JPS63502959A - 突然変異誘発及びスクリ−ニング方法並びに生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 突然変異誘発及びスクリーニング方法並びに生成物本出願は、１９８６年２月１ ２日米国で出願された出願第８２８，５４５号の一部継続出願であって、その内 容は参考のため本明細書に十分に組込まれる。

発明の分野 本発明は、遺伝物質を突然変異させかつ所望の突然変異に関して突然変異遺伝物 質をスクリーニングするための方法に関する。本発明は更に、開示された方法に 従い製造された突然変異遺伝物質、並びにかかる突然変異遺伝物質の発現生成物 にも関する。

背景技術の説明 天然タンパク質のうち最大の類は酵素である。各酵素は通常各種の化学反応を触 媒し、その機能に関して通常高い特異性を有する。酵素分子は、特定基質が触媒 回路代謝時に結合する活性部位を有している。

所定の生物種における個々のタイプの天然酵素には異なる種類が若干存在するが 、同一の生物種から産生される特定のタイプの酵素分子は通常、基質特異性、熱 安定性、様々な条件（例えば、温度及びｐＨ）下における活性レベル、酸化安定 性等に関して実質上同一である。天然又は“野生型”酵素のこのような特性は、 酵素を自然環境下以外で使用した場合には、必ずしも最適ム状態とはならない。

したがって、特定の用途、即ち特定の環境下での使用のために酵素のある性質を 最適なものとするためには、酵素の天然特性を変えることが望まれるのである。

酵素のアミノ酸配列は酵素の特性を決定し、更に酵素のアミノ酸配列は酵素につ いてコードする遺伝子のヌクレオチド配列によって特定される。酵素のアミノ酸 配列の変更は酵素の性質を様々に異なった程度で変え、即ちアミノ酸配列におけ る変更の位置、種類及び／又は程度に応じて酵素を不活性にさえさせるかもしれ ない。

ＤＮＡのオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｅ−ｄｌｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｌｓ）のように特定アミノ酸の変更 をタンパク質に導入する方法は、当業者に公知である。しかしながら、特定の突 然変異の効果を予測しうる能力が乏しいため、所望の突然変異を生じさせ特徴付 けする方法を面倒なものにしている。

遺伝物質のランダム突然変異誘発方法も公知であるが、多数の突然変異体の迅速 かつ効果的なスクリーニング方法がないため、所望の変異物質をもつ生物の同定 は時間がかかるものである。

新規かつ実用的な突然変異誘発及びスクリーニング方法、並びにその生成物に関 する必要性が当業界にはなお存在している。

天然の細菌性プロテアーゼは現在多くの目的のために使用されており、これら目 的の中には洗浄用製品への添加剤としてのものがある。布地上のほとんどの汚れ はタンパク質であって、広域特異性プロテアーゼはかかる汚れの除去を実質上改 善することができる。しかし残念ながら、天然プロテアーゼは洗剤含有溶液中で 貯蔵された場合に活性を失ってしまう。典型的には、この活性の衰退は本来幾可 級数的であって、即ち活性が一定の率で経時的に失われていく。本発明は、天然 プロテアーゼよりも著しく長く液体洗剤中での貯蔵に耐えかつ高い熱的安定性を 有する新規プロテアーゼを開発する方法を提供する。

発明の要旨 本発明によれば、クローンＤＮＡを突然変異させしかる後突然変異体を同定する ための方法は、クローンＤＮＡセグメント中に一重鎖標的領域を作出し、−重鎖 ＤＮＡ中に突然変異を導入しうる化学的突然変異誘発剤で標的領域を処理するこ とにより標的領域中に突然変異を導入することからなる。次いで、標的領域は突 然変異した二重鎖ＤＮＡを形成させるために二重鎖化され１．微生物は突然変異 二重鎖ＤＮＡ含有の発現ベクターで形質転換される。形質転換微生物は突然変異 ＤＮＡが発現して発現生成物を形成するような条件下で培養され、発現生成物は ＤＮＡセグメント中の所望の突然変異を同定するためにスクリーニングされる。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明による突然変異誘発及びスクリーニングのためにプラスミドｐ ＧＸ４３３０でクローニングされたズブチリシン遺伝子について示した概略図で ある。

第２図は、本発明による突然変異誘発のためのギャップをもつ二重ＤＮＡ分子に ついて示した概略図である。

第３図は、本発明により熱安定性の高いズブチリシンを製造するズブチリシン遺 伝子において一塩基置換された変異ズブチリシンＤＮＡ配列の一部を示す。

第４図は、Ｉ）Ｈ８，０の１０　ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２，５０ｍＭ　ＫＣＩ、５ ０ｍＭ）リスＨＣＩ中６５℃での本発明の変異ズブチリシン（７１５０）及びズ ブチリシン野生型の熱不活性化について示したグラフ図である。

第５図は、Ｉ）Ｈ８，Ｏの１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　ＫＣＩ、５０ｍＭ ）リスＨＣＩ中４５℃での本発明の変異ズブチリシン（７２５０）及びズブチリ シン野生型の熱不活性化について示したグラフ図である。

第６図は、ｐＨ１０，５の１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ。

２０ｍＭ３−（シクロへキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）中４０ ℃での本発明の変異ズブチリシン（７１５０）及びズブチリシン野生型の熱不活 性化について示したグラフ図である。

第７図は、タンパク質濃度３．０ｇ＋ｇ／ｍｌ　（走査速度６０℃／ｈｒ）にお ける本発明の変異ズブチリシン（７１５０）及びズブチリシン野生型の示差走査 熱量測定（Ｄ　Ｓ　Ｃ）結果を示したグラフ図である。サンプルは、１０ｍＭ　 ＥＤＴＡ又は１０　ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２を含むｐＨ８，０の５０ｍＭトリスＨ Ｃ１，５０ｍＭ　ＫＣｌ中で走査された。

第８図は、ｐＨ８，０の１０　ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２，５０ｍＭ）リスＨＣ１， ５０ｍＭ　ＮａＣ１中７０℃での本発明の変異ズブチリシン及びズブチリシン野 生型の熱安定性について示したグラフ図である。

好ましい態様の詳細な説明 本発明は、タンパク質についてコードするヌクレオチド配列（遺伝子）を突然変 異させ、且つ所望の突然変異についてスクリーニングすることによる、酵素のよ うなタンパク質の１以上の特性の修正に関する。かかる修正としては、酵素の熱 安定性、基質特異性、酸化安定性、ｐＨ及び／又は温度の条件を変化させていっ た場合の活性プロフィール等を向上又は低下させることをいう。

対象とする酵素についてコードする遺伝子を突然変異させる前に、遺伝子は通常 その天然源からまず単離され、クローニングベクターによってクローニングされ る。あるいは、対象とする遺伝子から転写されるｍＲＮＡが細胞源から単離され 、クローニングベクターに組込むため逆転写によってｃＤＮＡに変換される。ク ローニングベクターはファージでもプラスミドであってもよく、微生物のゲノム に依存しない微生物中でのベクター自律的複製用のレプリコンを通常含有してい る。クローニングベクターは、ベクターで形質転換された微生物の選択の際に役 立つ、抗生物質耐性についてコードするＤＮＡのような１以上の表現型マーカー を含有していることが有利である。

クローニングのためにＤＮＡ又はｃＤＮＡをベクターに組込む方法は当業者に周 知である。これらの方法では通常ベクターの開環制限エンドヌクレアーゼ部位に 対象の遺伝子を挿入するが、遺伝子の末端にデオキシヌクレオチドのホモポリマ ー性尾部を加え、相補的ホモポリマー性尾部をもつクローニングベクターの開環 端に遺伝子を結合させてもよい。クローニングベクター中に存在する対象の遺伝 子は本発明の方法によって突然変異させることができる。

１つの態様において、本発明に従い処理される対象遺伝子は発現ベクター中に存 在する。発現ベクターはクローニングベクターの定義中に通常含まれるが、その 理由は発現ベクターが通常典型的クローニングベクターにおける諸成分、即ち上 記のような１以上のレプリコン及び選択のための１以上の表現型マーカーを有し ているからである。しかも発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、リポ ソーム結合部位及び翻訳開始シグナルについてコードするコントロール配列を有 している。コントロール配列の指示による発現のために、本発明に従い処理され る標的遺伝子は適当な読取り枠中でコントロール配列と作動可動に結合せしめら れる。

標的ＤＮＡ配列を有する発現ベクターはファージでもプラスミドであってもよい が、プラスミドが好ましい。

本発明の一面において、クローンＤＮＡセグメントを突然変異させしかる後変異 体を同定する方法では、クローンＤＮＡセグメントに一重鎖標的領域を組込む工 程を含む。標的領域は対象とする完全ＤＮＡセグメント又はその一部分を含有す ることができる。標的部分はランダムに又は特異的に選択することができる。

対象とするＤＮＡセグメントの標的領域は、ジョートルら、プロシーディングφ オブ・ナショナルφアカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７５巻、第２１７ ０−２１７４頁、１９７８年（Ｓｈｏｒｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃｅｅ ｄｉｎｇｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｕ ＳＡ、　７５　：　２１７０−２１７４（１９７８））に記載された方法のよう な当業者に公知のいずれかの適切な方法によって、−重鎖に変えられる。もう１ つの方法では、対象とするＤＮＡセグメントを含（プラスミドの一重鎖コピーを 製造し、プラスミド配列を含むが標的領域に相補的なセグメントを含まないＤＮ Ａ断片を一重鎖コピーにアニーリングさせる。この操作では、−重鎮標的領域を もつギャップのある二重分子を生み出す。

１以上の突然変異は、−重鎖ＤＮＡに突然変異を生じさせうる化学的又は生物学 的突然変異誘発剤（突然変異原）で標的物質を処理することにより、−重鎖標的 領域において生じる。１つのかかる化学的突然変異原としては、Ｇ−ＣからＡ− Ｔへの変換のみを生じさせる亜硫酸水素ナトリウムである（ここでＧ、Ｃ％Ａ又 はＴはそれぞれグアニン、シトシン、アデニン及びチミンを表わす）。他の化学 的又は生物学的突然変異原としては、例えばヒドロキシルアミン、亜硝酸、ギ酸 及びヒドラジンが適当であって、本発明において使用することができる。

突然変異は制御可能なレベルで有利には１分子当たり１〜約５つの変化を生じさ せて、突然変異プラスミド由来ＤＮＡのライブラリーが（例えば、ｐＨ６，０の ４Ｍ亜硫酸水素ナトリウム中５〜３０分間ＤＮＡをインキュベートすることによ り）製造される。所望の突然変異がまれに生じることから、有利なことに、ライ ブラリーは、微生物の形質転換により１０５〜１０６個以内の各種変異型を生じ させるほどの十分に大きなものである。

あるいは、突然変異は、自らのエラー誘発性（ｅｒｒｏｒｐｒｏｎｅ　）　Ｄ　 Ｎ　Ａポリメラーゼによりある範囲の突然変異を生じる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ ｃｈｉａ　ｃｏｌｌ）　Ｍｕ　ｔ　Ｄ株のような大腸菌ミューチーター（ｓｕｔ ａｔｏｒ　）株におけるクローンＤＮＡの複製によってクローンＤＮＡ中に導入 される。

この方法において、プラスミド含有ＭｕｔＤ大腸菌は５０１１１ｇ／ｍｌ含有の リッチ培地の２５０ｍ１培養物中３７℃で、６５０ｎｍの光学濃度が０．６とな るまで、増殖せしめられる。プラスミドは、クロラムフェニコール１７５μｇ　 ／　ｍｌを加え、３７℃で１６時間インキュベートを続けることにより増殖せし められる。

標的領域を突然変異させた後、標的領域はＤＮＡポリメラーゼ■（フレノウ断片 ）又は逆転写酵素で一重鎮領域をふさぐことにより二重鎖とされる（例えば、シ ョールら、同上参照）。

微生物は発現ベクター中に存在する突然変異二重鎖ＤＮＡで形質転換されるが、 この突然変異ＤＮＡは形質転換微生物中において突然変異ＤＮＡの発現を指示し うるコントロール配列に作動可能に結合せしめられている。

次いで形質転換微生物は、突然変異ＤＮＡが発現して発現生成物を形成するよう に、必要な栄養素、生理学上許容されるｐＨ及び温度等に関するタンパク質生産 条件下で培養される。

本発明の方法は、ある特性、特に熱安定性を高めるためにセリンプロテアーゼを 突然変異させる上で使用することができる。プロテアーゼはペプチド結合を開裂 させる触媒である。

セリンプロテアーゼはペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であるが、活性部 位においては必須のセリン残基が存在している。セリンプロテアーゼはフェニル メタンスルホニルフルオリド又はジイソプロピルフルオロホスフェートによって 阻害される。ズブチリシンはグラム陽性細菌又は真菌によって生産されるセリン プロテアーゼである。７種のズブチリシンのアミノ酸配列が知られている。これ らの中には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株からの５種のズブチリシンが含ま れる〔ズブチリシンＢＰＮ’、ズブチリシンカールスベルグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒ ｇ）、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミ口すツ力すチクス（ａＩｌｙｌｏｓ ａｃｃｈａｒｉｔｌｃｕｓ）及びメセンチコベブチダーゼ（ｍｅｓｅｎｔｌｃｏ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）　）。〔バサンタ（Ｖａｓａｎｔｈａ）ら。

“バチルス・アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｌｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｇｕ ｅｒａｃｌｅｎｓ　）のアルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼに関する遺 伝子は、シグナル配列及び成熟タンパク質についてコードする領域間に大きな読 取り枠を有している１、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ 　ｏｆ’　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌｏｇｙ　）　、第１５９巻、第８１１〜８１９頁 、１９８４年；ヤコブズ（Ｊａｃｏｂｓ）ら、“バチルス−リチェニホルミス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｌｆｏｒｍｉｓ）由来のズブチリシンカールス ベルグのクローニング配列決定及び発現″、ヌタレイック・アシッズ・リサーチ （Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、第１３巻、第８９１３ −８９２６頁、１９８５年；ネドコフ（Ｎｅｄｋｏｖ）ら、　′ズブチリシンＤ Ｙの完全アミノ酸配列の決定並びにズブチリシンＢＰＮ’、カールスベルグ及び アミロサラカリチフスの一次構造との比較°、バイオロジカル・ケミストリー・ ホップーセイラー（ＢｉｏｌｏｇＩｃａｌ　Ｃｈｅｇ＋１ｓｔｒｙ　Ｈｏｐｐｅ −８ｅｙｌｅｒ）　、第３６６巻、第４２１−４３０頁、１９８５年；クリハラ ら、　“ズブチリシンアミロサラカリチフス”、ジャーナル・オブ・バイオロジ カル・ケミストリー　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　ＢＩｏｌｏｇＩｃａｌ　Ｃｈｅ ａ＋１ｓｔｒｙ　）　ｙ第２４７巻。

第５６１９−５６３１頁、１９７２年；及びスペントセン（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ） ら、　′アルカリメセンテリコペブチダーゼの完全アミノ酸配列″、フエデレー ションＱオブΦヨーロピアン−バイオケミカル豐ソサエティーズψレターズ（Ｆ ｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｃａｌ　５ｏ ｃｌｅｔ１ｅｓＬｅｔｔｅｒｓ　）　、第１９６巻、第２２８−２３２頁。

１９８６年〕。

サーモアクチノミセス・ブルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏ−ｍｙｅｅＳ　 ＶｕｌｇａｒｉＳ）由来ズブチリシンサーミターゼのアミノ酸配列も知られてい る〔メローン（Ｍｅｌｏｕｎ）ら、　“サーモアクチノミセス争ブルガリス由来 す−ミターゼの完全−次構造及びズブチリシン型プロテアーゼと関連のあるその 構造上の特徴°、フエデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソ サエティーズ・レターズ。

第１８３巻、第１９５−２００頁、１９８５年〕。

２種の真菌プロテアーゼのアミノ酸配列も知られている；トリチラチウム・アル ブム（Ｔｒｌｔｌｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）のプロテアーゼＫ〔ジャニー（ Ｊａｎｙ）ら、　“トリチラチウム・アルバム・リムバー（Ｔｒｉｔｉｒａｅｈ ｌａｗ　ａｌｂａｍＬｌ■ｂｅｒ）のプロテアーゼＫ”、バイオロジー・ケミス トリー、ホップーセイラー、第３６６巻、第４８５−４９２頁、１９８５年〕及 び好熱真菌マルブランチェア・ブルチェラ（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ　ｐｕｌｃ ｈｅｌｌａ　）のサーモミコラーゼ〔ゴーチャー（Ｇａｕｃｈｅｒ　）ら、　“ エンドペプチダーゼ：サーモミコリン”、メソッズ・オブ・エンザイモロジ−（ Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｒ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　、第４５巻、第４１５−４ ３３頁、１９７６年〕。

これらの酵素は、それらの−次配列及び酵素学的性質のみではなく、Ｘ線結晶デ ータの比較によっても、ズブチリシンＢＰＮ’　と関連のあることが示された〔 マクファレン（ＭｅＰｈａｌｅｎ）ら、　“ズブチリシンカールスベルグと複合 化したヒル由来の阻害剤ニブリンの結晶及び分子構造″、フエデレーシジン・オ ブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサエティーズ・レターズ、第１８８巻。

第５５−５８頁、１９８５年及びパーラ−（Ｐａｈｌｅｒ）ら。

“真菌プロテイナーゼにの三次元構造は細菌ズブチリシンと類似性を有する゛、 ＥＭＢＯジャーナル、第３巻。

第１３１１−１３１４頁、１９８４年〕。

本発明で用いられる用語“ズブチリシン物質″とは、その活性成分としてズブチ リシンを含有するタンパク質物質のことである。本発明で用いられかつズブチリ シン物質の定義に含まれるいずれのセリンプロテアーゼも、ズブチリシンＢＰＮ ’、ズブチリシンカールスベルグ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミ口すツ 力すチクス、メセンチコベプチダーゼ、サーミターゼ、プロテイナーゼＫ及びサ ーモミコラーゼに関する上記配列と、少なくとも３０％、好ましくは５０％、更 に好ましくは８０％のアミノ酸配列相同性を有するズブチリシンである。これら のセリンプロテアーゼは、“相同セリンプロテアーゼ′としても本明細書で記載 されている。

−態様において、Ｂ、ズブチリスは突然変異ＤＮＡを有する発現ベクターで形質 転換される。発現がＢ、ズブチリスのような分泌微生物で起こる場合には、シグ ナル配列は翻訳開始シグナルの後でかつ対象とするＤＮＡ配列の前に位置してい るであろう。そのシグナル配列は、分泌時に生成物から切断される細胞壁に発現 生成物を輸送するように機能する。上記“コントロール配列”という用語は、シ グナル配列が存在している場合には、それを含む意味を有する。

突然変異体をスクリーニングするめに、形質転換Ｂ。

ズブチリスは分泌された発現生成物（例えば、酵素）が結合しうるフィルター物 質（例えば、ニトロセルロース）の存在下で培養される。所望の特性をもつ発現 生成物に関してスクリーニングするために、フィルター結合発現生成物は対象の 発現生成物を野生型発現生成物から識別しうる条件下におかれる。例えば、フィ ルター結合発現生成物は野生型発現生成物を不活性化させるような条件下に付す ことができる。処理された発現生成物はしかる後酵素基質と接触せしめられ、基 質に対する酵素活性によって発現生成物が高い安定性を有するか否かが判明し、 もって所望の突然変異が生じているか否かを確認することができる。

本発明ははバチルスセリンプロテアーゼたるズブチリシンＢＰＮ’の熱安定性変 異型の製造法に関して更に具体的に記載されているが、本発明は他のタンパク質 の特性を修正する場合にも同様に適用可能であることが理解されるであろう。特 に、他の微生物由来の他の相同セリンプロテアーゼも本発明に従い突然変異させ かつスクリーニングすることができる。これらの相同セリンプロテアーゼとして は、格別限定されるわけではないが、バチルス・リチェニホルミス由来のズブチ リシンカールスベルグ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミ口すツ力すチクス 及びメセンテリコペブチダーゼのような他のバチルス株由来のものがある。プロ テアーゼＫ及びサーモミコラーゼのような真菌プロテアーゼも、細菌宿主で製造 される哺乳動物プロテアーゼと同様に使用することができる。

ズブチリシン遺伝子コード配列を突然変異させ、かつ熱安定性の高い変異ズブチ リシンタンパク質を単離するために、天然プロモーター及び他のコントロール配 列を有するバチルス種由来のズブチリシン遺伝子は、大腸菌及びＢ、ズブチリス 双方のレプリコン、選択可能な表現型マーカー、並びにヘルパーファージＩＲ１ の重感染時における一重鎖ブラスミドＤＮＡ生産のためのＭ１３複製源を有する プラスミドベクターに組込まれてクローニングされる。クローンズブチリシン遺 伝子を有する一重鎮ブラスミドＤＮＡが単離され、ベクター配列を有するがズブ チリシンコード領域を有さないＤＮＡ断片とアニーリングされて、ギャップのあ る二重分子が製造さ鶴る。

突然変異は、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸もしくはギ酸により又は上記大腸菌 のミューチーター株中での複製によって、ズブチリシン遺伝子に導入される。亜 硫酸水素ナトリウムは一重鎖ＤＮＡのシトシンのみと反応するため、この突然変 異原により発生する突然変異はコード領域のみに限られる。反応時間及び亜硫酸 水素塩濃度は、平均して１〜５つの突然変異が１つのズブチリシン遺伝子当たり で発生するように各実験毎に変更される。反応容量４００μｇのｐＨ６，０の４ Ｍ亜硫酸水素ナトリウム中３７℃で８分間のギャップのある二重ＤＮＡｌ０μｇ のインキュベートでは、−重鎖領域において約１％のシトシンを脱アミノ化させ る。成熟ズブチリシンのコード領域はＤＮＡ鎖によって異なるが約２００個のシ トシンを有する。有利には、反応時間は約４分間（２００個中約１個の突然変異 率を生じる）〜約２０分間（２００個中約５個）の範囲で変更される。

突然変異誘発後、ギャップのある分子は、十分に二重鎖化された分子を作り出し かつ突然変異を固定化させるために、インビトロにおいてＤＮＡポリメラーゼＩ （フレノウ断片）で処理される。次いでコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大 腸菌は変異ズブチリシンの増幅ライブラリーを製造するために突然変異ＤＮＡで 形質転換される。

増幅変異体ライブラリーは、自らのエラー誘発性ＤＮＡポリメラーゼにより突然 変異範囲を増加させるような大腸菌ＭｕｔＤ株中でプラスミドＤＮＡを増殖させ ることによっても製造することができる。

突然変異原たる亜硝酸及びギ酸も変異体ライブラリーを製造するために使用可能 である。これらの化学物質は亜硫酸水素ナトリウムなど一重鎖ＤＮＡに対して特 異的ではないため、突然変異誘発反応は下記操作に従い行なわれる。ズブチリシ ン遺伝子のコード部分は標準的方法によりＭ１３ファージに組込まれてクローニ ングされ、−重鎖ファージＤＮＡが製造される。次いで一重鎖ＤＮＡはｐＨ４， ３の１Ｍ亜硝酸と２３℃で１５〜６０分間又は２．４Ｍギ酸と２３℃で１〜５分 間反応せしめられる。これらの反応時間範囲では、１０００個中１側御１０００ 個中５個の突然変異発生率となる。突然変異誘発後、ユニバーサル（ｕｎｉｖｅ ｒｓａｌ　）プライマーをＭ１３ＤＮＡにアニーリングし、二重ＤＮＡを、ズブ チリシン遺伝子のコード部分が十分に二重鎖化されるように鋳型として突然変異 −重鎖ＤＮＡを用いて合成する。

この点に関し、コード領域は制限酵素によってＭ１３ベクターから切除し、突然 変異が制限断片においてのみ生じるように未突然変異発現ベクターに結合させる こともできる〔マイヤーズら、サイエンス、第２２９巻、第２４２−２４７頁、 １９８５年（Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ。

２２９　：　２４２−２４７　（１９８５）］。

熱安定性に関するスクリーニングのためには、Ｂ、ズブチリスの形質転換により 約５Ｘ１０’個以上のランダムズブチリシン変異体を生成するほど大きなズブチ リシン変異体ライブラリーが製造されるべきであるが、その理由は熱安定性の高 い突然変異がまれにしか生じないからである。

突然変異誘発後、変異体ライブラリーはズブチリシンを発現かつ分泌するような り、ズブチリスに形質転換させるために使用される。ズブチリシン担持プラスミ ドは有利なことに高複製能Ｂ、ズブチリスレプリコンを有しており、バチルス宿 主中高レベルでズブチリシンを生産することができる。安定な変異体に関してス クリーニングするために、プロテアーゼ欠乏Ｂ、ズブチリス株は変異プラスミド ライブラリーで形質転換され、次のようにして培養される：即ち、ニトロセルロ ースフィルターがペトリ皿中の栄養基質上におかれ、酢酸セルロースフィルター がニトロセルロースの上におかれる。コロニーは酢酸セルロース上で増殖せしめ られ、個々のコロニーからズブチリシンが、それが安定的に結合するニトロセル ロースフィルター上の酢酸セルロースを介して分泌される。数百のコロニーから のズブチリシンが１つのフィルターに結合され、次いで多数のフィルターで処理 することにより、異なる数千の変異体をスクリーニングする。

熱安定性の高いズブチリシンを生産するコロニーを同定するために、フィルター は緩衝液中７０℃で３０分間インキュベートされ、すべての野生型ズブチリシン 活性が実質上不活性化される。安定性の高い変異ズブチリシンはこの加熱工程後 にも活性を保持している。安定性の更に高いものをスクリーニングするために安 定な変異体が更に突然変異せしめられた場合には、温度がより高く長いインキュ ベート時間がバックグランド活性を不活性化させるために適用されねばならない 。次いで熱処理フィルターはトシル−Ｌ−Ａｒｇメチルエステル（ＴＡＭＥ）（ ジグ７　（Ｓｉｇｍａ　）　）及びｐＨ指示薬フェノールレッド〔コダック（Ｋ ｏｄａｋ　）　）を含有した溶液中に浸漬される。ＴＡ（Ｅはズブチリシンの基 質であるため、これは熱処理後にも活性がある変異ズブチリシンを担持したフィ ルター上の領域で開裂される。開裂が生じると、プロトンがその反応から放出さ れ、プロテアーゼ活性残存領域において赤色から黄色にフェノールレッドを変色 させる。

この操作は、わずかに修正されただけの他種の変異体についてスクリーニングす るためにも利用可能である。

例えば、フィルターは、耐性変異体を見つけるために、高ｐＨで変性剤、酸化剤 により、又はズブチリシンのような酵素を通常不活性化させる別の条件下で処理 することができる。基質特異性を変えた変異体は、野生型ズブチリシンでは通常 開裂されない別の基質をＴＡＭＨの代わりに用いてスクリーニングされる。

安定性の高い変異体がスクリーニングにより同定されると、変異体が由来するコ ロニーが単離され、変異ズブチリシンが精製される。熱不活性化条件、変性温度 、動力学的パラメーター及び他の物理学的測定値を調べるための実験が精製され た酵素に関して実施される。変異遺伝子は、安定性増加の原因をなすアミノ酸変 化を調べるために配列決定することもできる。この操作を利用して６５℃での熱 不活性化に対する耐性が１．５〜８倍改善された変異体が単離された。熱的に安 定したズブチリシンはクリーニング用組成物において使用される。

驚くべきことに、ズブチリシンにおいて２１８位のアミノ酸に相当するアスパラ ギンを別のアミノ酸で置換するとズブチリシンの熱安定性が高まることが発見さ れた。

特定の理論と関係しているわけではないが、２１８位のアスパラギンをセリンで 置換した場合には変性（ｕｎｆｏｌｄ−１ｎｇ　）反応における自由エネルギー の変化を高めることによってズブチリシンを安定化させていると考えられる。

本発明の一態様において、本発明はズブチリシンにおける２１８位のアミノ酸に 相当するアスパラギンをセリンで置換したズブチリシン物質についてコードする クローン突然変異ズブチリシン遺伝子に関する。ＧＸ７１５０株によって生産さ れるこの変異体は７１５０と命名された。本発明は、ズブチリシンの２１８位の アミノ酸において他のアミノ酸、特にアスパラギン酸による置換も含む。

本発明の別の態様において、ズブチリシン物質についてコードする遺伝子は２１ ８位のアミノ酸としてセリン又はアスパラギン酸を有しているが、ズブチリシン 遺伝子は更に１以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。クローン突然変異２１ ８位置換ズブチリシン遺伝子において他の好ましいアミノ酸置換体としては、下 記法により生産される以下のランダム突然変異ズブチリシン変異体ＧＸ７１６９ 　ＡＳＮ２１８　→　ＳＥＲ７１６９ＧＬＹ１３１　→　ＡＳＰ ＧＸ８３０１　ＡＳＮ２１８　→　ＳＥＲ８３０１ＴＨＲ２５４→　ＡＬＡ ＧＸ８３０６　ＡＳＮ２１８　→　ＳＥＲ８３０６ＧＬＹ１６６　→　５ＥＲ ＧＸ８３１５　ＡＳＮ２１８　→　ＳＥＲ８３１５ＧＬＹ１３１　→　ＡＳＰ ＴＨＲ２５４→　ＡＬＡ ズブチリシンの熱安定性を高める他の置換として、下記のものがある： 株　置　換　変異　体 ＧＸ７１４２　ＡＬＡ１１６　→　ＴＨＲ７１４２ＧＬＹ１３１　→　ＡＳＰ ＧＸ７１４８　ＧＬＹ１３１　→　ＡＳＰ　７１４８ＧＸ７１７８　５ＥＲ１８ ８→　ＰＲＯ７１７８ＧＸ７１８８　ＡＬＡ１１６　→　ＧＬＵ　７１８８ＧＸ ７１８９　ＬＥＵ１２６　→　ＩＬＥ　７１８９ＧＸ８３０５　５ＥＲ５３→　 ＴＨＲ８３０５上記アミノ酸置換体のすべては、ランダム突然変異誘発により製 造され、本発明に従いスクリーニングされた。

一度ランダム突然変異が行なわれかつ同定されるならば、突然変異はオリゴヌク レオチド突然変異誘発によって繰返しかつ再現することができる。しかも２以上 の安定化突然変異がズブチリシン分子中で発生する場合には、これら変化の効果 は自由エネルギーの増大として表われる。

ズブチリシン遺伝子の他に、他のセリンプロテアーゼまたは他のタイプの酵素に 関する遺伝子も、特性が向上した生成物を製造するために突然変異させることが できる。

上記方法を他のセリンプロテアーゼに応用することに加え、例えばズブチリシン カールスベルグのように密接に関連した他のプロテアーゼを改良するために１種 のセリンプロテアーゼたるズブチリシンＢＰＮ’から得られる情報を利用するこ とができる。関連近似性はアミノ酸配列の比較から調べられる。タンパク質配列 を整列させる多くの方法が存在するが、関連度が非常に低い場合には差異のみが 明らかとされるにしかすぎない。タンパク質配列及び構造の図解、マーガレット ・オー・デイホフ編集、第５巻、増刊第２号、１９７６年１国立生物医学研究財 団、ジョージタウン大学医学センター、ワシントン、デー−シー、研究及び配列 と題される第３頁以下（Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ 　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＭａｒｇａｒｅｔＯ，Ｄａｙｈｏｒｆ　ｅｄｌ ｔｏｒ、　Ｖｏｌ、５　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　２．１９７１１ｉ、　Ｎａｔｉ ｏ−ｎａｌ　Ｂｌｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 、　ＧｅｏｒｇｅｔｏｖｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔ、ｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔ ｅｒ、　Ｗａｓｈｌｎｇｔｏｎ、　ＤＣ，、ｐ、３ｒｆ’、、　ｅｎｔｌｔｌｅ ｄ　５ＥＡＲＣＨａｎｄ　ＡＬＩＧＮ）に記載された方法によれば関連性を明ら かにできる。当業者に周知のように、関連タンパク質はアミノ酸の数及び鏡上に 沿った各アミノ酸の同一性が異なる。即ち、２つの構造が最大の同一性に関して 整列された場合、削除又は挿入がある。例えば、ズブチリシンカールスベルグは ２７４個のみのアミノ酸を有するが、ズブチリシンＢＰＮ’　は２７５個のアミ ノ酸を有する。２つの配列を整列させたところ、力−ルスベルグはズブチリシン ＢＰＮ’における５６位のＡＳＮ５６に相当する残基を欠いている。このように 、カールスベルグのアミノ酸配列は、ギャップが５６位において記録されていな い場合には、ＢＰＮ’　とは非常に異なったものとなるであろう。したがって、 カールスベルグの残基にＢＰＮ’　と対応させて番号を付した場合、ズブチリシ ンカールスベルグの２１８位においてＡＳＮＯ代わりにＳＥＲを用いると熱安定 性が高まるである。うということを高い信頼性をもって予測することができる。

２種の相同ズブチリシンのうち一方がギャップをもつ場合、構造はその位置関係 において異なることを考慮しなければならない。このような差異をもつ例は当業 者に周知である。これら位置上の違いがあることから、いずれか一方のズブチリ シンが突然変異部位に又はその隣接部位にギャップを有する場合には、安定化さ せる突然変異を転用するべきではない。したがって、アミノ酸配列の整列後には 、ギャップ部位又はその隣接部位でのそれら突然変異は望ましい突然変異のリス トから削除され、突然変異は行なわれない。

この論理は、本明細書に記載されたすべてのランダムに得られる安定化突然変異 を他の相同セリンプロテアーゼで転用する場合にも応用することができる。

ランダム突然変異誘発法により見出される安定化突然変異では、研究される酵素 の構造がその位置に関し最適ではないことがわかる。ランダム法は遺伝子内で通 常わずかに塩基を変化させるにしかすぎない。通常１個の塩基のみが所定のコド ンで変化するだけであるため、いずれか１個のアミノ酸から他のすべてのアミノ 酸に変化させることはできない。例えば、ＡＳＰ　（ＧＡＴ及びＧＡＣ）に関す るコドンは、塩基１個の変化によってＨＩ　５ＳＴＹＲＳＡＳＮＳＧＬＹ、ＡＬ Ａ％ＶＡＬ又はＧＬＵに関してコードする（ＣＡＴ、ＴＡＴ、ＡＡＴ。

ＣＡＣ，ＴＡＣ，ＡＡＣ，、ＧＧＴＳＧＴＴ、、ＧＣＴ。

ＧＧＣ，ＧＴＣ，ＧＣＣＳＧＡＡ又はＧＡＧ）に変えることができるが、但しＰ ＨＥ、、ＬＥＵ、ＩＬＥ、ＭＥＴ。

ＴＨＲ，ＳＥＲ，ＣＹＳ、ＬＹＳＳＡＲＧ、ＧＬＮ。

ＴＲＰ又はＰＲＯに変えることはできない。

ランダム法で所定部位が最適でなかった場合、オリゴヌクレオチド突然変異誘発 法がその部位において残り１８個のアミノ酸のいずれかを導入するために利用さ れうる。次いでこれらの変異体は改良された性質に関して試験される。

本発明の変異ズブチリシン物質は、クリーニングのために特に布地のクリーニン グのために使用される洗剤のような洗浄用製品に添加剤として使用しうる。本発 明の変異ズブチリシン物質は、野生型ズブチリシン物質よりも熱的に安定である ため、洗剤含有溶液中で貯蔵された場合又はクリーニング時の使用中に高熱に付 された場合において野生型はど急速には活性を失わない。洗浄用製品中の添加剤 として本発明の変異ズブチリシン物質を使用することにより、繊維上のタンパク 質性の汚れの除去作用は改善される。洗浄用製品に添加剤として使用される変異 ズブチリシン物質の量は、当業者に周知であるか、又は日常的実験法によって容 易に確認することができる。

最適の酵素濃度範囲は、勿論酵素の価格及び要求されるクリーニング量と関係が ある。

本発明は下記例によって説明されるが、これは限定のためのものではない。

例１ バチルス・アミロリグエファシエンス由来のズブチリシン遺伝子を単離し〔バサ ンタら、１９８４年、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１５９＠、第８ １１−８１９頁（Ｖａｓａｎｔｈａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ｊｏｕｒｎ ａｌ　ｏｆ’　Ｂａｅｔｅ−ｒｉｏｌｏｇｙ　１５９　：　８１１−８１９　） 　）　、大腸菌中で増殖させるためにβ−ラクタマーゼ遺伝子及びｐＢＲ３２２ 由来レプリコン；Ｂ、ズブチリス中で増殖させるためにカナマイシンヌクレオチ ジルトランスフエラーゼ遺伝子及びｐＵＢ１１０由来レプリコン；並びにヘルパ ーファージＩＲＩの重感染時における一重鎖ブラスミドＤＮＡ製造のためにＭ１ ３複製源を有するベクター（ｐｃｘ４３３０、第１図）に組込んでクローニング した。突然変異は、亜硫酸水素ナトリウムで又は大腸菌ミューチーター株中での 複製によりズブチリシン遺伝子において発生させた。亜硫酸水素ナトリウム突然 変異は、フォーク及びホフステッター、１９８５年、セル、第３３巻、第５８５ −５９３頁［Ｐｏ１ｋ　ａｎｄ　Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ　（１９８５）　Ｃｅ１ １３３　：　５８５−５９３］の方法の変法によってズブチリシンコード領域に 限定させた。−重鎮プラスミドＤＮＡを、ベクター配列を有するがズブチリシン のコード領域を有さないＤＮＡ断片とアニーリングさせ、ギャップのある二重分 子を製造した（第２図）。−重鎖ｐＧＸ４３３０　１μｇを容量１５ｕｌｌの５ ０ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ８，０の５０ｍＭ）リスＨＣｌ　−１０ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ Ｉ　２中においてＢａｍＨＩ及び５ａｌＩで切断された二重鎖ｐＧＸ４３３０　 １μｇと混合した。ＤＮＡを沸騰水中５分間９０℃まで加熱し、６０℃で１０分 間アニーリングさせた。ギャップのある二重体を容量４００μｇ中３７℃でｐＨ ５，０の亜硫酸水素ナトリウムと反応させた。反応時間は４〜２０分間の間で変 更させ、１遺伝子当たり平均１〜５個の突然変異体を発生させた。亜硫酸水素ナ トリウムは一重鎖ＤＮＡ中のシトシンとのみ反応するため、突然変異はズブチリ シンコード領域にのみ限定された。

突然変異誘発後、ギャップのある分子を周知の技術（例えば、フォーク及びホフ ステッター、同上参照）によりインビトロでＤＮＡポリメラーゼ■（フレノウ断 片）で処理して十分に二重鎖化された分子を製造し、突然変異を固定させた。次 いでコンピテント大腸菌を標準的操作法〔例えば、マニアナイスら、１９８３年 “分子クローニング；実験マニュアル２．コールド・スプリング・ハーバ−・プ レス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ　（１９８３）　”Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒｃ ｌｏｎｌｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−、Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ　）参照〕により突然変異ＤＮＡで形質転 換させ、変異ズブチリシンの増幅ライブラリーを製造した。ライブラリーは、自 らのエラー誘発性ＤＮＡポリメラーゼにより広範囲の突然変異を生じる大腸菌Ｍ ｕｔＤ株中でｐＧＸ４３３０を増殖させることによって製造した。

例２ Ｂ、ズブチリスにおける発現及び分泌並びに変化した安定性に関するスクリーニ ング例１で製造された変異ライブラリーを、ズブチリシンを発現かつ分泌するＢ 、ズブチリス株ＧＸ４９３５を形質転換させるために使用した。ズブチリシン担 持プラスミドは高複製能Ｂ、ズブチリスレプリコンを有しており、バチルス宿主 中高レベルでズブチリシンを製造することができる。安定な変異体７１　ｐ　ｒ 　−、ｎ　ｐｒ−についてスクリーニングするため、Ｂ、ズブチリス株ＧＸ４９ ３５を変異プラスミドライブラリーで形質転換し、下記のように培養した。２個 のフィルターをトリプトース血液寒天基質及び１０μｇ　／　ｍｌカナマイシン のプレート上においた。ニトロセルロースフィルターは寒天上に直接おき、酢酸 セルロースフィルターはその上においた。フィルター上部で増殖したコロニーは 、ズブチリスが安定的に結合するニトロセルロース上へ透過性酢酸セルロースを 介ブチリシンが１個のフィルターに結合していたが、その後多数のフィルターを 交換して数千の異なる変異体についてスクリーニングした。

ズブチリシンが結合したフィルターをｐＨ８，０の１０ｍＭ　ＣａＣｌ２．１０ ｍＭ）リスＨＣＩ中７０℃で３０分間インキュベートし、実質上すべての天然又 は野生型ズブチリシンの活性を消失させた。安定性の高い変異プロテアーゼは加 熱工程後にも活性を留めている。

フィルター結合プロテアーゼの活性を検出するために、フィルターをトシルＬ− Ａｒｇメチルエステル（ＴＡＭＥ）（１０ｍＭ）及びｐＨ９，０まで滴定しうる ｐＨ指示薬フェノールレッド含有溶液に浸した。

ＴＡＭＥはズブチリシンの良い基質であ７て、活性ズブチリシンを担持したフィ ルター上の領域で開、裂される。

操作時に開裂が生じると、プロトンが反応系から放出され、プロテアーゼ活性領 域で赤色から黄色にフェノールレッドを変色させた。このアッセイ操作では、熱 的に安定な変異体を識別することができる。

候補物がフィルターのスクリーニングで確認された場合には、酢酸セルロースフ ィルターからの相当するコロニーを液体培地（２％酵母エキス、１０μｇ／ｍｌ カナマイシン）中で１８時間増殖させた。この条件下でズブチリシンは培養ブロ ス中に０．５〜１．　ＯＬｉｇ／ｍｌの濃度で分泌されたが、これはＳＤＳポリ アクリルアミドゲル電気泳動により検出可能な細胞外総タンパク質の８０％以上 を占める。変異ズブチリシンを溶液中において熱不活性化に対する耐性に関して 試験した。培養上澄を１０ｒｎＭ　Ｃａ　Ｃ１２、ｐＨ８，０の５０ｍＭ）リス ＨＣＩ又は５ｍＭ　ＥＤＴＡＳｐＨ８，０の５０ｍＭ）リスＭＣＩで２０倍に希 釈した。ズブチリシンを非常に安定化させるカルシウムの存在下でサンプルを６ ５℃にてインキュベートし、９０分以内の間隔で一部を取出し、基質としてアゾ コール（＾ｚｏｃｏｌｌ　）を用い３７℃で活性を測定した。４５℃でインキュ ベート後、ＥＤＴＡ存在下で経過時間を計った。熱不活性化の半減期が野生型ズ ブチリシンの１５０％以上も長い変異体が重要であって、更に特徴付けた。安定 なズブチリシン表現型がプラスミド由来突然変異に起因したのか否かを確認する ために、陽性クローンからプラスミドを精製し、Ｂ、ズブチリスを再形質転換さ せるために用いた。はとんどすべてのケースにおいて、再形質転換Ｂ、ズブチリ スは元来の単離物と同様に機能する。安定な変異遺伝子の配列を決定するため、 プラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、プントら、１９８３年、ヌクレイツク ・アシッズ・リサーチ。

第１１巻、第１６４５−１６５５頁（Ｄｅｎｔｅ　ｅｔ　ａｔ、。

（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｃｈ、旦：　１６４５ −１６５５）に記載された操作に従いファージＩＲＩで重感染させることによっ て一重鎖鋳型を製造した。熱安定性ズブチリシンを製造する１つの変異体（ＧＸ ７１５０；米国基準培養寄託機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　、　０　”／クビル、メリーランド州にＡＴＣＣ Ｎα５３４５９として寄託されている）〕は、２１８位アスパラギンがセリンで 置換されたクローンズブチリシン遺伝子において１個の塩基変化のあることが明 らかにされた（第３図参照）。安定性の向上がこの変化のみに起因することを確 認するため、標準的操作〔例えば、シラー及びスミス。

１９８３年、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第１００巻、第４６８−５０ ０頁（Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ（１９８３）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ユ００　：　４６８−５００）参照〕を利用したオ リゴヌクレオチド突然変異によって野生型ズブチリシンに突然変異を生じさせた 。得られるズブチリシン変異体は、ＧＸ７１５０から生産されるランダム単離変 異ズブチリシンと全く同一に機能することが判明した。

例４ Ｂ、ズブチリス株ＧＸ７１５０から生産されるズブチリシンの物理的かつ化学的 性質 精製： ２１８位のアスパラギンがセリンに変わった上記ＧＸ７１５０生産ズブチリシン を、下記３工程精製手段によって無細胞発酵ブロスから精製した： （１）粗発酵ブロスのＤＥＡＥクロマトグラフィーニブロスを固体２−　（Ｎ− モルホリノ）エタンスルホン酸（Ｍｅｓ）添加によってｐＨ７，０に調整し、予 め２０ｍＭＭｅｓ緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化されたＤＥ＝５２セルロース〔 ワットマン（讐ｈａｔｉａｎ））床（１３Ｘ５ｃｏ＋）の上に加えた。ズブチリ シンの洗浄はこれらの条件下では遅延しなかった。

（２）ＤＥＡＥ溶離液のアセトン分画：アセトン（−２０℃）をＤＥＡＥ溶離液 と一緒に４℃で撹拌した。

ズブチリシンは５０〜７０％アセトンで沈殿する。０〜５０％アセトンで沈殿す る分画を捨てた。

（３）アセトン沈殿物の５Ｅ−５３（ワットマン）クロマトグラフィー：アセト ン沈殿ズブチリシンを２０ｍＭＭｅｓ緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解し、同一緩衝 液で平衡化された５Ｅ−５３セルロースカラム（２，５ｘ１６Ｃ１１）上に加え た。直線塩勾配（０〜０．２Ｍ　ＮａＣ１）を利用してズブチリシンを溶離させ た。

最大の特異的活性がある両分をプールし、沈殿剤として７０％イソプロパツール 又は５０％硫酸アンモニウムを加え一２０℃で貯蔵した。

酵素アッセイ： ズブチリシン活性は、２５．０℃における５０ｍＭ）リスＭＣＩ　（ｐＨ８，０ ）　、５０ｍＭ　ＫＣＩ中スラスクシニル）−Ａｌａ−（Ｌ）−Ａｌａ−（Ｌ） −Ｐｒ。

−（Ｌ）、−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（ＳＡＡＰＦ−ｐＮＡ（カルビオケム （Ｃａｌｂｌｏｃｈｅｍ）　）　）基質１．０ｍＭ溶液の加水分解をモニターす ることによって調べた。

活性１単位は、これらの条件で１分間当たり基質１μｓｏｌを加水分解する酵素 量に相当する。加水分解産物の１つであるｐ−ニトロアニリドは４１０ｎｍにお いて８８００　Ｍ”ｃｓ−’の吸光係数を有しており、このため酵素反応を８属 にモニターすることができる〔デルマーら。

１９７９年、アナライティカル・バイオケミストリー。

第９９１．＊３１６−３２０頁（Ｄｅｌｍａｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７９）Ａ ｎａｌｙｔｌｃａｌ　Ｂｉｏｅｈｅｓｌｓｔｒｙ、９９　：　３１Ｂ−４２０） 　）　＠ズブチリシン濃度は、Ｅ（０，１％）−１，１７を基準にして２８０ｎ ｍで調べた〔オッテセン及びスベンドソン。

１９７６年、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第２０７頁（Ｏｔｔｅｓｅｎ 　＆　５ｖｅｎｄｓｏｎ　（１９７６）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｎＥｎｚｙ會ｏ１ ｏｇｙ、ｐ、２０７））　（１熱不活性化の動力学： 熱不活性化試験は、ある特定の温度で選択される緩衝ｔｆＬ（通常５０ｒｎＭ） リスＨＣＩ　ＣｐＨ８，０）、５０ｍＭＫｃ］）に溶解されたズブチリシン溶液 （０，０５ｍｇ／ｍＤをインキュベートすることにより行なった。サンプルをガ ラス製ダラム（Ｄｕｒｈａｓ）管に入れ、これを選択された温度で平衡化された サーモスタット調節循環水浴に浸した。サンプル管からの蒸発はパラフィルム（ Ｐａｒａｆｉｌｗ）でシールすることにより防いだ。一部（１０μｇ）を様々な 時点で取出し、１．０ｍｌのアッセイ溶液となるように希釈し２５℃で試験した 。時間Ｏの時点における測定値は、サンプルが温浴に浸される前における５ＡＡ ＰＦ−ｐＮＡの加水分解率であった。その後のすべての基質の加水分解率を浴浸 漬後に測定した。

示差走査熱量測定； 示差走査熱量測定データは、１８Ｍパーソナルコンピュータ（モデルＸＴ）と連 結されかつＤＳＣソフトウェア〔ハード・サイエンティフ４７り（Ｈａｒｔ　５ ｃｌｅｎｔｌ自ｃ））及びキセニクス（Ｘｅｎ１ｘ　）操作システム〔マイクロ ソフトーサンタ・クルズ・オペレーシッンズ（Ｍｌｃｒｏｓｏｒｔ−Ｓａｎｔａ 　Ｃｒｕｚ　０ｐｅｒａｔ１ｏｎｓ　）　）で制御されるハート善サイエンティ フィック装置によって得た。温度は、開始時点の２０℃から９０℃まで６０℃／ ｈｒの速度で上昇させた。

タンパク質濃度は３．０ｍｇ／ｍｌであった。

等電点電気泳動： ポリアクリルアミド薄層におけるズブチリシンの分析用電気泳動は、公知技術を 使って行なった〔例えば、ウィンターら、１９７７年、ＬＫＢアプリケーション −ノー　）　２５０　（ｖｌｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７７）　ＬＫＢ　 ＡｐｐＨｃａｔ１ｏｎＮｏｔｅ　２５０）参照〕。市販アクリルアミドゲルの７ ムホリン（＾５ｐｈｏｌｉｎｅ　）　ＰＡＧブレー）　（ｐＨ３，０〜９．５） をＬＫＢから購入し、検定用標準（ｐＨ５，０〜１０．５）をファルマシア（Ｐ ｈａｒｓａｃｌａ　）から購入した。

ズブチリシンサンプルを電気泳動中の自己分解から防ぐために、ゲル上に加える 前にフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）で不活性化させた。

結果： 精製されたズブチリシン７１５０は等電点が８．８であることがわかったが、野 生型酵素の等電点とは実質上区別不可能であった。等電点８，３においてわずか に微量汚染成分が検出されただけであった。この程度の均一性は野生型の均一性 の程度に匹敵する。

ペプチド基質に対するズブチリシン７１５０の特異的活性レベルは、１２０±５ 単位／１ｇであった。この値は、野生型の８０±５単位／ｑ（２ダ一ス以上の別 々の単離物の平均値である）よりも５０％高い。この差異は、より高度に精製さ れた調製物であるということよりも、基質の加水分解に関する動力学的パラメー ター上のわずかな変化に起因する。

熱不活性化： 残存活性対時間の対数プロットによれば、大部分が半減期の３倍の時間にわたっ て直線的であることがわかった。したがって、−次速度剤が適用可能である。こ れは第４図で説明され、そこでは１０　ｍ　Ｍ　Ｃａ　ＣＩ　２．５０ｍＭ　Ｋ ＣＩ及びｐＨ８，Ｏの５ＱｍＭ）リスＨＣＩの存在下６５℃におけるズブチリシ ン７１５ｑ及び野生型酵素の活性低下速度を示す、これらの条件下で、野生！２ ＃素は半減期が５９±３分でありて、同様の条件で文献に報告された値と一致す る〔ブートウーら。

１９７６年、バイオケミストリー、１１１５巻、第、３７１６−３７２４頁（Ｖ ｏｏｒｄｏｕｖ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７Ｂ）　Ｂｌｏ−て、野生型の場合のほ ぼ４倍である。このことは、２１８位におけるアスパラギンからセリンへの１個 のアミノ酸変換がズブチリシンの動力学的熱安定性を著しく高めることの明白な 証明となる。

ズブチリシン７１５０における安定性増加は、他の様々な条件下で更に証明され た。例えば５０ｍＭ　ＫＣＩ及び＄）Ｈ８，０の１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ存在下に おけるズブチリシン７１５０及び野生型の熱不活性化については第５図で示され ている。ＥＤＴＡがカルシウムイオンの既知のズブチリシン安定化作用を打消す という事実からみて、これらの実験を４５℃で行うことが必要であつた。これら の条件下において、ズブチリシン７１５０は野生型酵素のほぼ３倍の半減期を有 していた。

ズブチリシン７１５０の明らかに高い安定性は、ｊｉ１６図で示されるように、 １．０ｍＭ　ＥＤＴＡ及び濃度５０μｇ／ｍｌのタンパク質存在下４０℃高ｐＨ （１０，５）の条件下でも観察された。

示差走査熱量測定： ズブチリシンの変性反応に関する熱力学的パラメータ−は、示差走査熱ｊｌａＰ Ｊ定法を使うことにより得た。ズブチリシン７１５０及び野生型酵素に関しては 得られた結果は第７図に示されている。ズブチリシン７１５０の変性転移は、ｐ Ｈ８，０の５０ｍＭトリスＨＣＩ、５０ｍＭＫＣｌ及び１０　ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ １２中において、野生型の場合に同一条件下で観察される値よりも約２．４℃高 い８０．７±０．１℃で起こったｏｌＯｍＭＥＤＴＡの存在下においてはズブチ リシン７１５０の変性温度が６２．８℃あって、野生型ズブチリシンよりも約４ ℃高い。これらの変性パラメーターは、２０℃で開始し９０℃で終了するまで温 度を６０℃／ｈｒの速度で上昇させることによって得た。競合型阻害剤Ｎ−ダン シル−３−アミノベンゼンボロン酸（Ｎ−ｄａｎｓｙｌ−３−ａｓｉｎｏｂｅｎ −ｚｅｎｅｂｏｒｏｎｌｃ　ａｃｉｄ）が濃度２ｍＭ　（ｐＨ８，０においてＫ １−２μｍ）で存在する場合には、ズブチリシンの変性プロセスに伴う自己分解 量を著しく低下させる。

変性温度の上昇は、２１８位におけるアスパラギンからセリンへの置換が変性反 応における自由エネルギーの変化の増大によってズブチリシンを安定化させてい るこアルカリ条件下における安定性試験のために、Ｂ、ズブチリシン株ＧＸ７１ ５０由来のズブチリシンを４℃７．０００ｒｐｒＡで３０分間の遠心分離によっ て発酵ブロスから回収した。次いでズブチリシンを硫酸アンモニウム（４９５ｇ ／ｆＩ）の添加により４℃で濃縮し、沈殿物を４℃１２．００Ｏｒｐｍで３０分 間の遠心分離により回収した。ベレット状タンパク質を脱イオンで希釈し、濃度 ４０，０００アル力リデルフト単位（Ａｌｋａｌｉｎｅ　ＤｅｌｆｔＵｎｉｔ） ／ｇとした。比較のために、市販プロテアーゼエンゼコ（Ｅｎｚｅｃｏ）　（エ ンザイムφデベロップメント（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）　＊　 ニューヨーク、ニューヨーク州〕を脱イオン水で希釈し、濃度４０，０ＯＯＡＤ Ｕ／ｇとした。

酵素をｐＨ１０，０に調整された非リン酸系米国製ヘビーデユーティ−液体洗剤 ライスフ（Ｍｉｓ）”）　（レバーブロス社（Ｌｅｖｅｒ　Ｂｒｏｓ、　Ｃｏ、 、　Ｉｎｃ、　）の登録商標、ニューヨーク、ニューヨーク州〕中４０００ＡＤ Ｕ／ｇの濃度でインキュベートした。溶液をこれらの条件下２５℃で５６日間イ ンキュベートした。

洗浄試験は、試験繊維としてＥＭＰＡ−１１６（テスト・ファブリクス社（Ｔｅ ｓｔ　Ｆａｂｒｌｃｓ、　Ｉｎｃ、）　、二ニーヨーク、ニューヨーク州のエン ザイム・マニュファクチャラーズーパフォーマンス・アッセイ（ＥｎｚｙＩｌｅ 　Ｍａｎｕｆ’ａｃ−１ｕｒｅｒｓ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ａｓ５ａｙ）　 ）を用いターボトメ−ター（Ｔｅｒｇｏｔｏｍｅｔｅｒ）にて行なった。酵素含 有ライスフ洗剤２ｇをｐＨ９，０の脱イオン洗浄水１ｇに加えた。次いで３枚の ６’Ｘ６’（約１５Ｘ１５（至））ＥＭＰＡ−１１６片及び３枚の６’Ｘ６’（ 約１５Ｘ１５ｃｍ）ＥＭＰＡ−２２１片（汚れのない布）を洗浄水に加えた。

洗浄は５５℃７５ｒｐａ＋の撹拌で１５分間行なった。洗浄水をすてた後、繊維 を冷水道水１ｆ！で２回すすぎ、乾燥し、軽くアイロンをかけた。布きれの反射 率をガードナー　（Ｃａｒｄｎｅｔ　）比色計゛（ΔＬ値を与える）で測定した 。

反射率値を各布地の両側で読取った（布地１枚につき合計１０回の読取り）。結 果は各試験において３０回のΔＬ（３枚ＯＥＭＰＡ−１１６繊維）読取り値の平 均値として示されている。反射率は同一条件で未修正ズブチリシンＢＰＮ’を用 いて、及び洗剤単独を用いて洗浄されたＥＭＰＡ−１１６布の場合と比較した。

ライスフ洗剤中での効能結果は第１表に示されている。

第１表 １日目　３５５日目　５６日目 試験サンプル　洗浄改　洗浄改　洗浄改ΔＬ　善事％　ΔＬ　善事％　ΔＬ　善 事％ウィスク　２８．５７　−　２８．５１　−　２６．４９　−ライスフ＋ ＧＸ７１５０３９．０５　４７　３７．６０　３２　３２．９９　２５修正ズブ チリ シンＢＰＮ’ ライスフ＋ ズブチリシン　３７．２９　４０　３０．１７　２０　２８．４４　０ＢＰＮ’ 例５ 変異体ＧＸ８３１５を３箇所点突然変異により製造した。３箇所点突然変異体は すべて、前記例２のランダム突然変異ズブチリシンをスクリニングすることによ って見つけられた。３箇所点突然変異はＡｓｎ２１８＝Ｓｅｒ　；Ｇ１ｙ１３１ →Ａｓｐ　；及びＴｈｒ２５４→Ａｌａであった。オリゴヌクレオチド突然変異 誘発法（ＯＤＭ）を使って、野生型ズブチリシンにおいてこれら３箇所の変化を 生じさせた。

第８図はこれら突然変異の数例の組合せ体の熱安定性に関する効果を示す。様々 なタンパク質をｐＨ８，０の１０ｍＭ　ＣａＣｌ２．５０ｍＭ）リスＨＣＩ、５ ０ｍＭＮａｃｌ中７０℃でインキュベートした。一部を様々な時間に取出し、残 存酵素活性について試験した。

これら条件下で、野生型ズブチリシンはその活性を１９．７分毎に半減させる。

ＧＸ７１６０はＧＸ７１５０と同様であるが、但しＯＤＭによっては製造されな い。

変異体ＧＸ７１６０　（Ａｓｎ２１８→Ｓｅｒ、突然変異誘発法により製造）は その活性を７１．１分毎に半減させるが、野生型の半減期よりも３．５９倍長い 。

変異体ＧＸ７１６９　（Ａｓｎ２１８−”Ｓｅｒ及びＧｌ）’１３１−”Ａｓｐ ）はその活性を１２７．７分毎に半減させるが、野生型の半減期よりも６．４５ 倍長い。

変異体ＧＸ８３１５　（Ａｓｎ２１８−”Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１３１−”Ａｓｐ及び Ｔｈｒ２５４　→Ａｌａ）はその活性を２３０．３分毎に半減させるが、野生型 の半減期よりも１１．６４倍長い。

例６ 例４で記載された示差走査熱量測定及び熱不活性化速度測定を３種の変異体で行 なったニ ア１５０　ＡＳＮ２１８　→　５ＥＲ ７１４２ＧＬＹ１３１　→　ＡＳＰ ７１６９　ＡＳＮ２１８　→　５ＥＲ ＧＬＹ１３１　→　ＡＳＰ 結果は第２表に示されている。

第２表 安定性を高めたズブチリシンＢＰＮ’の変異体１０ｍＭ　１０ｍＭ　１　ｍＭ　 １０ｍＭ７１５０　３．９　２．４　２．８　３．８＋０．４７１４２　０．８ 　１．０　１．５ ７１６９　３．４　２．９　２．２　Ｂ、２ａ　ΔＴｍは示差走査熱量測定実験 で測定されたＴｍの増加値である。遊離カルシウム濃度の二極端、１０ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ及び１０ｍＭ　ＣａＣｌ２の場合における結果が示されている。

ｂ　熱不活性化速度は野生型酵素の場合の値に対する倍数として示されている。

１ｍＭ　ＥＤＴＡでの結果は４５℃で得られ、１０ｍＭ　ＣａＣｌ２での結果は ６５℃で得られた。

これらのデータは、（Ｔｍで測定される）変性の自由エネルギーに関する単一突 然変異の効果は様々な単一突然変異が単一分子で併発した場合にほぼ相加的であ るが、一方不活性化速度に関する効果は相乗的であることを明らかにしている。

例７ 変異体ＧＸ７１６４を、２１８位がアスパラギン酸となるオリゴヌクレオチド突 然変異によって製造した。これは、２１８位におけるアスパラギンからセリンへ の置換がズブチリシンＢＰＮ’を安定化させることが明らかとなったことから実 施された。ズブチリシン１６４は、野生型ズブチリシンよりも１．９倍長い熱不 活性化半減期を有する。

微生物 原英文明細書第２５頁第１７行に記載の微生物寄託機関：アメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクション 住　所：１２３０１、バークローン・ドライブ・ロツクヴイル、メリーランド、 ２０８５２、アメリカ合衆国 寄託臼：１９８６年２月６日 受託番号：ＡＴＣＣ５３４５９ 微生物の表示：バチルス、ズブチリス、ＧＸ７１５０浄書（た鱈ミ夏叉なし） ＦＩＧ、　ｌ 浄書（内容に変更なし） 一重４Ω４ｉｘ或の突然尖スを妓 ＦＩＧ、　２ 浄書（内容に変更なし） ｅｔ ＦＩＧ、　３ くく敷と田２ 浄書（内容に変更なし） 贅藝敷犀酷 浄書（内容：こ変更なし） 扶緘枝場碕ト 沙瞥（：℃こ：、こ二３＝、χし〉 ぐＩｉ；″ズ賜１ 浄書（内容に変更なし） 實修灼型モ←？ 手続補正書動式） 昭和６３年８月１８日立へ

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．クローンＤＮＡを突然変異させしかる後変異体を同定するための方法ですつ て、 （ａ）クローンＤＮＡセグメントに一重鎖標的領域を設け； （ｂ）一重鎖ＤＮＡに突然変異を導入しうる化学的又は生物学的突然変異誘発剤 で該標的領域を処理することにより、該一重鎖標的領域に突然変異を導入し；（ ｃ）突然変異二重鎖ＤＮＡを形成させるために、該標的領域を二重鎖化させ； （ｄ）発現ベクター中に存在する該突然変異二重鎖ＤＮＡで微生物を形質転換さ せ； （ｅ）突然変異ＤＮＡが発現生成物を形成するように発現せしめられる条件下で 該形質転換微生物を培養し；（ｆ）ＤＮＡセグメント中の所望の突然変異を同定 するために発現生成物をスクリーニングする；ことからなる方法。
2. ２．クローンＤＮＡが酵素についてコードし、発現生成物が該酵素の変異体であ る、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．酵素がズブチリシンである、請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．酵素がズブチリシンと相同性のセリンプロテアーゼである請求の範囲第２項 記載の方法。
5. ５．所望の突然変異が熱安定性の高いズブチリシン物質を与える、請求の範囲第 ３項又は第４項記載の方法。
6. ６．化学的突然変異誘発剤が、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸及びギ酸からなる 群より選択される、請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．微生物がＢ、ズブチリスである、請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．形質転換微生物を発現生成物が結合するフィルター物質の存在下、発現生成 物がフィルター物質に移行して結合するような培養条件のもとで培養し；しかも 、スクリーニング工程が、野生型発現生成物を不活性化させるような条件にフィ ルター結合発現生成物を付すことによって発現生成物結合フィルター物質を処理 するものであって、しかる後安定性の高い発現生成物を同定しかつそれによって 所望の突然変異を同定するために処理済み発現生成物を酵素基質と接触させるこ とを含む、請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．請求の範囲第１項記載の方法に従い突然変異されかつ同定されたクローンＤ ＮＡセグメント。
10. １０．野生型ズブチリシンが不活性化される温度においてズブチリシン活性を残 存しうるズブチリシン物質についてコードするクローン突然変異ズブチリシン遺 伝子。
11. １１．ズブチリシンのアミノ酸２１８位においてアスパラギンの代わりに別のア ミノ酸を有するズブチリシン物質についてコードするクローン突然変異ズブチリ シン遺伝子。
12. １２．ズブチリシンのアミノ酸２１８位においてアスパラギンの代わりにセリン 又はアスパラギン酸を有するズブチリシン物質についてコードする、請求の範囲 第１１項記載の遺伝子。
13. １３．少なくとも１つのアミノ酸置換を更にうけた、請求の範囲第１１項記載の 遺伝子。
14. １４．ズブチリシンのアミノ酸２１８位においてアスパラギンの代わりにセリン を有しかつアミノ酸１３１位においてグリシンの代わりにアスパラギン酸を有す る変異ズブチリシン物質についてコードするクローン突然変異ズブチリシン遺伝 子。
15. １５．ズブチリシンのアミノ酸２１８位においてアスパラギンの代わりにセリン を有しかつアミノ酸２５４位においてスレオニンの代わりにアラニンを有する変 異ズブチリシン物質についてコードするクローン突然変異ズブチリシン遺伝子。
16. １６．アミノ酸２１８位においてアスパラギンの代わりにセリンを有しかつアミ ノ酸１６６位においてグリシンの代わりにセリンを有する変異ズブチリシン物質 についてコードするクローン突然変異ズブチリシン遺伝子。
17. １７．ズブチリシンのアミノ酸２１８位においてアスパランギンの代わりにセリ ンを有し、アミノ酸１３１位においてグリシンの代わりにアスパラギン酸を有し 、かつアミノ酸２５４位においてスレオニンの代わりにアラニンを有する変異ズ ブチリシン物質についてコードするクローン突然変異ズブチリシン遺伝子。
18. １８．ズブチリシンのアミノ酸１３１位においてグリシンの代わりにアスパラギ ン酸を有する変異ズブチリシン物質についてコードするクローン突然変異ズブチ リシン遺伝子。
19. １９．ズブチリシンのアミノ酸１８８位においてセリンの代わりにプロリンを有 する変異ズブチリシン物質についてコードするクローン突然変異ズブチリシン遺 伝子。
20. ２０．アミノ酸１１６位においてアラニンの代わりにグルタミン酸を有する変異 ズブチリシン物質についてコードするクローン突然変異ズブチリシン遺伝子。
21. ２１．ズブチリシンのアミノ酸１２６位においてロイシンの代わりにイソロイシ ンを有する変異ズブチリシン物質についてコードするクローン突然変異ズブチリ シン遺伝子。
22. ２２．ズブチリシンのアミノ酸５３位においてセリンの代わりにスレオニンを有 する変異ズブチリシン物質についてコードするクローン突然変異ズブチリシン遺 伝子。
23. ２３．Ｂ、ズブチリス株ＧＸ７１５０（ＡＴＣＣＮＯ．５３４５９）に存在する 、請求の範囲第１０項記載のクローン突然変異ズブチリシン遺伝子。
24. ２４．熱安定性の高いズブチリシン物質を製造かつ同定するための方法であって 、 （ａ）少なくとも一部分が一重鎖型であるクローンズブチリシン遺伝子を、亜硫 酸水素ナトリウム、亜硝酸及びギ酸からなる群より選択される突然変異誘発剤で 、上記遺伝子に少なくとも１つの突然変異を導入するために処理し； （ｂ）処理された遺伝子を二重鎖化させ；（ｃ）発現ベクター中に存在する処理 済み二重鎖遺伝子でＢ、ズブチリスを形質転換させ； （ｄ）ズブチリシンが結合しうるフィルター物質の存在下、処理済みの遺伝子が 発現生成物を形成するように発現せしめられかつ発現生成物がフィルター物質に 移行して結合するような条件のもとで、形質転換Ｂ、ズブチリスを培養し； （ｅ）野生型ズブチリシンが不活性化される温度で又はその温度以上で発現生成 物が結合したフィルター物質をインキュベートし；並びに （ｆ）熱安定性の高いズブチリシン物質を同定しかつそれによって熱安定性の高 いズブチリシン物質についてコードする突然変異ズブチリシン遺伝子を同定する ために、インキュベートされた発現生成物をズブチリシン基質物質と接触させる ； ことからなる方法。
25. ２５．野生型ズブチリシンが不活性化される温度でズブチリシン活性を残存しう る突然変異ズブチリシン物質。
26. ２６．該物質が突然変異ズブチリシンである、請求の範囲第２５項記載の突然変 異ズブチリシン物質。
27. ２７．該物質がズブチリシンと相同性の突然変異セリンプロテアーゼである、請 求の範囲第２５項記載の突然変異ズブチリシン物質。
28. ２８．請求の範囲第１項記載の方法に従い製造される、請求の範囲第２５項記載 の突然変異ズブチリシン物質。
29. ２９．野生型ズブチリシンが不活性化される温度で突然変異ズブチリシン物質に ズブチリシン活性が残存しうるようにされた、請求の範囲第１項記載の方法に従 い製造された、アミノ酸置換又はいずれかの組合せのアミノ酸置換をうけた突然 変異ズブチリシン物質。
30. ３０．野生型ズブチリシンが不活性化される温度で第一突然変異ズブチリシン物 質にズブチリシン活性が残存しうるようになった第一突然変異ズブチリシン物質 におけるアミノ酸置換位置に相当するいずれかのアミノ酸置換をうけた突然変異 ズブチリシン物質。
31. ３１．ズブチリシンのアミノ酸２１８位においてアスパラギンの代わりに別のア ミノ酸を有する突然変異ズブチリシン物質。
32. ３２．ズブチリシンのアミノ酸２１８位においてアスパラギンの代わりにセリン 又はアスパラギン酸を有する、請求の範囲第３１項記載の突然変異ズブチリシン 物質。
33. ３３．少なくとも１つのアミノ酸置換を更にうけた、請求の範囲第３１項記載の 突然変異ズブチリシン物質。
34. ３４．ズブチリシンのアミノ酸２１８位においてアスパラギンの代わりにセリン を有しかつアミノ酸１３１位においてグリシンの代わりにアスパラギン酸を有す る突然変異ズブチリシン物質。
35. ３５．ズブチリシンのアミノ酸２１８位においてアスパラギンの代わりにセリン を有しかつアミノ酸２５４位においてスレオニンの代わりにアラニンを有する突 然変異ズブチリシン物質。
36. ３６．アミノ酸２１８位においてアスパラギンの代わりにセリンを有しかつアミ ノ酸１６６位においてグリシンの代わりにセリンを有する突然変異ズブチリシン 物質。
37. ３７．ズブチリシンのアミノ酸２１８位においてアスパラギンの代わりにセリン を有し、アミノ酸１３１位においてグリシンの代わりにアスパラギン酸を有しか つアミノ酸２５４位においてスレオニンの代わりにアラニンを有する突然変異ズ ブチリシン物質。
38. ３８．ズブチリシンのアミノ酸１３１位においてグリシンの代わりにアスパラギ ン酸を有する突然変異ズブチリシン物質。
39. ３９．ズブチリシンのアミノ酸１８８位においてセリンの代わりにプロリンを有 する突然変異ズブチリシン物質。
40. ４０．アミノ酸１１６位においてアラニンの代わりにグルタミン酸を有する突然 変異ズブチリシン物質。
41. ４１．ズブチリシンのアミノ酸１２６位においてロイシンの代わりにイソロイシ ンを有する突然変異ズブチリシン物質。
42. ４２．ズブチリシンのアミノ酸５３位においてセリンの代わりにスレオニンを有 する突然変異ズブチリシン物質。
43. ４３．Ｂ、ズブチリス株ＧＸ７１５０（ＡＴＣＣＮＯ．５３４５９）を培養する ことによって製造される、請求の範囲第１５項記載の突然変異ズブチリシン物質 。
44. ４４．タンパク質生産条件下でＢ、ズブチリス株ＧＸ７１５０（ＡＴＣＣＮＯ． ５３４５９）を培養することからなる、請求の範囲第４３項記載の突然変異ズブ チリシン物質の製造方法。
45. ４５．請求の範囲第１０項記載の突然変異遺伝子を有するＢ、ズブチリス株。
46. ４６．請求の範囲第１１項記載の突然変異遺伝子を有するＢ、ズブチリス株。
47. ４７．Ｂ、ズブチリス株ＧＸ７１５０（ＡＴＣＣＮＯ．５３４５５９）。
48. ４８．下記工程： （ａ）請求の範囲第１項記載の方法により第一ズブチリシンを突然変異させ、か つ熱的に安定化させるアミノ酸突然変異を同定し； （ｂ）第二天然ズブチリシンのアミノ酸配列を調べ；（ｃ）上記第一突然変異ズ ブチリシンのアミノ酸配列を第二天然ズブチリシンのアミノ酸配列と整列させ； （ｄ）上記第一及び第二ズブチリシンのアミノ酸配列におけるギャップ部位又は その隣接部位に位置する第一突然変異ズブチリシンのアミノ酸突然変異を削除し ；（ｅ）上記第一突然変異ズブチリシンの突然変異に適合させるためにオリゴヌ クレオチド突然変異誘発によって上記第二ズブチリシンを突然変異させ；並びに （ｆ）熱的に安定な突然変異ズブチリシン物質を製造する； によって得られる熱安定性突然変異ズブチリシンセリンプロテアーゼ物質。
49. ４９．繊維上のタンパク質の汚れの除去法を改善するための方法であって、 請求の範囲第３０項〜第４３項のいずれか又は第４８項に記載の突然変異ズブチ リシン物質を洗浄用製品に加え、上記汚れのある繊維を上記洗浄用製品で洗浄す ることからなる方法。