DE68926163T2 - Mutierte subtilisingene - Google Patents
Mutierte subtilisingeneInfo
- Publication number
- DE68926163T2 DE68926163T2 DE68926163T DE68926163T DE68926163T2 DE 68926163 T2 DE68926163 T2 DE 68926163T2 DE 68926163 T DE68926163 T DE 68926163T DE 68926163 T DE68926163 T DE 68926163T DE 68926163 T2 DE68926163 T2 DE 68926163T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- subtilisin
- amino acid
- gene
- enzyme
- mutant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 46
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 claims abstract description 130
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract 4
- 108010020132 microbial serine proteinases Proteins 0.000 claims description 56
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 15
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 13
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 claims description 9
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 52
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 52
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 5
- RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N chembl564271 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]2C(C)SC[C@H](N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NC(=O)[C@@H](NC2=O)CSC1C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C(=C\C)/NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]2NC(=O)CNC(=O)[C@@H]3CCCN3C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]3N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NC(=O)C(=C)NC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(O)=O)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)C1=CC=CC=C1 RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N 0.000 abstract 1
- 108010082567 subtilin Proteins 0.000 abstract 1
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 62
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 62
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 60
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 51
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 description 39
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 35
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 35
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 14
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 13
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 9
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 9
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 9
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 5
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- BTUDGPVTCYNYLK-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylglutaric acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)CCC(O)=O BTUDGPVTCYNYLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical group O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- MAMOLWXGDKFYIC-CQSZACIVSA-N methyl (2r)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)-2-(4-methylphenyl)sulfonylpentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@](N)(C(=O)OC)S(=O)(=O)C1=CC=C(C)C=C1 MAMOLWXGDKFYIC-CQSZACIVSA-N 0.000 description 4
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 4
- 235000020384 spinach juice Nutrition 0.000 description 4
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 3
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 3
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101710173714 Subtilisin amylosacchariticus Proteins 0.000 description 3
- BGRWYDHXPHLNKA-UHFFFAOYSA-N Tetraacetylethylenediamine Chemical compound CC(=O)N(C(C)=O)CCN(C(C)=O)C(C)=O BGRWYDHXPHLNKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 3
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 3
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006171 Britton–Robinson buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- RPTUSVTUFVMDQK-UHFFFAOYSA-N Hidralazin Chemical compound C1=CC=C2C(NN)=NN=CC2=C1 RPTUSVTUFVMDQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003855 mesentericopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 108010031354 thermitase Proteins 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- LKDMKWNDBAVNQZ-WJNSRDFLSA-N 4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-WJNSRDFLSA-N 0.000 description 1
- NRTLIYOWLVMQBO-UHFFFAOYSA-N 5-chloro-1,3-dimethyl-N-(1,1,3-trimethyl-1,3-dihydro-2-benzofuran-4-yl)pyrazole-4-carboxamide Chemical compound C=12C(C)OC(C)(C)C2=CC=CC=1NC(=O)C=1C(C)=NN(C)C=1Cl NRTLIYOWLVMQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- -1 CL 68 cation Chemical class 0.000 description 1
- 101100016363 Caenorhabditis elegans his-67 gene Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710178665 Error-prone DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101000638484 Malbranchea cinnamomea Thermomycolin Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001523956 Parengyodontium album Species 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710194948 Protein phosphatase PhpP Proteins 0.000 description 1
- 101150090155 R gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000003667 Serine Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000083 Serine Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000219315 Spinacia Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- YNPKJCSIKJCODK-UHFFFAOYSA-N disodium boric acid hydrogen borate decahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OB(O)O.OB(O)O.OB(O)O.OB([O-])[O-] YNPKJCSIKJCODK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002474 hydralazine Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- ZBJVLWIYKOAYQH-UHFFFAOYSA-N naphthalen-2-yl 2-hydroxybenzoate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C=CC=C2)C2=C1 ZBJVLWIYKOAYQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- HWGNBUXHKFFFIH-UHFFFAOYSA-I pentasodium;[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O HWGNBUXHKFFFIH-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N sodium silicate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Si]([O-])=O NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Mutationen des Subtilisin-Gens, das Änderungen in den chemischen Eigenschaften des Enzyms Subtilisin ergibt. Mutationen an spezifischen Nucleinsäuren des Subtilisin-Gens führen zu Aminosäuresubstitutionen und infolgedessen zu einer veränderten Enzymfunktion. Einige dieser mutanten Enzyme weisen physikalische Eigenschaften auf, die für gewerbliche Anwendungen, insbesondere in der Waschmittelindustrie, wertvoll sind, da sie Subtilisin liefern, das stabiler gegenüber einer Oxidation ist, eine stärkere Protease-Aktivität besitzt und ein verbessertes Waschvermögen aufweist.
- Enzyme, die Amidbindungen in Proteinsubstraten spalten, werden als Proteasen oder (gleichwertig) Peptidasen bezeichnet (vgl. Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms, W. H. Freeman and Company, San Francisco, Kapitel 3). Bakterien der Spezies Bacillus sezernieren zwei extrazelluläre Protease-Spezies, eine neutrale oder Metalloprotease und eine alkalische Protease, die als Serin-endopeptidase wirkt und als Subtilisin bezeichnet wird. Die Sekretion dieser Proteasen ist mit dem bakteriellen Wachstumszyklus verbunden, wobei die stärkste Expression der Protease während der stationären Phase, in der auch die Sporulation stattfindet, erfolgt. Joliffe et al. (J. Bacteriol, Bd. 141 (1980), S. 1199-1208) weisen darauf hin, daß Bacillus-Proteasen eine Funktion im Zellwand-Turnover besitzen.
- Bei einer Serin-protease handelt es sich um ein Enzym, das die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert, wobei sich ein essentieller Serinrest am aktiven Zentrum befindet (White, Handler und Smith, 1973, "Principles of Biochemistry", 5. Aufl., McGraw-Hill Book Company, NY, S. 271-272).
- Die Serin-proteasen weisen Molekulargewichte im Bereich von 25 000 bis 30 000 auf. Sie werden durch Diisopropylfluorophosphat gehemmt, sind aber im Gegensatz zu Metalloproteasen resistent gegen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (obgleich sie bei hohen Temperaturen durch Calciumionen stabilisiert werden). Sie hydrolysieren einfache terminale Ester und besitzen eine ähnliche Aktivität wie eukaryontisches Chymotrypsin, das ebenfalls eine Serin-protease ist. Der alternative Ausdruck "alkalische Protease" bezieht sich auf das hohe pH-Optimum der Serin-protease vom pH- Wert 9,0 bis 11,0 (bezüglich eines Übersichtsartikels wird auf Priest, Bacteriological Rev., Bd. 41 (1977), S. 711-753 verwiesen).
- Ein Subtilisin ist eine durch gram-positive Bakterien oder Pilze gebildete Serin-protease. Eine große Vielzahl von Subtilisinen wurde identifiziert. Die Aminosäuresequenzen von mindestens acht Subtilisinen wurden bestimmt. Dazu gehören sechs Subtilisine aus Bacillus-Stämmen, nämlich Subtilisin 168, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin amylosacchariticus und Mesenterico-peptidase (Kurihara et al., J. Biol. Chem., Bd. 247 (1972), S. 5629-5631; Stahl und Ferrari, J. Bacteriol., Bd. 158 (1984), S. 411-418; Vasantha et al., J. Bacteriol., Bd. 159 (1984), S. 811-819; Jacobs et al., Nucl. Acids Res., Bd. 13 (1985), S. 8913-8926; Nedkov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Bd. 366 (1985), S. 421-430; Svendsen et al., FEBS Lett., Bd. 196 (1986), S. 228- 232) und zwei Pilz-Subtilisine, nämlich Subtilisin-thermitase aus Thermoactinymyces vulgaris (Meloun et al., FEBS. Lett., Bd. 183 (1985), S. 195-200) und Proteinase K aus Tritirachium album (Jany und Mayer, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Bd. 366 (1985), S. 485-492).
- Subtilisine sind physikalisch und chemisch gut charakterisiert. Außer der Kenntnis der Primärstruktur (Aminosäuresequenz) dieser Enzyme wurden mehr als 50 Röntgenstrukturanalysen mit hoher Auflösung von Subtilisin durchgeführt, die die Substratbindung, den Übergangszustand, die Produkte und drei unterschiedliche Protease-Inhibitoren beschreiben und die strukturellen Konsequenzen natürlicher Variationen definieren (Kraut, Ann. Rev. Biochem., Bd. 46 (1971), S. 331-358). Willkürliche und positionsgerichtete Mutationen des Subtilisin-Gens ergaben sich aus der Kenntnis der physikalischen und chemischen Eigenschaften des Enzyms und haben zu den Informationen über die katalytische Aktivität von Subtilisin, über dessen Substratspezifität und über dessen tertiäre Struktur und dergl. beigetragen (Wells et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1981), S. 1219- 1223; Wells et al., Phil. Trans, R. Soc. Lond. A., Bd. 317 (1986), S. 415-423; Hwang und Warshel, Biochem., Bd. 26 (1987), S. 266-2673; Rao et al., Nature, Bd. 328 (1987), S. 551-554).
- Eine Veröffentlichung (Estell et al., J. Biol. Chem., Bd. 260 (1985), S. 6518-6521) beschreibt die positionsgerichtete Mutagenese, die zur Substitution des Methionins in der 222-Position von Subtilisin BPN' durch sämtliche 19 Aminosäuren verwendet wird. Es wurde festgestellt, daß bei der Substitution die relativen spezifischen Aktivitäten gegenüber dem Substrat N-Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid unterschiedliche Werte von 138% bis 0,3% in bezug zu Wildtyp-Subtilisin BPN' aufweisen, wobei die Cys-Substitution die höchste Aktivität zeigte. Die Ala- und Ser-Substitutionen ergaben eine Aktivität von 53% bzw. 35% in bezug auf das Wildtyp-Enzym. Zum gleichen Zeitpunkt wurde festgestellt, daß Ala- und Ser-Substituenten eine verbesserte Beständigkeit gegen eine Oxidation durch H&sub2;O&sub2; aufweisen.
- Subtilisine werden in der Industrie im großen Umfang eingesetzt, insbesondere in Waschmittelpräparaten, da sie sich zur Entfernung von proteinartigen Flecken eignen. Um wirksam zu sein, müssen diese Enzyme nicht nur unter Waschbedingungen Aktivität besitzen, sondern sie müssen bei der Lagerung auch mit den übrigen Waschmittelbestandteilen verträglich sein. Beispielsweise kann Subtilisin in Kombination eingesetzt werden mit Amylasen, die gegen Stärken aktiv sind; Cellulasen, die Cellulosematerialien abbauen; Lipasen, die gegenüber Fetten aktiv sind; Peptidasen, die gegenüber Peptiden aktiv sind; und Ureasen, die gegenüber Urinflecken wirksam sind. Es muß nicht nur gewährleistet sein, daß die Formulierung die übrigen Enzyme vor einem Abbau durch Subtilisin schützt, sondern das Subtilisin muß auch in bezug auf Oxidationsvermögen, Calcium-Bindungseigenschaften, Waschwirkung und hohem pH-Wert von nicht-enzymatischen Waschmittelbestandteilen stabil sein. Die Fähigkeit des Enzyms, in Gegenwart dieser Bestandteile seine Stabilität zu erhalten, wird häufig als Wascheignung bezeichnet.
- US-3 770 587 betrifft chemische Modifikationen von proteolytischen Enzymen und stellt Vergleiche zwischen Ausgangsenzymen und modifizierten Enzymen in Waschmitteln an, um die Brauchbarkeit der modifizierten proteolytischen Enzyme zu ermitteln.
- Die vorliegende Erfindung betrifft Mutationen des Subtilisin-Gens, von denen einige zu Veränderungen der chemischen Eigenschaften des Enzyms Subtilisin führen. Mutationen werden an bestimmten Nucleinsäuren des Subtilisin-Gens erzeugt. In verschiedenen speziellen Ausführungsformen besitzen die mutanten Enzyme veränderte chemische Eigenschaften, zu denen (ohne Beschränkung hierauf) eine erhöhte Stabilität gegenüber Oxidation, ein erhöhtes proteolytisches Wirkungsvermögen und eine verbesserte Wascheignung gehören.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch (ohne Beschränkung hierauf) die Aminosäure- und DNA-Sequenzen für Protease-Mutanten, die sich von der Bacillus lentus-Variante Subtilisin 309 ableiten.
- Eine positionsgerichtete Mutation kann in wirksamer Weise mutante Subtilisin-Enzyme erzeugen, die für eine Vielzahl von gewerblichen Anwendungen, insbesondere auf dem Gebiet der Waschmittel- und Nahrungsmitteltechnologie, maßgeschneidert werden können. Die vorliegende Erfindung betrifft zum Teil (ohne Beschränkung hierauf) Mutanten des Subtilisin 309- Gene, wobei eine verbesserte Stabilität gegenüber Oxidation, eine erhöhte Protease-Aktivität und/oder eine verbesserte Wascheignung gewährleistet sind.
- A = Ala = Alanin
- V = Val = Valin
- L = Leu = Leucin
- I = Ile = Isoleucin
- P = Pro = Prolin
- F = Phe = Phenylalanin
- W = Trp = Tryptophan
- M = Met = Methionin
- G = Gly = Glycin
- S = Ser = Serin
- T = Thr = Threonin
- C = Cys = Cystein
- Y = Tyr = Tyrosin
- N = Asn = Asparagin
- Q = Gln = Glutamin
- D = Asp = Asparaginsäure
- E = Glu = Glutaminsäure
- K = Lys = Lysin
- R = Arg = Arginin
- H = His = Histidin
- Fig. 1 erläutert die Insertion einer Untergruppe von Fragmenten mit einem Längenbereich von 1,5 kb bis 6,5 kb, erzeugt durch partiellen Verdau von Bacillus lentus-Stamm 309-DNA mit Sau 3A-Restriktionsendonuclease, in das mit BamHI geschnittene Plasmid pSX50. Die beiden erhaltenen Plasmide, nämlich pSX86 und pSX88, die das Subtilisin 309-Gen in entgegengesetzten Orientierungen enthalten, sind ebenfalls abgebildet.
- Fig. 2 erläutert die Insertion von Bacillus lentus-Stamm 147-DNA- Fragmenten in das Plasmid pSX56. Ein partieller Verdau der Stamm 147-DNA- wurde unter Verwendung von Sau 3A-Restriktionsendonuclease durchgeführt. Fragmente im Größenbereich von 1,5 bis 6,5 kb wurden sodann in das mit BamHI gespaltene Plasmid pSX56 eingebunden. Das Produkt pSX94 enthält das Subtilisin 147-Gen.
- Fig. 3 erläutert eine Lücken-Duplex-Mutagenese unter Anwendung des Verfahrens von Morinaga et al. (Biotechnology, Bd. 2 (1984), S. 636-639). Es ergeben sich zwei Plasmide, nämlich pSX93 und pSX119, die beide von pUC13 abgeleitet sind. pSX93 enthält ein XbaI-HindIII-Fragment des Subtilisin 309-Gens, und pSX119 enthält den Rest des Subtilisin 309-Gens in einem EcoRI-XbaI-Fragment.
- In (A) wird das Plasmid pSX93 mit XbaI und ClaI gespalten. Die mit Lücken versehenen Moleküle werden mit pSX93, das mit ScaI geschnitten ist, vermischt, denaturiert und der Reanelierung überlassen, so daß Plasmide mit einer Region aus einer einzelsträngigen DNA, die sich innerhalb der Subtilisin 309-Kodierungssequenz erstreckt, entstehen. Ein synthetisches Oligonucleotid, das homolog zum Subtilisin 309-Gen ist, aber eine Mutation enthält, läßt man mit der einzelsträngigen Lücke anelieren, die sodann unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und T4- DNA-Ligase aufgefüllt wird. Nach Replikation des Plasmids werden doppelsträngige Mutanten des Subtilisin 309-Gens erzeugt. Das gleiche Verfahren wird in (B) unter Verwendung des Plasmids pSX119 und von EcoRI und XbaI- Enzymen durchgeführt, wobei Mutationen im entsprechenden Bereich des subtilisin 309-Gens entstehen.
- Fig. 4 zeigt das Plasmid pSX92, bei dem es sich um ein Derivat des Plasmids pSX62 handelt und das das Subtilisin 309-Gen trägt. Mutierte Fragmente (d. h. XbaI-ClaI, XbaI-HindIII oder EcoRI-XbaI), die aus dem Mutationsplasmid pSX93 oder pSX119 (vgl. Fig. 3) unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsendonucleasen ausgeschnitten worden waren, wurden in das Plasmid pSX92 zur Expression in B. subtilis Stamm DN 497 inseriert.
- Fig. 5 zeigt das Plasmid pSX143, das verkürzte Formen von Subtilisin 309-Gen und Subtilisin 147-Gen enthält. Eine in vivo-Rekombination zwischen homologen Bereichen der beiden Gene kann zu einer aktiven Protease führen.
- Die Erfindung betrifft Mutationen des Subtilisin-Gens, von denen einige zu Änderungen der chemischen Eigenschaften des Subtilisin-Enzyme führen. Mutationen an speziellen Nucleinsäuren können erzeugt werden. Auf diese Weise läßt sich Subtilisin so ausgestalten, daß es den Bedürfnissen einer gewerblichen Anwendung genügt.
- Die Erfindung beruht teilweise auf dem Befund, daß Mutationen von speziellen Nucleinsäuren im Subtilisin-Gen zu Enzymen mit veränderten Eigenschaften führen können. In verschiedenen Ausführungsformen lassen sich Enzyme mit verbesserter Stabilität gegenüber Oxidation, mit erhöhter Protease-Aktivität oder mit verbesserter Wascheignung erzeugen.
- Nachstehend wird die Erfindung aus Gründen der Klarheit in vier Abschnitten beschrieben, die aber keine Beschränkung beinhalten sollen: (a) Chemische Struktur von bekannten Subtilisinen und von Subtilisin 147 und 309; (b) Verfahren zur Erzeugung von Mutationen im Subtilisin-Gen; (c) Expression von Mutanten von Subtilisin; und (d) Screening von Subtilisin- Mutanten auf erwünschte chemische Eigenschaften.
- Die Sequenzanalyse von Subtilisin aus verschiedenen Quellen kann die funktionelle Bedeutung der primären Aminosäuresequenz erhellen und kann Direktiven zur Erzeugung neuer Mutanten mit gezielt modifizierten Funktionen geben. Vergleicht man die Aminosäuresequenz von unterschiedlichen Subtilisinformen unter Unterscheidung ihrer physikalischen oder chemischen Eigenschaften, so kann man spezielle Zielregionen auffinden, die vermutlicherweise wertvolle mutante Enzyme bilden.
- Die Aminosäuresequenzen von mindestens acht Subtilisinen sind bekannt. Hierzu gehören sechs Subtilisine von Bacillus-Stämmen, nämlich Subtilisin 168, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlserg, Subtilisin DY, Subtilisin amylosacchariticus und Mesenticopeptidase (Kurihara et al., J. Biol. Chem., Bd. 247 (1972), S. 5629-5631; Stahl und Ferran, J. Bacteriol., Bd. 158 (1984), S. 411-418; Vasantha et al., J. Bacteriol., Bd. 159 (1984), S. 811-819; Jacobs et al., Nucl. Acids Res., Bd. 13 (1985), S. 8913-8926; Nedkov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Bd. 366 (1985), S. 421-430; Svendsen et al., FEBS Lett., Bd. 196 (1986), S. 228-232) und zwei Pilz-Subtilisine, nämlich Subtilisin-thermitase aus Thermoactinymyces vulgaris (Meloun et al., FEBS. Lett., Bd. 183 (1985), S. 195-200) und Proteinase K aus Tritirichium album limber (Jany und Mayer, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Bd. 366 (1985), S. 485-492).
- In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung werden die Aminosäureund DNA-Sequenzen für zwei weitere Serin-proteasen aufgeklärt. Diese Proteasen leiten sich von den zwei Bacillus lentus-Varianten C303 und C360 ab, die beim NCIB hinterlegt wurden und die Hinterlegungsnummern NCIB 10147 und NCIB 10309 erhalten haben.
- Die Hinterlegungen wurden am 26. Januar 1968 bzw. 9. September 1968 vorgenommen. In bezug auf den Budapester Vertrag gilt als Hinterlegungstag der 31. März 1982.
- Aus Zweckmäßigkeitsgründen erhalten die von diesen Stämmen gebildeten Proteasen die Bezeichnungen Subtilisin 147 bzw. Subtilisin 309. Die für diese Proteine kodierenden Gene werden als Subtilisin 147-Gen bzw. Subtihein 309-Gen bezeichnet.
- Der erfindungsgemäß verwendete Ausdruck "Subtilisin-Material" bezieht sich auf ein proteinartiges Material, das ein Subtilisin als Wirkstoff enthält. Gemäß dem hier verwendeten Sprachgebrauch und unter der gegebenen Definition von Subtilisin-Material handelt es sich bei einer beliebigen Serin-protease um ein Subtilisin, wenn mindestens zu 30%, vorzugsweise zu 50% und insbesondere zu 80% eine Aminosäuresequenz-Homologie mit den vorstehend angegebenen Sequenzen für Subtilisin 147, Subtilisin 309, Subtilisin 168, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin amylosacchariticus, Mesentericopeptidase, Thermitase, Proteinase K und Thermomycolase vorliegt. Diese Serinproteasen werden hier auch als "homologe Serin-Proteasen" bezeichnet.
- In Tabelle 1 sind die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Subtilisin 309, Subtilisin 147, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg und Subtilisin 168 gegenübergestellt (Spizizen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 44 (1958), S. 1012-1078). In Tabelle II ist die Nucleinsäuresequenz des Subtilisin 309-Gens und in Tabelle III die Nucleinsäuresequenz des Subtilisin 147-Gens aufgeführt. Die Sequenzen von Subtilisin 309 oder 147 oder von deren funktionellen Aquivalenten können erfindungsgemäß herangezogen werden. Beispielsweise können die in den Tabellen I, II oder III dargestellten Sequenzen von Subtilisin 309 oder 147 durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die zu funktionell äquivalenten Molekülen führen, verändert werden. Beispielsweise können in der erfindungsgemäßen Praxis aufgrund der Degeneration von Nucleotid-Kodierungssequenzen andere DNA-Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie in Tabelle I kodieren, herangezogen werden. Hierzu gehören (ohne Beschränkung hierauf) Nucleotidsequenzen, die die Gesamtheit oder Teile der in den Tabellen II oder III dargestellten Subtilisin 309- oder Subtilisin 147-Sequenzen umfassen, die durch die Substitution von verschiedenen Codons, die für gleiche oder funktionell äquivalente Aminosäurereste innerhalb der Sequenz kodieren, verändert sind, wodurch man eine stille Veränderung erzeugt. Beispielsweise können einer oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure von ähnlicher Polarität, die als funktionelles Aquivalent wirkt, substituiert werden. Ein Ersatz für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz kann unter anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Beispielsweise gehören zu den nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Zu den polaren neutralen Aminosäuren gehören Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Thyrosin, Asparagin und Glutamin. Zu den positiv geladenen (basischen) Aminosäuren gehören Arginin, Lysin und Histidin. Zu den negativ geladenen (sauren) Aminosäuren gehören Asparaginsäure und Glutaminsäure.
- Der Verwandtschaftsgrad läßt sich durch Vergleich der Aminosäuresequenzen messen. Es gibt zahlreiche Verfahren zur gegenseitigen Ausrichtung von Proteinsequenzen, wobei sich die Unterschiede aber erst zeigen, wenn der Verwandtschaftsgrad recht gering ist. Die im Atlas of Protein Sequence and Structure, Hrsg. Margaret O. Dayhoff, Bd. 5, Ergänzungsband 2, 1976, National Biomedical Research Foundation, Georgetown University Medical Center, Washington, D. C., S. 3 ff. unter dem Titel "SEARCH and ALIGN" beschriebenen Verfahren definieren den Verwandtschaftsgrad. Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß verwandte Proteine in bezug auf die Zahl von Aminosäuren sowie in bezug auf die Identität der einzelnen Aminosäuren entlang der Kette differieren können. Dies bedeutet, daß es Deletionen oder Insertionen geben kann, wenn zwei Strukturen so aufeinander ausgerichtet werden, daß eine maximale Identität besteht. Beispielsweise weist Subtilisin Carlsberg nur 274 Aminosäuren auf, während Subtilisin BPN' 275 Aminosäuren aufweist. Die Ausrichtung der beiden Sequenzen zeigt, daß Carlsberg keinen Rest aufweist, der Asn56 von Subtilisin BPN' entspricht. Somit würde die Carlsberg-Aminosäuresequenz sich von BPN' sehr stark unterscheiden, wenn nicht die Lücke in der Position 56 berücksichtigt wird. Daher kann man mit einem hohen Konfidenzgrad vorhersagen, daß ein Ersatz von Asn durch Ser in der Position 218 von Subtilisin Carlsberg die thermische Stabilität erhöht, vorausgesetzt, daß die Reste im Carlsberg-Enzym homolog zum BPN'-Enzym numeriert werden.
- Erfindungsgemäß können die für Subtilisin 309 und Subtilisin 147 bestimmten Sequenzen mit Sequenzen bekannter Subtilisine (Tabelle I) oder mit neu entdeckten Subtilisinen verglichen werden, um Stellen für wunschenswerte Mutationen aufzufinden. Um dies zu tun, muß die Nähe des Verwandtschaftsgrads der zu vergleichenden Subtilisine bestimmt werden.
- Versuche zur Bestimmung der Beziehung zwischen der Primärstruktur von Subtilisin und von dessen physikalischen Eigenschaften haben die Bedeutung des Methioninrestes 222 sowie der funktionellen Aminosäuren im aktiven Zentrum, nämlich Asparaginsäure 32, Histidin 64 und Serin 221, ergeben. Asparagin 155 und Serin 221 liegen innerhalb der Oxyanion-Bindungsstelle. Für Mutationen an diesen Positionen besteht die Wahrscheinlichkeit, daß sie die proteolytische Aktivität verringern. Erfindungsgemäß wurden die Aminosäuresequenzen von Subtilisin 309 und Subtilisin 147 miteinander und mit den Sequenzen anderer Subtilisine verglichen (vgl. Tabelle II). Reste, die zwischen Subtilisin 309 oder Subtilisin 147 und anderen Subtilisinen variierten, wurden identifiziert. Beispielsweise enthält Subtilisin 309 am Rest 153 einen Serinrest, während Subtilisin 147, BPN', Carlsberg und 168 einen Alaninrest enthalten. Würde daher der Serinrest 153 von Subtilisin 309 durch einen Alaninrest ersetzt, könnten sich die physikalischen Eigenschaften von Subtilisin 309 in einer gewunschten Richtung verändern. In ähnlicher Weise enthält Subtilisin 147 einen Serinrest in Position 218, während bei den übrigen Subtilisinen ein Asparaginrest exprimiert ist. Da Subtilisin 147 eine im Vergleich zu anderen Subtilisinen verbesserte thermische Stabilität aufweist, könnte eine Mutation von Asparagin 218 von Subtilisin 309 in einen Serinrest die thermische Stabilität von Subtilisin 309 verbessern. Als ein weiteres Beispiel wurde aufgrund der Tatsache, daß Thr 71 sich nahe am aktiven Zentrum befindet, darauf geschlossen, daß die Einführung einer negativ geladenen Aminosäure, wie Asparaginsäure den oxidativen Angriff durch elektrostatische Abstoßung unterdrücken könnte. Die Stellen, die vermutlich besonders wichtig für die physikalischen Eigenschaften von Subtilisin sind, sind die, bei denen eine Konservierung von Aminosäureresten zwischen den meisten Subtilisinen vorliegt, beispielsweise die vorstehend erörterten Asp-153 und Asn-218 sowie Trp-6, Arg-170, Pro-166, His-67, Met-175, Gly-219 und Arg-275. Durch Mutation der Nucleinsäuresequenz in der Weise, daß eine Aminosäure, die im Vergleich zu anderen Subtilisinen unterschiedlich ist, durch eine entsprechende Aminosäure substituiert ist, kann eine stabilere Form von Subtilisin erhalten werden.
- Wells et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 1219- 1223) haben den Vergleich von Aminosäuresequenzen und eine positionsgerichtete Mutation zur Manipulation der Subtilisin-Substratspezifität herangezogen. Die katalytischen Aktivitäten von verschiedenen Subtilisinen gegenüber ausgewählten Substraten können sich erheblich unterscheiden. Wells hat gezeigt, daß nur drei Aminosäuresubstitutionen bewirken können, daß die Substratspezifität von B. amyloliquefaciens-Subtilisin sich der von B. lichenformis-Subtilisin nähert, wobei es sich um Enzyme handelt, die sich in ihrem nativen Zustand in bezug auf die katalytische Wirksamkeit um Faktoren von 10-50 unterscheiden. Ein Vergleich der Analyse zwischen Subtilisin 147 und Subtilisin 309 und anderen Subtilisinen hat ergeben, daß eine Mutation folgender Stellen die physikalischen oder chemischen Eigenschaften von Subtilisin verändern kann: 6, 9, 11-12, 19, 25, 36-38, 53-59, 67, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121-122, 124, 128, 131, 140, 153-166, 168, 169-170, 172, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 199, 218, 219, 222, 226, 234-238, 241, 260-262, 265, 268 oder 275. Deletionen erfolgen an folgenden Stellen in Subtilisin 147 und/oder Subtilisin 309, wobei eine Insertion von geeigneten Aminosäureresten an diesen Stellen die Stabilität der Ausgangsenzyme erhöhen kann: 1, 36, 56, 159, 164-166. Gemäß dem in diesen Beispielen (die keine Beschränkung darstellen) erläuterten Verfahren ergibt sich eine Anzahl von möglichen Mutationsstellen. Tabelle I Vergleich der Aminosäuresequenzen für verschiedene Proteasen
- a = Subtilisin 309
- b = Subtilisin 147
- c = Subtilisin BPN'
- d = Subtilisin Carlsberg
- e = Subtilisin 168
- º = zugeordnete Deletion
- Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren zur Einführung von Mutationen in Gene bekannt. Nach einer kurzen Erörterung der Klonierung von Subtilisin-Genen werden Verfahren zur Erzeugung von Mutationen sowohl an willkürlichen als auch an spezifischen Stellen innerhalb des Subtilisin-Gens erörtert.
- Das für Subtilisin kodierende Gen kann aus beliebigen gram-positiven Bakterien oder Pilzen nach verschiedenen bekannten Verfahren geklont werden. Zunächst muß eine genomische und/oder cDNA-Bibliothek von DNA unter Verwendung von chromosomaler DNA oder Messenger-RNA aus dem Organismus, der das zu untersuchende Subtilisin bildet, konstruiert werden. Wenn die Aminosäuresequenz des Subtilisins bekannt ist, können homologe, markierte Oligonucleotid-Sonden synthetisiert und zur Identifizierung von für Subtilisin kodierenden Klonen aus einer genomischen Bibliothek von bakterieller DNA oder aus einer Pilz-CDNA-Bibliothek verwendet werden. Alternativ könnte eine markierte Oligonucleotid-sonde mit einem Gehalt an für Subtilisin aus einem anderen Stamm von Bakterien oder Pilzen homologen Sequenzen als Sonde verwendet werden, um für Subtilisin kodierende Klone zu identifizieren, wobei man Hybridisierungs- und Waschbedingungen von geringerer Stringenz anwendet.
- Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung von Subtilisin erzeugenden Klonen würde darin bestehen, Fragmente von genomischer DNA in einen Expressionsvektor, z. B. ein Plasmid, zu inserieren, Protease-negative Bakterien mit der erhaltenen genomischen DNA-Bibliothek zu transformieren und sodann die transformierten Bakterien auf Agar mit einem Gehalt an einem Substrat für Subtilisin, wie Magermilch, auszustreichen. Bakterien, die ein Subtilisin tragendes Plasmid enthalten, erzeugen Kolonien, die von einem Hof aus klarem Agar umgeben sind, und zwar aufgrund der Verdauung der Magermilch durch ausgeschiedenes Subtilisin.
- Nachdem das Subtilisin-Gen in einen geeigneten Vektor, wie ein Plasmid, geklont worden ist, können verschiedene Verfahren herangezogen werden, um in das Gen willkürliche Mutationen einzuführen. Ein Verfahren besteht in der Einverleibung des klonierten Subtilisin-Gens als Teil eines wiedergewinnbaren Vektors in einen Mutatorstamm von Escherichia coli.
- Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Erzeugung einer einzelsträngigen Form des Subtilisin-Gens und das anschließende Anelieren des DNA- Fragments mit einem Gehalt an dem Subtilisin-Gen mit einem weiteren DNA- Fragment, so daß ein Teil des Subtilisin-Gens einzelsträngig bleibt. Diese diskrete, einzelsträngige Region kann sodann einer Anzahl von Mutagenisierungsmitteln ausgesetzt werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) Natriumbisulfit, Hydroxylamin, salpetrige Säure, Ameisensäure oder Hydralazin gehören. Ein spezielles Beispiel für dieses Verfahren zur Erzeugung von willkürlichen Mutationen wird von Shortle und Nathans (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75 (1978), S. 2170-2174) beschrieben. Gemäß dem Verfahren von Shortle und Nathans wird das das Subtilisin-Gen tragende Plasmid durch ein Restriktionsenzym, das eine Spaltung innerhalb des Gens vornimmt, gebrochen. Dieses Bruchstück wird sodann unter der Exonuclease- Einwirkung von DNA-Polymerase I zu einer Lücke erweitert. Die erhaltene einzelsträngige Lücke kann sodann unter Verwendung von einem der vorstehend erwähnten Mutagenisierungsmittel mutagenisiert werden.
- Alternativ kann das Subtilisin-Gen aus einer Bacillus-Spezies, das die natürlichen Promotor- und andere Steuersequenzen einschließt, in einen Plasmidvektor mit einem Gehalt an Replicons sowohl für E. coli als auch B. subtilis, einem selektierbaren, phänotypischen Marker und der M13-Replikationsursprungsstelle für die Erzeugung einer einzelsträngigen Plasmid-DNA bei Superinfektion mit dem Helferphagen IR1 geklont werden. Einzelsträngige Plasmid-DNA mit einem Gehalt an dem geklonten Subtilisin- Gen wird isoliert und mit einem DNA-Fragment, das Vektor-Sequenzen aber nicht die Kodierungsregion für Subtilisin enthält, aneliert, wodurch man ein Duplex-Molekül mit einer Lücke erhält. Mutationen werden in das subtilisin-Gen entweder mit Natriumbisulfit, salpetriger Säure oder Ameisensäure oder durch Replikation in einem Mutatorstamm von E. coli gemäß den vorstehenden Angaben eingeführt. Da Natriumbisulfit ausschließlich mit Cytosin in einer einzelsträngigen DNA reagiert, sind die mit diesem Mutagen erzeugten Mutationen nur auf die Kodierungsbereiche beschränkt. Die Reaktionszeit und die Bisulfitkonzentration werden in verschiedenen Experimenten variiert, so daß durchschnittlich pro Subtilisin-Gen 1 bis 5 Mutationen erzeugt werden. Durch Inkubation von 10 µg einer mit einer Lücke versehenden Duplex-DNA in 4 M Na-bisulfit, pH-Wert 6,0, für 9 Minuten bei 37ºC in einem Reaktionvolumen von 400 µl werden etwa 1% Cytosine in der einzeisträngigen Region desaminiert. Die Kodierungsregion von reifem subtilisin enthält etwa 200 Cytosine, je nach dem DNA-Strang. Vorteilhafterweise wird die Reaktionszeit von etwa 4 Minuten (zur Erzeugung einer Mutationsfrequenz von etwa 1 bei 200) bis etwa 20 Minuten (etwa 5 bei 200) variiert.
- Nach der Mutagenese werden die mit einer Lücke versehenen Moleküle in vitro mit DNA-Polymerase 1 (Klenow-Fragment) behandelt, um vollständige doppelsträngige Moleküle zu bilden und um die Mutationen zu fixieren. Kompetente E. coli-Zellen werden sodann mit der mutagenisierten DNA unter Bildung einer amplifizierten Bibliothek von mutanten Subtilisinen transformiert. Amplifizierte mutante Bibliotheken können auch durch Züchten der Plasmid-DNA in einem Mut D-Stamm von E. coli erzeugt werden, was den Bereich der Mutationen aufgrund von dessen fehleranfälliger DNA-Polymerase erhöht.
- Die Mutagene salpetrige Säure und Ameisensäure können ebenfalls zur Erzeugung von mutanten Bibliotheken verwendet werden. Da diese Chemikalien nicht wie Natriumbisulfit für einzelsträngige DNA spezifisch sind, werden die Mutagenesereaktionen folgendermaßen durchgeführt. Der Kodierungsbereich des Subtilisin-Gens wird nach üblichen Verfahren in den M13- Phagen geklont, und einzelsträngige Phagen-DNA wird hergestellt. Die einzeisträngige DNA wird sodann mit 1 M salpetriger Säure vom pH-Wert 4,3 15-60 Minuten bei 23ºC oder mit 2,4 M Ameisensäure 1-5 Minuten bei 23ºC umgesetzt. Diese Bereiche von Reaktionszeiten erzeugen eine Mutationsfrequenz von 1 bei 1000 bis 5 bei 1000. Nach der Mutagenese wird ein universeller Primer mit der M13-DNA aneliert, und Duplex-DNA wird unter Verwendung der mutagenisierten, einzeisträngigen DNA als Matrize synthetisiert, so daß der Kodierungsbereich des Subtilisin-Gens vollständig doppelsträngig wird. An dieser Stelle kann der Kodierungsbereich aus dem M13-Vektor mit Restriktionsenzymen ausgeschnitten und in einen nicht-mutagenisierten Expressionsvektor ligiert werden, so daß Mutationen nur im Restriktionsfragment auftreten (Myers et al., Science, Bd. 229 (1985), S. 242-257).
- Nach einem weiteren Verfahren können Mutationen erzeugt werden, indem man zwei unterschiedliche Formen von Subtilisin einer in vivo-Rekombination unterwirft. Gemäß diesem Verfahren führen homologe Regionen innerhalb der beiden Gene zu einem Cross-over der entsprechenden Regionen, was zu einem Austausch von genetischer Information führt. Die Erzeugung von hybriden Amylase-Molekülen nach dieser Technik ist in der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 67 992 (eingereicht am 29.06.1987) ausführlich beschrieben (auf diese Druckschrift wird in ihrer Gesamtheit durch Verweis Bezug genommen). Ein Beispiel für ein Plasmid, das hybride Formen von Subtilisin erzeugen kann, ist in Fig. 5 dargestellt. Sowohl das subtilisin 309-Gen als auch das Subtilisin 147-Gen, die in das Plasmid pSX143 eingebaut sind, sind verkürzt und können daher selbst nicht zur Subtilisin-Expression führen. Wenn jedoch eine Rekombiantion zwischen den beiden Genen so erfolgt, daß der durch die Verkürzung erzeugte Defekt korrigiert wird, d.h. daß die N-terminale Region des Subtilisin 309-Gens mit der C-terminalen Region des Subtilisin 147-Gens verknüpft wird, so läßt sich aktives, mutantes Subtilisin erzeugen. Wird pSX143 in einen Protease-negativen Stamm von Bakterien eingebaut und werden anschließend Bakterien, die einen Protease-positiven Phänotyp entwickeln, ausgewählt, so lassen sich verschiedene Mutanten, Subtilisin 309/147-Chimäre, identifizieren.
- Nachdem das Subtilisin-Gen geklont worden ist und erwünschte Stellen für die Mutation identifiziert worden sind, können diese Mutationen unter Verwendung von synthetischen Oligonudeotiden eingeführt werden. Diese Oligonudeotide enthalten die die gewünschten Mutationsstellen flankierenden Nucleotidsequenzen. Mutante Nucleotide werden während der Oligonucleotidsynthese inseriert. In einem bevorzugten Verfahren wird eine einzelsträngige Lücke von DNA, die das Subtilisin-Gen überbrückt, in einem das Subtuisin-Gen tragenden Vektor erzeugt. Anschließend wird das synthetische Nucleotid, das die gewünschte Mutation trägt, zu einem homologen Bereich der einzelsträngigen DNA aneliert. Die verbleibende Lücke wird sodann durch DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt, und das Konstrukt wird unter Verwendung von T4-Ligase verknüpft. Ein spezielles Beispiel für dieses Verfahren wird von Morinaga et al. beschrieben (Biotechnology, Bd. 2 (1984), S. 636-639). Gemäß Morinaga et al. wird ein Fragment innerhalb des Gens unter Verwendung von Restriktionsendonuclease entfernt. Das Vektor/Gen das nunmehr eine Lücke enthält, wird sodann denaturiert und zum Vektor/Gen hybridisiert, das, statt eine Lücke zu enthalten, mit einer anderen Restriktionsendonuclease an einer Stelle außerhalb des Lückenbereichs gespalten worden ist. Eine einzelsträngige Region des Gens steht sodann für die Hybridisierung mit mutierten Oligonucleotiden bereit, wobei die restliche Lücke durch Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt wird, wobei die Insertionen mit T4-DNA-Ligase ligiert werden. Nach einem Replikationszyklus entsteht ein doppelsträngiges Plasmid, das die gewünschte Mutation trägt. Das Morinaga-Verfahren vermeidet die zusätzliche Manipulation bei der Konstruktion von neuen Restriktionsstellen und erleichtert somit die Erzeugung von Mutationen an mehreren Stellen. Das US-Patent 4 760 025 (Estelle et al., Ausgabetag 26. Juli 1988) ermöglicht die Einführung von Mehrfachmutationen tragenden Oligonudeotiden durch Vornahme von geringeren Veränderungen an der Kassette, wobei jedoch eine noch größere Vielzahl von Mutationen bei einem Vorgang nach dem Morinaga-Verfahren eingeführt werden kann, da eine große Vielzahl von Oligonudeotiden unterschiedlicher Längen eingeführt werden kann.
- Erfindungsgemäß kann ein mutiertes Subtilisin-Gen, das nach den vorstehend beschriebenen Verfahren oder nach beliebigen alternativen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren erzeugt worden ist, in Enzymform unter Verwendung eines Expressionsvektors exprimiert werden. Ein Expressionsvektor fällt allgemein unter die Definition eines Klonierungsvektors, da ein Expressionsvektor üblicherweise die Komponenten eines typischen Klonierungsvektors enthält, nämlich ein Element, das eine autonome Replikation des Vektors in Mikroorganismen unabhängig vom Genom des Mikroorganismus erlaubt, und einen oder mehrere phänotypische Marker für Selektionszwecke. Ein Expressionsvektor umfaßt für einen Promotor kodierende Steuersequenzen, einen Operator, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translationsinitationssignal und ggf. ein Repressorgen. Um die Sekretion des exprimierten Proteins zu ermöglichen, können Nucleotide, die für eine "Signalsequenz" kodieren, vor der Kodierungssequenz des Gens inseriert werden. Für die Expression unter Steuerung der Steuersequenzen wird ein erfindungsgemäß zu behandelndes zielgen funktionell mit den Steuersequenzen im geeigneten Leseraster verknüpft. Promotorsequenzen, die Plasmidvektoren einverleibt werden können und die die Transkription des mutanten Subtilisin-Gens unterstützen können, umfassen (ohne Beschränkung hierauf) den prokaryontischen β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75 (1978), S. 3727-3731) und den tac-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1963), S. 21-25).
- Weitere Hinweise finden sich in "Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, Bd. 242 (1980), S. 74-94.
- Gemäß einer Ausführungsform wird B. subtilis durch einen Expressionsvektor, der die mutierte DNA trägt, transformiert. Wenn die Expression in einem sezernierenden Mikroorganismus, wie B. subtilis, stattfinden soll, kann eine Signalsequenz dem Translationsinitiationssignal folgen und der DNA-Sequenz von Interesse vorhergehen. Die Signalsequenz bewirkt einen Transport des Expressionsprodukts zur Zellwand, wo es bei der Sekretion vom Produkt abgespalten wird. Der vorstehend definierte Ausdruck "Steuersequenzen" soll eine Signalsequenz, wenn diese vorhanden ist, umfassen.
- Zum Sreening auf Mutanten kann transformierter B. subtilis in Gegenwart eines Filtermaterials (wie Nitrocellulose), mit dem das sezernierte Expressionsprodukt (z.B. Enzym) eine Bindung eingeht, gezüchtet werden. Um ein Screening auf ein Expressionsprodukt mit einer gewünschten Eigenschaft vorzunehmen, wird das an den Filter gebundene Expressionsprodukt Bedingungen unterworfen, die eine Unterscheidung zwischen dem in Frage stehenden Expressionsprodukt und dem Wild-Typ-Expressionsprodukt ermöglichen. Beispielsweise kann das an den Filter gebundene Expressionsprodukt Bedingungen unterworfen werden, die zu einer Inaktivierung eines Wild- Typ-Produkts führen. Eine nach dieser Inaktivierungsbehandlung konservierte Enzymaktivität läßt darauf schließen, daß die Mutation dem Enzym verstärkte Stabilität verleiht, so daß es sich um eine wertvolle Mutation handelt.
- In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Screening auf stabile Varianten unter Verwendung eines B. subtilis-Stammes mit einem Protease- Mangel, der mit dem varianten Plasmid transformiert und auf folgende Weise ausgestrichen worden ist, durchgeführt. Ein Nitrocellulose-Filter wird auf eine Nährbasis in einer Petri-Schale gelegt. Oben auf die Nitrocellulose wird ein Celluloseacetat-Filter gelegt. Kolonien werden auf dem Celluloseacetat gezüchtet. Protease von einzelnen Kolonien wird durch das Celluloseacetat auf den Nitrocellulose-Filter sezerniert, wo sie in stabiler Weise gebunden wird. Protease von Hunderten von Kolonien wird an einem einzelnen Filter gebunden, was das anschließende Screening von Tausenden unterschiedlicher Varianten durch Verarbeitung von mehreren Filtern ermöglicht.
- Zur Identifizierung von Kolonien, die Subtilisin von erhöhter thermischer Stabilität erzeugen, können die Filter in Pufferlösungen bei Temperaturen, die im wesentlichen die gesamte Wild-Typ-Aktivität inaktivieren, inkubiert werden. Varianten von erhöhter Stabilität oder Aktivität behalten ihre Aktivität auch nach dieser Stufe. Der in geeigneter Weise behandelte Filter wird sodann in einer Lösung mit einem Gehalt an Tosyl-L-Argmethylester (TAME), Benzoyl-Arg-ethylester (BAEE), Acetyl-Tyr-ethylester (ATEE) (Sigma) oder ähnlichen Verbindungen eingeweicht. Da TAME, BAEE und ATEE Substrate für die Proteasen sind, werden sie in Zonen auf dem Filter mit einem Gehalt an Subtilisin-Varianten, die nach der Behandlung ihre Aktivität behalten, gespalten. Bei der Spaltung werden bei der Umsetzung Reaktionen freigesetzt, wodurch Phenolrot in den Bereichen, wo die Protease-Aktivität erhalten bleibt, sich von Rot nach Gelb verfärbt.
- Dieses Verfahren kann zum Screening unterschiedlicher Klassen von Varianten mit nur geringfügigien Modifikationen herangezogen werden. Beispielsweise können die Filter bei hohen Temperaturen, einem hohen pH- Wert, mit Denaturierungsmitteln, mit Oxidationsmitteln oder unter Bedingungen, die normalerweise zur Inaktivierung eines Enzyms, beispielsweise einer Protease, führen, behandelt werden, um resistente Varianten aufzufinden. Varianten mit veränderter Substratspezifität können herausgefunden werden, indem man TAME, BAEE oder ATEE durch andere Substrate ersetzt, die normalerweise von Wild-Typ-Subtilisin nicht gespalten werden.
- Nachdem durch das Screening eine Variante von erhöhter Stabilität identifiziert worden ist, wird die Kolonie, die sich von der Variante ableitet, isoliert, und das veränderte Subtilisin wird gereinigt. Es können Versuche mit dem gereinigten Enzym durchgeführt werden, um die Bedingungen bezüglich Oxidationsstabilität, thermischer Inaktivierung, Denaturierungstemperatur, kinetischen Parametern sowie anderen physikalischen Messungen zu bestimmen. Das veränderte Gen kann auch sequenziert werden, um die für die erhöhte Stabilität verantwortlichen Aminosäurenveränderungen festzustellen. Unter Anwendung dieses Verfahrens wurden Varianten mit erhöhter Wascheignung isoliert.
- B. subtilis 309 und 147 sind Varianten von Bacillus lentus, die beim NCIB unter den Hinterlegungsnummern NCIB 10147 und NCIB 10309 hinterlegt worden sind und im US-Patent 3 723 250 (Ausgabetag 27. März 1973), das hier in seiner Gesamtheit durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht wird, beschrieben. B. subtilis DN 497 ist in der US-Anmeldung 039 298 (die ebenfalls durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht wird) beschrieben: es handelt sich um eine aro+-Transformante von RUB 200 mit chromosomaler DNA aus SL 438, einem von Dr. Kim Hardy von Biogen erhaltenen Stamm mit einem Mangel an Sporulation und Protease. E. coli MC 1000 r&supmin;m&spplus; (M. J. Casa-daban und S. N. Cohen, J. Mol. Biol., Bd. 138 (1980), S. 179-207) wurde gemäß herkömmlichen Verfahren mit dem Merkmal r&supmin;m&spplus; ausgestattet und ist ebenfalls in der US-Anmeldung 039 298 beschrieben.
- pSX50 (beschrieben in der US-Anmeldung 039 298, Anmeldetag 17. April 1987, die durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht wird) ist ein Derivat des Plasmide pDN 1050, das den Promotor-Operator P&sub1;O&sub1;, das B. pumilus xyn B-Gen und das B. subtilis xyl R-Gen umfaßt.
- pSX65 (beschrieben in der vorgenannten US-Anmeldung 039 298) ist ein Derivat des Plasmids pDN 1050, das den Promotor-Operator P&sub2;O&sub2;, das B. pumilus xyn B-Gen und das B. subtilis xyl-R-Gen umfaßt.
- pSX93, das in Fig. 3a dargestellt ist, ist pUC13 (Vieira und Messing, Gene, Bd. 19 (1982), S. 259-262), das ein 0,7 kb XbaI-HindIII-Fragment des Subtilisin 309-Gens unter Einschluß des in eine Polylinker-Sequenz inserierten Terminators umfaßt.
- pSX119 ist pUC13 mit einem EcoRI-XbaI-Fragment des in den Polylinker inserierten Subtilisin 309-Gens.
- pSX62 (beschrieben in der vorgenannten US-Anmeldung 039 298) ist ein Derivat von pSX52 (a. a. O.), das ein Fusionsgen zwischen dem Kälber-Prochymosin-Gen und dem B. pumilus xyn B-Gen, inseriert in pSX50 (vergl. oben), umfaßt. pSX62 wurde durch Inserieren von E. coli rrn B-Terminator in pSX52 hinter dem Prochymosin-Gen erzeugt.
- pSX92 wurde durch Klonieren von Subtilisin 309 in das Plasmid pSX62 (vergl. oben), geschnitten an ClaI und HindIII und aufgefüllt vor der Insertion der Fragmente DraI-NheI und NheI-HindIII aus dem klonierten Subtilisin 309-Gen, erzeugt.
- Das Verfahren betrifft eine typische Reinigung eines 10 Liter-Fermentationsansatzes des Subtilisin 147-Enzyms, des Subtilisin 309-Enzyms oder von Mutanten davon.
- Etwa 8 Liter Fermentationsbrühe wurden 35 Minuten in 1 Liter fassenden Bechergläsern bei 5000 U/min zentrifugiert. Die überstände wurden unter Verwendung von 10% Essigsäure auf den pH-Wert 6,5 eingestellt und an Seitz Supra S100-Filterplatten filtriert.
- Die Filtrate wurden unter Verwendung einer Amicon CH2A UF-Anlage, die mit einer Amicon S1Y10 UF-Patrone ausgerüstet war, auf etwa 400 ml eingeengt. Das UF-Konzentrat wurde vor der Adsorption an einer Bacitracin- Affinitätssäule beim pH-Wert 7 zentrifugiert und futriert. Die Protease wurde von der Bacitracin-Säule unter Verwendung von 25% 2-Propanol und 1 M Natriumchlorid in einer Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,01 Dimethylglutarsäure, 0,1 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, der auf den pH- Wert 7 eingestellt war, eluiert. Die Fraktionen mit Protease-Aktivität aus der Bacitracin-Reinigungsstufe wurden vereinigt und auf eine mit 750 ml Sephadex G25-Säule (Durchmesser 5 cm) aufgesetzt, die mit einem Puffer mit einem Gehalt an 0,01 M Dimethylglutarsäure, 0,2 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, der auf den pH-Wert 6,5 eingestellt war, äquilibriert worden war.
- Fraktionen mit proteolytischer Aktivität aus der Sephadex G25-Säule wurden vereinigt und auf eine 150 ml CM Sepharose CL 68-Kationenaustauscher enthaltende Säule (5 cm Durchmesser) aufgesetzt, die mit einem Puffer mit einem Gehalt an 0,01 M Dimethylglutarsäure, 0,2 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, der auf dem pH-Wert 6,5 eingestellt worden war, äquilibriert worden war.
- Die Protease wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0-0,1 M Natriumchlorid in 2 Liter des gleichen Puffers eluiert (0-0,2 M Natriumchlorid im Fall von sub 147).
- In einer letzten Reinigungsstufe wurden Protease enthaltende Fraktionen von der CM Sepharose-Säule vereinigt und in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle, die mit einer GRBLP-Membran (von der Firma Danish Sugar Factones Inc.) ausgerüstet war, eingeengt.
- Subtilisin 309 und die Mutanten
- Met 222 für Ala
- Gly 195 für Glu
- Asn 218 für Ser
- Arg 170 für Tyr
- Gly 195 für Glu, Arg 170 für Tyr
- Gly 195 für Glu, Met 222 für Ala wurden nach diesem Verfahren gereinigt.
- Sämtliche Fehl-Primer wurden an einem Applied Biosystems 380 A DNA- synthesegerät synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigt.
- Das gereinigte Enzym wurde auf einen Enzymgehalt von etwa 0,1 mg/ml in 0,01 M Dimethylglutarsäure, pH-Wert 7, und dem gleichen Puffer mit 0,01 M Peressigsäure (pH-Wert 7) verdünnt.
- Beide Verdünnungsansätze wurden 20 Minuten auf 50ºC erwärmt. Die proteolytische Aktivität wurde in den Verdünnungen vor und nach der Wärmebehandlung gemessen.
- Die proteolytische Aktivität wurde unter Verwendung von Casein als Substrat bestimmt. Eine Casein-Protease-Einheit (CPU) ist als die Enzymmenge definiert, die 1 mmol primäre Aminogruppen (bestimmt durch Vergleich mit einem Serin-Standard) pro Minute unter Standardbedingungen, d. h. 30-minütige Inkubation bei 25ºC und bei pH-Wert 9,51 freisetzt.
- Eine 2% (Gew.-/Vol.) Lösung von Casein (Hammarstein, Produkt der Fa. Merck AG, Deutschland) wurde mit Universalpuffer gemäß den Angaben von Britton und Robinson (Journ. Chem. Soc., (1931), S. 1451), eingestellt auf den pH-Wert 9,5, hergestellt.
- 2 ml Substratlösung wurden in einem Wasserbad 10 Minuten bei 25ºC vorinkubiert. 1 ml Enzymlösung mit einem Gehalt an etwa 0,2-0,3 CPU/ml Britton-Robinson-Puffer (pH-Wert 915) wurden zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 25ºC wurde die Umsetzung durch Zugabe eines Stoppreagenz (5 ml einer Lösung mit einem Gehalt an Trichloressigsäure (17,9 g), Natriumacetat (29,9 g) und Essigsäure (19,8 g) mit 500 ml entionisiertem Wasser aufgefüllt) beendet. Ein Leerwert wurde auf die gleiche Weise wie die Testlösung hergestellt, mit der Ausnahme, daß das Stoppreagenz vor der Enzymlösung zugegeben wurde.
- Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten auf dem Wasserbad gehalten, wonach es durch Whatrnan Nr. 42-Papierfilter futriert wurde.
- Primäre Aminogruppen wurden durch ihre Farbentwicklung mit o-Phthaldialdehyd (OPA) bestimmt.
- Dinatriumtetraborat-decahydrat (7,62 g) und Natriumdodecylsulfat (2,0 g) wurden in 150 ml Wasser gelöst. OPA (160 mg), gelöst in 4 ml Methanol, wurde sodann zusammen mit 400 µl β-Mercaptoethanol gelöst, wonach die Lösung mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt wurde. Das OPA-Reagenz (3 ml) wurde mit 40 µl der vorerwähnten Futrate unter Vermischen versetzt. Die optische Dichte (OD) bei 340 nm wurde nach etwa 5 Minuten gemessen.
- Der OPA-Test wurde auch mit einem Serin-Standard mit einem Gehalt an 10 mg Serin in 100 ml Britton-Robinson-Puffer (pH-Wert 9,5) durchgeführt. Der Puffer wurde als Leerwert eingesetzt.
- Die Protease-Aktivität wurde aus den Messungen der optischen Dichte gemäß folgender Formel berechnet:
- CPU/ml Enzymlösung = (ODt - ODb) x Cser x Q/(ODser - ODB) x Mgser x ti
- CPU/g Enzympräparat = CPU/ml: b
- worin ODt, ODb, ODser und ODB die optische Dichte der Testlösung, des Leerwerte, des Serin-Standards bzw. des Puffers bedeuten, Cser die Serin- Konzentration in mg/ml im Standard bedeutet und MGser das Molekulargewicht von Serin bedeutet. Q bedeutet den Verdünnungsfaktor (in diesem Fall hat er den Wert 8) für die Enzymlösung und ti die Inkubationszeit in Minuten.
- In der nachstehenden Tabelle V sind die Ergebnisse für den vorstehenden Test in bezug zum Ausgangsenzym aufgeführt.
- Teststoffe (7 cm x 7 cm, etwa 1 g) wurden vorbereitet, indem man Stoff aus entschlichteter Baumwolle (100% Baumwolle, DS 71) durch das Gefäß in einer Mathis-Wasch- und Trockenanlage Typ TH (Werner Mathis AG, Zürich, Schweiz) mit einem Gehalt an Spinatsaft (hergestellt aus frischem Spinat) und anschließend durch die Preßwalze der Maschine führte, um überschüssigen Spinatsaft zu entfernen.
- Schließlich wurde der Stoff in einem starken Luftstrom bei Raumtemperatur getrocknet, 3 Wochen bei Raumtemperatur belassen und anschließend bis zur Verwendung bei -18ºC aufbewahrt.
- Die Tests wurden in einer Terg-O-tometer-Testwaschmaschine (beschrieben in Jay C. Harns "Detergency Evaluation and Testing", Interscience Publishers Ltd., 1954, S. 60-61) isothermisch 10 Minuten bei 100 U/min durchgeführt. Als Waschmittel wurde das folgende Standardwaschpulver verwendet:
- LAS, Nansa 5 80 0,4 g/l
- AE, Berol 0 65 0,15 g/l
- Seife 0,15 g/l
- STPP 1,75 g/1
- Natriumsilicat 0,40 g/1
- CMC 0,05 gil
- EDTA 0,01 g/l
- Na&sub2;SO&sub4; 2,10 gil
- Perborat 1,00 g/l
- TAED 0,10 g/l
- TAED = N,N,N',N'-Tetraacetylethylendiamin; der pH-Wert wurde mit 4 N NaOH auf 9,5 eingestellt. Das verwendete Wasser wies eine Härte von 9º auf (Deutsche Härtegrade).
- Die Tests wurden bei den Enzymkonzentrationen 0, 0,05 CPU/1 und 0,1 CPU/1 durchgeführt. Für jede der Mutanten wurden zwei unabhängige Sätze von Tests vorgenommen.
- Acht Stoffe wurden für jeden Test unter Verwendung von 1 Becherglas (800 ml) Waschmittel verwendet. Von den Stoffen waren vier sauber und vier mit Spinatsaft verschmutzt. Nach dem Waschen wurden die Stoffe 25 Minuten in laufendem Wasser in einem Eimer gespült.
- Sodann wurden die Stoffe über Nacht (gegen Tageslicht geschützt) an der Luft getrocknet. Die Remission R, bestimmt mit einem ELREPHO 2000- Spektrophotometer der Fa. Datacolor S. A., Dietikon, Schweiz, bei 460 nm wurde ermittelt.
- Als ein Maß für die Wascheignung wurde die differentielle Remission, Δ R, herangezogen, wobei Δ R die Remission nach Waschen mit Enzymzusatz minus die Remission nach Waschen ohne Enzymzusatz bedeutet.
- Das gleiche Verfahren wie für die Wascheignung wurde auch zur Ermittlung der Thermostabilität der gebildeten Mutanten herangezogen, indem man den Test bei Temperaturen von 40 bzw. 60ºC durchführte.
- Chromosomale DNA des Stammes "309" wurde durch 30-minütige Behandlung einer Zellsuspension mit Lysozym bei 37ºC und sodann durch 5-minütige Behandlung mit SDS bei 60ºC isoliert. Anschließend wurde die Suspension mit Phenol-Chloroform (50:50) extrahiert, mit Ethanol gefällt, und der Niederschlag wurde in TE erneut gelöst. Diese Lösung wurde 1 Stunde bei 37ºC mit RNase behandelt.
- Etwa 30 µg der chromosomalen DNA wurden partiell mit dem Restriktionsenzym Sau 3A (New England Biolabs) verdaut, und Fragmente von etwa 1,5 kb bis etwa 6,5 kb wurden an DEAE-Cellulosepapier von einem 1% Agarosegel isoliert (das Subtilisin-Gen in anderen Spezies weist eine Länge von etwa 1,2 kb auf).
- Wie in Fig. 1 dargestellt, wurden die Fragmente aneliert und an mit BamHI geschnittenes Plasmid pSX50 (beschrieben in der US-Anmeldung 039 298, Einreichungstag 17. April 1987; diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) ligiert. Die Plasmide wurden sodann in kompetente B. subtilis DN 497-Zellen transformiert.
- Die Zellen wurden sodann auf LB-Agarplatten mit 10 mM Phosphat vom pH-Wert 7, mit 6 µg/ml Chloramphenicol und 0,2% Xylose ausgestrichen, um den xyn-Promotor im Plasmid zu induzieren. Die Platten enthielten ferner 1% Magermilch, so daß die Protease bildenden Transformanten durch den klaren Hof an der Stelle, wo die Magermilch abgebaut worden war, nachgewiesen werden konnten.
- Protease exprimierende Klone wurden in einer Häufigkeit von 10&supmin;&sup4; gebildet. Von zwei Klonen wurde festgestellt, daß sie Plasmide für das Gen Subtilisin 309 trugen, nämlich pSX86 und pSX88. Das Gen wurde sodann gemäß dem Verfahren von Maxarn und Gilbert sequenziert. Die abgeleitete Nucleotidsequenz von Subtilisin 309 ist in Tabelle II dargestellt. Tabelle II Das Subtilisin 309-Gen Signal
- Das vorstehende Verfahren wurde zur Klonierung des Subtilisin 147- Gens angewandt, mit der Ausnahme, daß die DNA-Fragmente in das Plasmid pSX56 (ebenfalls in der vorstehenden US-Anmeldung 039 298 beschrieben), das, wie in Fig. 2 angegeben, anstelle des xyn-Promotors den xyl-Promotor enthält, ligiert wurden. Von einem Klon wurde festgestellt, daß er ein das Gen für Subtilisin 147 tragendes Plasmid, pSX94, enthält. Die Sequenz für dieses Gen ist in der nachstehenden Tabelle III aufgeführt. Tabelle III Das Subtilisin 147-Gen Signal
- Positionsepezifische Mutationen wurden gemäß dem Verfahren von Monnaga et al. (Biotechnology, a. a. O.) durchgeführt. Die folgenden Oligonudeotide wurden zur Einführung der Mutationen verwendet:
- a) Gly-195 Glu:
- Ein 27-mer-Fehl-Primer, NOR-237, der auch eine neue SacI-Restriktionsstelle erzeugt
- b) Gly-195 Asp:
- Ein 23-mer Fehl-Primer, NOR-323, der auch eine neue BglII-Stelle erzeugt
- c) Met-222 Cys:
- Ein 24-mer Fehl-Primer, NOR-236
- d) Met-222 Ala:
- Ein 22-mer Fehl-Primer, NOR-235
- Diese beiden Primer zerstören die einzige ClaI-Stelle.
- e) Ser-153 Äla:
- Ein 18-mer Fehl-Primer, NOR-324, der auch eine neue PvuII-Stelle erzeugt
- f) Aun-218 9er:
- Ein 23-mer Fehl-Primer, NOR-325, der auch eine neue MspI-Stelle erzeugt
- g) Thr-71 Aup:
- Ein 23-mer Fehl-Primer, NOR-463,
- h) Met-222 Cys und Gly-219 Cys: Ein 32-mer Fehl-Primer, NOR-494,
- i + j) Gly-195 Glu und Met-222 Ala oder Met-222 Cys:
- Diese doppelten Mutantenkombinationen von NOR-237 und NOR-235 oder NOR-236 wurden durch Verbinden der einzelnen mutanten DNA-Fragmente erzeugt.
- k) Ser-153 Ala und ABN-216 Ser:
- Eine Kombination von NOR-324 und NOR-325 wurde in Analogie zu den vorstehenden Ausführungen erzeugt.
- Eine Lücken-Duplex-Mutagenese wurde unter Verwendung des Plasmids pSX93 als Schablone durchgeführt. pSX93 ist in Fig. 3a und 3b dargestellt. Es handelt sich um pUC13 (J. Vieira und J. Messing, Gene, Bd. 19 (1982), S. 259-268) mit einem 0,7 kb-XbaI-HindIII-Fragment des Subtilisin 309-Gens unter Einschluß des in den Polylinker inserierten Terminators. Der Terminator und die HindIII-Stelle sind in Tabelle II nicht aufgeführt.
- Zur Einführung von Mutationen in den N-terminalen Teil des Enzyms wurde das Plasmid pSX119 verwendet. Bei pSX119 handelt es sich um pUC13 mit einem EcoRI-XbaI-Fragment des in den Polylinker eingesetzten Subtilisin 309-Gens. Die Matrizen pSX93 und pSX119 decken somit das gesamte Subtilisin 309-Gen ab.
- Die Mutationen a), b) und e) wurden durch Schneiden von pSX93 mit XbaI und ClaI gemäß den Angaben in Fig. 3a durchgeführt. Die Mutationen c), d), f) und h) wurden durch Schneiden von pSX93 mit XbaI und HindIII gemäß den Angaben in Fig. 3b durchgeführt.
- Die Mutation g) wurde in entsprechender Weise in pSX119 durch Schneiden mit EcoRI und XbaI durchgeführt.
- Die Doppelmutanten i) und j) wurden durch Schneiden des 0,7 kb-Xba- HindIII-Fragments aus a) partiell mit HgiAI (HgiAI schneidet auch in SacI, das durch die Mutation eingeführt wurde) erzeugt. Dieses 180 bp-XbaI-HgiAI-Fragment und das 0,5 kb HgiAI-Fragment der c)- bzw. d)-Mutanten wurden in das große HindIII-XbaI-Fragment von pSX93 ligiert.
- Die Doppelmutante k) wurde auf die vorstehend angegebene Weise durch Kombination der Mutanten e) und f) erzeugt.
- Anschließend an das Anelieren, Auffüllen und Ligieren wurde das Gemisch zur Transformation von E. coli MC 1000 r&supmin;m&spplus; verwendet. Mutanten unter den Transformanten wurden durch Kolonienhybridisierung gemäß den Angaben von Vlasuk et al. (J. Biol. Chem., Bd. 258 (1983), S. 7141-7148) und von G. P. Vlasuk und S. Inouye ("Experimental Manipulation of Gene Expression", M. Inouye (Hrsg.), Academic Press, New York, S. 292-303) abgesucht. Die Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
- Anschließend an die Sequenzbestätigung der korrekten Mutation wurden die mutierten DNA-Fragmente in das Plasmid pSX92, das zur Erzeugung der Mutanten verwendet wurde, inseriert.
- Das Plasmid pSX92 ist in Fig. 4 dargestellt und wurde hergestellt, indem man das Sub 309-Gen in bei ClaI geschnittenes Plasmid pSX62 inserierte, mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase 1 auffüllte und vor der Insertion der Fragmente Drai-NheI und NheI-HindIII aus dem klonierten Sub 309-Gen schnitt.
- Zur Expression der Mutanten wurden die mutierten Fragmente (XbaI- ClaI, XbaI-HindIII oder EcoRI-XbaI) aus dem entsprechenden Mutationsplasmid pSX93 bzw. pSX119 ausgeschnitten und in pSX92 inseriert.
- Das mutierte pSX92 wurde sodann zur Transformation des Stammes B. subtilis DN 497 verwendet, der im gleichen Medium, das zum Klonieren des Ausgangsgens herangezogen wurde, gezüchtet wurde.
- Nach entsprechendem Wachstum wurden die mutierten Enzyme gewonnen und gereinigt.
- Die Mutanten a) und d) wurden auf ihre Oxidationsstabilität in 0,01 M Peressigsäure nach 20 Minuten bei 50ºC und beim pH-Wert 7 getestet. Die Protease des Ausgangsetammes NCIB 10309 wurde als Vergleich verwendet.
- Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV aufgeführt. Dort ist die restliche proteolytische Aktivität in den wärmebehandelten Proben im Vergleich zu nicht durch Oxidationsmittel oder Wärme behandelten Proben angegeben. Tabelle IV Oxidationuatabilität gegenüber Peressigsäure Restaktivität nach 20 min bei 50ºC Enzym ohne Oxidationsmittel mit Oxidationsmittel sub 309 Mutante a Mutante d
- Es läßt sich der Schluß ziehen, daß die Mutante d (Met 222 für Ala) eine überlegene Oxidationsstabilität im Vergleich zum Ausgangsenzym und Mutante a aufweist.
- Sämtliche Mutanten mit Ausnahme von g) und h) wurden auch qualitativ in 100-500 ppm Hypochlorit bei Raumtemperatur von 35ºC bei den pH-Werten 6,5 und 9,0 15 Minuten bis 2 Stunden getestet.
- Diese Tests ergaben, daß die Mutanten c), d), i) und j) (alle Met-222) gegen Hypochlorit 3- bis 5-fach beständiger als die übrigen Mutanten waren.
- Bei Test in einem flüssigen Waschmittel von üblichem Aufbau wurde festgestellt, daß die Mutante f) eine überlegene Stabilität im Vergleich zu den beiden übrigen Mutanten und dem "parentalen" Enzym aufwies.
- Die proteolytische Aktivität von verschiedenen Mutanten wurde gegen Casein als Proteinsubstrat gemäß den oben angegebenen Verfahren getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.
- Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Mutante a) eine erhöhte Aktivität gegenüber dem parentalen Produkt zeigt. Es ist ferner ersichtlich, daß die Met-222-Mutanten eine geringere Aktivität als das Ausgangsprodukt aufweisen, daß aber aufgrund ihrer verbesserten Oxidationsstabilität ihre Anwendung in Waschmittelzusammensetzungen mit einem Gehalt an Oxidationsmitteln nicht ausgeschlossen ist. Tabelle V Proteolytische Ativität von mutanten Subtilisinen Mutante relative Aktivität keine
- Die Wascheignung von verschiedenen Mutanten wurde gegen Spinatsaft gemäß den vorstehend angegebenen Verfahren getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt.
- Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß sämtliche getesteten Mutanten eine verbesserte Wascheignung im Vergleich zum Ausgangsenzym aufwiesen, und daß die Mutanten c), d), i) und j) erheblich besser waren. Tabelle VI Wascheignung der Mutante Mutante ΔR Konzentration (CPU/1) keine 95%-Vertrauensbereich: ±0,9
- Die Thermostabilität der Mutante f) wurde gegen das Wildtyp-Enzym unter Anwendung des Wascheignungstests bei 40ºC bzw. 60ºC getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII aufgeführt.
- Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Mutante f) bei 60ºC eine erheblich verbesserte Wascheignung im Vergleich zum Wildtyp-Enzym zeigt, während bei 40ºC die Wascheignung der Mutante f) nur geringfügig besser als die des Wildtyp-Enzyms ist. Tabelle VII Wascheignung bei unterschiedlichen Temperaturen Mutante ΔR Konzentration (CPU/1) keine 95%-Vertrauensbereich: ±0,9 (40ºC) und ±0,7 (60ºC)
- Subtilisin-Gene wurden aus den Varianten 147 und 309 des Bacteriums Bacillus lentus geklont. Die geklonten Gene wurden sequenziert. Durch Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Subtilisine 147 und 309 miteinander und mit den Sequenzen von anderen Subtilisinen wurden Stellen, die nach Mutation die physikalischen Eigenschaften des Ausgangsenzyme verändern können, identifiziert. Eine positionsgerichtete Mutagenese wurde zur Erzeugung von Mutationen an mehreren dieser Stellen im Subtilisin 309-Gen herangezogen. Die erhaltenen mutanten Enzyme wurden sodann in einem Bacillus-Stamm exprimiert und auf verschiedene physikalische und chemische Parameter getestet. Von einigen der Mutanten wurde gezeigt, daß sie eine verbesserte Oxidationsstabilität, eine erhöhte proteolytische Aktivität oder eine verbesserte Wascheignung im Vergleich zum Ausgangsenzym Subtilisin 309 aufweisen. Diese Mutanten besitzen Eigenschaften, die für Enzyme in Waschmittelzusammensetzungen wünschenswert sind.
- 1. Gebiet der Erfindung 3
- 2. Hintergrund der Erfindung 3
- 2.1. Bacillus-Proteasen 3
- 2.2. Subtilisin 3
- 2.3. Gewerbliche Anwendungen von Subtilisinen 5
- 3. Zusammenfassende Darstellung der Erfindung 5
- 3.1. Abkürzungen 6
- 4. Beschreibung der Figuren 6
- 5. Ausführliche Beschreibung der Erfindung 8
- 5.1. Chemische Struktur von bekannten 8 Subtilisinen und von Subtilisin 147 und 309 8
- 5.2. Verfahren zur Erzeugung von Mutationen im Subtilisin-Gen 15
- 5.2.1. Klonierung eines Subtilisin-Gens 15
- 5.2.2. Erzeugung von willkürlichen Mutationen im Subtilisin-Gen 16
- 5.2.3. Erzeugung von positionsgerichteten Mutationen im Subtilisin-Gen 18
- 5.3. Expression von Subtilisin-Mutanten 19 5.4. Screening von mutanten Subtilisinen 20
- 6. Beispiel: Eine positionspezifische Mutation des Subtilisin-Gens erzeugt Mutanten mit wertvollen chemischen Eigenschaften 21
- 6.1. Materialien und Methoden 21
- 6.1.1. Bakterienstämme 21
- 6.1.2. Plasmide 22
- 6.1.3. Reinigung von Subtilisinen 22
- 6.1.4. Oligonucleotid-Synthese 24
- 6.1.5. Bestimmung der Oxidationsstabilität 24
- 6.1.6. Test auf proteolytische Aktivität 24
- 6.1.7. Test auf Wascheignung 25
- 6.1.8. Test auf Thermostabilität 26
- 6.2. Ergebnisse 26
- 6.2.1. Klonierung der Subtilisin 309- und 147-Gene 26
- 6.2.2. Erzeugung von positionsspezifischen Mutationen des Subtilisin 309-Gens 30
- 6.2.3. Expression von mutanten Subtilisinen 32
- 6.2.4. Oxidationsstabilität von mutanten Subtilisinen 33
- 6.2.5. Proteolytische Aktivität von mutanten Subtil isinen 33
- 6.2.6. Waschvermögen von mutanten Subtilisinen 34
- 6.2.7. Thermostabilität von mutanten Subtilisinen 34
- 6.3. Diskussion 35
Claims (9)
1. Detergens-Zusammensetzung umfassend ein Oxidationsmittel und eine
Mutante eines Subtilisin-Enzyms mit einer Aminosäuresequenz, die
Zu mindestens 80 % mit der Aminosäuresequenz von Subtilisin 309,
wie in Tabelle I(a) dargestellt, homolog ist, und von B. lentus C360
(NCIB 10309) erhältlich ist, und wobei der Methioninrest in Position
222 durch Substitution mit einem anderen Aminosäurerest
ausgetauscht ist.
2. Detergens-Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei auch der
Aminosäurerest in Position 195 des mutanten Subtilisin-Enzytris durch
Substitution mit einem anderen Aminosäurerest ausgetauscht ist.
3. Detergens-Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der
Methioninrest an Position 222 durch Cystein oder Alanin substituiert ist.
4. Detergens-Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der Glycinrest
an Position 195 durch Glutaminsäure und der Methioninrest an
Position 222 durch Alanin oder Cystein substituiert ist.
5. Mutantes Subtilisin-Enzym umfassend eine Aminosäuresequenz, die
Zu mindestens 80 % mit der Aminosäuresequenz von Subtilisin 309,
wie in Tabelle I(a) dargestellt, homolog ist, und von B. lentus C360
(NCIB 10309) erhältlich ist, und wobei der Methioninrest in Position
222 durch Cystein oder Alanin substituiert ist.
6. Mutantes Subhhsin-Enzym umfassend eine Aminosäuresequenz, die
Zu mindestens 80 % mit der Aminosäuresequenz von Subtilisin 309,
wie in Tabelle I(a) dargestellt, homolog ist, und von B. lentus C360
(NCIB 10309) erhältlich ist, und wobei der Glycinrest in Position
195 durch Glutaminsäure und der Methioninrest in Position 222
durch Alanin oder Cystein substituiert ist.
7. Rekombinantes DNA-Molekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die
für ein Subtilisin-Enzym codiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt
mit mindestens 80 % Homologie mit der Aminosäuresequenz wie in
Tabelle I(a) dargestellt, in dem die Nukleinsäuresequenz derart
geändert worden ist, daß die codierte Aminosäuresequenz dadurch
einem mutanten Subtilisin-Enzym nach Anspruch 5 oder 6 entspricht.
8. Rekombinantes DNA-Molekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die
fur das Subtilisin 309-Enzym codiert, im wesentlichen wie in Tabelle
II dargestellt, in dem die Nukleinsäuresequenz derart geändert
worden ist, daß die codierte Aminosäuresequenz dadurch einem
mutanten Subtilisin 309-Enzym nach Anspruch 5 oder 6 entspricht.
9. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls nach Anspruch 7
oder 8 Zur Herstellung eines Subtilisin-Enzyms.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK006488A DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Enzymer |
PCT/DK1989/000002 WO1989006279A1 (en) | 1988-01-07 | 1989-01-06 | Mutated subtilisin genes |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE68926163D1 DE68926163D1 (de) | 1996-05-09 |
DE68926163T2 true DE68926163T2 (de) | 1996-10-02 |
Family
ID=8089323
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE68926163T Expired - Fee Related DE68926163T2 (de) | 1988-01-07 | 1989-01-06 | Mutierte subtilisingene |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US5741694A (de) |
EP (4) | EP1498481A1 (de) |
JP (3) | JPH0675504B2 (de) |
AT (1) | ATE136329T1 (de) |
DE (1) | DE68926163T2 (de) |
DK (3) | DK6488D0 (de) |
WO (1) | WO1989006279A1 (de) |
Families Citing this family (695)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5185258A (en) * | 1984-05-29 | 1993-02-09 | Genencor International, Inc. | Subtilisin mutants |
DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
US5324653A (en) * | 1988-02-11 | 1994-06-28 | Gist-Brocades N.V. | Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins |
CN1056187C (zh) * | 1988-02-11 | 2000-09-06 | 金克克国际有限公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
US6287841B1 (en) | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
EP0405901B1 (de) * | 1989-06-26 | 2004-09-01 | Unilever Plc | Enzymatische Waschmittelzusammensetzungen |
DK316989D0 (da) * | 1989-06-26 | 1989-06-26 | Novo Nordisk As | Enzymer |
US5665587A (en) | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
JPH04500384A (ja) * | 1989-06-26 | 1992-01-23 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 酵素洗剤組成物 |
US5658871A (en) * | 1989-07-07 | 1997-08-19 | Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. | Microbial lipase muteins and detergent compositions comprising same |
JP3220137B2 (ja) * | 1989-08-25 | 2001-10-22 | ヘンケル・リサーチ・コーポレイション | アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法 |
US5352603A (en) * | 1989-08-31 | 1994-10-04 | Kali-Chemie Ag | Highly alkaline proteases |
DE4023458A1 (de) * | 1989-08-31 | 1991-03-07 | Kali Chemie Ag | Neue hochalkalische proteasen |
US6271012B1 (en) * | 1989-10-11 | 2001-08-07 | Genencor International, Inc. | Protease muteins and their use in detergents |
US5541062A (en) * | 1990-02-23 | 1996-07-30 | Arch Development Corporation | Methods and compositions for preparing protein processing enzymes |
DK97190D0 (da) * | 1990-04-19 | 1990-04-19 | Novo Nordisk As | Oxidationsstabile detergentenzymer |
US5733473A (en) * | 1990-11-14 | 1998-03-31 | The Procter & Gamble Company | Liquid detergent composition containing lipase and protease |
DK271490D0 (da) * | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Novo Nordisk As | Detergentkomposition |
US6967080B1 (en) * | 1990-12-05 | 2005-11-22 | Novozymes A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
DE69130113T2 (de) * | 1990-12-05 | 1999-05-12 | Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd | Proteine mit geänderten epitopen und verfahren zur deren herstellung |
US5766898A (en) * | 1990-12-05 | 1998-06-16 | Novo Nordisk A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
GB9027836D0 (en) * | 1990-12-21 | 1991-02-13 | Unilever Plc | Enzymes and enzymatic detergent compositions |
US5482849A (en) * | 1990-12-21 | 1996-01-09 | Novo Nordisk A/S | Subtilisin mutants |
ES2110488T3 (es) * | 1990-12-21 | 1998-02-16 | Novo Nordisk As | Mutantes enzimaticos con un bajo grado de variacion de la carga molecular en un intervalo de ph. |
US5340735A (en) * | 1991-05-29 | 1994-08-23 | Cognis, Inc. | Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability |
US5646028A (en) * | 1991-06-18 | 1997-07-08 | The Clorox Company | Alkaline serine protease streptomyces griseus var. alkaliphus having enhanced stability against urea or guanidine |
EP0995801A1 (de) * | 1991-07-27 | 2000-04-26 | Genencor International GmbH | Verfahren zur Verbesserung des Stabilität von Enzymen und stabilisierte Enzyme |
US5275945A (en) * | 1991-10-08 | 1994-01-04 | Vista Chemical Company | Alkaline proteases stable in heavy-duty detergent liquids |
HUT66846A (en) * | 1991-10-16 | 1995-01-30 | Unilever Nv | Aqueous enzymatic detergent compositions |
US5371198A (en) * | 1991-12-16 | 1994-12-06 | Novo Nordisk A/S | Method for protection of proteolysis-susceptible protein during protein production in a fluid medium |
US5623059A (en) * | 1992-03-09 | 1997-04-22 | Novo Nordisk A/S | Method for protection of proteolysis-susceptible protein during protein production in a fluid medium |
DE69333463D1 (de) * | 1992-05-18 | 2004-05-06 | Genencor Int | Alkalische Proteasen produzierende Bakterien, und Verfahren zur Herstellung dieser alkalischen Proteasen |
PL178045B1 (pl) * | 1992-07-17 | 2000-02-29 | Genencor Int | Mutant proteazy do stosowania w detergentach, sekwencja DNA kodująca mutanta proteazy, sposób otrzymywania mutanta proteazy oraz kompozycja detergentowa |
JPH0763377B2 (ja) * | 1992-09-03 | 1995-07-12 | 大阪府 | 耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子、組換え体プラスミドpABT17、枯草菌プラスミドベクターpABTts14およびその枯草菌プラスミドベクターpABTts14の形質転換体 |
DE4231726A1 (de) * | 1992-09-23 | 1994-03-24 | Cognis Bio Umwelt | Mutierte subtilisinartige Serinproteasen |
GB9220669D0 (en) * | 1992-09-30 | 1992-11-11 | Unilever Plc | Detergent composition |
US6436690B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-20 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted |
US6440717B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-27 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
MA23346A1 (fr) | 1993-10-14 | 1995-04-01 | Genencor Int | Variantes de la subtilisine |
DE69432954T2 (de) * | 1993-10-14 | 2004-04-22 | The Procter & Gamble Company, Cincinnati | Proteasen enthaltende bleichmittelzusammensetzungen |
AU8079794A (en) * | 1993-10-14 | 1995-05-04 | Procter & Gamble Company, The | Protease-containing cleaning compositions |
US5837458A (en) * | 1994-02-17 | 1998-11-17 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
US6406855B1 (en) | 1994-02-17 | 2002-06-18 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US6335160B1 (en) | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US6599730B1 (en) * | 1994-05-02 | 2003-07-29 | Procter & Gamble Company | Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
AU703378B2 (en) * | 1994-06-23 | 1999-03-25 | Unilever Plc | Dishwashing compositions |
US6066611A (en) * | 1994-10-13 | 2000-05-23 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising protease enzymes |
US6455295B1 (en) | 1995-03-08 | 2002-09-24 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
US6475765B1 (en) | 1995-03-09 | 2002-11-05 | Procter & Gamble Company | Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
IL117350A0 (en) | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
US6682924B1 (en) * | 1995-05-05 | 2004-01-27 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
EP0824585B1 (de) * | 1995-05-05 | 2009-04-22 | Novozymes A/S | Protease-varianten und verbindungen |
US5837517A (en) | 1995-05-05 | 1998-11-17 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
US20120165241A1 (en) * | 1995-05-05 | 2012-06-28 | Unilever Plc | Subtilase Variants |
US6936289B2 (en) | 1995-06-07 | 2005-08-30 | Danisco A/S | Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products |
CA2270180C (en) * | 1996-11-04 | 2011-01-11 | Novo Nordisk A/S | Subtilase variants and compositions |
CN1554750B (zh) | 1996-11-04 | 2011-05-18 | 诺维信公司 | 枯草酶变种及组合物 |
US6077662A (en) * | 1996-11-27 | 2000-06-20 | Emory University | Virus-like particles, methods and immunogenic compositions |
EP0977869B2 (de) * | 1997-04-09 | 2008-11-12 | Danisco A/S | Lipase und verwendung davon zur verbesserung von teigen und backwaren |
US6140475A (en) | 1997-04-11 | 2000-10-31 | Altus Biologics Inc. | Controlled dissolution crosslinked protein crystals |
AU8798198A (en) * | 1997-08-29 | 1999-03-22 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
EP1012251A1 (de) | 1997-08-29 | 2000-06-28 | Novo Nordisk A/S | Varianten der protease und zusammensetzungen |
EP0913458B1 (de) * | 1997-10-22 | 2004-06-16 | The Procter & Gamble Company | Flüssige Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen |
ES2368718T3 (es) * | 1997-10-23 | 2011-11-21 | Danisco Us Inc. | Variantes de subtilisina con múltiples sustituciones. |
MA25044A1 (fr) * | 1997-10-23 | 2000-10-01 | Procter & Gamble | Compositions de lavage contenant des variants de proteases multisubstituees. |
US6780629B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-24 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
US6773907B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-10 | Peter Kamp Hansen | Subtilase enzymes |
EP1032655B1 (de) | 1997-11-21 | 2005-06-29 | Novozymes A/S | Protease-varianten und zusammensetzungen |
US6642011B2 (en) | 1998-04-15 | 2003-11-04 | Genencor International, Inc. | Human protease and use of such protease for pharmaceutical applications and for reducing the allergenicity of non-human proteins |
US6835550B1 (en) | 1998-04-15 | 2004-12-28 | Genencor International, Inc. | Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins |
US6936249B1 (en) | 1998-04-15 | 2005-08-30 | Genencor International, Inc. | Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
WO2000005396A1 (en) | 1998-07-21 | 2000-02-03 | Danisco A/S | Foodstuff |
US6461849B1 (en) * | 1998-10-13 | 2002-10-08 | Novozymes, A/S | Modified polypeptide |
US6376450B1 (en) | 1998-10-23 | 2002-04-23 | Chanchal Kumar Ghosh | Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants |
US6831053B1 (en) | 1998-10-23 | 2004-12-14 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising multiply-substituted protease variants |
DE69941364D1 (de) | 1998-11-27 | 2009-10-15 | Novozymes As | Varianten eines lipolytischen enzyms |
NZ512088A (en) | 1998-12-08 | 2004-01-30 | Children S Hospital And Region | Polymorphic loci that differentiate escherichia coli 0157:H7 from other strains |
EP1803817B1 (de) | 1998-12-18 | 2011-04-06 | Novozymes A/S | Subtilase Enzyme der I-S1- und I-S2-Untergruppen mit einem zusätzlichen Aminosäurerest in einer aktiven Schleifenregion |
CN100523181C (zh) | 1999-03-31 | 2009-08-05 | 诺维信公司 | 具有碱性α-淀粉酶活性的多肽及其编码核酸 |
EP2889375B1 (de) | 1999-03-31 | 2019-03-20 | Novozymes A/S | Polypeptide mit alkalischer Alpha-Amylase-Aktivität und Nukleinsäuren zur Codierung davon |
KR20000065867A (ko) | 1999-04-09 | 2000-11-15 | 손경식 | 세탁세제용 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이, 이를 코딩하는 유전자, 재조합 발현벡터 및 형질전환된 균주 |
ATE408676T1 (de) | 1999-05-20 | 2008-10-15 | Novozymes As | Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 132 und 133 |
AU4392900A (en) | 1999-05-20 | 2000-12-12 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additionalamino acid residue between positions 127 and 128 |
EP1183340B1 (de) | 1999-05-20 | 2008-09-03 | Novozymes A/S | Subtilase-enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit wenigstens einem zusätzlichen aminosäurerest zwischen positionen 126 und 127 |
ATE408680T1 (de) | 1999-05-20 | 2008-10-15 | Novozymes As | Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 128 und 129 |
AU4393100A (en) | 1999-05-20 | 2000-12-12 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additionalamino acid residue between positions 125 and 126 |
WO2000071687A1 (en) | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 129 and 130 |
MXPA02000840A (es) * | 1999-07-22 | 2002-07-30 | Procter & Gamble | Variantes de proteasa de subtilisina que tienen substituciones de aminoacidos en regiones de epitopes definidas. |
WO2001016285A2 (en) | 1999-08-31 | 2001-03-08 | Novozymes A/S | Novel proteases and variants thereof |
US6727085B2 (en) | 1999-12-15 | 2004-04-27 | Fanoe Tina Sejersgaard | Subtilase variants having an improved wash performance on egg stains |
US6777218B1 (en) | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
WO2001075087A2 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Maxygen, Inc. | Subtilisin variants |
AU2001254623A1 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-12 | Novozymes A/S | Production and use of protein variants having modified immunogenicity |
EP1313846B1 (de) | 2000-08-21 | 2013-10-16 | Novozymes A/S | Subtilase enzyme |
US6541234B1 (en) * | 2000-09-11 | 2003-04-01 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Calcium free subtilisin mutants |
US6541235B1 (en) * | 2000-09-29 | 2003-04-01 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Calcium free subtilisin mutants |
EP1975229A3 (de) | 2000-10-13 | 2009-03-18 | Novozymes A/S | Alpha-amylase-variante mit veränderten Eigenschaften |
US6893855B2 (en) * | 2000-10-13 | 2005-05-17 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
WO2002031133A1 (en) | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
US6673580B2 (en) | 2000-10-27 | 2004-01-06 | Genentech, Inc. | Identification and modification of immunodominant epitopes in polypeptides |
AU758744B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-03-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a bacillus strain |
ES2305023T3 (es) * | 2000-10-31 | 2008-11-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Metodos para el analisis de componentes no proteinaceos usando una proteasa de una cepa de bacilo. |
EP1201752A1 (de) * | 2000-10-31 | 2002-05-02 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Analyse von nicht-proteischen Bestandteilen mittels einer Protease aus einem Bacillus-Stamm |
US7303907B2 (en) | 2001-01-08 | 2007-12-04 | Health Protection Agency | Degradation and detection of TSE infectivity |
EP1373296B1 (de) | 2001-03-23 | 2011-10-05 | Genencor International, Inc. | Proteine, die veränderte immunogene reaktionen bewirken, und verfahren zu deren herstellung und anwendung |
DE10121463A1 (de) * | 2001-05-02 | 2003-02-27 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten |
US7498158B2 (en) | 2001-05-15 | 2009-03-03 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variant with altered properties |
JP4309137B2 (ja) | 2001-05-18 | 2009-08-05 | ダニスコ エイ/エス | 酵素を使用した練り粉の調製方法 |
EP1421224B1 (de) | 2001-06-26 | 2012-10-17 | Novozymes A/S | Polypeptide mit cellobiohydrolase-i-aktivität und dafür codierende polynucleotide |
DK200101090A (da) | 2001-07-12 | 2001-08-16 | Novozymes As | Subtilase variants |
CA2472206C (en) | 2001-12-31 | 2013-04-09 | Genencor International, Inc. | Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
JP4703113B2 (ja) * | 2002-01-16 | 2011-06-15 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | 複数置換プロテアーゼ変異体 |
AU2003210551A1 (en) * | 2002-01-16 | 2003-09-02 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants |
DE60317478T2 (de) | 2002-02-26 | 2008-09-04 | Genencor International, Inc., Palo Alto | Beurteilungen und mittel auf populationsbasis zur bestimmung der rangfolge der relativen immunogenität von proteinen |
EP1490485B1 (de) | 2002-03-27 | 2015-03-04 | Novozymes A/S | Granulate mit filamentösen schichten |
US8124399B2 (en) | 2002-03-29 | 2012-02-28 | Danisco Us Inc. | Enhanced protein expression in Bacillus |
WO2004003187A2 (en) | 2002-07-01 | 2004-01-08 | Novozymes A/S | Mpg added to fermentation |
KR101211445B1 (ko) | 2002-07-30 | 2012-12-12 | 다니스코 유에스 인크. | 에어로졸 발생을 감소시킨 제형물 |
ATE494368T1 (de) | 2002-10-01 | 2011-01-15 | Novozymes As | Polypeptide der gh-61-familie |
SG166001A1 (en) * | 2002-10-02 | 2010-11-29 | Catalyst Biosciences Inc | Methods of generating and screening for proteases with altered specificity |
TWI319007B (en) | 2002-11-06 | 2010-01-01 | Novozymes As | Subtilase variants |
US7888093B2 (en) * | 2002-11-06 | 2011-02-15 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
JP4851093B2 (ja) | 2002-12-11 | 2012-01-11 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 洗剤組成物 |
ATE438711T1 (de) | 2002-12-20 | 2009-08-15 | Novozymes As | Polypeptide mit cellobiohydrolase ii-aktivität und dafür kodierende polynucleotide |
US7955814B2 (en) | 2003-01-17 | 2011-06-07 | Danisco A/S | Method |
DE602004030000D1 (de) | 2003-01-17 | 2010-12-23 | Danisco | Verfahren zur in-situ-herstellung eines emulgators in einem nahrungsmittel |
US20050196766A1 (en) | 2003-12-24 | 2005-09-08 | Soe Jorn B. | Proteins |
ATE461276T1 (de) | 2003-01-27 | 2010-04-15 | Novozymes As | Enzymstabilisierung |
US7294499B2 (en) * | 2003-01-30 | 2007-11-13 | Novozymes A/S | Subtilases |
JP2006517989A (ja) | 2003-02-18 | 2006-08-03 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 洗剤組成物 |
WO2004099228A2 (en) | 2003-05-02 | 2004-11-18 | Novozymes Inc. | Variants of beta-glucosidases |
ATE407202T1 (de) | 2003-05-07 | 2008-09-15 | Novozymes As | Enzymvarianten von subtilisin (subtilasen) |
EP1675941B1 (de) | 2003-06-25 | 2013-05-22 | Novozymes A/S | Polypeptide mit alpha-amylase-aktivität und für diese codierende polynukleotide |
DK2617825T3 (en) | 2003-08-25 | 2015-06-01 | Novozymes Inc | Variants of glycoside hydrolase |
EP1678296B1 (de) | 2003-10-23 | 2011-07-13 | Novozymes A/S | Protease mit verbesserter stabilität in detergentien |
US7244605B2 (en) | 2003-10-28 | 2007-07-17 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same |
EP1682655B1 (de) | 2003-10-30 | 2009-09-02 | Novozymes A/S | Kohlenhydratbindende module |
US7906307B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-03-15 | Danisco A/S | Variant lipid acyltransferases and methods of making |
GB0716126D0 (en) | 2007-08-17 | 2007-09-26 | Danisco | Process |
WO2008090395A1 (en) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Danisco A/S | Production of a lipid acyltransferase from transformed bacillus licheniformis cells |
US7718408B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-05-18 | Danisco A/S | Method |
WO2005066339A2 (en) | 2004-01-06 | 2005-07-21 | Novozymes A/S | Polypeptides of alicyclobacillus sp. |
ES2469840T3 (es) | 2004-01-30 | 2014-06-20 | Novozymes Inc. | Polip�ptidos con actividad de mejora celulol�tica y polinucle�tidos que los codifican |
EP2325318A1 (de) | 2004-02-13 | 2011-05-25 | Novozymes A/S | Proteasevarianten |
GB0405637D0 (en) * | 2004-03-12 | 2004-04-21 | Danisco | Protein |
DE602005025202D1 (de) * | 2004-04-02 | 2011-01-20 | Novozymes As | Subtilasevarianten mit veränderter immunogenität |
EP1735339A2 (de) * | 2004-04-09 | 2006-12-27 | Genencor International, Inc. | Pcka modifikationen und erhöhte proteinexpression in bacillus |
US7148404B2 (en) | 2004-05-04 | 2006-12-12 | Novozymes A/S | Antimicrobial polypeptides |
EP1766021B1 (de) * | 2004-05-20 | 2012-05-09 | AES Chemunex S.A. | Polynukleotide zum nachweis von escherichia coli o157:h7- und escherichia coli o157:nm-verotoxinproduzenten |
US20090060933A1 (en) * | 2004-06-14 | 2009-03-05 | Estell David A | Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
CN101010429B (zh) | 2004-07-05 | 2013-05-08 | 诺维信公司 | 具有改变特性的α-淀粉酶变异体 |
AU2005263954B2 (en) * | 2004-07-16 | 2011-04-07 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Enzymatic oil-degumming method |
WO2006031554A2 (en) | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Novozymes North America, Inc. | Methods for preventing, removing, reducing, or disrupting biofilm |
US7811979B2 (en) | 2004-09-21 | 2010-10-12 | Novozymes A/S | Subtilases |
EP1794296B1 (de) | 2004-09-21 | 2012-04-18 | Novozymes A/S | Subtilasen |
US7741095B2 (en) | 2004-09-21 | 2010-06-22 | Novozymes A/S | Subtilases |
EP1799819B1 (de) | 2004-09-30 | 2011-03-23 | Novozymes Inc. | Polypeptide mit lipase-aktivität und diese kodierende polynukleotide |
CN101253263B (zh) | 2005-04-27 | 2014-07-02 | 诺维信股份有限公司 | 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 |
EP2385112B1 (de) | 2005-07-08 | 2016-11-30 | Novozymes A/S | Subtilasevarianten |
US8119387B2 (en) | 2005-08-16 | 2012-02-21 | Novozymes A/S | Polypeptides of strain Bacillus sp. P203 |
CN101243182B (zh) | 2005-08-16 | 2014-08-06 | 诺维信公司 | 枯草蛋白酶 |
EP2385110A3 (de) | 2005-09-30 | 2011-11-16 | Novozymes, Inc. | Verfahren zur Verstärkung des Verfalls oder der Umwandlung von Cellulose-Material |
WO2007036235A1 (en) | 2005-09-30 | 2007-04-05 | Novozymes A/S | Immobilization of enzymes |
US7883711B2 (en) | 2006-03-22 | 2011-02-08 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having antimicrobial activity |
WO2007113241A1 (en) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Novozymes A/S | A stabilized liquid enzyme composition |
BRPI0709978A2 (pt) | 2006-04-14 | 2011-08-02 | Genencor Int | tratamento em etapa única de produtos têxteis |
EP2013339B1 (de) | 2006-04-20 | 2013-09-11 | Novozymes A/S | Savinase-varianten mit verbesserter waschleistung gegen eiflecken |
US20090286302A1 (en) | 2006-06-21 | 2009-11-19 | Novosymes A/S | Desizing and Scouring Process |
BRPI0714870A2 (pt) | 2006-07-21 | 2013-05-28 | Novozymes Inc | mÉtodo para produzir um polipeptÍdeo secretado tendo atividade biolàgica, proteÍna de fusço isolada, polinucleotÍdeo isolado, construÇço de proteÍna de fusço, vetor de expressço, cÉlula hospedeira féngica, mÉtodos para degradar ou conventer um material celulàsico e para produzir uma substÂncia |
US8383097B2 (en) | 2006-08-11 | 2013-02-26 | Novozymes Biologicals, Inc | Bacteria cultures and compositions comprising bacteria cultures |
US20080057528A1 (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Detection of hydrogen peroxide released by enzyme-catalyzed oxidation of an analyte |
CN101522878B (zh) | 2006-10-06 | 2012-11-14 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物及其中酶组合的使用 |
US20080090745A1 (en) * | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Fox Bryan P | Expression of Streptomyces subtilism inhibitor (SSI) proteins in Bacillus and Streptomyces sp. |
US8034766B2 (en) * | 2006-10-27 | 2011-10-11 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compositions and methods for prion decontamination |
EP2097519A2 (de) | 2006-12-21 | 2009-09-09 | Danisco US, INC., Genencor Division | Zusammensetzungen und verwendung eines aplpha-amylase-polypeptids der bazillus-spezies 195 |
CN101617035A (zh) | 2007-02-20 | 2009-12-30 | 诺维信公司 | 用于洗衣的酶泡沫处理 |
BRPI0808513A2 (pt) | 2007-03-09 | 2014-08-19 | Danisco Us Inc Genencor Div | Variantes de alfa-amilase de espécies de bacillus alcalifílico, composições compreendendo variantes de alfa-amilase e métodos de uso |
US8779112B2 (en) | 2007-03-12 | 2014-07-15 | Danisco Us Inc. | Modified protease propeptides |
WO2008118749A2 (en) | 2007-03-23 | 2008-10-02 | Novozymes Biologicals, Inc. | Preventing and reducing biofilm formation and planktonic proliferation |
DE102007016139A1 (de) | 2007-03-30 | 2008-10-02 | Jenabios Gmbh | Verfahren zur regioselektiven Oxygenierung von N-Heterozyklen |
US20100190682A1 (en) | 2007-04-30 | 2010-07-29 | Sang-Kyu Lee | Use of protein hydrolysates to stabilize metalloprotease detergent formulations |
WO2008141281A1 (en) | 2007-05-10 | 2008-11-20 | Danisco Us Inc., Genencor Division | A modified secretion system to increase expression of polypeptides in bacteria |
SG148934A1 (en) | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Novozymes As | A process for combined biopolishing and bleach clean-up |
DE102007047433A1 (de) | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Lanxess Deutschland Gmbh | Flüssigwasch- und Flüssigreinigungsmittel |
MX2010004676A (es) | 2007-11-05 | 2010-05-20 | Danisco Us Inc | Variantes de alfa-amilasa con propiedades alteradas. |
EP2215202B2 (de) | 2007-11-05 | 2024-01-10 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase-varianten des bacillus sp. ts-23 mit veränderten eigenschaften |
JP5629584B2 (ja) | 2007-12-21 | 2014-11-19 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス内での促進されたタンパク質生成 |
EP2245060B1 (de) | 2008-02-01 | 2017-11-01 | Novozymes A/S | Flüssige enzymzusammensetzung |
WO2009098229A2 (en) | 2008-02-04 | 2009-08-13 | Danisco Us Inc., Genencor Division | A method of preparing food products using ts23 alpha-amylase |
WO2009111258A2 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-11 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition comprising lipase |
WO2009107091A2 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-03 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition comprising lipase |
CN107090014B (zh) | 2008-03-26 | 2023-04-25 | 诺维信公司 | 稳定化的液体酶组合物 |
KR101683302B1 (ko) | 2008-03-28 | 2016-12-06 | 다니스코 유에스 인크. | 박테리아 세포 내 로커스 증폭 방법 |
JP5702714B2 (ja) | 2008-04-30 | 2015-04-15 | ダニスコ・ユーエス・インク | 新規キメラアルファアミラーゼ変異体 |
WO2009140481A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-19 | Novozymes A/S | Liquid detergent compositions |
US9040278B2 (en) | 2008-06-06 | 2015-05-26 | Danisco Us Inc. | Production of glucose from starch using alpha-amylases from Bacillus subtilis |
JP5599113B2 (ja) | 2008-06-06 | 2014-10-01 | ダニスコ・ユーエス・インク | 糖化酵素組成物及びその糖化方法 |
ES2538406T3 (es) | 2008-06-06 | 2015-06-19 | Danisco Us Inc. | Alfa-amilasas variantes de Bacillus subtilis y sus métodos de uso |
CA2726265A1 (en) | 2008-06-06 | 2009-12-10 | Danisco Us Inc. | Geobacillus stearothermophilus alpha-amylase (amys) variants with improved properties |
BRPI0915728A2 (pt) | 2008-07-07 | 2015-10-27 | Basf Se | composição enzimática, processo para preparar a composição, uso da composição enzimática, e, composição detergente. |
EP2149786A1 (de) | 2008-08-01 | 2010-02-03 | Unilever PLC | Verbesserungen bei der Analyse von Reinigungsmitteln |
WO2010028941A1 (en) | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Unilever Plc | Dispenser and pretreater for viscous liquids |
JP5419303B2 (ja) | 2008-09-25 | 2014-02-19 | ダニスコ・ユーエス・インク | アルファアミラーゼ混合物及びその混合物を使用する方法 |
ES2667812T3 (es) | 2008-11-20 | 2018-05-14 | Novozymes Inc. | Polipéptidos que tienen actividad potenciadora amilolítica y polinucleótidos que codifican los mismos |
BRPI0922773B1 (pt) | 2008-12-04 | 2018-10-09 | Novozymes As | célula microbiana hospedeira transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica e para degradar ou converter um material celulósico, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, e, composição detergente. |
EP2376527A1 (de) | 2008-12-12 | 2011-10-19 | Novozymes Inc. | Polypeptide mit lipaseaktivität und für diese codierende polynukleotide |
EP2202290A1 (de) | 2008-12-23 | 2010-06-30 | Unilever PLC | Fließfähige Waschmittelzusammensetzung und Verpackung dafür |
EP2213723A1 (de) | 2009-01-30 | 2010-08-04 | Novozymes A/S | Isomaltose zur Pilzfermentation |
WO2010097436A1 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Novozymes A/S | Mutant cells having reduced expression of metallopeptidase, suitable for recombinant polypeptide production |
EP2406373B1 (de) | 2009-03-10 | 2014-05-28 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase aus bacillus megaterium dsm90, verwandte amylasen und deren verwendung |
CA2757343A1 (en) | 2009-04-01 | 2010-10-07 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods comprising alpha-amylase variants with altered properties |
WO2010117511A1 (en) | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Danisco Us Inc. | Halomonas strain wdg195-related alpha-amylases, and methods of use, thereof |
AR076941A1 (es) | 2009-06-11 | 2011-07-20 | Danisco Us Inc | Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina |
EP3269804B1 (de) | 2009-09-17 | 2020-11-11 | Novozymes, Inc. | Polypeptide mit verstarkter zelluloseabbauender wirkung und dafur kodierende polynukleotide |
BR112012006487A8 (pt) | 2009-09-25 | 2018-04-24 | Novozymes As | variante de uma subtilisina precursora, polinucleotídeo isolado, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição de limpeza ou detergente, e, método para produzir uma variante |
BR112012006497A2 (pt) | 2009-09-25 | 2015-09-08 | Novozymes As | uso de uma variante de subtilisina, composição de lavagem de pratos, e, uso de uma composição. |
BR112012006982B1 (pt) | 2009-09-29 | 2021-12-21 | Novozymes, Inc. | Célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, construções de ácido nucleico, vetor de expressão, polipeptídeo isolado tendo atividade intensificadora celulolítica, polinucleotídeo isolado que codifica o mesmo, e, composição detergente |
US8586829B2 (en) | 2009-09-30 | 2013-11-19 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
US8586827B2 (en) | 2009-09-30 | 2013-11-19 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
CA2778471A1 (en) | 2009-10-23 | 2011-04-28 | Danisco Us Inc. | Methods for reducing blue saccharide |
EP2501792A2 (de) | 2009-12-29 | 2012-09-26 | Novozymes A/S | Gh61-polypeptide mit waschmittelverstärkendem effekt |
AU2011208429B2 (en) | 2010-01-22 | 2014-05-22 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Methods for producing amino-substituted glycolipid compounds |
CA2788548A1 (en) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | Novozymes A/S | Biogas production process with enzymatic pre-treatment |
US8859259B2 (en) | 2010-02-14 | 2014-10-14 | Ls9, Inc. | Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols |
US8815559B2 (en) | 2010-02-18 | 2014-08-26 | Danisco Us Inc. | Amylase from nesterenkonia and methods of use, thereof |
WO2011104339A1 (en) | 2010-02-25 | 2011-09-01 | Novozymes A/S | Variants of a lysozyme and polynucleotides encoding same |
CN102906251B (zh) | 2010-04-26 | 2016-11-16 | 诺维信公司 | 酶颗粒剂 |
BR112012028033B1 (pt) | 2010-06-22 | 2021-04-27 | Novozymes A/S | Método para desprender pelos em couro cru ou peles, processos para depilação de couro cru ou peles, e, para preparar um azul molhado |
WO2012022777A1 (en) | 2010-08-19 | 2012-02-23 | Novozymes A/S | Induced sporulation screening method |
RU2013114300A (ru) | 2010-08-30 | 2014-10-10 | Новозимс А/С | Стирка с концентрированным замачиванием |
US20130118532A1 (en) | 2010-08-30 | 2013-05-16 | Novozymes A/S | Two-Soak Wash |
WO2012035103A1 (en) | 2010-09-16 | 2012-03-22 | Novozymes A/S | Lysozymes |
GB201015672D0 (en) | 2010-09-20 | 2010-10-27 | Unilever Plc | Improvements relating to fabric treatment compositions comprising targeted benefit agents |
DK2622070T3 (en) | 2010-09-30 | 2016-11-21 | Novozymes Inc | Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM |
BR112013007693B1 (pt) | 2010-09-30 | 2021-12-07 | Novozymes, Inc | Variante, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira microbiana recombinante, métodos para produzir uma variante, para produzir uma variante tendo atividade intensificadora celulolítica, para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, e, composição enzimática, formulação do caldo completo ou composição de cultura de células |
BR112013010129A2 (pt) | 2010-11-18 | 2016-07-05 | Novozymes Inc | polipeptídeo gh61 quimérico isolado, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira, métodos para produzir um polipeptídeo gh61 quimérico, para degradas ou converter um material celulóstico, para sintetizar um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico e para limpar ou lavar uma superfície dura ou roupa para lavar, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, uso do polipeptídeo gh61 quimérico, composição detergente, e, formulação de caldo ou composição de cultura de células completas |
CN103339260A (zh) | 2011-01-04 | 2013-10-02 | 诺维信公司 | 从含果胶和木素纤维素的材料产生生物气的方法 |
WO2012101149A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Novozymes A/S | Storage-stable enzyme granules |
ES2656049T3 (es) | 2011-01-31 | 2018-02-22 | Novozymes A/S | Uso de glucosa tostada para la producción fermentativa de taxtomina |
EP3431581B1 (de) | 2011-02-15 | 2022-04-06 | Novozymes Biologicals, Inc. | Geruchsminderung bei reinigungsmaschinen und reinigungsverfahren |
WO2012110563A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-23 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising metalloproteases |
WO2012110564A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-23 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising m7 or m35 metalloproteases |
JP2014508830A (ja) | 2011-02-16 | 2014-04-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 金属プロテアーゼを含む洗剤組成物 |
GB201102865D0 (en) | 2011-02-18 | 2011-04-06 | Danisco | Feed additive composition |
GB201102857D0 (en) | 2011-02-18 | 2011-04-06 | Danisco | Feed additive composition |
BR112013016830A2 (pt) | 2011-02-23 | 2017-03-01 | Novozymes Inc | polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, método de produzir o polipeptídeo, de produzir um mutante de uma célula parental, de inibir a expressão de um polipeptídeo, de produzir uma proteína, de degradar ou converter um material celulósico, de produzir um produto de fermentação e de fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo, molécula de rna de fita dupla, composição, e, formulação de caldo completo ou composição de cultura de células |
US9410136B2 (en) | 2011-03-31 | 2016-08-09 | Novozymes, Inc. | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
US20140031272A1 (en) | 2011-04-08 | 2014-01-30 | Danisco Us Inc. | Compositions |
DE102011007313A1 (de) | 2011-04-13 | 2012-10-18 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Expressionsverfahren |
DK2702162T3 (da) | 2011-04-29 | 2020-05-18 | Novozymes Inc | Fremgangsmåder til forbedring af nedbrydningen eller omdannelsen af celluloseholdigt materiale |
MX351761B (es) | 2011-06-20 | 2017-10-26 | Novozymes As | Composicion particulada. |
EP2537918A1 (de) | 2011-06-20 | 2012-12-26 | The Procter & Gamble Company | Verbraucherprodukte mit lipasenhaltigen beschichteten Partikeln |
JP6126086B2 (ja) | 2011-06-24 | 2017-05-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド |
US20140106427A1 (en) | 2011-06-28 | 2014-04-17 | Novozymes A/S | Biogas From Enzyme-Treated Bagasse |
CN112662734A (zh) | 2011-06-30 | 2021-04-16 | 诺维信公司 | 用于筛选α-淀粉酶的方法 |
MX353621B (es) | 2011-06-30 | 2018-01-22 | Novozymes As | Variantes de alfa-amilasa. |
EP2726592B1 (de) | 2011-07-01 | 2015-04-01 | Novozymes A/S | Stabilisierte subtilisinzusammensetzung |
BR112013033816A2 (pt) | 2011-07-01 | 2017-02-14 | Novozymes A / S | composição de detergente líquido sem boro |
US10711262B2 (en) | 2011-07-12 | 2020-07-14 | Novozymes A/S | Storage-stable enzyme granules |
CN109022518A (zh) | 2011-07-22 | 2018-12-18 | 诺维信北美公司 | 用于预处理纤维素材料和改进其水解的方法 |
MX2014001594A (es) | 2011-08-15 | 2014-04-25 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad de celulasa y polinucleotidos que los codifican. |
WO2013041689A1 (en) | 2011-09-22 | 2013-03-28 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
TR201909896T4 (tr) | 2011-09-23 | 2019-07-22 | Novozymes As | Tekstilde renk değiştirme. |
CA2850079A1 (en) | 2011-10-28 | 2013-05-02 | Danisco Us Inc. | Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants |
WO2013119302A2 (en) | 2011-11-21 | 2013-08-15 | Novozymes, Inc. | Gh61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same |
BR112014012170A2 (pt) | 2011-11-25 | 2020-06-23 | Novozymes A/S | polipetídeo isolado, composição, aditivo de ração animal, uso de um polipetídeo, métodos de isolamento de dna de bastérias, e de produção de um poliptídeo, polinucleotídeo isolado, constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, e, planta, parte de planta ou célula de planta |
JP2015500006A (ja) | 2011-11-25 | 2015-01-05 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | サブチラーゼ変異体およびこれをコードするポリヌクレオチド |
WO2013083801A2 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Novozymes A/S | Biogas from substrates comprising animal manure and enzymes |
EP3272862A1 (de) | 2011-12-16 | 2018-01-24 | Novozymes, Inc. | Polypeptide mit laccaseaktivität und dafür kodierende polynukleotide |
EP3172966A1 (de) | 2011-12-19 | 2017-05-31 | Novozymes Bioag A/S | Biopestizid verfahren und zusammensetzungen |
EP2607468A1 (de) | 2011-12-20 | 2013-06-26 | Henkel AG & Co. KGaA | Reinigungsmittelzusammensetzungen mit Subtilasevarianten |
CN107267489A (zh) | 2011-12-20 | 2017-10-20 | 诺维信公司 | 枯草杆菌酶变体和编码它们的多核苷酸 |
BR112014015421A2 (pt) | 2011-12-22 | 2019-09-24 | Danisco Us Inc | alfa-amilases variantes e métodos de uso das mesmas |
EP2794866A1 (de) | 2011-12-22 | 2014-10-29 | Danisco US Inc. | Zusammensetzungen und verfahren mit einer variante eines lipolytischen enzyms |
US9809787B2 (en) | 2011-12-29 | 2017-11-07 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising lipase |
ES2644007T3 (es) | 2012-01-26 | 2017-11-27 | Novozymes A/S | Uso de polipéptidos con actividad de proteasa en piensos para animales y en detergentes |
EP2628785B1 (de) | 2012-02-17 | 2016-05-18 | Henkel AG & Co. KGaA | Reinigungsmittelzusammensetzungen mit Subtilasevarianten |
JP2015509364A (ja) | 2012-02-17 | 2015-03-30 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | サブチリシン変異体およびそれをコードするポリヌクレオチド |
US20150064773A1 (en) | 2012-03-07 | 2015-03-05 | Novozymes A/S | Detergent Composition and Substitution of Optical Brighteners in Detergent Composition |
US10087401B2 (en) | 2012-03-16 | 2018-10-02 | Monosol, Llc | Water soluble compositions incorporating enzymes, and method of making same |
EP2831215B1 (de) | 2012-03-29 | 2018-08-08 | Novozymes A/S | Verwendung von enzymen zur herstellung von wasserlöslichen folien |
US9394092B2 (en) | 2012-04-16 | 2016-07-19 | Monosol, Llc | Powdered pouch and method of making same |
DK3279320T3 (da) | 2012-04-27 | 2020-03-16 | Novozymes Inc | GH61-polypeptidvarianter og polynukleotider, som koder for dem |
CN117904080A (zh) | 2012-05-07 | 2024-04-19 | 诺维信公司 | 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码其的核苷酸 |
CA2870830A1 (en) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Danisco Us Inc. | Use of alpha-amylase from aspergillus clavatus for saccharification |
EP2875111A1 (de) | 2012-05-16 | 2015-05-27 | Novozymes A/S | Zusammensetzungen mit lipase und verwendungsverfahren dafür |
EP4026902A1 (de) | 2012-06-08 | 2022-07-13 | Danisco US Inc. | Variante alpha-amylasen mit erhöhter wirkung auf stärkepolymere |
EP2861749A1 (de) | 2012-06-19 | 2015-04-22 | Novozymes Bioag A/S | Enzymatische reduktion von hydroperoxiden |
EP2863759A2 (de) | 2012-06-20 | 2015-04-29 | Novozymes Biopolymer A/S | Verwendung von polypeptiden mit proteasewirkung in tierfutter und reinigungsmitteln |
KR101380740B1 (ko) | 2012-06-29 | 2014-04-11 | 쉐어 휴먼 제네텍 세러피스, 인코포레이티드 | 이듀로네이트-2-설파타제의 정제 |
US9150841B2 (en) | 2012-06-29 | 2015-10-06 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase |
PL3553172T3 (pl) | 2012-08-16 | 2023-03-27 | Novozymes A/S | Sposób obróbki wyrobu włókienniczego z użyciem endoglukanazy |
CA2878988A1 (en) | 2012-08-16 | 2014-02-20 | Danisco Us Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and pullulanase for saccharification |
BR112015003726A2 (pt) | 2012-08-22 | 2019-09-24 | Novozymes As | composição detergente, uso de uma composição e de um polipeptídeo, e, método para remoção de uma nódoa de uma superfície. |
EP2888360B1 (de) | 2012-08-22 | 2017-10-25 | Novozymes A/S | Metalloproteasen aus alicyclobacillus sp. |
BR112015003724A2 (pt) | 2012-08-22 | 2017-08-08 | Novozymes As | polipeptídeo isolado, composição, uso de uma composição, polinucleotídeo isolado, constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, e, métodos de produção de um polipeptídeo e de produção de uma proteína. |
DK2914611T3 (en) | 2012-11-01 | 2018-12-10 | Novozymes As | Method of DNA Removal |
US20180112203A1 (en) | 2012-11-20 | 2018-04-26 | Danisco Us Inc. | Amylase with maltogenic properties |
CA2893454C (en) | 2012-12-07 | 2022-04-19 | Novozymes A/S | Washing method for textiles |
WO2014092960A1 (en) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | Danisco Us Inc. | Trichoderma reesei host cells expressing a glucoamylase from aspergillus fumigatus and methods of use thereof |
WO2014090940A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Novozymes A/S | Removal of skin-derived body soils |
EP2931911A1 (de) | 2012-12-14 | 2015-10-21 | Danisco US Inc. | Verfahren zur verwendung von alpha-amylase aus aspergillus fumigatus und isoamylase zur verzuckerung |
EP2904105A1 (de) | 2012-12-20 | 2015-08-12 | Danisco US Inc. | Verfahren zur verwendung von alpha-amylase aus aspergillus terreus und pullulanase für eine verzuckerung |
CN104884614A (zh) | 2012-12-21 | 2015-09-02 | 丹尼斯科美国公司 | α-淀粉酶变体 |
WO2014099525A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Danisco Us Inc. | Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof |
US9551042B2 (en) | 2012-12-21 | 2017-01-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
CN104903443A (zh) | 2013-01-03 | 2015-09-09 | 诺维信公司 | α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
ES2882517T3 (es) | 2013-03-11 | 2021-12-02 | Danisco Us Inc | Variantes combinatorias de alfa-amilasa |
EP2970830B1 (de) | 2013-03-14 | 2017-12-13 | Novozymes A/S | Protease und hemmer enthaltend in wasserlöslichen filmen |
EP3569611A1 (de) | 2013-04-23 | 2019-11-20 | Novozymes A/S | Flüssige reinigungszusammensetzungen für automatische geschirrspüler |
EP3461881A1 (de) | 2013-05-03 | 2019-04-03 | Novozymes A/S | Mikroverkapselung von wasch- und reinigungsmittelenzymen |
RU2020101263A (ru) | 2013-05-14 | 2020-02-17 | Новозимс А/С | Моющие композиции |
WO2014183921A1 (en) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha amylase activity |
WO2014191170A1 (en) | 2013-05-30 | 2014-12-04 | Novozymes A/S | Particulate enzyme composition |
US10538751B2 (en) | 2013-06-06 | 2020-01-21 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
PE20160799A1 (es) | 2013-06-12 | 2016-09-03 | Earth Alive Clean Tech Inc | Supresor de polvo |
WO2014200658A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis |
WO2014200656A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces umbrinus |
WO2014200657A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis |
EP3011020A1 (de) | 2013-06-17 | 2016-04-27 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase aus einem mitglied der bacillaceae-familie |
WO2014207224A1 (en) | 2013-06-27 | 2014-12-31 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
CN105874067A (zh) | 2013-06-27 | 2016-08-17 | 诺维信公司 | 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
CN105358593B (zh) | 2013-07-03 | 2018-06-22 | 巴斯夫欧洲公司 | 通过含酸基团的单体在聚醚化合物存在下聚合得到的凝胶状聚合物组合物 |
WO2015001017A2 (en) | 2013-07-04 | 2015-01-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having anti-redeposition effect and polynucleotides encoding same |
EP3019603A1 (de) | 2013-07-09 | 2016-05-18 | Novozymes A/S | Polypeptide mit lipaseaktivität und polynukleotide zur codierung davon |
CN105555951A (zh) | 2013-07-19 | 2016-05-04 | 丹尼斯科美国公司 | 包含脂解酶变体的组合物和方法 |
EP2832853A1 (de) | 2013-07-29 | 2015-02-04 | Henkel AG&Co. KGAA | Waschmittelzusammensetzung mit Proteasevarianten |
EP3613853A1 (de) | 2013-07-29 | 2020-02-26 | Novozymes A/S | Proteasevarianten und polynukleotide zur codierung davon |
RU2670946C9 (ru) | 2013-07-29 | 2018-11-26 | Новозимс А/С | Варианты протеазы и кодирующие их полинуклеотиды |
WO2015050723A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof |
WO2015049370A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Novozymes A/S | Detergent composition and use of detergent composition |
US20160186102A1 (en) | 2013-10-03 | 2016-06-30 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof |
UA119331C2 (uk) | 2013-11-08 | 2019-06-10 | Новозімес Біоаґ А/С | Композиції та способи для обробки від шкідників |
MX2016006489A (es) | 2013-11-20 | 2016-08-03 | Danisco Us Inc | Alfa-amilasas variantes que tienen susceptibilidad reducida a la escision por proteasas y metodos de uso. |
WO2015077278A1 (en) | 2013-11-20 | 2015-05-28 | Novozymes Bioag A/S | Compositions and methods comprising chromobacterium for controlling plant nematode pests and plant insect pests |
WO2015094809A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Danisco Us Inc. | Chimeric fungal alpha-amylases comprising carbohydrate binding module and the use thereof |
EP3083954B1 (de) | 2013-12-20 | 2018-09-26 | Novozymes A/S | Polypeptide mit proteaseaktivität und polynukleotide, die für diese kodieren |
US10463701B2 (en) | 2013-12-31 | 2019-11-05 | DuPont Nutrition BioScience ApS | Blends of Bacillus strains and enzymes |
JP6585602B2 (ja) | 2013-12-31 | 2019-10-02 | ダニスコ・ユーエス・インク | タンパク質発現の増大 |
CN105849121B (zh) | 2014-01-22 | 2020-12-29 | 诺维信公司 | 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 |
EP3114219A1 (de) | 2014-03-05 | 2017-01-11 | Novozymes A/S | Zusammensetzungen und verfahren zur verbesserung der eigenschaften von nichtcellulosischen textilmaterialien mit xyloglucan-endotransglycosylase |
CN106062271A (zh) | 2014-03-05 | 2016-10-26 | 诺维信公司 | 用于改进具有木葡聚糖内糖基转移酶的纤维素纺织材料的性质的组合物和方法 |
EP3117001B1 (de) | 2014-03-12 | 2019-02-20 | Novozymes A/S | Polypeptide mit lipaseaktivität und polynukleotide zur codierung davon |
JP6591998B2 (ja) * | 2014-03-28 | 2019-10-16 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 低pHでのタンパク質結晶の再可溶化 |
US20170015950A1 (en) | 2014-04-01 | 2017-01-19 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha amylase activity |
WO2015155350A1 (en) | 2014-04-11 | 2015-10-15 | Novozymes A/S | Detergent composition |
CN106715465B (zh) | 2014-04-15 | 2021-10-08 | 诺维信公司 | 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 |
US10023852B2 (en) | 2014-05-27 | 2018-07-17 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
AR100605A1 (es) | 2014-05-27 | 2016-10-19 | Novozymes As | Métodos para la producción de lipasas |
US20170121695A1 (en) | 2014-06-12 | 2017-05-04 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
WO2016001319A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Novozymes A/S | Improved stabilization of non-protease enzyme |
EP3739029A1 (de) | 2014-07-04 | 2020-11-18 | Novozymes A/S | Subtilasevarianten und polynukleotide zur codierung davon |
WO2016001449A1 (en) * | 2014-07-04 | 2016-01-07 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
WO2016054528A2 (en) | 2014-10-03 | 2016-04-07 | Monosol, Llc | Degradable materials and packaging made from same |
EP3172329A1 (de) | 2014-10-24 | 2017-05-31 | Danisco US Inc. | Verfahren zur herstellung von alkoholen durch verwendung einer tripeptidylpeptidase |
WO2016079110A2 (en) | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Novozymes A/S | Use of enzyme for cleaning |
US10287562B2 (en) | 2014-11-20 | 2019-05-14 | Novoszymes A/S | Alicyclobacillus variants and polynucleotides encoding same |
EP3227442B1 (de) | 2014-12-05 | 2022-02-16 | Novozymes A/S | Lipasevarianten und polynukleotide zur codierung davon |
WO2016096714A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent composition comprising subtilase variants |
WO2016096996A1 (en) | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having n-acetyl glucosamine oxidase activity |
EP3233893B1 (de) | 2014-12-16 | 2021-01-20 | Danisco US Inc. | Erhöhte protein expression |
CN107109388A (zh) | 2014-12-19 | 2017-08-29 | 诺维信公司 | 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
US11518987B2 (en) | 2014-12-19 | 2022-12-06 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
US20170369537A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-12-28 | Danisco Us Inc. | Enhanced protein expression |
CN107404922B (zh) | 2015-03-30 | 2021-09-14 | 雀巢产品有限公司 | 乳基蛋白质水解物及由其制备的组合物 |
EP3280267A1 (de) | 2015-04-06 | 2018-02-14 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Proteasen für proteinreiche fermentierte milchprodukte |
EP3280791A1 (de) | 2015-04-10 | 2018-02-14 | Novozymes A/S | Waschverfahren, verwendung von dnase und waschmittelzusammensetzung |
EP3280800A1 (de) | 2015-04-10 | 2018-02-14 | Novozymes A/S | Reinigungsmittelzusammensetzung |
WO2016184944A1 (en) | 2015-05-19 | 2016-11-24 | Novozymes A/S | Odor reduction |
EP3303536B1 (de) | 2015-06-02 | 2019-04-17 | Unilever PLC | Waschmittelzusammensetzung |
EP3101108B1 (de) | 2015-06-04 | 2018-01-31 | The Procter and Gamble Company | Flüssige handspülmittelzusammensetzung |
EP3101109B1 (de) | 2015-06-04 | 2018-03-07 | The Procter and Gamble Company | Flüssige handspülmittelzusammensetzung |
EP3101102B2 (de) | 2015-06-05 | 2023-12-13 | The Procter & Gamble Company | Kompaktierte flüssigwaschmittelzusammensetzung |
PL3101100T3 (pl) | 2015-06-05 | 2018-07-31 | The Procter And Gamble Company | Zagęszczone płynne kompozycje detergentowe do prania |
EP3101107B1 (de) | 2015-06-05 | 2019-04-24 | The Procter and Gamble Company | Kompaktierte flüssigwaschmittelzusammensetzung |
BR112017026234B1 (pt) | 2015-06-11 | 2022-10-04 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de detergente para lavagem de roupas e método de tratamento doméstico de um tecido |
WO2016202739A1 (en) | 2015-06-16 | 2016-12-22 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
EP3310688A1 (de) | 2015-06-17 | 2018-04-25 | Novozymes A/S | Behälter |
BR112017027402B1 (pt) | 2015-06-26 | 2022-05-10 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de detergente para lavagem de roupas e método de tratamento doméstico de um tecido |
US20180171271A1 (en) | 2015-06-30 | 2018-06-21 | Novozymes A/S | Laundry detergent composition, method for washing and use of composition |
US10920203B2 (en) | 2015-07-01 | 2021-02-16 | Novozymes A/S | Methods of reducing odor |
CN107969136B (zh) | 2015-07-06 | 2021-12-21 | 诺维信公司 | 脂肪酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
CN108026487B (zh) | 2015-09-17 | 2021-04-30 | 汉高股份有限及两合公司 | 包含具有黄原胶降解活性的多肽的洗涤剂组合物 |
WO2017046260A1 (en) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same |
EP3356504B1 (de) | 2015-10-01 | 2019-08-14 | Unilever PLC | Waschmittel in pulverform |
MX2018002831A (es) | 2015-10-07 | 2018-09-28 | Novozymes As | Polipeptidos. |
CN108291215A (zh) | 2015-10-14 | 2018-07-17 | 诺维信公司 | 具有蛋白酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸 |
EP3362556B1 (de) | 2015-10-14 | 2024-07-10 | Novozymes A/S | Polypeptidvarianten |
BR112018007474A2 (pt) | 2015-10-14 | 2018-10-30 | Novozymes A/S | ?limpeza de membranas de filtração de água? |
WO2016203064A2 (en) | 2015-10-28 | 2016-12-22 | Novozymes A/S | Detergent composition comprising protease and amylase variants |
BR112018009235B1 (pt) | 2015-11-09 | 2022-11-22 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Composição de aditivo alimentar, método de preparação da mesma, uso de um microorganismo de alimentação direta, kit, composição alimentar, e pré-mistura |
EP3380608A1 (de) | 2015-11-24 | 2018-10-03 | Novozymes A/S | Polypeptide mit proteaseaktivität und dafür codierende polynukleotide |
US10870838B2 (en) | 2015-12-01 | 2020-12-22 | Novozymes A/S | Methods for producing lipases |
MX2018007067A (es) | 2015-12-09 | 2018-08-01 | Basf Se | Metodo de purificacion de una proteina a partir de solidos de fermentacion en condiciones de desorcion. |
WO2017100720A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
WO2017117089A1 (en) | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Novozymes Bioag A/S | Heat priming of bacterial spores |
CA3006607A1 (en) | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Novozymes A/S | Enzyme variants and polynucleotides encoding the same |
US20210171927A1 (en) | 2016-01-29 | 2021-06-10 | Novozymes A/S | Beta-glucanase variants and polynucleotides encoding same |
EP3205393A1 (de) | 2016-02-12 | 2017-08-16 | Basf Se | Verfahren zur herstellung von mikrokapseln |
EP3205392A1 (de) | 2016-02-12 | 2017-08-16 | Basf Se | Mikrokapseln und verfahren zur herstellung von mikrokapseln |
EP3417040B1 (de) | 2016-02-17 | 2019-09-04 | Unilever PLC | Bleichungszusammensetzung |
WO2017140391A1 (en) | 2016-02-17 | 2017-08-24 | Unilever Plc | Whitening composition |
CN108884415A (zh) | 2016-03-21 | 2018-11-23 | 荷兰联合利华有限公司 | 洗衣洗涤剂组合物 |
EP3715442A1 (de) | 2016-03-23 | 2020-09-30 | Novozymes A/S | Verwendung eines polypeptids mit dnase-aktivität zur behandlung von geweben |
WO2017173324A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
WO2017173190A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
EP3440172B1 (de) | 2016-04-08 | 2019-08-21 | Unilever PLC | Wäschewaschmittelzusammensetzung |
CN109312270B (zh) | 2016-04-08 | 2022-01-28 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物及其用途 |
WO2017182295A1 (en) | 2016-04-18 | 2017-10-26 | Basf Se | Liquid cleaning compositions |
EP3448978B1 (de) | 2016-04-29 | 2020-03-11 | Novozymes A/S | Reinigungsmittelzusammensetzungen und verwendungen davon |
CN109415421B (zh) | 2016-05-03 | 2023-02-28 | 诺维信公司 | α-淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
MX2018013556A (es) | 2016-05-09 | 2019-03-14 | Novozymes As | Polipeptidos variantes con rendimiento mejorado y uso de los mismos. |
WO2017210188A1 (en) | 2016-05-31 | 2017-12-07 | Novozymes A/S | Stabilized liquid peroxide compositions |
CN114381342A (zh) | 2016-06-23 | 2022-04-22 | 诺维信公司 | 酶的用途、组合物以及用于去除污垢的方法 |
CN109563495A (zh) | 2016-06-30 | 2019-04-02 | 诺维信公司 | 脂肪酶变体及包含表面活性剂和脂肪酶变体的组合物 |
WO2018002261A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
CN109715794A (zh) | 2016-07-05 | 2019-05-03 | 诺维信公司 | 果胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
WO2018007573A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | Novozymes A/S | Detergent compositions with galactanase |
CN109642222A (zh) | 2016-07-13 | 2019-04-16 | 诺维信公司 | 食物芽孢杆菌dna酶变体 |
MX2019000621A (es) | 2016-07-14 | 2019-08-01 | Basf Se | Medio de fermentacion que comprende agente quelante. |
EP4357453A2 (de) | 2016-07-18 | 2024-04-24 | Novozymes A/S | Lipasevarianten, polynukleotide zur codierung davon und verwendung davon |
WO2018029021A1 (en) | 2016-08-08 | 2018-02-15 | Basf Se | Liquid laundry formulation |
EP3284805B1 (de) | 2016-08-17 | 2020-02-19 | The Procter & Gamble Company | Reinigungszusammensetzung |
US11512300B2 (en) | 2016-08-24 | 2022-11-29 | Novozymes A/S | Xanthan lyase variants and polynucleotides encoding same |
CN109563498A (zh) | 2016-08-24 | 2019-04-02 | 汉高股份有限及两合公司 | 包含黄原胶裂解酶变体i的洗涤剂组合物 |
EP3504313A1 (de) | 2016-08-24 | 2019-07-03 | Henkel AG & Co. KGaA | Waschmittelzusammensetzung mit gh9-endoglucanasevarianten i |
CA3031609A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | Novozymes A/S | Gh9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same |
CN109790491B (zh) | 2016-09-27 | 2021-02-23 | 荷兰联合利华有限公司 | 家用洗衣方法 |
CN110023474A (zh) | 2016-09-29 | 2019-07-16 | 诺维信公司 | 酶用于洗涤的用途、洗涤方法和器皿洗涤组合物 |
CN109996859B (zh) | 2016-09-29 | 2021-11-30 | 诺维信公司 | 含孢子的颗粒 |
EP3532592A1 (de) | 2016-10-25 | 2019-09-04 | Novozymes A/S | Waschmittelzusammensetzungen |
US11753605B2 (en) | 2016-11-01 | 2023-09-12 | Novozymes A/S | Multi-core granules |
CA3043443A1 (en) | 2016-12-01 | 2018-06-07 | Basf Se | Stabilization of enzymes in compositions |
WO2018108865A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Novozymes A/S | Use of polypeptides |
BR112019011999B1 (pt) | 2016-12-15 | 2022-11-08 | Unilever Ip Holdings B.V | Composição de detergente líquida aquosa para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido |
US11866713B2 (en) | 2017-02-24 | 2024-01-09 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods for increased protein production in bacillus licheniformis |
WO2018177938A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Novozymes A/S | Polypeptides having dnase activity |
WO2018177936A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Novozymes A/S | Polypeptides having dnase activity |
US11149233B2 (en) | 2017-03-31 | 2021-10-19 | Novozymes A/S | Polypeptides having RNase activity |
WO2018184004A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Danisco Us Inc | Alpha-amylase combinatorial variants |
US20200109388A1 (en) | 2017-04-03 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Recovery Process |
US20200109352A1 (en) | 2017-04-04 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Polypeptide compositions and uses thereof |
US20200109354A1 (en) | 2017-04-04 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Polypeptides |
CN110651029B (zh) | 2017-04-04 | 2022-02-15 | 诺维信公司 | 糖基水解酶 |
ES2728758T3 (es) | 2017-04-05 | 2019-10-28 | Henkel Ag & Co Kgaa | Composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas |
EP3385362A1 (de) | 2017-04-05 | 2018-10-10 | Henkel AG & Co. KGaA | Waschmittelzusammensetzungen mit pilzmannanasen |
US11407964B2 (en) | 2017-04-06 | 2022-08-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2018185280A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2018185285A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
EP3607042A1 (de) | 2017-04-06 | 2020-02-12 | Novozymes A/S | Reinigungszusammensetzungen und verwendungen davon |
CA3058519A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions comprosing a dnase and a protease |
WO2018184873A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
US10968416B2 (en) | 2017-04-06 | 2021-04-06 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2018184818A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2018202846A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Novozymes A/S | Compositions comprising lipase and sulfite |
WO2018206300A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2018206535A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Novozymes A/S | Carbohydrate-binding domain and polynucleotides encoding the same |
EP3401385A1 (de) | 2017-05-08 | 2018-11-14 | Henkel AG & Co. KGaA | Tensidzusammensetzungen enthaltend polypeptide enthaltend eine carbohydrate binding domain |
CA3058095A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2018224544A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Novozymes A/S | Compositions comprising polypeptides having cellulase activity and amylase activity, and uses thereof in cleaning and detergent compositions |
US20200181542A1 (en) | 2017-06-30 | 2020-06-11 | Novozymes A/S | Enzyme Slurry Composition |
WO2019008036A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Unilever Plc | WHITENING COMPOSITION |
BR112020000205B1 (pt) | 2017-07-07 | 2023-10-31 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de limpeza para a lavagem de tecidos e método doméstico de tratamento de um tecido |
EP3665267A1 (de) | 2017-08-07 | 2020-06-17 | Novozymes A/S | Verwendung von fca-steuerung auf ph-basis |
AR112778A1 (es) | 2017-08-07 | 2019-12-11 | Novozymes As | Fermentador equipado con eyector |
US11441139B2 (en) | 2017-08-18 | 2022-09-13 | Danisco Us Inc (157111) | α-Amylase variants |
EP3655537A1 (de) | 2017-08-23 | 2020-05-27 | Danisco US Inc. | Verfahren und zusammensetzungen zur effizienten genetischen modifikation von bacillus-licheniformis-stämmen |
CN111344404A (zh) | 2017-08-24 | 2020-06-26 | 诺维信公司 | 黄原胶裂解酶变体以及编码其的多核苷酸 |
US11624059B2 (en) | 2017-08-24 | 2023-04-11 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent compositions comprising GH9 endoglucanase variants II |
WO2019038058A1 (en) | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Novozymes A/S | GH9 ENDOGLUCANASE VARIANTS AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SUCH VARIANTS |
EP3673060A1 (de) | 2017-08-24 | 2020-07-01 | Henkel AG & Co. KGaA | Reinigungsmittelzusammensetzung mit xanthanlyasevarianten ii |
EP3682010A1 (de) | 2017-09-13 | 2020-07-22 | Danisco US Inc. | Modifizierte sequenzen von 5'-untranslatierten regionen (utr) für erhöhte proteinproduktion in bacillus |
US20200277553A1 (en) | 2017-09-20 | 2020-09-03 | Novozymes A/S | Use of Enzymes for Improving Water Absorption And/Or Whiteness |
US11414814B2 (en) | 2017-09-22 | 2022-08-16 | Novozymes A/S | Polypeptides |
JP7317811B2 (ja) | 2017-09-27 | 2023-07-31 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | リパーゼ変異体及びかかるリパーゼ変異体を含むマイクロカプセル組成物 |
WO2019067390A1 (en) | 2017-09-27 | 2019-04-04 | The Procter & Gamble Company | DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING LIPASES |
CN111373036A (zh) | 2017-10-02 | 2020-07-03 | 诺维信公司 | 具有甘露聚糖酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 |
WO2019068713A1 (en) | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Novozymes A/S | POLYPEPTIDES HAVING MANNANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THESE POLYPEPTIDES |
WO2019076800A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Novozymes A/S | CLEANING COMPOSITIONS AND USES THEREOF |
CN111448302A (zh) | 2017-10-16 | 2020-07-24 | 诺维信公司 | 低粉化颗粒 |
WO2019076834A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Novozymes A/S | PELLETS WITH LOW DUST CONTENT |
WO2019081515A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Novozymes A/S | COMPOSITIONS COMPRISING POLYPEPTIDES HAVING MANNANASE ACTIVITY |
CN111386340B (zh) | 2017-10-27 | 2024-05-24 | 宝洁公司 | 包含多肽变体的洗涤剂组合物 |
EP3701017A1 (de) | 2017-10-27 | 2020-09-02 | Novozymes A/S | Dnase-varianten |
DE102017125558A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine i enthalten |
BR112020008737A2 (pt) | 2017-11-01 | 2020-10-13 | Novozymes A/S | polipeptídeos e composições que compreendam tais polipeptídeos |
DE102017125560A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten |
DE102017125559A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine ii enthalten |
CN111479919A (zh) | 2017-11-01 | 2020-07-31 | 诺维信公司 | 多肽以及包含此类多肽的组合物 |
EP3704220A1 (de) | 2017-11-01 | 2020-09-09 | Novozymes A/S | Verfahren zur reinigung von medizinischen vorrichtungen |
WO2019089898A1 (en) | 2017-11-02 | 2019-05-09 | Danisco Us Inc | Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes |
CN111315879A (zh) | 2017-11-09 | 2020-06-19 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含有机白色颜料的酶颗粒涂层 |
JP2021504546A (ja) | 2017-11-29 | 2021-02-15 | ビーエイエスエフ・ソシエタス・エウロパエアBasf Se | 組成物、その製造方法および使用方法 |
EP3717616B1 (de) | 2017-11-30 | 2021-10-13 | Unilever IP Holdings B.V. | Reinigungszusammensetzung mit protease |
US11725197B2 (en) | 2017-12-04 | 2023-08-15 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
DK3735478T3 (da) | 2018-01-03 | 2023-10-30 | Danisco Us Inc | Mutante og genmodificerede bacillus-celler og fremgangsmåder dertil til forøget proteinproduktion |
CN111801416A (zh) | 2018-02-08 | 2020-10-20 | 诺维信公司 | 脂肪酶变体及其组合物 |
CN111868239A (zh) | 2018-02-08 | 2020-10-30 | 诺维信公司 | 脂肪酶、脂肪酶变体及其组合物 |
KR20200124258A (ko) | 2018-02-23 | 2020-11-02 | 헨켈 아게 운트 코. 카게아아 | 크산탄 리아제 및 엔도글루카나제 변이체를 포함하는 세제 조성물 |
CN111770788B (zh) | 2018-03-13 | 2023-07-25 | 诺维信公司 | 使用氨基糖低聚物进行微囊化 |
WO2019185726A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2019201793A1 (en) | 2018-04-17 | 2019-10-24 | Novozymes A/S | Polypeptides comprising carbohydrate binding activity in detergent compositions and their use in reducing wrinkles in textile or fabric. |
US11661592B2 (en) | 2018-04-19 | 2023-05-30 | Novozymes A/S | Stabilized endoglucanase variants |
WO2019201785A1 (en) | 2018-04-19 | 2019-10-24 | Novozymes A/S | Stabilized cellulase variants |
CN112368375A (zh) | 2018-04-26 | 2021-02-12 | 巴斯夫欧洲公司 | 脂肪酶 |
WO2019211143A1 (en) | 2018-05-03 | 2019-11-07 | Basf Se | Amylase enzymes |
CN112119147B (zh) | 2018-05-17 | 2023-09-29 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 清洁组合物 |
WO2019238761A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-19 | Basf Se | Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes |
CN112368363A (zh) | 2018-06-28 | 2021-02-12 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物及其用途 |
EP3814473A1 (de) | 2018-06-29 | 2021-05-05 | Novozymes A/S | Reinigungsmittelzusammensetzungen und verwendungen davon |
WO2020002255A1 (en) | 2018-06-29 | 2020-01-02 | Novozymes A/S | Subtilase variants and compositions comprising same |
WO2020007863A1 (en) | 2018-07-02 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2020007875A1 (en) | 2018-07-03 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2020008043A1 (en) | 2018-07-06 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2020008024A1 (en) | 2018-07-06 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
MX2021001213A (es) | 2018-07-31 | 2021-08-24 | Danisco Us Inc | Variantes de alfa-amilasas que tienen sustituciones de aminoácidos que bajan el pka del ácido general. |
WO2020030623A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Basf Se | Packaging unit comprising a detergent composition containing an enzyme and at least one chelating agent |
WO2020058024A1 (en) | 2018-09-17 | 2020-03-26 | Unilever Plc | Detergent composition |
US20210340466A1 (en) | 2018-10-01 | 2021-11-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
WO2020070014A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition comprising anionic surfactant and a polypeptide having rnase activity |
WO2020070011A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition |
WO2020070209A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition |
WO2020070249A1 (en) | 2018-10-03 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions |
US11993762B2 (en) | 2018-10-03 | 2024-05-28 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha-mannan degrading activity and polynucleotides encoding same |
JP2022512599A (ja) | 2018-10-05 | 2022-02-07 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 液体中のアミラーゼを安定化する化合物 |
US20210395650A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-12-23 | Basf Se | Compounds stabilizing hydrolases in liquids |
JP2022504190A (ja) | 2018-10-05 | 2022-01-13 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 液体中のヒドロラーゼを安定化する化合物 |
EP3677676A1 (de) | 2019-01-03 | 2020-07-08 | Basf Se | Verbindungen zur stabilisierung von amylasen in flüssigkeiten |
EP3864124A1 (de) | 2018-10-11 | 2021-08-18 | Novozymes A/S | Reinigungszusammensetzungen und verwendungen davon |
WO2020077331A2 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Danisco Us Inc | Alpha-amylases with mutations that improve stability in the presence of chelants |
EP3647398B1 (de) | 2018-10-31 | 2024-05-15 | Henkel AG & Co. KGaA | Reinigungszusammensetzungen mit dispersinen v |
EP3647397A1 (de) | 2018-10-31 | 2020-05-06 | Henkel AG & Co. KGaA | Reinigungsmittel mit dispersins iv |
WO2020099490A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising enzymes |
WO2020104231A1 (en) | 2018-11-19 | 2020-05-28 | Basf Se | Powders and granules containing a chelating agent and an enzyme |
BR112021009785A2 (pt) | 2018-11-20 | 2021-08-17 | Unilever Ip Holdings B.V. | composição detergente, método de tratamento de um substrato de tecido e uso de uma enzima |
TW202033100A (zh) | 2018-11-20 | 2020-09-16 | 丹麥商杜邦營養生物科學有限公司 | 經改造之強健高Tm值的植酸酶類多肽及其片段 |
CN113056550B (zh) | 2018-11-20 | 2022-10-28 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
BR112021009789A2 (pt) | 2018-11-20 | 2021-08-17 | Unilever Ip Holdings B.V. | composição detergente, método de tratamento de um substrato de tecido e uso de uma enzima esterase |
EP3884022B1 (de) | 2018-11-20 | 2024-06-12 | Unilever Global Ip Limited | Reinigungsmittelzusammensetzung |
CN113166689A (zh) | 2018-11-20 | 2021-07-23 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
EP3891264A1 (de) | 2018-12-03 | 2021-10-13 | Novozymes A/S | Waschmittelpulverzusammensetzung mit niedrigem ph-wert |
US20220056379A1 (en) | 2018-12-03 | 2022-02-24 | Novozymes A/S | Powder Detergent Compositions |
US11959111B2 (en) | 2018-12-21 | 2024-04-16 | Novozymes A/S | Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same |
CN113330101A (zh) | 2018-12-21 | 2021-08-31 | 诺维信公司 | 包含金属蛋白酶的洗涤剂袋 |
EP3927837A1 (de) | 2019-02-20 | 2021-12-29 | Basf Se | Industrielles fermentationsverfahren für bacillus unter verwendung eines definierten mediums und einer magnesiumzufuhr |
CN114127256A (zh) | 2019-02-20 | 2022-03-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 用确定成分培养基和微量元素补料的芽孢杆菌工业发酵工艺 |
EP3702452A1 (de) | 2019-03-01 | 2020-09-02 | Novozymes A/S | Waschmittelzusammensetzungen mit zwei proteasen |
BR112021018731A2 (pt) | 2019-03-21 | 2021-12-21 | Novozymes As | Variantes de alfa-amilase e polinucleotídeos codificando as mesmas |
WO2020193535A2 (en) | 2019-03-25 | 2020-10-01 | Basf Se | Amylase enzymes |
EP3947664A2 (de) | 2019-03-25 | 2022-02-09 | Basf Se | Amylaseenzyme |
CN113795578A (zh) * | 2019-04-02 | 2021-12-14 | 诺维信公司 | 液体餐具清洗洗涤剂组合物 |
US20220169953A1 (en) | 2019-04-03 | 2022-06-02 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucanase activity, polynucleotides encoding same and uses thereof in cleaning and detergent compositions |
WO2020207944A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
US20220186151A1 (en) | 2019-04-12 | 2022-06-16 | Novozymes A/S | Stabilized glycoside hydrolase variants |
WO2020229480A1 (en) | 2019-05-14 | 2020-11-19 | Basf Se | Compounds stabilizing hydrolases in liquids |
BR112021022167A2 (pt) | 2019-05-16 | 2022-01-18 | Unilever Ip Holdings B V | Composição de lavanderia auxiliar, método para administrar enzimas a tecidos, método para aprimorar o benefício amaciante de um condicionador de tecido e uso de uma composição de lavanderia auxiliar |
US20220275355A1 (en) | 2019-06-13 | 2022-09-01 | Basf Se | Method of Recovering a Protein from Fermentation Broth Using a Divalent Cation |
US20220306791A1 (en) | 2019-06-14 | 2022-09-29 | Basf Se | Aqueous polymer dispersions suitable as opacifiers in liquid formulations |
BR112021025261A2 (pt) | 2019-06-28 | 2022-04-26 | Unilever Ip Holdings B V | Composição detergente e método doméstico para tratar um tecido |
BR112021025399A2 (pt) | 2019-06-28 | 2022-04-26 | Unilever Ip Holdings B V | Composição detergente e método doméstico para tratar um tecido |
WO2020260006A1 (en) | 2019-06-28 | 2020-12-30 | Unilever Plc | Detergent compositions |
WO2020259949A1 (en) | 2019-06-28 | 2020-12-30 | Unilever Plc | Detergent composition |
US20220372400A1 (en) | 2019-06-28 | 2022-11-24 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Detergent composition |
US20220364022A1 (en) | 2019-06-28 | 2022-11-17 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Detergent composition |
CN114008068A (zh) | 2019-07-01 | 2022-02-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 稳定酶的肽缩醛 |
US20220340865A1 (en) | 2019-07-02 | 2022-10-27 | Basf Se | Method for preparing a fermentation medium |
CN114207123A (zh) | 2019-07-02 | 2022-03-18 | 诺维信公司 | 脂肪酶变体及其组合物 |
MX2022000253A (es) | 2019-07-05 | 2022-02-03 | Basf Se | Proceso de fermentacion industrial para celulas microbianas mediante el uso de un precultivo de alimentacion por lotes. |
MX2022000355A (es) | 2019-07-09 | 2022-03-17 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Composiciones de enzimas particuladas recubiertas de grasa. |
WO2021009067A1 (en) | 2019-07-12 | 2021-01-21 | Novozymes A/S | Enzymatic emulsions for detergents |
BR112022002779A2 (pt) | 2019-08-16 | 2022-08-09 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Composições para saúde intestinal que compreendem combinações de cepas de lactobacillus |
JP2022545465A (ja) | 2019-08-22 | 2022-10-27 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | アミラーゼバリアント |
US20220325204A1 (en) | 2019-08-27 | 2022-10-13 | Novozymes A/S | Detergent composition |
CN114555769A (zh) | 2019-08-27 | 2022-05-27 | 诺维信公司 | 包含脂肪酶的组合物 |
AR119874A1 (es) | 2019-09-02 | 2022-01-19 | Unilever Nv | Composición detergente con un derivado de éster de ácido cítrico de un monoglicérido |
WO2021046073A1 (en) | 2019-09-05 | 2021-03-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed composition |
US20220315866A1 (en) | 2019-09-19 | 2022-10-06 | Novozymes A/S | Detergent Composition |
DE112020004477T5 (de) | 2019-09-19 | 2022-06-30 | Unilever Global Ip Limited | Detergenszusammensetzungen |
WO2021064068A1 (en) | 2019-10-03 | 2021-04-08 | Novozymes A/S | Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains |
AR120142A1 (es) | 2019-10-07 | 2022-02-02 | Unilever Nv | Composición detergente |
EP4045625A1 (de) | 2019-10-18 | 2022-08-24 | Basf Se | Lagerstabile hydrolase-haltige flüssigkeiten |
US20220395543A1 (en) | 2019-10-21 | 2022-12-15 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Compositions for gut health |
CN114846023A (zh) | 2019-10-24 | 2022-08-02 | 丹尼斯科美国公司 | 成麦芽五糖/麦芽六糖变体α-淀粉酶 |
WO2021102238A1 (en) | 2019-11-20 | 2021-05-27 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Thermostable phytase variants |
WO2021105336A1 (en) | 2019-11-29 | 2021-06-03 | Basf Se | Compositions comprising polymer and enzyme |
WO2021115912A1 (en) | 2019-12-09 | 2021-06-17 | Basf Se | Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes |
CN115103602A (zh) | 2019-12-19 | 2022-09-23 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 日粮配制品 |
WO2021122118A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Cleaning compositions comprising dispersins vi |
EP4077656A2 (de) | 2019-12-20 | 2022-10-26 | Novozymes A/S | Polypeptide mit proteolytischer aktivität und verwendung davon |
AU2020405786A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-08-11 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Cleaning compositions comprising dispersins IX |
CN114929848A (zh) | 2019-12-20 | 2022-08-19 | 诺维信公司 | 稳定的液体无硼酶组合物 |
WO2021122117A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Cleaning composition coprising a dispersin and a carbohydrase |
JP2023524334A (ja) | 2020-01-15 | 2023-06-12 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス・リケニフォルミス(bacillus licheniformis)における強化したタンパク質産生のための組成物及び方法 |
US20230407208A1 (en) | 2020-01-29 | 2023-12-21 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Laundry detergent product |
WO2021152120A1 (en) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
BR112022014946A2 (pt) | 2020-01-31 | 2022-10-04 | Novozymes As | Variantes de mananase e polinucleotídeos codificando as mesmas |
EP4099838A1 (de) | 2020-02-07 | 2022-12-14 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Futterzusammensetzungen für die tiergesundheit |
WO2021160818A1 (en) | 2020-02-14 | 2021-08-19 | Basf Se | Mannanase variants |
BR112022017034A2 (pt) | 2020-02-28 | 2022-12-13 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Composições de ração |
EP3892708A1 (de) | 2020-04-06 | 2021-10-13 | Henkel AG & Co. KGaA | Reinigungszusammensetzungen mit dispersinvarianten |
CN115210371A (zh) | 2020-04-08 | 2022-10-18 | 诺维信公司 | 碳水化合物结合模块变体 |
EP4139431A1 (de) | 2020-04-21 | 2023-03-01 | Novozymes A/S | Reinigungszusammensetzungen mit polypeptiden mit fructanabbauender aktivität |
EP3907271A1 (de) | 2020-05-07 | 2021-11-10 | Novozymes A/S | Reinigungszusammensetzung, verwendung und verfahren zum reinigen |
WO2021239818A1 (en) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | Novozymes A/S | Subtilase variants and compositions comprising same |
WO2021249927A1 (en) | 2020-06-08 | 2021-12-16 | Unilever Ip Holdings B.V. | Method of improving protease activity |
US20230235250A1 (en) | 2020-06-18 | 2023-07-27 | Basf Se | Compositions and Their Use |
CN115836125A (zh) | 2020-06-24 | 2023-03-21 | 诺维信公司 | 纤维素酶用于从纺织品去除尘螨的用途 |
EP3936593A1 (de) | 2020-07-08 | 2022-01-12 | Henkel AG & Co. KGaA | Reinigungszusammensetzungen und verwendungen davon |
EP4179053B1 (de) | 2020-07-09 | 2024-04-03 | Basf Se | Zusammensetzungen und deren anwendungen |
WO2022008732A1 (en) | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Basf Se | Enhancing the activity of antimicrobial preservatives |
WO2022023250A1 (en) | 2020-07-27 | 2022-02-03 | Unilever Ip Holdings B.V. | Use of an enzyme and surfactant for inhibiting microorganisms |
KR20230057391A (ko) | 2020-08-24 | 2023-04-28 | 노보자임스 에이/에스 | 프럭타나제를 포함하는 구강 관리 조성물 |
WO2022043321A2 (en) | 2020-08-25 | 2022-03-03 | Novozymes A/S | Variants of a family 44 xyloglucanase |
BR112023001773A2 (pt) | 2020-08-28 | 2023-03-28 | Unilever Ip Holdings B V | Composição detergente e método |
US20230287302A1 (en) | 2020-08-28 | 2023-09-14 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Detergent composition |
WO2022043045A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Unilever Ip Holdings B.V. | Detergent composition |
US20230287300A1 (en) | 2020-08-28 | 2023-09-14 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Surfactant and detergent composition |
WO2022043042A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Unilever Ip Holdings B.V. | Detergent composition |
US20230323330A1 (en) | 2020-08-28 | 2023-10-12 | Novozymes A/S | Polyester degrading protease variants |
EP4213641A1 (de) | 2020-09-15 | 2023-07-26 | Novozymes A/S | Tierfutter mit insekten oder insektenmehl |
BR112023005106A2 (pt) | 2020-09-22 | 2023-04-18 | Basf Se | Composição líquida, formulação de detergente líquida, e, usos de pelo menos um diol (exceto 1,2-proanodiol) e das formulações de detergente |
WO2022074037A2 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
WO2022081947A1 (en) | 2020-10-16 | 2022-04-21 | Dupont Nutrition Biosciences | Feed compositions for animal health |
WO2022083949A1 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-28 | Basf Se | Compositions and their use |
EP4232539A2 (de) | 2020-10-20 | 2023-08-30 | Novozymes A/S | Verwendung von polypeptiden mit dnase-aktivität |
EP4237525A1 (de) | 2020-10-28 | 2023-09-06 | Novozymes A/S | Verwendung von lipoxygenase |
JP2023547450A (ja) | 2020-10-29 | 2023-11-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | リパーゼ変異体及びそのようなリパーゼ変異体を含む組成物 |
US20230407209A1 (en) | 2020-11-13 | 2023-12-21 | Novozymes A/S | Detergent Composition Comprising a Lipase |
WO2022106400A1 (en) | 2020-11-18 | 2022-05-27 | Novozymes A/S | Combination of immunochemically different proteases |
US20240010950A1 (en) | 2020-12-07 | 2024-01-11 | Conopco Inc., D/B/A Unilever | Detergent compositions |
EP4256019A1 (de) | 2020-12-07 | 2023-10-11 | Unilever IP Holdings B.V. | Waschmittelzusammensetzungen |
EP4015629A1 (de) | 2020-12-18 | 2022-06-22 | Basf Se | Polymermischungen zur erhöhung der stabilität und leistung von hydrolasehaltigen waschmitteln |
EP4032966A1 (de) | 2021-01-22 | 2022-07-27 | Novozymes A/S | Flüssige enzymzusammensetzung mit sulfitabfänger |
EP4284905A1 (de) | 2021-01-28 | 2023-12-06 | Novozymes A/S | Lipase mit geringer geruchsbildung |
WO2022169933A2 (en) | 2021-02-03 | 2022-08-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Compositions for gut health |
EP4039806A1 (de) | 2021-02-04 | 2022-08-10 | Henkel AG & Co. KGaA | Reinigungsmittelzusammensetzung mit xanthan-lyase- und endoglucanase-varianten mit verbesserter stabilität |
WO2022171872A1 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Novozymes A/S | Stabilized biological detergents |
WO2022171780A2 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
EP4305146A1 (de) | 2021-03-12 | 2024-01-17 | Novozymes A/S | Polypeptidvarianten |
EP4060036A1 (de) | 2021-03-15 | 2022-09-21 | Novozymes A/S | Polypeptidvarianten |
WO2022194673A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-22 | Novozymes A/S | Dnase variants |
EP4314222A1 (de) | 2021-03-26 | 2024-02-07 | Novozymes A/S | Waschmittelzusammensetzung mit reduziertem polymergehalt |
EP4359518A1 (de) | 2021-06-23 | 2024-05-01 | Novozymes A/S | Alpha-amylase-polypeptide |
CN117881772A (zh) | 2021-08-20 | 2024-04-12 | 丹尼斯科美国公司 | 编码新型核酸酶的多核苷酸、其组合物及其从蛋白质制剂中消除dna的方法 |
CN117957300A (zh) | 2021-09-20 | 2024-04-30 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
CA3232987A1 (en) | 2021-09-27 | 2023-03-30 | Marion BERNARDEAU | Feed additive compositions and methods for using the same |
CN118202030A (zh) | 2021-10-13 | 2024-06-14 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含聚合物的组合物、聚合物及其用途 |
WO2023066741A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Basf Se | Phosphate-free composition and methods for their manufacture and use |
WO2023088776A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
WO2023088761A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
WO2023088777A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
CA3241094A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Jonathan LASSILA | Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases |
WO2023110599A2 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Basf Se | Compositions and their applications |
WO2023116569A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Novozymes A/S | Composition comprising a lipase and a booster |
EP4206309A1 (de) | 2021-12-30 | 2023-07-05 | Novozymes A/S | Proteinpartikel mit verbesserter weisse |
WO2023148086A1 (en) | 2022-02-04 | 2023-08-10 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
EP4234664A1 (de) | 2022-02-24 | 2023-08-30 | Evonik Operations GmbH | Zusammensetzung mit glucolipiden und enzymen |
WO2023165507A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Novozymes A/S | Use of xyloglucanase for improvement of sustainability of detergents |
WO2023165950A1 (en) | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Novozymes A/S | Dnase variants and compositions |
WO2023194204A1 (en) | 2022-04-08 | 2023-10-12 | Novozymes A/S | Hexosaminidase variants and compositions |
WO2023227331A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition comprising a specific methyl ester ethoxylate surfactant and a lipase |
WO2023227332A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an alkoxylated zwitterionic polyamine polymer and a protease |
WO2023227335A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Liquid composition comprising linear alkyl benzene sulphonate, methyl ester ethoxylate and alkoxylated zwitterionic polyamine polymer |
WO2023227356A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition containing enzyme |
WO2023227375A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an aminocarboxylate, an organic acid and a fragrance |
WO2023227421A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an alkoxylated zwitterionic polyamine polymer, and a fragrance |
CN114836408B (zh) * | 2022-05-28 | 2023-09-19 | 湖北大学 | 含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用 |
WO2023233028A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry detergent product |
WO2023247348A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2023247664A2 (en) | 2022-06-24 | 2023-12-28 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions comprising such lipase variants |
WO2024012894A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Basf Se | Alkanolamine formates for enzyme stabilization in liquid formulations |
WO2024056334A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
WO2024056333A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
WO2024056331A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
WO2024056278A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
EP4349943A1 (de) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Flüssigwaschmittelzusammensetzung |
EP4349942A1 (de) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Flüssigwaschmittelzusammensetzung |
EP4349947A1 (de) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Flüssigwaschmittelzusammensetzung |
EP4349948A1 (de) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Flüssigwaschmittelzusammensetzung |
EP4349944A1 (de) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Flüssigwaschmittelzusammensetzung |
EP4349946A1 (de) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Einheitsdosisprodukt zur behandlung von textilien |
EP4349945A1 (de) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Flüssigwaschmittelzusammensetzung |
WO2024083589A1 (en) | 2022-10-18 | 2024-04-25 | Basf Se | Detergent compositions, polymers and methods of manufacturing the same |
EP4361239A1 (de) | 2022-10-25 | 2024-05-01 | Unilever IP Holdings B.V. | Flüssigwaschmittelzusammensetzung |
WO2024088716A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-02 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition |
WO2024088706A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-02 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition |
WO2024115106A1 (en) | 2022-11-29 | 2024-06-06 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition |
WO2024115754A1 (en) | 2022-12-02 | 2024-06-06 | Basf Se | Aqueous compositions containing polyalkoxylates, polyalkoxylates, and use |
WO2024121058A1 (en) | 2022-12-05 | 2024-06-13 | Novozymes A/S | A composition comprising a lipase and a peptide |
WO2024124013A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | International N&H Denmark Aps | Feed formulations comprising a phytase for dairy ruminant animals |
WO2024126483A1 (en) | 2022-12-14 | 2024-06-20 | Novozymes A/S | Improved lipase (gcl1) variants |
EP4389864A1 (de) | 2022-12-20 | 2024-06-26 | Basf Se | Cutinasen |
WO2024133344A1 (en) | 2022-12-20 | 2024-06-27 | Novozymes A/S | A method for providing a candidate biological sequence and related electronic device |
WO2024131880A2 (en) | 2022-12-23 | 2024-06-27 | Novozymes A/S | Detergent composition comprising catalase and amylase |
Family Cites Families (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1234445A (de) | 1967-10-03 | 1971-06-03 | ||
US3929887A (en) | 1970-05-18 | 1975-12-30 | Endo Lab | Alkylenepoly(aralkylamines) and the salts thereof |
US4760025A (en) | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
NZ208612A (en) * | 1983-06-24 | 1991-09-25 | Genentech Inc | Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations |
US5700676A (en) * | 1984-05-29 | 1997-12-23 | Genencor International Inc. | Modified subtilisins having amino acid alterations |
US5972682A (en) * | 1984-05-29 | 1999-10-26 | Genencor International, Inc. | Enzymatically active modified subtilisins |
US4752585A (en) * | 1985-12-17 | 1988-06-21 | Cetus Corporation | Oxidation-resistant muteins |
WO1987004461A1 (en) * | 1986-01-15 | 1987-07-30 | Amgen | THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF |
US5013657A (en) * | 1988-04-12 | 1991-05-07 | Bryan Philip N | Subtilisin mutations |
US4990452A (en) * | 1986-02-12 | 1991-02-05 | Genex Corporation | Combining mutations for stabilization of subtilisin |
JPS63502959A (ja) * | 1986-02-12 | 1988-11-02 | ジェネックス、コ−ポレ−ション | 突然変異誘発及びスクリ−ニング方法並びに生成物 |
US4980288A (en) * | 1986-02-12 | 1990-12-25 | Genex Corporation | Subtilisin with increased thermal stability |
IE65767B1 (en) * | 1986-04-30 | 1995-11-15 | Genencor Int | Non-human carbonyl hydrolase mutants DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors |
JP3026567B2 (ja) * | 1987-02-27 | 2000-03-27 | ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド | 分子のクローニング及びタンパク分解酵素をコードする遺伝子の発現 |
EP0479396B1 (de) * | 1987-02-27 | 1999-06-09 | Genencor International, Inc. | Transformation von alkalophilen Bazillus-Stämmen |
ATE184316T1 (de) * | 1987-04-06 | 1999-09-15 | Novo Nordisk As | Regelung von elektrostatischen interaktionen an metallionen-bindungsstellen zur stabilisierung von proteinen |
US4914031A (en) * | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
US5122449A (en) * | 1988-10-07 | 1992-06-16 | Eastman Kodak Company | Use of a protease in the extraction of chlamydial, gonococcal and herpes antigens |
US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
DK97190D0 (da) * | 1990-04-19 | 1990-04-19 | Novo Nordisk As | Oxidationsstabile detergentenzymer |
US5766898A (en) * | 1990-12-05 | 1998-06-16 | Novo Nordisk A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
EP0583339B1 (de) * | 1991-05-01 | 1998-07-08 | Novo Nordisk A/S | Stabilisierte enzyme und waschmittelzusammensetzungen |
US6682924B1 (en) * | 1995-05-05 | 2004-01-27 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
US5837517A (en) * | 1995-05-05 | 1998-11-17 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
CA2270180C (en) * | 1996-11-04 | 2011-01-11 | Novo Nordisk A/S | Subtilase variants and compositions |
EP1012251A1 (de) * | 1997-08-29 | 2000-06-28 | Novo Nordisk A/S | Varianten der protease und zusammensetzungen |
AU8798198A (en) * | 1997-08-29 | 1999-03-22 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
EP1032655B1 (de) * | 1997-11-21 | 2005-06-29 | Novozymes A/S | Protease-varianten und zusammensetzungen |
US6780629B2 (en) * | 1997-11-21 | 2004-08-24 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
US6773907B2 (en) * | 1997-11-21 | 2004-08-10 | Peter Kamp Hansen | Subtilase enzymes |
US6777218B1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
WO2001075087A2 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Maxygen, Inc. | Subtilisin variants |
AU2001254623A1 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-12 | Novozymes A/S | Production and use of protein variants having modified immunogenicity |
US6799287B1 (en) | 2000-05-01 | 2004-09-28 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Method and apparatus for verifying error correcting codes |
US7109016B2 (en) * | 2000-08-21 | 2006-09-19 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
US6893855B2 (en) * | 2000-10-13 | 2005-05-17 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
DK200101090A (da) * | 2001-07-12 | 2001-08-16 | Novozymes As | Subtilase variants |
US7888093B2 (en) * | 2002-11-06 | 2011-02-15 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
US20070161531A1 (en) * | 2005-07-08 | 2007-07-12 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
-
1988
- 1988-01-07 DK DK006488A patent/DK6488D0/da not_active Application Discontinuation
-
1989
- 1989-01-06 EP EP04025116A patent/EP1498481A1/de not_active Withdrawn
- 1989-01-06 EP EP95107678A patent/EP0675196A3/de not_active Ceased
- 1989-01-06 AT AT89901711T patent/ATE136329T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-01-06 WO PCT/DK1989/000002 patent/WO1989006279A1/en active IP Right Grant
- 1989-01-06 DE DE68926163T patent/DE68926163T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-06 JP JP1501511A patent/JPH0675504B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-06 EP EP89901711A patent/EP0396608B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-06 EP EP05004172A patent/EP1538204A3/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-07-04 DK DK199001612A patent/DK175697B1/da not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-02-10 JP JP6016202A patent/JP2726799B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/486,415 patent/US5741694A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/486,846 patent/US6506589B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-29 DK DK199600361A patent/DK176102B1/da not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-10-01 JP JP9268984A patent/JPH10113179A/ja active Pending
-
2002
- 2002-11-27 US US10/306,089 patent/US6808913B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-05 US US10/310,730 patent/US6835821B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-06 US US10/313,853 patent/US6908991B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-07-21 US US10/896,177 patent/US20050003986A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2726799B2 (ja) | 1998-03-11 |
EP0675196A2 (de) | 1995-10-04 |
JPH0675504B2 (ja) | 1994-09-28 |
JPH10113179A (ja) | 1998-05-06 |
EP1498481A1 (de) | 2005-01-19 |
DK161290D0 (da) | 1990-07-04 |
US20050003986A1 (en) | 2005-01-06 |
ATE136329T1 (de) | 1996-04-15 |
EP0396608B1 (de) | 1996-04-03 |
US5741694A (en) | 1998-04-21 |
DK161290A (da) | 1990-09-07 |
JPH03503477A (ja) | 1991-08-08 |
US20030148495A1 (en) | 2003-08-07 |
US6808913B2 (en) | 2004-10-26 |
DE68926163D1 (de) | 1996-05-09 |
US20030175933A1 (en) | 2003-09-18 |
DK6488D0 (da) | 1988-01-07 |
DK176102B1 (da) | 2006-06-12 |
US20030186378A1 (en) | 2003-10-02 |
EP0675196A3 (de) | 1995-11-22 |
EP1538204A2 (de) | 2005-06-08 |
DK36196A (da) | 1996-03-29 |
WO1989006279A1 (en) | 1989-07-13 |
EP0396608A1 (de) | 1990-11-14 |
DK175697B1 (da) | 2005-01-24 |
EP1538204A3 (de) | 2007-07-04 |
JPH06292577A (ja) | 1994-10-21 |
US6908991B2 (en) | 2005-06-21 |
US6835821B2 (en) | 2004-12-28 |
US6506589B1 (en) | 2003-01-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE68926163T2 (de) | Mutierte subtilisingene | |
EP1456368B1 (de) | Neue alkalische protease aus bacillus sp. (dsm 14392) und wasch- und reinigungsmittel enthaltend diese neue alkalische protease | |
DE3486139T2 (de) | Bacillus, der weder Subtilisin noch neutrale Protease ausscheiden kann. | |
DE68912359T2 (de) | Proteolytische Enzyme und ihre Verwendung in Waschmitteln. | |
EP1456366B1 (de) | Neue alkalische protease aus bacillus gibsonii (dsm 14393) und wasch- und reinigungsmittel enthaltend diese neue alkalische protease | |
DE69226182T2 (de) | Stabilisierte enzyme und waschmittelzusammensetzungen | |
DE69212390T2 (de) | Stabilisierte Enzyme enthaltende Waschmittelzusammensetzungen | |
DE69033644T2 (de) | Mutierte subtilisin-protease | |
DE3750916T2 (de) | Mutante einer nicht menschlichen Carbonyl-Hydrolase, für diese kodierende DNS-Sequenzen und Vektoren und durch diese Vektoren transformierte Wirte. | |
EP0415296B2 (de) | Neue hochalkalische Proteasen | |
DE69839076T2 (de) | Proteasevarianten und zusammensetzungen | |
DE69833031T2 (de) | Alkalische protease | |
DE69034159T2 (de) | Enzymatische Waschmittelzusammensetzungen | |
EP0995801A1 (de) | Verfahren zur Verbesserung des Stabilität von Enzymen und stabilisierte Enzyme | |
DE69128094T2 (de) | Enzym-mutanten mit einer geringen variation der molekularladung über einen ph-bereich | |
EP0572992A1 (de) | Alkalische Proteasen aus Bacillus pumilus | |
EP3440203B1 (de) | Neue protease mit verbesserter waschleistung | |
DE4106525A1 (de) | Verfahren zur verbesserung der stabilitaet von hochalkalischen proteasen | |
DE69334177T2 (de) | Hochalkalische serinproteasen | |
EP0610808A2 (de) | Verbesserte hochalkalische Proteasen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: NOVOZYMES A/S, BAGSVAERD, DK |
|
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |