DK176102B1 - Muterede subtilisin-gener - Google Patents

Description

i DK 176102 B1

Den foreliggende opfindelse angår mutant subtilisinenzym, kendetegnet ved, at det har en - aminosyresekvens med mindst . 80% homologi med 1 aminosyresekvensen for subtilisin 309 som angivet i Tabel - 5 1(a), som kan fremstilles af B. lentus C360 (NCIB 10309), og at aminosyreresten ved en eller flere af positionerne: 6, 9, 11, 12, 19, 25, 37, 38, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 68, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121, 122, 140, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 226, 234, 235, 236, 237, 238, 241, 260, 10 261, 262, 265, 268 eller 275 ændres ved substitution med en anden aminosyrerest, eller, at en eller flere aminosyrerester indsættes ved en eller flere af positionerne: 36, 56, 159 eller 164-165. Mutationer ved specifikke nucleinsyrer i subtilisingenet medfører 15 aminosyresubstitutioner og dermed ændret enzymfunktion. Nogle af disse muterede enzymer udviser fysiske egenskaber, som er fordelagtige ved industriel anvendelse, især inden for detergentindustrien, idet de giver subtilisin, som er mere stabilt over for oxidation, har større proteaseaktivitet og 20 udviser forbedrede vaskeegenskaber.

Enzymer, der spalter amidbindingerne i proteinsubstrater klassificeres som proteaser, eller (alternativt) peptidaser (se Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms, 25 w.H. Freeman and Company, San Francisco, kap. 3),. Bakterier af Bacillus-arten secernerer to ekstracellulære proteaser , en neutral eller metalloprotease, og en alkalisk protease, som funktionelt er en serin endopeptidase, omtalt som subtilisin. Secernering af disse proteaser er blevet sammenkædet med den 30 bakterielle vækstcyklus med størst udtrykkelse af protease i den stationære fase, hvor sporedannelse også finder sted. Joliffe et al. (1980, J. Bacteriol 141: 1199-1208) har foreslået, at Bacillus-proteaser fungerer i cellevægsudskift- 4 ningen.

En serinprotease er et enzym, som katalyserer hydro- 35 2 DK 176102 B1 lysen af. peptidbindinger, i hvilke der er en essentiel serin-rest ved den aktive position (White, Handler og Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," 5. udg., McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272). i 5 Serinproteaseme har en molekylvægt inden for området 25.000 til 30.000. De inhiberes af diisopropylfluorofosfat, men i modsætning til metalloproteaser er de modstandsdygtige over for ethylenediamin-tetraeddikesyre (EDTA) (skønt de stabiliseres ved høj temperatur af kalciumioner). De hydroly-10 serer simple terminale estre og med hensyn til aktivitet ligner de eukaryotisk chymotrypsin, som også er en serinprotease.

Det andet udtryk, alkalisk protease, genspejler serinpro-teasens høje pH-optimum, fra pH 9,0 til 11,0 (se Priest, 1977, Bacteriological Rev. 41: 711-753).

15 Subtilisin er en serinprotease produceret af gram positive bakterier eller svampe. En lang række subtilisiner er identificeret, og aminosyresekvenserne fra mindst otte subtilisiner er bestemt. Disse omfatter seks subtilisiner fra Bacillus-stammer, nemlig subtilisin 168, subtilisin BPN', 20 subtilisin Carlsberg, subtilisin DY, Subtilisin amylosacchari-ticus og mesentericopeptidase (Kurihara et al., 1972, J.Biol.Chem. 247; 5629-5631,- Stahl og Ferrari, 1984, J.Bac- teriol. 158: 411-418; Vasantha et al., 1984, J.Bacteriol. 159: 811-819; Jacobs et al., 1985, Nucl.Acids Res. 13: 8913-8926; 25 Nedkov et al., 1985, Biol.Chem. Hoppe-Seyler 366: 421-430;

Svendsen et al., 1986, FEBS Lett 196: 228-232), og to svampe-subtilisiner, subtilisin thermitase fra Thermoactinomyces vulgaris (Meloun et al., 1985, FEBS. Lett. 183: 195-200) og proteinase K fra Tritirachium album (Jany og Mayer, 1985, 30 Biol.Chem. Hoppe-Seyler 366: 485-492).

Subtilisiner er velkarakteriserede fysisk og kemisk.

Ud over kendskab til den primære struktur (aminosyresekvenser) hos disse enzymer er mere end 50 højopløsningsrøntgenstrukturer af subtilisin blevet bestemt, som aftegner sub-35 stratbinding, overgangstilstand, produkter, tre forskellige proteaseinhibitorer og definerer de strukturelle konsekvenser for naturlig variation (Kraut, 1977, Ann.Rev.Biochem. £6: 331- 3 DK 176102 B1 358). Tilfældige og stedsrettede mutationer af subtilisingenet er både opstået ud fra kendskab til de fysiske og kemiske egenskaber hos enzymer og har bidraget med oplysninger om ' subtilisins katalytiske aktivitet, substratspecificitet, - 5 tertiære struktur, etc. {Wells et al., 1987,

Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 84: 1219-1223; Wells et al., 1986,

Phil.Trans.R.Soc.Lond.A. 317: 415-423; Hwang og Warshel, 1987, Biochem. 26: 2669-2673; Rao et al., 1987, Nature 328: 551-554) .

10 Subtilisiner har fundet udbredt anvendelse inden for industrien, især detergentformuleringer, da de er nyttige til fjernelse af proteinholdige pletter. For at være effektive skal disse enzymer imidlertid ikke blot være aktive under vaskeforhold, men skal også være forenelige med andre deter-15 gentkomponenter under opbevaring. For eksempel kan subtilisin anvendes sammen med amylaser, som er aktive over for stivelse,-cellulaser, som vil nedbryde cellulosemateriale; lipaser, som er aktive over for fedt; peptidaser, som aktive over for peptider og ureaser, som er effektive over for urinpletter.

20 Formuleringen skal ikke blot beskytte andre enzymer mod nedbrydning fra subtilisin, men subtilisin skal være stabilt med hensyn til oxidation, kalciumbindende egenskaber, deter-gens og højt pH hos ikke-enzymatiske detergentkomponenter. Enzymets evne til at forblive stabilt i deres nærvær omtales 25 ofte som dets vaskeevne eller vaskeegenskaber.

I en artikel (Estell et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:6518-6521) beskrives stedsrettet mutagenese anvendt til at erstatte methionin i position 222 i subtilisin BPN' med alle 30 19 aminosyrer. Det fandtes, at ved substitution ændredes de relative specifikke aktiviteter overfor substratet N-succinyl- L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid sig med 138% til 0,3% i forhold til vildtype subtilisin BPN', idet Cys substitutionen havde den højeste aktivitet. Ala- og Ser-substitutionerne 35 havde henholdsvis 53% og 35% af vildtypens aktivitet. Samtidig fandtes det, at Ala- og Ser-substituenteme havde forbedret resistens mod oxidation med H2Q2.

4 DK 176102 B1

Subtilisiner har fundet udbredt anvendelse inden for industrien, især detergentformuleringer, da de er nyttige til fjernelse af proteinholdige pletter. For at være effektive 5 skal disse enzymer imidlertid ikke blot være aktive under vaskeforhold, men skal også være forenelige med andre detergentkomponenter under opbevaring. For eksempel kan subtilisin anvendes sammen med amylaser, som er aktive over for stivelse; cellulaser, som vil nedbryde cellulosemateriale; lipaser, som 10 er aktive over for fedt; peptidaser, som aktive over for peptider og ureaser, som er effektive over for urinpletter. Formuleringen skal ikke blot beskytte andre enzymer mod nedbrydning fra subtilisin, men subtilisin skal være stabilt med hensyn til oxidation, kalciumbindende egenskaber, deter-15 gens og højt pH hos ikke-enzymatiske detergentkomponenter. Enzymets evne til at forblive stabilt i deres nærvær omtales ofte som dets vaskeevne eller vaskeegenskaber.

US patent nr. 3.770.587, der angår kemisk modifikation af proteolytiske enzymer, anvender således 20 sammenligninger mellem udgangsenzymet og det modificerede enzym i detergenter for at bestemme brugbarheden af de modificerede proteolytiske enzymer.

Den foreliggende opfindelse angår mutant 25 subtilisinenzym, kendetegnet ved, at det har en aminosyresekvens med mindst 80% homologi med aminosyresekvensen for subtilisin 309 som angivet i Tabel 1(a), som kan fremstilles af B. lentus C360 (NCIB 10309), og at aminosyreresten ved en eller flere af positionerne: 30 6, 9, 11, 12, 19, 25, 37, 38, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 68, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121, 122, 140, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 226, 234, 235, 236, 237, 238, 241, 260, 261, 262, 265, 268 eller 275 ændres ved substitution med en anden aminosyrerest, eller, 35 at en eller flere aminosyrerester indsættes ved en eller flere af positionerne: 36, 56, 159 eller 164-165. Mutationerne 5 DK 176102 B1 skabes ved specifikke nucleinsyrer i subtilisingenet, og i forskellige specifikke udførelsesformer besidder de muterede enzymer ændrede kemiske egenskaber omfattende, men ikke begrænset til forøget stabilitet over for oxidation, øget 5 proteolytisk evne og forbedret vaskeevne.

Den foreliggende opfindelse angår også, men er ikke begrænset til aminosyre- og DNA-sekvenserne for to proteaser hidrørende fra Bacillus lentus varianter, subtilisin 147 og subtilisin 309 så vel som mutationer af disse gener og tilsva-10 rende muterede enzymer.

Stedsrettet mutation kan effektivt fremstille muterede subtilisinenzymer, som kan tildannes til at passe til en række industrielle anvendelser, især inden for områderne detergent-og fødevareindustri. Den foreliggende opfindelse 15 angår delvist, men er ikke begrænset til mutanter af subtilisin 309 genet, som udviser forbedret stabilitet over for oxidation, forøget proteaseaktivitet, og/eller forbedret vaskeevne.

20 Forkortelser A = Ala = Alanin V = Val = Valin L = Leu = Leucin I = Ile = Isoleucin 25 P = Pro = Prolin F = Phe = Phenylalanin W = Trp = Tryptophan M = Met = Methionin G - Gly = Glycin 30 S = Ser = Serin T = Thr = Threonin C = Cys = Cystein Y = Tyr = Ty ros in N = Asn = Asparagin 35 Q Gin = Glutamin D = Asp = Asparaginsyre E = Glu = Glutaminsyre 6 DK 176102 B1 K = Lys = Lysin R = Arg = Arginin H = His = Histidin 5

Beskrivelse af figurerne

Figur 1 illustrerer indsættelsen af en delmængde af fragmenter, hvis længder ligger i området fra 1,5 kb til 6,5 10 kb, frembragt ved delvis nedbrydelse af Bacillus lentus stamme 309 DNA med Sau 3A restriktionsendonuclease til Barn HI skåret plasmid pSX50. De to resulterende plasmider, pSX86 og pSX88 indeholdende subtilisin 309 genet i modsatte retninger er også vist.

15 Figur 2 illustrerer indsættelsen af Bacillus lentus stamme 147 DNA fragmenter i plasmid pSX86. Delvis nedbrydning af stamme 147 DNA blev udført med Sau 3A restriktionsendonuclease. Fragmenter med størrelser i området fra 1,5 til 6,5 kb blev derpå ligeret i Barn HI spaltet plasmid pSX56.

20 Produktet, pSX94 indeholder subtilisin 147 genet.

Figur 3 illustrerer åben dobbelt mutagenese under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Morinaga et al., (1984, Biotechnology 2: 636-639). Den viser to plasmider, pSX93 og pSC119, begge stammende fra puC13. pSX93 indeholder et Xbal-25 Hindlll fragment af subtilisin 309 genet, og pSX119 indeholder resten af subtilisin 309 genet i et EcoRI-Xbal fragment. I (A) , spaltes plasmid pSX93 med Xbal og Clal, og de åbne molekyler blandes med pSX93 skåret med SacI, denatureres og baseparres igen til frembringelse af plasmider med en enkelt-30 strenget DNA region, som strækker sig inden for subtilisin 309 kodningssekvensen. Et syntetisk oligonucleotid, homologt med subtilisin 309 genet, men indeholdende en mutation, baseparres med den enkeltstrengede åbning, som derpå udfyldes, idet Klenow-fragmentet af DNA polymerase I og T4 DNA ligase anven-35 des. Ved replikation af plasmidet dannes dobbeltstrengede mutanter af subtilisin 309 genet. Samme fremgangsmåde anvendes i (B), idet plasmid pSX119 og EcoRI og Xbal enzymer anven- 7 DK 176102 B1 des til dannelse af mutationer i den tilsvarende region af subtilisin 309 genet.

Figur 4 illustrerer plasmid pSX92, som er et derivat af plasmid pSX62 bærende subtilisin 309 genet. Muterede frag-5 menter (d.v.s. Xbal - Clal, Xbal - Hindlll, eller EcoRI -Xbal), skåret ud af mutationsplasmiderne pSX93 eller pSX119 (se fig. 3) under anvendelse af de relevante restriktionsendo-nucleaser, blev indsat i plasmid pSX92 til ekspression i B. subtilis stamme DN 497.

10 Figur 5 illustrerer plasmid pSX143, som indeholder trunkerede former både af subtilisin 309 og subtilisin 147 genet. In vivo rekombination mellem homologe regioner af disse to gener kan resultere i aktive proteaser.

15 Opfindelsen angår mutationer af subtilisingenet, hvoraf nogle resulterer i ændringer i de kemiske karakteristika af subtilisinenzymet. Mutationer ved specifikke nuclein-syrer kan frembringes, og subtilisinformer kan udformes således, at de kan imødekomme behov ved industriel anvendelse.

20 Opfindelsen bygger delvist på den opdagelse, at mutationer af specifikke nucleinsyrer i subtilisingenet kan resultere i enzymer med ændrede egenskaber. I forskellige udførelsesformer kan der frembringes enzymer med forbedret stabilitet over for oxidation, forøget proteaseaktivitet eller 25 forbedret vaskeevne.

Med henblik på beskrivelsens klarhed og ikke for at begrænse opfindelsen skal den beskrives i fire dele: (a) den kemiske struktur hos kendte subtilisiner og subtilisin 147 og 309; (b) fremgangsmåder til fremstilling af mutationer af 30 subtilisingenet; (c) ekspression af mutanter af subtilisin og (d) screening af subtilisinmutanter for ønskede kemiske egenskaber .

Kemiske strukturer hos kendte subtilisiner og subtilisin 147 35 og 309

Sekvensanalyse af subtilisin fra forskellige kilder kan afsløre den funktionelle betydning af den primære amino- 8 DK 176102 B1 syresekvens, og kan styre dannelsen af hidtil ukendte mutanter med bevidst modificerede funktioner. Sammenligning af amino-syresekvensen for forskellige subtilisin, medens deres fysiske eller kemiske egenskaber stilles over for hinanden, kan 5 afsløre specifikke målregioner, som sandsynligvis kan fremstille nyttige mutantenzymer.

Aminosyresekvenseme fra mindst otte subtilisiner er kendt. Disse omfatter seks subtilisiner fra Bacillus stammer, nemlig subtilisin 168, subtilisin BPN', subtilisin Carlsberg, 10 subtilisin DY, subtilisin amylosacchariticus og mesenterico-peptidase (Kurihara et al., 1972, J.Biol.Chem. 247: 5629 - 5631; Stahl og Ferrari, 1984, j.Bacteriol. 158; 411 - 418;

Vasantha et al., 1984, J.Bacteriol. 159: 811 - 819, Jacobs et al., 1985, Nucl.Acids Res. 13: 8913 - 8926; Nedkov et al., 15 1985, Biol.Chem. Hoppe-Seyler 366: 421 - 430; Svendsen et al., 1986, FEBS Lett. 196: 228 - 232), og to svampesubtilisiner, subtilisin thermitase fra Thermoactinomyces vulgaris (Meloun et al., 1985, FEBS Lett. 183: 195 - 200) og proteinase K fra Tritirachium album limber (Jany og Mayer, 1985, Biol.Chem.

20 Hoppe-Seyler 366: 485-492).

I forbindelse med den foreliggende opfindelse anføres aminosyresekvenseme og .DNA-sekvenserne for to yderligere serinproteaser. Disse proteaser fås fra to Bacillus lentus varianter, 147 og 309, som er deponeret hos NCIB og tildelt 25 accessionsnumrene henholdsvis NCIB 10147 og NCIB 10309.

Deponeringerne skete henholdsvis 26. januar 1968 og 9. september 1968. Med hensyn til Budapesttraktaten anses deponeringsdatoen at være 31. marts 1982.

For bekvemmelighedens skyld benævnes proteaserne 30 fremstillet ud fra disse stammer henholdsvis subtilisin 147 og subtilisin 309, og generne, der koder for disse proteiner, betegnes subtilisin 147 og 309 generne.

I den foreliggende opfindelse anvendes udtrykket "subtilisinmateriale" til at betegne et proteinmateriale, som 35 indeholder en subtilisin som dets aktive ingrediens. Som det anvendes her og under definitionen af subtilisinmateriale, er en hvilken som helst serinprotease en subtilisin, som har 9 DK 176102 B1 mindst 80% aminosyresekvenshomologi med sekvenserne, der omtales ovenfor for subtilisin 309. Disse serinproteaser beskrives også heri som "homologe serinproteaser".

Tabel I sammenligner de afledte aminosyresekvenser 5 fra subtilisin 309, subtilisin 147, subtilisin BPN', subtilisin Carlsberg og subtilisin 168 (Spizizen et al., 1958,

Proc .Natl-Acad. Sci. U.S.A. 44^: 1072 - 1078) . Tabel II viser subtilisin 309 genets nucleinsyresekvens, og Tabel III viser subtilisin 147 genets nucleinsyresekvens. Sekvenserne for 10 subtilisin 309 eller 147 eller deres funktionelle ækvivalenter kan anvendes i overensstemmelse med opfindelsen. For eksempel kan de i Tabellerne I, II eller III viste sekvenser fra 309 eller 147 ændres ved substitutioner, additioner eller deletioner, som sørger for funktionelt ækvivalente molekyler. På 15 grund af degenerationen i nucleotidkodningssekvenserne kan andre DNA sekvenser, som i det væsentlige koder for den samme aminosyresekvens som vist i Tabel I, anvendes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse. Disse omfatter, men er ikke begrænset til nucleotidsekvenser omfattende det hele eller 20 dele af subtilisin 309 eller 147 sekvenserne vist i Tabellerne II eller III, som ændres ved substitution af forskellige kodoner, som koder for den samme eller en funktionelt ækvivalent aminosyrerest inden for sekvensen, idet der således frembringes en stum ændring. For eksempel kan en eller flere 25 aminosyrerester inden for sekvensen substitueres med en anden aminosyrerest med lignende polaritet, der virker som en funktionel ækvivalent. Substitutioner for en aminosyre inden for sekvensen kan udvælges blandt andre medlemmer af den klasse, som aminosyren hører til. For eksempel omfatter de ikke-polære 30 (hydrofobe) aminosyrer alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, phenylalanin, tryptophan og methionin. De polære neutrale aminosyrer omfatter glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin. De negativt 35 ladede (sure) aminosyrer omfatter asparaginsyre og glutamin-syre.

Nær overensstemmelse kan måles ved sammenligning af 10 DK 176102 B1 aminosyresekvenserne. Der findes mange metoder til sammenstilling af proteinsekvenser, men forskellene viser sig kun, når graden af overensstemmelse er ret lille. Metoderne beskrevet i Atlas of Protein Sequence and Structure, Margaret O. Dayhoff 5 ed., vol. 5, supp. 2, 1976, National Biomedical Research Foundation, Georgetown University Medical Center, Washington, D.C., p. 3 ff., med titlen SEARCH and ALIGN, definerer overensstemmelse. Det er kendt teknik, at beslægtede proteiner kan variere i antal af aminosyrer så vel som identitet af hver 10 aminosyre langs kæden. Det vil sige, at der kan forekomme deletioner eller indsættelser, når to strukturer sammenstilles med henblik på maksimal identitet. For eksempel har subtilisin Carlsberg kun 274 aminosyrer, medens subtilisin BPN’ har 275 aminosyrer. Sammenstilling af de to aminosyrer viser, at 15 Carlsberg ikke har en rest, der svarer til Asn56 fra subtilisin BPN'. Aminosyresekvensen fra Carlsberg synes derfor meget forskellig fra BPN', medmindre der anføres et hul ved lokation 56. Derfor kan det med en høj grad af sikkerhed forudsiges, at erstatning af Asn med Ser ved lokation 218 i subtilisin Carls-20 berg vil forøge thermostabiliteten, forudsat at resterne i Carlsberg nummereres med homologi til BPN’.

Ifølge den foreliggende opfindelse kan de for subtilisin 309 og 147 bestemte sekvenser sammenlignes med sekvenser fra kendte subtilisiner (se tabel I) eller nyligt opdagede 25 subtilisiner for at udlede positioner for ønskede mutationer.

For at gøre dette skal nær overensstemmelse mellem de sammenlignede subtilisiner bestemmes.

Forsøg på at bestemme forholdet mellem subtilisins primære struktur og dens fysiske egenskaber har afsløret 30 betydningen af methionin-222 resten så vel som de i den aktive position funktionelle aminosyrer, nemlig asparaginsyre-32, histidin-64 og serin-221. Asparagin-155 og Serin-221 ligger inden for oxyanionbindingspositionent. Mutationer ved disse positioner mindsker sandsynligvis den proteolytiske aktivitet.

35 Ifølge den foreliggende opfindelse blev aminosyresekvenserne fra subtilisin 309 og 147 sammenlignet med hinanden og med andre subtilisinsekvenser (se Tabel II). Rester, som varierede 11 DK 176102 B1 mellem subtilisin 309 eller 147 og andre subtilisiner blev identificeret. For eksempel indeholder subtilisin 309 en serinrest ved rest 153, hvorimod subtilisin 147, BPN', Carls-berg og 168 indeholder en alaninrest. Hvis derfor serin 153 5 resten fra subtilisin 309 blev ændret til en alaninrest, kunne de fysiske egenskaber af subtilisin 309 ændres i en ønsket retning. På samme måde indeholder subtilisin 147 en serinrest ved position 218, hvorimod de andre subtilisiner udtrykte en asparaginrest. Fordi subtilisin 147 har forbedret thermosta-10 bilitet i forhold til andre subtilisiner, .kan mutation af asparagin 218 fra subtilisin 309 til en serinrest forbedre thermostabiliteten for subtilisin 309. Som et andet eksempel blev det sluttet, at eftersom Thr 71 er tæt på den aktive position, kunne indførelsen af en negativt ladet aminosyre, 15 såsom asparaginsyre, undertrykke oxidative angreb ved elektrostatisk frastødning. De for subtilisins fysiske egenskaber sandsynligvis mest relevante positioner er sådanne, i hvilke der er bevaring af aminorester mellem de fleste subtilisiner, for eksempel de ovenfor omtalte Asp-153 og Asn-· 20 218 og også Trp-6, Arg-170, Pro-168, His-67, Met-175, Gly-219,

Arg-275. Ved mutation af nucleinsyresekvenserne således at en aminosyre, som er forskellig fra andre subtilisiner substitueres med en aminosyre, som stemmer overens, kan resultatet være en mere stabil form for subtilisin.

25 Wells et al. (1987, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 84: 1219 - 1233) har anvendt sammenligning af aminosyresekvenser og positionrettet mutation til at frembringe subtilisinsub-stratspecificitet. Forskellige subtilisiners katalytiske aktiviteter kan være væsentlig forskellige over for udvalgte 30 substrater. Wells har vist, at kun tre aminosyresubstitutioner kan bevirke, at B. amyloliquefaciens subtilisins substratspecificitet nærmer sig B. licheniformis subtilisins, enzymer, som er forskellige med faktor 10 - 50 med hensyn til katalytisk effektivitet i deres naturlige tilstand. Sammenlignings-35 analyse mellem subtilisin 147 og 309 og andre subtilisiner har vist, at mutation af de følgende positioner kan ændre de fysiske eller kemiske egenskaber hos subtilisin: 6, 9, 11-12, 12 DK 176102 B1 19, 25, 36-38, 53-59, 67, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121-122, 124, 128, 131, 140, 153-166, 168, 169-170, 172, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 199, 218, 219, 222, 226, 234-238, 241, 260-262, 265, 268 eller 275. Deletioner forekommer ved 5 følgende positioner i subtilisinerne 147 og/eller 309, indsættelse af passende aminosyrerester i disse positioner kunne forbedre oprindelsesenzymernes stabilitet: 1, 36, 56, 159, 164-166. Ifølge fremgangsmåden illustreret med disse eksempler, som ikke er begrænsende, fremkommer adskillige 10 mulige mutationspositioner.

Tabel I

Sammenligning af aminosyresekvens for forskellige proteaser 15 10 20 30 a) A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V- b) *-Q-T-V-P-W-G-I-S-F-I-N-T-Q-Q-A-H-N-R-G-I-F-G-N-G-A-R-V-A-V- c) A-Q-S-V-P-Y-G-V-S-Q-I-K-A-F-A-L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V-20 d) A-Q-T-V-P-Y-G-I-P-L-I-K-A-D-K-V-Q-A-Q-G-F-K-G-A-N-V-K-V-A-V- e) A-Q-S-V-P-Y-G- I-S-Q-I-K-A-P-A-L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V- 40 50 60 a) L-D-T-G-I-*-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-*-S-T-Q-D- b) L-D-T-G-I-*-A-T-H-P-D-L-R-I-A-G-G-A-S-F-I-S-S-E-P-*-S-Y-H-D-25 c) I-D-S-G-I-D-S-S-H-P-D-L-K-V-A-G-G-A-S-M-V-P-S-E-T-N-P-F-Q-D- d) L-D-T-G-I-Q-A-S-H-P-D-L-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-*-Y-N-T-D- e) L-D-S-G-I-D-S-S-H-P-D-L-N-V-R-G-G-A-S-F-V-A-S-E-T-N-P-Y-Q-D- 70 80 90 30 a) G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-E-L-bJ N-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-D-L-C) N-N-S-H-G-T-H-V-A-G-T-V-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-S-L- d) G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-V-A-A-L-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-S-V-S-L- e) G-S-S-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-S-P-S-A-S-L-35 100 110 120 a) Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H- t 13 DK 176102 B1 b) Y-A-V-K-V-L-D-R-N-G-S-G-S-L-A-S-V-A-Q-G-I-E-W-A-I-N-N-N-M-H- c) Y-A-V-K-V-L-G-A-D-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-A-I-A-N-N-M-D- d) Y-A-V-K-V-L-N-S-S-G-S-G-T-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-A-T-T-N-G-M-D- e) Y-A-V-K-V-L-D-S-T-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-A-I-S-N-N-M-D-5 130 140 150 a) V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V- b) I-I-N-M-S-L-G-S-T-S-G-S-S-T-L-E-L-A-V-N-R-A-N-N-A-G-I-L-L-V- c) V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-P-S-A-A-L-K-A-A-V-D-K-A-V-A-S-G-V-V-V-V-10 d) V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-M-K-Q-A-V-D-N-A-Y-A-R-G-V-V-V-V- e) V-I-N-M-S-L-G-G-P-T-G-S-A-A-L-K-T-V-V-D-K-A-V-S-S-G-I-L-V-A- 160 170 180 a) A-A-S-G-N-S-G-A-*-G-S-I-S-*-*-*-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-15 b) G-A-A-G-N-T-G-R-*-Q-G-V-N-*-*-*-Y-P-A-R-Y-S-G-V-M-A-V-A-A-V- c) A-A-A-G-N-E-G-T-S-G-S-S-S-T-V-G-Y-P-G-K-Y-P-S-V-I-A-V-G-A-V- d) A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-N-T-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D-S-V-I-A-V-G-A-V- e) A-A-A-G-N-E-G-S-S-G-S-S-S-T-V-G-Y-P-A-K-Y-P-S-T-I-A-V-G-A-V- 20 190 200 210 a) D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-

b) D-Q-N-G-Q-P-P-S-F-S-T-Y-G-P-E-I-E-I-S-A-P-G-V-N-V-N-S-T-Y-T-C) D-S-S-N-Q-R-A-S-F-S-S-V-G-P-E-L-D-V-M-A-P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P

d) D-S-N-S-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A-P-G-A-G-V-Y-S-T-Y-P- 25 e) N-S-S-N-Q-R-A-S-F-S-S-A-G-S-E-L-D-V-M-A-P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P- 220 230 240 a) G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S- b) G-N-R-Y-V-S-L-S-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-V-A-A-L-V-K-S-R-Y-P-S-30 C) G-N-K-Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-S-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N- d) T-S-T-Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N- e) G-G-T-Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-T- 35 a) W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-b) Y-T-N-N-Q-I-R-Q-R-I-N-Q-T-A-T-Y-L-G-S-P-S-L-Y-G-N-G-L-V-H-A-C) W-T-N-T-Q-V-R-S-S-L-E-N-T-T-T-K-L-G-D-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V- 14 DK 176102 B1 d) L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A-T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V- e) W-T-N-A-Q-V-R-D-R-L-E-S-T-A-T-Y-L-G-N-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V-

5 a) E-A-A-T-R

b) G-R-A-T-Q

c) Q-A-A-A-Q

d) E-A-A-A-Q

e) Q-A-A-A-Q

10 a = subtilisin 309 b = subtilisin 147 c = subtilisin BPN' 15 d = subtilisin Carlsberg e = subtilisin 168 * = angivet deletion 20

Der findes inden for teknikkens stade mange velkendte metoder til indføring af mutationer i gener. Efter en kort diskussion af kloning af subtilisingener, vil fremgangsmåder til dannelse af mutationer i subtilisingenet på både tilfæl-25 dige positioner og specifikke positioner blive diskuteret.

Det gen, der koder for subtilisin, kan klones fra en hvilken som helst Gram-positiv bakterie eller svamp ved hjælp af forskellige inden for teknikken velkendte metoder. Først skal der konstrueres et genom og/eller cDNA bibliotek af DNA, 30 idet der anvendes kromosomalt DNA eller messenger RNA fra organismen, der fremstiller den subtilisin, der skal undersøges. Hvis aminosyresekvensen af subtilisin er kendt, kan homologe, mærkede oligonucleotidprober derpå syntetiseres og anvendes til identifikation af kloner, der koder for subtili-35 sin, fra et genom bibliotek af bakterielt DNA eller fra et fungus cDNA bibliotek. Eller der kan anvendes en mærket oligonucleotidprobe indeholdende sekvenser, der er homologe 15 DK 176102 B1 med subtilisin fra en anden bakteriestamme eller svamp, som en probe til identifikation af subtilisinkodende kloner, idet hybridisering og vaskebetingelser med lavere stringens anvendes .

5 En yderligere metode til identifikation af subtili- sinproducerende kloner kunne indebære indsættelse af fragmenter af genom DNA i en udtrykkelsesvektor, såsom et plasmid, transformering af protease-negative bakterier med det fremkomne genome DNA bibliotek, og efterfølgende udspredning 10 af de transformerede bakterier på agar indeholdende et substrat for subtilisin, såsom skummetmælk. Bakterier indeholdende subtilisiribærende plasmid vil frembringe kolonier omgivet af en ring af klar agar, på grund af at skummetmælken nedbrydes af secerneret subtilisin.

15 Når først subtilisingenet er klonet i en egnet vek tor, såsom et plasmid, kan adskillige fremgangsmåder til indførelse af tilfældige mutationer i genet anvendes.

En fremgangsmåde kunne være indføring af det klonede subtilisingen som en del af en optagelig vektor i en muta-20 torstamme af Eschericia coli.

En anden fremgangsmåde ville indebære frembringelse af en enkeltstrenget form af subtilisingenet og derpå baseparring af DNA-fragmentet indeholdende subtilisingenet med et andet DNA-fragment, således at en del af subtilisingenet 25 forbliver enkeltstrenget. Denne diskrete, enkeltstrengede region kunne derpå udsættes for et hvilket som helst af en række mutagener, herunder, men ikke begrænset til, natrium-bisulfit, hydroxylamin, salpetersyrling, myresyre eller hydra-lazin. Et særligt eksempel på denne fremgangsmåde til dannelse 30 af tilfældige mutationer er beskrevet af Shortle og Nathans (1978, Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A., 75: 2170-2174). Ifølge

Shortle og Nathans fremgangsmåde ville plasmidet bærende subtilisingenet blive "knækket" af et restriktionsenzym, som spalter inden for genet. Det fremkomne hak ville blive 35 udvidet til en åbning af exonucleasevirkningen fra DNA polymerase I. Den fremkomne enkeltstrengede åbning kunne derpå mutageniseres, ved at et hvilket som helst af de nævnte muta- 16 DK 176102 B1 genesemidler anvendtes.

Som en anden mulighed kan subt i lis ingenet fra en Bacillus-art omfattende den naturlige promoter og andre kontrolsekvenser klones i en plasmidvektor indeholdende repli-5 koner for både E. coli og B. subtilis, en selekterbar pheno-typisk markør og M13 replikationsorigo til fremstilling af enkeltstrenget plasmid DNA på superinfektion med hjælpefag IR1. Enkeltstrenget plasmid DNA indeholdende det klonede subtilisingen isoleres og baseparres med et DNA-fragment indehol-10 dende vektorsekvenser, men ikke subtilisins kodende region, hvilket bevirker til et åbent duplex molekyle. Mutationer indføres i subtilisingenet enten med natriumbisulfit, salpetersyrling eller myresyre eller ved replikation i en mutatorstamme af E. coli som beskrevet ovenfor. Eftersom 15 natriumbisulfit udelukkende reagerer med cytosin i et enkeltstrenget DNA, er de med dette mutagen skabte mutationer kun begrænset til de kodende regioner. Reaktionstid og bisulfit-' koncentration varieres i forskellige forsøg, således at der gennemsnitligt skabes fra en til fem mutationer per subtili-20 singen. Inkubation af 10 μg åbent dobbelt DNA i 4 M Na-bisul-fit, pH 6,0, i 9 minutter ved 37°C i en reaktionsvolumen på 400 μΐ, deaminerer ca. 1% cytosiner i den enkeltstrengede region. Den kodende region for modent subtilisin indeholder ca. 200 cytosiner afhængigt af DNA strengen. Reaktionstiden 25 kan med fordel varieres fra ca. 4 minutter (til frembringelse af en mutationsfrekvens på ca. 1 ud af 200) til ca. 20 minutter (ca. 5 ud af 200).

Efter mutagenese behandles de åbnede molekyler in vitro med DNA polymerase I (Klenow fragment) til dannelse af 30 fuldstændigt dobbeltstrengede molekyler og for at fiksere mutationerne. Kompetente E. coli transformeres derpå med det mutageniserede DNA til fremstilling af et forstærket bibliotek af mutante subtilisiner. Forstærkede mutant biblioteker kan også fremstilles ved dyrkning af plasmid DNA i en Mut D stamme 35 af E. coli, som forøger rækken af mutationer på grund af fejlbehæftet DNA-polymerase.

17 DK 176102 B1

Mutagenerne salpetersyrling og myresyre kan også anvendes til fremstilling af mutantbiblioteker. Fordi disse stoffer ikke er så specifikke for enkeltstrenget DNA som na-triumbisulf it, udføres mutagenesereaktioneme efter følgende 5 fremgangsmåde. Den kodende del af subtilisingenet klones i M13 phagen ifølge standardmetoder og enkeltstrenget DNA forberedes. Den enkeltstrengede DNA omsættes derpå med 1 M salpetersyrling, pH 4,3 i 15 - 60 minutter ved 23°C eller 2,4 M myresyre i 1 - 5 minutter i 23°C. Disse reaktionstidsområder 10 frembringer en mutationsfrekvens på fra 1 ud af 1000 til 5 ud af 1000. Efter mutagenese baseparres en universel primer med M13 DNA og dobbelt DNA syntetiseres, idet mutageniseret enkeltstrenget DNA anvendes som templat, således at den kodende del af subtilisingenet bliver fuldstændigt dobbeltstrenget. På 15 dette punkt kan den kodende region skæres ud af M13 vektoren med restriktionsenzymer og ligeres i en umutageniseret ekspressionsvektor, således at mutationer kun forekommer i restriktionsfragmentet (Myers et al., Science 229: 242 - 257 (1985)) .

20 Ifølge yderligere en fremgangsmåde kan mutationer dannes ved at underkaste to forskellige former for subtilisin in vivo rekombination. Ifølge denne fremgangsmåde fører homologe regioner inden for de to gener til en krydsning af tilsvarende regioner, hvilket resulterer i udvekslingen af 25 genetisk information. Dannelsen af hybride amylasemolekyler ifølge denne teknik er fuldstændigt beskrevet i dansk patent nr. 160840, som der herefter skal henvises til. Et eksempel på et plasmid, som kan danne hybride subtilisinformer er afbildet i fig. 5. Både subtilisin 309 og 147 generne, indført i 30 plasmid pSX143, er trunkerede og kan derfor ikke selv føre til subtilisinekspression. Hvis rekombinationen imidlertid forekommer mellem de to gener, for at korrigere manglen hidrørende fra trunkering, d.v.s. den N-terminale region af subtilisin 309 genet bliver kædet sammen med den C-terminale 35 region af subtilisin 147 genet, kan der fremstilles aktivt mutant subtilisin. Hvis pSX143 indføres i en proteasenegativ 18 DK 176102 B1 bakteriestamme, og bakterier, som udvikler en proteasepositiv phenotype, derpå selekteres, kan der identificeres forskellige mutanter, subtilisin 309/147 kimærer.

Når subtilisingenet er blevet klonet og de ønskede 5 mutationssteder fastlagt, kan disse mutationer indføres ved at anvende syntetiske oligonucleotider. Disse oligonucleotider indeholder nucleotidsekvenser, som flankerer de ønskede mutationspositioner; mutante nucleotider indsættes under oligonucleotidsyntese. Ifølge en foretrukket fremgangsmåde 10 skabes en enkeltstrenget DNA-åbning, som danner bro i subtilisingenet, i en vektor, der bærer subtilisingenet. Derpå baseparres det syntetiske nucleotid, der bærer den ønskede mutation, til en homolog del af det enkeltstrengede DNA. Den resterende åbning udfyldes derpå af DNA polymerase I (Klenow 15 fragment) og konstruktionen ligeres, idet der anvendes T4 ligase. Et specifikt eksempel på denne fremgangsmåde er beskrevet i Morinaga et al., (1984, Biotechnology 2:636-639). Ifølge Morinaga et al., fjernes et indre fragment fra genet, idet der anvendes restriktionsendonuclease. Vektoren/genet, 20 der nu indeholder en åbning, denatureres derpå og hybridiseres til en vektor/gen, som, i stedet for at indeholde en åbning, er blevet spaltet med en anden restriktionsendonuclease ved en position uden for det område, som er berørt af åbningen. En enkeltstrenget region i genet er derpå tilgængelig for 25 hybridisering med muterede oligonucleotider, den resterende åbning udfyldes af Klenow-fragmentet fra DNA polymerase I, indskudene ligeres med T4 DNA ligase, og efter en replikationscyklus frembringes et dobbeltstrenget plasmid, som bærer den ønskede mutation. Ved fremgangsmåden ifølge Morinaga 30 undgås den yderligere manipulation konstruktion af nye restriktionspositioner, og derfor lettes dannelsen af mutationer ved multiple positioner. Ifølge US patentskrift nr. 4.760.025 (Estell et al., juli 26, 1988) er det muligt at indføre oligonucleotider, der bærer multiple mutationer ved 35 udførelse af mindre ændringer i kassetten; imidlertid kan endnu flere forskellige mutationer indføres på et hvilket som helst tidspunkt ifølge Morinaga-metoden, da en række 19 DK 176102 B1 oligonucleotider af forskellig længde kan indføres.

Et muteret subtilisingen fremstilles ifølge de beskrevne fremgangsmåder eller en hvilken som helst fremgangsmåde inden for kendt teknik udtrykkes i enzymform, 5 idet en ekspressionsvektor anvendes. En ekspressionsvektor falder almindeligvis inden for definitionen af en kloningsvektor, eftersom en ekspressionsvektor oftest omfatter bestanddelene i en typisk kloningsvektor, d.v.s. et element, som tillader autonom replikation af vektoren i en mikro-10 organisme uafhængig af mikroorganismens genom og en eller flere phenotypiske markører til selektionsformål. En ekspressionsvektor omfatter kontrolsekvenser, der koder for en promoter, operator, ribosombindingssted, translationsinitieringssignal og eventuelt et repressorgen. For at tillade 15 secerneringen af det udtrykte protein, kan nucleotider, der koder for en "signalsekvens", indsættes inden genets kodningssekvens. Med henblik på ekspression under styringen af kontrolsekvenser, bindes et målgen, som skal behandles ifølge opfindelsen, operabelt til kontrolsekvenserne i den korrekte 20 læseramme. Promotersekvenser, som kan indføres i plasmid-vektorer, og som kan understøtte transskriptionen af det mutante subtilisingen, omfatter, men er ikke begrænset til, den prokaryote β-lactamasepromoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc.Natl.Acad.Sci. , U.S.A. 75: 3727-3731) og tac 25 promoteren (DeBoer et al., 1983, Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A. 80:21-25). Yderligere henvisninger kan også findes i "Useful proteins from recombinant bacteria" i Scientific American, 1980, 242: 74-94.

Ifølge en udførelsesform transformeres B. subtilis 3 0 med en ekspressionsvektor, der bærer det muterede DNA. Hvis ekspression skal ske i en secernerende mikroorganisme, såsom B. subtilis, kan en signalsekvens følge translationsinitiationssignalet og gå forud for den relevante DNA-sekvens. Signalsekvensen fungerer ved at transportere ekspressions-35 produktet til cellevæggen, hvor det spaltes fra produktet ved secernering. Det er hensigten, at udtrykket "kontrolsekvenser" 20 DK 176102 B1 som defineret ovenfor, skal omfatte en signalsekvens, når den er tilstede.

Til screening af mutanter kan transformeret B. subtilis dyrkes i nærvær af et filtermateriale (såsom nitro-5 cellulose), hvortil det secernerede ekspressionsprodukt (f.eks. enzym) binder. For at screene for et ekspressionsprodukt med en ønsket egenskab udsættes et filterbundet ekspressionsprodukt for betingelser, som adskiller det relevante ekspressionsprodukt fra det naturligt forekommende 10 ekspressionsprodukt. For eksempel kan det filterbundne ekspressionsprodukt udsættes for betingelser, som ville inaktivere et naturligt forekommende produkt. Bevaret enzymaktivitet, der følger ødelæggende behandling, viser, at mutationen giver enzymet øget stabilitet, og at det derfor er en 15 nyttig mutation.

Ifølge en udførelsesform for opfindelsen udføres screening for stabile varianter, idet der anvendes en prote-asedefekt B. subtilis stamme transformeret med variantplas-midet og spredt ud på plader som følger: et nitrocellulose-20 filter anbringes på en næringsbase i en petriskål, og et celluloseacetatfilter anbringes ovenpå nitrocellulosen. Kolonier dyrkes på celluloseacetatet, og protease fra individuelle kolonier secerneres gennem celluloseacetatet til nitrocellulosefiltret, hvor det bindes stabilt. Protease fra 25 hundereder af kolonier bindes til et enkelt filter, hvilket tillader efterfølgende screening af tusinder af forskellige varianter ved behandling af adskillige filtre.

Til identifikation af kolonier, der fremstiller subtilisin med forøget thermostabilitet, kan filtrene inku-30 beres i pufferopløsninger ved temperaturer, som vil inaktivere i det væsentlige al vildtypeaktivitet. Varianter med forøget stabilitet eller aktivitet beholder aktiviteten efter dette trin. Det passende behandlede filter dyppes derpå i en opløsning indeholdende Tosyl-L-Arg methyl ester (TAME) Benzoyl-Arg-35 ethyl-ester (BAEE), Acetyl-Tyr-ethyl-ester (ATEE) (Sigma) eller lignende forbindelser. Fordi TAME, BAEE og ATEE er substrater for proteaserne, spaltes de i de zoner på filtret, der 21 DK 176102 B1 indeholder subtilisinvarianter, som forbliver aktive efter behandling. Når spaltning forekommer, frigøres protoner i reaktionsblandingen og bevirker, at phenolrødt ændrer farve fra rød til gul på områder, der beholder proteaseaktivitet.

5 Denne fremgangsmåde kan anvendes til at screene for forskellige variantklasser blot med mindre modifikationer. For eksempel kunne filtrene behandles ved høj temperatur, ved høj pH, med denatureringsmidler, oxidationsmidler eller under andre betingelser, som normalt inaktiverer et enzym, såsom en 10 protease, for at finde resistente varianter. Varianter med ændret substratspecificitet kunne screenes ved at erstatte TAME, BAEE eller ATEE med andre substrater, som normalt ikke spaltes med naturligt forekommende vildtypesubtilisin.

Når først en variant med forstærket stabilitet er 15 identificeret ved screening, isoleres kolonien, hvorfra varianten er deriveret, og den ændrede subtilisin oprenses. Forsøg kan udføres med det oprensede enzym til bestemmelse af stabilitetsbetingelserne mod oxidation, thermisk inaktivering, denatureringstemperatur, kinetiske parametre så vel som andre 20 fysiske målinger. Det ændrede gen kan også sekvensbestemmes for at bestemme de aminosyreændringer, der er ansvarlige for den forbedrede stabilitet. Ved at anvende denne fremgangsmåde i er varianter med forbedrede vaskeegenskaber blevet isoleret.

25

Eksempel

Stedsspecifik mutation af subtilisingenet frembringer mutanter med nyttige kemiske egenskaber_ 30

Bakteriestammer B. subtilis 309 og 147 er varianter af Bacillus len-tus, deponeret hos NCIB og tildelt accessionsnumrene NCIB 10147 og NCIB 10309 og beskrevet i US patentskrift nr.

35 3.723.250 (27. marts 1973), som der skal henvises til. B.

subtilis DN 4 97 er beskrevet i US patent nr. 5,036,002, som der også skal henvises til, og er en aro+ transformant af RUB

22 DK 176102 B1 200 med kromosomalt DNA fra SL 438, en sporulerings- og proteasedeficient stamme fra Dr. Kim Hardy fra Biogen. E. coli MC 1000 r'm+ (Casadaban, M. J. og Cohen, S.N. (1980) , J.Mol.Biol. 138: 179-207, blev gjort r‘m+ ved hjælp af 5 konventionelle metoder og er også beskrevet i US patent nr. 5,036,002.

Plasmider pSX50 (beskrevet i US patent nr. 5,036,002, som der 10 skal henvises til) er et derivat af plasmid pDN 1050 omfattende promoter-operatoren pi0lf B. pumilus xyn B genet og B. subtilis xyl R genet.

pSX65 (beskrevet i US patent nr. 5,036,002 ovenfor) er et derivat af plasmid pDN 1050, omfattende promoter-15 operatoren p202, B. pumilus xyn B genet, og B. subtilis xyl R genet.

pSX93 vist i figur 3a, er pUC13 (Vieira og Messing, 1982, Gene 19: 259-268) omfattende et 0,7 kb Xbal-Hindlll fragment af subtilisin 309 genet inklusiv terminatoren indsat 20 i en polylinkersekvens.

pSX119 er pUCl3 indeholdende et EcoRI-Xbal fragment af subtilisin 309-genet indsat i polylinkeren.

pSX62 (beskrevet i US patent nr. 5,036,002 ovenfor) er et derivat af pSX52 (ibid.), som omfatter et fusionsgen 25 mellem kalveprochymosingenet og B. pumilus xyn B genet indsat i pSX50 (ovenfor). pSX62 blev frembragt ved indsættelse af E. coli rm B terminatoren i pSX52 bag prochymosingenet.

pSX92 blev fremstillet ved kloning af subtilisin 309 i plasmid pSX62 (ovenfor) skåret ved Clal og Hind III og fyldt 30 inden indsættelsen af fragmenterne Dral-Nhel og Nhel-Hindlll fra det klonede subtilisin 309-gen.

Oprensning af subtilisiner 35

Fremgangsmåden angår en typisk oprensning af en fermentering i 10 liter skala af subtilisin 147 enzymet, 23 DK 176102 B1 subtilisin 309 enzymet eller mutanter deraf.

Ca. 8 liter næringsmedium blev centrifugeret ved 5000 opm i 35 minutter i 1 liters bægre. Supernatanterne blev indstillet til pH 6,5 under anvendelse af 10% eddikesyre og 5 filtreret på Seitz Supra S100 filterplader.

Filtraterne blev koncentreret til ca. 400 ml med en Amicon CH2A UF enhed udstyret med en Amicon S1Y10 UF patron. UF-koncentratet blev centrifugeret og filtreret inden adsorption på en Bacitracin affinitetssøjle ved pH 7. Proteasen blev 10 elueret fra Bacitracin søjlen med 25% 2-propanol og 1 M

natriumchlorid i en pufferopløsning med 0,01 M dimethylglutar-syre, 0,1 M borsyre og 0,002 M kalciumchlorid indstillet til pH 7.

Fraktionerne med proteaseaktivitet fra Bacitracin-15 oprensningstrinnet blev kombineret og anbragt på en 750 ml Sephadex G25 søjle {5 cm dia.) ækvilibreret med en puffer indeholdende 0,01 M dimethylglutarsyre, 0,2 M borsyre og 0,002 M kalciumchlorid indstillet til pH 6,5.

Fraktioner med proteolytisk aktivitet fra Sephadex 20 G25 søjlen blev kombineret og en 150 ml CM Sepharose CL 6B

kationbyttersøj le {5 cm dia.) ækvilibreret med en puffer indeholdende 0,01 M dimethylglutaminsyre, 0,2 M borsyre og 0,002 M kalciumchlorid indstillet til pH 6,5.

Proteasen blev elueret med en lineær gradient af 0 -25 0,1 M natriumchlorid i 2 liter af samme puffer (0 - 0,2 M na triumchlorid i tilfælde af subtilisin 147).

I et sidste oprensningstrin blev proteaseholdige fraktioner fra CM Sepharose søjlen kombineret og koncentreret i en Amicon ultrafiltreringscelle udstyret med en GR81P 30 membran {fra De Danske Sukkerfabriker A/S).

Subtilisin 309 og mutanter Met 222 til Ala

Gly 195 til Glu

Asn 218 til Ser 35 Arg 170 til Tyr

Gly 195 til Glu, Arg 170 til Tyr

Gly 195 til Glu, Met 222 til Ala 24 DK 176102 B1 blev oprenset med denne fremgangsmåde.

5 Oligonucleotidsyntese

Alle umage primere blev syntetiseret på en Applied Biosystems 380 A DNA syntesiser og oprenset ved hjælp af poly-acrylamidgelelektroforese (PAGE).

10

Bestemmelse af oxidationsstabilitet

Det oprensede enzym fortyndes til et enzymindhold på ca. 0,1 mg/ml i 0,01 M dimethylglutarsyre, pH 7, og i den 15 samme puffer med 0,01 M pereddikesyre (pH 7).

Begge fortyndinger blev opvarmet til 50°C i 20 minutter. Proteolytisk aktivitet blev målt i fortyndingerne før og efter varmebehandlingen.

20

Prøve for proteolytisk aktivitet OPA Casein metode

Proteolytisk aktivitet blev bestemt med casein som substrat. En Caseinproteaseenhed (CPU) defineres som den 25 mængde enzym, der frigør 1 millimol primære aminogrupper (bestemt ved sammenligning med en serinstandard) per minut under standardbetingelser, d.v.s. inkubation i 30 minutter ved 25°C og pH 9,5.

En 2% (w/v) caseinopløsning (Hammarstein fra Merck 30 AG, Vesttyskland) blev fremstillet med Universal Buffer beskrevet af Britton og Robinson (Journ.Chem.Soc. 1931, p.

1451), indstillet til pH 9,5.

To ml substratopløsning blev præinkuberet i et vandbad i 10 minutter ved 25°C. 1 ml enzymopløsning indeholdende 35 ca. 0,2 - 0,3 CPU/ml Britton-Robinson puffer (pH 9,5) blev tilsat. Efter 30 minutters inkubation ved 25°C standsedes 25 DK 176102 B1 reaktionen ved tilsætning af et stopmiddel (5 ml af en opløsning indeholdende trichloreddikesyre {17,9 g), natriumacetat (29,9 g), og eddikesyre (19,8 g), og suppleret op til 500 ml med ionfrit vand). En blindprøve blev fremstillet på samme 5 måde som prøveopløsningen med undtagelse af, at stopmidlet blev tilsat før enzymopløsningen.

Reaktionsblandingerne blev holdt i 20 minutter i vandbad, hvorefter de blev filtreret gennem Whatman®42 papirfiltre.

10 Primære aminogrupper blev bestemt ved deres farve- udvikling med o-phthaldialdehyd (OPA).

Dinatriumtetraboratdecahydrat (7,62 g) og natrium-dodecylsulfat (2,0 g) blev opløst i 150 ml vand). OPA (160 mg) opløst i 4 ml methanol blev derpå tilsat sammen med 400 μΐ 15 beta-mercaptoethanol, hvorefter opløsningen blev suppleret op til 200 ml med vand.

Til OPA reagenset (3 ml) blev tilsat 40 μΐ af de ovenfor nævnte filtrater blanding. Den optiske tæthed (OD) ved 340 nm blev målt efter ca. 5 minutter.

20 OPA testen blev også udført med en serinstandard indeholdende 10 mg serin i 100 ml Britton-Robinson puffer (pH 9,5). Pufferen blev anvendt som en blindprøve.

Proteaseaktiviteten blev beregnet fra målinger af den optiske tæthed ved hjælp af følgende formel: 25

CPU/ml enzymopløsning = (ODt - ODb) x Cser x Q

(ODser - ODb) X MWser X ti CPU/g enzympræparat = CPU/ml: b 30 i hvor 0Dt/ ODb, 0DSer og ODB er den optiske tæthed for henholdsvis prøveopløsningen, blindprøven, serinstandarden og pufferen, Cser serinkoncentrationen i mg/ml i standarden, MWser molekylvægten af serin. Q er fortyndingsfaktoren (i dette 35 tilfælde lig med 8) for enzymopløsningen og ti er inkubationstiden i minutter.

26 DK 176102 B1 I den følgende tabel V er vist resultater fra den ovenstående prøve i forhold til det oprindelige enzym.

<►

Prøve for vaskeegenskab 5 Prøvelapper (7 cm x 7 cm, ca. 1 g) blev fremstillet ved at passere krympebehandlet bomuldsstof (100% bomuld, DS 71) gennem karret i en Mathis vaske- og tørremaskine af typen TH (Werner Mathis AG, Zurich, Schweiz) indeholdende spinatsaft (fremstillet af frisk spinat) og derpå gennem maskinens tryk-10 valse for at fjerne overskydende spinatsaft.

Til slut blev tøjet tørret i en kraftig luftstrøm ved stuetemperatur, opbevaret ved stuetemperatur i 3 uger og derpå opbevaret ved -18°C inden anvendelse.

Prøverne blev udført isothermisk i en Terg-0-tometer 15 prøvevaskemaskine (beskrevet i Jay C. Harris "Detergency Evaluation and Testing", Interscience Publishers Ltd., 1954, p. 60-61) i 10 minutter ved 100 opm. Som detergent blev følgende standardpulverdetergent anvendt: 20 LAS, Nansa S 80 0,4 g/1 AE, Berol 0 65 0,15 g/1 Sæbe 0,15 g/1 STPP 1,75 g/1

Natriumsilikat 0,40 g/1 25 CMC 0,05 g/1 EDTA 0,01 g/1 I Na2S04 2,10 g/1

Perborat 1.00 g/1 TAED 0,10 g/1 30 TAED = Ν,Ν,Ν',N‘-tetraacetyl-ethylendiamin; pH blev indstillet med 4 N NaOH til 9,5. Vandet, der anvendtes, var ca. 9° GH (German Hardness).

Forsøgene blev udført ved enzymkoncentrationer på: 0, 35 0,05 CPU/1 og 0,1 CPU/1 og to uafhængige rækker forsøg blev udført for hver af mutanterne.

27 DK 176102 B1

Til hvert forsøg anvendtes otte tøj lapper og et bæger (800 ml) detergent. Af de otte lapper var fire rene og fire var plettede med spinatsaft. Efter vask blev lapperne skyllet i rindende vand i 25 minutter i en spand.

5 Lapperne/stykkerne blev derpå lufttørret natten over (beskyttet mod dagslys) og remissionen, R, bestemt på et E1REPHO 2000 spektrophotometer fra Datacolor S.A., Dietkikon, Schweiz, ved 460 nm.

Som målestok for vaskeevnen anvendtes differential-10 remission, AR, hvor AR er lig med remissionen efter vask med tilsat enzym minus remissionen efter vask uden enzym.

Prøve for thermostabilitet

Samme fremgangsmåde som ovenfor for vaskeevne blev 15 anvendt ved bedømmelse af thermostabiliteten hos de frembragte mutanter, ved at udføre prøven ved temperaturer på henholdsvis 40°C og 60°C.

20 Kloning af subtilisin 309 og 147 gener

Kromosomalt DNA fra "309" stammen blev isoleret ved at behandle en celleopløsning med Lysozym i 30 minutter ved 37°C og derpå med SDS i 5 minutter ved 60°C. Derefter blev opløsningen ekstraheret med phenolchloroform (50:50), udfældet 25 med ethanol, og præcipitatet opløst igen i TE. Denne opløsning blev behandlet med RNase i 1 time ved 37°C.

Ca. 30 pg kromosomalt DNA blev delvist nedbrudt med restriktionsenzym Sau 3A (New England Biolabs) og fragmenter fra ca. 1,5 kb til ca. 6,5 kb blev isoleret på DEAE cellulose-30 papir fra en 1% agarosegel {subtilisingenet i andre arter er ca. 1,2 kb langt).

Som vist i fig. 1 blev fragmenterne baseparret og ligeret til BamHI skåret plasmid pSX50 (beskrevet i US patentansøgning nr. 039,298 indleveret 17. april, 1987, som der 35 henvises til). Plasmiderne blev derpå transformeret til kompetent B. subtilis DN 497.

28 DK 176102 B1

Cellerne blev derpå bredt ud på LB agarplader med 10 mM phosphat, pH 7, 6 μ9^1 kloramphenicol, og 0,2% xylose for at inducere xyn-promoteren i plasmidet. Pladerne indeholdt også 1% skummetmælk, så de proteaseproducerende transformanter 5 kunne detekteres ved den klare ring, hvor skummetmælken var nedbrudt.

Kloner, der udtrykte protease, blev fremstillet med en frekvens på 10"4. Der fandtes to kloner indeholdende plasmider, der bærer genet for subtilisin 309, pSX86 og pSX88.

10 Genet blev derpå sekvensbestemt, idet fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilbert anvendtes. Den fremkomne nucleotidsekvens fra subtilisin 309 er vist i tabel II.

29 DK 176102 B1

Tabel il

Subtilisin 309 genet 5 Signal ATGAAGAAACCG TTGGGGAAAATT GTCGCAAGCACC GCACTACTCATT TCTGTTGCTTTT 1 pro

AGTTCATCGATC GCATCGGCTGCT GAACAACGAAAA GAAAAATATTTA ATTGGCTTTAAT

82

10 GAGCAGGAAGCT GTCAGTGAGTTT GTAGAACAAGTA GAGGCAAATGAC GAGGTCGCCATT

CTCTCTGAGGAA GAGGAAGTCGAA ATTGAATTGCTT CATGAATTTGAA ACGATTCCTGTT

TTATCCGTTGAG TTAAGCCCAGAA GATGTGGACGCG CTTGAACTCGAT CCAGCGATTTCT

15 Mature

TATATTGAAGAG GATGCAGAAGTA ACGACAATGGCG CAATCAGTGCCA TGGGGAATTAGC

334

CGTGTGCAAGCC CCAGCTGCCCAT AACCGTGGATTG ACAGGTTCTGGT GTAAAAGTTGCT

20 GTCCTCGATACA GGTATTTCCACT CATCCAGACTTA AATATTCGTGGT GGCGCTAGCTTT

GTACCAGGGGAA CCATCCACTCAA GATGGGAATGGG CATGGCACGCAT GTGGCCGGGACG

ATTGCTGCTTTA AACAATTCGATT GGCGTTCTTGGC GTAGCGCCGAGC GCGGAACTATAC

25

GCTGTTAAAGTA TTAGGGGCGAGC GGTTCAGGTTCG GTCAGCTCGATT GCCCAAGGATTG

GAATGGGCAGGG AACAATGGCATG CACGTTGCTAAT TTGAGTTTAGGA AGCCCTTCGCCA

Xbal

30 AGTGCCACACTT GAGCAAGCTGTT AATAGCGCGACT TCTAGAGGCGTT CTTGTTGTAGCG

GCATCTGGGAAT TCAGGTGCAGGC TCAATCAGCTAT CCGGCCCGTTAT GCGAACGCAATG

GCAGTCGGAGCT ACTGACCAAAAC AACAACCGCGCC AGCTTTTCACAG TATGGCGCAGGG

35

CTTGACATTGTC GCACCAGGTGTA AACGTGCAGAGC ACATACCCAGGT TCAACGTATGCC

Clal

AGCTTAAACGGT ACATCGATGGCT ACTCCTCATGTT GCAGGTGCAGCA GCCCTTGTTAAA

40 CAAAAGAAC C CA TCTTGGTCCAAT GTACAAATCCGC AATCATCTAAAG AATACGGCAACG

AGCTTAGGAAGC ACGAACTTGTAT GGAAGCGGACTT GTCAATGCAGAA GCGGCAACACGC

Stop

TAA

45 1141

Samme fremgangsmåde som ovenfor anvendtes til kloning af subtilisin 147 genet med undtagelse af, at DNA fragmenter 50 blev ligeret i plasmid pSX56 (også beskrevet i U.S. patent nr. 5,036,002 ovenfor) der som angivet i fig. 2 i stedet for xyn DK 176102 B1 30 promoteren indeholder xyl promoteren. Der fandtes en klon indeholdende et plasmid pSX94, der bærer genet for subtilisin 147. Sekvensen for dette gen er vist i tabel III nedenfor.

5

Tabel III

Subtilisin 147 genet 10 Signal

ATGAGACAAAGT CTAAAAGTTATG GTTTTGTCAACA GTGGCATTGCTT TTCATGGCAAAC

1 Pro

CCAGCAGCAGCA GGCGGGGAGAAA AAGGAATATTTG ATTGTCGTCGAA CCTGAAGAAGTT

73

15 TCTGCTCAGAGT GTCGAAGAAAGT TATGATGTGGAC GTCATCCATGAA TTTGAAGAGATT

CCAGTCATTCAT GCAGAACTAACT AAAAAAGAATTG AAAAAATTAAAG AAAGATCCGAAC

Mature GTAAAAGCCATC GAAGAGAATGCA GAAGTAACCATC AGTCAAACGGTT CCTTGGGGAATT 20 280

TCATTCATTAAT ACGCAGCAAGCG CACAACCGCGGT ATTTTTGGTAAC GGTGCTCGAGTC

GCTGTCCTTGAT ACAGGAATTGCT TCACACCCAGAC TTACGAATTGCA GGGGGAGCGAGC

25 TTTATTTCAAGC GAGCCTTCCTAT CATGACAATAAC GGACACGGAACT CACGTGGCTGGT

ACAATCGCTGCG TTAAACAATTCA ATCGGTGTGCTT GGTGTACGACCA TCGGCTGACTTG

TACGCTCTCAAA GTTCTTGATCGG AATGGAAGTGGT TCGCTTGCTTCT GTAGCTCAAGGA

30

ATCGAATGGGCA ATTAACAACAAC ATGCACATTATT AATATGAGCCTT GGAAGCACGAGT

GGTTCTAGCACG TTAGAGTTAGCT GTCAACCGAGCA AACAATGCTGGT ATTCTCTTAGTA

35 GGGGCAGCAGGT AATACGGGTAGA CAAGGAGTTAAC TATCCTGCTAGA TACTCTGGTGTT

ATGGCGGTTGCA GCAGTTGATCAA AATGGTCAACGC GCAAGCTTCTCT ACGTATGGCCCA

i GAAATTGAAATT TCTGCACCTGGT GTCAACGTAAAC AGCACGTACACA GGCAATCGTTAC

40

GTATCGCTTTCT GGAACATCTATG GCAACACCACAC GTTGCTGGAGTT GCTGCACTTGTG

AAGAGCAGATAT CCTAGCTATACG AACAACCAAATT CGCCAGCGTATT AATCAAACAGCA

45 ACGTATCTAGGT TCTCCTAGCCTT TATGGCAATGGA TTAGTACATGCT GGACGTGCAACA

Stop CAATAA 1084 50 31 DK 176102 B1

Frembringelse af stedsspecifikke mutationer af subtilisin 309 genet__

Stedsspecifikke mutationer blev udført ifølge

Morinaga et al. (Biotechnology, ovenfor). Følgende oligonucle-5 otider anvendtes til indføring af mutationerne: a) Gly-195 Glu:

En 27 mer umage primer, Nor-237, som også danner et nyt SacI restriktionssite 10 5' CACAGTATGGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGG 3 ' NOR-237 5' GTATGGCGCAGAGCTCGACATTTGTCGC 3'

SacI

15 b) Gly-195 Asp:

En 23-mer umage primer, NOR-323, som også danner en ny Bglll site

AT

5 1 CACAGTATGGGCGCAGGGCTTGACATTGTC3’ 20 3' CATACCGCGTCTAGAACTGTAAC 5'

Bglll e) Ser-153 Ala:

En 18-mer umage primer, NOR-324, som også danner en 25 ny PvuII site

G

5' CTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGT 3' NOR-324 3·CATCGCCGTCGACCCTTA 5'

PvuII

30 f) Asn-218 Ser:

En 23-mer umage primer, NOR-325, som også danner en ny MspI site

TC

35 5' TATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATG 3' NOR-324 3' TACGGTCGAATAGGCCATGTAGC 51

MspI

32 DK 176102 B1 g) Thr-71 Asp:

En 23-mer umage primer, NOR-483,

GAC

5' TGTGGCCCGGGACGATTGCTGCTT 3 ' 5 NOR-483 3' ACACCGGCCCCCTGTAACGACGAA 5' h) Met-222 Cys og Gly-219_Cys:

En 32-mer umage, NOR-484,

T TGT

10 5' CAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTC 3' 219 222 NOR-484 3' GTCGAATTTGACATGTAGCACACGATGAGGAG 5' 15 i + j) Gly-195 Glu og Met-222 Ala eller Met-222 Cys:

For disse dobbelte mutanter udførtes kombinationer af NOR-237 og NOR-235 eller NOR-236 ved at forbinde de enkelte mutante DNA-fragmenter.

20 k) Ser-153 Ala og Asn-218 Ser:

En kombination af NOR-324 og NOR-325 blev udført som beskrevet ovenfor.

Åben duplex mutagenese udførtes med plasmid pSX93 som templat. pSX93 er vist i fig. 3a og 3b, og er pUC13 (Vieira, 25 J. og Messing, J.; 1982, Gene 19: 259-268) indeholdende et 0,7 kb Xbal-Hindlll fragment af subtilisin 309 genet omfattende terminatoren indsat i polylinkeren. Terminatoren og Hindlll site er ikke vist i Tabel II.

Til indføring af mutationerae i den N-terminale del 30 af enzymet anvendtes plasmid pSX119. pSX119 er pUC13 indeholdende et EcoRI-Xbal fragment af subtilisin 309 genet indsat i polylinkeren. Templaterne pSX93 og pSXH9 dækker således hele subtilisin 309 genet.

Mutationerne a), b) og e) udførtes ved at skære pSX93 35 med Xbal og Clal som angivet på fig. 3a; c), d) , f) og h) udførtes ved at skære pSX93 med Xbal og Hindlll som angivet i fig. 3b.

33 DK 176102 B1

Mutation g) udførtes tilsvarende i pSX119 ved at skære med EcoRI og Xbal.

De dobbelte mutanter i) og j) fremstilledes ved at skære 0,7 kb Xba-HindIII fragmentet fra a) delvist med HgiAI 5 (HgiAI skærer også i SacI, som blev indført ved mutationen).

Dette 180 bp Xbal-HgiAI fragment og 0,5 kb HgiAI fragmentet fra henholdsvis c) og d) mutanterne blev ligeret til det store Hindlll-Xbal fragment fra pSX93.

Den dobbelte mutant k) fremstilledes som ovenfor ved 10 at kombinere mutanterne e) og f).

Efter baseparring, udfyldning og ligering anvendtes blandingen til at transformere E. coli MC 1000 r'm+. Mutanter blandt transformanterne blev screenet for kolonihybridisering som beskrevet i Vlasuk et al.; 1983, J.Biol.Chem., 258: 7141-15 7148 og i Vlasuk, G.P. og Inouye, S.: p. 292-303 i "Experimental Manipulation of Gene Expression” Inouye, M.

(ed.) Academic Press, New York. Mutationerne bekræftedes ved hjælp af DNA sekvensbestemmelse.

20 Udtrykkelse af mutante subtilisiner

Efter sekvensbekræftelse af den korrekte mutation blev de muterede DNA fragmenter indsat i plasmid pSX92, som anvendtes til fremstilling af mutanterne.

Plasmid pSX92 er vist i fig. 4 og fremstilledes ved 25 kloning af Sub 309 genet i plasmid pSX62 skåret ved Clal, udfyldt med Klenow fragmentet fra DNA polymerase I og skåret med Hindlll inden indsættelse af fragmenterne Dral-Nhel og Nhel-Hindlll fra det klonede Sub 309 gen.

For at udtrykke mutanterne blev de muterede frag-30 menter (Xbal-Clal, Xbal-Hindlll eller EcoRI-Xbal) udskåret fra den passende mutation henholdsvis plasmid pSX93 eller pSX119 og indsat i pSX92.

Det muterede pSX92 anvendtes derpå til transformation af B. subtilis stamme DN497, som derpå dyrkedes i det samme 35 medium og under samme betingelser som anvendt til kloning af det oprindelige gen.

Efter passende dyrkning udvandtes de muterede enzymer 34 DK 176102 B1 og oprensedes.

Oxidationsstabilitet af mutante subtilisiner 5 Mutanterne a) og d) blev afprøvet for oxidations- stabilitet i 0,01 M pereddikesyre efter 20 minutter ved 50°C og pH 7. Den oprindelige stamme NCIB 10309 protease anvendtes som reference.

Resultaterne er vist i tabel IV nedenfor, som viser 10 restproteolytisk aktivitet i de varmebehandlede prøver i forhold til prøver, der ikke er behandlet med oxidationsmiddel eller varme.

15 Tabel iv

Oxidationsstabilitet over for pereddikesyre

Enzym Restaktivitet efter 20 minutter ved 50°C

20 _uden oxidationsmiddel med oxidationsmiddel sub 309 89% 48% mutant a 83% 45% mutant d 92% 93% 25 Det ses, at mutant d (Met 222 til Ala) udviser overlegen oxidationsstabilitet i forhold til det oprindelige enzym og mutant a.

Alle mutanter undtagen g) og h) er også blevet 3 0 afprøvet kvalitativt i 100 - 500 ppm hypochlorit ved stuetemperatur og 35°C, pH 6,5 og 9,0 i fra 15 minutter til 2 timer.

Disse forsøg viste, at mutanter c), d), i) og j) (alle Met-222) kunne modstå 3-5 gange mere hypochlorit end de andre mutanter.

35 Ved afprøvning i et flydende detergent af den sædvan lige type fandt man, at mutant f) udviste overlegen stabilitet 35 DK 176102 B1 i sammenligning med både de øvrige mutanter og det oprindelige enzym.

5 Proteolytisk aktivitet hos mutante subtilisiner

Den proteolytiske aktivitet hos forskellige mutanter blev afprøvet mod casein som proteinsubstrat ifølge de ovenfor beskrevne fremgangsmåder. Resultaterne er vist i tabel V.

Af tabellen ses, at mutant a) udviser forbedret akti-10 vitet i sammenligning med det oprindelige enzym. Det ses også, at Met-222 mutanterne har lavere aktivitet end det oprindelige enzym, men på grund af deres forbedrede oxidationsstabilitet er deres anvendelse i detergentforbindelser indeholdende oxidanter ikke udelukket.

15

Tabel V

Proteolytisk aktivitet hos mutante subtilisiner 20 Mutant Relativ aktivitet

Ingen 100 a) 120 b) 100 e) 100 25 f) 100 i) 20 j) 30 30 Vaskeevne hos mutante subtilisiner

Vaskeevnen hos forskellige mutanter blev afprøvet på spinatsaft ifølge de ovenfor beskrevne fremgangsmåder. Resultaterne er vist i Tabel VI.

Af tabellen ses, at alle de afprøvede mutanter 35 udviste forbedret vaskeevne i forhold til det oprindelige enzym, og at mutanterne i) og j) er tydeligt bedre.

36 DK 176102 B1

Tabel VI

Vaskeevne hos mutanten

5 AR

Mutant Koncentration (CPU/1) 0,05 0,1 ingen 14,4 20,4 a) 18,8 21,5 10 b) 16,9 19,7 e) 15,4 21,8 f) 16,6 19,3 i) 21,6 22,1 j) 20,6 22,6 15 95% konfidensinterval: ±0,9

Termostabilitet hos mutante subtilisiner 20 Thermostabiliteten af mutant f) blev afprøvet over for vildtype enzymet ved at anvende vaskeevneprøven ved henholdsvis 40°C og 60°C. Resultaterne er vist i tabel VII.

Af tabellen ses, at mutant f) ved 60°C udviser en meget forbedret vaskeevne sammenlignet med vildtype enzymet, 25 hvorimod vaskeevnen af mutant f) kun er lidt bedre ved 4 0°C end af vildtype enzymet.

37 DK 176102 B1

Tabel VII

Vaskeevne ved forskellige temperaturer

AR

5 Mutant Koncentration {CPU/1) 0,05 0,1 ingen (40°C) 14,4 20,4 f) (40°C) 16,6 19,3 ingen <60°C) 15,1 24,9 10 f) <60°C) 30,4 31,3 95% konf idens interval +0,9 (40°C) og +0,7 (60°C) 15 Diskussion

Subtilisin gener blev klonet fra 147 og 309 varianterne af Bacillus lentus, og de klonede gener sekvensbestemt.

Ved at sammenligne de afledte aminosyresekvenser for subtili-sin 14 7 og 3 09 med hinanden og med andre subtilisinsekvenser 20 blev der identificeret steder, som ved mutation kunne ændre det oprindelige enzyms fysiske egenskaber. Stedsrettet muta-genese anvendtes til at frembringe mutationer adskillige steder i subtilisin 309 genet. De resulterende mutante enzymer blev derpå udtrykt i en Bacillus stamme og afprøvet mod 25 forskellige fysiske og kemiske parametre. Adskillige af mutanterne viste sig af have forbedret stabilitet over for oxidation, forøget proteolytisk evne eller forbedret vaskeevne sammenlignet med det oprindelige subtilisin 309 enzym. Disse mutanter udviser egenskaber, der er ønskværdige for enzymer i 30 detergentsammensætninger.

Claims (13)

1. Mutant subtilisinenzym, kendetegnet ved, at det har en aminosyresekvens med mindst 80% homologi med 5 aminosyresekvensen for subtilisin 309 som angivet i Tabel 1(a), som kan fremstilles af B. lentus C360 (NCIB 10309), og at aminosyreresten ved en eller flere af positionerne: 6, 9, 11, 12, 19, 25, 37, 38, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 68, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121, 122, 140, 175, 180, 182, 186, 10 187, 191, 194, 195, 226, 234, 235, 236, 237, 238, 241, 260, 261, 262, 265, 268 eller 275 ændres ved substitution med en anden aminosyrerest, eller, at en eller flere aminosyrerester indsættes ved en eller flere af positionerne: 36, 56, 159 eller 164-165. 15

2. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at resten ved position 6 substitueres med tyrosin og/eller resten ved position 68 substitueres med cystein eller methionin og/eller resten ved position 71 substitueres med 20 asparaginsyre eller glutaminsyre og/eller resten ved position 175 substitueres med isoleucin.

3. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at resten ved position 195 substitueres med glutaminsyre 25 eller asparaginsyre og/eller resten ved position 275 substitueres med glutamin, eller resten ved position 19 substitueres med glycin og resten ved position 219 substitueres med cystein. 3 0

4. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det omfatter aminosyresekvensen i det væsentlige som afbildet i Tabel I(a).

5. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet 35 ved, at det omfatter aminosyresekvensen i det væsentlige som afbildet i Tabel I(b). DK 176102 B1

6. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1 og 5, * kendetegnet ved, at tryptophanresten ved position 6 substitueres med tyrosin, og/eller valinresten ved position 68 * 5 substitueres med cystein eller methionin; og/eller threoninresten ved position 71 substitueres med asparaginsyre eller glutaminsyre; og/eller methioninresten ved position 175 substitueres med isoleucin,* og/eller glutaminsyreresten ved position 195 substitueres med glycin eller asparaginsyre; 10 og/eller glutaminresten ved position 275 substitueres med arginin.

7. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1 og 5, kendetegnet ved, at argininresten ved position 19 substitueres 15 med glycin og glycinresten ved position 219 substitueres med cystein.

8. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleotidsekvens, der koder for et subtilisinenzym 20 omfattende en aminosyresekvens som afbildet i Tabel 1(a) eller i Tabel I(b).

9. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleotidsekvens, der koder for subtilisin 309 25 enzymet i det væsentlige som afbildet i Tabel II.

10. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleotidsekvens, der koder for subtilisin 147 enzymet i det væsentlige som afbildet i Tabel III. 30

11. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at nucleinsyresekvensen ifølge krav 8, 9 eller 10 er blevet ændret således at det koder for en subtilisinmutant ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 7. 35

12. Anvendelse af rekombinant DNA molekyle ifølge et DK 176102 B1 hvilket som helst af kravene 8 til 11 til frembringelse af et subtilisinenzym.

13. Detergentkomposition, kendetegnet ved, at det 5 omfatter et subtilisinenzym ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 7.