BR112013027120B1 - Vírion de vírus adenoassociado recombinante (raav), seu uso, composição farmacêutica e vírion de vírus adenoassociado recombinante 2 (raav2) - Google Patents

Vírion de vírus adenoassociado recombinante (raav), seu uso, composição farmacêutica e vírion de vírus adenoassociado recombinante 2 (raav2) Download PDF

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David V. Schaffer
Ryan R. Klimczak
James T. Koerber
John G. Flannery
Deniz Dalkara Mourot
Meike Visel
Leah C.T. Byrne
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Abstract

PROTEÍNA DE CAPSÍDEO DE VÍRUS ADENOASSOCIADO (AAV) VARIANTE, VÍRION DE VÍRUS ADENOASSOCIADO RECOMBINANTE (RAAV), SEU USO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO E CÉLULA HOSPEDEIRA. A presente divulgação fornece vírions de vírus adenoassociado (AAV) com proteína de capsídeo alterada, onde os vírions de AAV exibem maior infectividade de células retinais quando administrados via injeção intravítrea em comparação AAV tipo selvagem. A presente divulgação ainda fornece métodos para distribuir um produto de gene para uma célula retinal em um indivíduo e métodos para tratar doença ocular.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA
[001] Este pedido reivindica o benefício de pedido de patenteprovisório US 61/478.355, depositado em 22 de abril de 2011, cuja revelação é incorporada aqui como referência em sua totalidade.
DECLARAÇÃO RELACIONADA À PESQUISA COM PATROCÍNIO FEDERAL
[002] Esta invenção foi realizada com suporte governamental sobos N.°s de concessão EY016994-02 e EY1018241 conferido pelo National Eye Institute do National Institutes of Health. O governo tem certos direitos na invenção.
FUNDAMENTOS
[003] Fotorreceptores são os primeiros neurônios na retina a receber e processar as informações visuais, convertendo radiação ele-tromagnética em respostas hiperpolarizadas através da fototransdu- ção. A maioria esmagadora de doenças de retina herdades resulta na perda destas células, diretamente, como em mutações dominantes que afetam a dobra da proteína rodopsina, ou indiretamente, como mutações recessivas que afetam as vias de reciclagem da retina no epitélio de pigmento de retina (RPE).
[004] AAV pertence à família Parvoviridae e gênero Dependovi-rus, cujos membros requerem coinfecção om um vírus auxiliar como adenovírus para promover a replicação, e AAV estabiliza uma infecção latente na ausência de um ajudante. Os vírions são compostos de um capsídeo icosaédrico de 25 nm englobando um genoma de DNA de fita simples de 4,9 kb com duas regiões de leitura: rep e cap. O gene rep não estrutural codifica quatro proteínas regulatórias essenciais pa- ra replicação viral, enquanto que cap codifica três proteínas estruturais (VP1-3) que montam uma casca de capsídeo de 60-mero. Este capsí- deo viral medeia a capacidade de vetores AAV em superar muitas das barreiras biológicas de transdução viral, incluindo ligação ao receptor de superfície celular, endocitose, tráfego intracelular, e desempacota- mento no núcleo.Literatura
[005] Publicação de Patente US 2005/0053922; Publicação dePatente US 2009/0202490; Allocca et al. (2007) J. Virol. 81: 11372; Boucas et al. (2009) J. Gene Med. 11: 1103.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] A presente divulgação fornece vírions de vírus adeno associado (AAV) com proteína de capsídeo alterada, onde os vírions AAV exibem maior infectividade de uma célula de retina, quando administrados via injeção intravítrea em comparação ao AAV tipo selvage,. A presente divulgação ainda fornece métodos para liberar um produto de further gene a uma célula da retina em um indivíduo e métodos para tratar doença ocular.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[007] A Figura 1 fornece um modelo tridimensional representativode AAV2 contendo um heptâmero aleatório após aminoácido 587.
[008] A Figura 2 descreve níveis maiores de transdução intraví-trea por AAV2 variante 7M8 (direita), em relação ao AAV2 (esquerda).
[009] A Figura 3 fornece imagens de fluorescência representativas de criofatias de retina que mostram a expressão de proteína fluorescente verde (GFP) resultante de 7M8 contendo o gene GFP sob o controle de promotor ubíquo CAG (esquerda) ou um promotor Rho específico para o fotorreceptor (direita).
[0010] A Figura 4 representa células fotorreceptoras GFP+ por milhão de células retinais como contado por citometria de fluxo, em se- guida a transdução por 7M8 ou por 7M8 contendo 4 mutações de tiro- sina (7m8.4YF).
[0011] A Figura 5 fornece uma sequência de aminoácido de AAV2VP1 (SEQ ID NO: l).
[0012] A Figura 6 fornece sequências de aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 570-610 de AAV2 (Figura 5) de uma proteína VP1 de capsídeo AAV de vários sorotipos AAV.
[0013] As Figuras 7A-I representam melhoras estruturais na retinade camundongo Rs1h-/- após transferência de gene.
[0014] As Figuras 8A-D representam resgate funcional das ondasA e B de eletroretinograma em seguida a liberação do gene RS1.
[0015] As Figuras 9A-E representam melhoras sustentadas emespessura de retina medidas em 10 meses após tratamento de 7m8- rho-RS1.
[0016] A Figura 10 fornece uma sequência de aminoácido de reti-nosquisina.
[0017] A Figura 11 fornece uma sequência de aminoácido de fatorneurotrófico derivado de cérebro.
[0018] A Figura 12 fornece uma sequência de aminoácido deRPE65.
[0019] As Figuras 13A-C fornecem a sequência de nucleotídeo doconstruto 7m8-rho-RS1.
[0020] A Figura 14 fornece uma sequência de aminoácido de peri-ferina 2.
[0021] A Figura 15 fornece uma sequência de aminoácido de peri-ferina.
[0022] A Figura 16 fornece uma sequência de aminoácido de proteína 1 de interação com GTPase de retinite pigmentosa.
[0023] As Figuras 17A-C fornecem um alinhamento de sequênciasde aminoácidos de regiões da alça IV (alça GH) da proteína de capsí- deo AAV. Sítios de inserção são mostrados em negrito e sublinhados.
[0024] As Figuras 18A-C fornecem um alinhamento de sequênciasde aminoácidos das regiões da alça GH de proteína do capsídeo AAV, com inserções de peptídeos heterólogos.
[0025] A Figura 19 fornece uma imagem de fundo de olho de fluorescência que mostra a expressão GFP em retina primata central 9 semanas após a administração de 7m8 contendo GFP sob o controle de promotor connexin36.
DEFINIÇÕES
[0026] O termo "célula da retina" pode se referir aqui a qualquertipo de célula que compreende a retina, como células ganglionares da retina, células amácrimas, células horizontais, células bipolares, e células fotorreceptoras incluindo bastonetes e cones, células gliais de Müller, e epitélio pigmentado da retina.
[0027] "AAV" é uma abreviação para vírus adeno associado e pode ser usada para se referir ao próprio vírus ou derivados dos mesmos. O termo cobre todos os subtipos e ambas as formas de ocorrência natural e recombinantes, exceto onde requerido de outra forma. A abreviação "rAAV" refere-se ao vírus adeno associado recombinante, também referenciado como um vetor AAV recombinante (ou "vetor rA- AV"). O termo "AAV" inclui AAV tipo 1 (AAV-1), AAV tipo 2 (AAV-2), AAV tipo 3 (AAV-3), AAV tipo 4 (AAV-4), AAV tipo 5 (AAV-5), AAV tipo 6 (AAV-6), AAV tipo 7 (AAV-7), AAV tipo 8 (AAV-8), AAV aviário, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV primata, AAV não primata, e AAV oviN.° "AAV primata" refere-se a AAV que infecta primatas, "AAV não primata" refere-se a um AAV que infecta mamíferos não primatas, "AAV bovino" refere-se a AAV que infecta mamíferos bovinos, etc.
[0028] As sequências genômicas de vários sorotipos de AAV, bemcomo as sequências das repetições terminais nativas (TRs), proteínas Rep, e subunidades de capsídeo são conhecidas na técnica. Ditas se- quências podem ser encontradas na literatura ou bancos de dados públicos como GenBank. Ver, por exemplo, GenBank Números de acessão NC_002077 (AAV-1), AF063497 (AAV-1), NC_001401 (AAV-2),AF043303 (AAV-2), NC_001729 (AAV-3), NC_001829 (AAV-4),U89790 (AAV-4), NC_006152 (AAV-5), AF513851 (AAV-7), AF513852 (AAV-8), e NC_006261 (AAV-8); as revelações das quais são incorporadas por referência aqui para ensinamento de sequências de ácido nucleico e aminoácidos de AAV. Ver ainda, por exemplo, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et al.,(1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al. (2004) Virology 33:375-383; publicações de patente internacionais WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; e patente US 6.156.303.
[0029] Um "vetor rAAV" como usado aqui se refere a um vetorAAV compreendendo uma sequência de polinucleotídeo não de origem AAV (ou seja, um polinucleotídeo heterólogo a AAV), tipicamente uma sequência de interesse para a transformação genética de uma célula. Em geral, o polinucleotídeo heterólogo é flanqueado em pelo menos uma, e geralmente por duas, sequências repetidas de terminal invertido de AAV (ITRs). O termo vetor rAAV inclui ambos partículas de vetor rAAV e plasmídeos de vetor rAAV. Um vetor rAAV pode ser fita simples (ssAAV) ou autocomplementar (scAAV).
[0030] Um "vírus AAV" ou "partícula viral AAV" ou "partícula devetor rAAV" refere-se a uma partícula viral composta de pelo menos uma proteína de capsídeo AAV (tipicamente todas as proteínas de capsídeo de um AAV tipo selvagem) e um vetor rAAV de polinucleotí- deo encapsidado. Se a partícula compreende um polinucleotídeo hete- rólogo (ou seja, um polinucleotídeo além do genoma de AAV tipo sel vagem como um transgene a ser liberado a uma célula de mamífero), esta é tipicamente referenciada como uma "partícula de vetor rAAV" ou simplesmente um "vetor rAAV". Assim, a produção de partícula rAAV necessariamente inclui a produção de vetor rAAV, como um vetor é contido dentro de uma partícula de rAAV.
[0031] "Empacotamento" refere-se a uma série de eventos intracelulares que resultam na montagem e encapsidação de uma partícula AAV.
[0032] Genes "rep" e "cap" de AAV referem-se às sequências depolinucleotídeo que codificam proteínas de replicação e encapsidação de vírus adeno associados. AAV rep e cap são referenciados aqui como "genes de empacotamento" de AAV.
[0033] Um "vírus auxiliar" para AAV refere-se a um vírus que permite a AAV (por exemplo, AAV tipo selvagem) ser replicado e empacotado por uma célula de mamífero. Uma variedade de dito vírus auxiliar para AAV é conhecida na técnica, incluindo, adenovírus, herpes vírus e pox vírus, tal como vaccínia. Os adenovírus incluem um número de subgrupos diferentes, embora Adenovírus tipo 5 de subgrupo C seja mais comumente usado. Vários adenovírus de origem humana, mamífera não humana e de origem aviária são conhecidos e disponíveis dos depositários como o ATCC. Os vírus da família herpes incluem, por exemplo, vírus herpes simplex (HSV) e vírus Epstein-Barr (EBV), bem como citomegalovírus (CMV) e vírus pseudo-raiva (PRV); que são ainda disponíveis de depositórios como ATCC.
[0034] As "funções de vírus auxiliar" referem-se às funções codificadas em um genoma de vírus auxiliar que permitem a replicação AAV e empacotamento (em conjunto com outros requisitos para replicação e empacotamento descritos aqui). Como descrito aqui, "função de vírus auxiliar" pode ser fornecida em uma variedade de formas, incluindo fornecendo vírus auxiliar ou fornecendo, por exemplo, sequências de polinucleotídeo que codifica as funções requisitos para uma célula produtora em trans. Por exemplo, um plasmídeo ou outro vetor de expressão compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais proteínas adenovirais em uma célula produtora junto com um vetor rAAV.
[0035] Um vírus "infeccioso" ou partícula viral é um que compreende um capsídeo viral montado competentemente e é capaz de liberar um componente polinucleotídeo em uma célula pela qual a espécie viral é trópica. O termo não necessariamente envolve qualquer capacidade de replicação do vírus. Os ensaios para contagem de partículas virais são descritos em outro ponto nesta revelação e na técnica. A infectividade viral pode ser expressa como a proporção de partículas virais infecciosas para o total de partículas virais. Métodos para determinar a proporção de partícula viral infecciosa para um total de partículas virais são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11:S337 (que descreve um ensaio de título infeccioso TCID50); e Zolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6:973. Ver também os Exemplos.
[0036] Um vírus "competente para replicação" (por exemplo, umAAV competente para replicação) refere-se a um vírus tipo selvagem fenotipicamente que é infeccioso e é ainda capaz de ser replicado em uma célula infectada (ou seja, na presença de um vírus auxiliar ou funções de vírus auxiliar). No caso de AAV, competência para replicação geralmente requer a presença de genes de empacotamento AAV funcionais. Em geral, os vetores rAAV como descrito aqui são incompetentes para replicação em células mamíferas (especialmente em células humanas) em virtude da falta de um ou mais genes de empacotamento AAV. Tipicamente, ditos vetores rAAV são desprovidos de qualquer gene de empacotamento AAV para minimizar a possibilidade que AAV competente para replicação seja gerado por recombinação entre genes de empacotamento de AAV e um vetor rAAV de entrada. Em muitas modalidades, as preparações de vetor rAAV como descritas aqui são aquelas que contêm alguns se algum AAV competente para replicação (rcAAV, ainda referenciado como RCA) (por exemplo, menos do que cerca de 1 rcAAV por 102 partículas de rAAV, menos do que cerca de 1 rcAAV por 104 partículas de rAAV, menos do que cerca de 1 rcAAV por 108 partículas de rAAV, menos do que cerca de 1 rcA- AV por 1012 partículas de rAAV, ou sem rcAAV).
[0037] O termo "polinucleotídeo" refere-se a uma forma poliméricade nucleotídeos de qualquer comprimento, incluindo desoxiribonucleo- tídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Um polinucleo- tídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo, e podem ser interrompidos por componentes não nucleotídeos. Se presentes, as modificações à estrutura do nucleotídeo podem ser conferidas antes ou após a montagem do polímero. O termo polinucleotídeo, como usado aqui, refere-se de modo intercambiável às moléculas de fita simples e dupla. Salvo se especificado ou requerido de outra forma, qualquer modalidade da invenção descrita aqui que é um polinucleotídeo inclui ambas as formas de fita dupla e cada uma das formas complementares de fita simples ou previstas para preparar a forma de fita dupla.
[0038] As reações de hibridização de ácido nucleico podem serrealizadas em condições de diferentes "rigores". As condições que aumentam o rigor de uma reação de hibridização amplamente conhecidas e publicadas na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, aqui incorporado por referência. Por exemplo, ver pagina 7.52 de Sambrook et al. Exemplos de condições relevantes incluem (em ordem de rigor crescente): temperaturas de incubação de 25°C, 37°C, 50°C e 68°C; concentrações de tampão de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (onde 1 x SSC é 0,15 M NaCl e 15 mM tampão citrato) e seus equivalentes usando outros sistemas de tampão; concentrações de formamida de 0%, 25%, 50%, e 75%; tempos de incubação de 5 minutos a 24 horas; 1, 2, ou mais etapas de lavagem; tempos de incubação de lavagem de 1, 2, ou 15 minutos; e soluções de lavagem de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, ou água deionizada. Um exemplo de condições de hibridização rigorosas a 50°C ou maiores e 0,1 x SSC (15 mM de cloreto de sódio /1,5 mM citrato de sódio). Outro exemplo de condições de hibridização rigorosas é incubação durante a noite a 42°C em uma solução: 50% formamida, 1 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato de sódio), 50 mM fosfato de sódio (pH 7,6), 5 x solução de Denhardt, 10% sulfato de dextrana, e 20 μg/ml de DNA de espermatozóide de salmão cortado desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 0,1 x SSC em cerca de 65°C. Como outro exemplo, as condições de hibridização rigorosas compreendem: pré-hibridização por 8 horas durante a noite a 65°C em uma solução compreendendo 6X citrato de intensidade simples (SSC) (1X SSC é 0,15 M NaCl, 0,015 M citrato de Na; pH 7,0), 5X solução de Denhardt, 0,05% pirofosfato de sódio e 100 μg/ml DNA de espermato- zoide de arenque; hibridização por 18-20 horas a 65°C em uma solução contendo 6X SSC, 1X solução de Denhardt, 100 μg/ml tRNA de levedura e 0,05% pirofosfato de sódio; e lavagem de filtros a 65°C por 1 h em uma solução contendo 0,2X SSC e 0,1% SDS (dodecil sulfato de sódio).
[0039] Condições rigorosas de hibridização são condições de hi-bridização que são pelo menos rigorosas que as condições representativas acima. Outras condições rigorosas de hibridização são conhecidas na técnica e podem ainda ser empregadas para identificar ácidos nucleicos desta modalidade particular da invenção.
[0040] "Tm" é a temperatura em graus Celsius em que 50% de um duplex de polinucleotídeo feito de fitas complementares de hidrogênio ligadas em direção anti-paralela por pareamento de base de Watson- Crick se dissociam em fitas simples nas condições do experimento. Tm pode ser prevista de acordo com uma fórmula padrão, como:Tm= 81,5 + 16,6 log[X+] + 0,41 (%G/C) - 0,61 (%F) - 600/L
[0041] onde [X+] é a concentração de cátion (geralmente íon sódio,Na+) em mol/L; (%G/C) é o número de resíduos G e C como um percentual de resíduos totais no duplex; (%F) é a formamida percentual em solução (peso/vol); e L e o número de nucleotídeos em cada fita do duplex.
[0042] Um polinucleotídeo ou polipeptídeo tem determinado percentual de "identidade de sequência" a outro polinucleotídeo ou peptí- deo, significando que, quando alinhado, aquele percentual de bases ou aminoácidos são o mesmo quando comparando as duas sequências. A similaridade de sequência pode ser determinada em um número de diferentes modos. Para determinar a identidade de sequência, as sequências podem ser alinhadas usando os métodos e programas de computador, incluindo BLAST, disponível na internet em ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Outro algoritmo de alinhamento é FASTA, disponível no pacote Genetics Computing Group (GCG), de Madison, Wisconsin, USA, uma subsidiária integral de Oxford Molecular Group, Inc. Outras técnicas para alinhamento são descritas em Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Se-quence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., uma divisão de Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA. De particular interesse são programas de alinhamento que permitem lacunas na sequência. O Smith-Waterman é um tipo de algoritmo que permite hiatos em alinhamentos de sequência. Ver Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Ainda, o programa GAP usando o método de alinhamento de Needleman e Wunsch pode ser utilizado para alinhar as sequências. Ver J. Mol. Biol. 48: 443- 453 (1970).
[0043] De interesse é o programa BestFit usando o algoritmo dehomologia local de Smith e Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981) para determinar a identidade de sequência. A penalidade de geração de gap irá geralmente variar de 1 a 5, geralmente 2 a 4 e em muitas modalidades será de 3. A penalidade de extensão de gap irá geralmente variar de cerca de 0,01 a 0,20 e em muitos casos será de 0,10. O programa tem parâmetros padrões determinados pelas sequências inseridas a serem comparadas. Preferencialmente, a identidade de sequência é determinada usando os parâmetros padrões determinados pelo programa. Este programa está disponível ainda de pacote Genetics Computing Group (GCG), de Madison, Wisconsin, USA.
[0044] Outro programa de interesse é o algoritmo FastDB. FastDBé descrito em Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Ap-plications, pp. 127-149, 1988, Alan R. Liss, Inc. O percentual de identidade de sequência é calculado por FastDB baseado nos seguintes parâmetros:Penalidade de Incompatibilidade: 1,00;Penalidade de Gap: 1,00;Penalidade de Tamanho de Gap: 0,33; e Penalidade de Junção: 30,0.
[0045] Um "gene" refere-se a um polinucleotídeo contendo pelomenos uma região de leitura que é capaz de codificar uma proteína particular após ser transcrita e traduzida.
[0046] Um "produto de gene" é uma molécula que resulta da expressão de um gene particular. Produtos de gene incluem, por exemplo, um polipeptídeo, um aptâmero, um RNA interferente, um aptâme- ro, um RNA interferente, um mRNA e similares.
[0047] Uma "interferene curto" ou "RNA interferente curto" ou siRNA é um RNA duplex de nucleotídeos que é direcionado a um gene de interesse (um "gene alvo"). Um "RNA duplex" refere-se à estrutura formada pelo pareamento complementar entre duas regiões de uma molécula de RNA. siRNA é "direcionado" a um gene em que a sequência de nucleotídeo da porção da porção duplex do siRNA é complementar a uma sequência de nucleotídeo do gene alvo. Em algumas modalidades, o comprimento de duplex de siRNAs é de menos do que 30 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o duplex pode ser de 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 nucleotídeos em comprimento. Em algumas modalidades, o comprimento do duplex é de 19-25 nucleotídeos em comprimento. A porção de RNA duplex do siRNA pode ser parte da estrutura em hairpin. Além da porção duplex, a estrutura em hairpin pode conter uma porção em alça posicionada entre as duas sequências que formam o duplex. A alça loop pode variar em comprimento. Em algumas modalidades a alça é de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 nucleotídeos em comprimento. A estrutura hairpin pode ainda conter posição de sobreposição 3' ou 5'. Em algumas modalidades, a sobreposição é uma sobreposição 3' ou 5' de 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos em comprimento.
[0048] Um "RNA pequeno hairpin," ou shRNA, é um construto depolinucleotídeo que pode ser preparado para expressar um RNA interferente como siRNA.
[0049] "Recombinante," como aplicado a um polinucleotídeo significa que o polinucleotídeo é o produto de várias combinações de etapas de clonagem, restrição ou ligação, e outros procedimentos que resultam em um construto que é distinto de um polinucleotídeo encontrado na natureza. Um vírus recombinante é uma partícula viral compreendendo um polinucleotídeo recombinante. Os termos respectivamente incluem replicatas do construto de polinucleotídeo original e progenia do construto de vírus original.
[0050] Um "elemento de controle" ou "sequência de controle" éuma sequência de nucleotídeo envolvida em uma interação de moléculas que contribuem para a regulação funcional de um polinucleotí- deo, incluindo replicação, duplicação, transcrição, processamento, tradução ou degradação do polinucleotídeo. A regulação pode afetar a frequência, velocidade ou especificidade do processo, e pode ser de melhora ou inibitória na natureza. Elementos de controle conhecidos na técnica incluem, por exemplo, sequências de regulação de transcrição, como promotores e estimuladores. Um promotor é uma região de DNA capaz em certas condições de ligar RNA polimerase e iniciando a transcrição de uma região de codificação geralmente localizada à jusante (na direção 3') do promotor.
[0051] "Operativamente ligado" ou "operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição de elementos genéticos, em que os elementos estão em uma relação que permite que os mesmos operem de um modo esperado. Por exemplo, um promotor é operativamente ligado a uma região de codificação se o promotor ajuda a iniciar a transcrição da sequência de codificação. Pode haver resíduos intervenientes entre o promotor e a região codificadora contanto que esta relação funcional seja mantida.
[0052] Um "vetor de expressão" é um vetor que compreende umaregião que codifica um polipeptídeo de interesse, e é usado para efetuar a expressão da proteína em uma célula alvo pretendida. Um vetor de expressão ainda compreende elementos de controle operativamente ligados à região de codificação para facilitar a expressão da proteína no alvo. A combinação de elementos de controle e um gene ou genes aos quais são operacionalmente ligados para a expressão é algumas vezes referenciada como um "cassete de expressão," um número grande dos quais são conhecidos e disponíveis na técnica ou podem ser prontamente construídos a partir dos componentes que estão disponíveis na técnica.
[0053] "Heterólogo" significa derivado de uma entidade genotipi-camente distinta daquela do resto da entidade à qual está sendo comparada. Por exemplo, um polinucleotídeo introduzido por técnicas de engenharia genética em um plasmídeo ou vetor derivado de uma espécie diferente é um polinucleotídeo heterólogo. Um promotor removido de sua sequência de codificação nativa e operativamente ligado a uma sequência de codificação com a qual não é naturalmente encontrado ligado é um promotor heterólogo. Assim, por exemplo, um rAAV que inclui um ácido nucleico heterólogo que codifica um produto de gene heterólogo é um rAAV que inclui um ácido nucleico não normalmente incluído em um AAV tipo selvagem de ocorrência natural e o produto de gene heterólogo codificado é um produto de gene não normalmente codificado por um AAV tipo selvagem de ocorrência natural.
[0054] Os termos "alteração genética" e "modificação genética" (evariantes gramaticais dos mesmos) são usados de modo intercambiá- vel aqui para se referir a um processo em que um elemento genético (por exemplo, um polinucleotídeo) é introduzido em uma célula de outro modo que não mitose ou meiose. O elemento pode ser um heteró- logo à célula, ou pode ser uma cópia adicional ou versão melhorada de um elemento já presente na célula. Alteração genética pode ser efetuada, por exemplo, transferindo uma célula com um plasmídeo re- combinante através de qualquer processo conhecido na técnica, como eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, ou contato com um complexo de polinucleotídeo-lipossoma. Alteração genética pode ainda ser efetuada, por exemplo, por transdução ou infecção com um vírus de DNA ou RNA ou vetor viral. Geralmente, o elemento genético é introduzido em um cromossomo ou minicromossomo na célula; mas qualquer alteração que modifica o fenótipo e/ou genótipo e sua descendência é incluída neste termo.
[0055] Uma célula é dita como sendo "estavelmente" alterada,transduzida, geneticamente modificada, ou transformada com uma sequência genética se a sequência está disponível para realizar sua função durante a cultura estendida da célula in vitro. Geralmente, dita uma célula é alterada "hereditariamente" (geneticamente modificada) em que uma alteração genética é introduzida que é ainda hereditaria- mente por descendência da célula alterada.
[0056] Os termos "polipeptídeo," "peptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável aqui para se referir aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. Os termos também incluem um polímero de aminoácido que foi modificado, por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, fosforilação, ou conjugação com um componente marcador. Polipeptídeos como polipeptídeos anti-angiogênicos, polipeptídeos neuroprotetores, e semelhantes, quando discutidos no contexto de liberação de um produto de gene à um sujeito mamífero e composições destes, referem-se ao respectivo polipeptídeo intacto, ou qualquer fragmento ou derivado geneticamente modificado destes, que retêm a função bioquímica da proteína intacta. De modo semelhante, os ácidos nucleicos que codificam polipeptí- deos anti-angiogênicos, ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos neuroprotetores, e outros ditos ácidos nucleicos para uso na liberação de um produto de gene à um sujeito mamífero (que pode ser referen-ciado como "transgenes" a serem liberados a uma célula receptora), incluem polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo intacto ou qualquer fragmento geneticamente modificado derivado que possui a função bioquímica desejada.
[0057] Um plasmídeo "isolado", ácido nucleico, vetor, vírus, vírion,célula hospedeira, ou outra substância de refere-se a uma preparação apesar de pelo menos algumas dos outros componentes que podem ainda estar presentes onde a substância ou uma substância semelhante ocorre ou é inicialmente preparado de. Assim, por exemplo, uma substância isolada pode ser preparada usando uma técnica de purificação para enriquecer esta de uma mistura fonte. O enriquecimento pode ser medido em uma base absoluta, como peso por volume de solução, ou este pode ser medido em relação à segunda, potencialmente interferente presente na mistura fonte. Enriquecimentos aumentados das modalidades desta revelação são cada vez mais isolados. Um plasmídeo isolado, ácido nucleico, vetor, vírus célula hospedeira ou outra substância está em algumas modalidades purificadas, por exemplo, de cerca de 80% a cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, pelo menos cerca de 98% puro, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais puro.
[0058] Como usado aqui, os termos "tratamento," "tratar," e semelhantes, refere-se à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico. O efeito pode ser profilático em termos de completamente ou parcialmente prevenindo uma doença ou sintoma do mesmo e/ou em termos de cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuíveis à doença. "Tratamento," como usado aqui, cobre qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em um humano inclui: (a) prevenir a doença da ocorrência em um sujeito que pode ser predisposto à doença ou em risco de adquirir a doença, mas não foi ainda diagnosticado como tendo esta; (b) inibir a doença, ou seja, interromper seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença, ou seja, causar a regressão da doença.
[0059] Os termos "indivíduo," "hospedeiro," "sujeito" e "paciente" sãousados de modo intercambiável aqui, e se refere a um mamífero, incluindo, entre outros, humanos e primatas não humanos; animais esportivos mamíferos (por exemplo, cavalos); animais de fazenda mamíferos (por exemplo, ovelhas, cabras, etc.); animais de estimação mamíferos (cães, gatos, etc.); e roedores (por exemplo, camundongos, ratos, etc.).
[0060] Antes de a presente invenção ser descrita em mais detalhes, deve ser entendido que esta invenção não é limitada às modalidades particulares descritas, que dessa forma podem, naturalmente, variar. Deve ainda ser entendido que a terminologia usada aqui tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas, e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[0061] Se um intervalo de valores é fornecido, é entendido que cada valor intermediário, para o décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto claramente indicar o contrário, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor declarado ou intermediário nesse intervalo declarado, é incluído na invenção. Os limites superiores e inferiores desses intervalos menores podem ser incluídos independentemente nos intervalos menores e também são incluídos na invenção, sujeito a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicado. Quando o intervalo declarado incluir um ou ambos os limites, os intervalos excluindo um ou ambos daqueles incluídos também estão incluídos na invenção.
[0062] Salvo se determinado de outra forma, todos os termos científicos e técnicos usados aqui têm o mesmo significado como comu- mente entendido por um especialista na técnica a que pertence esta invenção. Embora todos os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos também podem ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos preferenciais e os materiais são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui como referência para revelar e descrever os métodos e/ou materiais em relação às publicações citadas.
[0063] Deve notar-se que como usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "a/o" incluem os plurais referentes salvo se o contexto claramente indicar de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a um "vírion AAV recombinante" inclui uma pluralidade de ditos vírions e as referências à "célula fotorreceptora" inclui referência a uma ou mais células fotorreceptoras e equivalentes das mesmas conhecidas aos especialistas na técnica, e assim por diante. Deve-se notar ainda que as reivindicações serão redigidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração pretende servir como uma base antecedente para uso de dita terminologia exclusiva como "unicamente," "somente" e semelhantes em conexão com a menção de elementos reivindicados, ou uso de uma limitação "negativa".
[0064] É apreciado que determinadas características da invenção,que são, para esclarecimento, descritas no contexto das modalidades separadas, podem ainda ser fornecidas em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, várias características da invenção, que são, por questões de brevidade, descritas no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidas separadamente ou em quaisquer subcombinações apropriadas. Todas as combinações das modalidades que pertencem à invenção são especificamente incluídas pela presente invenção e são reveladas aqui justo como se cada e toda combinação fosse individualmente e explicitamente revelada. Além disso, todas as subcombinações das várias modalidades e elementos das mesmas são também especificamente incluídas pela presente invenção e são aqui reveladas justamente como se cada subcombina- ção fosse individualmente e explicitamente revelada aqui.
[0065] As publicações discutidas aqui são fornecidas unicamentepara suas revelações antes da data de depósito do pedido presente. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não tem direito a antecipar essa publicação em virtude da invenção prévia. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais que podem precisar de confirmação de forma independente.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0066] A presente divulgação fornece vírions de vírus adeno associado (AAV) com proteína de capsídeo alterada, onde os vírions AAV exibem maior infectividade de uma célula de retina, quando administrados via injeção intravítrea em comparação ao AAV tipo selvagem. A presente divulgação ainda fornece métodos para liberar um produto de gene a uma célula da retina em um indivíduo e métodos para tratar doença ocular.
[0067] A célula da retina pode ser um fotorreceptor (por exemplo,bastonetes; cones), uma célula ganglionar da retina (RGC), uma célula de Müller (uma célula da glia de Müller), uma célula bipolar, uma célula amácrima, uma célula horizontal, ou uma célula de epitélio pigmentado da retina (RPE).POLIPEPTÍDEOS DE CAPSÍDEOS AAV VARIANTES
[0068] A presente divulgação fornece uma proteína de capsídeoAAV variante, onde a proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos em um sítio de inserção na alça GH da proteína do capsídeo ou alça IV, em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente, e onde a proteína do capsídeo variante, quando presente em um vírion AAV, confere infectividade aumentada de uma célula de retina em comparação à infectividade da célula de retina por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente. Em alguns casos, a célula de retina é uma célula fotorreceptora (por exemplo, bas- tonetes; cones). Em outros casos, a célula de retina é uma RGC. Em outros casos, a célula de retina é uma célula RPE. Em outros casos, a célula de retina é uma célula Müller. Outras células de retina incluem células amácrimas, células bipolares, e células horizontais. Uma "inserção de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos" é ainda referenciado aqui como uma "inserção de peptídeo" (por exemplo, uma inserção de peptídeo heterólogo). Uma "proteína de capsídeo AAV parental correspondente" refere-se a uma proteína de capsídeo AAV do mesmo sorotipo AAV, sem a inserção do peptídeo.
[0069] O sítio de inserção está na alça GH, ou alça IV, da proteínade capsídeo AAV, por exemplo, em uma porção acessível ao solvente da alça GH, ou alça IV, da proteína de capsídeo AAV. Para a alça GH /alça IV de capsídeo AAV, ver, por exemplo, van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047; e Shen et al. (2007) Mol. Ther. 15: 1955. Por exemplo, o sítio de inserção pode estar dentro dos aminoácidos 411-650 de uma proteína de capsídeo AAV, como descrito nas Figuras 17A e 17B. Por exemplo, o sítio de inserção pode estar dentro dos aminoácidos 570-611 de AAV2, nos aminoácidos 571-612 de AAV1, nos aminoácidos 560-601 de AAV5, nos aminoácidos 571 a 612 de AAV6, nos aminoácidos 572 a 613 de AAV7, nos aminoácidos 573 a 614 de AAV8, nos aminoácidos 571 a 612 de AAV9, ou nos aminoácidos 573 a 614 de AAV10, como descrito na Figura 6.
[0070] Em alguns casos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11aminoácidos são inseridos em um sítio de inserção na alça GH ou alça IV da proteína do capsídeo em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente. Por exemplo, o sítio de inserção pode ser entre aminoácidos 587 e 588 de AAV2, ou as posições correspondentes da subunidade do capsídeo de outro sorotipo AAV. Deve ser notado que o sítio de inserção 587/588 é baseado em uma proteína de capsídeo AAV2. De cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoáci- dos podem ser inseridos em um sítio correspondente em um sorotipo AAV além de AAV2 (por exemplo, AAV8, AAV9, etc.). Os especialistas na técnica saberiam, baseado em uma comparação das sequências de aminoácidos de proteínas de capsídeos de vários sorotipos AAV, onde um sítio de inserção "correspondente aos aminoácidos 587-588 de AAV2" poderia estar em uma proteína de capsídeo de qualquer so- rotipo AAV fornecido. As sequências correspondentes aos aminoáci- dos 570-611 de proteína de capsídeo VP1 de AAV2 (ver Figura 5) em vários sorotipos AAV são mostradas na Figura 6. Ver, por exemplo, GenBank N.° de acessão NP_049542 par AAV1; GenBank N.° de acessão AAD13756 para AAV5; GenBank N.° de acessão AAB95459 para AAV6; GenBank N.° de acessão YP_077178 para AAV7; GenBank N.° de acessão YP_077180 para AAV8; GenBank N.° de acessão AAS99264 para AAV9 e GenBank N.° de acessão AAT46337 para AAV10.
[0071] Em algumas modalidades, o sítio de inserção é um sítio deinserção único entre dois aminoácidos adjacentes localizados entre aminoácidos 570-614 de VP1 de qualquer sorotipo AAV, por exemplo, o sítio de inserção está entre dois aminoácidos adjacentes localizados nos aminoácidos 570-610, aminoácidos 580-600, aminoácidos 570575, aminoácidos 575-580, aminoácidos 580-585, aminoácidos 585590, aminoácidos 590-600, ou aminoácidos 600-614, de VP1 de qualquer sorotipo AAV ou variante. Por exemplo, o sítio de inserção pode estar entre aminoácidos 580 e 581, aminoácidos 581 e 582, aminoáci- dos 583 e 584, aminoácidos 584 e 585, aminoácidos 585 e 586, ami- noácidos 586 e 587, aminoácidos 587 e 588, aminoácidos 588 e 589, ou aminoácidos 589 e 590. O sítio de inserção pode estar entre ami- noácidos 575 e 576, aminoácidos 576 e 577, aminoácidos 577 e 578, aminoácidos 578 e 579, ou aminoácidos 579 e 580. O sítio de inserção pode estar entre aminoácidos 590 e 591, aminoácidos 591 e 592, ami- noácidos 592 e 593, aminoácidos 593 e 594, aminoácidos 594 e 595, aminoácidos 595 e 596, aminoácidos 596 e 597, aminoácidos 597 e 598, aminoácidos 598 e 599, ou aminoácidos 599 e 600.
[0072] Por exemplo, o sítio de inserção pode estar entre aminoáci-dos 587 e 588 de AAV2, entre aminoácidos 590 e 591 de AAV1, entre aminoácidos 575 e 576 de AAV5, entre aminoácidos 590 e 591 de AAV6, entre aminoácidos 589 e 590 de AAV7, entre aminoácidos 590 e 591 de AAV8, entre aminoácidos 588 e 589 de AAV9, ou entre ami- noácidos 588 e 589 de AAV10.
[0073] Como outro exemplo, o sítio de inserção pode estar entreaminoácidos 450 e 460 de uma proteína de capsídeo de AAV, como mostrado na Figura 17A. Por exemplo, o sítio de inserção pode estar no (por exemplo, imediatamente N-terminal ao) aminoácido 453 de AAV2, no aminoácido 454 de AAV1, no aminoácido 454 de AAV6, no aminoácido 456 de AAV7, no aminoácido 456 de AAV8, no aminoácido 454 de AAV9, ou no aminoácido 456 de AAV10, como mostrado na Figura 17A.
[0074] Em algumas modalidades, uma proteína de capsídeo objetoinclui uma alça GH compreendendo uma sequência de aminoácido contendo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100%, identidade de sequência de aminoácido a uma sequência de aminoácido estabelecida na Figura 18A-C.
Peptídeos de inserção
[0075] Como notado acima, um peptídeo de cerca de 5 aminoáci-dos a cerca de 11 aminoácidos em comprimento é inserido na alça GH de um capsídeo AAV. O peptídeo de inserção tem um comprimento de 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9 ami- noácidos, 10 aminoácidos, ou 11 aminoácidos.
[0076] O peptídeo de inserção pode compreender uma sequênciade aminoácido de qualquer uma das fórmulas estabelecidas abaixo.
[0077] Por exemplo, um peptídeo de inserção pode ser um peptí- deo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula I:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0078] onde:
[0079] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr;
[0080] X1; se presente, é selecionado de Leu, Asn, e Lys;
[0081] X2 é selecionado de Gly, Glu, Ala, e Asp;
[0082] X3 é selecionado de Glu, Thr, Gly, e Pro;
[0083] X4 é selecionado de Thr, He, Gln, e Lys;
[0084] X5 é selecionado de Thr e Ala;
[0085] X6 é selecionado de Arg, Asn, e Thr;
[0086] X7, se presente, é selecionado de Pro e Asn.
[0087] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser umpeptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula IIa:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0088] onde:
[0089] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr; cada um de X1-X4 é qualquer aminoácido;
[0090] X5 é Thr;
[0091] X6 é Arg; e
[0092] X7 é Pro.
[0093] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser umpeptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula IIb:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0094] onde:
[0095] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente sele- cionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr;
[0096] X1; se presente, é selecionado de Leu e Asn;
[0097] X2, se presente, é selecionado de Gly e Glu;
[0098] X3 é selecionado de Glu e Thr;
[0099] X4 é selecionado de Thr e Ile;
[00100] X5 é Thr;
[00101] X6 é Arg; e
[00102] X7 é Pro.
[00103] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula III:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00104] onde:
[00105] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr;
[00106] X1; se presente, é Lys;
[00107] X2 é selecionado de Ala e Asp;
[00108] X3 é selecionado de Gly e Pro;
[00109] X4 é selecionado de Gln e Lys;
[00110] X5 é selecionado de Thr e Ala;
[00111] X6 é selecionado de Asn e Thr;
[00112] X7, se presente, é Asn.
[00113] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula IV:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00114] onde:
[00115] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr;
[00116] X1; se presente, é um aminoácido positivamente carregado; ou é selecionado de Leu, Asn, Arg, Ala, Ser, e Lys;
[00117] X2 é um aminoácido negativamente carregado ou um ami-noácido não carregado; ou é selecionado de Gly, Glu, Ala, Val, Thr, e Asp;
[00118] X3 é um aminoácido negativamente carregado ou um ami-noácido não carregado; ou é selecionado de Glu, Thr, Gly, Asp, ou Pro;
[00119] X4 é selecionado de Thr, Le, Gly, Lys, Asp, e Gln;
[00120] X5 é um aminoácido polar, um álcool (um aminoácido contendo um grupo hidroxil livre), ou um aminoácido hidrofóbico; ou é selecionado de Thr, Ser, Val, e Ala;
[00121] X6 é um aminoácido positivamente carregado ou um ami-noácido não carregado; ou é selecionado de Arg, Val, Lys, Pro, Thr, e Asn; e
[00122] X7, se presente, é um aminoácido positivamente carregadoou um aminoácido não carregado; ou é selecionado de Pro, Gly, Phe, Asn, e Arg.
[00123] Como exemplos não limitantes, o peptídeo de inserção pode compreender uma sequência de aminoácido selecionada de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), e STGKVPN (SEQ ID NO:60).
[00124] Em alguns casos, o peptídeo de inserção tem de 1 a 4 ami- noácidos espaçadores (Y1——Y4) na terminação de amino e/ou na terminação carboxil de qualquer um de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NE- TITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), e STGKVPN (SEQ ID NO:60).
[00125] Aminoácidos espaçadores apropriados incluem, entre ou- tros, leucina, alanina, glicina e serina.
[00126] Por exemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserçãotem uma das seguintes sequências de aminoácidos:
[00127] LALGETTRPA (SEQ ID NO:45); LANETITRPA (SEQ IDNO:46), LAKAGQANNA (SEQ ID NO:47), LAKDPKTTNA (SEQ ID NO:48), LAKDTDTTRA (SEQ ID NO:61), LARAGGSVGA (SEQ ID NO:62), LAAVDTTKFA (SEQ ID NO:63), e LASTGKVPNA (SEQ ID NO:64).
[00128] Como outro exemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserção tem uma das seguintes sequências de aminoácidos: AAL- GETTRPA (SEQ ID NO:49); AANETITRPA (SEQ ID NO:50), AA- KAGQANNA (SEQ ID NO:51), e AAKDPKTTNA (SEQ ID NO:52). Como ainda outro exemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserção tem uma das seguintes sequências de aminoácidos: GLGETTRPA (SEQ ID NO:53); GNETITRPA (SEQ ID NO:54), GKAGQANNA (SEQ ID NO:55), e GKDPKTTNA (SEQ ID NO:56). Como outro exemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserção compreende um de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), e STGKVPN (SEQ ID NO:60), flanqueado no C-terminal em AA e em N-terminal em A; ou compreende um de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), e STGKVPN (SEQ ID NO:60) flanqueado no C-terminal por G e em N- terminal por A.
[00129] Em algumas modalidades, um capsídeo variante AAV objeto não inclui qualquer outra substituição de aminoácidos, inserção, ou deleções, além da inserção de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos na alça GH ou alça IV em relação a uma proteína de capsídeo AAV parental correspondente. Em outras modalidades, um capsídeo AAV variante objeto inclui de 1 a cerca de 25 inserções de aminoácidos, deleções ou substituições, em comparação à proteína de capsídeo AAV parental, além de uma inserção de cerca de 5 aminoá- cidos a cerca de 11 aminoácidos na alça GH ou alça IV em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente. Por exemplo, em algumas modalidades, um capsídeo AAV variante objeto includes de 1 a cerca de 5, de cerca de 5 a cerca de 10, de cerca de 10 a cerca de 15, de cerca de 15 a cerca de 20, ou de cerca de 20 a cerca de 25 inserções de aminoácidos, deleções, ou substituições, em comparação à proteína de capsídeo de AAV parental, além de uma inserção de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos na alça GH ou alça IV em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00130] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de capsídeo variante objeto não inclui uma, duas, três ou quatro das seguintes substituições de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F e Y730F.
[00131] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de capsídeo variante objeto compreende, além de um peptídeo de inserção como descrito acima, uma, duas, três ou quatro, das seguintes substituições de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F e Y730F.
[00132] Em algumas modalidades, um polipeptídeo capsídeo variante AAV é um capsídeo quimérico, por exemplo, o capsídeo compreende uma parte de um capsídeo AAV de um primeiro sorotipo AAV e uma parte de um capsídeo AAV de um segundo sorotipo; e compreende uma inserção de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoáci- dos na alça GH ou alça IV em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00133] Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo variante objeto compreende uma sequência de aminoácido contendo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, identidade de sequência de aminoácido à sequência de aminoácido fornecida na Figura 5; e uma inserção de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos na alça GH ou alça IV em relação à proteína de cap- sídeo AAV parental correspondente.
[00134] Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo variante objeto é isolada, por exemplo, purificada. Em alguns casos, uma proteína do capsídeo variante objeto está incluída em um vetor AAV, que é ainda fornecido. Como descrito em detalhes abaixo, uma proteína do capsídeo variante objeto pode ser incluída em um vírion AAV recombinante.
VÍRION AAV RECOMBINANTE
[00135] A presente revelação fornece um vírion de vírus adeno associado (rAAV) compreendendo: a) uma proteína de capsídeo AAV variante, onde a proteína de capsídeo AAV variante compreende uma inserção de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos em um sítio de inserção na alça GH da proteína do capsídeo ou alça IV, em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente, e onde a proteína do capsídeo variante confere infectividade aumentada de uma célula de retina comparado à infectividade da célula de retina por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente; e b) um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto do gene. Em alguns casos, a célula de retina é uma célula fotorreceptora (por exemplo, bastonetes e/ou cones). Em outros casos, a célula de retina é uma célula RGC. Em outros casos, a célula de retina é uma célula RPE. Em outros casos, a célula de retina é uma célula de Müller. Em outros casos, as células retinais podem incluir células amácrimas, células bipolares e células horizontais. Uma "inserção de cerca de 5 ami- noácidos a cerca de 11 aminoácidos" é ainda referenciada aqui como uma "inserção de peptídeo" (por exemplo, uma inserção de peptídeo heterólogo). Uma "proteína de capsídeo AAV parental correspondente" refere-se a uma proteína de capsídeo AAV do mesmo sorotipo AAV, sem a inserção de peptídeo.
[00136] O sítio de inserção está na alça GH, ou alça IV, da proteína de capsídeo AAV, por exemplo, em uma porção acessível ao solvente da alça GH, ou alça IV, da proteína de capsídeo AAV. Para a alça GH, ver, por exemplo, van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047; e Shen et al. (2007) Mol. Ther. 15: 1955. Por exemplo, o sítio de inserção está nos aminoácidos 570-611 de AAV2, nos aminoácidos 571-612 de AAV1, nos aminoácidos 560-601 de AAV5, nos aminoácidos 571 a 612 de AAV6, nos aminoácidos 572 a 613 de AAV7, nos aminoácidos 573 a 614 de AAV8, nos aminoáci- dos 571 a 612 de AAV9, ou nos aminoácidos 573 a 614 de AAV10.
[00137] De cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos são inseridos em um sítio de inserção na alça GH ou alça IV da proteína do capsídeo em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente. Por exemplo, o sítio de inserção pode estar entre aminoácidos 587 e 588 de AAV2, ou as posições correspondentes da subunidade de capsídeo de outro sorotipo AAV. Deve ser notado que o sítio de inserção 587/588 é baseado em uma proteína de capsídeo AAV2. De cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos podem ser inseridos em um sítio correspondente em um sorotipo AAV além de AAV2 (por exemplo, AAV8, AAV9, etc.). Os especialistas na técnica saberiam, baseado em uma comparação das sequências de aminoácidos de proteínas de capsídeos de vários sorotipos AAVs, onde um sítio de inserção "correspondente aos aminoácidos 587-588 de AAV2" poderia estar em uma proteína de cap- sídeo de qualquer sorotipo AAV fornecido. As sequências correspondentes aos aminoácidos 570-611 de proteína de capsídeo VP1 de AAV2 (ver Figura 5) em vários sorotipos AAVs são mostrados na Figura 6.
[00138] Em algumas modalidades, o sítio de inserção é um sítio de inserção único entre dois aminoácidos adjacentes localizados entre aminoácidos 570-614 de VP1 de qualquer sorotipo AAV, por exemplo, o sítio de inserção está entre dois aminoácidos adjacentes localizados nos aminoácidos 570-614, aminoácidos 580-600, aminoácidos 570575, aminoácidos 575-580, aminoácidos 580-585, aminoácidos 585590, aminoácidos 590-600, ou aminoácidos 600-610, de VP1 de qualquer sorotipo AAV ou variante. Por exemplo, o sítio de inserção pode estar entre aminoácidos 580 e 581, aminoácidos 581 e 582, aminoáci- dos 583 e 584, aminoácidos 584 e 585, aminoácidos 585 e 586, ami- noácidos 586 e 587, aminoácidos 587 e 588, aminoácidos 588 e 589, ou aminoácidos 589 e 590. O sítio de inserção pode estar entre ami- noácidos 575 e 576, aminoácidos 576 e 577, aminoácidos 577 e 578, aminoácidos 578 e 579, ou aminoácidos 579 e 580. O sítio de inserção pode estar entre aminoácidos 590 e 591, aminoácidos 591 e 592, ami- noácidos 592 e 593, aminoácidos 593 e 594, aminoácidos 594 e 595, aminoácidos 595 e 596, aminoácidos 596 e 597, aminoácidos 597 e 598, aminoácidos 598 e 599, ou aminoácidos 599 e 600.
[00139] Por exemplo, o sítio de inserção pode estar entre aminoáci- dos 587 e 588 de AAV2, entre aminoácidos 590 e 591 de AAV1, entre aminoácidos 575 e 576 de AAV5, entre aminoácidos 590 e 591 de AAV6, entre aminoácidos 589 e 590 de AAV7, entre aminoácidos 590 e 591 de AAV8, entre aminoácidos 588 e 589 de AAV9, ou entre ami- noácidos 589 e 590 de AAV10.
Peptídeos de inserção
[00140] Como notado acima, um vírion rAAV objeto compreende um peptídeo de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos em comprimento inserido na alça GH do capsídeo AAV. O peptídeo de inserção tem um comprimento de 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9 aminoácidos, 10 aminoácidos, ou 11 aminoácidos.
[00141] O peptídeo de inserção pode compreender uma sequência de aminoácido de qualquer uma das fórmulas estabelecidas abaixo.
[00142] Por exemplo, um peptídeo de inserção pode ser um peptí- deo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula I:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00143] onde:
[00144] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr;
[00145] X1; se presente, é selecionado de Leu, Asn, e Lys;
[00146] X2 é selecionado de Gly, Glu, Ala, e Asp;
[00147] X3 é selecionado de Glu, Thr, Gly, e Pro;
[00148] X4 é selecionado de Thr, He, Gln, e Lys;
[00149] X5 é selecionado de Thr e Ala;
[00150] X6 é selecionado de Arg, Asn, e Thr;
[00151] X7, se presente, é selecionado de Pro e Asn.
[00152] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser umpeptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula IIa:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00153] onde:
[00154] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr; cada um de X1-X4 é qualquer aminoácido;
[00155] X5 é Thr;
[00156] X6 é Arg; e
[00157] X7 é Pro.
[00158] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula IIb:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00159] onde:
[00160] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr;
[00161] X1, se presente, é selecionado de Leu e Asn;
[00162] X2, se presente, é selecionado de Gly e Glu;
[00163] X3 é selecionado de Glu e Thr;
[00164] X4 é selecionado de Thr eLe;
[00165] X5 é Thr;
[00166] X6 é Arg; e
[00167] X7 é Pro.
[00168] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula III:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00169] onde:
[00170] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr;
[00171] X1; se presente, é Lys;
[00172] X2 é selecionado de Ala e Asp;
[00173] X3 é selecionado de Gly e Pro;
[00174] X4 é selecionado de Gln e Lys;
[00175] X5 é selecionado de Thr e Ala;
[00176] X6 é selecionado de Asn e Thr;
[00177] X7, se presente, é Asn.
[00178] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula IV:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00179] onde:
[00180] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr;
[00181] X1; se presente, é um aminoácido positivamente carregadoou um aminoácido não carregado; ou é selecionado de Leu, Asn, Arg, Ala, Ser, e Lys;
[00182] X2 é um aminoácido negativamente carregado ou um ami-noácido não carregado; ou é selecionado de Gly, Glu, Ala, Val, Thr, e Asp;
[00183] X3 é um aminoácido negativamente carregado ou um ami-noácido não carregado; ou é selecionado de Glu, Thr, Gly, Asp, ou Pro;
[00184] X4 é selecionado de Thr, Le, Gly, Lys, Asp, e Gln;
[00185] X5 é um aminoácido polar, um álcool (um aminoácido contendo um grupo hidroxil livre), ou um aminoácido hidrofóbico; ou é selecionado de Thr, Ser, Val, e Ala;
[00186] X6 é um aminoácido positivamente carregado ou um ami-noácido não carregado; ou é selecionado de Arg, Val, Lys, Pro, Thr, e Asn; e
[00187] X7, se presente, é um aminoácido positivamente carregadoou um aminoácido não carregado; ou é selecionado de Pro, Gly, Phe, Asn, e Arg.
[00188] Como exemplos não limitantes, o peptídeo de inserção pode compreender uma sequência de aminoácido selecionada de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), e STGKVPN (SEQ ID NO:60).
[00189] Em alguns casos, o peptídeo de inserção tem de 1 a 4 ami- noácidos espaçadores (Y1-Y4) em amino terminal e/ou em carboxil terminal de qualquer um de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), e STGKVPN (SEQ ID NO:60).
[00190] Aminoácidos espaçadores apropriados incluem, entre outros, leucina, alanina, glicina e serina.
[00191] Por exemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserçãotem uma das seguintes sequências de aminoácidos:
[00192] LALGETTRPA (SEQ ID NO:45); LANETITRPA (SEQ IDNO:46), LAKAGQANNA (SEQ ID NO:47), LAKDPKTTNA (SEQ ID NO:48), LAKDTDTTRA (SEQ ID NO:61), LARAGGSVGA (SEQ ID NO:62), LAAVDTTKFA (SEQ ID NO:63), e LASTGKVPNA (SEQ ID NO:64).
[00193] Como outro exemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserção tem uma das seguintes sequências de aminoácidos: AAL- GETTRPA (SEQ ID NO:49); AANETITRPA (SEQ ID NO:50), AA- KAGQANNA (SEQ ID NO:51), e AAKDPKTTNA (SEQ ID NO:52). Como ainda outro exemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserção tem uma das seguintes sequências de aminoácidos: GLGETTRPA (SEQ ID NO:53); GNETITRPA (SEQ ID NO:54), GKAGQANNA (SEQ ID NO:55), e GKDPKTTNA (SEQ ID NO:56). Como outro exemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserção compreende um de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), e STGKVPN (SEQ ID NO:60), flanqueado em C-terminal por AA e em N-terminal por A; ou compreende um de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), e STGKVPN (SEQ ID NO:60) flanqueado na C-terminal por G e em N- terminal por A.
[00194] Em algumas modalidades, um capsídeo de vírion rAAV objeto não inclui qualquer outra substituição de aminoácido, inserções ou deleções, além de uma inserção de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos na alça GH ou alça IV em relação à proteína de cap- sídeo AAV parental correspondente. Em outras modalidades, um cap- sídeo de vírion rAAV objeto inclui de 1 a cerca de 25 inserções de aminoácidos, deleções, ou substituições, comparado à proteína de capsídeo de AAV parental, além de uma inserção de cerca de 7 ami- noácidos a cerca de 10 aminoácidos na alça GH ou alça IV em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente. Por exemplo, em algumas modalidades, um capsídeo de vírion rAAV objeto inclui de 1 a cerca de 5, de cerca de 5 a cerca de 10, de cerca de 10 a cerca de 15, de cerca de 15 a cerca de 20, ou de cerca de 20 a cerca de 25 inserções de aminoácidos, deleções, ou substituições, comparado à proteína de capsídeo de AAV parental, além de uma inserção de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos na alça GH ou alça IV em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00195] Em algumas modalidades, um capsídeo de vírion rAAV objeto não inclui uma, duas, três ou quatro, das seguintes substituições de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F, e Y730F.
[00196] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de capsídeo variante objeto compreende, além de um peptídeo de inserção como descrito acima, uma, duas, três ou quatro, das seguintes substituições de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F, e Y730F.
[00197] Em algumas modalidades, um capsídeo de vírion rAAV objeto é um capsídeo quimérico, por exemplo, o capsídeo compreende uma parte de um capsídeo AAV de um primeiro sorotipo AAV e uma parte de um capsídeo AAV de um segundo sorotipo; e compreende uma inserção de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos na alça GH ou alça IV em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00198] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto compreende uma proteína de capsídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contendo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, identidade de sequência de aminoácido à sequência de aminoácido fornecida na Figura 5; e uma inserção de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos na alça GH ou alça IV em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00199] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto compreende uma proteína de capsídeo que inclui uma alça GH compreendendo uma sequência de aminoácido contendo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100%, identidade de sequência de aminoácido a uma sequência de aminoácido estabelecida na Figura 18A-C.
[00200] Um vírion rAAV objeto exibe pelo menos 10 vezes, pelomenos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, infectividade aumentada de uma célula de retina, comparada à infectividade de célula de retina por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00201] Em alguns casos, um vírion rAAV objeto exibe pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, infectividade aumentada de uma célula de retina, quando administrado via injeção intravítrea, comprado à infectividade da célula de retina por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente, quando administrado via injeção intravítrea.
[00202] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, infectivi- dade aumentada de uma célula fotorreceptora (bastonete ou cone), comparado à infectividade da célula fotorreceptora por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00203] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula fotorreceptora (bastonete ou cone), quando administrado via injeção intravítrea, comparada à infecti- vidade da célula fotorreceptora por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente, quando administrado via injeção intravítrea.
[00204] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma RGC, comparada à infectividade de RGC por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00205] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma RGC, quando administrado via injeção intravítrea, comparada à infectividade da RGC por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente, quando administrado via injeção intravítrea.
[00206] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula RPE, comparada à infectividade da célula RPE por um vírion AAV compreendendo a proteína de cap- sídeo AAV parental correspondente.
[00207] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula RPE, quando administrado via injeção intravítrea, comparada à infectividade da célula RPE por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente, quando administrado via injeção intravítrea.
[00208] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelomenos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula Müller, comparada à infectivida- de da célula Müller por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00209] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelomenos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula Müller, quando administrado via injeção intravítrea, comparada à infectividade da célula Müller por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente, quando administrado via injeção intravítrea.
[00210] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelomenos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula bipolar, comparada à infectivida- de da célula bipolar por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00211] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelomenos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula bipolar, quando administrado via injeção intravítrea, comparada à infectividade da célula bipolar por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente, quando administrado via injeção intravítrea.
[00212] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelomenos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula amácrima, comparada à infecti- vidade da célula amácrima por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00213] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelomenos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula amácrima, quando administrado via injeção intravítrea, comparada à infectividade da célula amácrima por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente, quando administrado via injeção intravítrea.
[00214] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelomenos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula horizontal, comparada à infecti- vidade da célula horizontal por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente.
[00215] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelomenos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula horizontal, quando administrado via injeção intravítrea, comparada à infectividade da célula horizontal por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente, quando administrado via injeção intravítrea.
[00216] Em alguns casos, um vírion rAAV objeto exibe pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, capacidade aumentada em atravessar a membrana limitante interna (ILM), compa- rada à capacidade de um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente para atravessar a ILM.
[00217] Em alguns casos, um vírion rAAV objeto exibe pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, capacidade aumentada, quando administrado via injeção intravítrea, em atravessar a membrana limitante interna (ILM), comparado à capacidade de um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente em atravessar a ILM quando administrado via injeção in- travítrea.
[00218] Um vírion rAAV objeto pode atravessar a ILM, e pode ainda atravessar as camadas de célula, incluindo células de Müller, células amácrimas, etc., em atingir as células fotorreceptoras e ou células RPE. Por exemplo, um vírion rAAV objeto, quando administrado via injeção intravítrea, pode atravessar a ILM, e pode ainda passar pelas camadas da célula, incluindo células de Müller, células amácrimas, etc., para atingir as células fotorreceptoras e ou células RPE.
[00219] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto seletivamente infecta uma célula de retina, por exemplo, um vírion rAAV objeto infecta uma célula de retina com 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, especificidade do que uma célula não retina, por exemplo, uma célula fora do olho. Por exemplo, em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto seletivamente infecta uma célula de retina, por exemplo, um vírion rAAV objeto infecta uma célula fotorreceptora com 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, especificidade do que uma célula não retina, por exemplo, uma célula fora do olho.
[00220] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto seletivamente infecta uma célula fotorreceptora, por exemplo, um vírion rAAV objeto infecta uma célula fotorreceptora com 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, especificidade do que uma célula não fotorreceptora presente no olho, por exemplo, uma célula de gânglio de retina, uma célula de Müller, etc.
[00221] Em algumas modalidades, um vírion rAAV objeto exibe pelomenos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mais do que 50 vezes, in- fectividade aumentada de uma célula fotorreceptora, quando administrado via injeção intravítrea, comparada à infectividade da célula fotor- receptora por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente, quando administrado via injeção intraví- trea.
Produtos de gene
[00222] Um vírion rAAV objeto compreende um ácido nucleico hete- rólogo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto do gene. Em algumas modalidades, o produto de gene é um RNA interferente. Em algumas modalidades, o produto de gene é um aptâmero. Em algumas modalidades, o produto de gene é um polipep- tídeo. Em algumas modalidades, o produto de gene é uma nucleasse específica por sítio que fornece knock-down específico para sítio da função de gene.RNA interferente
[00223] Onde o produto de gene é um RNA interferente (RNAi), RNAi apropriado inclui RNAi que reduz o nível de um fator apoptótico ou angiogênico em uma célula. Por exemplo, um RNAi pode ser um shRNA ou siRNA que reduz o nível de um produto de gene que induz ou promove apoptose em uma célula. Genes cujos produtos de gene induzem ou promove a apoptose são referenciados aqui como "genes pró-apoptóticos" e os produtos destes genes (mRNA; proteína) são referenciados como "produtos de gene pró- apoptóticos." Produtos de gene pró-apoptótico incluem, por exemplo, produtos de gene Bax, Bid, Bak, e Bad. Ver, por exemplo, patente US 7.846.730.
[00224] RNAs interferentes poderiam ainda ser contra um produto angiogênico, por exemplo VEGF (por exemplo, Cand5; ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. N.° 2011/0143400; Publicação de Patente US 2008/0188437; e Reich et al. (2003) Mol. Vis. 9:210),VEGFR1 (por exemplo, Sirna-027; ver, por exemplo, Kaiser et al. (2010) Am. J. Ophthalmol. 150:33; e Shen et al. (2006) Gene Ther. 13:225), ou VEGFR2 (Kou et al. (2005) Biochem. 44: 15064). Ver ainda, patentes US 6.649.596, 6.399.586, 5.661.135, 5.639.872, e5.639.736; e patentes US 7.947.659 e 7.919.473.
Aptâmeros
[00225] Onde o produto de gene é um aptâmero, aptâmeros exemplares de interesse incluem um aptâmero contra fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Ver, por exemplo, Ng et al. (2006) Nat. Rev. Drug Discovery 5: 123; e Lee et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 18902. Por exemplo, um aptâmero VEGF pode compreender a sequência de nucleotídeo 5'-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3' (SEQ ID NO: 17). Ainda apropriado para uso é um aptâmero específico para PDGF, por exemplo, E10030; ver, por exemplo, Ni and Hui (2009) Ophthalmologica 223:401; e Akiyama et al. (2006) J. Cell Physiol. 207:407).
Polipeptídeos
[00226] Onde o produto de gene é um polipeptídeo, o polipeptídeo é geralmente um polipeptídeo que melhora a função de uma célula de retina, por exemplo, a função de uma célula fotorreceptora bastonete ou cone, uma célula ganglionar da retina, uma célula de Müller, uma célula bipolar, uma célula amácrima, uma célula horizontal, ou uma célula epitelial pigmentada. Polipeptídeos exemplares incluem polipep- tídeos neuroprotetores (por exemplo, GDNF, CNTF, NT4, NGF, e NTN); polipeptídeos antiangiogênicos (por exemplo, um receptor de fator de crescimento endotelial vascular solúvel (VEGF); um anticorpo de ligação à VEGF; um fragmento de ligação à VEGF (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF de cadeia simples); endostatina; tumstatina; angiostatina; um polipeptídeo Flt solúvel (Lai et al. (2005) Mol. Ther. 12:659); uma proteína de fusão Fc compreendendo um polipeptídeo Flt solúvel (ver, por exemplo, Pechan et al. (2009) Gene Ther. 16: 10); fator derivado de epitélio pigmentar (PEDF); um receptor de Tie-2 solúvel; etc.); inibidor tecidual de metaloproteinases-3 (TIMP-3); uma op- sina responsiva à luz, por exemplo, uma rodopsina; polipeptídeos anti- apoptóticos (por exemplo, Bcl-2, Bcl-Xl); e semelhantes. Polipeptídeos apropriados incluem, entre outros, fator neurotrófico derivado de glia (GDNF); fator de crescimento de fibroblasto 2; neurturina (NTN); fator neurotrófico ciliar (CNTF); fator de crescimento de nervo (NGF); neuro- trofina-4 (NT4); fator neurotrófico derivado de cérebro (BDNF; por exemplo, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoá- cido contendo pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100%, identidade de sequência de aminoácido à um trecho contíguo de cerca de 200 aminoácidos a 247 aminoácidos da sequência de aminoácido descrito na Figura 11 (SEQ ID NO: 11)); fator de crescimento epidérmico; rodopsina; inibidor ligado a X de apoptose; e Sonic hedgehog.
[00227] Opsinas responsivas à luz apropriadas incluem, por exemplo, uma opsina responsiva à luz como descrito na Publicação de Patente US 2007/0261127 (por exemplo, ChR2; Chop2); Publicação de Patente US 2001/0086421; Publicação de Patente US 2010/0015095; e Diester et al. (2011) Nat. Neurosci. 14:387.
[00228] Polipeptídeos apropriados incluem retinosquisina (por exemplo, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoá- cido contendo pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100%, iden- tidade de sequência de aminoácido à um trecho contíguo de cerca de 200 aminoácidos a 224 aminoácidos da sequência de aminoácido descrito na Figura 10 (SEQ ID NO: 10). Polipeptídeos apropriados incluem, por exemplo, proteína 1 de interação com GTPase de retinite pigmentosa (RGPR) (ver, por exemplo, GenBank Nos. de acessão Q96KN7, Q9EPQ2, e Q9GLM3) (por exemplo, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contendo pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100%, identidade de sequência de aminoáci- do à um trecho contíguo de cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, ou de cerca de 1200 aminoácidos a 1286 aminoá- cidos, da sequência de aminoácido descrito na Figura 16 (SEQ ID NO:21); periferina-2 (Prph2) (ver, por exemplo, GenBank N.° de acessão NP_000313 (por exemplo, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contendo pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100%, identidade de sequência de aminoácido à um trecho contíguo de cerca de 300 aminoácidos a 346 aminoácidos da sequência de aminoácido descrito na Figura 14 (SEQ ID NO: 19); e Travis et al. (1991) Genomics 10:733); periferina (por exemplo, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contendo pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100%, identidade de sequência de ami- noácido à um trecho contíguo de cerca de 400 aminoácidos a cerca de 470 aminoácidos da sequência de aminoácido descrito na Figura 15 (SEQ ID NO:20); uma proteína específica de epitélio de pigmento de retina (RPE65), (por exemplo, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contendo pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100%, identidade de sequência de aminoácido à um trecho contíguo de cerca de 200 aminoácidos a 247 aminoácidos da sequência de aminoácido descrito na Figura 12 (SEQ ID NO: 12)) (ver, por exemplo, GenBank AAC39660; e Morimura et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3088); e semelhantes.
[00229] Polipeptídeos apropriados ainda incluem: CHM (coroider- mia (proteína Rab escort 1)), um polipeptídeo que, quando defeituosa ou faltante, causa coroideremia (ver, por exemplo, Donnelly et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3: 1017; e van Bokhoven et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3: 1041); e homólogo de Crumbs 1 (CRB1), um polipeptí- deo que, quando defeituoso ou faltante, causa amaurose congênita de Leber e retinite pigmentosa (ver, por exemplo, den Hollander et al. (1999) Nat. Genet. 23:217; e GenBank N.° de acessão CAM23328).
[00230] Polipeptídeos apropriados ainda incluem polipeptídeos que, quando defeituoso ou faltante, leva à acromotopsia, onde ditos poli- peptídeos incluem, por exemplo, subunidade alfa de canal disparado por cGMP de cone fotorreceptor (CNGA3) (ver, por exemplo, GenBank N.° de acessão NP_001289; e Booij et al. (2011) Ophthalmology 118: 160-167); subunidade beta de canal de cátion disparado por cGMP de cone fotorreceptor (CNGB3) (ver, por exemplo, Kohl et al.(2005) Eur J Hum Genet. 13(3):302); proteína de ligação ao nucleotídeo guanina (proteína G), polipeptídeo 2 de atividade transdutora alfa (GNAT2) (ACHM4); e ACHM5; e polipeptídeos que, quando defeituosos ou fal- tantes, levam às várias formas de cegueira de cor (por exemplo, L- opsina, M-opsina, e S-opsina). Ver Mancuso et al. (2009) Nature 461(7265):784-787.Endonucleases específicas de sítio
[00231] Em alguns casos, um produto de gene de interesse é uma endonuclease específica de sítio que fornece knock-down específico de função de gene, por exemplo, onde a endonuclease nocauteia um alelo associado com uma doença de retina. Por exemplo, onde um ale- lo dominante codifica uma cópia defeituosa de um gene que, quando tipo selvagem, é uma proteína de estrutura de retina e/ou fornece função normal de retina, uma endonuclease específica por sítio pode ser direcionada ao alelo defeituoso e nocaute do alelo defeituoso.
[00232] Além de nocautear um alelo defeituoso, uma nuclease específica de sítio pode ainda ser usada para estimular a recombinação homóloga com um DNA doador que codifica uma cópia funcional da proteína codificada pelo alelo defeituoso. Assim, por exemplo, um ví- rion rAAV objeto pode ser usado para liberar ambos uma endonuclease específica de sítio que nocauteia um alelo defeituoso, e pode ser usado para liberar uma cópia funcional do alelo defeituoso, resultando no reparo do alelo defeituoso, assim, fornecendo para a produção de uma proteína de retina funcional (por exemplo, retinosquisina funcional, RPE65 funcional, periferina funcional, etc.). Ver, por exemplo, Li et al. (2011) Nature 475:217. Em algumas modalidades, um ví- rion rAAV objeto compreende uma sequência de nucleotídeo heterólo- ga que codifica uma endonuclease específica de sítio; e uma sequência de nucleotídeo heteróloga que codifica uma cópia funcional de um alelo defeituoso, onde a cópia funcional codifica a proteína de retina funcional. As proteínas de retina funcionais incluem, por exemplo, reti- nosquisina, RPE65, proteína 1 de interação de GTPase reguladora de retinite pigmentosa (RGPR), periferina, periferina-2, e semelhantes.
[00233] Endonucleases específicas de sítios que são apropriadas para uso incluem, por exemplo, nucleases dedo de zinco (ZFNs); e nucleases efetoras tipo ativador de transcrição (TALENs), onde ditas endonucleases específicas de sítio são de ocorrência não natural e são modificadas para direcionar a um gene específico. Ditas nucleases específicas de sítio podem ser projetadas para cortar os locais dentro de um genoma, e extremidades não homólogas de união então reparam a quebra enquanto inserem ou deletam vários nucleotídeos. Ditas endonucleases específicas de sítios (também referenciadas como "INDELs") então jogam a proteína fora e efetivamente nocaute do gene. Ver, por exemplo, Publicação de Patente US 2011/0301073.
Sequências regulatórias
[00234] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto do gene de interesse é operacionalmente ligada à um promotor constitutivo. Em outras modalidades, uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto do gene de interesse é operacionalmente ligada à um promotor induzível. Em alguns casos, uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto do gene de interesse é operacionalmente ligada à um elemento regulatório específico de tecido, ou específico de tipo de célula. Por exemplo, em alguns casos, uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto do gene de interesse é operacionalmente ligada à um elemento regulatório específico de fotorreceptor (por exemplo, um promotor específico de fotorreceptor), por exemplo, um elemento regulatório que confere ex-pressão seletiva do gene operacionalmente ligado em uma célula fo- torreceptora. Elementos regulatórios específicos de fotorreceptor incluem, por exemplo, um promotor de rodopsina; um promotor de ro- dopsina quinase (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); um promotor de beta fosfodiesterase (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9: 1015); um promotor de gene de retinite pigmentosa (Nicoud et al. (2007) supra); um estimulador de gene de proteína de ligação à in- terfotorreceptor de retinoide (IRBP) (Nicoud et al. (2007) supra); um promotor de gene IRBP (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225).
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00235] A presente revelação fornece uma composição farmacêutica compreendendo: a) um vírion rAAV objeto, como descrito acima; e b) um carreador, diluente, ou tampão farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o carreador, diluente, excipiente ou tampão farmaceuticamente aceitável é apropriado para uso em um humano.
[00236] Ditos excipientes, carreadores, diluentes e tampões incluem qualquer agente farmacêutico que pode ser administrado sem toxicidade indevida. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, líquidos como água, salina, glicerol e etanol. Sais farmaceu- ticamente aceitáveis podem ser incluídos neste, por exemplo, sais de ácido mineral como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos, e semelhantes; e os sais dos ácidos orgânicos como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, e semelhantes. Além disso, substâncias auxiliares, como agentes molhantes ou emulsificantes, substâncias tamponantes de pH, e semelhantes, pode estar presentes em ditos veículos. Uma ampla variedade de excipientes farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técnica e não precisam ser discutidos em detalhes aqui. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis foram amplamente descritos em uma variedade de publicações, incluindo, por exemplo, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3 rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.MÉTODOS PARA LIBERAÇÃO DE UM PRODUTO DE GENE A UMA CÉLULA DE RETINA E MÉTODOS DE TRATAMENTO
[00237] A presente revelação fornece um método para liberar um produto de gene a uma célula de retina em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo um vírion rAAV objeto como descrito acima. O produto de gene pode ser um polipeptídeo ou um RNA interferente (por exemplo, um shRNA, um siRNA, e semelhantes), um aptâmero, ou uma endonuclease específica de sítio, como descrito acima. Liberar um produto de gene a uma célula de retina pode fornecer tratamento de uma doença de retina. A célula de retina pode ser um fotorreceptor, uma célula de gânglio de retina, uma célula de Müller, uma célula bipolar, uma célula amácrima, uma célula horizontal, ou uma célula epitelial pigmentada de retina. Em alguns casos, a célula de retina é uma célula fotorreceptora, por exemplo, uma célula de bastonete ou cone.
[00238] A presente revelação fornece um método para tratar uma doença de retina, o método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um vírion rAAV objeto como descrito acima. Um vírion rAAV objeto pode ser administrado via injeção intraocular, por injeção intravítrea, ou por qualquer outro modo conveniente ou via de administração. Outros modos convenientes ou vias de administração incluem, por exemplo, intravenosa, intranasal, etc.
[00239] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" estará em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de experimentação e/ou estudos clínicos. Por exemplo, para injeção in vivo, ou seja, injeção diretamente no olho, uma dose terapeuticamente efetiva estará na ordem de cerca de 106 a cerca de 1015 dos vírions rAAV, por exemplo, de cerca de 108 a 1012 vírions rAAV. Para transdução in vitro, uma quantidade efetiva de vírions rAAV a ser liberada às células, será na ordem de cerca de 108 a cerca de 1013 de vírions rAAV. Outras dosagens efetivas podem ser prontamente estabelecidas por um especialista na técnica através de estudos de rotina que estabelecem as curvas de dose-resposta.
[00240] Em algumas modalidades, mais do que uma administração (por exemplo, duas, três, quatro ou mais administrações) pode ser empregada para obter o nível desejado de expressão de gene por um período de vários intervalos, por exemplo, diário, semanal, mensal, anual, etc.
[00241] Doenças oculares que podem ser tratadas usando um método objeto incluem, entre outras, neuroretinopatia macular aguda; doença de Behcet; neovascularização coroidal; uveíte diabética; histo- plasmose; degeneração da macula, como degeneração da mácula, degeneração da mácula relacionada à idade não exudativa e degeneração da mácula relacionada à idade exudativa; edema, como edema macular, edema macular cistoide e edema macular diabético; coroidite multifocal; trauma ocular que afeta um sítio ou local ocular posterior; tumores oculares; distúrbios de retina, como oclusão de veia central da retina, retinopatia diabética (incluindo retinopatia proliferativa diabética), vitreoretinopatia proliferativa (PVR), doença oclusiva arterial de retina, deslocamento de retina, doença de retina uveítica; oftalmia simpatética; síndrome de Vogt Koyanagi-Harada (VKH); difusão uveal; uma condição ocular posterior causada por ou influenciada por um tratamento a laser ocular; condições oculares posteriores causados por ou influenciados por terapia fotodinâmica; fotocoagulação, retinopatia de radiação; distúrbios de membrana epiretinal; oclusão de veia de ramo de retina; neuropatia óptica isquêmica anterior; disfunção de retina diabética não retinopatia; retinosquise; retinite pigmentosa; glaucoma; síndrome de Usher, distrofia de cone-bastonete; doença de Stargardt (flavimaculatoso de fundo); degeneração macular herdada; degeneração corioretinal; amaurose congênita Leber; cegueira noturna estacionária congênita; coroideremia; síndrome de Bardet-Biedl; telan-giectasia macular; neuropatia óptica hereditária de Leber; retinopatia de prematuridade; e distúrbios de visão de cor, incluindo acromatop- sia, protanopia, deuteranopia, e tritanopia.ÁCIDOS NUCLEICOS E CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[00242] A presente revelação fornece um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma pro- teína de capsídeo de vírus adeno associado variante objeto (AAV) como descrito acima, onde a proteína de capsídeo AAV variante compreende uma inserção de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 ami- noácidos na alça GH ou alça IV em relação à proteína de capsídeo AAV parental correspondente, e onde a proteína do capsídeo variante, quando presente em um vírion AAV, fornece infectividade aumentada de uma célula de retina comparada à infectividade da célula de retina por um vírion AAV compreendendo a proteína de capsídeo AAV parental correspondente. Um ácido nucleico isolado objeto pode ser um vetor AAV, por exemplo, um vetor AAV recombinante.Peptídeos de inserção
[00243] Uma proteína de capsídeo AAV variante codificada por um ácido nucleico objeto tem um peptídeo de inserção de cerca de 5 ami- noácidos a cerca de 11 aminoácidos em comprimento é inserido na alça GH de um capsídeo AAV. O peptídeo de inserção tem um comprimento de 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoá- cidos, 9 aminoácidos, 10 aminoácidos, ou 11 aminoácidos.
[00244] O peptídeo de inserção pode compreender uma sequência de aminoácido de qualquer uma das fórmulas estabelecidas abaixo.
[00245] Por exemplo, um peptídeo de inserção pode ser um peptí-deo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula I:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00246] onde:
[00247] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr;
[00248] X1; se presente, é selecionado de Leu, Asn, e Lys;
[00249] X2 é selecionado de Gly, Glu, Ala, e Asp;
[00250] X3 é selecionado de Glu, Thr, Gly, e Pro;
[00251] X4 é selecionado de Thr, He, Gln, e Lys;
[00252] X5 é selecionado de Thr e Ala;
[00253] X6 é selecionado de Arg, Asn, e Thr;
[00254] X7, se presente, é selecionado de Pro e Asn.
[00255] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser umpeptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula IIa:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00256] onde:
[00257] cada um de Y1 -Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr; cada um de X1 - X4 é qualquer aminoácido;
[00258] X5 é Thr;
[00259] X6 é Arg; e
[00260] X7 é Pro.
[00261] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula IIb:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00262] onde:
[00263] cada um de Y1 -Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr; X1; se presente, é selecionado de Leu e Asn;
[00264] X2, se presente, é selecionado de Gly e Glu;
[00265] X3 é selecionado de Glu e Thr;
[00266] X4 é selecionado de Thr e Le;
[00267] X5 é Thr;
[00268] X6 é Arg; e
[00269] X7 é Pro.
[00270] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula III:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00271] onde:
[00272] cada um de Y1-Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr;
[00273] X1, se presente, é Lys;
[00274] X2 é selecionado de Ala e Asp;
[00275] X3 é selecionado de Gly e Pro;
[00276] X4 é selecionado de Gln e Lys;
[00277] X5 é selecionado de Thr e Ala;
[00278] X6 é selecionado de Asn e Thr;
[00279] X7, se presente, é Asn.
[00280] Como outro exemplo, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 5 a 11 aminoácidos em comprimento, onde o peptídeo de inserção é de Fórmula IV:Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[00281] onde:
[00282] cada um de Yi -Y4, se presente, é independentemente selecionado de Ala, Leu, Gly, Ser, e Thr;
[00283] X1 ; se presente, é um aminoácido positivamente carregado ou um aminoácido não carregado; ou é selecionado de Leu, Asn, Arg, Ala, Ser, e Lys;
[00284] X2 é um aminoácido negativamente carregado ou um ami-noácido não carregado; ou é selecionado de Gly, Glu, Ala, Val, Thr, e Asp;
[00285] X3 é um aminoácido negativamente carregado ou um ami-noácido não carregado; ou é selecionado de Glu, Thr, Gly, Asp, ou Pro;
[00286] X4 é selecionado de Thr, Le, Gly, Lys, Asp, e Gln;
[00287] X5 é um aminoácido polar, um álcool (um aminoácido con- tendo um grupo hidroxil livre), ou um aminoácido hidrofóbico; ou é selecionado de Thr, Ser, Val, e Ala;
[00288] X6 é um aminoácido positivamente carregado ou um ami-noácido não carregado; ou é selecionado de Arg, Val, Lys, Pro, Thr, e Asn; e
[00289] X7, se presente, é um aminoácido positivamente carregadoou um aminoácido não carregado; ou é selecionado de Pro, Gly, Phe, Asn, e Arg.
[00290] Como exemplos não limitantes, o peptídeo de inserção pode compreender uma sequência de aminoácido selecionada de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), e STGKVPN (SEQ ID NO:60).
[00291] Em alguns casos, o peptídeo de inserção tem de 1 a 4 ami- noácidos espaçadores (Yi-Y4) em amino terminal e/ou em carboxil terminal de qualquer um de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), and STGKVPN (SEQ ID NO:60).
[00292] Aminoácidos espaçadores apropriados incluem, entre outros, leucina, alanina, glicina, e serina.
[00293] Por exemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserção tem uma das seguintes sequências de aminoácidos: LALGETTRPA (SEQ ID NO:45); LANETITRPA (SEQ ID NO:46), LAKAGQANNA(SEQ ID NO:47), LAKDPKTTNA (SEQ ID NO:48), LAKDTDTTRA(SEQ ID NO:61), LARAGGSVGA (SEQ ID NO:62), LAAVDTTKFA(SEQ ID NO:63), e LASTGKVPNA (SEQ ID NO:64). Como outroexemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserção tem uma das seguintes sequências de aminoácidos: AALGETTRPA (SEQ ID NO:49); AANETITRPA (SEQ ID NO:50), AAKAGQANNA (SEQ ID NO:51), e AAKDPKTTNA (SEQ ID NO:52). Como ainda outro exemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserção tem uma das seguintes sequências de aminoácidos: GLGETTRPA (SEQ ID NO:53); GNETITRPA (SEQ ID NO:54), GKAGQANNA (SEQ ID NO:55), e GKDPKTTNA (SEQ ID NO:56). Como outro exemplo, em alguns casos, um peptídeo de inserção compreende um de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), e STGKVPN (SEQ ID NO:60), flanqueado em C-terminal por AA e em N-terminal por A; ou compreende um de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), e STGKVPN (SEQ ID NO:60) flanqueado em C-terminal por G e em N-terminal por A.
[00294] Um vetor AAV recombinante objeto pode ser usado para gerar um vírion AAV recombinante objeto, como descrito acima. Assim, a presente revelação fornece um vetor AAV recombinante que, quando introduzido em uma célula apropriada, pode fornecer produção de um vírion AAV recombinante.
[00295] A presente invenção ainda fornece células hospedeiras, por exemplo, células hospedeiras isoladas (geneticamente modificadas), compreendendo um ácido nucleico objeto. Uma célula hospedeira objeto pode ser uma célula isolada, por exemplo, uma célula em cultura in vitro. Uma célula hospedeira objeto é útil para produzir um vírion rAAV objeto, como descrito abaixo. Onde uma célula hospedeira objeto para produzir um vírion rAAV objeto, esta é referenciada como uma "célula de empacotamento." Em algumas modalidades, uma célula hospedeira objeto é estavelmente geneticamente modificada como um ácido nucleico objeto. Em outras modalidades, uma célula hospedeira objeto é transitoriamente geneticamente modificada com um ácido nu- cleico objeto.
[00296] Um ácido nucleico objeto é introduzido estavelmente ou transitoriamente em uma célula hospedeira, usando técnicas estabelecidas, entre outras, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por lipossoma, e semelhantes. Para transformação estável, um ácido nucleico objeto irá geralmente ainda incluir um marcador selecionável, por exemplo, qualquer um de marcadores selecionáveis bem conhecidos como resistência à neomicina, e seme-lhantes.
[00297] Uma célula hospedeira objeto é gerada por introdução de um ácido nucleico objeto em qualquer uma de uma variedade de células, por exemplo, células mamíferas, incluindo, por exemplo, células de murino, e células de primata (por exemplo, células humanas). Células de mamíferos apropriadas incluem, entre outras, células primárias e linhagens de células, onde as linhagens de células apropriadas incluem, entre outras, células 293, células COS, células HeLa, células Vero, 3T3 fibroblastos de camundongo, fibroblastos C3H10T1/2, células CHO, e semelhantes. Exemplos não limitantes de células hospedeiras apropriadas incluem, por exemplo, células HeLa (por exemplo, American Tipo Culture Collection (ATCC) N.° CCL-2), células CHO (por exemplo, ATCC N.°s. CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por exemplo, ATCC N.° CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por exemplo, ATCC N.° CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por exemplo, ATCC N.° CCL10), células PC12 (ATCC N.° CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC N.° CRL1651), células RATI, células L de camundongos (ATCC N.° CCLI.3), células renais embrionárias humanas (HEK) (ATCC N.° CRL1573), células HLHepG2, e semelhantes. Uma célula hospedeira objeto pode ainda ser realizada usando um ba- culovírus para infetar células de inseto de como células Sf9, que produzem AAV (ver, por exemplo, patente US 7.271.002; pedido de patente US 12/297.958)
[00298] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneti- camente modificada objeto inclui, além de um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína de capsídeo AAV variante, como descrito acima, um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas rep de AAV. Em outras modalidades, uma célula hospedeira objeto ainda compreende um vetor rAAV. Um vírion rAAV pode ser gerado usando uma célula hospedeira objeto. Métodos para gerar um vírion rAAV são descritos em, por exemplo, Publicação de Patente US 2005/0053922 e Publicação de Patente US 2009/0202490.
EXEMPLOS
[00299] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a fornecer aos especialistas na técnica uma revelação e descrição completas de como preparar e usar a presente invenção descrita, e não pretendem limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção e nem pretendem representar que os experimentos abaixo são todos ou unicamente os experimentos realizados. Esforços foram feitos para garantir a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser contabilizados. Salvo se indicado em contrário, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio do peso, a temperatura é em graus Celsius, e a pressão é ou está próxima da atmosférica. Abreviações padrões podem ser usadas, por exemplo, bp, pares de base; kb, quilobases; pi, picolitros; s ou seg, segundos; min, minutos; h ou hr, horas; aa, aminoácidos; kb, quiloba- ses; bp, pares de base; nt, nucleotídeos; i.m., intramuscular; i.p., intraperitoneal; s.c, subcutânea; e semelhantes.Exemplo 1: variante AAV com transdução melhorada de células de retina
[00300] A abordagem usada foi criar uma biblioteca de apresentação de peptídeo introduzindo um sítio AvrII único site no genoma de AAV2 tipo selvagem entre aminoácido 587 e 588 por mutagênese de reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma inserção aleatória de 21 nucleotídeos, 7mero For, foi usado para sintetizar insertos de dsDNA, junto com o iniciador antissenso 7mero Rev. Os insertos resultantes de dsDNA foram clonados no sítio AvrII do genoma após a digestão com NheI, produzindo uma biblioteca de apresentação 7mero diversa que foi então empacotada (Perabo et al., 2003; Müller et al., 2003). O vírus foi gerado de modo que cada genoma viral foi empacotado ou encap- sidado com a variante de proteína de capsídeo que aquele genoma codificou. Com relação a isto, melhoras funcionais identificadas através de seleção podem ser ligadas à sequência de genoma que codifica a função melhorada contida dentro do capsídeo viral.
[00301] Esta biblioteca foi submetida à seleção positiva em camundongos rho-GFP (Wensel et al. (2005) Vision Res. 45:3445). Resumidamente, em uma rodada de seleção, camundongos adultos rho-GFP foram injetados intravitrealmente com 2 μL de salina tamponada com fosfato (PBS) dialisada, biblioteca purificada por iodixanol com um título genômico de aproximadamente 1x1012 de genomas virais (vg)/mL. Uma agulha ultrafina de calibre 30 1/2 descartável foi passado pela esclera do olho do animal, no equador e próximo ao limbo, na cavidade vítrea. A injeção de 2μl de vírus foi realizada com observação direta da agulha no centro da cavidade vítrea. Uma semana após a injeção, os olhos foram enucleados e as retinas dissociadas usando um tratamento de luz, protease de papaína, seguido por isolamento em classificador de célula ativada por fluorescência (FACS) das populações fo- torreceptoras. Os vírions bem sucedidos foram, então, amplificados em PCR a partir de extrações genômicas e ainda clonados e re- empacotados para injeção.
[00302] Outras iterações desta seleção foram realizadas, estreitando o grupo de variantes a um subgrupo com as mutações mais per- missivas. Após três iterações, uma rodada de PCR error prone foi realizada para criar outra geração de variantes para seleção. No total, este processo foi repetido por duas gerações. Com relação a isto, este processo de evolução direcionada criou variantes AAV permissivas ao fotorreceptor através da aplicação de seleção positiva e mutagênese induzida, semelhante ao processo de evolução natural.
[00303] Subsequentemente, os genes cap de cinquenta variantes foram sequenciados para determinar as variantes mais proeminentes e bem sucedidas para terem mutações permissivas para transdução de fotorreceptor intravítrea. Dos 50 clones, 46 geraram sequências legíveis de um inserto 7mero. Notavelmente, quase dois terços de clones continham o mesmo motivo distinto 7mero (~588LGETTRP~; SEQ ID NO: 13). De modo interessante, a variante mais proeminente seguinte (~ 588 NETITRP-; SEQ ID NO: 14) também continha um motivo flan- queador que consiste em um resíduo de arginina positivamente carregado em entre treonina polar e um resíduo prolina não polar (TRP).
Figure img0001
Tabela 1. Sequenciamento de variantes isoladas de evolução direcionada revela um alto grau de convergência em bibliotecas virtuais. Todas as variantes derivadas de biblioteca AAV2 7mero, com aproximadamente 64% de variantes contendo o mesmo motivo 7mero (~588LGETTRP~ (SEQ ID NO: 13)).
[00304] Entre as sequências de inserto 7mero, houve preferências moderadas em posições particulares, por exemplo, um aminoácido positivamente carregado na posição 1; um aminoácido negativamente carregado na posição 2; um álcool (por exemplo, um aminoácido contendo um grupo álcool (um grupo hidroxil livre), como Thr ou Ser) na posição 5.
[00305] Os insertos 7mero foram flanqueados por espaçadores, como mostrado na Tabela 2:
Figure img0002
[00306] Figura 1. Modelo de capsídeo tridimensional representativo de AAV2 contendo um heptâmero aleatório (mostrado em laranja) após aminoácido 587. Esta área de capsídeo AAV2 possivelmente participa de ligação de receptor de superfície celular.
[00307] À luz do alto grau de convergência de biblioteca a partir da seleção descrita acima, uma forma recombinante de AAV2 ~588LGETTRP~ (SEQ ID NO: 13; chamado 7M8) foi clonado e empacotado o vetor com um transgene scCAG-GFP para visualizar seu perfil de transdução. Três semanas após a injeção intravítrea em camundongos adultos, a expressão robusta em vários tipos de células, incluindo células de gânglio de retina (RGCs) e células de Müller, foi observada. De modo importante, a transdução de fotorreceptores em retinas injetadas com 7M8, como observado por expressão de GFP em nú-cleos da camada nuclear externa (ONL) (setas vermelhas) e em segmentos externos (Figura 2, seta azul), foi observada, enquanto que AAV2 não mostrou expressão de fotorreceptor discernível.
[00308] Figura 2 Variante AAV2 7M8 (direita) demonstra níveis maiores de transdução de fotorreceptor intravítreo em relação a AAV2 (esquerda). Microscopia confocal de seções de retina transversa três semanas após a injeção intravítrea de 2 μL de 1x1012 vg/mL de AAV2 7M8 e AAV2 scCAG GFP em camundongos adultos. As setas vermelhas (superior) denotam núcleos fotorreceptores e seta azul (superior) denota segmentos externos de fotorreceptor.
[00309] À luz destes ganhos na transdução de célula de retina, uma tentativa foi feita para aumentar a especificidade na expressão através do uso de um transgene ssRho-eGFP contendo um promotor de ro- dopsina específico ao fotorreceptor para melhor resolver as eficiências de transdução especificamente em fotorreceptores (Figura 3). De fato o uso de um promotor Rho específico ao fotorreceptor limitou a expressão GFP aos fotorreceptores. Uma tentativa foi realizada para melhorar a eficiência de transdução de 7M8 combinando uma abordagem de desenho racional para a abordagem de evolução direcionada anterior. Portanto, quatro resíduos de tirosina expostos foram mutageniza- dos às fenilalaninas no capsídeo 7M8 (Y273F, Y444F, Y500F, e Y730F) que demonstrou anteriormente aumentar a infectividade de fotorreceptor (Petrs-Silva et al., 2009). De modo interessante, a adição de mutações reduziu o número de fotorreceptores transduzidos comparados ao vírus original como mostrado por classificação FACs de fotorreceptores GFP(+) de retinas infectadas por 7m8 ou 7m8-4YF (Figura 4).
[00310] Figura 3. Imagens de fluorescência representativas de crio- fatias de retina que mostram a expressão de GFP de 7m8 contendo o gene GFP sob o controle de promotor ubíquo CAG (esquerda) ou um promotor Rho específico para o fotorreceptor (direita).
[00311] Figura 4. Células fotorreceptoras GFP(+) por milhão de células de retina como contado por citometria de fluxo. 7m8 transduz mais do que 2x a quantidade de fotorreceptores comparados ao 7m8 contendo 4 mutações de tirosina (superior).Exemplo 2: Tratamento de retinosquise
[00312] Usando o construto de expressão 7m8-rho-RS 1, uma proteína funcional retinosquisina (RS1) foi liberada para camundongos deficientes em retinosquisina (camundongos deficientes em Rs1h; Rs1h é o homologo de camundongo RS1 humana). O vetor compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína funcional retinosquisina em controle de transcrição de um promotor rodopsi- na. Ver Figuras 13A-C, onde a sequência em negrito e sublinhada de nucleotídeo (nucleotídeos 4013-4851) é o promotor rodopsina; e nu- cleotídeos 4866-5540 (com as sequências de início atg e de parada tga mostradas em negrito) codificam uma proteína RS1 humana.
[00313] O construto 7m8-rho-RS l foi administrado de modo intraví- treo para camundongos Rs1h-/- em P15. Camundongos Rs1h-/- foram gerados através do rompimento de exon 3 do gene Rs1h, como descrito (Weber et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6222). Os camundongos Rs1h-/- são deficientes no produto de proteína Rs1h, têm um ERG eletronegativo (por exemplo, uma onda b reduzida com preservação relativa de uma onda a) e divisão de camadas de retina, semelhante ao observado em pacientes com retinosquise humanos. A injeção de vetor 7m8- rho-RS l no Rs1h-/- levou aos altos níveis de expressão panretinal de RS1 de fotorreceptores na retina. A expressão de RS1 levou à morfologia de retina melhorada com uma redução no número e tamanho de cavidades na retina como observado na imagem de tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD- OCT) (Figuras 7A-I), um resgate de onda b ERG (Figuras 8A-D), e preservação estrutural de longo prazo da retina (Figuras 9A-E).
[00314] Figuras 7A-I. Imagens representativas de alta resolução em SD-OCT de retinas injetadas com 7m8-rho-GFP (coluna esquerda), 7m8-rho-RS1 (coluna do meio), ou animais WT não injetados (coluna direita). As imagens de fundo foram tiradas na camada nuclear interna da retina superior e excluem outras camadas (a-c). Imagens transversas da retina superior (d-f) e inferior (g-i) foram tiradas usando a cabeça do nervo óptico como um marco.
[00315] A retina RS1 não tratada aumenta em espessura geral quando medido a partir da membrana de limite interno (ILM) aos fotor- receptores, conforme a patologia progride devido à fissuras que dividem a retina interna. Este processo é distinto do observado nas doenças de retina mais degenerativas (RDD) que não formam fissuras, mas apresentam morte de célula fotorreceptora progressiva em INL e concomitante afinamento da retina e perda de amplitude ERG. Em RS1, o ONL afina conforme os fotorreceptores morrem da doença, mas esta é distinta a partir da alteração geral de espessamento de retina. É geralmente pensado que uma terapia bem sucedida para RS1 poderia retornar a espessura de retina ao tipo selvagem e amenizar a perda de fotorreceptor em ONL. Na maioria de RDD além de Rs1, a perda de fotorreceptores, marcado por afinamento de ONL, é paralelo a uma redução em saída fisiológica de retina como medido pela amplitude ERG. RS1 é um dos muito poucos exemplos de uma doença de retina na qual a patologia aumenta a espessura da retina com concomitante perca de amplitude erg. Em resumo, restabelecer o produto do gene RS1, uma "cola de retina extracelular" afina o fundo da retina à espessura do tipo selvagem e a amplitude erg retorna aos níveis normais conforme a fissura se resolve.
[00316] Figura 8a mostra uma comparação de resgate funcional de olhos não Rs1-/- não tratados para olhos injetados com AAV2-rho- RS1, 7m8-rho-GFP, e 7m8-rho-RS1 ambos um mês (esquerda) e 4 meses (direita) após a injeção. Um mês após a injeção, 7m8-rho-RS1 levou a um resgate considerável de amplitude de onda b de ERG, en- quanto que AAV2-rho.RS1 foi estatisticamente indistinguível de olhos não tratados.
[00317] Após 4 meses, a amplitude 7m8-rho-RS 1 ainda aumenta na direção de amplitude de tipo selvagem (direita). Figura 8b mostra traços de ERG representativos de olhos injetados com 7m8-rho-RS1 que mostra amplitude aumentada de uma onda a e onda b e uma forma de onda mais curta aos olhos tipo selvagem, comparado aos olhos injetados com 7m8-rho-GFP. Figura 8c mostra a amplitude do escotó- pico de campo completo de onda b resultante de um estímulo de alta intensidade (1 log cd x s/m2) foi registrado em uma base mensal começando um mês após a injeção em P15 para cada condição. Três respostas foram registradas e ponderadas para cada olho em cada ponto de tempo.
[00318] Amplitudes médias de onda b ERG foram plotadas como uma função de tempo após a injeção. n=7 foi usado para ambas as condições. A Figura 8d mostra uma análise de respostas ERG em condições escotópicas (traços superiores, estímulo varia de -3 a 1 log cd x s/m2) e fotópicas (traços inferiores, variam de -0,9 a 1,4 log cd x s/m2) indica função melhorada de bastonetes e cones sobre uma faixa de intensidades de estímulos.
[00319] Figuras 9A-E. Melhoras sustentadas em espessura de retina medidas em 10 meses após tratamento 7m8-rho-RS1. Imagens transversas representativas em SD-OCT de retinas tradas com a) 7m8-rho-RS1 ou b) ou 7m8-rho-GFP 10 meses após a injeção centrada na cabeça de nervo óptico. As medidas de c) espessura de retina, d) espessura ONL, e e) espessura de segmento interno e externo são plotadas como uma função de cabeça de nervo óptico.
[00320] Exemplo 3: variante AAV usada para liberar uma proteína às células de retina no macaco
[00321] Um vírion AAV2 recombinante (7m8 carreando GFP sob o controle de um promotor connexin36) foi gerado. O vírion AAV2 re- combinante incluiu um variante de capsídeo AAV2 com uma inserção de peptídeo LALGETTRPA entre aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2, e GFP em controle de transcrição de um promotor conne- xin36, que é expresso em interneurônios. O vírion rAAV2 foi injetado intravítreo no olho de um macaco. Os dados são mostrados na Figura 18.
[00322] Figura 18 fornece uma imagem de fundo de olho de fluorescência que mostra a expressão GFP no fundo da retina primata central 9 semanas após a administração de 7m8 contendo GFP sob o controle de promotor connexin36. Comparado ao sorotipo AAV2 parental (Yin et al, IOVS 52(5); 2775), um nível maior de expressão foi observado no anel foveal, e fluorescência visível foi observada na retina central fora da fóvea.LISTAGEM DE REFERÊNCIADaiger SP, Bowne SJ, Sullivan LS (2007) Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol 125: 151-158.Dalkara D, Kolstad KD, Caporale N, Visel M, Klimczak RR, et al. (2009) Inner Limiting Membrane Barriers to AAV Mediated Retinal Transduction from the Vitreous. Mol Ther.den Hollander AI, Roepman R, Koenekoop RK, Cremers FP (2008) Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Prog Retin Eye Res 27: 391-419.Gruter O, Kostic C, Crippa SV, Perez MT, Zografos L, et al. (2005) Lentiviral vector-mediated gene transfer in adult mouse photoreceptors is impaired by the presence of a physical barrier. Gene Ther 12: 942-947.Maguire AM, Simonelli F, Pierce EA, Pugh EN, Jr., Mingozzi F, et al. (2008) Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358: 2240-2248.Mancuso K, Hauswirth WW, Li Q, Connor TB, Kuchenbecker JA, et al. (2009) Gene therapy for red-green colour blindness in adult primates. Nature 461: 784-787.McGee Sanftner LH, Abel H, Hauswirth WW, Flannery JG (2001) Glial cell line derived neurotrophic factor delays photoreceptor degeneration in a transgenic rat model of retinitis pigmentosa. Mol Ther 4: 622-629.Muller OJ, Kaul F, Weitzman MD, Pasqualini R, Arap W, et al. (2003) Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat Biotechnol 21: 1040-1046.Nakazawa T. et al. (2007) Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Invest Ophthamol Vis Sci 48: 2760-8.Nakazawa T. et al. (2006) Characterization of cytokine responses to retinal detachment in rats. Mol Vis 12: 867-78.Perabo L, Buning H, Kofler DM, Ried MU, Girod A, et al. (2003) In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther 8: 151-157.Petrs-Silva H, Dinculescu A, Li Q, Min SH, Chiodo V, et al. (2009) High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosinemutant AAV serotype vectors. Mol Ther 17: 463-471.Reme CE, Grimm C, Hafezi F, Wenzel A, Williams TP (2000) Apoptosis in the Retina: The Silent Death of Vision. News Physiol Sci 15: 120-124.Rolling F (2004) Recombinant AAV-mediated gene transfer to the retina: gene therapy perspectives. Gene Ther 11 Suppl 1: S26-32. Wensel TG, Gross AK, Chan F, Sykoudis K, Wilson JH (2005) Rhodopsin-EGFP knock-ins for imaging quantal gene alterations. Vision Res 45: 3445-3453.Zhong L, Li B, Mah CS, Govindasamy L, Agbandje- McKenna M, et al. (2008) Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 7827-7832.
[00323] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às modalidades específicas da mesma, deve ser entendido pelos especialistas na técnica que várias alterações podem ser feitas e equivalentes poderão ser substituídos sem se afastar do verdadeiro espírito e escopo da invenção. Além disso, muitas modificações podem ser realizadas para se adaptar a uma situação, material, composição objeto, processo, etapa ou etapas do processo, ao objetivo, espírito e escopo particular da presente invenção. Todas as ditas modificações pretendem estar no escopo das reivindicações anexadas aqui.

Claims (22)

1. Uso de um vírion de vírus adenoassociado recombinante (rAAV), caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para tratar uma doença ocular, em que o medicamento compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável, e em que o vírion de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) compreende:a) uma proteína de capsídeo de AAV variante, em que a proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de um peptídeo no loop GH da proteína do capsídeo relativa a uma proteína de capsídeo de AAV parental correspondente, em que a inserção compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de LALGETTRPA (SEQ ID NO: 45); LANETITRPA (SEQ ID NO: 46), LA- KAGQANNA (SEQ ID NO: 47), LAKDPKTTNA (SEQ ID NO: 48), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), STGKVPN (SEQ ID NO:60), LAKDTDTTRA (SEQ ID NO: 61), LARAGGSVGA (SEQ ID NO: 62), LAAVDTTKFA (SEQ ID NO: 63), e LASTGKVPNA (SEQ ID NO: 64), eb) um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene;em que o vírion rAAV infecta uma célula da retina,em que a doença ocular é glaucoma, retinite pigmentosa, degeneração macular, retinosquise, Amaurose Congênita de Leber, retinopatia diabética, acromotopsia ou daltonismo.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sítio de inserção está dentro dos aminoácidos 570 a 611 da proteína de capsídeo AAV2 como estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou as posições correspondentes na proteína de capsídeo de outro so- rotipo AAV.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a célula de retina é um fotorreceptor, uma célula gan glionar da retina, uma célula de Müller, uma célula bipolar, uma célula amácrina, uma célula horizontal ou uma célula de epitélio pigmentado da retina.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito medicamento é adequado para injeção intraocular.
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito medicamento é adequado para injeção intravítrea.
6. Vírion de vírus adenoassociado recombinante (rAAV), ca-racterizado pelo fato de que compreende:a) uma proteína de capsídeo de AAV variante, em que a proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de um peptídeo no loop GH da proteína do capsídeo relativa a uma proteína de capsídeo de AAV parental correspondente, em que a inserção compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de LALGETTRPA (SEQ ID NO: 45); LANETITRPA (SEQ ID NO: 46), LA- KAGQANNA (SEQ ID NO: 47), LAKDPKTTNA (SEQ ID NO: 48), LAK- DTDTTRA (SEQ ID NO: 61), LARAGGSVGA (SEQ ID NO: 62), LAAV- DTTKFA (SEQ ID NO: 63), e LASTGKVPNA (SEQ ID NO: 64), e em que a proteína de capsídeo variante confere infectividade de uma célula da retina, eb) um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene.
7. Vírion de rAAV de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o sítio de inserção está dentro dos aminoáci- dos 570 a 611 da proteína de capsídeo AAV2 ou as posições correspondentes na proteína de capsídeo de outro sorotipo AAV.
8. Vírion de rAAV de acordo com a reivindicação 6 ou 7, ca-racterizado pelo fato de que a célula de retina é um fotorreceptor, uma célula ganglionar da retina, uma célula de Müller, uma célula bipolar, uma célula amácrina, uma célula horizontal ou uma célula de epitélio pigmentado da retina.
9. Vírion de rAAV de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o sítio de inserção está entre os aminoácidos 587 e 588 da proteína de capsídeo AAV2 como estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou as posições correspondentes na proteína de capsídeo de outro sorotipo AAV.
10. Vírion de rAAV de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que o produto de gene é um RNA interferente, um aptâmero ou um polipeptídeo.
11. Vírion de rAAV de acordo com a reivindicação 10, ca-racterizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado do grupo consistindo em: fator neurotrófico derivado de glia, fator de crescimento de fibroblasto 2, neurturina, fator neurotrófico ciliar, fator de crescimento de nervo, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator de crescimento epidérmico, rodopsina, inibidor de apoptose ligado a X, reti- nosquisina, proteína específica de epitélio de pigmento de retina (RPE65), proteína 1 de interação com GTPase de retinite pigmentosa, periferina, periferina 2, uma rodopsina e Sonic hedgehog.
12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende:a) um vírion de rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 11; eb) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
13. Vírion de vírus adenoassociado recombinante 2 (rA- AV2), caracterizado pelo fato de que compreende:a) uma proteína de capsídeo AAV2 variante, em que a proteína de capsídeo AAV variante compreende uma inserção de um pep- tídeo na alça GH da proteína de capsídeo em relação a uma proteína de capsídeo do AAV parental correspondente, em que a inserção compreende uma sequência de aminoácidos LALGETTRPA (SEQ ID NO: 45), em que o local de inserção está dentro dos aminoácidos 570611 da proteína de capsídeo AAV2 estabelecida na SEQ ID NO: 1; eb) um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um produto genético.
14. Vírion de rAAV2, de acordo com a reivindicação 13, ca-racterizado pelo fato de que o sítio de inserção está entre os aminoá- cidos 587-588 da proteína de capsídeo AAV2 estabelecida na SEQ ID NO: 1.
15. Vírion de rAAV2, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o produto do gene é um RNA de interferência ou um aptâmero.
16. Vírion de rAAV2, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que o produto do gene é um polipeptídeo.
17. Vírion de rAAV2, de acordo com a reivindicação 16, ca-racterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um polipeptídeo que melhora a função de uma célula da retina, um polipeptídeo neuroprotetor ou um polipeptídeo antiangiogênico.
18. Vírion de rAAV2, de acordo com a reivindicação 16, ca-racterizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em: fator neurotrófico derivado da glia, fator de crescimento de fibroblasto 2, neurturina, fator neurotrófico ciliar, fator de crescimento do nervo, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator de crescimento epidérmico, rodopsina, inibidor X ligado a apoptose, retinosquisina, RPE65, proteína-1 interativa da GTPase da retinite pigmentosa, perifi- na, perifina-2, rodopsina e Sonic Hedgehog.
19. Vírion de rAAV2, de acordo com a reivindicação 16, ca-racterizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em: um receptor de fator de crescimento de endotélio vascular solúvel (VEGF), um anticorpo de ligação a VEGF, um polipeptídeo de fusão Fc compreendendo um polipeptídeo Flt solúvel.
20. Vírion de rAAV2, de acordo com a reivindicação 18, ca-racterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um polipeptídeo de fusão Fc compreendendo um polipeptídeo Flt solúvel.
21. Vírion de rAAV2, de acordo com a reivindicação 16, ca-racterizado pelo fato de que o polipeptídeo é subunidade alfa do canal de cátion ativado por cGMP do fotorreceptor de cone (CNGA3) ou su- bunidade beta do canal de cátion ativado por cGMP do fotorreceptor de cone (CNGB3).
22. Vírion de rAAV2, de acordo com a reivindicação 16, ca-racterizado pelo fato de que o polipeptídeo é L-opsina, M-opsina ou S- opsina.
BR112013027120-5A 2011-04-22 2012-04-20 Vírion de vírus adenoassociado recombinante (raav), seu uso, composição farmacêutica e vírion de vírus adenoassociado recombinante 2 (raav2) BR112013027120B1 (pt)

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Families Citing this family (230)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
RS60207B1 (sr) 2011-04-22 2020-06-30 Univ California Adeno-povezani virioni virusa sa varijantama kapsida i postupci za njihovu primenu
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2931897B1 (en) 2012-12-12 2017-11-01 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP2954051B1 (en) 2013-02-08 2019-03-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified aav8 capsid for gene transfer for retinal therapies
US10266845B2 (en) 2013-02-08 2019-04-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Enhanced AAV-mediated gene transfer for retinal therapies
KR102346455B1 (ko) 2013-03-15 2022-01-04 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 Ｍｐｓｉ 치료를 위한 조성물 및 방법
EP2996725A4 (en) * 2013-05-16 2016-12-28 Applied Genetic Tech Corp PROMOTERS, EXPRESSION CASSETTES, VECTORS, KITS AND METHODS FOR TREATING COLOR BLINDNESS AND OTHER PROBLEMS
US11136557B2 (en) 2013-05-31 2021-10-05 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
AU2014281027A1 (en) 2013-06-17 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
CN106062197A (zh) 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导***、方法和组合物的递送、工程化和优化
CN107995927B (zh) 2013-06-17 2021-07-30 布罗德研究所有限公司 用于肝靶向和治疗的crispr-cas***、载体和组合物的递送与用途
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
KR20160056869A (ko) 2013-06-17 2016-05-20 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 바이러스 구성성분을 사용하여 장애 및 질환을 표적화하기 위한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료 적용
EP3013946B8 (en) * 2013-06-28 2019-04-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for expressing a polynucleotide of interest in the retina of a subject
US11667913B2 (en) 2013-07-08 2023-06-06 Inserm Methods for performing antisense oligonucleotide-mediated exon skipping in the retina of a subject in need thereof
EP3561062A1 (en) 2013-09-13 2019-10-30 California Institute of Technology Selective recovery
EP3080271B1 (en) 2013-12-12 2020-02-12 The Broad Institute, Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
MX2016007325A (es) 2013-12-12 2017-07-19 Broad Inst Inc Composiciones y metodos de uso de sistemas crispr-cas en desordenes debidos a repeticion de nucleotidos.
CA2932478A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
US20170007720A1 (en) * 2014-02-21 2017-01-12 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for gene delivery to on bipolar cells
CA2941640A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors and methods for transduction of photoreceptors and rpe cells
WO2015134812A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
EP3553176A1 (en) * 2014-03-10 2019-10-16 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
SG10201810150UA (en) 2014-03-17 2018-12-28 Adverum Biotechnologies Inc Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
EP3981876A1 (en) 2014-03-26 2022-04-13 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
IL292951B1 (en) 2014-05-02 2024-06-01 Genzyme Corp AAV vectors for gene therapy in the central nervous system and retina
US10577627B2 (en) 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
KR20170036085A (ko) * 2014-07-31 2017-03-31 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 오클라호마 포유동물 rpe65의 높은 아소머로하이드롤라아제 활성 돌연변이
RU2718047C2 (ru) * 2014-09-16 2020-03-30 Джензим Корпорейшн Аденоассоциированные вирусные векторы для лечения миоцилиновой (myoc) глаукомы
CA2966620A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Voyager Therapeutics, Inc. Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease
SG11201703419UA (en) 2014-11-14 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
US10597660B2 (en) 2014-11-14 2020-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
WO2016131009A1 (en) * 2015-02-13 2016-08-18 University Of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
WO2016133917A1 (en) 2015-02-16 2016-08-25 University Of Florida Research Foundation Raav vector compositions, methods for targeting vascular endothelial cells and use in treatment of type i diabetes
AU2016219789B2 (en) * 2015-02-20 2021-03-25 Fondazione Telethon Methods and compositions for treating genetic eye diseases
AU2016226289B2 (en) * 2015-03-02 2021-04-29 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
ES2860712T3 (es) 2015-03-24 2021-10-05 Univ California Variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de las mismas
US10081659B2 (en) 2015-04-06 2018-09-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Adeno-associated vectors for enhanced transduction and reduced immunogenicity
EP3286571B1 (en) 2015-04-24 2021-08-18 Editas Medicine, Inc. Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
EP3294332A4 (en) * 2015-05-14 2018-12-26 Joslin Diabetes Center, Inc. Retinol-binding protein 3 (rbp3) as a protective factor in non-diabetic retinal degeneration
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
TWI813532B (zh) 2015-06-18 2023-09-01 美商博得學院股份有限公司 降低脱靶效應的ｃｒｉｓｐｒ酶突變
WO2017093566A1 (en) * 2015-12-04 2017-06-08 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) Promoters and uses thereof
US11510998B2 (en) 2015-12-11 2022-11-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Gene therapy for combined methylmalonic acidemia/aciduria and hyperhomocysteinemia/homocystinuria, cobalamin C type, and deficiency of MMACHC
CN108699565B (zh) 2015-12-11 2023-08-08 加州理工学院 用于定向腺相关病毒(aav)的靶向肽
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods
MA43968A (fr) 2016-02-03 2018-12-12 Univ Pennsylvania Thérapie génique pour traiter la mucopolysaccharidose de type i
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
JP7046828B2 (ja) 2016-04-15 2022-04-04 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 滲出型加齢性黄斑変性の治療のための組成物
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
CA3025975A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Gensight Biologics Sa Optogenetic visual restoration using chrimson
WO2017190125A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Adverum Biotechnologies, Inc. Evasion of neutralizing antibodies by a recombinant adeno-associated virus
WO2017192750A1 (en) * 2016-05-04 2017-11-09 Oregon Health & Science University Recombinant adeno-associated viral vectors
CN109476707B (zh) 2016-05-13 2022-12-02 4D分子治疗有限公司 腺相关病毒变体衣壳和其使用方法
KR102392236B1 (ko) 2016-05-18 2022-05-03 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
SG11201809643UA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
MA44546B1 (fr) * 2016-06-15 2021-03-31 Univ California Virus adéno-associés variants et procédés d'utilisation
KR102622823B1 (ko) * 2016-06-16 2024-01-10 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 안구 혈관신생을 저하시키기 위한 조성물 및 방법
CN117531025A (zh) * 2016-06-16 2024-02-09 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 使用aav2变体和阿柏西普治疗amd
JP7071332B2 (ja) 2016-07-29 2022-05-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 変異カプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法
EP3494220A1 (en) 2016-08-02 2019-06-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating cep290 associated disease
US11298041B2 (en) 2016-08-30 2022-04-12 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
WO2018075798A1 (en) * 2016-10-19 2018-04-26 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified aav capsids and uses thereof
AU2017372351B2 (en) * 2016-11-06 2019-12-12 Nanoscope Technologies Llc Optogenetic modulation by multi-characteristic opsins for vision restoration and other applications thereof
US11236360B2 (en) 2016-12-09 2022-02-01 Regents Of The University Of Minnesota Adeno-associated viruses engineered for selectable tropism
CA3054687A1 (en) * 2017-02-28 2018-09-07 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified aav capsids and uses thereof
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2018170473A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression
WO2018189244A1 (en) * 2017-04-11 2018-10-18 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Adeno-associated virus library
TW201903146A (zh) 2017-04-14 2019-01-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 使用由人類神經或膠細胞產生的重組人類艾杜糖醛酸鹽 (iduronate)-2-硫酸酯酶 (ids) 之黏多醣病ii之治療
WO2018204803A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
CN110913866A (zh) 2017-05-05 2020-03-24 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
EP3645052A4 (en) * 2017-06-30 2021-07-28 Regents of the University of California ADENO-ASSOCIATED VIRUS VIRIONS WITH ASSOCIATED CAPSIDE VARIANTS AND METHODS OF USE
CA3068328A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav9-mediated gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type i
WO2019018342A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. NETWORK EQUIPMENT TRACK GUIDE SYSTEM
BR112020003571A2 (pt) 2017-08-28 2020-08-25 The Regents Of The University Of California variantes capsidiais de vírus adenoassociado e métodos de uso das mesmas
UA127455C2 (uk) 2017-09-20 2023-08-30 4Д Молекьюлар Терапьютикс Інк. Капсид аденоасоційованого вірусу і спосіб його застосування
JP7502991B2 (ja) 2017-10-16 2024-06-19 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
US20200308553A1 (en) * 2017-10-16 2020-10-01 Vigeneron Gmbh Aav vectors
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
EP3697449A1 (en) 2017-10-18 2020-08-26 REGENXBIO Inc. Treatment of ocular diseases and metastatic colon cancer with human post-translationally modified vegf-trap
WO2019079496A2 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Regenxbio, Inc. FULLY HUMAN ANTIBODY-BASED THERAPEUTIC AGENTS HAVING POST-TRANSLATION MODIFICATION
EP3697448A1 (en) * 2017-10-20 2020-08-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of expressing a polynucleotide of interest in the cone photoreceptors of a subject comprising the subretinal delivery of a therapeutically effective amount of a recombinant aav9-derived vector
US11851671B2 (en) 2017-10-23 2023-12-26 Regents Of The University Of Minnesota Programmable assembly of virus composites for receptor-targeted gene delivery
EP4219695A3 (en) 2017-11-27 2024-01-17 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
EP3749754A4 (en) 2018-02-08 2021-10-20 Applied Stemcell, Inc. PROCEDURE FOR SCREENING VARIANTS OF A TARGET
EP3755795A4 (en) 2018-02-19 2022-07-20 Homology Medicines, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR RECOVERING F8 GENE FUNCTION AND METHODS OF USE THEREOF
CN112533644A (zh) * 2018-04-03 2021-03-19 斯特里迪比奥公司 靶向眼组织的病毒载体
WO2019212922A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Regenxbio Inc. Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome content, capsid content and full/empty ratios of adeno-associated virus particles
WO2019212921A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Regenxbio Inc. Scalable clarification process for recombinant aav production
US11987801B2 (en) 2018-05-11 2024-05-21 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Altering tissue tropism of adeno-associated viruses
US11821009B2 (en) 2018-05-15 2023-11-21 Cornell University Genetic modification of the AAV capsid resulting in altered tropism and enhanced vector delivery
KR20210020100A (ko) 2018-06-14 2021-02-23 리젠엑스바이오 인크. 재조합 aav 생성을 위한 음이온 교환 크로마토그래피
WO2019240431A1 (ko) * 2018-06-14 2019-12-19 (주) 에빅스젠 세포 투과 펩티드 및 rpe65의 융합 단백질을 포함하는 레버 선천성 흑암시 치료용 약학적 조성물
CN112703198A (zh) 2018-07-11 2021-04-23 布里格姆妇女医院 用于跨血脑屏障递送试剂的方法和组合物
US20210163991A1 (en) 2018-08-10 2021-06-03 Regenxbio Inc. Scalable method for recombinant aav production
AU2019346447A1 (en) 2018-09-26 2021-04-29 California Institute Of Technology Adeno-associated virus compositions for targeted gene therapy
JP2022514112A (ja) 2018-10-15 2022-02-09 リジェネクスバイオ インコーポレイテッド 複製欠損型ウイルスベクター及びウイルスの感染性を測定するための方法
JP2022515338A (ja) * 2018-12-05 2022-02-18 アビオナ・セラピュ―ティクス・インコーポレイテッド 遺伝子送達のための組み換えアデノ随伴ウイルスベクター
EP3893717A4 (en) * 2018-12-12 2022-09-14 Tesseract Health, Inc. BIOMETRIC IDENTIFICATION METHODS
CN113825521A (zh) * 2018-12-21 2021-12-21 ***合众国由健康及人类服务部部长代表 腺相关病毒及其用于内耳疗法的用途
CN110437317B (zh) * 2019-01-30 2023-05-02 上海科技大学 具有变异衣壳蛋白的腺相关病毒及其用途
EP3924364A1 (en) 2019-02-15 2021-12-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions and methods for producing recombinant aav
MX2021010149A (es) 2019-02-25 2021-09-14 Novartis Ag Composiciones y metodos para tratar la distrofia cristalina de bietti.
US20220154211A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
CA3131919A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Adeno-associated virus vectors for the delivery of therapeutics
CN111621502B (zh) * 2019-02-28 2023-05-02 武汉纽福斯生物科技有限公司 视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用
AU2020231505A1 (en) 2019-03-04 2021-08-19 Adverum Biotechnologies, Inc. Sequential intravitreal administration of AAV gene therapy to contralateral eyes
SG11202110789VA (en) 2019-04-03 2021-10-28 Regenxbio Inc Gene therapy for eye pathologies
TW202102526A (zh) * 2019-04-04 2021-01-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 重組腺相關病毒及其用途
WO2020210600A1 (en) 2019-04-11 2020-10-15 Regenxbio Inc. Methods of size exclusion chromatography for the characterization of recombinant adeno-associated virus compositions
CA3136939A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Regenxbio Inc. Adeno-associated virus vector formulations and methods
KR20220012231A (ko) 2019-04-24 2022-02-03 리젠엑스바이오 인크. 완전-인간 번역 후 변형된 항체 치료제
JP2022530845A (ja) * 2019-04-27 2022-07-04 オクジェン アイエヌシー． 眼疾患に対するａｄｅｎｏ随伴ウイルス連ウイルスベクター媒介遺伝子治療
US11737665B2 (en) 2019-06-21 2023-08-29 Tesseract Health, Inc. Multi-modal eye imaging with shared optical path
AU2020308909A1 (en) 2019-06-27 2022-01-27 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Enhancing AAV-mediated transduction of ocular tissues with hyaluronic acid
US20220251567A1 (en) 2019-07-10 2022-08-11 Inserm (Institut National De La Santè Et De La Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
EP3997214B1 (en) * 2019-07-11 2023-08-02 Centre National de la Recherche Scientifique Chemically-modified adeno-associated virus
US10557149B1 (en) 2019-07-15 2020-02-11 Vigene Biosciences, Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus
US10653731B1 (en) 2019-07-15 2020-05-19 Vigene Biosciences Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency
US10801042B1 (en) 2019-07-15 2020-10-13 Vigene Biosciences, Inc. Use of ion concentrations to increase the packaging efficiency of recombinant adeno-associated virus
CA3145112A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Chunping Qiao Engineered nucleic acid regulatory element and methods of uses thereof
RU2751592C2 (ru) 2019-08-22 2021-07-15 Общество С Ограниченной Ответственностью "Анабион" Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе
KR20220051246A (ko) 2019-08-26 2022-04-26 리젠엑스바이오 인크. 완전 인간 번역 후 변형된 항-VEGF Fab를 사용한 당뇨병성 망막병증의 치료
EP4027983A1 (en) 2019-09-11 2022-07-20 Adverum Biotechnologies, Inc. Methods of treating ocular neovascular diseases using aav2 variants encoding aflibercept
CN114729384A (zh) * 2019-09-12 2022-07-08 博德研究所 工程化腺相关病毒衣壳
GB201913974D0 (en) 2019-09-27 2019-11-13 King S College London Vector
WO2021067598A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Methods for improved therapeutic use of recombinant aav
CN114728049A (zh) 2019-10-07 2022-07-08 再生生物股份有限公司 腺相关病毒载体药物组合物和方法
EP4045664A1 (en) * 2019-10-16 2022-08-24 Wuxi Apptec (Shanghai) Co., Ltd. A novel aav variant
EP4054651A1 (en) * 2019-11-08 2022-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
WO2021099394A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
CN115335529A (zh) * 2019-11-26 2022-11-11 马萨诸塞大学 用于递送kh902(康柏西普)的重组腺相关病毒及其用途
EP4065596A2 (en) 2019-11-28 2022-10-05 RegenxBio Inc. Microdystrophin gene therapy constructs and uses thereof
CN115279400A (zh) 2020-01-10 2022-11-01 布里格姆妇女医院 用于跨血脑屏障递送免疫治疗剂以治疗脑癌的方法和组合物
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
EP4093428A1 (en) 2020-01-22 2022-11-30 RegenxBio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis i with fully-human glycosylated human alpha-l-iduronidase (idua)
CA3168251A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis iva
WO2021154963A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis ii with recombinant human iduronate-2-sulfatase (ids) produced by human neural or glial cells
CA3164714A1 (en) 2020-02-14 2021-08-19 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy for treating cdkl5 deficiency disorder
US20230235353A1 (en) 2020-03-19 2023-07-27 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Compositions and methods for reducing reverse packaging of cap and rep sequences in recombinant aav
EP4127189A1 (en) 2020-03-31 2023-02-08 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy for treating propionic acidemia
US20230159609A1 (en) 2020-04-10 2023-05-25 Sorbonne Université G-protein-gated-k+ channel-mediated enhancements in light sensitivity in rod-cone dystrophy (rcd)
WO2021214282A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for preventing induction of immune responses to the transduced cells expressing a transgene product after ocular gene therapy
EP4103211A4 (en) 2020-04-27 2023-08-23 4D Molecular Therapeutics Inc. CODON OPTIMIZED GLA GENES AND USES THEREOF
KR20230022175A (ko) 2020-05-13 2023-02-14 보이저 테라퓨틱스, 인크. Aav 캡시드의 향성 방향변경
EP4179091A1 (en) 2020-07-10 2023-05-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale - Inserm Methods and compositions for treating epilepsy
JP2023538129A (ja) * 2020-08-21 2023-09-06 カプシダ， インコーポレイテッド 好ましい発現レベルを有するアデノ随伴ウイルス組成物
CN112226461B (zh) * 2020-08-21 2022-04-22 华侨大学 Cd4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用
WO2022060915A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Regenxbio Inc. Vectorized lanadelumab and administration thereof
WO2022060916A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Regenxbio Inc. Vectorized antibodies for anti-viral therapy
CN113717248B (zh) * 2020-09-30 2022-07-08 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用
WO2022076750A2 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns or muscle delivery
WO2022076549A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Formulations for suprachoroidal administration such as high viscosity formulations
WO2022076595A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Formulations for suprachoroidal administration such as gel formulations
EP4225777A2 (en) 2020-10-07 2023-08-16 RegenxBio Inc. Adeno-associated viruses for ocular delivery of gene therapy
JP2023544799A (ja) 2020-10-07 2023-10-25 レジェンクスバイオ インコーポレーテッド 凝集体形成物を含む製剤などの脈絡膜上投与用の製剤
AU2021371307A1 (en) 2020-10-28 2023-06-01 Regenxbio, Inc. VECTORIZED ANTI-TNF-α ANTIBODIES FOR OCULAR INDICATIONS
WO2022094157A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Regenxbio Inc. Vectorized anti-cgrp and anti-cgrpr antibodies and administration thereof
IL302282A (en) 2020-10-29 2023-06-01 Regenxbio Inc Vectored TNF-alpha antagonists for ocular indications
EP4236974A2 (en) 2020-10-29 2023-09-06 RegenxBio Inc. Vectorized factor xii antibodies and administration thereof
US20240002839A1 (en) 2020-12-02 2024-01-04 Decibel Therapeutics, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
EP4263575A1 (en) * 2020-12-16 2023-10-25 Children's Medical Research Institute Adeno-associated virus capsids and vectors
CA3201743A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Robert STADELMAN Method of producing a recombinant adeno-associated virus particle
TW202241943A (zh) 2020-12-29 2022-11-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 Tau特異性抗體基因療法組合物、方法及其用途
US20240084329A1 (en) 2021-01-21 2024-03-14 Regenxbio Inc. Improved production of recombinant polypeptides and viruses
AU2022221284A1 (en) 2021-02-10 2023-08-17 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis ii with recombinant human iduronate-2-sulfatase (ids)
CN113121651B (zh) * 2021-04-19 2023-11-17 信念医药科技(上海)有限公司 低中和抗体腺相关病毒衣壳蛋白
CN113121652B (zh) * 2021-04-19 2022-10-11 上海信致医药科技有限公司 视网膜和肌肉高亲和性腺相关病毒衣壳蛋白及相关应用
EP4326339A2 (en) 2021-04-20 2024-02-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Compositions and methods for treating retinal degenerative disorders
JP2024517143A (ja) 2021-04-26 2024-04-19 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド ジストロフィン異常症の治療のためのマイクロジストロフィン遺伝子療法投与
KR20240005764A (ko) 2021-04-27 2024-01-12 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 아플리베르셉트를 코딩하는 aav2 변이체를 사용하여 안구 질환을 치료하는 방법
EP4334454A2 (en) 2021-05-04 2024-03-13 RegenxBio Inc. Novel aav vectors and methods and uses thereof
WO2022241030A1 (en) 2021-05-11 2022-11-17 Regenxbio Inc. Treatment of duchenne muscular dystrophy and combinations thereof
KR20240035759A (ko) 2021-05-26 2024-03-18 스페어링비젼 막대세포-원추세포 이상증(rcd)에서 g-단백질-개폐-k+ 채널-매개 감광성 향상
CA3219898A1 (en) * 2021-05-28 2023-11-21 Wentao Zhang Recombinant adeno-associated virus having variant capsid, and application thereof
EP4346767A1 (en) * 2021-06-03 2024-04-10 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid variants and methods of using the same
WO2023280926A1 (en) 2021-07-07 2023-01-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Synergistic combination of rdcfv2 and rdcvf2l for the treatment of tauopathies
EP4367251A1 (en) 2021-07-08 2024-05-15 Tenaya Therapeutics, Inc. Optimized expression cassettes for gene therapy
EP4373947A1 (en) 2021-07-19 2024-05-29 New York University Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease
WO2023019168A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Compositions and methods for treating a muscular dystrophy
AR126840A1 (es) 2021-08-20 2023-11-22 Llc «Anabion» Proteína de la cápside vp1 modificada aislada del virus adeno-asociado de serotipo 5 (aav5), cápside y vector basado en esta
AR126839A1 (es) 2021-08-20 2023-11-22 Llc «Anabion» Proteína de la cápside vp1 modificada aislada del virus adeno-asociado de serotipo 9 (aav9), cápside y vector basado en esta
WO2023022631A1 (ru) 2021-08-20 2023-02-23 Акционерное общество "БИОКАД" Способ получения модифицированного капсида аденоассоциированного вируса
CN118202060A (zh) 2021-10-05 2024-06-14 再生生物股份有限公司 用于重组aav生产的组合物和方法
WO2023060113A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2023060272A2 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
WO2023060269A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for targeted delivery
EP4163296A1 (en) 2021-10-11 2023-04-12 Sparingvision G-protein-gated-k+ channel-mediated enhancements in light sensitivity in patients with rod-cone dystrophy (rcd)
WO2023077092A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof
WO2023108507A1 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 National Institute Of Biological Sciences, Beijing Recombinant aav vectors and use thereof
WO2023150566A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Adverum Biotechnologies, Inc. Methods of treating ocular neovascular diseases using aav2 variants encoding aflibercept
WO2023158990A1 (en) 2022-02-16 2023-08-24 Adverum Biotechnologies, Inc. Method of reducing cst fluctuation in neovascular amd by a recombinant adeno-associated virus
WO2023155828A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Skyline Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Recombinant adeno-associated virus with modified aav capsid polypeptides
WO2023172491A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Modified batch aav production systems and methods
WO2023178053A1 (en) 2022-03-13 2023-09-21 Regenxbio Inc. Modified muscle-specific promoters
WO2023183623A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Regenxbio Inc. Dominant-negative tumor necrosis factor alpha adeno-associated virus gene therapy
TW202345913A (zh) 2022-04-06 2023-12-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如凝膠調配物
TW202404651A (zh) 2022-04-06 2024-02-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如形成聚集體之調配物
WO2023196873A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Regenxbio Inc. Pharmaceutical composition comprising a recombinant adeno-associated virus vector with an expression cassette encoding a transgene forsuprachoidal administration
WO2023201207A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
WO2023201277A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
WO2023201308A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Regenxbio Inc. Gene therapy for treating an ocular disease
CN116970648A (zh) * 2022-04-24 2023-10-31 上海朗昇生物科技有限公司 新型aav衣壳改造株及其用途
WO2023215807A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Regenxbio Inc. VECTORIZED ANTI-TNF-α INHIBITORS FOR OCULAR INDICATIONS
TW202400803A (zh) 2022-05-03 2024-01-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 載體化抗補體抗體與補體劑及其投與
WO2023240062A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Adverum Biotechnologies, Inc. Melanopsin variants for vision restoration
WO2023239627A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Regenxbio Inc. Methods for recombinant aav production
WO2024017990A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating chronic pain disorders
WO2024033837A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Institute Of Molecular And Clinical Ophthalmology Basel (Iob) Human cone photoreceptor optogenetic constructs
WO2024044725A2 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses and uses thereof
WO2024073669A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Regenxbio Inc. Treatment of ocular diseases with recombinant viral vectors encoding anti-vegf fab
WO2024081746A2 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof
WO2024084075A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Sparingvision Compositions and methods for treating retinal degenerative disorders
EP4357359A1 (en) 2022-10-20 2024-04-24 Sparingvision G-protein-gated-k+ channel-mediated enhancements in light sensitivity in rod-cone dystrophy (rcd)
WO2024107670A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins comprising membrane bound il-12 with protease cleavable linkers

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9206016D0 (en) 1992-03-19 1992-04-29 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5639872A (en) 1993-07-27 1997-06-17 Hybridon, Inc. Human VEGF-specific oligonucleotides
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US6001650A (en) * 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
AU1686997A (en) 1995-12-08 1997-06-27 Hybridon, Inc. Modified vegf antisense oligonucleotides for treatment of skin disorders
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
AU2678097A (en) 1996-04-16 1997-11-07 Immusol Incorporated Targeted viral vectors
US20030215422A1 (en) 1996-09-11 2003-11-20 John A. Chiorini Aav4 vector and uses thereof
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6710036B2 (en) 1997-07-25 2004-03-23 Avigen, Inc. Induction of immune response to antigens expressed by recombinant adeno-associated virus
WO1999014354A1 (en) 1997-09-19 1999-03-25 The Trustees Of The University Of The Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
AU1449499A (en) 1997-10-31 1999-05-24 Maxygen, Incorporated Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
US6410300B1 (en) 1998-01-12 2002-06-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and formulations for mediating adeno-associated virus (AAV) attachment and infection and methods for purifying AAV
US6551795B1 (en) 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
ATE402254T1 (de) 1998-05-28 2008-08-15 Us Gov Health & Human Serv Aav5 vektoren und deren verwendung
DE19827457C1 (de) 1998-06-19 2000-03-02 Medigene Ag Strukturprotein von AAV, seine Herstellung und Verwendung
EP1109925B1 (en) * 1998-09-11 2005-05-04 The Regents of The University of California Recombinant adenovirus for tissue specific expression in heart
JP4573437B2 (ja) 1998-11-05 2010-11-04 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス血清型１核酸配列、ベクターおよび同一物を含有する宿主細胞
WO2000028004A1 (en) 1998-11-10 2000-05-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Virus vectors and methods of making and administering the same
US6943153B1 (en) 1999-03-15 2005-09-13 The Regents Of The University Of California Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
US6498244B1 (en) 1999-05-28 2002-12-24 Cell Genesys, Inc. Adeno-associated virus capsid immunologic determinants
US7314912B1 (en) 1999-06-21 2008-01-01 Medigene Aktiengesellschaft AAv scleroprotein, production and use thereof
DE19933288A1 (de) 1999-07-15 2001-01-18 Medigene Ag Strukturprotein von Adeno-assoziiertem Virus mit veränderter Antigenität, seine Herstellung und Verwendung
DE19933719A1 (de) 1999-07-19 2001-01-25 Medigene Ag Strukturprotein in Adeno-assoziiertem Virus mit veränderten chromatographischen Eigenschaften, seine Herstellung und Verwendung
US8232081B2 (en) 1999-09-21 2012-07-31 Basf Se Methods and microorganisms for production of panto-compounds
DE10001363A1 (de) 2000-01-14 2001-07-26 Windmoeller & Hoelscher Extruderdüsenkopf
WO2002081628A2 (en) 2001-04-05 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth, using nucleic acid based technologies
US6855314B1 (en) 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
EP1356070A2 (en) * 2000-09-22 2003-10-29 Virxsys Conditionally replicating viral vectors and their use
US6962815B2 (en) * 2001-01-05 2005-11-08 Children's Hopital Inc. AAV2 vectors and methods
US7749492B2 (en) * 2001-01-05 2010-07-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. AAV vectors and methods
US20030144221A1 (en) 2001-07-17 2003-07-31 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of BCL2-associated X protein expression
US7647184B2 (en) 2001-08-27 2010-01-12 Hanall Pharmaceuticals, Co. Ltd High throughput directed evolution by rational mutagenesis
US20030129203A1 (en) * 2001-08-27 2003-07-10 Nautilus Biotech S.A. Mutant recombinant adeno-associated viruses
WO2003042361A2 (en) 2001-11-09 2003-05-22 Government Of The United States Of America, Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
NZ600121A (en) 2001-11-13 2013-12-20 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
WO2003054197A2 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Medigene Ag A library of modified structural genes or capsid modified particles useful for the identification of viral clones with desired cell tropism
DE10216005A1 (de) 2002-04-11 2003-10-30 Max Planck Gesellschaft Verwendung von biologischen Photorezeptoren als direkt lichtgesteuerte Ionenkanäle
US20060292117A1 (en) 2002-04-17 2006-12-28 Loiler Scott A Improved rAAv vectors
WO2003093436A2 (en) 2002-04-30 2003-11-13 University Of Florida Treatment for phenylketonuria
AU2003223775A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 Duke University Adeno-associated viral vectors and methods for their production from hybrid adenovirus and for their use
US7254489B2 (en) 2002-05-31 2007-08-07 Microsoft Corporation Systems, methods and apparatus for reconstructing phylogentic trees
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
AU2003265855A1 (en) 2002-08-28 2004-03-19 University Of Florida Modified aav
WO2004056080A1 (en) * 2002-12-18 2004-07-01 Novartis Ag Endothelial cell specifically binding peptides
WO2004083441A2 (en) 2003-03-19 2004-09-30 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Random peptide library displayed on aav vectors
WO2004108922A2 (en) 2003-04-25 2004-12-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of aav comprising a capsid protein from aav7 or aav8 for the delivery of genes encoding apoprotein a or e genes to the liver
US7611868B2 (en) * 2003-05-14 2009-11-03 Instituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Recombinant modified adenovirus fiber protein
EP1486567A1 (en) 2003-06-11 2004-12-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved adeno-associated virus (AAV) vector for gene therapy
PL1633772T3 (pl) 2003-06-19 2016-10-31 Wiriony AAV o zmniejszonej immunoreaktywności i ich zastosowanie
EP1644038A2 (en) 2003-06-23 2006-04-12 A & G Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for restoring sensitivity of tumor cells to antitumor therapy and inducing apoptosis
US9441244B2 (en) * 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
EP1670897A4 (en) 2003-09-24 2008-02-27 Univ Leland Stanford Junior IGF-1 MULTIPOTENTE ADULTS HAS NEW NEURAL CNS STEM CELLS INTO AN OLIGOD DROGLIA CELLINE
JP5054975B2 (ja) 2003-09-30 2012-10-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）の同源系統群、配列、それらを含有するベクターおよびそれらの用途
KR100550967B1 (ko) 2003-12-03 2006-02-13 주식회사 엘지생활건강 유중수형 화장료 조성물
EP2899278A1 (en) 2004-03-12 2015-07-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc. iRNA agents targeting VEGF
US7427396B2 (en) 2004-06-03 2008-09-23 Genzyme Corporation AAV vectors for gene delivery to the lung
AU2005316476A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric vectors
US20060211650A1 (en) 2004-12-16 2006-09-21 Forest Laboratories, Inc. Reducing carbohydrate derivatives of adamantane amines, and synthesis and methods of use thereof
US20100172871A1 (en) 2005-02-17 2010-07-08 Flannery John G Muller Cell Specific Gene Therapy
JP5702519B2 (ja) 2005-04-07 2015-04-15 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａａｖベクターの機能を上げる方法
US20070053996A1 (en) 2005-07-22 2007-03-08 Boyden Edward S Light-activated cation channel and uses thereof
CN1834255A (zh) * 2005-12-23 2006-09-20 上海交通大学附属第一人民医院 加快并提高腺相关病毒介导的基因在视网膜细胞内表达的方法
US7867484B2 (en) 2006-01-27 2011-01-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Heparin and heparan sulfate binding chimeric vectors
WO2007120542A2 (en) 2006-03-30 2007-10-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid library and aav capsid proteins
JP2009536219A (ja) * 2006-05-04 2009-10-08 ウェイン・ステート・ユニバーシティー ロドプシン拡散のインビボ送達による視覚応答の回復
RU2457252C2 (ru) * 2006-06-21 2012-07-27 Амстердам Молекьюла Терапьютикс (Амт) Ип Б.В. AAV ВЕКТОРЫ С УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫМИ Rep-КОДИРУЮЩИМИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫМИ В СИСТЕМАХ ПРОДУКЦИИ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ
US7872118B2 (en) 2006-09-08 2011-01-18 Opko Ophthalmics, Llc siRNA and methods of manufacture
CN1966082B (zh) * 2006-11-03 2010-06-30 许瑞安 一种防治结直肠癌的基因药物及其制备方法和用途
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
EP2147096B1 (en) 2007-04-13 2015-03-25 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor VII polypeptides and uses thereof
EP1985708B1 (en) * 2007-04-27 2015-04-15 Universität Rostock Selective targeting of viruses to neural precursor cells
US8632764B2 (en) * 2008-04-30 2014-01-21 University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
CN102159713A (zh) 2008-05-20 2011-08-17 Eos神经科学公司 用于递送光敏蛋白的载体和使用方法
US20110171262A1 (en) 2008-06-17 2011-07-14 Andrew Christian Bakker Parvoviral capsid with incorporated gly-ala repeat region
WO2010093784A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
CN101532024A (zh) * 2009-04-30 2009-09-16 许瑞安 一种用于基因治疗的新型细胞特异性内含microRNA结合序列的基因HAAVmir
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
EP2550021A2 (en) 2010-03-22 2013-01-30 Association Institut de Myologie Methods of increasing efficiency of vector penetration of target tissue
CA2798988C (en) 2010-05-17 2020-03-10 Sangamo Biosciences, Inc. Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof
US8663624B2 (en) * 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
CA2826273C (en) * 2011-02-10 2021-11-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Viral vectors with modified transduction profiles and methods of making and using the same
RS60207B1 (sr) 2011-04-22 2020-06-30 Univ California Adeno-povezani virioni virusa sa varijantama kapsida i postupci za njihovu primenu
US9169299B2 (en) 2011-08-24 2015-10-27 The Board Of Trustees Of The Leleand Stanford Junior University AAV capsid proteins for nucleic acid transfer
US9677088B2 (en) 2012-05-09 2017-06-13 Oregon Health & Science University Adeno associated virus plasmids and vectors
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
US9938541B2 (en) 2012-12-25 2018-04-10 Takara Bio Inc. AAV variant
EP2954051B1 (en) 2013-02-08 2019-03-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified aav8 capsid for gene transfer for retinal therapies
JP6670743B2 (ja) 2013-05-29 2020-03-25 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｉｉ型ｃｒｉｓｐｒシステムにおける新規のコンパクトなｃａｓ９足場
US11136557B2 (en) 2013-05-31 2021-10-05 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
EP3633041A3 (en) 2013-09-26 2020-07-29 University of Florida Research Foundation, Inc. Synthetic combinatorial aav capsid library for targeted gene therapy
CN106232618A (zh) 2013-10-11 2016-12-14 马萨诸塞眼科耳科诊所 预测祖先病毒序列的方法及其用途
SG10201810150UA (en) 2014-03-17 2018-12-28 Adverum Biotechnologies Inc Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
IL292951B1 (en) 2014-05-02 2024-06-01 Genzyme Corp AAV vectors for gene therapy in the central nervous system and retina
CA2951707A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
AU2016226289B2 (en) 2015-03-02 2021-04-29 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
US20180043034A1 (en) 2015-03-06 2018-02-15 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Gene augmentation therapies for inherited retinal degeneration caused by mutations in the prpf31 gene
WO2017023724A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of aadc deficiency
CN109476707B (zh) 2016-05-13 2022-12-02 4D分子治疗有限公司 腺相关病毒变体衣壳和其使用方法
BR112020003571A2 (pt) 2017-08-28 2020-08-25 The Regents Of The University Of California variantes capsidiais de vírus adenoassociado e métodos de uso das mesmas

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US20190218627A1 (en) 2019-07-18
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BR112013027120A2 (pt) 2017-08-01
PT3693025T (pt) 2022-01-20
SI2699270T1 (sl) 2017-11-30
IL228976A0 (en) 2013-12-31
CY1124905T1 (el) 2023-01-05
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PT2699270T (pt) 2017-08-30
DK3254703T3 (da) 2020-05-11

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