抗C3或抗C5抗體治療的適應症的症狀。本文鑑別了用於向人類個體中之細胞(在實施例中，包括一或多個眼組織細胞)遞送編碼治療性抗C3或抗C5抗體或其抗原結合片段或hCFHL-1蛋白之轉殖基因的病毒載體，以及可操作地連接於編碼抗C3或抗C5抗體之促進抗體在細胞中之表現之重鏈及輕鏈的核苷酸序列或可操作地連接至編碼hCFHL-1之核苷酸序列(在實施例中，在眼組織細胞中)的調控元件。此類調控元件(包括組成型啟動子，諸如CAG)以及眼組織特異性調控元件提供於本文之 表 1及 表 1a中。因此，此類病毒載體可以適當劑量遞送至人類個體，使得在投與之後至少20、30、40、50或60天，抗C3或抗C5抗體或CFHL-1蛋白以治療有效含量存在於該人類個體之血清或眼組織中。在實施例中，(在人類試驗、動物模型等中)測定抗C3或抗C5抗體或CFHL-1之治療有效含量以將最佳矯正視力(BCVA)改良≥ 2 ETDRS行，使地圖狀萎縮減少(或基於疾病之控制或自然史使地圖狀萎縮之進展相對於未治療個體減緩)，減少隱結儲存物或其他乾性AMD量度。
由轉殖基因編碼的HuPTM mAb或HuPTM抗原結合片段可包括但不限於結合於C3(包括但不限於NGM621)或結合於C5(包括但不限於可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗或特度魯單抗)的治療性抗體之全長或抗原結合片段。前述之抗原結合片段之重鏈及輕鏈之胺基酸序列提供於下文 表 7中。重鏈可變域在SEQ ID NO: 1、3、4、5、6、8、10、11或12內(CH1域加底線且VH域不加)，且其中Fab片段由核苷酸序列SEQ ID NO: 26、28、29、31或33(分別(未提供NGM621編碼序列))編碼，且輕鏈Fab (CL1域加底線且VL域不加底線)具有SEQ ID NO: 2、5、7、9或14之胺基酸序列(分別由核苷酸序列SEQ ID NO: 27、30、32或34編碼(未提供NGM621序列))。亦提供hCFHL-1之胺基酸序列(SEQ ID NO: 23)，由SEQ ID NO: 49之核苷酸序列編碼。亦提供BB5.1全長抗體之重鏈及輕鏈(SEQ ID NO: 15及16)，分別由核苷酸序列SEQ ID NO: 35及36編碼。由轉殖基因編碼之HuPTM mAb或HuPTM抗原結合片段可包括但不限於經工程改造以在Fab域上含有其他醣基化位點的治療性抗體或抗原結合片段之全長或抗原結合片段(例如參見Courtois等人, 2016, mAbs 8: 99-112，其關於在全長抗體之Fab域上經高醣基化的抗體衍生物之描述以全文引用之方式併入本文中)。
用於遞送轉殖基因之重組載體包括非複製型重組腺相關病毒載體(「rAAV」)。rAAV由於以下多種原因而成為尤其具有吸引力之載體：其可經修飾以優先靶向所選特定器官；且可自數百個殼體血清型進行選擇以獲得所需組織特異性，及/或避免被預先存在的針對一些AAV之患者抗體中和。本文所用之AAV類型優先靶向眼，亦即具有視網膜細胞向性。此類rAAV包括但不限於包含來自以下中之一或多者之殼體組分的基於AAV之載體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV9e、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39、AAVhu.37、AAVrh73、AAVrh74、AAV.hu51、AAV.hu21、AAV.hu12或AAV.hu26。在某些實施例中，本文所提供之基於AAV之載體包含來自以下中之一或多者的殼體：AAV3B、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV10或AAVrh73血清型。
然而，可使用其他病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、痘瘡病毒載體或稱為「裸DNA」構築體之非病毒表現載體。轉殖基因之表現可由組成型或組織特異性表現控制元件控制。
基因療法構築體經設計以使得重鏈及輕鏈均得以表現。在某些實施例中，表現抗體之全長重鏈及輕鏈。在某些實施例中，編碼序列編碼Fab或F(ab') 2或scFv。重鏈及輕鏈應以大約相等之量表現，換言之，重鏈及輕鏈以重鏈與輕鏈約1:1之比率表現。重鏈及輕鏈之編碼序列可在單一構築體中經工程改造，其中重鏈及輕鏈藉由可裂解連接子或IRES分開，從而表現分開的重鏈及輕鏈多肽。在特定實施例中，分開重鏈及輕鏈之連接子為弗林蛋白酶-2A連接子，例如弗林蛋白酶-F2A連接子RKRR(GSG)APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NOS: 143或144)或弗林蛋白酶-T2A連接子RKRR(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NOS: 141或142)。在某些實施例中，構築體自N端至C端表現NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。在其他實施例中，構築體自N端至C端表現NH2-信號或定位序列-VL-連接子-VH-COOH或NH2-信號或定位序列-VH-連接子-VL-COOH。在其他實施例中，構築體表現重鏈及輕鏈可變域經由可撓性、不可裂解連接子(諸如GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53))連接的scFv。例示性可裂解及不可裂解連接子見於 表 4中。
在某些實施例中，本文揭示之核酸(例如聚核苷酸)及核酸序列可例如經由熟習此項技術者已知的任何密碼子最佳化技術而經密碼子最佳化(參見例如Quax等人, 2015, Mol Cell 59:149-161之綜述)且亦可經最佳化以減少CpG二聚體。可伐利單抗及依庫珠單抗重鏈及輕鏈以及CFHL-1之經密碼子最佳化之序列提供於 表 8中(SEQ ID NO: 26至30及49)。各重鏈及輕鏈需要信號序列以確保適當轉譯後加工及分泌(除非表現為scFv，其中僅N端鏈需要信號序列)。本文例如在 表 2及 表 3中揭示適用於治療性抗體之重鏈及輕鏈於人類細胞中之表現的信號序列。例示性重組表現構築體展示於 圖 1A、 圖 1B及 圖 1C中。
產生HuPTM mAb或HuPTM Fab (包括HuPTM scFv)將產生用於經由基因療法實現之疾病治療的「生物改良」分子，該基因療法例如藉由將編碼全長HuPTM mAb或治療性mAb之HuPTM Fab或其他抗原結合片段(諸如scFv)的病毒載體或其他DNA表現構築體或CFHL-1蛋白投與至經診斷患有經指示用彼mAb或蛋白質治療之疾病的患者(人類個體)，以在個體中形成持久儲存物，從而連續供應藉由個體之經轉導細胞產生的人類醣基化、硫酸化轉殖基因產物。用於HuPTM mAb或HuPTM Fab或HuPTM scFv之cDNA構築體應包括確保藉由經轉導人類細胞進行適當共轉譯及轉譯後加工(醣基化及蛋白質硫酸化)的信號肽。
適合於向人類個體投與之醫藥組合物包含重組載體於包含生理學上相容之水性緩衝液、界面活性劑及視情況存在之賦形劑之調配緩衝液中之懸浮液。此類調配緩衝液可包含多醣、界面活性劑、聚合物或油中之一或多者。
作為基因療法之替代方案或除基因療法以外之治療，可藉由重組DNA技術在人類細胞株中產生全長HuPTM mAb或HuPTM Fab或scFv或其其他抗原結合片段或者CFHL-1蛋白，且可向患者投與醣蛋白。僅舉幾例，可用於此類重組醣蛋白產生之人類細胞株包括但不限於人胚腎293細胞(HEK293)、纖維肉瘤HT-1080、HKB-11、CAP、HuH-7及視網膜細胞株PER.C6或RPE(例如參見Dumont等人, 2015, Crit. Rev. Biotechnol. 36(6):1110-1122，其關於可用於重組產生HuPTM mAb、HuPTM Fab或HuPTM scFv產物，例如HuPTM Fab醣蛋白之人類細胞株的綜述以全文引用之方式併入)或HuPTM CFHL-1蛋白。為確保完全醣基化，尤其唾液酸化及酪胺酸硫酸化，用於產生之細胞株可藉由工程改造宿主細胞以共表現α-2,6-唾液酸轉移酶(或α-2,3-唾液酸轉移酶及α-2,6-唾液酸轉移酶兩者)及/或負責人類細胞中之酪胺酸-O-硫酸化的TPST-1及TPST-2酶來增強。
在基因療法或蛋白質療法中產生之每個分子不必完全醣基化及硫酸化。確切而言，所產生之醣蛋白群體應充分醣基化(包括2,6-唾液酸化)及硫酸化以證實功效。本發明之基因療法治療之目標在於減緩或遏制疾病之進展。
本發明之方法涵蓋涉及伴隨投與其他可用治療而將全長HuPTM mAb或HuPTM Fab或HuPTM scFv或其抗原結合片段遞送至患者的組合療法。可在基因療法治療之前、同時或之後投與其他治療。此類其他治療可包括但不限於使用治療性mAb之輔助療法。
亦提供製造病毒載體，尤其基於AAV之病毒載體的方法。在特定實施例中，提供產生重組AAV之方法，其包含培養含有人工基因體之宿主細胞，該人工基因體包含：由AAV ITR側接之順式表現卡匣，其中該順式表現卡匣包含編碼治療性抗體之轉殖基因，該轉殖基因可操作地連接於將控制轉殖基因於人類細胞中之表現的表現控制元件；不具有AAV ITR之反式表現卡匣，其中該反式表現卡匣編碼AAV rep及殼體蛋白，該AAV rep及殼體蛋白可操作地連接於驅動該AAV rep及殼體蛋白於培養物中之該宿主細胞中之表現且反式供應rep及cap蛋白的表現控制元件；足以准許藉由AAV殼體蛋白複製及包裝人工基因體的腺病毒輔助功能；及自該細胞培養物回收殼體包裹該人工基因體之重組AAV。 5.1 構築體
本文提供病毒載體或其他DNA表現構築體，其編碼抗C5或抗C3 mAb或其抗原結合片段，尤其HuGlyFab或HuPTM mAb抗原結合片段或hCFHL-1蛋白之高醣基化衍生物。本文所提供之病毒載體及其他DNA表現構築體包括用於將轉殖基因遞送至目標細胞之任何適合方法。轉殖基因之遞送方式包括病毒載體、脂質體、其他含脂質複合物、其他大分子複合物、合成的經修飾mRNA、未修飾之mRNA、小分子、非生物活性分子(例如金粒子)、聚合分子(例如樹枝狀聚合物)、裸DNA、質體、噬菌體、轉座子、黏質體或游離基因體。在一些實施例中，載體為靶向載體，例如靶向眼組織細胞之載體或具有眼組織細胞向性之載體。
在一些態樣中，本發明提供供使用之核酸，其中核酸包含呈本文所描述之轉殖基因形式的編碼HuPTM mAb或HuPTM Fab或HuPTM scFv或HuGlyFab或其其他抗原結合片段或者hCFHL-1之核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接至普遍存在的啟動子、眼組織特異性啟動子或誘導型啟動子，其中啟動子經選擇以表現於經靶向以表現轉殖基因的組織中。啟動子可例如為CB7/CAG啟動子(SEQ ID NO: 73)及相關上游調控序列；CAG啟動子(CMS早期強化子、雞β-肌動蛋白啟動子-雞β肌動蛋白內含子-兔β-球蛋白剪接受體)(SEQ ID NO: 74)；巨細胞病毒(CMV)啟動子；EF-1α啟動子(SEQ ID NO: 76)；mU1a (SEQ ID NO: 75)；UB6啟動子；雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子；及眼組織特異性啟動子，諸如人類視紫質激酶(GRK1)啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)或人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)。適用啟動子之清單參見表1及表1a以及實例13。
在某些實施例中，本文提供包含一或多種核酸(例如聚核苷酸)之重組載體。核酸可包含DNA、RNA或DNA及RNA之組合。在某些實施例中，DNA包含選自由以下組成之群的序列中之一或多者：啟動子序列、所關注之基因(轉殖基因，例如編碼HuPTMmAb或HuPTM Fab或HuPTM scFv或HuGlyFab或其他抗原結合片段或CFHL-1蛋白之重鏈及輕鏈的核苷酸序列)之序列、非轉譯區及終止序列。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含可操作地連接於所關注之基因的啟動子。
在某些實施例中，本文所揭示之核酸(例如聚核苷酸)及核酸序列可例如經由熟習此項技術者已知的任何密碼子最佳化技術而經密碼子最佳化(參見例如Quax等人, 2015, Mol Cell 59:149-161之綜述)。
在一特定實施例中，本文所描述之構築體包含以下組分：(1)側接表現卡匣之AAV2反向末端重複序列；(2)一或多個控制元件，b)視情況存在之雞β-肌動蛋白或其他內含子及c)兔β-球蛋白多腺苷酸信號；及(3)編碼mAb或Fab之由自裂解弗林蛋白酶(F)/(F/T)2A連接子(SEQ ID NO: 141-144)分開的重鏈及輕鏈，從而確保等量重鏈與輕鏈多肽之表現，或編碼scFv或CFHL蛋白的核酸序列。例示性構築體展示於 圖 1A 、圖 1B及 圖 1C中。
在一特定實施例中，本文所描述之構築體包含以下組分：(1)側接表現卡匣之AAV2反向末端重複序列；(2) GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77)，b)視情況存在之VH4內含子(SEQ ID NO: 80)或其他內含子及c)兔β-球蛋白多腺苷酸信號(SEQ ID NO: 78)；及(3)編碼全長抗體的核酸序列，包含使用編碼重鏈之Fab部分之序列的重鏈及輕鏈序列，包括鉸鏈區序列，加上重鏈之用於適當同型及輕鏈的Fc多肽，其中重鏈及輕鏈核苷酸序列由自裂解弗林蛋白酶(F)/(F/T)2A連接子(SEQ ID NO: 141-144)分開，從而確保等量之重鏈與輕鏈多肽或scFv或CFHL蛋白之表現。 5.1.1 mRNA 載體
在某些實施例中，作為DNA載體之替代方案，本文所提供之載體為編碼所關注之基因(例如轉殖基因，例如HuPTMmAb或HuGlyFab或其其他抗原結合片段或CFHL-1蛋白)的經修飾mRNA。用於將轉殖基因遞送至視網膜色素上皮細胞之經修飾及未經修飾mRNA的合成教示於例如Hansson等人, J. Biol. Chem., 2015, 290(9):5661-5672中，其以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，本文提供一種編碼HuPTMmAb、HuPTM Fab或HuPTM scFv之經修飾mRNA。 5.1.2 病毒載體
病毒載體包括腺病毒、腺相關病毒(AAV，例如AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV10)、慢病毒、輔助依賴型腺病毒、單純疱疹病毒、痘病毒、日本血球凝集素病毒(HVJ)、α病毒、痘瘡病毒及反轉錄病毒載體。反轉錄病毒載體包括基於小鼠白血病病毒(MLV)及人類免疫缺乏病毒(HIV)之載體。α病毒載體包括塞姆利基森林病毒(semliki forest virus；SFV)及辛得比斯病毒(sindbis virus；SIN)。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體為重組病毒載體。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體經改變以使其在人類中為複製缺陷型。在某些實施例中，病毒載體為雜交載體，例如置於「無助」腺病毒載體中之AAV載體。在某些實施例中，本文提供病毒載體，其包含來自第一病毒之病毒殼體及來自第二病毒之病毒包膜蛋白。在特定實施例中，第二病毒為水泡性口炎病毒(VSV)。在更特定的實施例中，包膜蛋白為VSV-G蛋白。
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體為基於HIV之病毒載體。在某些實施例中，本文所提供之基於HIV之載體包含至少兩個聚核苷酸，其中gag及pol基因來自HIV基因體，且env基因來自另一種病毒。
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體為基於單純疱疹病毒之病毒載體。在某些實施例中，本文提供之基於單純疱疹病毒之載體經修飾以使其不包含一或多種即刻早期(IE)基因，從而使其無細胞毒性。
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體為基於MLV之病毒載體。在某些實施例中，代替病毒基因，本文所提供之基於MLV之載體包含多達8 kb之異源DNA。
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體為基於慢病毒之病毒載體。在某些實施例中，本文提供之慢病毒載體來源於人類慢病毒。在某些實施例中，本文提供之慢病毒載體來源於非人類慢病毒。在某些實施例中，將本文提供之慢病毒載體包裝於慢病毒殼體中。在某些實施例中，本文所提供之慢病毒載體包含以下元件中之一或多者：長末端重複序列、引子結合位點、聚嘌呤區、att位點及殼體包裹位點。
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體為基於α病毒之病毒載體。在某些實施例中，本文提供之α病毒載體為重組的複製缺陷型α病毒。在某些實施例中，本文提供之α病毒載體中的α病毒複製子藉由在其病毒粒子表面上呈現功能性異源配體而靶向特定細胞類型。
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體為基於AAV之病毒載體。在某些實施例中，本文所提供之基於AAV之載體不編碼AAV rep基因(複製所需)及/或AAV cap基因(合成殼體蛋白所需)(rep及cap蛋白可由包裝細胞反式提供)。已鑑別多種AAV血清型。在某些實施例中，本文所提供之基於AAV之載體包含來自一或多個AAV血清型之組分。在較佳實施例中，本文所提供之基於AAV之載體包含來自具有眼組織、肝臟及/或肌肉向性之一或多個AAV血清型的組分。在某些實施例中，本文所提供之基於AAV之載體包含來自以下中之一或多者的殼體組分：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV9e、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39、AAVhu.37、AAVrh73、AAVrh74、AAV.hu51、AAV.hu21、AAV.hu12或AAV.hu26。在某些實施例中，本文所提供之基於AAV之載體為或包含來自AAV8、AAV3B、AAV9、AAV10、AAVrh73或AAVrh10血清型中之一或多者的組分。提供病毒載體，其中殼體蛋白為AAV8殼體蛋白(SEQ ID NO: 196)、AAV3B殼體蛋白(SEQ ID NO: 190)或AAVrh73殼體蛋白(SEQ ID NO: 202)之變體，且殼體蛋白例如與AAV8殼體蛋白(SEQ ID NO: 196)、AAV9 (SEQ ID NO: 197)、AAV3B殼體蛋白(SEQ ID NO: 190)或AAVrh73殼體蛋白(SEQ ID NO: 202)之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致，同時保留原生殼體之生物功能。在某些實施例中，經編碼AAV殼體具有含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸取代且保留AAV8、AAV3B或AAVrh73殼體之生物功能的SEQ ID NO: 196之序列。 圖 3基於標記有SUBS之列中的比較提供不同AAV血清型之殼體蛋白之胺基酸序列與可在比對序列中某些位置處經取代之潛在胺基酸的比較性比對。因此，在特定實施例中，AAV載體包含AAV8、AAV3B或AAVrh73殼體變體，其具有在原生AAV殼體序列中之彼位置處不存在之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸取代，如在 圖 3之SUBS列中所鑑別。 圖 3提供AAV8、AAV9、AAV3B或AAVrh73殼體之胺基酸序列。
hu37殼體之胺基酸序列可見於國際申請案PCT WO 2005/033321 (其SEQ ID NO: 88)中，且rh8殼體之胺基酸序列可見於國際申請案PCT WO 03/042397 (SEQ ID NO: 97)。rh64R1序列之胺基酸序列見於WO2006/110689中(Rh.64序列之R697W取代，其為WO 2006/110689之SEQ ID NO: 43)。
在一些實施例中，基於AAV之載體包含來自一或多個AAV血清型之組分。在一些實施例中，本文所提供之基於AAV之載體包含來自以下中之一或多者的殼體組分：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAVS3、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.rh46、AAV.rh73、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV粒子，或其兩者或超過兩者之組合。在一些實施例中，本文所提供之基於AAV之載體包含來自以下中之一或多者的組分：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAVS3、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.rh46、AAV.rh73、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV粒子，或其兩種或超過兩種血清型之組合。在一些實施例中，rAAV粒子包含與例如選自以下之AAV殼體血清型之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或80%以上一致(例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即達100%一致)的殼體蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAVS3、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.rh46、AAV.rh73、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、 AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16，或其衍生物、修飾或假型。
在特定實施例中，用於本文中之組合物及方法的重組AAV為AAVS3 (包括其變體)(參見例如美國專利申請案第20200079821號，其全文以引用的方式併入本文中)。在特定實施例中，rAAV粒子包含如Puzzo等人, 2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418中所描述之AAV-LK03或AAV3B之殼體，該文獻以全文引用之方式併入。在特定實施例中，用於本文中之組合物及方法中的AAV為US 10,301,648中所揭示之任何AAV，諸如AAV.rh46或AAV.rh73。在一些實施例中，用於本文中之組合物及方法中之重組AAV為Anc80或Anc80L65(參見例如Zinn等人, 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068，其以全文引用之方式併入)。在特定實施例中，用於本文中之組合物及方法中的AAV為US 9,585,971中所揭示之任何AAV，諸如AAV-PHP.B。在特定實施例中，用於本文中之組合物及方法中的AAV為AAV2/Rec2或AAV2/Rec3載體，其具有來源於AAV8及血清型cy5、rh20或rh39之雜交殼體序列(參見例如Issa等人, 2013, PLoS One 8(4): e60361，其關於此等載體之內容以引用之方式併入本文中)。在特定實施例中，用於本文中之組合物及方法中的AAV為以下(其各以全文引用之方式併入本文中)中之任一者中所揭示之AAV：US 7,282,199、US 7,906,111、US 8,524,446、US 8,999,678、US 8,628,966、US 8,927,514、US 8,734,809、US9,284,357、US 9,409,953、US 9,169,299、US 9,193,956、US 9,458,517、US 9,587,282、US 2015/0374803、US 2015/0126588、US 2017/0067908、US 2013/0224836、US 2016/0215024、US 2017/0051257、PCT/US2015/034799及PCT/EP2015/053335。在一些實施例中，rAAV粒子具有與以下專利及專利申請案(其各以全文引用之方式併入本文中)中之任一者中所揭示之AAV殼體之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或80%以上一致(例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即達100%一致)的殼體蛋白：美國專利第7,282,199號、第7,906,111號、第8,524,446號、第8,999,678號、第8,628,966號、第8,927,514號、第8,734,809號、第US 9,284,357號、第9,409,953號、第9,169,299號、第9,193,956號、第9,458,517號及第9,587,282號；美國專利申請公開案第2015/0374803號、第2015/0126588號、第2017/0067908號、第2013/0224836號、第2016/0215024號、第2017/0051257號；及國際專利申請案第PCT/US2015/034799號、第PCT/EP2015/053335號。
在一些實施例中，rAAV粒子包含美國專利第9,840,719號及WO 2015/013313中所揭示之任何AAV殼體，諸如AAV.Rh74及RHM4-1，該等文獻各以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含WO 2014/172669中所揭示之任何AAV殼體，諸如AAV rh.74，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含如Georgiadis等人, 2016, Gene Therapy 23: 857-862及Georgiadis等人, 2018, Gene Therapy 25: 450中所描述之AAV2/5之殼體，該等文獻各以全文引用之方式併入。在一些實施例中，rAAV粒子包含WO 2017/070491中所揭示之任何AAV殼體，諸如AAV2tYF，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含美國專利第8,628,966號、US 8,927,514、US 9,923,120及WO 2016/049230中所揭示之任何AAV殼體，諸如HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15或HSC16，該等文獻各以全文引用之方式併入。
在一些實施例中，rAAV粒子具有以下中所揭示之殼體蛋白：國際申請公開案第WO 2003/052051號(參見例如´051公開案之SEQ ID NO: 2)、第WO 2005/033321號(參見例如´321公開案之SEQ ID NO: 123及88)、第WO 03/042397號(參見例如´397公開案之SEQ ID NO: 2、81、85及97)、第WO 2006/068888號(參見例如´888公開案之SEQ ID NO: 1及3-6)、第WO 2006/110689號(參見例如´689公開案之SEQ ID NO: 5-38)、第WO2009/104964號(參見例如´964公開案之SEQ ID NO: 1-5、7、9、20、22、24及31)、第WO 2010/127097號(參見例如´097公開案之SEQ ID NO: 5-38)及第WO 2015/191508號(參見例如´508公開案之SEQ ID NO: 80-294)；以及美國申請公開案第20150023924號(參見例如´924公開案之SEQ ID NO: 1、5-10)，其中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子具有與以下中所揭示之AAV殼體之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或80%以上一致(例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即達100%一致)的殼體蛋白：國際申請公開案第WO 2003/052051號(參見例如´051公開案之SEQ ID NO: 2)、WO 2005/033321 (參見例如´321公開案之SEQ ID NO: 123及88)、WO 03/042397 (參見例如´397公開案之SEQ ID NO: 2、81、85及97)、WO 2006/068888 (參見例如´888公開案之SEQ ID NO: 1及3-6)、WO 2006/110689 (參見例如´689公開案之SEQ ID NO: 5-38)、WO2009/104964 (參見例如964公開案之SEQ ID NO: 1-5、7、9、20、22、24及31)、W0 2010/127097 (參見例如´097公開案之SEQ ID NO: 5-38)及WO 2015/191508 (參見例如´508公開案之SEQ ID NO: 80-294)；以及美國申請公開案第20150023924號(參見例如´924公開案之SEQ ID NO: 1、5-10)。
在其他實施例中，rAAV粒子包含假型AAV殼體。在一些實施例中，假型AAV殼體為rAAV2/8或rAAV2/9假型AAV殼體。用於產生及使用假型rAAV粒子之方法為此項技術中已知(參見例如Duan等人, J. Virol., 75:7662-7671 (2001)；Halbert等人, J. Virol., 74:1524-1532 (2000)；Zolotukhin等人, Methods 28:158-167 (2002)；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001))。
基於AAV8、基於AAV3B及基於AAVrh73之病毒載體用於本文所描述之方法中之某些中。基於AAV之病毒載體的核苷酸序列及製造重組AAV及AAV殼體之方法教示於例如美國專利第7,282,199 B2號、美國專利第7,790,449 B2號、美國專利第8,318,480 B2號、美國專利第8,962,332 B2號及國際專利申請案第PCT/EP2014/076466號中，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。在一個態樣中，本文提供編碼轉殖基因(例如HuPTM Fab或HuPTM scFv或蛋白質)的基於AAV (例如AAV8、AAV3B、AAVrh73或AAVrh10)之病毒載體。包括AAV8、AAV3B、AAVrh73及AAVrh10之AAV殼體之胺基酸序列提供於 圖 3中。
在某些實施例中，可使用上文之單股AAV (ssAAV)。在某些實施例中，可使用自補載體，例如scAAV (參見例如Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82，McCarty等人, 2001, Gene Therapy, 第8卷, 第16期, 第1248-1254頁；及美國專利第6,596,535號；第7,125,717號；及第7,456,683號，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)。
在某些實施例中，用於本文中所描述之方法中之病毒載體為基於腺病毒之病毒載體。重組腺病毒載體可用於在編碼HuPTMmAb或HuPTM scFv或蛋白質或HuGlyFab或抗原結合片段之轉殖基因中轉移。重組腺病毒可為第一代載體，其具有E1缺失、具有或不具有E3缺失且具有***任一缺失區中之表現卡匣。重組腺病毒可為第二代載體，其含有E2及E4區之全部或部分缺失。輔助依賴型腺病毒僅保留腺病毒反向末端重複序列及包裝信號(φ)。轉殖基因***包裝信號與3' ITR之間，具有或不具有用以使基因體保持接近大約36 kb之野生型大小的填充序列。用於產生腺病毒載體之例示性方案可見於Alba等人, 2005, 「Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy,」 Gene Therapy 12:S18-S27中，其以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，用於本文中所描述之方法中之病毒載體為基於慢病毒之病毒載體。重組慢病毒載體可用於在編碼HuPTM mAb抗原結合片段之轉殖基因中轉移。使用四種質體來製造構築體：含有Gag/pol序列之質體、含有Rev序列之質體、含有包膜蛋白之質體(例如VSV-G)及含包裝元件及抗C3或C5抗原結合片段基因或CFHL-1之順式質體。
為了產生慢病毒載體，將四種質體共轉染至細胞(例如基於HEK293之細胞)中，其中尤其聚乙烯亞胺或磷酸鈣可用作轉染劑。隨後在上清液中收穫慢病毒(慢病毒需要自細胞中萌芽以具有活性，因此不需要/不應該進行細胞收穫)。過濾上清液(0.45 µm)且隨後添加氯化鎂及全能核酸酶(benzonase)。其他下游過程可有很大的不同，其中使用TFF及管柱層析為最具GMP相容性之方法。其他方法使用具有/不具有管柱層析之超速離心。用於產生慢病毒載體之例示性方案可見於Lesch等人, 2011, 「Production and purification of lentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviral vectors,」 Gene Therapy 18:531-538及Ausubel等人, 2012, 「Production of CGMP-Grade Lentiviral Vectors,」 Bioprocess Int. 10(2):32-43中，其皆以全文引用之方式併入本文中。
在一特定實施例中，用於本文所描述的方法中之載體為編碼HuPTM mAb之載體，使得在將載體引入相關細胞中之後，HuPTM mAb之醣基化及/或酪胺酸硫酸化變體由該細胞表現。 5.1.3 基因表現之啟動子及 修飾子
在某些實施例中，本文所提供之載體包含調節基因遞送或基因表現的組分(例如「表現控制元件」)。在某些實施例中，本文所提供之載體包含調節基因表現之組分。在某些實施例中，本文所提供之載體包含影響對細胞之結合或靶向之組分。在某些實施例中，本文所提供之載體包含影響攝取後聚核苷酸(例如轉殖基因)在細胞內之定位的組分。在某些實施例中，本文所提供之載體包含可用作例如用以偵測或選擇已攝取聚核苷酸之細胞的可偵測或可選標記的組分。
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含一或多個控制轉殖基因之表現的啟動子。此等啟動子(及其他控制轉錄之調控元件，諸如強化子)可為組成型的(促進廣泛表現)或可特異性地或選擇性地在眼中表現。在某些實施例中，啟動子為組成型啟動子。
在某些實施例中，啟動子為CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)(參見Dinculescu等人, 2005, Hum Gene Ther 16: 649-663，其以全文引用的方式併入本文中)。在一些實施例中，CAG (SEQ ID NO: 74)或CB7啟動子(SEQ ID NO: 73)包括其他增強由載體驅動之轉殖基因之表現的表現控制元件。在某些實施例中，其他表現控制元件包括雞β-肌動蛋白內含子及/或兔β-球蛋白多腺苷酸信號(SEQ ID NO: 78)。在某些實施例中，啟動子包含TATA盒。在某些實施例中，啟動子包含一或多個元件。在某些實施例中，一或多個啟動子元件可相對於彼此倒置或移動。在某些實施例中，啟動子之元件經定位以協同起作用。在某些實施例中，啟動子之元件經定位以獨立地起作用。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含一或多個選自由以下組成之群的啟動子：人類CMV即刻早期基因啟動子、SV40早期啟動子、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus；RS)長末端重複序列及大鼠胰島素啟動子。在某些實施例中，本文所提供之載體包含一或多個選自由以下組成之群的長末端重複序列(LTR)啟動子：AAV、MLV、MMTV、SV40、RSV、HIV-1及HIV-2 LTR。
在某些實施例中，本文提供之載體包含一或多個組織特異性啟動子(例如視網膜特異性啟動子)。在特定實施例中，本文所提供之病毒載體包含眼組織細胞特異性啟動子，諸如人類視紫質激酶(GRK1)啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)或人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)。
提供相對於元件之排列以串聯方式嵌合於表現卡匣中的核酸調控元件。調控元件一般具有作為識別位點之多種功能，用於轉錄起始或調控、與細胞特異性機制協作以在信號傳導後驅動表現及增強下游基因之表現。
在某些實施例中，啟動子為誘導型啟動子。在某些實施例中，啟動子為低氧誘導型啟動子。在某些實施例中，啟動子包含低氧誘導因子(HIF)結合位點。在某些實施例中，啟動子包含HIF-1α結合位點。在某些實施例中，啟動子包含HIF-2α結合位點。在某些實施例中，HIF結合位點包含RCGTG (SEQ ID NO: 227)模體。關於HIF結合位點之位置及序列的細節，參見例如Schӧdel等人, Blood, 2011, 117(23):e207-e217，其以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，啟動子包含除HIF轉錄因子以外之低氧誘導型轉錄因子的結合位點。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含一或多個在低氧時優先轉譯之IRES位點。對於有關低氧誘導型基因表現及其中所涉及之因素的教示內容，參見例如Kenneth及Rocha, Biochem J., 2008, 414:19-29，其以全文引用之方式併入本文中。在特定實施例中，低氧誘導型啟動子為人類N-WASP啟動子，參見例如Salvi, 2017, Biochemistry and Biophysics Reports 9:13-21 (關於N-WASP啟動子之教示內容以引用之方式併入)或為人類Epo之低氧誘導型啟動子，參見例如Tsuchiya等人, 1993, J. Biochem. 113:395-400 (關於Epo低氧誘導型啟動子之揭示內容以引用之方式併入)。在其他實施例中，啟動子為藥物誘導型啟動子，例如由雷帕黴素(rapamycin)或其類似物之投與誘導的啟動子。參見例如以下PCT公開案中之雷帕黴素誘導型啟動子之揭示內容：WO94/18317、WO 96/20951、WO 96/41865、WO 99/10508、WO 99/10510、WO 99/36553及WO 99/41258以及US 7,067,526，其關於藥物誘導型啟動子之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
本文提供含有某些普遍存在及組織特異性啟動子之構築體。此類啟動子包括合成及串聯啟動子。啟動子之實例及核苷酸序列提供於下文 表 1及 表 1a以及實例13中。 表 1亦包括適用於本文所提供之表現卡匣的其他調控元件之核苷酸序列。 表 1. 啟動子及其他調控元件序列
名稱/ SEQ ID NO. 序列
CAG/CB7 SEQ ID NO: 73 gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaag
CAG (CMV-雞B-肌動蛋白啟動子-嵌合內含子) SEQ ID NO: 74 gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacag
mU1a SEQ ID NO: 75 atggaggcggtactatgtagatgagaattcaggagcaaactgggaaaagcaactgcttccaaatatttgtgatttttacagtgtagttttggaaaaactcttagcctaccaattcttctaagtgttttaaaatgtgggagccagtacacatgaagttatagagtgttttaatgaggcttaaatatttaccgtaactatgaaatgctacgcatatcatgctgttcaggctccgtggccacgcaactcatact
EF-1α (核) SEQ ID NO: 76 gggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacag
GRK1啟動子 SEQ ID NO:77 GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGGCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCAGGGCGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGC
兔β-球蛋白多腺苷酸 SEQ ID NO: 78 gatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcg
嵌合內含子 SEQ ID NO: 79 gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag
VH4內含子 SEQ ID NO:80 gtgagtatctcagggatccagacatggggatatgggaggtgcctctgatcccagggctcactgtgggtctctctgttcacag
5'ITR SEQ ID NO: 81 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct
5'-ITR (自補AAV之缺失D序列) SEQ ID NO: 82 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtgg
3'-ITR AAV SEQ ID NO: 83 gaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa
3'-ITR (自補AAV之缺失D序列) SEQ ID NO: 84 ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
人類UbC    SEQ ID NO:211 Gtctaacaaaaaagccaaaaacggccagaatttagcggacaatttactagtctaacactgaa AattacatattgacccaaatgattacatttcaaaaggtgcctaaaaaacttcacaaaacacactCgccaaccccgagcgcatagttcaaaaccggagcttcagctacttaagaagataggtacataaAaccgaccaaagaaactgacgcctcacttatccctcccctcaccagaggtccggcgcctgtcgaTtcaggagagcctaccctaggcccgaaccctgcgtcctgcgacggagaaaagcctaccgcacaCctaccggcaggtggccccaccctgcattataagccaacagaacgggtgacgtcacgacacgaCgagggcgcgcgctcccaaaggtacgggtgcactgcccaacggcaccgccataactgccgcccCcgcaacagacgacaaaccgagttctccagtcagtgacaaacttcacgtcagggtccccagatgGtgccccagcccatctcacccgaataagagctttcccgcattagcgaaggcctcaagaccttgggTtcttgccgcccaccatgccccccaccttgtttcaacgacctcacagcccgcctcacaagcgtcttcCattcaagactcgggaacagccgccattttgctgcgctccccccaacccccagttcagggcaaccTtgctcgcggacccagactacagcccttggcggtctctccacacgcttccgtcccaccgagcggccCggcggccacgaaagccccggccagcccagcagcccgctactcaccaagtgacgatcacagcgaTccacaaacaagaaccgcgacccaaatcccggctgcgacggaactagctgtgccacacccggcgCgtccttatataatcatcggcgttcaccgccccacggagatccctccgcagaatcgccgagaagggActacttttcctcgcctgttccgctctctggaaagaaaaccagtgccctagagtcacccaagtcccgtCctaaaatgtccttctgctgatactggggttctaaggccgagtcttatgagcagcgggccgctgtcctGagcgtccgggcggaaggatcaggacgctcgctgcgcccttcgtctgacgtggcagcgctcgccgtgaggaggggggcgcccgcgggaggcgccaaaacccggcgcggaggcc
人類紅色視蛋白(RedO) (感光細胞特異性)    SEQ ID NO: 212 ggaggctgaggggtggggaaagggcatgggtgtttcatgaggacagagcttccgtttcat gcaatgaaaagagtttggagacggatggtggtgactggactatacacttacacacggtag cgatggtacactttgtattatgtatattttaccacgatctttttaaagtgtcaaaggcaa atggccaaatggttccttgtcctatagctgtagcagccatcggctgttagtgacaaagcc cctgagtcaagatgacagcagcccccataactcctaatcggctctcccgcgtggagtcat ttaggagtagtcgcattagagacaagtccaacatctaatcttccaccctggccagggccc cagctggcagcgagggtgggagactccgggcagagcagagggcgctgacattggggcccg gcctggcttgggtccctctggcctttccccaggggccctctttccttggggctttcttgg gccgccactgctcccgctcctctccccccatcccaccccctcaccccctcgttcttcata tccttctctagtgctccctccactttcatccacccttctgcaagagtgtgggaccacaaa tgagttttcacctggcctggggacacacgtgcccccacaggtgctgagtgactttctagg acagtaatctgctttaggctaaaatgggacttgatcttctgttagccctaatcatcaatt agcagagccggtgaaggtgcagaacctaccgcctttccaggcctcctcccacctctgcca cctccactctccttcctgggatgtgggggctggcacacgtgtggcccagggcattggtgg gattgcactgagctgggtcattagcgtaatcctggacaagggcagacagggcgagcggag ggccagctccggggctcaggcaaggctgggggcttcccccagacaccccactcctcctct gctggacccccacttcatagggcacttcgtgttctcaaagggcttccaaatagcatggtg gccttggatgcccagggaagcctcagagttgcttatctccctctagacagaaggggaatc tcggtcaagagggagaggtcgccctgttcaaggccacccagccagctcatggcggtaatg ggacaaggctggccagccatcccaccctcagaagggacccggtggggcaggtgatctcag aggaggctcacttctgggtctcacattcttggatccggttccaggcctcggccctaaata gtctccctgggctttcaagagaaccacatgagaaaggaggattcgggctctgagcagttt caccacccaccccccagtctgcaaatcctgacccgtgggtccacctgccccaaaggcgga cgcaggacagtagaagggaacagagaacacataaacacagagagggccacagcggctccc acagtcaccgccaccttcctggcggggatgggtggggcgtctgagtttggttcccagcaa atccctctgagccgcccttgcgggctcgcctcaggagcaggggagcaagaggtgggagga ggaggtctaagtcccaggcccaattaagagatcaggtagtgtagggtttgggagctttta aggtgaagaggcccgggctgatcccacaggccagtataaagcgccgtgaccctcaggtga tgcgccagggccggctgccgtcggggacagggctttccatagcc
人類視紫質(Rho) (感光細胞特異性)    SEQ ID NO:213 Agatcttcccc a cctagccacc tggcaaactg ctccttctct caaaggccca aacatggcct cccagactgc aacccccagg cagtcaggcc ctgtctccac aacctcacag ccaccctgga cggaatctgc ttcttcccac atttgagtcc tcctcagccc ctgagctcct ctgggcaggg ctgtttcttt ccatctttgt attcccaggg gcctgcaaat aaatgtttaa tgaacgaaca agagagtgaa ttccaattcc atgcaacaag gattgggctc ctgggcccta ggctatgtgt ctggcaccag aaacggaagc tgcaggttgc agcccctgcc ctcatggagc tcctcctgtc agaggagtgt ggggactgga tgactccaga ggtaacttgt gggggaacga acaggtaagg ggctgtgtga cgagatgaga gactgggaga ataaaccaga aagtctctag ctgtccagag gacatagcac agaggcccat ggtccctatt tcaaacccag gccaccagac tgagctggga ccttgggaca gacaagtcat gcagaagtta ggggaccttc tcctcccttt tcctggatgg atcctgagta ccttctcctc cctgacctca ggcttcctcc tagtgtcacc ttggcccctc ttagaagcca attaggccct cagtttctgc agcggggatt aatatgatta tgaacacccc caatctccca gatgctgatt cagccaggag cttaggaggg ggaggtcact ttataagggt ctgggggggt cagaacccag agtc (外顯子1起始於5339；亦參見Bennett,J.、Sun,D.及Kariko,K. Sequence analysis of the 5.34-kb 5' flanking region of the human rhodopsin-encoding gene. Gene 167 (1-2), 317-320 (1995))
小鼠視錐抑制蛋白啟動子(CAR) ( 感光細胞特異性)   SEQ ID NO:214 TGGCCCTGGCATTCCCCTATACTGGGACATAGAACCTTCACAGGACCAAGGGCCTCTCCTCCCATTGATGACTGACTAGGCCATCCTCTAGCTACATAGGTGGTGGAGCCTAGAGTCCCTCCTTGTGTACTCTTTGGTGGTGGTTACTCTGGGGGTACTAGGTTAGTTCGTATTGTTGTTCCTCCTAGGGGACTGCAAACCCCTTCAGCTCCTTGGGTCCTTTCTCTAGTTCCTTCTTTGGGGACCCTGTGCTCAGTTCAATGGATGGCCAATTTCCTTCTTAAATGCCCCTAGCAGTAACTGTTAGGTCTCAATCCCAAGACAAATGTCTGAGGTGCCTATTTAACAGATCAAAGCGGACCTGTCCTCAGGTTAACCCAGTCACTCCCTGTACCTCAGTCCCTACCCATCACAATTCTCCAGCCCATGAGCTTCGGGCTGTACTTCCCCAACGGGTTCTCCCATTTTGGGTACATGGCCTTTTTTTTTTACCTTTTTGGTTCCTTTGGCCTTTTGGCTTTTGGCTTCCAGGGCTTCTGGATCCCCCCCAACCCCTCCCATACACA TACACATGTGCACTCGTGCACTCAACCCAGCACAGGATAATGTTCATTCTTGACCTTTCCACATACATCTGGCTATGTTCTCTCTCTTATCTACAATAAATCTCCTCCACTATACTTAGGAGCAGTTATGTTCTTCTTCTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTCATTCAGTAACATCATCAGAATCCCCTAGCTCTGGCCTACCTCCTCAGTAACAATCAGC TGATCCCTGGCCACTAATCTGTACTCACTAATCTGTTTTCCAAACTCTTGGCCCCTGAGCTAATTATAGCAGTGCTTCATGCCACCCACCCCAACCCTATCCTTGTTCTCTGACTCCCACTAATCTACACATTCAGAGGATTGTGGATATAAGAGGCTGGGAGGCCAGCTTAGCAACCAGAGCTCGAGGCTGATGCGAGCTTCATCTCTTCCCTC
小鼠視錐抑制蛋白啟動子(CAR) ( 感光細胞特異性)SEQ ID NO:215 TTTTTTTTTTACCTTTTTGGTTCCTTTGGCCTTTTGGCTTTTGGCTTCCAGGGCTTCTGGATCCCCCCCAACCCCTCCCATACACATACACATGTGCACTCGTGCACTCAACCCAGCACAGGATA ATGTTCATTCTTGACCTTTCCACATACATCTGGCTATGTTCTCTCTCTTATCTACAATAAATCTCCTCCACTATACTTAGGAGCAGTTATGTTCTTCTTCTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTCATTCAGTAACATCATCAGAATCCCCTAGCTCTGGCCTACCTCCTCAGTAACAATCAGC TGATCCCTGGCCACTAATCTGTACTCACTAATCTGTTTTCCAAACTCTTGGCCCCTGAGCTAATTATAGCAGTGCTTCATGCCACCCACCCCAACCCTATCCTTGTTCTCTGACTCCCACTAATCTACACATTCAGAGGATTGTGGATATAAGAGGCTGGGAGGCCAGCTTAGCAACCAGAGCTCGAGGCTGATGCGAGCTTCATCTCTTCCCTC
小鼠視錐抑制蛋白啟動子(CAR) ( 感光細胞特異性)SEQ ID NO:216 TGATCCCTGGCCACTAATCTGTACTCACTAATCTGTTTTCCAAACTCTTGGCCCCTGAGCTAATTATAGCAGTGCTTCATGCCACCCACCCCAACCCTATCCTTGTTCTCTGACTCCCACTAATCTACACATTCAGAGGATTGTGGATATAAGAGGCTGGGAGGCCAGCTTAGCAACCAGAGCTCGAGGCTGATGCGAGCTTCATCTCTTCCCTC
人類視紫質激酶(RK)或GRK1 ( 感光細胞特異性)SEQ ID NO:217 gggcccca gaagcctggt ggttgtttgt ccttctcagg ggaaaagtga ggcggcccct tggaggaagg ggccgggcag aatgatctaa tcggattcca agcagctcag gggattgtct ttttctagca ccttcttgcc actcctaagc gtcctccgtg accccggctg ggatttagcc tggtgctgtg tcagccccgg
人類斑萎蛋白1 (Bestrophin 1；BEST1)啟動子 ( 亦稱為hVMD2 啟動子)SEQ ID NO:218 AAGG ACTCCTTTGT GGAGGTCCTG GCTTAGGGAG TCAAGTGACG GCGGCTCAGC ACTCACGTGG GCAGTGCCAG CCTCTAAGAG TGGGCAGGGG CACTGGCCAC AGAGTCCCAG GGAGTCCCAC CAGCCTAGTC GCCAGACC +38
人類斑萎蛋白1 (BEST1)啟動子 ( 亦稱為hVMD2 啟動子 )SEQ ID NO:219 GTCAAGTGACG GCGGCTCAGC ACTCACGTGG GCAGTGCCAG CCTCTAAGAG TGGGCAGGGG CACTGGCCAC AGAGTCCCAG GGAGTCCCAC CAGCCTAGTC GCCAGACC (轉錄起始位點殘基在+1處加底線)
人類斑萎蛋白1 (BEST1)啟動子 ( 亦稱為hVMD2 啟動子 )SEQ ID NO:220 CTCAGC ACTCACGTGG GCAGTGCCAG CCTCTAAGAG TGGGCAGGGG CACTGGCCAC AGAGTCCCAG GGAGTCCCAC CAGCCTAGTC GCCAGAC (轉錄起始位點殘基在+1處加底線)
人類斑萎蛋白1 (BEST1)啟動子 ( 亦稱為hVMD2 啟動子 )SEQ ID NO:221 TTAATAAACA TTTGGGCGAT TCTTACGGCC TCTAAAGACC AAGAACCACT GCTGCCTAGA GCTCTGCTCT CTTCATTGAA CAATACAAGA GGAGTGTGTA GGTAGACACC CACCACTTCC AACAGCTTAG GAGAGCCCTT GAGTATGGAT TGATGTATTA AAATTTATTG AATCACATGC TGAGATTTTC ACCAGCTGCC CGTGGGGATC TGGGCATTTA TTCCCATATT GCACTGGCTG GCTGGAAGCC AGCAGCATAA ACTCCAGGGC TGTTCTGTCA ACCCCCACCA GACTCACCCC GCTCCACCAG CCCCGGCAGG CTTCTCCTTC CATCTCTCTG AAGCAACTTA CTGATGGGCC CTGCCAGCCA ATCACAGCCA GAATAACGTA TGATGTCACC AGCAGCCAAT CAGAGCTCCT CGTCAGCATA TGCAGAATTC TGTCATTTTA CTAGGGTGAT GAAATTCCCA AGCAACACCA TCCTTTTCAGATAAGGGCAC TGAGGCTGAG AGAGGAGCTG AAACCTACCC GGCGTCACCA CACACAGGTG GCAAGGCTGG GACCAGAAAC CAGGACTGTT GACTGCAGCC CGGTATTCAT TCTTTCCATA GCCCACAGGG CTGTCAAAGA CCCCAGGGCC TAGTCAGAGG CTCCTCCTTC CTGGAGAGTT CCTGGCACAG AAGTTGAAGC TCAGCACAGC CCCCTAACCC CCAACTCTCT CTGCAAGGCC TCAGGGGTCA GAACACTGGT GGAGCAGATC CTTTAGCCTC TGGATTTTAG GGCCATGGTA GAGGGGGTGT TGCCCTAAAT TCCAGCCCTG GTCTCAGCCC AACACCCTCC AAGAAGAAAT TAGAGGGGCC ATGGCCAGGC TGTGCTAGCC GTTGCTTCTG AGCAGATTAC AAGAAGGGAC CAAGACAAGG ACTCCTTTGT GGAGGTCCTG GCTTAGGGAG TCAAGTGACG GCGG CTCAGC ACTCACGTGG GCAGTGCCAG CCTCTAAGAG TGGGCAGGGG CACTGGCCAC AGAGTCCCAG GGAGTCCCAC CAGCCTAGTC GCCAGACC TT CTGTGGGATC ATCGGACCCA (轉錄起始位點殘基在+1處加底線；最小活性啟動子區加粗)
CB啟動子 SEQ ID NO: 222 gacgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgg
 CB長啟動子SEQ ID NO:  223 gacgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcg
 Best/GRK1串聯啟動子 SEQ ID NO: 224 GTCGACAAATTCTGTCATTTTACTAGGGTGATGAAATTCCCAAGCAACACCATCCTTTTCAGATAAGGGCACTGAGGCTGAGAGAGGAGCTGAAACCTACCCGGGGTCACCACACACAGGTGGCAAGGCTGGGACCAGAAACCAGGACTGTTGACTGCAGCCCGGTATTCATTCTTTCCATAGCCCACAGGGCTGTCAAAGACCCCAGGGCCTAGTCAGAGGCTCCTCCTTCCTGGAGAGTTCCTGGCACAGAAGTTGAAGCTCAGCACAGCCCCCTAACCCCCAACTCTCTCTGCAAGGCCTCAGGGGTCAGAACACTGGTGGAGCAGATCCTTTAGCCTCTGGATTTTAGGGCCATGGTAGAGGGGGTGTTGCCCTAAATTCCAGCCCTGGTCTCAGCCCAACACCCTCCAAGAAGAAATTAGAGGGGCCATGGCCAGGCTGTGCTAGCCGTTGCTTCTGAGCAGATTACAAGAAGGGACTAAGACAAGGACTCCTTTGTGGAGGTCCTGGCTTAGGGAGTCAAGTGACGGCGGCTCAGCACTCACGTGGGCAGTGCCAGCCTCTAAGAGTGGGCAGGGGCACTGGCCACAGAGTCCCAGGGAGTCCCACCAGCCTAGTCGCCAGAtCTAGAGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAAGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGGCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCAGGGCGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCCTTAAGC
SV40內含子 SEQ ID NO: 225 gtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctag
上游Kozak序列 SEQ ID NO: 25 GCCACC
表 1a.其他調控序列
LSPX1 SEQ ID NO:228 aggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattccagatccaggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattccagatccggcgcgccagggctggaagctacctttgtctagaaggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagaggggtacccggggatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacaatgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
LSXP2 SEQ ID NO:229 aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagagggtctagaaggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagaggggtacccggggatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacaatgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
LTP1 SEQ ID NO:230 aggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattccagatccaggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattccagatccggcgcgccagggctggaagctacctttgacatcatttcctctgcgaatgcatgtataatttctacagaacctattagaaaggatcacccagcctctgcttttgtacaactttcccttaaaaaactgccaattccactgctgtttggcccaatagtgagaactttttcctgctgcctcttggtgcttttgcctatggcccctattctgcctgctgaagacactcttgccagcatggacttaaacccctccagctctgacaatcctctttctcttttgttttacatgaagggtctggcagccaaagcaatcactcaaagttcaaaccttatcattttttgctttgttcctcttggccttggttttgtacatcagctttgaaaataccatcccagggttaatgctggggttaatttataactaagagtgctctagttttgcaatacaggacatgctataaaaatggaaagatgttgctttctgagaggatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacagtgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
LTP2 SEQ ID NO:231 aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagagggtctagagcccttaagctagcaggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattccagatccaggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattccagatccggcgcgccagggctggaagctacctttgacatcatttcctctgcgaatgcatgtataatttctacagaacctattagaaaggatcacccagcctctgcttttgtacaactttcccttaaaaaactgccaattccactgctgtttggcccaatagtgagaactttttcctgctgcctcttggtgcttttgcctatggcccctattctgcctgctgaagacactcttgccagcatggacttaaacccctccagctctgacaatcctctttctcttttgttttacatgaagggtctggcagccaaagcaatcactcaaagttcaaaccttatcattttttgctttgttcctcttggccttggttttgtacatcagctttgaaaataccatcccagggttaatgctggggttaatttataactaagagtgctctagttttgcaatacaggacatgctataaaaatggaaagatgttgctttctgagaggatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacagtgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
LTP3 SEQ ID NO:232 aggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattccagatccaggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattccagatccggcgcgccagggctggaagctacctttgacatcatttcctctgcgaatgcatgtataatttctacagaacctattagaaaggatcacccagcctctgcttttgtacaactttcccttaaaaaactgccaattccactgctgtttggcccaatagtgagaactttttcctgctgcctcttggtgcttttgcctatggcccctattctgcctgctgaagacactcttgccagcatggacttaaacccctccagctctgacaatcctctttctcttttgttttacatgaagggtctggcagccaaagcaatcactcaaagttcaaaccttatcattttttgctttgttcctcttggccttggttttgtacatcagctttgaaaataccatcccagggttaatgctggggttaatttataactaagagtgctctagttttgcaatacaggacatgctataaaaatggaaagatgttgctttctgagaggatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacagtgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtaaaacaggtaagtccgctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctggcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggtcctgggtgacgaacag
LMTP6 SEQ ID NO:233 aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagagggccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcgtcgagatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacagtgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
LMTP13 SEQ ID NO:234 aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagaggggtacccggggatcttgctaccagtctagaggccgtccgccctcggcaccatcctcacgacacccaaatatggcgacgggtgaggaatggtggggagttatttttagagcggtgaggaaggtgggcaggcagcaggtgttggcgctctaaaaataactcccgggagttatttttagagcggaggaatggtggacacccaaatatggcgacggttcctcacccgtcgccatatttgggtgtccgccctcggccggggccgcattcctgggggccgggcggtgctcccgcccgcctcgataaaaggctccggggccggcggcggcccacgagctacccggaggagcgggaggcgccaagcgtgagtatcgatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacagtgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
LMTP14 SEQ ID NO:235 gaatggtggacacccaaatatggcgacggttcctcacccgtcgccatatttgggtgtccgccctcggccggggccgcattcctgggggccgggcggtgctcccgcccgcctcgataaaaggctccggggccggcggcggcccacgagctacccggaggagcgggaggcgccaagcgatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacagtgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
LMTP15 SEQ ID NO:236 aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagagggtctagagaatggtggacacccaaatatggcgacggttcctcacccgtcgccatatttgggtgtccgccctcggccggggccgcattcctgggggccgggcggtgctcccgcccgcctcgataaaaggctccggggccggcggcggcccacgagctacccggaggagcgggaggcgccaagcgatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacagtgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
LMTP18 SEQ ID NO:237 aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagagggccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcgtcgagatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacagtgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
LMTP19 SEQ ID NO:238 aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagagggccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcgtcgagatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacagtgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
LMTP20 SEQ ID NO:239 aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagagggcccttcagattaaaaataactgaggtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttggggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttcatgggcaaaccttggggccctgctgaagctttggcccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcgtcgagatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacagtgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
ApoE.hAAT SEQ ID NO:240 aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagaggggtacccggggatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacaatgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
α-Mic/Bik強化子(Mic/BikE)    SEQ ID NO:241 aggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattcc
串聯(2)α-Mic/Bik強化子 (2 Mic/BikE) SEQ ID NO:242 aggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattccaggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattcc
含有ApoE肝控制區之ApoE強化子    SEQ ID NO:243 aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagaggg
串聯(2) ApoE強化子 SEQ ID NO:244 aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagagggtctagaaggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctg
hAAT啟動子 SEQ ID NO:245 gatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtaca atgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
hAAT( ΔATG)啟動子 SEQ ID NO:246 gatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtaca gtgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagt
Mck增強子(MckE) SEQ ID NO:247 ccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatc
串聯(2) Mck強化子 (2 MckE) SEQ ID NO:248 ccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatc
串聯Mck (3)強化子 (3 MckE) SEQ ID NO:249 ccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatc
肌凝蛋白重鏈強化子(MhcE)    SEQ ID NO:250 cccttcagattaaaaataactgaggtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttggggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttcatgggcaaaccttggggccctgctgaagctttggc
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含一或多個除啟動子以外的調控元件。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含強化子。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含抑制子。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含內含子(例如VH4內含子(SEQ ID NO: 80)、SV40內含子(SEQ ID NO: 225)或嵌合內含子(β-球蛋白/Ig內含子)(SEQ ID NO: 79)。病毒載體亦可包括用以促進轉殖基因產物之轉譯的Kozak序列，例如GCCACC (SEQ ID NO: 25)。
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含轉殖基因之編碼區下游的多腺苷酸化序列。對傳導轉錄終止信號且導引多腺苷酸尾之合成的任何多腺苷酸位點均適合用於本發明之AAV載體中。例示性多腺苷酸信號來源於但不限於以下：SV40晚期基因、兔β-球蛋白基因(SEQ ID NO: 78)、牛生長激素(BPH)基因、人類生長激素(hGH)基因、合成多腺苷酸(SPA)位點及牛生長激素(bGH)基因。參見例如Powell及Rivera-Soto, 2015, Discov. Med., 19(102):49-57。 5.1.4 信號肽
在某些實施例中，本文所提供之載體包含調節蛋白質遞送之組分。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含一或多個信號肽。信號肽(亦稱作「信號序列」)在本文中亦稱為「前導序列」或「前導肽」。在某些實施例中，信號肽允許轉殖基因產物在細胞中實現適當包裝(例如醣基化)。在某些實施例中，信號肽允許轉殖基因產物在細胞中實現適當定位。在某些實施例中，信號肽允許轉殖基因產物實現自細胞之分泌。
存在在基因療法情形下或在細胞培養物中選擇用於蛋白質產生之信號序列的兩種通用方法。一種方法為使用來自與所表現蛋白質同源之蛋白質的信號肽。舉例而言，人類抗體信號肽可用於在CHO或其他細胞中表現IgG。另一方法為鑑別針對用於表現之特定宿主細胞最佳化的信號肽。信號肽可在不同蛋白質之間或甚至不同生物體之蛋白質之間互換，但通常彼細胞類型之最豐富分泌蛋白之信號序列係用於蛋白質表現。舉例而言，發現人類白蛋白(血漿中之豐富蛋白質)之信號肽實質上增加CHO細胞中之蛋白質產物產量。然而，某些信號肽可在自所表現蛋白質裂解之後保持功能及發揮活性，正如「靶向後功能」。因此，在特定實施例中，信號肽係選自由細胞分泌的用於表現的最豐富蛋白質之信號肽以避免靶向後功能。在某一實施例中，信號序列與重鏈及輕鏈序列兩者融合。在另一實施例中，一個信號序列存在於轉殖基因中且與在轉殖基因N端之任一序列(重鏈或輕鏈)融合。例示性序列為MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)，其可由SEQ ID NO: 90之核苷酸序列編碼(參見 表 2、 圖 2A至 圖 2G)。或者，適合於表現且可引起HuPTM mAb或Fab或scFv在眼/CNS、肌肉或肝臟中之選擇性表現或定向表現之信號序列分別提供於下文表2、表3及表4中。 表 2. 用於眼 /CNS 中之表現的信號肽
信號肽來源 SEQ ID NO: 序列
突變介白素2信號肽 85 MYRMQLLLLIALSLALVTNS
突變介白素2信號肽編碼序列 86 atgtataggatgcaactgctcctcctgattgctctgagcctggctcttgtgaccaactct
VEGF-A信號肽 87 MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQA
纖蛋白-1信號肽 88 MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA
玻連蛋白信號肽 89 MAPLRPLLILALLAWVALA
補體因子H信號肽 90 MRLLAKIICLMLWAICVA
旋光蛋白(Opticin)信號肽 91 MRLLAFLSLLALVLQETGT
白蛋白信號肽 92 MKWVTFISLLFLFSSAYS
胰凝乳蛋白酶原信號肽 93 MAFLWLLSCWALLGTTFG
介白素-2信號肽 94 MYRMQLLSCIALILALVTNS   
胰蛋白酶原-2信號肽 95 MNLLLILTFVAAAVA
表 3.用於表現於肝臟(SEQ ID NO 96-116)及肌肉(SEQ ID NO: 117-127、226及178-182)細胞中的信號肽。
信號肽來源 SEQ ID NO: 序列
人血清白蛋白 96 MKWVTFISLLFLFSSAYS
人類α-1抗胰蛋白酶(SERPINA1) 97 MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA
人類載脂蛋白A-1 98 MKAAVLTLAVLFLTGSQA
人類載脂蛋白A-2 99 MKLLAATVLLLTICSLEG
人類載脂蛋白B-100 100 MDPPRPALLALLALPALLLLLLAGARA
人類凝血因子IX 101 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAEC
人類補體C2 102 MGPLMVLFCLLFLYPGLADS
人類補體因子H相關蛋白2 (CFHR2) 103 MWLLVSVILISRISSVGG
人類補體因子H相關蛋白5 (CFHR5) 104 MLLLFSVILISWVSTVGG
人類纖維蛋白原α鏈(FGA) 105 MFSMRIVCLVLSVVGTAWT
人類纖維蛋白原β鏈(FGB) 106 MKRMVSWSFHKLKTMKHLLLLLLCVFLVKS
人類纖維蛋白原γ鏈(FGG) 107 MSWSLHPRNLILYFYALLFLSSTCVA
人類α-2-HS-醣蛋白(AHSG) 108 MKSLVLLLCLAQLWGCHS
人類凝血酶(HPX) 109 MARVLGAPVALGLWSLCWSLAIA
人類激肽原-1 110 MKLITILFLCSRLLLSLT
人類甘露糖結合蛋白C (MBL2) 111 MSLFPSLPLLLLSMVAASYS
人類纖維蛋白溶酶原(PLMN) 112 MEHKEVVLLLLLFLKSGQG
人類凝血酶原(凝血因子II) 113 MAHVRGLQLPGCLALAALCSLVHS
人類分泌磷蛋白24 114 MISRMEKMTMMMKILIMFALGMNYWSCSG
人類抗凝血酶III (SERPINC1) 115 MYSNVIGTVTSGKRKVYLLSLLLIGFWDCVTC
人類血清轉鐵蛋白(Serotransferrin；TF) 116 MRLAVGALLVCAVLGLCLA
人類SPARC 117 MRAWIFFLLCLAGRALA
人類膠原蛋白α-1(I)鏈 118 MFSFVDLRLLLLLAATALLTHG
人類乳運鐵蛋白 119 MKLVFLVLLFLGALGLCLA
人類補體C3 120 MGPTSGPSLLLLLLTHLPLALG
人類基膜聚糖 121 MSLSAFTLFLALIGGTSG
人類凝溶膠蛋白同功異型物1 122 MAPHRPAPALLCALSLALCALSLPVRA
人類組織蛋白酶原(Pro-cathepsin) H 123 MWATLPLLCAGAWLLGVPVCGA
人類SERPINF1 124 MQALVLLLCIGALLGHSSC
人類SERPINE1 125 MQMSPALTCLVLGLALVFGEGSA
人類組織蛋白酶D 126 MQPSSLLPLALCLLAAPASA
人類TIMP1 127 MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA
人類纖維結合蛋白 226 MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVPSTGASKSKR
人類補體C1s子組分 178 MWCIVLFSLLAWVYA
人類組織蛋白酶L1 179 MNPTLILAAFCLGIASA
人類組織蛋白酶B 180 MWQLWASLCCLLVLANA
人類唾液酸性富脯胺酸磷蛋白½ 181 MLLILLSVALLAFSSA
人類卵泡抑素相關蛋白1 182 MWKRWLALALALVAVAWVRA
5.1.5 多順反子訊息 -IRES 及 2A 連接子以及 scFv 構築體
內部核糖體進入位點. 單一構築體可經工程改造以編碼重鏈及輕鏈兩者，該等重鏈及輕鏈由可裂解連接子或IRES分開以使得分開之重鏈及輕鏈多肽由經轉導細胞表現。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體提供多順反子(例如雙順反子)訊息。舉例而言，病毒構築體可編碼由內部核糖體進入位點(IRES)元件分開的重鏈及輕鏈(例如使用IRES元件產生雙順反子載體，參見例如Gurtu等人, 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm. 229(1):295-8，其以全文引用之方式併入本文中)。IRES元件繞過核糖體掃描模型且在內部位點開始轉譯。IRES在AAV中之用途描述於例如Furling等人, 2001, Gene Ther 8(11): 854-73中，其以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，雙順反子訊息包含在病毒載體內，該病毒載體對其中聚核苷酸之大小有限制。在某些實施例中，雙順反子訊息包含在基於AAV病毒之載體(例如基於AAV8、基於AAV3B或基於AAVrh73之載體)內。
弗林蛋白酶 -2A 連接子.  在其他實施例中，本文所提供之病毒載體編碼重鏈及輕鏈，該等重鏈及輕鏈由具有或不具有上游弗林蛋白酶裂解位點之可裂解連接子(諸如自裂解2A及2A樣肽)分開，該等可裂解連接子為例如弗林蛋白酶/2A連接子，諸如弗林蛋白酶/F2A (F/F2A)或弗林蛋白酶/T2A (F/T2A)連接子(Fang等人, 2005, Nature Biotechnology 23: 584-590，Fang, 2007, Mol Ther 15: 1153-9，及Chang, J.等人, MAbs 2015, 7(2):403-412，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)。舉例而言，弗林蛋白酶/2A連接子可併入表現卡匣中以將重鏈及輕鏈編碼序列分開，從而產生具有以下結構之構築體：  信號序列-重鏈-弗林蛋白酶位點-2A位點-信號序列-輕鏈-多腺苷酸。 諸如包含胺基酸序列RKRR(GSG)APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 143或144)之F2A位點或包含胺基酸序列RKRR(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 141或142)之T2A位點的2A位點或2A樣位點為自加工的，從而引起最終G與P胺基酸殘基之間的「裂解」。可使用的具有或不具有上游可撓性Gly-Ser-Gly (GSG)連接子序列(SEQ ID NO: 128)之數種連接子包括但不限於： T2A：(GSG)EGRGSLLTCGDVEENP GP(SEQ ID NOS:133或134)； P2A：(GSG)ATNFSLLKQAGDVEENP GP(SEQ ID NOS:135或136)； E2A：(GSG)QCTNYALLKLAGDVESNP GP(SEQ ID NOS:137或138)； F2A：(GSG)APVKQTLNFDLLKLAGDVESNP GP(SEQ ID NOS:139或140) (亦參見例如Szymczak等人, 2004, Nature Biotechnol 22(5):589-594及Donnelly等人, 2001, J Gen Virol, 82:1013-1025，其各自以引用之方式併入本文中)。編碼可撓性連接子之不同部分的例示性胺基酸序列(SEQ ID NO: 128-144及51-55)及核苷酸序列(SEQ ID NO 145-149)描述於 表 4中。 表 4.連接子序列
ID SEQ ID NO: 序列
GSG連接子 128 GSG
弗林蛋白酶連接子 129 RKRR
弗林蛋白酶連接子 130 RRRR
弗林蛋白酶連接子 131 RRKR
弗林蛋白酶連接子 132 RKKR 
T2A 133 EGRGSLLTCGDVEENP GP
T2A 134 GSGEGRGSLLTCGDVEENP GP
P2A 135 ATNFSLLKQAGDVEENP GP
P2A 136 GSGATNFSLLKQAGDVEENP GP
E2A 137 QCTNYALLKLAGDVESNP GP
E2A 138 GSGQCTNYALLKLAGDVESNP GP
F2A 139 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNP GP
F2A 140 GSGAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNP GP
弗林蛋白酶-T2A 141 RKRREGRGSLLTCGDVEENPGP
弗林蛋白酶-GSG-T2A 142 RKRRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
弗林蛋白酶-F2A 143 RKRRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
弗林蛋白酶-GSG-F2A 144 RKRRGSGAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
弗林蛋白酶-GSG-T2A 145 agaaagagaagaggctctggagaaggcagaggctccctgctgacatgtggggatgttgaagagaatcctgggcct
弗林蛋白酶 146 agaaagagaaga
弗林蛋白酶-GSG連接子 147 agaaagagaagaggctctgga
GSG連接子 148 ggctctgga
T2A 149 gaaggcagaggctccctgctgacatgtggggatgttgaagagaatcctgggcct
G4S 51 GGGGS
4GS2 52 GGGGSGGGGS
4GS3 53 GGGGSGGGGSGGGGS
4GS4 54 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
4GS5 55 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
在某些實施例中，例如弗林蛋白酶裂解位點之其他蛋白水解裂解位點鄰近於自加工裂解位點(例如2A或2A樣序列)併入表現構築體中，從而提供一種移除在由自加工裂解序列裂解之後仍保留之其他胺基酸的方式。不受任一理論束縛，當核糖體在開放閱讀框中遇到2A序列時，跳過肽鍵，從而使得轉譯終止或繼續轉譯下游序列(輕鏈)。此自加工序列在重鏈之C端產生一串其他胺基酸。然而，此類其他胺基酸隨後在弗林蛋白酶裂解位點由宿主細胞弗林蛋白酶裂解，該等弗林蛋白酶裂解位點例如位於緊鄰2A位點之前及重鏈序列之後，且由羧基肽酶進一步裂解。視所用弗林蛋白酶連接子之序列及活體內裂解連接子之羧肽酶而定，所得重鏈可在C端包括一個、兩個、三個或更多個其他胺基酸，或其可不具有此類其他胺基酸(參見例如Fang等人, 2005年4月17日, Nature Biotechnol. Advance Online Publication；Fang等人, 2007, Molecular Therapy 15(6):1153-1159；Luke, 2012, Innovations in Biotechnology, Ch. 8, 161-186)。可使用之弗林蛋白酶連接子包含一系列四個鹼性胺基酸，例如RKRR (SEQ ID NO: 129)、RRRR (SEQ ID NO: 130)、RRKR (SEQ ID NO: 131)或RKKR (SEQ ID NO: 132)。一旦此連接子由羧肽酶裂解，即可保留其他胺基酸，使得其他的零、一、二、三或四個胺基酸可保留在重鏈之C端上，例如R、RR、RK、RKR、RRR、RRK、RKK、RKRR (SEQ ID NO: 129)、RRRR (SEQ ID NO: 130)、RRKR (SEQ ID NO: 131)或RKKR (SEQ ID NO: 132)。在某些實施例中，一旦連接子由羧肽酶裂解，則不保留其他胺基酸。在某些實施例中，由用於本文所描述之方法中之構築體產生的抗體(例如抗原結合片段)群體中之0.5%至1%、1%至2%、5%、10%、15%或20%在裂解之後具有一、二、三或四個胺基酸保留在重鏈之C端上。在某些實施例中，弗林蛋白酶連接子具有序列R-X-K/R-R，使得重鏈之C端上的其他胺基酸為R、RX、RXK、RXR、RXKR (SEQ ID NO: 251)或RXRR (SEQ ID NO: 252)，其中X為任何胺基酸，例如丙胺酸(A)。在某些實施例中，其他胺基酸可不保留在重鏈之C端上。
可撓性肽連接子.  在一些實施例中，單一構築體可經工程改造以編碼由可撓性肽連接子分開之重鏈及輕鏈(例如重鏈及輕鏈可變域)兩者，諸如編碼scFv之彼等構築體。可撓性肽連接子可由如甘胺酸及絲胺酸之可撓性殘基構成，使得相鄰重鏈及輕鏈域相對於彼此自由移動。構築體可經排列使得重鏈可變域處於scFv之N端，繼之以連接子及隨後之輕鏈可變域。或者，構築體可經排列使得輕鏈可變域處於scFv之N端，繼之以連接子及隨後之重鏈可變域。亦即，組分可經排列為NH 2-V L-連接子-V H-COOH或NH 2-V H-連接子-V L-COOH。
在某些實施例中，本文所描述之表現卡匣包含在病毒載體內，該病毒載體對其中聚核苷酸之大小有限制。在某些實施例中，表現卡匣包含在基於AAV病毒之載體內。歸因於某些載體之大小限制，載體可或可不容納治療性抗體之完整重鏈及輕鏈之編碼序列，但可容納抗原結合片段之重鏈及輕鏈之編碼序列，諸如Fab或F(ab') 2片段或scFv之重鏈及輕鏈。詳言之，本文所描述之AAV載體可容納大約4.7千鹼基之轉殖基因。較小表現元件之取代將准許表現較大蛋白質產物，諸如全長治療性抗體。
常用可撓性連接子具有主要由四個Gly及一個Ser殘基之伸長段組成之序列(「GS」連接子)，其為最廣泛使用之可撓性連接子之一個實例，其具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (GGGGS或G4S；SEQ ID NO: 51)之序列。藉由調節拷貝數「n」，可最佳化此GS連接子之長度以實現功能域之適當分離，或保持必要的域間相互作用。實例包括但不限於(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (SEQ ID NO: 52)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEQ ID NO: 53)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4 (SEQ ID NO: 54)及(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)5 (SEQ ID NO: 55)。除GS連接子以外，已針對重組融合蛋白設計了許多其他可撓性連接子(Chen, X.等人, Adv Drug Deliv Rev. 2013年10月15日; 65(10): 1357-1369)。參見例如 表 4。 5.1.6 非轉譯區
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含一或多個非轉譯區(UTR)，例如3'及/或5' UTR。在某些實施例中，UTR針對所要蛋白質表現量而經最佳化。在某些實施例中，UTR針對轉殖基因之mRNA半衰期而經最佳化。在某些實施例中，UTR針對轉殖基因之mRNA的穩定性而經最佳化。在某些實施例中，UTR針對轉殖基因之mRNA的二級結構而經最佳化。 5.1.7 反向末端重複序列
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體包含一或多個反向末端重複(ITR)序列。ITR序列可用於將重組基因表現卡匣包裝至病毒載體之病毒粒子中。在某些實施例中，ITR係來自AAV，例如AAV8或AAV2 (參見例如Yan等人, 2005, J. Virol., 79(1):364-379；美國專利第7,282,199 B2號、美國專利第7,790,449 B2號、美國專利第8,318,480 B2號、美國專利第8,962,332 B2號及國際專利申請案第PCT/EP2014/076466號，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)。在較佳實施例中，編碼ITR之核苷酸序列可例如包含SEQ ID NO: 81 (5'-ITR)或82 (3'-ITR)之核苷酸序列。在某些實施例中，可使用用於產生自補載體，例如scAAV之經修飾ITR (參見例如Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82，McCarty等人, 2001, Gene Therapy, 第8卷, 第16期, 第1248-1254頁；及美國專利第6,596,535號；第7,125,717號；及第7,456,683號，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)。在較佳實施例中，編碼經修飾ITR之核苷酸序列可例如包含SEQ ID NO: 81 (5'-ITR)或83 (3'-ITR)，之核苷酸序列或經修飾用於scAAV之核苷酸序列可例如包含SEQ ID NO: 82 (m 5'ITR)或SEQ ID NO: 84 (m 3' ITR)。 5.1.8 轉殖基因
轉殖基因編碼HuPTM mAb，其呈基於本文所揭示之治療性抗體之全長抗體或其抗原結合片段，例如Fab片段(HuGlyFab)或F(ab') 2、奈米抗體或scFv之形式。在特定實施例中，HuPTM mAb或抗原結合片段(尤其HuGlyFab)經工程改造以在Fab域上含有其他醣基化位點(例如參見Courtois等人, 2016, mAbs 8: 99-112，其關於Fab域上之高醣基化位點之描述以全文引用之方式併入本文中)。另外，對於包含Fc域之HuPTM mAb，Fc域可經工程改造以改變N297處之醣基化位點，以便阻止彼位點之醣基化(例如，在N297處取代為另一胺基酸及/或在T297處取代為並非T或S之殘基以剔除醣基化位點)。此類Fc域為「非醣基化的」。 5.1.8.1 用於全長 HuPTM mAb 之 表現的構築體
在某些實施例中，轉殖基因編碼在表現後與Fc域締合形成抗原結合抗體的全長重鏈(包括重鏈可變域、重鏈恆定域1(C H1)、鉸鏈及Fc域)及全長輕鏈(輕鏈可變域及輕鏈恆定域)。重組AAV構築體在細胞、細胞培養物或個體中表現完整(亦即，全長)或實質上完整HuPTM mAb。(「實質上完整」係指具有與全長mAb序列至少95%一致之序列的mAb。) 編碼重鏈及輕鏈之核苷酸序列可針對人類細胞中之表現經密碼子最佳化且降低CpG二聚體在序列中之出現率以促進於人類細胞中之表現。參見例如 表 8之可伐利單抗(SEQ ID NO: 26、27、37或38)或依庫珠單抗(SEQ ID NO: 28-30或39-41)的經密碼子最佳化之序列。轉殖基因可編碼任何全長抗體。在較佳實施例中，轉殖基因編碼本文所揭示之治療性抗體中之任一者的全長形式，例如，其Fab片段描繪於本文圖 2A 至圖 2G中且在某些實施例中，包括表 6中所提供之相關Fc域。
由本文所描述之轉殖基因編碼的全長mAb較佳地具有全長治療性抗體之Fc域，或為與待表現治療性抗體相同類型的免疫球蛋白之Fc域。在某些實施例中，Fc區為IgG Fc區，但在其他實施例中，Fc區可為IgA、IgD、IgE或IgM。Fc域較佳地為與待表現治療性抗體相同之同型，例如若治療性抗體為IgG1同型，則由該轉殖基因表現之抗體包含IgG1 Fc域。自轉殖基因表現之抗體可具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc域。
完整mAb之Fc區具有一或多個隨抗體同型變化之效應功能。該等效應功能可與野生型或治療性抗體之效應功能相同，或可使用下文章節5.1.9中所揭示之Fc修飾自其進行修飾，以添加、增強、修改或抑制一或多個效應功能。在某些實施例中，HuPTM mAb轉殖基因編碼包含Fc多肽或 表 6中所列之IgG1、IgG2或IgG4同型之例示性Fc域的mAb，該Fc多肽包含與 表 6中針對可伐利單抗、依庫株單抗、雷武珠單抗、特度魯單抗或NGM621所列之本文所描述治療性抗體之Fc域多肽中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，HuPTM mAb包含一序列之Fc多肽，該序列為 表 6中之Fc多肽序列之變體，變化之處在於該序列已藉由下文章節5.1.9中所描述之該等技術中之一或多者修飾以改變Fc多肽之效應功能。在其他實施例中，轉殖基因編碼用於NHP或其他動物模型中之替代抗體，例如作為至少依庫珠單抗或雷武珠單抗之C5結合替代物的抗體BB5.1。
在一些實施例中，提供用於向人類個體投與基因療法以便於個體中表現完整或實質上完整HuPTM mAb的例示性重組AAV構築體，諸如 圖 1A 、圖 1B 及圖 1C中所示之構築體。基因療法構築體經設計以使得重鏈及輕鏈兩者以串聯方式自包括重鏈之Fc域多肽之載體表現。在某些實施例中，轉殖基因編碼具有如 表 7中所示之重鏈及輕鏈Fab片段多肽之轉殖基因，但具有在重鏈鉸鏈區C端進一步包含Fc域多肽(包括IgG1、IgG2或IgG4 Fc域或如 表 6中之可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗、特度魯單抗或NGM621 Fc)的重鏈。在特定實施例中，轉殖基因為編碼以下之核苷酸序列：信號序列-重鏈Fab部分(包括鉸鏈區)-重鏈Fc多肽-弗林蛋白酶-2A連接子-信號序列-輕鏈Fab部分。
在關於在眼組織細胞類型中表現完整或實質上完整mAb之特定實施例中，本文所描述之構築體包含以下組分：(1)側接表現卡匣之AAV2反向末端重複序列；(2)控制元件，其包括a)眼組織特異性啟動子或組成型啟動子，b)視情況存在之內含子，諸如雞β-肌動蛋白內含子或VH4內含子，及c)兔β-球蛋白多腺苷酸信號；及(3)編碼抗C5或抗C3 mAb (例如可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗、特度魯單抗或NGM621)之重鏈Fab的核酸序列；與治療性抗體( 表 6)相關或為與治療性抗體之原生形式相同之同型(諸如來自 表 6之IgG同型胺基酸序列)的Fc多肽；以及抗C5或抗C3 mAb (例如可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗、特度魯單抗或NGM621)之輕鏈，其中重鏈(Fab及Fc區)及輕鏈由自裂解弗林蛋白酶(F)/F2A或T2A或可撓性連接子分開，從而確保表現等量重鏈與輕鏈多肽。例示性構築體提供於 圖 1A 及圖 1B中。
在關於在眼組織細胞類型中表現完整或實質上完整mAb之特定實施例中，本文所描述之構築體包含以下組分：(1)側接表現卡匣之AAV2反向末端重複序列；(2)控制元件，其包括a)眼組織特異性啟動子或組成型啟動子，b)視情況存在之內含子，諸如雞β-肌動蛋白內含子或VH4內含子，及c)兔β-球蛋白多腺苷酸信號；及(3)編碼scFv之核酸序列，其中重鏈與輕鏈可變域經由可撓性、不可裂解連接子(諸如GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53))連接。在某些實施例中，構築體自N端表現NH 2-V L-連接子-V H-COOH或NH 2-V H-連接子-V L-COOH。在某些實施例中，構築體自N端編碼NH 2-V L-GGGGSGGGGSGGGGS-V H-COOH或NH 2-V H-GGGGSGGGGSGGGGS-V L-COOH。在某些實施例中，連接子為GGGGS (SEQ ID NO: 51)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 52)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 54)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55)。在某些實施例中，信號序列為MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)或來自表2之信號序列。在某些實施例中，VH為SEQ ID NO: 251且VL為SEQ ID NO: 252，其中VH為SEQ ID NO: 253且VL為SEQ ID NO: 254，其中VH為SEQ ID NO: 255且VL為SEQ ID NO: 256，其中VH為SEQ ID NO: 257且VL為SEQ ID NO: 258，或其中VH為SEQ ID NO: 259且VL為SEQ ID NO: 260或261。例示性構築體提供於 圖 1C 以及表 7 及表8中。
在特定實施例中，提供編碼實例13之人工基因體的核苷酸序列。
在特定實施例中，提供AAV載體，其包含：病毒殼體，該病毒殼體與AAV8殼體(SEQ ID NO: 196)或替代地AAV9、AAV3B或AAVrh73殼體(或其變體)的胺基酸序列至少95%一致；人工基因體，該人工基因體包含藉由AAV反向末端重複序列(ITR)側接之表現卡匣，其中該表現卡匣包含編碼完整或實質上完整抗C5或抗C3 mAb的轉殖基因；該轉殖基因可操作地連接於控制轉殖基因於眼組織類型細胞(諸如RPE細胞、BrM細胞、脈絡膜毛細管層細胞、感光細胞(視桿及/或視錐)、視網膜神經節細胞中之表現的一或多個調控序列。
可投與編碼及表現全長治療性抗體之rAAV載體以治療或預防適合於用治療性抗體治療、預防或改善症狀之疾病或病況，諸如乾性AMD，或改善其症狀。亦提供使用編碼HuPTM mAb之rAAV載體及構築體在人類細胞中表現HuPTM mAb的方法。 5.1.8.2 用於抗原結合片段之表現的構築體
在一些實施例中，轉殖基因表現基於本文所揭示之治療性抗體的抗原結合片段，例如Fab片段(HuGlyFab)或F(ab') 2、奈米抗體或scFv。 圖 2A 至圖 2G及章節5.4.提供治療性抗體之Fab片段之重鏈及輕鏈的胺基酸序列(亦參見 表 7，其提供治療性抗體之Fab重鏈及輕鏈之胺基酸序列)。
某些此等核苷酸序列針對人類細胞中之表現經密碼子最佳化。參見例如 表 8中之可伐利單抗(SEQ ID NO: 26、27、37或38)或依庫珠單抗(SEQ ID NO: 28-30或39-41)的經密碼子最佳化之序列。轉殖基因可使用編碼表7中所提供之胺基酸序列但不包括重鏈上形成鏈間二硫鍵之鉸鏈區部分(例如含有序列CPPCPA (SEQ ID NO: 150)之部分)的核苷酸序列編碼Fab片段。不含有在C端之鉸鏈區之CPPCP (SEQ ID NO: 151)序列的重鏈Fab域序列將不形成鏈內二硫鍵，且因此將形成具有對應輕鏈Fab域序列之Fab片段，而具有在C端之鉸鏈區之含有序列CPPCP (SEQ ID NO: 151)之部分的彼等重鏈Fab域序列將形成鏈內二硫鍵且因此將形成Fab 2片段。舉例而言，在一些實施例中，轉殖基因可編碼包含經其間之可撓性連接子連接之輕鏈可變域及重鏈可變域的scFv (其中重鏈可變域可在scFv之N端或C端)，且視情況可進一步在重鏈之C端包含Fc多肽(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。或者，在其他實施例中，轉殖基因可編碼F(ab') 2片段，其包含編碼輕鏈及至少包括鉸鏈區之序列CPPCA (SEQ ID NO: 152)之重鏈序列的核苷酸序列，如 圖 2A 至圖 2G中所描繪，該等圖描繪鉸鏈區的可包括於重鏈序列之C端處的各個區。在實施例中，鉸鏈區為序列EPKSCDKTH (SEQ ID NO: 149)。預先存在之抗鉸鏈抗體(AHA)可產生免疫原性且降低功效。因此，在某些實施例中，對於IgG1同型，具有D221之C端或具有突變T225L或具有L242之末端可減少與AHA之結合。(參見例如Brezski, 2008, J Immunol 181: 3183-92及Kim, 2016, 8: 1536-1547)。對於IgG2，AHA之風險較低，因為IgG2之鉸鏈區不易受產生內源性AHA所需之酶裂解影響。(參見例如Brezski, 2011, MAbs 3: 558-567)。 表 5 . 鉸鏈區
SEQ ID NO: 序列
149 EPKSCDKTH
150 CPPCP
151 CPPCPA
152 CPPCA
153 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
154 EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGG
155 EPKSCDKTHL
156 EPKSCDKTHT
157 EPKSCDKTHTCPPCPA
158 EPKSCDKTHLCPPCPA
159 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
160 EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL
161 EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG
162 EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL
163 EPKSCDKTHLCPPCPAPEAAGGPSVFL
164 ERKSCVECPPCPAPPVAG
165 ERKSCVECPPCPA
166 ESKYGPPCPPCPAPEFLGG
167 ESKYGPPCPPCPA
168 ESKYGPPCPSCPA
150 ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL
169 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL
170 ERKCCVECPPCPAPPVAG
171 ERKCCVECPPCPA
172 EPKSCDKTHTCPPCPAPELAGA
173 EPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFL
174 EPKSCDKTHLCPPCPAPELAGAPSVFL
175 EPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGG
176 EPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFL
177 EPKSCDKTHLCPPCPAPEFEGGPSVFL
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體按以下次序包含以下元件：a)組成型或誘導型(例如低氧誘導型或利福黴素(rifamycin)誘導型)啟動子序列或組織特異性啟動子/調控區，例如 表 1或 表 1a或實例13中所提供之調控區中之一者；及b)編碼轉殖基因(例如HuGlyFab)之序列。在某些實施例中，編碼轉殖基因之序列包含由IRES元件分開的多個ORF。在某些實施例中，ORF編碼HuGlyFab之重鏈及輕鏈域。在某些實施例中，編碼轉殖基因之序列在一個由F/F2A序列或F/T2A序列分開的ORF中包含多個次單元。在某些實施例中，包含轉殖基因之序列編碼由F/F2A序列或F/T2A序列分開的HuGlyFab之重鏈及輕鏈域。在某些實施例中，包含轉殖基因之序列編碼由可撓性肽連接子分開的HuGlyFab之重鏈及輕鏈可變域(如同scFv)。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體按以下次序包含以下元件：a)組成型或誘導型啟動子序列或組織特異性啟動子，諸如 表 1或 表 1a或實例13中之啟動子或調控區中之一者；及b)編碼轉殖基因(例如HuGlyFab)之序列，其中該轉殖基因包含編碼信號肽、由IRES元件分開之輕鏈及重鏈Fab部分的核苷酸序列。在某些實施例中，本文所提供之病毒載體按以下次序包含以下元件：a) 表 1或 表 1a或實例13中所列之組成型或低氧誘導型啟動子序列或調控元件；及b)編碼轉殖基因之序列，該轉殖基因包含信號肽、由可裂解F/F2A序列(SEQ ID NO: 143或144)或F/T2A序列(SEQ ID NO: 141或142)或可撓性肽連接子分開之輕鏈及重鏈序列。
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體按以下次序包含以下元件：a)第一ITR序列；b)第一連接子序列；c)組成型或誘導型啟動子序列或組織特異性啟動子或調控區；d)第二連接子序列；e)內含子序列；f)第三連接子序列；g)第一UTR序列；h)編碼轉殖基因(例如HuGlyFab)之序列；i)第二UTR序列；j)第四連接子序列；k)多腺苷酸序列；l)第五連接子序列；及m)第二ITR序列。
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體按以下次序包含以下元件：a)第一ITR序列；b)第一連接子序列；c)組成型或誘導型啟動子序列或組織特異性調控區；d)第二連接子序列；e)內含子序列；f)第三連接子序列；g)第一UTR序列；h)編碼轉殖基因(例如HuGlyFab)之序列；i)第二UTR序列；j)第四連接子序列；k)多腺苷酸序列；l)第五連接子序列；及m)第二ITR序列，其中轉殖基因包含信號，且其中轉殖基因編碼由可裂解F/2A序列分開的輕鏈及重鏈序列。
在某些實施例中，本文所提供之病毒載體按以下次序包含以下元件：a)第一ITR序列；b)第一連接子序列；c)組成型或誘導型啟動子序列或組織特異性調控區；d)第二連接子序列；e)內含子序列；f)第三連接子序列；g)第一UTR序列；h)編碼轉殖基因(例如VH-(連接子)-VL或VL-(連接子)-VH)之序列；i)第二UTR序列；j)第四連接子序列；k)多腺苷酸序列；l)第五連接子序列；及m)第二ITR序列。 5.1.9. Fc 區 修飾
在某些實施例中，轉殖基因編碼締合形成全長或完整抗體的全長或實質上全長重鏈及輕鏈。(「實質上完整」或「實質上全長」係指mAb具有與全長重鏈mAb胺基酸序列至少95%一致之重鏈序列及與全長輕鏈mAb胺基酸序列至少95%一致之輕鏈序列)。因此，轉殖基因包含編碼例如Fab片段之輕鏈及重鏈，包括Fab片段-一種Fc域肽之重鏈之鉸鏈區及重鏈之C端的核苷酸序列。 表 6提供Fc多肽針對可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗、特度魯單抗及NGM621之胺基酸序列。或者，可利用其序列提供於 表 6中的IgG1、IgG2或IgG4 Fc域。
術語「Fc區」係指兩個「Fc多肽」(或「Fc域」)之二聚體，各「Fc多肽」包含抗體之除第一恆定區免疫球蛋白域以外之重鏈恆定區。在一些實施例中，「Fc區」包括藉由一或多個二硫鍵、化學連接子或肽連接子連接的兩個Fc多肽。「Fc多肽」係指IgA、IgD及IgG之至少最後兩個恆定區免疫球蛋白域或IgE及IgM之最後三個恆定區免疫球蛋白域，且亦可包括此等域之N端的可撓性鉸鏈之部分或全部。對於IgG，舉例而言，「Fc多肽」包含免疫球蛋白域Cgamma2 (Cγ2，通常稱作CH2域)及Cgamma3 (Cγ3，亦稱作CH3域)，且可包括Cgamma1 (Cγ1，亦稱作CH1域)與CH2域之間的鉸鏈域之下部部分。儘管Fc多肽之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc多肽通常定義為包含在T223或C226或P230起、至其羧基端的殘基，其中編號係根據Kabat等人(1991, NIH出版物91-3242,國家技術資訊服務中心(National Technical Information Services), Springfield, Va.)中之EU索引。對於IgA，舉例而言，Fc多肽包含免疫球蛋白域Calpha2 (Cα2)及Calpha3 (Cα3)，且可包括Calpha1 (Cα1)與Cα2之間的鉸鏈之下部部分。
在某些實施例中，Fc多肽為治療性抗體之Fc多肽或為對應於治療性抗體之同型的Fc多肽。在其他實施例中，Fc多肽為IgG Fc多肽。Fc多肽可來自IgG1、IgG2或IgG4同型(參見 表 6)，或可為IgG3 Fc域，此視例如治療性抗體之所需效應子活性而定。在一些實施例中，包括Fc域之經工程改造重鏈恆定區(CH)為嵌合的。因而，嵌合CH區組合來源於超過一個免疫球蛋白同型及/或亞型之CH域。舉例而言，嵌合(或雜交) CH區包含來自IgG、IgA及/或IgM之Fc區之部分或全部。在其他實例中，嵌合CH區包含來源於人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之CH2域的部分或所有與來源於人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之CH3域之部分或全部的組合。在其他實施例中，嵌合CH區含有嵌合鉸鏈區。 表 6. Fc 域胺基酸序列之表格
Fc 鏈/ SEQ ID NO. 序列
IgG1 Fc域/SEQ ID NO: 61 FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
IgG2 Fc域/SEQ ID NO: 62 FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTVVHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPAPI EKTISKTKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDISVEWE SNGQPENNYK TTPPMLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
IgG4 Fc域/SEQ ID NO: 63 FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK
可伐利單抗 Fc域/SEQ ID NO: 64 FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVLHEAL HAHYTRKELS LSP
依庫珠單抗 Fc域/SEQ ID NO: 65 FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK
雷武珠單抗 Fc域/ SEQ ID NO:66 FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVLHEAL HSHYTQKSLS LSLGK
特度魯單抗 Fc域/SEQ ID NO: 67 FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
NGM621 Fc域/ SEQ ID NO: 68 FPPKPKDTLM ISRIPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
在一些實施例中，重組載體編碼包含經工程改造(突變) Fc區(例如IgG恆定區之經工程改造Fc區)的治療性抗體。與具有野生型IgG恆定區或無所述修飾之IgG重鏈恆定區的對應抗體相比，對IgG抗體之抗體恆定區、Fc區或Fc片段之修飾可改變一或多個效應功能，諸如Fc受體結合或新生兒Fc受體(FcRn)結合，且因此改變半衰期、CDC活性、ADCC活性及/或ADPC活性。因此，在一些實施例中，抗體可經工程改造以提供展現改變的與一或多個Fc受體(例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、FcγRIIIB、FcγRIV或FcRn受體)之結合(與無所述修飾的參考或野生型恆定區相比)的IgG抗體之抗體恆定區、Fc區或Fc片段。在一些實施例中，與具有野生型IgG恆定區或無所述修飾之IgG恆定區的對應抗體相比，IgG抗體之抗體恆定區、Fc區或Fc片段展現一或多個改變之效應功能，諸如CDC、ADCC或ADCP活性。
「效應功能」係指由抗體Fc區與Fc受體或配體之相互作用產生之生物化學事件。效應功能包括FcγR介導之效應功能，諸如ADCC及ADCP；及補體介導之效應功能，諸如CDC。
「效應細胞」係指表現一或多個Fc受體且介導一或多個效應功能之免疫系統的細胞。效應細胞包括但不限於單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、樹突狀細胞、嗜伊紅白血球、肥大細胞、血小板、B細胞、大顆粒淋巴球、蘭格漢氏細胞(Langerhans' cell)、自然殺手(NK)細胞及T細胞，且可來自包括但不限於人類、小鼠、大鼠、兔及猴之任何生物體。
「ADCC」或「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」係指其中表現FcγR之非特異性細胞毒性效應(免疫)細胞識別目標細胞上結合之抗體且隨後使得目標細胞溶解的細胞介導之反應。
「ADCP」或「抗體依賴性細胞介導之吞噬作用」係指其中表現FcγR之非特異性細胞毒性效應(免疫)細胞識別目標細胞上結合之抗體且隨後引起目標細胞之吞噬的細胞介導之反應。
「CDC」或「補體依賴性細胞毒性」係指其中一或多個補體蛋白組分識別目標細胞上結合之抗體且隨後引起目標細胞之溶解的反應。
在一些實施例中，Fc域之修飾包括但不限於參考IgG恆定區之EU編號(參見 圖 5)的以下修飾及其組合：233、234、235、236、237、238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438及439。
在某些實施例中，Fc區包含IgG之胺基酸殘基251-256、285-290、308-314、385-389及428-436中之一或多者之胺基酸添加、缺失或取代。在一些實施例中，251-256、285-290、308-314、385-389及428-436 (Kabat之EU編號；參見 圖 5)經組胺酸、精胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺或麩醯胺酸取代。在一些實施例中，非組胺酸殘基經組胺酸殘基取代。在一些實施例中，組胺酸殘基經非組胺酸殘基取代。
與具有野生型Fc之抗體相比，具有經工程改造Fc之抗體增強FcRn結合使得親和力增強之抗體與FcRn優先結合，因此引起FcRn親和力增強之抗體之淨增強再循環，從而得到進一步延長之抗體半衰期。增強之再循環方法允許高效地靶向及清除抗原，包括例如「高效價」循環抗原，諸如C5、細胞介素，或細菌或病毒抗原。
某些實施例中提供相較於野生型Fc區(無經工程改造修飾)增強血清FcRn結合的IgG抗體之經修飾恆定區、Fc區或Fc片段。在一些情況下，抗體(例如IgG抗體)經工程改造而在中性pH下(例如處於或高於pH 7.4)結合於FcRn，以相較於野生型Fc區(無經工程改造修飾)增強FcRn結合之pH相關性。在一些情況下，抗體(例如IgG抗體)經工程改造以展現相對於野生型IgG及/或參考抗體在酸性pH下之FcRn結合以及相較於血清FcRn結合(例如在中性pH，例如處於或高於pH 7.4下)增強的胞內體FcRn結合(例如在酸性pH，例如處於或低於pH 6.0下)(例如提高的親和力或K D)。提供具有IgG抗體之經工程改造抗體恆定區Fc區或Fc片段的抗體，其展現相較於具有野生型IgG恆定區或無所述修飾之IgG恆定區的對應抗體改良的血清或滯留組織半衰期。
此等Fc修飾之非限制性實例包括例如位置250 (例如E或Q)、250及428 (例如L或F)、252 (例如LN/Y/W或T)、254 (例如S或T)及256 (例如S/R/Q/E/D或T)處的修飾；或位置428及/或433 (例如H/L/R/S/P/Q或K)及/或434 (例如H/F或Y或A)處的修飾，包括428L及434A；或位置250及/或428處的修飾；或位置307或308 (例如308F、V308F)及434處的修飾。在一個實施例中，修飾包含428L (例如M428L)及434S (例如N434S)修飾；428L、2591 (例如V2591)及308F (例如V308F)修飾；433K (例如H433K)及434 (例如434Y)修飾；252、254及256 (例如252Y、254T及256E)修飾；250Q及428L修飾(例如T250Q及M428L)；及307及/或308修飾(例如308F或308P)(EU編號；參見 圖 5)。
在一些實施例中，Fc區可為突變形式，諸如hIgG1 Fc，其包括展現增強之人類FcRn親和力的M252突變，例如M252Y及S254T及T256E(「YTE突變」)(Dall'Acqua等人,2002, J Immunol 169:5171-5180)；及結合於hFcRn從而產生兩個鹽橋的此突變抗體之後續晶體結構(Oganesyan等人2014, JBC 289(11): 7812-7824)。具有YTE突變之抗體已向猴及人類投與，且其具有顯著改良之藥物動力學特性(Haraya等人, 2019, Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 34(1):25-41)。
在一些實施例中，對Fc區中之一或多個胺基酸殘基的修飾可縮短在全身循環(血清)中之半衰期，但會藉由禁止FcRn結合(例如H435A，Kabat之EU編號)而使組織中(例如眼中)之滯留有所改良(Ding等人, 2017, MAbs 9:269-284；及Kim, 1999, Eur J Immunol 29:2819)。
在一些實施例中，Fc域可經工程改造以活化正常Fc效應功能中之全部、一些或不進行活化，而不影響Fc多肽(例如抗體)之所需藥物動力學特性。具有改變效應功能之Fc多肽可合乎需要，因為其可藉由治療性蛋白減少不合需要之副作用，諸如效應細胞之活化。
改變或甚至消除效應功能之方法可包括抗體之鉸鏈區胺基酸殘基之突變或修飾。舉例而言，包含根據EU編號系統的234A、237A及238S取代之IgG Fc域突變體展現減少之補體依賴性溶解及/或細胞介導之破壞。在此項技術中已顯示，下部鉸鏈中，例如鉸鏈域內位置233-236 (EU編號)缺失或經修飾為甘胺酸之處的缺失及/或取代顯著降低ADCC及CDC活性。
在特定實施例中，Fc域為在殘基297或299處具有取代以改變297處之醣基化位點，從而使得Fc域不經醣基化的非醣基化Fc域。此類非醣基化Fc域可具有降低之ADCC或其他效應活性。
包含具有改變之效應功能的突變及/或嵌合CH區的蛋白質及對突變抗體進行工程改造及測試之方法的非限制性實例在此項技術中描述於例如K.L. Amour等人, Eur. J. Immunol. 1999, 29:2613-2624；Lazar等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103:4005；2007年6月14日公開之美國專利申請公開案第20070135620A1號；2008年6月26日公開之美國專利申請公開案第20080154025 A1號；2010年9月16日公開之美國專利申請公開案第20100234572 A1號；2012年9月6日公開之美國專利申請公開案第20120225058 A1號；2015年11月26日公開之美國專利申請公開案第20150337053 A1號；2016年10月6日公開之國際公開案第WO20/16161010A2號；2016年6月7日發佈之U.S. 9,359,437；及2018年8月21日發佈之美國專利第10,053,517號中，該等文獻皆以引用之方式併入本文中。
所有人類IgG子類之重鏈基因中保留之C端離胺酸(-K)一般不存在於在血清中循環之抗體中，C端離胺酸在循環中裂解，產生異質循環IgG群體。(van den Bremer等人, 2015, mAbs 7:672-680)。在全長mAb之載體化構築體中，編碼C端離胺酸(-K)或Fc端之甘胺酸-離胺酸(-GK)的DNA可缺失以原位產生更同質之抗體產物。(參見Hu等人, 2017 Biotechnol. Prog. 33: 786-794，其以全文引用之方式併入本文中)。 5.1.10 載體之製造及測試
本文所提供之病毒載體可使用宿主細胞製造。本文所提供之病毒載體可使用哺乳動物宿主細胞製造，例如A549、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、293、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、初代纖維母細胞、肝細胞及肌母細胞。本文所提供之病毒載體可使用來自人類、猴、小鼠、大鼠、兔或倉鼠之宿主細胞製造。
宿主細胞藉由編碼轉殖基因及相關元件(例如載體基因體)之序列及在宿主細胞中產生病毒之方式，例如複製及殼體基因(例如AAV之rep及cap基因)穩定地轉化。關於產生具有AAV8殼體之重組AAV載體的方法，參見美國專利第7,282,199 B2號之具體實施方式的章節IV，該專利以全文引用之方式併入本文中。該等載體之基因體拷貝效價可例如藉由TAQMAN®分析測定。病毒粒子可例如藉由CsCl 2沈降回收。
或者，昆蟲細胞中之桿狀病毒表現系統可用於產生AAV載體。關於綜述，參見Aponte-Ubillus等人, 2018, Appl. Microbiol. Biotechnol. 102:1045-1054，其關於製造技術之全文以引用之方式併入本文中。
活體外分析(例如細胞培養分析法)可用於量測本文所描述之載體之轉殖基因表現，因此指示例如載體之效力。另外，活體外中和分析法可用於量測自本文所描述之載體表現的轉殖基因之活性。舉例而言，來源於非洲綠猴之腎臟的細胞株Vero-E6細胞，或經工程改造以穩定表現ACE2受體之希拉細胞(HeLa cell)(HeLa-ACE2)，可用於評定自本文所描述之載體表現的轉殖基因之中和活性。另外，可確定所表現產物之其他特性，例如確定與HuGlyFab相關之醣基化及酪胺酸硫酸化型態。醣基化型態及確定其之方法論述於章節5.3中，而酪胺酸硫酸化型態及確定其之方法論述於章節5.3中。另外，可使用此項技術中已知的分析法，例如章節5.3中所描述之方法，來確定由細胞表現之HuGlyFab的醣基化/硫酸化產生的益處。
可使用數位PCR (dPCR)或ddPCR™ (BioRad Technologies, Hercules, CA, USA)評估載體基因體濃度(GC)或載體基因體拷貝。在一個實例中，在數個時間點獲得眼組織樣本，諸如眼房液及/或玻璃狀液樣本。在另一實例中，在注射後之不同時間點處死數隻小鼠。對眼組織樣本進行總DNA萃取及載體拷貝數之dPCR分析。可在單一生檢樣本中量測或在連續時間點在不同組織切片中量測的每公克組織之載體基因體(轉殖基因)拷貝將顯露AAV在眼中的散佈。用DNeasy血液與組織套組(DNeasy Blood & Tissue Kit)提取來自所收集眼液或眼組織之總DNA，且使用Nanodrop分光光度計量測DNA濃度。為測定各組織樣本中之載體拷貝數，用Naica Crystal Digital PCR系統(Stilla technologies)執行數位PCR。應用兩個多色系統(color multiplexing system)以同時量測轉殖基因AAV及內源性對照。簡言之，可用FAM (6-羧基螢光素)染料標記轉殖基因探針，同時可用VIC螢光染料標記內源性對照探針。特定組織切片中每二倍體細胞之所遞送載體拷貝數經計算為：(載體拷貝數)/×2。特定細胞類型或組織，諸如角膜、虹膜、睫狀體、施萊姆氏管(schlemm's canal)細胞、小樑網狀結構、視網膜細胞、RPE細胞、RPE脈絡膜組織或視神經細胞中隨時間推移之載體拷貝可指示組織持續表現轉殖基因。 5.1.11 組合物
適合於向人類個體投與之醫藥組合物包含重組載體於包含生理學上相容之水性緩衝液、界面活性劑及視情況存在之賦形劑之調配緩衝液中之懸浮液。此類調配緩衝液可包含多醣、界面活性劑、聚合物或油中之一或多者。在一些實施例中，醫藥組合物包含rAAV與用於向個體投與的醫藥學上可接受之載劑的組合。在一個實施例中，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或洲政府之監管機構批准或在美國藥典或其他公認之藥典中列出適用於動物，且更特定言之適用於人類。術語「載劑」係指與藥劑一起投與之稀釋劑、佐劑(例如，弗氏完全及不完全佐劑)、賦形劑或媒劑。此類醫藥學載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，包括例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。當醫藥組合物經靜脈內投與時，水為常用載劑。亦可使用生理鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合的醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似物。醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及穩定劑之其他實例包括但不限於緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白及明膠；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或此項技術中已知之非離子型界面活性劑，諸如TWEEN TM、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS TM。除以上成分以外，本發明之醫藥組合物亦可包括潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、調味劑、乳化劑、懸浮劑及防腐劑。此等組合物可採取溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、持續釋放調配物及其類似形式。 5.2 治療乾性 AMD 之方法
在另一態樣中，提供用於治療有需要之個體之乾性AMD (老年性AMD)或其他可用抗C5或抗C3抗體或CHFL-1蛋白治療之適應症的方法，其包含投與重組AAV顆粒，該等重組AAV顆粒包含編碼抗C5或C3抗體或其抗體結合片段及變體或者CFHL-1蛋白的表現卡匣。有需要之個體包括患有乾性AMD之個體或易患乾性AMD之個體，例如處於罹患乾性AMD或其他可用抗C5或C3抗體或者CFHL-1蛋白治療之適應症風險下的個體。投與此類基因療法之個體可為對抗C5或C3抗體或者CFHL-1蛋白，例如可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗、特度魯單抗或NGM621抗體有反應之個體。在特定實施例中，該等方法涵蓋治療經診斷患有乾性AMD且在某些實施例中經鑑別對抗C5或抗C3抗體或者CFHL-1蛋白治療有反應或被視為抗C5或抗C3抗體或者CFHL-1蛋白療法之良好候選者的患者。在特定實施例中，患者先前已用抗C5或抗C3抗體或者CFHL-1蛋白治療。為測定反應性，可直接向個體投與抗C5或抗C3抗體或抗原結合片段轉殖基因產物或者CFHL-1蛋白(例如於人類細胞培養物、生物反應器等中產生)。
在特定實施例中，提供治療有需要之人類個體的乾性AMD或其他適合於用hCFHL-1蛋白之抗C3或C5抗體治療之適應症的方法，其包含：向眼投與，例如玻璃體內、視網膜下、脈絡膜上、前房內或鼻內投與，或向肝臟及/或肌肉投與，例如藉由向該個體全身性投與(包括靜脈內或肌肉內)治療有效量之重組核苷酸表現載體，諸如AAV載體，該載體包含編碼具有Fc區之實質上全長或全長抗C5或C3抗體或其抗原結合片段或者hCFHL-1之轉殖基因，該轉殖基因可操作地連接於一或多個控制轉殖基因於人類眼組織細胞(諸如視網膜細胞、BrM細胞、脈絡膜毛細管層細胞、RPE細胞及/或脈絡膜細胞)中之表現，使得形成釋放mAb之HuPTM形式或其抗原結合片段或CFHL-1蛋白之儲存物的調控序列。視網膜下、玻璃體內、前房內或脈絡膜上投與應引起轉殖基因產物於以下視網膜細胞類型中之一或多者中之表現：布魯赫膜(BrM)，包括其上皮細胞、脈絡膜毛細管層、人類感光細胞(視錐細胞、視桿細胞)；水平細胞；雙極細胞；無長突細胞；視網膜神經節細胞(侏儒細胞、傘型細胞、雙複層細胞、巨型視網膜神經節細胞、感光神經節細胞及穆勒膠質細胞(muller glia)；及視網膜色素上皮細胞或其他眼組織細胞：角膜細胞、虹膜細胞、睫狀體細胞、施萊姆氏管細胞、小樑網狀結構細胞、RPE-脈絡膜組織細胞或視神經細胞。
用於治療有需要之個體之疾病或病症的重組載體及醫藥組合物描述於章節5.1中。此類載體應具有人類眼組織或肝臟及/或肌肉細胞向性且可包括非複製型rAAV，尤其攜帶AAV3B、AAV8、AAAV9、AAV10、AAVrh10或AAVrh73殼體之彼等非複製型rAAV。重組載體可按任何使得重組載體進入眼組織細胞之方式投與，例如藉由將重組載體引入眼中。此類載體應進一步包含一或多個控制轉殖基因於人類眼組織細胞及/或人類肝臟及肌肉細胞中之表現的調控序列，包括但不限於人類視紫質激酶(GRK1)啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)、CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)、CB啟動子或CBlong啟動子(SEQ ID NO: 222或223)或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)(亦參見表1及表1a)。
本文所描述的方法治療有治療需要之人類個體之乾性(老年性) AMD，減緩其進展，降低其嚴重程度或對其進行預防。可相對於治療之前的個體、類似未治療個體或根據疾病之自然病史來評定治療、進展減緩、嚴重程度降低或預防。特定言之，本發明之方法可減少地圖狀萎縮(包括中央凹內)之進展、減緩視網膜細胞損耗、減緩中心視覺損耗、加快或減緩視覺銳度損耗等。
基於年齡及/或諸如吸菸史、肥胖症、心血管疾病或糖尿病，個體可處於罹患乾性AMD之風險下或傾向於罹患乾性AMD。 5.3. N- 醣基化、酪胺酸硫酸化及 O- 醣基化
本文所揭示之HuGlyFab或HuPTM Fab、HuPTMmAb及HuPTM scFv之胺基酸序列(一級序列)各自包含至少一個針對治療性抗體之Fab片段之胺基酸序列內之醣基化及/或硫酸化位置進行N-醣基化或酪胺酸硫酸化的位點(參見例示性 圖 4)。轉譯後修飾亦發生於全長抗體之Fc域中，尤其殘基N297處(藉由EU編號，參見 表 6)。
或者，突變可引入至Fc域中以改變殘基N297 (Eu編號，參見 表 6)處之醣基化位點，尤其用另一胺基酸取代297處之天冬醯胺或299處之蘇胺酸以移除醣基化位點，從而產生非醣基化Fc域。 5.3.1. N- 醣基化 反向醣基化位點
典型的N-醣基化序列在此項技術中已知為Asn-X-Ser (或Thr)，其中X可為除Pro之外的任何胺基酸。然而，最近已證實，人類抗體之天冬醯胺(Asn)殘基可在反向共同模體Ser(或Thr)-X-Asn之情形下經醣基化，其中X可為除Pro之外的任何胺基酸。參見Valliere-Douglass等人, 2009, J. Biol. Chem. 284:32493-32506；及Valliere-Douglass等人, 2010, J. Biol. Chem. 285:16012-16022。如本文所揭示，本文所揭示之某些HuGlyFab及HuPTM scFv包含此類反向共同序列。 非共同醣基化位點
除反向N-醣基化位點之外，最近已證實，人類抗體之麩醯胺酸(Gln)殘基可在非共同模體Gln-Gly-Thr之情形下經醣基化。參見Valliere-Douglass等人, 2010, J. Biol. Chem. 285:16012-16022。出人意料地，本文所揭示之某些HuGlyFab片段包含此類非共同序列。另外，O-醣基化包含藉由酶將N-乙醯基-半乳胺糖添加至絲胺酸或蘇胺酸殘基。已證實存在於抗體鉸鏈區中之胺基酸殘基可經O-醣基化。與例如大腸桿菌中產生之抗原結合片段相比，O-醣基化之可能性賦予本文所提供之治療性抗體另一個優勢，同樣因為大腸桿菌天然不含有與人類O-醣基化中使用的機制等效的機制。(替代地，僅當細菌經修飾以含有特定O-醣基化機制時證實大腸桿菌中之O-醣基化。參見例如Farid-Moayer等人, 2007, J. Bacteriol. 189:8088-8098。) 經工程改造之 N- 醣基化位點
在某些實施例中，與通常會與HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv相關之核酸相比(例如相對於在其未經修飾狀態下與HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv相關的N-醣基化位點之數目)，編碼HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv之核酸經修飾以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個N-醣基化位點(包括典型N-醣基化共同序列、反向N-醣基化位點及非共同N-醣基化位點)。在特定實施例中，醣基化位點之引入係藉由在抗原結合片段之一級結構中的任何位置***N-醣基化位點(包括典型的N-醣基化共同序列、反向N-醣基化位點及非共同N-醣基化位點)來實現，只要該引入不影響抗體或抗原結合片段與其抗原之結合即可。醣基化位點之引入可藉由例如添加新胺基酸至抗原結合片段或抗原結合片段所來源於之抗體之一級結構(例如全部或部分添加醣基化位點)，或藉由使抗原結合片段或抗原結合片段所來源於之抗體中之現有胺基酸突變，以便產生N-醣基化位點(例如不將胺基酸添加至抗原結合片段/抗體，而是使抗原結合片段/抗體之所選胺基酸突變以形成N-醣基化位點)來實現。熟習此項技術者應認識到，蛋白質之胺基酸序列可使用此項技術中已知的方法容易地修飾，例如包括修飾編碼蛋白質之核酸序列的重組方法。
在一特定實施例中，HuGlyMab或抗原結合片段經修飾以使得當在哺乳動物細胞(諸如視網膜、CNS、肝臟或肌肉細胞)中表現時，其可經高醣基化。參見Courtois等人, 2016, mAbs 8:99-112，其以全文引用之方式併入本文中。 HuPTM mAb 及 HuPTM 抗原結合片段之 N- 醣基化
與小分子藥物不同，生物製劑通常包含許多具有不同修飾或形式之變異體的混合物，該等變異體可具有不同的效力、藥物動力學及/或安全概況。在基因療法或蛋白質療法中產生之每個分子不必完全醣基化及硫酸化。確切而言，所產生之醣蛋白群體應充分醣基化(包括2,6-唾液酸化)及硫酸化以證實功效。本文所提供之基因療法治療之目標可例如在於減緩或遏制疾病或異常病況之進展或降低與疾病或異常病況相關之一或多個症狀之嚴重度。
當HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv表現於人類細胞中時，抗原結合片段之N-醣基化位點可經各種不同聚醣醣基化。抗原結合片段之N-聚醣及Fc域已在此項技術中表徵。舉例而言，Bondt等人, 2014, Mol. & Cell. Proteomics 13.11:3029-3039 (其關於Fab相關之N-聚醣的揭示內容以全文引用之方式併入本文中)表徵與Fab相關之聚醣，且證實抗體之Fab及Fc部分包含獨特的醣基化型態，其中相對於Fc聚醣，Fab聚醣在半乳醣基化、唾液酸化及等分(例如等分GlcNAc)中高，但在岩藻醣基化中低。如Bondt一樣，Huang等人, 2006, Anal. Biochem. 349:197-207 (其關於Fab相關之N-聚醣的揭示內容以全文引用之方式併入本文中)發現Fab之大多數聚醣經唾液酸化。然而，在由Huang檢驗之抗體的Fab (其在小鼠細胞背景中產生)中，經鑑別之唾液酸殘基為N-羥乙醯基神經胺糖酸(「Neu5Gc」或「NeuGc」) (其不為人類天然的)，而非N-乙醯基神經胺糖酸(「Neu5Ac」，主要的人類唾液酸)。另外，Song等人, 2014, Anal. Chem. 86:5661-5666 (其關於Fab相關之N-聚醣的揭示內容以全文引用之方式併入本文中)描述與市售抗體相關之N-聚醣文庫。
Fc域之醣基化已經表徵，且為在天冬醯胺297 (EU編號；參見 表 6)處之單一N連接聚醣。聚醣起到整體結構及功能作用，從而影響抗體效應功能，諸如與Fc受體之結合(關於Fc醣基化在抗體功能中之作用之論述參見例如Jennewein及Alter, 2017, Trends In Immunology 38:358)。Fc區聚醣之移除幾乎完全消除效應功能(Jennewein及Alter，在362處)。已顯示Fc聚醣之組成影響效應功能，例如已顯示高醣基化及岩藻醣基化之減少會增加ADCC活性，而唾液酸化與抗炎性作用相關(同上，在364處)。疾病狀態、遺傳學及甚至膳食皆可影響活體內Fc聚醣之組成。對於以重組方式表現之抗體，聚醣組成可因用於重組表現之宿主細胞之類型而顯著不同，且策略可用於控制及修改以重組方式表現在細胞培養物(諸如CHO)中之治療性抗體中之聚醣之組成，以改變效應功能(參見例如Hansen等人之US 2014/0193404)。因此，與表現於非人類宿主細胞中之抗體相比，本文所提供之HuPTM mAb可適宜在N297處具有更類似於天然人類聚醣組成的聚醣。
重要的是，當HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv表現於人類細胞中時，規避了對原核宿主細胞(例如大腸桿菌)或真核宿主細胞(例如CHO細胞或NS0細胞)中之活體外產生之需求。替代地，根據本文所描述之方法，HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv之N-醣基化位點有利地經與人類治療相關且對其有益之聚醣裝飾。此優勢在將CHO細胞、NS0細胞或大腸桿菌用於抗體/抗原結合片段產生中時難以實現，因為例如CHO細胞(1)不表現2,6唾液酸轉移酶且因此無法在N-醣基化期間添加2,6唾液酸；(2)可添加Neu5Gc而非Neu5Ac作為唾液酸；且(3)亦可產生免疫原性聚醣α-Gal抗原，其與大部分個體中存在之抗α-Gal抗體反應，從而在高濃度下可引發全身性過敏反應；而且因為(4)大腸桿菌天然地不含有N-醣基化所需的組分。
用於確定抗體(包括抗原結合片段)之醣基化型態的分析為此項技術中已知的。舉例而言，肼解可用於分析聚醣。首先，多醣藉由與肼一起培育而自其相關蛋白釋放(可使用Ludger Liberate Hydrazinolysis聚醣釋放套組, Oxfordshire, UK)。親核肼攻擊多醣與載體蛋白之間的糖苷鍵，且允許釋放附接之聚醣。N-乙醯基在此處理過程中丟失，必須藉由重新N-乙醯化來重建。亦可使用酶釋放聚醣，諸如糖苷酶或內切糖苷酶，諸如PNGase F及Endo H，其與肼相比裂解得更乾淨，且副反應更少。游離聚醣可在碳管柱上純化，且隨後在還原端用螢光團2-胺基苯甲醯胺標記。根據Royle等人, Anal Biochem 2002, 304(1):70-90之HPLC方案，可在GlycoSep-N管柱(GL Sciences)上分離經標記之多醣。所得螢光層析圖指示多醣長度及重複單元之數目。可藉由收集個別峰且隨後進行MS/MS分析來搜集結構資訊。由此可確認重複單元之單醣組成及序列，且另外可鑑別多醣組成之同質性。低或高分子量之特定峰可藉由MALDI-MS/MS來分析，且結果用於確認聚醣序列。層析圖中之各峰對應於由某一數目之重複單元及其片段(例如糖殘基)組成之聚合物，例如聚醣。因此，層析圖允許量測聚合物(例如聚醣)長度分佈。溶離時間為聚合物長度之指示，而螢光強度與相應聚合物(例如聚醣)之莫耳豐度相關。評定與抗原結合片段相關之聚醣的其他方法包括Bondt等人, 2014, Mol. & Cell. Proteomics 13.11:3029-3039、Huang等人, 2006, Anal. Biochem. 349:197-207及/或Song等人, 2014, Anal. Chem. 86:5661-5666所描述之方法。
與抗體(包括抗原結合片段)相關之聚醣型態的同質性或異質性，由於與醣基化位點上存在之聚醣長度或大小及聚醣數目有關，可使用此項技術中已知之方法來評定，例如量測聚醣長度或大小及流體動力半徑之方法。HPLC (諸如尺寸排阻、正相、逆相及陰離子交換HPLC)以及毛細管電泳允許量測流體動力半徑。與具有較少醣基化位點之載體相比，蛋白質中較高的醣基化位點數目導致較大的流體動力半徑變化。然而，當分析單一聚醣鏈時，其可能由於長度更受控制而更同質。可藉由肼解、SDS PAGE及毛細管凝膠電泳來量測聚醣長度。另外，同質性亦可意謂某些醣基化位點使用型態變化至更寬/更窄的範圍。此等因素可藉由醣肽LC-MS/MS來量測。
在某些實施例中，HuPTM mAb或其抗原結合片段亦不含有可偵測NeuGc及/或α-Gal。「可偵測NeuGc」或「可偵測α-Gal」或「不含有或不具有NeuGc或α-Gal」在本文中意謂HuPTM mAb或抗原結合片段不含有藉由此項技術中已知之標準分析方法可偵測的NeuGc或α-Gal部分。舉例而言，根據Hara等人, 1989, 「Highly Sensitive Determination of N-Acetyl- and N-Glycolylneuraminic Acids in Human Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection」 J. Chromatogr., B: Biomed. 377, 111-119 (其關於偵測NeuGc之方法以引用之方式併入本文中)，NeuGc可藉由HPLC來偵測。或者，NeuGc可藉由質譜法來偵測。α-Gal可使用ELISA偵測，參見例如Galili等人, 1998, 「A sensitive assay for measuring α-Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody」 Transplantation. 65(8):1129-32，或藉由質譜法偵測，參見例如Ayoub等人, 2013, 「Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques」 Landes Bioscience. 5(5):699-710。亦參見Platts-Mills等人, 2015, 「Anaphylaxis to the Carbohydrate Side-Chain Alpha-gal」 Immunol Allergy Clin North Am. 35(2): 247-260中所引用之參考文獻。 N- 醣基化之益處
N-醣基化賦予本文所描述之HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv多種益處。藉由在大腸桿菌中產生抗原結合片段無法獲得此類益處，因為大腸桿菌天然不具有N-醣基化所需之組分。此外，一些益處難以經由在例如CHO細胞(或鼠類細胞，諸如NS0細胞)中之抗體產生實現，因為CHO細胞缺乏添加某些聚醣所需之組分(例如2,6唾液酸及等分GlcNAc)；而且因為CHO或鼠類細胞株添加並非人類天然(及潛在免疫原性)之N-N-羥乙醯基神經胺糖酸(「Neu5Gc」或「NeuGc」)，而非主要人類唾液酸N-乙醯基神經胺糖酸(「Neu5Ac」)。參見例如Dumont等人, 2015, Crit. Rev. Biotechnol. 36(6):1110-1122；Huang等人, 2006, Anal. Biochem. 349:197-207 (NeuGc為諸如SP2/0及NS0之鼠類細胞株中之主要唾液酸)；及Song等人, 2014, Anal. Chem. 86:5661-5666，其中之各者以全文引用之方式併入本文中。此外，CHO細胞亦可產生免疫原性聚醣(α-Gal抗原)，其與大部分個體中存在之抗α-Gal抗體反應，從而在高濃度下可引發全身性過敏反應。參見例如Bosques, 2010, Nat. Biotech. 28:1153-1156。本文所描述之HuPTM scFv之HuGlyFab之人類醣基化型態將降低轉殖基因產物之免疫原性且改良功效。
儘管非典型醣基化位點通常導致抗體群體之醣基化量低(例如1-5%)，但功能益處可為顯著的(參見例如van de Bovenkamp等人, 2016, J. Immunol. 196:1435-1441)。舉例而言，Fab醣基化可影響抗體之穩定性、半衰期及結合特性。為了確定Fab醣基化對抗體與其目標之親和力的效應，可使用熟習此項技術者已知的任何技術，例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)或表面電漿子共振(SPR)。為了確定Fab醣基化對抗體之半衰期的效應，可使用熟習此項技術者已知的任何技術，例如藉由量測已投與放射性標記抗體之個體的血液或器官中之放射性水平。為了確定Fab醣基化對抗體穩定性(例如聚集量或蛋白質去摺疊量)之效應，可使用熟習此項技術者已知的任何技術，例如差示掃描熱量測定(DSC)、高效液相層析(HPLC) (例如尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC))、毛細管電泳、質譜法或濁度量測。
用於本文中所描述之方法中之HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv上唾液酸之存在可影響HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv之清除率。因此，HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv之唾液酸型態可用於產生具有最佳化清除率之治療劑。評定抗原結合片段清除率之方法為此項技術中已知的。參見例如Huang等人, 2006, Anal. Biochem. 349:197-207。
在另一特定實施例中，由N-醣基化賦予之益處為聚集減少。佔據之N-醣基化位點可掩蓋易於聚集之胺基酸殘基，從而使得聚集減少。此類N-醣基化位點可為本文所用之抗原結合片段原生的或經工程改造至本文所用之抗原結合片段中，從而產生在表現時，例如表現於人類細胞中時較不易於聚集的HuGlyFab或HuPTM scFv。評定抗體聚集之方法為此項技術中已知的。參見例如Courtois等人, 2016, mAbs 8:99-112，其以全文引用之方式併入本文中。
在另一特定實施例中，由N-醣基化賦予之益處為免疫原性降低。此類N-醣基化位點可為本文所用之抗原結合片段原生的或經工程改造至本文所用之抗原結合片段中，從而產生在表現時，例如表現於人類眼組織細胞、人類CNS細胞、人類肝臟細胞或人類肌肉細胞中時較不易於具有免疫原性的HuPTM mAb、HuGlyFab或HuPTM scFv。
在另一特定實施例中，由N-醣基化賦予之益處為蛋白質穩定性。眾所周知，蛋白質之N-醣基化賦予其穩定性，且評定由N-醣基化產生之蛋白質穩定性的方法為此項技術中已知的。參見例如Sola及Griebenow, 2009, J Pharm Sci., 98(4): 1223-1245。
在另一特定實施例中，由N-醣基化賦予之益處為結合親和力改變。此項技術中已知，抗體可變域中N-醣基化位點之存在可增加抗體對其抗原的親和力。參見例如Bovenkamp等人, 2016, J. Immunol. 196:1435-1441。用於量測抗體結合親和力之分析為此項技術中已知的。參見例如Wright等人, 1991, EMBO J. 10:2717-2723；及Leibiger等人, 1999, Biochem. J. 338:529-538。 酪胺酸硫酸化
酪胺酸硫酸化發生在酪胺酸(Y)殘基處，麩胺酸酯(E)或天冬胺酸(D)在Y之+5至-5位置內，且其中Y之位置-1為中性或酸性帶電荷胺基酸，而非消除硫酸化之鹼性胺基酸，例如精胺酸(R)、離胺酸(K)或組胺酸(H)。本文所描述之HuGlyFab及HuPTM scFv包含酪胺酸硫酸化位點(參見例示性 圖 2)。
重要的是，經酪胺酸硫酸化之抗原結合片段無法在大腸桿菌中產生，大腸桿菌天然不具有酪胺酸硫酸化所需之酶。另外，CHO細胞缺乏酪胺酸硫酸化—其並非分泌細胞且轉譯後酪胺酸硫酸化之能力有限。參見例如Mikkelsen及Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537。有利地，本文所提供之方法需要在分泌性的且具有酪胺酸硫酸化能力之人類細胞中表現HuPTM Fab。
酪胺酸硫酸化由於若干原因為有利的。舉例而言，已顯示針對目標之治療性抗體之抗原結合片段的酪胺酸硫酸化大大增加對抗原之親合力及活性。參見例如Loos等人, 2015, PNAS 112: 12675-12680，及Choe等人, 2003, Cell 114: 161-170。用於偵測酪胺酸硫酸化之分析為此項技術中已知的。參見例如Yang等人, 2015, Molecules 20:2138-2164。 5.3.3 O- 醣基化
O-醣基化包含藉由酶將N-乙醯基-半乳胺糖添加至絲胺酸或蘇胺酸殘基。已證實存在於抗體鉸鏈區中之胺基酸殘基可經O-醣基化。在某些實施例中，HuGlyFab包含其鉸鏈區之全部或一部分，且因此能夠在表現於人類細胞中時經O-醣基化。與例如大腸桿菌中產生之抗原結合片段相比，O-醣基化之可能性賦予本文所提供之HuGlyFab另一個優勢，同樣因為大腸桿菌天然不含有等效於人類O-醣基化中所用之機制的機制。(替代地，僅當細菌經修飾以含有特定O-醣基化機制時證實大腸桿菌中之O-醣基化。參見例如Farid-Moayer等人, 2007, J. Bacteriol. 189:8088-8098)。O-醣基化HuGlyFab憑藉具有聚醣而與N-醣基化HuGlyFab (如上文所論述)共有有利特性。 5.4. 用於乾性 AMD 之 抗 C5 、抗 C3 或 CFHL 構築體及調配物
描述用於遞送結合於來源於抗C5或C3抗體之C3或C5的HuPTM mAb或其抗原結合片段，諸如HuPTM Fab的組合物及方法，且該等組合物及方法經指示用於治療乾性AMD。在某些實施例中，HuPTM mAb具有可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗、特度魯單抗或NGM621或其抗原結合片段之胺基酸序列。此等抗體之Fab片段之胺基酸序列提供於 圖 2A 至圖 2G中(亦參見 表 7)。在其他實施例中，提供用於遞送HuPTM CFHL-1 ( 表 7中之胺基酸序列)之組合物及方法。遞送可經由基因療法實現，例如藉由向經診斷患有乾性AMD之患者(人類個體)投與編碼抗C5或抗C3 HuPTM mAb (或其抗原結合片段及/或高醣基化衍生物或其他衍生物)或CFHL-1之病毒載體或其他DNA表現構築體，以形成持久儲存物，從而連續供應人類PTM，例如人類醣基化轉殖基因產物。 轉殖基因
提供重組載體，其含有轉殖基因，該轉殖基因編碼結合於CFHL-1之C5 (且抑制C5裂解及補體活化)或C3 (且抑制C3裂解及補體活化)的HuPTM mAb或HuPTM Fab (或HuPTM mAb之其他抗原結合片段)，該重組載體可經投與以在患者中遞送HuPTM mAb或抗原結合片段或CFHL-1。轉殖基因為核酸，其包含編碼結合於C5 (諸如可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗或特度魯單抗)或結合於C3 (諸如NGM621)或CFHL-1蛋白或其變體的抗體之抗原結合片段的核苷酸序列，如本文中詳述。轉殖基因亦可編碼含有其他醣基化位點之C3或C5抗原結合片段(例如參見Courtois等人)。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因包含編碼可伐利單抗之Fab部分之重鏈及輕鏈(分別具有SEQ ID NO. 1及2之胺基酸序列，參見 表 7及 圖 2A)的核苷酸序列。核苷酸序列可針對人類細胞中之表現而經密碼子最佳化。核苷酸序列可例如包含如 表 8中所列之SEQ ID NO: 26 (編碼可伐利單抗重鏈Fab部分)及SEQ ID NO: 27 (編碼可伐利單抗輕鏈部分)的核苷酸序列。重鏈及輕鏈序列皆在N端具有適合於人類細胞(尤其人類眼組織細胞(例如視網膜細胞)或肝臟及/或肌肉細胞)中之表現及分泌的信號或前導序列。信號序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)之胺基酸序列。或者，信號序列可具有選自 表 2中所列之信號序列中之任一者的胺基酸序列，該等信號序列對應於眼組織細胞類型所分泌之蛋白質。或者，信號序列可適合於肌肉或肝臟細胞中之表現，諸如下文 表 3中所列之彼等序列。
除重鏈及輕鏈可變域以及C H1及C L域序列以外，轉殖基因可在重鏈C H1域序列之C端包含鉸鏈區之全部或一部分。在特定實施例中，抗C5抗原結合域具有SEQ ID NO: 1之重鏈Fab域，其中其他鉸鏈區序列起始於C端纈胺酸(V)之後，該抗C5抗原結合域含有如 圖 2A中所列之胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLRR (SEQ ID NO: 153)及特定言之EPKSCDKTH (SEQ ID NO: 149)、EPKSCDKTHL (SEQ ID NO: 155)、EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 156)、EPKSCDKTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 157)、EPKSCDKTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 158)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 159)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 160)之全部或一部分。在另一實施例中，轉殖基因包含編碼抗體之全長(或實質上全長)重鏈及輕鏈的胺基酸序列，該等重鏈及輕鏈在重鏈之C端包含Fc域，例如具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列( 表 6)或IgG1 Fc域，諸如SEQ ID No. 61或如 圖 5中所描繪，或其突變體或變體。Fc域可經工程改造以改變與一或多個Fc受體之結合及/或效應功能，如章節5.1.9所揭示，見下文。在實施例中，Fc域具有增強之FcRn結合以及減少之FcγR1及C1q結合，例如具有取代M428L及N434A。
在特定實施例中，提供構築體，其編碼全長可伐利單抗，包括Fc域，尤其全長可伐利單抗之核苷酸序列(編碼所表現轉殖基因多肽(包括前導序列及連接子序列)之SEQ ID NO: 38)，或可伐利單抗之抗原結合片段，尤其Fab片段(編碼所表現轉殖基因多肽(包括前導序列及連接子序列)之SEQ ID NO: 37)，如本文表 8中所列，在某些情況下，針對CpG二聚體缺失。轉殖基因亦可包含編碼信號肽MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85；例如在重鏈及/或輕鏈之N端處)的核苷酸序列，該信號肽可由SEQ ID NO: 86之核苷酸序列編碼。編碼輕鏈及重鏈之核苷酸序列可由弗林蛋白酶-2A連接子(SEQ ID NO: 146-149，亦參見SEQ ID NO: 142及144之胺基酸序列)分開，以產生雙順反子載體。或者，輕鏈及重鏈之核苷酸序列由弗林蛋白酶-T2A連接子(諸如SEQ ID NO: 145)分開。可伐利單抗之表現可由組成型或組織特異性啟動子導引。在某些實施例中，轉殖基因含有CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)、CB啟動子或CB長啟動子(SEQ ID NO: 222或223)、GRK1 (SEQ ID NO: 77)啟動子。或者，啟動子可為組織特異性啟動子(或包括啟動子及強化子元件之調控序列)，諸如GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)。在實施例中，內含子序列位於啟動子與編碼序列之間，例如VH4內含子序列(SEQ ID NO: 70)。轉殖基因可含有 表 1或 表 1a或實例13中所提供之元件。編碼可伐利單抗之全長及Fab片段的例示性轉殖基因及其中將ITR序列添加至3'及5'端的人工基因體(或編碼人工基因體之構築體)提供於 表 8中，且包括CAG.可伐利單抗.全長(SEQ ID NO: 44)或CAG.可伐利單抗.Fab (SEQ ID NO: 43)。轉殖基因可包裝至AAV，尤其AAV8中。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含輕鏈之C5抗原結合片段，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 2中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含重鏈之C5抗原結合片段，該重鏈包含與SEQ ID NO: 1中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含輕鏈及重鏈之抗原結合片段，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 2中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，該重鏈包含與SEQ ID NO: 1中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在特定實施例中，C5抗原結合片段包含重鏈，該重鏈包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個胺基酸取代、***或缺失的SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，且該等取代、***或缺失例如在構架區(例如CDR外的彼等區，該等CDR在 圖 2A中加底線)中發生。在特定實施例中，C5抗原結合片段包含輕鏈，該輕鏈包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個胺基酸取代、***或缺失的SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，且例如在構架區(例如CDR外的彼等區，該等CDR在 圖 2A中加底線)中形成取代、***或缺失。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼抗原結合片段且包含編碼六個可伐利單抗CDR之核苷酸序列，該等CDR在 圖 2A之重鏈及輕鏈可變域序列中加底線，該等CDR在構架區(一般而言，人類構架區)之間間隔開且取決於抗原結合分子之形式而與恆定域結合，如此項技術中已知以形成抗C5抗體或其抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈可變域。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因包含編碼依庫珠單抗之Fab部分之重鏈(包括IgG1 CH1域或IgG2 CH1域)(具有SEQ ID NO. 3及4之胺基酸序列)(重鏈Fab分別具有IgG1及IgG2 CH1域)及依庫珠單抗之輕鏈(SEQ ID NO: 5，參見 表 7以及 圖 2B及 圖 2C)的核苷酸序列。核苷酸序列可針對人類細胞中之表現而經密碼子最佳化。核苷酸序列可例如包含如 表 8中所列的SEQ ID NO: 28或29(分別編碼依庫珠單抗重鏈IgG1或IgG2 Fab部分)及SEQ ID NO: 30 (編碼依庫珠單抗輕鏈)之核苷酸序列。重鏈及輕鏈序列皆在N端具有適合於人類細胞(尤其人類眼組織細胞(例如視網膜細胞)或肝臟及/或肌肉細胞)中之表現及分泌的信號或前導序列。信號序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)之胺基酸序列。或者，信號序列可具有選自 表 2中所列之信號序列中之任一者的胺基酸序列，該等信號序列對應於眼組織細胞類型所分泌之蛋白質。或者，信號序列可適合於肌肉或肝臟細胞中之表現，諸如下文 表 3中所列之彼等序列。編碼輕鏈及重鏈之核苷酸序列可由弗林蛋白酶-2A連接子(SEQ ID NO: 146-149，亦參見SEQ ID NO: 142及144之胺基酸序列)分開，以產生雙順反子載體。或者，輕鏈及重鏈之核苷酸序列由弗林蛋白酶-T2A連接子(諸如SEQ ID NO: 145)分開。依庫珠單抗之表現可由組成型或組織特異性啟動子導引。在某些實施例中，轉殖基因含有CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)、CB啟動子或CB長啟動子(SEQ ID NO: 222或223)、GRK1 (SEQ ID NO: 77)啟動子。或者，啟動子可為組織特異性啟動子(或包括啟動子及強化子元件之調控序列)，諸如GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)。在實施例中，內含子序列位於啟動子與編碼序列之間，例如VH4內含子序列(SEQ ID NO: 70)。轉殖基因可含有 表 1或 表 1a或實例13中所提供之元件。編碼全長依庫珠單抗及依庫珠單抗之Fab片段(IgG1及IgG2兩者)的例示性轉殖基因及其中將ITR序列添加至3'及5'端的人工基因體(或編碼人工基因體之構築體)提供於 表 8中且包括CAG.依庫珠單抗.全長(SEQ ID NO: 47)或CAG.依庫珠單抗.Fab.IgG1 (SEQ ID NO: 45)或CAG.依庫珠單抗.Fab.IgG2 (SEQ ID NO: 46)或依庫珠單抗.scFv (SEQ ID NO: 268或269)。轉殖基因可包裝至AAV，尤其AAV8中。
除重鏈及輕鏈可變域以及C H1及C L域序列以外，轉殖基因可在重鏈C H1域序列之C端包含鉸鏈區之全部或一部分。在特定實施例中，抗C5抗原結合域具有SEQ ID NO: 3或4之重鏈Fab域，其中其他鉸鏈區序列起始於C端纈胺酸(V)之後，該抗C5抗原結合域含有如 圖 2B 及圖 2C中所列之胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 153)及特定言之EPKSCDKTHL (SEQ ID NO: 155)、EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 156)、EPKSCDKTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 157)、EPKSCDKTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 158)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 159)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 160)之全部或一部分。在另一實施例中，轉殖基因包含編碼抗體之全長(或實質上全長)重鏈及輕鏈的胺基酸序列，該等重鏈及輕鏈在重鏈之C端包含Fc域，例如具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列( 表 6)或IgG1 Fc域，諸如SEQ ID No. 61或如 圖 5中所描繪，或其突變體或變體。Fc域可經工程改造以改變與一或多個Fc受體之結合及/或效應功能，如章節5.1.9所揭示，見下文。在實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO: 37 (編碼可伐利單抗Fab片段)或SEQ ID NO: 38 (編碼可伐利單抗全長抗體)之核苷酸序列。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含輕鏈之C5抗原結合片段，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 5中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含重鏈之C5抗原結合片段，該重鏈包含與SEQ ID NO: 3或4中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含輕鏈及重鏈之抗原結合片段，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 5中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，該重鏈包含與SEQ ID NO: 3或4中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在特定實施例中，C5抗原結合片段包含重鏈，該重鏈包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個胺基酸取代、***，或缺失的SEQ ID NO: 3或4之胺基酸序列，且該等取代、***或缺失例如在構架區(例如CDR外之彼等區，該等CDR在 圖 2B及 圖 2C中加底線)發生或為經其他治療性抗體中之一或多者之重鏈中處於彼位置之胺基酸取代，例如如藉由 圖 7A中之比對所鑑別。在特定實施例中，C5抗原結合片段包含輕鏈，該輕鏈包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個胺基酸取代、***或缺失的SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，且該等取代、***或缺失例如在構架區(例如CDR外之彼等區，該等CDR在 圖 2B或 圖 2C中加底線)發生或為經其他治療性抗體中之一或多者之輕鏈中處於彼位置之胺基酸取代，例如如藉由 圖 7B中之比對所鑑別。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼抗原結合片段且包含編碼六個依庫珠單抗CDR之核苷酸序列，該等CDR在 圖 2B及 圖 2C之重鏈及輕鏈可變域序列中加底線，該等CDR在構架區(一般而言，人類構架區)之間間隔開且取決於抗原結合分子之形式而與恆定域結合，如此項技術中已知以形成抗C5抗體或其抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈可變域。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因包含編碼雷武珠單抗之Fab部分之重鏈及輕鏈(分別具有SEQ ID NO. 6及7之胺基酸序列，參見 表 7及 圖 2D)的核苷酸序列。核苷酸序列可針對人類細胞中之表現而經密碼子最佳化。重鏈及輕鏈序列皆在N端具有適合於人類細胞(尤其人類眼組織細胞(例如視網膜細胞)或肝臟及/或肌肉細胞)中之表現及分泌的信號或前導序列。信號序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)之胺基酸序列。或者，信號序列可具有選自 表 2中所列之信號序列中之任一者的胺基酸序列，該等信號序列對應於眼組織細胞類型所分泌之蛋白質。或者，信號序列可適合於肌肉或肝臟細胞中之表現，諸如下文 表 3中所列之彼等序列。編碼輕鏈及重鏈之核苷酸序列可由弗林蛋白酶-2A連接子(SEQ ID NO: 146-149，亦參見SEQ ID NO: 142及144之胺基酸序列)分開，以產生雙順反子載體。或者，輕鏈及重鏈之核苷酸序列由弗林蛋白酶-T2A連接子(諸如SEQ ID NO: 145)分開。雷武珠單抗之表現可由組成型或組織特異性啟動子導引。在某些實施例中，轉殖基因含有CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)、CB啟動子或CB長啟動子(SEQ ID NO: 222或223)、GRK1 (SEQ ID NO: 77)啟動子。或者，啟動子可為組織特異性啟動子(或包括啟動子及強化子元件之調控序列)，諸如GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)。在實施例中，內含子序列位於啟動子與編碼序列之間，例如VH4內含子序列(SEQ ID NO: 70)。轉殖基因可含有 表 1或 表 1a或實例13中所提供之元件。轉殖基因可包裝至AAV，尤其AAV8中。
除重鏈及輕鏈可變域以及C H1及C L域序列以外，轉殖基因可在重鏈C H1域序列之C端包含鉸鏈區之全部或一部分。在特定實施例中，抗C5抗原結合域具有SEQ ID NO: 6之重鏈可變域，其中其他鉸鏈區序列起始於C端纈胺酸(V)之後，該抗C5抗原結合域含有如 圖 2D中所列之胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 153)及特定言之EPKSCDKTHL (SEQ ID NO: 155)、EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 156)、EPKSCDKTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 157)、EPKSCDKTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 158)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 159)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 160)之全部或一部分。在另一實施例中，轉殖基因包含編碼抗體之全長(或實質上全長)重鏈及輕鏈的胺基酸序列，該等重鏈及輕鏈在重鏈之C端包含Fc域，例如具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列( 表 6)或IgG1 Fc域，諸如SEQ ID No. 61或如 圖 5中所描繪，或其突變體或變體。Fc域可經工程改造以改變與一或多個Fc受體之結合及/或效應功能，如章節5.1.9所揭示，見下文。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含輕鏈之C5抗原結合片段，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 7中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含重鏈之C5抗原結合片段，該重鏈包含與SEQ ID NO: 6中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含輕鏈及重鏈之抗原結合片段，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 7中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，該重鏈包含與SEQ ID NO: 6中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在特定實施例中，C5抗原結合片段包含重鏈，該重鏈包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個胺基酸取代、***或缺失的SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，且該等取代、***或缺失例如在構架區(例如CDR外之彼等區，該等CDR在 圖 2D中加底線)發生或為經其他治療性抗體中之一或多者之重鏈中處於彼位置之胺基酸取代，例如如藉由 圖 7A中之比對所鑑別。在特定實施例中，C5抗原結合片段包含輕鏈，該輕鏈包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個胺基酸取代、***或缺失的SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，且該等取代、***或缺失例如在構架區(例如CDR外之彼等區，該等CDR在 圖 2D中加底線)發生或為經其他治療性抗體中之一或多者之輕鏈中處於彼位置之胺基酸取代，例如如藉由 圖 7B中之比對所鑑別。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼抗原結合片段且包含編碼六個雷武珠單抗CDR之核苷酸序列，該等CDR在 圖 2D之重鏈及輕鏈可變域序列中加底線，該等CDR在構架區(一般而言，人類構架區)之間間隔開且取決於抗原結合分子之形式而與恆定域結合，如此項技術中已知以形成抗C5抗體或其抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈可變域。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因包含編碼特度魯單抗之Fab部分之重鏈及輕鏈(分別具有SEQ ID NO. 8及9之胺基酸序列，參見 表 7及 圖 2E)的核苷酸序列。核苷酸序列可針對人類細胞中之表現而經密碼子最佳化。重鏈及輕鏈序列皆在N端具有適合於人類細胞(尤其人類眼組織細胞(例如視網膜細胞)或肝臟及/或肌肉細胞)中之表現及分泌的信號或前導序列。信號序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)之胺基酸序列。或者，信號序列可具有選自 表 2中所列之信號序列中之任一者的胺基酸序列，該等信號序列對應於眼組織細胞類型所分泌之蛋白質。或者，信號序列可適合於肌肉或肝臟細胞中之表現，諸如下文 表 3中所列之彼等序列。編碼輕鏈及重鏈之核苷酸序列可由弗林蛋白酶-2A連接子(SEQ ID NO: 146-149，亦參見SEQ ID NO: 142及144之胺基酸序列)分開，以產生雙順反子載體。或者，輕鏈及重鏈之核苷酸序列由弗林蛋白酶-T2A連接子(諸如SEQ ID NO: 145)分開。特度魯單抗之表現可由組成型或組織特異性啟動子導引。在某些實施例中，轉殖基因含有CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)、CB啟動子或CB長啟動子(SEQ ID NO: 222或223)、GRK1 (SEQ ID NO: 77)啟動子。或者，啟動子可為組織特異性啟動子(或包括啟動子及強化子元件之調控序列)，諸如GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)。在實施例中，內含子序列位於啟動子與編碼序列之間，例如VH4內含子序列(SEQ ID NO: 70)。轉殖基因可含有 表 1或 表 1a或實例13中所提供之元件。轉殖基因可包裝至AAV，尤其AAV8中。
除重鏈及輕鏈可變域以及C H1及C L域序列以外，轉殖基因可在重鏈C H1域序列之C端包含鉸鏈區之全部或一部分。在特定實施例中，抗C5抗原結合域具有SEQ ID NO: 8之重鏈可變域，其中其他鉸鏈區序列起始於C端纈胺酸(V)之後，該抗C5抗原結合域含有如 圖 2E中所列之胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 153)及特定言之EPKSCDKTHL (SEQ ID NO: 155)、EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 156)、EPKSCDKTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 157)、EPKSCDKTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 158)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 159)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 160)之全部或一部分。在另一實施例中，轉殖基因包含編碼抗體之全長(或實質上全長)重鏈及輕鏈的胺基酸序列，該等重鏈及輕鏈在重鏈之C端包含Fc域，例如具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列( 表 6)或IgG1 Fc域，諸如SEQ ID No. 61或如 圖 5中所描繪，或其突變體或變體。Fc域可經工程改造以改變與一或多個Fc受體之結合及/或效應功能，如章節5.1.9所揭示，見下文。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含輕鏈之C5抗原結合片段，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 9中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含重鏈之C5抗原結合片段，該重鏈包含與SEQ ID NO: 8中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼包含輕鏈及重鏈之抗原結合片段，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 9中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，該重鏈包含與SEQ ID NO: 68中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在特定實施例中，C5抗原結合片段包含重鏈，該重鏈包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個胺基酸取代、***或缺失的SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，且該等取代、***或缺失例如在構架區(例如CDR外之彼等區，該等CDR在 圖 2E中加底線)發生或為經其他治療性抗體中之一或多者之重鏈中處於彼位置之胺基酸取代，例如如藉由 圖 7A中之比對所鑑別。在特定實施例中，C5抗原結合片段包含輕鏈，該輕鏈包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個胺基酸取代、***或缺失的SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，且該等取代、***或缺失例如在構架區(例如CDR外之彼等區，該等CDR在 圖 2E中加底線)發生或為經其他治療性抗體中之一或多者之輕鏈中處於彼位置之胺基酸取代，例如如藉由 圖 7B中之比對所鑑別。
在某些實施例中，抗C5抗原結合片段轉殖基因編碼抗原結合片段且包含編碼六個特斯多魯單抗CDR之核苷酸序列，該等CDR在 圖 2E之重鏈及輕鏈可變域序列中加底線，該等CDR在構架區(一般而言，人類構架區)之間間隔開且取決於抗原結合分子之形式而與恆定域結合，如此項技術中已知以形成抗C5抗體或其抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈可變域。
在某些實施例中，抗C3抗原結合片段轉殖基因包含編碼NGM621之Fab部分之重鏈及輕鏈(分別地，重鏈具有SEQ ID NO. 10或11之胺基酸序列且輕鏈具有SEQ ID NO: 14之胺基酸序列，參見 表 7及 圖 2F及 圖 2G)的核苷酸序列。核苷酸序列可針對人類細胞中之表現而經密碼子最佳化。重鏈及輕鏈序列皆在N端具有適合於人類細胞(尤其人類眼組織細胞(例如視網膜細胞)或肝臟及/或肌肉細胞)中之表現及分泌的信號或前導序列。信號序列可具有MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)之胺基酸序列。或者，信號序列可具有選自 表 2中所列之信號序列中之任一者的胺基酸序列，該等信號序列對應於眼組織細胞類型所分泌之蛋白質。或者，信號序列可適合於肌肉或肝臟細胞中之表現，諸如下文 表 3中所列之彼等序列。編碼輕鏈及重鏈之核苷酸序列可由弗林蛋白酶-2A連接子(SEQ ID NO: 146-149，亦參見SEQ ID NO: 142及144之胺基酸序列)分開，以產生雙順反子載體。或者，輕鏈及重鏈之核苷酸序列由弗林蛋白酶-T2A連接子(諸如SEQ ID NO: 145)分開。NGM621之表現可由組成型或組織特異性啟動子導引。在某些實施例中，轉殖基因含有CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)、CB啟動子或CB長啟動子(SEQ ID NO: 222或223)、GRK1 (SEQ ID NO: 77)啟動子。或者，啟動子可為組織特異性啟動子(或包括啟動子及強化子元件之調控序列)，諸如GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)。在實施例中，內含子序列位於啟動子與編碼序列之間，例如VH4內含子序列(SEQ ID NO: 70)。轉殖基因可含有 表 1或 表 1a或實例13中所提供之元件。轉殖基因可包裝至AAV，尤其AAV8中。
除重鏈及輕鏈可變域以及C H1及C L域序列以外，轉殖基因可在重鏈C H1域序列之C端包含鉸鏈區之全部或一部分。在特定實施例中，抗C53抗原結合域具有SEQ ID NO: 6之重鏈可變域，其中其他鉸鏈區序列起始於C端纈胺酸(V)之後，該抗C53抗原結合域含有如 圖 2F及 圖 2G中所列之胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 153)及特定言之EPKSCDKTHL (SEQ ID NO: 155)、EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 156)、EPKSCDKTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 157)、EPKSCDKTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 158)、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 159)或EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 160)之全部或一部分。在另一實施例中，轉殖基因包含編碼抗體之全長(或實質上全長)重鏈及輕鏈的胺基酸序列，該等重鏈及輕鏈在重鏈之C端包含Fc域，例如具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列( 表 6)或IgG1 Fc域，諸如SEQ ID No. 61或如 圖 5中所描繪，或其突變體或變體。Fc域可經工程改造以改變與一或多個Fc受體之結合及/或效應功能，如章節5.1.9所揭示，見下文。
在某些實施例中，抗C3抗原結合片段轉殖基因編碼包含輕鏈之C3抗原結合片段，該輕鏈包含與SEQ ID NO:11中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在某些實施例中，抗C3抗原結合片段轉殖基因編碼包含重鏈之C3抗原結合片段，該重鏈包含與SEQ ID NO: 10中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在某些實施例中，抗C3抗原結合片段轉殖基因編碼包含輕鏈及重鏈之抗原結合片段，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 11中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，該重鏈包含與SEQ ID NO: 10中所列之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在特定實施例中，C3抗原結合片段包含重鏈，該重鏈包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個胺基酸取代、***或缺失的SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，且該等取代、***或缺失例如在構架區(例如CDR外之彼等區，該等CDR在 圖 2F及 圖 2G中加底線)中發生或為經其他治療性抗體中之一或多者之重鏈中處於彼位置之胺基酸取代，例如如藉由 圖 7A中之比對所鑑別。在特定實施例中，C3抗原結合片段包含輕鏈，該輕鏈包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個胺基酸取代、***或缺失的SEQ ID NO: 11之胺基酸序列，且該等取代、***或缺失在例如構架區(例如CDR外之彼等區，該等CDR在 圖 2F或 圖 2G中加底線)中發生或為經其他治療性抗體中之一或多者之輕鏈中處於彼位置之胺基酸取代，例如如藉由 圖 7B中之比對所鑑別。
在某些實施例中，抗C3抗原結合片段轉殖基因編碼抗原結合片段且包含編碼六個NGM621 CDR之核苷酸序列，該等CDR在 圖 2F及 圖 2G之重鏈及輕鏈可變域序列中加底線，該等CDR在構架區(一般而言，人類構架區)之間間隔開且取決於抗原結合分子之形式而與恆定域結合，如此項技術中已知以形成抗C3抗體或其抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈可變域。
亦提供轉殖基因及包含編碼一種抗C5抗體BB5.1之轉殖基因的重組AAV載體，該抗C5抗體結合非人類靈長類動物中之C5且可在本文所描述之編碼彼等抗C5抗體及其抗原結合片段的重組載體之臨床前研究中用作至少依庫珠單抗及雷武珠單抗之替代抗體。因此，轉殖基因編碼BB5.1之重鏈及輕鏈(SEQ ID NO: 15及16為BB5.1之全長重鏈及輕鏈)(參見 表 7)。編碼BB5.1重鏈及輕鏈之核苷酸序列分別包括SEQ ID NO: 35及36。BB5.1重鏈及輕鏈可自轉殖基因表現，重鏈及輕鏈由具有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列且可由SEQ ID NO: 42之核苷酸序列編碼的連接子連接。在實施例中，編碼BB5.1重鏈及輕鏈之轉殖基因可以可操作方式連接於調控序列以表現於眼組織細胞中且可由ITR序列側接。舉例而言，編碼構築體或人工基因體具有SEQ ID NO: 48之核苷酸序列。
在某些實施例中，提供載體，其包括AAV載體，該AAV載體包含編碼具有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列( 表 7)之人類補體因子H樣1蛋白(CFHL-1)的轉殖基因。CFHL-1蛋白可由包含SEQ ID NO: 49之核苷酸序列(參見 表 8)編碼。或者，提供載體，包括AAV載體，該AAV載體包含編碼具有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列(參見UniProtKB-P08603)之人類補體因子H蛋白的轉殖基因。SEQ ID NO: 23及SEQ ID NO: 24之前十八個胺基酸為CFHL-1或CFH信號序列(亦為SEQ ID NO: 90， 表 2)。核苷酸序列可針對人類細胞中之表現而經密碼子最佳化。CFHL-1蛋白可在N端具有適合於人類細胞(尤其人類眼組織細胞(例如視網膜細胞)或肝臟及/或肌肉細胞)中之表現及分泌的信號或前導序列。信號序列可具有內源性CFHL-1 (或CFH)序列之胺基酸序列，其為MRLLAKIICLMLWAICVA (SEQ ID NO: 90)(在 表 7中加底線)或可為MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)。或者，信號序列可具有選自 表 2中所列之信號序列中之任一者的胺基酸序列，該等信號序列對應於眼組織細胞類型所分泌之蛋白質。或者，信號序列可適合於肌肉或肝臟細胞中之表現，諸如下文 表 3中所列之彼等序列。CHLH-1之表現可由組成型或組織特異性啟動子導引。在某些實施例中，轉殖基因含有CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)、CB啟動子或CB長啟動子(SEQ ID NO: 222或223)、GRK1 (SEQ ID NO: 77)啟動子。或者，啟動子可為組織特異性啟動子(或包括啟動子及強化子元件之調控序列)，諸如GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)。在實施例中，內含子序列位於啟動子與編碼序列之間，例如VH4內含子序列(SEQ ID NO: 70)。轉殖基因可含有 表 1或 表 1a或實例13中所提供之元件。轉殖基因可包裝至AAV，尤其AAV8中。
在某些實施例中，提供編碼構築體或人工基因體，其中可操作地連接於調控序列之轉殖基因側接ITR序列。構築體或人工基因體可包含SEQ ID NO: 48之核苷酸序列或由其組成。
在特定實施例中，提供根據實例13的抗C3及抗C5抗體之Fab、scFv及全長重鏈及輕鏈之胺基酸序列。在特定實施例中，提供編碼根據實例13之人工基因體的核苷酸序列。
表 7及實例13提供抗C3及抗C5抗體之Fab、scFv及全長重鏈及輕鏈以及轉殖基因之表現產物(包括信號序列及連接子，諸如弗林蛋白酶/T2a連接子)之胺基酸序列，及CFHL-1之胺基酸序列。 表 8提供編碼抗體及本文所揭示之CFHL-1蛋白、轉殖基因編碼序列及人工基因體之Fab及全長重鏈及輕鏈的核苷酸序列。 表 7. 重鏈及輕鏈及蛋白質之胺基酸序列
mAb或蛋白質 鏈/ SEQ ID NO: 序列
可伐利單抗 Fab 重鏈/ SEQ ID NO: 1 QVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTVH SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSSA STKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK V EPKSCDKTH
可伐利單抗 輕鏈/ SEQ ID NO: 2 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SSLAWYQQKP GKAPKLLIYG ASETESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN TKVGSSYGNT FGGGTKVEIK R TVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
依庫珠單抗 Fab IgG1 重鏈/ SEQ ID NO: 3 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGSTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SSA STKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCDKTHT
依庫珠單抗 Fab IgG2 重鏈/ SEQ ID NO: 4 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGSTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SSA STKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV
依庫珠單抗 輕鏈/ SEQ ID NO: 5 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQQKP GKAPKLLIYG ATNLADGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN VLNTPLTFGQ GTKVEIKR TV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
雷武珠單抗 Fab 重鏈/ SEQ ID NO: 6 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGHIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGHTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SS ASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVE+/- CPPCPA+/- PPVAG
雷武珠單抗 輕鏈/ SEQ ID NO: 7 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQQKP GKAPKLLIYG ATNLADGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN VLNTPLTFGQ GTKVEIKR TV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
特度魯單抗 Fab 重鏈/ SEQ ID NO: 8 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGG IGPFFGTANY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARDT PYFDYWGQGT LVTVSS ASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD+/- KTHT (或KTHL) +/- CPPCPA +/- PEAAGGPSVFL
特度魯單抗 輕鏈/ SEQ ID NO: 9 SYELTQPLSV SVALGQTARI TCSGDSIPNY YVYWYQQKPG QAPVLVIYDD SNRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISRAQAG DEADYYCQSF DSSLNAEVFG GGTKLTVL GQ PKAAPSVTLF PPSSEELQAN KATLVCLISD FYPGAVTVAW KADSSPVKAG VETTTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS
NGM621 Fab 重鏈/ SEQ ID NO: 10 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DFYMDWVRQA PGQRLEWMGY IYPHNAGTTY NQQFTGRVTI TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG GFDFDYWGQG TLVTVSS AST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC D =/-KTHT ( 或 KTHL) CPPCP APALAGGPSV FL
NGM621 Fab 重鏈/ SEQ ID NO: 11 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DFYMDWVRQA PGQRLEWMGY IYPHNTGTTY NQQFTGRVTI TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG GFDFDYWGQG TLVTVSS AST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC D =/-KTHT ( 或 KTHL) CPPCP APALAGGPSV FL
NGM621    全長重鏈 重鏈/ SEQ ID NO: 12 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DFYMDWVRQA PGQRLEWMGY IYPHNAGTTY NQQFTGRVTI TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG GFDFDYWGQG TLVTVSS ASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APALAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRIPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
NGM621 輕鏈/ SEQ ID NO: 13 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASENVD TYVSWYQQKP GKAPKLLIYG ASNRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYHCGQ SHSYPLTFGQ GTKLEIK
NGM621 輕鏈/ SEQ ID NO: 14 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASENVD TYVSWYQQKP GKAPKLLIYG ASNRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYHCGQ SHSYPLTFGQ GTKLEIK RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSILT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
BB5.1 全長重鏈 重鏈/ SEQ ID NO: 15 QVQLQQPGAE LVRPGTSVKL SCKASGYTFT SSWMHWVKQR PGQGLEWIGV IDPSDSYTNY NQKFKGKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARGG GSSYNRYFDV WGTGTTVTVS SAKTTPPSVY PLAPGSAAQT NSMVTLGCLV KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS DLYTLSSSVT VPSSPRPSET VTCNVAHPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCIC TVPEVSSVFI FPPKPKDVLT ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDV EVHTAQTQPR EEQFNSTFRS VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMNTNG SYFVYSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK
BB5.1 輕鏈/ SEQ ID NO: 16 NIMMTQSPSS LAVSAGEKVT MSCKSSQSVL YSSNQKNYLA WYQQKPGQSP KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVQAEDLA VYYCHQYLSS RTFGGGTKLE IKRADAAPTV SIFPPSSEQL TSGGASVVCF LNNFYPKDIN VKWKIDGSER QNGVLNSWTD QDSKDSTYSM SSTLTLTKDE YERHNSYTCE ATHKTSTSPI VKSFNRGEC
可伐利單抗載體化Fab-完全編碼蛋白質 SEQ ID NO: 17 MYRMQLLLLI ALSLALVTNSQVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTVH SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK V EPKSCDKTH RKRRGSGEGR GSLLTCGDVE ENPGP MYRMQ LLLLIALSLA LVTNSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCRA SQGISSSLAW YQQKPGKAPK LLIYGASETE SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYCQNTKVGS SYGNTFGGGT KVEIKRTVAA PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRG EC 前導序列以粗體展示；弗林蛋白酶-2A連接子加底線；鉸鏈區以斜體展示
可伐利單抗載體化完全編碼蛋白質 SEQ ID NO: 18 MYRMQLLLLI ALSLALVTNSQVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTVH SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK V EPKSCDKTH TCPPCPAPEL RRGPKVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVLHEALHA HYTRKELSLS P RKRRGSGEG RGSLLTCGDV EENPGP MYRM QLLLLIALSL ALVTNSDIQM TQSPSSLSAS VGDRVTITCR ASQGISSSLA WYQQKPGKAP KLLIYGASET ESGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA TYYCQNTKVG SSYGNTFGGG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC 前導序列以粗體展示；弗林蛋白酶-2A連接子加底線；鉸鏈區以斜體展示
依庫珠單抗載體化Fab-IgG1完全編碼蛋白質 SEQ ID NO: 19 MYRMQLLLLI ALSLALVTNSQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGSTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKR V EPKSCDKTHT RKRRGSGEGR GSLLTCGDVE ENPGP MYRMQ LLLLIALSLA LVTNSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCGA SENIYGALNW YQQKPGKAPK LLIYGATNLA DGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYCQNVLNTP LTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC 前導序列以粗體展示；弗林蛋白酶-2A連接子加底線；鉸鏈區以斜體展示
依庫珠單抗載體化Fab-IgG2完全編碼蛋白質 SEQ ID NO: 20 MYRMQLLLLI ALSLALVTNSQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGSTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV RKRRGSGEGR GSLLTCGDVE ENPGP MYRMQ LLLLIALSLA LVTNSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCGA SENIYGALNW YQQKPGKAPK LLIYGATNLA DGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYCQNVLNTP LTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC 前導序列以粗體展示；弗林蛋白酶-2A連接子加底線；鉸鏈區以斜體展示
依庫珠單抗載體化完全編碼蛋白質 SEQ ID NO: 21 MYRMQLLLLI ALSLALVTNSQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGSTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK RK RRGSGEGRGS LLTCGDVEEN PGP MYRMQLL LLIALSLALV TNSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCGASE NIYGALNWYQ QKPGKAPKLL IYGATNLADG VPSRFSGSGS GTDFTLTISS LQPEDFATYY CQNVLNTPLT FGQGTKVEIK RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC 前導序列以粗體展示；弗林蛋白酶-2A連接子加底線；鉸鏈區以斜體展示
BB5.1載體化全長mAb-完全編碼蛋白質 SEQ ID NO: 22 MYRMQLLLLIALSLALVTNSQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSSWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGGSSYNRYFDVWGTGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK RKRRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP MYRMQLLLLIALSLALVTNSNIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRGEC 前導序列以粗體展示；弗林蛋白酶-2A連接子加底線；鉸鏈區以斜體展示
CFHL1 SEQ ID NO: 23 MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNHGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVSFTL* 前導序列呈粗體。
人類補體因子H (UniProtKB-P08603) SEQ ID NO: 24 MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSPDLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKR 前導序列呈粗體。
可伐利單抗 VH SEQ ID NO: 251 QVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTVH SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSSA
可伐利單抗 VL SEQ ID NO: 252 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SSLAWYQQKP GKAPKLLIYG ASETESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN TKVGSSYGNT FGGGTKVEIK R
依庫珠單抗 VH SEQ ID NO: 253 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGSTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SSA STKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCDKTHT
依庫珠單抗 VL SEQ ID NO: 254 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQQKP GKAPKLLIYG ATNLADGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN VLNTPLTFGQ GTKVEIKR
雷武珠單抗 VH SEQ ID NO: 255 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGHIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGHTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SS
雷武珠單抗 VL SEQ ID NO: 256 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQQKP GKAPKLLIYG ATNLADGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN VLNTPLTFGQ GTKVEIKR
特度魯單抗 VH SEQ ID NO: 257 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGG IGPFFGTANY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARDT PYFDYWGQGT LVTVSS
特度魯單抗 VL SEQ ID NO: 258 SYELTQPLSV SVALGQTARI TCSGDSIPNY YVYWYQQKPG QAPVLVIYDD SNRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISRAQAG DEADYYCQSF DSSLNAEVFG GGTKLTVL
NGM621 VH SEQ ID NO: 259 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DFYMDWVRQA PGQRLEWMGY IYPHNAGTTY NQQFTGRVTI TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG GFDFDYWGQG TLVTVSS
NGM621 VL SEQ ID NO: 260 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASENVD TYVSWYQQKP GKAPKLLIYG ASNRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYHCGQ SHSYPLTFGQ GTKLEIK
NGM621 VL SEQ ID NO:260 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASENVD TYVSWYQQKP GKAPKLLIYG ASNRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYHCGQ SHSYPLTFGQ GTKLEIK
可伐利單抗載體化scFv mAb-完全編碼蛋白質(H-L) SEQ ID NO:261 QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVHSSYYMAWVRQAPGKGLEWVGAIFTGSGAEYKAEWAKGRVTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCASDAGYDYPTHAMHYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASETESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNTKVGSSYGNTFGGGTKVEIKR 重鏈 + 連接子 + 輕鏈
可伐利單抗載體化scFv mAb-完全編碼蛋白質(L-H) SEQ ID NO:262 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASETESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNTKVGSSYGNTFGGGTKVEIKR GGGGSGGGGSGGGGS QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVHSSYYMAWVRQAPGKGLEWVGAIFTGSGAEYKAEWAKGRVTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCASDAGYDYPTHAMHYWGQGTLVTVSS 輕鏈 + 連接子 + 重鏈
依庫珠單抗載體化scFv mAb-完全編碼蛋白質(H-L) SEQ ID NO:263 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGSTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SSA GGGGSGGGGSGGGGS DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQQKP GKAPKLLIYG ATNLADGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN VLNTPLTFGQ GTKVEIKR 重鏈 + 連接子 + 輕鏈
依庫珠單抗載體化scFv mAb-完全編碼蛋白質(L-H) SEQ ID NO:264 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQQKP GKAPKLLIYG ATNLADGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN VLNTPLTFGQ GTKVEIKR GGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGSTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SSA 輕鏈 + 連接子 + 重鏈
雷武珠單抗載體化scFv mAb-完全編碼蛋白質(H-L) SEQ ID NO:265 VQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGHIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGHTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SS GGGGSGGGGSGGGGS DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQQKP GKAPKLLIYG ATNLADGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN VLNTPLTFGQ GTKVEIKR 重鏈 + 連接子 + 輕鏈
雷武珠單抗載體化scFv mAb-完全編碼蛋白質(L-H) SEQ ID NO:266 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQQKP GKAPKLLIYG ATNLADGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN VLNTPLTFGQ GTKVEIKR GGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGHIFS NYWIQWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGHTEY TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SS 輕鏈 + 連接子 + 重鏈
特度魯單抗載體化scFv mAb-完全編碼蛋白質(H-L) SEQ ID NO:270 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGG IGPFFGTANY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARDT PYFDYWGQGT LVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS SYELTQPLSV SVALGQTARI TCSGDSIPNY YVYWYQQKPG QAPVLVIYDD SNRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISRAQAG DEADYYCQSF DSSLNAEVFG GGTKLTVL 重鏈 + 連接子 + 輕鏈
特度魯單抗載體化scFv mAb-完全編碼蛋白質(L-H) SEQ ID NO:271 SYELTQPLSV SVALGQTARI TCSGDSIPNY YVYWYQQKPG QAPVLVIYDD SNRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISRAQAG DEADYYCQSF DSSLNAEVFG GGTKLTVL GGGGSGGGGSGGGGS EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGG IGPFFGTANY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARDT PYFDYWGQGT LVTVSS 輕鏈 + 連接子 + 重鏈
表 8. 重鏈及輕鏈、所表現多肽、蛋白質以及基因體之核苷酸序列
mAb、蛋白質或構築體名稱 鏈/ SEQ ID NO: 序列
可伐利單抗重鏈Fab 重鏈/ SEQ ID NO: 26 CAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGACTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCTCTGGCTTCACAGTGCACAGCAGCTACTACATGGCCTGGGTTAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTTGGAGCCATCTTCACAGGCTCTGGGGCTGAGTATAAGGCTGAGTGGGCCAAGGGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACCTACTACTGTGCCTCTGATGCTGGCTATGACTACCCCACACATGCCATGCACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCAGCAAGAGCACCAGTGGTGGAACAGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGATTACTTCCCTGAGCCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCACTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGTGACAAGACCCAC
可伐利單抗 輕鏈 輕鏈/ SEQ ID NO: 27 GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCTCTAGCAGTCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGGGGCCTCTGAGACAGAATCTGGGGTGCCCAGCAGATTTTCAGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGCCAGAACACCAAAGTGGGCAGCAGCTATGGCAACACCTTTGGTGGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTGTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCAGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGC
依庫珠單抗Fab IgG1 重鏈/ SEQ ID NO: 28 CAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAACCTGGGGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACATCTTCAGCAACTATTGGATCCAGTGGGTCAGACAGGCCCCTGGCCAAGGACTTGAGTGGATGGGAGAGATCCTGCCTGGCTCTGGCAGCACAGAGTACACAGAGAACTTCAAGGACAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCACCTCCACAGTGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACAGCAGTGTACTATTGTGCCAGATACTTCTTTGGCAGCAGCCCCAACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCAGCAAGAGCACCAGTGGTGGAACAGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCACTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAACCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACC
依庫珠單抗Fab IgG2 重鏈/ SEQ ID NO: 29 CAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAACCTGGGGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACATCTTCAGCAACTACTGGATTCAGTGGGTCAGACAGGCCCCTGGCCAAGGACTTGAGTGGATGGGAGAGATCCTGCCTGGCTCTGGCAGCACAGAGTACACAGAGAACTTCAAGGACAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCACCTCCACAGTGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACAGCAGTGTACTATTGTGCCAGATACTTCTTTGGCAGCAGCCCCAACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCAGAAGCACCTCTGAGTCTACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTTCCTGAGCCTGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCTCTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCCAGCAGCAATTTTGGCACCCAGACCTACACCTGTAATGTGGACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTG
依庫珠單抗輕鏈 輕鏈/ SEQ ID NO: 30 GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATCACCTGTGGGGCCTCTGAGAACATCTATGGGGCCCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATATATGGGGCCACCAATCTGGCTGATGGGGTGCCCTCTAGATTTTCTGGCAGTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGTCAGAATGTGCTGAACACCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTaTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCTGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGC
雷武珠單抗重鏈 Fab 重鏈/ SEQ ID NO: 31 caggtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcgcgagcgtgaaagtgagctgcaaagcgagcggccatatttttagcaactattggattcagtgggtgcgccaggcgccgggccagggcctggaatggatgggcgaaattctgccgggcagcggccataccgaatataccgaaaactttaaagatcgcgtgaccatgacccgcgataccagcaccagcaccgtgtatatggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcggtgtattattgcgcgcgctatttttttggcagcagcccgaactggtattttgatgtgtggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgcgagcaccaaaggcccgagcgtgtttccgctggcgccgtgcagccgcagcaccagcgaaagcaccgcggcgctgggctgcctggtgaaagattattttccggaaccggtgaccgtgagctggaacagcggcgcgctgaccagcggcgtgcatacctttccggcggtgctgcagagcagcggcctgtatagcctgagcagcgtggtgaccgtgccgagcagcaactttggcacccagacctatacctgcaacgtggatcataaaccgagcaacaccaaagtggataaaaccgtggaacgcaaatgctgcgtggaa +/- TGCCCCCCCTGCCCCGCC +/- CCCCCCGTGGCCGGC
雷武珠單抗輕鏈 輕鏈/ SEQ ID NO: 32 gatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcggcgcgagcgaaaacatttatggcgcgctgaactggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatggcgcgaccaacctggcggatggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccagaacgtgctgaacaccccgctgacctttggccagggcaccaaagtggaaattaaacgcaccgtggcggcgccgagcgtgtttatttttccgccgagcgatgaacagctgaaaagcggcaccgcgagcgtggtgtgcctgctgaacaacttttatccgcgcgaagcgaaagtgcagtggaaagtggataacgcgctgcagagcggcaacagccaggaaagcgtgaccgaacaggatagcaaagatagcacctatagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaagcggattatgaaaaacataaagtgtatgcgtgcgaagtgacccatcagggcctgagcagcccggtgaccaaaagctttaaccgcggcgaatgc
特度魯單抗重鏈 Fab 重鏈/ SEQ ID NO: 33 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCAGCTACGCCATCAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGGCATCGGCCCCTTCTTCGGCACCGCCAACTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGACGAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACACCCCCTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGAC+/- AAGACCCACACC (或AAGACCCACCTG) +/- TGCCCCCCCTGCCCCGCC +/-CCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTG
特度魯單抗輕鏈 輕鏈/ SEQ ID NO: 34 AGCTACGAGCTGACCCAGCCCCTGAGCGTGAGCGTGGCCCTGGGCCAGACCGCCAGGATCACCTGCAGCGGCGACAGCATCCCCAACTACTACGTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCGTGCTGGTGATCTACGACGACAGCAACAGGCCCAGCGGCATCCCCGAGAGGTTCAGCGGCAGCAACAGCGGCAACACCGCCACCCTGACCATCAGCAGGGCCCAGGCCGGCGACGAGGCCGACTACTACTGCCAGAGCTTCGACAGCAGCCTGAACGCCGAGGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGCCAGCCCAAGGCCGCCCCCAGCGTGACCCTGTTCCCCCCCAGCAGCGAGGAGCTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGATCAGCGACTTCTACCCCGGCGCCGTGACCGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCAGCCCCGTGAAGGCCGGCGTGGAGACCACCACCCCCAGCAAGCAGAGCAACAACAAGTACGCCGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGGAAGAGCCACAGGAGCTACAGCTGCCAGGTGACCCACGAGGGCAGCACCGTGGAGAAGACCGTGGCCCCCACCGAGTGCAGC
BB5.1 (全長重鏈 重鏈/ SEQ ID NO: 35 CAGGTTCAGCTGCAGCAACCTGGGGCTGAGCTTGTCAGACCTGGCACATCTGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAAGCAGCTGGATGCACTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGTGATTGACCCCTCTGACAGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAAGCCACACTGACAGTGGACACCAGCAGCAGCACAGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGGTGGTGGCAGCAGCTACAACAGATACTTTGATGTGTGGGGCACAGGCACCACAGTGACTGTGTCCTCTGCCAAGACAACCCCTCCTTCTGTGTACCCTCTGGCTCCTGGATCTGCTGCCCAGACCAACTCTATGGTCACACTGGGCTGTCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCTCTGTCCTCTGGGGTGCACACATTCCCTGCAGTGCTGCAGTCTGATCTGTACACCCTGAGCAGCTCTGTGACTGTGCCTAGCAGCCCCAGACCTTCTGAGACTGTGACCTGCAATGTGGCTCACCCTGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGAGACTGTGGCTGCAAGCCCTGCATCTGTACAGTGCCTGAGGTTTCCTCTGTGTTCATCTTCCCACCTAAGCCTAAGGATGTGCTGACCATCACACTGACCCCTAAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACATCAGCAAGGATGACCCTGAGGTGCAGTTCTCTTGGTTTGTGGATGATGTGGAAGTGCACACAGCCCAGACACAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTTCAGATCAGTGTCTGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAAGAGTTCAAGTGCAGAGTGAACTCTGCTGCTTTCCCTGCTCCTATTGAAAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCTCCCCAGGTGTACACAATCCCTCCACCTAAAGAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACAGATTTCTTCCCAGAGGATATCACAGTTGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCTGCTGAGAACTACAAGAACACCCAGCCTATCATGAACACCAATGGCAGCTACTTTGTGTACAGCAAGCTGAATGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCTGGCAACACCTTTACCTGCTCTGTGCTGCATGAGGGCCTGCACAACCACCATACAGAGAAGTCCCTGTCTCACAGCCCTGGCAAG
BB5.1輕鏈 - 輕鏈/ SEQ ID NO: 36 AATATCATGATGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGGCTGTGTCTGCTGGGGAGAAAGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGTCTGTGCTGTACTCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGTCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAATCTGGGGTGCCAGACAGATTCACAGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCTGTGCAGGCTGAGGACCTGGCAGTGTACTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCAGAACCTTTGGTGGTGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGGGCTGATGCTGCCCCTACAGTGTCTATCTTCCCACCTAGCTCTGAGCAGCTGACCAGTGGTGGTGCCTCTGTTGTGTGCTTCCTGAACAACTTCTACCCCAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATTGATGGCTCTGAGAGGCAGAATGGGGTGCTGAACAGCTGGACAGACCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCATGAGCAGCACACTGACCCTGACCAAGGATGAGTATGAGAGGCACAACAGCTACACCTGTGAAGCCACACACAAGACCAGCACAAGCCCCATTGTGAAGTCCTTCAACAGGGGAGAGTGC
載體化可伐利單抗Fab編碼序列 SEQ ID NO: 37 ATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGACTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCTCTGGCTTCACAGTGCACAGCAGCTACTACATGGCCTGGGTTAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTTGGAGCCATCTTCACAGGCTCTGGGGCTGAGTATAAGGCTGAGTGGGCCAAGGGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACCTACTACTGTGCCTCTGATGCTGGCTATGACTACCCCACACATGCCATGCACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCAGCAAGAGCACCAGTGGTGGAACAGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGATTACTTCCCTGAGCCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCACTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCTCTAGCAGTCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGGGGCCTCTGAGACAGAATCTGGGGTGCCCAGCAGATTTTCAGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGCCAGAACACCAAAGTGGGCAGCAGCTATGGCAACACCTTTGGTGGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTGTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCAGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGCTGA
載體化可伐利單抗全長編碼序列 SEQ ID NO: 38 ATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGACTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCTCTGGCTTCACAGTGCACAGCAGCTACTACATGGCCTGGGTTAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTTGGAGCCATCTTCACAGGCTCTGGGGCTGAGTATAAGGCTGAGTGGGCCAAGGGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACCTACTACTGTGCCTCTGATGCTGGCTATGACTACCCCACACATGCCATGCACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCAGCAAGAGCACCAGTGGTGGAACAGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGATTACTTCCCTGAGCCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCACTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAGCTGAGAAGAGGCCCCAAGGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGTGTGGTGGTTGATGTGTCCCATGAGGACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGGTATGTGGATGGGGTTGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCATCAGGACTGGCTGAATGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCAAGCAGCATTGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGGCAGCCCAGAGAACCTCAGGTTTACACCCTGCCTCCAAGCAGGGAAGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTTAAGGGCTTCTACCCCTCTGACATTGCTGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCTGATGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACTGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGTGTGCTGCATGAAGCCCTGCATGCCCACTACACCAGAAAAGAGCTGTCTCTGAGCCCCAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCTCTAGCAGTCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGGGGCCTCTGAGACAGAATCTGGGGTGCCCAGCAGATTTTCAGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGCCAGAACACCAAAGTGGGCAGCAGCTATGGCAACACCTTTGGTGGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTGTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCAGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGCTGA
載體化依庫珠單抗Fab IgG1編碼序列 SEQ ID NO: 39 ATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAACCTGGGGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACATCTTCAGCAACTATTGGATCCAGTGGGTCAGACAGGCCCCTGGCCAAGGACTTGAGTGGATGGGAGAGATCCTGCCTGGCTCTGGCAGCACAGAGTACACAGAGAACTTCAAGGACAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCACCTCCACAGTGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACAGCAGTGTACTATTGTGCCAGATACTTCTTTGGCAGCAGCCCCAACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCAGCAAGAGCACCAGTGGTGGAACAGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCACTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAACCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATCACCTGTGGGGCCTCTGAGAACATCTATGGGGCCCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATATATGGGGCCACCAATCTGGCTGATGGGGTGCCCTCTAGATTTTCTGGCAGTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGTCAGAATGTGCTGAACACCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTaTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCTGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGCTGA
載體化依庫珠單抗Fab IgG2編碼序列 SEQ ID NO: 40 ATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAACCTGGGGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACATCTTCAGCAACTACTGGATTCAGTGGGTCAGACAGGCCCCTGGCCAAGGACTTGAGTGGATGGGAGAGATCCTGCCTGGCTCTGGCAGCACAGAGTACACAGAGAACTTCAAGGACAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCACCTCCACAGTGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACAGCAGTGTACTATTGTGCCAGATACTTCTTTGGCAGCAGCCCCAACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCAGAAGCACCTCTGAGTCTACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTTCCTGAGCCTGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCTCTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCCAGCAGCAATTTTGGCACCCAGACCTACACCTGTAATGTGGACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTGAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATCACCTGTGGGGCCTCTGAGAACATCTATGGGGCCCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATATATGGGGCCACCAATCTGGCTGATGGGGTGCCCTCTAGATTTTCTGGCAGTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGTCAGAATGTGCTGAACACCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTaTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCTGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGCTGA
載體化依庫珠單抗全長編碼序列 SEQ ID NO: 41 ATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAACCTGGGGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACATCTTCAGCAACTACTGGATTCAGTGGGTCAGACAGGCCCCTGGCCAAGGACTTGAGTGGATGGGAGAGATCCTGCCTGGCTCTGGCAGCACAGAGTACACAGAGAACTTCAAGGACAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCACCTCCACAGTGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACAGCAGTGTACTATTGTGCCAGATACTTCTTTGGCAGCAGCCCCAACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCAGAAGCACCTCTGAGTCTACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTTCCTGAGCCTGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCTCTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCCAGCAGCAATTTTGGCACCCAGACCTACACCTGTAATGTGGACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTGGAAAGAAAGTGCTGTGTGGAATGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCAGTGGCTGGACCTTCTGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCAAGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTATGTGGATGGGGTTGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATTGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCAAGAGAACCCCAAGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCAAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCTGACATTGCTGTGGAATGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGACTGACAGTGGACAAGTCCAGATGGCAAGAGGGCAATGTGTTCAGCTGCTCTGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCTCTGTCTCTGAGCCTGGGCAAGAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATCACCTGTGGGGCCTCTGAGAACATCTATGGGGCCCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATATATGGGGCCACCAATCTGGCTGATGGGGTGCCCTCTAGATTTTCTGGCAGTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGTCAGAATGTGCTGAACACCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTaTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCTGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGCTGA
載體化BB5.1全長編碼序列 SEQ ID NO:42 ATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTTCAGCTGCAGCAACCTGGGGCTGAGCTTGTCAGACCTGGCACATCTGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAAGCAGCTGGATGCACTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGTGATTGACCCCTCTGACAGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAAGCCACACTGACAGTGGACACCAGCAGCAGCACAGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGGTGGTGGCAGCAGCTACAACAGATACTTTGATGTGTGGGGCACAGGCACCACAGTGACTGTGTCCTCTGCCAAGACAACCCCTCCTTCTGTGTACCCTCTGGCTCCTGGATCTGCTGCCCAGACCAACTCTATGGTCACACTGGGCTGTCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCTCTGTCCTCTGGGGTGCACACATTCCCTGCAGTGCTGCAGTCTGATCTGTACACCCTGAGCAGCTCTGTGACTGTGCCTAGCAGCCCCAGACCTTCTGAGACTGTGACCTGCAATGTGGCTCACCCTGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGAGACTGTGGCTGCAAGCCCTGCATCTGTACAGTGCCTGAGGTTTCCTCTGTGTTCATCTTCCCACCTAAGCCTAAGGATGTGCTGACCATCACACTGACCCCTAAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACATCAGCAAGGATGACCCTGAGGTGCAGTTCTCTTGGTTTGTGGATGATGTGGAAGTGCACACAGCCCAGACACAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTTCAGATCAGTGTCTGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAAGAGTTCAAGTGCAGAGTGAACTCTGCTGCTTTCCCTGCTCCTATTGAAAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCTCCCCAGGTGTACACAATCCCTCCACCTAAAGAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACAGATTTCTTCCCAGAGGATATCACAGTTGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCTGCTGAGAACTACAAGAACACCCAGCCTATCATGAACACCAATGGCAGCTACTTTGTGTACAGCAAGCTGAATGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCTGGCAACACCTTTACCTGCTCTGTGCTGCATGAGGGCCTGCACAACCACCATACAGAGAAGTCCCTGTCTCACAGCCCTGGCAAGAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTAATATCATGATGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGGCTGTGTCTGCTGGGGAGAAAGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGTCTGTGCTGTACTCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGTCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAATCTGGGGTGCCAGACAGATTCACAGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCTGTGCAGGCTGAGGACCTGGCAGTGTACTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCAGAACCTTTGGTGGTGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGGGCTGATGCTGCCCCTACAGTGTCTATCTTCCCACCTAGCTCTGAGCAGCTGACCAGTGGTGGTGCCTCTGTTGTGTGCTTCCTGAACAACTTCTACCCCAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATTGATGGCTCTGAGAGGCAGAATGGGGTGCTGAACAGCTGGACAGACCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCATGAGCAGCACACTGACCCTGACCAAGGATGAGTATGAGAGGCACAACAGCTACACCTGTGAAGCCACACACAAGACCAGCACAAGCCCCATTGTGAAGTCCTTCAACAGGGGAGAGTGCTGA
CAG.可伐利單抗.Fab (5' ITR至3' ITR) ITR序列呈斜體 SEQ ID NO: 43 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctctagataggtaccctagtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagAATTCGCCACCATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGACTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCTCTGGCTTCACAGTGCACAGCAGCTACTACATGGCCTGGGTTAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTTGGAGCCATCTTCACAGGCTCTGGGGCTGAGTATAAGGCTGAGTGGGCCAAGGGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACCTACTACTGTGCCTCTGATGCTGGCTATGACTACCCCACACATGCCATGCACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCAGCAAGAGCACCAGTGGTGGAACAGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGATTACTTCCCTGAGCCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCACTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCTCTAGCAGTCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGGGGCCTCTGAGACAGAATCTGGGGTGCCCAGCAGATTTTCAGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGCCAGAACACCAAAGTGGGCAGCAGCTATGGCAACACCTTTGGTGGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTGTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCAGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGCTGATAACtcgaggacggggtgaactacgcctgaggatccgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaagcaattcgttgatctgaatttcgaccacccataatacccattaccctggtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGC aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
CAG.可伐利單抗全長(5' ITR至3'TR) ITR序列呈斜體 SEQ ID NO: 44 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctctagataggtaccctagtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagAATTCGCCACCATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGACTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCTCTGGCTTCACAGTGCACAGCAGCTACTACATGGCCTGGGTTAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTTGGAGCCATCTTCACAGGCTCTGGGGCTGAGTATAAGGCTGAGTGGGCCAAGGGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACCTACTACTGTGCCTCTGATGCTGGCTATGACTACCCCACACATGCCATGCACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCAGCAAGAGCACCAGTGGTGGAACAGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGATTACTTCCCTGAGCCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCACTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAGCTGAGAAGAGGCCCCAAGGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGTGTGGTGGTTGATGTGTCCCATGAGGACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGGTATGTGGATGGGGTTGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCATCAGGACTGGCTGAATGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCAAGCAGCATTGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGGCAGCCCAGAGAACCTCAGGTTTACACCCTGCCTCCAAGCAGGGAAGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTTAAGGGCTTCTACCCCTCTGACATTGCTGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCTGATGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACTGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGTGTGCTGCATGAAGCCCTGCATGCCCACTACACCAGAAAAGAGCTGTCTCTGAGCCCCAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCTCTAGCAGTCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGGGGCCTCTGAGACAGAATCTGGGGTGCCCAGCAGATTTTCAGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGCCAGAACACCAAAGTGGGCAGCAGCTATGGCAACACCTTTGGTGGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTGTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCAGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGCTGATAACtcgaggacggggtgaactacgcctgaggatccgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaagcaattcgttgatctgaatttcgaccacccataatacccattaccctggtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGC aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
CAG.依庫珠單抗.Fab.IgG1 (5' ITR至3' ITR)  ITR序列呈斜體  SEQ ID NO: 45 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctctagataggtaccctagtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagAATTCGCCACCATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAACCTGGGGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACATCTTCAGCAACTATTGGATCCAGTGGGTCAGACAGGCCCCTGGCCAAGGACTTGAGTGGATGGGAGAGATCCTGCCTGGCTCTGGCAGCACAGAGTACACAGAGAACTTCAAGGACAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCACCTCCACAGTGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACAGCAGTGTACTATTGTGCCAGATACTTCTTTGGCAGCAGCCCCAACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCAGCAAGAGCACCAGTGGTGGAACAGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCACTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAACCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATCACCTGTGGGGCCTCTGAGAACATCTATGGGGCCCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATATATGGGGCCACCAATCTGGCTGATGGGGTGCCCTCTAGATTTTCTGGCAGTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGTCAGAATGTGCTGAACACCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTaTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCTGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGCTGATAACtcgaggacggggtgaactacgcctgaggatccgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaagcaattcgttgatctgaatttcgaccacccataatacccattaccctggtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGC aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
CAG.依庫珠單抗.Fab.IgG2 (5' ITR至3' ITR)  ITR序列呈斜體  SEQ ID NO:46 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctctagataggtaccctagtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagAATTCGCCACCATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAACCTGGGGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACATCTTCAGCAACTACTGGATTCAGTGGGTCAGACAGGCCCCTGGCCAAGGACTTGAGTGGATGGGAGAGATCCTGCCTGGCTCTGGCAGCACAGAGTACACAGAGAACTTCAAGGACAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCACCTCCACAGTGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACAGCAGTGTACTATTGTGCCAGATACTTCTTTGGCAGCAGCCCCAACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCAGAAGCACCTCTGAGTCTACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTTCCTGAGCCTGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCTCTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCCAGCAGCAATTTTGGCACCCAGACCTACACCTGTAATGTGGACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTGAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATCACCTGTGGGGCCTCTGAGAACATCTATGGGGCCCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATATATGGGGCCACCAATCTGGCTGATGGGGTGCCCTCTAGATTTTCTGGCAGTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGTCAGAATGTGCTGAACACCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTaTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCTGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGCTGATAACtcgaggacggggtgaactacgcctgaggatccgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaagcaattcgttgatctgaatttcgaccacccataatacccattaccctggtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGC aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
CAG.依庫珠單抗.全長(5' ITR至3' ITR) ITR序列呈斜體  SEQ ID NO: 47 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctctagataggtaccctagtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagAATTCGCCACCATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAACCTGGGGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACATCTTCAGCAACTACTGGATTCAGTGGGTCAGACAGGCCCCTGGCCAAGGACTTGAGTGGATGGGAGAGATCCTGCCTGGCTCTGGCAGCACAGAGTACACAGAGAACTTCAAGGACAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCACCTCCACAGTGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACAGCAGTGTACTATTGTGCCAGATACTTCTTTGGCAGCAGCCCCAACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCCTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCAGAAGCACCTCTGAGTCTACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTTCCTGAGCCTGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGTGCTCTGACCTCTGGGGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTCACAGTGCCCAGCAGCAATTTTGGCACCCAGACCTACACCTGTAATGTGGACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTGGAAAGAAAGTGCTGTGTGGAATGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCAGTGGCTGGACCTTCTGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCAAGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTATGTGGATGGGGTTGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATTGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCAAGAGAACCCCAAGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCAAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCTGACATTGCTGTGGAATGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGACTGACAGTGGACAAGTCCAGATGGCAAGAGGGCAATGTGTTCAGCTGCTCTGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCTCTGTCTCTGAGCCTGGGCAAGAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATCACCTGTGGGGCCTCTGAGAACATCTATGGGGCCCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATATATGGGGCCACCAATCTGGCTGATGGGGTGCCCTCTAGATTTTCTGGCAGTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGTCAGAATGTGCTGAACACCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAACAGTGGCTGCCCCTTCTGTaTTCATCTTCCCACCATCTGATGAGCAGCTGAAGAGTGGCACAGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCTGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACTGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGGCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAATAGAGGGGAGTGCTGATAACtcgaggacggggtgaactacgcctgaggatccgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaagcaattcgttgatctgaatttcgaccacccataatacccattaccctggtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGC aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
CAG.BB5.1 (ITR至ITR) (5' ITR至3' ITR) ITR序列呈斜體 SEQ ID NO: 48 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctctagataggtaccctagtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagAATTCGCCACCATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTTCAGCTGCAGCAACCTGGGGCTGAGCTTGTCAGACCTGGCACATCTGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAAGCAGCTGGATGCACTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGTGATTGACCCCTCTGACAGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAAGCCACACTGACAGTGGACACCAGCAGCAGCACAGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGGTGGTGGCAGCAGCTACAACAGATACTTTGATGTGTGGGGCACAGGCACCACAGTGACTGTGTCCTCTGCCAAGACAACCCCTCCTTCTGTGTACCCTCTGGCTCCTGGATCTGCTGCCCAGACCAACTCTATGGTCACACTGGGCTGTCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCTCTGTCCTCTGGGGTGCACACATTCCCTGCAGTGCTGCAGTCTGATCTGTACACCCTGAGCAGCTCTGTGACTGTGCCTAGCAGCCCCAGACCTTCTGAGACTGTGACCTGCAATGTGGCTCACCCTGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGAGACTGTGGCTGCAAGCCCTGCATCTGTACAGTGCCTGAGGTTTCCTCTGTGTTCATCTTCCCACCTAAGCCTAAGGATGTGCTGACCATCACACTGACCCCTAAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACATCAGCAAGGATGACCCTGAGGTGCAGTTCTCTTGGTTTGTGGATGATGTGGAAGTGCACACAGCCCAGACACAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTTCAGATCAGTGTCTGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAAGAGTTCAAGTGCAGAGTGAACTCTGCTGCTTTCCCTGCTCCTATTGAAAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCTCCCCAGGTGTACACAATCCCTCCACCTAAAGAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACAGATTTCTTCCCAGAGGATATCACAGTTGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCTGCTGAGAACTACAAGAACACCCAGCCTATCATGAACACCAATGGCAGCTACTTTGTGTACAGCAAGCTGAATGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCTGGCAACACCTTTACCTGCTCTGTGCTGCATGAGGGCCTGCACAACCACCATACAGAGAAGTCCCTGTCTCACAGCCCTGGCAAGAGAAAGAGAAGAGGCTCTGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGTGGGGATGTTGAAGAGAATCCTGGGCCTATGTATAGGATGCAACTGCTCCTCCTGATTGCTCTGAGCCTGGCTCTTGTGACCAACTCTAATATCATGATGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGGCTGTGTCTGCTGGGGAGAAAGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGTCTGTGCTGTACTCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGTCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAATCTGGGGTGCCAGACAGATTCACAGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCTGTGCAGGCTGAGGACCTGGCAGTGTACTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCAGAACCTTTGGTGGTGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGGGCTGATGCTGCCCCTACAGTGTCTATCTTCCCACCTAGCTCTGAGCAGCTGACCAGTGGTGGTGCCTCTGTTGTGTGCTTCCTGAACAACTTCTACCCCAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATTGATGGCTCTGAGAGGCAGAATGGGGTGCTGAACAGCTGGACAGACCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCATGAGCAGCACACTGACCCTGACCAAGGATGAGTATGAGAGGCACAACAGCTACACCTGTGAAGCCACACACAAGACCAGCACAAGCCCCATTGTGAAGTCCTTCAACAGGGGAGAGTGCTGATAACtcgaggacggggtgaactacgcctgaggatccgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaagcaattcgttgatctgaatttcgaccacccataatacccattaccctggtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGC aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
hCFHL.1 SEQ ID NO: 49 GAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTGA
CAG.hCFHL.1 (5' ITR至3' ITR) ITR序列呈斜體 SEQ ID NO: 50 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctctagataggtaccctagtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagAATTCGCCACCATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTGATAACtcgaggacggggtgaaCTGCAGctacgcctGAGCTCgaCgatccgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaagcaattcgttgatctgaatttcgaccacccataatacccattaccctggtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGC aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
可伐利單抗scFv (H-L)編碼序列 SEQ ID NO: 267 CAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGACTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCTCTGGCTTCACAGTGCACAGCAGCTACTACATGGCCTGGGTTAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTTGGAGCCATCTTCACAGGCTCTGGGGCTGAGTATAAGGCTGAGTGGGCCAAGGGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACCTACTACTGTGCCTCTGATGCTGGCTATGACTACCCCACACATGCCATGCACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGGAGGTGGTGGAAGTGGTGGTGGTGGAAGTGGAGGTGGTGGTTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCTCTAGCAGTCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGGGGCCTCTGAGACAGAATCTGGGGTGCCCAGCAGATTTTCAGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGCCAGAACACCAAAGTGGGCAGCAGCTATGGCAACACCTTTGGTGGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGATAA
可伐利單抗scFv (H-L)卡匣(ITR-ITR) SEQ ID NO: 268 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggaattcacgcgtggtaccgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaaggaattcGCCACCATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGACTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCTCTGGCTTCACAGTGCACAGCAGCTACTACATGGCCTGGGTTAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTTGGAGCCATCTTCACAGGCTCTGGGGCTGAGTATAAGGCTGAGTGGGCCAAGGGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACCTACTACTGTGCCTCTGATGCTGGCTATGACTACCCCACACATGCCATGCACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGGAGGTGGTGGAAGTGGTGGTGGTGGAAGTGGAGGTGGTGGTTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCTCTAGCAGTCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGGGGCCTCTGAGACAGAATCTGGGGTGCCCAGCAGATTTTCAGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGCCAGAACACCAAAGTGGGCAGCAGCTATGGCAACACCTTTGGTGGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAtaaTAAagcggccatcaagcttgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggctagcgcatgctggggagagatcgatctgaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTgCCcGGGCGGCCTCAgTGAGcgagcgagcgcgcagagagggagtggcc
可伐利單抗scFv (H-L)卡匣 (CAG-信號序列+ ScFv轉殖基因-多腺苷酸) SEQ ID NO: 269 gactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaaggaattcGCCACCATGTACAGAATGCAGCTGCTGCTGCTCATTGCCCTGTCTCTGGCCCTGGTCACCAATTCTCAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGACTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCTCTGGCTTCACAGTGCACAGCAGCTACTACATGGCCTGGGTTAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTTGGAGCCATCTTCACAGGCTCTGGGGCTGAGTATAAGGCTGAGTGGGCCAAGGGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACCTACTACTGTGCCTCTGATGCTGGCTATGACTACCCCACACATGCCATGCACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCTCTGGAGGTGGTGGAAGTGGTGGTGGTGGAAGTGGAGGTGGTGGTTCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCTCTAGCAGTCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGGGGCCTCTGAGACAGAATCTGGGGTGCCCAGCAGATTTTCAGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACCTACTACTGCCAGAACACCAAAGTGGGCAGCAGCTATGGCAACACCTTTGGTGGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAGAGAtaaTAAagcggccatcaagcttgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggctagcgcatgctggggag
可伐利單抗scFv (L-H)卡匣 (CAG-信號序列+ ScFv轉殖基因-多腺苷酸)    CAG - 信號序列+ 可伐利單抗(L- 連接子-H) – 多腺苷酸
依庫珠單抗scFv  (H-L)卡匣(ITR-ITR)    ITR - CAG - 信號序列+ 依庫珠單抗(H- 連接子-L) – 多腺苷酸-ITR
依庫珠單抗scFv  (L-H)卡匣(ITR-ITR)    ITR - CAG - 信號序列+ 依庫珠單抗(L- 連接子-H) – 多腺苷酸-ITR
依庫珠單抗scFv (H-L)卡匣 (CAG-信號序列+ ScFv轉殖基因-多腺苷酸)    CAG - 信號序列+ 依庫珠單抗(H- 連接子-L) – 多腺苷酸
依庫珠單抗scFv (L-H)卡匣 (CAG-信號序列+ ScFv轉殖基因-多腺苷酸)    CAG - 信號序列+ 依庫珠單抗(L- 連接子-H) – 多腺苷酸
BB5.1 scFv  (H-L)卡匣(ITR-ITR)    ITR - CAG - 信號序列+ BB5.1 (H- 連接子-L) – 多腺苷酸-ITR
BB5.1 scFv  (L-H)卡匣(ITR-ITR)    ITR - CAG - 信號序列+ BB5.1 (L- 連接子-H) – 多腺苷酸-ITR
BB5.1 scFv (H-L)卡匣 (CAG-信號序列+ ScFv轉殖基因-多腺苷酸)    CAG - 信號序列+ BB5.1 (H- 連接子-L) – 多腺苷酸
BB5.1 scFv  (L-H)卡匣 (CAG-信號序列+ ScFv轉殖基因-多腺苷酸)    CAG - 信號序列+ BB5.1 (L- 連接子-H) – 多腺苷酸
基因療法方法
提供藉由投與含有編碼抗C5或抗C3抗體或其抗原結合片段或CFHL-1蛋白之轉殖基因的病毒載體來治療人類個體之乾性AMD的方法。抗體可為可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗、特度魯單抗或NGM621，且為例如全長或實質上全長抗體或其Fab片段或其其他抗原結合片段。病毒載體具有帶有人類眼組織向性的AAV殼體，且可為AAV8、AAV9、AAV3B或AAVrh73 (或例如與AAV8、AAV9、AAV3B或AAVrh73之殼體序列具有90%、95%或99%序列一致性的其變體)。轉殖基因由調控序列可操作地連接，該等調控序列促進轉殖基因於人類眼組織細胞中(包括視網膜細胞、RPE、脈絡膜、BrM、脈絡膜毛細管層、感光細胞、視網膜神經節細胞中)之表現，該等調控序列為例如CAG (SEQ ID NO: 74)啟動子或眼特異性啟動子，諸如人類視紫質激酶(GRK1)啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)。在特定實施例中，啟動子為揭示於實例13中之彼等啟動子。調控序列亦可包括多腺苷酸化信號序列。包含轉殖基因及可操作地連接之調控序列的表現卡匣由ITR序列側接，呈人工AAV基因體形式。側接ITR序列可經組態以提供自補AAV (scAAV)基因體。包括 圖 2A 至圖 2G中所示之彼等重組載體的重組載體可以任何使得重組載體進入一或多個眼組織細胞之方式投與。在特定實施例中，重組AAV包含CAG.可伐利單抗.scFv (SEQ ID NO: 269)、CAG.可伐利單抗.Fab (SEQ ID NO: 43)、CAG.可伐利單抗.全長(SEQ ID NO: 44)、CAG.依庫珠單抗.Fab.IgG1 (SEQ ID NO: 45)、CAG.依庫珠單抗.Fab.IgG2 (SEQ ID NO: 46)、CAG.依庫珠單抗.全長(SEQ ID NO: 47)、CAG.hCFHL-1 (SEQ ID NO: 50)之人工基因體(或使用包含該等抗體之順式質體或構築體產生)。在其他實施例中，重組AAV包含用於動物模型(諸如非人類靈長類動物)中測試抗C5抗體的構築體，該構築體包含編碼替代抗C5抗體或其抗原結合片段(包括BB5.1)之轉殖基因。編碼BB5.1抗體之構築體包括CAG.BB5.1 (SEQ ID NO: 48)。
亦提供投與包含為scFv之轉殖基因之重組AAV載體的方法。在一些實施例中，轉殖基因編碼具有以下結構之scFv：信號序列-VH-連接子-VL-多腺苷酸。在一些實施例中，轉殖基因編碼具有以下結構之scFv：信號序列-VL-連接子-VH-多腺苷酸。在一些實施例中，連接子為GGGGS (SEQ ID NO: 51)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 52)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 54)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55)。在一些實施例中，信號序列為MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)或來自表2之信號序列。在一些實施例中，VH為SEQ ID NO: 251且VL為SEQ ID NO: 252，其中VH為SEQ ID NO: 253且VL為SEQ ID NO: 254，其中VH為SEQ ID NO: 255且VL為SEQ ID NO: 256，其中VH為SEQ ID NO: 257且VL為SEQ ID NO: 258，或其中VH為SEQ ID NO: 259且VL為SEQ ID NO: 260或261。
將以任何使得重組載體進入眼組織細胞(例如視網膜細胞)之方式投與治療有效劑量之此等重組載體中之任一者，例如經由視網膜下、玻璃體內、前房內或脈絡膜上注射或鼻內投與。或者，外周(例如靜脈內、肌肉內或皮下)投與載體，使得重組載體轉導肝臟及/或肌肉細胞，在肝臟及/或肌肉組織中產生儲存物，從而使轉殖基因產物表現至血流中，將治療劑遞送至眼組織。或者，視網膜下、玻璃體內、前房內、脈絡膜上投與將使得轉殖基因產物表現於眼細胞中，於患者之一或多個眼組織細胞中產生儲存物，從而將抗C3或C5 HuPTM mAb或抗C3或C5 mAb (或CFHL-1)之抗原結合片段連續地供應至個體之眼組織。轉殖基因表現在眼房液、玻璃狀液、視網膜組織、RPE、BrM或脈絡膜毛細管層中產生治療有效含量的CFHL-1蛋白之抗C5或抗C3抗體或其抗原結合片段。
投與此類基因療法之個體可為對抗補體療法有反應之個體。在某些實施例中，方法涵蓋治療經診斷患有乾性AMD或具有與此相關之一或多個症狀且經鑑別對抗cC3或C5抗體治療有反應或被視為抗C3或C5抗體或CFHL-1蛋白療法之良好候選者的患者。在特定實施例中，患者先前已用可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗、特度魯單抗或其他補體活化抑制劑治療且已發現對其有反應。為了確定反應性，可直接向個體投與抗C3或C5轉殖基因產物(例如在細胞培養物、生物反應器等中產生之產物)。
在實施例中，投與包含用於表現編碼抗C3或抗C5抗體或其抗原結合片段或CFHL-1蛋白之轉殖基因之構築體之重組AAV於眼組織中，使得在投與該AAV之後的10天、20天、30天、40天、6個月、9個月或1年內乾性AMD之一或多個症狀減少或進展減緩。在實施例中，例如藉由眼底自發螢光檢查(FAF)所量測，該投與使得個體之地圖狀萎縮(包括中央凹之地圖狀萎縮)之進展速率相對於未治療個體或如個體中基於乾性AMD之自然史所預期減緩或減小。在實施例中，該投與使得視力或最佳矯正視力(BCVA)之損耗速率改良或降低，例如藉由標準ETDRS圖表所量測；或改良視覺功能，如藉由黑暗適應法所量測；改良對比敏感度，藉由Pelli-Robson測試；或減小隱結面積或隱結積聚。在其他實施例中，藉由基因療法遞送之治療性基因的劑量足以抑制補體活化而不加重脈絡膜血管新生(CNV)。
然而，在所有情況下，因為轉殖基因產物持續產生，所以維持低濃度可為有效的。然而，因為轉殖基因產物連續地產生，所以維持低濃度可為有效的。轉殖基因產物之濃度可在患者血清樣本中量測。
適合於視網膜下、玻璃體內、鼻內、前房內、脈絡膜上或全身性(靜脈內、肌肉內或皮下)投與之醫藥組合物包含含有編碼抗C3或C5抗體或其抗原結合片段或CFHL-1蛋白的轉殖基因之重組載體於包含生理學上相容之水性緩衝液之調配緩衝液中之懸浮液。調配緩衝液可包含多醣、界面活性劑、聚合物或油中之一或多者。
在某些實施例中，HuPTM mAb或Fab為治療上有效的，且至少0.5%、1%或2%經醣基化及/或硫酸化，且可至少5%、10%或甚至50%或100%經醣基化及/或硫酸化。本文提供之基因療法治療之目標在於減緩或遏制乾性AMD之進展或緩解其一或多個症狀，以降低地圖狀萎縮之速率或改良視力(或降低視力損耗速率)。
本文所提供之方法涵蓋抗C3或C5 HuPTM mAb或其抗原結合片段或CFHL-1遞送至眼睛、肝臟及/或肌肉伴隨遞送其他可用治療的組合。可在基因療法治療之前、同時或之後投與其他治療。可與本文所提供之基因療法組合的患乾性AMD個體之可用治療包括(但不限於)伊拉米肽(elamipretide)、瑞蘇尼布(risuteganib)、光生物調節(photobiomodulation)、酒石酸溴莫尼定(brimonidine tartrate)、卡姆戊啶(kamuvudine)、Xiflam或多西環素等，以及抗C3抗體或C5抗體或CFHL-1蛋白投與。 5.6. 功效監測
可使用用於評定治療、預防或改善乾性AMD之功效的任何方法來評定本文所描述之組合物及方法之功效。可在動物模型中或在人類個體中確定評定結果。對視覺缺陷之功效可藉由最佳矯正視力(BCVA)來量測，例如評定字母數目或行數之增加，且其中功效可評定為大於或等於2個ETDRS行之增加或待藉由目視檢查評定的地圖狀萎縮(包括中央凹之地圖狀萎縮)之減少。
可使用用於評定治療、預防或改善乾性AMD之功效的任何方法來評定本文所描述之組合物及方法之功效。可在動物模型中或在人類個體中確定評定結果。對視覺缺陷之功效可藉由最佳矯正視力(BCVA)來量測，例如評定字母數目或行數之增加，且其中功效可評定為大於或等於2個ETDRS行之增加或logMAR之增加。眼睛之物理變化，包括地圖狀萎縮之變化可使用此項技術中已知之方法藉由光學同調斷層掃描(Optical Coherence Tomography)量測。
可使用活體外補體抑制分析，諸如攻膜複合物(「MAC」)形成、C5a產生及溶血作用評定本文所描述之組合物及方法之功效。可在任何以下適當細胞類型中執行補體抑制分析，諸如ARPE19細胞(MAC及C5a分析)、iPSC衍生之RPE細胞(MAC及C5a分析)或綿羊/兔紅血球(溶血分析)。MAC形成分析量測RPE細胞表面上的MAC沈積(MAC形成相對抑制%)。C5a產生分析量測C5抗體預防C5裂解之能力(較少C5裂解=較少C5a)。溶血分析允許比較不同補體抑制因子之補體抑制(50%補體抑制劑量(ng/ml)(CH 50；AH 50)。
動物模型可用於評估編碼抗C3抗體、抗C5抗體或CFHL-1蛋白之重組載體的表現、治療效果及不良作用。動物模型可包括人源化C3-/C5-嚙齒動物模型(實例9)或NaIO3誘導大鼠或小鼠模型(亦參見實例9)或CFH-/-小鼠模型。動物可例如視網膜下或脈絡膜上投與本文所描述之載體，且隨後藉由OCT、視網膜病理學(RPE損傷)及乾性AMD病理學之其他評定以及C3a或C5a之減少、C3或C5之裂解或補體活化之其他標記物來評定地圖狀萎縮(或其變化)。
功效指標可包括但不限於至12、16、20、24或28週或投與時間時研究之眼中之地圖狀萎縮(若較早，則為12、16、20、24或28週時研究之眼中反應者之比例)相對於基線的平均變化；至12、16、20、24或28週最佳矯正視力相對於基線之平均變化；生活品質/患者報導結果評定相對於基線的變化；至12、16、20、24或28週視力相對於基線之平均變化。 5 實例 6.1 實例 1 ： 基於可伐利單抗 Fab cDNA 之載體
構築基於可伐利單抗Fab cDNA之載體，其包含轉殖基因，該轉殖基因包含編碼可伐利單抗之重鏈及輕鏈序列(胺基酸序列分別為SEQ ID NO. 1及2)之Fab部分的核苷酸序列。編碼重鏈及輕鏈之Fab部分的核苷酸序列分別為SEQ ID NO: 26及27之核苷酸序列。轉殖基因亦包含編碼信號肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)之核苷酸序列。編碼輕鏈及重鏈之核苷酸序列由IRES元件或2A裂解位點(參見 表 4，尤其SEQ ID NO: 142或144)分開以產生雙順反子載體。載體另外包括組成型啟動子CAG (SEQ ID NO: 74)。或者，可使用其他組成型啟動子，諸如mU1a、EF1a、CB7、CB或CB長啟動子；組織特異性啟動子，諸如眼組織特異性啟動子，尤其GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77)或BEST1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)；或誘導型啟動子，諸如低氧誘導型啟動子。在特定實施例中，啟動子為揭示於實例13中之彼等啟動子。人工基因體自5' ITR至3' ITR展示於SEQ ID NO: 43中。 6.2 實例 2 ： 基於依庫珠單抗 IgG1 Fab cDNA 之載體
構築基於依庫珠單抗Fab IgG1 cDNA之載體，其包含轉殖基因，該轉殖基因包含編碼依庫珠單抗之重鏈及輕鏈序列(胺基酸序列分別為SEQ ID NO. 3及5)之Fab部分的核苷酸序列。編碼重鏈及輕鏈之Fab部分的核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 28及30之核苷酸序列。轉殖基因亦包含編碼信號肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)之核苷酸序列。編碼輕鏈及重鏈之核苷酸序列由IRES元件或2A裂解位點(參見 表 4，尤其SEQ ID NO: 142或144)分開以產生雙順反子載體。載體另外包括組成型啟動子CAG (SEQ ID NO: 74)。或者，可使用其他組成型啟動子，諸如mU1a、EF1a、CB或CB長啟動子；組織特異性啟動子，諸如眼組織特異性啟動子，尤其GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77)或BEST1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)；或誘導型啟動子，諸如低氧誘導型啟動子。在特定實施例中，啟動子為揭示於實例13中之彼等啟動子。載體自5' ITR至3' ITR之序列展示於SEQ ID NO: 45中。 6.3 實例 3 ： 基於依庫珠單抗 IgG2 Fab cDNA 之載體
構築基於依庫珠單抗Fab cDNA之載體，其包含轉殖基因，該轉殖基因包含編碼依庫珠單抗之重鏈及輕鏈序列(胺基酸序列分別為SEQ ID NO. 4及5)之Fab部分的核苷酸序列。編碼重鏈及輕鏈之Fab部分的核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 29及30之核苷酸序列。轉殖基因亦包含編碼信號肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)之核苷酸序列。編碼輕鏈及重鏈之核苷酸序列由IRES元件或2A裂解位點(參見 表 4，尤其SEQ ID NO: 142或144)分開以產生雙順反子載體。載體另外包括組成型啟動子CAG (SEQ ID NO: 74)。或者，可使用其他組成型啟動子，諸如mU1a、EF1a、CB或CB長啟動子；組織特異性啟動子，諸如眼組織特異性啟動子，尤其GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77)或BEST1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)；或誘導型啟動子，諸如低氧誘導型啟動子。載體自5' ITR至3' ITR之序列展示於SEQ ID NO: 46中。 6.4 實例 4 ： 基於雷武珠單抗 Fab cDNA 之載體
構築基於雷武珠單抗Fab cDNA之載體，其包含轉殖基因，該轉殖基因包含編碼雷武珠單抗之重鏈及輕鏈序列(胺基酸序列分別為SEQ ID NO. 6及7)之Fab部分的核苷酸序列。編碼重鏈及輕鏈之Fab部分的核苷酸序列可分別為SEQ ID NO. 31及32之核苷酸序列。轉殖基因亦包含編碼信號肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)之核苷酸序列。編碼輕鏈及重鏈之核苷酸序列由IRES元件或2A裂解位點(參見 表 4，尤其SEQ ID NO: 142或144)分開以產生雙順反子載體。載體另外包括組成型啟動子，諸如CAG (SEQ ID NO: 74)、mU1a、EF1a、CB或CB長啟動子；組織特異性啟動子，諸如眼組織特異性啟動子，尤其GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77)或BEST1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)；或誘導型啟動子，諸如低氧誘導型啟動子。 6.5 實例 5 ： 基於特度魯單抗 Fab cDNA 之載體
構築基於特度魯單抗Fab cDNA之載體，其包含轉殖基因，該轉殖基因包含編碼tesidolumab之重鏈及輕鏈序列(胺基酸序列分別為SEQ ID NO. 8及9)之Fab部分的核苷酸序列。編碼重鏈及輕鏈之Fab部分的核苷酸序列可分別為SEQ ID NO. 33及34之核苷酸序列。轉殖基因亦包含編碼信號肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)之核苷酸序列。編碼輕鏈及重鏈之核苷酸序列由IRES元件或2A裂解位點(參見 表 4，尤其SEQ ID NO: 142或144)分開以產生雙順反子載體。載體另外包括組成型啟動子，諸如CAG (SEQ ID NO: 74)、mU1a、EF1a、CB或CB長啟動子；諸如眼組織特異性啟動子，尤其GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77)或BEST1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)；或誘導型啟動子，諸如低氧誘導型啟動子。 6.6 實例 6 ： 基於 NGM621 Fab cDNA 之載體
構築基於NGM621 Fab cDNA之載體，其包含轉殖基因，該轉殖基因包含編碼NGM621之重鏈及輕鏈序列(胺基酸序列分別為SEQ ID NO. 10及13)之Fab部分的核苷酸序列。或者，構築包含轉殖基因之載體，該轉殖基因包含編碼NGM621之重鏈及輕鏈序列(胺基酸序列可分別為SEQ ID NO. 11及13)之Fab部分的核苷酸序列。編碼重鏈及輕鏈之Fab部分的核苷酸序列可為分別編碼SEQ ID NO. 10及13的經密碼子最佳化之核苷酸序列，或替代地，分別編碼SEQ ID NO. 11及13的經密碼子最佳化之核苷酸序列。轉殖基因亦包含編碼信號肽，例如MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)之核苷酸序列。編碼輕鏈及重鏈之核苷酸序列由IRES元件或2A裂解位點(參見 表 4，尤其SEQ ID NO: 142或144)分開以產生雙順反子載體。載體另外包括組成型啟動子，諸如CAG (SEQ ID NO: 74)、mU1a、EF1a、CB或CB長啟動子；組織特異性啟動子，諸如眼組織特異性啟動子，尤其GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77)或BEST1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)；或誘導型啟動子，諸如低氧誘導型啟動子。 6.7 實例 7 ： 依庫珠單抗、可伐利單抗及 hCFHL.1 於 HEK293 細胞 中之表現
將順式質體pITR-CAG-依庫珠單抗.IgG1 (SEQ ID NO: 45)或pITR-CAG-可伐利單抗(SEQ ID NO: 43)轉染至HEK293細胞中。收集上清液及集結粒樣本且在非還原凝膠( 圖 6A)上運行，其中在細胞培養物之上清液中觀測到代表全長抗體之條帶，或在還原凝膠 ( 圖 6B)上運行，指示細胞集結粒及上清液兩者中均可見抗體之重鏈及輕鏈。將質體pITR-CAG-hCFHL.1或對照(GFFP)轉染至HEK293細胞中且偵測表現( 圖 6C)。 6.8 實例 8 ： 自補 hCFHL1 轉殖基因卡匣
構築基於CFHL-1 cDNA之載體，其包含轉殖基因，該轉殖基因包含編碼包括原生補體因子H信號序列之CFHL-1 (SEQ ID NO: 23)的核苷酸序列，該原生補體因子H信號序列為SEQ ID NO: 23之前18個胺基酸(亦為SEQ ID NO: 90，表2)。編碼CFHL-1之核苷酸序列可為SEQ ID NO: 49之經密碼子最佳化之核苷酸序列。載體另外包括組成型啟動子，諸如CAG (SEQ ID NO: 74)、mU1a、EF1a、CB或CB長啟動子；組織特異性啟動子，諸如眼組織特異性啟動子，尤其GRK1啟動子(SEQ ID NO: 77)或BEST1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)；或誘導型啟動子，諸如低氧誘導型啟動子及多腺苷酸化信號。表現卡匣由ITR序列側接，其中一個ITR突變產生自補人工基因體(例如SEQ ID NO: 84之3' ITR序列， 表 1)，且人工基因體可具有SEQ ID NO: 50之核苷酸序列。 6.9 實例 9 ： NaIO3 誘發小鼠模型
將使用嚙齒動物中乾性AMD之NaIO3誘發模型(誘發RPE損傷)來評定抗C3、抗C5抗體及CFHL-1蛋白AAV構築體。將以1E7、1E8或1E9之劑量向人源化C3-/C5-小鼠視網膜下或脈絡膜上投與AAV8構築體AAV8.CAG.可伐利單抗.Fab (SEQ ID NO: 43)、AAV8.CAG.可伐利單抗.完全(SEQ ID NO:NO:44)、AAV8.依庫珠單抗.Fab.IgG1 (SEQ ID NO: 45)、AAV8.依庫珠單抗.Fab.IgG2 (SEQ ID NO: 46)、AAV8.依庫珠單抗.全長(SEQ ID NOL 47)、AAV8.CAG.BB5.1 (SEQ ID NO: 48)及AAV8.CAG.hCFHL.1f (SEQ ID NO: 5)。28天後，將向小鼠投與NaIO3以誘發地圖狀萎縮。一週後，將藉由眼底且針對視覺功能缺陷評定小鼠眼睛，隨後將處死小鼠並評定眼之RPE損傷抑制及感光細胞損耗以及轉殖基因、C3及C5含量。 6.10 實例 10 ： 溶血分析
使用自轉染至HEK293T細胞中之質體(如本文所描述編碼補體抑制劑)收集的上清液，進行典型補體路徑相關溶血抑制分析。收集上清液(含有補體抑制劑，或含有無抑制劑之培養基或含有非補體相關目標之載體化抗體的陰性對照)，且塗覆於綿羊紅血球，其塗佈有最佳含量的以5×10 8個細胞/毫升於分析培養盤之孔中懸浮於明膠佛羅那緩衝生理鹽水(Gelatin Veronal Buffered saline)(GVB++緩衝液)中之兔抗綿羊紅血球IgM抗體。將溶血百分比與含有正常人類血清的已滴定至50%溶血的陽性測試溶血溶液相比較。照此計算溶血百分比：溶血% = (測試樣本溶血(OD405)-背景溶血(OD405))/(最高溶血(OD405)-背景溶血(OD405))×100。
用CAG啟動子及兔β-球蛋白多腺苷酸構築此研究中利用之所有C5抑制劑表現卡匣。所有轉殖基因經密碼子最佳化且去除CpG。在分析中，在於293T細胞中轉染之前，首先篩選順式質體，隨後包裝呈AAV8病毒載體(包括scAAV8載體)以供進一步研究。
HEK293細胞中表現之C5抑制劑在溶血抑制分析中以不同程度抑制補體路徑活化。scFv型式呈現補體之強抑制( 圖 8A 至圖 8B)。
各 C5 抑制劑之重組純化形式之結合動力學及親和力
比較各C5抑制劑(如上表現於HEK293細胞中)所產生之重組純化蛋白在典型及替代補體路徑兩者中的IC50值。用OctetRED384系統量測各C5抑制劑針對人類、獼猴及小鼠C5之結合動力學及親和力。
各C5抑制劑之重組純化形式抑制典型及替代溶血分析中補體活化之有效抑制的呈現( 圖 9A 至圖 9F)。抗人類C5抑制劑(可伐利單抗)之所有三個型式展現針對人類及獼猴C5的低至高皮莫耳範圍內之KD值，而C5抑制劑以低奈莫耳親和力常數相對不強地結合。具有相同載體化抗體型式之抗小鼠(BB5.1)及抗人類(可伐利單抗) C5抑制劑展現類似於小鼠C5之親和力。參見 表 9。 表 9
配體 人類 C5 獼猴 C5 小鼠 C5
分析物 K D(M) K D(M) K D(M)
抗hC5 IgG 3.136E-11 1.310E-11 2.291E-11
抗hC5 Fab 4.001E-10 6.023E-11 4.142E-09
抗hC5 scFV 2.533E-10 8.454E-11 4.539E-09
抗mC5 IgG N/A N/A 1.214E-11
抗mC5 Fab N/A N/A 3.469E-09
抗mC5 scFV N/A N/A 3.692E-09
重組C5抑制(C5I)蛋白 1.017E-08 5.092E-09 6.278E-09
6.11 實例 11 ： iPSC 衍生之 RPE 中經 AAV 表現之 C5 抑制劑的評估
C5抑制劑防止C5裂解且減少攻膜複合物(MAC)形成( 圖 10A 至圖 10C，ARPE19； 圖 10D 至圖 10H，iPSC衍生之RPE)。用AAV.抗hC5 scFv (可伐利單抗scFv)以增加之MOI轉導的iPSC衍生之RPE展現頂端及底端區室中轉殖基因產物(TP)含量的劑量依賴性增加( 圖 10G)。TP含量( 圖 10G)與藉由ddPCR量測的AAV之mRNA/cDNA相符( 圖 10H)。 6.12 實例 12 ： 活體內經 AAV 表現之 C5 抑制劑的評估
經由視網膜下(SR)投與以1E8及3E8微克/眼將編碼AAV8之C5抑制劑注射至野生型小鼠眼中。經由視網膜下AAV投與遞送的抗C5 scFv (抗hC5:可伐利單抗或抗mC5:BB5.1)展現比IgG (全長抗體)及Fab形式高＞10倍之TP含量( 圖 11A=奈克/眼； 圖 11B= 皮莫耳/眼)以及類似於腹膜內(IP)遞送之純化抗mC5 IgG的含量。 6.13 實例 13 ： 活體內經 AAV 表現之 C5 抑制劑的評估
製成以下構築體。所有scAAV製成為具有一個突變ITR。下文包括全長(「ITR-ITR」構築體作為各構築體之實例，且名稱指示其是製成為單股(ss)抑或自補(sc) AAV。 可伐利單抗.ScFv.HL ( 編碼序列之信號序列加底線) 可伐利單抗 .scFv.HL ( 蛋白質 - 信號序列加底線 ) CAG. 可伐利單抗 .scFv.HL ss.CAG. 可伐利單抗 .scFv.HL 2924 可伐利單抗 .scFv.LH ( 編碼序列 - 信號序列加底線 ) 可伐利單抗 .scFv.LH ( 蛋白質 - 信號序列加底線 ) CAG. 可伐利單抗 .scFv.LH ( 啟動子至多腺苷酸 ) ss.CAG. 可伐利單抗 .scFv.LH (ITR 至 ITR) 3206 .VH4i. 可伐利單抗 .HL.scFv.RBGpA ( 啟動子至多腺苷酸 ) scAAV.mu1a.VH4i. 可伐利單抗 .scFv.HL.RBGpA (ITR 至 ITR) scAAV.CB.sv40. 可伐利單抗 .scFv.HL ( 啟動子至多腺苷酸 ) scAAV.CB.sv40. 可伐利單抗 .scFv.HL (ITR 至 ITR) 新啟動子 CAG(Del5) CAG(Del5). 可伐利單抗 .ScFv.HL ( 啟動子至多腺苷酸 ) scAAV.CAG(Del5). 可伐利單抗 .ScFv.HL (ITR 至 ITR) 新啟動子 CAG(Delm) CAG(Delm).可伐利單抗 .ScFv.HL ( 啟動子至多腺苷酸 ) scAAV.CAG(Delm). 可伐利單抗 .ScFv.HL (ITR 至 ITR) 新啟動子 CAG(Del3) CAG(Del3). 可伐利單抗 .ScFv.HL scAAV.CAG(Del3). 可伐利單抗 .ScFv.HL (ITR 至 ITR) BB5.1.scFv.HL ( 編碼序列 - 信號序列加底線 ) BB5.1.scFv.HL  ( 蛋白質 - 信號序列加底線 ) CAG.BB5.1.scFv.HL ( 啟動子至多腺苷酸 ) ss.CAG.BB5.1.scFv.HL (ITR 至 ITR) CAG.BB5.1.scFv.LH ( 啟動子至多腺苷酸 ) ss.CAG.BB5.1.scFv.LH (ITR 至 ITR) BB5.1.scFv.LH ( 編碼序列 - 信號肽 ( 前導 ) 序列加底線 ) BB5.1.scFv.LH ( 蛋白質 ) CB.sv40.BB5.1.scFv.LH ( 啟動子至多腺苷酸 ) scAAV.CB.sv40.BB5.1.scFv.LH (ITR 至 ITR) BB5.1.scFv.LH-FLAG 標記 ( 編碼序列 ) BB5.1.scFv.LH-FLAG 標記 ( 蛋白質 ) CAG.BB5.1.scFv.LH-FLAG 標記 ( 啟動子至多腺苷酸 ) CAG.BB5.1.scFv.LH-FLAG 標記 (ITR 至 ITR) 等效物
儘管本發明參考其特定實施例進行詳細描述，但應理解功能上等效之變化形式屬於本發明之範疇。實際上，根據前文描述及隨附圖式，除本文所展示及描述之彼等修改之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。此等修改意欲屬於隨附申請專利範圍之範疇。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文所描述之本發明特定實施例之許多等效物。此等等效物意欲由以下申請專利範圍涵蓋。
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案在本文中以引用之方式併入本說明書中，程度如同各個別公開案、專利或專利申請案專門且個別地指示為以全文引用之方式併入本文中一般。
圖 1A 至圖 1C. rAAV載體基因體構築體之示意圖，該等構築體含有編碼由弗林蛋白酶-2A連接子分開的治療性mAb之重鏈及輕鏈的表現卡匣，該表現卡匣可操作地連接於啟動子、藉由AAV ITR側接。轉殖基因可包含編碼以下之核苷酸序列：具有Fc區之全長重鏈及輕鏈( A)；Fab部分之重鏈及輕鏈( B)；或用連接子連接抗體之重鏈及輕鏈的單鏈可變片段(scFv) ( C)。
圖 2A 至圖 2G.用於針對C5之可伐利單抗 (A)、依庫珠單抗IgG1 (B)、依庫珠單抗IgG2 ( C)、雷武珠單抗 (D)及特度魯單抗 (E)治療性抗體以及針對C3之NGM621 (F)及 (G)治療性抗體之Fab區的轉殖基因構築體之胺基酸序列。醣基化位點為粗體字。麩醯胺酸醣基化位點、天冬醯胺(N)醣基化位點、非共同天冬醯胺(N)醣基化位點及酪胺酸-O-硫酸化位點(斜體字)如圖例中所指示。互補決定區(CDR)加底線。鉸鏈區以灰色突出顯示。
圖 3. 具有眼組織向性的各種殼體之Clustal多序列比對。可藉由自其他比對AAV殼體之對應位置「募集」胺基酸殘基來對AAV8殼體進行胺基酸取代(在底部列中以粗體展示)。以灰色展示之序列=高變區。AAV殼體之胺基酸序列指定如圖3中所指示之序列ID號。
圖 4. 可連接至全長mAb或抗原結合域之HuGlyFab區的聚醣。(自Bondt等人, 2014, Mol & Cell Proteomics 13.1: 3029-3039改編)。
圖 5.  IgG1 (SEQ ID NO: 183)、IgG2 (SEQ ID NO: 184)及IgG4 (SEQ ID NO: 185)之恆定重鏈區(CH2及CH3)之Clustal多重序列比對。鉸鏈區(自重鏈之殘基219至殘基230)以斜體字展示。胺基酸之編號呈EU格式。
圖 6A 至圖 6C.( A 及 B)在於非還原( A)及還原( B)凝膠上用pITR-CAG-依庫珠單抗及pITR-CAG-可伐利單抗轉染HEK293T細胞之後，全長可伐利單抗及依庫珠單抗含量之表現。( C)在用pITR-CAG-hCFHL.1轉染HEK293T細胞之後，全長hCFHL1含量之表現。
圖 7A 及圖 7B展示不同抗體序列之比對。A)抗體之重鏈序列。自上至下：SEQ ID NO: 1之胺基酸1-230、SEQ ID NO: 3之胺基酸1-230、SEQ ID NO: 4之胺基酸1-220、SEQ ID NO: 6之胺基酸1-238、SEQ ID NO: 8之胺基酸1-228、SEQ ID NO: 10之胺基酸1-238及SEQ ID NO: 11之胺基酸1-245。B)抗體之輕鏈序列。自上至下：SEQ ID NO: 2之胺基酸1-164、SEQ ID NO: 5之胺基酸1-161、SEQ ID NO: 7之胺基酸1-161、SEQ ID NO: 9之胺基酸1-162及SEQ ID NO: 14之胺基酸1-161。
圖 8A及 圖 8B展示HEK293細胞中順式質體表現之載體化抗體在使用( A) 1.5%正常人類血清或( B) 20%正常小鼠血清之溶血抑制分析中抑制補體之能力的結果。 A)與重組C5抑制(C5I)蛋白以及同型及媒劑對照相比，人類C5抑制劑：IgG =可伐利單抗全長mAb，Fab =可伐利單抗Fab，scFv =可伐利單抗scFv mAb。 B)與重組C5抑制(C5I)蛋白以及同型及媒劑對照相比，小鼠C5抑制劑：IgG = BB5.1全長mAb，Fab = BB5.1 Fab，scFv = BB5.1 scFv mAb。
圖 9A 至圖 9F展示針對以下的溶血抑制分析中之各C5抑制劑抑制之典型及替代補體路徑的重組純化形式： A) 50%人類C5，典型補體路徑條件，測試抗hC5 (可伐利單抗型式)及C5抑制劑； B) 50%人類C5，替代補體路徑條件，測試抗hC5 (可伐利單抗型式)及C5抑制劑； C) 50%小鼠C5，典型補體路徑條件，測試抗hC5 (可伐利單抗型式)及抗mC5 (BB5.1 mAb型式)； D) 50%小鼠C5，典型補體路徑條件，比較抗hC5 (可伐利單抗全長mAb)與抗mC5 (BB5.1全長mAb)；E) 50%小鼠C5，典型補體路徑條件，比較抗hC5 (可伐利單抗Fab mAb)與抗mC5 (BB5.1 Fab mAb)；及 F) 50%小鼠C5，典型補體路徑條件，比較抗hC5 (可伐利單抗scFv mAb)及抗mC5 (BB5.1 scFv mAb)。
圖 10A至 圖 10H量測ARPE-19細胞( 圖 10A 至圖 10C)或iPSC衍生之RPE細胞( 圖 10D 至圖 10H)中之攻膜複合物(MAC)形成。
圖 11A及 圖 11B展示經由以1E8及3E8vg/眼視網膜下(SR)投與注射至野生型小鼠眼中之AAV8編碼C5抑制劑的結果。AAV8.CAG.抗hC5 (可伐利單抗)載體經格式化為IgG (全長)、Fab或scFv載體化抗體且以各劑量視網膜下(SR)投與，且AAV8.CAG.抗mC5 (BB5.1)載體以各劑量SR投與，而經純化重組抗mC5 IgG (BB5.1)或同型對照係腹膜內(ip)遞送。 A)表示呈ng/眼計(RNA轉錄物)之轉殖基因產物(TP)之量測結果； B)表示以pmol/眼計(蛋白質)之轉殖基因產物(TP)之量測結果。

Claims (119)

  1. 一種用於治療有需要之人類個體之老年性黃斑部病變(Age-Related Macular Degeneration；AMD)的醫藥組合物，其包含腺相關病毒(AAV)載體，該載體具有： (a)     病毒殼體，其對眼組織細胞具有向性；及 (b)    人工基因體，其包含側接AAV反向末端重複序列(ITR)之表現卡匣，其中該表現卡匣包含編碼實質上全長或全長抗C3或抗C5抗體或其抗原結合片段之重鏈及輕鏈的轉殖基因，可操作地連接於一或多個促進該轉殖基因於人類眼組織細胞中表現的調控序列； 其中該AAV載體經調配以向該人類個體視網膜下、玻璃體內、鼻內、前房內、脈絡膜上或全身性投與。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該病毒殼體與以下之胺基酸序列至少95%一致：AAV血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型3B (AAV3B)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8)、血清型9 (AAV9)、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型rh39 (AAVrh39)、血清型hu.37 (AAVhu.37)、血清型rh73 (AAVrh73)或血清型rh74 (AAVrh74)、血清型hu51 (AAV.hu51)、血清型hu21 (AAV.hu21)、血清型hu12 (AAV.hu12)或血清型hu26 (AAV.hu26)。
  3. 如請求項1或請求項2之醫藥組合物，其中該AAV殼體為AAV9、AAV8、AAV3B或AAVrh73，或其變體。
  4. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其中該等人類眼組織細胞為視網膜細胞、RPE-脈絡膜組織細胞、BrM上皮細胞、脈絡膜毛細管層上皮細胞，或感光細胞(視桿、視錐及/或視網膜神經節細胞)。
  5. 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物，其中該調控序列包含表1之調控序列。
  6. 如請求項5之醫藥組合物，其中該調控序列為CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)、CB啟動子(SEQ ID NO: 222或223)、人類視紫質激酶(GRK1)啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(cone arresting；CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(red opsin；RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)。
  7. 如請求項6之醫藥組合物，其中該調控序列為CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)。
  8. 如請求項1至7中任一項之醫藥組合物，其中該轉殖基因包含在編碼該實質上全長或全長抗C3或抗C5抗體或其抗原結合片段的重鏈之核苷酸序列與輕鏈之核苷酸序列之間的弗林蛋白酶(Furin)/2A連接子。
  9. 如請求項8之醫藥組合物，其中該弗林蛋白酶/2A連接子為具有胺基酸序列RKRR(GSG)APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 143或144)之弗林蛋白酶/T2A連接子。
  10. 如請求項1至9中任一項之醫藥組合物，其中該轉殖基因編碼信號序列在該抗原結合片段之重鏈及輕鏈之N端，該信號序列導引該等人類眼組織細胞中之分泌及轉譯後修飾。
  11. 如請求項10之醫藥組合物，其中該信號序列為MYRMQLLLLIALSL ALVTNS (SEQ ID NO: 85)或表2之信號序列。
  12. 如請求項1至7中任一項之醫藥組合物，其中該轉殖基因編碼具有如下結構之scFv：信號序列-VH-連接子-VL-多腺苷酸。
  13. 如請求項1至7中任一項之醫藥組合物，其中該轉殖基因編碼具有如下結構之scFv：信號序列-VL-連接子-VH-多腺苷酸。
  14. 如請求項12或13之醫藥組合物，其中該連接子為GGGGS (SEQ ID NO: 51)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 52)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 54)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55)。
  15. 如請求項14之醫藥組合物，其中該連接子為GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53)。
  16. 如請求項12至15中任一項之醫藥組合物，其中該信號序列為MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)或表2之信號序列。
  17. 如請求項16之醫藥組合物，其中該信號序列為MYRMQLLLLIALS LALVTNS (SEQ ID NO: 85)。
  18. 如請求項12至17中任一項之醫藥組合物，其中VH為SEQ ID NO: 251且VL為SEQ ID NO: 252，其中VH為SEQ ID NO: 253且VL為SEQ ID NO: 254，其中VH為SEQ ID NO: 255且VL為SEQ ID NO: 256，其中VH為SEQ ID NO: 257且VL為SEQ ID NO: 258，或其中VH為SEQ ID NO: 259且VL為SEQ ID NO: 260或261。
  19. 如請求項18之醫藥組合物，其中該轉殖基因編碼SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 262、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 264、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 266、SEQ ID NO: 270或SEQ ID NO: 271或其中該人工基因體包含可伐利單抗.scFv (Crovalimab.scFv) (SEQ ID NO: 267或SEQ ID NO: 268或SEQ ID NO: 269)。
  20. 如請求項1至11中任一項之醫藥組合物，其中轉殖基因具有以下結構：信號序列-重鏈-弗林蛋白酶位點-2A位點-信號序列-輕鏈-多腺苷酸。
  21. 如請求項1至11或20中任一項之醫藥組合物，其中該抗C5抗體為可伐利單抗、依庫珠單抗(eculizumab)、雷武珠單抗(ravulizumab)或特度魯單抗(tesidolumab)，或其抗原結合片段。
  22. 如請求項1至11或20至21中任一項之醫藥組合物，其中該實質上全長或全長抗C5抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之輕鏈；具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之輕鏈；具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之輕鏈；具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之輕鏈；具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之輕鏈。
  23. 如請求項1至11或20至22中任一項之醫藥組合物，其中該轉殖基因包含編碼重鏈的SEQ ID NO: 26之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 27之核苷酸序列；編碼重鏈之SEQ ID NO: 28之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 30之核苷酸序列；編碼重鏈之SEQ ID NO: 29之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 30之核苷酸序列；編碼重鏈之SEQ ID NO: 31之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 32之核苷酸序列；或編碼重鏈之SEQ ID NO: 33之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 34之核苷酸序列。
  24. 如請求項1至11或20中任一項之醫藥組合物，其中該抗C3抗體為NGM621或其抗原結合片段。
  25. 如請求項1至11或20或24中任一項之醫藥組合物，其中該實質上全長或全長抗C3或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之輕鏈；或具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之輕鏈。
  26. 如請求項1至25中任一項之醫藥組合物，其中該抗原結合片段為Fab、F(ab') 2或scFv。
  27. 如請求項1至11或20至23或26中任一項之醫藥組合物，其中該人工基因體包含CAG.依庫珠單抗.全長(SEQ ID NO: 47)、CAG.可伐利單抗.全長(SEQ ID NO: 44)、CAG.依庫珠單抗.fab.IgG1 (SEQ ID NO: 45)、CAG.依庫珠單抗.fab.IgG2 (SEQ ID NO: 46)，或CAG.可伐利單抗.fab (SEQ ID NO: 43)。
  28. 一種組合物，其包含腺相關病毒(AAV)載體，該AAV載體具有： a. 視情況與以下之胺基酸序列至少95%一致的病毒AAV殼體：AAV血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型3B (AAV3B)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8)、血清型9 (AAV9)、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型rh39 (AAVrh39)、血清型hu.37 (AAVhu.37)、血清型rh73 (AAVrh73)或血清型rh74 (AAVrh74)、血清型hu51 (AAV.hu51)、血清型hu21 (AAV.hu21)、血清型hu12 (AAV.hu12)或血清型hu26 (AAV.hu26)；及 b. 人工基因體，其包含側接AAV反向末端重複序列(ITR)之表現卡匣，其中該表現卡匣包含編碼實質上全長或全長BB5.1或可伐利單抗或其抗原結合片段之重鏈及輕鏈的轉殖基因，可操作地連接於一或多個促進該轉殖基因於人類眼組織細胞中表現的調控序列； 其中該轉殖基因編碼信號序列在該重鏈及該輕鏈之N端，且其中該信號序列導引該實質上全長或全長BB5.1或可伐利單抗或其抗原結合片段在該等人類眼組織細胞中之分泌及轉譯後修飾。
  29. 如請求項28之組合物，其中該等眼組織細胞為視網膜細胞、RPE-脈絡膜組織細胞、BrM上皮細胞、脈絡膜毛細管層上皮細胞，或感光細胞(視桿、視錐及/或視網膜神經節細胞)。
  30. 如請求項28或請求項29之組合物，其中該AAV殼體為AAV8、AAV9、AAV3B或AAVrh73，或其變體。
  31. 如請求項28至30中任一項之組合物，其中該全長mAb或該抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 2胺基酸序列之輕鏈；或SEQ ID NO:15及具有SEQ ID NO:16之胺基酸序列之輕鏈。
  32. 如請求項28至31中任一項之組合物，其中該轉殖基因包含編碼重鏈之SEQ ID NO: 26之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 27之核苷酸序列或編碼重鏈之SEQ ID NO: 35之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 36之核苷酸序列。
  33. 如請求項28至32中任一項之組合物，其中該轉殖基因包含在編碼該實質上全長或全長BB5.1或可伐利單抗的重鏈及輕鏈之該等核苷酸序列之間的弗林蛋白酶/2A連接子。
  34. 如請求項28至33中任一項之組合物，其中編碼弗林蛋白酶2A連接子之核酸併入該表現卡匣中在編碼該等重鏈及輕鏈序列之該等核苷酸序列之間，產生具有如下結構之構築體：信號序列-重鏈-弗林蛋白酶位點-2A位點-信號序列-輕鏈-多腺苷酸。
  35. 如請求項28至34中任一項之組合物，其中該弗林蛋白酶2A連接子為弗林蛋白酶/T2A連接子，具有胺基酸序列RKRR(GSG)APVKQT LNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 143或144)。
  36. 如請求項28至35中任一項之組合物，其中該信號序列為MYRMQ LLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)或表2之信號序列。
  37. 如請求項28至36中任一項之組合物，其中該抗原結合片段為Fab、F(ab') 2或scFv。
  38. 如請求項28至37中任一項之組合物，其中該人工基因體包含CAG.可伐利單抗.全長(SEQ ID NO: 44)、CAG.可伐利單抗.fab (SEQ ID NO: 43)、CAG.BB5.1 (SEQ ID NO: 48)或可伐利單抗.scFv (SEQ ID NO: 267或SEQ ID NO: 268或SEQ ID NO: 269)。
  39. 如請求項28至30中任一項之組合物，其中該轉殖基因編碼具有如下結構之scFv：信號序列-VH-連接子-VL-多腺苷酸。
  40. 如請求項28至30中任一項之組合物，其中該轉殖基因編碼具有如下結構之scFv：信號序列-VL-連接子-VH-多腺苷酸。
  41. 如請求項39或請求項40中任一項之組合物，其中該連接子為GGGGS (SEQ ID NO: 51)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 52)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 54)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55)。
  42. 如請求項41之組合物，其中該連接子為GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53)。
  43. 如請求項39至42中任一項之組合物，其中該信號序列為MYRMQ LLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)或表2之信號序列。
  44. 如請求項43之組合物，其中該信號序列為MYRMQLLLLIALS LALVTNS (SEQ ID NO: 85)。
  45. 如請求項39至44中任一項之組合物，其中VH為SEQ ID NO: 251且VL為SEQ ID NO: 252，其中VH為SEQ ID NO: 253且VL為SEQ ID NO: 254，其中VH為SEQ ID NO: 255且VL為SEQ ID NO: 256，其中VH為SEQ ID NO: 257且VL為SEQ ID NO: 258，或其中VH為SEQ ID NO: 259且VL為SEQ ID NO: 260或261。
  46. 如請求項39至45中任一項之組合物，其中該轉殖基因編碼SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 262、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 264、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 266、SEQ ID NO: 270或SEQ ID NO: 271或其中該人工基因體包含可伐利單抗.scFv (SEQ ID NO: 267或SEQ ID NO: 268或SEQ ID NO: 269)。
  47. 一種分析基因療法治療功效的方法，其包含向AMD之非人類靈長類動物或嚙齒動物模型投與如請求項28至46中任一項之組合物，其中該表現卡匣包含編碼實質上全長或全長BB5.1之重鏈及輕鏈的轉殖基因。
  48. 一種用於治療有需要之人類個體之老年性黃斑部變性(AMD)之組合物或方法，其包含向該個體視網膜下、玻璃體內、鼻內、前房內、脈絡膜上或全身性投與治療有效量的包含重組AAV之組合物，該重組AAV包含編碼抗C3 mAb或抗C5 mAb或其抗原結合片段之轉殖基因，可操作地連接於一或多個控制該轉殖基因於眼組織細胞中表現的調控序列。
  49. 如請求項48之組合物或方法，其中該抗C5 mAb為可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗或特度魯單抗。
  50. 如請求項48或49之組合物或方法，其中該全長抗C5 mAb或該抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之輕鏈；具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之輕鏈；具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之輕鏈；具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之輕鏈；或具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之輕鏈。
  51. 如請求項48至50中任一項之組合物或方法，其中該轉殖基因包含編碼重鏈之SEQ ID NO: 26之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 27之核苷酸序列；編碼重鏈之SEQ ID NO: 28之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 30之核苷酸序列；編碼重鏈之SEQ ID NO: 29之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 30之核苷酸序列；編碼重鏈之SEQ ID NO: 31之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 32之核苷酸序列；或編碼重鏈之SEQ ID NO: 33之核苷酸序列及編碼輕鏈之SEQ ID NO: 34之核苷酸序列。
  52. 如請求項48之組合物或方法，其中該抗CD3抗體為NGM621或其抗原結合片段。
  53. 如請求項48或請求項52之組合物或方法，其中該全長mAb或該抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之輕鏈，或具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列之重鏈及視情況具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之Fc多肽以及具有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之輕鏈。
  54. 如請求項48至53中任一項之組合物或方法，其中該眼組織細胞為視網膜細胞、RPE-脈絡膜組織細胞、BrM上皮細胞、脈絡膜毛細管層上皮細胞，或感光細胞(視桿、視錐及/或視網膜神經節細胞)。
  55. 如請求項48至54中任一項之組合物或方法，其中該病毒殼體與以下之胺基酸序列至少95%一致：AAV血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型3B (AAV3B)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8)、血清型9 (AAV9)、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型rh39 (AAVrh39)、血清型hu.37 (AAVhu.37)、血清型rh73 (AAVrh73)或血清型rh74 (AAVrh74)、血清型hu51 (AAV.hu51)、血清型hu21 (AAV.hu21)、血清型hu12 (AAV.hu12)或血清型hu26 (AAV.hu26)。
  56. 如請求項48至55中任一項之組合物或方法，其中該AAV殼體為AAV9、AAV8、AAV3B或AAVrh73，或其變體。
  57. 如請求項48至56中任一項之組合物或方法，其中該調控序列包括表1或表1a之調控序列。
  58. 如請求項57之組合物或方法，其中該調控序列為CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)、CB啟動子(SEQ ID NO: 222或223)、人類視紫質激酶(GRK1)啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)，或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)。
  59. 如請求項48至58中任一項之組合物或方法，其中該轉殖基因包含在編碼該mAb之重鏈及輕鏈的核苷酸序列之間的弗林蛋白酶/2A連接子。
  60. 如請求項59之組合物或方法，其中該弗林蛋白酶/2A連接子為弗林蛋白酶/T2A連接子，具有胺基酸序列RKRR(GSG)APVKQTLNFDLLKL AGDVESNPGP (SEQ ID NO: 143或144)。
  61. 如請求項48至60中任一項之組合物或方法，其中該轉殖基因編碼信號序列在該抗原結合片段之重鏈及輕鏈之N端，該信號序列導引該等人類眼組織細胞中之分泌及轉譯後修飾。
  62. 如請求項61之組合物或方法，其中該信號序列為MYRMQLLLLIA LSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)或表2之信號序列。
  63. 如請求項48至62中任一項之組合物或方法，其中轉殖基因具有如下結構：信號序列-重鏈-弗林蛋白酶位點-2A位點-信號序列-輕鏈-多腺苷酸。
  64. 如請求項48至58中任一項之組合物或方法，其中該轉殖基因編碼具有如下結構之scFv：信號序列-VH-連接子序列-VL-多腺苷酸。
  65. 如請求項48至58中任一項之組合物或方法，其中該轉殖基因編碼具有如下結構之scFv：信號序列-VL-連接子序列-VH-多腺苷酸。
  66. 如請求項64或請求項65之組合物或方法，其中該連接子為GGGGS (SEQ ID NO: 51)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 52)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 54)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55)。
  67. 如請求項66之組合物或方法，其中該連接子為GGGGSGGGGS GGGGS (SEQ ID NO: 53)。
  68. 如請求項64至67中任一項之組合物或方法，其中該信號序列為MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)或表2之信號序列。
  69. 如請求項68之組合物或方法，其中該信號序列為MYRMQLLLLIA LSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)。
  70. 如請求項64至69中任一項之組合物或方法，其中VH為SEQ ID NO: 251且VL為SEQ ID NO: 252，其中VH為SEQ ID NO: 253且VL為SEQ ID NO: 254，其中VH為SEQ ID NO: 255且VL為SEQ ID NO: 256，其中VH為SEQ ID NO: 257且VL為SEQ ID NO: 258，或其中VH為SEQ ID NO: 259且VL為SEQ ID NO: 260或261。
  71. 如請求項64至70中任一項之組合物或方法，其中該轉殖基因編碼SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 262、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 264、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 266、SEQ ID NO: 270或SEQ ID NO: 271或其中該人工基因體包含可伐利單抗.scFv (SEQ ID NO: 267或SEQ ID NO: 268或SEQ ID NO: 269)。
  72. 如請求項48至71中任一項之組合物或方法，其中該mAb或其抗原結合片段之該HuPTM形式之產生係藉由該重組核苷酸表現載體轉導培養物中之人類眼組織細胞且表現該mAb或其抗原結合片段確認。
  73. 如請求項48至72中任一項之組合物或方法，其中該治療有效量經測定足以維持RPE、視網膜、眼房液或玻璃狀液中至少10 ng/mL之濃度。
  74. 如請求項48至73中任一項之組合物或方法，其中該治療有效量經測定足以在投與10週、20週、6個月或1年內改良最佳矯正視力(BCVA) ≥ 2 ETDRS行；減小地圖狀萎縮之平均變化速率，如藉由眼底自發螢光(fundus autofluorescence；FAF)所量測；改良視覺功能，如藉由黑暗適應法所量測；改良對比敏感度，藉由Pelli-Robson測試；或減小隱結面積。
  75. 如請求項48至74中任一項之組合物或方法，其中該人工基因體包含CAG.依庫珠單抗.全長(SEQ ID NO: 47)、CAG.可伐利單抗.全長(SEQ ID NO: 44)、CAG.依庫珠單抗.fab.IgG1 (SEQ ID NO: 45)、CAG.依庫珠單抗.fab.IgG2 (SEQ ID NO: 46)、CAG.可伐利單抗.fab (SEQ ID NO: 43)，或可伐利單抗.scFv (SEQ ID NO: 267或SEQ ID NO: 268或SEQ ID NO: 269)。
  76. 如請求項48至75中任一項之組合物或方法，其中該抗C3 mAb或抗C5 mAb或其抗原結合片段抑制典型及替代補體路徑兩者。
  77. 如請求項48至76中任一項之方法，其中該抗C3 mAb或抗C5 mAb或其抗原結合片段抑制攻膜複合物(MAC)形成。
  78. 一種產生重組AAV之方法，其包含： (a)     培養含有以下之宿主細胞： (i) 人工基因體，其包含側接AAV ITR之順式表現卡匣，其中該順式表現卡匣包含編碼實質上全長或全長抗C3或抗C5或其抗原結合片段之轉殖基因，可操作地連接於一或多個促進該轉殖基因於人類眼組織細胞中表現的調控序列； (ii)     缺乏AAV ITR之反式表現卡匣，其中該反式表現卡匣編碼AAV rep及AAV殼體蛋白，可操作地連接於驅動該AAV rep及該AAV殼體蛋白於培養物宿主細胞中表現且反式供應該AAV rep及該AAV殼體蛋白的表現控制元件，其中該殼體具有眼組織細胞向性； (iii)    足夠腺病毒輔助功能以允許複製及由該AAV殼體蛋白包裝該人工基因體；及 (b)    自該細胞培養物回收殼體包裹(encapsidating)該人工基因體之重組AAV。
  79. 如請求項78之方法，其中該轉殖基因編碼包含BB5.1、可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗、特度魯單抗或NGM621之重鏈及輕鏈可變域的實質上全長或全長mAb或抗原結合片段，其中該AAV殼體蛋白為AAV8、AAV9、AAV3B或AAVrh73或其變體殼體蛋白。
  80. 如請求項78或請求項79之方法，其中該眼組織細胞為視網膜細胞、RPE-脈絡膜組織細胞、BrM上皮細胞、脈絡膜毛細管層上皮細胞，或感光細胞(視桿、視錐及/或視網膜神經節細胞)。
  81. 如請求項78至80中任一項之方法，其中該人工基因體包含CAG.依庫珠單抗.全長(SEQ ID NO: 47)、CAG.可伐利單抗.全長(SEQ ID NO: 44)、CAG.依庫珠單抗.fab.IgG1 (SEQ ID NO: 45)、CAG.依庫珠單抗.fab.IgG2 (SEQ ID NO: 46)、CAG.可伐利單抗.fab (SEQ ID NO: 43)、CAG.BB5.1 (SEQ ID NO: 48)、依庫珠單抗.scFv (SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 268或SEQ ID NO: 269)。
  82. 一種宿主細胞，其包含： 質體，其包含側接AAV ITR之順式表現卡匣，其中該順式表現卡匣包含編碼實質上全長或全長抗C3 mAb或抗C5 mAb或其抗原結合片段之轉殖基因，可操作地連接於一或多個促進該轉殖基因於人類眼組織細胞中表現的調控序列。
  83. 如請求項82之宿主細胞，其中該轉殖基因編碼包含BB5.1、可伐利單抗、依庫珠單抗、雷武珠單抗、特度魯單抗或NGM621之重鏈及輕鏈可變域的實質上全長或全長mAb或抗原結合片段。
  84. 如請求項82或請求項83之宿主細胞，其中該眼組織細胞為視網膜細胞、RPE-脈絡膜組織細胞、BrM上皮細胞、脈絡膜毛細管層上皮細胞，或感光細胞(視桿、視錐及/或視網膜神經節細胞)。
  85. 如請求項82至84中任一項之宿主細胞，其中該構築體內之轉殖基因包含CAG.依庫珠單抗.全長(SEQ ID NO: 47)、CAG.可伐利單抗.全長(SEQ ID NO: 44)、CAG.依庫珠單抗.fab.IgG1 (SEQ ID NO: 45)、CAG.依庫珠單抗.fab.IgG2 (SEQ ID NO: 46)、CAG.可伐利單抗.fab (SEQ ID NO: 43)、CAG.BB5.1 (SEQ ID NO: 48)、可伐利單抗.scFv (SEQ ID NO: 267或SEQ ID NO: 268或SEQ ID NO: 269)。
  86. 一種用於治療有需要之人類個體之AMD的醫藥組合物，其包含腺相關病毒(AAV)載體，該AAV載體具有： (a)     病毒殼體，其對眼組織細胞具有向性；及 (b)    人工基因體，其包含側接AAV內部串聯重複序列(ITR)之表現卡匣，其中該表現卡匣包含編碼hCFHL1之轉殖基因，可操作地連接於一或多個控制該轉殖基因於人類眼組織細胞中表現的調控序列； 其中該AAV載體經調配以向該人類個體視網膜下、玻璃體內、鼻內、前房內、脈絡膜上或全身性投與。
  87. 如請求項86之醫藥組合物，其中該病毒殼體與以下之胺基酸序列至少95%一致：AAV血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型3B (AAV3B)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8)、血清型9 (AAV9)、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型rh39 (AAVrh39)、血清型hu.37 (AAVhu.37)、血清型rh73 (AAVrh73)或血清型rh74 (AAVrh74)、血清型hu51 (AAV.hu51)、血清型hu21 (AAV.hu21)、血清型hu12 (AAV.hu12)或血清型hu26 (AAV.hu26)。
  88. 如請求項86或請求項87之醫藥組合物，其中該AAV殼體為AAV8、AAV9、AAV3B或AAVrh73，或其變體。
  89. 如請求項86至88中任一項之醫藥組合物，其中該等眼組織細胞為視網膜細胞、RPE-脈絡膜組織細胞、BrM上皮細胞、脈絡膜毛細管層上皮細胞，或感光細胞(視桿、視錐及/或視網膜神經節細胞)。
  90. 如請求項86至89中任一項之醫藥組合物，其中該調控序列包含表1之調控序列。
  91. 如請求項90之醫藥組合物，其中該調控序列為CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)、CB啟動子(SEQ ID NO: 222或223)、人類視紫質激酶(GRK1)啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)，或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)。
  92. 如請求項86至91中任一項之醫藥組合物，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 49之核苷酸序列。
  93. 如請求項86至92中任一項之醫藥組合物，其中該hCFHL1蛋白具有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。
  94. 如請求項86至93中任一項之醫藥組合物，其中該人工基因體包含構築體CAG.hCFHL.1 (SEQ ID NO: 50)。
  95. 一種組合物，其包含腺相關病毒(AAV)載體，該AAV載體具有： a. 視情況與以下之胺基酸序列至少95%一致的病毒AAV殼體：AAV血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型3B (AAV3B)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8)、血清型9 (AAV9)、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型rh39 (AAVrh39)、血清型hu.37 (AAVhu.37)、血清型rh73 (AAVrh73)或血清型rh74 (AAVrh74)、血清型hu51 (AAV.hu51)、血清型hu21 (AAV.hu21)、血清型hu12 (AAV.hu12)或血清型hu26 (AAV.hu26)； b. 人工基因體，其包含側接AAV反向末端重複序列(ITR)之表現卡匣，其中該表現卡匣包含編碼hCFHL蛋白之轉殖基因，可操作地連接於一或多個促進該轉殖基因於人類眼組織細胞中表現的調控序列； 其中該轉殖基因編碼信號序列在該hCFHL1蛋白之N端，該信號序列導引該hCFHL1蛋白於該等眼組織細胞中之分泌及轉譯後修飾。
  96. 如請求項95之組合物，其中該hCFHL1蛋白具有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。
  97. 如請求項95或請求項96之組合物，其中該等眼組織細胞為視網膜細胞、RPE-脈絡膜組織細胞、BrM上皮細胞、脈絡膜毛細管層上皮細胞，或感光細胞(視桿、視錐及/或視網膜神經節細胞)。
  98. 如請求項95至97中任一項之組合物，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 49之核苷酸序列。
  99. 如請求項95至98中任一項之組合物，其中該信號序列為MYRMQ LLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 85)或表2之信號序列。
  100. 如請求項95至99中任一項之組合物，其中該人工基因體為自補的。
  101. 如請求項95至100中任一項之組合物，其中該人工基因體包含構築體CAG.hCFHL.1 (SEQ ID NO: 50)。
  102. 一種治療有需要之人類個體之AMD的方法，其包含向該個體視網膜下、玻璃體內、鼻內、前房內、脈絡膜上或全身性投與治療有效量的包含重組AAV之組合物，該重組AAV包含編碼hCFHL1蛋白之轉殖基因，可操作地連接於一或多個控制該轉殖基因於眼組織細胞中表現的調控序列。
  103. 一種治療有需要之人類個體之AMD的方法，其包含：向該個體視網膜下、玻璃體內、鼻內、前房內、脈絡膜上或全身性投與治療有效量的包含編碼hCFHL1蛋白之轉殖基因的重組核苷酸表現載體，可操作地連接於一或多個控制該轉殖基因於人類眼組織細胞中表現的調控序列，使得形成釋放hCFHL1蛋白之人類轉譯後修飾(HuPTM)形式的儲存物(depot)。
  104. 如請求項102或103之方法，其中該眼組織細胞為視網膜細胞、RPE-脈絡膜組織細胞、BrM上皮細胞、脈絡膜毛細管層上皮細胞，或感光細胞(視桿、視錐及/或視網膜神經節細胞)。
  105. 如請求項102至104中任一項之方法，其中該轉殖基因具有SEQ ID NO: 49之核苷酸序列。
  106. 如請求項102至105中任一項之方法，其中該病毒殼體與以下之胺基酸序列至少95%一致：AAV血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型3B (AAV3B)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8)、血清型9 (AAV9)、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型rh39 (AAVrh39)、血清型hu.37 (AAVhu.37)、血清型rh73 (AAVrh73)或血清型rh74 (AAVrh74)、血清型hu51 (AAV.hu51)、血清型hu21 (AAV.hu21)、血清型hu12 (AAV.hu12)或血清型hu26 (AAV.hu26)。
  107. 如請求項102至106中任一項之方法，其中該AAV殼體為AAV8、AAV9、AAV3B或AAVrh73，或其變體。
  108. 如請求項102至107中任一項之方法，其中該調控序列包括表1或表1a之調控序列。
  109. 如請求項108之方法，其中該調控序列為CAG啟動子(SEQ ID NO: 74)、CB啟動子(SEQ ID NO: 222或223)、人類視紫質激酶(GRK1)啟動子(SEQ ID NO: 77或217)、小鼠視錐抑制蛋白(CAR)啟動子(SEQ ID NO: 214-216)、人類紅色視蛋白(RedO)啟動子(SEQ ID NO: 212)，或Best1/GRK1串聯啟動子(SEQ ID NO: 224)。
  110. 如請求項102至109中任一項之方法，其中該轉殖基因編碼信號序列在該hCFHL1蛋白之N端，該信號序列導引該等人類眼組織細胞中之分泌及轉譯後修飾。
  111. 如請求項110之方法，其中該信號序列為MYRMQLLLLIALSL ALVTNS (SEQ ID NO: 85)或表2之信號序列。
  112. 如請求項102至111中任一項之方法，其中該hCFHL1蛋白之HuPTM形式之產生係藉由該重組核苷酸表現載體轉導培養物中之人類眼細胞及表現該hCFHL1蛋白確認。
  113. 如請求項102或請求項103之方法，其中該治療有效量經測定足以在投與10週、20週、6個月或1年內改良最佳矯正視力(BCVA)≥ 2 ETDRS行或增加logMAR；減小地圖狀萎縮之平均變化速率，如藉由眼底自發螢光(FAF)所量測；改良視覺功能，如藉由黑暗適應法所量測；改良對比敏感度，藉由Pelli-Robson測試；或減小隱結面積。
  114. 如請求項102至113中任一項之方法，其中該轉殖基因在構築體CAG.hCFHL.1 (SEQ ID NO: 50)內。
  115. 一種產生重組AAV之方法，其包含： (c)     培養宿主細胞，該宿主細胞含有： (i) 人工基因體，其包含側接AAV ITR之順式表現卡匣，其中該順式表現卡匣包含編碼hCFHL1蛋白之轉殖基因，可操作地連接於一或多個促進該轉殖基因於人類眼組織細胞中表現的調控序列； (ii)     缺乏AAV ITR之反式表現卡匣，其中該反式表現卡匣編碼AAV rep及AAV殼體蛋白，可操作地連接於驅動該AAV rep及該AAV殼體蛋白於培養物宿主細胞中表現且反式供應該AAV rep及該AAV殼體蛋白的表現控制元件，其中該殼體具有眼組織向性； (iii)    足夠的腺病毒輔助功能以允許複製及由該AAV殼體蛋白包裝該人工基因體；及 (d)    自該細胞培養物回收殼體包裹該人工基因體之重組AAV。
  116. 如請求項115之方法，其中該眼組織細胞為視網膜細胞、RPE-脈絡膜組織細胞、BrM上皮細胞、脈絡膜毛細管層上皮細胞，或感光細胞(視桿、視錐及/或視網膜神經節細胞)。
  117. 如請求項115或請求項116之方法，其中該AAV殼體蛋白為AAV血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型3B (AAV3B)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8)、血清型9 (AAV9)、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型rh39 (AAVrh39)、血清型hu.37 (AAVhu.37)、血清型rh73 (AAVrh73)或血清型rh74 (AAVrh74)、血清型hu51 (AAV.hu51)、血清型hu21 (AAV.hu21)、血清型hu12 (AAV.hu12)或血清型hu26 (AAV.hu26)。
  118. 一種宿主細胞，其包含： 質體，其包含側接AAV ITR之順式表現卡匣，其中該順式表現卡匣包含編碼hCFHL1之轉殖基因，可操作地連接於一或多個促進該轉殖基因於人類眼組織細胞中表現的調控序列。
  119. 如請求項118之宿主細胞，其中該轉殖基因編碼hCFHL1 (SEQ ID NO: 23)。
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