BR112018009235B1 - Composição de aditivo alimentar, método de preparação da mesma, uso de um micro­organismo de alimentação direta, kit, composição alimentar, e pré-mistura - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO DE ADITIVO ALIMENTAR. A presente invenção refere-se a uma composição de aditivo alimentar que consiste essencialmente em um micro-organismo de alimentação direta que compreende uma ou mais cepas bacterianas em combinação com pelo menos uma protease e um método para aperfeiçoar o desempenho de um indivíduo ou para aperfeiçoar a digestibilidade de uma matéria-prima em uma alimentação, em que tal método compreende administrar a um indivíduo um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório n° U.S. 62/253089, depositado em 9 de novembro de 2015, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO

[002] O campo refere-se a uma composição de aditivo alimentar que compreende um micro-organismo de alimentação direta que compreende uma ou mais cepas bacterianas em combinação com uma ou mais proteases, bem como métodos, kits e usos da mesma.

ANTECEDENTES

[003] Os micro-organismos de alimentação direta (DFM) ou pro- bióticos são suplementos dietéticos que inibem a infecção gastrointestinal e fornecem ambientes microbianos regulados de maneira ideal no trato digestivo. A preocupação quanto ao uso de antibióticos na indústria de alimentos para animais tem levado à exploração de alternativas para prevenir doença. DFMs podem ser usados como reposições antimicro- bianas e, dessa forma, reduzem a necessidade por antibióticos em alimentação animal. DFMs também podem competir com e inibir o crescimento de patógenos, estimular a função imune e modular o equilíbrio microbiano no trato gastrointestinal. DFMs incluem produtos à base de levedura e bactérias de alimentação direta. Constatou-se que a combinação de DFMs com uma ou mais enzimas pode aperfeiçoar as características de desempenho de produção e utilização de nutrientes em animais.

[004] A publicação de patente n° U.S. 2013/0330307, publicada em 12 de dezembro de 2013, revela uma composição de aditivo alimentar que compreende um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase, bem como um método para aperfeiçoar as características de desempenho de produção em animais.

[005] A publicação de patente n° U.S. 2014/0234279, publicada em 21 de agosto de 2014, revela uma composição de aditivo alimentar que compreende um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease, uma xilanase, uma amilase e uma fitase, bem como um método para aperfeiçoar as características de desempenho de produção em animais.

[006] A patente n° U.S. 8.722.058, concedida a Rehberger et al. em 13 de maio de 2014, descreve um método para alimentar um animal com uma ou mais cepas de Bacilllus selecionadas dentre o grupo que consiste em 3A-P4 ATCC PTA-6506, 15A-P4 ATTC PTA-6507 e 22C- P1 ATCC PTA-6508.

SUMÁRIO

[007] Em um aspecto, é revelada uma composição de aditivo alimentar que consiste essencialmente em um micro-organismo de alimentação direta que compreende uma ou mais cepas bacterianas em combinação com pelo menos uma protease.

[008] Em um segundo aspecto, o micro-organismo de alimentação direta é um micro-organismo de alimentação direta antipatógeno.

[009] Em um terceiro aspecto, o micro-organismo de alimentação direta compreende pelo menos três cepas bacterianas selecionadas dentre o grupo que consiste em: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobac- terium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera e combinações dos mesmos.

[0010] Em um quarto aspecto, o micro-organismo de alimentação direta compreende pelo menos três cepas bacterianas selecionadas dentre o grupo que consiste em: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Enterococcus, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farci- minus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp e combinações dos mesmos.

[0011] Em um quinto aspecto, o micro-organismo de alimentação direta compreende cepas de Bacillus subtilis 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B-50508) e 1013 (NRRL B-50509).

[0012] Em um sexto aspecto, o micro-organismo de alimentação direta pode ser sob a forma de um endósporo.

[0013] Em um sétimo aspecto, a composição de aditivo alimentar compreende também pelo menos uma protease que é uma subtilisina, uma bacilolisina, uma serina protease alcalina, uma queratinase ou uma protease de Nocardiopsis.

[0014] Em um oitavo aspecto, pelo menos uma protease é uma subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

[0015] Em um nono aspecto, pelo menos uma protease na com posição de aditivo alimentar está presente em uma dosagem de 1.000 PU/g de composição de aditivo alimentar a 200.000 PU/g de composição de aditivo alimentar.

[0016] Em um décimo aspecto, o DFM na composição de aditivo alimentar está presente em uma dosagem de 1x103 CFU/g de composição de aditivo alimentar a 1x1013 CFU/g de composição de aditivo alimentar.

[0017] Em um décimo primeiro aspecto, é revelado um método para aperfeiçoar o desempenho de um indivíduo, para aperfeiçoar a diges- tibilidade de uma matéria-prima em uma alimentação (por exemplo, digestibilidade de nutriente, como digestibilidade de aminoácido), para aperfeiçoar a retenção de nitrogênio, para aperfeiçoar a resistência de indivíduos à enterite necrótica, para aperfeiçoar a taxa de conversão alimentar (FCR), para aumentar o rendimento de carne ou carcaça, para aperfeiçoar o ganho de peso corporal em um indivíduo, para aperfeiçoar a eficiência alimentar em um indivíduo, para modular (por exemplo, aperfeiçoar) a resposta imunológica do indivíduo, para promover o crescimento de bactérias benéficas no trato gastrointestinal de um indivíduo, para reduzir populações de bactérias patogênicas no trato gastrointestinal de um indivíduo, para reduzir a excreção de nutrientes em estrume, para reduzir a produção de amônia em estrume ou para aperfeiçoar a digestibilidade ou utilização de fibra ou hemicelulose dietética, tal método que compreende administrar um micro-organismo de alimentação direta que compreende uma ou mais cepas bacterianas em combinação com pelo menos uma protease.

[0018] Em um décimo segundo aspecto, é revelado um kit que compreende qualquer uma das composições de aditivo alimentar descritas no presente documento e instruções para administração.

[0019] Em um décimo terceiro aspecto, é revelado um método para preparar uma composição de aditivo alimentar que compreende misturar por adição um micro-organismo de alimentação direta que compreende uma ou mais cepas bacterianas em combinação com pelo menos uma protease e embalar.

[0020] Em um décimo quarto aspecto, é revelada uma alimentação que compreende qualquer uma das composições de aditivo alimentar descritas no presente documento.

[0021] Em um décimo quinto aspecto, é revelada uma pré-mistura que compreende qualquer uma das composições de aditivo alimentar descritas no presente documento e pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0022] A Figura 1 mostra os efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease (P3000) quando alimentado isoladamente ou em combinação no desempenho de crescimento de porco.

[0023] A Figura 2 mostra os efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado isoladamente ou em combinação no desempenho de crescimento de porco.

[0024] A Figura 3 mostra os efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado isoladamente ou em combinação nas emissões de amônia fecal.

[0025] A Figura 4 mostra os efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado isoladamente ou em combinação no desempenho de crescimento de porco.

[0026] A Figura 5 mostra os efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado isoladamente ou em combinação na concentração de amônia fecal.

[0027] A Figura 6 mostra os efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado em combinação ou DFM sozinho no desempenho de crescimento de porco.

[0028] A Figura 7 mostra os efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado isoladamente ou em combinação no desempenho de crescimento de porco.

[0029] A Figura 8.1 mostra os efeitos de um DFM de 3 cepas de Bacillus em combinação com uma protease na solubilização de proteína in vitro do digerido ileal de porcos alimentados com uma dieta à base de farinha de soja.

[0030] A Figura 8.2 mostra os efeitos de um DFM de cepa única de Bacillus licheniformis em combinação com uma protease na solubili- zação de proteína in vitro do digerido ileal de porcos alimentados com uma dieta à base de farinha de soja.

[0031] A Figura 8.3 mostra os efeitos de um DFM de cepa única de Bacillus pumilis em combinação com uma protease na solubilização de proteína in vitro do digerido ileal de porcos alimentados com uma dieta à base de farinha de soja.

[0032] A Figura 8.4 mostra os efeitos de um DFM de cepa única de Bacillus pumilis em combinação com uma protease na solubilização de proteína in vitro do digerido ileal de porcos alimentados com uma dieta à base de trigo.

[0033] A Figura 8.5 mostra os efeitos de um DFM de cepa única de Bacillus licheniformis em combinação com uma protease na solubili- zação de proteína in vitro do digerido ileal de porcos alimentados com uma dieta à base de trigo.

[0034] A Figura 8.6 mostra os efeitos de um DFM de cepa única de Lactobacillus reuteri em combinação com uma protease na solubiliza- ção de proteína in vitro do digerido ileal de porcos alimentados com uma dieta à base de trigo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0035] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações men cionados estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0036] Nessa descrição, diversos termos e abreviações são usados. As definições a seguir se aplicam a não ser que especificamente determinado de outro modo.

[0037] Os artigos "um", "uma" e "o", "a" que precedem um elemento ou componente são concebidos como não restritivos em relação ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto, "um", "uma" e "o", "a" devem ser lidos incluindo um ou pelo menos um, e a forma de palavra no singular do elemento ou componente também inclui o plural, a não ser que o número obviamente signifique o singular.

[0038] O termo "que compreende" significa a presença dos recur sos, números inteiros, etapas ou componentes determinados conforme mencionado nas modalidades, mas não exclui a presença ou a adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. O termo "que compreende" destina-se a incluir modalidades englobadas pelos termos "que consiste essencialmente em" e "que consiste em". Similarmente, o termo "que consiste essencialmente em" destina-se a incluir modalidades englobadas pelo termo "que consiste em".

[0039] Quando presentes, todas as faixas são inclusivas e combiná veis. Por exemplo, quando uma faixa de "1 a 5" é mencionada, a faixa mencionada deve ser interpretada como incluindo as faixas "1 a 4", "1 a 3", "1 a 2", "1 a 2 e 4 a 5", "1 a 3 e 5" se similares.

[0040] Como usado aqui em combinação com um valor numérico, o termo "cerca de" se refere a uma faixa de +/- 0,5 do valor numérico, a menos que o termo seja especificamente definido de outro modo no contexto. Por exemplo, a expressão "valor de pH de cerca de 6" se refere a valores de pH de cerca de 5,5 a 6,5, a menos que o valor de pH seja especificamente definido de outro modo.

[0041] Pretende-se que cada limitação numérica máxima dada ao longo deste Relatório Descritivo inclua cada limitação numérica inferior, como se tais limitações numéricas inferiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada limitação numérica mínima dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá cada limitação numérica superior, como se tais limitações numéricas superiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada faixa numérica dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá todas as faixas numéricas mais estreitas que estejam abrangidas dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas fossem, todas, expressamente escritas no presente documento.

[0042] Os termos "animal" e "indivíduo" são usados de forma intercambiável no presente documento. Um animal inclui todos os animais não ruminantes (incluindo seres humanos) e ruminantes. Em uma modalidade específica, o animal é um animal não ruminante, como um cavalo ou animal monogástrico. Os exemplos de animais mono- gástricos incluem, mas sem limitação, porcos e suínos, como leitões, porcos em fase de crescimento, porcas; aves como perus, patos, galinhas, frangos de corte, galinha poedeira; peixe como salmão, truta, tilápia, bagre e carpas; e crustáceos como camarões e camarões grandes. Em uma modalidade adicional, o animal é um animal ruminante incluindo, mas sem limitação, gado, bezerros jovens, cabras, ovelha, girafas, bisão, alce americano, alce indonésio, iaques, búfalo de água, veado, camelos, alpacas, lhamas, antílope, antílope americano e antílope asiático.

[0043] O termo "patógeno", como usado aqui, significa qualquer agente causador de doença. Tais agentes causadores podem incluir, porém sem limitação, agentes causadores bacterianos, virais, fúngicos e similares.

[0044] Uma "alimentação" e um "alimento", respectivamente, signi ficam qualquer dieta natural ou artificial, refeição ou similares ou componentes de tais refeições destinados ou adequados para serem comidos, tomados, digeridos, por um animal não humano e um ser humano, respectivamente.

[0045] Como usado aqui, o termo "alimento" é usado em um sentido amplo e abrange alimentos e produtos alimentícios para seres humanos, assim como alimentos para animais não humanos (isto é, uma alimentação).

[0046] O termo "alimentação" é usado em referência a produtos que são alimentados a animais na criação de gado. Os termos "alimentação" e "alimentação animal" são usados de forma intercambiável.

[0047] O termo "micro-organismo de alimentação direta" ("DFM"), como usado aqui, é originado de micro-organismos de ocorrência natural vivos (viáveis). Um DFM pode compreender um ou mais dentre tais micro-organismos de ocorrência natural como cepas bacterianas. As categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias formadoras de ácido láctico e Leveduras. Os Bacillus são hastes gram-positivas exclusivas que formam esporos. Os esporos são muito estáveis e podem suportar condições ambientais como calor, umidificação e uma faixa de pH. Esses esporos germinam em células vegetativas ativas quando ingeridos por um animal e podem ser usados em refeição e dietas peletizadas. As bactérias formadoras de ácido láctico são cocos gram- positivos que produzem ácido láctico que são antagonistas a patógenos. Uma vez que as bactérias formadoras de ácido láctico parecem ser um tanto sensíveis ao calor, não podem ser usadas em dietas peletizadas. Os tipos de bactérias formadoras de ácido láctico incluem Bifidobacterium, Lactobacillus e Streptococcus. As leveduras não são bactérias. Esses micro-organismos pertencem aos fungos do grupo de planta. Dessa forma, o termo DFM abrange um ou mais dentre os seguintes: bactérias de alimentação direta, levedura de alimentação direta e combinações das mesmas.

[0048] O termo "prebiótico" significa um ingrediente alimentar não digestível que afeta de modo benéfico o hospedeiro estimulando-se seletivamente o crescimento e/ou a atividade de uma ou um número limitado de bactérias benéficas.

[0049] O termo "cultura probiótico", como usado aqui, define micro organismos vivos (incluindo bactérias ou leveduras, por exemplo) que quando, por exemplo, ingeridos ou aplicados localmente em números suficientes, afetam de modo benéfico o organismo hospedeiro, isto é, conferindo-se um ou mais benefícios de saúde demonstráveis no organismo hospedeiro. Os probióticos pode melhorar o equilíbrio microbiano em uma ou mais superfícies mucosas. Por exemplo, a superfície mucosa pode ser o intestino, o trato urinário, o trato respiratório ou a pele. O termo "probiótico", para uso no presente documento, também abrange micro-organismos vivos que podem estimular as ramificações benéficas do sistema imunológico e ao mesmo tempo diminuir as reações inflamatórias em uma superfície mucosa, por exemplo, o intestino. Embora não existam limites superiores ou inferiores para a ingestão de probiótico, foi sugerido que pelo menos 106-1012, de preferência, pelo menos 106-1010, de preferência, 108-109, cfu como uma dose diária será eficaz para obter os efeitos benéficos sobre a saúde em um indivíduo.

[0050] O termo "CFU", como usado aqui, significa "unidades de formação de colônia" e é uma medição de células viáveis em que uma colônia representa um agregado de células derivadas de uma única célula progenitora.

[0051] O termo "protease", como usado aqui, refere-se a uma enzima com capacidade para clivar uma ligação peptídica. Os termos "protease", "peptidase" e "proteinase" podem ser usados de forma inter- cambiável. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, bactérias, archaea e vírus. A proteólise pode ser atingida por enzimas atualmente classificadas em seus grupos amplos: proteases aspárticas, cisteína proteases, serina proteases, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.

[0052] O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Os exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, porém sem limitação, qualquer célula hospedeira, enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou da totalidade dos constituintes de ocorrência natural aos quais está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância presente na natureza; ou (4) qualquer substância modificada mediante aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada. Os termos "molécula de ácido nucleico isolada", "polinucleotídeo isolado" e "fragmento de ácido nucleico isolado" serão usados de forma intercambiável e referem-se a um polímero de RNA ou DNA que é de fita simples ou dupla fita, que contém opcionalmente bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Uma molécula de ácido nucleico isolada na forma de um polímero de DNA pode ser compreendida por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

[0053] O termo "purificado" conforme aplicado aos ácidos nucleicos ou polipeptídeos, de modo geral, denotados como um ácido nucleico ou polipeptídeo que é essencialmente livre de outros componentes conforme determinado pelas técnicas analíticas bem conhecidas na técnica (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo purificado forma uma banda discreta em um gel eletroforético, eluato cromato- gráfico e/ou um meio submetido à centrifugação de gradiente por densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que origina essencialmente uma banda em um gel eletroforético é "purificado". Um ácido nucleico ou polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 50% puro, normalmente pelo menos cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 99,5%, cerca de 99,6%, cerca de 99,7%, cerca de 99,8% ou mais puro (por exemplo, porcentagem em peso em uma base molar). Em um sentido relacionado, uma composição é enriquecida para uma molécula quando há um aumento substancial na concentração da molécula após aplicação de uma técnica de purificação ou enriquecimento. O termo "enriquecido" se refere a um composto, polipeptídeo, célula, ácido nucleico, aminoácido ou outro material ou componente especificado que esteja presente em uma composição em uma concentração relativa ou absoluta que seja maior que uma composição inicial.

[0054] O termo "transformação", como usado aqui, se refere à transferência ou à introdução de uma molécula de ácido nucleico em um organismo hospedeiro. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida como uma forma linear ou circular de DNA. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo que replica autonomamente, ou pode integrar-se ao genoma de um hospedeiro de produção. Os hospedeiros de produção que contêm o ácido nucleico transformado são denominados organismos "transformados" ou "recombinantes" ou "trans- gênicos" ou "transformantes".

[0055] O termo "recombinante", como usado aqui, refere-se a uma combinação artificial de dois segmentos de sequências e ácidos nucleicos de outro modo separados, por exemplo, por síntese química, ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por meio de técnicas de engenharia genética. Por exemplo, DNA em que um ou mais segmentos ou genes foram inseridos, naturalmente ou por manipulação em laboratório, de uma molécula diferente, de outra parte a mesma molécula ou uma sequência artificial, resultando na introdução de uma nova sequência em um gene e subsequentemente em um organismo. Os termos "recombinante", "transgênico", "transformado", "geneticamente modificado" ou "modificado para expressão de gene exógena" são usados de forma intercambiável no presente documento.

[0056] O termo "microbiano" no presente documento é usado de forma intercambiável com "micro-organismo". Um micro-organismo viável é aquele que metabolicamente ativo ou capaz de se diferenciar.

[0057] Os DFMs descritos no presente documento compreendem pelo menos um micro-organismo viável, como uma cepa bacteriana viável, uma levedura viável ou um fungo viável. De preferência, o DFM compreende pelo menos uma bactéria viável.

[0058] Em uma modalidade, o DFM pode ser um cepa bacteriana de formação de esporo e, por conseguinte, o termo DFM pode ser compreendido de ou conter esporos, por exemplo, esporos bacterianos. Dessa forma, o termo "micro-organismo viável", como usado aqui, pode incluir esporos microbianos, como endósporos ou conídia. Alternativamente, o DFM na composição de aditivo alimentar descrita no presente documento pode não compreender ou pode não conter esporos microbianos, por exemplo, endósporos ou conídia.

[0059] O micro-organismo pode ser um micro-organismo de ocor rência natural ou pode ser um micro-organismo transformado. De preferência, o micro-organismo é uma combinação de pelo menos três micro-organismos adequados, como bactérias, que podem ser isolados.

[0060] Um DFM conforme descrito no presente documento pode compreender micro-organismos de um ou mais dentre os seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococ- cus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera e combinações dos mesmos.

[0061] De preferência, o DFM compreende uma ou mais cepas bacterianas selecionadas dentre os seguintes Bacillus spp: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis e Bacillus amyloliquefaciens.

[0062] O "gênero Bacillus", como usado aqui, inclui todas as espécies dentro do gênero "Bacillus" conforme conhecido por aqueles versados na técnica, incluindo, porém sem limitação, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. gibsonii, B. pumilis e B. thuringiensis. É reconhecido que o gênero Bacillus continua a ser submetido a reorganização taxonômica. Dessa forma, entende-se que o gênero inclui espécies que foram reclassificadas, incluindo, porém sem limitação, tais organismos como Bacillus stearothermophilus, que agora é nomeado "Geobacillus stearothermophilus" ou Bacillus polymyxa, que é agora "Paenibacillus polymyxa". A produção de endósporos resistentes sob condições ambientais estressantes é considerada o atributo de definição do gênero Bacillus, embora essa característica também se aplique aos recentemente nomeados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Graciliba- cillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureiba- cillus e Virgibacillus.

[0063] De preferência, o DFM pode ser uma combinação de três ou mais cepas de Bacillus subtilis 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B- 50508) e 1013 (NRRL B-50509).

[0064] As cepas 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B-50508) e 1013 (NRRL B-50509) estão publicamente disponíveis junto à Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL). Essas cepas são mostradas no documento sob o n° WO2013029013.

[0065] Em um outro aspecto, o DFM pode ser adicionalmente combinado com os seguintes Lactococcus spp: Lactococcus cremoris e Lactococcus lactis e combinações dos mesmos.

[0066] O DFM pode ser adicionalmente combinado com os seguintes Lactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus aci-dophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii e Lactobacillus jensenii, e combinações de quaisquer dos mesmos.

[0067] Em ainda um outro aspecto, o DFM pode ser adicionalmente combinado com os seguintes Bifidobacteria spp: Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis e Bifidobacterium angulatum, e combinações de quaisquer dos mesmos.

[0068] Podem ser mencionadas as bactérias das seguintes espécies: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefa- ciens, Bacillus pumilis, Enterococcus, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Megasphaera elsdenii, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius, Propionibacteria sp e combinações dos mesmos.

[0069] O micro-organismo de alimentação direta descrito no presente documento que compreende uma ou mais cepas bacterianas pode ser do mesmo tipo (gênero, espécie e cepa) ou pode compreender uma mistura de gêneros, espécies e/ou cepas.

[0070] Adequadamente, a composição de acordo com a presente descrição pode ser combinada com um ou mais dentre os produtos ou os micro-organismos contidos naqueles produtos revelados no documento sob o n° WO2012110778, e resumidos conforme exposto a seguir: cepa de Bacillus subtilis 2084 n° de acesso NRRl B-50013, cepa de Bacillus subtilis LSSAO1 n° de acesso NRRL B-50104 e cepa de Bacillus subtilis 15A-P4 ATCC n° de acesso PTA-6507 (disponíveis junto à Enviva Pro®. (anteriormente conhecida como Avicorr®); cepa de Bacillus subtilis C3102 (disponível junto à Calsporin®); cepa de Bacillus subtilis PB6 (disponível junto à Clostat®); Bacillus pumilis (8G-134); Enterococcus NCIMB 10415 (SF68) (disponível junto à Cylactin®); cepa de Bacillus subtilis C3102 (disponível junto à Gallipro® & GalliproMax®); Bacillus licheniformis (disponível junto à Gallipro®Tect®); Enterococcus e Pediococcus (disponível junto à Poultry star®); Lactobacillus, Bifidobacterium e/ou Enterococcus disponível junto à Protexin®); cepa de Bacillus subtilis QST 713 (disponível junto à Proflora®); Bacillus amyloliquefaciens CECT-5940 (disponível junto à Ecobiol® & Ecobiol® Plus); Enterococcus faecium SF68 (disponível junto à Fortiflora®); Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis (disponível junto à BioPlus2B®); bactérias de ácido lático 7 Enterococcus faecium (disponível junto à Lactiferm®); cepa de Bacillus (disponível junto à CSI®); Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à Yea-Sacc®); Enterococcus (disponível junto à Biomin IMB52®); Pediococcus acidilactici, Enterococcus, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactoba- cillus salivarius ssp. salivarius (disponível junto à Biomin C5®); Lactobacillus farciminis (disponível junto à Biacton®); Enterococcus (disponível junto à Oralin E1707®); Enterococcus (2 cepas), Lactococcus lactis DSM 1103(disponível junto à Probios-pioneer PDFM®); Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus farciminis (disponível junto à Sorbiflore®); Bacillus subtilis (disponível junto à Animavit®); Enterococcus (disponível junto à Bonvital®); Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à Levucell SB 20®); Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à Levucell SC 0 & SC10® ME); Pediococcus acidilacti (disponível junto à Bactocell); Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à ActiSaf® (anteriormente BioSaf®)); Saccharomyces cerevisiae NCYC Sc47 (disponível junto à Actisaf® SC47); Clostridium butyricum (disponível junto à Miya-Gold®); Enterococcus (disponível junto à Fecinor e Fecinor Plus®); Saccharomyces cerevisiae NCYC R-625 (disponível junto à InteSwine®); Saccharomyces cerevisia (disponível junto à BioSprint®); Enterococcus e Lactobacillus rhamnosus (disponível junto à Provita®); Bacillus subtilis e Aspergillus oryzae (disponível junto à PepSoyGen-C®); Bacillus cereus (disponível junto à Toyocerin®); Bacillus cereus var. toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012 (disponível junto à TOYOCERIN®), ou outros DFMs, como Bacillus licheniformis e Bacillus subtilis (disponível junto à BioPlus® YC) e Bacillus subtilis (disponível junto à GalliPro®).

[0071] O DFM pode ser combinado com Enviva Pro® que está disponível comercialmente junto à Danisco A/S. Enviva Pro® é uma combinação da cepa de Bacillus 2084 n° de acesso NRRl B-50013, cepa de Bacillus LSSAO1 n° de acesso NRRL B-50104 e cepa de Bacillus 15A-P4 ATCC n° de acesso PTA-6507 (conforme mostrado no documento sob o n° US 7.754.469 B - incorporado ao presente documento a título de referência).

[0072] Também é possível combinar o DFM descrito no presente documento com uma levedura dos gêneros: Saccharomyces spp.

[0073] De preferência, o DFM descrito no presente documento compreende micro-organismos que são, em geral, reconhecidos como seguros (GRAS) e, de preferência, são aprovados por GRAS.

[0074] Uma pessoa com habilidade comum na técnica estará prontamente ciente das espécies e/ou cepas específicas de micro-organismos dos gêneros descritos no presente documento que são usados nas indústrias alimentícias e/ou agrícolas e que são considerados, de modo geral, adequados para o consumo animal.

[0075] Vantajosamente, em que o produto é uma alimentação ou composição de aditivo alimentar, o DFM deve permanecer eficaz através do "prazo de validade" ou data de "expiração" normal do produto durante a qual a alimentação ou composição de aditivo alimentar é oferecida para venda pelo revendedor. Os períodos de tempo desejados e vida útil normal irão variar entre as composições de ração e aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que os tempos de vida útil irão variar com o tipo de composição de ração, o tamanho da composição de ração, temperaturas de armazenamento, condições de processamento, material de embalagem e equipamento de embalagem.

[0076] Em algumas modalidades, é importante que o DFM seja tolerante ao calor, isto é, seja termotolerante. Isso é particularmente o caso quando a alimentação é peletizada. Portanto, em uma outra modalidade, o DFM pode ser um micro-organismo termotolerante, como uma bactéria termotolerante incluindo, por exemplo, Bacillus spp.

[0077] Em outros aspectos, pode ser desejável que o DFM com preenda uma bactéria de produção de esporo, como Bacilli, por exemplo, Bacillus spp. Os Bacilli têm capacidade para formar endóspo- ros estáveis quando as condições para o crescimento não são favoráveis e são muito resistentes ao calor, pH, umidade e desinfetantes.

[0078] O DFM descrito no presente documento pode diminuir ou impedir o estabelecimento intestinal de micro-organismo patogênico (como Clostridium perfringens e/ou E. coli e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp.). Em outras palavras, o DFM pode ser antipa- togênico. O termo "antipatogênico", como usado aqui, significa que o DFM enfrenta um efeito (efeito negativo) de um patógeno.

[0079] Conforme descrito acima, o DFM pode ser qualquer DFM adequado. Por exemplo, o seguinte ensaio "ENSAIO DE DFM" pode ser usado para determinar a adequação de um micro-organismo para ser um DFM. O ensaio de DFM, como usado aqui, é explicado em maiores detalhes no documento sob o n° US2009/0280090. Para evitar qualquer dúvida, o DFM selecionado como uma cepa inibitória (ou um DFM antipatogênico) de acordo com o "ENSAIO DE DFM" mostrado no presente documento é um DFM adequado para o uso de acordo com a presente descrição, isto é, na composição de aditivo alimentar de acordo com a presente descrição.

[0080] Os tubos foram semeados, cada um, com um patógeno representativo (por exemplo, bactérias) de um agrupamento representativo.

[0081] O sobrenadante de um DFM potencial, desenvolvido de maneira aeróbica ou anaeróbica, é adicionado aos tubos semeados (exceto para o controle a qual nenhum sobrenadante é adicionado) e incubados. Após incubação, a densidade óptica (OD) do controle e tubos tratados com sobrenadante foi medida para cada patógeno.

[0082] As colônias de cepas (DFM potencial) que produziram uma OD reduzida em comparação com o controle (que não continha qualquer sobrenadante) podem ser, então, classificadas como uma cepa inibitória (ou um DFM antipatogênico). Dessa forma, o ensaio de DFM, como usado aqui, é explicado em maiores detalhes no documento sob o n° US2009/0280090.

[0083] De preferência, um patógeno representativo nesse ensaio de DFM pode ser um (ou mais) dentre os seguintes: Clostridium, como Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, e/ou E. coli e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp. Em uma modalidade preferencial, o ensaio é conduzido com um ou mais dentre Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile e/ou E. coli, de preferência, Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, mais preferencialmente, Clostridium perfringens.

[0084] Os DFMs antipatogênicos incluem uma ou mais dentre as seguintes bactérias e são descritos no documento sob o n° WO2013029013: cepa de Bacillus subtilis 3BP5 n° de acesso NRRL B-50510, cepa de Bacillus subtilis 918 ATCC n° de acesso NRRL B- 50508, e cepa de Bacillus subtilis 1013 ATCC n° de acesso NRRL B- 50509.

[0085] Os DFMs podem ser preparados como cultura (ou culturas) e carreador (ou carreadores) (quando usados) e podem ser adicionados a um misturador de fita ou pá e misturados durante cerca de 15 minutos, apesar de o tempo poder ser aumentado ou diminuído. Os componentes são misturados de modo que resulte em uma mistura uniforme das culturas e carreadores. O produto final é, de preferência, um pó seco e fluidificável. O DFM (ou DFMs) que compreende uma ou mais cepas bacterianas pode ser, então, adicionado à alimentação para animal ou uma pré-mistura de alimentação, adicionado à água de um animal, ou administrado de outras formas conhecidas na técnica (de preferência, simultaneamente com as enzimas descritas no presente documento.

[0086] A inclusão das cepas individuais na mistura de DFM pode ser em proporções que variam de 1% a 99% e, de preferência, de 25% a 75%.

[0087] As dosagens adequadas do DFM em alimentação para animal podem se situar na faixa de cerca de 1x103 CFU/g de alimentação a cerca de 1x1010 CFU/g de alimentação, adequadamente entre cerca de 1x104 CFU/g de alimentação a cerca de 1x108 CFU/g de alimentação, adequadamente entre cerca de 7,5x104 CFU/g de alimentação a cerca de 1x107 CFU/g de alimentação.

[0088] Em um outro aspecto, o DFM pode ser dosado em com posição de ração em mais que cerca de 1x103 CFU/g de alimentação, adequadamente mais que cerca de 1x104 CFU/g de alimentação, adequadamente mais que cerca de 5x104 CFU/g de alimentação ou adequadamente mais que cerca de 1x105 CFU/g de alimentação.

[0089] O DFM pode ser dosado em uma composição de aditivo alimentar de cerca de 1x103 CFU/g de composição a cerca de 1x1013 CFU/g de composição, de preferência, 1x105 CFU/g de composição a cerca de 1x1013 CFU/g de composição, more de preferência, entre cerca de 1x106 CFU/g de composição a cerca de 1x1012 CFU/g de composição, e com máxima preferência, entre cerca de 3,75x107 CFU/g de composição a cerca de 1x1011 CFU/g de composição. Em um outro aspecto, o DFM pode ser dosado em uma composição de aditivo alimentar em mais que cerca de 1x105 CFU/g de composição, de preferência, mais que cerca de 1x106 CFU/g de composição, e com máxima preferência, mais que cerca de 3,75x107 CFU/g de composição. Em uma modalidade, o DFM é dosado na composição de aditivo alimentar em mais que cerca de 2x105 CFU/g de composição, adequadamente mais que cerca de 2x106 CFU/g de composição, adequadamente mais que cerca de 3,75x107 CFU/g de composição.

[0090] Uma composição de aditivo alimentar, conforme descrito no presente documento, consiste essencialmente em um DFM que compreende uma ou mais cepas bacterianas e pelo menos uma protease. A protease pode ser uma subtilisina (E.C. 3.4.21.62) ou uma bacilolisina (E.C. 3.4.24.28) ou uma serina protease alcalina (E.C. 3.4.21.x) ou uma queratinase (E.C. 3.4.x.x). A protease preferencial é uma subtilisina. A protease pode ser de B. subtilis ou a protease pode ser uma protease de Nocardiopsis disponível junto à Novozymes A/S.

[0091] Outras proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. As proteases mutantes geneticamente modificadas por proteína ou quimicamente modificadas também podem ser usadas. A protease pode ser uma serina protease ou uma metaloprotease, por exemplo, uma protease microbiana alcalina ou uma protease semelhante à tripsina. Os exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus sp., por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309 (consultar, por exemplo, a patente n° U.S. 6.287.841), subtilisina 147 e subtilisina 168 (consultar, por exemplo, o documento WO 89/06279). Os exemplos de proteases semelhantes à tripsina são tripsina (por exemplo, de origem porcina ou bovina) e proteases de Fusarium (consultar, por exemplo, os documentos WO 89/06270 e WO 94/25583). Os exemplos de proteases úteis também incluem, porém, sem limitação, as variantes descritas nos documentos WO 92/19729 e WO 98/20115.

[0092] Uma ou mais proteases em um ou mais produtos comerciais abaixo podem ser usadas em combinação com o micro-organismo de alimentação direta de três cepas descrito no presente documento:

[0093] De preferência, a protease está presente na composição de ração na faixa de cerca de 1.000 PU/kg a cerca de 200.000 PU/kg de alimentação, mais preferencialmente, cerca de 1.500 PU/kg de alimentação a cerca de 100.000 PU/kg de alimentação, mais preferencialmente, cerca de 2.000 PU/kg de alimentação a cerca de 60.000 PU/kg de alimentação. Mais especificamente, a protease está presente na composição de ração em mais que cerca de 1.000 PU/kg de alimentação, mais que cerca de 1.500 PU/kg de alimentação ou mais que cerca de 2.000 PU/kg de alimentação. Em um outro aspecto, a protease está presente na composição de ração em menos que cerca de 200.000 PU/kg de alimentação, menos que cerca de 100.000 PU/kg de alimentação, menos que cerca de 70.000 PU/kg de alimentação ou menos que cerca de 60.000 PU/kg de alimentação.

[0094] A protease pode estar presente na composição de aditivo alimentar na faixa de cerca de 200 PU/g a cerca de 400.000 PU/g de composição, mais preferencialmente, cerca de 300 PU/g de composição a cerca de 200.000 PU/g de composição, e, ainda mais preferencialmente, cerca de 5.000 PU/g de composição a cerca de 100.000 PU/g de composição, e, ainda mais preferencialmente, cerca de 700 PU/g de composição a cerca de 70.000 PU/g de composição, e, ainda mais preferencialmente, cerca de 1.000 PU/g de composição a cerca de 60.000 PU/g de composição.

[0095] Em um outro aspecto, a protease está presente na com posição de aditivo alimentar em mais que cerca de 200 PU/g de composição, mais que cerca de 300 PU/g de composição, mais que cerca de 400 PU/g de composição, mais que cerca de 500 PU/g de composição, mais que cerca de 750 PU/g de composição ou mais que cerca de 1.000 PU/g de composição.

[0096] Em ainda um outro aspecto, a protease está presente na composição de aditivo alimentar em menos que cerca de 400.000 PU/g de composição, menos que cerca de 200.000 PU/g de composição, menos que cerca de 100.000 PU/g de composição, menos que cerca de 80.000 PU/g de composição, menos que cerca de 70.000 PU/g de composição ou menos que cerca de 60.000 PU/g de composição.

[0097] Será compreendido que uma unidade de protease (PU) é a quantidade de enzima que libera 2,3 microgramas de composto fenólico (expresso como equivalentes de tirosina) de um substrato de caseína por minuto em pH 10,0 a 50 °C. Isso pode ser mencionado como o ensaio para determinar 1 PU.

[0098] Sem se ater à teoria, as proteases causam hidrólise não específica de proteína dietética produzindo uma variedade de polipep- tídeos no lúmen intestinal. Os animais finalizam a hidrólise de proteína e absorvem tais aminoácidos. No entanto, no caso de provocações patogênicas entéricas, as bactérias patogênicas podem aproveitar a disponibilidade de peptídeo maior no lúmen de jejuno e íleo. O DFM (ou DFMs) inibe o crescimento de entero-patógenos por meio, por exemplo, da competição por fontes de N, bem como por inibição direta.

[0099] A combinação específica de DFM que compreende uma ou mais bactérias e a pelo menos uma protease mostrada no presente documento pode levar vantajosamente à secreção de mucina reduzida. Acredita-se que essa secreção de mucina reduzida possa resultar em uma redução de perdas de aminoácido endógeno e/ou pode ser responsável pelo desempenho aperfeiçoado.

[00100] A combinação específica de DFM que compreende uma ou mais bactérias e a pelo menos uma protease mostrada no presente documento pode vantajosamente reduzir inflamação no íleo. Isso pode ser visto pela regulação decrescente da expressão de Interferon gama (IFN gama) no íleo.

[00101] A composição de aditivo alimentar descrita no presente documento pode ser alimentada a um animal como um micro-organismo de alimentação direta (DFM). Um ou mais carreadores ou outros ingredientes podem ser adicionados ao DFM. O DFM pode ser apresentado em diversas formas físicas, por exemplo, como uma cobertura, como um concentrado solúvel em água para uso como uma solução oral líquida ou para ser adicionado a um substituto do leite, cápsula de gelatina ou géis. Em uma modalidade da forma de cobertura, o produto de fermentação liofilizado é adicionado a um carreador, como soro do leite, maltodextrina, sacarose, dextrose, calcário (carbonato de cálcio), cascas de arroz, cultura de levedura, amido seco e/ou silício aluminato de sódio. Em uma modalidade do concentrado solúvel em água para uma solução oral ou suplemento substituto do leite, o produto de fermentação liofilizado é adicionado a um carreador solúvel em água, como soro do leite, maltodextrina, sacarose, dextrose, amido seco, silício aluminato de sódio e um líquido é adicionado para formar a solução oral ou o suplemento é adicionado ao leite ou um substituto do leite. Em uma modalidade da forma de cápsula de gelatina, o produto de fermentação liofilizado é adicionado a um carreador, como soro do leite, maltodextrina, açúcar, calcário (carbonato de cálcio), cascas de arroz, cultura de levedura, amido seco e/ou silício aluminato de sódio. Em uma modalidade, as bactérias e o carreador são envolvidos em uma cápsula de gelatina degradável. Em uma modalidade da forma de géis, o produto de fermentação liofilizado é adicionado a um carreador, como óleo vegetal, sacarose, dióxido de silício, polissorbato 80, propileno- glicol, hidróxi anisol butilado, ácido cítrico, etoxiquina e/ou coloração artificial para formar o gel.

[00102] O DFM (ou DFMs) pode, opcionalmente, ser misturado por adição com uma formulação seca de aditivos incluindo, mas não se limitando a, substratos de crescimento, enzimas, açúcares, carboidratos, extratos e microingredientes de promoção de crescimento. Os açúcares poderiam incluir os seguintes: lactose; maltose; dextrose; maltodextrina; glicose; frutose; manose; tagatose; sorbose; raffinose; e galactose. Os açúcares se situam na faixa de 50 a 95%, individualmente ou em combinação. Os extratos poderiam incluir levedura ou solúveis de fermentação de levedura secos que se situam na faixa de 5 a 50%. Os substratos de crescimento poderiam incluir: tripticase, que se situa na faixa de 5 a 25%; lactato de sódio, que se situa na faixa de 5 a 30%; e, Tween 80, que se situa na faixa de 1 a 5%. Os carboidratos poderiam incluir manitol, sorbitol, adonitol e arabitol. Os carboidratos se situam na faixa de 5 a 50% individualmente ou em combinação. Os microingre- dientes poderiam incluir os seguintes: carbonato de cálcio, que se situa na faixa de 0,5 a 5,0%; cloreto de cálcio, que se situa na faixa de 0,5 a 5,0%; fosfato dipotássico, que se situa na faixa de 0,5 a 5,0%; fosfato de cálcio, que se situa na faixa de 0,5 a 5,0%; proteinato de manganês, que se situa na faixa de 0,25 a 1,00%; e, manganês, que se situa na faixa de 0,25 a 1,0%.

[00103] O DFM que compreende uma ou mais cepas bacterianas e a pelo menos uma protease pode ser formulado em qualquer maneira adequada para garantir que a formulação compreenda DFMs viáveis e pelo menos uma protease ativa. Em uma modalidade, o DFM que compreende uma ou mais cepas bacterianas e pelo menos uma protease pode ser formulado como um líquido, um pó seco ou um grânulo.

[00104] O pó seco ou grânulos podem ser preparados por meios conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como em revestidor de leito fluidizado por aspersão superior, em um Wurster de aspersão inferior ou por granulação de tambor (por exemplo, granulação de alto cisalhamento), extrusão, revestimento em recipiente ou em um misturador de microingredientes.

[00105] Para algumas modalidades, o DFM e/ou a pelo menos uma protease pode ser revestida, por exemplo, encapsulada. Adequadamente, o DFM e a pelo menos uma protease podem ser formulados dentro do mesmo revestimento ou encapsulados dentro da mesma cápsula. Alternativamente, uma, duas, três ou quatro enzimas podem ser formuladas dentro do mesmo revestimento ou encapsuladas dentro da mesma cápsula e o DFM poderia ser formulado em um revestimento separado da uma ou mais dentre ou todas as enzimas.

[00106] Em algumas modalidades, como em que o DFM tem capacidade para produzir endósporos, o DFM pode ser fornecido sem qualquer revestimento. Em tais circunstâncias, os endósporos de DFM podem ser simplesmente misturados por adição com pelo menos uma protease. No último caso, a pelo menos uma protease pode ser revestida, por exemplo, encapsulada.

[00107] Em uma modalidade, o revestimento protege as enzimas, como a pelo menos uma protease, contra o calor e pode ser considerado um termoprotetor.

[00108] Em um outro aspecto, a composição de aditivo de alimentação é formulada a um pó seco ou grânulos conforme descrito no documento WO2007/044968 (denominados grânulos TPT) ou WO1997/016076 ou WO1992/012645 (cada um dos quais está incorporado ao presente documento a título de referência).

[00109] A composição de aditivo alimentar pode ser formulada em um grânulo que é, então, adicionado à alimentação, o grânulo compreende: um núcleo; um agente ativo; e pelo menos um revestimento, o agente ativo do grânulo que retém pelo menos 50% de atividade, pelo menos 60% de atividade, pelo menos 70% de atividade, pelo menos 80% de atividade após as condições selecionadas de um ou mais dentre a) um processo de peletização de alimentação, b) um processo de pré- tratamento de alimentação aquecida a vapor, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não peletizada e e) armazenamento como um ingrediente em uma mistura de base de alimentação ou uma pré-mistura de alimentação que compreende pelo menos um composto selecionado dentre minerais vestigiais, ácidos orgânicos, açúcares redutores, vitaminas, cloreto de colina e compostos que resultam em uma pré-mistura de alimentação ou mistura de base de alimentação ácida ou básica.

[00110] Em relação ao grânulo, pelo menos um revestimento pode compreender um material de hidratação por umidificação que constitui pelo menos 55% em p/p do grânulo; e/ou pelo menos um revestimento pode compreender dois revestimentos. Os dois revestimentos podem ser um revestimento de hidratação por umidificação e um revestimento de barreira de umidificação. Em algumas modalidades, o revestimento de hidratação por umidificação pode ser entre 25% e 60% em p/p do grânulo, e o revestimento de barreira de umidificação pode ser entre 2% e 15% em p/p do grânulo. O revestimento de hidratação por umidificação pode ser selecionado dentre sais inorgânicos, sacarose, amido e maltodextrina, e o revestimento de barreira de umidificação pode ser selecionado dentre polímeros, gomas, soro de leite e amido.

[00111] A alimentação que contém a composição de aditivo alimentar pode ser produzida com o uso de um processo de peletização de alimentação e o processo de pré-tratamento de alimentação pode ser conduzido entre 70 °C e 95 °C durante pelo menos 30 segundos até vários minutos a uma temperatura entre 85 °C e 95 °C.

[00112] A alimentação que contém a composição de aditivo alimentar pode ser produzida com o uso de um processo de peletização aquecido por vapor que pode ser conduzido entre 85 °C e 95 °C em qualquer parte de cerca de 30 segundos até vários minutos.

[00113] Em algumas modalidades, o DFM (por exemplo, endósporos de DFM, por exemplo) pode ser diluído com o uso de um diluente, como amido em pó, calcário ou similares.

[00114] Em uma modalidade, a composição está em uma formulação líquida adequada para consumo, de preferência, tal consumo de líquido contém um ou mais dos seguintes: um tampão, sal, sorbitol e/ou glicerol.

[00115] Em outra modalidade, a composição de aditivo alimentar pode ser formulada aplicando-se, por exemplo, aspergindo-se, a enzima (ou enzimas) em um substrato carreador, como trigo triturado, por exemplo.

[00116] Em uma modalidade, a composição de aditivo alimentar pode ser formulada como uma pré-mistura. A título de exemplo apenas, a pré-mistura pode compreender um ou mais componentes de alimentação, como um ou mais minerais e/ou uma ou mais vitaminas.

[00117] Em uma outra modalidade, o DFM que compreende uma ou mais cepas bacterianas e/ou a pelo menos uma protease pode ser formulado com pelo menos um carreador fisiologicamente aceitável selecionado a partir de pelo menos um dentre maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente de trigo, sacarose, amido, Na2SO4, Talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbato, glicerol, sacarose, propileno glicol, 1,3-propano diol, glicose, parabenos, cloreto de sódio, citrato, acetato, fosfato, cálcio, metabissulfito, formato e suas misturas.

[00118] Em uma modalidade, a composição de aditivo alimentar e/ou pré-mistura e/ou alimentação ou composição de ração é embalada.

[00119] Em uma modalidade preferencial, a composição de aditivo alimentar e/ou pré-mistura e/ou alimentação ou composição de ração é embalada em uma bolsa, como uma bolsa de papel.

[00120] Em uma modalidade alternativa, a composição de aditivo alimentar e/ou pré-mistura e/ou alimentação ou composição de ração pode ser vedada em um recipiente. Pode ser usado qualquer recipiente adequado.

[00121] A composição de aditivo alimentar, conforme descrito no presente documento, pode ser usada como - ou na preparação de - uma alimentação.

[00122] O termo "alimentação" é usado de forma intercambiável com o termo "composição de ração". Como usado aqui, o termo "composição de ração" se refere a um material alimentar ao qual uma ou mais composições de aditivo alimentar foram adicionadas.

[00123] A alimentação pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

[00124] Quando usada como alimentação, ou na preparação de uma alimentação, como alimentação funcional, a composição de aditivo alimentar descrita no presente documento pode ser usada em conjunto com um ou mais dentre: um carreador nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nutricionalmente ativo.

[00125] Em uma modalidade preferencial, a composição de aditivo alimentar pode ser misturada por adição com um componente de alimentação para formar uma composição de ração.

[00126] O termo "componente de alimentação" como usado aqui significa toda ou parte da composição de ração. Parte da composição de ração pode significar um constituinte da composição de ração ou mais do que um constituinte da composição de ração, por exemplo, 2, 3 ou 4. Em uma modalidade, o termo "componente de alimentação" engloba uma pré-mistura ou constituintes de pré-mistura.

[00127] Preferencialmente, a ração pode ser uma forragem, ou uma pré-mistura da mesma, uma alimentação de composto ou uma pré- mistura da mesma. Em uma modalidade, a composição de aditivo alimentar pode ser misturada por adição com uma alimentação de composto, um componente de alimentação de composto ou a uma pré- mistura de uma alimentação de composto ou a uma forragem, um componente de forragem ou uma pré-mistura de uma forragem.

[00128] O termo forragem como usado no presente documento significa qualquer alimento que seja fornecido a um animal (ao invés de o animal ter de forragear por si próprio). A forragem engloba plantas que foram cortadas.

[00129] O termo forragem inclui feno, palha, silagem, rações comprimidas e peletizadas, óleos e rações mistas e também grãos germinados e legumes.

[00130] A forragem pode ser obtida de uma ou mais plantas selecionadas dentre: alfafa (luzerna), cevada, cornichão, brássicas, couve-de-folha, couve, colza (canola), rutabaga (couve-nabo), nabo, trevo, trevo híbrido, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco, gramínea, gramínea falsa de aveia, festuca, gramínea Bermuda, bromus, gramínea do tipo heath, gramíneas de prado (de relvados de pastagem naturalmente mistos, dátilo, azevém, erva-dos-prados, milho (maís), painço, aveia, sorgo, sojas, árvores (brotos de árvores em talhadia de cabeça para feno), trigo e legumes.

[00131] O termo "alimentação de composto" significa uma alimentação comercial na forma de uma farinha, um pélete, nozes, bolo ou um farelo. As alimentações de composto podem ser mescladas a partir de várias matérias-primas e aditivos. Estas combinações são formuladas de acordo com os requisitos específicos do animal alvo.

[00132] As alimentações de composto podem ser alimentações completas que fornecem todos os nutrientes diários necessários, concentrados que fornecem uma parte da ração (proteína, energia) ou suplementos que fornecem apenas micronutrientes adicionais, como minerais e vitaminas.

[00133] Os principais ingredientes usados em alimentação de composto são os grãos de alimentação, que incluem milho, sojas, sorgo, aveias e cevada.

[00134] Adequadamente, uma pré-mistura denominada no presente documento pode ser uma composição composta de microingredientes, como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióticos, produtos de fermentação e outros ingredientes essenciais. As pré-misturas são normalmente composições adequadas para combinação em rações comerciais.

[00135] Qualquer composição de ração descrita no presente documento pode compreender um ou mais materiais alimentícios selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como maís ou sorgo; b) subprodutos de cereais, como farinha de milho com glúten, Solúveis de Grão Seco de Destilaria (DDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.

[00136] Adicionalmente, tal composição de ração pode conter pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em peso de farinha de milho e soja ou milho e soja com gordura total ou farinha de trigo ou farinha de girassol.

[00137] Adicional ou alternativamente, um composição de ração pode compreender pelo menos um material de alimentação rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de alimentação rico em fibras para fornecer uma composição de ração rica em fibras. Os exemplos de materiais de alimentação ricos em fibras incluem: trigo, cevada, centeio, aveias, subprodutos de cereais, como farinha de milho com glúten, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos. Algumas fontes de proteínas podem ser também consideradas como ricas em fibras: proteína obtida a partir de fontes tais como girassol, tremoço, feijões de fava e algodão.

[00138] Conforme descrito no presente documento, a alimentação pode ser um ou mais dentre os seguintes: uma pré-mistura e alimentação de composto, incluindo péletes, nozes ou bolo (gado); uma cultura ou resíduo de cultura: milho, soja, sorgo, aveia, cevada, restos culturais do milho, copra, palha, chaff, desperdício de beterraba-sacarina; farinha de peixe; grama recém-cortada e outras plantas de forragem; farinha de carne e ossos; melaços; bolo de óleo e bolo de bagaço; oligossacarí- deos; plantas de forragem conservadas: feno e silagem; alga marinha; sementes e grãos, inteiros ou preparados por esmagamento, moagem, etc.; grãos germinados e legumes; extrato de levedura.

[00139] O termo "alimentação", como usado aqui, também engloba, em algumas modalidades, alimento para animais de estimação. Um alimento para animais de estimação é material vegetal ou animal destinado ao consumo por animais de estimação, como alimento para cães ou alimento para gatos. O alimento para animais de estimação, como alimento para cães e gatos, pode estar em uma forma seca, como croquete para cães, ou forma enlatada úmida. O alimento para gatos pode conter o aminoácido taurina.

[00140] O termo alimentação também pode englobar, em algumas modalidades, alimento para peixes. Um alimento para peixes contém normalmente macronutrientes, elementos-traço e vitaminas necessários para manter o peixe cativo em boa saúde. O alimento para peixes pode estar na forma de um floco, pélete ou comprimido. As formas peletiza- das, algumas das quais se afundam rapidamente, são frequentemente usadas para peixe maior ou espécies que se alimentam do fundo. Alguns alimentos para peixes também contêm aditivos, como betacaroteno ou hormônios sexuais, para intensificar artificialmente a cor de peixe ornamental.

[00141] É também abrangido pelo termo "alimentação" o alimento para pássaros incluindo alimento que é usado tanto em alimentadores de pássaros como para alimentar pássaros de estimação. Tipicamente, o alimento para pássaros compreende uma variedade de sementes, mas pode também englobar sebo (gordura de bovino ou carneiro).

[00142] Como usado aqui, o termo "contato" se refere à aplicação indireta ou direta da composição de aditivo alimentar ao produto (por exemplo, a alimentação). Exemplos dos métodos de aplicação que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, tratamento do produto em um material que compreende a composição de aditivo alimentar, aplicação direta por mistura da composição de aditivo alimentar com o produto, pulverização da composição de aditivo alimentar na superfície do produto ou imersão do produto em uma preparação da composição de aditivo alimentar.

[00143] Essa composição de aditivo alimentar é, de preferência, misturada por adição com o produto (por exemplo, composição de ração). Alternativamente, a composição de aditivo alimentar pode ser incluída na emulsão ou ingredientes em bruto de um composição de ração.

[00144] Para algumas aplicações é importante que a composição seja tornada disponível na ou à superfície de um produto a ser afetado/tratado. Isso permite que a composição confira uma ou mais das seguintes características favoráveis: benefícios de desempenho.

[00145] As composições de aditivo alimentar podem ser aplicadas para intercalar, revestir e/ou impregnar um produto (por exemplo, composição de ração ou ingredientes em bruto de uma composição de ração) com uma quantidade controlada de DFM e enzimas.

[00146] O DFM que compreende pelo menos uma cepa bacteriana e pelo menos uma protease pode ser usado simultaneamente (por exemplo, quando são misturados por adição em conjunto ou mesmo quando são entregues por vias diferentes) ou sequencialmente (por exemplo, podem ser entregues por vias diferentes). Em uma modalidade, de preferência, o DFM e as enzimas são aplicados simultaneamente. De preferência, o DFM que compreende pelo menos uma cepa bacteriana e pelo menos uma protease são misturados por adição antes de serem entregues a uma composição de ração ou a um ingrediente em bruto de uma composição de ração.

[00147] O DFM que compreende pelo menos uma cepa bacteriana e pelo menos uma protease pode ser adicionado em concentrações adequadas, por exemplo, em concentrações no produto de alimentação final que oferecem uma dose diária entre cerca de 2x103 CFU/g de alimentação a cerca de 2x1011 CFU/g de alimentação, adequadamente entre cerca de 2x106 a cerca de 1x1010, adequadamente entre cerca de 3,75x107 CFU/g de alimentação a cerca de 1x1010 CFU/g de alimentação.

[00148] De preferência, a composição de aditivo alimentar será termicamente estável ao tratamento térmico até cerca de 70 °C; até cerca de 85°C ou até cerca de 95°C. O tratamento térmico pode ser realizado de cerca de 30 segundos até vários minutos. O termo termi- camente estável significa que pelo menos cerca de 50% dos componentes de enzima e/ou DFM que estavam presentes/ativos no aditivo antes do aquecimento até a temperatura especificada estão ainda presentes/ativos após resfriar até a temperatura ambiente. Em uma modalidade particularmente preferencial, a composição de aditivo alimentar é homogeneizada para produzir um pó.

[00149] Alternativamente, a composição de aditivo alimentar é formulada a grânulos conforme descrito no documento WO2007/044968 (denominados como grânulos TPT) incorporado ao presente documento a título de referência.

[00150] Em outra modalidade preferencial, quando a composição de aditivo alimentar é formulada em grânulos, os grânulos compreendem um sal de barreira hidratado revestido sobre o núcleo de proteína. A vantagem de tal revestimento de sal é termotolerância aperfeiçoada, estabilidade em armazenamento aperfeiçoada e proteção contra outros aditivos alimentares que de outro modo têm efeito adverso na pelo menos uma protease e/ou DFM que compreende uma ou mais cepas bacterianas. De preferência, o sal usado para o revestimento de sal tem uma atividade de água maior que 0,25 ou umidade constante maior que 60% a 20°C. De preferência, o revestimento de sal compreende um Na2SO4.

[00151] A alimentação que contém a composição de aditivo alimentar pode ser produzida com o uso de um processo de peletização de alimentação. Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um tratamento com vapor, ou estágio de condicionamento, antes da formação dos péletes. A mistura que compreende o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção de vapor. A mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura especificada, como de 60 a 100°C, temperaturas típicas seriam 70°C, 80°C, 85°C, 90°C ou 95°C. O tempo de permanência pode ser variável de segundos a minutos e mesmo horas. Como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minutos, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora.

[00152] Será entendido que a composição de aditivo alimentar, conforme revelado no presente documento, é adequada para adição a qualquer material alimentar apropriado.

[00153] Como usado aqui, o termo material de ração refere-se ao material de ração básico a ser consumido por um animal. Será adicionalmente entendido que isto pode compreender, por exemplo, pelo menos um ou mais grãos não processados e/ou material vegetal e/ou animal processado, tal como farinha de soja ou farinha de ossos.

[00154] Será entendido pela pessoa versada que diferentes animais requerem diferentes composições de alimentação, e até o mesmo animal pode requerer diferentes composições de alimentação, dependendo do propósito para o qual o animal é criado.

[00155] Preferencialmente, a composição de ração pode compreender materiais alimentares que compreendem milho ou maís, trigo, cevada, triticale, centeio, arroz, tapioca, sorgo e/ou qualquer um dos subprodutos, bem como componentes ricos em proteínas como farinha de soja, farinha de sementes de colza, farinha de canola, farinha de sementes de algodão, farinha de sementes de girassol, farinhas de subprodutos animais e misturas dos mesmos. Mais preferencialmente, a composição de ração compreende gorduras animais e/ou óleos vegetais.

[00156] Opcionalmente, a composição de ração pode também conter minerais adicionais, como, por exemplo, cálcio e/ou vitaminas adicionais. Preferencialmente, a composição de ração é uma mistura de farinha de milho e soja.

[00157] Em outro aspecto, é fornecido um método para produzir uma composição de ração. A composição de ração é tipicamente produzida em moinhos de alimentação nos quais as matérias-primas são em primeiro lugar trituradas até um tamanho de partículas adequado e depois misturadas com aditivos apropriados. A composição de ração pode ser depois produzida como um mingau ou péletes; em que os últimos envolvem tipicamente um método pelo qual a temperatura é aumentada até um nível alvo, e depois a alimentação é passada através de uma matriz para produzir péletes de um tamanho particular. Os péletes são deixados para resfriar. Subsequentemente podem ser adicionados aditivos líquidos como gordura e enzima. A produção de composição de ração pode também envolver uma etapa adicional que inclui extrusão ou expansão antes da peletização, em particular, por técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor.

[00158] A composição de ração pode ser uma composição de ração para um animal monogástrico, como aves domésticas (por exemplo, frango de corte, poedeiras, reprodutores de frangos de corte, peru, pato, ganso, galinha d'água), suíno (todas as categorias de idade), um animal de estimação (por exemplo, cães, gatos) ou peixe, preferencialmente a composição de ração é para aves domésticas.

[00159] Em uma modalidade, a composição de ração não é para uma poedeira.

[00160] A título de exemplo apenas, uma composição de ração para galinhas, por exemplo, galinhas de corte, pode compreender dentre um ou mais dos ingredientes listados na tabela abaixo, por exemplo, na % de idades dada na tabela abaixo:

[00161] A título de exemplo somente, a especificação da dieta para galinhas, tais como galinhas de corte, pode ser como definida na Tabela em baixo:

[00162] A título de exemplo somente, uma composição de ração para galinhas poedeiras pode compreender dentre um ou mais dos ingredientes listados na tabela em baixo, por exemplo, na % de idades dada na tabela em baixo:

[00163] A título de exemplo somente, a especificação da dieta para galinhas poedeiras pode ser como definida na Tabela em baixo:

[00164] A título de exemplo apenas, uma composição de ração para perus pode compreender de um ou mais dos ingredientes listados na tabela abaixo, por exemplo, na % de idades dada na tabela abaixo:

[00165] A título de exemplo somente, a especificação da dieta para perus pode ser como definida na Tabela em baixo:

[00166] A título de exemplo apenas, uma composição de ração para leitões pode compreender de um ou mais dos ingredientes listados na tabela abaixo, por exemplo, na % de idades dada na tabela abaixo:

[00167] A título de exemplo somente, a especificação da dieta para leitões pode ser como definida na Tabela em baixo:

[00168] A título de exemplo apenas, uma composição de ração para porcos produtores/finalizadores pode compreender de um ou mais dos ingredientes listados na tabela abaixo, por exemplo, na % de idades dada na tabela abaixo:

[00169] A título de exemplo somente, a especificação da dieta para leitões produtores/finalizadores pode ser como definida na Tabela em baixo:

[00170] A composição de aditivo alimentar descrita no presente documento e outros componentes e/ou a composição de ração que compreende os mesmos podem ser usados em qualquer forma adequada, como preparações sólidas ou líquidas ou alternativas das mesmas. Exemplos de preparações sólidas incluem pós, pastas, bolo alimentar, cápsulas, péletes, comprimidos, poeiras e grânulos que podem ser molháveis, secos por pulverização ou liofilizados. Exemplos de preparações líquidas incluem, porém sem limitação, soluções, suspensões e emulsões aquosas, orgânicas ou aquosas-orgânicas.

[00171] Em algumas aplicações, as composições de aditivo alimentar podem ser misturadas com a alimentação ou administradas na água potável. Em uma modalidade, a faixa de dosagem para a inclusão em água é de cerca de 1x103 CFU/animal/dia a cerca de 1x1010 CFU/animal/dia, e mais preferencialmente, cerca de 1x107 CFU/animal/ dia.

[00172] Exemplos adequados de formas incluem um ou mais de: pós, pastas, bolo alimentar, péletes, comprimidos, pílulas, grânulos, cápsulas, óvulos, soluções ou suspensões, que podem conter agentes aromatizantes ou corantes, para aplicações de liberação imediata, retardada, modificada, sustentada, pulsada ou controlada.

[00173] A título de exemplo, se a composição de aditivo alimentar descrita no presente documento for usada em uma forma sólida, por exemplo, pode também conter um ou mais dentre: excipientes como celulose microcristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina; desintegrantes como amido (preferencialmente amido de milho, batata ou tapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose sódica e certos silicatos complexos; ligantes de granulação como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelu- lose (HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia; agentes lubrificantes como estereato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talco podem estar incluídos.

[00174] Exemplos de carreadores nutricionalmente aceitáveis para uso na preparação das formas incluem, por exemplo, água, soluções de sal, álcool, silicone, ceras, vaselina, óleos vegetais, polietileno glicóis, propilenoglicol, lipossomos, açúcares, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, tensoativos, ácido silícico, parafina viscosa, óleo de perfume, monoglicerídeos e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos de petroetral, hidroximetil-celulose, polivinilpirrolidina e similares.

[00175] Os excipientes preferidos para as formas incluem lactose, amido, uma celulose, açúcar de leite ou polietileno glicóis de peso molecular alto.

[00176] Para suspensões e/ou elixires aquosos, a composição de aditivo alimentar pode ser combinada com vários agentes adoçantes ou aromatizantes, matéria corante ou corantes, com agentes emulsifican- tes e/ou de suspensão e com diluentes como água, propileno glicol e glicerina, e combinações dos mesmos.

[00177] O soro de leite não hidroscópico é muitas vezes usado como um carreador para DFMs (particularmente DFMs bacterianos) e é um bom meio para iniciar o crescimento.

[00178] As pastas que contêm DFM bacteriano podem ser formuladas com óleo vegetal e ingredientes de gelificação inertes.

[00179] Os produtos fúngicos podem ser formulados com subprodutos de grão como carreadores.

[00180] Em uma modalidade, de preferência, a composição de aditivo alimentar não é sob a forma de um sistema de micropartícula, como o sistema de micropartícula mostrado no documento sob o n° WO2005/123034.

[00181] O DFM e/ou composição de aditivo alimentar pode ser projetado para a dosagem de uma vez ou pode ser projetado para alimentação em uma base diária.

[00182] A quantidade ideal da composição de aditivo alimentar (e cada componente na mesma) a ser usada em combinação dependerá do produto a ser tratado e/ou do método de contato do produto com a composição e/ou do uso pretendido para a mesma.

[00183] A quantidade de DFM e enzimas usados nas composições deve ser uma quantidade suficiente para serem eficazes e para permanecerem suficientemente eficazes no aperfeiçoamento do desempenho dos produtos de alimentação para animais que contém a dita composição. Esse período de tempo para eficácia deve se estender até pelo menos o tempo de utilização do produto (por exemplo, composição de aditivo alimentar ou alimentação que contém a mesma).

[00184] Uma composição de aditivo alimentar, conforme descrito no presente documento, pode ser combinada com (ou um ou mais dos constituintes do mesmo) um outro componente que é adequado para o consumo animal e tem capacidade para fornecer um benefício fisiológico ou médico para o consumidor.

[00185] Em uma modalidade, de preferência, o "outro componente" não é uma enzima adicional ou um DFM adicional.

[00186] Os componentes podem ser prebióticos. Os prebióticos são tipicamente carboidrato não digestível (oligo ou polissacarídeos) ou um álcool de açúcar que não é degradado ou absorvido no trato digestivo superior. Os prebióticos conhecidos usados em produtos comerciais e úteis incluem inulina (fruto-oligossacarídeo ou FOS) e transgalato- oligossacarídeos (GOS ou TOS). Os prebióticos adequados incluem oligossacarídeo de palatinose, oligossacarídeo de soja, alginato, xantana, pectina, goma de alfarrobeira (LBG), inulina, goma guar, galato-oligossacarídeo (GOS), fruto-oligossacarídeo (FOS), amido não degradável, lactosacarose, lactulose, lactitol, maltitol, maltodextrina, polidextrose (isto é, Litesse®), lactitol, lactosacarose, oligossacarídeos de soja, palatinose, isomalto-oligossacarídeos, gluco-oligossacarídeos e xilo-oligossacarídeos, fragmentos de pectina, fibras dietéticas, mana- no-oligossacarídeos.

[00187] As fibras dietéticas podem incluir polissacarídeos não amídicos, como arabinoxilanos, celulose e muitos outros componentes de planta, como dextrinas resistentes, inulina, lignina, ceras, quitinas, pectinas, beta-glucanos e oligossacarídeos.

[00188] Em uma modalidade, é revelada no presente documento a combinação da composição de aditivo alimentar (ou um ou mais constituintes da mesma) com um prebiótico. O prebiótico pode ser administrado simultaneamente com (por exemplo, em mistura por adição juntamente com ou entregue simultaneamente por vias iguais ou diferentes) ou sequencialmente (por exemplo, por meio das vias iguais ou diferentes) à composição de aditivo alimentar (ou constituintes da mesma).

[00189] Outros componentes das combinações incluem polidextrose, como Litesse® e/ou uma maltodextrina e/ou lactitol. Esses outros componentes podem ser opcionalmente adicionados à composição de aditivo alimentar para assistir o processo de secagem e auxiliar na sobrevivência de DFM.

[00190] Os exemplos adicionais de outros componentes adequados incluem um ou mais de: espessantes, agentes gelificantes, emulsifi- cantes, aglutinantes, modificadores de cristal, adoçantes (incluindo adoçantes artificiais), modificadores de reologia, estabilizantes, antio- xidantes, corantes, enzimas, carreadores, veículos, excipientes, diluen- tes, agentes lubrificantes, agentes aromatizantes, matéria corante, agentes de suspensão, desintegrantes, aglutinantes de granulação, etc. Esses outros componentes podem ser naturais. Esses outros componentes podem ser preparados com o uso de técnicas químicas e/ou enzimáticas.

[00191] Em uma modalidade, o DFM que compreende pelo menos uma cepa bacteriana e/ou pelo menos uma protease pode ser encapsulado. Em uma modalidade, a composição de aditivo alimentar e/ou DFM e/ou enzimas é/são formulados como um pó seco ou grânulo, conforme descrito no documento WO2007/044968 (denominado como grânulos TPT) - referência incorporada ao presente documento a título de referência.

[00192] Em uma modalidade preferencial, o DFM que compreende pelo menos uma cepa bacteriana e/ou pelo menos uma protease pode ser usado em combinação com um ou mais lipídios.

[00193] Por exemplo, o DFM que compreende pelo menos uma cepa bacteriana e/ou pelo menos uma protease pode ser usado em combinação com uma ou mais micelas lipídicas. A micela lipídica pode ser uma micela lipídica simples ou uma micela lipídica complexa. A micela lipídica pode ser um agregado de moléculas orientadas de substâncias anfipáticas, como um lipídio e/ou um óleo.

[00194] Para uso no presente documento, o termo "espessante ou agente gelificante" se refere a um produto que impede a separação mediante a diminuição ou impedimento do movimento de partículas, gotículas de líquidos imiscíveis, ar ou sólidos insolúveis. O espessamento ocorre quando moléculas hidratadas individuais causam um aumento em viscosidade, desacelerando a separação. A gelificação ocorre quando as moléculas hidratadas se ligam para formar uma rede tridimensional que captura as partículas, imobilizando, assim, as mesmas.

[00195] O termo "estabilizante" como usado aqui é definido como um ingrediente ou combinação de ingredientes que impede um produto (por exemplo, um produto alimentar) de mudar ao longo do tempo.

[00196] O termo "emulsificante" como usado aqui se refere a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente alimentar) que previne a separação de emulsões. As emulsões são duas substâncias imiscíveis, uma presente em forma de gotículas, contidas uma dentro da outra. As emulsões podem consistir em óleo-em-água, onde a gotícula ou fase dispersa é óleo e a fase contínua é água; ou água-em-óleo, onde a água se torna a fase dispersa e a fase contínua é óleo. As espumas, que são gás-em-líquido, e suspensões, que são sólido-em-líquido, podem ser também estabilizadas através do uso de emulsificantes.

[00197] Como usado aqui, o termo "aglutinante" se refere a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente alimentar) que une o produto através de uma reação física ou química. Durante a "gelificação" por exemplo, água é absorvida, proporcionando um efeito de ligação. Entretanto, os aglutinantes podem absorver outros líquidos, como óleos, mantendo-os dentro do produto. Os aglutinantes seriam tipicamente usados em produtos sólidos ou com baixa umidade, por exemplo, produtos de padaria: bolos, doughnuts, pão e outros.

[00198] "Carreadores" ou "veículos" significam materiais adequados para administração do DFM e/ou enzimas e incluem qualquer tal material conhecido na técnica como, por exemplo, qualquer líquido, gel, solvente, diluente líquido, solubilizante ou similares, que é não tóxico e que não interage com quaisquer componentes da composição em um modo prejudicial.

[00199] Exemplos de excipientes incluem um ou mais de: celulose microcristalina e outras celuloses, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico, glicina, amido, açúcar do leite e polietileno glicóis com elevado peso molecular.

[00200] Exemplos de desintegrantes incluem um ou mais de: amido (preferencialmente amido de maís, batata ou tapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose sódica e certos silicatos complexos.

[00201] Exemplos de aglutinantes de granulação incluem um ou mais de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropil- celulose (HPC), sacarose, maltose, gelatina e acácia.

[00202] Exemplos de agentes lubrificantes incluem um ou mais de: estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talco.

[00203] Exemplos de diluentes incluem um ou mais de: água, etanol, propilenoglicol e glicerina, e combinações dos mesmos.

[00204] Os outros componentes podem ser usados simultaneamente (por exemplo, quando estão em mistura em conjunto ou mesmo quando são administrados por diferentes rotas) ou sequencialmente (por exemplo, podem ser entregues por rotas diferentes).

[00205] De preferência, quando a composição de aditivo alimentar é misturada por adição com um outro componente (ou componentes), o DFM que compreende pelo menos uma cepa bacteriana permanece viável.

[00206] Em uma modalidade, de preferência, a composição de aditivo alimentar não compreende cromo ou cromo orgânico.

[00207] Em uma modalidade, de preferência, o aditivo alimentar não contém glucanase.

[00208] Em uma outra modalidade, de preferência, o aditivo alimentar não contém ácido sórbico.

[00209] O DFM (ou DFMs) que compreende pelo menos uma cepa bacteriana pode ser sob a forma de concentrados. Tipicamente, esses concentrados compreendem uma concentração substancialmente alta de um DFM.

[00210] As composições de aditivo alimentar descritas no presente documento podem ter um teor de células viáveis (unidades de formação de colônia, CFUs) que se situa na faixa de pelo menos 103 CFU/g (adequadamente incluindo pelo menos 105 CFU/g, como pelo menos 106 CFU/g, por exemplo, pelo menos 107 CFU/g, pelo menos 108 CFU/g, por exemplo, pelo menos 109 CFU/g) a cerca de 1010 CFU/g (ou até cerca de 1011 CFU/g ou cerca de 1012 CFU/g).

[00211] Quando o DFM está sob a forma de um concentrado, as composições de aditivo alimentar podem ter um teor de células viáveis na faixa de pelo menos 109 CFU/g a cerca de 1012 CFU/g, de preferência, pelo menos 1010 CFU/g a cerca de 1012 CFU/g.

[00212] Os pós, grânulos e composições líquidas sob a forma de concentrados podem ser diluídos em água ou ressuspensos em água ou outros diluentes adequados, por exemplo, um meio de crescimento adequado como leite, óleos vegetais ou minerais, para gerar composições prontas para o uso.

[00213] A composição de aditivo alimentar pode ser sob a forma de concentrados que podem ser preparados de acordo com os métodos conhecidos na técnica. As composições de aditivo alimentar descritas no presente documento podem ser secas por atomização ou liofilizadas por métodos conhecidos na técnica.

[00214] Os processos típicos para fabricação de partículas com o uso de um processo de secagem por atomização envolvem um material sólido que é dissolvido em um solvente adequado (por exemplo, uma cultura de um DFM em um meio de fermentação). Alternativamente, o material pode ser suspenso ou emulsificado em um não solvente para formar uma suspensão ou emulsão. Outros ingredientes (conforme discutido acima) ou componentes como agentes antimicrobianos, agentes estabilizantes, corantes e agentes que assistem o processo de secagem podem ser opcionalmente adicionados nesse estágio.

[00215] A solução é, então, atomizada para formar uma névoa fina de gotículas. As gotículas entram imediatamente em uma câmara de secagem onde entram em contato com um gás de secagem. O solvente é evaporado das gotículas no gás de secagem para solidificar as gotículas, formando assim partículas. As partículas são, então, separadas do gás de secagem e coletadas.

[00216] O termo "indivíduo", como usado aqui, significa um animal que deve ser ou foi administrado com uma composição de aditivo alimentar ou uma composição de ração que compreende a dita composição de aditivo alimentar.

[00217] O termo "indivíduo", para uso no presente documento, significa um animal. De preferência, o indivíduo é um mamífero, pássaro, peixe ou crustáceo incluindo, por exemplo, gado ou um animal domesticado (por exemplo, animal doméstico).

[00218] Em uma modalidade, o indivíduo pode ser provocado por um patógeno entérico.

[00219] A título de exemplo, um indivíduo pode ter um ou mais patógenos entéricos presentes em seu intestino ou trato digestivo. Por exemplo, um indivíduo pode ter um ou mais patógenos entéricos em seu intestino ou trato digestivo em um nível que: i) resulta em perda de desempenho do animal; e/ou ii) está em níveis clinicamente relevantes; ou iii) está em níveis subclínicos.

[00220] O patógeno entérico pode ser Clostridium perfringens, por exemplo.

[00221] Como usado aqui, o "desempenho do animal" pode ser determinado pela eficiência alimentar e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão alimentar e/ou pela digestibilidade de um nutriente em uma alimentação (por exemplo, digestibilidade de aminoácidos) e/ou energia digestível ou energia metabolizável em uma alimentação e/ou por retenção de nitrogênio e/ou pela capacidade de animais de evitar os efeitos negativos da enterite necrótica e/ou pela resposta imunológica do sujeito.

[00222] De preferência, o "desempenho do animal" é determinado pela eficiência da alimentação e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão alimentar.

[00223] Por "desempenho do animal aperfeiçoado" se entende que existe eficiência alimentar aumentada e/ou ganho de peso aumentado e/ou razão de conversão alimentar reduzida e/ou digestibilidade aperfeiçoada de nutrientes ou energia em uma alimentação e/ou por retenção de nitrogênio aperfeiçoada e/ou por capacidade aperfeiçoada para evitar os efeitos negativos de enterite necrótica e/ou por uma resposta imunológica aperfeiçoada no indivíduo que resulta do uso da composição de aditivo alimentar na alimentação, em comparação com a alimentação que não compreende a dita composição de aditivo alimentar.

[00224] De preferência, por "desempenho do animal aperfeiçoado" se entende que existe uma eficiência alimentar aumentada e/ou ganho de peso aumentado e/ou razão de conversão da alimentação reduzida.

[00225] Como usado aqui, o termo "eficiência alimentar" se refere à quantidade de ganho de peso em um animal que ocorre quando o animal é alimentado ad-libitum ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo.

[00226] Por "eficiência alimentar aumentada" se entende que o uso de uma composição de aditivo alimentar em alimentação resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de ingestão de alimentação em comparação com um animal alimentado sem a dita composição de aditivo alimentar estar presente.

[00227] Como usado aqui, o termo "razão de conversão alimentar" se refere à quantidade de alimentação alimentada a um animal para aumentar o peso do animal por uma quantidade especificada.

[00228] Uma razão de conversão alimentar aperfeiçoada significa uma razão de conversão alimentar mais baixa.

[00229] Por "razão de conversão alimentar mais baixa" ou "razão de conversão alimentar aperfeiçoada" se entende que o uso de uma composição de aditivo alimentar em alimentação resulta em uma quantidade de alimentação mais baixa que é necessária para ser alimentada a um animal para aumentar o peso do animal por uma quantidade especificada em comparação com a quantidade de alimentação necessária para aumentar o peso do animal pela mesma quantidade quando a alimentação não compreende a dita composição de aditivo alimentar.

[00230] A digestibilidade de nutrientes, como usado aqui, significa a fração de um nutriente que desaparece do trato gastrointestinal ou um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o intestino delgado. A digestibilidade de nutrientes pode ser medida como a diferença entre o que é administrado ao sujeito e o que sai nas fezes do sujeito, ou entre o que é administrado ao sujeito e o que permanece no digerido em um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o íleo.

[00231] A digestibilidade de nutrientes como usada aqui pode ser medida pela diferença entre a ingestão de um nutriente e o nutriente excretado por meio da coleta total de excreções durante um período de tempo; ou com o uso de um marcador inerte que não seja absorvido pelo animal, e permite que o investigador calcule a quantidade de nutriente que desapareceu no trato gastrointestinal inteiro ou um segmento do trato gastrointestinal. Um tal marcador inerte pode ser dióxido de titânio, óxido crômico ou cinza insolúvel em ácido. A digestibilidade pode ser expressa como uma porcentagem do nutriente na alimentação, ou como unidades de massa de nutriente digestível por unidades de massa na alimentação.

[00232] A digestibilidade de nutrientes, como usado aqui, engloba a digestibilidade de amido, digestibilidade de gordura, digestibilidade de proteína e digestibilidade de aminoácidos.

[00233] A digestibilidade de energia, como usado aqui, significa a energia bruta da alimentação consumida menos a energia bruta das fezes ou a energia bruta da alimentação consumida menos a energia bruta do digerido restante em um segmento especificado do trato gastrointestinal do animal, por exemplo, o íleo.

[00234] Energia metabolizável, como usado aqui, se refere à energia metabolizável aparente e significa a energia bruta da alimentação consumida menos a energia bruta contida nas fezes, urina, e produtos gasosos da digestão. A digestibilidade de energia e energia metabo- lizável pode ser medida como a diferença entre a ingestão de energia bruta e a energia bruta excretada nas fezes ou no digerido presente em segmento especificado do trato gastrointestinal usando os mesmos métodos para medir a digestibilidade de nutrientes, com correções apropriadas para excreção de nitrogênio para se calcular a energia metabolizável da alimentação. Em algumas modalidades, as composições de aditivo alimentar podem aperfeiçoar a digestibilidade ou utilização de fibra ou hemicelulose dietética em um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um porco.

[00235] Retenção de nitrogênio, como usado aqui, significa a capacidade de um indivíduo para reter nitrogênio a partir da dieta como massa corporal. Ocorre um equilíbrio de nitrogênio negativo quando a excreção de nitrogênio excede a ingestão diária e é frequentemente visto quando o músculo está sendo perdido. Um equilíbrio de nitrogênio positivo está frequentemente associado ao crescimento dos músculos, particularmente em animais em crescimento. A retenção de nitrogênio pode ser medida como a diferença entre a ingestão de nitrogênio e o nitrogênio excretado por meio da coleta total de excreções e urina durante um período de tempo. É entendido que o nitrogênio excretado inclui proteína não digerida da alimentação, secreções proteicas endógenas, proteína microbiana, e nitrogênio urinário.

[00236] O termo "sobrevivência", como usado aqui, significa o número de indivíduos que permanecem vivos. O termo "sobrevivência aperfeiçoada" pode ser uma outra maneira de dizer "mortalidade reduzida".

[00237] O termo "rendimento da carcaça", como usado aqui, significa a quantidade de carcaça como uma proporção do peso corporal vivo, após um processo de abate comercial ou experimental. O termo carcaça significa o corpo de um animal que foi abatido para alimento, com a cabeça, entranhas, parte dos membros, e penas ou pele removidos. O termo "rendimento da carne" como usado aqui significa a quantidade de carne comestível como uma porção do peso corporal vivo, ou a quantidade de uma carne especificada cortada como uma proporção do peso corporal vivo.

[00238] A presente modalidade fornece adicionalmente um método para aumentar o ganho de peso em um indivíduo, por exemplo, aves domésticas ou suínos, que compreende alimentar o dito indivíduo com uma composição de ração que compreende uma composição de aditivo alimentar.

[00239] Um "ganho de peso aumentado" se refere a um animal que tem peso corporal aumentado ao ser alimentado com a alimentação que compreende uma composição de aditivo alimentar, em comparação com um animal que é alimentado com uma alimentação sem a dita composição de aditivo alimentar estar presente.

[00240] A resposta imunológica, conforme usado na presente invenção, se refere a uma dentre as múltiplas formas em que os DFMs modulam o sistema imunológico de animais, incluindo produção de anticorpos aumentada, regulação crescente de imunidade mediada por célula, regulação crescente de citocinas pró-inflamatórias e sinalização de receptor semelhante a toll aumentada. Compreende-se que a imunoestimulação do trato gastrointestinal por DFMs pode ser vantajosa para proteger o hospedeiro contra doença, e que a imunossupressão do trato gastrointestinal pode ser vantajosa para o hospedeiro devido ao fato de que são usados menos nutrientes e energia para suportar a função imune.

[00241] De preferência, a resposta imunológica é uma resposta imunológica celular que pode ser medida examinando-se marcadores imunes. Em um outro aspecto, as populações de patógenos no trato gastrointestinal de um indivíduo podem ser reduzidas.

[00242] Em uma modalidade, a redução de excreção de nutrientes em estrume, ou a redução da produção de amônia em estrume pode ser obtida. Isso tem efeitos positivos na redução de riscos ambientais. Por exemplo, em uma modalidade preferencial é revelado um método para reduzir o teor de nitrogênio e/ou fósforo no estrume do indivíduo. Isso, portanto, reduz a quantidade de nitrogênio e/ou fósforo no ambiente, o qual pode ser benéfico. Para algumas aplicações, acredita-se que o DFM que compreende pelo menos uma cepa bacteriana na composição de aditivo alimentar descrita no presente documento possa exercer um efeito de cultura probiótica. Também é possível adicionar a essa composição de aditivo alimentar probióticos e/ou prebióticos adicionais.

[00243] Os exemplos não limitantes das composições e métodos revelados no presente documento incluem: 1. Uma composição de aditivo alimentar que consiste essencialmente em um micro-organismo de alimentação direta que compreende uma ou mais cepas bacterianas em combinação com pelo menos uma protease. 2. Uma composição de aditivo alimentar, de acordo com a modalidade 1, em que o micro-organismo de alimentação direta é um micro-organismo de alimentação direta antipatógeno. 3. A composição de aditivo alimentar da modalidade 1 ou 2, em que o micro-organismo de alimentação direta compreende pelo menos três cepas bacterianas selecionadas dentre o grupo que consiste em: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera e combinações dos mesmos. 4. A composição de aditivo alimentar da modalidade 3, em que o micro-organismo de alimentação direta compreende pelo menos três cepas bacterianas selecionadas dentre o grupo que consiste em: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus amy- loliquefaciens, Enterococcus, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rham-nosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp e combinações dos mesmos. 5. A composição de aditivo alimentar de qualquer uma das modalidades 1, 2 ou 4, em que o micro-organismo de alimentação direta compreende cepas de Bacillus subtilis 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B-50508) e 1013 (NRRL B-50509). 6. A composição de aditivo alimentar das modalidades 1, 2 ou 4, em que o micro-organismo de alimentação direta é sob a forma de um endósporo. 7. A composição de aditivo alimentar da modalidade 5, em que o micro-organismo de alimentação direta é sob a forma de um endósporo. 8. A composição de aditivo alimentar das modalidades 1, 2, 4 ou 7, em que a protease é uma subtilisina, uma bacilolisina, uma serina protease alcalina, uma queratinase ou uma protease de Nocardiopsis. 9. A composição de aditivo alimentar da modalidade 6, em que a protease é uma subtilisina, uma bacilolisina, uma serina protease alcalina, uma queratinase ou uma protease de Nocardiopsis. 10. A composição de aditivo alimentar, de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2, 4 ou 7, em que a protease é uma subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. 11. A composição de aditivo alimentar da modalidade 6, em que a protease é uma subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. 12. A composição de aditivo alimentar, de acordo com qualquer uma das modalidades 1, 2, 4 ou 7, em que a protease está presente em uma dosagem de 1.000 PU/g de composição de aditivo alimentar a 200.000 PU/g de composição de aditivo alimentar. 13. A composição de aditivo alimentar da modalidade 6, em que a protease está presente em uma dosagem de 1.000 PU/g de composição de aditivo alimentar a 200.000 PU/g de composição de aditivo alimentar. 14. A composição de aditivo alimentar de qualquer uma das modalidades 1, 2, 4 ou 7, em que o DFM está presente em uma dosagem de 1x103 CFU/g de composição de aditivo alimentar a 1x1013 CFU/g de composição de aditivo alimentar. 15. A composição de aditivo alimentar da modalidade 6, em que o DFM está presente em uma dosagem de 1x103 CFU/g de composição de aditivo alimentar a 1x1013 CFU/g de composição de aditivo alimentar. 16. Um método para aperfeiçoar o desempenho de um indivíduo, para aperfeiçoar a digestibilidade de uma matéria-prima em uma alimentação (por exemplo, digestibilidade de nutriente, como digestibilidade de aminoácido), para aperfeiçoar a retenção de nitrogênio, para aperfeiçoar a resistência de indivíduos à enterite necrótica, para aperfeiçoar a taxa de conversão alimentar (FCR), para aumentar o rendimento de carne ou carcaça, para aperfeiçoar o ganho de peso corporal em um indivíduo, para aperfeiçoar a eficiência alimentar em um indivíduo, para modular (por exemplo, aperfeiçoar) a resposta imu- nológica do indivíduo, para promover o crescimento de bactérias benéficas no trato gastrointestinal de um indivíduo, para reduzir populações de bactérias patogênicas no trato gastrointestinal de um indivíduo, para reduzir a excreção de nutrientes em estrume, para reduzir a produção de amônia em estrume ou para aperfeiçoar a digestibilidade ou utilização de fibra ou hemicelulose dietética, tal método que compreende administrar um micro-organismo de alimen-tação direta que compreende uma ou mais cepas bacterianas em combinação com pelo menos uma protease. 17. Um kit que compreende a composição de aditivo alimentar da modalidade 1 e instruções para administração. 18. Um método para preparar uma composição de aditivo alimentar que compreende misturar por adição um micro-organismo de alimentação direta que compreende uma ou mais cepas bacterianas em combinação com pelo menos uma protease e embalar. 19. Uma composição alimentar que compreende a composição de aditivo alimentar das modalidades 1, 2, 4 ou 7. 20. Uma composição alimentar que compreende a composição de aditivo alimentar da modalidade 6. 21. Uma pré-mistura que compreende a composição de aditivo alimentar da modalidade 1 e pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina.

EXEMPLOS

[00244] A menos que definido de outro modo no presente documento, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual esta divulgação pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2a Edição, John Wiley e Sons, Nova York (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionam a uma pessoa versada na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta descrição.

[00245] A descrição é adicionalmente definida nos Exemplos a seguir. Deve-se compreender que os Exemplos, embora indicando certas modalidades, são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão acima e dos Exemplos, uma pessoa versada na técnica pode determinar características essenciais desta descrição e, sem se afastar do espírito e do escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações para adaptar a mesma para vários usos e condições.

Exemplo 1 Efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado isoladamente ou em combinação no desempenho de crescimento e digestibilidade de trato total de nutrientes em porcos alimentados com dietas à base de milho MATERIAIS E MÉTODOS ALOJAMENTO E AMBIENTE

[00246] O uso de animais e protocolo experimental é aprovado pelo Comitê de Experimentação Animal. A dieta basal, na matéria natural, é formulada para ser equilibrada quanto à energia e proteína, e para atender ou exceder os requisitos de nutriente para o crescimento de porcos dessa idade (Tabela 1) conforme recomendado pelo NRC (2012). Um marcador de digestibilidade comum (óxido crômico) é incluído em 0,30% para permitir a determinação da digestibilidade de componentes dietéticos.

[00247] A dieta basal é dividida em porções que são, então, tratadas com as enzimas ou micro-organismos de alimentação direta (DFMs) ou uma combinação de ambos, conforme identificado na Tabela 2. Durante a mistura da alimentação, o misturador é lavado para impedir contaminação cruzada da dieta. As amostras são coletadas a partir de cada dieta de tratamento do início, meio e fim de cada batelada e mescladas em conjunto para confirmar as atividades enzimáticas e contagens de DFM na alimentação. As amostras a partir de cada dieta de tratamento são retidas durante a mistura e armazenadas a -20°C até quando necessário. Tabela 1: Exemplos de composição de dieta basal para porcos com 20 a 50 kg de peso corporal (%, na matéria natural) Itens Dieta Basal Ingredientes, % Milho 42,33 Grãos secos de destiladores com solúveis 20,00 Farinha de soja 19,88 Farinha de Colza 2,00 Trigo 5,00 Farelo de arroz 3,00 Sebo 2,00 Melaços 3,00 L-Lisina HCl 0,24 Itens Dieta Basal DL-metionina 0,02 Sal 0,30 Calcário 1,18 Fosfato de dicálcio 0,45 Pré-mistura de vitaminas e mineral Óxido crômico 0,30 0,30 Total Composição calculada Matéria seca, % 100,00 87,55 Proteína em Bruto, % 19,24 Energia digestível, MJ/kg Lisina digestível ileal padronizada, % Metionina digestível ileal padronizada, % Metionina e cisteína digestíveis ileais padronizadas, % Treonina digestível ileal padronizada, % Triptofano digestível ileal padronizado, % Fibra de detergente neutro, % Fibra de detergente ácido, % Cálcio, % 14,61 0,91 0,30 0,55 0,54 0,16 17,59 5,97 0,72 Fósforo digestível, % Composição analisada Matéria seca, % 0,33 88,23 Proteína em Bruto, % 19,56 Fibra de detergente neutro, % Fibra de detergente ácido, % 17,16 5,75 d-cálcio), 20 mg. 2Fornecido por quilograma de dieta: Cu (como CuSO4^5H2O), 19 mg; Fe (como FeSO4^7H2O), 70 mg; Zn (como ZnSO4), 50 mg; Mn (como MnO2), 50 mg; I (como KI), 0,5 mg; Co (como CoSO4^7H2O), 0,3 mg; e Se (como Na2SeO3^5H2O), 0,2 mg. 3O ME da dieta foi calculado de acordo com NRC (2012). Tabela 2: Identificação de dietas experimentais

1 3 cepas de Bacillus: cepas de Bacillus 3BP5, 918 e 1013 2Protease: protease de Bacillus amyloliquefaciens P3000

[00248] O experimento é planejado e conduzido para corresponder à fase de crescimento (≤25 a ~60 kg de peso corporal).

PROJETO EXPERIMENTAL

[00249] Um total de 96 porcos em crescimento [(Yorkshire × Landrace) × Duroc] com um BW médio de 22,6 ± 1,9 kg são usados no experimento de 42 dias. Os porcos são aleatoriamente alocados para 4 dietas de experimento de acordo com seu BW inicial. Existem 8 cercados idênticos por tratamento com 3 porcos por cercado. Os porcos castrados e marrãs são separados com quatro cercados de porcos castrados e quatro cercados de marrãs em cada tratamento. Todos os porcos são alojados em uma sala com controle ambiental. Cada cercado é equipado com um auto-alimentador de aço inoxidável unilateral e um bebedouro tipo chupeta com os porcos tendo acesso permitido à alimentação e água ad libitum.

ANÁLISE E COLETA DE AMOSTRA FECAL E DESEMPENHO DE CRESCIMENTO

[00250] O peso corporal e consumo de alimento são medidos semanalmente para monitorar o ganho diário médio (ADG), ingestão alimentar diária média (ADFI) e razão de conversão alimentar (FCR). A digestibilidade de trato total aparente (ATTD, %) de GE e N é determinada mediante a adição de óxido crômico (0,3%) como um indicador inerte na dieta. Os porcos são alimentados com dietas misturadas com óxido crômico uma semana antes do final do teste (dia 35). As amostras rápidas fecais frescas são coletadas de pelo menos 2 porcos por cercado por meio de massagem retal (dia 40, 41 e 42) e armazenadas em um congelador a -20°C até a análise. Antes da análise química, as amostras fecais são descongeladas e secas a 60 °C durante 72 h, depois disso, são finamente trituradas a um tamanho que poderia passar através de uma peneira de 1 mm. Todas as amostras fecais e alimentares são, então, analisadas acerca de matéria seca, energia bruta, nitrogênio, fibra de detergente ácido (FDA) e fibra de detergente neutro (FDN) seguindo os procedimentos resumidos pelo AOAC (2000). O cromo é analisado através de espectrofotometria de absorção de UV (Shimadzu, UV-1201, Shimadzu, Kyoto, Japão) seguindo o método descrito por Williams et al. (1962). A digestibilidade de trato total aparente de proteína bruta é calculada multiplicando-se nitrogênio por um fator de conversão de 6,25. Os aperfeiçoamentos em energia digestível (kcal) com a adição de cada aditivo alimentar em comparação com o controle negativo foram calculados pelas seguintes equações; 1. GE dietética analisada (kcal/kg)/100 * ATTD de energia = Energia digestível na matéria natural (kcal/kg) 2. Aperfeiçoamento de energia digestível (kcal/kg) = energia digestível média na matéria natural (kcal/kg) de grupo NC - energia digestível média na matéria natural (kcal/kg) de réplica de DFM+protease

[00251] Todos os dados foram submetidos à análise estatística como um projeto de bloco completo randomizado com o uso dos procedimentos mistos de SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC), e o cercado foi usado como a unidade experimental. O BW inicial foi usado como uma covariante para ADFI e ADG. A significância é incorporada em P<0,05.

[00252] Desempenho de crescimento: A suplementação de uma dieta à base de milho com uma combinação de um DFM (Bacillus) e protease aperfeiçoa significativamente o ganho diário médio e a razão de eficiência de conversão alimentar (P<0,05) em comparação com a dieta basal de controle negativo sem quaisquer aditivos alimentares (Figura 1). A adição de DFM (Bacillus) e protease isoladamente a dietas à base de milho não aperfeiçoou significativamente o ganho diário médio ou razão de eficiência de conversão alimentar em comparação com a dieta de controle negativo.

[00253] Digestibilidade de trato total aparente de nutrientes: A digestibilidade de trato total aparente de matéria seca, nitrogênio, energia digestível, fibra de detergente ácido e fibra de detergente neutro são todos significativamente aperfeiçoados com a suplementação do DFM em combinação com a protease em comparação com a dieta de controle negativo (Tabela 3; P<0,05). Esse aperfeiçoamento em diges- tibilidade de nutriente como resultado da alimentação da combinação de DFM + protease se equiparou a 3% para nitrogênio, 9% para FDA e 3,5% para FDN em comparação com a dieta de controle negativo. Entretanto, quando suplementada isoladamente, não há diferença em digestibilidade de trato total aparente de matéria seca, nitrogênio, energia digestível, fibra de detergente ácido e fibra de detergente neutro entre a dieta de controle negativo e os tratamentos de DFM ou protease. A combinação de DFM e protease aumentou a energia digestível da dieta em 56,8 kcal/kg em comparação com a dieta de controle negativo (P<0,05), enquanto que os aditivos quando adicionados isoladamente reduziram a digestibilidade de energia da dieta. Tabela 3. Efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease (P3000) quando alimentado isoladamente ou em combinação na digestibilidade de trato total aparente de nutrientes

a,b,cMédia na mesma fileira com sobrescritos diferentes se difere (P<0,05) nutrientes e excreção de amônia fecal em porcos alimentados com dietas à base de milho

MATERIAIS E MÉTODOS ALOJAMENTO E AMBIENTE

[00254] O uso de animais e protocolo experimental é aprovado pelo Comitê de Experimentação Animal. A dieta basal, na matéria natural, é formulada para ser equilibrada quanto à energia e proteína, e para atender ou exceder os requisitos de nutriente para o crescimento de porcos dessa idade (Tabela 2.1) conforme recomendado pelo NRC (2012). Um marcador de digestibilidade comum (óxido crômico) é incluído em 3 g/kg para permitir a determinação da digestibilidade de componentes dietéticos.

[00255] A dieta basal é dividida em porções que são, então, tratadas com as enzimas ou micro-organismos de alimentação direta (DFMs) ou uma combinação de ambos, conforme identificado na Tabela 2.2. Durante a mistura da alimentação, o misturador é lavado para impedir contaminação cruzada da dieta. As amostras são coletadas a partir de cada dieta de tratamento do início, meio e fim de cada batelada e mescladas em conjunto para confirmar as atividades enzimáticas e contagens de DFM na alimentação. As amostras a partir de cada dieta de tratamento são retidas durante a mistura e armazenadas a -20°C até quando necessário. Tabela 2.1: Exemplos de composição de dieta basal para porcos com 20 a 50 kg de peso corporal (%, na matéria natural)

Tabela 2.1: Exemplos de composição de dieta basal para porcos com 20 a 50 kg de peso corporal (%, na matéria natural)

1Fornecidas por quilograma de dieta: vitamina A, 10.000 IU; vitamina D3, 1.300 IU; vitamina E, 40 IU; vitamina K (complexo de bissulfato de menadiona), 3,0 mg; vitamina B2, 5,2 mg; vitamina B6, 2,6 mg; vitamina B12, 26 μg; niacina, 32 mg; e ácido d-pantotênico (como pantotenato de d-cálcio), 20 mg. 2Fornecido por quilograma de dieta: Cu (como CuSO4^5H2O), 19 mg; Fe (como FeSO4^7H2O), 70 mg; Zn (como ZnSO4), 50 mg; Mn (como MnO2), 50 mg; I (como KI), 0,5 mg; Co (como CoSO4^7H2O), 0,3 mg; e Se (como Na2SeOa^5H2O), 0,2 mg. 3Fitase suplementar (Danisco UK Ltd) Tabela 2.2. Identificação de dietas experimentais

1 3 cepas de Bacillus: cepas de Bacillus 3BP5, 918 e 1013 2Protease: protease de Bacillus amyloliquefaciens P3000

[00256] O experimento é planejado e conduzido para corresponder à fase de crescimento (≤25 a ~60 kg de peso corporal). PROJETO EXPERIMENTAL

[00257] Um total de 128 porcos em crescimento [(Yorkshire × Landrace) × Duroc] com um BW médio de 24,99 ± 1,84 kg são usados no experimento de 42 dias. Os porcos são aleatoriamente alocados para 4 dietas de experimento de acordo com seu BW inicial. Existem 8 cercados idênticos por tratamento com 4 porcos por cercado. Os porcos castrados e marrãs são separados com quatro cercados de porcos castrados e quatro cercados de marrãs em cada tratamento. Todos os porcos são alojados em uma sala com controle ambiental. Cada cercado é equipado com um auto-alimentador de aço inoxidável unilateral e um bebedouro tipo chupeta com os porcos tendo acesso permitido à alimentação e água ad libitum.

ANÁLISE E COLETA DE AMOSTRA FECAL E DESEMPENHO DE CRESCIMENTO

[00258] O peso corporal e consumo de alimento são medidos semanalmente para monitorar o ganho diário médio (ADG), ingestão alimentar diária média (ADFI) e razão de conversão alimentar (FCR). A digestibilidade de trato total aparente (ATTD) de GE e N é determinada mediante a adição de óxido crômico (0,3%) como um indicador inerte na dieta. Os porcos são alimentados com dietas misturadas com óxido crômico ao longo do teste. As amostras rápidas fecais frescas são coletadas de pelo menos 2 porcos por cercado por meio de massagem retal (dia 21 e 42) e armazenadas em um congelador a -20°C até a análise. Antes da análise química, as amostras fecais são descongeladas e secas a 60°C durante 72 h, depois disso, são finamente trituradas a um tamanho que poderia passar através de uma peneira de 1 mm. Todas as amostras fecais e alimentares são, então, analisadas acerca de matéria seca, energia bruta, nitrogênio, fibra de detergente ácido (FDA) e fibra de detergente neutro (FDN) seguindo os procedimentos resumidos pelo AOAC (2000). O cromo é analisado através de espectrofotometria de absorção de UV (Shimadzu, UV-1201, Shimadzu, Kyoto, Japão) seguindo o método descrito por Williams et al. (1962). A digestibilidade de trato total aparente de proteína bruta foi calculada multiplicando-se nitrogênio por um fator de conversão de 6,25. Os aperfeiçoamentos em energia digestível (kcal) com a adição de cada aditivo alimentar em comparação com o controle negativo foram calculados pelas seguintes equações; 1. GE dietética analisada (kcal/kg)/100 * ATTD de energia = Energia digestível na matéria natural (kcal/kg) 2. Aperfeiçoamento de energia digestível (kcal/kg) = energia digestível média na matéria natural (kcal/kg) de grupo NC - energia digestível média na matéria natural (kcal/kg) de réplica de DFM+protea- se

EMISSÃO DE AMÔNIA FECAL

[00259] Para análise da concentração de NH3 fecal, 300 g de amostras fecais frescas são coletadas de pelo menos dois porcos por cercado e são transferidas para uma caixa vedada e fermentadas em um incubador (35 °C). A concentração de NH3 é então analisada com o uso de uma sonda de pesquisa de gás (Gastec Corp., Kanagawa, Japão) no dita 7.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[00260] Todos os dados foram submetidos à análise estatística como um projeto de bloco completo randomizado com o uso dos procedimentos mistos de SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC), e o cercado foi usado como a unidade experimental. O BW inicial foi usado como uma covariante para ADFI e ADG. A significância é incorporada em P<0,05. RESULTADOS

[00261] Desempenho de crescimento: A suplementação de uma dieta à base de milho com uma combinação de um DFM (Bacillus) e protease aperfeiçoa significativamente o ganho diário médio e a razão de eficiência de conversão alimentar (P<0,05) em comparação com a dieta basal de controle negativo sem quaisquer aditivos alimentares (Figura 2). A adição de DFM (Bacillus) e protease isoladamente a dietas à base de milho também aperfeiçoa o ganho diário médio e a razão de eficiência de conversão alimentar (P<0,05) em comparação com a dieta de controle negativo, entretanto; a magnitude do aperfeiçoamento foi menor que observado para a combinação da protease + DFM.

[00262] Digestibilidade de trato total aparente de nutrientes: Tanto no dia 21 como 42, a digestibilidade de trato total aparente de matéria seca e proteína bruta é aperfeiçoada com a suplementação do DFM em combinação com a protease, em comparação com a dieta de controle negativo (Tabela 2.3; P<0,05). Esse aperfeiçoamento em digestibilidade de nutriente como resultado da alimentação da combinação de DFM + protease se equiparou a 5% para matéria seca, 5% para nitrogênio e 2% tanto para FDN como para FDA, em comparação com a dieta de controle negativo no dia 21 e 5% para matéria seca, 6% para nitrogênio, 6% para FDA e 2% para FDN em comparação com a dieta de controle negativo no dia 42. Entretanto, quando suplementado isoladamente, não há diferença em digestibilidade de trato total aparente de matéria seca e nitrogênio entre a dieta de controle negativo e os tratamentos de DFM ou protease (P>0,05). No dia 21, o tratamento de protease e DFM resultou em digestibilidade de trato total aparente numericamente maior de energia digestível, FDA e FDN do que todos os outros tratamentos. No dia 42, a combinação de protease e DFMs aumentou numericamente a digestibilidade de trato total aparente de energia digestível, FDN e FDA. Uma resposta sinérgica em energia digestível foi observada entre a protease e DFMs, de modo que a combinação tenha liberado um adicional de 181,3 kcal/kg em comparação com a dieta de controle negativo e esse valor foi maior que a soma da energia digestível adicional que poderia ser atribuída aos DFMs ou protease sozinha. Tabela 2.3. Efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado isoladamente ou em combinação na digestibilidade de trato total aparente de nutrientes.

a,b,cMédia na mesma fileira com sobrescritos diferentes se difere (P<0,05) 1FDA: fibra em detergente ácido 2FDN: fibra em detergente neutro 3DE: A diferença em energia digestível (kcal/kg) em relação à dieta de controle negativo. Emissões de amônia fecal

[00263] A adição de protease sozinha a uma dieta à base de milho não diminui as emissões de amônia fecal em comparação com o tratamento de controle negativo ou DFM sozinho (Figura 3). Em comparação com o tratamento de controle negativo, a alimentação de DFM sozinho diminuiu as emissões de amônia (P<0,05). Entretanto, quando os porcos foram alimentados com uma combinação de protease e DFM, uma resposta sinérgica foi evidente, de modo que a magnitude de redução em emissões de amônia fosse maior (17% de redução em concentração de amônia em comparação com o controle negativo) que a soma da redução que poderia ser atribuída aos tratamentos individuais sozinhos (P<0,05). Exemplo 3 Efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado isoladamente ou em combinação no desempenho de crescimento e digestibilidade de trato total de nutrientes em porcos alimentados com dietas à base de milho MATERIAIS E MÉTODOS

ALOJAMENTO E AMBIENTE

[00264] O uso de animais e protocolo experimental é aprovado pelo Comitê de Experimentação Animal. A dieta basal, na matéria natural, é formulada para ser equilibrada quanto à energia e proteína, e para atender ou exceder os requisitos de nutriente para o crescimento de porcos dessa idade (Tabela 3,1) conforme recomendado pelo NRC (2012). Um marcador de digestibilidade comum (óxido crômico) é incluído em 3 g/kg para permitir a determinação da digestibilidade de componentes dietéticos.

[00265] A dieta basal é dividida em porções que são, então, tratadas com as enzimas ou micro-organismos de alimentação direta (DFMs) ou uma combinação de ambos, conforme identificado na Tabela 3.2. Durante a mistura da alimentação, o misturador é lavado para impedir contaminação cruzada da dieta. As amostras são coletadas a partir de cada dieta de tratamento do início, meio e fim de cada batelada e mescladas em conjunto para confirmar as atividades enzimáticas e contagens de DFM na alimentação. Tabela 3.1: Exemplos de composição de dieta basal para porcos com 20 a 50 kg de peso corporal (%, na matéria natural) Itens Dieta Basal Ingredientes, % Milho 52,94 Farinha de soja, 18,20 Farelo de arroz, 12,50 Farelo de trigo 7,83 Melaços, 2,50 Farinha de peixe, 1,50 Gordura de peixe 1,00 Farinha de carne e ossos 1,00 Carbonato de cálcio fino 0,75 Sal 0,68 Ácido orgânico (fumárico, cítrico, maleico) 0,30 Pré-mistura de vitaminas e elementos-traço1,2 0,25 Klinofeed (argila) 0,20 L-lisina HCl 0,17 DL-metionina 0,05 Fosfato dicálcico, 17% 0,05 Carreador vegetal de Cloreto de colina a 60% 0,05 L-Treonina, 95,8% 0,03 Total 100,00 Composição calculada Matéria seca, % 86,56 Proteína em Bruto, % 17,13 Lisina digestível ileal aparente, % 0,82 Metionina digestível ileal aparente, % 0,29 Itens Dieta Basal Metionina e cisteína digestível ileal aparente, % 0,50 Treonina digestível ileal aparente, % 0,49 Triptofano digestível ileal aparente, % 0,15 Cálcio, % 0,89 Fósforo digestível, % 1,30 1Fornecidas por quilograma de dieta: vitamina A, 10.000 IU; vitamina D3, 1.300 IU; vitamina E, 40 IU; vitamina K (complexo de bissulfato de menadiona), 3,0 mg; vitamina B2, 5,2 mg; vitamina B6, 2,6 mg; vitamina B12, 26 μg; niacina, 32 mg; e ácido d-pantotênico (como pantotenato de d-cálcio), 20 mg. 2Fornecido por quilograma de dieta: Cu (como CuSO4^5H2O), 19 mg; Fe (como FeSO4^7H2O), 70 mg; Zn (como ZnSO4), 50 mg; Mn (como MnO2), 50 mg; I (como KI), 0,5 mg; Co (como CoSO4^7H2O), 0,3 mg; e Se (como Na2SeOβ^5H2O), 0,2 mg. Tabela 3.2: Identificação de dietas experimentais

1 3 cepas de Bacillus: cepas de Bacillus 3BP5, 918 e 1013 2Protease: protease de Bacillus amyloliquefaciens P3000 O experimento é planejado e conduzido para corresponder à fase de crescimento (≤25 a ~60 kg de peso corporal).

PROJETO EXPERIMENTAL

[00266] Um total de 128 porcos em crescimento [(Yorkshire x Landrace) x Duroc] são usados no experimento de 42 dias. Os porcos são aleatoriamente alocados para 4 dietas de experimento de acordo com seu BW inicial. Existem 8 cercados idênticos por tratamento com 3 porcos por cercado. Os porcos castrados e marrãs são separados com quatro cercados de porcos castrados e quatro cercados de marrãs em cada tratamento. Todos os porcos são alojados em uma sala com controle ambiental. Cada cercado é equipado com um auto-alimentador de aço inoxidável unilateral e um bebedouro tipo chupeta com os porcos tendo acesso permitido à alimentação e água ad libitum.

ANÁLISE E COLETA DE AMOSTRA FECAL E DESEMPENHO DE CRESCIMENTO

[00267] O peso corporal e consumo de alimento são medidos semanalmente para monitorar o ganho diário médio (ADG), ingestão alimentar diária média (ADFI) e razão de conversão alimentar (FCR). A digestibilidade de trato total aparente (ATTD) de GE e N é determinada mediante a adição de óxido crômico (0,3%) como um indicador inerte na dieta. Os porcos são alimentados com dietas misturadas com óxido crômico ao longo da duração do teste. As amostras rápidas fecais frescas são coletadas de pelo menos 2 porcos por cercado por meio de massagem retal (dia 21 e 42) e armazenadas em um congelador a - 20°C até a análise. Antes da análise química, as amostras fecais são descongeladas e secas a 60 °C durante 72 h, depois disso, são finamente trituradas a um tamanho que poderia passar através de uma peneira de 1 mm. Todas as amostras fecais e alimentares são, então, analisadas acerca de matéria seca, energia bruta, nitrogênio, fibra de detergente ácido (FDA) e fibra de detergente neutro (FDN) seguindo os procedimentos resumidos pelo AOAC (2000). O cromo é analisado através de espectrofotometria de absorção de UV (Shimadzu, UV-1201, Shimadzu, Kyoto, Japão) seguindo o método descrito por Williams et al. (1962). A digestibilidade de trato total aparente de proteína bruta foi calculada multiplicando-se nitrogênio por um fator de conversão de 6,25. Os aperfeiçoamentos em energia digestível (kcal) com a adição de cada aditivo alimentar em comparação com o controle negativo foram calculados pelas seguintes equações; 1. GE dietética analisada (kcal/kg)/100 * ATTD de energia = Energia digestível na matéria natural (kcal/kg) 2. Aperfeiçoamento de energia digestível (kcal/kg) = energia digestível média na matéria natural (kcal/kg) de grupo NC - energia digestível média na matéria natural (kcal/kg) de réplica de DFM+protease

CONCENTRAÇÃO DE AMÔNIA FECAL

[00268] Para análise da concentração de NH3 fecal, 300 g de amostras fecais frescas são coletadas de pelo menos dois porcos por cercado e são transferidas para uma caixa vedada e fermentadas em um incubador (35 °C). A concentração de NH3 é então analisada com o uso de uma sonda de pesquisa de gás (Gastec Corp., Kanagawa, Japão) no dita 7.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[00269] Todos os dados foram submetidos à análise estatística como um projeto de bloco completo randomizado com o uso dos procedimentos mistos de SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC), e o cercado foi usado como a unidade experimental. O BW inicial foi usado como uma covariante para ADFI e ADG. A significância é incorporada em P < 0,05.

RESULTADOS

[00270] Desempenho de crescimento: A suplementação de uma dieta à base de milho com uma combinação de um DFM (Bacillus) e protease aperfeiçoa significativamente o ganho diário médio e a razão de eficiência de conversão alimentar (P < 0,05) em comparação com a dieta basal de controle negativo sem quaisquer aditivos alimentares (Figura 4). A adição de DFM (Bacillus) e protease isoladamente a dietas à base de milho também aperfeiçoa o ganho diário médio e a razão de eficiência de conversão alimentar (P < 0,05) em comparação com a dieta de controle negativo, entretanto; a magnitude do aperfeiçoamento foi significativamente menor (P < 0,05) do que observado para a combinação da protease + DFM.

[00271] Digestibilidade de trato total aparente de nutrientes: Tanto no dia 21 como 42, a digestibilidade de trato total aparente de matéria seca e nitrogênio é aperfeiçoada com a suplementação do DFM em combinação com a protease, em comparação com a dieta de controle negativo e os aditivos alimentados isoladamente (Tabela 3.3; P < 0,05). Esse aperfeiçoamento em digestibilidade de nutriente como resultado da alimentação da combinação de DFM + protease se equiparou a 3% para matéria seca, 5,5% para FDA e 4,5% tanto para FDN como para nitrogênio, em comparação com a dieta de controle negativo no dia 21 e 3% para matéria seca, 4% para nitrogênio, 6% para FDA e 3,5% para FDN em comparação com a dieta de controle negativo no dia 42. No dia 21, o tratamento de protease e DFM resultou em digestibilidade de trato total aparente numericamente maior de energia digestível e FDA do que todos os outros tratamentos. Além disso, no dia 21, a combinação de DFM + protease aumentou significativamente a digestibilidade de trato total aparente de FDN em comparação com o tratamento de controle negativo e protease sozinha. No dia 42, a combinação de protease e DFMs aumentou numericamente a diges- tibilidade de trato total aparente de FDN e FDA em comparação com todos os outros tratamentos. Além disso, a combinação de DFM + protease aumenta significativamente a digestibilidade de trato total aparente de energia em comparação com os tratamentos de controle negativo e protease sozinha (P < 0,05). A energia digestível adicional (kcal/kg) liberada pelo tratamento de DFM + protease foi maior que a energia digestível liberada dos tratamentos de DFM ou protease sozinhos. Tabela 3.3. Efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado isoladamente ou em combinação na digestibilidade de trato total aparente de nutrientes.

a,b,cMédia na mesma fileira com sobrescritos diferentes se difere (P<0,05) 1FDA: fibra em detergente ácido 2FDN: fibra em detergente neutro 3DE: A diferença em energia digestível (kcal/kg) em relação à dieta de controle negativo.

[00272] Emissões de amônia fecal: A adição da combinação de protease + DFM a uma dieta à base de milho diminui significativamente as emissões de amônia fecal em comparação com o controle negativo (Figura 5). Embora os DFMs e protease quando alimentados isoladamente diminuíssem numericamente as emissões de amônia fecal em comparação com o controle, a combinação da protease e DFMs em conjunto resultou na redução maior (11% de redução em comparação com o controle negativo) em concentração de amônia fecal. PKY1312 - Exemplo 4 Efeitos de uma combinação de micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease no desempenho de crescimento de porcos alimentados com dietas à base de milho

MATERIAIS E MÉTODOS PROJETO EXPERIMENTAL

[00273] Um total de 180 porcos (BW = 23,15 ± 2,66 kg) de porcos castrados e marrãs iguais foram alocados para 1 de 3 tratamentos dietéticos: 1) controle negativo (NC) 2) NC + DFM e 3) NC + Protease + DFM (Tabela 4.1). Existiram 4 porcos por cercado com 15 cercados (8 cercados de marrãs e 7 cercados de porcos castrados) por tratamento. Os porcos receberam acesso ad libitum à alimentação e água. As dietas foram formuladas para atender ou exceder os requisitos de energia e nutriente NRC 2012 e 3 fases foram formuladas (Tabela 4.2). A composição química calculada das dietas de fase 2 e 3 é resumida na Tabela 4.3. As fases 1, 2 e 3 foram alimentadas durante 41, 45 e 23 dias, respectivamente, em um período experimental total de 109 dias. Os porcos e alimentadores foram pesados semanalmente para calcular o ganho diário médio (ADG), ingestão alimentar diária média (ADFI) e razão de conversão alimentar (FCR). Tabela 4.1: Identificação de dietas experimentais

1 3 cepas de Bacillus: cepas de Bacillus 3BP5, 918 e 1013 2 Protease: protease de Bacillus amyloliquefaciens P3000 Tabela 4.2. Composição de ingrediente (%) de dietas experimentais, com base na matéria natural

1Composição: Fornecida por kg de dieta: vitamina A, 6.600 IU; vitamina D3, 880 IU; vitamina E, 44 IU; vitamina K (complexo de bissulfato de menadiona), 6,4 mg; tiamina, 4,0 mg; riboflavina, 8,8 mg; piridoxina, 4,4 mg; vitamina B12, 33 μg; ácido fólico, 1,3 mg; niacina, 44 mg. 2Composição: Fornecida por kg de dieta Zn, 131 mg como ZnO; Fe, 131 mg como FeSO^H2O; Mn 45 mg, como MnO; Cu, 13 mg como CuSO4^5H2O; I, 1,5 mg como CaIO6; Co, 0,23 mg como CoCO3; Se, 0,28 mg como Na2O3Se. 2Fornecida por kg de dieta: Zn, 131 mg como ZnO; Fe, 131 mg como FeSO4^H2O; Mn 45 mg, como MnO; Cu, 13 mg como CuSO4^5H2O; I, 1,5 mg como CaIO6; Co, 0,23 mg como CoCO3; Se, 0,28 mg como Na2O3Se. 3Contém menos que 9,5% de partículas finas 4Suplementado em 100 g por tonelada métrica. 5Suplementado em 250 g por tonelada métrica. 6DFM = micro-organismo de alimentação direta; incluído em 60 g por tonelada métrica. Tabela 4.3. Composição química calculada (%) de dietas experimentais na fase 2 e 3, base de DM1

1DM = matéria seca 2FDN = fibra em detergente neutro

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[00274] Os dados foram analisados durante o procedimento MIXED de SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). Para desempenho de crescimento, o cercado foi usado como a unidade experimental. Para todos os dados, o modelo incluiu tratamento como um efeito fixo e cercado como um efeito aleatório. Os resultados fora dos limites foram determinados com o uso do procedimento UNIVARIATE. A significância foi determinada em P < 0,05.

RESULTADOS

[00275] Os porcos alimentados com o tratamento de protease + DFM tenderam a ter ADG maior em comparação com o controle (P = 0,09). Em comparação com a alimentação do DFM sozinho, a alimentação do DFM em combinação resultou em ADG maior e FCR menor (Figura 6). Exemplo 5 Efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado isoladamente ou em combinação no desempenho de crescimento e digestibilidade de trato total de nutrientes em porcos alimentados com dietas à base de milho MATERIAIS E MÉTODOS

[00276] Um total de 64 porcos (Danbred DB90, fêmeas reprodutoras x Agroceres PIC 337, machos reprodutores) com um peso corporal inicial (BW) de 25,96 ± 0,57 kg foram usados em um estudo de 42 dias. Os animais foram alocados em 32 cercados com 2 porcos cada, que foram compreendidos de razões de sexo equalizadas com 8 representantes/tratamentos. O cercado foi considerado a unidade experimental do estudo. Os porcos receberam acesso ad libitum à alimentação e água. As dietas foram formuladas para atender ou exceder os requisitos de energia e nutriente NRC 2012 (Tabela 5.1) e os cercados foram aleatoriamente alocados para um dos quatro tratamentos (Tabela 5.2). Tabela 5.1 Composição nutricional de alimentação basal.

1 3 cepas de Bacillus: cepas de Bacillus 3BP5, 918 e 1013 2Protease: protease de Bacillus amyloliquefaciens P3000 Desempenho de crescimento:

[00277] O peso corporal e consumo de alimento são medidos semanalmente para monitorar o ganho diário médio (ADG), ingestão alimentar diária média (ADFI) e razão de conversão alimentar (FCR).

RESULTADOS

[00278] Desempenho de crescimento: Houve um aperfeiçoamento no ADG de porcos alimentados com dietas à base de milho, quando DFM + protease foram adicionados à dieta em comparação com a alimentação do DFM ou protease individualmente (Figura 7). Exemplo 6 Avaliação in-vitro dos efeitos de cepas únicas ou múltiplas cepas de micro-organismos de alimentação direta (DFMs) e Protease em sua capacidade para solubilizar proteína de substrato à base de farinha de soja ou trigo alimentado a porcos

MATERIAIS E MÉTODOS

[00279] Um total de 8 porcos castrados com cânula ileal (BW inicial de 30 kg) foram alimentados com uma das 2 dietas experimentais em um projeto de quadrado latino 8 x 2. Houveram dois períodos consecutivos, cada um consistindo em 7 dias. As dietas semi-purifica- das, que consistem principalmente em trigo ou SBM, foram alimentadas por 7 dias durante cada período com 5 dias para adaptação e 2 dias para coleta ileal. Os porcos foram aleatoriamente alocados para 1 de 2 dietas experimentais no início do primeiro período (d 0) e alterados para a segunda dieta no início do segundo período (d 7). As dietas continham óxido crômico que foi usado para calcular a digestibilidade ileal aparente de proteína bruta, e as amostras do porco com digestibilidade ileal aparente de proteína bruta mais próximo à média da população foram selecionadas para o estudo in-vitro. Os porcos foram alojados em uma sala com ambiente controlado. Cada cercado foi equipado com um auto- alimentador de aço inoxidável unilateral e um bebedouro tipo chupeta com os porcos tendo acesso permitido à alimentação e água ad libitum. A dieta basal foi formulada para atender ou exceder os requisitos de nutriente para o crescimento de porcos dessa idade (Tabela 6.1) conforme recomentado pelo NRC (2012). Tabela 6.1: Exemplo de composição de dieta basal para porcos com 30 kg de peso corporal

[00280] Mediante a coleta do digerido dos porcos, o mesmo foi imediatamente congelado a -20°C e subsequentemente liofilizado. As amostras de digerido liofilizadas foram, então, usadas em uma incubação in-vitro com o DFM e protease isoladamente ou em combinação. Os DFMs usados no estudo incluíram cepas únicas de Bacillus pumilis (8G-134), Bacillus licheniformis (AEE3), Lactobacillus reuteri (ANC1) e uma combinação de 3 cepas de Bacillus que consiste em 3 cepas de B. subtilis (918, 1013 e 3BP5).

CULTIVO DE BACTÉRIAS ANAERÓBICAS

[00281] As culturas de um dia para o outro de Lactobacillus reuteri (ANC1) foram inoculadas por meio da transferência de uma microesfera com as bactérias criopreservadas aderindo à superfície em um tubo de 13 ml (Sarstedt 62.515.006) que contém 3 ml de meio MRS (deMan, Rogosa e Sharpe) (OXOID, CMS359) preparado e esterilizado de acordo com as instruções do fabricante. Os tubos foram colocados em uma jarra anaeróbica reforçada (Anaerocult®) que retém dois sachês de geração de gás anaeróbico ativado (Oxoid AnaeroGen 2,5 l, Thermo Scientific). Tiras Anaerotest (Merck 115112) foram inseridas na jarra e indicaram que a atmosfera era anaeróbica (cor branca) durante a incubação. As bactérias foram incubadas durante 18 horas a 37 °C com agitação a 50 rpm.

[00282] Uma subcultura foi feita transferindo-se 30 μl de cultura de um dia para o outro para 3 ml de meio MRS fresco em novos tubos de 13 ml (Sarstedt 62.515.006). Os tubos colocados na jarra anaeróbica hermética (Anaerocult®) juntamente com um sachê de geração de gás anaeróbico ativado fresco (Oxoid AnaeroGen 2,5 l, Thermo Scientific). A subcultura foi incubada a 37 °C com agitação a 50 rpm até que as culturas alcançassem uma densidade óptica em 600 nm (OD600) entre 0,2 e 0,4. A cultura foi diluída com meio MRS a OD600 = 0,1 e subsequentemente diluída 10 vezes com tampão MES (ácido 2-(N- morfolino)etano sulfônico) a 100 mM, pH 6,2. O tratamento das amostras ileais foi iniciado imediatamente depois.

CULTIVO DE BACTÉRIAS AERÓBICAS

[00283] As culturas de um dia para o outro de B. subtilis (3BP5, 918 e 1013), B. licheniformis (AEE3) e B. pumilis (8G-134) foram inoculadas por meio da transferência de uma microesfera com as bactérias criopreservadas aderindo à superfície em um tubo de 13 ml (Sarstedt 62.515.006) que contém 3 ml de meio TSB (caldo tríptico de soja) (Merck 1.05459) preparado e esterilizado de acordo com as instruções do fabricante. Os tubos foram incubados durante 18 horas com agitação (200 rpm). A cepa de B. pumilis foi incubada a 32 °C e o restante das cepas foi incubado a 37 °C.

[00284] Foi feita uma subcultura transferindo-se 300 μl de cultura de um dia para o outro para 30 ml de meio TSB fresco em frascos de vidro de 250 ml com três defletores. Sob agitação contenciosa, a cepa de B. pumilis foi incubada a 32 °C e o restante das cepas foi incubado a 37 °C até que um valor de OD600 na faixa de 0,3 e 0,7 fosse obtido. A cultura foi diluída com meio TSB a OD600 = 0,1 e subsequentemente diluída 10 vezes com tampão MES a 100 mM, pH 6,2. O tratamento das amostras ileais foi iniciado imediatamente depois.

TRATAMENTO DE AMOSTRAS ILEAIS COM UMA COMBINAÇÃO DE BACTÉRIAS E PROTEASE

[00285] As amostras ileais liofilizadas foram tratadas com as culturas bacterianas individuais isoladamente ou em combinação com protease. Todos os tratamentos foram testados em pares. Entre 0,097 e 0,103 g de amostra ileal liofilizada foram transferidos para um tubo para microcentrífuga de 2 ml (Eppendorf). 850 μl de tampão MES a 100 mM, pH 6,2 foram adicionados juntamente com 20 μl de tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,0 ou protease (protease de B. amyloliquefaciens P3000, 55 U/ml) em tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,0. As amostras foram misturadas cuidadosamente até todo material ser umedecido. 30 μl de tampão MES a 100 mM, pH 6,2 ou cultura bacte- riana diluída em tampão MES foram adicionados. Para a combinação de 3 cepas de Bacillus (cepa 918, 1013 e 3BP5) foram adicionados 10 μl para cada uma das três cepas (dado um volume total de 30 μl). Todos os tubos foram incubados durante 2 horas a 37 °C com agitação (1.150 rpm) em um Thermomixer (Eppendorf). Após 2 horas de incubação, as amostras foram transferidas para gelo e deixadas repousar por 5 min. Os tubos foram centrifugados a 17.000 xg por 2 min. O sobrenadante foi recuperado e filtrado com o uso de placas de filtro AcroPrep™ Advance (3 μm de fibra de vidro/0,2 μm de membrana Supor®) por centrifugação. As amostras foram armazenadas a -20 °C até a análise adicional.

QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA

[00286] A proteína em solução foi quantificada com o uso do kit de ensaio de proteína Quant-iT (sondas moleculares Q33210) contra uma curva padrão BSA (0 a 300 μg/ml) com o uso do protocolo fornecido pelo fabricantes com um volume de amostra de 10 μl.

RESULTADOS

[00287] Solubilização de proteína: A combinação de uma combinação de 3 cepas de Bacillus subtilis com uma protease aumentou a solubilização da proteína de digerido ileal de porco à base de farinha de soja em comparação com o componente de DFMs ou protease individual sozinho (Figura 8.1).

[00288] A combinação de uma cepa única de Bacillus licheniformis com uma protease também resultou em solubilização de proteína maior do digerido ileal de porcos alimentados com uma dieta à base de farinha de soja do que os componentes individuais de protease ou DFM sozinhos (Figura 8.2).

[00289] A combinação de uma cepa única de Bacillus pumilis com uma protease também resultou em solubilização de proteína maior do digerido ileal de porcos alimentados com uma dieta à base de farinha de soja do que os componentes individuais de protease ou DFM sozinhos (Figura 8.3).

[00290] A combinação de uma cepa única de Bacillus pumilis com uma protease resultou em solubilização de proteína maior do digerido ileal de porcos alimentados com uma dieta à base de trigo do que os componentes individuais de protease ou DFM sozinhos (Figura 8.4).

[00291] A combinação de uma cepa única de Bacillus licheniformis com uma protease resultou em solubilização de proteína maior do digerido ileal de porcos alimentados com uma dieta à base de trigo do que os componentes individuais de protease ou DFM sozinhos (Figura 8.5).

[00292] A combinação de uma cepa única de Lactobacillus reuteri com uma protease resultou em solubilização de proteína maior do digerido ileal de porcos alimentados com uma dieta à base de trigo do que os componentes individuais de protease ou DFM sozinhos (Figura 8.6).

Exemplo 7 Efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando alimentado em combinação nas características de carcaça de porcos alimentados com dietas à base de milho MATERIAIS E MÉTODOS

[00293] O experimento foi conduzido de acordo com os Códigos de Prática de Laboratório/Regulamentações do Comitê de Ética e Experimental Animal nos Países-Baixos. A dieta basal, na matéria natural, foi formulada para atender ou exceder os requisitos de nutriente para o crescimento de porcos dessa idade (Tabela 7.1) conforme recomendado pelo NRC (2012), exceto pela energia líquida (NE) que foi reduzida em aproximadamente 200 kcal/kg. A dieta basal foi dividida em porções que foram, então, tratadas com a combinação de enzima e micro-organismo de alimentação direta (DFM) conforme identificado na Tabela 7.2. Durante a mistura de alimentação, o misturador foi lavado para impedir a contaminação cruzada de dietas. As amostras foram coletadas a partir de cada dieta de tratamento do início, meio e fim de cada batelada e mescladas em conjunto para confirmar as atividades enzimáticas e contagens de DFM na alimentação. Tabela 7.1: Exemplo de composição de dieta basal para porcos com 23 a 116 kg de peso corporal

Tabela 7.2: Identificação de dietas experimentais

13 cepas de Bacillus: cepas de Bacillus 3BP5, 918 e 1013 2Protease: protease de Bacillus amyloliquefaciens P3000

[00294] O experimento é planejado e conduzido para corresponder à fase de crescimento (≤23 a ~116 kg de peso corporal).

PROJETO EXPERIMENTAL

[00295] Um total de 180 porcos em crescimento [Great York x Landrace] com um peso corporal médio de 23 kg foi usado no experimento de 96 a 113 dias. Os porcos foram aleatoriamente alocados para 2 dietas experimentais de acordo com seu peso corporal inicial. Existiram 10 cercados idênticos por tratamento com 9 porcos por cercado. Os porcos castrados e marrãs são separados com cinco cercados de porcos castrados e cinco cercados de marrãs em cada tratamento. Todos os porcos são alojados em uma sala com controle ambiental. Cada cercado é equipado com um auto-alimentador de aço inoxidável unilateral e um bebedouro tipo chupeta que os porcos são permitidos terem acesso à alimentação e água ad libitum.

ANÁLISE E MEDIÇÃO DE CARACTERÍSTICAS DE CARCAÇA

[00296] No dia final do experimento, quando os porcos pesavam aproximadamente 116 kg de peso corporal (em 96 ou 116 dias), os porcos foram sacrificados e a qualidade de carcaça foi determinada a partir dos dados no abate. A profundidade de gordura dorsal (mm) foi medida no local P2 que está situado 65 mm da linha mediana dorsal no nível da última costela com uma sonda. A porcentagem de carne, uma medição que é usada rotineiramente para estimar a magreza da carcaça, foi calculada conforme exposto a seguir: % de Carne = {8,588 + (0,465 x peso de carcaça) + (3,005 x área muscular lombar) - (21,896 x profundidade de gordura)}/peso de carcaça

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[00297] Todos os dados foram submetidos à análise estatística como um projeto de bloco completo randomizado com o uso dos procedimentos mistos de SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC), e o cercado foi usado como a unidade experimental. Os dados foram considerados significativos em P<0,05.

RESULTADOS

[00298] A suplementação de uma dieta à base de milho com uma combinação de um DFM (Bacillus) e uma protease aperfeiçoou significativamente a porcentagem de carne e profundidade de gordura dorsal (P<0,05) em comparação com a dieta basal de controle negativo sem quaisquer aditivos (Tabela 7.3). Tabela 7.3: Efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918,1013) e Protease quando alimentados em combinação nas características de carcaça

a,bMédia na mesma fileira com sobrescritos diferentes se difere (P<0,05) Exemplo 8 Avaliação in-vitro dos efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando aplicados isoladamente ou em combinação na solubilização de proteína de dietas à base de farinha de soja ou trigo alimentadas para porcos em crescimento

MATERIAIS E MÉTODOS

[00299] Um total de 8 porcos castrados com cânula ileal (BW inicial de 30 kg) foram alimentados com uma das 2 dietas experimentais em um projeto de quadrado latino 8 x 2. Houveram dois períodos consecutivos, cada um consistindo em 7 dias. As dietas semi-purificadas, que consistem principalmente em trigo ou SBM, foram alimentadas por 7 dias durante cada período com 5 dias para adaptação e 2 dias para coleta ileal. Os porcos foram aleatoriamente alocados para 1 de 2 dietas experimentais no início do primeiro período (d 0) e alterados para a segunda dieta no início do segundo período (d 7). As dietas continham óxido crômico que foi usado para calcular a digestibilidade ileal aparente de proteína bruta, e as amostras do porco com digestibilidade ileal aparente de proteína bruta mais próximo à média da população foram selecionadas para o estudo in-vitro. Os porcos foram alojados em uma sala com ambiente controlado. Cada cercado foi equipado com um auto- alimentador de aço inoxidável unilateral e um bebedouro tipo chupeta com os porcos tendo acesso permitido à alimentação e água ad libitum. A dieta basal foi formulada para atender ou exceder os requisitos de nutriente para o crescimento de porcos dessa idade (Tabela 8.1) conforme recomentado pelo NRC (2012). Tabela 8.1: Exemplo de composição de dieta basal para porcos com 30 kg de peso corporal

[00300] Mediante a coleta do digerido dos porcos, o mesmo foi imediatamente congelado a -20 °C e subsequentemente liofilizado. As amostras de digerido liofilizadas foram, então, usadas em uma incubação in-vitro com o DFM e protease isoladamente ou em combinação. Os DFMs usados no estudo incluíram uma combinação de 3 cepas de Bacillus que consiste em 3 cepas de B. subtilis (3BP5, 918 e 1013)().

[00301] CULTIVO DE BACTÉRIAS AERÓBICAS As culturas de um dia para o outro de B. subtilis (3BP5, 918 e 1013) foram inoculadas por meio da transferência de uma microesfera com as bactérias criopreservadas aderindo à superfície em um tubo de 13 ml (Sarstedt 62.515.006) que contém 3 ml de meio TSB (caldo tríptico de soja) (Merck 1.05459) preparado e esterilizado de acordo com as instruções do fabricante. Os tubos foram incubados durante 18 horas com agitação (200 rpm). Todas as cepas de Bacillus foram incubadas a 37 °C.

[00302] Foi feita uma subcultura transferindo-se 300 μl de cultura de um dia para o outro para 30 ml de meio TSB fresco em frascos de vidro de 250 ml com três defletores. Sob agitação contenciosa, todas as cepas de Bacillus foram incubadas a 37 °C até que um valor de OD600 na faixa de 0,3 e 0,7 fosse obtido. A cultura foi diluída com meio TSB a OD600 = 0,1 e subsequentemente diluída 10 vezes com tampão MES a 100 mM, pH 6,2. O tratamento das amostras ileais foi iniciado imediatamente depois.

TRATAMENTO DE AMOSTRAS ILEAIS COM UMA COMBINAÇÃO DE BACTÉRIAS E PROTEASE

[00303] As amostras ileais liofilizadas foram tratadas com as culturas bacterianas individuais isoladamente ou em combinação com protease. Todos os tratamentos foram testados em pares. Entre 0,097 e 0,103 g de amostra ileal liofilizada foram transferidos para um tubo para microcentrífuga de 2 ml (Eppendorf). 850 μl de tampão MES a 100 mM, pH 6,2 foram adicionados juntamente com 20 μl de tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,0 ou protease (protease de B. amyloliquefaciens P3000, 55 U/ml) em tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,0. As amostras foram misturadas cuidadosamente até todo material ser umedecido. 30 μl de tampão MES a 100 mM, pH 6,2 ou cultura bacteriana diluída em tampão MES foram adicionados. Para a combinação de 3 cepas de Bacillus (cepa 918, 1013 e 3BP5) foram adicionados 10 μl para cada uma das três cepas (dado um volume total de 30 μl). Todos os tubos foram incubados durante 2 horas a 37 °C com agitação (1.150 rpm) em um Thermomixer (Eppendorf). Após 2 horas de incubação, as amostras foram transferidas para gelo e deixadas repousar por 5 min. Os tubos foram centrifugados a 17.000 xg por 2 min. O sobrenadante foi recuperado e filtrado com o uso de placas de filtro AcroPrep™ Advance (3 μm de fibra de vidro/0,2 μm de membrana Supor®) por centrifugação. As amostras foram armazenadas a -20 °C até a análise adicional.

QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA

[00304] A proteína em solução foi quantificada com o uso do kit de ensaio de proteína Quant-iT (sondas moleculares Q33210) contra uma curva padrão BSA (0 a 300 μg/ml) com o uso do protocolo fornecido pelo fabricantes com um volume de amostra de 10 μl.

RESULTADOS

[00305] A aplicação única de protease ou DFM aumentou numericamente a quantidade de proteína solubilizada a partir das amostras de farinha de soja e trigo em comparação com o controle negativo sem aditivos. Entretanto, quando a protease e o DFM de 3 cepas de Bacillus foram combinados, houve um aumento na quantidade de proteína solubilizada a partir das amostras de farinha de soja e trigo em comparação com o controle e a protease ou DFM sozinho (Tabela 8.3). Tabela 8.3: Efeitos de um micro-organismo de alimentação direta à base de três cepas de Bacillus (cepas de Bacillus 3BP5, 918, 1013) e Protease quando aplicados isoladamente ou em combinação na solubilização de proteína de dietas à base de farinha de soja ou trigo alimentadas para porcos em crescimento

Claims (10)

1. Composição de aditivo alimentar, caracterizada pelo fato de que consiste essencialmente em um micro-organismo de alimen-tação direta compreendendo cepas de Bacillus 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B-50508) e 1013 (NRRL B-50509) em combinação com uma protease, em que a composição de aditivo alimentar não compreende outras enzimas além da protease.

2. Composição de aditivo alimentar, de acordo com a uma das reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o micro-organismo de alimentação direta está sob a forma de um endósporo.

3. Composição de aditivo alimentar, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a protease é uma subtilisina, uma bacilolisina, uma serina protease alcalina, uma queratinase ou uma protease de Nocardiopsis, por exemplo, uma subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

4. Composição de aditivo alimentar, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, ou 3, caracterizada pelo fato de que a protease está presente em uma dosagem de 1.000 PU/g de composição de aditivo alimentar a 200.000 PU/g de composição de aditivo alimentar.

5. Composição de aditivo alimentar, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, ou 4, caracterizada pelo fato de que o DFM está presente em uma dosagem de 1x103 CFU/g de composição de aditivo alimentar a 1x1013 CFU/g de composição de aditivo alimentar.

6. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a composição de aditivo alimentar, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e instruções para administração.

7. Método para preparar uma composição de aditivo alimentar, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende misturar por adição um micro-organismo de alimentação direta que compreende cepas de Bacillus 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B-50508) e 1013 (NRRL B- 50509) em combinação com uma protease e embalar.

8. Composição alimentar, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de aditivo alimentar como definida em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4.

9. Pré-mistura, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de aditivo alimentar, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um mineral e/ou uma vitamina.

10. Uso de um micro-organismo de alimentação direta que compreende cepas de Bacillus 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B- 50508) e 1013 (NRRL B-50509) em combinação com uma protease, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para melhoria da resistência de um indivíduo à enterite necrótica, ou para promover o crescimento de bactérias benéficas no trato gastrointestinal de um indivíduo ou para reduzir populações de bactérias patogênicas no trato gastrointestinal de um indivíduo, em que a composição de aditivo alimentar não compreende outras enzimas além da protease.

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