DK176102B1 - Muterede subtilisin-gener - Google Patents
Muterede subtilisin-gener Download PDFInfo
- Publication number
- DK176102B1 DK176102B1 DK199600361A DK36196A DK176102B1 DK 176102 B1 DK176102 B1 DK 176102B1 DK 199600361 A DK199600361 A DK 199600361A DK 36196 A DK36196 A DK 36196A DK 176102 B1 DK176102 B1 DK 176102B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- subtilisin
- residue
- amino acid
- substituted
- mutant
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
i DK 176102 B1
Den foreliggende opfindelse angår mutant subtilisinenzym, kendetegnet ved, at det har en - aminosyresekvens med mindst . 80% homologi med 1 aminosyresekvensen for subtilisin 309 som angivet i Tabel - 5 1(a), som kan fremstilles af B. lentus C360 (NCIB 10309), og at aminosyreresten ved en eller flere af positionerne: 6, 9, 11, 12, 19, 25, 37, 38, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 68, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121, 122, 140, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 226, 234, 235, 236, 237, 238, 241, 260, 10 261, 262, 265, 268 eller 275 ændres ved substitution med en anden aminosyrerest, eller, at en eller flere aminosyrerester indsættes ved en eller flere af positionerne: 36, 56, 159 eller 164-165. Mutationer ved specifikke nucleinsyrer i subtilisingenet medfører 15 aminosyresubstitutioner og dermed ændret enzymfunktion. Nogle af disse muterede enzymer udviser fysiske egenskaber, som er fordelagtige ved industriel anvendelse, især inden for detergentindustrien, idet de giver subtilisin, som er mere stabilt over for oxidation, har større proteaseaktivitet og 20 udviser forbedrede vaskeegenskaber.
Enzymer, der spalter amidbindingerne i proteinsubstrater klassificeres som proteaser, eller (alternativt) peptidaser (se Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms, 25 w.H. Freeman and Company, San Francisco, kap. 3),. Bakterier af Bacillus-arten secernerer to ekstracellulære proteaser , en neutral eller metalloprotease, og en alkalisk protease, som funktionelt er en serin endopeptidase, omtalt som subtilisin. Secernering af disse proteaser er blevet sammenkædet med den 30 bakterielle vækstcyklus med størst udtrykkelse af protease i den stationære fase, hvor sporedannelse også finder sted. Joliffe et al. (1980, J. Bacteriol 141: 1199-1208) har foreslået, at Bacillus-proteaser fungerer i cellevægsudskift- 4 ningen.
En serinprotease er et enzym, som katalyserer hydro- 35 2 DK 176102 B1 lysen af. peptidbindinger, i hvilke der er en essentiel serin-rest ved den aktive position (White, Handler og Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," 5. udg., McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272). i 5 Serinproteaseme har en molekylvægt inden for området 25.000 til 30.000. De inhiberes af diisopropylfluorofosfat, men i modsætning til metalloproteaser er de modstandsdygtige over for ethylenediamin-tetraeddikesyre (EDTA) (skønt de stabiliseres ved høj temperatur af kalciumioner). De hydroly-10 serer simple terminale estre og med hensyn til aktivitet ligner de eukaryotisk chymotrypsin, som også er en serinprotease.
Det andet udtryk, alkalisk protease, genspejler serinpro-teasens høje pH-optimum, fra pH 9,0 til 11,0 (se Priest, 1977, Bacteriological Rev. 41: 711-753).
15 Subtilisin er en serinprotease produceret af gram positive bakterier eller svampe. En lang række subtilisiner er identificeret, og aminosyresekvenserne fra mindst otte subtilisiner er bestemt. Disse omfatter seks subtilisiner fra Bacillus-stammer, nemlig subtilisin 168, subtilisin BPN', 20 subtilisin Carlsberg, subtilisin DY, Subtilisin amylosacchari-ticus og mesentericopeptidase (Kurihara et al., 1972, J.Biol.Chem. 247; 5629-5631,- Stahl og Ferrari, 1984, J.Bac- teriol. 158: 411-418; Vasantha et al., 1984, J.Bacteriol. 159: 811-819; Jacobs et al., 1985, Nucl.Acids Res. 13: 8913-8926; 25 Nedkov et al., 1985, Biol.Chem. Hoppe-Seyler 366: 421-430;
Svendsen et al., 1986, FEBS Lett 196: 228-232), og to svampe-subtilisiner, subtilisin thermitase fra Thermoactinomyces vulgaris (Meloun et al., 1985, FEBS. Lett. 183: 195-200) og proteinase K fra Tritirachium album (Jany og Mayer, 1985, 30 Biol.Chem. Hoppe-Seyler 366: 485-492).
Subtilisiner er velkarakteriserede fysisk og kemisk.
Ud over kendskab til den primære struktur (aminosyresekvenser) hos disse enzymer er mere end 50 højopløsningsrøntgenstrukturer af subtilisin blevet bestemt, som aftegner sub-35 stratbinding, overgangstilstand, produkter, tre forskellige proteaseinhibitorer og definerer de strukturelle konsekvenser for naturlig variation (Kraut, 1977, Ann.Rev.Biochem. £6: 331- 3 DK 176102 B1 358). Tilfældige og stedsrettede mutationer af subtilisingenet er både opstået ud fra kendskab til de fysiske og kemiske egenskaber hos enzymer og har bidraget med oplysninger om ' subtilisins katalytiske aktivitet, substratspecificitet, - 5 tertiære struktur, etc. {Wells et al., 1987,
Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 84: 1219-1223; Wells et al., 1986,
Phil.Trans.R.Soc.Lond.A. 317: 415-423; Hwang og Warshel, 1987, Biochem. 26: 2669-2673; Rao et al., 1987, Nature 328: 551-554) .
10 Subtilisiner har fundet udbredt anvendelse inden for industrien, især detergentformuleringer, da de er nyttige til fjernelse af proteinholdige pletter. For at være effektive skal disse enzymer imidlertid ikke blot være aktive under vaskeforhold, men skal også være forenelige med andre deter-15 gentkomponenter under opbevaring. For eksempel kan subtilisin anvendes sammen med amylaser, som er aktive over for stivelse,-cellulaser, som vil nedbryde cellulosemateriale; lipaser, som er aktive over for fedt; peptidaser, som aktive over for peptider og ureaser, som er effektive over for urinpletter.
20 Formuleringen skal ikke blot beskytte andre enzymer mod nedbrydning fra subtilisin, men subtilisin skal være stabilt med hensyn til oxidation, kalciumbindende egenskaber, deter-gens og højt pH hos ikke-enzymatiske detergentkomponenter. Enzymets evne til at forblive stabilt i deres nærvær omtales 25 ofte som dets vaskeevne eller vaskeegenskaber.
I en artikel (Estell et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:6518-6521) beskrives stedsrettet mutagenese anvendt til at erstatte methionin i position 222 i subtilisin BPN' med alle 30 19 aminosyrer. Det fandtes, at ved substitution ændredes de relative specifikke aktiviteter overfor substratet N-succinyl- L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid sig med 138% til 0,3% i forhold til vildtype subtilisin BPN', idet Cys substitutionen havde den højeste aktivitet. Ala- og Ser-substitutionerne 35 havde henholdsvis 53% og 35% af vildtypens aktivitet. Samtidig fandtes det, at Ala- og Ser-substituenteme havde forbedret resistens mod oxidation med H2Q2.
4 DK 176102 B1
Subtilisiner har fundet udbredt anvendelse inden for industrien, især detergentformuleringer, da de er nyttige til fjernelse af proteinholdige pletter. For at være effektive 5 skal disse enzymer imidlertid ikke blot være aktive under vaskeforhold, men skal også være forenelige med andre detergentkomponenter under opbevaring. For eksempel kan subtilisin anvendes sammen med amylaser, som er aktive over for stivelse; cellulaser, som vil nedbryde cellulosemateriale; lipaser, som 10 er aktive over for fedt; peptidaser, som aktive over for peptider og ureaser, som er effektive over for urinpletter. Formuleringen skal ikke blot beskytte andre enzymer mod nedbrydning fra subtilisin, men subtilisin skal være stabilt med hensyn til oxidation, kalciumbindende egenskaber, deter-15 gens og højt pH hos ikke-enzymatiske detergentkomponenter. Enzymets evne til at forblive stabilt i deres nærvær omtales ofte som dets vaskeevne eller vaskeegenskaber.
US patent nr. 3.770.587, der angår kemisk modifikation af proteolytiske enzymer, anvender således 20 sammenligninger mellem udgangsenzymet og det modificerede enzym i detergenter for at bestemme brugbarheden af de modificerede proteolytiske enzymer.
Den foreliggende opfindelse angår mutant 25 subtilisinenzym, kendetegnet ved, at det har en aminosyresekvens med mindst 80% homologi med aminosyresekvensen for subtilisin 309 som angivet i Tabel 1(a), som kan fremstilles af B. lentus C360 (NCIB 10309), og at aminosyreresten ved en eller flere af positionerne: 30 6, 9, 11, 12, 19, 25, 37, 38, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 68, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121, 122, 140, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 226, 234, 235, 236, 237, 238, 241, 260, 261, 262, 265, 268 eller 275 ændres ved substitution med en anden aminosyrerest, eller, 35 at en eller flere aminosyrerester indsættes ved en eller flere af positionerne: 36, 56, 159 eller 164-165. Mutationerne 5 DK 176102 B1 skabes ved specifikke nucleinsyrer i subtilisingenet, og i forskellige specifikke udførelsesformer besidder de muterede enzymer ændrede kemiske egenskaber omfattende, men ikke begrænset til forøget stabilitet over for oxidation, øget 5 proteolytisk evne og forbedret vaskeevne.
Den foreliggende opfindelse angår også, men er ikke begrænset til aminosyre- og DNA-sekvenserne for to proteaser hidrørende fra Bacillus lentus varianter, subtilisin 147 og subtilisin 309 så vel som mutationer af disse gener og tilsva-10 rende muterede enzymer.
Stedsrettet mutation kan effektivt fremstille muterede subtilisinenzymer, som kan tildannes til at passe til en række industrielle anvendelser, især inden for områderne detergent-og fødevareindustri. Den foreliggende opfindelse 15 angår delvist, men er ikke begrænset til mutanter af subtilisin 309 genet, som udviser forbedret stabilitet over for oxidation, forøget proteaseaktivitet, og/eller forbedret vaskeevne.
20 Forkortelser A = Ala = Alanin V = Val = Valin L = Leu = Leucin I = Ile = Isoleucin 25 P = Pro = Prolin F = Phe = Phenylalanin W = Trp = Tryptophan M = Met = Methionin G - Gly = Glycin 30 S = Ser = Serin T = Thr = Threonin C = Cys = Cystein Y = Tyr = Ty ros in N = Asn = Asparagin 35 Q Gin = Glutamin D = Asp = Asparaginsyre E = Glu = Glutaminsyre 6 DK 176102 B1 K = Lys = Lysin R = Arg = Arginin H = His = Histidin 5
Beskrivelse af figurerne
Figur 1 illustrerer indsættelsen af en delmængde af fragmenter, hvis længder ligger i området fra 1,5 kb til 6,5 10 kb, frembragt ved delvis nedbrydelse af Bacillus lentus stamme 309 DNA med Sau 3A restriktionsendonuclease til Barn HI skåret plasmid pSX50. De to resulterende plasmider, pSX86 og pSX88 indeholdende subtilisin 309 genet i modsatte retninger er også vist.
15 Figur 2 illustrerer indsættelsen af Bacillus lentus stamme 147 DNA fragmenter i plasmid pSX86. Delvis nedbrydning af stamme 147 DNA blev udført med Sau 3A restriktionsendonuclease. Fragmenter med størrelser i området fra 1,5 til 6,5 kb blev derpå ligeret i Barn HI spaltet plasmid pSX56.
20 Produktet, pSX94 indeholder subtilisin 147 genet.
Figur 3 illustrerer åben dobbelt mutagenese under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Morinaga et al., (1984, Biotechnology 2: 636-639). Den viser to plasmider, pSX93 og pSC119, begge stammende fra puC13. pSX93 indeholder et Xbal-25 Hindlll fragment af subtilisin 309 genet, og pSX119 indeholder resten af subtilisin 309 genet i et EcoRI-Xbal fragment. I (A) , spaltes plasmid pSX93 med Xbal og Clal, og de åbne molekyler blandes med pSX93 skåret med SacI, denatureres og baseparres igen til frembringelse af plasmider med en enkelt-30 strenget DNA region, som strækker sig inden for subtilisin 309 kodningssekvensen. Et syntetisk oligonucleotid, homologt med subtilisin 309 genet, men indeholdende en mutation, baseparres med den enkeltstrengede åbning, som derpå udfyldes, idet Klenow-fragmentet af DNA polymerase I og T4 DNA ligase anven-35 des. Ved replikation af plasmidet dannes dobbeltstrengede mutanter af subtilisin 309 genet. Samme fremgangsmåde anvendes i (B), idet plasmid pSX119 og EcoRI og Xbal enzymer anven- 7 DK 176102 B1 des til dannelse af mutationer i den tilsvarende region af subtilisin 309 genet.
Figur 4 illustrerer plasmid pSX92, som er et derivat af plasmid pSX62 bærende subtilisin 309 genet. Muterede frag-5 menter (d.v.s. Xbal - Clal, Xbal - Hindlll, eller EcoRI -Xbal), skåret ud af mutationsplasmiderne pSX93 eller pSX119 (se fig. 3) under anvendelse af de relevante restriktionsendo-nucleaser, blev indsat i plasmid pSX92 til ekspression i B. subtilis stamme DN 497.
10 Figur 5 illustrerer plasmid pSX143, som indeholder trunkerede former både af subtilisin 309 og subtilisin 147 genet. In vivo rekombination mellem homologe regioner af disse to gener kan resultere i aktive proteaser.
15 Opfindelsen angår mutationer af subtilisingenet, hvoraf nogle resulterer i ændringer i de kemiske karakteristika af subtilisinenzymet. Mutationer ved specifikke nuclein-syrer kan frembringes, og subtilisinformer kan udformes således, at de kan imødekomme behov ved industriel anvendelse.
20 Opfindelsen bygger delvist på den opdagelse, at mutationer af specifikke nucleinsyrer i subtilisingenet kan resultere i enzymer med ændrede egenskaber. I forskellige udførelsesformer kan der frembringes enzymer med forbedret stabilitet over for oxidation, forøget proteaseaktivitet eller 25 forbedret vaskeevne.
Med henblik på beskrivelsens klarhed og ikke for at begrænse opfindelsen skal den beskrives i fire dele: (a) den kemiske struktur hos kendte subtilisiner og subtilisin 147 og 309; (b) fremgangsmåder til fremstilling af mutationer af 30 subtilisingenet; (c) ekspression af mutanter af subtilisin og (d) screening af subtilisinmutanter for ønskede kemiske egenskaber .
Kemiske strukturer hos kendte subtilisiner og subtilisin 147 35 og 309
Sekvensanalyse af subtilisin fra forskellige kilder kan afsløre den funktionelle betydning af den primære amino- 8 DK 176102 B1 syresekvens, og kan styre dannelsen af hidtil ukendte mutanter med bevidst modificerede funktioner. Sammenligning af amino-syresekvensen for forskellige subtilisin, medens deres fysiske eller kemiske egenskaber stilles over for hinanden, kan 5 afsløre specifikke målregioner, som sandsynligvis kan fremstille nyttige mutantenzymer.
Aminosyresekvenseme fra mindst otte subtilisiner er kendt. Disse omfatter seks subtilisiner fra Bacillus stammer, nemlig subtilisin 168, subtilisin BPN', subtilisin Carlsberg, 10 subtilisin DY, subtilisin amylosacchariticus og mesenterico-peptidase (Kurihara et al., 1972, J.Biol.Chem. 247: 5629 - 5631; Stahl og Ferrari, 1984, j.Bacteriol. 158; 411 - 418;
Vasantha et al., 1984, J.Bacteriol. 159: 811 - 819, Jacobs et al., 1985, Nucl.Acids Res. 13: 8913 - 8926; Nedkov et al., 15 1985, Biol.Chem. Hoppe-Seyler 366: 421 - 430; Svendsen et al., 1986, FEBS Lett. 196: 228 - 232), og to svampesubtilisiner, subtilisin thermitase fra Thermoactinomyces vulgaris (Meloun et al., 1985, FEBS Lett. 183: 195 - 200) og proteinase K fra Tritirachium album limber (Jany og Mayer, 1985, Biol.Chem.
20 Hoppe-Seyler 366: 485-492).
I forbindelse med den foreliggende opfindelse anføres aminosyresekvenseme og .DNA-sekvenserne for to yderligere serinproteaser. Disse proteaser fås fra to Bacillus lentus varianter, 147 og 309, som er deponeret hos NCIB og tildelt 25 accessionsnumrene henholdsvis NCIB 10147 og NCIB 10309.
Deponeringerne skete henholdsvis 26. januar 1968 og 9. september 1968. Med hensyn til Budapesttraktaten anses deponeringsdatoen at være 31. marts 1982.
For bekvemmelighedens skyld benævnes proteaserne 30 fremstillet ud fra disse stammer henholdsvis subtilisin 147 og subtilisin 309, og generne, der koder for disse proteiner, betegnes subtilisin 147 og 309 generne.
I den foreliggende opfindelse anvendes udtrykket "subtilisinmateriale" til at betegne et proteinmateriale, som 35 indeholder en subtilisin som dets aktive ingrediens. Som det anvendes her og under definitionen af subtilisinmateriale, er en hvilken som helst serinprotease en subtilisin, som har 9 DK 176102 B1 mindst 80% aminosyresekvenshomologi med sekvenserne, der omtales ovenfor for subtilisin 309. Disse serinproteaser beskrives også heri som "homologe serinproteaser".
Tabel I sammenligner de afledte aminosyresekvenser 5 fra subtilisin 309, subtilisin 147, subtilisin BPN', subtilisin Carlsberg og subtilisin 168 (Spizizen et al., 1958,
Proc .Natl-Acad. Sci. U.S.A. 44^: 1072 - 1078) . Tabel II viser subtilisin 309 genets nucleinsyresekvens, og Tabel III viser subtilisin 147 genets nucleinsyresekvens. Sekvenserne for 10 subtilisin 309 eller 147 eller deres funktionelle ækvivalenter kan anvendes i overensstemmelse med opfindelsen. For eksempel kan de i Tabellerne I, II eller III viste sekvenser fra 309 eller 147 ændres ved substitutioner, additioner eller deletioner, som sørger for funktionelt ækvivalente molekyler. På 15 grund af degenerationen i nucleotidkodningssekvenserne kan andre DNA sekvenser, som i det væsentlige koder for den samme aminosyresekvens som vist i Tabel I, anvendes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse. Disse omfatter, men er ikke begrænset til nucleotidsekvenser omfattende det hele eller 20 dele af subtilisin 309 eller 147 sekvenserne vist i Tabellerne II eller III, som ændres ved substitution af forskellige kodoner, som koder for den samme eller en funktionelt ækvivalent aminosyrerest inden for sekvensen, idet der således frembringes en stum ændring. For eksempel kan en eller flere 25 aminosyrerester inden for sekvensen substitueres med en anden aminosyrerest med lignende polaritet, der virker som en funktionel ækvivalent. Substitutioner for en aminosyre inden for sekvensen kan udvælges blandt andre medlemmer af den klasse, som aminosyren hører til. For eksempel omfatter de ikke-polære 30 (hydrofobe) aminosyrer alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, phenylalanin, tryptophan og methionin. De polære neutrale aminosyrer omfatter glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin. De negativt 35 ladede (sure) aminosyrer omfatter asparaginsyre og glutamin-syre.
Nær overensstemmelse kan måles ved sammenligning af 10 DK 176102 B1 aminosyresekvenserne. Der findes mange metoder til sammenstilling af proteinsekvenser, men forskellene viser sig kun, når graden af overensstemmelse er ret lille. Metoderne beskrevet i Atlas of Protein Sequence and Structure, Margaret O. Dayhoff 5 ed., vol. 5, supp. 2, 1976, National Biomedical Research Foundation, Georgetown University Medical Center, Washington, D.C., p. 3 ff., med titlen SEARCH and ALIGN, definerer overensstemmelse. Det er kendt teknik, at beslægtede proteiner kan variere i antal af aminosyrer så vel som identitet af hver 10 aminosyre langs kæden. Det vil sige, at der kan forekomme deletioner eller indsættelser, når to strukturer sammenstilles med henblik på maksimal identitet. For eksempel har subtilisin Carlsberg kun 274 aminosyrer, medens subtilisin BPN’ har 275 aminosyrer. Sammenstilling af de to aminosyrer viser, at 15 Carlsberg ikke har en rest, der svarer til Asn56 fra subtilisin BPN'. Aminosyresekvensen fra Carlsberg synes derfor meget forskellig fra BPN', medmindre der anføres et hul ved lokation 56. Derfor kan det med en høj grad af sikkerhed forudsiges, at erstatning af Asn med Ser ved lokation 218 i subtilisin Carls-20 berg vil forøge thermostabiliteten, forudsat at resterne i Carlsberg nummereres med homologi til BPN’.
Ifølge den foreliggende opfindelse kan de for subtilisin 309 og 147 bestemte sekvenser sammenlignes med sekvenser fra kendte subtilisiner (se tabel I) eller nyligt opdagede 25 subtilisiner for at udlede positioner for ønskede mutationer.
For at gøre dette skal nær overensstemmelse mellem de sammenlignede subtilisiner bestemmes.
Forsøg på at bestemme forholdet mellem subtilisins primære struktur og dens fysiske egenskaber har afsløret 30 betydningen af methionin-222 resten så vel som de i den aktive position funktionelle aminosyrer, nemlig asparaginsyre-32, histidin-64 og serin-221. Asparagin-155 og Serin-221 ligger inden for oxyanionbindingspositionent. Mutationer ved disse positioner mindsker sandsynligvis den proteolytiske aktivitet.
35 Ifølge den foreliggende opfindelse blev aminosyresekvenserne fra subtilisin 309 og 147 sammenlignet med hinanden og med andre subtilisinsekvenser (se Tabel II). Rester, som varierede 11 DK 176102 B1 mellem subtilisin 309 eller 147 og andre subtilisiner blev identificeret. For eksempel indeholder subtilisin 309 en serinrest ved rest 153, hvorimod subtilisin 147, BPN', Carls-berg og 168 indeholder en alaninrest. Hvis derfor serin 153 5 resten fra subtilisin 309 blev ændret til en alaninrest, kunne de fysiske egenskaber af subtilisin 309 ændres i en ønsket retning. På samme måde indeholder subtilisin 147 en serinrest ved position 218, hvorimod de andre subtilisiner udtrykte en asparaginrest. Fordi subtilisin 147 har forbedret thermosta-10 bilitet i forhold til andre subtilisiner, .kan mutation af asparagin 218 fra subtilisin 309 til en serinrest forbedre thermostabiliteten for subtilisin 309. Som et andet eksempel blev det sluttet, at eftersom Thr 71 er tæt på den aktive position, kunne indførelsen af en negativt ladet aminosyre, 15 såsom asparaginsyre, undertrykke oxidative angreb ved elektrostatisk frastødning. De for subtilisins fysiske egenskaber sandsynligvis mest relevante positioner er sådanne, i hvilke der er bevaring af aminorester mellem de fleste subtilisiner, for eksempel de ovenfor omtalte Asp-153 og Asn-· 20 218 og også Trp-6, Arg-170, Pro-168, His-67, Met-175, Gly-219,
Arg-275. Ved mutation af nucleinsyresekvenserne således at en aminosyre, som er forskellig fra andre subtilisiner substitueres med en aminosyre, som stemmer overens, kan resultatet være en mere stabil form for subtilisin.
25 Wells et al. (1987, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 84: 1219 - 1233) har anvendt sammenligning af aminosyresekvenser og positionrettet mutation til at frembringe subtilisinsub-stratspecificitet. Forskellige subtilisiners katalytiske aktiviteter kan være væsentlig forskellige over for udvalgte 30 substrater. Wells har vist, at kun tre aminosyresubstitutioner kan bevirke, at B. amyloliquefaciens subtilisins substratspecificitet nærmer sig B. licheniformis subtilisins, enzymer, som er forskellige med faktor 10 - 50 med hensyn til katalytisk effektivitet i deres naturlige tilstand. Sammenlignings-35 analyse mellem subtilisin 147 og 309 og andre subtilisiner har vist, at mutation af de følgende positioner kan ændre de fysiske eller kemiske egenskaber hos subtilisin: 6, 9, 11-12, 12 DK 176102 B1 19, 25, 36-38, 53-59, 67, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121-122, 124, 128, 131, 140, 153-166, 168, 169-170, 172, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 199, 218, 219, 222, 226, 234-238, 241, 260-262, 265, 268 eller 275. Deletioner forekommer ved 5 følgende positioner i subtilisinerne 147 og/eller 309, indsættelse af passende aminosyrerester i disse positioner kunne forbedre oprindelsesenzymernes stabilitet: 1, 36, 56, 159, 164-166. Ifølge fremgangsmåden illustreret med disse eksempler, som ikke er begrænsende, fremkommer adskillige 10 mulige mutationspositioner.
Tabel I
Sammenligning af aminosyresekvens for forskellige proteaser 15 10 20 30 a) A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V- b) *-Q-T-V-P-W-G-I-S-F-I-N-T-Q-Q-A-H-N-R-G-I-F-G-N-G-A-R-V-A-V- c) A-Q-S-V-P-Y-G-V-S-Q-I-K-A-F-A-L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V-20 d) A-Q-T-V-P-Y-G-I-P-L-I-K-A-D-K-V-Q-A-Q-G-F-K-G-A-N-V-K-V-A-V- e) A-Q-S-V-P-Y-G- I-S-Q-I-K-A-P-A-L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V- 40 50 60 a) L-D-T-G-I-*-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-*-S-T-Q-D- b) L-D-T-G-I-*-A-T-H-P-D-L-R-I-A-G-G-A-S-F-I-S-S-E-P-*-S-Y-H-D-25 c) I-D-S-G-I-D-S-S-H-P-D-L-K-V-A-G-G-A-S-M-V-P-S-E-T-N-P-F-Q-D- d) L-D-T-G-I-Q-A-S-H-P-D-L-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-*-Y-N-T-D- e) L-D-S-G-I-D-S-S-H-P-D-L-N-V-R-G-G-A-S-F-V-A-S-E-T-N-P-Y-Q-D- 70 80 90 30 a) G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-E-L-bJ N-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-D-L-C) N-N-S-H-G-T-H-V-A-G-T-V-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-S-L- d) G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-V-A-A-L-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-S-V-S-L- e) G-S-S-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-S-P-S-A-S-L-35 100 110 120 a) Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H- t 13 DK 176102 B1 b) Y-A-V-K-V-L-D-R-N-G-S-G-S-L-A-S-V-A-Q-G-I-E-W-A-I-N-N-N-M-H- c) Y-A-V-K-V-L-G-A-D-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-A-I-A-N-N-M-D- d) Y-A-V-K-V-L-N-S-S-G-S-G-T-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-A-T-T-N-G-M-D- e) Y-A-V-K-V-L-D-S-T-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-A-I-S-N-N-M-D-5 130 140 150 a) V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V- b) I-I-N-M-S-L-G-S-T-S-G-S-S-T-L-E-L-A-V-N-R-A-N-N-A-G-I-L-L-V- c) V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-P-S-A-A-L-K-A-A-V-D-K-A-V-A-S-G-V-V-V-V-10 d) V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-M-K-Q-A-V-D-N-A-Y-A-R-G-V-V-V-V- e) V-I-N-M-S-L-G-G-P-T-G-S-A-A-L-K-T-V-V-D-K-A-V-S-S-G-I-L-V-A- 160 170 180 a) A-A-S-G-N-S-G-A-*-G-S-I-S-*-*-*-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-15 b) G-A-A-G-N-T-G-R-*-Q-G-V-N-*-*-*-Y-P-A-R-Y-S-G-V-M-A-V-A-A-V- c) A-A-A-G-N-E-G-T-S-G-S-S-S-T-V-G-Y-P-G-K-Y-P-S-V-I-A-V-G-A-V- d) A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-N-T-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D-S-V-I-A-V-G-A-V- e) A-A-A-G-N-E-G-S-S-G-S-S-S-T-V-G-Y-P-A-K-Y-P-S-T-I-A-V-G-A-V- 20 190 200 210 a) D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-
b) D-Q-N-G-Q-P-P-S-F-S-T-Y-G-P-E-I-E-I-S-A-P-G-V-N-V-N-S-T-Y-T-C) D-S-S-N-Q-R-A-S-F-S-S-V-G-P-E-L-D-V-M-A-P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P
d) D-S-N-S-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A-P-G-A-G-V-Y-S-T-Y-P- 25 e) N-S-S-N-Q-R-A-S-F-S-S-A-G-S-E-L-D-V-M-A-P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P- 220 230 240 a) G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S- b) G-N-R-Y-V-S-L-S-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-V-A-A-L-V-K-S-R-Y-P-S-30 C) G-N-K-Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-S-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N- d) T-S-T-Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N- e) G-G-T-Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-T- 35 a) W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-b) Y-T-N-N-Q-I-R-Q-R-I-N-Q-T-A-T-Y-L-G-S-P-S-L-Y-G-N-G-L-V-H-A-C) W-T-N-T-Q-V-R-S-S-L-E-N-T-T-T-K-L-G-D-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V- 14 DK 176102 B1 d) L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A-T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V- e) W-T-N-A-Q-V-R-D-R-L-E-S-T-A-T-Y-L-G-N-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V-
5 a) E-A-A-T-R
b) G-R-A-T-Q
c) Q-A-A-A-Q
d) E-A-A-A-Q
e) Q-A-A-A-Q
10 a = subtilisin 309 b = subtilisin 147 c = subtilisin BPN' 15 d = subtilisin Carlsberg e = subtilisin 168 * = angivet deletion 20
Der findes inden for teknikkens stade mange velkendte metoder til indføring af mutationer i gener. Efter en kort diskussion af kloning af subtilisingener, vil fremgangsmåder til dannelse af mutationer i subtilisingenet på både tilfæl-25 dige positioner og specifikke positioner blive diskuteret.
Det gen, der koder for subtilisin, kan klones fra en hvilken som helst Gram-positiv bakterie eller svamp ved hjælp af forskellige inden for teknikken velkendte metoder. Først skal der konstrueres et genom og/eller cDNA bibliotek af DNA, 30 idet der anvendes kromosomalt DNA eller messenger RNA fra organismen, der fremstiller den subtilisin, der skal undersøges. Hvis aminosyresekvensen af subtilisin er kendt, kan homologe, mærkede oligonucleotidprober derpå syntetiseres og anvendes til identifikation af kloner, der koder for subtili-35 sin, fra et genom bibliotek af bakterielt DNA eller fra et fungus cDNA bibliotek. Eller der kan anvendes en mærket oligonucleotidprobe indeholdende sekvenser, der er homologe 15 DK 176102 B1 med subtilisin fra en anden bakteriestamme eller svamp, som en probe til identifikation af subtilisinkodende kloner, idet hybridisering og vaskebetingelser med lavere stringens anvendes .
5 En yderligere metode til identifikation af subtili- sinproducerende kloner kunne indebære indsættelse af fragmenter af genom DNA i en udtrykkelsesvektor, såsom et plasmid, transformering af protease-negative bakterier med det fremkomne genome DNA bibliotek, og efterfølgende udspredning 10 af de transformerede bakterier på agar indeholdende et substrat for subtilisin, såsom skummetmælk. Bakterier indeholdende subtilisiribærende plasmid vil frembringe kolonier omgivet af en ring af klar agar, på grund af at skummetmælken nedbrydes af secerneret subtilisin.
15 Når først subtilisingenet er klonet i en egnet vek tor, såsom et plasmid, kan adskillige fremgangsmåder til indførelse af tilfældige mutationer i genet anvendes.
En fremgangsmåde kunne være indføring af det klonede subtilisingen som en del af en optagelig vektor i en muta-20 torstamme af Eschericia coli.
En anden fremgangsmåde ville indebære frembringelse af en enkeltstrenget form af subtilisingenet og derpå baseparring af DNA-fragmentet indeholdende subtilisingenet med et andet DNA-fragment, således at en del af subtilisingenet 25 forbliver enkeltstrenget. Denne diskrete, enkeltstrengede region kunne derpå udsættes for et hvilket som helst af en række mutagener, herunder, men ikke begrænset til, natrium-bisulfit, hydroxylamin, salpetersyrling, myresyre eller hydra-lazin. Et særligt eksempel på denne fremgangsmåde til dannelse 30 af tilfældige mutationer er beskrevet af Shortle og Nathans (1978, Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A., 75: 2170-2174). Ifølge
Shortle og Nathans fremgangsmåde ville plasmidet bærende subtilisingenet blive "knækket" af et restriktionsenzym, som spalter inden for genet. Det fremkomne hak ville blive 35 udvidet til en åbning af exonucleasevirkningen fra DNA polymerase I. Den fremkomne enkeltstrengede åbning kunne derpå mutageniseres, ved at et hvilket som helst af de nævnte muta- 16 DK 176102 B1 genesemidler anvendtes.
Som en anden mulighed kan subt i lis ingenet fra en Bacillus-art omfattende den naturlige promoter og andre kontrolsekvenser klones i en plasmidvektor indeholdende repli-5 koner for både E. coli og B. subtilis, en selekterbar pheno-typisk markør og M13 replikationsorigo til fremstilling af enkeltstrenget plasmid DNA på superinfektion med hjælpefag IR1. Enkeltstrenget plasmid DNA indeholdende det klonede subtilisingen isoleres og baseparres med et DNA-fragment indehol-10 dende vektorsekvenser, men ikke subtilisins kodende region, hvilket bevirker til et åbent duplex molekyle. Mutationer indføres i subtilisingenet enten med natriumbisulfit, salpetersyrling eller myresyre eller ved replikation i en mutatorstamme af E. coli som beskrevet ovenfor. Eftersom 15 natriumbisulfit udelukkende reagerer med cytosin i et enkeltstrenget DNA, er de med dette mutagen skabte mutationer kun begrænset til de kodende regioner. Reaktionstid og bisulfit-' koncentration varieres i forskellige forsøg, således at der gennemsnitligt skabes fra en til fem mutationer per subtili-20 singen. Inkubation af 10 μg åbent dobbelt DNA i 4 M Na-bisul-fit, pH 6,0, i 9 minutter ved 37°C i en reaktionsvolumen på 400 μΐ, deaminerer ca. 1% cytosiner i den enkeltstrengede region. Den kodende region for modent subtilisin indeholder ca. 200 cytosiner afhængigt af DNA strengen. Reaktionstiden 25 kan med fordel varieres fra ca. 4 minutter (til frembringelse af en mutationsfrekvens på ca. 1 ud af 200) til ca. 20 minutter (ca. 5 ud af 200).
Efter mutagenese behandles de åbnede molekyler in vitro med DNA polymerase I (Klenow fragment) til dannelse af 30 fuldstændigt dobbeltstrengede molekyler og for at fiksere mutationerne. Kompetente E. coli transformeres derpå med det mutageniserede DNA til fremstilling af et forstærket bibliotek af mutante subtilisiner. Forstærkede mutant biblioteker kan også fremstilles ved dyrkning af plasmid DNA i en Mut D stamme 35 af E. coli, som forøger rækken af mutationer på grund af fejlbehæftet DNA-polymerase.
17 DK 176102 B1
Mutagenerne salpetersyrling og myresyre kan også anvendes til fremstilling af mutantbiblioteker. Fordi disse stoffer ikke er så specifikke for enkeltstrenget DNA som na-triumbisulf it, udføres mutagenesereaktioneme efter følgende 5 fremgangsmåde. Den kodende del af subtilisingenet klones i M13 phagen ifølge standardmetoder og enkeltstrenget DNA forberedes. Den enkeltstrengede DNA omsættes derpå med 1 M salpetersyrling, pH 4,3 i 15 - 60 minutter ved 23°C eller 2,4 M myresyre i 1 - 5 minutter i 23°C. Disse reaktionstidsområder 10 frembringer en mutationsfrekvens på fra 1 ud af 1000 til 5 ud af 1000. Efter mutagenese baseparres en universel primer med M13 DNA og dobbelt DNA syntetiseres, idet mutageniseret enkeltstrenget DNA anvendes som templat, således at den kodende del af subtilisingenet bliver fuldstændigt dobbeltstrenget. På 15 dette punkt kan den kodende region skæres ud af M13 vektoren med restriktionsenzymer og ligeres i en umutageniseret ekspressionsvektor, således at mutationer kun forekommer i restriktionsfragmentet (Myers et al., Science 229: 242 - 257 (1985)) .
20 Ifølge yderligere en fremgangsmåde kan mutationer dannes ved at underkaste to forskellige former for subtilisin in vivo rekombination. Ifølge denne fremgangsmåde fører homologe regioner inden for de to gener til en krydsning af tilsvarende regioner, hvilket resulterer i udvekslingen af 25 genetisk information. Dannelsen af hybride amylasemolekyler ifølge denne teknik er fuldstændigt beskrevet i dansk patent nr. 160840, som der herefter skal henvises til. Et eksempel på et plasmid, som kan danne hybride subtilisinformer er afbildet i fig. 5. Både subtilisin 309 og 147 generne, indført i 30 plasmid pSX143, er trunkerede og kan derfor ikke selv føre til subtilisinekspression. Hvis rekombinationen imidlertid forekommer mellem de to gener, for at korrigere manglen hidrørende fra trunkering, d.v.s. den N-terminale region af subtilisin 309 genet bliver kædet sammen med den C-terminale 35 region af subtilisin 147 genet, kan der fremstilles aktivt mutant subtilisin. Hvis pSX143 indføres i en proteasenegativ 18 DK 176102 B1 bakteriestamme, og bakterier, som udvikler en proteasepositiv phenotype, derpå selekteres, kan der identificeres forskellige mutanter, subtilisin 309/147 kimærer.
Når subtilisingenet er blevet klonet og de ønskede 5 mutationssteder fastlagt, kan disse mutationer indføres ved at anvende syntetiske oligonucleotider. Disse oligonucleotider indeholder nucleotidsekvenser, som flankerer de ønskede mutationspositioner; mutante nucleotider indsættes under oligonucleotidsyntese. Ifølge en foretrukket fremgangsmåde 10 skabes en enkeltstrenget DNA-åbning, som danner bro i subtilisingenet, i en vektor, der bærer subtilisingenet. Derpå baseparres det syntetiske nucleotid, der bærer den ønskede mutation, til en homolog del af det enkeltstrengede DNA. Den resterende åbning udfyldes derpå af DNA polymerase I (Klenow 15 fragment) og konstruktionen ligeres, idet der anvendes T4 ligase. Et specifikt eksempel på denne fremgangsmåde er beskrevet i Morinaga et al., (1984, Biotechnology 2:636-639). Ifølge Morinaga et al., fjernes et indre fragment fra genet, idet der anvendes restriktionsendonuclease. Vektoren/genet, 20 der nu indeholder en åbning, denatureres derpå og hybridiseres til en vektor/gen, som, i stedet for at indeholde en åbning, er blevet spaltet med en anden restriktionsendonuclease ved en position uden for det område, som er berørt af åbningen. En enkeltstrenget region i genet er derpå tilgængelig for 25 hybridisering med muterede oligonucleotider, den resterende åbning udfyldes af Klenow-fragmentet fra DNA polymerase I, indskudene ligeres med T4 DNA ligase, og efter en replikationscyklus frembringes et dobbeltstrenget plasmid, som bærer den ønskede mutation. Ved fremgangsmåden ifølge Morinaga 30 undgås den yderligere manipulation konstruktion af nye restriktionspositioner, og derfor lettes dannelsen af mutationer ved multiple positioner. Ifølge US patentskrift nr. 4.760.025 (Estell et al., juli 26, 1988) er det muligt at indføre oligonucleotider, der bærer multiple mutationer ved 35 udførelse af mindre ændringer i kassetten; imidlertid kan endnu flere forskellige mutationer indføres på et hvilket som helst tidspunkt ifølge Morinaga-metoden, da en række 19 DK 176102 B1 oligonucleotider af forskellig længde kan indføres.
Et muteret subtilisingen fremstilles ifølge de beskrevne fremgangsmåder eller en hvilken som helst fremgangsmåde inden for kendt teknik udtrykkes i enzymform, 5 idet en ekspressionsvektor anvendes. En ekspressionsvektor falder almindeligvis inden for definitionen af en kloningsvektor, eftersom en ekspressionsvektor oftest omfatter bestanddelene i en typisk kloningsvektor, d.v.s. et element, som tillader autonom replikation af vektoren i en mikro-10 organisme uafhængig af mikroorganismens genom og en eller flere phenotypiske markører til selektionsformål. En ekspressionsvektor omfatter kontrolsekvenser, der koder for en promoter, operator, ribosombindingssted, translationsinitieringssignal og eventuelt et repressorgen. For at tillade 15 secerneringen af det udtrykte protein, kan nucleotider, der koder for en "signalsekvens", indsættes inden genets kodningssekvens. Med henblik på ekspression under styringen af kontrolsekvenser, bindes et målgen, som skal behandles ifølge opfindelsen, operabelt til kontrolsekvenserne i den korrekte 20 læseramme. Promotersekvenser, som kan indføres i plasmid-vektorer, og som kan understøtte transskriptionen af det mutante subtilisingen, omfatter, men er ikke begrænset til, den prokaryote β-lactamasepromoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc.Natl.Acad.Sci. , U.S.A. 75: 3727-3731) og tac 25 promoteren (DeBoer et al., 1983, Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A. 80:21-25). Yderligere henvisninger kan også findes i "Useful proteins from recombinant bacteria" i Scientific American, 1980, 242: 74-94.
Ifølge en udførelsesform transformeres B. subtilis 3 0 med en ekspressionsvektor, der bærer det muterede DNA. Hvis ekspression skal ske i en secernerende mikroorganisme, såsom B. subtilis, kan en signalsekvens følge translationsinitiationssignalet og gå forud for den relevante DNA-sekvens. Signalsekvensen fungerer ved at transportere ekspressions-35 produktet til cellevæggen, hvor det spaltes fra produktet ved secernering. Det er hensigten, at udtrykket "kontrolsekvenser" 20 DK 176102 B1 som defineret ovenfor, skal omfatte en signalsekvens, når den er tilstede.
Til screening af mutanter kan transformeret B. subtilis dyrkes i nærvær af et filtermateriale (såsom nitro-5 cellulose), hvortil det secernerede ekspressionsprodukt (f.eks. enzym) binder. For at screene for et ekspressionsprodukt med en ønsket egenskab udsættes et filterbundet ekspressionsprodukt for betingelser, som adskiller det relevante ekspressionsprodukt fra det naturligt forekommende 10 ekspressionsprodukt. For eksempel kan det filterbundne ekspressionsprodukt udsættes for betingelser, som ville inaktivere et naturligt forekommende produkt. Bevaret enzymaktivitet, der følger ødelæggende behandling, viser, at mutationen giver enzymet øget stabilitet, og at det derfor er en 15 nyttig mutation.
Ifølge en udførelsesform for opfindelsen udføres screening for stabile varianter, idet der anvendes en prote-asedefekt B. subtilis stamme transformeret med variantplas-midet og spredt ud på plader som følger: et nitrocellulose-20 filter anbringes på en næringsbase i en petriskål, og et celluloseacetatfilter anbringes ovenpå nitrocellulosen. Kolonier dyrkes på celluloseacetatet, og protease fra individuelle kolonier secerneres gennem celluloseacetatet til nitrocellulosefiltret, hvor det bindes stabilt. Protease fra 25 hundereder af kolonier bindes til et enkelt filter, hvilket tillader efterfølgende screening af tusinder af forskellige varianter ved behandling af adskillige filtre.
Til identifikation af kolonier, der fremstiller subtilisin med forøget thermostabilitet, kan filtrene inku-30 beres i pufferopløsninger ved temperaturer, som vil inaktivere i det væsentlige al vildtypeaktivitet. Varianter med forøget stabilitet eller aktivitet beholder aktiviteten efter dette trin. Det passende behandlede filter dyppes derpå i en opløsning indeholdende Tosyl-L-Arg methyl ester (TAME) Benzoyl-Arg-35 ethyl-ester (BAEE), Acetyl-Tyr-ethyl-ester (ATEE) (Sigma) eller lignende forbindelser. Fordi TAME, BAEE og ATEE er substrater for proteaserne, spaltes de i de zoner på filtret, der 21 DK 176102 B1 indeholder subtilisinvarianter, som forbliver aktive efter behandling. Når spaltning forekommer, frigøres protoner i reaktionsblandingen og bevirker, at phenolrødt ændrer farve fra rød til gul på områder, der beholder proteaseaktivitet.
5 Denne fremgangsmåde kan anvendes til at screene for forskellige variantklasser blot med mindre modifikationer. For eksempel kunne filtrene behandles ved høj temperatur, ved høj pH, med denatureringsmidler, oxidationsmidler eller under andre betingelser, som normalt inaktiverer et enzym, såsom en 10 protease, for at finde resistente varianter. Varianter med ændret substratspecificitet kunne screenes ved at erstatte TAME, BAEE eller ATEE med andre substrater, som normalt ikke spaltes med naturligt forekommende vildtypesubtilisin.
Når først en variant med forstærket stabilitet er 15 identificeret ved screening, isoleres kolonien, hvorfra varianten er deriveret, og den ændrede subtilisin oprenses. Forsøg kan udføres med det oprensede enzym til bestemmelse af stabilitetsbetingelserne mod oxidation, thermisk inaktivering, denatureringstemperatur, kinetiske parametre så vel som andre 20 fysiske målinger. Det ændrede gen kan også sekvensbestemmes for at bestemme de aminosyreændringer, der er ansvarlige for den forbedrede stabilitet. Ved at anvende denne fremgangsmåde i er varianter med forbedrede vaskeegenskaber blevet isoleret.
25
Eksempel
Stedsspecifik mutation af subtilisingenet frembringer mutanter med nyttige kemiske egenskaber_ 30
Bakteriestammer B. subtilis 309 og 147 er varianter af Bacillus len-tus, deponeret hos NCIB og tildelt accessionsnumrene NCIB 10147 og NCIB 10309 og beskrevet i US patentskrift nr.
35 3.723.250 (27. marts 1973), som der skal henvises til. B.
subtilis DN 4 97 er beskrevet i US patent nr. 5,036,002, som der også skal henvises til, og er en aro+ transformant af RUB
22 DK 176102 B1 200 med kromosomalt DNA fra SL 438, en sporulerings- og proteasedeficient stamme fra Dr. Kim Hardy fra Biogen. E. coli MC 1000 r'm+ (Casadaban, M. J. og Cohen, S.N. (1980) , J.Mol.Biol. 138: 179-207, blev gjort r‘m+ ved hjælp af 5 konventionelle metoder og er også beskrevet i US patent nr. 5,036,002.
Plasmider pSX50 (beskrevet i US patent nr. 5,036,002, som der 10 skal henvises til) er et derivat af plasmid pDN 1050 omfattende promoter-operatoren pi0lf B. pumilus xyn B genet og B. subtilis xyl R genet.
pSX65 (beskrevet i US patent nr. 5,036,002 ovenfor) er et derivat af plasmid pDN 1050, omfattende promoter-15 operatoren p202, B. pumilus xyn B genet, og B. subtilis xyl R genet.
pSX93 vist i figur 3a, er pUC13 (Vieira og Messing, 1982, Gene 19: 259-268) omfattende et 0,7 kb Xbal-Hindlll fragment af subtilisin 309 genet inklusiv terminatoren indsat 20 i en polylinkersekvens.
pSX119 er pUCl3 indeholdende et EcoRI-Xbal fragment af subtilisin 309-genet indsat i polylinkeren.
pSX62 (beskrevet i US patent nr. 5,036,002 ovenfor) er et derivat af pSX52 (ibid.), som omfatter et fusionsgen 25 mellem kalveprochymosingenet og B. pumilus xyn B genet indsat i pSX50 (ovenfor). pSX62 blev frembragt ved indsættelse af E. coli rm B terminatoren i pSX52 bag prochymosingenet.
pSX92 blev fremstillet ved kloning af subtilisin 309 i plasmid pSX62 (ovenfor) skåret ved Clal og Hind III og fyldt 30 inden indsættelsen af fragmenterne Dral-Nhel og Nhel-Hindlll fra det klonede subtilisin 309-gen.
Oprensning af subtilisiner 35
Fremgangsmåden angår en typisk oprensning af en fermentering i 10 liter skala af subtilisin 147 enzymet, 23 DK 176102 B1 subtilisin 309 enzymet eller mutanter deraf.
Ca. 8 liter næringsmedium blev centrifugeret ved 5000 opm i 35 minutter i 1 liters bægre. Supernatanterne blev indstillet til pH 6,5 under anvendelse af 10% eddikesyre og 5 filtreret på Seitz Supra S100 filterplader.
Filtraterne blev koncentreret til ca. 400 ml med en Amicon CH2A UF enhed udstyret med en Amicon S1Y10 UF patron. UF-koncentratet blev centrifugeret og filtreret inden adsorption på en Bacitracin affinitetssøjle ved pH 7. Proteasen blev 10 elueret fra Bacitracin søjlen med 25% 2-propanol og 1 M
natriumchlorid i en pufferopløsning med 0,01 M dimethylglutar-syre, 0,1 M borsyre og 0,002 M kalciumchlorid indstillet til pH 7.
Fraktionerne med proteaseaktivitet fra Bacitracin-15 oprensningstrinnet blev kombineret og anbragt på en 750 ml Sephadex G25 søjle {5 cm dia.) ækvilibreret med en puffer indeholdende 0,01 M dimethylglutarsyre, 0,2 M borsyre og 0,002 M kalciumchlorid indstillet til pH 6,5.
Fraktioner med proteolytisk aktivitet fra Sephadex 20 G25 søjlen blev kombineret og en 150 ml CM Sepharose CL 6B
kationbyttersøj le {5 cm dia.) ækvilibreret med en puffer indeholdende 0,01 M dimethylglutaminsyre, 0,2 M borsyre og 0,002 M kalciumchlorid indstillet til pH 6,5.
Proteasen blev elueret med en lineær gradient af 0 -25 0,1 M natriumchlorid i 2 liter af samme puffer (0 - 0,2 M na triumchlorid i tilfælde af subtilisin 147).
I et sidste oprensningstrin blev proteaseholdige fraktioner fra CM Sepharose søjlen kombineret og koncentreret i en Amicon ultrafiltreringscelle udstyret med en GR81P 30 membran {fra De Danske Sukkerfabriker A/S).
Subtilisin 309 og mutanter Met 222 til Ala
Gly 195 til Glu
Asn 218 til Ser 35 Arg 170 til Tyr
Gly 195 til Glu, Arg 170 til Tyr
Gly 195 til Glu, Met 222 til Ala 24 DK 176102 B1 blev oprenset med denne fremgangsmåde.
5 Oligonucleotidsyntese
Alle umage primere blev syntetiseret på en Applied Biosystems 380 A DNA syntesiser og oprenset ved hjælp af poly-acrylamidgelelektroforese (PAGE).
10
Bestemmelse af oxidationsstabilitet
Det oprensede enzym fortyndes til et enzymindhold på ca. 0,1 mg/ml i 0,01 M dimethylglutarsyre, pH 7, og i den 15 samme puffer med 0,01 M pereddikesyre (pH 7).
Begge fortyndinger blev opvarmet til 50°C i 20 minutter. Proteolytisk aktivitet blev målt i fortyndingerne før og efter varmebehandlingen.
20
Prøve for proteolytisk aktivitet OPA Casein metode
Proteolytisk aktivitet blev bestemt med casein som substrat. En Caseinproteaseenhed (CPU) defineres som den 25 mængde enzym, der frigør 1 millimol primære aminogrupper (bestemt ved sammenligning med en serinstandard) per minut under standardbetingelser, d.v.s. inkubation i 30 minutter ved 25°C og pH 9,5.
En 2% (w/v) caseinopløsning (Hammarstein fra Merck 30 AG, Vesttyskland) blev fremstillet med Universal Buffer beskrevet af Britton og Robinson (Journ.Chem.Soc. 1931, p.
1451), indstillet til pH 9,5.
To ml substratopløsning blev præinkuberet i et vandbad i 10 minutter ved 25°C. 1 ml enzymopløsning indeholdende 35 ca. 0,2 - 0,3 CPU/ml Britton-Robinson puffer (pH 9,5) blev tilsat. Efter 30 minutters inkubation ved 25°C standsedes 25 DK 176102 B1 reaktionen ved tilsætning af et stopmiddel (5 ml af en opløsning indeholdende trichloreddikesyre {17,9 g), natriumacetat (29,9 g), og eddikesyre (19,8 g), og suppleret op til 500 ml med ionfrit vand). En blindprøve blev fremstillet på samme 5 måde som prøveopløsningen med undtagelse af, at stopmidlet blev tilsat før enzymopløsningen.
Reaktionsblandingerne blev holdt i 20 minutter i vandbad, hvorefter de blev filtreret gennem Whatman®42 papirfiltre.
10 Primære aminogrupper blev bestemt ved deres farve- udvikling med o-phthaldialdehyd (OPA).
Dinatriumtetraboratdecahydrat (7,62 g) og natrium-dodecylsulfat (2,0 g) blev opløst i 150 ml vand). OPA (160 mg) opløst i 4 ml methanol blev derpå tilsat sammen med 400 μΐ 15 beta-mercaptoethanol, hvorefter opløsningen blev suppleret op til 200 ml med vand.
Til OPA reagenset (3 ml) blev tilsat 40 μΐ af de ovenfor nævnte filtrater blanding. Den optiske tæthed (OD) ved 340 nm blev målt efter ca. 5 minutter.
20 OPA testen blev også udført med en serinstandard indeholdende 10 mg serin i 100 ml Britton-Robinson puffer (pH 9,5). Pufferen blev anvendt som en blindprøve.
Proteaseaktiviteten blev beregnet fra målinger af den optiske tæthed ved hjælp af følgende formel: 25
CPU/ml enzymopløsning = (ODt - ODb) x Cser x Q
(ODser - ODb) X MWser X ti CPU/g enzympræparat = CPU/ml: b 30 i hvor 0Dt/ ODb, 0DSer og ODB er den optiske tæthed for henholdsvis prøveopløsningen, blindprøven, serinstandarden og pufferen, Cser serinkoncentrationen i mg/ml i standarden, MWser molekylvægten af serin. Q er fortyndingsfaktoren (i dette 35 tilfælde lig med 8) for enzymopløsningen og ti er inkubationstiden i minutter.
26 DK 176102 B1 I den følgende tabel V er vist resultater fra den ovenstående prøve i forhold til det oprindelige enzym.
<►
Prøve for vaskeegenskab 5 Prøvelapper (7 cm x 7 cm, ca. 1 g) blev fremstillet ved at passere krympebehandlet bomuldsstof (100% bomuld, DS 71) gennem karret i en Mathis vaske- og tørremaskine af typen TH (Werner Mathis AG, Zurich, Schweiz) indeholdende spinatsaft (fremstillet af frisk spinat) og derpå gennem maskinens tryk-10 valse for at fjerne overskydende spinatsaft.
Til slut blev tøjet tørret i en kraftig luftstrøm ved stuetemperatur, opbevaret ved stuetemperatur i 3 uger og derpå opbevaret ved -18°C inden anvendelse.
Prøverne blev udført isothermisk i en Terg-0-tometer 15 prøvevaskemaskine (beskrevet i Jay C. Harris "Detergency Evaluation and Testing", Interscience Publishers Ltd., 1954, p. 60-61) i 10 minutter ved 100 opm. Som detergent blev følgende standardpulverdetergent anvendt: 20 LAS, Nansa S 80 0,4 g/1 AE, Berol 0 65 0,15 g/1 Sæbe 0,15 g/1 STPP 1,75 g/1
Natriumsilikat 0,40 g/1 25 CMC 0,05 g/1 EDTA 0,01 g/1 I Na2S04 2,10 g/1
Perborat 1.00 g/1 TAED 0,10 g/1 30 TAED = Ν,Ν,Ν',N‘-tetraacetyl-ethylendiamin; pH blev indstillet med 4 N NaOH til 9,5. Vandet, der anvendtes, var ca. 9° GH (German Hardness).
Forsøgene blev udført ved enzymkoncentrationer på: 0, 35 0,05 CPU/1 og 0,1 CPU/1 og to uafhængige rækker forsøg blev udført for hver af mutanterne.
27 DK 176102 B1
Til hvert forsøg anvendtes otte tøj lapper og et bæger (800 ml) detergent. Af de otte lapper var fire rene og fire var plettede med spinatsaft. Efter vask blev lapperne skyllet i rindende vand i 25 minutter i en spand.
5 Lapperne/stykkerne blev derpå lufttørret natten over (beskyttet mod dagslys) og remissionen, R, bestemt på et E1REPHO 2000 spektrophotometer fra Datacolor S.A., Dietkikon, Schweiz, ved 460 nm.
Som målestok for vaskeevnen anvendtes differential-10 remission, AR, hvor AR er lig med remissionen efter vask med tilsat enzym minus remissionen efter vask uden enzym.
Prøve for thermostabilitet
Samme fremgangsmåde som ovenfor for vaskeevne blev 15 anvendt ved bedømmelse af thermostabiliteten hos de frembragte mutanter, ved at udføre prøven ved temperaturer på henholdsvis 40°C og 60°C.
20 Kloning af subtilisin 309 og 147 gener
Kromosomalt DNA fra "309" stammen blev isoleret ved at behandle en celleopløsning med Lysozym i 30 minutter ved 37°C og derpå med SDS i 5 minutter ved 60°C. Derefter blev opløsningen ekstraheret med phenolchloroform (50:50), udfældet 25 med ethanol, og præcipitatet opløst igen i TE. Denne opløsning blev behandlet med RNase i 1 time ved 37°C.
Ca. 30 pg kromosomalt DNA blev delvist nedbrudt med restriktionsenzym Sau 3A (New England Biolabs) og fragmenter fra ca. 1,5 kb til ca. 6,5 kb blev isoleret på DEAE cellulose-30 papir fra en 1% agarosegel {subtilisingenet i andre arter er ca. 1,2 kb langt).
Som vist i fig. 1 blev fragmenterne baseparret og ligeret til BamHI skåret plasmid pSX50 (beskrevet i US patentansøgning nr. 039,298 indleveret 17. april, 1987, som der 35 henvises til). Plasmiderne blev derpå transformeret til kompetent B. subtilis DN 497.
28 DK 176102 B1
Cellerne blev derpå bredt ud på LB agarplader med 10 mM phosphat, pH 7, 6 μ9^1 kloramphenicol, og 0,2% xylose for at inducere xyn-promoteren i plasmidet. Pladerne indeholdt også 1% skummetmælk, så de proteaseproducerende transformanter 5 kunne detekteres ved den klare ring, hvor skummetmælken var nedbrudt.
Kloner, der udtrykte protease, blev fremstillet med en frekvens på 10"4. Der fandtes to kloner indeholdende plasmider, der bærer genet for subtilisin 309, pSX86 og pSX88.
10 Genet blev derpå sekvensbestemt, idet fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilbert anvendtes. Den fremkomne nucleotidsekvens fra subtilisin 309 er vist i tabel II.
29 DK 176102 B1
Tabel il
Subtilisin 309 genet 5 Signal ATGAAGAAACCG TTGGGGAAAATT GTCGCAAGCACC GCACTACTCATT TCTGTTGCTTTT 1 pro
AGTTCATCGATC GCATCGGCTGCT GAACAACGAAAA GAAAAATATTTA ATTGGCTTTAAT
82
10 GAGCAGGAAGCT GTCAGTGAGTTT GTAGAACAAGTA GAGGCAAATGAC GAGGTCGCCATT
CTCTCTGAGGAA GAGGAAGTCGAA ATTGAATTGCTT CATGAATTTGAA ACGATTCCTGTT
TTATCCGTTGAG TTAAGCCCAGAA GATGTGGACGCG CTTGAACTCGAT CCAGCGATTTCT
15 Mature
TATATTGAAGAG GATGCAGAAGTA ACGACAATGGCG CAATCAGTGCCA TGGGGAATTAGC
334
CGTGTGCAAGCC CCAGCTGCCCAT AACCGTGGATTG ACAGGTTCTGGT GTAAAAGTTGCT
20 GTCCTCGATACA GGTATTTCCACT CATCCAGACTTA AATATTCGTGGT GGCGCTAGCTTT
GTACCAGGGGAA CCATCCACTCAA GATGGGAATGGG CATGGCACGCAT GTGGCCGGGACG
ATTGCTGCTTTA AACAATTCGATT GGCGTTCTTGGC GTAGCGCCGAGC GCGGAACTATAC
25
GCTGTTAAAGTA TTAGGGGCGAGC GGTTCAGGTTCG GTCAGCTCGATT GCCCAAGGATTG
GAATGGGCAGGG AACAATGGCATG CACGTTGCTAAT TTGAGTTTAGGA AGCCCTTCGCCA
Xbal
30 AGTGCCACACTT GAGCAAGCTGTT AATAGCGCGACT TCTAGAGGCGTT CTTGTTGTAGCG
GCATCTGGGAAT TCAGGTGCAGGC TCAATCAGCTAT CCGGCCCGTTAT GCGAACGCAATG
GCAGTCGGAGCT ACTGACCAAAAC AACAACCGCGCC AGCTTTTCACAG TATGGCGCAGGG
35
CTTGACATTGTC GCACCAGGTGTA AACGTGCAGAGC ACATACCCAGGT TCAACGTATGCC
Clal
AGCTTAAACGGT ACATCGATGGCT ACTCCTCATGTT GCAGGTGCAGCA GCCCTTGTTAAA
40 CAAAAGAAC C CA TCTTGGTCCAAT GTACAAATCCGC AATCATCTAAAG AATACGGCAACG
AGCTTAGGAAGC ACGAACTTGTAT GGAAGCGGACTT GTCAATGCAGAA GCGGCAACACGC
Stop
TAA
45 1141
Samme fremgangsmåde som ovenfor anvendtes til kloning af subtilisin 147 genet med undtagelse af, at DNA fragmenter 50 blev ligeret i plasmid pSX56 (også beskrevet i U.S. patent nr. 5,036,002 ovenfor) der som angivet i fig. 2 i stedet for xyn DK 176102 B1 30 promoteren indeholder xyl promoteren. Der fandtes en klon indeholdende et plasmid pSX94, der bærer genet for subtilisin 147. Sekvensen for dette gen er vist i tabel III nedenfor.
5
Tabel III
Subtilisin 147 genet 10 Signal
ATGAGACAAAGT CTAAAAGTTATG GTTTTGTCAACA GTGGCATTGCTT TTCATGGCAAAC
1 Pro
CCAGCAGCAGCA GGCGGGGAGAAA AAGGAATATTTG ATTGTCGTCGAA CCTGAAGAAGTT
73
15 TCTGCTCAGAGT GTCGAAGAAAGT TATGATGTGGAC GTCATCCATGAA TTTGAAGAGATT
CCAGTCATTCAT GCAGAACTAACT AAAAAAGAATTG AAAAAATTAAAG AAAGATCCGAAC
Mature GTAAAAGCCATC GAAGAGAATGCA GAAGTAACCATC AGTCAAACGGTT CCTTGGGGAATT 20 280
TCATTCATTAAT ACGCAGCAAGCG CACAACCGCGGT ATTTTTGGTAAC GGTGCTCGAGTC
GCTGTCCTTGAT ACAGGAATTGCT TCACACCCAGAC TTACGAATTGCA GGGGGAGCGAGC
25 TTTATTTCAAGC GAGCCTTCCTAT CATGACAATAAC GGACACGGAACT CACGTGGCTGGT
ACAATCGCTGCG TTAAACAATTCA ATCGGTGTGCTT GGTGTACGACCA TCGGCTGACTTG
TACGCTCTCAAA GTTCTTGATCGG AATGGAAGTGGT TCGCTTGCTTCT GTAGCTCAAGGA
30
ATCGAATGGGCA ATTAACAACAAC ATGCACATTATT AATATGAGCCTT GGAAGCACGAGT
GGTTCTAGCACG TTAGAGTTAGCT GTCAACCGAGCA AACAATGCTGGT ATTCTCTTAGTA
35 GGGGCAGCAGGT AATACGGGTAGA CAAGGAGTTAAC TATCCTGCTAGA TACTCTGGTGTT
ATGGCGGTTGCA GCAGTTGATCAA AATGGTCAACGC GCAAGCTTCTCT ACGTATGGCCCA
i GAAATTGAAATT TCTGCACCTGGT GTCAACGTAAAC AGCACGTACACA GGCAATCGTTAC
40
GTATCGCTTTCT GGAACATCTATG GCAACACCACAC GTTGCTGGAGTT GCTGCACTTGTG
AAGAGCAGATAT CCTAGCTATACG AACAACCAAATT CGCCAGCGTATT AATCAAACAGCA
45 ACGTATCTAGGT TCTCCTAGCCTT TATGGCAATGGA TTAGTACATGCT GGACGTGCAACA
Stop CAATAA 1084 50 31 DK 176102 B1
Frembringelse af stedsspecifikke mutationer af subtilisin 309 genet__
Stedsspecifikke mutationer blev udført ifølge
Morinaga et al. (Biotechnology, ovenfor). Følgende oligonucle-5 otider anvendtes til indføring af mutationerne: a) Gly-195 Glu:
En 27 mer umage primer, Nor-237, som også danner et nyt SacI restriktionssite 10 5' CACAGTATGGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGG 3 ' NOR-237 5' GTATGGCGCAGAGCTCGACATTTGTCGC 3'
SacI
15 b) Gly-195 Asp:
En 23-mer umage primer, NOR-323, som også danner en ny Bglll site
AT
5 1 CACAGTATGGGCGCAGGGCTTGACATTGTC3’ 20 3' CATACCGCGTCTAGAACTGTAAC 5'
Bglll e) Ser-153 Ala:
En 18-mer umage primer, NOR-324, som også danner en 25 ny PvuII site
G
5' CTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGT 3' NOR-324 3·CATCGCCGTCGACCCTTA 5'
PvuII
30 f) Asn-218 Ser:
En 23-mer umage primer, NOR-325, som også danner en ny MspI site
TC
35 5' TATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATG 3' NOR-324 3' TACGGTCGAATAGGCCATGTAGC 51
MspI
32 DK 176102 B1 g) Thr-71 Asp:
En 23-mer umage primer, NOR-483,
GAC
5' TGTGGCCCGGGACGATTGCTGCTT 3 ' 5 NOR-483 3' ACACCGGCCCCCTGTAACGACGAA 5' h) Met-222 Cys og Gly-219_Cys:
En 32-mer umage, NOR-484,
T TGT
10 5' CAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTC 3' 219 222 NOR-484 3' GTCGAATTTGACATGTAGCACACGATGAGGAG 5' 15 i + j) Gly-195 Glu og Met-222 Ala eller Met-222 Cys:
For disse dobbelte mutanter udførtes kombinationer af NOR-237 og NOR-235 eller NOR-236 ved at forbinde de enkelte mutante DNA-fragmenter.
20 k) Ser-153 Ala og Asn-218 Ser:
En kombination af NOR-324 og NOR-325 blev udført som beskrevet ovenfor.
Åben duplex mutagenese udførtes med plasmid pSX93 som templat. pSX93 er vist i fig. 3a og 3b, og er pUC13 (Vieira, 25 J. og Messing, J.; 1982, Gene 19: 259-268) indeholdende et 0,7 kb Xbal-Hindlll fragment af subtilisin 309 genet omfattende terminatoren indsat i polylinkeren. Terminatoren og Hindlll site er ikke vist i Tabel II.
Til indføring af mutationerae i den N-terminale del 30 af enzymet anvendtes plasmid pSX119. pSX119 er pUC13 indeholdende et EcoRI-Xbal fragment af subtilisin 309 genet indsat i polylinkeren. Templaterne pSX93 og pSXH9 dækker således hele subtilisin 309 genet.
Mutationerne a), b) og e) udførtes ved at skære pSX93 35 med Xbal og Clal som angivet på fig. 3a; c), d) , f) og h) udførtes ved at skære pSX93 med Xbal og Hindlll som angivet i fig. 3b.
33 DK 176102 B1
Mutation g) udførtes tilsvarende i pSX119 ved at skære med EcoRI og Xbal.
De dobbelte mutanter i) og j) fremstilledes ved at skære 0,7 kb Xba-HindIII fragmentet fra a) delvist med HgiAI 5 (HgiAI skærer også i SacI, som blev indført ved mutationen).
Dette 180 bp Xbal-HgiAI fragment og 0,5 kb HgiAI fragmentet fra henholdsvis c) og d) mutanterne blev ligeret til det store Hindlll-Xbal fragment fra pSX93.
Den dobbelte mutant k) fremstilledes som ovenfor ved 10 at kombinere mutanterne e) og f).
Efter baseparring, udfyldning og ligering anvendtes blandingen til at transformere E. coli MC 1000 r'm+. Mutanter blandt transformanterne blev screenet for kolonihybridisering som beskrevet i Vlasuk et al.; 1983, J.Biol.Chem., 258: 7141-15 7148 og i Vlasuk, G.P. og Inouye, S.: p. 292-303 i "Experimental Manipulation of Gene Expression” Inouye, M.
(ed.) Academic Press, New York. Mutationerne bekræftedes ved hjælp af DNA sekvensbestemmelse.
20 Udtrykkelse af mutante subtilisiner
Efter sekvensbekræftelse af den korrekte mutation blev de muterede DNA fragmenter indsat i plasmid pSX92, som anvendtes til fremstilling af mutanterne.
Plasmid pSX92 er vist i fig. 4 og fremstilledes ved 25 kloning af Sub 309 genet i plasmid pSX62 skåret ved Clal, udfyldt med Klenow fragmentet fra DNA polymerase I og skåret med Hindlll inden indsættelse af fragmenterne Dral-Nhel og Nhel-Hindlll fra det klonede Sub 309 gen.
For at udtrykke mutanterne blev de muterede frag-30 menter (Xbal-Clal, Xbal-Hindlll eller EcoRI-Xbal) udskåret fra den passende mutation henholdsvis plasmid pSX93 eller pSX119 og indsat i pSX92.
Det muterede pSX92 anvendtes derpå til transformation af B. subtilis stamme DN497, som derpå dyrkedes i det samme 35 medium og under samme betingelser som anvendt til kloning af det oprindelige gen.
Efter passende dyrkning udvandtes de muterede enzymer 34 DK 176102 B1 og oprensedes.
Oxidationsstabilitet af mutante subtilisiner 5 Mutanterne a) og d) blev afprøvet for oxidations- stabilitet i 0,01 M pereddikesyre efter 20 minutter ved 50°C og pH 7. Den oprindelige stamme NCIB 10309 protease anvendtes som reference.
Resultaterne er vist i tabel IV nedenfor, som viser 10 restproteolytisk aktivitet i de varmebehandlede prøver i forhold til prøver, der ikke er behandlet med oxidationsmiddel eller varme.
15 Tabel iv
Oxidationsstabilitet over for pereddikesyre
Enzym Restaktivitet efter 20 minutter ved 50°C
20 _uden oxidationsmiddel med oxidationsmiddel sub 309 89% 48% mutant a 83% 45% mutant d 92% 93% 25 Det ses, at mutant d (Met 222 til Ala) udviser overlegen oxidationsstabilitet i forhold til det oprindelige enzym og mutant a.
Alle mutanter undtagen g) og h) er også blevet 3 0 afprøvet kvalitativt i 100 - 500 ppm hypochlorit ved stuetemperatur og 35°C, pH 6,5 og 9,0 i fra 15 minutter til 2 timer.
Disse forsøg viste, at mutanter c), d), i) og j) (alle Met-222) kunne modstå 3-5 gange mere hypochlorit end de andre mutanter.
35 Ved afprøvning i et flydende detergent af den sædvan lige type fandt man, at mutant f) udviste overlegen stabilitet 35 DK 176102 B1 i sammenligning med både de øvrige mutanter og det oprindelige enzym.
5 Proteolytisk aktivitet hos mutante subtilisiner
Den proteolytiske aktivitet hos forskellige mutanter blev afprøvet mod casein som proteinsubstrat ifølge de ovenfor beskrevne fremgangsmåder. Resultaterne er vist i tabel V.
Af tabellen ses, at mutant a) udviser forbedret akti-10 vitet i sammenligning med det oprindelige enzym. Det ses også, at Met-222 mutanterne har lavere aktivitet end det oprindelige enzym, men på grund af deres forbedrede oxidationsstabilitet er deres anvendelse i detergentforbindelser indeholdende oxidanter ikke udelukket.
15
Tabel V
Proteolytisk aktivitet hos mutante subtilisiner 20 Mutant Relativ aktivitet
Ingen 100 a) 120 b) 100 e) 100 25 f) 100 i) 20 j) 30 30 Vaskeevne hos mutante subtilisiner
Vaskeevnen hos forskellige mutanter blev afprøvet på spinatsaft ifølge de ovenfor beskrevne fremgangsmåder. Resultaterne er vist i Tabel VI.
Af tabellen ses, at alle de afprøvede mutanter 35 udviste forbedret vaskeevne i forhold til det oprindelige enzym, og at mutanterne i) og j) er tydeligt bedre.
36 DK 176102 B1
Tabel VI
Vaskeevne hos mutanten
5 AR
Mutant Koncentration (CPU/1) 0,05 0,1 ingen 14,4 20,4 a) 18,8 21,5 10 b) 16,9 19,7 e) 15,4 21,8 f) 16,6 19,3 i) 21,6 22,1 j) 20,6 22,6 15 95% konfidensinterval: ±0,9
Termostabilitet hos mutante subtilisiner 20 Thermostabiliteten af mutant f) blev afprøvet over for vildtype enzymet ved at anvende vaskeevneprøven ved henholdsvis 40°C og 60°C. Resultaterne er vist i tabel VII.
Af tabellen ses, at mutant f) ved 60°C udviser en meget forbedret vaskeevne sammenlignet med vildtype enzymet, 25 hvorimod vaskeevnen af mutant f) kun er lidt bedre ved 4 0°C end af vildtype enzymet.
37 DK 176102 B1
Tabel VII
Vaskeevne ved forskellige temperaturer
AR
5 Mutant Koncentration {CPU/1) 0,05 0,1 ingen (40°C) 14,4 20,4 f) (40°C) 16,6 19,3 ingen <60°C) 15,1 24,9 10 f) <60°C) 30,4 31,3 95% konf idens interval +0,9 (40°C) og +0,7 (60°C) 15 Diskussion
Subtilisin gener blev klonet fra 147 og 309 varianterne af Bacillus lentus, og de klonede gener sekvensbestemt.
Ved at sammenligne de afledte aminosyresekvenser for subtili-sin 14 7 og 3 09 med hinanden og med andre subtilisinsekvenser 20 blev der identificeret steder, som ved mutation kunne ændre det oprindelige enzyms fysiske egenskaber. Stedsrettet muta-genese anvendtes til at frembringe mutationer adskillige steder i subtilisin 309 genet. De resulterende mutante enzymer blev derpå udtrykt i en Bacillus stamme og afprøvet mod 25 forskellige fysiske og kemiske parametre. Adskillige af mutanterne viste sig af have forbedret stabilitet over for oxidation, forøget proteolytisk evne eller forbedret vaskeevne sammenlignet med det oprindelige subtilisin 309 enzym. Disse mutanter udviser egenskaber, der er ønskværdige for enzymer i 30 detergentsammensætninger.
Claims (13)
1. Mutant subtilisinenzym, kendetegnet ved, at det har en aminosyresekvens med mindst 80% homologi med 5 aminosyresekvensen for subtilisin 309 som angivet i Tabel 1(a), som kan fremstilles af B. lentus C360 (NCIB 10309), og at aminosyreresten ved en eller flere af positionerne: 6, 9, 11, 12, 19, 25, 37, 38, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 68, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121, 122, 140, 175, 180, 182, 186, 10 187, 191, 194, 195, 226, 234, 235, 236, 237, 238, 241, 260, 261, 262, 265, 268 eller 275 ændres ved substitution med en anden aminosyrerest, eller, at en eller flere aminosyrerester indsættes ved en eller flere af positionerne: 36, 56, 159 eller 164-165. 15
2. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at resten ved position 6 substitueres med tyrosin og/eller resten ved position 68 substitueres med cystein eller methionin og/eller resten ved position 71 substitueres med 20 asparaginsyre eller glutaminsyre og/eller resten ved position 175 substitueres med isoleucin.
3. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at resten ved position 195 substitueres med glutaminsyre 25 eller asparaginsyre og/eller resten ved position 275 substitueres med glutamin, eller resten ved position 19 substitueres med glycin og resten ved position 219 substitueres med cystein. 3 0
4. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det omfatter aminosyresekvensen i det væsentlige som afbildet i Tabel I(a).
5. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet 35 ved, at det omfatter aminosyresekvensen i det væsentlige som afbildet i Tabel I(b). DK 176102 B1
6. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1 og 5, * kendetegnet ved, at tryptophanresten ved position 6 substitueres med tyrosin, og/eller valinresten ved position 68 * 5 substitueres med cystein eller methionin; og/eller threoninresten ved position 71 substitueres med asparaginsyre eller glutaminsyre; og/eller methioninresten ved position 175 substitueres med isoleucin,* og/eller glutaminsyreresten ved position 195 substitueres med glycin eller asparaginsyre; 10 og/eller glutaminresten ved position 275 substitueres med arginin.
7. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1 og 5, kendetegnet ved, at argininresten ved position 19 substitueres 15 med glycin og glycinresten ved position 219 substitueres med cystein.
8. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleotidsekvens, der koder for et subtilisinenzym 20 omfattende en aminosyresekvens som afbildet i Tabel 1(a) eller i Tabel I(b).
9. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleotidsekvens, der koder for subtilisin 309 25 enzymet i det væsentlige som afbildet i Tabel II.
10. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleotidsekvens, der koder for subtilisin 147 enzymet i det væsentlige som afbildet i Tabel III. 30
11. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at nucleinsyresekvensen ifølge krav 8, 9 eller 10 er blevet ændret således at det koder for en subtilisinmutant ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 7. 35
12. Anvendelse af rekombinant DNA molekyle ifølge et DK 176102 B1 hvilket som helst af kravene 8 til 11 til frembringelse af et subtilisinenzym.
13. Detergentkomposition, kendetegnet ved, at det 5 omfatter et subtilisinenzym ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 7.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK199600361A DK176102B1 (da) | 1988-01-07 | 1996-03-29 | Muterede subtilisin-gener |
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK6488 | 1988-01-07 | ||
DK006488A DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Enzymer |
DK161290 | 1990-07-04 | ||
DK199001612A DK175697B1 (da) | 1988-01-07 | 1990-07-04 | Muterede subtilisin-gener |
DK36196 | 1996-03-29 | ||
DK199600361A DK176102B1 (da) | 1988-01-07 | 1996-03-29 | Muterede subtilisin-gener |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK36196A DK36196A (da) | 1996-03-29 |
DK176102B1 true DK176102B1 (da) | 2006-06-12 |
Family
ID=8089323
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK006488A DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Enzymer |
DK199001612A DK175697B1 (da) | 1988-01-07 | 1990-07-04 | Muterede subtilisin-gener |
DK199600361A DK176102B1 (da) | 1988-01-07 | 1996-03-29 | Muterede subtilisin-gener |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK006488A DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Enzymer |
DK199001612A DK175697B1 (da) | 1988-01-07 | 1990-07-04 | Muterede subtilisin-gener |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US5741694A (da) |
EP (4) | EP1498481A1 (da) |
JP (3) | JPH0675504B2 (da) |
AT (1) | ATE136329T1 (da) |
DE (1) | DE68926163T2 (da) |
DK (3) | DK6488D0 (da) |
WO (1) | WO1989006279A1 (da) |
Families Citing this family (695)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5185258A (en) * | 1984-05-29 | 1993-02-09 | Genencor International, Inc. | Subtilisin mutants |
DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
US5324653A (en) * | 1988-02-11 | 1994-06-28 | Gist-Brocades N.V. | Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins |
CN1056187C (zh) * | 1988-02-11 | 2000-09-06 | 金克克国际有限公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
US6287841B1 (en) | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
EP0405901B1 (en) * | 1989-06-26 | 2004-09-01 | Unilever Plc | Enzymatic detergent compositions |
DK316989D0 (da) * | 1989-06-26 | 1989-06-26 | Novo Nordisk As | Enzymer |
US5665587A (en) | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
JPH04500384A (ja) * | 1989-06-26 | 1992-01-23 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 酵素洗剤組成物 |
US5658871A (en) * | 1989-07-07 | 1997-08-19 | Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. | Microbial lipase muteins and detergent compositions comprising same |
JP3220137B2 (ja) * | 1989-08-25 | 2001-10-22 | ヘンケル・リサーチ・コーポレイション | アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法 |
US5352603A (en) * | 1989-08-31 | 1994-10-04 | Kali-Chemie Ag | Highly alkaline proteases |
DE4023458A1 (de) * | 1989-08-31 | 1991-03-07 | Kali Chemie Ag | Neue hochalkalische proteasen |
US6271012B1 (en) * | 1989-10-11 | 2001-08-07 | Genencor International, Inc. | Protease muteins and their use in detergents |
US5541062A (en) * | 1990-02-23 | 1996-07-30 | Arch Development Corporation | Methods and compositions for preparing protein processing enzymes |
DK97190D0 (da) * | 1990-04-19 | 1990-04-19 | Novo Nordisk As | Oxidationsstabile detergentenzymer |
US5733473A (en) * | 1990-11-14 | 1998-03-31 | The Procter & Gamble Company | Liquid detergent composition containing lipase and protease |
DK271490D0 (da) * | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Novo Nordisk As | Detergentkomposition |
US6967080B1 (en) * | 1990-12-05 | 2005-11-22 | Novozymes A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
DE69130113T2 (de) * | 1990-12-05 | 1999-05-12 | Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd | Proteine mit geänderten epitopen und verfahren zur deren herstellung |
US5766898A (en) * | 1990-12-05 | 1998-06-16 | Novo Nordisk A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
GB9027836D0 (en) * | 1990-12-21 | 1991-02-13 | Unilever Plc | Enzymes and enzymatic detergent compositions |
US5482849A (en) * | 1990-12-21 | 1996-01-09 | Novo Nordisk A/S | Subtilisin mutants |
ES2110488T3 (es) * | 1990-12-21 | 1998-02-16 | Novo Nordisk As | Mutantes enzimaticos con un bajo grado de variacion de la carga molecular en un intervalo de ph. |
US5340735A (en) * | 1991-05-29 | 1994-08-23 | Cognis, Inc. | Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability |
US5646028A (en) * | 1991-06-18 | 1997-07-08 | The Clorox Company | Alkaline serine protease streptomyces griseus var. alkaliphus having enhanced stability against urea or guanidine |
EP0995801A1 (de) * | 1991-07-27 | 2000-04-26 | Genencor International GmbH | Verfahren zur Verbesserung des Stabilität von Enzymen und stabilisierte Enzyme |
US5275945A (en) * | 1991-10-08 | 1994-01-04 | Vista Chemical Company | Alkaline proteases stable in heavy-duty detergent liquids |
HUT66846A (en) * | 1991-10-16 | 1995-01-30 | Unilever Nv | Aqueous enzymatic detergent compositions |
US5371198A (en) * | 1991-12-16 | 1994-12-06 | Novo Nordisk A/S | Method for protection of proteolysis-susceptible protein during protein production in a fluid medium |
US5623059A (en) * | 1992-03-09 | 1997-04-22 | Novo Nordisk A/S | Method for protection of proteolysis-susceptible protein during protein production in a fluid medium |
DE69333463D1 (de) * | 1992-05-18 | 2004-05-06 | Genencor Int | Alkalische Proteasen produzierende Bakterien, und Verfahren zur Herstellung dieser alkalischen Proteasen |
PL178045B1 (pl) * | 1992-07-17 | 2000-02-29 | Genencor Int | Mutant proteazy do stosowania w detergentach, sekwencja DNA kodująca mutanta proteazy, sposób otrzymywania mutanta proteazy oraz kompozycja detergentowa |
JPH0763377B2 (ja) * | 1992-09-03 | 1995-07-12 | 大阪府 | 耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子、組換え体プラスミドpABT17、枯草菌プラスミドベクターpABTts14およびその枯草菌プラスミドベクターpABTts14の形質転換体 |
DE4231726A1 (de) * | 1992-09-23 | 1994-03-24 | Cognis Bio Umwelt | Mutierte subtilisinartige Serinproteasen |
GB9220669D0 (en) * | 1992-09-30 | 1992-11-11 | Unilever Plc | Detergent composition |
US6436690B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-20 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted |
US6440717B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-27 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
MA23346A1 (fr) | 1993-10-14 | 1995-04-01 | Genencor Int | Variantes de la subtilisine |
DE69432954T2 (de) * | 1993-10-14 | 2004-04-22 | The Procter & Gamble Company, Cincinnati | Proteasen enthaltende bleichmittelzusammensetzungen |
AU8079794A (en) * | 1993-10-14 | 1995-05-04 | Procter & Gamble Company, The | Protease-containing cleaning compositions |
US5837458A (en) * | 1994-02-17 | 1998-11-17 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
US6406855B1 (en) | 1994-02-17 | 2002-06-18 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US6335160B1 (en) | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US6599730B1 (en) * | 1994-05-02 | 2003-07-29 | Procter & Gamble Company | Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
AU703378B2 (en) * | 1994-06-23 | 1999-03-25 | Unilever Plc | Dishwashing compositions |
US6066611A (en) * | 1994-10-13 | 2000-05-23 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising protease enzymes |
US6455295B1 (en) | 1995-03-08 | 2002-09-24 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
US6475765B1 (en) | 1995-03-09 | 2002-11-05 | Procter & Gamble Company | Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
IL117350A0 (en) | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
US6682924B1 (en) * | 1995-05-05 | 2004-01-27 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
EP0824585B1 (en) * | 1995-05-05 | 2009-04-22 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
US5837517A (en) | 1995-05-05 | 1998-11-17 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
US20120165241A1 (en) * | 1995-05-05 | 2012-06-28 | Unilever Plc | Subtilase Variants |
US6936289B2 (en) | 1995-06-07 | 2005-08-30 | Danisco A/S | Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products |
CA2270180C (en) * | 1996-11-04 | 2011-01-11 | Novo Nordisk A/S | Subtilase variants and compositions |
CN1554750B (zh) | 1996-11-04 | 2011-05-18 | 诺维信公司 | 枯草酶变种及组合物 |
US6077662A (en) * | 1996-11-27 | 2000-06-20 | Emory University | Virus-like particles, methods and immunogenic compositions |
EP0977869B2 (en) * | 1997-04-09 | 2008-11-12 | Danisco A/S | Lipase and use of same for improving doughs and baked products |
US6140475A (en) | 1997-04-11 | 2000-10-31 | Altus Biologics Inc. | Controlled dissolution crosslinked protein crystals |
AU8798198A (en) * | 1997-08-29 | 1999-03-22 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
EP1012251A1 (en) | 1997-08-29 | 2000-06-28 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
EP0913458B1 (en) * | 1997-10-22 | 2004-06-16 | The Procter & Gamble Company | Liquid hard-surface cleaning compositions |
ES2368718T3 (es) * | 1997-10-23 | 2011-11-21 | Danisco Us Inc. | Variantes de subtilisina con múltiples sustituciones. |
MA25044A1 (fr) * | 1997-10-23 | 2000-10-01 | Procter & Gamble | Compositions de lavage contenant des variants de proteases multisubstituees. |
US6780629B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-24 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
US6773907B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-10 | Peter Kamp Hansen | Subtilase enzymes |
EP1032655B1 (en) | 1997-11-21 | 2005-06-29 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
US6642011B2 (en) | 1998-04-15 | 2003-11-04 | Genencor International, Inc. | Human protease and use of such protease for pharmaceutical applications and for reducing the allergenicity of non-human proteins |
US6835550B1 (en) | 1998-04-15 | 2004-12-28 | Genencor International, Inc. | Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins |
US6936249B1 (en) | 1998-04-15 | 2005-08-30 | Genencor International, Inc. | Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
WO2000005396A1 (en) | 1998-07-21 | 2000-02-03 | Danisco A/S | Foodstuff |
US6461849B1 (en) * | 1998-10-13 | 2002-10-08 | Novozymes, A/S | Modified polypeptide |
US6376450B1 (en) | 1998-10-23 | 2002-04-23 | Chanchal Kumar Ghosh | Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants |
US6831053B1 (en) | 1998-10-23 | 2004-12-14 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising multiply-substituted protease variants |
DE69941364D1 (de) | 1998-11-27 | 2009-10-15 | Novozymes As | Varianten eines lipolytischen enzyms |
NZ512088A (en) | 1998-12-08 | 2004-01-30 | Children S Hospital And Region | Polymorphic loci that differentiate escherichia coli 0157:H7 from other strains |
EP1803817B1 (en) | 1998-12-18 | 2011-04-06 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the I-S1 and I-S2 sub-groups having an additional amino acid residue in an active site loop region |
CN100523181C (zh) | 1999-03-31 | 2009-08-05 | 诺维信公司 | 具有碱性α-淀粉酶活性的多肽及其编码核酸 |
EP2889375B1 (en) | 1999-03-31 | 2019-03-20 | Novozymes A/S | Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same |
KR20000065867A (ko) | 1999-04-09 | 2000-11-15 | 손경식 | 세탁세제용 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이, 이를 코딩하는 유전자, 재조합 발현벡터 및 형질전환된 균주 |
ATE408676T1 (de) | 1999-05-20 | 2008-10-15 | Novozymes As | Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 132 und 133 |
AU4392900A (en) | 1999-05-20 | 2000-12-12 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additionalamino acid residue between positions 127 and 128 |
EP1183340B1 (en) | 1999-05-20 | 2008-09-03 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 126 and 127 |
ATE408680T1 (de) | 1999-05-20 | 2008-10-15 | Novozymes As | Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 128 und 129 |
AU4393100A (en) | 1999-05-20 | 2000-12-12 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additionalamino acid residue between positions 125 and 126 |
WO2000071687A1 (en) | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 129 and 130 |
MXPA02000840A (es) * | 1999-07-22 | 2002-07-30 | Procter & Gamble | Variantes de proteasa de subtilisina que tienen substituciones de aminoacidos en regiones de epitopes definidas. |
WO2001016285A2 (en) | 1999-08-31 | 2001-03-08 | Novozymes A/S | Novel proteases and variants thereof |
US6727085B2 (en) | 1999-12-15 | 2004-04-27 | Fanoe Tina Sejersgaard | Subtilase variants having an improved wash performance on egg stains |
US6777218B1 (en) | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
WO2001075087A2 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Maxygen, Inc. | Subtilisin variants |
AU2001254623A1 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-12 | Novozymes A/S | Production and use of protein variants having modified immunogenicity |
EP1313846B1 (en) | 2000-08-21 | 2013-10-16 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
US6541234B1 (en) * | 2000-09-11 | 2003-04-01 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Calcium free subtilisin mutants |
US6541235B1 (en) * | 2000-09-29 | 2003-04-01 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Calcium free subtilisin mutants |
EP1975229A3 (en) | 2000-10-13 | 2009-03-18 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variant with altered properties |
US6893855B2 (en) * | 2000-10-13 | 2005-05-17 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
WO2002031133A1 (en) | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
US6673580B2 (en) | 2000-10-27 | 2004-01-06 | Genentech, Inc. | Identification and modification of immunodominant epitopes in polypeptides |
AU758744B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-03-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a bacillus strain |
ES2305023T3 (es) * | 2000-10-31 | 2008-11-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Metodos para el analisis de componentes no proteinaceos usando una proteasa de una cepa de bacilo. |
EP1201752A1 (en) * | 2000-10-31 | 2002-05-02 | Roche Diagnostics GmbH | Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a Bacillus strain |
US7303907B2 (en) | 2001-01-08 | 2007-12-04 | Health Protection Agency | Degradation and detection of TSE infectivity |
EP1373296B1 (en) | 2001-03-23 | 2011-10-05 | Genencor International, Inc. | Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
DE10121463A1 (de) * | 2001-05-02 | 2003-02-27 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten |
US7498158B2 (en) | 2001-05-15 | 2009-03-03 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variant with altered properties |
JP4309137B2 (ja) | 2001-05-18 | 2009-08-05 | ダニスコ エイ/エス | 酵素を使用した練り粉の調製方法 |
EP1421224B1 (en) | 2001-06-26 | 2012-10-17 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase i activity and polynucleotides encoding same |
DK200101090A (da) | 2001-07-12 | 2001-08-16 | Novozymes As | Subtilase variants |
CA2472206C (en) | 2001-12-31 | 2013-04-09 | Genencor International, Inc. | Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
JP4703113B2 (ja) * | 2002-01-16 | 2011-06-15 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | 複数置換プロテアーゼ変異体 |
AU2003210551A1 (en) * | 2002-01-16 | 2003-09-02 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants |
DE60317478T2 (de) | 2002-02-26 | 2008-09-04 | Genencor International, Inc., Palo Alto | Beurteilungen und mittel auf populationsbasis zur bestimmung der rangfolge der relativen immunogenität von proteinen |
EP1490485B1 (en) | 2002-03-27 | 2015-03-04 | Novozymes A/S | Granules with filamentous coatings |
US8124399B2 (en) | 2002-03-29 | 2012-02-28 | Danisco Us Inc. | Enhanced protein expression in Bacillus |
WO2004003187A2 (en) | 2002-07-01 | 2004-01-08 | Novozymes A/S | Mpg added to fermentation |
KR101211445B1 (ko) | 2002-07-30 | 2012-12-12 | 다니스코 유에스 인크. | 에어로졸 발생을 감소시킨 제형물 |
ATE494368T1 (de) | 2002-10-01 | 2011-01-15 | Novozymes As | Polypeptide der gh-61-familie |
SG166001A1 (en) * | 2002-10-02 | 2010-11-29 | Catalyst Biosciences Inc | Methods of generating and screening for proteases with altered specificity |
TWI319007B (en) | 2002-11-06 | 2010-01-01 | Novozymes As | Subtilase variants |
US7888093B2 (en) * | 2002-11-06 | 2011-02-15 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
JP4851093B2 (ja) | 2002-12-11 | 2012-01-11 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 洗剤組成物 |
ATE438711T1 (de) | 2002-12-20 | 2009-08-15 | Novozymes As | Polypeptide mit cellobiohydrolase ii-aktivität und dafür kodierende polynucleotide |
US7955814B2 (en) | 2003-01-17 | 2011-06-07 | Danisco A/S | Method |
DE602004030000D1 (de) | 2003-01-17 | 2010-12-23 | Danisco | Verfahren zur in-situ-herstellung eines emulgators in einem nahrungsmittel |
US20050196766A1 (en) | 2003-12-24 | 2005-09-08 | Soe Jorn B. | Proteins |
ATE461276T1 (de) | 2003-01-27 | 2010-04-15 | Novozymes As | Enzymstabilisierung |
US7294499B2 (en) * | 2003-01-30 | 2007-11-13 | Novozymes A/S | Subtilases |
JP2006517989A (ja) | 2003-02-18 | 2006-08-03 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 洗剤組成物 |
WO2004099228A2 (en) | 2003-05-02 | 2004-11-18 | Novozymes Inc. | Variants of beta-glucosidases |
ATE407202T1 (de) | 2003-05-07 | 2008-09-15 | Novozymes As | Enzymvarianten von subtilisin (subtilasen) |
EP1675941B1 (en) | 2003-06-25 | 2013-05-22 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same |
DK2617825T3 (da) | 2003-08-25 | 2015-06-01 | Novozymes Inc | Varianter af glycosidhydrolase |
EP1678296B1 (en) | 2003-10-23 | 2011-07-13 | Novozymes A/S | Protease with improved stability in detergents |
US7244605B2 (en) | 2003-10-28 | 2007-07-17 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same |
EP1682655B1 (en) | 2003-10-30 | 2009-09-02 | Novozymes A/S | Carbohydrate-binding modules |
US7906307B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-03-15 | Danisco A/S | Variant lipid acyltransferases and methods of making |
GB0716126D0 (en) | 2007-08-17 | 2007-09-26 | Danisco | Process |
WO2008090395A1 (en) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Danisco A/S | Production of a lipid acyltransferase from transformed bacillus licheniformis cells |
US7718408B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-05-18 | Danisco A/S | Method |
WO2005066339A2 (en) | 2004-01-06 | 2005-07-21 | Novozymes A/S | Polypeptides of alicyclobacillus sp. |
ES2469840T3 (es) | 2004-01-30 | 2014-06-20 | Novozymes Inc. | Polip�ptidos con actividad de mejora celulol�tica y polinucle�tidos que los codifican |
EP2325318A1 (en) | 2004-02-13 | 2011-05-25 | Novozymes A/S | Protease variants |
GB0405637D0 (en) * | 2004-03-12 | 2004-04-21 | Danisco | Protein |
DE602005025202D1 (de) * | 2004-04-02 | 2011-01-20 | Novozymes As | Subtilasevarianten mit veränderter immunogenität |
EP1735339A2 (en) * | 2004-04-09 | 2006-12-27 | Genencor International, Inc. | Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus |
US7148404B2 (en) | 2004-05-04 | 2006-12-12 | Novozymes A/S | Antimicrobial polypeptides |
EP1766021B1 (en) * | 2004-05-20 | 2012-05-09 | AES Chemunex S.A. | Polynucleotides for the detection of escherichia coli o157:h7 and escherichia coli o157:nm verotoxin producers |
US20090060933A1 (en) * | 2004-06-14 | 2009-03-05 | Estell David A | Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
CN101010429B (zh) | 2004-07-05 | 2013-05-08 | 诺维信公司 | 具有改变特性的α-淀粉酶变异体 |
AU2005263954B2 (en) * | 2004-07-16 | 2011-04-07 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Enzymatic oil-degumming method |
WO2006031554A2 (en) | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Novozymes North America, Inc. | Methods for preventing, removing, reducing, or disrupting biofilm |
US7811979B2 (en) | 2004-09-21 | 2010-10-12 | Novozymes A/S | Subtilases |
EP1794296B1 (en) | 2004-09-21 | 2012-04-18 | Novozymes A/S | Subtilases |
US7741095B2 (en) | 2004-09-21 | 2010-06-22 | Novozymes A/S | Subtilases |
EP1799819B1 (en) | 2004-09-30 | 2011-03-23 | Novozymes Inc. | Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same |
CN101253263B (zh) | 2005-04-27 | 2014-07-02 | 诺维信股份有限公司 | 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 |
EP2385112B1 (en) | 2005-07-08 | 2016-11-30 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
US8119387B2 (en) | 2005-08-16 | 2012-02-21 | Novozymes A/S | Polypeptides of strain Bacillus sp. P203 |
CN101243182B (zh) | 2005-08-16 | 2014-08-06 | 诺维信公司 | 枯草蛋白酶 |
EP2385110A3 (en) | 2005-09-30 | 2011-11-16 | Novozymes, Inc. | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
WO2007036235A1 (en) | 2005-09-30 | 2007-04-05 | Novozymes A/S | Immobilization of enzymes |
US7883711B2 (en) | 2006-03-22 | 2011-02-08 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having antimicrobial activity |
WO2007113241A1 (en) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Novozymes A/S | A stabilized liquid enzyme composition |
BRPI0709978A2 (pt) | 2006-04-14 | 2011-08-02 | Genencor Int | tratamento em etapa única de produtos têxteis |
EP2013339B1 (en) | 2006-04-20 | 2013-09-11 | Novozymes A/S | Savinase variants having an improved wash performance on egg stains |
US20090286302A1 (en) | 2006-06-21 | 2009-11-19 | Novosymes A/S | Desizing and Scouring Process |
BRPI0714870A2 (pt) | 2006-07-21 | 2013-05-28 | Novozymes Inc | mÉtodo para produzir um polipeptÍdeo secretado tendo atividade biolàgica, proteÍna de fusço isolada, polinucleotÍdeo isolado, construÇço de proteÍna de fusço, vetor de expressço, cÉlula hospedeira féngica, mÉtodos para degradar ou conventer um material celulàsico e para produzir uma substÂncia |
US8383097B2 (en) | 2006-08-11 | 2013-02-26 | Novozymes Biologicals, Inc | Bacteria cultures and compositions comprising bacteria cultures |
US20080057528A1 (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Detection of hydrogen peroxide released by enzyme-catalyzed oxidation of an analyte |
CN101522878B (zh) | 2006-10-06 | 2012-11-14 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物及其中酶组合的使用 |
US20080090745A1 (en) * | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Fox Bryan P | Expression of Streptomyces subtilism inhibitor (SSI) proteins in Bacillus and Streptomyces sp. |
US8034766B2 (en) * | 2006-10-27 | 2011-10-11 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compositions and methods for prion decontamination |
EP2097519A2 (en) | 2006-12-21 | 2009-09-09 | Danisco US, INC., Genencor Division | Compositions and uses for an alpha-amylase polypeptide of bacillus species 195 |
CN101617035A (zh) | 2007-02-20 | 2009-12-30 | 诺维信公司 | 用于洗衣的酶泡沫处理 |
BRPI0808513A2 (pt) | 2007-03-09 | 2014-08-19 | Danisco Us Inc Genencor Div | Variantes de alfa-amilase de espécies de bacillus alcalifílico, composições compreendendo variantes de alfa-amilase e métodos de uso |
US8779112B2 (en) | 2007-03-12 | 2014-07-15 | Danisco Us Inc. | Modified protease propeptides |
WO2008118749A2 (en) | 2007-03-23 | 2008-10-02 | Novozymes Biologicals, Inc. | Preventing and reducing biofilm formation and planktonic proliferation |
DE102007016139A1 (de) | 2007-03-30 | 2008-10-02 | Jenabios Gmbh | Verfahren zur regioselektiven Oxygenierung von N-Heterozyklen |
US20100190682A1 (en) | 2007-04-30 | 2010-07-29 | Sang-Kyu Lee | Use of protein hydrolysates to stabilize metalloprotease detergent formulations |
WO2008141281A1 (en) | 2007-05-10 | 2008-11-20 | Danisco Us Inc., Genencor Division | A modified secretion system to increase expression of polypeptides in bacteria |
SG148934A1 (en) | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Novozymes As | A process for combined biopolishing and bleach clean-up |
DE102007047433A1 (de) | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Lanxess Deutschland Gmbh | Flüssigwasch- und Flüssigreinigungsmittel |
MX2010004676A (es) | 2007-11-05 | 2010-05-20 | Danisco Us Inc | Variantes de alfa-amilasa con propiedades alteradas. |
EP2215202B2 (en) | 2007-11-05 | 2024-01-10 | Danisco US Inc. | VARIANTS OF BACILLUS sp. TS-23 ALPHA-AMYLASE WITH ALTERED PROPERTIES |
JP5629584B2 (ja) | 2007-12-21 | 2014-11-19 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス内での促進されたタンパク質生成 |
EP2245060B1 (en) | 2008-02-01 | 2017-11-01 | Novozymes A/S | Liquid enzyme composition |
WO2009098229A2 (en) | 2008-02-04 | 2009-08-13 | Danisco Us Inc., Genencor Division | A method of preparing food products using ts23 alpha-amylase |
WO2009111258A2 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-11 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition comprising lipase |
WO2009107091A2 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-03 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition comprising lipase |
CN107090014B (zh) | 2008-03-26 | 2023-04-25 | 诺维信公司 | 稳定化的液体酶组合物 |
KR101683302B1 (ko) | 2008-03-28 | 2016-12-06 | 다니스코 유에스 인크. | 박테리아 세포 내 로커스 증폭 방법 |
JP5702714B2 (ja) | 2008-04-30 | 2015-04-15 | ダニスコ・ユーエス・インク | 新規キメラアルファアミラーゼ変異体 |
WO2009140481A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-19 | Novozymes A/S | Liquid detergent compositions |
US9040278B2 (en) | 2008-06-06 | 2015-05-26 | Danisco Us Inc. | Production of glucose from starch using alpha-amylases from Bacillus subtilis |
JP5599113B2 (ja) | 2008-06-06 | 2014-10-01 | ダニスコ・ユーエス・インク | 糖化酵素組成物及びその糖化方法 |
ES2538406T3 (es) | 2008-06-06 | 2015-06-19 | Danisco Us Inc. | Alfa-amilasas variantes de Bacillus subtilis y sus métodos de uso |
CA2726265A1 (en) | 2008-06-06 | 2009-12-10 | Danisco Us Inc. | Geobacillus stearothermophilus alpha-amylase (amys) variants with improved properties |
BRPI0915728A2 (pt) | 2008-07-07 | 2015-10-27 | Basf Se | composição enzimática, processo para preparar a composição, uso da composição enzimática, e, composição detergente. |
EP2149786A1 (en) | 2008-08-01 | 2010-02-03 | Unilever PLC | Improvements relating to detergent analysis |
WO2010028941A1 (en) | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Unilever Plc | Dispenser and pretreater for viscous liquids |
JP5419303B2 (ja) | 2008-09-25 | 2014-02-19 | ダニスコ・ユーエス・インク | アルファアミラーゼ混合物及びその混合物を使用する方法 |
ES2667812T3 (es) | 2008-11-20 | 2018-05-14 | Novozymes Inc. | Polipéptidos que tienen actividad potenciadora amilolítica y polinucleótidos que codifican los mismos |
BRPI0922773B1 (pt) | 2008-12-04 | 2018-10-09 | Novozymes As | célula microbiana hospedeira transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica e para degradar ou converter um material celulósico, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, e, composição detergente. |
EP2376527A1 (en) | 2008-12-12 | 2011-10-19 | Novozymes Inc. | Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same |
EP2202290A1 (en) | 2008-12-23 | 2010-06-30 | Unilever PLC | A flowable laundry composition and packaging therefor |
EP2213723A1 (en) | 2009-01-30 | 2010-08-04 | Novozymes A/S | Isomaltose for fungus fermentation |
WO2010097436A1 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Novozymes A/S | Mutant cells having reduced expression of metallopeptidase, suitable for recombinant polypeptide production |
EP2406373B1 (en) | 2009-03-10 | 2014-05-28 | Danisco US Inc. | Bacillus megaterium strain dsm90-related alpha-amylases, and methods of use, thereof |
CA2757343A1 (en) | 2009-04-01 | 2010-10-07 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods comprising alpha-amylase variants with altered properties |
WO2010117511A1 (en) | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Danisco Us Inc. | Halomonas strain wdg195-related alpha-amylases, and methods of use, thereof |
AR076941A1 (es) | 2009-06-11 | 2011-07-20 | Danisco Us Inc | Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina |
EP3269804B1 (en) | 2009-09-17 | 2020-11-11 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
BR112012006487A8 (pt) | 2009-09-25 | 2018-04-24 | Novozymes As | variante de uma subtilisina precursora, polinucleotídeo isolado, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição de limpeza ou detergente, e, método para produzir uma variante |
BR112012006497A2 (pt) | 2009-09-25 | 2015-09-08 | Novozymes As | uso de uma variante de subtilisina, composição de lavagem de pratos, e, uso de uma composição. |
BR112012006982B1 (pt) | 2009-09-29 | 2021-12-21 | Novozymes, Inc. | Célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, construções de ácido nucleico, vetor de expressão, polipeptídeo isolado tendo atividade intensificadora celulolítica, polinucleotídeo isolado que codifica o mesmo, e, composição detergente |
US8586829B2 (en) | 2009-09-30 | 2013-11-19 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
US8586827B2 (en) | 2009-09-30 | 2013-11-19 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
CA2778471A1 (en) | 2009-10-23 | 2011-04-28 | Danisco Us Inc. | Methods for reducing blue saccharide |
EP2501792A2 (en) | 2009-12-29 | 2012-09-26 | Novozymes A/S | Gh61 polypeptides having detergency enhancing effect |
AU2011208429B2 (en) | 2010-01-22 | 2014-05-22 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Methods for producing amino-substituted glycolipid compounds |
CA2788548A1 (en) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | Novozymes A/S | Biogas production process with enzymatic pre-treatment |
US8859259B2 (en) | 2010-02-14 | 2014-10-14 | Ls9, Inc. | Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols |
US8815559B2 (en) | 2010-02-18 | 2014-08-26 | Danisco Us Inc. | Amylase from nesterenkonia and methods of use, thereof |
WO2011104339A1 (en) | 2010-02-25 | 2011-09-01 | Novozymes A/S | Variants of a lysozyme and polynucleotides encoding same |
CN102906251B (zh) | 2010-04-26 | 2016-11-16 | 诺维信公司 | 酶颗粒剂 |
BR112012028033B1 (pt) | 2010-06-22 | 2021-04-27 | Novozymes A/S | Método para desprender pelos em couro cru ou peles, processos para depilação de couro cru ou peles, e, para preparar um azul molhado |
WO2012022777A1 (en) | 2010-08-19 | 2012-02-23 | Novozymes A/S | Induced sporulation screening method |
RU2013114300A (ru) | 2010-08-30 | 2014-10-10 | Новозимс А/С | Стирка с концентрированным замачиванием |
US20130118532A1 (en) | 2010-08-30 | 2013-05-16 | Novozymes A/S | Two-Soak Wash |
WO2012035103A1 (en) | 2010-09-16 | 2012-03-22 | Novozymes A/S | Lysozymes |
GB201015672D0 (en) | 2010-09-20 | 2010-10-27 | Unilever Plc | Improvements relating to fabric treatment compositions comprising targeted benefit agents |
DK2622070T3 (da) | 2010-09-30 | 2016-11-21 | Novozymes Inc | Varianter af polypeptider med cellulolytisk forbedrende aktivitet og polynukleotider, der koder for dem |
BR112013007693B1 (pt) | 2010-09-30 | 2021-12-07 | Novozymes, Inc | Variante, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira microbiana recombinante, métodos para produzir uma variante, para produzir uma variante tendo atividade intensificadora celulolítica, para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, e, composição enzimática, formulação do caldo completo ou composição de cultura de células |
BR112013010129A2 (pt) | 2010-11-18 | 2016-07-05 | Novozymes Inc | polipeptídeo gh61 quimérico isolado, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira, métodos para produzir um polipeptídeo gh61 quimérico, para degradas ou converter um material celulóstico, para sintetizar um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico e para limpar ou lavar uma superfície dura ou roupa para lavar, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, uso do polipeptídeo gh61 quimérico, composição detergente, e, formulação de caldo ou composição de cultura de células completas |
CN103339260A (zh) | 2011-01-04 | 2013-10-02 | 诺维信公司 | 从含果胶和木素纤维素的材料产生生物气的方法 |
WO2012101149A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Novozymes A/S | Storage-stable enzyme granules |
ES2656049T3 (es) | 2011-01-31 | 2018-02-22 | Novozymes A/S | Uso de glucosa tostada para la producción fermentativa de taxtomina |
EP3431581B1 (en) | 2011-02-15 | 2022-04-06 | Novozymes Biologicals, Inc. | Mitigation of odor in cleaning machines and cleaning processes |
WO2012110563A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-23 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising metalloproteases |
WO2012110564A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-23 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising m7 or m35 metalloproteases |
JP2014508830A (ja) | 2011-02-16 | 2014-04-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 金属プロテアーゼを含む洗剤組成物 |
GB201102865D0 (en) | 2011-02-18 | 2011-04-06 | Danisco | Feed additive composition |
GB201102857D0 (en) | 2011-02-18 | 2011-04-06 | Danisco | Feed additive composition |
BR112013016830A2 (pt) | 2011-02-23 | 2017-03-01 | Novozymes Inc | polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, método de produzir o polipeptídeo, de produzir um mutante de uma célula parental, de inibir a expressão de um polipeptídeo, de produzir uma proteína, de degradar ou converter um material celulósico, de produzir um produto de fermentação e de fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo, molécula de rna de fita dupla, composição, e, formulação de caldo completo ou composição de cultura de células |
US9410136B2 (en) | 2011-03-31 | 2016-08-09 | Novozymes, Inc. | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
US20140031272A1 (en) | 2011-04-08 | 2014-01-30 | Danisco Us Inc. | Compositions |
DE102011007313A1 (de) | 2011-04-13 | 2012-10-18 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Expressionsverfahren |
DK2702162T3 (da) | 2011-04-29 | 2020-05-18 | Novozymes Inc | Fremgangsmåder til forbedring af nedbrydningen eller omdannelsen af celluloseholdigt materiale |
MX351761B (es) | 2011-06-20 | 2017-10-26 | Novozymes As | Composicion particulada. |
EP2537918A1 (en) | 2011-06-20 | 2012-12-26 | The Procter & Gamble Company | Consumer products with lipase comprising coated particles |
JP6126086B2 (ja) | 2011-06-24 | 2017-05-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド |
US20140106427A1 (en) | 2011-06-28 | 2014-04-17 | Novozymes A/S | Biogas From Enzyme-Treated Bagasse |
CN112662734A (zh) | 2011-06-30 | 2021-04-16 | 诺维信公司 | 用于筛选α-淀粉酶的方法 |
MX353621B (es) | 2011-06-30 | 2018-01-22 | Novozymes As | Variantes de alfa-amilasa. |
EP2726592B1 (en) | 2011-07-01 | 2015-04-01 | Novozymes A/S | Stabilized subtilisin composition |
BR112013033816A2 (pt) | 2011-07-01 | 2017-02-14 | Novozymes A / S | composição de detergente líquido sem boro |
US10711262B2 (en) | 2011-07-12 | 2020-07-14 | Novozymes A/S | Storage-stable enzyme granules |
CN109022518A (zh) | 2011-07-22 | 2018-12-18 | 诺维信北美公司 | 用于预处理纤维素材料和改进其水解的方法 |
MX2014001594A (es) | 2011-08-15 | 2014-04-25 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad de celulasa y polinucleotidos que los codifican. |
WO2013041689A1 (en) | 2011-09-22 | 2013-03-28 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
TR201909896T4 (tr) | 2011-09-23 | 2019-07-22 | Novozymes As | Tekstilde renk değiştirme. |
CA2850079A1 (en) | 2011-10-28 | 2013-05-02 | Danisco Us Inc. | Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants |
WO2013119302A2 (en) | 2011-11-21 | 2013-08-15 | Novozymes, Inc. | Gh61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same |
BR112014012170A2 (pt) | 2011-11-25 | 2020-06-23 | Novozymes A/S | polipetídeo isolado, composição, aditivo de ração animal, uso de um polipetídeo, métodos de isolamento de dna de bastérias, e de produção de um poliptídeo, polinucleotídeo isolado, constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, e, planta, parte de planta ou célula de planta |
JP2015500006A (ja) | 2011-11-25 | 2015-01-05 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | サブチラーゼ変異体およびこれをコードするポリヌクレオチド |
WO2013083801A2 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Novozymes A/S | Biogas from substrates comprising animal manure and enzymes |
EP3272862A1 (en) | 2011-12-16 | 2018-01-24 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having laccase activity and polynucleotides encoding same |
EP3172966A1 (en) | 2011-12-19 | 2017-05-31 | Novozymes Bioag A/S | Biopesticide method and compositions |
EP2607468A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-26 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising subtilase variants |
CN107267489A (zh) | 2011-12-20 | 2017-10-20 | 诺维信公司 | 枯草杆菌酶变体和编码它们的多核苷酸 |
BR112014015421A2 (pt) | 2011-12-22 | 2019-09-24 | Danisco Us Inc | alfa-amilases variantes e métodos de uso das mesmas |
EP2794866A1 (en) | 2011-12-22 | 2014-10-29 | Danisco US Inc. | Compositions and methods comprising a lipolytic enzyme variant |
US9809787B2 (en) | 2011-12-29 | 2017-11-07 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising lipase |
ES2644007T3 (es) | 2012-01-26 | 2017-11-27 | Novozymes A/S | Uso de polipéptidos con actividad de proteasa en piensos para animales y en detergentes |
EP2628785B1 (en) | 2012-02-17 | 2016-05-18 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising subtilase variants |
JP2015509364A (ja) | 2012-02-17 | 2015-03-30 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | サブチリシン変異体およびそれをコードするポリヌクレオチド |
US20150064773A1 (en) | 2012-03-07 | 2015-03-05 | Novozymes A/S | Detergent Composition and Substitution of Optical Brighteners in Detergent Composition |
US10087401B2 (en) | 2012-03-16 | 2018-10-02 | Monosol, Llc | Water soluble compositions incorporating enzymes, and method of making same |
EP2831215B1 (en) | 2012-03-29 | 2018-08-08 | Novozymes A/S | Use of enzymes for preparing water soluble films |
US9394092B2 (en) | 2012-04-16 | 2016-07-19 | Monosol, Llc | Powdered pouch and method of making same |
DK3279320T3 (da) | 2012-04-27 | 2020-03-16 | Novozymes Inc | GH61-polypeptidvarianter og polynukleotider, som koder for dem |
CN117904080A (zh) | 2012-05-07 | 2024-04-19 | 诺维信公司 | 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码其的核苷酸 |
CA2870830A1 (en) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Danisco Us Inc. | Use of alpha-amylase from aspergillus clavatus for saccharification |
EP2875111A1 (en) | 2012-05-16 | 2015-05-27 | Novozymes A/S | Compositions comprising lipase and methods of use thereof |
EP4026902A1 (en) | 2012-06-08 | 2022-07-13 | Danisco US Inc. | Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers |
EP2861749A1 (en) | 2012-06-19 | 2015-04-22 | Novozymes Bioag A/S | Enzymatic reduction of hydroperoxides |
EP2863759A2 (en) | 2012-06-20 | 2015-04-29 | Novozymes Biopolymer A/S | Use of polypeptides having protease activity in animal feed and detergents |
KR101380740B1 (ko) | 2012-06-29 | 2014-04-11 | 쉐어 휴먼 제네텍 세러피스, 인코포레이티드 | 이듀로네이트-2-설파타제의 정제 |
US9150841B2 (en) | 2012-06-29 | 2015-10-06 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase |
PL3553172T3 (pl) | 2012-08-16 | 2023-03-27 | Novozymes A/S | Sposób obróbki wyrobu włókienniczego z użyciem endoglukanazy |
CA2878988A1 (en) | 2012-08-16 | 2014-02-20 | Danisco Us Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and pullulanase for saccharification |
BR112015003726A2 (pt) | 2012-08-22 | 2019-09-24 | Novozymes As | composição detergente, uso de uma composição e de um polipeptídeo, e, método para remoção de uma nódoa de uma superfície. |
EP2888360B1 (en) | 2012-08-22 | 2017-10-25 | Novozymes A/S | Metalloproteases from alicyclobacillus sp. |
BR112015003724A2 (pt) | 2012-08-22 | 2017-08-08 | Novozymes As | polipeptídeo isolado, composição, uso de uma composição, polinucleotídeo isolado, constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, e, métodos de produção de um polipeptídeo e de produção de uma proteína. |
DK2914611T3 (da) | 2012-11-01 | 2018-12-10 | Novozymes As | Fremgangsmåde til fjernelse af DNA |
US20180112203A1 (en) | 2012-11-20 | 2018-04-26 | Danisco Us Inc. | Amylase with maltogenic properties |
CA2893454C (en) | 2012-12-07 | 2022-04-19 | Novozymes A/S | Washing method for textiles |
WO2014092960A1 (en) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | Danisco Us Inc. | Trichoderma reesei host cells expressing a glucoamylase from aspergillus fumigatus and methods of use thereof |
WO2014090940A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Novozymes A/S | Removal of skin-derived body soils |
EP2931911A1 (en) | 2012-12-14 | 2015-10-21 | Danisco US Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus fumigatus and isoamylase for saccharification |
EP2904105A1 (en) | 2012-12-20 | 2015-08-12 | Danisco US Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and pullulanase for saccharification |
CN104884614A (zh) | 2012-12-21 | 2015-09-02 | 丹尼斯科美国公司 | α-淀粉酶变体 |
WO2014099525A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Danisco Us Inc. | Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof |
US9551042B2 (en) | 2012-12-21 | 2017-01-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
CN104903443A (zh) | 2013-01-03 | 2015-09-09 | 诺维信公司 | α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
ES2882517T3 (es) | 2013-03-11 | 2021-12-02 | Danisco Us Inc | Variantes combinatorias de alfa-amilasa |
EP2970830B1 (en) | 2013-03-14 | 2017-12-13 | Novozymes A/S | Enzyme and inhibitor contained in water-soluble films |
EP3569611A1 (en) | 2013-04-23 | 2019-11-20 | Novozymes A/S | Liquid automatic dish washing detergent compositions with stabilised subtilisin |
EP3461881A1 (en) | 2013-05-03 | 2019-04-03 | Novozymes A/S | Microencapsulation of detergent enzymes |
RU2020101263A (ru) | 2013-05-14 | 2020-02-17 | Новозимс А/С | Моющие композиции |
WO2014183921A1 (en) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha amylase activity |
WO2014191170A1 (en) | 2013-05-30 | 2014-12-04 | Novozymes A/S | Particulate enzyme composition |
US10538751B2 (en) | 2013-06-06 | 2020-01-21 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
PE20160799A1 (es) | 2013-06-12 | 2016-09-03 | Earth Alive Clean Tech Inc | Supresor de polvo |
WO2014200658A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis |
WO2014200656A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces umbrinus |
WO2014200657A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis |
EP3011020A1 (en) | 2013-06-17 | 2016-04-27 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase from bacillaceae family member |
WO2014207224A1 (en) | 2013-06-27 | 2014-12-31 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
CN105874067A (zh) | 2013-06-27 | 2016-08-17 | 诺维信公司 | 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
CN105358593B (zh) | 2013-07-03 | 2018-06-22 | 巴斯夫欧洲公司 | 通过含酸基团的单体在聚醚化合物存在下聚合得到的凝胶状聚合物组合物 |
WO2015001017A2 (en) | 2013-07-04 | 2015-01-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having anti-redeposition effect and polynucleotides encoding same |
EP3019603A1 (en) | 2013-07-09 | 2016-05-18 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
CN105555951A (zh) | 2013-07-19 | 2016-05-04 | 丹尼斯科美国公司 | 包含脂解酶变体的组合物和方法 |
EP2832853A1 (en) | 2013-07-29 | 2015-02-04 | Henkel AG&Co. KGAA | Detergent composition comprising protease variants |
EP3613853A1 (en) | 2013-07-29 | 2020-02-26 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
RU2670946C9 (ru) | 2013-07-29 | 2018-11-26 | Новозимс А/С | Варианты протеазы и кодирующие их полинуклеотиды |
WO2015050723A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof |
WO2015049370A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Novozymes A/S | Detergent composition and use of detergent composition |
US20160186102A1 (en) | 2013-10-03 | 2016-06-30 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof |
UA119331C2 (uk) | 2013-11-08 | 2019-06-10 | Новозімес Біоаґ А/С | Композиції та способи для обробки від шкідників |
MX2016006489A (es) | 2013-11-20 | 2016-08-03 | Danisco Us Inc | Alfa-amilasas variantes que tienen susceptibilidad reducida a la escision por proteasas y metodos de uso. |
WO2015077278A1 (en) | 2013-11-20 | 2015-05-28 | Novozymes Bioag A/S | Compositions and methods comprising chromobacterium for controlling plant nematode pests and plant insect pests |
WO2015094809A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Danisco Us Inc. | Chimeric fungal alpha-amylases comprising carbohydrate binding module and the use thereof |
EP3083954B1 (en) | 2013-12-20 | 2018-09-26 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
US10463701B2 (en) | 2013-12-31 | 2019-11-05 | DuPont Nutrition BioScience ApS | Blends of Bacillus strains and enzymes |
JP6585602B2 (ja) | 2013-12-31 | 2019-10-02 | ダニスコ・ユーエス・インク | タンパク質発現の増大 |
CN105849121B (zh) | 2014-01-22 | 2020-12-29 | 诺维信公司 | 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 |
EP3114219A1 (en) | 2014-03-05 | 2017-01-11 | Novozymes A/S | Compositions and methods for improving properties of non-cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase |
CN106062271A (zh) | 2014-03-05 | 2016-10-26 | 诺维信公司 | 用于改进具有木葡聚糖内糖基转移酶的纤维素纺织材料的性质的组合物和方法 |
EP3117001B1 (en) | 2014-03-12 | 2019-02-20 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
JP6591998B2 (ja) * | 2014-03-28 | 2019-10-16 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 低pHでのタンパク質結晶の再可溶化 |
US20170015950A1 (en) | 2014-04-01 | 2017-01-19 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha amylase activity |
WO2015155350A1 (en) | 2014-04-11 | 2015-10-15 | Novozymes A/S | Detergent composition |
CN106715465B (zh) | 2014-04-15 | 2021-10-08 | 诺维信公司 | 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 |
US10023852B2 (en) | 2014-05-27 | 2018-07-17 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
AR100605A1 (es) | 2014-05-27 | 2016-10-19 | Novozymes As | Métodos para la producción de lipasas |
US20170121695A1 (en) | 2014-06-12 | 2017-05-04 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
WO2016001319A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Novozymes A/S | Improved stabilization of non-protease enzyme |
EP3739029A1 (en) | 2014-07-04 | 2020-11-18 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
WO2016001449A1 (en) * | 2014-07-04 | 2016-01-07 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
WO2016054528A2 (en) | 2014-10-03 | 2016-04-07 | Monosol, Llc | Degradable materials and packaging made from same |
EP3172329A1 (en) | 2014-10-24 | 2017-05-31 | Danisco US Inc. | Method for producing alcohol by use of a tripeptidyl peptidase |
WO2016079110A2 (en) | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Novozymes A/S | Use of enzyme for cleaning |
US10287562B2 (en) | 2014-11-20 | 2019-05-14 | Novoszymes A/S | Alicyclobacillus variants and polynucleotides encoding same |
EP3227442B1 (en) | 2014-12-05 | 2022-02-16 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
WO2016096714A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent composition comprising subtilase variants |
WO2016096996A1 (en) | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having n-acetyl glucosamine oxidase activity |
EP3233893B1 (en) | 2014-12-16 | 2021-01-20 | Danisco US Inc. | Enhanced protein expression |
CN107109388A (zh) | 2014-12-19 | 2017-08-29 | 诺维信公司 | 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
US11518987B2 (en) | 2014-12-19 | 2022-12-06 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
US20170369537A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-12-28 | Danisco Us Inc. | Enhanced protein expression |
CN107404922B (zh) | 2015-03-30 | 2021-09-14 | 雀巢产品有限公司 | 乳基蛋白质水解物及由其制备的组合物 |
EP3280267A1 (en) | 2015-04-06 | 2018-02-14 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Proteases for high protein fermented milk products |
EP3280791A1 (en) | 2015-04-10 | 2018-02-14 | Novozymes A/S | Laundry method, use of dnase and detergent composition |
EP3280800A1 (en) | 2015-04-10 | 2018-02-14 | Novozymes A/S | Detergent composition |
WO2016184944A1 (en) | 2015-05-19 | 2016-11-24 | Novozymes A/S | Odor reduction |
EP3303536B1 (en) | 2015-06-02 | 2019-04-17 | Unilever PLC | Laundry detergent composition |
EP3101108B1 (en) | 2015-06-04 | 2018-01-31 | The Procter and Gamble Company | Hand dishwashing liquid detergent composition |
EP3101109B1 (en) | 2015-06-04 | 2018-03-07 | The Procter and Gamble Company | Hand dishwashing liquid detergent composition |
EP3101102B2 (en) | 2015-06-05 | 2023-12-13 | The Procter & Gamble Company | Compacted liquid laundry detergent composition |
PL3101100T3 (pl) | 2015-06-05 | 2018-07-31 | The Procter And Gamble Company | Zagęszczone płynne kompozycje detergentowe do prania |
EP3101107B1 (en) | 2015-06-05 | 2019-04-24 | The Procter and Gamble Company | Compacted liquid laundry detergent composition |
BR112017026234B1 (pt) | 2015-06-11 | 2022-10-04 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de detergente para lavagem de roupas e método de tratamento doméstico de um tecido |
WO2016202739A1 (en) | 2015-06-16 | 2016-12-22 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
EP3310688A1 (en) | 2015-06-17 | 2018-04-25 | Novozymes A/S | Container |
BR112017027402B1 (pt) | 2015-06-26 | 2022-05-10 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de detergente para lavagem de roupas e método de tratamento doméstico de um tecido |
US20180171271A1 (en) | 2015-06-30 | 2018-06-21 | Novozymes A/S | Laundry detergent composition, method for washing and use of composition |
US10920203B2 (en) | 2015-07-01 | 2021-02-16 | Novozymes A/S | Methods of reducing odor |
CN107969136B (zh) | 2015-07-06 | 2021-12-21 | 诺维信公司 | 脂肪酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
CN108026487B (zh) | 2015-09-17 | 2021-04-30 | 汉高股份有限及两合公司 | 包含具有黄原胶降解活性的多肽的洗涤剂组合物 |
WO2017046260A1 (en) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same |
EP3356504B1 (en) | 2015-10-01 | 2019-08-14 | Unilever PLC | Powder laundry detergent composition |
MX2018002831A (es) | 2015-10-07 | 2018-09-28 | Novozymes As | Polipeptidos. |
CN108291215A (zh) | 2015-10-14 | 2018-07-17 | 诺维信公司 | 具有蛋白酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸 |
EP3362556B1 (en) | 2015-10-14 | 2024-07-10 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
BR112018007474A2 (pt) | 2015-10-14 | 2018-10-30 | Novozymes A/S | ?limpeza de membranas de filtração de água? |
WO2016203064A2 (en) | 2015-10-28 | 2016-12-22 | Novozymes A/S | Detergent composition comprising protease and amylase variants |
BR112018009235B1 (pt) | 2015-11-09 | 2022-11-22 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Composição de aditivo alimentar, método de preparação da mesma, uso de um microorganismo de alimentação direta, kit, composição alimentar, e pré-mistura |
EP3380608A1 (en) | 2015-11-24 | 2018-10-03 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
US10870838B2 (en) | 2015-12-01 | 2020-12-22 | Novozymes A/S | Methods for producing lipases |
MX2018007067A (es) | 2015-12-09 | 2018-08-01 | Basf Se | Metodo de purificacion de una proteina a partir de solidos de fermentacion en condiciones de desorcion. |
WO2017100720A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
WO2017117089A1 (en) | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Novozymes Bioag A/S | Heat priming of bacterial spores |
CA3006607A1 (en) | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Novozymes A/S | Enzyme variants and polynucleotides encoding the same |
US20210171927A1 (en) | 2016-01-29 | 2021-06-10 | Novozymes A/S | Beta-glucanase variants and polynucleotides encoding same |
EP3205393A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-16 | Basf Se | Process for preparation of microcapsules |
EP3205392A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-16 | Basf Se | Microcapsules and process for preparation of microcapsules |
EP3417040B1 (en) | 2016-02-17 | 2019-09-04 | Unilever PLC | Whitening composition |
WO2017140391A1 (en) | 2016-02-17 | 2017-08-24 | Unilever Plc | Whitening composition |
CN108884415A (zh) | 2016-03-21 | 2018-11-23 | 荷兰联合利华有限公司 | 洗衣洗涤剂组合物 |
EP3715442A1 (en) | 2016-03-23 | 2020-09-30 | Novozymes A/S | Use of polypeptide having dnase activity for treating fabrics |
WO2017173324A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
WO2017173190A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
EP3440172B1 (en) | 2016-04-08 | 2019-08-21 | Unilever PLC | Laundry detergent composition |
CN109312270B (zh) | 2016-04-08 | 2022-01-28 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物及其用途 |
WO2017182295A1 (en) | 2016-04-18 | 2017-10-26 | Basf Se | Liquid cleaning compositions |
EP3448978B1 (en) | 2016-04-29 | 2020-03-11 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
CN109415421B (zh) | 2016-05-03 | 2023-02-28 | 诺维信公司 | α-淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
MX2018013556A (es) | 2016-05-09 | 2019-03-14 | Novozymes As | Polipeptidos variantes con rendimiento mejorado y uso de los mismos. |
WO2017210188A1 (en) | 2016-05-31 | 2017-12-07 | Novozymes A/S | Stabilized liquid peroxide compositions |
CN114381342A (zh) | 2016-06-23 | 2022-04-22 | 诺维信公司 | 酶的用途、组合物以及用于去除污垢的方法 |
CN109563495A (zh) | 2016-06-30 | 2019-04-02 | 诺维信公司 | 脂肪酶变体及包含表面活性剂和脂肪酶变体的组合物 |
WO2018002261A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
CN109715794A (zh) | 2016-07-05 | 2019-05-03 | 诺维信公司 | 果胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
WO2018007573A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | Novozymes A/S | Detergent compositions with galactanase |
CN109642222A (zh) | 2016-07-13 | 2019-04-16 | 诺维信公司 | 食物芽孢杆菌dna酶变体 |
MX2019000621A (es) | 2016-07-14 | 2019-08-01 | Basf Se | Medio de fermentacion que comprende agente quelante. |
EP4357453A2 (en) | 2016-07-18 | 2024-04-24 | Novozymes A/S | Lipase variants, polynucleotides encoding same and the use thereof |
WO2018029021A1 (en) | 2016-08-08 | 2018-02-15 | Basf Se | Liquid laundry formulation |
EP3284805B1 (en) | 2016-08-17 | 2020-02-19 | The Procter & Gamble Company | Cleaning composition comprising enzymes |
US11512300B2 (en) | 2016-08-24 | 2022-11-29 | Novozymes A/S | Xanthan lyase variants and polynucleotides encoding same |
CN109563498A (zh) | 2016-08-24 | 2019-04-02 | 汉高股份有限及两合公司 | 包含黄原胶裂解酶变体i的洗涤剂组合物 |
EP3504313A1 (en) | 2016-08-24 | 2019-07-03 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising gh9 endoglucanase variants i |
CA3031609A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | Novozymes A/S | Gh9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same |
CN109790491B (zh) | 2016-09-27 | 2021-02-23 | 荷兰联合利华有限公司 | 家用洗衣方法 |
CN110023474A (zh) | 2016-09-29 | 2019-07-16 | 诺维信公司 | 酶用于洗涤的用途、洗涤方法和器皿洗涤组合物 |
CN109996859B (zh) | 2016-09-29 | 2021-11-30 | 诺维信公司 | 含孢子的颗粒 |
EP3532592A1 (en) | 2016-10-25 | 2019-09-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
US11753605B2 (en) | 2016-11-01 | 2023-09-12 | Novozymes A/S | Multi-core granules |
CA3043443A1 (en) | 2016-12-01 | 2018-06-07 | Basf Se | Stabilization of enzymes in compositions |
WO2018108865A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Novozymes A/S | Use of polypeptides |
BR112019011999B1 (pt) | 2016-12-15 | 2022-11-08 | Unilever Ip Holdings B.V | Composição de detergente líquida aquosa para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido |
US11866713B2 (en) | 2017-02-24 | 2024-01-09 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods for increased protein production in bacillus licheniformis |
WO2018177938A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Novozymes A/S | Polypeptides having dnase activity |
WO2018177936A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Novozymes A/S | Polypeptides having dnase activity |
US11149233B2 (en) | 2017-03-31 | 2021-10-19 | Novozymes A/S | Polypeptides having RNase activity |
WO2018184004A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Danisco Us Inc | Alpha-amylase combinatorial variants |
US20200109388A1 (en) | 2017-04-03 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Recovery Process |
US20200109352A1 (en) | 2017-04-04 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Polypeptide compositions and uses thereof |
US20200109354A1 (en) | 2017-04-04 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Polypeptides |
CN110651029B (zh) | 2017-04-04 | 2022-02-15 | 诺维信公司 | 糖基水解酶 |
ES2728758T3 (es) | 2017-04-05 | 2019-10-28 | Henkel Ag & Co Kgaa | Composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas |
EP3385362A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-10 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising fungal mannanases |
US11407964B2 (en) | 2017-04-06 | 2022-08-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2018185280A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2018185285A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
EP3607042A1 (en) | 2017-04-06 | 2020-02-12 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
CA3058519A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions comprosing a dnase and a protease |
WO2018184873A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
US10968416B2 (en) | 2017-04-06 | 2021-04-06 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2018184818A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2018202846A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Novozymes A/S | Compositions comprising lipase and sulfite |
WO2018206300A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2018206535A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Novozymes A/S | Carbohydrate-binding domain and polynucleotides encoding the same |
EP3401385A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-14 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising polypeptide comprising carbohydrate-binding domain |
CA3058095A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2018224544A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Novozymes A/S | Compositions comprising polypeptides having cellulase activity and amylase activity, and uses thereof in cleaning and detergent compositions |
US20200181542A1 (en) | 2017-06-30 | 2020-06-11 | Novozymes A/S | Enzyme Slurry Composition |
WO2019008036A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Unilever Plc | WHITENING COMPOSITION |
BR112020000205B1 (pt) | 2017-07-07 | 2023-10-31 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de limpeza para a lavagem de tecidos e método doméstico de tratamento de um tecido |
EP3665267A1 (en) | 2017-08-07 | 2020-06-17 | Novozymes A/S | Use of fca control based on ph |
AR112778A1 (es) | 2017-08-07 | 2019-12-11 | Novozymes As | Fermentador equipado con eyector |
US11441139B2 (en) | 2017-08-18 | 2022-09-13 | Danisco Us Inc (157111) | α-Amylase variants |
EP3655537A1 (en) | 2017-08-23 | 2020-05-27 | Danisco US Inc. | Methods and compositions for efficient genetic modifications of bacillus licheniformis strains |
CN111344404A (zh) | 2017-08-24 | 2020-06-26 | 诺维信公司 | 黄原胶裂解酶变体以及编码其的多核苷酸 |
US11624059B2 (en) | 2017-08-24 | 2023-04-11 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent compositions comprising GH9 endoglucanase variants II |
WO2019038058A1 (en) | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Novozymes A/S | GH9 ENDOGLUCANASE VARIANTS AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SUCH VARIANTS |
EP3673060A1 (en) | 2017-08-24 | 2020-07-01 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising xanthan lyase variants ii |
EP3682010A1 (en) | 2017-09-13 | 2020-07-22 | Danisco US Inc. | Modified 5'-untranslated region (utr) sequences for increased protein production in bacillus |
US20200277553A1 (en) | 2017-09-20 | 2020-09-03 | Novozymes A/S | Use of Enzymes for Improving Water Absorption And/Or Whiteness |
US11414814B2 (en) | 2017-09-22 | 2022-08-16 | Novozymes A/S | Polypeptides |
JP7317811B2 (ja) | 2017-09-27 | 2023-07-31 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | リパーゼ変異体及びかかるリパーゼ変異体を含むマイクロカプセル組成物 |
WO2019067390A1 (en) | 2017-09-27 | 2019-04-04 | The Procter & Gamble Company | DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING LIPASES |
CN111373036A (zh) | 2017-10-02 | 2020-07-03 | 诺维信公司 | 具有甘露聚糖酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 |
WO2019068713A1 (en) | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Novozymes A/S | POLYPEPTIDES HAVING MANNANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THESE POLYPEPTIDES |
WO2019076800A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Novozymes A/S | CLEANING COMPOSITIONS AND USES THEREOF |
CN111448302A (zh) | 2017-10-16 | 2020-07-24 | 诺维信公司 | 低粉化颗粒 |
WO2019076834A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Novozymes A/S | PELLETS WITH LOW DUST CONTENT |
WO2019081515A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Novozymes A/S | COMPOSITIONS COMPRISING POLYPEPTIDES HAVING MANNANASE ACTIVITY |
CN111386340B (zh) | 2017-10-27 | 2024-05-24 | 宝洁公司 | 包含多肽变体的洗涤剂组合物 |
EP3701017A1 (en) | 2017-10-27 | 2020-09-02 | Novozymes A/S | Dnase variants |
DE102017125558A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine i enthalten |
BR112020008737A2 (pt) | 2017-11-01 | 2020-10-13 | Novozymes A/S | polipeptídeos e composições que compreendam tais polipeptídeos |
DE102017125560A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten |
DE102017125559A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine ii enthalten |
CN111479919A (zh) | 2017-11-01 | 2020-07-31 | 诺维信公司 | 多肽以及包含此类多肽的组合物 |
EP3704220A1 (en) | 2017-11-01 | 2020-09-09 | Novozymes A/S | Methods for cleaning medical devices |
WO2019089898A1 (en) | 2017-11-02 | 2019-05-09 | Danisco Us Inc | Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes |
CN111315879A (zh) | 2017-11-09 | 2020-06-19 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含有机白色颜料的酶颗粒涂层 |
JP2021504546A (ja) | 2017-11-29 | 2021-02-15 | ビーエイエスエフ・ソシエタス・エウロパエアBasf Se | 組成物、その製造方法および使用方法 |
EP3717616B1 (en) | 2017-11-30 | 2021-10-13 | Unilever IP Holdings B.V. | Detergent composition comprising protease |
US11725197B2 (en) | 2017-12-04 | 2023-08-15 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
DK3735478T3 (da) | 2018-01-03 | 2023-10-30 | Danisco Us Inc | Mutante og genmodificerede bacillus-celler og fremgangsmåder dertil til forøget proteinproduktion |
CN111801416A (zh) | 2018-02-08 | 2020-10-20 | 诺维信公司 | 脂肪酶变体及其组合物 |
CN111868239A (zh) | 2018-02-08 | 2020-10-30 | 诺维信公司 | 脂肪酶、脂肪酶变体及其组合物 |
KR20200124258A (ko) | 2018-02-23 | 2020-11-02 | 헨켈 아게 운트 코. 카게아아 | 크산탄 리아제 및 엔도글루카나제 변이체를 포함하는 세제 조성물 |
CN111770788B (zh) | 2018-03-13 | 2023-07-25 | 诺维信公司 | 使用氨基糖低聚物进行微囊化 |
WO2019185726A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2019201793A1 (en) | 2018-04-17 | 2019-10-24 | Novozymes A/S | Polypeptides comprising carbohydrate binding activity in detergent compositions and their use in reducing wrinkles in textile or fabric. |
US11661592B2 (en) | 2018-04-19 | 2023-05-30 | Novozymes A/S | Stabilized endoglucanase variants |
WO2019201785A1 (en) | 2018-04-19 | 2019-10-24 | Novozymes A/S | Stabilized cellulase variants |
CN112368375A (zh) | 2018-04-26 | 2021-02-12 | 巴斯夫欧洲公司 | 脂肪酶 |
WO2019211143A1 (en) | 2018-05-03 | 2019-11-07 | Basf Se | Amylase enzymes |
CN112119147B (zh) | 2018-05-17 | 2023-09-29 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 清洁组合物 |
WO2019238761A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-19 | Basf Se | Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes |
CN112368363A (zh) | 2018-06-28 | 2021-02-12 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物及其用途 |
EP3814473A1 (en) | 2018-06-29 | 2021-05-05 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
WO2020002255A1 (en) | 2018-06-29 | 2020-01-02 | Novozymes A/S | Subtilase variants and compositions comprising same |
WO2020007863A1 (en) | 2018-07-02 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2020007875A1 (en) | 2018-07-03 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2020008043A1 (en) | 2018-07-06 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2020008024A1 (en) | 2018-07-06 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
MX2021001213A (es) | 2018-07-31 | 2021-08-24 | Danisco Us Inc | Variantes de alfa-amilasas que tienen sustituciones de aminoácidos que bajan el pka del ácido general. |
WO2020030623A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Basf Se | Packaging unit comprising a detergent composition containing an enzyme and at least one chelating agent |
WO2020058024A1 (en) | 2018-09-17 | 2020-03-26 | Unilever Plc | Detergent composition |
US20210340466A1 (en) | 2018-10-01 | 2021-11-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
WO2020070014A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition comprising anionic surfactant and a polypeptide having rnase activity |
WO2020070011A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition |
WO2020070209A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition |
WO2020070249A1 (en) | 2018-10-03 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions |
US11993762B2 (en) | 2018-10-03 | 2024-05-28 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha-mannan degrading activity and polynucleotides encoding same |
JP2022512599A (ja) | 2018-10-05 | 2022-02-07 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 液体中のアミラーゼを安定化する化合物 |
US20210395650A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-12-23 | Basf Se | Compounds stabilizing hydrolases in liquids |
JP2022504190A (ja) | 2018-10-05 | 2022-01-13 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 液体中のヒドロラーゼを安定化する化合物 |
EP3677676A1 (en) | 2019-01-03 | 2020-07-08 | Basf Se | Compounds stabilizing amylases in liquids |
EP3864124A1 (en) | 2018-10-11 | 2021-08-18 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2020077331A2 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Danisco Us Inc | Alpha-amylases with mutations that improve stability in the presence of chelants |
EP3647398B1 (en) | 2018-10-31 | 2024-05-15 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions containing dispersins v |
EP3647397A1 (en) | 2018-10-31 | 2020-05-06 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions containing dispersins iv |
WO2020099490A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising enzymes |
WO2020104231A1 (en) | 2018-11-19 | 2020-05-28 | Basf Se | Powders and granules containing a chelating agent and an enzyme |
BR112021009785A2 (pt) | 2018-11-20 | 2021-08-17 | Unilever Ip Holdings B.V. | composição detergente, método de tratamento de um substrato de tecido e uso de uma enzima |
TW202033100A (zh) | 2018-11-20 | 2020-09-16 | 丹麥商杜邦營養生物科學有限公司 | 經改造之強健高Tm值的植酸酶類多肽及其片段 |
CN113056550B (zh) | 2018-11-20 | 2022-10-28 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
BR112021009789A2 (pt) | 2018-11-20 | 2021-08-17 | Unilever Ip Holdings B.V. | composição detergente, método de tratamento de um substrato de tecido e uso de uma enzima esterase |
EP3884022B1 (en) | 2018-11-20 | 2024-06-12 | Unilever Global Ip Limited | Detergent composition |
CN113166689A (zh) | 2018-11-20 | 2021-07-23 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
EP3891264A1 (en) | 2018-12-03 | 2021-10-13 | Novozymes A/S | LOW pH POWDER DETERGENT COMPOSITION |
US20220056379A1 (en) | 2018-12-03 | 2022-02-24 | Novozymes A/S | Powder Detergent Compositions |
US11959111B2 (en) | 2018-12-21 | 2024-04-16 | Novozymes A/S | Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same |
CN113330101A (zh) | 2018-12-21 | 2021-08-31 | 诺维信公司 | 包含金属蛋白酶的洗涤剂袋 |
EP3927837A1 (en) | 2019-02-20 | 2021-12-29 | Basf Se | Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed |
CN114127256A (zh) | 2019-02-20 | 2022-03-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 用确定成分培养基和微量元素补料的芽孢杆菌工业发酵工艺 |
EP3702452A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-02 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising two proteases |
BR112021018731A2 (pt) | 2019-03-21 | 2021-12-21 | Novozymes As | Variantes de alfa-amilase e polinucleotídeos codificando as mesmas |
WO2020193535A2 (en) | 2019-03-25 | 2020-10-01 | Basf Se | Amylase enzymes |
EP3947664A2 (en) | 2019-03-25 | 2022-02-09 | Basf Se | Amylase enzymes |
CN113795578A (zh) * | 2019-04-02 | 2021-12-14 | 诺维信公司 | 液体餐具清洗洗涤剂组合物 |
US20220169953A1 (en) | 2019-04-03 | 2022-06-02 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucanase activity, polynucleotides encoding same and uses thereof in cleaning and detergent compositions |
WO2020207944A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
US20220186151A1 (en) | 2019-04-12 | 2022-06-16 | Novozymes A/S | Stabilized glycoside hydrolase variants |
WO2020229480A1 (en) | 2019-05-14 | 2020-11-19 | Basf Se | Compounds stabilizing hydrolases in liquids |
BR112021022167A2 (pt) | 2019-05-16 | 2022-01-18 | Unilever Ip Holdings B V | Composição de lavanderia auxiliar, método para administrar enzimas a tecidos, método para aprimorar o benefício amaciante de um condicionador de tecido e uso de uma composição de lavanderia auxiliar |
US20220275355A1 (en) | 2019-06-13 | 2022-09-01 | Basf Se | Method of Recovering a Protein from Fermentation Broth Using a Divalent Cation |
US20220306791A1 (en) | 2019-06-14 | 2022-09-29 | Basf Se | Aqueous polymer dispersions suitable as opacifiers in liquid formulations |
BR112021025261A2 (pt) | 2019-06-28 | 2022-04-26 | Unilever Ip Holdings B V | Composição detergente e método doméstico para tratar um tecido |
BR112021025399A2 (pt) | 2019-06-28 | 2022-04-26 | Unilever Ip Holdings B V | Composição detergente e método doméstico para tratar um tecido |
WO2020260006A1 (en) | 2019-06-28 | 2020-12-30 | Unilever Plc | Detergent compositions |
WO2020259949A1 (en) | 2019-06-28 | 2020-12-30 | Unilever Plc | Detergent composition |
US20220372400A1 (en) | 2019-06-28 | 2022-11-24 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Detergent composition |
US20220364022A1 (en) | 2019-06-28 | 2022-11-17 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Detergent composition |
CN114008068A (zh) | 2019-07-01 | 2022-02-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 稳定酶的肽缩醛 |
US20220340865A1 (en) | 2019-07-02 | 2022-10-27 | Basf Se | Method for preparing a fermentation medium |
CN114207123A (zh) | 2019-07-02 | 2022-03-18 | 诺维信公司 | 脂肪酶变体及其组合物 |
MX2022000253A (es) | 2019-07-05 | 2022-02-03 | Basf Se | Proceso de fermentacion industrial para celulas microbianas mediante el uso de un precultivo de alimentacion por lotes. |
MX2022000355A (es) | 2019-07-09 | 2022-03-17 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Composiciones de enzimas particuladas recubiertas de grasa. |
WO2021009067A1 (en) | 2019-07-12 | 2021-01-21 | Novozymes A/S | Enzymatic emulsions for detergents |
BR112022002779A2 (pt) | 2019-08-16 | 2022-08-09 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Composições para saúde intestinal que compreendem combinações de cepas de lactobacillus |
JP2022545465A (ja) | 2019-08-22 | 2022-10-27 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | アミラーゼバリアント |
US20220325204A1 (en) | 2019-08-27 | 2022-10-13 | Novozymes A/S | Detergent composition |
CN114555769A (zh) | 2019-08-27 | 2022-05-27 | 诺维信公司 | 包含脂肪酶的组合物 |
AR119874A1 (es) | 2019-09-02 | 2022-01-19 | Unilever Nv | Composición detergente con un derivado de éster de ácido cítrico de un monoglicérido |
WO2021046073A1 (en) | 2019-09-05 | 2021-03-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed composition |
US20220315866A1 (en) | 2019-09-19 | 2022-10-06 | Novozymes A/S | Detergent Composition |
DE112020004477T5 (de) | 2019-09-19 | 2022-06-30 | Unilever Global Ip Limited | Detergenszusammensetzungen |
WO2021064068A1 (en) | 2019-10-03 | 2021-04-08 | Novozymes A/S | Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains |
AR120142A1 (es) | 2019-10-07 | 2022-02-02 | Unilever Nv | Composición detergente |
EP4045625A1 (en) | 2019-10-18 | 2022-08-24 | Basf Se | Storage-stable hydrolase containing liquids |
US20220395543A1 (en) | 2019-10-21 | 2022-12-15 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Compositions for gut health |
CN114846023A (zh) | 2019-10-24 | 2022-08-02 | 丹尼斯科美国公司 | 成麦芽五糖/麦芽六糖变体α-淀粉酶 |
WO2021102238A1 (en) | 2019-11-20 | 2021-05-27 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Thermostable phytase variants |
WO2021105336A1 (en) | 2019-11-29 | 2021-06-03 | Basf Se | Compositions comprising polymer and enzyme |
WO2021115912A1 (en) | 2019-12-09 | 2021-06-17 | Basf Se | Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes |
CN115103602A (zh) | 2019-12-19 | 2022-09-23 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 日粮配制品 |
WO2021122118A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Cleaning compositions comprising dispersins vi |
EP4077656A2 (en) | 2019-12-20 | 2022-10-26 | Novozymes A/S | Polypeptides having proteolytic activity and use thereof |
AU2020405786A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-08-11 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Cleaning compositions comprising dispersins IX |
CN114929848A (zh) | 2019-12-20 | 2022-08-19 | 诺维信公司 | 稳定的液体无硼酶组合物 |
WO2021122117A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Cleaning composition coprising a dispersin and a carbohydrase |
JP2023524334A (ja) | 2020-01-15 | 2023-06-12 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス・リケニフォルミス(bacillus licheniformis)における強化したタンパク質産生のための組成物及び方法 |
US20230407208A1 (en) | 2020-01-29 | 2023-12-21 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Laundry detergent product |
WO2021152120A1 (en) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
BR112022014946A2 (pt) | 2020-01-31 | 2022-10-04 | Novozymes As | Variantes de mananase e polinucleotídeos codificando as mesmas |
EP4099838A1 (en) | 2020-02-07 | 2022-12-14 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Feed compositions for animal health |
WO2021160818A1 (en) | 2020-02-14 | 2021-08-19 | Basf Se | Mannanase variants |
BR112022017034A2 (pt) | 2020-02-28 | 2022-12-13 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Composições de ração |
EP3892708A1 (en) | 2020-04-06 | 2021-10-13 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions comprising dispersin variants |
CN115210371A (zh) | 2020-04-08 | 2022-10-18 | 诺维信公司 | 碳水化合物结合模块变体 |
EP4139431A1 (en) | 2020-04-21 | 2023-03-01 | Novozymes A/S | Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity |
EP3907271A1 (en) | 2020-05-07 | 2021-11-10 | Novozymes A/S | Cleaning composition, use and method of cleaning |
WO2021239818A1 (en) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | Novozymes A/S | Subtilase variants and compositions comprising same |
WO2021249927A1 (en) | 2020-06-08 | 2021-12-16 | Unilever Ip Holdings B.V. | Method of improving protease activity |
US20230235250A1 (en) | 2020-06-18 | 2023-07-27 | Basf Se | Compositions and Their Use |
CN115836125A (zh) | 2020-06-24 | 2023-03-21 | 诺维信公司 | 纤维素酶用于从纺织品去除尘螨的用途 |
EP3936593A1 (en) | 2020-07-08 | 2022-01-12 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions and uses thereof |
EP4179053B1 (en) | 2020-07-09 | 2024-04-03 | Basf Se | Compositions and their applications |
WO2022008732A1 (en) | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Basf Se | Enhancing the activity of antimicrobial preservatives |
WO2022023250A1 (en) | 2020-07-27 | 2022-02-03 | Unilever Ip Holdings B.V. | Use of an enzyme and surfactant for inhibiting microorganisms |
KR20230057391A (ko) | 2020-08-24 | 2023-04-28 | 노보자임스 에이/에스 | 프럭타나제를 포함하는 구강 관리 조성물 |
WO2022043321A2 (en) | 2020-08-25 | 2022-03-03 | Novozymes A/S | Variants of a family 44 xyloglucanase |
BR112023001773A2 (pt) | 2020-08-28 | 2023-03-28 | Unilever Ip Holdings B V | Composição detergente e método |
US20230287302A1 (en) | 2020-08-28 | 2023-09-14 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Detergent composition |
WO2022043045A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Unilever Ip Holdings B.V. | Detergent composition |
US20230287300A1 (en) | 2020-08-28 | 2023-09-14 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Surfactant and detergent composition |
WO2022043042A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Unilever Ip Holdings B.V. | Detergent composition |
US20230323330A1 (en) | 2020-08-28 | 2023-10-12 | Novozymes A/S | Polyester degrading protease variants |
EP4213641A1 (en) | 2020-09-15 | 2023-07-26 | Novozymes A/S | Animal feed comprising insects or insect meal |
BR112023005106A2 (pt) | 2020-09-22 | 2023-04-18 | Basf Se | Composição líquida, formulação de detergente líquida, e, usos de pelo menos um diol (exceto 1,2-proanodiol) e das formulações de detergente |
WO2022074037A2 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
WO2022081947A1 (en) | 2020-10-16 | 2022-04-21 | Dupont Nutrition Biosciences | Feed compositions for animal health |
WO2022083949A1 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-28 | Basf Se | Compositions and their use |
EP4232539A2 (en) | 2020-10-20 | 2023-08-30 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having dnase activity |
EP4237525A1 (en) | 2020-10-28 | 2023-09-06 | Novozymes A/S | Use of lipoxygenase |
JP2023547450A (ja) | 2020-10-29 | 2023-11-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | リパーゼ変異体及びそのようなリパーゼ変異体を含む組成物 |
US20230407209A1 (en) | 2020-11-13 | 2023-12-21 | Novozymes A/S | Detergent Composition Comprising a Lipase |
WO2022106400A1 (en) | 2020-11-18 | 2022-05-27 | Novozymes A/S | Combination of immunochemically different proteases |
US20240010950A1 (en) | 2020-12-07 | 2024-01-11 | Conopco Inc., D/B/A Unilever | Detergent compositions |
EP4256019A1 (en) | 2020-12-07 | 2023-10-11 | Unilever IP Holdings B.V. | Detergent compositions |
EP4015629A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-22 | Basf Se | Polymer mixtures for increasing stability and performance of hydrolase-containing detergents |
EP4032966A1 (en) | 2021-01-22 | 2022-07-27 | Novozymes A/S | Liquid enzyme composition with sulfite scavenger |
EP4284905A1 (en) | 2021-01-28 | 2023-12-06 | Novozymes A/S | Lipase with low malodor generation |
WO2022169933A2 (en) | 2021-02-03 | 2022-08-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Compositions for gut health |
EP4039806A1 (en) | 2021-02-04 | 2022-08-10 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising xanthan lyase and endoglucanase variants with im-proved stability |
WO2022171872A1 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Novozymes A/S | Stabilized biological detergents |
WO2022171780A2 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
EP4305146A1 (en) | 2021-03-12 | 2024-01-17 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
EP4060036A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-21 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
WO2022194673A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-22 | Novozymes A/S | Dnase variants |
EP4314222A1 (en) | 2021-03-26 | 2024-02-07 | Novozymes A/S | Detergent composition with reduced polymer content |
EP4359518A1 (en) | 2021-06-23 | 2024-05-01 | Novozymes A/S | Alpha-amylase polypeptides |
CN117881772A (zh) | 2021-08-20 | 2024-04-12 | 丹尼斯科美国公司 | 编码新型核酸酶的多核苷酸、其组合物及其从蛋白质制剂中消除dna的方法 |
CN117957300A (zh) | 2021-09-20 | 2024-04-30 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
CA3232987A1 (en) | 2021-09-27 | 2023-03-30 | Marion BERNARDEAU | Feed additive compositions and methods for using the same |
CN118202030A (zh) | 2021-10-13 | 2024-06-14 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含聚合物的组合物、聚合物及其用途 |
WO2023066741A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Basf Se | Phosphate-free composition and methods for their manufacture and use |
WO2023088776A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
WO2023088761A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
WO2023088777A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
CA3241094A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Jonathan LASSILA | Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases |
WO2023110599A2 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Basf Se | Compositions and their applications |
WO2023116569A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Novozymes A/S | Composition comprising a lipase and a booster |
EP4206309A1 (en) | 2021-12-30 | 2023-07-05 | Novozymes A/S | Protein particles with improved whiteness |
WO2023148086A1 (en) | 2022-02-04 | 2023-08-10 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
EP4234664A1 (en) | 2022-02-24 | 2023-08-30 | Evonik Operations GmbH | Composition comprising glucolipids and enzymes |
WO2023165507A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Novozymes A/S | Use of xyloglucanase for improvement of sustainability of detergents |
WO2023165950A1 (en) | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Novozymes A/S | Dnase variants and compositions |
WO2023194204A1 (en) | 2022-04-08 | 2023-10-12 | Novozymes A/S | Hexosaminidase variants and compositions |
WO2023227331A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition comprising a specific methyl ester ethoxylate surfactant and a lipase |
WO2023227332A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an alkoxylated zwitterionic polyamine polymer and a protease |
WO2023227335A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Liquid composition comprising linear alkyl benzene sulphonate, methyl ester ethoxylate and alkoxylated zwitterionic polyamine polymer |
WO2023227356A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition containing enzyme |
WO2023227375A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an aminocarboxylate, an organic acid and a fragrance |
WO2023227421A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an alkoxylated zwitterionic polyamine polymer, and a fragrance |
CN114836408B (zh) * | 2022-05-28 | 2023-09-19 | 湖北大学 | 含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用 |
WO2023233028A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry detergent product |
WO2023247348A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2023247664A2 (en) | 2022-06-24 | 2023-12-28 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions comprising such lipase variants |
WO2024012894A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Basf Se | Alkanolamine formates for enzyme stabilization in liquid formulations |
WO2024056334A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
WO2024056333A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
WO2024056331A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
WO2024056278A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
EP4349943A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
EP4349942A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
EP4349947A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
EP4349948A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
EP4349944A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
EP4349946A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Unit dose fabric treatment product |
EP4349945A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
WO2024083589A1 (en) | 2022-10-18 | 2024-04-25 | Basf Se | Detergent compositions, polymers and methods of manufacturing the same |
EP4361239A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-01 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
WO2024088716A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-02 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition |
WO2024088706A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-02 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition |
WO2024115106A1 (en) | 2022-11-29 | 2024-06-06 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition |
WO2024115754A1 (en) | 2022-12-02 | 2024-06-06 | Basf Se | Aqueous compositions containing polyalkoxylates, polyalkoxylates, and use |
WO2024121058A1 (en) | 2022-12-05 | 2024-06-13 | Novozymes A/S | A composition comprising a lipase and a peptide |
WO2024124013A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | International N&H Denmark Aps | Feed formulations comprising a phytase for dairy ruminant animals |
WO2024126483A1 (en) | 2022-12-14 | 2024-06-20 | Novozymes A/S | Improved lipase (gcl1) variants |
EP4389864A1 (en) | 2022-12-20 | 2024-06-26 | Basf Se | Cutinases |
WO2024133344A1 (en) | 2022-12-20 | 2024-06-27 | Novozymes A/S | A method for providing a candidate biological sequence and related electronic device |
WO2024131880A2 (en) | 2022-12-23 | 2024-06-27 | Novozymes A/S | Detergent composition comprising catalase and amylase |
Family Cites Families (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1234445A (da) | 1967-10-03 | 1971-06-03 | ||
US3929887A (en) | 1970-05-18 | 1975-12-30 | Endo Lab | Alkylenepoly(aralkylamines) and the salts thereof |
US4760025A (en) | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
NZ208612A (en) * | 1983-06-24 | 1991-09-25 | Genentech Inc | Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations |
US5700676A (en) * | 1984-05-29 | 1997-12-23 | Genencor International Inc. | Modified subtilisins having amino acid alterations |
US5972682A (en) * | 1984-05-29 | 1999-10-26 | Genencor International, Inc. | Enzymatically active modified subtilisins |
US4752585A (en) * | 1985-12-17 | 1988-06-21 | Cetus Corporation | Oxidation-resistant muteins |
WO1987004461A1 (en) * | 1986-01-15 | 1987-07-30 | Amgen | THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF |
US5013657A (en) * | 1988-04-12 | 1991-05-07 | Bryan Philip N | Subtilisin mutations |
US4990452A (en) * | 1986-02-12 | 1991-02-05 | Genex Corporation | Combining mutations for stabilization of subtilisin |
JPS63502959A (ja) * | 1986-02-12 | 1988-11-02 | ジェネックス、コ−ポレ−ション | 突然変異誘発及びスクリ−ニング方法並びに生成物 |
US4980288A (en) * | 1986-02-12 | 1990-12-25 | Genex Corporation | Subtilisin with increased thermal stability |
IE65767B1 (en) * | 1986-04-30 | 1995-11-15 | Genencor Int | Non-human carbonyl hydrolase mutants DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors |
JP3026567B2 (ja) * | 1987-02-27 | 2000-03-27 | ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド | 分子のクローニング及びタンパク分解酵素をコードする遺伝子の発現 |
EP0479396B1 (en) * | 1987-02-27 | 1999-06-09 | Genencor International, Inc. | Transformation of alkalophilic bacillus strains |
ATE184316T1 (de) * | 1987-04-06 | 1999-09-15 | Novo Nordisk As | Regelung von elektrostatischen interaktionen an metallionen-bindungsstellen zur stabilisierung von proteinen |
US4914031A (en) * | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
US5122449A (en) * | 1988-10-07 | 1992-06-16 | Eastman Kodak Company | Use of a protease in the extraction of chlamydial, gonococcal and herpes antigens |
US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
DK97190D0 (da) * | 1990-04-19 | 1990-04-19 | Novo Nordisk As | Oxidationsstabile detergentenzymer |
US5766898A (en) * | 1990-12-05 | 1998-06-16 | Novo Nordisk A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
EP0583339B1 (en) * | 1991-05-01 | 1998-07-08 | Novo Nordisk A/S | Stabilized enzymes and detergent compositions |
US6682924B1 (en) * | 1995-05-05 | 2004-01-27 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
US5837517A (en) * | 1995-05-05 | 1998-11-17 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
CA2270180C (en) * | 1996-11-04 | 2011-01-11 | Novo Nordisk A/S | Subtilase variants and compositions |
EP1012251A1 (en) * | 1997-08-29 | 2000-06-28 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
AU8798198A (en) * | 1997-08-29 | 1999-03-22 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
EP1032655B1 (en) * | 1997-11-21 | 2005-06-29 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
US6780629B2 (en) * | 1997-11-21 | 2004-08-24 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
US6773907B2 (en) * | 1997-11-21 | 2004-08-10 | Peter Kamp Hansen | Subtilase enzymes |
US6777218B1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
WO2001075087A2 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Maxygen, Inc. | Subtilisin variants |
AU2001254623A1 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-12 | Novozymes A/S | Production and use of protein variants having modified immunogenicity |
US6799287B1 (en) | 2000-05-01 | 2004-09-28 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Method and apparatus for verifying error correcting codes |
US7109016B2 (en) * | 2000-08-21 | 2006-09-19 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
US6893855B2 (en) * | 2000-10-13 | 2005-05-17 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
DK200101090A (da) * | 2001-07-12 | 2001-08-16 | Novozymes As | Subtilase variants |
US7888093B2 (en) * | 2002-11-06 | 2011-02-15 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
US20070161531A1 (en) * | 2005-07-08 | 2007-07-12 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
-
1988
- 1988-01-07 DK DK006488A patent/DK6488D0/da not_active Application Discontinuation
-
1989
- 1989-01-06 EP EP04025116A patent/EP1498481A1/en not_active Withdrawn
- 1989-01-06 EP EP95107678A patent/EP0675196A3/en not_active Ceased
- 1989-01-06 AT AT89901711T patent/ATE136329T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-01-06 WO PCT/DK1989/000002 patent/WO1989006279A1/en active IP Right Grant
- 1989-01-06 DE DE68926163T patent/DE68926163T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-06 JP JP1501511A patent/JPH0675504B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-06 EP EP89901711A patent/EP0396608B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-06 EP EP05004172A patent/EP1538204A3/en not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-07-04 DK DK199001612A patent/DK175697B1/da not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-02-10 JP JP6016202A patent/JP2726799B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/486,415 patent/US5741694A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/486,846 patent/US6506589B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-29 DK DK199600361A patent/DK176102B1/da not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-10-01 JP JP9268984A patent/JPH10113179A/ja active Pending
-
2002
- 2002-11-27 US US10/306,089 patent/US6808913B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-05 US US10/310,730 patent/US6835821B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-06 US US10/313,853 patent/US6908991B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-07-21 US US10/896,177 patent/US20050003986A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE68926163T2 (de) | 1996-10-02 |
JP2726799B2 (ja) | 1998-03-11 |
EP0675196A2 (en) | 1995-10-04 |
JPH0675504B2 (ja) | 1994-09-28 |
JPH10113179A (ja) | 1998-05-06 |
EP1498481A1 (en) | 2005-01-19 |
DK161290D0 (da) | 1990-07-04 |
US20050003986A1 (en) | 2005-01-06 |
ATE136329T1 (de) | 1996-04-15 |
EP0396608B1 (en) | 1996-04-03 |
US5741694A (en) | 1998-04-21 |
DK161290A (da) | 1990-09-07 |
JPH03503477A (ja) | 1991-08-08 |
US20030148495A1 (en) | 2003-08-07 |
US6808913B2 (en) | 2004-10-26 |
DE68926163D1 (de) | 1996-05-09 |
US20030175933A1 (en) | 2003-09-18 |
DK6488D0 (da) | 1988-01-07 |
US20030186378A1 (en) | 2003-10-02 |
EP0675196A3 (en) | 1995-11-22 |
EP1538204A2 (en) | 2005-06-08 |
DK36196A (da) | 1996-03-29 |
WO1989006279A1 (en) | 1989-07-13 |
EP0396608A1 (en) | 1990-11-14 |
DK175697B1 (da) | 2005-01-24 |
EP1538204A3 (en) | 2007-07-04 |
JPH06292577A (ja) | 1994-10-21 |
US6908991B2 (en) | 2005-06-21 |
US6835821B2 (en) | 2004-12-28 |
US6506589B1 (en) | 2003-01-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK176102B1 (da) | Muterede subtilisin-gener | |
JP3471797B2 (ja) | 安定化酵素及び洗剤 | |
FI105481B (fi) | Uudet proteolyyttiset entsyymit ja niiden käyttö pesuaineissa | |
JP5603164B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP2002533080A (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4768128B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4768129B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4647787B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4611529B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4611530B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4647788B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
MXPA01006223A (en) | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having an additional amino acid residue in an active site loop region |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |