JP3471797B2

JP3471797B2 - 安定化酵素及び洗剤

Info

Publication number: JP3471797B2
Application number: JP50915292A
Authority: JP
Inventors: デルオステン，クラウスボン; ブランネル，スベン; スベンゼン，アラン; ヘデゴールド，リスベト; エリクセン，ニナ; ロベルトエグモント，マールテン; カステレエイン，エリク
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1991-05-01
Filing date: 1992-04-30
Publication date: 2003-12-02
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: DK0583339T3; EP0583339B1; EP0583339A1; ES2121014T3; KR100258460B1; DE69226182D1; ATE168130T1; FI115972B; US5858757A; FI934811A0; WO1992019729A1; JPH06506832A; DE69226182T2; JP2003289891A; FI934811A; JP4050654B2

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は新規の安定化プロテアーゼ、この安定化プロ
テアーゼをコードするヌクレオチド配列及びこの新規の
安定化プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含
む宿主生物に関する。

背景技術プロテアーゼ／ズブチリシンプロテアーゼ又は（同義語の）ペプチダーゼは、タン
パク質基質におけるアミド結合を切断する酵素である。
バチルス（Bacillus）の種の細菌は２種類の細胞外プロ
テアーゼ、即ち、中性又は金属プロテアーゼと、機能的
にセリンエンドプロテアーゼであり、ズブチリシンと呼
ばれるアルカリ性プロテアーゼとを分泌する。

セリンプロテアーゼはペプチド結合の加水分解を触媒
する酵素であり、そしてその中には活性部位にて必須の
セリン残基が存在している〔White,HandlerとSmith（19
73）;Principles of Biochemistry;第５版,McGraw−Hil
l Book Company,NY,271−272〕。

細菌性セリンプロテアーゼは20,000〜45,000の範囲に
おける分子量を有する。それらは単純な末端エステルを
加水分解し、そして真核性キモトリプシン（これもセリ
ンプロテアーゼである）と活性において類似する。サブ
グループを包括するより狭義な語アルカリ性プロテアー
ゼは、pH9.0から11.0に至る一部のセリンプロテアーゼ
の高いpH最適性を反映している〔参考のため、Priest;B
acteriological Rev.,41 711−753（1977）を参照のこ
と〕。

本発明との関連において、ズブチリシンはグラム陽性
の細菌又は菌類より生産されるセリンプロテアーゼであ
る。別の定義に従うと、ズブチリシンはセリンプロテア
ーゼであり、その触媒性トリアドにおけるアミノ酸残基
の相対順序はAsp−His−Ser（位置32,64及び221）であ
る。幅広い様々なズブチリシンが固定されており、そし
て数多くのズブチリシンのアミノ酸配列が決定されてい
る。これにはとりわけバチルス株に由来する６種のズブ
チリシン、即ち、ズブチリシン168,ズブチリシンBP
N′，ズブチリシンカールスバーグ、ズブチリシンDY,
ズブチリシンアミロサッカリティカス及びメセンテリコ
ペプチダーゼ〔Kuriharaら（1972）;J.Biol.Chem.;247
5629−5631;Wellsら（1983）;Nucleic Acids Res.;1179
11−7925;StahlとFerrari（1984）;J.Bacteriol.;159 8
11−819;Jacobsら（1985）;Nucl.Acids Res.;13 8913−
8926;Nedkovら（1985）;Biol.Chem.Hoppe−Seyler;366
421−430;Svendsenら（1985）;FEBS LETTERS;196 228−
232〕、アクチノミセス目由来の１種のズブチリシン、
即ち、サーモアクチノマイセスバルガリス（Thermoac
tinomyces vulgaris）由来のサーミターゼ〔Melounら
（195）;FEBS LETTERS;1983 195−200〕、及び１種の菌
類ズブチリシン、即ち、トリチラキウムアルブム（Tr
itirachium album）由来のプロテイナーゼＫ〔JanyとMa
yer（1985）;Biol Chem.Hoppe−Seyler;366 548−492〕
が含まれる。

ズブチリシンのようなプロテアーゼは工業、特に洗剤
配合物においてかなりの有用性が見い出されており、な
ぜならそれらはタンパク質性の染みを除去するのに有用
であるからである。

タンパク質の構造プロテアーゼは球状タンパク質であり、そしてその長
いポリペプチド鎖の折りたたみが相当量の程度あること
に基づいてかなりコンパクトである。そのポリペプチド
鎖は「主鎖」及びその「側鎖基」より本質的に構成され
る。ペプチド結合は平面性であるため、Ｃα−Ｎ軸及び
Ｃα−C'軸を中心とする回転のみが可能である。ペプチ
ド主鎖のＣα−Ｎ結合を中心とする回転はねじれ角φ
（ファイ）で表わされ、Ｃα−C'結合を中心とする回転
はΨ（サイ）で表わされる〔例えば、Creighton,T.E.
（1984）;Proteins;W.H.Freeman and Company,New Yor
k、を参照のこと〕。これらの回転角の値の選択は、最
大に伸ばした鎖に＋180゜（これは−180゜と同一であ
る）の最大値を設定することによりなされる。完全に伸
びきったポリペプチド鎖において、N,Cα及びC¹原子は
全て互いに対して「トランス」にある。「シス」コンホ
メーションにおいては、φ及びΨのの角は０゜の値と定
める。この位置からのこれらの結合の回転、即ち、この
回転した結合の背後から見て原子が「反時計方向」に移
動することを定義により負の値と定め、「時計方向」を
正の値と定める。従って、ねじれ角の値は−180゜〜＋1
80゜の範囲にある。

Ｃα−原子はこの鎖の回転点であるため、Ｃα−原子
に結合している側鎖基（Ｒ基）は分子のコンホメーショ
ンに関連して非常に重要となる。

「コンホメーション」なる語はタンパク質の全体構造
を形成するうえでのポリペプチド鎖の二次及び三次構造
の関与を明らかにする。タンパク質の適切なコンホメー
ションはタンパク質の特異的な構造にとって主に重要で
あり、そして酵素の固有の触媒的性質（即ち、活性及び
特異性）並びにその安定性に大いに寄与する。

ポリペプチドのアミノ酸は４種の一般的な群、即ち、
非極性、非荷電、及び負又は正荷電極性アミノ酸に分類
することができる。タンパク質分子は、それが通常見い
出せるその水性環境に沈められると、周囲の環境に対し
てその最大数の極性側鎖基をさらす傾向にあり、その
際、大半のその非極性側鎖基は内側に配向する。この状
況における側鎖基の配向はタンパク質のコンホメーショ
ンの安定化につながる。

従って、タンパク質は、折りたたまれ、且つ、秩序の
とれた状態と、ほどかれ、且つ、無秩序な状態との動力
学的平衡状態において存在している。この平衡状態は、
タンパク質の全体構造を安定化せしめる傾向の、ポリペ
プチド鎖の様々なセグメント間での近距離の相互作用に
ある程度反映する。同時に、熱力学的エネルギーはほど
かれた分子の無秩序化を助長する傾向にある。

安定化酵素を画策する方法は、ポリペプチド主鎖の柔
軟性を下げることによりほどきの程度を下げ、そして同
時にほどかれている鎖のエントロピーを下げることにあ
る。現在まで、新規の安定化プロテアーゼの開発におい
てこの理論を証明するのにわずかな試みしかなされてい
ない。

タンパク質の熱的安定性を高める一般的な理論が提供
されている〔Suzuki,Y.（1989）;Proc.Japan Acad.;65
Ser.B〕。この論文においてSuzukiは、球状タンパク質
の熱的安定性は、酵素の二次及び三次構造、並びに触媒
的機能を有意に変えることなく、β−ターンの第２部位
におけるプロリンの存在率を高めることによって高い程
度にまで漸増的に高めることができると述べている。こ
の理論は様々な事実及び発見、特にプロリン残基がβ−
ターンの第２部位にて優先的に存在する傾向が強いこと
を示す事実に基づく〔Levitt,M（1978）;Biochemistry;
17 4277−4285;及びChou,P.Y.＆Fasman,G.D（1977）;J.
Mol.Biol.;115 135−175〕。この理論はタンパク質にお
けるβ−ターンの第２部位へのプロリンの挿入に限定さ
れ、その他の部位については述べられていない。

国際特許公開WO 89/01520（Cetus Corporation,USA）
は、タンパク質のほどきの形態的エントロピーを下げる
ことによりタンパク質の安定性を高める方法を提供す
る。この方法はストレプトマイシンソルビキノサス（St
reptomyces rubiqinosus）キシロースイソメラーゼに適
用され、そしてこれはプロリンによるアミノ酸の置換、
又は予測の位置でのグリシンのアラニンとの交換を包括
する。

国際特許公開WO 89/09819（Genex Corporation,USA）
において、ズブチリシンの安定化のために突然変異を組
入れる方法が提供されている。この公開公報は熱的安定
化性突然変異であると認められる数多くのアミノ酸突然
変異を列挙している。このリストはズブチリシンの位置
188（BPN'の番号付け）でのセリンのプロリンによる置
換を含んで成る。

国際特許出願公開WO 87/05050（Genex Corporation,U
SA）は突然変異誘発及びスクリーニングについての方法
を述べている。この方法により、１又は複数の突然変異
が突然変異誘発剤による処理によって導入され、そして
この方法は変更された性質を有する生成物についてのそ
の後のスクリーニングを含んでいる。そのランダム突然
変更誘発の結果、位置188（BPN'番号付け）にプロリン
残基を有するズブチリシンが提供される。

本発明の目的は、改善した安定性を有する新規のプロ
テアーゼの提供にある。

発明の概要本発明は新規の安定化プロテアーゼを提供し、そのう
ちの天然のアミノ酸残基（プロリンを除く）は１又は複
数の位置にてプロリン残基に置き換えられ、その位置に
て二面角φ（ファイ）及びΨ（サイ）は〔−90゜＜φ＜
−40゜及び−180゜＜Ψ＜180゜〕の間隔以内、好ましく
は〔−90゜＜φ＜−40゜及び120゜＜Ψ＜180゜〕又は
〔−90゜＜φ＜−40゜及び−50゜＜Ψ＜10゜〕の間隔以
内の値を構成し、そしてそれらの位置は、α−ヘリック
ス又はβ−シート構造を保有することにより特徴付けら
れるこのプロテアーゼにおける領域には位置していな
い。

別の観点において、本発明は該プロテアーゼをコード
するヌクレオチド配列に関連する。更なる観点におい
て、本発明はプロテアーゼをコードするヌクレオチド配
列を含んで成る発現ベクター、及びこの発現ベクターを
含む宿主生物に関する。

ズブチリシン本発明に関連して、ズブチリシンはグラム陽性の細菌
又は菌類により生産されるセリンプロテアーゼと定義す
る。別の定義によると、ズブチリシンはセリンプロテア
ーゼであり、ここでその触媒性トリアドにおけるアミノ
酸残基の相対順序はAsp−His−Ser（位置32,64及び221,
BPN'番号付け）にある。

アミノ酸下記の記号をアミノ酸の略語について用いた：Ａ＝Ala＝アラリンＣ＝Cys＝システインＤ＝Asp＝アスパラギン酸Ｅ＝Glu＝グルタミン酸Ｆ＝Phe＝フェニルアラニンＧ＝Gly＝グリシンＨ＝His＝ヒスチジンＩ＝Ile＝イソロイシンＫ＝Lys＝リシンＬ＝Leu＝ロイシンＭ＝Met＝メチオニンＮ＝Asn＝アスパラギンＰ＝Pro＝プロリンＱ＝Gln＝グルタミンＲ＝Arg＝アルギニンＳ＝Ser＝セリンＴ＝Thr＝スレオニンＶ＝Val＝バリンＷ＝Trp＝トリプトファンＹ＝Tyr＝チロシンＢ＝Asx＝Asp（Ｄ）又はAsn（Ｎ）Ｚ＝Glx＝Glu（Ｅ）又はGln（Ｑ）Ｘ＝任意のアミノ酸 ^＊＝アミノ酸の欠失又は不存在プロテアーゼ変異体本発明の安定化プロテアーゼはプロテアーゼ変異体又
は突然変異プロテアーゼである。プロテアーゼ変異体又
は突然変異プロテアーゼとは、親遺伝子のDNAヌクレオ
チド配列又はその誘導体の変更により獲得できるプロテ
アーゼを意味とする。このプロテアーゼ変異体又は突然
変異プロテアーゼは、このプロテアーゼをコードするDN
Aヌクレオチド配列を適当な宿主生物における適用ベク
ターの中に挿入したときに発現して生成される。この宿
主生物はこの親遺伝子が由来する生物と同一である必要
はない。

アミノ酸の番号付け本発明に関連して、ズブチリシンにおけるアミノ酸残
基の位置の特別の番号付けを採用している。様々なズブ
チリシンのアミノ酸配列をズブチリシンBPN'と並べるこ
とにより、任意のズブチリシンにおけるアミノ酸残基の
位置に、ズブチリシンBPN'における類似のアミノ酸位置
の番号に対する番号を設定することが可能である（「BP
N'の番号付け」、例えば国際特許公開WO 89/06279及びW
O 91/00345を参照のこと）。

本発明に従って生成された又は考慮される様々なプロ
テアーゼ変異体を説明するうえで、下記の専門用語を参
照のし易さのために採用する：〔オリジナルアミノ酸：位置：置換アミノ酸〕従って、位置195におけるアラニンのプロリンによる
置換は： A195P、として表わす。

位置36でのアスパラギン酸の欠失はD36^＊として表わ
し、そしてかかる位置における挿入は、36D（位置36に
おけるアスパラギン酸の挿入）として表わす。

多重突然変異はプラスで分けている。即ち： A194P＋G195E は、位置194及び195における、プロリン及びグリシンに
よるそれぞれの置換の突然変異を表わす。

もし例えばズブチリシン309における突然変異がなさ
れたなら、その生成物は例えば「ズブチリシン309/G195
E」と表わす。

これに関して挙げる全ての位置は前記のBPN'の番号付
けに関連する。

タンパク質分解活性本発明に関連して、タンパク質分解活性はキロノボプ
ロテアーゼ単位（KNPU）として表わす。この活性は、標
準酵素（SAVINASE〔商標〕）に相対して決定しており、
そしてその決定は標準条件、即ち、50℃、pH8.3、反応
時間９分、測定時間３分での、タンパク質分解酵素によ
るジメチルカゼイン（DMC）の消化に基づく。ホルダーA
F 220/1はノボノルディスク A/S、デンマーク国から
注問により入手でき、このホルダーは引用することで本
明細書に組入れる。

洗浄性能例えば洗濯の際に洗浄にすべく物体上に存在する様々
な天然の基質の分解を触媒する酵素の能力は、通常洗浄
能性、洗浄性、清浄性又は洗浄性能と呼ぶ。本明細書に
わたっては、洗浄性能なる後をその性能を包括するよう
に利用している。

図面の簡単な説明本発明を添付図面を参照しながら更に説明するが、こ
こで：図１（図面1/20〜15/20）は合成遺伝子の構築を示
し；そして図２（図面16/20〜20/20）は、液体洗剤中で保存した
後の、野生型酵素と比べたズブチリシン309変異体の残
留活性を示す。

発明の詳細な開示本発明は新規の安定化プロテアーゼを提供し、それに
おいて天然のアミノ酸残基（プロリンを除く）は１又は
複数の位置にてプロリン残基に置き換えられ、その位置
にて二面角φ（ファイ）及びΨ（サイ）は〔−90゜＜φ
＜−40゜及び−180゜＜Ψ＜180゜〕の間隔以内、好まし
くは〔−90゜＜φ＜−40゜及び120゜＜Ψ＜180゜〕又は
〔−90゜＜φ＜−40゜及び−50゜＜Ψ＜10゜〕の間隔以
内の値を構成し、そしてそれらの位置は、α−ヘリック
ス又はβ−シート構造を保有することにより特徴付けら
れるこのプロテアーゼにおける領域には位置していな
い。

本発明に関して、安定化プロテアーゼはプロテアーゼ
変異体又は突然変異プロテアーゼであり、天然のプロテ
アーゼと機能的に同等であるか又はそれと類似の構造的
特徴を有し、且つ、このプロテアーゼにおいて天然のア
ミノ酸残基（プロリンを除く）は１又は複数の位置にて
プロリン残基に置き換えられ、その位置にて二面角φ
（ファイ）及びΨ（サイ）は〔−90゜＜φ＜−40゜及び
−180゜＜Ψ＜180゜〕の間隔以内、好ましくは〔−90゜
＜φ＜−40゜及び120゜＜Ψ＜180゜〕又は〔−90゜＜φ
＜−40゜及び−50゜＜Ψ＜10゜〕の間隔以内の値を構成
し、そしてそれらの位置は、α−ヘリックス又はβ−シ
ート構造を保有することにより特徴付けられるこのプロ
テアーゼにおける領域には位置していないものである。

更に、本発明に関連して、安定化プロテアーゼは改善
された安定性、例えば熱安定性、貯蔵安定性等を、親酵
素の比とべたときに有するプロテアーゼである。

タンパク質の二次構造の規定本発明の安定化プロテアーゼは、課題のプロテアーゼ
を二次構造の分析に付して、α−ヘリックス又はβ−シ
ート構造を保有することにより特徴付けられる該プロテ
アーゼにおける領域に位置する残基を除く、間隔〔−90
゜＜φ＜−40゜及び−180゜＜Ψ＜180゜〕、好ましくは
間隔〔−90゜＜φ＜−40゜及び−120゜＜Ψ＜180゜〕又
は〔−90゜＜φ＜−40゜及び−50゜＜Ψ＜10゜〕に限定
される二面角α（ファイ）及びΨ（サイ）をそれぞれ有
する該プロテアーゼにおける残基を同定し、もしこの同
定した位置にプロリンが存在していないなら、この同定
した位置において天然アミノ酸をプロリン残基によって
置換し（好ましくは課題のプロテアーゼをコードする遺
伝子に部位特異的突然変異誘発を適用することによ
る）、次いでこの安定化プロテアーゼをコードする遺伝
子を適当な宿主生物に挿入して遺伝子を発現させ、続い
て適当な栄養培地の中で前記宿主生物の培養を行い、そ
して所望のプロテアーゼを回収することによって獲得で
きる。

この調製法は課題のプロテアーゼを二次構造について
の分析に付することを含む。かかる分析を行うには、こ
のプロテアーゼの原子構造を明確にしなくてはならな
い。原子構造はＸ線回折技術により決定できる。Ｘ線回
折技術は例えばHendrickson,W.A〔Ｘ−ray diffractio
n:Protein Engineering（Oxender,D.L.とFox,C.F.編）
第１章;Alan R.Liss,lnc.（1897）〕及びCreighton,T.
E.,前掲、第６章に説明されている。

ズブチリシン309の結晶構造は推定されており〔Betze
l,B.,Klupsch,S.,Papendolf,G.,Hostrup,S.,Branner,S.
及びWilson,K.S.（1992）;J.Mol.Biol.223 427−44
5〕、そして同等物が寄与されており、そしてBrookhave
n Protein Data Bankより入手できる〔Bernsteinら（19
77）;J.Mol.Biol.112 535−542〕。

原子構造が決定されたら、その原子配位から二面角を
計算することが可能となる。更に、二次構造因子を決定
することが可能となる。この二次構造因子は水素結合に
基づいて決定される。協調的二次構造は「ターン」及び
「ブリッジ」の基本的な水素結合パターンの反復として
認識される。反復ターンは「ヘソックス」であり、反復
ブリッジは「ラダー」であり、連結ラダーは「シート」
である。

二次構造因子についての分析は、構造設定と原子配位
から抽出した幾何学的特徴とのコンピューター編集を必
要とする。原子配位に基づくタンパク質の二次構造を明
らかにする常用の方法はKabsch,W.とSander,C.により説
明されている〔Biopolymers（1983）22 2577−2637〕。
この論文において、パターン認識プロセスによる、原子
配位からの構造的特徴についての計算法が提供されてい
る。まず、Ｈ結合基のペアー間での静電的相互作用を基
礎としてＨ結合を同定する。次に、Ｈ結合のパターンを
二次構造因子、例えばターン（Ｔ）、ヘッド（Ｓ）、ブ
リッジ（Ｂ）、ヘリックス（G,H,I）、β−ラダー
（Ｅ）及びβ−シート（Ｅ）を規定するために利用す
る。

Kabsch ＆ Sanderファイルの計算を可能とし、そして
基本書PASCALに記載のコンピュータプログラムDSSP（タ
ンパク質の二次構造規定）はProtein Data Bank,Chemis
try Dept.,Brookhaven National Laboratory,Upton,N.
Y.11973より入手できる。

結晶性プロテアーゼにおける原子構造に基づいてアミ
ノ酸についての二面角φ（ファイ）及びΨ（サイ）を計
算した後、プロリン残基による置換にとって好適な二面
ファイ及びプサイ角を有する位置を選別することが可能
となる。プロリン残基の脂肪側鎖はペプチド基の窒素原
子に共有結合している。その結果５員環はペプチド主鎖
のＮ−Ｃα結合を中心とする回転は強く拘束され、同時
に主鎖Ｎ−原子に対する水素結合の形成は妨げられてい
る。このような構造的理由のため、プロリンは一般にα
−ヘリックス及びβ−シート二次コンホメーションとは
適合しない。Ｃα−Ｎ結合を中心とする同じ回転的拘束
及び鎖における所定のアミノ酸が乱れない条件に基づ
き、二面角ファイ及びサイ（特にファイ）の程度はポリ
ペプチドにおけるプロリン残基に関して一定の間隔で限
定される。ポリペプチドにおけるプロリン残基について
の二面角はほぼ排他的に間隔〔−90゜＜φ＜−40゜及び
−180゜＜Ψ＜180゜〕、好ましくは間隔〔−90゜＜φ＜
−40゜及び120゜＜Ψ＜180゜〕又は〔−90゜＜φ＜−40
゜及び−50゜＜Ψ＜10゜〕以内にある。関連して、シス
−及びトランス−プロリン残基の両方が考えられる。

前記の手法により１又は複数の位置にプロリンが既に
存在していることが認められることがあり、そしてこの
場合はむろん置換は不適切である。そうでなければ、こ
の方法は天然アミノ酸のプロリン残基による置換を含
む。

しかしながら、予測位置全てでのプロリンへの置換は
常にプロテアーゼの熱的安定性の改善をもたらすわけで
はない。この方法により表示されるいくつかの位置で
は、天然アミノ酸残基のプロリン残基への置換は予測し
得ない因子、例えば本質的な柔軟性の欠失、Ｈ結合の可
能性の欠失、予測し得ない立体障害等に基づいて不安定
の原因となりうる。かかる「臨界部位」は予測できな
い。

個別の置換の安定化性（又は不安定化性）効果は付加
的であると予測される。例えばWells,J.A.〔Biochemist
ry（1990）この（37）8510−8517〕及び下記の表４を参
照のこと。

ズブチリシン309とは異なるズブチリシンをこの方法
に付するとき（たとえこの２種のズブチリシンが非常に
類似しているときでさえも）、この方法より同じ位置番
号又は特に同じ位置が得られるとは限らない。いくつか
の位置は同一でありうる傾向にあり、そして位置の番号
はほぼ同じ傾向にあるが、それを予測することはできな
い。

しかしながら、任意の特定のプロテアーゼに適用した
上記の方法に由来する安定化性プロリン置換は、任意の
その他のプロテアーゼに対して、前者のプロテアーゼに
適用した上記の方法の結果とは異なる安定化性効果を有
していることもある。

ズブチリシン309分子（国際特許出願PCT/DK88/00002
を参照のこと）に本方法を実施したとき、表１及び２に
記載の一連のデーターが得られた。表１には、ファイ及
びサイ角に関連する、第１基準に合う一連の位置、及び
他の基準に合う一連の位置を示す。

表１に記載の基準に対するサイ角における拘束を緩和
することにより、４種の更なる突然変異が企てらる。表
２を参照のこと。

好ましい安定化プロテアーゼ好ましくは、本発明のプロテアーゼは安定化ズブチリ
シンプロテアーゼである。より特別な観点において、本
発明の好ましいプロテアーゼはズブチリシンであり、こ
こでこの獲得される安定化ズブチリシンは表１及び２に
記載の１又は複数の位置（BPN'番号）又はそれに類似の
位置でのプロリン残基への置換を含んで成る任意のズブ
チリシンである。

より特別な観点において、本発明のプロテアーゼは、
位置38,57,98,172,188,194,242及び259（BPN'番号）の
１又は複数の位置における天然アミノ酸（プロリンを除
く）がプロリン残基で置換されているズブチリシンであ
る。更に好ましい態様において、このズブチリシンは下
記の置換のうちの１又は複数の置換を更に含んで成る:2
7R,36D,76D,97N,98R,104Y,120D,128G,195E,206C,218S,2
35L,235R,237R,251E及び263F（BPN'番号）。

更により特別な観点において、本発明のプロテアーゼ
は安定化ズブチリシン309、安定化ズブチリシン147、安
定化ズブチリシンBPN'又は安定化ズブチリシンカールス
バーグである。ズブチリシン309及びズブチリシン147は
バチルスレンタス（Bacillus lentus）の変異体であ
り、そして米国特許第3,723,250号及び国際特許出願PCT
/DK88/00002に記載され、ズブチリシンBPN'はWellら〔N
ucleic Acids Res.（1983）11 7911−7925〕に記載さ
れ；ズブチリシンカールスバーグはSmithら〔Smith,E.
L.;Delange.R.J;Evans,W.H.;Landon,W.;Markland.F.S.
（1968）;Subtilisn Carlsberg V.The complete sequen
ce:comparison with subtilisin BPN';Evolutionary re
lation ships;J.Biol.Chem.243（９）2184−2191）及び
Jacobsら〔Nucl.Acids.Res.（1985）13 8913−8926〕に
記載されている。

別の特別な観点において、本発明のプロテアーゼは安
定化ズブチリシン308であって下記の置換のうちの１又
は複数が導入されているものである:T38P,S57P,A98P,S1
88P,A172P,A194P,S242P及びS259P（BPN'番号）。更に好
ましい態様において、このズブチリシンは下記の置換の
うちの１又は複数を更に含んで成る:K27R,^＊36D,N76D,G
97N,A98R,V104Y,H120D,S128G,G195E,Q206C,N218S,K235
L,K235R,K237R,K251E及びY263F（BPN'番号）。

更なる別の特別な観点において、本発明のプロテアー
ゼは安定化ズブチリシン309であって下記の置換のうち
の１又は複数が導入されているものである:T38P,S57P,A
98P,A172P,A194P,S242P及びS259P（BPN'番号）。更に好
ましい態様において、このズブチリシン309は下記の置
換のうちの１又は複数を更に含んで成る:K27R,^＊36D,N7
6D,G97N,A98R,V104Y,H120D,S128G,G195E,Q206C,N218S,K
235L,K235R,K237R,K251E及びY263F（BPN'番号）。

本発明の最好ましいプロテアーゼは：ズブチリシン30
9/K27R＋^＊36D＋G97N＋A98R＋A194P＋K235R＋K237R＋K2
51E＋Y263F、ズブチリシン309/K27R＋^＊36D＋G97N＋A19
4P＋K235R＋K237R＋K251E＋Y263F、ズブチリシン309/K2
7R＋^＊36D＋G97N＋A194P＋K235R＋K237R＋Y263F、ズブ
チリシン309/^＊36D＋N76D＋H120D＋A194P＋G195E＋K235
L、ズブチリシン309/^＊36D＋G97N＋V104Y＋H120D＋A194
P＋G195E、ズブチリシン309/^＊36D＋G97N＋V104Y＋H120
D＋A194P＋G195E＋K235L、ズブチリシン309/^＊36D＋G97
N＋H120D＋A194P＋G195E、ズブチリシン309/^＊36D＋G97
N＋H120D＋A194P＋G195E＋K235L、ズブチリシン309/^＊3
6D＋V104Y＋H120D＋A194P＋G195E、ズブチリシン309/^＊
36D＋V104Y＋H120D＋A194P＋G195E＋K235L、ズブチリシ
ン309/^＊36D＋H120D＋A194P＋G195E、ズブチリシン309/
^＊36D＋H120D＋A194P＋G195E＋K235L及びズブチリシン3
09/A194P（BPN'番号）である。

プロリン安定化の効果本発明に従って獲得できた精製変異体は野生型ズブチ
リシン（ズブチリシン309）に比べて少なくとも同等に
良好に洗浄をもたらすことが試験された。実験データー
については実施例５を参照のこと。

貯蔵安定性は一般に熱安定性に反映する、即ち、改善
された熱安定性は改善された貯蔵安定性に対応する。精
製変異体の熱安定性における改善を、示差熱量（DSC）
法により試験した。実験データーについては実施例３を
参照のこと。これらの試験の結果を下記の表３に示す。
貯蔵安定性はミニストーレッジテストにより試験し
（実験データーについては、実施例４を参照のこと）、
そして貯蔵安定性の結果を図２に示す。

表３から、野生型酵素に比にて構築した変異体のうち
の３種が有意に改善された熱安定性を有し、変異体のう
ちの２種が若干改善された熱安定性を有し、変異体のう
ちの４種が熱安定性において有意な変化を有さず、そし
て変異体のうちの３種が有意に下がった熱安定性を有す
ることが示された。

これらの結果は、本明細書に記載のファイ−プサイ−
概念によるタンパク質のプロリン残基の導入による安定
化について明確な理論が存在するにもかかわらず、個別
の変異体の安定化効果についての結論は立てられない。

しかしながら、改善された熱安定性を有する変異体が
獲得されるとき、個別の突然変異の安定化効果は一般に
付加的と考えられる。これは、野生型酵素に対比して
の、ズブチリシン309変異体の示差熱量（DSC）により決
定される熱変性温度を示している下記の表４において実
証されている。

従って、挿入した安定化性プロリン残基の他に、本明
細書記載の１又は複数の付加安定化性突然変異を含む安
定化プロテアーゼ変異体は本発明の範囲に属すると考え
られる。

プロテアーゼをコードする遺伝子において突然変異を供
する方法遺伝子の中へと突然変異を導入する多くの方法が当業
界によく知られている。ズブチリシン遺伝子をクローニ
ングする簡単な説明の後に、このズブチリシン遺伝子内
の特定の部位に突然変異を発生せしめる方法を説明す
る。

ズブチリシン遺伝子のクローニングズブチリシンをコードする遺伝子は当業界によく知ら
れている様々な方法により任意のグラム陽性菌又は菌類
からクローンされうる。まずゲノム及び／又はDNAのcDN
Aライブラリーを、課題のズブチリシンを生産する生物
に由来する染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構
築する。次に、ズブチリシンのアミノ酸配列がわかって
いるなら、相同性のオリゴヌクレオチドプローブを合成
し、ラベルし、そして細菌DNAのゲノムライブラリーに
由来する、又は菌類cDNAライブラリーに由来するズブチ
リシンコードクローンを同定するのに用いることができ
る。他方、別の細菌又は菌類の株に由来するズブチリシ
ンに相同性の配列を含むラベル化オリゴヌクレオチドプ
ローブを、低緊縮のハイブリダイゼーション及び洗浄条
件を用いてズブチリシンコードクローンを同定するプロ
ーブとして利用できる。

ズブチリシン生産性クローンを同定する更に別の方法
は、プラスミドのような発現ベクターへのゲノムDNAの
フラグメントの挿入、得られるゲノムDNAライブラリー
によるプロテアーゼ陰性細菌の形質転換、その後のこの
形質転換細菌のズブチリシンのための基質、例えばスキ
ムミルクを含むアガー上でのプレーティングを包括す
る。ズブチリシン保有プラスミドを含む細菌は、分泌し
たズブチリシンによるスキムミルクの消化により、透明
なアガーの輪により囲まれたコロニーをもたらすであろ
う。

ズブチリシン遺伝子における部位特異的突然変異誘発の
発生ズブチリシン遺伝子がクローンでき、そして突然変異
誘発にとって所望される部位が同定されたら、合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて突然変異を導入することができ
る。これらのオリゴヌクレオチドは所望の突然変異部位
にフランクしたヌクレオチド配列を含んでおり、突然変
異ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成中に挿入され
る。好ましい方法において、ズブチリシン遺伝子を橋渡
しする一本鎖ギャップのDNAを、ズブチリシン遺伝子を
抱えるベクターの中に作る。次に所望の突然変異を抱え
る合成ヌクレオチドをこの一本鎖DNAの相同性領域とア
ニールさせる。残留ギャップを次にDNAポリメラーゼＩ
（クレノウフラグメント）により補完し、そしてその
構築体をT4リガーゼを用いてリゲートさせる。本方法の
特定の例はMorinagaら（1984）;Biotechnology,2 646−
639に記載されている。Morinagaらに従うと、遺伝子内
のフラグメントは制限エンドヌクレアーゼを用いて除去
している。ギャップを含んでいるベクター／遺伝子を次
に変性させ、次いでギャップを含む代わりに、このギャ
ップに包括される領域外の部位にて別の制限エンドヌク
レアーゼで切断されているベクター／遺伝子とハイブリ
ダイズさせる。この遺伝子の一本鎖領域はこれにより突
然変異オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
にとって有用となり、残留ギャップはDNAポリメラーゼ
Ｉのクレノウフラグメントにより補完し、挿入体はT4 D
NAリガーゼによりリゲートし、そして１サイクルの複製
の後、所望の突然変異を抱える二本鎖プラスミドを作
る。Morinagaの方法は新しい制限部位を構築する付加操
作を回避しており、従って複数の箇所での突然変異の発
生を助長する。1988年７月26日に認められたEstellらの
米国特許第4,760,025号は、カセットのマイナー変更を
実施して複数の突然変異を抱えるオリゴヌクレオチドを
導入することを可能としているが、しかしながら、Mori
nagaの方法は、様々な長さの多重オリゴヌクレオチドを
導入することができるため、同時により多くの突然変異
を導入することさえもできる。

ズブチリシン変異体の発現本発明に従い、上記の方法により、実施例１に記載の
方法により、又は当業界に知られる任意のそれらに代わ
る方法により生産された突然変異ズブチリシンは、発現
ベクターを用いることで酵素形態で発現されうる。発現
ベクターは一般にクローニングベクターの定義のもとに
属し、なぜなら発現ベクターは通常典型的なクローニン
グベクターの構成要素、即ち、微生物のゲノムとは独立
して微生物におけるベクターの自己複製を可能とする因
子、及び選別目的のための１又は複数の表現型マーカー
を含むからである。発現ベクターはプロモーター、オペ
レーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルをコ
ードするコントロール配列、及び任意的にレプレッサー
遺伝子又は様々な活性化遺伝子を含む。

発現タンパク質の分泌を可能とするため、「シグナル
配列」をコードするヌクレオチドを遺伝子のコード配列
の前に挿入することができる。コントロール配列の指示
のもとで発現のため、本発明に従って処理すべき標的遺
伝子は適切なリーディングフレーム中のコントロール配
列と作動連結している。プラスミドベクターの中に含ま
せることができ、且つ、突然変異ズブチリシン遺伝子の
転写を助けることのできるプロモーター配列には原核系
β−ラクタマーゼプロモーター〔Villa−Kamaroffら（1
978）;Proc.Natl.Acad.Sci.USA;75 3727−3731〕及びta
cプロモーター〔DeBoerら（1983）;Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA;80 21−25〕が含まれるが、それらに限定されな
い。更なる参考はScientific American（1980）;242 74
−94の「Useful proteins from recombinant bacteri
a」においても見い出せる。

一態様に従うと、B.スブチリスを突然変異DNAを保有
する発現ベクターにより形質転換させる。発現を分泌性
微生物、例えばB.スブチリスの中で行うとき、シグナル
配列は翻訳開始シグナルの後方、且つ、課題のDNA配列
の前方にあってよい。シグナル配列は発現生成物を細胞
壁へと輸送するのに働き、ここでそれらは分泌によって
この生成物から切断される。「コントロール配列」なる
語はシグナル配列が存在するならそれを含むことを意図
する。

本発明の安定化酵素を生産することの可能な微生物
は、同化炭素及び窒素をその他の必須栄養物と一緒に含
む栄養培地の中での常用の培養法により培養でき、この
培地は当業界の原理に従って構成される。

ヌクレオチド配列及び微生物本発明はまた、本発明の安定化プロテアーゼをコード
するDNAヌクレオチド配列及び安定化プロテアーゼをコ
ードするDNAヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関
連する。

この安定化プロテアーゼは、このプロテアーゼをコー
ドするDNAヌクレオチド配列を適当な宿主生物における
適当な発現ベクターの中に挿入したときに発現されて生
産される。この宿主生物は親遺伝子が由来する生物と同
一である必要はない。突然変異遺伝子、ベクター、並び
に突然変異及び形質転換微生物の構築は当業界に知られ
る任意の適切な組換DNA技術により実施されうる。

本発明は安定化プロテアーゼをコードするDNAヌクレ
オチド配列を保有する発現ベクターを含む宿主生物にも
関連する。

洗剤本発明は更に、洗浄及び洗浄組成物における本発明の
安定化プロテアーゼの利用、並びに安定化プロテアーゼ
を含んで成るかかる組成物を含んで成る。

かかる組成物は本発明の任意の１又は複数のプロテア
ーゼを単独で、又はかかる組成物の中に含まれている当
業者によく知られている任意の通常の成分と組合されて
含んで成る。

かかる成分はビルダー、例えばホスフェートもしくは
ゼオライトビルター、界面活性剤、例えばアニオン、カ
チオン、非イオンもしくは両性イオン型界面活性剤、ポ
リマー、例えばアクリルもしくは等価（equivalent）ポ
リマー、ブリーチ系、例えばパーボレートもしくはアミ
ノ含有ブリーチ前駆体もしくは活性剤、構成剤（struct
urant）、例えばシリケート構成剤、pH調整のためのア
ルカリもしくは酸、保湿剤、及び／又は中性無機塩を含
んで成る。

本発明の洗剤は任意の常用の形態、例えば粉末、液体
等に処方されうる。

該酵素は洗浄中でのよく知られた標準量において利用
されうる。その量は非常に広範囲、例えば約0.0002〜0.
01、例えば約0.005〜0.05アンソン単位／洗浄ｇであり
うる。他の単位で表わすと、このプロテアーゼは組成物
の中に、約0.1〜100GU/洗剤mg（例えば１〜50、特に５
〜20GU/mg）の桁の量、又は約0.01〜４、例えば0.1〜0.
4KNPU/洗剤ｇを中心とする広範囲における任意の量にお
いて含まれる。

KNPUは既に定義した。GUはグリシン単位であり、標準
条件のもとで、40℃での15分間のインキュベーションの
際に、基質としてＮ−アセチルカゼインを用い、１マイ
クロモルのグリシンに相当するNH₂基の量を供するタン
パク質分解酵素活性として定義する。

例えば本酵素を１リットルの洗浄液当り約0.25mgの酵
素タンパク質の割合で利用することが適切であり、これ
は0.08KNPU/l程度の酵素活性に相当する。関連の洗浄組
成物は例えば0.1〜0.4KNPU/gの量における酵素を含みう
る。

この洗剤は更なる酵素も含みうる。

例えば、リパーゼが、担体材料を有する脂質分解酵素
の顆粒組成物（又は溶液もしくはスラリー）の形態にお
いて有利に加えられうる（例えばEP特許公開第258,068
号（ノボノルディスクA/S）；更にはLipolase（商
標）及びその他のノボノルディスクの酵素組成物）。

加えるリパーゼの量は幅広い限界内、例えば50〜30,0
00LU/g/界面活性剤もしくは洗剤ｇ、例えば通常は少な
くとも100LU/g、非常に有用には少なくとも500LU/g、時
折り好ましくは1000LU/g以上、2000LU/g以上又は4000LU
/g以上又はそれより多くの範囲内で選ぶことができ、従
ってたいていは50〜4000LU/gの範囲、そして可能として
は200〜1000LU/gの範囲にある。本明細書におけるリパ
ーゼの単位はEP特許公開第258,068号に定義されている
通りである。

脂質分解酵素は広範囲にわたるリパーゼから選ばれう
る。詳しくは、例えば下記の特許明細書:EP特許公開第2
14,761号（ノボノルディスクA/S）、第258,068号に記
載のリパーゼ、そして特に、サーモマイセスラヌギノ
サス（Thermomyces lanuginosus）由来のリパーゼに対
して発生させた抗血清と免疫学的に交差反応性を示すリ
パーゼ（EP特許公開第205,208号及び第206,390号）、そ
して特に、クロモバクタービスコサムバーリポリ
チカム（Chromobacter viscosum var lipolyticum）NRR
L B−3673に由来のリパーゼ又はアルカリジーンズ（Alc
aligenes）PL−679,ATCC 31371及びFERM−P 3783由来の
リパーゼに対して発生させた抗血清と免疫学的に交差反
応性を示すリパーゼ、更にはWO 87/00859（Gist−Broca
des）及びEP特許公開第204,284号（サッポロビール）に
記載のリパーゼである。特に適切なのは例えば下記の市
販のリパーゼ調製物である；リプラーゼノボノルデ
ィスクA/S、アマノリパーゼCE,P,B,AP,M−AP,AML及びCE
S、並びにメイトーリパーゼMY−30,OF、及びPL、更には
エステラーゼMM、リポザイム、SP 225,SP285、サイケン
リパーゼ、エンゼコリパーゼ、トーヨジョーゾーリパー
ゼ及びディオシンス（Diosynth）リパーゼである（商
標）。

所望するならば例えばアミラーゼを、約１〜約100MU
（マルトース単位）／洗剤ｇ（又は0.014〜1.4、例えば
0.07〜0.7KNU/g（ノボ単位））の範囲の量で利用でき
る。所望するならば例えばセルラーゼを、約0.3〜約35C
EVU単位／洗剤ｇの範囲の量で利用できる。

本発明の洗剤の中に通常の量で存在しうる通常の洗剤
成分は下記の通りである：この組成物はビルダー入り又
はビルダーなしでよく、そしてゼロ−Ｐ−型でありうる
（即ち、リン含有ビルダーを全く含まない）。従って該
組成物は例えば１〜50重量％、例えば少なくとも約重量
５％、そして通常は約35〜45重量％の１又は複数の有機
及び／又は無機ビルダーを凝集物の中に含みうる。典型
的なビルダーには前記したものが含まれ、そして更に広
くは、アルカリ金属オルト、ピロ及びトリポリホスフェ
ート、アルカリ金属カルボネートが含まれ、それらは単
独で、又は方解石、アルカリ金属シトレート、アルカリ
金属ニトリロトリアセテート、カルボキシメチルオキシ
スクシネート、ゼオライト、ポリアセタルカルボキシレ
ート等と混合されていてよい。

更に、該洗剤は１〜35％のブリーチング剤もしくはブ
リーチ前駆体、又はブリーチング剤及び／もしくは前駆
体とそれらの活性剤とを含んで成る系を含みうる。更な
る任意的な成分には、泡ブースター、発泡低下剤、腐触
防止剤、土壌懸濁剤、封鎖剤、耐汚染付着剤、香料、着
色料、酵素のための安定剤等である。

該組成物は繊維材料、特に、限定はしないが綿及びポ
リエステルベース繊維並びにその複合物の洗浄のために
利用できる。例えば洗浄工程は約60〜65℃又はそれより
低い、例えば約30〜35℃又はそれより低い温度で実施さ
れるのが特に好ましい。該組成物を約例えば0.4〜0.8g/
lの洗浄液中の界面活性剤を供するのに十分な割合で利
用することが非常に適切でありうるが、より低い又はよ
り高い濃度を利用することも必要であるならばむろん可
能である。限定はしないが、約１〜10g/l、例えば約３
〜6g/lの洗剤の利用率が、この洗剤が実質的に実施例の
通りである場合は適切である。

いくつかの有用な態様において、洗剤は下記の通りに
処方されうる：洗剤I: ゼオライトビルダーを含む本発明の態様に従う洗剤粉
末は以下のものを含むように配合される：約16％の全活性洗剤、約９％のアニオン洗剤、約６％
の非イオン洗剤、約20％のゼオライト含有ビルダー、約
3.5％のアクリル又は等価ポリマー、約６〜18％のパー
ボレートブリーチ前駆体、約２％のアミノ含有ブリーチ
活性剤、約3.5％あるいは下は約2.5％までのシリケート
又は他の構成剤、約８（あるいは約15）グリシン単位/m
g級の酵素と、使用時に所望のpHに合わせるためのアル
カリ、及び中性無機塩、並びに酵素（約0.5％の各酵
素）。

アニオン洗剤はドデシル−ベンゼンスルホン酸ナトリ
ウムあるいは線形アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム６％と、第一アルキルスルフェート３％との混合物で
ある。非イオン洗剤は、モル当り７個のエトキシレート
残基を有するおよそC13〜C15の第一アルコールのエトキ
シレートである。ゼオライトビルダーはＡ型ゼオライト
である。ポリマーはポリアクリル酸である。パーボレー
トブリーチ前駆体は四硼酸ナトリウム・４水和物又は１
水和物である。活性剤はテトラアセチル−エチレンジア
ミンである。構成剤は珪酸ナトリウムである。中性無機
塩は硫酸ナトリウムである。

洗剤II 本発明の態様にかかわる水性洗剤液は下記のものを含
むように配合される： 16％のドデシルベンゼンスルホン酸、７％の7mol/mol
のエチレンオキサイドと縮合したC12〜C15の線形アルコ
ール、２％のモノエタノールアミン、6.5％のクエン
酸、６％のキシレンスルホン酸ナトリウム、約4.1％の
水酸化ナトリウム、0.5％のプロテアーゼ、100％に至る
水。pHは９と10との間の値に合わせる。

他の有用な態様において、該洗浄は例えば国際特許公
開WO 91/00334,WO 91/00335及び国際特許出願PCT/DK91/
00399に記載の通りに配合されうる。

本発明を下記の実施例で更に説明するが、これらは本
発明の範囲を限定することは意図していない。

実施例１調製例野生型及び本発明の態様に従う変異プロテアーゼにつ
いてコードする遺伝子を構築及び発現するための現状好
ましい方法を示している下記の実施例において、材料は
下記の通りである： B.スブチリス309及び147はバチルスレンタスの変異
体であり、NCIBに寄託されて寄託番号NCIB 10147及びNC
IB 10309が付され、そして引用することで本明細書に組
入れる米国特許第3,723,250号に記載してある。

E.コリMC100（M.J.CasadabenとS.N.Cohen（1980）;J.
Mol.Biol.;138 179−207）は、常用の方法によりγ−,m
＋とされ、そして米国特許出願第039,298に記載されて
いる。

ズブチリシン及びその突然変異体をコードする合成遺
伝子に適するベクターを構築した。これは本質的にpCU1
9プラスミド〔C.Yanish−PerronとJ.Messing（1985）;G
ene;33 103−119〕であり、その多重クローニング部位
は、この遺伝子を構成する５つのサブフラグメントを分
けるのに利用する制限部位を含むリンカーで置き換えら
れている。この新しいリンカーはEco RI−Hind III切断
pCU19の中に挿入され、これによりそれらの部位は破壊
される。

（RI）Kpnl Pstl EcoRI Hind3 Clal Sphl Bam（H3）ズブチリシン309の成熟部についてコードする合成遺
伝子を下記の詳細及び添付図面の図１（図面1/7〜7/7）
の図式により示す通りに構築した。合成遺伝子の構造は
図面１〜/7〜4/7にまとめてあり、これはこの構築にお
いて用いたフラグメントも示している。各サブフラグメ
ントは６〜12のオリゴヌクレオチドより成る。このオリ
ゴヌクレオチドは制御型ガラス支持体の上でホスホラミ
ジット化学を用い、自動DNA合成装置で合成した〔S.L.B
eaucageとM.H.Carruthers（1981）;Tetrahedron Letter
s;22 1859−1869〕。図中のオリゴヌクレオチドの5'末
端における点は、これらのオリゴヌクレオチドがリン酸
化されていることを示す。オリゴヌクレオチドの対応の
組より二量体（図面1/7〜4/7に示す）を、90℃で５分熱
し、続いて75分かけて室温に冷やすことによって形成せ
しめた。この二量体をT4 DNAリガーゼと混ぜ合わせ、そ
して処理した。

５つのサブフラグメントを２％のアガロースゲルで単
離し、そしてpSX191に挿入した。この配列をジデオキシ
ヌクレオチドシーケンシングにより確認した。フラグメ
ントＡ〜Ｅが単離され、そして一緒にKpn I−Bam HI切
断pSX191にリゲートさせた。このリゲーション混合物を
アンピシリン耐性についての選別用のコンピテントE.コ
リMC1000γ−,m＋に形質転換せしめるために用いた。該
酵素の成熟部についてコードするズブチリシン309の部
分を構成する850bpのKpn I−Bam HIフラグメントを次
に、pSX212上の野生型遺伝子と置き換えるために用いて
pSX222を作り、次にこれをコンピテントＢスブチリスSH
a273に形質転換させた。この形質転換性の培養及び酵素
の精製を経て、この生成物は野生型生成物とは異なるこ
とが示された。

合成遺伝子に由来するプロテアーゼ変異体は、突然変
異が所望される箇所（例えば以下に示す配列を有する箇
所）にて変更された配列を有するオリゴヌクレオチドを
用い、次いでそれをこの合成遺伝子に適する残りのオリ
ゴヌクレオチドと混ぜ合わせることによって作った。変
異遺伝子の集成は、前述の方法に類似した方法で、変異
材料を用いて実施した。合成遺伝子の更なる情報はAgar
valら（1970）;Nature;227 27−34において得られる。

Kpn I部位を、この酵素の成熟部をコードするズブチ
リシン309合成遺伝子の起源に導入した。利用した方法
はいわゆるオリゴヌクレオチド誘導二本鎖破損修復突然
変異誘発であり、そしてWlodek Mandecki（1986）;Pro
c.Nat.Acad.Sci.USA;83 7177−7181に記載されている。
pSX172をNco Iにより、ズブチリシン309遺伝子の成熟部
の起源で開き、そしてオリゴヌクレオチドNOR789（図１
（7/7）に配列を示す）と混ぜ、100℃に熱し、０℃に冷
やし、そしてE.コリに形質転換させた。再形質転換の
後、この組換体は32−Ｐ−ラベル化NOR789を用いるコロ
ニーハイブリダイゼーションによってスクリーンでき
る。このスクリーングで陽性と認められる組換体は、ア
ミノ酸配列を変えずに２個の塩基が変わることによる、
Nco Iのすぐ前に導入されたKpn I部位を有していた。pS
X172はEP特許公開第405,901に記載されている。このよ
うにして作られたKpn I部位を400bpのPvu I−Nhe Iフラ
グメント上のpSX120に挿入して、pSX212を作った。pSX1
20もEP特許公開第405,901号に記載されている。

合成遺伝子をpSX212上のKpn IとBam HIとの間に挿入
してpSX222を作った。

オリゴヌクレオチドの突然変異及び対応の配列は以下
の通りである：これらのオリゴヌクレオチドを、合成遺伝子の変化し
ていない残りのオリゴヌクレオチドと合わせた。

実施例２精製例この手順はズブチリシン147酵素、ズブチリシン309酵
素又はそれらの突然変異体10リットルスケール培養の精
製に関する。

約81の培養培地を１リットルのビーカーの中で35分間
5000rpmで遠心した。その上清液を10％の酢酸を用いてp
H6.5に合わせ、そしてSeitz Supra S100フィルタープレ
ートで濾過した。

その濾液を、Amicon S1Y10 UFカートリッジの付いたA
micon CH2A UFユニットを用いて約400mlに濃縮した。こ
のUF濃縮物を遠心し、次いで濾過し、そしてBacitracin
アフィニティーカラムに室温でpH7にて吸収させた。こ
のプロテアーゼを、0.01のジメチルグルタル酸、0.1Mの
硼酸及び0.002Mの塩化カルシウムを含むpH7に合わせた
緩衝液中の25％の２−プロパノール及び1Mの塩化ナトリ
ウムを用いて室温でこのBacitracinカラムから溶離させ
た。

このBacitracin精製工程由来のプロテアーゼ活性を有
する画分を合わせ、そして0.01のジメチルグルタル酸、
0.2Mの硼酸及び0.02Mの塩化カルシウムを含むpH6.5に合
わせた緩衝液で平衡にした750mlのSephadex G25カラム
（径5cm）に適用した。

このSephadex G25カラム由来のタンパク質分解活性を
有する画分を合わせ、そして0.01Mのジメチルグルタル
酸、0.2Mの硼酸及び0.002Mの塩化カルシウムを含みpH6.
5に合わせた緩衝液で平衡にした150mlのCM Sepharose C
L 6B陽イオン交換カラム（径5cm）に適用した。

このプロテアーゼを同一の緩衝液２リットル中の０〜
0.1Mの塩化ナトリウム勾配（sub 147の場合は０〜0.2M
の塩化ナトリウム）を用いて溶離させた。

CM Sepharoseカラム由来の画分を含む最終精製工程プ
ロテアーゼを合わせ、そしてGRP81PP膜（Danish Sugar
Factories 1nc.より）の付いたAmicon限外濾過セルで濃
縮した。

実施例３示差熱量精製プロテアーゼ変異体を示差熱量（DSC）によって
熱分析にかけた。

装置は、データーの収集及び分析のためのHP86コンピ
ューターに接続されたSetaram micro DSC装置とした。S
etaramのソフトウェアーを用いた。

酵素を下記の組成の液状ビルト洗剤（pH8.5）の中で
好ましくは2mg/mlの濃度に希釈した： AE¹（C_12-14）;EO6 15％ LAS²（C₁₂） 10％ココナッツ脂酸９％オレイン酸（C₁₈）１％トリエタノールアミン（pKA7.9）９％グリセロール 10.5％エタノール 1.5％クエン酸ナトリウム８％ CaCl;2H₂O 0.1％ NaOH １％水 34.9％１）アルコールエトキシレート２）線形アルキルベンゼンスルホネート加熱率は25℃から90℃に至るまで0.5℃／分とした。

この方法により測定した、野生型酵素に対するズブチ
リシン309変異体の安定化を上記の表３に示している。

実施例４貯蔵安定性本発明の酵素の貯蔵安定性を決定し、そしてズブチリ
シン309（野生型）の貯蔵安定性と比較した。この安定
性試験はミニストーレッジテストで行った。各チュー
ブの中で100μｌのサンプルを用いた。

酵素容量は0.25mgの酵素／洗剤ｇとした。この試験に
おいて液状洗剤を用いた。前掲の洗剤IIを参照のこと。

チューブを35℃でそれぞれ3,7,14及び21日間インキュ
ベートし、そして残留活性を決定した。

残留活性決定法はタンパク質分解酵素によるジメチル
カゼイン（DMC）溶液の消化に基づく。このプロセスで
形成される第一アミノ基はトリニトロベンゼンスルホン
酸（TNBS）と反応して、着色錯体を形成する。この反応
をその場で追って、単位時間当りの吸収の変化を計算す
る。

この洗剤は第一アミノ基を有する化合物を含みうるた
め、これを調べ、そして清浄効率の補正を行うことが必
要である。補正は純粋な洗浄剤のブラインド値を測定
し、そしてこの値を前述の通りに測定した値から差し引
くことによって行われる。

活性は、調製後直ちに凍結して分析するまで−10℃の
温度に保存したサンプルと対比させて決定した。このサ
ンプルの活性を100％に設定した。貯蔵試験からの対応
のサンプルの活性を100％のサンプルの対比させて決定
した。

反応条件は：温度 :40℃ pH :8.3 波長 :420nm 反応時間 :9分測定時間 :3分装置：〈COBAS〉FARA II遠心分析器（Rocheよ
り）とした。

全ての活性は二重測定した。

この分析法を説明しているホルダーAF285/1（又は後
版）はノボノルディスクA/Sデンマークより受問によ
り入手でき、これは引用することで本明細書に組入れ
る。

貯蔵安定性試験の結果を図２に示す。一般に、DSCに
より決定した熱安定性と貯蔵安定性はよく相関する。

実施例５洗浄性能洗浄性能試験は20℃で等温で10分間の標準洗浄におい
て、草汁で汚した綿に基づいて行った。

洗剤として5g/lの粉末洗剤を用いた。前掲の洗剤Ｉを
参照のこと。NaOH/HClの添加によってpHを10.2に合わせ
た。表５に示す試験については約９゜dH（ドイツ硬度）
の水を使用した。表６に示す試験については６゜dHの水
を使用した。繊維／洗浄液の比は洗浄液のリットル当り
6gの繊維とした。

試験は0,0.025,0.05,0.1,0.5,1.0及び2.0mg酵素タン
パク質/lの酵素濃度で行った。２通りの個別セットの試
験を各酵素について行った。表５〜６に示す結果はこれ
らの試験の平均値である。

洗浄に続いて、布帛を流水道水ですすぎ、そして風乾
した。プロテアーゼ性能はDatacolor Elrephometer 200
0で測定した460nmでの規約反射率（％Ｒ）の変化（Δ
Ｒ）によって決定し、ΔＲは加えたプロテアーゼによる
洗浄後の規約反射率から、プロテアーゼを加えない洗浄
後の規約反射率を差し引いたものである。

洗浄性能試験由来の結果を表５〜６に示す。ズブチリ
シン309/S256Pを除く全ての変異体はズブチリシン309
（野生型）と少なくとも同程度に機能することが認めら
れた。

フロントページの続き (72)発明者ヘデゴールド，リスベトデンマーク国，デーコー−2100 コペンハーゲンエー．，クラッセンスガゼ 35，５．テー．ホー. (72)発明者エリクセン，ニナデンマーク国，デーコー−2000 フレデリクスベルウ，マティルデバイ 15，イー．テー．ベー. (72)発明者エグモント，マールテンロベルトオランダ国，エヌエル−3461 ヘーデーリンスホーテン，デネス 34 (72)発明者カステレエイン，エリクオランダ国，2907 セーヘーカペレアー／デーエイッセル，パレティエルブルク 105 (56)参考文献特表昭63−502959（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／009819（ＷＯ，Ａ１) 国際公開91／000345（ＷＯ，Ａ１) 国際公開89／006279（ＷＯ，Ａ１) 国際公開89／001520（ＷＯ，Ａ１) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．160, Ｎｏ．１（1989）ｐ．109−114 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ズブチリシンのプロリンを除く天然アミノ
酸が位置194（BPN′番号）にてプロリン残基により置換
されている、安定化ズブチリシン。
【請求項２】１又は複数の下記の置換:27R,36D,38P,76
D,97N,98R,104Y,120D,128G,188P,195E,206C,218S,235L,
235R,237R,242P,251E及び263F（BPN′番号）を更に含ん
で成る、請求項１に記載の安定化ズブチリシン。
【請求項３】ズブチリシンがズブチリシン309又はズブ
チリシンカールスバーグである、請求項１又は２に記載
の安定化ズブチリシン。
【請求項４】ズブチリシンがズブチリシン309であり、
置換A194P（BPN′番号）が導入されている、請求項３に
記載の安定化ズブチリシン。
【請求項５】１又は複数の下記の置換:K27R,^＊36D,N76
D,G97N,A98R,V104Y,H120D,S128G,G195E,Q206C,N218S,K2
35L,K235R,K237R,K251E及びY263F（BPN′番号）を更に
含んで成る、請求項４に記載の安定化ズブチリシン。
【請求項６】ズブチリシンがズブチリシン309であり、
下記のズブチリシン309変異体のいずれかである、請求
項５に記載の安定化ズブチリシン： K27R＋^＊36D＋G97N＋A98R＋A194P＋K235R＋K237R＋K251
E＋Y263F（BPN′番号）； K27R＋^＊36D＋G97N＋A194P＋K235R＋K237R＋K251E＋Y26
3F（BPN′番号）； K27R＋^＊36D＋G97N＋A194P＋K235R＋K237R＋Y263F（BP
N′番号）；^＊ 36D＋N76D＋H120D＋A194P＋G195E＋K235L（BPN′番
号）；^＊ 36D＋G97N＋V104Y＋H120D＋A194P＋G195E（BPN′番
号）；^＊ 36D＋G97N＋V104Y＋H120D＋A194P＋G195E＋K235L（BP
N′番号）；^＊ 36D＋G97N＋H120D＋A194P＋G195E（BPN′番号）；^＊ 36D＋G97N＋H120D＋A194P＋G195E＋K235L（BPN′番
号）；^＊ 36D＋V104Y＋H120D＋A194P＋G195E（BPN′番号）；^＊ 36D＋V104Y＋H120D＋A194P＋G195E＋K235L（BPN′番
号）；^＊ 36D＋H120D＋A194P＋G195E（BPN′番号）；^＊ 36D＋H120D＋A194P＋G195E＋K235L（BPN′番号）； A194P（BPN′番号）。
【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項に記載の安定
化ズブチリシンをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】請求項１〜６のいずれか１項に記載の安定
化ズブチリシンをコードするポリヌクレオチドを含んで
成る発現ベクター。
【請求項９】請求項１〜６のいずれか１項に記載の安定
化ズブチリシンをコードするポリヌクレオチドを担持す
る発現ベクターを含む宿主生物。