JP3220137B2

JP3220137B2 - アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法

Info

Publication number: JP3220137B2
Application number: JP51191790A
Authority: JP
Inventors: ウイルソン、チャールズ・アール; ラーディン、ベス・エフ; ミーレンツ、ジョナサン・アール; ホム、シェーマン・スー・ミン; ハンセン、ディーター; レイノルズ、ロバート・ビー; ケネディー、ニコラス・チャールズ・トーマス; シュナイダー、ヨアヒム; バーン、ミハエル; シュミット、ロルフ; マルクグラフ、マルチナ; パエヒ、クリスチャン
Original assignee: ヘンケル・リサーチ・コーポレイション
Priority date: 1989-08-25
Filing date: 1990-08-17
Publication date: 2001-10-22
Anticipated expiration: 2016-10-22
Also published as: EP0493398B1; ES2144990T3; KR920701425A; WO1991002792A1; ATE187490T1; DE69033388D1; DE69033388T2; US5352604A; JPH04507346A; KR100200166B1; EP0493398A1; DK0493398T3

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景 1.産業上の利用分野本発明はアルカリ性タンパク質分解酵素、遺伝子的に
変化させたバチルス（Bacillus）株の培養によるその製
造、およびバチルス株内のアルカリ性タンパク質分解酵
素をコードする遺伝子配列に関する。

2.関連技術の紹介タンパク質分解酵素は家庭用洗濯洗浄剤の組成中に、
衣服のような物品からタンパク質ベースの汚れを落とす
ために広く使用されている。これらの酵素はペプチド結
合を切断するセリンプロテアーゼとして知られるもので
ある。水性洗浄剤溶液中で有用であるために、これらの
酵素は７から10の範囲のpHにおいて活性でなくてはなら
ない。洗浄剤への適応において有用性を得るためには、
また酸化および酵素的あるいは非酵素的加水分解に対し
ても安定でなくてはならない。様々なバチルス株が適当
な好気性発酵条件においてセリンプロテアーゼを産生す
る。しかしながら、野性株によって産生されるプロテア
ーゼの量およびそのプロテアーゼを産生する速度は通
常、商業的な生産には不充分である。プロテアーゼ収量
を増加させる一つの方法はラジエーションや化学的な突
然変異誘発物質によって突然変異株を作成することであ
る。しかしながら、古典的な突然変異方法では要求され
る突然変異は、統計的な分散量を作成するだけであり、
および／またはかなりの部分が再び野生種に戻ってしま
う。近年、これらの問題を解決する試みが最近の株の遺
伝子的な変更に集中してなされている。これはリコンビ
ナントDNAを、宿主細胞がこのリコンビナントDNAの多く
のコピーに複写することが分かっている環境下で導入す
ることにより行われている。加えて、外来DNAに担われ
た遺伝子も発現させることができる。遺伝子的に操作し
た有機体は古典的な突然変異細菌にしばしば認められる
欠点に病むことがなく、それ故商業的な酵素製造に有用
である。

リコンビナントDNA技術を使用してプロテアーゼを作
成する技術は既知である。例えば欧州特許第130756A号
はカルボニルハイドラーゼ（プロテアーゼの１種）を、
米国特許第4,760,025号は天然由来の株から変化させた
アミノ酸シークエンスを有する株からのサブチリジン
（subtilisin）を開示している。ドイツ特許第DE292542
7号は、キレート剤および界面活性剤に高度に安定で、
バチルス・リッシェニフォルミス（Bacillus lichenifo
rmis）株の発酵によって製造されるアルカリ性プロテア
ーゼを開示している。バチルス・リッシェニフォルミス
の培養によるアルカリ性プロテアーゼ酵素の製造は英国
特許第1,263,765号；ドイツ特許第1,940,488;ロシア特
許第400,116;米国特許第3,623,956号；同第3,623,957号
に開示されている。

発明の要旨本発明の目的のひとつは、pH7〜10、温度が10〜60℃
の水溶液中において、増加したプロテアーゼ活性と酸化
に対する安定性を有する、洗浄剤の組成中に使用するた
めのタンパク質分解酵素を供給することである。また、
洗浄剤の製造に有用なタンパク質分解酵素の商業的な製
造に使用するための、バチルス属の突然変異株を提供す
ることも本発明の目的のひとつである。さらに宿主のバ
チルス細胞の形質転換のための望ましいタンパク質分解
酵素をコードする配列を有する発現ベクターを供給する
ことも本発明の目的である。これらの目的は、実質的に
FIG.1に示されたアミノ酸配列を有するマチュアーなタ
ンパク質分解酵素を提供することにより達成される。マ
チュアーなタンパク質分解酵素は、およそアミノ酸残基
番号112からおよそアミノ酸残基番号380まで伸びてい
る。このタンパク質分解酵素は、バチルス・リッシェニ
フォルミスATCC53926株の転写の方向に、バチルス・リ
ッシェニフォルミスATCC53926アルカリ性プロテアーゼ
遺伝子プロモーター、リボソーム結合部位および、バチ
ルス・レンツス（Bacillus lentus）株のアルカリ性プ
ロテアーゼ酵素をコードしているマチュアー部位に操作
しやすいようリンクしている、プレ−プロ部位に操作し
やすくリンクした開始コドンを有する調節部位を有する
DNA配列を有するプラスミドによって形質転換されたバ
チルス・リッシェニフォルミスATCC53926株の培養によ
って製造される。

バチルス・リッシェニフォルミスATCC53926株はこれ
以降、ATCC53926と呼ぶ。バチルス・リッシェニフォル
ミスDSM641株はこれ以降、DSM641と呼ぶ。米国特許第4,
683195,号及び第4,683,202号に開示されているポリメラ
ーゼ鎖反応はこれ以降、PCRと呼ぶ。FIG.27に示したバ
チルス・リッシェニフォルミスATCC53926株のアルカリ
性プロテアーゼ遺伝子は、これ以降、ATCC53926アルカ
リ性プロテアーゼ遺伝子と呼ぶ。バチルスレンツスのア
ルカリ性プロテアーゼはこれ以降、BLAPと呼ぶ。バチル
ス・リッシェニフォルミスATCC53926アルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子プロモーターはATCC53926アルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子からのプロモーターであり、これ以降AT
CC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子プロモーターと
呼ぶ。kbの記号は1000塩基対の語のかわりに使用する。

図面の簡単な説明 FIG.1はBLAPタンパク質のプレ、プロ、およびマチュア
ー領域のアミノ酸配列を示す。

FIG.2はBLAP遺伝子を含有するバチルス・レンツス株か
らの3.4kb Hind IIIフラグメントのDNA配列を示す。

FIG.3はプラスミドpGM15の制限酵素地図を示す。

FIG.4はプラスミドpCB11Cの制限酵素地図を示す。

FIG.5はプラスミドpCB1Nの制限酵素地図を示す。

FIG.6はプラスミドpCB13Cの制限酵素地図を示す。

FIG.7はプラスミドpCB2Nの制限酵素地図を示す。

FIG.8はオリゴヌクレオチド１〜３を示す。位置の表示
はATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子ないのヌク
レオチド配列の位置に対応する。ミスマッチ部位は小文
字で表している。制限部位には下線を引いて示してい
る。

FIG.9はプラスミドpCB15Cの制限酵素地図を示す。

FIG.10はプラスミドpCB4Nの制限酵素地図を示す。

FIG.11はプラスミドpCB1Nの構築の概略図を示す。

FIG.12はプラスミドpCB11Cの構築の概略図を示す。

FIG.13はプラスミドpCB55Cの制限酵素地図を示す。

FIG.14はプラスミドpCB56Cの制限酵素地図を示す。

FIG.15はプラスミドpCB58Cの制限酵素地図を示す。

FIG.16はプラスミドpCB75Cの制限酵素地図を示す。

FIG.17はプラスミドpCB78Cの制限酵素地図を示す。

FIG.18はプラスミドpCB50Nの制限酵素地図を示す。

FIG.19はプラスミドpCB51Nの制限酵素地図を示す。

FIG.20はプラスミドpCB53Nの制限酵素地図を示す。

FIG.21はプラスミドpCB70Nの制限酵素地図を示す。

FIG.22はプラスミドpCB73Nの制限酵素地図を示す。

FIG.23は大腸菌（Escherichia coli）およびバチルス内
にCla I融合プラスミド構築物を構築する方法の概略図
を示す。

FIG.24はサビナーゼオリゴヌクレオチドプローブの概略
ダイアグラム図である。これらのプローブは既知のサビ
ナーゼアミノ酸配列に基づいており、バチルス・レンツ
ス遺伝子バンクをプローブし、PCR反応におけるプライ
マーとして使用提供される。

FIG.25はオリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマ
ーの特定の配列である。

FIG.26はプラスミドpMG108.2の制限酵素地図を示す。

FIG.27および27aはATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺
伝子をコードする遺伝子中への制限部位の導入を示す。

FIG.28はATCC53926作製株中に構築した、異なるATCC539
26アルカリ性プロテアーゼ−BLAPプロテアーゼの収量の
比較を示している。

FIG.29はATCC53926アルカリ性プロテアーゼ−BLAPのNco
I遺伝子融合構築物により作製された成熟タンパク質の
アミノ酸配列である。

好ましい具体例の説明 pH7〜10、温度が10〜60℃の水性溶液中において増加
したプロテアーゼ活性および酸化安定性を有しているバ
チルス・レンツスにより産生されるタンパク質分解酵素
（BLAP）を供給する。マチュアーなBLAP酵素は269個の
アミノ酸残基を有し、分子量が26,823ダルトンであり、
計算上の等電点が9.7である。この酵素は土壌試料から
分離され、表１に示す性質を有するバチルス・レンツス
DSM5483から最初に得られた。

FIG.1に示したアミノ酸配列は、一部分を標準的なア
ミノ酸配列決定方法により決定し、残りは核酸配列から
演繹した。

BLAP酵素を作製する為に、転写の方向に調節領域を有
し、BLAP酵素をコードするDNA配列を有するハイブリッ
ドプラスミドを含有するバチルス宿主細胞を培養するこ
とを含む方法を提供する。ここで、上記調節領域は転写
の順に、ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子プロ
モーター、リボソーム結合部位、そして、BLAPをコード
するマチュアー領域に作動出来るようにリンクしている
プレ−プロ領域に、操作出来るようにリンクしている開
始コドンを有している。上記のものはすべて、ATCC5392
6アルカリ性プロテアーゼ遺伝子からのカルボキシ末端
（Ｃ−末端）DNA配列にリンクしている。Ｃ−末端DNA配
列は、ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のおよ
そSal IおよびおよそSst I制限部位の間のDNA配列であ
る。これは、米国特許出願のなかに開示されているよう
な、染色体でコードされるプロテアーゼを抑制するのに
使用してもよい。どのようなバチルス株でも本発明の方
法においてBLAP酵素を製造するのに使用することができ
る。バチルス・リッシェニフォルミスは好ましい株であ
る。ATCC53926は最も好ましい菌株である。ATCC53926
は、表２に挙げた性質を有するバチルス・リッシェニフ
ォルミスDSM641株の古典的突然変異誘発によって得られ
た株である。

BLAP酵素をコードするDNAはバチルス・レンツスのDSM
5483株から染色体DNAを単離し、バチルス・レンツスプ
ロテアーゼをコードしていると推定できるDNA配列とホ
モロジーを有するDNAプローブを構築し、単離した染色
体DNAからの遺伝子ライブラリーを作製し、そしてプロ
ーブへハイブリダイゼーションして興味のある遺伝子を
このライブラリーからスクリーニングすることによって
得られる。遺伝子ライブラリーはプラスミドpBR322、バ
クテリオファージラムダEMBL3およびEMBL4、およびコス
ミドpCP13をクローニングベクターとして使用すること
によって大腸菌内に構築することができる。好ましくは
バチルス・レンツスDSM5483株のクロモソームDNAのジー
ンバンクはコスミドpCP13を用いて大腸菌内に構築す
る。

サビナーゼ（Savinase）遺伝子（サビナーゼをコード
する遺伝子、Novo Industri A/Sから発売されている市
販のセリンプロテアーゼ）のDNA配列と同じDNA配列を有
するオリゴヌクレオチドプローブを、サビナーゼ様遺伝
子のプローブとして使用することができる。好ましく
は、BLAP配列を使用する。これらのオリゴヌクレオチド
類は、制限酵素で消化した大腸菌HB101株、バチルスバ
チルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）のDB104株、
バチルス・リッシェニフォルミス株およびバチルス・レ
ンツス株からの染色体DNAのサザンブロットのスクリー
ンとして使用してもよい。FIG.24および25に示したＮ末
端および内部オリゴヌクレオチド類もまたPCRにおいて
バチルス・レンツス染色体DNAのマチュアーなアルカリ
性プロテアーゼのＮ末端からＣ末端シアノゲンブロミド
フラグメントのＮ末端まで伸びているバチルス・レンツ
ス染色体DNA領域を増幅するのに利用することができ
る。

アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のマチュアーな領域の
一部をより大きなバチルス・レンツスに特有なダブルス
トランドDNAをPCRを用いて構築することにより単離する
ことができる。サビナーゼプロテアーゼからのＣ末端シ
アノゲンブロミドフラグメントのアミノ酸配列に基づい
た解析により、この配列は他のサブチリシンタイプ（su
btilysin type）のセリンプロテアーゼと同様、サビナ
ーゼの活性部位セリン周辺のアミノ酸配列とホモロジー
を有していることがわかった。増幅されたフラグメント
はおよそ650塩基対（basepairs;bp）の長さで、他のバ
チルスアルカリ性プロテアーゼから得られる有効な配列
データから予期された大きさと一致する。650bpのPCRフ
ラグメントはマチュアーなプロテアーゼのＮ末端のすぐ
あとからはじまり、タンパク質コード領域内まで続いて
いるアルカリ性プロテアーゼをコードする部位を示す。

650bpのフラグメントは遺伝子ライブラリー内のBLAP
遺伝子を同定するのに使用することができる。精製した
後、650bpのフラグメントは、例えばニックトランスレ
ーションによって標識し、バチルス・レンツスDSM5483
株のDNAのジーンバンクをプローブするために使用して
もよい。このジーンバンクはコスミドpCP13およびEMBL
ラムダベクターによって構築してもよい。650bpのPCRフ
ラグメントおよび選択的オリゴヌクレオチドプローブと
ホモロジーを有するDNAを担うコスミドクローンを幾つ
か同定してもよい。これらのコスミドのうちのひとつの
プラスミドDNAであるpHSH44を精製し。制限酵素分析に
よって解析した。サザン分析の結果、バチルス・レンツ
スのDSM5483株の、約3.4kbのHind IIIフラグメントは、
放射性活性にラベルしたプローブである650bpのPCRフラ
グメントとハイブリダイズすることができることが示さ
れた。ハイブリダイゼーション、制限酵素分析およびDN
A配列（FIG.2）により、650bpのPCRフラグメントとホモ
ロジーを有する3.4kbのHind IIIフラグメントはBLAP遺
伝子をコードすることを示した。

ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子部およびBLA
P遺伝子部からなる遺伝子融合に基づいた、発現カセッ
トを含有するATCC53926株の発酵は、好ましい大量合成
ベースのBLAP製造方法に使用される。このようなカセッ
トは、プロモーター、リボソーム結合部位および関連す
る遺伝子の効果的な転写および翻訳にかかわる開始コド
ンを含有するATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子
からの調節領域からなる。この調節領域の後にシグナル
（プレ）ペプチドをコードするDNA配列が続き、その後
にプロ−ペプチドおよびマチュアープロテアーゼをコー
ドするDNA配列が続く。DNA配列の転写の後、プロモータ
ーから下がってメッセンジャーRNA（ｍ−RNA）がシグナ
ルペプチド、プロペプチドおよびマチュアーなプロテア
ーゼを形成するプレ−プロ−マチュアープロテアーゼ内
へ翻訳される。シグナル配列は細胞質膜内のインマチュ
アーなプロテアーゼを支配し、そこでシグナルペプチド
はシグナルペプチダーゼによって酵素的に切断される。
プロ配列は、細胞質膜および細胞壁を通してのトランス
ロケーションの間あるいは後に、正しいフォールディン
グとプロセシング、マチュアーなプロテアーゼを遊離さ
せることを保証しているようである。（Power,S.D.ら、
PNAS（米国）第83巻第3096頁（1986年）;Ikeura,H.ら、
J.Biol.Chem.第262巻第7859頁（1987年））;Ikeura,H.
ら、J.Biol.Chem.第263巻第12959頁（1988年））。

ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子およびBLAP
遺伝子の異なった部分をつなぐために使用される制限酵
素部位によって区別される２種類の融合タイプは、上記
のATCC53926の形質転換をさせるために使用した場合
に、BLAP酵素を商業的規模で生産する発現カセットを作
製するのに使用することができる。これらのカセットは
Cla IとNco Iによる融合から作製される。Cla I融合
は、ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子プロモー
ターと、プロおよびマチュアーなBLAP配列をコードする
DNAフラグメントを有するプレ配列とを結合させる。Cla
I制限部位はATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子
内、ATCC53926アルカリ性プロテアーゼのプレおよびプ
ロ配列の結合点から数個さかのぼったコドン内に導入す
ることができる。BLAP遺伝子は生来この箇所にCla I部
位を有する。ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子
のプロモーターおよび殆どのプレ領域は（Ava I/Cla I
DNAフラグメント）、BLAP遺伝子の、BLAP遺伝子のプレ
領域の一部と全てのプロおよびマチュアーな領域を含有
している（Cla I/Sst I）フラグメントと融合すること
ができる。Nco IおよびCla Iの融合は大腸菌内で作製さ
れ、異なった２つのバチルスベクター内の、Ava I/Sst
IのDNAフラグメント上にサブクローン化できる。

Nco I融合ではBLAPとわずかに違うマチュアーなプロ
テアーゼを製造する。Nco Iによって製造されたタンパ
ク質は、マチュアーなプロテアーゼのＮ末端から３つ目
にスレオニンを有するが同じ位置がBLAPではセリンであ
る（FIG.29）。Nco I融合はプロモーター、ATCC53926ア
ルカリ性プロテアーゼ遺伝子のプレおよびプロ配列をBL
AP遺伝子のマチュアーな配列と結合させることによって
構成される。Nco I制限部位は、ATCC53926アルカリ性プ
ロテアーゼ遺伝子内のプロとマチュアー配列の結合点か
ら数コドン下がったところに導入することができる。自
然のNco I部位がBLAP遺伝子には同じ部位にある。こう
して、プロモーター、プレ、プロ、およびマチュアーな
ATCC53926配列の４コドン（Ava I/Nco I DNAフラグメン
ト）を最初の４コドン（Nco I/Sst I DNAフラグメン
ト）を欠損したマチュアーはBLAP配列と融合することが
できる。Nco IおよびCla I融合は大腸菌内で作成するこ
とができ、２つの異なったバチルスベクター内のAva I/
Sst I DNAフラグメント上にサブクローン化することが
できる。

より酵素の生産を増加させるため、ClaおよびNco I融
合体を164bpDNAフラグメントであるATCC53926アルカリ
性プロテアーゼの転写ターミネーターカセットかまたは
608bpのATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のＣ末
端フラグメント（以下に詳しく述べる）と共にクローン
化してもよい。

ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ−BLAP融合遺伝子
は大腸菌ベクターpGM15（FIG.3）のBLAP遺伝子を含有す
る3.4kbのHind III/Kpn Iフラグメントを含有するpTZ19
R誘導体内に構築することが出来、その後バチルスベク
ターのpCB16およびpCB110内にサブクローン化される。
バチルス融合遺伝子ベクターpCB1N（FIG.5）は、FIG.11
に示したようにして構築される。バチルス融合遺伝子ベ
クターpCB11C（FIG.4）は、FIG.12に示したようにして
構築することができる。上に記載したそれぞれの遺伝子
の融合体は、（ａ）より効果的なBLAPプロテアーゼ遺伝
子の発現のためおよび（ｂ）染色体のコードするATCC53
926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の発現の抑制を完全
にするためにに多様なものが作製される。効果的なBLAP
プロテアーゼ遺伝子転写のターミネーションを得るた
め、ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ転写のターミネ
ーターを上記それぞれの融合遺伝子中へ、BLAPターミネ
ーターから下がって、164bpのDNAフラグメントとしてク
ローンすることができる。ATCC53926アルカリ性プロテ
アーゼ転写のターミネーターカセットを、ATCC53926ア
ルカリ性プロテアーゼ−BLAP融合遺伝子の転写に関して
同じ方向へプラスミドpCB11CおよびpCB11内に担う構築
物を、それぞれpCB13CおよびpCB2Nと呼ぶ。染色体のATC
C53926アルカリ性プロテアーゼをコードする遺伝子の発
現を抑制するため、さらに２つの、ATCC53926アルカリ
性プロテアーゼ遺伝子のＣ末端フラグメントを有するバ
チルスBLAP融合遺伝子ベクターをプラスミドpCB11Cおよ
びpCB1N内に、プラスミドpC51を鋳型として用い、PCRに
よって合成された、ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ
遺伝子の608bpのフラグメントと連結させることによっ
て構築してもよい。608bpのDNAフラグメントはpCB11Cお
よびpCB1Nベクター上にあるシングルのKpn I部位に連結
し、608bpのATCC53926のＣ末端フラグメントを、pCB11C
およびpCB1内のATCC53926アルカリ性プロテアーゼ−BLA
P融合遺伝子の転写の方向と同じ方向にを有する新たな
構築をし、それぞれpCB15CおよびpCB4Nと呼ぶ。これら
のプラスミドの制限酵素地図はそれぞれFIG.9および10
に示した。

上に記載し、以下に挙げた６個のATCC53926アルカリ
性プロテアーゼ−BLAP融合遺伝子はバチルスベクター内
へスブクローンを構築してもバチルス・ズブチリスDB10
4内へ形質転換してもよい。ATCC53926アルカリ性プロテ
アーゼ−BLAP融合遺伝子はAva I/Sst I DNAフラグメン
トとしてpBC16およびpUB110誘導体の中へ、ATCC53926ア
ルカリ性プロテアーゼ−BLAP融合遺伝子（pCB1N、pCB11
C、pCB2N、pCB13C、pCB4N、およびpCB15C）を含有する
大腸菌をAva IおよびSst Iで消化させ、そしてこれら
を、Ava I、Sst I、Pst IおよびSal Iで制限されている
バチルスプラスミドpC51およびpH70と連結させてサブク
ローン化してもよい。プラスミドpC51およびpH70はAva
I/Sst Iで切断して、必要な複製起点および抗生物質抵
抗性遺伝子（テトラサイクリン抵抗性をpC51内に、カナ
マイシン抵抗性をpH70内に）を含有する、大きなAva I/
Sst Iベクターフラグメントを得た。Sal IおよびPst I
は、pC51およびpH70上にあるATCC53926アルカリ性プラ
スミド遺伝子の総てを含有するを小さなAva I/Sst Iフ
ラグメントを３つのより小さなDNAフラグメントへ制限
するのに使用できる。これはATCC53926アルカリ性遺伝
子がバチルスベクター内へ再連結する可能性を減らす。

Cla IおよびNco I融合から誘導され、上に記載したよ
うにして構築された、ATCC53926アルカリ性プロテアー
ゼ−BLAP遺伝子融合プラスミド10個の総てはATCC53926
内に実現することができる。６個のCla I融合体から得
られた５個のバチルスプラスミド構築物はATCC53926株
内へ形質転換することができる。これらのバチルスプラ
スミドはpCB55C、pCB56C、pCB58C、pCB75CおよびpCB78C
である（それぞれ、FIG.13、14、15、16、17）。６個の
Nco I融合から得られた５個のバチルスプラスミド構築
物はATCC53926株内へ形質転換することができる。これ
らのバチルスプラスミドはpCB50N、pCB51N、pCB53N、pC
B70NおよびpCB73Nである（それぞれFIG.18、19、20、21
および22）。

大きなプロテアーゼ収量を挙げるためには、pC51誘導
体内へ挿入されたCla I融合構築物（FIG.23）を担うATC
C53926株が好ましい。ATCC53926株内におけるpCB58C（F
IG.15）の構築が最も高いプロテアーゼ収量を得るのに
最も好ましい具体例である。

発酵は、当業者には一般的に知られている複合栄養培
地内で行うことができる。これらの培地は炭素源として
グルコース、シュクロースおよび／またはコーンスター
チを含有してもよい。この培地はまた、窒素源として大
豆粉、綿実粉、カゼインおよびジャガイモ抽出物を含有
してもよい。他の成育調節剤には醸造残渣、コーンステ
ィープリカー（corn steep liquor）および無機リン酸
のような無機物質を含有する。培地には消泡剤もまた含
んでもよい。

ATCC53926製造株内における異なったATCC53926アルカ
リ性プロテアーゼ−BLAP構築物のプロテアーゼ収量の相
対値の比較をFIG.28に示した。発酵工程は選択のための
抗生物質の存在下で0.5％の窒素含有複合製造培地を用
いて行った。ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ−BLAP
構築物のプロテアーゼ収量はATCC53926含有プラスミドp
AM2.3との相対値にて示した。このプラスミドはプラス
ミドpC51 Stu I/Ssl I部位の間に挿入されたNur I/Ssl
I制限フラグメント上に天然のBLAPプロモーターおよび
構造遺伝子を有する。

ATCC53926生産株内の異なったATCC53926アルカリ性プ
ロテアーゼ−BLAP構築物の培養から得られる発酵液に
は、通常他のタンパク質分解酵素が含まれている。しか
しながら、ATCC53926生産株内の異なったATCC53926アル
カリ性プロテアーゼ−BLAP構築物の発酵によって得られ
るこの発酵液中のBLAPプロテアーゼは、この液中の最も
多いタンパク質分解酵素である。これらの、タンパク質
分解酵素類を含有する発酵液はバチルス・レンツスDSM4
5483の培養液からは得られないものである。詳しくは、
ATCC53926生産株内の異なったATCC53926アルカリ性プロ
テアーゼ−BLAP構築物はBLAPプロテアーゼと、ATCC5392
6株によって生産される他のタンパク質分解酵素を少な
くとも１種生産する。好ましくはBLAP酵素はバチルス・
レンツスDSM5483からの、FIG.1に示したおよそアミノ酸
残基112位からおよそアミノ酸残基380位からなるアミノ
酸配列を有するマチュアーなアルカリ性タンパク質分解
酵素であるBLAPと、バチルス・リッシェニフォルミスAT
CC53926からの他のタンパク質分解酵素を少なくとも一
種含有する組成物として得られる。

さまざまなリコンビナントプラスミドを含有するATCC
53926株の培養によって生産されるプロテアーゼは特に
洗浄剤の構成に有用である。これらは、洗浄剤および洗
濯用組成物、特に洗濯用洗浄剤組成物を製作する当業者
には公知である方法に沿って、界面活性剤と共に構成さ
れる。界面活性剤は水の表面の自由エネルギーを減少さ
せるものであり、セッケン、非イオン性界面活性剤、陰
イオン性界面活性剤、および陽イオン性界面活性剤を含
有する。洗濯用洗浄剤の構成の場合には、直鎖アルキル
ベンゼンスルホネート類、エトキシレート化直鎖アルコ
ール類、エトキシレート化アルキルスルフェート類ある
いは硫酸化直鎖アルコール類等のような適当な界面活性
剤と結合させてもよい。この構成にはまた、ビルダー、
蛍光光輝剤、漂白剤および当業者の間で通常使用されて
いる他の成分を配合しても良い。

微生物の寄託 ATCC53926およびATCC番号68032とされたATCC53926内
のプラスミドpCB58Cの生培養物は、特許手続き上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、
アメリカンタイプカルチャーコレクション（（American
typeculture collection）1231 Perklawn Drive,Rockv
ille,MD 2852）に寄託が受理された。バチルス・レンツ
スDSM5483の生培養物はドイツサミュルンフォンマイク
ロオルガニズメン（Deutsche Sammlungvon Mikroorgani
smen（DSM）、Grisebachstr.8,3400 Gttingen,German
y）に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブダペスト条約により寄託が受理された。

以下の実施例は説明のためであり、限定のためではな
い。

実施例１バチルス・レンツスDSM5483ジーンバンクの構築 A.コスミドクローニングベクターpCP13の使用コスミドクローニングベクターpCP13はバチルス・レ
ンツスDSM5483DNAから遺伝子ライブラリーを構築するた
めに選択された。このプラスミドpLAFR1から誘導された
広い宿主域のベクター（Friedmanら、Gene第18巻、第28
9頁（1982年））はDepertment of Molecular Biologyの
F.Ausubel氏（Massachusetts General Hospital,Bosto
n,MA）から得た。プラスミドpCP13は23kbの大きさでテ
トラサイクリン（Tc^R）およびカナマイシン（Km^R）の両
方に抵抗性をコードし、多様でユニークなエンドヌクレ
アーゼ制限部位を有し、可動性であるが自己伝達性では
ない。pCP13のBamH I部位内へのクローニングはKm抵抗
性決定要素を挿入的不活性に導き、組換体をTc^RおよびK
m^Rフェノタイプによる同定が可能となる。このベクター
にはまた、コスミドのコンカテマー形状を市販のパッケ
ージングシステムを使用してラムダファージ粒子内へパ
ックすることのできるラムダコス部位を有す。12から30
kbの大きさの範囲内の挿入物は、pCP13内にクローン化
することができるため、このクローニングベクターをジ
ーンバンクの構築に非常に魅力的なもとなる。精製した
pCB13DNA（20μｇ）はBamH I（３ユニット（Ｕ）／μ
ｇ）で消化し、続いて再環化を防ぐため脱リン酸化を行
った。バチルス・レンツス株DSM5483から得た精製染色
体DNA（410μｇ）はBcl I（0.0625U/μgDAN）で、50
℃、60分間部分的に消化し、その後BamH Iで消化したpC
B13DNAとと連結させた。連結反応混合物には150μg/ml
のpCB13ベクター、および50μg/mlのDSM5483染色体DNA
を最終体積30μｌ中に含有する。連結は14℃で９時間行
った。コンカテマー形のpCB13−バチルス・レンツスゲ
ノムDNAフラグメントを含有する連結混合物は、ラムダ
ファージの頭部にプロモネガ（Promega（Madison,Wisco
nsin））から購入したパックラージン・ラムダDNA（Pac
lagene Lambda DNA）パッケージングシステムを用いて
パッケージした。ファージ粒子内にパッケージされたこ
の組み替えコスミド分子は大腸菌HB101を感染させるの
に使用した。大腸菌HB101は、30℃で一夜、175rpmのロ
ータリーシェーカー内で10mlのトリプトン・ブロス（Tr
yptone Broth）またはTB（１リットルあたり、（１）ト
リプトン10g、NaClを5g、マルトース2gおよびMg₂SO₄を
2.46g、オートクレーブ滅菌）で成育した。細胞をペレ
ットにし、10mMのMg₂SO₄に再懸濁した。パッケージ混合
物および細胞（それぞれ50μｌと100μｌ）を混合し、3
7℃で20分間培養した。その後1mlのルリア・ブロス（Lu
ria Broth）培地（１リットルあたりバクトトリプトン1
0g、NaClを10g、イースト抽出物5g）を加え、そして試
験官を37℃で60分間、ニュー・ブラウンズウィック（Ne
w Brunswick）G24ロータリーシェーカー内で150rpmにて
培養した。感染されたHB101細胞は室温で遠心沈降（130
00×ｇ）を５分間行ってペレットとし、ルリア・ブロス
に再懸濁して15μg/mlのTcを含有するルリア寒天培地上
に撒いた。1400個のTc^RKm^SHB101組み替えクローンが得
られた。平均挿入サイズを決めるため、14個のランダム
に選択したポテンシャルクローンからのプラスミドDNA
を単離し、EcoR Iで消化させ、アガロース寒天電気泳動
により分析した。14クローン中11個が平均挿入サイズ2
5.9kb（21.7から32.7kb）の挿入を含有していた。この
大きな挿入サイズおよびバチルス・レンツスゲノムが大
腸菌とほぼ同じ大きさであるという仮定に基づいて理論
的な計算すると、サビナーゼ様遺伝子が768のコスミド
クローンのスクリーニングによって見いだされる確率が
99％予想される。

B.ファージクローニングベクターEMBL3およびEMBLの使
用大きなゲノムDNA（＞10kb）片のクローニングの他の
方法はバクテリオファージラムダクローニングベクター
を使用する方法である。これらの挿入ベクターは、9kb
と23kbの間のヘテロローガスなDNAを受け入れることが
可能である。このヘテロローガスなDNAおよびこのラム
ダDNAは大腸菌宿主内において活性化されるために、こ
のリコンビナントDNAはファージの頭部にパッケージし
なくてはならない。EMBL3およびEMBL4ファージベクター
はストラタジーン（Stratagene（La Jolla,CA））から
購入した。これらのクローニングベクターは複製に必要
でない内部サファー（suffer）DNAの側面を守るポリリ
ンカー部を有する構成をしている。ラムダDNAが適当な
酵素で制限されたとき、残った２本の、左腕および右腕
と呼ばれるDNAフラグメントは複製に必要であり、ヘテ
ロローガスなDNAに連結することができる。このリコン
ビナントなDNAがファージの頭部に効果的にパッケージ
されるためには、連結はコンカナマーの形成を助けるよ
う、高いDNA濃度のもとで行うべきであり、ヘテロロー
ガスな挿入断片は9kbと23kbの間の大きさでなくてはな
らない。この後者の条件はパッケージされることのでき
るDNAの長さは野生種のラムダゲノムの大きさの70％と1
05％の間であるという観察結果に基づいている。さら
に、両方のEMBLシステムはspi選択（バクテリオファー
ジP2阻害に対する感受性）に有用である。サファー（su
ffer）フラグメントに連結され、ファージの頭部にパッ
ケージされたEMBL腕は、P2を含有する溶原性の宿主株上
にはには成育しない。このシステムにおいて、サファー
フラグメントとEMBL腕が再連結することはほとんどな
い。もし、再連結がおこれば、このファージは適当な大
腸菌宿主上に撒いた時にも複製しないであろう。

DSM5483株のDNAのゲノムライブラリーをEMBL3またはE
MBL4ベクター内に作成するために、DSM5483のDNAはEcoR
IまたはBCl I（BCl Iによる５′付着末端がBamH Iで切
断されたベクターの末端に相補的である）で部分的に消
化した。それぞれの場合において、ゲノムDNAはDNA1マ
イクログラムあたり１ユニット以下の酵素にて60分間消
化した。最高パッケージ効率はコンカナマー形態のラム
ダDNAによって得られた。それゆえ、連結反応は最終DNA
濃度が、コンカナマー形成を助ける200μg/mlとなるよ
うにセットした。標準的な５μｌ連結反応においては、
１μｇのベクター腕を200から400ngのゲノムDNAと混合
する。連結は、室温で１時間おいた後、４℃、一夜の培
養で行った。連結反応から得たコンカナマー型のDNA
は、ストラタジーンから購入したギガパックプラス（Gi
gaPack Plus）イン・ビトロパッケージングエクストラ
クトを用い、このエクストラクトに添付された手法によ
ってファージ頭部内へパッケージした。パッケージ後、
0.5mlのファージ希釈用バッファー（１リットルあた
り、5.0gのNaCl、2gのMgSO₄、50mlの1MトリスHCl（pH7.
5）、5mlの２％ゼラチン）および20μｌのクロロホルム
をこのパッケージ反応物に添加した。このパッケージ反
応の力価を検定し、ストラタジーン（のプロトコールに
沿って増幅した。それぞれのファージライブラリーから
５×10⁵のリコンビナントファージが得られた。市販の
クローニングキットの挿入断片を用いて同様の実験を行
ったとき、３×10⁶のリコンビナントファージが得られ
た。コントロールの挿入断片による５％以下のプラーク
形成は、バックグラウンドとなるファージからのもので
ある。リコンビナントファージはは平均挿入サイズが12
〜14kbであり、およそ70％のファージが実際挿入を示し
た。このファージライブラリーは10⁸ファージ/mlの力価
となるまで増幅し、クロロホルム内にて４℃にて保存し
た。−70℃で保存する長期間保存のために、他のストッ
クを作製した。

EMBLライブラリーを解析し、サビナーゼ様遺伝子を発
見するために、以下のアプローチを行った。プラーク群
をEMBL3あるいはEMBL4のどちらかのライブラリーから単
離し、そのDNAをファージミニプレパレーション法（マ
ニアティス（Maniatisら）、ア・ラボラトリー・マニュ
アル（A Laboratory Manual）コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリーズ（cold Spring Harbor Labor
atories）出版（1982年）（Cold Spring Harbor、New Y
ork）にて単離した。EMBL3およびEMBL4内にある挿入ゲ
ノムDNA断片を、Sal IかEcoR Iのどちらかでそれぞれ消
化し、アガロース寒天電気泳動ののち、DNAフラグメン
トはジーンスクリーンプラス（Gene Screen Plus）へト
ランスファーした。DSM5483のすべてのゲノムDNAがニッ
クトランスレーションされ、EMBLライブラリー中にある
挿入断片が本当にDSM5483のDNAであるかどうかを確かめ
るためのハイブリダイゼーションプローブとして使用し
た。予期したように、クローンした挿入断片は標識を施
したDSM5483のDNAとハイブリダイズした。第２の実験に
おいては、DSM5483のゲノムDNAをEcoR IまたはBcl Iの
どちらかで切断し、アガロースゲル内で電気泳動し、そ
の後ジーンスクリーンにトランスファーした。EMBL3ま
たはEMBL4のどちらかのライブラリーから得られたリコ
ンビナントファージの群から単離されたDSM5483をニッ
クトランスレーションし、ハイブリダイゼーションプロ
ーブとして使用した。予期したごとく、DSM5483ゲノムD
NAに対するハイブリダイゼーションは起こったが一方で
他のバチルス属から得たDNAに対するハイブリダイゼー
ションはほとんどあるいは全く認められなかった、これ
らの結果はバチルス・レンツスDSM5483の染色体DNAのラ
イブラリーがラムダEMBLクローニングベクターを用いて
形成されていることを証明するものである。

実施例２バチルス・レンツスDSM5483株内にあるサビナーゼ様プ
ロテアーゼに特異的なDNAプローブの構築 A.オリゴヌクレオチドプローブ大腸菌内にコスミドpCP13を用いて構築したDSM5483染
色体DSM5483のジーンバンクをオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いてスクリーニングした。バイオサーチ（Bios
earch）DNA合成機を用いて様々な縮重を有する一連のプ
ローブを合成した。これらのオリゴヌクレオチド類の配
列は、サビナーゼプロテアーゼのＮ末端、シアノーゲン
ブロミド切断によって誘導されたサビナーゼのＣ末端か
ら得られたアミノ酸配列データから演繹した。サビナー
ゼプロテアーゼと比較したこれらのプローブの配列およ
びロケーションをFIG.24および25に示した。プローブの
NO2およびNO4シリーズはどちらもＮ末端アミノ酸配列デ
ータからデザインした。NO2シリーズは23塩基の長さ
で、14塩基のホモロジーおよび16倍の縮重を有する一
方、NO4シリーズは17塩基の長さで48倍の縮重を有す
る。NO4のプローブの１〜４シリーズはバチルス・ズブ
チリスに対する最も確率の高いコドン解読を用いてデザ
インした。オリゴヌクレオチドのCO3シリーズはすべて1
7塩基の長さで32倍の縮重を有する。後者のプローブは
サビナーゼのＣ−末端シアノーゲンブロミドフラグメン
トから誘導されたアミノ酸配列からデザインされた。精
製し、放射性活性に標識したこれらのプローブを、制限
され、アガロース寒天上で電気泳動したDSM5483からの
染色体DNAにハイブリダイズして、サザン法を用いてニ
トロセルロース上にブロットした。使用した制限酵素に
はEcoR I、Hind III、Tag I、Sau3A、Sst I、Xba Iおよ
びXho Iを含む。最も強いハイブリダイゼーションのシ
グナルはNO2.2、NO4.4およびCO3.3（FIG.25）のオリゴ
ヌクレオチドで得られた。これら３つの標識したオリゴ
ヌクレオチドは大腸菌HB101、バチルス・ズブチリスDB1
04、バチルス・リッシェニフォルミス、そしてこのバチ
ルス・レンツス株からの制限された染色体DNAのサザン
ブロットスクリーンに使用され、バチルス・レンツス株
由来のDNAフラグメントのみとハイブリダイズすること
が分かった。この結果はこれらの３つのオリゴヌクレオ
チドがサビナーゼ様プロテアーゼをコードするDNAに特
有であることを確認する。

B.アルカリ性プロテアーゼ遺伝子配列部分の増幅上に記載した３つのオリゴヌクレオチドプローブがDS
M5483染色体DNAに特有であったが、サビナーゼ様アルカ
リ性プロテアーゼに特有で、より大きい２本鎖DNAプロ
ーブを単離するために、さらなるアプローチが行われて
いる。上に記載したＮ末端および内部オリゴヌクレオチ
ドは、PCR法の中で、そのＮ末端からマチュアーなアル
カリ性プロテアーゼ（FIG.24）の222アミノ酸残基にま
で伸びている、DSM5483の染色体DNAの領域を増幅するた
めのプライマーとして使用した。サビナーゼのＣ末端シ
アノーゲンブロミドフラグメントから得られたアミノ酸
配列は他のセリンプロテアーゼの活性部位領域とホモロ
ジーを有している。サビナーゼのＮ末端から活性部位領
域の距離が他のセリンプロテアーゼ類と同じであれば、
予想される増幅されたフラグメントのサイズはおよそ65
0bpとなる。

PCR法はパーキン・エルマー・セタス・インスツルメ
ンツ（Perkin−Elmer Cetus Instruments）から購入し
た市販のジーンアンプ（GeneAmp）キットを用いて行っ
た。PCR法において、増幅されるDNA断片の長さは数百bp
から5kb以上の範囲であってよく、プラスミドが染色体D
NA鋳型のどちらかの上に含まれる。増幅には２つの、お
よそ15から25塩基の長さで、DNA断片の両端の対向するD
NA鎖とホモロジーを有するようにデザインされたオリゴ
ヌクレオチドプライマーの合成が必要である。DNAの合
成は５′から３′の方向へ行われるので、各プライマー
は相当する５′から３′の鎖を模倣するようにデザイン
されている。最初の実験において、16の異なったPCR
を、すべての可能なCO3とNO2のプローブシリーズの組み
合わせ、および鋳型としてDSM5483染色体DNAを用いて行
った。鋳型とプライマーの濃度はキットに記載の通りに
した。PCRは鋳型、過剰のプライマー、dNTP's、熱安定
性DNAポリメラーゼおよび反応バッファーをエッペンド
ルフ管内で混合し、設定した時間、94℃、37℃および72
℃のサイクルを循環させた。各サイクルにおいて、２本
鎖DNA鋳型は94℃で加熱することによって変性され、プ
ライマーが一本鎖となった鋳型の上の適当なDNA配列ア
ニーリングできるようにするため、37℃まで冷却され
る。管はその後72℃に移し、相補的なDNA鎖がアニーリ
ングしたプライマーの伸長にそって、熱安定性DNAポリ
メラーゼ（Tagポリメラーゼ）によって合成される。こ
のプロセスを25回繰り返し、増幅されたDNA量は各サイ
クルにつき倍となった。このPCRのひとつ（オリゴヌク
レオチドペアーNO2.2とCO3.3）においては、およそ650b
pの一つのシングルDNAフラグメントを増幅した。およそ
３μｇの650bpがPCRによって作成され、５×10⁴の増幅
を示した。PCR法はすべてのNO4およびCO3シリーズのプ
ローブの組み合わせで行った。さきの結果に基づいて、
NO4.2とCO3.3の組み合わせが増幅した650bpフラグメン
トを製造すると予期されたが、実際そうであった。

実施例３バチルス・レンツス由来のサビナーゼ様アルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子を担うコスミドクローンの同定サビナーゼ様遺伝子をスクリーニングするため、1400
のTc^RKm^SHB101クローンを、各100〜150クローンからな
る13のプールに分けた。各プールからおよびすべてのジ
ーンバンクを含有する培養物からのプラスミドDNAを精
製し、EcoR Iで消化した。制限フラグメントはアガロー
スゲル電気泳動によって分離し、ジーンスクリーンプラ
ス（Gene Screen Plus）ハイブリダイゼーション膜（Du
pont社製（Wilmington,Delaware））へ、この製品の方
法によりトランスファーした。このコスミドバンク内の
サビナーゼ様遺伝子の検出のため、オリゴヌクレオチド
プローブを合成した。プローブの予想配列は、さきに得
られたサビナーゼプロテアーゼのアミノ酸配列のデータ
に基づいている。これらのプローブはまた、BLAP遺伝子
の650bp部分のPCR法を用いた合成（上に記載した）のプ
ライマーとしても使用した。650bpのPCRフラグメントは
ニックトランスレーション反応において³²Pで標識し
（このプロトコールはエヌイーエヌ（NEN（Washington,
Delaware））から得た）、ハイブリダイゼーションプロ
ーブとして用いた。このフラグメントは内部にEcoR I部
位を有することが示されている。それゆえ、完全なバチ
ルス・レンツスサビナーゼ様プロテアーゼ遺伝子がEcoR
Iで消化されたコスミドプール内にある時には、ハイブ
リダイゼーションの２本のバンドが現れるであろう。DS
M5483のDNA全体のジーンバンクから単離されたコスミド
DNAがEcoR Iで消化されたとき、6.35kbと2.64kbの２本
のフラグメントが標識した650bpPCRプローブとハイブリ
ダイズするのが認められた。６個のリコンビナントコス
ミドプール（＃３、＃４、＃８、＃11、＃12および＃1
3）において、同様のハイブリダイゼーションのバンド
が認められ、サビナーゼ様遺伝子は６つのそれぞれのプ
ール中に含有される、少なくとも一つのコスミドクロー
ンに存在することを示した。150個の大腸菌形質転換体
を有するプール＃13をそれぞれ12または13個の形質転換
体を有する12のサブプールへさらに分配した。各サブプ
ールからのプラスミドDNAを単離し、EcoR Iで消化し、D
NAフラグメントをゲル電気泳動にて分離した。ジーンス
クリーンプラス膜へトランスファーした後、このフィル
ターは標識した650bpのPCRフラグメントとハイブリダイ
ズした。２個のサブプール（＃７と＃９）が、最初にプ
ール＃13で認められたものと同じハイブリダイゼーショ
ンバンドを含有することが認められた。サブプール＃７
と＃９内の各形質転換体からプラスミドDNAが単離さ
れ、このプラスミドDNAはEcoR IまたはHind IIIのどち
らかで別々に消化した。アガロースゲル電気泳動および
ジーンスクリーンプラスへのトランスファーののち、ハ
イブリダイゼーション操作を繰り返した。サブプール＃
９のクローン＃５からのコスミドDNAは、同じハイブリ
ダイゼーションのパターンを示し、サビナーゼ様プロテ
アーゼ遺伝子を含有するクローンであると考えられる。
クローン＃５からのコスミドDNAおよびD5483染色体DNA
をHind IIIで消化し、650bpPCRフラグメントとプローブ
したときに、両方に同じハイブリダイゼーションのバン
ドが検出された。3.4kbのフラグメントサイズは、既知
の標準分子量に対するハイブリダイゼーションの位置か
ら計算した。サブプール＃９のクローン＃５からのコス
ミドをpHSH44と名付けた。

大スケールのコスミドpHSH44の試料はCsC1−エチジウ
ムブロミド勾配遠心分離によって製造し、透析した後に
Hind IIIで制限した。Hind IIIフラグメントサイズはア
ガロースゲル電気泳動によって分離し、650bpPCRフラグ
メントとハイブリダイズした3.4kbのHind IIIフラグメ
トを精製し、通常制限酵素分析に使用されている大腸菌
ベクターであるpU19およびpBR322内へサブクローン化
し、さらにバチルスベクター内へもサブクローン化し
た。

実施例４バチルス・レンツスアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の遺
伝的解析 A.バチルス・レンツアルカリ性プロテアーゼ遺伝的を担
う制限フラグメントのサブクローニングと解析精製した後、650bpのフラグメントはニックトランス
フォーメーションによって標識し、コスミドpCP13とEMB
Lラムダベクターを用いて構築したDSM5483DNAのジーン
バンクをプローブするのに用いた。両方の場合におい
て、非常に厳密なハイブリダイゼーション条件を用いて
陽性クローンを単離した。ハイブリダイゼーションデー
タから、650bpのPCRフラグメントとホモロジーを有する
DNA部と選択的オリゴヌクレオチドプローブを有するコ
スミドクローンを幾つか同定した。これらのコスミドの
うちのひとつのプラスミドDNAであるpHSH44を精製し、
制限酵素分析によって解析した。サザンブロットの結果
から、およそ３から5kbのDSM5483のHind IIIフラグメン
トが650bpのPCRフラグメントから調製された放射性活性
プローブにハイブリダイズした。コスミドpHSH44には、
3.4kb、4.0kbおよび4.8kbの３つのHind III制限フラグ
メントがある。最初、これらのフラグメントの全てをア
ガロースゲル電気泳動によって精製し、pUC19とpBR322
の両方へクローン化した。全ての場合、連結反応には10
0ngの脱リン酸化ベクターDNAと、20μｌの体積にしたお
よそ1000ngの相当するHind IIIフラグメントを含有す
る。これらの連結混合物は大腸菌DH5∝（pUC19）または
大腸菌HB101（pBR322）のどちらかのコンピテントセル
内へ形質転換した。アピシリン耐性形質転換細胞を選択
し、プラスミド構築を確かめるためにスクリーニングし
た。全てのHind IIIフラグメントを両方のベクター内へ
クローンニングした。pUC19およびpBR322内の正しい構
築物をそれぞれpMG102.2およびpMG105.9と名付けた。ハ
イブリダイゼーションと制限酵素分析の結果から、3.4k
bのHind IIIフラグメント（プラスミドpMG102.2及びpMG
105.9にある）を650bpのPCRフラグメントとホモロジー
を有するものとして同定した。プラスミドpMG102.2は精
製し、26個の異なった酵素での制限酵素分析を行い解析
した。この3.4kbのHind IIIフラグメントの完全なヌク
レオチド配列を得るためには、pTZ配列決定ベクター内
へこれらのフラグメントの部分をサブクローン化する必
要がある。全てのサブクローンは、低融点のアガロース
からゲル電気泳動の後に精製したpMG102.2のDNAフラグ
メントを用いて作成した。摘出したDNAフラグメントは
適当な部位で制限されているベクターDNAと連結させ、
その後大腸菌DH5∝細胞内へ形質転換した。アンピシリ
ン耐性後形質転換細胞を選択し、制限酵素分析によって
同定されるクローンを確かめた。確かめた構造からのプ
ラスミドDNAをDH5∝株から精製し、DNAシークエンシン
グに必要な一本鎖の鋳型を得るために大腸菌NM522内へ
トランスフォームした。

B.バチルス・レンツスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子
を含有する3.4kbのHind IIIフラグメントの配列決定 650bpのPCRフラグメントもまた大腸菌プラスミドpUC1
9内へクローン化した。PCRフラグメントは、さきにSma
Iで消化したpCU19と平滑末端連結させ、ベテスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labs（BR
L））から購入した大腸菌DH5∝内に、BRLによる方によ
り形質転換した。形質転換細胞は50μg/mlのアンピシリ
ンを含有するＸ−galプレートにて選択した（MAniatis
ら、ibid）。650bpのフラグメントのSma I部位へのクロ
ーニングはlacZの相補性を分解し、そのためＸ−galプ
レート上に白いコロニーが形成されることが予想され
る。Ｘ−galプレート上の1000個のコロニーのうちおよ
そ200が白かった。この200の形質転換体のうち12個から
プラスミドDNAを調製し、650bpのフラグメントの存在を
調べた。12のうちの７個がpUC19の同じ方向に組み込ま
れたPCRフラグメントを有した。このプラスミドをpMG10
0.13と名付けた。DNAの配列決定のため、この650bpのフ
ラグメントをpMG100.13からBamH IおよびKpn Iの二重消
化によって除いた。これらの酵素の認識部位はpUC19由
来のポリリンカー配列注には含まれるがこの650bpのPCR
フラグメントにはない。このBamH I/Kpn I PCRフラグメ
ントを、同じ酵素で消化した市販のシークエンシング用
ベクターpTZ18RおよびpTZ19R（Pharmacia）と連結し、
大腸菌内へ形質転換した。正しい構築物を有する形質転
換体を、プラスミドDNAの単離と制限酵素分析によって
同定した。２つの新しい構築物がpTZベクター上にある
シークエンシングプライマー部位に関して両方の方向に
PCRフラグメントを示した。DNA配列決定はジデオキシ法
および市販のＭ−13からのシークエンシング用プライマ
ーを用いて行った。シークエンシングの初期データは各
鎖に対して約220塩基からなり、両端から始まり650bpの
PCRフラグメントの内部へ伸びている。初期配列から以
下のことが確認できる:PCRフラグメントがpUC19のSma I
部位へ平滑末端フラグメントとして組み込まれているこ
と;pTZ18クローン内のSma I部位にすぐ続くDNA配列はNO
2.2プライマーで構成されていること;pTZ19クローン内
（pTZ18の反対方向）のSma I部位にすぐ続く18bpのDNA
配列はCO3.3プライマーと一致すること；そしてNO2.2お
よびCO3.3の両方のプライマー領域内および領域該のDNA
配列から演繹されるアミノ酸配列はサビナーゼから決定
されたＮ末端および内部アミノ酸配列と一致すること。
上に述べた結果に基づいて、バチルス・レンツスDSM548
3株のDNAから増幅された650bpのPCRフラグメントはこの
マチュアーなプロテアーゼのＮ末端のすぐ後から開始
し、タンパク質コード領域にまで続いているアルカリ性
プロテアーゼをコードする遺伝子部位を有していると結
論付けられる。この650bpのPCRフラグメントの配列決定
を完成するため、２つのアプローチを行った。第１に65
0bpのPCRフラグメントを有するpTZ19Rベクターを、この
PCRフラグメントを除去するためにEcoR Iで消化し、再
連結して大腸菌内へ形質転換した。このPCRフラグメン
トの予備的な制限酵素分析により、内部にEcoR I部位を
有し、第２のEcoR I部位がこのベクター内のポリリンカ
ー部位にあることが明らかになっている。この実験によ
って単離された正しいサブクローンはDNAシークエンシ
ングのプライミング部位に隣接してEcoR I部位を含有し
ているため、このPCRフラグメントのさらなるDNA配列の
決定が可能である。同時にpTZ19RのPCR構築物から単離
された小さなEcoR IフラグメントをpTZ18Rの反対の方向
に組み込み、EcoR I部位から反対側のDNA配列の決定が
可能となった。

C.バチルス・レンツス5483株のアルカリ性プロテアーゼ
遺伝子の転写開始部位の決定クローンしたBLAP遺伝子の遺伝子操作のうえで必要な
ステップは転写の開始部位の決定である。プライマー伸
長プロトコール（アーノスティーとチャムバー（Arnost
iとChamberlain）、ピーエヌエーエス（PNAS（米国））
第86巻第830頁（1989年））をこの部位を決定するため
に用いた。この方法においては、プライマー（長さ20か
ら30塩基）を、予想される転写開始の200から300bp3′
に位置する鋳型DNAとホモロジーを有するように合成す
る。このプライマーをメッセンジャーRNAとハイブリダ
イズし、厳密な条件下で転写し、その後このプライマー
を逆転写酵素を使用して伸長した。逆転写体の大きさは
変性ポリアクリルアミドゲル内で測定した。伸長したプ
ライマーはまた、転写開始塩基がシークエンシングゲル
から正確に読み取れるよう配列決定を行った。DSM5483
またはバチルス・ズブチリスDB104株含有プラスミドpJW
5のトータルのRNAをアーノスティーとチャムバー（ibi
d）による方法で単離した。プラスミドpJW5は3.4kbのBL
APのHind IIIフラグメントをプラスミドpC194のHind II
I部位にクローニングして作成した。ライソザイム処理
に続いて超音波処理にを粉砕したバチルス細胞に施し
た。ヌクレアーゼ類の混入からRNAを精製するために、
少なくとも４から５回のフェノール抽出を行った。BLAP
遺伝子転写の大きさは、トーマス（Thomas）著メソッド
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）
第100巻、第255頁）のノーザン分析で決定した。この実
験においてトータルのバチルスRNAを変性し、その後変
性濃度のホルムアルデヒドを含有するアガロースゲルに
よる電気泳動で分析した（BRL Focus、第９巻第３、14
頁）。このRNAはその後ゲルからニトロセルロースフィ
ルターへトランスファーし、これをその後60℃で２時間
焼いた。プラスミドpMG109.3（pUC19＋3.4kbのBLAP遺伝
子を含有するHind IIIフラグメント）をニックトランス
レートし、ノーザンブロットのプローブとした。BLAP遺
伝子による転写は、およそ1200から1400塩基の長さであ
った。BLAPヌクレオチド配列にもとづいて、２つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーをデザインした。これらのプ
ライマーはBLAPとNco IおよびHpa I部位の間の配列、お
よび５′からマチュアーなプロテアーゼタンパク質をコ
ードするまでの配列とホモロガスである。プライマーＡ
はFIG.2に含有されるBLAPヌクレオチドの2056〜2033塩
基の間にまたがり、プライマーＢは2242〜2222塩基の間
にある。両方のプライマーおよびバチルス・レンツスDS
M4583またはpJW5プラスミドを担うバチルス・ズブチリ
スDB104から調製したメッセンジャーRNAを用いたプライ
マー延伸実験の結果も同じであった。両方の場合におい
て、転写の出発部位はBLAP配列内の1924位にあるアデニ
ン慙愧であると決定される。このアデニンは、BLAPシグ
ナルペプチドの最初にあるATG翻訳開始コドンから42bp
さかのぼったところに位置する。この結果に基づく、BL
APのメッセージの長さは1210塩基である。

実施例５バチルス・リッシェニフォルミスATCC53926アルカリ性
プロテアーゼ遺伝子とバチルス・レンツスアルカリ性プ
ロテアーゼ遺伝子（BLAP）との融合体の構築 A.アプローチ BLAPを大量生産するため、ATCC53926アルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子の断片とBLAP遺伝子の断片とを含有する
遺伝子の融合に基づいて発現システムをデザインした。
BLAP遺伝子の本来のプロモーターは、バチルス・ズブチ
リスDB104内において、DSM4583内におけるのと同様、効
果的にBLAPを生産するのには不十分なプローブであっ
た。ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のプロモ
ーターはATCC53926内のカールスベルグタイプ（Carlsbe
rg−Type）のプロテアーゼの大量生産に有用であること
が発酵の結果から知られている。よって、ATCC53926ア
ルカリ性プロテアーゼ遺伝子プロモーターの、BLAP構造
遺伝子への融合は市販のATCC53926内のセリンプロテア
ーゼと同じプロテアーゼの効果的な発現システムとなる
可能性がある。ATCC53926及びBLAPのようなアルカリ性
プロテアーゼをコードする遺伝子は典型的にはその酵素
のプレ−プロ形態をコードする。これらのすべては、プ
ロモーター、リボソーム−結合部位、および効果的な転
写および相応する遺伝子の翻訳を司る開始コドンを含有
する調節領域からはじまっている。この調節領域に続い
てシグナルペプチドをコードするDNA配列が続く。細胞
外プロテアーゼの分泌に必要なシグナル配列に続いて、
プロ−ペプチドとマチュアーなプロテアーゼのコード領
域がある。プロモーター以下のDNA配列の転写ののち、
メッセンジャーRNA（mRNA）は最終的な遺伝子へと翻訳
される。プレ−プロ−マチュアープロテアーゼは、シグ
ナルペプチド、プロペプチドおよびマチュアーなプロテ
アーゼで構成される。シグナル配列はインマチュアーな
プロテアーゼを細胞質膜を通して支配しており、そこで
シグナルペプチドはシグナルペプチダーゼによって酵素
的に切断される。プロ配列は、プロ−プロテアーゼの、
細胞質膜と細胞壁を通りぬける移動の間および後におい
て、正しい折り畳みとプロセシングに重要であるように
である。BLAPとATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝
子の間のアミノ酸配列を比較するとプレ領域においては
49％のホモロジー、プロ領域では38％のホモロジーそし
てマチュアー領域においては75％のホモロジーが認めら
れた。正常な分泌とプロテアーゼの成熟に必要な、プレ
およびプロ領域の相互作用が完全にはわからないので、
ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の断片とBLAP
遺伝子の断片の２つの異なった融合体を構築した。この
２つの基本的な融合体はATCC53926とBLAPの遺伝子の異
なった断片を接続するのに使用した制限酵素部位によっ
て同定した。

1.Cla I融合 ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ−BLAP Cla I遺伝
子融合体を作成するため、ATCC53926アルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子の376位、ATCC53926のプレとプロ配列の接
合点の隣（FIG.27、27A）に特別にClA I制限部位を導入
しなければならない。BLAP遺伝子は2032塩基対の位置に
すでに固有のCla I部位を相当する位置に有している。C
la I部位はPCR法を用いてATCC53926アルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子内に誘導した。上に記載したプラスミドpGM1
5をdam⁺大腸菌株であるNM522から単離し、Ava I、Cla I
およびMlu Iで制限し、4330bp、1296bp、382、147bpの
４本のDNAフラグメントを得た。BLAP配列（FIG.2）の12
06および2032位にあるCla I部位は、重なっているGATC
配列のdam−メチル化により制限されなかった。Mlu Iに
よる制限を1825bpのAva I/Cla Iフラグメントから３本
のDNAフラグメントを作り、これらのフラグメントが433
0bpのAva I/Cla Iフラグメントと再連結あるいは再クロ
ーニングしないために行った。pGM15からAva I/Cla I/M
lu Iで消化して得たDNAのフラグメントを、PCR法を使用
して合成した、ATCC53926アルカリ性プロテアーゼのプ
ロモーターおよびプレ配列を含有するDNAフラグメント
と連結させた。この292bpのフラグメントは５′と３′
の端がAva IおよびCla I制限部位であり、プラスミドpC
51を鋳型として使用し、＃１および＃３プライマー（FI
G.8）と共に合成される。PCRフラグメントは、ATCC5392
6アルカリ性プロテアーゼプロモーターおよびほとんど
のATCC53926プレ配列（第84位の塩基対にあるAva I部位
から新たに作成した376位の塩基対にあるCla I部位ま
で）を含有する、ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ遺
伝子のＮ末端部の情報を持つ配列を含有する。上記連結
体を大腸菌NM522内へ形質転換し、アンピシリン抵抗性
の形質転換体を選択した。プラスミドDNAを作成し、制
限酵素分析に供した。正しい構築物を同定し、pCB10C
（FIG.12）を名付けた。プラスミドpCB10CはATCC53926
アルカリ性プロテアーゼプロモーター、およびBLAPの29
41位に固有のCla I部位以下の配列と融合したATCC53926
のプレ配列のほとんどを含有する。プラスミドpCB10C
は、Cla Iで切断し、BLAP配列の2032位と2941位のCla I
部位の間の配列を含有するBLAP遺伝子からの909bpのCla
Iフラグメントを挿入して、最終的なCla I−融合遺伝
子を形成するのに使用した。この909bpのCla Iフラグメ
ントはプラスミドpMG108.28（FIG.26）をCla Iで加水分
解して得た。プラスミドpMG108.2は大腸菌GM33（dam^-）
から、テトラヌクレオチドGATC認識部位におけるアデニ
ン残基のdamメチル化を防ぐために単離した。909bpのDN
Aフラグメントは分離用アガロースゲルから単離し、さ
きにCla Iで制限した。細菌性アルカリ性フォスファタ
ーゼで脱リン酸化したプラスミドpCB10C内へ連結した。
連結混合物を大腸菌NM522内へ形質転換した。アンピシ
リン抵抗性の形質転換体をスクリーニングし、正しい構
築体（pCB10C）を同定した。pCB10Cの制限酵素地図をFI
G.4に、この構築の概略図をFIG.12に示した。プラスミ
ドpCB10C内にあるATCC53926とBLAP遺伝子の融合体のDNA
配列の分析から、予期したDNAとアミノ酸配列が確認で
きた。

2.Nco I融合 ATCC53926−BLAPのNco I遺伝子融合体を構築するた
め、ATCC53926のプロ配列とマチュアー配列（FIG.7およ
び7A）の接合点の近くの、ATCC53926アルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子の638位に特別にNco I制限部位を導入しな
くてはならない。BLAP遺伝子は固有のNco I部位を2311
位に有する。Nco IはATCC53926配列内にPCRを用いて導
入した。554bpのPCR用DNAフラグメントをpC51プラスミ
ドを鋳型として、オリゴヌクレオチド＃１および＃２
（FIG.8）をプライマーとして用いて合成した。このプ
ライマーのデザインは、フラグメントの５′と３′末端
のAva IおよびNco I部位にそれぞれ導入された。554bp
のフラグメントはATCC53926アルカリ性プロテアーゼプ
ロモーター、プレおよびプロ配列、そしてマチュアーな
ATCC53926プロテアーゼ遺伝子の最初の４個のアミノ酸
の配列情報を有する。Ava I/Nco Iによる制限の後、PCR
フラグメントを、プラスミドpGM15から得た4958bpのAva
I/Nco I DNAフラグメントへ連結させた。プラスミドpG
M15（FIG.3）をAva I、Nco IおよびMul Iで制限し、495
8bp、668bp、382bp、および147bpの４本のDNAフラグメ
ントを得た。Mul Iは1197bpのAva I/Nco Iフラグメント
を、このフラグメントが4958bpのAva I/Nco Iフラグメ
ントと再連結することを防止するため、３本のフラグメ
ントにするために使用した。連結混合物は大腸菌NM522
内へ形質転換した。アンピシリン抵抗性の形質転換体を
選出し、正確な構築体（pCB1N）を同定した。プラスミ
ドpCB1NのNco I部位にかかるDNA配列の分析により、予
期したDNAおよびアミノ酸配列を確かめた。Nco I融合ア
ルカリ性プロテアーゼ遺伝子は全てのプロモーター、AT
CC53926のプレ−およびプロ配列、そして３位のアミノ
酸残基のスレオニンがセリンに変わっているシングルア
ミノ酸置換があるマチュアーなBLAPの全ての配列を含
む。

実施例６バチルス・リッシェニフォルミスATCC53926−BLAP融合
遺伝子のバチルスベクター内へのサブクローニングおよ
びATCC53926製造株内への形質転換 ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ−バチルス融合遺
伝子を大腸菌内へ上に述べたようにして組み込んだ後、
バチルスベクター内へサブクローニングし、バチルス・
ズブチリスDB104内へ形質転換した。ATCC53926アルカリ
性プロテアーゼ−BLAP融合遺伝子はAva I/Sst I DNAフ
ラグメントとしてpBC16とpLB110誘導体内へ、ATCC53926
アルカリ性プロテアーゼ−BLAP誘導体遺伝子（pCB1N、p
CB11C、pCB2N、pCB13C、pCB4NおよびpCB15C）をAva Iと
Sst Iで制限し、これらを、Ava I、Sst I、Pst Iおよび
Sal Iで先に消化したバチルスプラスミドpC51およびpH7
0と連結することによって、サブクローニングを行っ
た。プラスミドpC51およびpH70はAva I/Sst Iで切断し
て、複製に必要なオリジンと選択のための抗生物質抵抗
性の遺伝子（pC51にはテトラサイクリン抵抗性、pH70に
はカナマイシン抵抗性）を含有する大きなAva I/Sst I
フラグメントを得た。Sal IおよびPst Iによるによる制
限は、pC51およびpH70にある、すべてのATCC53926アル
カリ性プロテアーゼ遺伝子を含有する、小さなAva I/Ss
t Iフラグメントをより小さな３本のDNAフラグメントに
加水分解するために行った。これは、ATCC53926あるプ
ロテアーゼ遺伝子がバチルスベクター内に再連結する可
能性を減少させる。バチルス内への最初のクローニング
実験はバチルス・ズブチリスDB104をレシピエントとし
て用いて行った。DB104はプロテアーゼの少ない株であ
るため、BLAP遺伝子の存在および発現を直接スクリーニ
ングすることができる。pH70およびpC51を大腸菌、上記
ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ−BLAP融合プラスミ
ドそれぞれからのAva I/Sst Iフラグメントのレシピエ
ントとして使用すると、12の活性なバチルスプラスミド
構築物が作製できた。FIG.23には大腸菌プラスミドpCB1
1C、pCB13CおよびpCB15Cに存在する３つのCla I融合体
から由来する６個のATCC53926−BLAPプラスミドを示し
た。このATCC53926生産株に形質転換可能なプラスミ
ド、pCB55C、pCB56C、pCB58C、pCB75C、およびpCB78Cプ
ラスミドの詳細な制限酵素地図は、それぞれFIG.13、1
4、15、16、17に示した。これら５つ全ての構築物をバ
チルス・ズブチリスDB104内およびATCC53926生産株内へ
形質転換した。同様にして、ATCC53926アルカリ性プロ
テアーゼ−BLAPのNco I融合体をpCB1N、pCB2NおよびpCB
4NからpC51とpH70内へクローニングした。このクローニ
ングから得られた６個のプラスミドのうちの５個（pCB5
0N、pCB51N、pCB53N、pCB70NおよびpCB73N）を、バチル
ス・ズブチリスDB104とATCC53926生産株内へ形質転換し
た。これらの構築物の制限酵素地図をそれぞれFIG.18、
19、20、21、及び22に示した。

実施例７バチルス・レンツスアルカリ性プロテアーゼ（BLAP）
を、ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ−BLAP株のフラ
スコ振とう培養によって製造するプロトコール異なったATCC53926アルカリ性プロテアーゼ−BLAPプ
ラスミドを担うバチルス・リッシェニフォルミスATCC53
926の誘導体を比較するために、３段階フラスコ振とう
方法を用いた。これらの実験のうち、抗生物質テトラサ
イクリンまたはカナマイシンを常に、希望するプラスミ
ドを選択するために培地中（以下に示す）へ添加した。
最初の前培養フラスコには、凍結保存バイアスを室温で
溶かしたものから接種した。39℃、200rpmで７時間培養
後、1.0％（v/v）のこの培養物を新たな（第２）前培養
用フラスコへ移し、培養を続けた。13時間から15時間の
間に、この培養物を主培養フラスコへ１％ずつ移したも
のを２本作成した。プロテアーゼ活性の測定用の培養標
本を27時間から50時間の間に主培養フラスコから過ヨウ
素酸化して得た。微生物が吸収することのできる炭素お
よび窒素源を、その他の有機物質と無機塩類と同様に含
有する混合培地を使用してフラスコ振とう実験を行っ
た。主成分には、加水分解したコーンスターチ、ナトリ
ウムカゼイネート、ダイズ粉、醸造残渣およびコーンス
ティープリカーを含有する。少量の消泡剤および無機塩
類、ビタミンB1およびビタミンB6もまた含有している。
調節したエーレンマイヤーフラスコに分配した後、培地
を15psiのもと、121℃に加熱して滅菌した。

実施例８ BLAPを生産するATCC53926誘導体の小規模発酵のプロト
コール発酵は２段階で行い、有機体は最初に内在プラスミド
DNAを選択するための抗生物質を含む混合培地を入れた
振とうフラスコ内で成育させた。高い細胞濃度となった
後、フラスコ培養物の一部をさらに成育させ、プロテア
ーゼを産生させるために主発酵槽へ移した。槽はバチル
ス・ブラウン・インコーポレイテッド製のバイオスタッ
ト（Biostat）ＥまたはESを使用した。全ての発酵は10
リットル以下の分量で、BL1（生物学的安全性レベル
１）封じ込めの予防措置をとり、ナショナルインスティ
テュートオブヘルスの組み替えDNA分子の研究に関する
ガイドライン（NIH Guidelines、1986年５月７日）に特
定されている、グッドラボラトリープラクティスに則っ
て行った。

振とうフラスコ法と発酵用の培地は、吸収し得る炭素
源、吸収し得る窒素源、有機栄養素および無機塩類を含
有する大変に類似した複合培地であり、微生物の活発な
成育をプロテアーゼの生産同様可能にする。培地の主成
分には脱イオン水、醸造残渣およびコーンスティープリ
カーを含む。微量添加物は（NH₄）₂HPO₄およびNa₂HPO₄
である。市販の消泡剤も発酵培地に含有する。この培地
は15psiにて121℃に加熱して滅菌した。ここに記載した
培地はフラスコ内に２リットル調節し、培養−グリセロ
ール凍結保存物（保存の章を参照のこと）を室温で溶か
したものから1.0ml接種した。テトラサイクリンかカナ
マイシンのどちらかの抗生物質を振とうフラスコ培養に
希望のプラスミドを担っている細胞を選択するために添
加した。振とうフラスコは39℃でゆっくり振とうさせな
がら培養物を成育させた。その後に、発酵用培地に、1.
5％（v/v）のフラスコ振とう培養物を接種した。抗生物
質は発酵用培地にも添加しておいた。撹拌速度および気
流はそれぞれ1300rpmと1vvm（リットル／分）に保っ
た。幾つかの実施例においては、この撹拌および気流速
度を、対数増殖期のしばらくの間、酸素分圧（pO₂）を
培養槽内で20％以上に保つために増加させねばならな
い。

生産株の培養の間、培養pHおよび温度は特定の時間に
変化させた。特に、培養pHの調節がプロテアーゼの産生
において重要であることが分かった。培養pHは、０〜1
3.5時間の間は6.8に調節し、その後18から35時間の間は
7.5に調節した。KOHとH₂SO₄の滅菌溶液を培地に添加し
てpHを調節した。発酵の開始は、培養温度を39℃にし
た。14.5時間の培養後この温度を34℃に下げた。

実施例９バチルス・レンツスアルカリ性プロテアーゼのアッセイフラスコ振とうまたは発酵からの試料のアッセイのた
め、プロテアーゼを細胞および培地の残骸から遠心分離
によって分離した。これらの粗試料内のプロテアーゼ量
を以下に記載したようにして計測した。

カゼインのプロテアーゼ消化物からの酸溶解性フラグ
メントの遊離の不連続アッセイに基づいたHPE（Henkel
Protease Einheit）法を用いた。およそ50μｌのプロテ
アーゼ溶液を、pH8.5のトリポリホスフェート−トリス
緩衝液内でハンマーステン（Hammarsten）カゼインを加
熱して得たカゼイン溶液と結合させた。2.2mlのエッペ
ンドルフ管内で50℃にて15分の培養をした後、660μｌ
の0.44Mトリクロロ酢酸溶液を加えた。混合物は遠心分
離により沈殿を分離する前に、氷上で15分間冷却した。
酸−溶解性ペプチドは290nmの分光光度計で測定した。H
PEユニットは290nmにおける吸光度が0.500OD変化する値
と決めた。EPE（エステロリティック・プロテアーゼ・
アインハイト（esterolytic Protease Einheit））法
は、ATCC53926生産株からの活性の最初の探索に有用で
ある。速度論的（kinetic）アッセイは、100μｌの試料
または既知の市販のプロテアーゼ（マクサターゼ（Maxa
tase）;Novo A/S）を、CBZ−バリン−ｐ−ニトロフェニ
ルエステルを含有するアセトンバッファー内へ混合する
ことで開始した。ｐ−ニトロフェノールがこのCBZエス
テルのエステル分解によって遊離する速度を分光光度計
にてA₃₄₀で測定し、直線回帰分析によって決定した。試
料のEPE活性ユニットはマクサターゼ標品と試料の反応
速度の比較から決定した。

実施例10 BLAPとバチルス・リッシェニフォルミスATCC53926プロ
テアーゼのゲル電気泳動法による分離 ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ−BLAP融合株によ
り生産されるバチルス・レンツスアルカリ性プロテアー
ゼは、ATCC53926に固有の細胞外タンパク質分解酵素
と、ホモジーニアスな非−変性（「ネイティブnativ
e」）12.5％ポリアクリルアミド（PA）ゲルでpH6.0バッ
ファーを用いて電気泳動法で分離した。発酵液の遠心分
離によって得た粗精製試料を、この方法によってファス
ト・システム（Phast System）装置（ファルマシア（Ph
armacia,Inc.））上に再度溶解した。タンパク質の種類
はPAゲルをクーマッシ・ブルー（Coomassi Blue）で染
色することによって可視化した。

実施例11 バチルス・リッシェニフォルミスATCC53926の調製バチルス・リッシェニフォルミスDSM641株を含有する
寒天傾斜培地から細胞物質をループにて取り、5mlの培
地Ａ（培地A:ネーブイリオン（Ｎhrbouillion）（Mer
ck）製品の指示どおりに調製した）に懸濁した。バイブ
ロックナイ（Vibroxnai）による強い撹拌の後、この懸
濁液を30℃でサーキュラーシェーカー（150rpm、振幅2.
5cm;24時間）で撹拌した。24時間後、1mlの懸濁液（640
nmにおける光学的密度（OD）＝１）を、500mlのエーレ
ンマイヤー振とうフラスコ内の100mlの培地Ａ内でさら
に24時間培養した。その後、6500rpmにて遠心分離を行
った。遠心分離物は等張性のNaCl溶液で２度リンスし、
細胞数がおよそ10⁹/mlとなるよう、十分な塩水内へ移し
た。

およそ8mlのこの懸濁液を直径9cm、U.V.ランプ（Schu
tt/Gttingen）から27cmの距離にあるのペトリ皿へ移
し、100rpmで撹拌しながらU.V.照射（５〜60分間）を行
った。細胞が沈殿しないように撹拌は照射の間続けた。
先に決めた、好ましくは６分間の照射時間の終了後、希
釈系を作成し、これらの希釈物を、培地Ａの抗生物質を
含有する、含有しない寒天プレート上へ撒いた。突然変
異誘発操作の前および後、抗生物質含有および含有しな
い培地のCFU（コロニーフォーミングユニット）の値か
ら、突然変異形成の指標となる復帰率（reversion rat
e）ばかりでなく死滅速度もわかる。DSM641の場合にお
いては、死滅率は＞95％であり、特に望ましいと考えら
れる。

レプリカプレート方を用いてコロニーをCa−カゼイネ
ート寒天へ移した。このプレートを39℃で72時間培養し
た。その24、48、及び72時間目にコロニーの回りの阻止
円を測定した。コロニーと阻止円を測定した後、コロニ
ーの直径と比べて大きな溶菌部を示したコロニーを選ん
だ。これらのコロニーの個々の培養物を標準的な微生物
的手法（コッホ（Koch）の寒天プレート法、リンドラー
（Lindner）のドロップ法、マルチプルストレーク法（m
ultiple streak procedure））により作成した。フラス
コ振とう実験は、これらの単離物をプロテアーゼ生産性
を測定するために行った。

実施例12 DSM641およびATCC53926により生産されるプロテアーゼ
の比較これらの株を500mlのエーレンマイヤーフラスコ内
で、50mlの培地Ｂ（表３のフットノートと１参照）とと
もに振とうフラスコ法で39℃、150rpm（振幅5cm）で96
時間培養した。プロテアーゼ活性は24時間毎に測定し
た。プロテアーゼの相対的な生産を表３にまとめた。

1.培地B: g/ KH₂PO₄ 2.5 MgSO₄×7H₂O 1.0 MnSO₄×2H₂O 0.5 CaCl₂×2H₂O 0.2 大豆粉末 3.0 カゼイン・ナッハ・ハンマーステン（Casein nach Hammersten） 15.0 じゃがいもデンプン 120.0 アミラーゼ 0.6 最終体積の1/3に懸濁したじゃがいもデンプンは、酵
素的に加水分解した。これとは別に、カゼインは75℃に
て水（最終体積の約1/3量）にKOH溶液を加えて溶かし
た。これらの２つの溶液と塩類とを混ぜ合わせ、全体積
を水で調整した。pHは7.2に調節し、溶液は滅菌した。

2. 2連の発酵を行った 3. 72と96は培養時間（時間）を示す表３はATCC株がDSM641株にくらべて30％以上のプロテ
アーゼを生産することを示す。

その他の実験操作 1.プラスミドDNAの調製プラスミド標本（ミニプレパレーションmini−prep.C
asl/エチジウムブロミド密度勾配にて精製）、アガロー
スおよびアクリルアミドゲル電気泳動、バッファー類
（トリスEDTA（TE）、トリス酢酸EDTA（TAE）、トリス
ボレートEDTA（TBE）および培地の調製は本質的にマニ
アチス（Maniatis）ら、イビッド（ibid）による方法で
行った。フェノールp.a.はIBIから購入し、使用前にTE
バッファーで平衡にした。アガロース（シーケムGTG（S
eaKem GTG））およびゲル化温度の低いアガロースであ
るシープラーク（SeaPlaque）はエフエムシーコーポレ
イション（FMC Corp.、Rockland,ME）９から購入した。

2.制限フラグメントの精製制限フラグメントは分離用アガロースゲルに試料を通
して単離した。DNAはエチジウムブロミドで染色して可
視化し、DNAフラグメントを含有するバンドを、回収の
ためにレーザー刃で切り取った。DNAはIBI電気溶出機に
て電気的に溶出し、一度フェノール抽出し、その後エタ
ノールで沈殿させた。

3.ポリメラーゼ鎖反応（PCR法） PCR法は製造者セータス・コーポレイション（Cetus C
orporation（Emeryville,Cakifornia）の記載した方法
をそのまま行った。PCR法によって生じたDNAを含有する
溶液をフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させ、制
限酵素による加水分解に適当なバッファーに最懸濁し
た。適当な制限酵素による加水分解ののち、溶液はフェ
ノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。この方法で
調製したDNAは連結に適している。このレポート注では
すべてのPCRにより作成されたDNAフラグメントの予想さ
れる長さは、適当な制限酵素で制限された後に認められ
るDNAフラグメントの長さに対応する。

4.制限酵素分析制限酵素、T4DNAリガーゼおよび細菌性アルカリ性フ
ォスファターゼは、製造者（NEB、BRL、IBI、Boheringe
r）の記載した方法で使用した。

5.プロトプラスト形質転換最初にバチルス・ズブチリスに対して最適化したプロ
トプラスト形質転換方法を他のバチルス属にも適応した
（チャンとコーエン、モル・ジェン・ジェネティックス
（ChangとCohen、Mol.Gen.Genetics第168巻第111頁）。
バチルス・ズブチリス、バチルス・レンツスまたはバチ
ルス・リッシェニフォルミスのコロニーを30mlの416培
地（416培地：バクトトリプトン２％、イースト抽出物
１％、NaC1l％含有、オートクレーブにて滅菌）に接種
し、一夜、37度でニュー・ブラウンスウィック（New Br
unswick）G24卓上シェーカーにて225rpmで振とうしなが
ら培養した。翌朝、各培養物の適当な量を、250mlのエ
ーンリッヒフラスコ内の40mlの416培地（予め温める）
に接種した。37℃の培養を振とうしながら、OD₆₅₀が0.4
と0.5の間に達するまで続けた。その後細胞を35mlの滅
菌ポリプロピレン製オークリッジタイプのチューブで30
00rpm、10分間、４℃にてペレットにした。上清を流
し、細胞のペレットは穏やかに5mlのSMMPへチューブを
反転させて再懸濁した。SMMPは常に、２×の体積のSMM
と４×の体積のPAB（２×SMMに含有するもの：シューク
ロース1.0M、マレイン酸0.04M、MgCl₂・6H₂O0.04M、pH
6.5（10％NaOHで調節）オートクレーブで滅菌:4×PAB含
有物:70gのディフコ（Difco）抗生物質培地＃３をを１
リットルの脱イオン水に溶かした、オートクレーブで滅
菌）を混合して新しく作成したものを使用する。細胞懸
濁液は滅菌した16×125mmの丸底、スクリュー蓋のカル
チャーチューブ（コーニング（Corning）＃25760）に注
いで移した。新たに作成したSMMPに溶かした10mg/mlの
ライソザイムを200μｌ加えた。チューブをG24ニュー・
ブラウンスウィックシェーカーのプラットフォームに乗
せ、37℃で非常に穏やかに（25〜30rpm）振とうしなが
ら培養した。プロトプラストの生成は、一般にバチルス
・リッシェニフォルmsで40〜60分、バチルス・レンツス
およびバチルス・ズブチリスで20〜40分間で起こる。プ
ロトプラストの生成度を測定するため、細胞懸濁液の試
料を位相差顕微鏡を使用して試験した。ライソザイムを
使用させた後、10mlのSMPPをプロトプラストの懸濁液に
加え、プロトプラストを室温で10分間2000rpmの遠心分
離によってペレットにした。SMMPにプロトプラストのペ
レットを再懸濁（最初の細胞懸濁液40mlにつき、3mlのS
MMP）する前に上清を注意して除いた。各形質転換反応
において、0.5mlのプロトプラスト細胞を滅菌プラスチ
ックの16×125mmの丸底培養チューブ（コーニング＃257
60）に移し、その後１から４マイクログラムのDNAを60
μｌあるいはそれ以下の体積にしたもの、1.5mlの40％
ポリエチレングリコール（PEG、シグマ・ケミカル・カ
ンパニー（Sigma Chemical Company）製造＃ｐ−3640）
を加えた。チューブを反転させて穏やかに混合した後、
３〜４分間室温でおき、その後PEGを5mlのSMMP＋２％BS
A（ウシ血清アルブミン）で希釈した。反転により混合
した後、プロトプラストは室温で10分間2000rpmで遠心
分離してペレットとし、ペレットを1mlのSMMP＋BSAに再
懸濁する前に上清を流して除いた。細胞は37℃で90分間
振とうしながら（ニュー・ブラウンスウィックG24卓上
シェーカー、150rpm）培養し、遺伝子をコードするプラ
スミドを発現させ、部分的に細胞壁を再生させる。CR5
再生（regenerating）培地をすべての、Km^Rをコードす
るプラスミドを含有する形質転換体を選択するのに使用
した（パイエル（Puyer）ら、FEMSマイクロバイオロジ
ー・レターズ（FEMS Microbiology Letters）第40巻第
１頁（1987年））。DM3再生培地は、Tc^Rをコードするプ
ラスミドで形質転換したバチルスの選択にもともと使用
されているものである（ChangとCohen（ibid））。しか
しながらバチルス・レンツスプロトプラストはこのサク
シネートを基本とする培地上では再生しなかった。その
ため、浸透圧の安定剤にマンニトールを使用した＃451
再生培地を試用した（ボーンとダンサー（BourneとDanc
er）、ジェイ・オブジェン・マイクロ（J.of Gen.Micr
o.）、第132巻第251頁（1986年）。すべてのバチルス株
はマンニトール培地上で良く再生したが、テトラサイク
リン必要量レベルが各株で異なっていた。バチルス・ズ
ブチリス、バチルス・レンツスおよびATCC53926のテト
ラサイクリンの選択レベルはそれぞれ65μg/ml、15μg/
ml、25μg/mlであった。各形質転換反応は５つの再生プ
レート上で１〜２日間37℃で培養した。強い形質転換株
は、適当な抗生物質を含有し、必要であれば１％のスキ
ムミルクを含有するLuria寒天上へ取り、プロテアーゼ
活性を検出した。株の同一性をチェックするために、ス
ピーチェン（Spizizen）の最小塩類培地に必要な他の栄
養素の添加をしたものと、していないものとを用いた。

6.細菌株大腸菌（Escherichia coli）株：１）大腸菌NM522はhadΔ５、Δ（lac−pro）、
［Ｆ′,pro⁺,lac I^qZΔM15］である。NM522は制限酵素
陰性、修飾陰性である（ファルマシアPharmacia（Pisca
taway,N.J.））。

２）大腸菌GM33（dam3）はdam−メチラーゼ陰性（マ
リナスとモーリス（Marinus,M.G.とMorris,N.R.）、ジ
ェイ・モル・ビオール（J.Mol.Biol）第85巻第309頁（1
974年））である。

３）大腸菌DH5∝は、Ｆ−φ80dlacZΔM15、Δ（lacZY
A−argF）UI69、recA1、endA1、hsdR17（r_k ^-、m_k ⁺）、s
upE44、ラムダー、thi−１、gyrA、relA1（コンピテン
ト凍結細胞、BRL（Gaithersburg,MD））である。

４）大腸菌HB101は、Ｆ−、hsdS20（r_B ^-、m_B ^-）、sup
E44,ara14、glaK2、lacYi、proA2、rpsL20（str^R）、xy
l15、leu、mtl1、ラムダ−、recA13である。

7.バチルス（Bacillus）株１）バチルス・ズブチリスDB104は、his、nprR2、npr
E18、aprA3の遺伝子型を有する。この株は、当局の許可
をうけて、カリフォルニア大学ディービイス校のRoy Do
i博士から譲られ、研究目的にのみ使用した。この株は
中性およびアルカリ性プロテアーゼの産生能を欠いてい
る。

２）バチルス・リッシェニフォルミスATCC53926はヘ
ンケル・ケナジー（Henkel KGaA、Ｄsseldorf,German
y）が開発した工業的に生産されている株である。

３）バチルス・レンツスDSM5483はドイツの土壌試料
から単離した天然由来の株である。

8.クローニングベクター１） pCU19:pCU19は大腸菌の小型（2686bp）プラスミ
ドであり、pBR322とM13mp19の部分を有する。これは、1
3の異なった制限エンドヌクレアーゼにに対する認識部
位を有する54bpからなるマルチプルクローニングサイト
を有する。このプラスミドはヤニッシュ−ペローン（C.
Yanisch−Perron）ら、ジーン（Gene）第33巻、第103頁
（1985年））によって構築されたもので、ニュー・イン
グランド・バイオラボラトリーズ・インコーポレイテッ
ド（New England Biolabs,Inc.（Bewverly,MA））から
購入できる。

２） pTZ18R:pTZ18R（メッド（Mead,D.A.）ら、プロテ
イン・エンジニアリング（Protein Engineering）第１
巻第67頁（1986年））は多機能ファージプラスミド（フ
ァスミド）ベクターである。これは、大腸菌ベクターpB
R322および大腸菌ファージf1の複製オリジンを有し、こ
のため一本鎖DNAを生産できるようにする。これは、プ
ラスミドpUC18のマルチプルクローニングサイトを含有
する。このベクターは、ファルマシア・エルケービー・
バイオテクノロジー・インコーポレイテッド（Pharmaci
a LKB Biotechnology,Inc.（Piscataway,NJ））から購
入することができる。

３） pTZ19R:pTZ19RはプラスミドpUC19のマルチプルク
ローニングサイトを有する以外はpTZ18Rと相同である。

４） pCP13:pCP13は先に解析されているプラスミドpLA
FR1（フリードマン（Friedman）ら、ジーン（Gene）第1
8巻第289頁（1982年））から誘導した、広い宿主域を有
するコスミドベクターである。プラスミドpCP13は23kb
の大きさで、テトラサイクリンおよびカナマイシン耐性
をコードする。このプラスミドにはクローニングに適当
な多様なユニークな制限部位を有し、可動化することが
できるが、自己伝染性ではない。

５） pC50:pC50はバルチスプラスミドpBC16の誘導体で
ある。このプラスミドには、pBC16のBamH I部位に組み
込んだDSM641プロテアーゼをコードする2kbのDNAを有す
る。

６） pC51:pC51はプラスミドpC50の第２世代誘導体で
ある。ATCC53926アルカリ性プロテアーゼをコードす
る、pC50からの1540bpのAva I/Sst Iフラグメントを最
初に大腸菌プロテアーゼpUC19のXma I部位とSst I部位
の間に組み込み、プラスミドpH9を作成した。ATCC53926
プロテアーゼ遺伝子をその後、pH9のEcoR I/BamH Iフラ
グメントから除き、プラスミドpBC16のEcoR I部位とBam
H Iの間に組み込んでプラスミドpC51を作成した。

７） pUB110:pUB110はカナマイシン耐性をコードスル4
548bpのプラスミドであり、スタフィロコッカス・アウ
レウス（Staphylococcus aureus）からラーシー（R.W.L
acey）により最初に単離された（ジェイ・メッド・マイ
クロビオール（J.Med.Microbiol）第７巻第285頁（1974
年））。

８） pKO110:pKO110はpBU110の780bpのEcoR I/BamH I
フラグメントを除き、pUC19からのポリリンカー領域を
含有するフラグメントと置き換えたものである。

９） pBU16:pBU16はおよそ4250bpの大きさで、テトラ
サイクリン耐性をコードする。このプラスミドは、バチ
ルス・セレウス（Bacillus cereus）から最初に単離さ
れ、バチルス・ズブチリス内へ形質転換（バーナード
（Bernhard,K.ら、ジェイ・バクテリオール（J.Bacteri
ol）第133巻第897頁（1978年））された。

10） pC194:pC194はクロラムフェニコール耐性をコー
ドする2910塩基対のプラスミドで、スタフィロコッカス
・アウレウスから単離され、バチルス・ズブチリス内へ
形質転換（イオーダン（Iordanescu,S.）ら、プラスミ
ド第１巻第468頁（1978年）およびエーリッヒ（Erlich,
S.D.）PNAS USA第74巻第1680頁（1977年）された。

11. pH70:pH70はプラスミドPUB110から誘導された。AT
CC53926プロテアーゼ遺伝子をプラスミドpH9（プラスミ
ドpC51の項参照）のEcoR I/BamH I DNAフラグメント上
から分離し、pUB110のEcoR I部位とBamH Iの間に組み込
んでプラスミドpH70を作成した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:10）Ｃ１２Ｒ 1:10）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者ミーレンツ、ジョナサン・アールアメリカ合衆国 95472 カリフォルニア、セバストポール、ファーガソン・ロード 1078番 (72)発明者ホム、シェーマン・スー・ミンアメリカ合衆国 95409 カリフォルニア、サンタ・ローザ、セント・フランシス・ロード 1237番 (72)発明者ハンセン、ディーターアメリカ合衆国 95409 カリフォルニア、サンタ・ローザ、ミッション・ボウルバード 800番 (72)発明者レイノルズ、ロバート・ビーアメリカ合衆国 95404 カリフォルニア、サンタ・ローザ、コルラノ・アベニュー 412番 (72)発明者ケネディー、ニコラス・チャールズ・トーマスドイツ連邦共和国デー―4000 デュッセルドルフ 13、サイデンバーグ 54番 (72)発明者シュナイダー、ヨアヒムドイツ連邦共和国デー―4010 ヒルデン、アム・アイケル・カンプ 158番 (72)発明者バーン、ミハエルドイツ連邦共和国デー―4000 デュッセルドルフ―フブベルラス、ドルフシュトラーセ 42番アー (72)発明者シュミット、ロルフドイツ連邦共和国デー―3340 ボルフェンビュッテル、フリードリッヒ―シェーフェル―シュトラーセ２番 (72)発明者マルクグラフ、マルチナドイツ連邦共和国デー―4000 デュッセルドルフ１、クロンプリンツェンシュトラーセ 48番 (72)発明者パエヒ、クリスチャンアメリカ合衆国 95403―2460 カリフォルニア、サンタ・ローザ、オードボン・コート 2803番 (56)参考文献特開昭62−32888（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−214187（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／6279（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 204，Ｎｏ．３（1988）ｐ．803−804 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/57 C12N 9/54 C12N 1/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス・リッシェニフォルミスATCC5392
6アルカリ性プロテアーゼのプロモーター、リボソーム
結合部位、および開始コドンをこの順に含む調節領域を
含有し、該開始コドンがプレ−プロ領域に機能性に連結
しており、該プレ−プロ領域が以下の配列の112から380
位：【化１】のアミノ酸配列を有するバチルス・レンツスDSM5483由
来アルカリ性タンパク質分解酵素をコードするマチュア
ー領域に機能性に連結しているDNA配列を有し、バチル
ス内で複製できるハイブリッドプラスミド。
【請求項２】バチルス・レンツスDSM5483由来アルカリ
性タンパク質分解酵素をコードするマチュアー領域へ機
能性に連結している、バチルス・リッシェニフォルミス
ATCC53926アルカリ性プロテアーゼ転写ターミネーター
をさらに含有している、第１項記載のハイブリッドプラ
スミド。
【請求項３】バチルス・レンツスルスDSM5483由来アル
カリ性タンパク質分解酵素をコードするマチュアー領域
へ機能性に連結しているATCC53926アルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子のカルボキシ末端部およびその転写ターミネ
ーターをさらに含有している、第１項記載のハイブリッ
ドプラスミド。
【請求項４】【化２】に示した切断地図を有する、第１項記載のハイブリッド
プラスミドpCB55C。
【請求項５】【化３】に示した切断地図を有する、第１項記載のハイブリッド
プラスミドpCB56C。
【請求項６】【化４】に示した切断地図を有する、第１項記載のハイブリッド
プラスミドpCB58C。
【請求項７】【化５】に示した切断地図を有する、第１項記載のハイブリッド
プラスミドpCB75C。
【請求項８】【化６】に示した切断地図を有する、第１項記載のハイブリッド
プラスミドpCB78C。
【請求項９】【化７】に示した切断地図を有する、第１項記載のハイブリッド
プラスミドpCB50N。
【請求項１０】【化８】に示した切断地図を有する、第１項記載のハイブリッド
プラスミドpCB51N。
【請求項１１】【化９】に示した切断地図を有する、第１項記載のハイブリッド
プラスミドpCB53N。
【請求項１２】【化１０】に示した切断地図を有する、第１項記載のハイブリッド
プラスミドpCB70N。
【請求項１３】【化１１】に示した切断地図を有する、第１項記載のハイブリッド
プラスミドpCB73N。
【請求項１４】第４項記載のハイブリッドプラスミドを
含有する形質転換されたバチルス宿主細胞。
【請求項１５】第５項記載のハイブリッドプラスミドを
含有する形質転換されたバチルス宿主細胞。
【請求項１６】第６項記載のハイブリッドプラスミドを
含有する形質転換されたバチルス宿主細胞。
【請求項１７】第７項記載のハイブリッドプラスミドを
含有する形質転換されたバチルス宿主細胞。
【請求項１８】第８項記載のハイブリッドプラスミドを
含有する形質転換されたバチルス宿主細胞。
【請求項１９】第９項記載のハイブリッドプラスミドを
含有する形質転換されたバチルス宿主細胞。
【請求項２０】第10項記載のハイブリッドプラスミドを
含有する形質転換されたバチルス宿主細胞。
【請求項２１】第11項記載のハイブリッドプラスミドを
含有する形質転換されたバチルス宿主細胞。
【請求項２２】第12項記載のハイブリッドプラスミドを
含有する形質転換されたバチルス宿主細胞。
【請求項２３】第13項記載のハイブリッドプラスミドを
含有する形質転換されたバチルス宿主細胞。
【請求項２４】宿主細胞がバチルス・リッシェニフォル
ミスATCC53926である、第14項記載の形質転換されたバ
チルス宿主細胞。
【請求項２５】宿主細胞がバチルス・リッシェニフォル
ミスATCC53926である、第15項記載の形質転換されたバ
チルス宿主細胞。
【請求項２６】宿主細胞がバチルス・リッシェニフォル
ミスATCC53926である、第16項記載の形質転換されたバ
チルス宿主細胞。
【請求項２７】宿主細胞がバチルス・リッシェニフォル
ミスATCC53926である、第17項記載の形質転換されたバ
チルス宿主細胞。
【請求項２８】宿主細胞がバチルス・リッシェニフォル
ミスATCC53926である、第18項記載の形質転換されたバ
チルス宿主細胞。
【請求項２９】宿主細胞がバチルス・リッシェニフォル
ミスATCC53926である、第19項記載の形質転換されたバ
チルス宿主細胞。
【請求項３０】宿主細胞がバチルス・リッシェニフォル
ミスATCC53926である、第20項記載の形質転換されたバ
チルス宿主細胞。
【請求項３１】宿主細胞がバチルス・リッシェニフォル
ミスATCC53926である、第21項記載の形質転換されたバ
チルス宿主細胞。
【請求項３２】宿主細胞がバチルス・リッシェニフォル
ミスATCC53926である、第22項記載の形質転換されたバ
チルス宿主細胞。
【請求項３３】宿主細胞がバチルス・リッシェニフォル
ミスATCC53926である、第23項記載の形質転換されたバ
チルス宿主細胞。
【請求項３４】バチルス・リッシェニフォルミスATCC53
926アルカリ性プロテアーゼのプロモーター、リボソー
ム結合部位、および開始コドンをこの順に含む調節領域
を含有し、該開始コドンがプレ−プロ領域に機能性に連
結しており、該プレ−プロ領域が以下の配列の112から3
80位：【化１２】のアミノ酸配列を有するバチルス・レンツスDSM5483由
来アルカリ性タンパク質分解酵素をコードするマチュア
ー領域に機能性に連結しているDNA配列を有し、バチル
ス内で複製できるハイブリッドプラスミドにて、バチル
ス・リッシェニフォルミスATCC53926を形質転換し、該
形質転換宿主を栄養培地で培養し、培地中に得られる酵
素を回収することを含む、バチルス・レンツスDSM5483
由来のアルカリ性タンパク質分解酵素であって、マチュ
アーなアルカリ性タンパク質分解酵素と、少なくとも１
のバチルス・リッシェニフォルミスATCC53926由来のア
ルカリ性プロテアーゼを含有するアルカリ性タンパク質
分解酵素組成物の製造方法。
【請求項３５】プラスミドがpCB55Cである、第34項記載
の方法。
【請求項３６】プラスミドがpCB56Cである、第34項記載
の方法。
【請求項３７】プラスミドがpCB58Cである、第34項記載
の方法。
【請求項３８】プラスミドがpCB75Cである、第34項記載
の方法。
【請求項３９】プラスミドがpCB78Cである、第34項記載
の方法。
【請求項４０】プラスミドがpCB50Nである、第34項記載
の方法。
【請求項４１】プラスミドがpCB51Nである、第34項記載
の方法。
【請求項４２】プラスミドがpCB53Nである、第34項記載
の方法。
【請求項４３】プラスミドがpCB70Nである、第34項記載
の方法。
【請求項４４】プラスミドがpCB73Nである、第34項記載
の方法。