JP2726799B2 - 変異ズブチリシン - Google Patents
変異ズブチリシンInfo
- Publication number
- JP2726799B2 JP2726799B2 JP6016202A JP1620294A JP2726799B2 JP 2726799 B2 JP2726799 B2 JP 2726799B2 JP 6016202 A JP6016202 A JP 6016202A JP 1620294 A JP1620294 A JP 1620294A JP 2726799 B2 JP2726799 B2 JP 2726799B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- residue
- substituted
- subtilisin enzyme
- mutant subtilisin
- subtilisin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ズブチリシン（subtil
isin) 酵素の化学的特性の変化を生じさせるズブチリシ
ン遺伝子の変異に関する。ズブチリシン遺伝子の特異的
核酸での変異はアミノ酸置換を生じ、その結果、酵素の
機能変換が起こる。これらの変異酵素の中には、産業上
の用途、特に洗浄剤工業において有利な物性を示して、
酸化に対してより安定で、プロテアーゼ活性がより大き
く、そして改善された洗浄性を示すズブチリシンを生成
するものがある。
isin) 酵素の化学的特性の変化を生じさせるズブチリシ
ン遺伝子の変異に関する。ズブチリシン遺伝子の特異的
核酸での変異はアミノ酸置換を生じ、その結果、酵素の
機能変換が起こる。これらの変異酵素の中には、産業上
の用途、特に洗浄剤工業において有利な物性を示して、
酸化に対してより安定で、プロテアーゼ活性がより大き
く、そして改善された洗浄性を示すズブチリシンを生成
するものがある。
【０００２】
２．１．桿菌プロテアーゼ タンパク質基質におけるアミド結合を開裂する酵素は、
プロテアーゼ、即ち、ペプチダーゼ（相互に交換して用
いられる）として分類される〔ワルシュ（Walsh)等、１
９７９年、「酵素反応機構（Enzymatic Reaction Mecha
nisms)」、ダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・カ
ンパニー (W.H.and Company)、サンフランシスコ、第３
章参照〕。桿菌種の細菌は、２種類の細胞外種のプロテ
アーゼ、即ち、中性又はメタロプロテアーゼと、機能的
にはズブチリシンと呼ばれるセリンエンドペプチダーゼ
であるアルカリ性プロテアーゼを分泌する。
プロテアーゼ、即ち、ペプチダーゼ（相互に交換して用
いられる）として分類される〔ワルシュ（Walsh)等、１
９７９年、「酵素反応機構（Enzymatic Reaction Mecha
nisms)」、ダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・カ
ンパニー (W.H.and Company)、サンフランシスコ、第３
章参照〕。桿菌種の細菌は、２種類の細胞外種のプロテ
アーゼ、即ち、中性又はメタロプロテアーゼと、機能的
にはズブチリシンと呼ばれるセリンエンドペプチダーゼ
であるアルカリ性プロテアーゼを分泌する。
【０００３】これらのプロテアーゼの分泌は細菌の成長
周期と連結しており、芽抱形成も生じるとき、定常期に
プロテアーゼの最大の発現が生じる。ジョリフェ（Joli
ffe)等（１９８０年、ジェイ・バクテリアル（J.Bacter
ial), 141 : 1199〜1208) は、桿菌プロテアーゼは細胞
壁ターンオーバーにおいて機能を果たすことを教示して
いる。
周期と連結しており、芽抱形成も生じるとき、定常期に
プロテアーゼの最大の発現が生じる。ジョリフェ（Joli
ffe)等（１９８０年、ジェイ・バクテリアル（J.Bacter
ial), 141 : 1199〜1208) は、桿菌プロテアーゼは細胞
壁ターンオーバーにおいて機能を果たすことを教示して
いる。
【０００４】２．２．ズブチリシン セリンプロテアーゼは、活性部位に必須セリン残基があ
るペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である〔ホワ
イト（White)、ハンドラー (Handler)及びスミス (Smit
h)、１９７３年、「生化学の原理（Principles of Bioc
hemistry) 」、第５版、マグローヒル・ブック・カンパ
ニー、ニューヨーク、第２７１〜２７２頁〕。
るペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である〔ホワ
イト（White)、ハンドラー (Handler)及びスミス (Smit
h)、１９７３年、「生化学の原理（Principles of Bioc
hemistry) 」、第５版、マグローヒル・ブック・カンパ
ニー、ニューヨーク、第２７１〜２７２頁〕。
【０００５】セリンプロテアーゼの分子量は、２５，０
００〜３０，０００の範囲である。セリンプロテアーゼ
は、ジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害さ
れるが、メタロプロテアーゼとは異なり、エチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）耐性がある〔但し、カルシウム
イオンにより高温で安定化される〕。また、セリンプロ
テアーゼは、単純末端エステル類を加水分解し、そして
真核性キモトリプシンと活性が類似している。
００〜３０，０００の範囲である。セリンプロテアーゼ
は、ジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害さ
れるが、メタロプロテアーゼとは異なり、エチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）耐性がある〔但し、カルシウム
イオンにより高温で安定化される〕。また、セリンプロ
テアーゼは、単純末端エステル類を加水分解し、そして
真核性キモトリプシンと活性が類似している。
【０００６】セリンプロテアーゼの代替用語であるアル
カリ性プロテアーゼは、セリンプロテアーゼの最適pHが
９．０〜１１．０と高いことを反映した用語である〔プ
リースト（Priest) 、１９７７年、バクテリオロジカル
・レビュー（Bacteriological Rev.),41,711〜753 〕。
ズブチリシンは、グラム陽性菌又はカビにより産生され
るセリンプロテアーゼである。多種多様のズブチリシン
が同定され、そして少なくとも８種のズブチリシンのア
ミノ酸配列が決定された。
カリ性プロテアーゼは、セリンプロテアーゼの最適pHが
９．０〜１１．０と高いことを反映した用語である〔プ
リースト（Priest) 、１９７７年、バクテリオロジカル
・レビュー（Bacteriological Rev.),41,711〜753 〕。
ズブチリシンは、グラム陽性菌又はカビにより産生され
るセリンプロテアーゼである。多種多様のズブチリシン
が同定され、そして少なくとも８種のズブチリシンのア
ミノ酸配列が決定された。
【０００７】これらには、細菌株由来の６種のズブチリ
シン、即ち、ズブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰ
Ｎ′、ズブチリシンカールズベルグ (subtilisin Carls
berg)、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミノサッカ
リチカス及びメサンテリコペプチダーゼ（mesentericop
eptidase) 〔栗原等、1972年、ジェイ・バイオル・ケム
（J.Biol.Chem.),247 : 5629〜5631；スタール (Stahl)
及びフェラリ (Ferrari), 1984、ジェイ・バクテリオル
(J.Bacteriol), 158 :411〜418;バサンサ (Vasantha)
等、1984年、ジェイ・バクテリオル (J.Bacteriol),15
9:811〜819 、ジャコブズ等、1985年、核酸研究 (Nucl.
Acids Res.), 13: 8913〜8926；ネドコフ（Nedkov)
等、1985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホッペ−
セイラー（Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :421〜430 ；
スベンドセン（Svendsen) 等、1986年、フェブス・レタ
ー (FEBS Lett), 196 :228〜232)〕と、
シン、即ち、ズブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰ
Ｎ′、ズブチリシンカールズベルグ (subtilisin Carls
berg)、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミノサッカ
リチカス及びメサンテリコペプチダーゼ（mesentericop
eptidase) 〔栗原等、1972年、ジェイ・バイオル・ケム
（J.Biol.Chem.),247 : 5629〜5631；スタール (Stahl)
及びフェラリ (Ferrari), 1984、ジェイ・バクテリオル
(J.Bacteriol), 158 :411〜418;バサンサ (Vasantha)
等、1984年、ジェイ・バクテリオル (J.Bacteriol),15
9:811〜819 、ジャコブズ等、1985年、核酸研究 (Nucl.
Acids Res.), 13: 8913〜8926；ネドコフ（Nedkov)
等、1985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホッペ−
セイラー（Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :421〜430 ；
スベンドセン（Svendsen) 等、1986年、フェブス・レタ
ー (FEBS Lett), 196 :228〜232)〕と、
【０００８】２種のカビズブチリシン、即ち、サーモア
クチヨミセス・バルガリス（Thermoactinymyces vulgar
is) 由来のズブチリシンサーミターゼ〔メロウン（Melo
un)等、1985年、フェブス・レター (FEBS Lett), 183 :
195〜200 〕及びトリチラウム・アルブム（Tritirachiu
m album) 〔ジェニ−（Janey)及びメイヤー (Mayer)、1
985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホッペ−セイ
ラー (Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :584〜492 〕が含
まれる。
クチヨミセス・バルガリス（Thermoactinymyces vulgar
is) 由来のズブチリシンサーミターゼ〔メロウン（Melo
un)等、1985年、フェブス・レター (FEBS Lett), 183 :
195〜200 〕及びトリチラウム・アルブム（Tritirachiu
m album) 〔ジェニ−（Janey)及びメイヤー (Mayer)、1
985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホッペ−セイ
ラー (Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :584〜492 〕が含
まれる。
【０００９】ズブチリシンは、物理的にも化学的にも十
分に特性決定がなされている。これらの酵素の一次構造
（アミノ酸配列）の知見の他に、ズブチリシンの５０を
超える高分解能Ｘ線構造が測定され、基質の結合、転移
状態、生成物、３種の異なるプロテアーゼ阻害因子を示
すとともに、自然変異における構造上の重要性が明らか
にされた〔クラウト（Kraut)、1977年、アン・レブ・バ
イオケム (Ann.Rev.Biochem.),46,331〜358 〕。
分に特性決定がなされている。これらの酵素の一次構造
（アミノ酸配列）の知見の他に、ズブチリシンの５０を
超える高分解能Ｘ線構造が測定され、基質の結合、転移
状態、生成物、３種の異なるプロテアーゼ阻害因子を示
すとともに、自然変異における構造上の重要性が明らか
にされた〔クラウト（Kraut)、1977年、アン・レブ・バ
イオケム (Ann.Rev.Biochem.),46,331〜358 〕。
【００１０】ズブチリシンのランダム変異及び部位特異
的変異は、両方とも、酵素の物理的性質及び化学的性質
の知見並びに論文に掲載されたズブチリシンの触媒活
性、基質特異性、三次構造等に関する情報に起因するも
のである〔ウエルズ（Wells)等、1987年、プロク・ナト
ル・アカド・ (Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、84：1219
〜1223；ウエルズ等、1986年、フィル・トランス・アー
ル・ソサ・ロンド・エイ(Phil.Trans.R.Soc.Lond.A.),3
17 :415〜423;ワング (Hwang)及びワーシェル (Warshe
l)、1987年、バイオケム (Biochem.),26: 2669〜2673；
ラオ（Rao)等、1987年、ネーチャー、328 :551〜554 〕
的変異は、両方とも、酵素の物理的性質及び化学的性質
の知見並びに論文に掲載されたズブチリシンの触媒活
性、基質特異性、三次構造等に関する情報に起因するも
のである〔ウエルズ（Wells)等、1987年、プロク・ナト
ル・アカド・ (Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、84：1219
〜1223；ウエルズ等、1986年、フィル・トランス・アー
ル・ソサ・ロンド・エイ(Phil.Trans.R.Soc.Lond.A.),3
17 :415〜423;ワング (Hwang)及びワーシェル (Warshe
l)、1987年、バイオケム (Biochem.),26: 2669〜2673；
ラオ（Rao)等、1987年、ネーチャー、328 :551〜554 〕
【００１１】２．３．ズブチリシンの産業上の用途 ズブチリシンは、タンパク様の汚れを除去するのに有効
であることから、産業上、特に洗浄剤配合物において多
大な実用性があることが判明した。しかしながら、これ
らの酵素が効果的であるには、洗浄条件化で活性を有す
る必要があるだけでなく、貯蔵中に他の洗浄剤成分と適
合しなければならない。
であることから、産業上、特に洗浄剤配合物において多
大な実用性があることが判明した。しかしながら、これ
らの酵素が効果的であるには、洗浄条件化で活性を有す
る必要があるだけでなく、貯蔵中に他の洗浄剤成分と適
合しなければならない。
【００１２】例えば、ズブチリシンは、澱粉に対して活
性なアミラーゼとの組み合わせ、セルロース性物質を消
化するセルラーゼとの組み合わせ、脂肪に対して活性な
リパーゼとの組み合わせ、ペプチドに対して活性なペプ
チダーゼとの組み合わせ、及び尿による汚れに対して効
果的なウレアーゼとの組み合わせで用いられることがあ
る。配合物は他の酵素をズブチリシンによる消化から保
護しなければならないだけでなく、ズブチリシンは酸化
力、カルシウム結合性、洗浄力及び高pHの非酵素洗浄剤
成分に関して安定でなければならない。酵素が安定して
存在できる能力は、洗浄性と称されることがよくある。
性なアミラーゼとの組み合わせ、セルロース性物質を消
化するセルラーゼとの組み合わせ、脂肪に対して活性な
リパーゼとの組み合わせ、ペプチドに対して活性なペプ
チダーゼとの組み合わせ、及び尿による汚れに対して効
果的なウレアーゼとの組み合わせで用いられることがあ
る。配合物は他の酵素をズブチリシンによる消化から保
護しなければならないだけでなく、ズブチリシンは酸化
力、カルシウム結合性、洗浄力及び高pHの非酵素洗浄剤
成分に関して安定でなければならない。酵素が安定して
存在できる能力は、洗浄性と称されることがよくある。
【００１３】
【発明の概要】本発明は、ズブチリシン遺伝子の変異に
関し、これらの変異の中にはズブチリシン酵素の化学的
特性を変更させるものもある。変異は、ズブチリシン遺
伝子の特異的核酸で生じ、そして種々の具体的実施態様
では、変異酵素の化学的性質が変化して、酸化安定性が
増加し、タンパク質分解活性が増加し、洗浄性が向上し
たりするが、これらには限定されない。
関し、これらの変異の中にはズブチリシン酵素の化学的
特性を変更させるものもある。変異は、ズブチリシン遺
伝子の特異的核酸で生じ、そして種々の具体的実施態様
では、変異酵素の化学的性質が変化して、酸化安定性が
増加し、タンパク質分解活性が増加し、洗浄性が向上し
たりするが、これらには限定されない。
【００１４】また、本発明は、バシラス・レンタス（Ba
cillus lentus)変異体、ズブチリシン１４７及びズブチ
リシン３０９由来の２種のプロテアーゼのアミノ酸配列
及びＤＮＡ配列、さらにこれらの遺伝子の変異及び対応
する変異酵素に関するが、これらのには限定されない。
サイト特異的変異では、特に洗浄剤及び食品技術分野に
おける多数の産業上の用途に適するようにすることので
きる変異ズブチリシン酵素を効果的に産生することがで
きる。また、本発明は、部分的には、酸化安定性の向
上、プロテアーゼ活性の増加及び／又は洗浄性の向上を
示すズブチリシン３０９遺伝子の変異体に関するがこれ
らには限定されない。
cillus lentus)変異体、ズブチリシン１４７及びズブチ
リシン３０９由来の２種のプロテアーゼのアミノ酸配列
及びＤＮＡ配列、さらにこれらの遺伝子の変異及び対応
する変異酵素に関するが、これらのには限定されない。
サイト特異的変異では、特に洗浄剤及び食品技術分野に
おける多数の産業上の用途に適するようにすることので
きる変異ズブチリシン酵素を効果的に産生することがで
きる。また、本発明は、部分的には、酸化安定性の向
上、プロテアーゼ活性の増加及び／又は洗浄性の向上を
示すズブチリシン３０９遺伝子の変異体に関するがこれ
らには限定されない。
【００１５】３．１．略語 Ａ＝Ａｌａ＝アラニン Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸 Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸 Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン
【００１６】
【発明の具体的な説明】本発明は、ズブチリシン遺伝子
の変異に関し、これらの変異の中にはズブチリシン酵素
の化学的特性を変化させるものもある。変異は特異的核
酸で生じるので、ズブチリシンの形態は産業上の用途の
必要性に合わせて設計できる。本発明は、部分的には、
ズブチリシン遺伝子における特異的核酸の変異により、
性質が変換された酵素が得られるという知見に基づいて
いる。種々の実施態様において、酸化安定性の向上、プ
ロテアーゼ活性の増加又は洗浄性の向上した酵素を生成
できる。
の変異に関し、これらの変異の中にはズブチリシン酵素
の化学的特性を変化させるものもある。変異は特異的核
酸で生じるので、ズブチリシンの形態は産業上の用途の
必要性に合わせて設計できる。本発明は、部分的には、
ズブチリシン遺伝子における特異的核酸の変異により、
性質が変換された酵素が得られるという知見に基づいて
いる。種々の実施態様において、酸化安定性の向上、プ
ロテアーゼ活性の増加又は洗浄性の向上した酵素を生成
できる。
【００１７】説明を明瞭に行うために、本発明を以下の
４つ部分に分けて説明するが、本発明はこれらには限定
されない：（ａ）公知のズブチリシン及びズブチリシン
１４７及びズブチリシン３０９の化学構造；（ｂ）ズブ
チリシン遺伝子における変異を生じさせる方法；（ｃ）
ズブチリシンの変異体の発現；及び（ｄ）所望の化学的
性質についてのズブチリシン変異のスクリーニング。
４つ部分に分けて説明するが、本発明はこれらには限定
されない：（ａ）公知のズブチリシン及びズブチリシン
１４７及びズブチリシン３０９の化学構造；（ｂ）ズブ
チリシン遺伝子における変異を生じさせる方法；（ｃ）
ズブチリシンの変異体の発現；及び（ｄ）所望の化学的
性質についてのズブチリシン変異のスクリーニング。
【００１８】５．１．公知のズブチリシン及びズブチリ
シン１４７及びズブチリシン３０９の化学構造 種々の起源からのズブチリシンの配列分析から、一次ア
ミノ酸配列の機能的重要性が分かり、そして慎重に変更
した機能を用いて新規な変異体を生成することができ
る。異種の形態のズブチリシンのアミノ酸配列を、物理
的性質又は化学的性質を対比しながら比較すると、有用
な変異酵素を産生すると思われる特異的な標的領域があ
ることが分かる。
シン１４７及びズブチリシン３０９の化学構造 種々の起源からのズブチリシンの配列分析から、一次ア
ミノ酸配列の機能的重要性が分かり、そして慎重に変更
した機能を用いて新規な変異体を生成することができ
る。異種の形態のズブチリシンのアミノ酸配列を、物理
的性質又は化学的性質を対比しながら比較すると、有用
な変異酵素を産生すると思われる特異的な標的領域があ
ることが分かる。
【００１９】ズブチリシンのアミノ酸配列は、少なくと
も８種類知られている。これらには、細菌株由来の６種
のズブチリシン、即ち、ズブチリシン１６８、ズブチリ
シンＢＰＮ′、ズブチリシンカールズベルグ（subtilis
in Carlsberg) 、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミ
ノサッカリチカス及びメサンテリコペプチダーゼ（mese
ntericopeptidase) 〔栗原等、1972年、ジェイ・バイオ
ル・ケム（J.Biol.Chem.),247 : 5629〜5631；スタール
(Stahl)及びフェラリ (Ferrari), 1984、ジェイ・バク
テリオル (J.Bacteriol), 158 :411〜418;バサンサ (Va
santha) 等、1984年、ジェイ・バクテリオル (J.Bacter
iol), 159 :811〜819;ジャコブス（Jacobs) 等、核酸研
究 (Nucl.Acids Res.), 13: 8913〜8926；ネドコフ（Ne
dkov) 等、1985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホ
ッペ−セイラー（Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :421〜
430 ；スベンドセン（Svendsen) 等、1986年、フェブス
・レター (FEBS Lett), 196 :228〜232)〕と、
も８種類知られている。これらには、細菌株由来の６種
のズブチリシン、即ち、ズブチリシン１６８、ズブチリ
シンＢＰＮ′、ズブチリシンカールズベルグ（subtilis
in Carlsberg) 、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミ
ノサッカリチカス及びメサンテリコペプチダーゼ（mese
ntericopeptidase) 〔栗原等、1972年、ジェイ・バイオ
ル・ケム（J.Biol.Chem.),247 : 5629〜5631；スタール
(Stahl)及びフェラリ (Ferrari), 1984、ジェイ・バク
テリオル (J.Bacteriol), 158 :411〜418;バサンサ (Va
santha) 等、1984年、ジェイ・バクテリオル (J.Bacter
iol), 159 :811〜819;ジャコブス（Jacobs) 等、核酸研
究 (Nucl.Acids Res.), 13: 8913〜8926；ネドコフ（Ne
dkov) 等、1985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホ
ッペ−セイラー（Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :421〜
430 ；スベンドセン（Svendsen) 等、1986年、フェブス
・レター (FEBS Lett), 196 :228〜232)〕と、
【００２０】２種のカビズブチリシン、即ち、サーモア
クチヨミセス・バルガリス（Thermoactinymyces vulgar
is) 由来のズブチリシンサーミターゼ〔メロウン（Melo
un)等、1985年、フェブス・レター (FEBS Lett), 183 :
195〜200 〕及びトリチラウム・アルブム・リンバー (T
ritirachium album limber)由来のプロテアーゼｋ〔ジ
ェニ−（Janey)及びメイヤー (Mayer)、1985年、バイオ
ロジカル・ケミストリー・ホッペ−セイラー (Biol.Che
m.Hoppe-Seyler),366 :485〜492 〕が含まれる。
クチヨミセス・バルガリス（Thermoactinymyces vulgar
is) 由来のズブチリシンサーミターゼ〔メロウン（Melo
un)等、1985年、フェブス・レター (FEBS Lett), 183 :
195〜200 〕及びトリチラウム・アルブム・リンバー (T
ritirachium album limber)由来のプロテアーゼｋ〔ジ
ェニ−（Janey)及びメイヤー (Mayer)、1985年、バイオ
ロジカル・ケミストリー・ホッペ−セイラー (Biol.Che
m.Hoppe-Seyler),366 :485〜492 〕が含まれる。
【００２１】本発明に関連して、更に２種のセリンプロ
テアーゼのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列が明らかとなっ
た。これらのプロテアーゼは、２種のバシラス・レンタ
ス変異体（１４７及び３０９）に由来のものである。こ
れらは、それぞれバシラス・レンタス（Bacillus lentu
s)C303、及びバシラス・レンタス（Bacillus lentus)C3
60としてＮＣＩＢにブダペスト条約に基き国際寄託さ
れ、それぞれ、寄託番号ＮＣＩＢ第１０１４７号及びＮ
ＣＩＢ第１０３０９号が与えられた。便宜上、上記の株
により産生したプロテアーゼを、それぞれズブチリシン
１４７及びズブチリシン３０９と命名し、そしてこれら
のタンパク質をコードしている遺伝子をズブチリシン１
４７遺伝子及びズブチリシン３０９遺伝子と称する。
テアーゼのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列が明らかとなっ
た。これらのプロテアーゼは、２種のバシラス・レンタ
ス変異体（１４７及び３０９）に由来のものである。こ
れらは、それぞれバシラス・レンタス（Bacillus lentu
s)C303、及びバシラス・レンタス（Bacillus lentus)C3
60としてＮＣＩＢにブダペスト条約に基き国際寄託さ
れ、それぞれ、寄託番号ＮＣＩＢ第１０１４７号及びＮ
ＣＩＢ第１０３０９号が与えられた。便宜上、上記の株
により産生したプロテアーゼを、それぞれズブチリシン
１４７及びズブチリシン３０９と命名し、そしてこれら
のタンパク質をコードしている遺伝子をズブチリシン１
４７遺伝子及びズブチリシン３０９遺伝子と称する。
【００２２】本発明において使用される用語「ズブチリ
シン物質（subtilisin material)」とは、活性成分とし
てズブチリシンを含有するタンパク様物質を意味する。
本明細書で使用されている用語「セリンプロテアーゼ
（serine protease)」とは、ズブチリシン物質の定義に
従って、ズブチリシン１４７、ズブチリシン３０９、ズ
ブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰＮ′、ズブチリシ
ンカールズベルグ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンア
ミノサッカリチカス、メサンテリコペプチダーゼ、サー
ミターゼ、タンパク質分解酵素Ｋ及びサーモミコラーゼ
に関して上記で述べた配列と少なくとも３０％、好まし
く５０％、より好ましくは８０％のアミノ酸配列の相同
性があるズブチリシンである。これらのセリンプロテア
ーゼは、本明細書において、「相同性セリンプロテアー
ゼ（homologous serine protease) 」とも称する。
シン物質（subtilisin material)」とは、活性成分とし
てズブチリシンを含有するタンパク様物質を意味する。
本明細書で使用されている用語「セリンプロテアーゼ
（serine protease)」とは、ズブチリシン物質の定義に
従って、ズブチリシン１４７、ズブチリシン３０９、ズ
ブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰＮ′、ズブチリシ
ンカールズベルグ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンア
ミノサッカリチカス、メサンテリコペプチダーゼ、サー
ミターゼ、タンパク質分解酵素Ｋ及びサーモミコラーゼ
に関して上記で述べた配列と少なくとも３０％、好まし
く５０％、より好ましくは８０％のアミノ酸配列の相同
性があるズブチリシンである。これらのセリンプロテア
ーゼは、本明細書において、「相同性セリンプロテアー
ゼ（homologous serine protease) 」とも称する。
【００２３】第Ｉ表は、演繹により推定したズブチリシ
ン３０９、ズブチリシン１４７、ズブチリシンＢＰ
Ｎ′、ズブチリシンカールズベルグ及びズブチリシン１
６８のアミノ酸配列を比較したものである〔スピズィー
ゼン（Spizizen) 等、1958年、プロク・ナトル・アカド
・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、44: 1072〜107
8〕。第II表にズブチリシン３０９遺伝子の核酸配列を
示し、そして第III 表にズブチリシン１４７遺伝子の核
酸配列を示す。本発明において、ズブチリシン３０９若
しくは１４７又はそれらの機能的等価物の配列を使用す
ることができる。
ン３０９、ズブチリシン１４７、ズブチリシンＢＰ
Ｎ′、ズブチリシンカールズベルグ及びズブチリシン１
６８のアミノ酸配列を比較したものである〔スピズィー
ゼン（Spizizen) 等、1958年、プロク・ナトル・アカド
・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、44: 1072〜107
8〕。第II表にズブチリシン３０９遺伝子の核酸配列を
示し、そして第III 表にズブチリシン１４７遺伝子の核
酸配列を示す。本発明において、ズブチリシン３０９若
しくは１４７又はそれらの機能的等価物の配列を使用す
ることができる。
【００２４】例えば、第Ｉ表、第II表又は第III 表に示
したズブチリシン３０９の配列又はズブチリシン１４７
の配列を、機能的に等価な分子を提供する置換、付加又
は欠失により変更することができる。本発明において
「実質的に記載される如きアミノ酸配列（又はヌクレオ
チド配列）」とは、具体的に記載されている配列又は該
配列に対してアミノ酸配列レベルで８０％以上の相同性
の範囲内で変更されている配列を意味する。例えば、ヌ
クレオチドをコードしている配列の縮退により、第Ｉ表
に示したのと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他
のＤＮＡ配列を、本発明の実施に用いることができる。
したズブチリシン３０９の配列又はズブチリシン１４７
の配列を、機能的に等価な分子を提供する置換、付加又
は欠失により変更することができる。本発明において
「実質的に記載される如きアミノ酸配列（又はヌクレオ
チド配列）」とは、具体的に記載されている配列又は該
配列に対してアミノ酸配列レベルで８０％以上の相同性
の範囲内で変更されている配列を意味する。例えば、ヌ
クレオチドをコードしている配列の縮退により、第Ｉ表
に示したのと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他
のＤＮＡ配列を、本発明の実施に用いることができる。
【００２５】これらには、配列内に同じ又は機能的に等
価なアミノ酸残基をコードしている異種のコドンの置換
により変更してサイレント変化を生じさせる第II表又は
第III 表に示したズブチリシン３０９又はズブチリシン
１４７の全ての部分又は一部分を含有しているヌクレオ
チド配列が含まれるが、本発明はこれらのものには限定
されない。例えば、配列内の一種以上のアミノ酸残基
を、機能的に等価に作用する同様の極性の別のアミノ酸
で置換することができる。配列内のアミノ酸の置換物
は、別の種類のアミノ酸から選択することができる。
価なアミノ酸残基をコードしている異種のコドンの置換
により変更してサイレント変化を生じさせる第II表又は
第III 表に示したズブチリシン３０９又はズブチリシン
１４７の全ての部分又は一部分を含有しているヌクレオ
チド配列が含まれるが、本発明はこれらのものには限定
されない。例えば、配列内の一種以上のアミノ酸残基
を、機能的に等価に作用する同様の極性の別のアミノ酸
で置換することができる。配列内のアミノ酸の置換物
は、別の種類のアミノ酸から選択することができる。
【００２６】非極性（疎水性) アミノ酸としては、例え
ば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロ
リン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニ
ンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシ
ン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アス
パラギン及びグルタミンが挙げられる。正に帯電した
（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及び
ヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ
酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げら
れる。
ば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロ
リン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニ
ンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシ
ン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アス
パラギン及びグルタミンが挙げられる。正に帯電した
（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及び
ヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ
酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げら
れる。
【００２７】類似性は、アミノ酸配列を比較することに
より測定できる。アミノ酸配列を整列させるには多くの
方法があるが、それらの差がはっきりするのは、関連性
がかなり小さいときだけである。「図解：タンパク質配
列とタンパク質構造（Atlasof Protein Sequence and S
tructure)」、マーガレット・オー・デイホフ（Margare
t O.Dayhoff) 編集、第５巻、補遺２、１９７６年、ナ
ショナル・バイオケミカル・リサーチ・ファウンデーシ
ョン（National Biochemical Research Foundation) 、
ジョウジタウン・ユニバーシティ・メディカルセンター
(Gergetown University Medical Center)、ワシントン
ＤＣ、第３頁以下、〔題名リサーチ・アンド・アライン
（RESEARCH and ALIGN) に記載されている方法により、
関連性が定義できる。
より測定できる。アミノ酸配列を整列させるには多くの
方法があるが、それらの差がはっきりするのは、関連性
がかなり小さいときだけである。「図解：タンパク質配
列とタンパク質構造（Atlasof Protein Sequence and S
tructure)」、マーガレット・オー・デイホフ（Margare
t O.Dayhoff) 編集、第５巻、補遺２、１９７６年、ナ
ショナル・バイオケミカル・リサーチ・ファウンデーシ
ョン（National Biochemical Research Foundation) 、
ジョウジタウン・ユニバーシティ・メディカルセンター
(Gergetown University Medical Center)、ワシントン
ＤＣ、第３頁以下、〔題名リサーチ・アンド・アライン
（RESEARCH and ALIGN) に記載されている方法により、
関連性が定義できる。
【００２８】当該技術分野において周知のように、同族
タンパク質は、アミノ酸の数だけでなく鎖に沿った各ア
ミノ酸の同一性においても異なることがある。即ち、２
つの構造を同一性が最大となるように整列させたとき、
欠失又は挿入が見られることがある。例えば、ズブチリ
シンカールズベルグはアミノ酸の数が２７４個であるの
に対して、ズブチリシンＢＰＮ′は２７５個のアミノ酸
を有している。２つの配列を整列させると、カールズベ
ルグにはズブチリシンＢＰＮ′のＡｓｎ５６に対応する
残基がないことが分かる。
タンパク質は、アミノ酸の数だけでなく鎖に沿った各ア
ミノ酸の同一性においても異なることがある。即ち、２
つの構造を同一性が最大となるように整列させたとき、
欠失又は挿入が見られることがある。例えば、ズブチリ
シンカールズベルグはアミノ酸の数が２７４個であるの
に対して、ズブチリシンＢＰＮ′は２７５個のアミノ酸
を有している。２つの配列を整列させると、カールズベ
ルグにはズブチリシンＢＰＮ′のＡｓｎ５６に対応する
残基がないことが分かる。
【００２９】このように、ギャップを位置５６に記録し
ない限り、カールズベルグのアミノ酸配列はＢＰＮ′と
は非常に異なるように思われる。したがって、カールズ
ベルグ中の残基がＢＰＮ′に対して相同となるように番
号が付けられていれば、ズブチリシンカールズベルグの
位置２１８のＡｓｎに対してＳｅｒを置換することによ
り、熱安定性が増加することが、高度の確信を持って予
測できる。本発明によれば、ズブチリシン３０９及びズ
ブチリシン１４７の配列を、公知のズブチリシン（第Ｉ
表参照）新規に見出したズブチリシンと比較して、所望
の変異の位置を演繹推定できる。これを行うために、比
較するズブチリシンの類似性を測定する必要がある。
ない限り、カールズベルグのアミノ酸配列はＢＰＮ′と
は非常に異なるように思われる。したがって、カールズ
ベルグ中の残基がＢＰＮ′に対して相同となるように番
号が付けられていれば、ズブチリシンカールズベルグの
位置２１８のＡｓｎに対してＳｅｒを置換することによ
り、熱安定性が増加することが、高度の確信を持って予
測できる。本発明によれば、ズブチリシン３０９及びズ
ブチリシン１４７の配列を、公知のズブチリシン（第Ｉ
表参照）新規に見出したズブチリシンと比較して、所望
の変異の位置を演繹推定できる。これを行うために、比
較するズブチリシンの類似性を測定する必要がある。
【００３０】ズブチリシンの一次構造とその物理的性質
との関係を実験で測定したところ、メチオニン−２２２
残基だけでなく活性部位において機能的なアミノ酸、即
ち、アスパラギン酸−３２、ヒスチジン−６４及びセリ
ン−２２１も重要であることが判明した。アスパラギン
−１５５とセリン−２２１は、オキシアニオン結合部位
内にある。これらの位置での変異は、タンパク質分解活
性を減少させると思われる。本発明により、ズブチリシ
ン３０９のアミノ酸配列とズブチリシン１４７のアミノ
酸配列とを互いに比較するとともに、他のズブチリシン
（第II表参照)とも比較した。
との関係を実験で測定したところ、メチオニン−２２２
残基だけでなく活性部位において機能的なアミノ酸、即
ち、アスパラギン酸−３２、ヒスチジン−６４及びセリ
ン−２２１も重要であることが判明した。アスパラギン
−１５５とセリン−２２１は、オキシアニオン結合部位
内にある。これらの位置での変異は、タンパク質分解活
性を減少させると思われる。本発明により、ズブチリシ
ン３０９のアミノ酸配列とズブチリシン１４７のアミノ
酸配列とを互いに比較するとともに、他のズブチリシン
（第II表参照)とも比較した。
【００３１】ズブチリシン３０９又はズブチリシン１４
７と他のズブチリシンとの間で異なる残基を同した。例
えば、残基１５３で、ズブチリシン３０９はセリン残基
を含んでいるのに対して、ズブチリシン１４７、ズブチ
リシンＢＰＮ′、ズブチリシンカールズベルグ及びズブ
チリシン１６８はアラニン残基を含んでいる。したがっ
て、ズブチリシン３０９のセリン１５３残基をアラニン
残基に変更すれば、ズブチリシン３０９の物性は所望の
方法に変化するであろう。同様に、ズブチリシン１４７
は位置２１８にセリン残基を含んでいるのに対して、他
のズブチリシンはアスパラギン残基を発現した。
７と他のズブチリシンとの間で異なる残基を同した。例
えば、残基１５３で、ズブチリシン３０９はセリン残基
を含んでいるのに対して、ズブチリシン１４７、ズブチ
リシンＢＰＮ′、ズブチリシンカールズベルグ及びズブ
チリシン１６８はアラニン残基を含んでいる。したがっ
て、ズブチリシン３０９のセリン１５３残基をアラニン
残基に変更すれば、ズブチリシン３０９の物性は所望の
方法に変化するであろう。同様に、ズブチリシン１４７
は位置２１８にセリン残基を含んでいるのに対して、他
のズブチリシンはアスパラギン残基を発現した。
【００３２】ズブチリシン１４７は他のズブチリシンよ
りも熱安定性が向上しているので、ズブチリシン３０９
のアルカリ性２１８をセリン残基に変異させることによ
り、ズブチリシン３０９の熱安定性が向上する。別の例
を挙げると、Ｔｈｒ７１は活性部位に近接しているの
で、アスパラギン酸等の負に帯電したアミノ酸を導入す
ると、静電反発による酸化攻撃が抑制される可能性があ
る。
りも熱安定性が向上しているので、ズブチリシン３０９
のアルカリ性２１８をセリン残基に変異させることによ
り、ズブチリシン３０９の熱安定性が向上する。別の例
を挙げると、Ｔｈｒ７１は活性部位に近接しているの
で、アスパラギン酸等の負に帯電したアミノ酸を導入す
ると、静電反発による酸化攻撃が抑制される可能性があ
る。
【００３３】ズブチリシンの物性に最も関連していると
思われる部位は、ほとんどのアミノ酸の間にアミノ酸残
基の保存されている所、例えば、上記したＡｓｐ−１５
３及びＡｓｎ−２１８、さらにＴｒｐ−６，Ａｒｇ−１
７０，Ｐｒｏ−１６８，Ｈｉｓ−６７，Ｍｅｔ−１７
５，Ｇｌｙ−２１９，Ａｒｇ−２７５である。他のズブ
チリシンとは異なるアミノ酸を、一致するアミノ酸で置
換するようにして各配列を変異させることにより、より
安定なズブチリシンが得られる。
思われる部位は、ほとんどのアミノ酸の間にアミノ酸残
基の保存されている所、例えば、上記したＡｓｐ−１５
３及びＡｓｎ−２１８、さらにＴｒｐ−６，Ａｒｇ−１
７０，Ｐｒｏ−１６８，Ｈｉｓ−６７，Ｍｅｔ−１７
５，Ｇｌｙ−２１９，Ａｒｇ−２７５である。他のズブ
チリシンとは異なるアミノ酸を、一致するアミノ酸で置
換するようにして各配列を変異させることにより、より
安定なズブチリシンが得られる。
【００３４】ウエルズ等（１９８７年、プロク・ナトル
・アカド・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)米国、04: 1219
〜1223〕は、ズブチリシン基質特異性を工作するため
に、アミノ酸配列と部位特異的変異とを比較した。選択
された基質に対する種々のズブチリシンの触媒活性は、
著しく異なることがある。ウエルズは３個のアミノ酸を
置換したときだけ、バシラス・アミロリクエファシーナ
（B.amyloliquefaciena)ズブチリシン基質特異性が生
じ、未変性状態における触媒効率とは１０〜５０倍異な
る酵素であるバシラス・リッチェンフォーミス（B.lich
enformis) ズブチリシンの基質特異性に似てくることを
示した。
・アカド・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)米国、04: 1219
〜1223〕は、ズブチリシン基質特異性を工作するため
に、アミノ酸配列と部位特異的変異とを比較した。選択
された基質に対する種々のズブチリシンの触媒活性は、
著しく異なることがある。ウエルズは３個のアミノ酸を
置換したときだけ、バシラス・アミロリクエファシーナ
（B.amyloliquefaciena)ズブチリシン基質特異性が生
じ、未変性状態における触媒効率とは１０〜５０倍異な
る酵素であるバシラス・リッチェンフォーミス（B.lich
enformis) ズブチリシンの基質特異性に似てくることを
示した。
【００３５】ズブチリシン１４７とズブチリシン３０９
と他のズブチリシンとを比較したところ、下記の部位を
変異させることによりズブチリシンの物理性質又は化学
的性質を変えることができることが分かった：６，９，
１１〜１２，１９，２５，３６〜３８，５３〜５９，６
７，７１，８９，１０４，１１１，１１５，１２０，１
２１〜１２２，１２４，１２８，１３１，１４０，１５
３〜１６６，１６８，１６９〜１７０，１７２，１７
５，１８０，１８２，１８６，１８７，１９１，１９
４，１９５，１９９，２１８，２１９，２２２，２２
６，２３４〜２３８，２４１，２６０〜２６２，２６
５，２６８又は２７５。
と他のズブチリシンとを比較したところ、下記の部位を
変異させることによりズブチリシンの物理性質又は化学
的性質を変えることができることが分かった：６，９，
１１〜１２，１９，２５，３６〜３８，５３〜５９，６
７，７１，８９，１０４，１１１，１１５，１２０，１
２１〜１２２，１２４，１２８，１３１，１４０，１５
３〜１６６，１６８，１６９〜１７０，１７２，１７
５，１８０，１８２，１８６，１８７，１９１，１９
４，１９５，１９９，２１８，２１９，２２２，２２
６，２３４〜２３８，２４１，２６０〜２６２，２６
５，２６８又は２７５。
【００３６】ズブチリシン１４７及び／又はズブチリシ
ン３０９の１，３６，５６，１５９，１６４〜１６６の
位置に欠失が生じ、これらの部位に適当なアミノ酸残基
を挿入すると親酵素の安定性が高まる。上記した例で説
明した方法に準じて、多数の変異の可能性のある部位が
明らかとなる。
ン３０９の１，３６，５６，１５９，１６４〜１６６の
位置に欠失が生じ、これらの部位に適当なアミノ酸残基
を挿入すると親酵素の安定性が高まる。上記した例で説
明した方法に準じて、多数の変異の可能性のある部位が
明らかとなる。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
【表３】
【００４０】
【表４】
【００４１】
【表５】
【００４２】５．２．ズブチリシン遺伝子において変異
を生成する方法 遺伝子に変異を導入する方法は、当該技術分野において
数多く知られている。ズブチリシン遺伝子のクローニン
グについて簡単に述べた後で、ズブチリシン遺伝子内の
ランダムな部位及び特異的な部位の両方に変異を生成す
る方法について説明する。
を生成する方法 遺伝子に変異を導入する方法は、当該技術分野において
数多く知られている。ズブチリシン遺伝子のクローニン
グについて簡単に述べた後で、ズブチリシン遺伝子内の
ランダムな部位及び特異的な部位の両方に変異を生成す
る方法について説明する。
【００４３】５．２．１．ズブチリシン遺伝子のクロー
ニング ズブチリシンをコードする遺伝子は、グラム陽性菌又は
カビから当該技術分野において公知の種々の方法により
クローニングできる。まず、ＤＮＡのゲノミックライブ
ラリー及び／又はｃＤＮＡライブラリーを、検討すべき
ズブチリシンを産生する微生物から染色体ＤＮＡ又はメ
ッセンジャーＲＮＡを用いて造成する必要がある。
ニング ズブチリシンをコードする遺伝子は、グラム陽性菌又は
カビから当該技術分野において公知の種々の方法により
クローニングできる。まず、ＤＮＡのゲノミックライブ
ラリー及び／又はｃＤＮＡライブラリーを、検討すべき
ズブチリシンを産生する微生物から染色体ＤＮＡ又はメ
ッセンジャーＲＮＡを用いて造成する必要がある。
【００４４】次に、もしズブチリシンのアミノ酸配列が
公知であるならば、相同な標識オリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成し、それを用いて細菌ＤＮＡのゲノミックラ
イブラリーからズブチリシンをコードしているクローン
を同定することができる。また、ハイブリダイゼーショ
ンとより低いストリンジェンシーの洗浄条件を利用し
て、細菌又はカビの別の株由来のズブチリシンに相同な
配列を含んでいる標識オリゴヌクレオチドプローブをプ
ローブとして用いてズブチリシンをコードしているクロ
ーンを同定することができる。
公知であるならば、相同な標識オリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成し、それを用いて細菌ＤＮＡのゲノミックラ
イブラリーからズブチリシンをコードしているクローン
を同定することができる。また、ハイブリダイゼーショ
ンとより低いストリンジェンシーの洗浄条件を利用し
て、細菌又はカビの別の株由来のズブチリシンに相同な
配列を含んでいる標識オリゴヌクレオチドプローブをプ
ローブとして用いてズブチリシンをコードしているクロ
ーンを同定することができる。
【００４５】ズブチリシン産生クローンのさらに別の同
定方法として、プラスミド等の発現ベクターにゲノミッ
クＤＮＡの断片を挿入し、得られるゲノミックＤＮＡラ
イブラリーでプロテアーゼ陰性バクテリアを形質転換
後、脱脂乳等のズブチリシンの基質を含む寒天上で形質
転換したバクテリアを平板培養することが挙げられる。
ズブチリシンを担持したプラスミドを含んでいるバクテ
リアは、分泌されたズブチリシンによる脱脂乳の消化に
より、透明な寒天の光輝により包囲されたコロニーを生
成する。
定方法として、プラスミド等の発現ベクターにゲノミッ
クＤＮＡの断片を挿入し、得られるゲノミックＤＮＡラ
イブラリーでプロテアーゼ陰性バクテリアを形質転換
後、脱脂乳等のズブチリシンの基質を含む寒天上で形質
転換したバクテリアを平板培養することが挙げられる。
ズブチリシンを担持したプラスミドを含んでいるバクテ
リアは、分泌されたズブチリシンによる脱脂乳の消化に
より、透明な寒天の光輝により包囲されたコロニーを生
成する。
【００４６】５．２．２．ズブチリシン遺伝子における
ランダム変異の生成 ズブチリシン遺伝子がプラスミド等の適当なベクターに
クローニングされたら、いくつかの方法を用いて遺伝子
にランダム変異を導入できる。一つの方法として、クロ
ーニングしたズブチリシン遺伝子を取り出しのできる
（retrievable)ベクターの一部分として大腸菌の突然変
異誘発株に組み込むことが挙げられる。
ランダム変異の生成 ズブチリシン遺伝子がプラスミド等の適当なベクターに
クローニングされたら、いくつかの方法を用いて遺伝子
にランダム変異を導入できる。一つの方法として、クロ
ーニングしたズブチリシン遺伝子を取り出しのできる
（retrievable)ベクターの一部分として大腸菌の突然変
異誘発株に組み込むことが挙げられる。
【００４７】別の方法として、一本鎖のズブチリシン遺
伝子を生成後、ズブチリシン遺伝子を含んでいる断片を
別のＤＮＡ断片とともに、ズブチリシンの一部分が一本
鎖で残るようにしてアニーリングすることが挙げられ
る。次に、この別個となった一本鎖領域を、亜硫酸水素
ナトリウム、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、ギ酸又はヒ
ドララジン（これらには限定されない）をはじめとする
多数の変異誘発剤のいずれかに暴露する。
伝子を生成後、ズブチリシン遺伝子を含んでいる断片を
別のＤＮＡ断片とともに、ズブチリシンの一部分が一本
鎖で残るようにしてアニーリングすることが挙げられ
る。次に、この別個となった一本鎖領域を、亜硫酸水素
ナトリウム、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、ギ酸又はヒ
ドララジン（これらには限定されない）をはじめとする
多数の変異誘発剤のいずれかに暴露する。
【００４８】ランダム変異を生成するこの方法の具体例
が、ショートル（Shortle)及びナサン（Nathan) 〔１９
７８年、プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.)、米国、75: 2170〜2174〕により記載されてい
る。ショートル・ナサン法によれば、ズブチリシン遺伝
子を担持しているプラスミドを、遺伝子内で開裂する制
限酵素により切断する。このニックを、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのエキソヌクレアーゼを用いてギャップ内に広げ
る。次に、得られる一本鎖ギャップを、上記した変異誘
発剤のいずれか一つを用いて変異誘発する。
が、ショートル（Shortle)及びナサン（Nathan) 〔１９
７８年、プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.)、米国、75: 2170〜2174〕により記載されてい
る。ショートル・ナサン法によれば、ズブチリシン遺伝
子を担持しているプラスミドを、遺伝子内で開裂する制
限酵素により切断する。このニックを、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのエキソヌクレアーゼを用いてギャップ内に広げ
る。次に、得られる一本鎖ギャップを、上記した変異誘
発剤のいずれか一つを用いて変異誘発する。
【００４９】また、天然プロモーター及び他の制御配列
を含んだ桿菌種由来のズブチリシンを、大腸菌と枯草菌
の両方のレプリコン、選択表現マーカー及び複製のＭ１
３起源を含んだプラスミドベクター内でクローニングし
て、ヘルパーファージＩＲ１で重感染により一本鎖プラ
スミドＤＮＡを産生させることができる。クローニング
したズブチリシン遺伝子を含んだ一本鎖プラスミドＤＮ
Ａを単離し、ベクター配列を有するがズブチリシンのコ
ード領域を含まないＤＮＡ断片とともにアニーリングし
てギャップ二重鎖分子を得る。
を含んだ桿菌種由来のズブチリシンを、大腸菌と枯草菌
の両方のレプリコン、選択表現マーカー及び複製のＭ１
３起源を含んだプラスミドベクター内でクローニングし
て、ヘルパーファージＩＲ１で重感染により一本鎖プラ
スミドＤＮＡを産生させることができる。クローニング
したズブチリシン遺伝子を含んだ一本鎖プラスミドＤＮ
Ａを単離し、ベクター配列を有するがズブチリシンのコ
ード領域を含まないＤＮＡ断片とともにアニーリングし
てギャップ二重鎖分子を得る。
【００５０】亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸又はギ酸を
用いるか、上記した大腸菌の変異誘発株中で複製するこ
とによりズブチリシン遺伝子に変異を導入する。亜硫酸
水素ナトリウムは一本鎖ＤＮＡ中のシトシンと過剰に反
応するので、この変異誘発剤で生成した変異はコード領
域に限られる。一種のズブチリシン当たり１〜５の変異
が生成するように実験ごとに反応時間及び亜硫酸水素ナ
トリウム濃度を変更する。
用いるか、上記した大腸菌の変異誘発株中で複製するこ
とによりズブチリシン遺伝子に変異を導入する。亜硫酸
水素ナトリウムは一本鎖ＤＮＡ中のシトシンと過剰に反
応するので、この変異誘発剤で生成した変異はコード領
域に限られる。一種のズブチリシン当たり１〜５の変異
が生成するように実験ごとに反応時間及び亜硫酸水素ナ
トリウム濃度を変更する。
【００５１】１０μｇのキャップ二重鎖ＤＮＡを４Ｍ亜
硫酸水素ナトリウム中において、反応容積４００μｌ
で、pH６．０、温度３７℃で９分間インキュベーション
することにより、一本鎖領域における約１％のシトシン
が脱アミノ化される。成熟ズブチリシンのコード領域
は、ＤＮＡ鎖に応じて約２００個のシトシンを含んでい
る。反応時間は、約４分間（２００個のうちの１個の変
異頻度で変異を生成するとき）〜約２０分間（２００個
のうちの約５個の変異）の範囲で変化させるのが有利で
ある。
硫酸水素ナトリウム中において、反応容積４００μｌ
で、pH６．０、温度３７℃で９分間インキュベーション
することにより、一本鎖領域における約１％のシトシン
が脱アミノ化される。成熟ズブチリシンのコード領域
は、ＤＮＡ鎖に応じて約２００個のシトシンを含んでい
る。反応時間は、約４分間（２００個のうちの１個の変
異頻度で変異を生成するとき）〜約２０分間（２００個
のうちの約５個の変異）の範囲で変化させるのが有利で
ある。
【００５２】変異誘発の後、ギャップ分子を、試験管内
においてＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）で処理
して完全二本鎖分子を作製するとともに変異を固定す
る。次に、コンピテント菌としての大腸菌を変異誘発し
たＤＮＡで形質転換して変異ズブチリシンの増幅ライブ
ラリーを生成する。また、増幅変異ライブラリーは、プ
ラスミドＤＮＡを、誤りがちなＤＮＡポリメラーゼによ
り変異の範囲が広がる大腸菌のＭｕｔＤ株中で成長させ
ることによっても製造できる。
においてＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）で処理
して完全二本鎖分子を作製するとともに変異を固定す
る。次に、コンピテント菌としての大腸菌を変異誘発し
たＤＮＡで形質転換して変異ズブチリシンの増幅ライブ
ラリーを生成する。また、増幅変異ライブラリーは、プ
ラスミドＤＮＡを、誤りがちなＤＮＡポリメラーゼによ
り変異の範囲が広がる大腸菌のＭｕｔＤ株中で成長させ
ることによっても製造できる。
【００５３】また、変異誘発剤の亜硫酸及びギ酸を用い
て変異体ライブラリーを生成することもできる。これら
の薬品は、亜硫酸ナトリウムほどには一本鎖ＤＮＡに対
して特異的ではないので、変異誘発反応を、以下の手順
で行う。ズブチリシン遺伝子のコード領域を、常法によ
りＭ１３ファージ中でクローニングして、一本鎖ファー
ジＤＮＡを調製する。次に、一本鎖ＤＮＡを１Ｍ亜硝酸
とpH４．３において２３℃の温度で１５〜６０分間反応
させるか、２．４Ｍギ酸と２３℃の温度で２〜５分間反
応させる。
て変異体ライブラリーを生成することもできる。これら
の薬品は、亜硫酸ナトリウムほどには一本鎖ＤＮＡに対
して特異的ではないので、変異誘発反応を、以下の手順
で行う。ズブチリシン遺伝子のコード領域を、常法によ
りＭ１３ファージ中でクローニングして、一本鎖ファー
ジＤＮＡを調製する。次に、一本鎖ＤＮＡを１Ｍ亜硝酸
とpH４．３において２３℃の温度で１５〜６０分間反応
させるか、２．４Ｍギ酸と２３℃の温度で２〜５分間反
応させる。
【００５４】上記の反応時間では、１：１０００〜５：
１０００の変異度数が得られる。変異誘発の後、万能プ
ライマーをＭ１３ＤＮＡに対してアニーリングし、そし
て変異誘発した一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて、ズブ
チリシン遺伝子のコード部分が完全に二重鎖となるよう
に二重鎖ＤＮＡを合成する。この時点で、コード領域を
Ｍ１３ベクターから制限酵素を用いて切断し、そして制
限断片においてのみ変異が生じるようにコード領域を未
変異誘発発現ベクターに結さつする〔マイヤー（Myers)
等、サイエンス、229: 242〜257(1985）〕。
１０００の変異度数が得られる。変異誘発の後、万能プ
ライマーをＭ１３ＤＮＡに対してアニーリングし、そし
て変異誘発した一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて、ズブ
チリシン遺伝子のコード部分が完全に二重鎖となるよう
に二重鎖ＤＮＡを合成する。この時点で、コード領域を
Ｍ１３ベクターから制限酵素を用いて切断し、そして制
限断片においてのみ変異が生じるようにコード領域を未
変異誘発発現ベクターに結さつする〔マイヤー（Myers)
等、サイエンス、229: 242〜257(1985）〕。
【００５５】さらに別の方法において、２種の異なるズ
ブチリシンを生体内で組み換えを行うことにより変異を
生成することができる。この方法によれば、２つの遺伝
子内の相同領域により、対応する領域のクロスオーバー
が生じて、遺伝子情報の交換が起きる。この手法による
ハイブリッドアミラーゼ分子の生成は、１９８７年６月
２９日出願の米国特許出願第６７，９９２号に詳細に記
載されている。この特許出願に記載の内容全体は、本発
明に利用できる。ハイブリッドの形態のズブチリシンを
生成できるプラスミドの例を図６に示す。
ブチリシンを生体内で組み換えを行うことにより変異を
生成することができる。この方法によれば、２つの遺伝
子内の相同領域により、対応する領域のクロスオーバー
が生じて、遺伝子情報の交換が起きる。この手法による
ハイブリッドアミラーゼ分子の生成は、１９８７年６月
２９日出願の米国特許出願第６７，９９２号に詳細に記
載されている。この特許出願に記載の内容全体は、本発
明に利用できる。ハイブリッドの形態のズブチリシンを
生成できるプラスミドの例を図６に示す。
【００５６】プラスミドｐＳｘ１４３に組み込まれたズ
ブチリシン３０９とズブチリシン１４７の両方がトラン
ケーションされるので、それら自体ではズブチリシンの
発現はできない。しかしながら、２つの遺伝子の間に組
み換えが生じて、トランケーションにより生じた欠陥が
修正される。即ち、ズブチリシン３０９遺伝子のＮ末端
領域が、ズブチリシン１４７遺伝子のＣ末端領域に結合
された状態になり、活性な変異体ズブチリシンが産生さ
れる。
ブチリシン３０９とズブチリシン１４７の両方がトラン
ケーションされるので、それら自体ではズブチリシンの
発現はできない。しかしながら、２つの遺伝子の間に組
み換えが生じて、トランケーションにより生じた欠陥が
修正される。即ち、ズブチリシン３０９遺伝子のＮ末端
領域が、ズブチリシン１４７遺伝子のＣ末端領域に結合
された状態になり、活性な変異体ズブチリシンが産生さ
れる。
【００５７】もしｐＳｘ１４３をバクテリアのプロテア
ーゼ陰性株に組み込む場合には、プロテアーゼ陽性表現
形を発現するバクテリアを選択し、その後、種々の変異
体ズブチリシン３０９／１４７キメラーゼを同定でき
る。
ーゼ陰性株に組み込む場合には、プロテアーゼ陽性表現
形を発現するバクテリアを選択し、その後、種々の変異
体ズブチリシン３０９／１４７キメラーゼを同定でき
る。
【００５８】５．２．３．ズブチリシン遺伝子における
部位特異的変異の生成 ズブチリシン遺伝子がクローニングし、変異のための所
望の部位が確認できたら、合成オリゴヌクレオチドを用
いて変異を導入できる。これらのオリゴヌクレオチド
は、所望の変異部位の側部に隣接してヌクレオチド配列
を含んでいる。変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチ
ド合成中に挿入される。好ましい方法においては、ズブ
チリシン遺伝子をブリッジしているＤＮＡの一本鎖ギャ
ップを、ズブチリシン遺伝子を担持しているベクター中
で生成する。
部位特異的変異の生成 ズブチリシン遺伝子がクローニングし、変異のための所
望の部位が確認できたら、合成オリゴヌクレオチドを用
いて変異を導入できる。これらのオリゴヌクレオチド
は、所望の変異部位の側部に隣接してヌクレオチド配列
を含んでいる。変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチ
ド合成中に挿入される。好ましい方法においては、ズブ
チリシン遺伝子をブリッジしているＤＮＡの一本鎖ギャ
ップを、ズブチリシン遺伝子を担持しているベクター中
で生成する。
【００５９】その後、所望の変異を担持している合成ヌ
クレオチドを、一本鎖ＤＮＡの相同部分に対してアニー
リングする。次に、残存しているギャップをＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー断片）で充填し、そして造成物を
Ｔ４リガーゼを用いて結合させる。この方法についての
具体例が、森永等（１９８４年、バイオテクノロジー、
２：６４６〜６３９）に開示されている。森永等によれ
ば、遺伝子内の断片は、制限エンドヌクレアーゼを用い
て取り除く。
クレオチドを、一本鎖ＤＮＡの相同部分に対してアニー
リングする。次に、残存しているギャップをＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー断片）で充填し、そして造成物を
Ｔ４リガーゼを用いて結合させる。この方法についての
具体例が、森永等（１９８４年、バイオテクノロジー、
２：６４６〜６３９）に開示されている。森永等によれ
ば、遺伝子内の断片は、制限エンドヌクレアーゼを用い
て取り除く。
【００６０】次に、ベクター／遺伝子（この時点ではギ
ャップを含んでいる）を変性後、ギャップを含有せしめ
る代わりに、ギャップに含まれている領域以外の部位を
別のエンドヌクレアーゼで開裂したベクター／遺伝子に
対してハイブリダイゼーションを行う。次に、遺伝子の
一本鎖領域が変異オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼ
ーションし、残存しているギャップにＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノー断片を充填し、挿入物をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合し、そして１サイクルの複製後に所望の変異
を担持している二重鎖プラスミドが産生する。
ャップを含んでいる）を変性後、ギャップを含有せしめ
る代わりに、ギャップに含まれている領域以外の部位を
別のエンドヌクレアーゼで開裂したベクター／遺伝子に
対してハイブリダイゼーションを行う。次に、遺伝子の
一本鎖領域が変異オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼ
ーションし、残存しているギャップにＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノー断片を充填し、挿入物をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合し、そして１サイクルの複製後に所望の変異
を担持している二重鎖プラスミドが産生する。
【００６１】森永の方法では、新規な制限部位を造成す
る追加の操作が必要なく、したがって、複数の部位に変
異を生成するのが容易となる。１９８８年７月２６日発
行のエステレ（Estelle)による米国特許第４，７６０，
０２５号では、カセットを多少変更することにより、複
数の変異を担持しているオリゴヌクレオチドを導入する
ことが可能であるが、森永の方法では種々の長さの多数
のオリゴヌクレオチドを導入できるので、森永の方法の
方がより多種類の変異を一度に導入できる。
る追加の操作が必要なく、したがって、複数の部位に変
異を生成するのが容易となる。１９８８年７月２６日発
行のエステレ（Estelle)による米国特許第４，７６０，
０２５号では、カセットを多少変更することにより、複
数の変異を担持しているオリゴヌクレオチドを導入する
ことが可能であるが、森永の方法では種々の長さの多数
のオリゴヌクレオチドを導入できるので、森永の方法の
方がより多種類の変異を一度に導入できる。
【００６２】５．３．ズブチリシン変異体の発現 本発明によれば、上記した方法又は当該技術分野におい
て公知の代替法により製造した変異ズブチリシン遺伝子
は、発現ベクターを用いて酵素の形態で発現できる。発
現ベクターは、一般的に、クローニングベクターの定義
の範囲に入る。これは、発現ベクターは、通常、典型的
なクローニングベクター、即ち、微生物のゲノムとは無
関係に微生物中においてベクターの自律複製を可能とす
る要素、並びに選択のための表現形マーカーを含んでい
るからである。
て公知の代替法により製造した変異ズブチリシン遺伝子
は、発現ベクターを用いて酵素の形態で発現できる。発
現ベクターは、一般的に、クローニングベクターの定義
の範囲に入る。これは、発現ベクターは、通常、典型的
なクローニングベクター、即ち、微生物のゲノムとは無
関係に微生物中においてベクターの自律複製を可能とす
る要素、並びに選択のための表現形マーカーを含んでい
るからである。
【００６３】発現ベクターは、プロモーターをコードし
ている制御配列、オペレーター、リボソーム結合部位、
翻訳開始信号及び必要に応じてリプレッサー遺伝子を含
んでいる。発現タンパク質を分泌させるために、「シグ
ナル配列（signal sequence)」を、遺伝子のコード配列
の前に挿入してもよい。制御配列方向の発現の場合、本
発明により処理されるべき標的遺伝子を、適当な読み取
り枠の制御配列に適切に結合する。
ている制御配列、オペレーター、リボソーム結合部位、
翻訳開始信号及び必要に応じてリプレッサー遺伝子を含
んでいる。発現タンパク質を分泌させるために、「シグ
ナル配列（signal sequence)」を、遺伝子のコード配列
の前に挿入してもよい。制御配列方向の発現の場合、本
発明により処理されるべき標的遺伝子を、適当な読み取
り枠の制御配列に適切に結合する。
【００６４】プラスミドベクターに組み込むことので
き、そして変異体ズブチリシン遺伝子の転写を補助する
ことのできるプロモーター配列は、原核βラクタマーゼ
プロモーター〔ビラ−カマロフ（Villa-Kamaroff) 等、
1978年、プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.)、米国、75: 3727〜3731〕と、ｔａｃプロモー
ター〔デボア（DeBoer) 等、1983年、プロク・ナトル・
アカド・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、80: 21〜
25〕を含むが、これらには限定されない。
き、そして変異体ズブチリシン遺伝子の転写を補助する
ことのできるプロモーター配列は、原核βラクタマーゼ
プロモーター〔ビラ−カマロフ（Villa-Kamaroff) 等、
1978年、プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.)、米国、75: 3727〜3731〕と、ｔａｃプロモー
ター〔デボア（DeBoer) 等、1983年、プロク・ナトル・
アカド・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、80: 21〜
25〕を含むが、これらには限定されない。
【００６５】このことについては、「組み換えバクテリ
ア由来の有用なタンパク質 (Usufulproteins from reco
mbinant bacteria)」,1980,242:74〜94にも記載があ
る。一実施態様によれば、枯草菌は、変異ＤＮＡを担持
している発現ベクターにより形質転換される。もし発現
が枯草菌等の分泌微生物中で起こる場合には、シグナル
配列を翻訳開始シグナルの後で且つ意図するＤＮＡ配列
に先立つようにする。シグナル配列は、発現産生物を細
胞壁まで輸送する役割を果たし、分泌にともない産生物
から開裂する。上記で使用した用語「制限配列（contro
l sequence)」は、シグナル配列が存在する場合にはそ
れを含む。
ア由来の有用なタンパク質 (Usufulproteins from reco
mbinant bacteria)」,1980,242:74〜94にも記載があ
る。一実施態様によれば、枯草菌は、変異ＤＮＡを担持
している発現ベクターにより形質転換される。もし発現
が枯草菌等の分泌微生物中で起こる場合には、シグナル
配列を翻訳開始シグナルの後で且つ意図するＤＮＡ配列
に先立つようにする。シグナル配列は、発現産生物を細
胞壁まで輸送する役割を果たし、分泌にともない産生物
から開裂する。上記で使用した用語「制限配列（contro
l sequence)」は、シグナル配列が存在する場合にはそ
れを含む。
【００６６】５．４．変異体ズブチリシンのスクリーニ
ング 変異体をスクリーニングするために、形質転換した枯草
菌を、濾材（ニトロセルロース等）の存在下で培養でき
る。この場合、分泌した発現産生物（例えば、酵素）が
濾材に結合する。所望の特性を有する発現産生物をスク
リーニングするために、意図する発現産生物と野生型発
現産生物とを識別できる条件下にフィルターに結合した
産生物を置く。逆処理して酵素活性が保持されていると
きには、変異により酵素の安定性が高まり、したがっ
て、その変異が有用であることを示している。
ング 変異体をスクリーニングするために、形質転換した枯草
菌を、濾材（ニトロセルロース等）の存在下で培養でき
る。この場合、分泌した発現産生物（例えば、酵素）が
濾材に結合する。所望の特性を有する発現産生物をスク
リーニングするために、意図する発現産生物と野生型発
現産生物とを識別できる条件下にフィルターに結合した
産生物を置く。逆処理して酵素活性が保持されていると
きには、変異により酵素の安定性が高まり、したがっ
て、その変異が有用であることを示している。
【００６７】本発明の一実施態様において、安定な変異
株のスクリーニングを、変異株プラスミドで形質転換し
たプロテアーゼ欠乏枯草菌株を用いて行い、以下のよう
にプレーティングする。ニトロセルロースフィルターを
ペトリ皿内の栄養基剤上に配置し、そして酢酸セルロー
スフィルターをニトロセルロースの上部に配置する。コ
ロニーが酢酸セルロース上に成長し、個々のコロニーか
らプロテアーゼが酢酸セルロースを通過してニトロセル
ロースフィルター上に分泌され、そこで安定に結合す
る。
株のスクリーニングを、変異株プラスミドで形質転換し
たプロテアーゼ欠乏枯草菌株を用いて行い、以下のよう
にプレーティングする。ニトロセルロースフィルターを
ペトリ皿内の栄養基剤上に配置し、そして酢酸セルロー
スフィルターをニトロセルロースの上部に配置する。コ
ロニーが酢酸セルロース上に成長し、個々のコロニーか
らプロテアーゼが酢酸セルロースを通過してニトロセル
ロースフィルター上に分泌され、そこで安定に結合す
る。
【００６８】何百ものコロニーからプロテアーゼが単一
のフィルターに結合するので、続いて多数のフィルター
を処理することにより何千もの異なる変異株がスクリー
ニングできる。熱安定性が高まったズブチリシンを産生
しているコロニーを同定するために、フィルターを、実
質的に全ての野性型活性を不活性化する温度において、
緩衝液中でインキュベーションできる。安定性又は活性
が高まった変異株は、この工程の後でも活性を保持して
いる。
のフィルターに結合するので、続いて多数のフィルター
を処理することにより何千もの異なる変異株がスクリー
ニングできる。熱安定性が高まったズブチリシンを産生
しているコロニーを同定するために、フィルターを、実
質的に全ての野性型活性を不活性化する温度において、
緩衝液中でインキュベーションできる。安定性又は活性
が高まった変異株は、この工程の後でも活性を保持して
いる。
【００６９】次に、適当に処理したフィルターを、トル
シ−Ｌ−Ａｒｇメチルエステル（ＴＡＭＥ）ベンゾリ−
Ａｒｇ−エチルエステル（ＢＡＥＥ）、アセチル−Ｔｙ
ｒ−エチルエステル（ＡＴＥＥ）（シグマ社製）又はこ
れに類似の化合物を含有している溶液に浸漬する。ＴＡ
ＭＥ，ＢＡＥＥ及びＡＴＥＥはプロテアーゼに対して基
質であるので、処理後に活性状態のままである変異ズブ
チリシンを含有しているフィルター上で開裂する。開裂
が生じるとともに、反応でプロトンが放出され、プロテ
アーゼ活性を保持している領域でフェノールレッドの色
が赤から黄色に変化する。
シ−Ｌ−Ａｒｇメチルエステル（ＴＡＭＥ）ベンゾリ−
Ａｒｇ−エチルエステル（ＢＡＥＥ）、アセチル−Ｔｙ
ｒ−エチルエステル（ＡＴＥＥ）（シグマ社製）又はこ
れに類似の化合物を含有している溶液に浸漬する。ＴＡ
ＭＥ，ＢＡＥＥ及びＡＴＥＥはプロテアーゼに対して基
質であるので、処理後に活性状態のままである変異ズブ
チリシンを含有しているフィルター上で開裂する。開裂
が生じるとともに、反応でプロトンが放出され、プロテ
アーゼ活性を保持している領域でフェノールレッドの色
が赤から黄色に変化する。
【００７０】この操作を使用して、わずかにしか変更し
ていない異種の変異株をスクリーニングできる。例え
ば、フィルターを、高温、高pHで、変性剤、酸化剤を用
いるか、通常プロテアーゼ等の酵素を不活性化して耐性
のある変異株を見つけ出す他の条件下で処理する。基質
特異性が変化した特異株は、ＴＡＭＥ，ＢＡＥＥ又はＡ
ＴＥＥの代わりに、通常野性型ズブチリシンにより開裂
されない他の基質を用いることによりスクリーニングで
きる。
ていない異種の変異株をスクリーニングできる。例え
ば、フィルターを、高温、高pHで、変性剤、酸化剤を用
いるか、通常プロテアーゼ等の酵素を不活性化して耐性
のある変異株を見つけ出す他の条件下で処理する。基質
特異性が変化した特異株は、ＴＡＭＥ，ＢＡＥＥ又はＡ
ＴＥＥの代わりに、通常野性型ズブチリシンにより開裂
されない他の基質を用いることによりスクリーニングで
きる。
【００７１】安定性が高まった変異株をスクリーニング
で同定したら、変異株を得たコロニーを単離し、変異し
たズブチリシンを精製する。精製酵素について実験を行
い、酸化、熱不活性化、変性温度、動的パラメーターに
対する安定性だけでなく、他の物理的測定値の条件も測
定した。変異遺伝子の配列決定を行って、安定性の向上
をもたらすアミノ酸の変化を測定することもできる。こ
の操作法を用いて、洗浄性の向上した変異株を単離し
た。
で同定したら、変異株を得たコロニーを単離し、変異し
たズブチリシンを精製する。精製酵素について実験を行
い、酸化、熱不活性化、変性温度、動的パラメーターに
対する安定性だけでなく、他の物理的測定値の条件も測
定した。変異遺伝子の配列決定を行って、安定性の向上
をもたらすアミノ酸の変化を測定することもできる。こ
の操作法を用いて、洗浄性の向上した変異株を単離し
た。
【００７２】６．実施例：ズブチリシン遺伝子の部位特
異的変異による有用な化学的特性を有する変異体の生成 ６．１．材料及び方法 ６．１．１．細菌株 Ｂ．ズブチリス （B.subtilis) ３０９及び１４７は、バ
シラスレンタス（Bacillus lentus) の変異株であり、
寄託番号ＮＣＩＢ １０１４７及びＮＣＩＢ１０３０９
としてＮＣＩＢに寄託され、そして、１９７３年３月２
７日に発行されたアメリカ特許第３，７２３，２５０号
（引用により明細書に組込まれる）に記載されている。
異的変異による有用な化学的特性を有する変異体の生成 ６．１．材料及び方法 ６．１．１．細菌株 Ｂ．ズブチリス （B.subtilis) ３０９及び１４７は、バ
シラスレンタス（Bacillus lentus) の変異株であり、
寄託番号ＮＣＩＢ １０１４７及びＮＣＩＢ１０３０９
としてＮＣＩＢに寄託され、そして、１９７３年３月２
７日に発行されたアメリカ特許第３，７２３，２５０号
（引用により明細書に組込まれる）に記載されている。
【００７３】Ｂ．ズブチリスＤＮ４９７は、アメリカ出
願番号第０３９，２９８号（また引用により明細書に組
込まれる）に記載されており、そしてＳＬ４３８、すな
わちBiogenのDr.Kim Hardyから得られた胞子形成及びプ
ロテアーゼ欠失性株からの染色体ＤＮＡを有するＲＵＢ
２００のａｒｏ+ 形質転換体である。Ｅ．コリMC1000r
- m+ (Casa-daban,M.J.及びCohen,S.N.(1980),J.Mol.B
iol.138 :179〜207)は、従来の方法によりｒ- ｍ+ にさ
れ、そしてアメリカ出願番号第０３９，２９８号にも記
載されている。
願番号第０３９，２９８号（また引用により明細書に組
込まれる）に記載されており、そしてＳＬ４３８、すな
わちBiogenのDr.Kim Hardyから得られた胞子形成及びプ
ロテアーゼ欠失性株からの染色体ＤＮＡを有するＲＵＢ
２００のａｒｏ+ 形質転換体である。Ｅ．コリMC1000r
- m+ (Casa-daban,M.J.及びCohen,S.N.(1980),J.Mol.B
iol.138 :179〜207)は、従来の方法によりｒ- ｍ+ にさ
れ、そしてアメリカ出願番号第０３９，２９８号にも記
載されている。
【００７４】６．１．２．プラスミド ｐＳＸ５０（１９８７年４月１７日に出願されたアメリ
カ特許出願第０３９，２９８号に記載され、そして引用
により明細書に組込まれている）は、プロモーター−オ
ペレーターＰ1 Ｏ1 、Ｂ．パミラス（B.pumilus)ｘｙｎ
Ｂ遺伝子及びＢ．ズブチリスｘｙｌＲ遺伝子を含む、プ
ラスミドｐＤＮ１０５０の誘導体である。
カ特許出願第０３９，２９８号に記載され、そして引用
により明細書に組込まれている）は、プロモーター−オ
ペレーターＰ1 Ｏ1 、Ｂ．パミラス（B.pumilus)ｘｙｎ
Ｂ遺伝子及びＢ．ズブチリスｘｙｌＲ遺伝子を含む、プ
ラスミドｐＤＮ１０５０の誘導体である。
【００７５】ｐＳＸ６５（アメリカ特許出願第０３９，
２９８、前記に記載される）は、プロモーター−オペレ
ーターＰ2 Ｏ2 、Ｂ．パミラスｘｙｎＢ遺伝子及びＢ．
ズブチリスｘｙｌＲ遺伝子を含む、プラスミドｐＤＮ１
０５０の誘導体である。図３に示されるｐＳＸ９３は、
ポリリンカー配列に挿入されるターミネーターを含むズ
ブチリシン３０９遺伝子の０．７kbのＸｂａＩ−Ｈｉｎ
ｄIII フラグメントを含んで成るｐＵＣ１３（Vieira及
びMessing,1982,Gene 19:259〜268)である。
２９８、前記に記載される）は、プロモーター−オペレ
ーターＰ2 Ｏ2 、Ｂ．パミラスｘｙｎＢ遺伝子及びＢ．
ズブチリスｘｙｌＲ遺伝子を含む、プラスミドｐＤＮ１
０５０の誘導体である。図３に示されるｐＳＸ９３は、
ポリリンカー配列に挿入されるターミネーターを含むズ
ブチリシン３０９遺伝子の０．７kbのＸｂａＩ−Ｈｉｎ
ｄIII フラグメントを含んで成るｐＵＣ１３（Vieira及
びMessing,1982,Gene 19:259〜268)である。
【００７６】ｐＳＸ１１９は、ポリリンカー中に挿入さ
れるズブチリシン３０９遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ
フラグメントを有するｐＵＣ１３である。ｐＳＸ６２
（アメリカ特許出願第０３９，２９８号、前記に記載さ
れる）は、ウシプロキモシン遺伝子とｐＳＸ５０（前
記）中に挿入されるＢ．パミラスｘｙｎＢ遺伝子との間
の融合遺伝子を含んで成る、ｐＳＸ５２の誘導体であ
る。ｐＳＸ６２は、プロキモシン遺伝子の後ろのｐＳＸ
５２中にＥ．コリｒｒｎＢターミネーターを挿入するこ
とによって生成された。
れるズブチリシン３０９遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ
フラグメントを有するｐＵＣ１３である。ｐＳＸ６２
（アメリカ特許出願第０３９，２９８号、前記に記載さ
れる）は、ウシプロキモシン遺伝子とｐＳＸ５０（前
記）中に挿入されるＢ．パミラスｘｙｎＢ遺伝子との間
の融合遺伝子を含んで成る、ｐＳＸ５２の誘導体であ
る。ｐＳＸ６２は、プロキモシン遺伝子の後ろのｐＳＸ
５２中にＥ．コリｒｒｎＢターミネーターを挿入するこ
とによって生成された。
【００７７】ｐＳＸ９２は、ＣｌａＩ及びＨｉｎｄIII
で切断されたプラスミドｐＳＸ６２（前記）中にズブチ
リシン３０９をクローン化することにより生成され、そ
してそのクローン化されたズブチリシン３０９遺伝子か
らのＤｒａＩ−ＮｈｅＩ及びＮｈｅＩ−ＨｉｎｄIII フ
ラグメントの挿入の前、フィルインされた。
で切断されたプラスミドｐＳＸ６２（前記）中にズブチ
リシン３０９をクローン化することにより生成され、そ
してそのクローン化されたズブチリシン３０９遺伝子か
らのＤｒａＩ−ＮｈｅＩ及びＮｈｅＩ−ＨｉｎｄIII フ
ラグメントの挿入の前、フィルインされた。
【００７８】６．１．３．ズブチリシンの精製 この方法は、ズブチリシン１４７酵素、ズブチリシン３
０９酵素又はそれらの突然変異体の１０ｌ規模発酵の典
型的な精製に関係する。およそ８ｌの発酵ブイヨンを、
１ｌのビーカー中で３５分間、５０００rpm で遠心分離
した。その上清液を、１０％酢酸を用いてpH６．５に調
整し、そしてSeitz Supra S100フィルタープレート上で
濾過した。
０９酵素又はそれらの突然変異体の１０ｌ規模発酵の典
型的な精製に関係する。およそ８ｌの発酵ブイヨンを、
１ｌのビーカー中で３５分間、５０００rpm で遠心分離
した。その上清液を、１０％酢酸を用いてpH６．５に調
整し、そしてSeitz Supra S100フィルタープレート上で
濾過した。
【００７９】その濾液を、Amicon S1Y10 UF 遠心分離機
を備えるAmicon CH2A UFユニットを用いて、約４００ml
に濃縮した。そのＵＦ濃縮物を遠心分離し、そして濾過
し、その後、pH７でBacitracinアフィニティーカラム上
に吸着した。pH７に調整された、０．０１Ｍのジメチル
グルタル酸、０．１Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カ
ルシウムを含む緩衝溶液中、２５％の２−プロパノール
及び１Ｍの塩化ナトリウム溶液を用いて、プロテアーゼ
をBacitracinカラムから溶離した。
を備えるAmicon CH2A UFユニットを用いて、約４００ml
に濃縮した。そのＵＦ濃縮物を遠心分離し、そして濾過
し、その後、pH７でBacitracinアフィニティーカラム上
に吸着した。pH７に調整された、０．０１Ｍのジメチル
グルタル酸、０．１Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カ
ルシウムを含む緩衝溶液中、２５％の２−プロパノール
及び１Ｍの塩化ナトリウム溶液を用いて、プロテアーゼ
をBacitracinカラムから溶離した。
【００８０】Bacitracin精製段階からのプロテアーゼ活
性を有する画分を組合し、そして０．０１Ｍのジメチル
グルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カ
ルシウムを含む、pH６．５に調整された緩衝液により平
衡化された７５０mlのSephadex G25カラム（直径５cm）
に適用した。Sephadex G25カラムからのタンパク質分解
活性を有する画分を組合し、そして０．０１Ｍのジメチ
ルグルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化
カルシウムを含む、pH６．５に調整された緩衝液により
平衡化された１５０mlのCM Sepharose CL 6Bカチオン交
換カラム（直径５cm）に適用した。
性を有する画分を組合し、そして０．０１Ｍのジメチル
グルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カ
ルシウムを含む、pH６．５に調整された緩衝液により平
衡化された７５０mlのSephadex G25カラム（直径５cm）
に適用した。Sephadex G25カラムからのタンパク質分解
活性を有する画分を組合し、そして０．０１Ｍのジメチ
ルグルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化
カルシウムを含む、pH６．５に調整された緩衝液により
平衡化された１５０mlのCM Sepharose CL 6Bカチオン交
換カラム（直径５cm）に適用した。
【００８１】プロテアーゼを、同じ緩衝液（０〜０．２
Ｍの塩化ナトリウム）２ｌ中、０〜０．１Ｍの塩化ナト
リウムの直線グラジェントを用いて溶離した。最終精製
段階において、CM Sepharoseカラムからのプロテアーゼ
含有画分を組合し、そしてＧＲ８１Ｆ膜（Danish Sugar
Facturies Inc. からの) を備えるAmicon限外濾過セル
で濃縮した。
Ｍの塩化ナトリウム）２ｌ中、０〜０．１Ｍの塩化ナト
リウムの直線グラジェントを用いて溶離した。最終精製
段階において、CM Sepharoseカラムからのプロテアーゼ
含有画分を組合し、そしてＧＲ８１Ｆ膜（Danish Sugar
Facturies Inc. からの) を備えるAmicon限外濾過セル
で濃縮した。
【００８２】ズブチリシン３０９及び突然変異体、 Ｍｅｔ２２２〜Ａｌａ Ｇｌｙ１９５〜Ｇｌｕ Ａｓｎ２１８〜Ｓｅｒ Ａｒｇ１７０〜Ｔｙｒ Ｇｌｙ１９５〜Ｇｌｕ，Ａｒｇ１７０〜Ｔｙｒ Ｇｌｙ１９５〜Ｇｌｕ，Ｍｅｔ２２２〜Ａｌａ を、この方法により精製した。
【００８３】６．１．４．オリゴヌクレオチド合成 すべての不適正（ミスマッチ）プライマーを、Applied
Biosystems 380A DNA合成機により合成し、そしてポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製し
た。
Biosystems 380A DNA合成機により合成し、そしてポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製し
た。
【００８４】６．１．５．酸化安定性の決定 精製された酵素を、pH７の０．０１Ｍジメチルグルタル
酸及び０．０１Ｍの過酢酸（pH７）を有する同じ緩衝液
により約０．１mg／mlの酵素含有濃度に希釈する。両組
の希釈溶液を５０℃に２０分間加熱した。希釈溶液中の
タンパク質分解活性を、加熱処理の前及び後で測定し
た。
酸及び０．０１Ｍの過酢酸（pH７）を有する同じ緩衝液
により約０．１mg／mlの酵素含有濃度に希釈する。両組
の希釈溶液を５０℃に２０分間加熱した。希釈溶液中の
タンパク質分解活性を、加熱処理の前及び後で測定し
た。
【００８５】６．１．６．タンパク質分解活性について
のアッセイ ＯＰＡ−カゼイン法 タンパク質分解活性を、基質としてカゼインを用いて決
定した。１つのカゼインプロテアーゼ単位（CPU)を、標
準条件、すなわち２５℃及びpH９．５で３０分間のイン
キュベーション下で、１分当たり一次アミノ基１ミリモ
ルを生成する酵素の量（セリン標準液との比較により決
定される）として定義される。
のアッセイ ＯＰＡ−カゼイン法 タンパク質分解活性を、基質としてカゼインを用いて決
定した。１つのカゼインプロテアーゼ単位（CPU)を、標
準条件、すなわち２５℃及びpH９．５で３０分間のイン
キュベーション下で、１分当たり一次アミノ基１ミリモ
ルを生成する酵素の量（セリン標準液との比較により決
定される）として定義される。
【００８６】カゼイン（Hammarstein,Merck A.G., 西ド
イツにより供給される）の２％（Ｗ／Ｖ）溶液を、Brit
ton 及びRobinson (Journ.Chem.Soc. 1931, 1451ペー
ジ) により記載される、pH９．５に調整されたUniversa
l Butterにより調製した。基質溶液２mlを、水浴中で１
０分間２５℃で予備インキュベートした。Britton-Robi
nson緩衝液（pH９．５）１ml当たり約０．２〜０．３CP
U を含む酵素溶液１mlを添加した。２５℃での３０分間
のインキュベーションの後、その反応を、停止剤（脱イ
オン水により５００mlまで希釈された、トリクロロ酢酸
１７．９ｇ、酢酸ナトリウム２９．９ｇ及び酢酸１９．
８ｇを含む溶液５ml）の添加により停止せしめた。ブラ
ンクを、試験溶液として同じ方法で調製した。但し、停
止剤は、酵素溶液の前に添加された。
イツにより供給される）の２％（Ｗ／Ｖ）溶液を、Brit
ton 及びRobinson (Journ.Chem.Soc. 1931, 1451ペー
ジ) により記載される、pH９．５に調整されたUniversa
l Butterにより調製した。基質溶液２mlを、水浴中で１
０分間２５℃で予備インキュベートした。Britton-Robi
nson緩衝液（pH９．５）１ml当たり約０．２〜０．３CP
U を含む酵素溶液１mlを添加した。２５℃での３０分間
のインキュベーションの後、その反応を、停止剤（脱イ
オン水により５００mlまで希釈された、トリクロロ酢酸
１７．９ｇ、酢酸ナトリウム２９．９ｇ及び酢酸１９．
８ｇを含む溶液５ml）の添加により停止せしめた。ブラ
ンクを、試験溶液として同じ方法で調製した。但し、停
止剤は、酵素溶液の前に添加された。
【００８７】反応混合物を、水浴中に２０分間保持し、
その後それらをWhatman(商標）濾紙を通して濾過した。
一次アミノ基を、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）に
よるそれらの色の展開により決定した。四硼酸＝ナトリ
ウム１０水和物（７．６２ｇ）及びドデシル硫酸ナトリ
ウム（２．０ｇ）を、水１５０mlに溶解した。次に、メ
タノール４ml中に溶解されたＯＰＡ（１６０mg）を、β
−メルカプトエタノール４００μｌと共に添加し、その
後、その溶液を水により２００mlにした。
その後それらをWhatman(商標）濾紙を通して濾過した。
一次アミノ基を、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）に
よるそれらの色の展開により決定した。四硼酸＝ナトリ
ウム１０水和物（７．６２ｇ）及びドデシル硫酸ナトリ
ウム（２．０ｇ）を、水１５０mlに溶解した。次に、メ
タノール４ml中に溶解されたＯＰＡ（１６０mg）を、β
−メルカプトエタノール４００μｌと共に添加し、その
後、その溶液を水により２００mlにした。
【００８８】ＯＰＡ試薬（３ml）に、上記濾液４０μｌ
を添加し、そして混合した。３４０nmでの光学密度を、
約５分後に測定した。ＯＰＡ試験をまた、Britton-Robi
nson緩衝液（pH９．５）１００mlにセリン１０mgを含む
セリン標準液により行なった。緩衝液を、ブランクとし
て使用した。プロテアーゼ活性を、次の式により光学密
度測定値から計算した：
を添加し、そして混合した。３４０nmでの光学密度を、
約５分後に測定した。ＯＰＡ試験をまた、Britton-Robi
nson緩衝液（pH９．５）１００mlにセリン１０mgを含む
セリン標準液により行なった。緩衝液を、ブランクとし
て使用した。プロテアーゼ活性を、次の式により光学密
度測定値から計算した：
【００８９】
【数１】 ここで、ＯＤt ，ＯＤb ；ＯＤser 及びＯＤB は、試験
溶液、ブランク、セリン標準液及び緩衝液の光学密度で
あり、Ｃser は、標準液中でのセリンの濃度mg／mlであ
り、μＷser はセリンの分子量である。Ｑは、酵素溶液
のための希釈係数（この場合、８に等しい）であり、そ
してｔi はインキュベーション時間（分）である。次の
第Ｖ表においては、上記アッセイからの結果が、親酵素
に比較して示される。
溶液、ブランク、セリン標準液及び緩衝液の光学密度で
あり、Ｃser は、標準液中でのセリンの濃度mg／mlであ
り、μＷser はセリンの分子量である。Ｑは、酵素溶液
のための希釈係数（この場合、８に等しい）であり、そ
してｔi はインキュベーション時間（分）である。次の
第Ｖ表においては、上記アッセイからの結果が、親酵素
に比較して示される。
【００９０】６．１．７．洗浄性についてのアッセイ 試験布（７cm×７cm、約１ｇ）を、ホウレンソウのジュ
ース（新鮮なホウレンソウから生成された）を含む、Ma
this Washing及びDrying Unit タイプＴＨ（Werner Mat
his AG,Zurich 、スイス) の容器を通して及び次に、過
剰のホウレンソウのジュースを除去するためにその機械
の圧力ロールを通して所望する綿 (１００％綿、ＤＳ７
１）の布を通すことによって製造した。
ース（新鮮なホウレンソウから生成された）を含む、Ma
this Washing及びDrying Unit タイプＴＨ（Werner Mat
his AG,Zurich 、スイス) の容器を通して及び次に、過
剰のホウレンソウのジュースを除去するためにその機械
の圧力ロールを通して所望する綿 (１００％綿、ＤＳ７
１）の布を通すことによって製造した。
【００９１】最後に、その布を、室温で強い空気流下で
乾燥せしめ、室温で３週間保存し、そして続いて、使用
する前、−１８℃で保持した。試験は、Terg−Ｏ−tome
ter 試験洗浄機（Jay C.Harris "Detergency Evaluatio
n and Testing",Interscience Publishers Ltd.,1954,
60〜61ページに記載される）により、１０分間、１００
rpm で恒温で行なわれた。洗剤として、次の標準粉末洗
剤を使用した：
乾燥せしめ、室温で３週間保存し、そして続いて、使用
する前、−１８℃で保持した。試験は、Terg−Ｏ−tome
ter 試験洗浄機（Jay C.Harris "Detergency Evaluatio
n and Testing",Interscience Publishers Ltd.,1954,
60〜61ページに記載される）により、１０分間、１００
rpm で恒温で行なわれた。洗剤として、次の標準粉末洗
剤を使用した：
【００９２】 ＬＡＳ，Ｎａｎｓａ Ｓ ８０ ０．４ ｇ／ｌ ＡＥ，Ｂｅｒａｌ Ｏ ６５ ０．１５ｇ／ｌ 石けん ０．１５ｇ／ｌ ＳＴＰＰ １．７５ｇ／ｌ 珪酸ナトリウム ０．４０ｇ／ｌ ＣＭＣ ０．０５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ ０．０１ｇ／ｌ Ｎａ2 ＳＯ4 ２．１０ｇ／ｌ 過硼酸塩 １．００ｇ／ｌ ＴＡＥＤ ０．１０ｇ／ｌ
【００９３】ここで、ＴＡＥＤ＝Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−
テトラアセチル−エチレンジアミン；pHは４ＮのＮａＯ
Ｈにより９．５に調整された。使用される水は、約９の
ＧＨ（Gernan Hardness)であった。試験は、０，０．０
５及び０．１ CPU／ｌの酵素濃度で行なわれ、そして２
つの独立した組の試験が、個々の突然変異体のために行
なわれた。
テトラアセチル−エチレンジアミン；pHは４ＮのＮａＯ
Ｈにより９．５に調整された。使用される水は、約９の
ＧＨ（Gernan Hardness)であった。試験は、０，０．０
５及び０．１ CPU／ｌの酵素濃度で行なわれ、そして２
つの独立した組の試験が、個々の突然変異体のために行
なわれた。
【００９４】８枚の布が、洗剤の１つのビーカー（８０
０ml）を用いて個々の試験のために使用された。それら
の布のうち、４枚はきれいで、そして他の４枚はホウレ
ンソウのジュースにより汚された。洗浄に続いて、それ
らの布を、バケツの中で２５分間、水道水によりフラッ
シュした。次に、それらの布を一晩、空気乾燥せしめ、
（日光に対して保護された）、そして規約反射率、Ｒ
を、４６０nmでDatacolor S.A.,Dietkikon、スイスから
のE1REPHO 2000分光光度計により決定した。洗浄能力示
差規約反射率の尺度として、ΔＲを使用し、ΔＲは、添
加された酵素による洗浄後の規約反射率−酵素添加によ
らない洗浄後の規約反射率に等しい。
０ml）を用いて個々の試験のために使用された。それら
の布のうち、４枚はきれいで、そして他の４枚はホウレ
ンソウのジュースにより汚された。洗浄に続いて、それ
らの布を、バケツの中で２５分間、水道水によりフラッ
シュした。次に、それらの布を一晩、空気乾燥せしめ、
（日光に対して保護された）、そして規約反射率、Ｒ
を、４６０nmでDatacolor S.A.,Dietkikon、スイスから
のE1REPHO 2000分光光度計により決定した。洗浄能力示
差規約反射率の尺度として、ΔＲを使用し、ΔＲは、添
加された酵素による洗浄後の規約反射率−酵素添加によ
らない洗浄後の規約反射率に等しい。
【００９５】６．１．８．熱安定性についてのアッセイ 洗浄性についての上記方法と同じ方法が、それぞれ４０
℃及び６０℃での試験を行なうことによって、生成され
た突然変異体の熱安定性を評価するために使用された。
℃及び６０℃での試験を行なうことによって、生成され
た突然変異体の熱安定性を評価するために使用された。
【００９６】６．２．結果 ６．２．１．ズブチリシン３０９及び１４７遺伝子のク
ローニング “３０９”株からの染色体ＤＮＡを、３７℃で３０分
間、リゾチームにより、及び次に６０℃で５分間、ＳＤ
Ｓにより細胞懸濁液を処理することにより単離した。続
いて、その懸濁液を、フェノールクロロホルム（５０：
５０）により抽出し、エタノールにより沈殿せしめ、そ
してその沈殿物をＴＥに再溶解した。この溶液を、３７
℃で１時間、ＲＮａｓｅにより処理した。
ローニング “３０９”株からの染色体ＤＮＡを、３７℃で３０分
間、リゾチームにより、及び次に６０℃で５分間、ＳＤ
Ｓにより細胞懸濁液を処理することにより単離した。続
いて、その懸濁液を、フェノールクロロホルム（５０：
５０）により抽出し、エタノールにより沈殿せしめ、そ
してその沈殿物をＴＥに再溶解した。この溶液を、３７
℃で１時間、ＲＮａｓｅにより処理した。
【００９７】約３０μｇの染色体ＤＮＡを、制限酵素Ｓ
ａｎ３Ａ（New England Biolabs)により一部消化し、そ
して約１．５kb〜約６．５kbのフラグメントを、１％ア
ガロースゲルからＤＥＡＥセルロース紙上で単離した
（他の種のズブチリシン遺伝子は約１．２kbの長さであ
る）。図１に概略されるように、そのフラグメントをア
ニールし、そしてＢａｍＨＩにより切断されたプラスミ
ドｐＳＸ５０（１９８７年４月１７日に出願されたアメ
リカ特許出願第０３９，２９８号に記載される、これは
引用により組込まれる）に連結した。次に、そのプラス
ミドを、コンピテントＢ．ズブチリスＤＮ４９７中に形
質転換せしめた。
ａｎ３Ａ（New England Biolabs)により一部消化し、そ
して約１．５kb〜約６．５kbのフラグメントを、１％ア
ガロースゲルからＤＥＡＥセルロース紙上で単離した
（他の種のズブチリシン遺伝子は約１．２kbの長さであ
る）。図１に概略されるように、そのフラグメントをア
ニールし、そしてＢａｍＨＩにより切断されたプラスミ
ドｐＳＸ５０（１９８７年４月１７日に出願されたアメ
リカ特許出願第０３９，２９８号に記載される、これは
引用により組込まれる）に連結した。次に、そのプラス
ミドを、コンピテントＢ．ズブチリスＤＮ４９７中に形
質転換せしめた。
【００９８】次に、その細胞を、１０mMのリン酸塩pH
７、６μｌ／mlのクロラムフェニコール及び０．２％の
キシロースを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、プラスミ
ドにおけるｘｙｎ−プロモーターを誘発した。そのプレ
ートはまた、プロテアーゼ産生形質転換体を、スキンミ
ルクが分解された場所での透明なかさにより検出するた
めに、１％スキンミルクも含んだ。
７、６μｌ／mlのクロラムフェニコール及び０．２％の
キシロースを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、プラスミ
ドにおけるｘｙｎ−プロモーターを誘発した。そのプレ
ートはまた、プロテアーゼ産生形質転換体を、スキンミ
ルクが分解された場所での透明なかさにより検出するた
めに、１％スキンミルクも含んだ。
【００９９】プロテアーゼ発現クローンを、１０-4の頻
度で生成した。２種のクローンは、ズブチリシン３０９
のための遺伝子を担持するプラスミド、ｐＳＸ８６及び
ｐＳＸ８８を有することが見出された。次に、その遺伝
子を、Maxam 及びGilbert の方法を用いて配列決定し
た。ズブチリシン３０９の推定されるヌクレオチド配列
は、表II表に示される。
度で生成した。２種のクローンは、ズブチリシン３０９
のための遺伝子を担持するプラスミド、ｐＳＸ８６及び
ｐＳＸ８８を有することが見出された。次に、その遺伝
子を、Maxam 及びGilbert の方法を用いて配列決定し
た。ズブチリシン３０９の推定されるヌクレオチド配列
は、表II表に示される。
【０１００】
【表６】
【０１０１】
【表７】
【０１０２】上記と同じ方法が、ズブチリシン１４７遺
伝子のクローニングのために使用された。但し、ＤＮＡ
フラグメントを、プラスミドｐＳＸ５６（アメリカ特許
出願第０３９，２９８号、前記にまた記載される）中に
連結し、そしてこれは、図２に示されるように、ｘｙｎ
プロモーターの代わりに、ｘｙｌプロモーターを有す
る。１つのクローンは、ズブチリシン１４７のための遺
伝子を担持するプラスミドｐＳＸ９４を有することが見
出された。この遺伝子のための配列は、下記第III 表に
示される。
伝子のクローニングのために使用された。但し、ＤＮＡ
フラグメントを、プラスミドｐＳＸ５６（アメリカ特許
出願第０３９，２９８号、前記にまた記載される）中に
連結し、そしてこれは、図２に示されるように、ｘｙｎ
プロモーターの代わりに、ｘｙｌプロモーターを有す
る。１つのクローンは、ズブチリシン１４７のための遺
伝子を担持するプラスミドｐＳＸ９４を有することが見
出された。この遺伝子のための配列は、下記第III 表に
示される。
【０１０３】
【表８】
【０１０４】
【表９】
【０１０５】６．２．２．ズブチリシン３０９遺伝子の
部位（サイト）特異的突然変異の発生 部位特異的突然変異はMorinagaらの方法（特にBiotechn
ology)により行なわれた。この突然変異をおこすため以
下のオリゴヌクレオチドが用いられた。
部位（サイト）特異的突然変異の発生 部位特異的突然変異はMorinagaらの方法（特にBiotechn
ology)により行なわれた。この突然変異をおこすため以
下のオリゴヌクレオチドが用いられた。
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】
【表１１】 この二重変異体に対し１個の変異体ＤＮＡフラグメント
を結合することによりＮＯＲ−２３７及びＮＯＲ−２３
５又はＮＯＲ−２３６の結合を行った。
を結合することによりＮＯＲ−２３７及びＮＯＲ−２３
５又はＮＯＲ−２３６の結合を行った。
【０１０８】ｋ）Ｓａｒ−１５３ Ａｌａ及びＡｓｎ−
２１８ Ｓｅｒ：上記と同様にＮＯＲ−３２４及びＮＯ
Ｒ−３２５の結合を行った。鋳型としてプラスミドｐＳ
Ｘ９３を用いて開裂重複突然変異を行った。ｐＳＸ９３
は図３及び図４に示してあり、ポリリンカーに挿入され
たターミネーターを含むズブチリシン３０９遺伝子の
０．７kbＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを含むｐ
ＵＣ１３である（Visira,J. 及びMessing J:1982,Gene
19:259〜268)。このターミネーター及びＨｉｎｄIII サ
イトは第IV表に示されていない。
２１８ Ｓｅｒ：上記と同様にＮＯＲ−３２４及びＮＯ
Ｒ−３２５の結合を行った。鋳型としてプラスミドｐＳ
Ｘ９３を用いて開裂重複突然変異を行った。ｐＳＸ９３
は図３及び図４に示してあり、ポリリンカーに挿入され
たターミネーターを含むズブチリシン３０９遺伝子の
０．７kbＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを含むｐ
ＵＣ１３である（Visira,J. 及びMessing J:1982,Gene
19:259〜268)。このターミネーター及びＨｉｎｄIII サ
イトは第IV表に示されていない。
【０１０９】酵素のＮ端部において突然変異を行なうた
めプラスミドｐＳＸ１１９を用いた。ｐＳＸ１１９はポ
リリンカーに挿入されたズブチリシン３０９遺伝子のＥ
ｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを有するｐＵＣ１３で
ある。こうして鋳型ｐＳＸ９３及びｐＳＸ１１９はズブ
チリシン３０９遺伝子全体をカバーする。突然変異
ａ），ｂ）、及びｅ）は図３に示すようにＸｂａＩ及び
ＣｌａＩによりｐＳＸ９３を切断することにより行な
い、ｃ），ｄ），ｆ）、及びｈ）は図４に示すようにＸ
ｂａＩ及びＨｉｎｄIII によりｐＳＸ９３を切断するこ
とにより行った。
めプラスミドｐＳＸ１１９を用いた。ｐＳＸ１１９はポ
リリンカーに挿入されたズブチリシン３０９遺伝子のＥ
ｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを有するｐＵＣ１３で
ある。こうして鋳型ｐＳＸ９３及びｐＳＸ１１９はズブ
チリシン３０９遺伝子全体をカバーする。突然変異
ａ），ｂ）、及びｅ）は図３に示すようにＸｂａＩ及び
ＣｌａＩによりｐＳＸ９３を切断することにより行な
い、ｃ），ｄ），ｆ）、及びｈ）は図４に示すようにＸ
ｂａＩ及びＨｉｎｄIII によりｐＳＸ９３を切断するこ
とにより行った。
【０１１０】突然変異ｇ）はＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩに
より切断することによりｐＳＸ１１９において行った。
重複突然変異体ｉ）及びｊ）はａ）からの０．７kbＸｂ
ａ−ＨｉｎｄIII フラグメントをＨｇｉＡＩにより一部
切断することにより形成された（ＨｇｉＡＩは突然変異
により形成されたＳａｃＩも切断する）。それぞれｃ）
及びｄ）突然変異からの１８０bpＸｂａＩ−ＨｇｉＡＩ
フラグメント及び０．５kbＨｇｉＡＩフラグメントはｐ
ＳＸ９３からの大きなＨｉｎｄIII −ＸｂａＩフラグメ
ントに縛られた。
より切断することによりｐＳＸ１１９において行った。
重複突然変異体ｉ）及びｊ）はａ）からの０．７kbＸｂ
ａ−ＨｉｎｄIII フラグメントをＨｇｉＡＩにより一部
切断することにより形成された（ＨｇｉＡＩは突然変異
により形成されたＳａｃＩも切断する）。それぞれｃ）
及びｄ）突然変異からの１８０bpＸｂａＩ−ＨｇｉＡＩ
フラグメント及び０．５kbＨｇｉＡＩフラグメントはｐ
ＳＸ９３からの大きなＨｉｎｄIII −ＸｂａＩフラグメ
ントに縛られた。
【０１１１】重複突然変異体ｋ）は突然変異体ｅ）及び
ｆ）を結合することにより形成された。アニーリング、
フィリング及び連結反応後、混合物をE.Coli MC 1000 r
- m+の形質転換に用いた。形質転換細胞の中の突然変
異体をVlasukら1983,J.Biol.Chem.258, 7141〜7148及び
Vlasuk G.P. 及びInouyeら、 p.292〜303,「Experiment
al Manipulation of Gene Expression" Academic Pres
s,New York に記載されているようにしてコロニーハイ
ブリッド法によりスクリーニングした。突然変異体はＤ
ＮＡ配列により確認された。
ｆ）を結合することにより形成された。アニーリング、
フィリング及び連結反応後、混合物をE.Coli MC 1000 r
- m+の形質転換に用いた。形質転換細胞の中の突然変
異体をVlasukら1983,J.Biol.Chem.258, 7141〜7148及び
Vlasuk G.P. 及びInouyeら、 p.292〜303,「Experiment
al Manipulation of Gene Expression" Academic Pres
s,New York に記載されているようにしてコロニーハイ
ブリッド法によりスクリーニングした。突然変異体はＤ
ＮＡ配列により確認された。
【０１１２】６．２．３．変異ズブチリシンの表示 正確な突然変異の配列確認後、突然変異ＤＮＡフラグメ
ントをプラスミドｐＳＸ９２に挿入し、これを突然変異
体の形成に用いた。プラスミドｐＳＸ９２は図５に示さ
れており、ＣｌａＩで切断され、ＤＮＡポリメラーゼＩ
のKlenowフラグメントで満たされ、及びクローニングさ
れたＳｕｂ３０９遺伝子からのフラグメントＤｒａＩ−
ＮｈｅＩ及びＮｈｅＩ−ＨｉｎｄIII の挿入前にＨｉｎ
ｄIII で切断されたプラスミドｐＳＸ６２にＳｕｂ３０
９遺伝子をクローニングすることにより形成された。
ントをプラスミドｐＳＸ９２に挿入し、これを突然変異
体の形成に用いた。プラスミドｐＳＸ９２は図５に示さ
れており、ＣｌａＩで切断され、ＤＮＡポリメラーゼＩ
のKlenowフラグメントで満たされ、及びクローニングさ
れたＳｕｂ３０９遺伝子からのフラグメントＤｒａＩ−
ＮｈｅＩ及びＮｈｅＩ−ＨｉｎｄIII の挿入前にＨｉｎ
ｄIII で切断されたプラスミドｐＳＸ６２にＳｕｂ３０
９遺伝子をクローニングすることにより形成された。
【０１１３】突然変異体を示すため、突然変異フラグメ
ント（ＸｂａＩ−ＣｌａＩ，ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 、
又はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ）を適当な突然変異プラスミ
ドｐＳＸ９３又はｐＳＸ１１９より切り出しｐＳＸ９２
に挿入した。次いでＢ．ズブチリス株ＤＮ４９７を形質
転換するため突然変異ｐＳＸ９２を用い、親遺伝子のク
ローニングに用いた同じ培地及び同じ条件において増殖
させた。適当に増殖後、突然変異酵素を回収し精製し
た。
ント（ＸｂａＩ−ＣｌａＩ，ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 、
又はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ）を適当な突然変異プラスミ
ドｐＳＸ９３又はｐＳＸ１１９より切り出しｐＳＸ９２
に挿入した。次いでＢ．ズブチリス株ＤＮ４９７を形質
転換するため突然変異ｐＳＸ９２を用い、親遺伝子のク
ローニングに用いた同じ培地及び同じ条件において増殖
させた。適当に増殖後、突然変異酵素を回収し精製し
た。
【０１１４】６．２．４．変異ズブチリシンの酸化安定
性 突然変異体ａ）及びｂ）を５０℃及びpH７において２０
分後０．０１Ｍ過酢酸中のその酸化安定性についてテス
トした。結果を第IV表に示すが、これはオキシダントも
しくは熱により未処理のサンプルに対する熱処理したサ
ンプルの残留蛋白分解活性を示している。
性 突然変異体ａ）及びｂ）を５０℃及びpH７において２０
分後０．０１Ｍ過酢酸中のその酸化安定性についてテス
トした。結果を第IV表に示すが、これはオキシダントも
しくは熱により未処理のサンプルに対する熱処理したサ
ンプルの残留蛋白分解活性を示している。
【０１１５】
【表１２】
【０１１６】突然変異体ｄ（Ｍｅｔ２２２からＡｌａ）
が親酵素及び突然変異体ａにくらべすぐれた酸化安定性
を示すことがわかる。ｇ）及びｈ）を除くすべての突然
変異体を室温及び３５℃、pH６．５及び９．０、１５分
〜２時間１００〜５００ppm 次亜塩素酸塩で処理した。
このテストは、突然変異体ｃ），ｄ），ｉ）、及びｊ）
（すべてＭｅｔ−２２２）が他の突然変異体よりも３〜
５倍次亜塩素酸塩に耐えることを示した。通常のタイプ
の液体洗剤でテストした場合、突然変異体ｆ）が他の突
然変異体及び親酵素と比較してすぐれた安定性を示すこ
とがわかった。
が親酵素及び突然変異体ａにくらべすぐれた酸化安定性
を示すことがわかる。ｇ）及びｈ）を除くすべての突然
変異体を室温及び３５℃、pH６．５及び９．０、１５分
〜２時間１００〜５００ppm 次亜塩素酸塩で処理した。
このテストは、突然変異体ｃ），ｄ），ｉ）、及びｊ）
（すべてＭｅｔ−２２２）が他の突然変異体よりも３〜
５倍次亜塩素酸塩に耐えることを示した。通常のタイプ
の液体洗剤でテストした場合、突然変異体ｆ）が他の突
然変異体及び親酵素と比較してすぐれた安定性を示すこ
とがわかった。
【０１１７】６．２．５．変異ズブチリシンの蛋白質分
解活性 前記方法に従い、蛋白質基質としてのカゼインに対し種
々の突然変異体の蛋白質分解活性をテストした。結果を
第Ｖ表に示す。この表より突然変異体ａ）が親にくらべ
高い活性を示すことがわかる。また、Ｍｅｔ−２２２突
然変異体が親よりも活性が低いこともわかるが、その改
良された酸化安定性のためオキシダントを含む洗浄にお
ける使用は除外されない。
解活性 前記方法に従い、蛋白質基質としてのカゼインに対し種
々の突然変異体の蛋白質分解活性をテストした。結果を
第Ｖ表に示す。この表より突然変異体ａ）が親にくらべ
高い活性を示すことがわかる。また、Ｍｅｔ−２２２突
然変異体が親よりも活性が低いこともわかるが、その改
良された酸化安定性のためオキシダントを含む洗浄にお
ける使用は除外されない。
【０１１８】
【表１３】
【０１１９】６．２．６．変異ズブチリシンの洗浄性 前記方法に従い、ホウレンソウジュースに対し種々の突
然変異体の洗浄性をテストした。結果を第VI表に示す。
この表より、テストした突然変異体はすべて親酵素と比
較して改良された洗浄能を有し、突然変異体ｃ），
ｄ），ｉ）、及びｊ）は特にすぐれていることがわか
る。
然変異体の洗浄性をテストした。結果を第VI表に示す。
この表より、テストした突然変異体はすべて親酵素と比
較して改良された洗浄能を有し、突然変異体ｃ），
ｄ），ｉ）、及びｊ）は特にすぐれていることがわか
る。
【０１２０】
【表１４】
【０１２１】６．２．７．変異ズブチリシンの熱安定性 ４０℃及び６０℃において洗濯適性テストを用いること
により野生タイプ酵素に対し突然変異体ｆ）の熱安定性
をテストした。結果を第VII 表に示す。この表より、突
然変異体ｆ）は６０℃において野生タイプ酵素にくらべ
改良された洗濯適性を示すが、４０℃では突然変異体
ｆ）の洗濯適性は野性タイプ酵素よりわずかのみすぐれ
ていることがわかる。
により野生タイプ酵素に対し突然変異体ｆ）の熱安定性
をテストした。結果を第VII 表に示す。この表より、突
然変異体ｆ）は６０℃において野生タイプ酵素にくらべ
改良された洗濯適性を示すが、４０℃では突然変異体
ｆ）の洗濯適性は野性タイプ酵素よりわずかのみすぐれ
ていることがわかる。
【０１２２】
【表１５】
【０１２３】６．３．考察 ズブチリシン遺伝子を、細菌バシラスレンタス（Bacill
us lentus)の１４７および３０９突然変異体からクロー
ン化し、クローン化した遺伝子を配列させた。ズブチリ
シン１４７および３０９突然変異体の推定アミノ酸配列
と、他のズブチリシンの配列と比較することにより、突
然変異の際、親酵素の物理的特性を変え得るサイトは同
一であった。ズブチリシン３０９遺伝子内において、こ
れらのいくつかのサイトで突然変異を生じさせるためサ
イト特異性変異誘発を用いた。
us lentus)の１４７および３０９突然変異体からクロー
ン化し、クローン化した遺伝子を配列させた。ズブチリ
シン１４７および３０９突然変異体の推定アミノ酸配列
と、他のズブチリシンの配列と比較することにより、突
然変異の際、親酵素の物理的特性を変え得るサイトは同
一であった。ズブチリシン３０９遺伝子内において、こ
れらのいくつかのサイトで突然変異を生じさせるためサ
イト特異性変異誘発を用いた。
【０１２４】得られた突然変異体の酵素を、バシラス菌
株内で発現させ、次いで種々の物理的および化学的パラ
メータを試験した。幾つかの突然変異体は、親ズブチリ
シン３０９酵素と比較して酸化に対する改良された安定
性、改良されたタンパク質分解能又は改良された洗浄性
を有することを示した。これらの突然変異体は、洗剤組
成物中に含まれる酵素中で望ましい特性を示す。
株内で発現させ、次いで種々の物理的および化学的パラ
メータを試験した。幾つかの突然変異体は、親ズブチリ
シン３０９酵素と比較して酸化に対する改良された安定
性、改良されたタンパク質分解能又は改良された洗浄性
を有することを示した。これらの突然変異体は、洗剤組
成物中に含まれる酵素中で望ましい特性を示す。
【図１】図１は、ＢａｍＨＩ切断プラスミドｐＳｘ５０
への、バシラス・レンタス株３０９ＤＮＡをＳａｕ３Ａ
制限エンドヌクレアーゼで部分的に消化することにより
得られた長さ１．５kb〜６．５kbのサブセットの断片の
挿入を示す図である。反対の向きにズブチリシン３０９
を含んでいる得られる２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ
８６とｐＳｘ８８も公知である。
への、バシラス・レンタス株３０９ＤＮＡをＳａｕ３Ａ
制限エンドヌクレアーゼで部分的に消化することにより
得られた長さ１．５kb〜６．５kbのサブセットの断片の
挿入を示す図である。反対の向きにズブチリシン３０９
を含んでいる得られる２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ
８６とｐＳｘ８８も公知である。
【図２】図２は、プラスミドｐＳｘ５６へのバシラス・
レンタス株１４７ＤＮＡ断片の挿入を示す図である。Ｓ
ａｕ３Ａ制限エンドヌクレアーゼを用いて、株１４７Ｄ
ＮＡを部分的に消化した。次に、サイズが１．５〜６．
５kbの断片を、ＢａｍＨＩ開裂プラスミドｐＳｘ５６に
結合させた。生成物であるｐＳｘ９４はズブチリシン１
４７遺伝子を含有している。
レンタス株１４７ＤＮＡ断片の挿入を示す図である。Ｓ
ａｕ３Ａ制限エンドヌクレアーゼを用いて、株１４７Ｄ
ＮＡを部分的に消化した。次に、サイズが１．５〜６．
５kbの断片を、ＢａｍＨＩ開裂プラスミドｐＳｘ５６に
結合させた。生成物であるｐＳｘ９４はズブチリシン１
４７遺伝子を含有している。
【図３】図３は、森永等の方法を用いたギャップ二本鎖
変異誘発を示す図である〔１９８４年、バイオテクノロ
ジー、２：６３６〜６３９）。この特徴は、ｐｕＣ１３
由来の２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ９３とｐＳｘ１
１９にある。ｐＳｘ９３はズブチリシン３０９遺伝子の
ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 断片を含んでおり、そしてｐＳ
ｘ１１９はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩにおける断片中のズブ
チリシン３０９遺伝子の残部を含んでいる。プラスミド
ｐＳｘ９３をＸｂａＩとＣｌａＩで開裂し、そしてギャ
ップ分子を、ＳｃａＩ切断ｐＳｘ９３と混合し、変性
し、そして再アニーリングを行って、ズブチリシン３０
９コード配列内に延びている一本鎖ＤＮＡの領域を有す
るプラスミドを生成する。ズブチリシン３０９遺伝子に
相同であるが変異を含んでいる合成オリゴヌクレオチド
を、一本鎖ギャップに対してアニーリング後、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー断片とＴ４リガーゼを用いて充
填する。プラスミドを複製すると、ズブチリシン３０９
遺伝子の二本鎖変異体が生成する。
変異誘発を示す図である〔１９８４年、バイオテクノロ
ジー、２：６３６〜６３９）。この特徴は、ｐｕＣ１３
由来の２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ９３とｐＳｘ１
１９にある。ｐＳｘ９３はズブチリシン３０９遺伝子の
ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 断片を含んでおり、そしてｐＳ
ｘ１１９はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩにおける断片中のズブ
チリシン３０９遺伝子の残部を含んでいる。プラスミド
ｐＳｘ９３をＸｂａＩとＣｌａＩで開裂し、そしてギャ
ップ分子を、ＳｃａＩ切断ｐＳｘ９３と混合し、変性
し、そして再アニーリングを行って、ズブチリシン３０
９コード配列内に延びている一本鎖ＤＮＡの領域を有す
るプラスミドを生成する。ズブチリシン３０９遺伝子に
相同であるが変異を含んでいる合成オリゴヌクレオチド
を、一本鎖ギャップに対してアニーリング後、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー断片とＴ４リガーゼを用いて充
填する。プラスミドを複製すると、ズブチリシン３０９
遺伝子の二本鎖変異体が生成する。
【図４】図４は、森永等の方法を用いたギャップ二本鎖
変異誘発を示す図である〔１９８４年、バイオテクノロ
ジー、２：６３６〜６３９）。この特徴は、ｐｕＣ１３
由来の２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ９３とｐＳｘ１
１９にある。ｐＳｘ９３はズブチリシン３０９遺伝子の
ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 断片を含んでおり、そしてｐＳ
ｘ１１９はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩにおける断片中のズブ
チリシン３０９遺伝子の残部を含んでいる。プラスミド
ｐＳｘ１１９とＥｃｏＲＩ酵素及びＸｂａＩ酵素を用い
て、同様の操作を行い、ズブチリシン遺伝子３０９の対
応領域に変異を生じさせる。
変異誘発を示す図である〔１９８４年、バイオテクノロ
ジー、２：６３６〜６３９）。この特徴は、ｐｕＣ１３
由来の２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ９３とｐＳｘ１
１９にある。ｐＳｘ９３はズブチリシン３０９遺伝子の
ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 断片を含んでおり、そしてｐＳ
ｘ１１９はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩにおける断片中のズブ
チリシン３０９遺伝子の残部を含んでいる。プラスミド
ｐＳｘ１１９とＥｃｏＲＩ酵素及びＸｂａＩ酵素を用い
て、同様の操作を行い、ズブチリシン遺伝子３０９の対
応領域に変異を生じさせる。
【図５】図５は、ズブチリシン３０９を担持しているプ
ラスミドｐＳｘ６２の誘導体であるプラスミドｐＳｘ９
３を示す図である。適当な制限エンドヌクレアーゼを用
いて変異プラスミドｐＳｘ９３又はｐＳｘ１１９（図３
及び図４参照）から切除した変異断片（即ち、ＸｂａＩ
−ＣｌａＩ，ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 又はＥｃｏＲＩ−
ＸｂａＩ）をプラスミドｐＳｘ９２に挿入し、枯草菌
（B.subtilis) 株ＤＮ４９７中で発現させた。
ラスミドｐＳｘ６２の誘導体であるプラスミドｐＳｘ９
３を示す図である。適当な制限エンドヌクレアーゼを用
いて変異プラスミドｐＳｘ９３又はｐＳｘ１１９（図３
及び図４参照）から切除した変異断片（即ち、ＸｂａＩ
−ＣｌａＩ，ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 又はＥｃｏＲＩ−
ＸｂａＩ）をプラスミドｐＳｘ９２に挿入し、枯草菌
（B.subtilis) 株ＤＮ４９７中で発現させた。
【図６】図６は、ズブチリシン３０９とズブチリシン１
４７を両方とも切形で含んでいるプラスミドｐＳｘ１４
３を示す図である。２種の遺伝子の相同性領域間の生体
内組み換えにより、活性プロテアーゼを生じさせること
ができる。
４７を両方とも切形で含んでいるプラスミドｐＳｘ１４
３を示す図である。２種の遺伝子の相同性領域間の生体
内組み換えにより、活性プロテアーゼを生じさせること
ができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 ファニイ ノリス デンマーク国，デーコー−2900 ヘルレ ルプ，アールマンス アレ 34 (72)発明者 ステフェン ベー．ペーターセン デンマーク国，デーコー−2750 バルレ ルプ，スネペホイ 15 (72)発明者 レイフ ネールスコウ−ラウリドゥセン デンマーク国，デーコー−4600 ケー エ，ビルケベイ 10 (72)発明者 ビリ ヨハネス イェンセン デンマーク国，デーコー−2880 バクス バエルト，スコウキルデン ６ (72)発明者 ドリト アースリング デンマーク国，デーコー−4000 ロスキ ルデ，スボゲルスレウ，フィアン ８ (56)参考文献 ＮＵＣＬＥＩＣ．ＡＣＩＤ．ＲＥＳＥ ＡＲＣＨ．，11（1983）Ｐ．7911−7925 Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，158（２) （1984），Ｐ．411−418 ＮＵＣＬＥＩＣ．ＡＣＩＤ．ＲＥＳＥ ＡＲＣＨ．，13（1985），Ｐ．8913− 8922 Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，103（1988）, 103（1988），Ｐ．1060−1065
Claims (49)
- 【請求項１】 第Ｉ表（ａ）に実質的に記載される如き
アミノ酸配列を含んでなる突然変異体ズブチリシン酵素
３０９。 - 【請求項２】 次の位置： ６，９，１１−１２，１９，２５，３６−３８，５３−
５９，６７，６８，７１，８９，１０４，１１１，１１
５，１２０，１２１−１２２，１２４，１２８，１３
１，１４０，１５３−１６６，１６８，１６９−１７
０，１７２，１７５，１８０，１８２，１８６，１８
７，１９１，１９４，１９５，１９９，２１８，２１
９，２２２，２２６，２３４−２３８，２４１，２６０
−２６２，２６５，２６８、または２７５の１個所また
はそれ以上の個所でアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基
により置換されている請求の範囲第１項記載の突然変異
体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項３】 アミノ酸が次の位置：３６，５６，１５
９もしくは１６４〜１６６の１個所またはそれ以上で挿
入されている請求の範囲第２項記載の突然変異体のズブ
チリシン酵素３０９。 - 【請求項４】 ６位のトリプトファン残基が、チロシン
によって置換されている、請求の範囲第２項記載の突然
変異体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項５】 ６７位のヒスチジン残基が、グルタミン
酸もしくはアスパラギン酸で置換されている請求の範囲
第２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項６】 ６８位のバリン残基が、システインもし
くはメチオニンで置換されている請求の範囲第２項記載
の突然変異体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項７】 ７１位のトレオニン残基が、アスパラギ
ン酸もしくはグルタミン酸で置換されている請求の範囲
第２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項８】 １５３位のセリン残基が、アラニンで置
換されている請求の範囲第２項記載の突然変異体のズブ
チリシン酵素３０９。 - 【請求項９】 １６８位のプロリン残基が、アラニンに
よって置換されている、請求の範囲第２項記載の突然変
異体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項１０】 １７０位のアルギニン残基が、チロシ
ンで置換されている請求の範囲第２項記載の突然変異体
のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項１１】 １７５位のメチオニン残基が、イソロ
イシンで置換されている請求の範囲第２項記載の突然変
異体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項１２】 １９５位のグリシン残基が、グルタミ
ン酸もしくはアスパラギン酸で置換されている請求の範
囲第２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項１３】 ２１８位のアスパラギン残基が、セリ
ンで置換されている請求の範囲第２項記載の突然変異体
のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項１４】 ２１９位のグリシン残基が、メチオニ
ンによって置換されている、請求の範囲第２項記載の突
然変異体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項１５】 ２２２位のメチオニン残基が、システ
インもしくはアラニンで置換されている請求の範囲第２
項記載の突然変異体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項１６】 ２７５位のアルギニン残基が、グルタ
ミンで置換されている請求の範囲第２項記載の突然変異
体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項１７】 １９位のアルギニン残基が、グリシン
で置換されておりさらに２１９位のグリシン残基がシス
テインで置換されている請求の範囲第２項記載の突然変
異体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項１８】 １５３位のセリン残基が、アラニンで
置換されておりさらに２１８位のアスパラギン残基がセ
リンで置換されている請求の範囲第２項記載の突然変異
体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項１９】 １９５位のグリシン残基が、グルタミ
ン酸で置換されており更に２２２位のメチオニン残基が
アラニンもしくはシステインによって置換されている、
請求の範囲第２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素
３０９。 - 【請求項２０】 ２１９位のグリシン残基がシステイン
で置換されており、更に２２２位のメチオニン残基がシ
ステインで置換されている請求の範囲第２項記載の突然
変異体のズブチリシン酵素３０９。 - 【請求項２１】 アミノ酸配列が第Ｉ表（ｂ）に実質的
に記載される如きアミノ酸配列を含んでなる突然変異体
のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項２２】 次の位置： ６，９，１１−１２，１９，２５，３６−３８，５３−
５９，６７，６８，７１，８９，１１１，１１５，１２
０，１２１−１２２，１２４，１２８，１３１，１４
０，１５３−１６６，１６８，１６９−１７０，１７
２，１７５，１８０，１８２，１８６，１８７，１９
１，１９４，１９５，１９９，２１８，２１９，２２
２，２２６，２３４−２３８，２４１，２６０−２６
２，２６５，２６８もしくは２７５、の１個所またはそ
れ以上の個所のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によっ
て置換されている請求の範囲第２１項記載の突然変異体
のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項２３】 １種もしくはそれ以上のアミノ酸残基
が、次の位置：３６，５６，１５９または１６４〜１６
６の１個所またはそれ以上の個所で挿入されている、請
求の範囲第２２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素
１４７。 - 【請求項２４】 ６位のトリプトファン残基がチロシン
で置換されている請求の範囲第２２項記載の突然変異体
のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項２５】 ６７位のヒスチジン残基が、グルタミ
ン酸もしくはアスパラギン酸によって置換されている、
請求の範囲第２２項記載の突然変異体のズブチリシン酵
素１４７。 - 【請求項２６】 ６８位のバリン残基が、システインも
しくはメチオニンで置換されている請求の範囲第２２項
記載の突然変異体のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項２７】 ７１位のトレオニン残基が、アスパラ
ギン酸もしくはグルタミン酸で置換されている請求の範
囲第２２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素１４
７。 - 【請求項２８】 １５３位のアラニン残基が、セリンで
置換されている請求の範囲第２３項記載の突然変異体の
ズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項２９】 １６８位のプロリン残基が、アラニン
で置換されている請求の範囲第２２項記載の突然変異体
のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項３０】 １７０位のアルギニン残基が、チロシ
ンによって置換されている、請求の範囲第２２項記載の
突然変異体のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項３１】 １７５位のメチオニン残基が、イソロ
イシンで置換されている請求の範囲第２２項記載の突然
変異体のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項３２】 １９５位のグルタミン酸残基が、アス
パラギン酸もしくはグリシンで置換されている請求の範
囲第２２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素１４
７。 - 【請求項３３】 ２１８位のセリン残基が、アスパラギ
ンで置換されている請求の範囲第２２項記載の突然変異
体のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項３４】 ２１９位のグリシン残基が、メチオニ
ンで置換されている請求の範囲第２２項記載の突然変異
体のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項３５】 ２２２位のメチオニン残基が、システ
インもしくはアラニンで置換されている請求の範囲第２
２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項３６】 ２７５位のグルタミン残基が、アルギ
ニンによって置換されている、請求の範囲第２２項記載
の突然変異体のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項３７】 １９位のアルギニン残基が、グリシン
で置換され、さらに２１９位のグリシン残基がシステイ
ンで置換されている請求の範囲第２２項記載の突然変異
体のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項３８】 １５３位のアラニン残基が、セリンで
置換され、さらに２１８位のセリン残基がアスパラギン
で置換されている請求の範囲第２２項記載の突然変異体
のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項３９】 １９５位のグルタミン酸残基が、グリ
シンで置換され、更に２２２位のメチオニン残基がアラ
ニンもしくはシステインで置換されている請求の範囲第
２２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項４０】 ２１９位のグリシン残基がシステイン
で置換され、さらに２２２位のメチオニン残基がシステ
インで置換されている請求の範囲第２２項記載の突然変
異体のズブチリシン酵素１４７。 - 【請求項４１】 第Ｉ表（ａ）に実質的に記載される如
きアミノ酸配列を含んでなるズブチリシン酵素をコード
するヌクレオチド配列を含んでなる組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項４２】 第Ｉ表（ｂ）に実質的に記載される如
きアミノ酸配列を含んでなるズブチリシン酵素をコード
するヌクレオチド配列を含んでなる組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項４３】 第II表に実質的に記載される如きズブ
チリシン３０９酵素をコードするヌクレオチド配列を含
んでなる組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項４４】 第III 表に実質的に記載される如きズ
ブチリシン１４７酵素をコードするヌクレオチド配列を
含んでなる組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項４５】 次の位置： ６，９，１１−１２，１９，２５，３６−３８，５３−
５９，６７，６８，７１，８９，１０４，１１１，１１
５，１２０，１２１−１２２，１２４，１２８，１３
１，１４０，１５３−１６６，１６８，１６９−１７
０，１７２，１７５，１８０，１８２，１８６，１８
７，１９１，１９４，１９５，１９９，２１８，２１
９，２２２，２２６，２３４−２３８，２４１，２６０
−２６２，２６５，２６８もしくは２７５の１個所もし
くはそれ以上の個所の対応するアミノ酸残基が、他のア
ミノ酸残基での置換により、または１個もしくはそれ以
上のアミノ酸残基を挿入もしくは欠失により変化される
ように核酸配列が変更されている請求の範囲第４１項も
しくは第４３項記載の組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項４６】 次の位置： ６，９，１１−１２，１９，２５，３６−３８，５３−
５９，６７，６８，７１，８９，１０４，１１１，１１
５，１２０，１２１−１２２，１２４，１２８，１３
１，１４０，１５３−１６６，１６８，１６９−１７
０，１７２，１７５，１８０，１８２，１８６，１８
７，１９１，１９４，１９５，１９９，２１８，２１
９，２２２，２２６，２３４−２３８，２４１，２６０
−２６２，２６５，２６８もしくは２７５、の１個所も
しくはそれ以上の個所の対応するアミノ酸残基が、他の
アミノ酸残基での置換により、または１個もしくはそれ
以上のアミノ酸残基を挿入もしくは欠失により変化され
るように核酸配列が変更されている請求の範囲第４２項
もしくは第４４項記載の組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項４７】 核酸配列が、次の位置：３６，５６，
１５９もしくは１６４〜１６６の１個所もしくはそれ以
上のアミノ酸残基が挿入されるように変更されている請
求の範囲第４１項もしくは第４３項記載の組換えＤＮＡ
分子。 - 【請求項４８】 核酸配列が、次の位置：３６，５６，
１５９、もしくは１６４〜１６６の１個所もしくはそれ
以上のアミノ酸残基が挿入されるように変更されている
請求の範囲第４２項もしくは第４４項記載の組換えＤＮ
Ａ分子。 - 【請求項４９】 請求の範囲第１項〜第４０項のいずれ
かに記載のズブチリシン酵素の製造方法であって、ズブ
チリシン酵素を発現するために請求の範囲第４１項〜第
４８項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換
された宿主細胞を培養し、次いでズブチリシン酵素を回
収することを特徴とする、前記製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK006488A DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Enzymer |
| DK64/88 | 1988-01-07 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1501511A Division JPH0675504B2 (ja) | 1988-01-07 | 1989-01-06 | 変異ズブチリシン遺伝子 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9268984A Division JPH10113179A (ja) | 1988-01-07 | 1997-10-01 | 変異ズブチリシン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06292577A JPH06292577A (ja) | 1994-10-21 |
| JP2726799B2 true JP2726799B2 (ja) | 1998-03-11 |
Family
ID=8089323
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1501511A Expired - Fee Related JPH0675504B2 (ja) | 1988-01-07 | 1989-01-06 | 変異ズブチリシン遺伝子 |
| JP6016202A Expired - Lifetime JP2726799B2 (ja) | 1988-01-07 | 1994-02-10 | 変異ズブチリシン |
| JP9268984A Pending JPH10113179A (ja) | 1988-01-07 | 1997-10-01 | 変異ズブチリシン |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1501511A Expired - Fee Related JPH0675504B2 (ja) | 1988-01-07 | 1989-01-06 | 変異ズブチリシン遺伝子 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9268984A Pending JPH10113179A (ja) | 1988-01-07 | 1997-10-01 | 変異ズブチリシン |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US6506589B1 (ja) |
| EP (4) | EP1538204A3 (ja) |
| JP (3) | JPH0675504B2 (ja) |
| AT (1) | ATE136329T1 (ja) |
| DE (1) | DE68926163T2 (ja) |
| DK (3) | DK6488D0 (ja) |
| WO (1) | WO1989006279A1 (ja) |
Families Citing this family (693)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5185258A (en) | 1984-05-29 | 1993-02-09 | Genencor International, Inc. | Subtilisin mutants |
| DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| US6287841B1 (en) | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
| US5324653A (en) * | 1988-02-11 | 1994-06-28 | Gist-Brocades N.V. | Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins |
| CN1056187C (zh) * | 1988-02-11 | 2000-09-06 | 金克克国际有限公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
| US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
| US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
| DK316989D0 (da) * | 1989-06-26 | 1989-06-26 | Novo Nordisk As | Enzymer |
| BR9006832A (pt) * | 1989-06-26 | 1991-08-06 | Unilever Nv | Composicao detergente enzimatica |
| JPH04500385A (ja) * | 1989-06-26 | 1992-01-23 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 酵素洗剤組成物 |
| US5658871A (en) * | 1989-07-07 | 1997-08-19 | Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. | Microbial lipase muteins and detergent compositions comprising same |
| ATE187490T1 (de) * | 1989-08-25 | 1999-12-15 | Henkel Research Corp | Alkalisches proteolytisches enzym und verfahren zur herstellung |
| DE4023458A1 (de) * | 1989-08-31 | 1991-03-07 | Kali Chemie Ag | Neue hochalkalische proteasen |
| US5352603A (en) * | 1989-08-31 | 1994-10-04 | Kali-Chemie Ag | Highly alkaline proteases |
| US6271012B1 (en) * | 1989-10-11 | 2001-08-07 | Genencor International, Inc. | Protease muteins and their use in detergents |
| US5541062A (en) * | 1990-02-23 | 1996-07-30 | Arch Development Corporation | Methods and compositions for preparing protein processing enzymes |
| DK97190D0 (da) * | 1990-04-19 | 1990-04-19 | Novo Nordisk As | Oxidationsstabile detergentenzymer |
| US5733473A (en) * | 1990-11-14 | 1998-03-31 | The Procter & Gamble Company | Liquid detergent composition containing lipase and protease |
| DK271490D0 (da) * | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Novo Nordisk As | Detergentkomposition |
| US6967080B1 (en) * | 1990-12-05 | 2005-11-22 | Novozymes A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
| KR100237968B1 (ko) * | 1990-12-05 | 2000-01-15 | 한센 핀 베네드 | 변화된 에피토프를 지닌 단백질 및 그 제조방법 |
| US5766898A (en) * | 1990-12-05 | 1998-06-16 | Novo Nordisk A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
| GB9027836D0 (en) * | 1990-12-21 | 1991-02-13 | Unilever Plc | Enzymes and enzymatic detergent compositions |
| US5482849A (en) * | 1990-12-21 | 1996-01-09 | Novo Nordisk A/S | Subtilisin mutants |
| EP0769549A3 (en) * | 1990-12-21 | 1997-05-21 | Novo Nordisk A/S | Enzyme mutants having a low degree of variation of the molecular charge over a pH range |
| US5340735A (en) | 1991-05-29 | 1994-08-23 | Cognis, Inc. | Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability |
| US5646028A (en) * | 1991-06-18 | 1997-07-08 | The Clorox Company | Alkaline serine protease streptomyces griseus var. alkaliphus having enhanced stability against urea or guanidine |
| DE4224125A1 (de) * | 1991-07-27 | 1993-01-28 | Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg | Verfahren zur verbesserung der stabilitaet von enzymen und stabilisierte enzyme |
| US5275945A (en) * | 1991-10-08 | 1994-01-04 | Vista Chemical Company | Alkaline proteases stable in heavy-duty detergent liquids |
| CA2119362A1 (en) * | 1991-10-16 | 1993-04-29 | Carlo J. Van Den Bergh | Aqueous enzymatic detergent compositions |
| US5371198A (en) * | 1991-12-16 | 1994-12-06 | Novo Nordisk A/S | Method for protection of proteolysis-susceptible protein during protein production in a fluid medium |
| US5623059A (en) * | 1992-03-09 | 1997-04-22 | Novo Nordisk A/S | Method for protection of proteolysis-susceptible protein during protein production in a fluid medium |
| EP0571014B1 (en) * | 1992-05-18 | 2004-03-31 | Genencor International, Inc. | Bacteria producing alkaline proteases, and production of these alkaline proteases |
| CA2139928C (en) * | 1992-07-17 | 2005-09-06 | Leonardus Johannes Sofie Marie Mulleners | High alkaline serine proteases |
| JPH0763377B2 (ja) * | 1992-09-03 | 1995-07-12 | 大阪府 | 耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子、組換え体プラスミドｐＡＢＴ１７、枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４およびその枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４の形質転換体 |
| DE4231726A1 (de) * | 1992-09-23 | 1994-03-24 | Cognis Bio Umwelt | Mutierte subtilisinartige Serinproteasen |
| GB9220669D0 (en) * | 1992-09-30 | 1992-11-11 | Unilever Plc | Detergent composition |
| US6436690B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-20 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted |
| US6440717B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-27 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| BR9407833A (pt) * | 1993-10-14 | 1997-05-13 | Procter & Gamble | Composições alvejantes compreendendo enzimas protease |
| CA2173105C (en) * | 1993-10-14 | 2003-05-27 | Andre Baeck | Protease-containing cleaning compositions |
| MA23346A1 (fr) | 1993-10-14 | 1995-04-01 | Genencor Int | Variantes de la subtilisine |
| US5837458A (en) * | 1994-02-17 | 1998-11-17 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
| US6406855B1 (en) | 1994-02-17 | 2002-06-18 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
| US6335160B1 (en) | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
| US6599730B1 (en) * | 1994-05-02 | 2003-07-29 | Procter & Gamble Company | Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| CA2190349A1 (en) * | 1994-06-23 | 1996-01-04 | James William Gordon | Dishwashing compositions |
| US6066611A (en) * | 1994-10-13 | 2000-05-23 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising protease enzymes |
| US6455295B1 (en) | 1995-03-08 | 2002-09-24 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| IL117350A0 (en) | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6475765B1 (en) | 1995-03-09 | 2002-11-05 | Procter & Gamble Company | Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US5837517A (en) | 1995-05-05 | 1998-11-17 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
| CN100387712C (zh) * | 1995-05-05 | 2008-05-14 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 蛋白酶变体和组合物 |
| US6682924B1 (en) * | 1995-05-05 | 2004-01-27 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
| US20120165241A1 (en) * | 1995-05-05 | 2012-06-28 | Unilever Plc | Subtilase Variants |
| US6936289B2 (en) | 1995-06-07 | 2005-08-30 | Danisco A/S | Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products |
| ATE409743T1 (de) | 1996-11-04 | 2008-10-15 | Novozymes As | Subtilase varianten und verbindungen |
| BR9712473B1 (pt) | 1996-11-04 | 2009-08-11 | variantes de subtilase e composições. | |
| US6077662A (en) * | 1996-11-27 | 2000-06-20 | Emory University | Virus-like particles, methods and immunogenic compositions |
| DE69806586T2 (de) * | 1997-04-09 | 2003-03-27 | Danisco As Kopenhagen Koebenha | Verbessertes verfahren zur herstellung von mehlteigwaren sowie produkte hergestellt aus solchen teigwaren unter verwendung von glyzerinoxidase |
| US6140475A (en) * | 1997-04-11 | 2000-10-31 | Altus Biologics Inc. | Controlled dissolution crosslinked protein crystals |
| BR9811248B1 (pt) | 1997-08-29 | 2011-10-04 | variante de enzima subtilase derivada de uma subtilase originária selecionada a partir do sub-grupo i-s1 ou do sub-grupo i-s2, dita variante tendo melhorado desempenho de lavagem em detergentes em comparação com a subtilase originária, sequência de dna isolada, vetor de expressão, célula hospedeira microbiana, processo para produzir uma variante, composição, uso de uma variante de subtilase. | |
| AU9061798A (en) | 1997-08-29 | 1999-03-22 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
| EP0913458B1 (en) * | 1997-10-22 | 2004-06-16 | The Procter & Gamble Company | Liquid hard-surface cleaning compositions |
| AR015977A1 (es) * | 1997-10-23 | 2001-05-30 | Genencor Int | Variantes de proteasa multiplemente substituida con carga neta alterada para su empleo en detergentes |
| ES2367505T3 (es) | 1997-10-23 | 2011-11-04 | Danisco Us Inc. | Variantes de proteasa con sustituciones múltiples con carga neta alterada para usar en detergentes. |
| US6780629B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-24 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
| CA2310454C (en) | 1997-11-21 | 2012-01-24 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
| US6773907B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-10 | Peter Kamp Hansen | Subtilase enzymes |
| US6642011B2 (en) | 1998-04-15 | 2003-11-04 | Genencor International, Inc. | Human protease and use of such protease for pharmaceutical applications and for reducing the allergenicity of non-human proteins |
| US6835550B1 (en) | 1998-04-15 | 2004-12-28 | Genencor International, Inc. | Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins |
| US6936249B1 (en) | 1998-04-15 | 2005-08-30 | Genencor International, Inc. | Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| DE69904941T3 (de) | 1998-07-21 | 2008-01-31 | Danisco A/S | Lebensmittel |
| US6461849B1 (en) * | 1998-10-13 | 2002-10-08 | Novozymes, A/S | Modified polypeptide |
| US6376450B1 (en) | 1998-10-23 | 2002-04-23 | Chanchal Kumar Ghosh | Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants |
| US6831053B1 (en) | 1998-10-23 | 2004-12-14 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising multiply-substituted protease variants |
| EP2716753A1 (en) | 1998-11-27 | 2014-04-09 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme variants |
| WO2000034484A1 (en) | 1998-12-08 | 2000-06-15 | Children's Hospital And Regional Medical Center | Polymorphic loci that differentiate escherichia coli 0157:h7 from other strains |
| EP1803817B1 (en) | 1998-12-18 | 2011-04-06 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the I-S1 and I-S2 sub-groups having an additional amino acid residue in an active site loop region |
| EP2889375B1 (en) | 1999-03-31 | 2019-03-20 | Novozymes A/S | Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same |
| EP1169434B1 (en) | 1999-03-31 | 2009-02-11 | Novozymes A/S | Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same |
| KR20000065867A (ko) | 1999-04-09 | 2000-11-15 | 손경식 | 세탁세제용 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이, 이를 코딩하는 유전자, 재조합 발현벡터 및 형질전환된 균주 |
| AU4393000A (en) † | 1999-05-20 | 2000-12-12 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additionalamino acid residue between positions 128 and 129 |
| DE60040149D1 (de) | 1999-05-20 | 2008-10-16 | Novozymes As | Subtilase-enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit wenigstens einem zusätzlichen aminosäurerest zwischen positionen 126 und 127 |
| EP1183337B1 (en) | 1999-05-20 | 2008-09-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 132 and 133 |
| EP1183341B2 (en) | 1999-05-20 | 2012-05-02 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 127 and 128 |
| WO2000071687A1 (en) | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 129 and 130 |
| DE60039693D1 (de) | 1999-05-20 | 2008-09-11 | Novozymes As | Subtilase-enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit wenigstens einem zusätzlichen aminosäurerest zwischen positionen 125 und 126 |
| WO2001007578A2 (en) * | 1999-07-22 | 2001-02-01 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin protease variants having amino acid substitutions in defined epitope regions |
| EP1214426A2 (en) | 1999-08-31 | 2002-06-19 | Novozymes A/S | Novel proteases and variants thereof |
| US6727085B2 (en) | 1999-12-15 | 2004-04-27 | Fanoe Tina Sejersgaard | Subtilase variants having an improved wash performance on egg stains |
| US6777218B1 (en) | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
| DE60144145D1 (de) * | 2000-04-03 | 2011-04-14 | Maxygen Inc | Subtilisin-variante |
| EP2236611A1 (en) * | 2000-04-28 | 2010-10-06 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme variant |
| AR030462A1 (es) | 2000-08-21 | 2003-08-20 | Novozymes As | Novedosas enzimas subtilasas que tienen una reducida tendencia hacia su inhibicion por las sustancias presentes en los huevos |
| US6541234B1 (en) * | 2000-09-11 | 2003-04-01 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Calcium free subtilisin mutants |
| US6541235B1 (en) * | 2000-09-29 | 2003-04-01 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Calcium free subtilisin mutants |
| ATE505537T1 (de) | 2000-10-13 | 2011-04-15 | Novozymes As | Subtilase varianten |
| US6893855B2 (en) * | 2000-10-13 | 2005-05-17 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
| US20040091994A1 (en) | 2000-10-13 | 2004-05-13 | Carsten Andersen | Alpha-amylase variant with altered properties |
| US6673580B2 (en) | 2000-10-27 | 2004-01-06 | Genentech, Inc. | Identification and modification of immunodominant epitopes in polypeptides |
| ES2305023T3 (es) * | 2000-10-31 | 2008-11-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Metodos para el analisis de componentes no proteinaceos usando una proteasa de una cepa de bacilo. |
| AU758744B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-03-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a bacillus strain |
| EP1201752A1 (en) * | 2000-10-31 | 2002-05-02 | Roche Diagnostics GmbH | Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a Bacillus strain |
| US7303907B2 (en) | 2001-01-08 | 2007-12-04 | Health Protection Agency | Degradation and detection of TSE infectivity |
| CA2441595C (en) | 2001-03-23 | 2012-07-03 | Genencor International, Inc. | Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| DE10121463A1 (de) * | 2001-05-02 | 2003-02-27 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten |
| US7498158B2 (en) | 2001-05-15 | 2009-03-03 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variant with altered properties |
| AU2002339115B2 (en) | 2001-05-18 | 2007-03-15 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Method of preparing a dough with an enzyme |
| EP2277997B1 (en) | 2001-06-26 | 2013-09-18 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase I activity and polynucleotides encoding same |
| DK200101090A (da) | 2001-07-12 | 2001-08-16 | Novozymes As | Subtilase variants |
| JP2005535284A (ja) * | 2001-12-31 | 2005-11-24 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | 免疫反応の変化を生じるプロテアーゼ、ならびにその製造および利用方法 |
| DK1523553T3 (da) * | 2002-01-16 | 2010-04-19 | Genencor Int | Multi-substituerede proteasevarianter |
| BR0306956A (pt) | 2002-01-16 | 2006-04-11 | Genencor Int | variantes de protease multiplamente substituìdas |
| CN101575635A (zh) | 2002-02-26 | 2009-11-11 | 金克克国际有限公司 | 免疫原性减弱的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白 |
| WO2003080827A2 (en) | 2002-03-27 | 2003-10-02 | Novozymes A/S | Granules with filamentous coatings |
| US8124399B2 (en) | 2002-03-29 | 2012-02-28 | Danisco Us Inc. | Enhanced protein expression in Bacillus |
| AU2003243925A1 (en) | 2002-07-01 | 2004-01-19 | Novozymes A/S | Mpg added to fermentation |
| CA2493361A1 (en) | 2002-07-30 | 2004-02-05 | Genencor International, Inc. | Reduced aerosol generating formulations |
| WO2004031378A2 (en) | 2002-10-01 | 2004-04-15 | Novozymes A/S | Family gh 61 polypeptides |
| KR101132555B1 (ko) * | 2002-10-02 | 2012-04-02 | 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 변경된 특이성을 갖는 프로테아제의 제조 및 선별 방법 |
| TWI319007B (en) | 2002-11-06 | 2010-01-01 | Novozymes As | Subtilase variants |
| US7888093B2 (en) * | 2002-11-06 | 2011-02-15 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
| CN1738899A (zh) | 2002-12-11 | 2006-02-22 | 诺和酶股份有限公司 | 洗涤剂组合物 |
| US7348168B2 (en) | 2002-12-20 | 2008-03-25 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase II activity and polynucleotides encoding same |
| US7955814B2 (en) | 2003-01-17 | 2011-06-07 | Danisco A/S | Method |
| DE602004030000D1 (de) * | 2003-01-17 | 2010-12-23 | Danisco | Verfahren zur in-situ-herstellung eines emulgators in einem nahrungsmittel |
| US20050196766A1 (en) | 2003-12-24 | 2005-09-08 | Soe Jorn B. | Proteins |
| DE602004026032D1 (de) | 2003-01-27 | 2010-04-29 | Novozymes As | Enzymstabilisierung |
| US7294499B2 (en) * | 2003-01-30 | 2007-11-13 | Novozymes A/S | Subtilases |
| WO2004074419A2 (en) | 2003-02-18 | 2004-09-02 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
| US7413888B2 (en) | 2003-05-02 | 2008-08-19 | Novozymes, Inc. | Variants of beta-glucosidases |
| EP1623029B1 (en) | 2003-05-07 | 2008-09-03 | Novozymes A/S | Variant subtilisin enzymes (subtilases) |
| WO2005001064A2 (en) | 2003-06-25 | 2005-01-06 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha-amylase activity and polypeptides encoding same |
| EP2617825B1 (en) | 2003-08-25 | 2015-04-01 | Novozymes, Inc. | Variants of glycoside hydrolases |
| EP1678296B1 (en) | 2003-10-23 | 2011-07-13 | Novozymes A/S | Protease with improved stability in detergents |
| ES2437198T3 (es) | 2003-10-28 | 2014-01-09 | Novozymes Inc. | Polipéptidos con actividad de beta-glucosidasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos |
| US8846340B2 (en) | 2003-10-30 | 2014-09-30 | Novozymes A/S | Carbohydrate-binding modules of a new family |
| US7718408B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-05-18 | Danisco A/S | Method |
| GB0716126D0 (en) | 2007-08-17 | 2007-09-26 | Danisco | Process |
| US7906307B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-03-15 | Danisco A/S | Variant lipid acyltransferases and methods of making |
| WO2005066339A2 (en) | 2004-01-06 | 2005-07-21 | Novozymes A/S | Polypeptides of alicyclobacillus sp. |
| EP2301958B1 (en) | 2004-01-30 | 2014-03-19 | Novozymes Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| EP2305821A3 (en) | 2004-02-13 | 2011-04-13 | Novozymes A/S | Protease variants |
| GB0405637D0 (en) | 2004-03-12 | 2004-04-21 | Danisco | Protein |
| ATE491025T1 (de) * | 2004-04-02 | 2010-12-15 | Novozymes As | Subtilasevarianten mit veränderter immunogenität |
| CA2562208A1 (en) * | 2004-04-09 | 2006-03-30 | Genencor International, Inc. | Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus |
| US7148404B2 (en) | 2004-05-04 | 2006-12-12 | Novozymes A/S | Antimicrobial polypeptides |
| EP1766021B1 (en) * | 2004-05-20 | 2012-05-09 | AES Chemunex S.A. | Polynucleotides for the detection of escherichia coli o157:h7 and escherichia coli o157:nm verotoxin producers |
| US20090060933A1 (en) * | 2004-06-14 | 2009-03-05 | Estell David A | Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| WO2006002643A2 (en) | 2004-07-05 | 2006-01-12 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants with altered properties |
| BRPI0511835A (pt) | 2004-07-16 | 2008-01-08 | Danisco | enzima lipolìtica e seus usos na indústria alimentìcia |
| CN101040052A (zh) | 2004-09-10 | 2007-09-19 | 诺维信北美公司 | 防止、去除、减少或破坏生物膜的方法 |
| US7741095B2 (en) | 2004-09-21 | 2010-06-22 | Novozymes A/S | Subtilases |
| DK1794296T3 (da) | 2004-09-21 | 2012-07-30 | Novozymes As | Subtilaser |
| DE602005026541D1 (de) | 2004-09-21 | 2011-04-07 | Novozymes As | Subtilasen |
| DE602005027093D1 (de) | 2004-09-30 | 2011-05-05 | Novozymes Inc | Polypeptide mit lipase-aktivität und diese kodierende polynukleotide |
| DK1877551T4 (da) | 2005-04-27 | 2014-03-31 | Novozymes Inc | Polypeptider, der har endoglucanaseaktivitet, og polynukleotider, der koder for samme |
| EP1904628B1 (en) | 2005-07-08 | 2011-10-19 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
| ATE530642T1 (de) | 2005-08-16 | 2011-11-15 | Novozymes As | Subtilasen |
| EP1920052A2 (en) | 2005-08-16 | 2008-05-14 | Novozymes A/S | Polypeptides of strain bacillus sp. p203 |
| EP1941023B1 (en) | 2005-09-30 | 2017-04-05 | Novozymes Inc. | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
| US9303256B2 (en) | 2005-09-30 | 2016-04-05 | Novozymes A/S | Immobilization of enzymes |
| WO2007107573A1 (en) | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having antimicrobial activity |
| EP2004789B1 (en) | 2006-03-31 | 2012-08-29 | Novozymes A/S | A stabilized liquid enzyme composition |
| US20100029538A1 (en) | 2006-04-14 | 2010-02-04 | Anna-Liisa Auterinen | One-Step Treatment of Textiles |
| EP2013339B1 (en) | 2006-04-20 | 2013-09-11 | Novozymes A/S | Savinase variants having an improved wash performance on egg stains |
| US20090286302A1 (en) | 2006-06-21 | 2009-11-19 | Novosymes A/S | Desizing and Scouring Process |
| ES2538360T3 (es) | 2006-07-21 | 2015-06-19 | Novozymes, Inc. | Métodos para aumentar la secreción de polipéptidos que tienen actividad biológica |
| CN103122327B (zh) | 2006-08-11 | 2015-11-18 | 诺维信生物股份有限公司 | 细菌培养物和包含细菌培养物的组合物 |
| US20080057528A1 (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Detection of hydrogen peroxide released by enzyme-catalyzed oxidation of an analyte |
| DK2074205T4 (en) | 2006-10-06 | 2017-02-06 | Novozymes As | CELLULOTIC ENZYME COMPOSITIONS AND APPLICATIONS THEREOF |
| US20080090745A1 (en) * | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Fox Bryan P | Expression of Streptomyces subtilism inhibitor (SSI) proteins in Bacillus and Streptomyces sp. |
| US8034766B2 (en) * | 2006-10-27 | 2011-10-11 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compositions and methods for prion decontamination |
| EP2097519A2 (en) | 2006-12-21 | 2009-09-09 | Danisco US, INC., Genencor Division | Compositions and uses for an alpha-amylase polypeptide of bacillus species 195 |
| AU2007344910B2 (en) | 2007-01-25 | 2013-03-28 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Production of a lipid acyltransferase from transformed Bacillus licheniformis cells |
| EP2126027B1 (en) | 2007-02-20 | 2013-09-11 | Novozymes A/S | Enzyme foam treatment for laundry |
| MX2009009378A (es) | 2007-03-09 | 2009-09-22 | Danisco Us Inc Genencor Div | Variantes de alfa-amilasa de especies de bacillus alcalifilico, composiciones que comprenden las variantes de alfa-amilasa, y metodos de uso. |
| KR20090129425A (ko) | 2007-03-12 | 2009-12-16 | 다니스코 유에스 인크. | 개질된 프로테아제 |
| ES2440741T3 (es) | 2007-03-23 | 2014-01-30 | Novozymes Biologicals, Inc. | Prevención y reducción de la formación de biopelícula y proliferación planctónica |
| DE102007016139A1 (de) | 2007-03-30 | 2008-10-02 | Jenabios Gmbh | Verfahren zur regioselektiven Oxygenierung von N-Heterozyklen |
| CA2685690A1 (en) | 2007-04-30 | 2008-11-06 | Danisco Us Inc. | Use of protein hydrolysates to stabilize metalloprotease detergent formulations |
| EP2152732B1 (en) | 2007-05-10 | 2012-03-21 | Danisco US Inc. | A modified secretion system to increase expression of polypeptides in bacteria |
| SG148934A1 (en) | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Novozymes As | A process for combined biopolishing and bleach clean-up |
| DE102007047433A1 (de) * | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Lanxess Deutschland Gmbh | Flüssigwasch- und Flüssigreinigungsmittel |
| CA2704745C (en) | 2007-11-05 | 2019-01-15 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase variants with altered properties |
| NZ584434A (en) | 2007-11-05 | 2011-12-22 | Danisco Us Inc | VARIANTS OF BACILLUS sp. TS-23 ALPHA-AMYLASE WITH ALTERED PROPERTIES |
| JP5629584B2 (ja) | 2007-12-21 | 2014-11-19 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス内での促進されたタンパク質生成 |
| EP2245060B1 (en) | 2008-02-01 | 2017-11-01 | Novozymes A/S | Liquid enzyme composition |
| US8236545B2 (en) | 2008-02-04 | 2012-08-07 | Danisco Us Inc., Genencor Division | TS23 alpha-amylase variants with altered properties |
| US20090217463A1 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-03 | Philip Frank Souter | Detergent composition comprising lipase |
| WO2009111258A2 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-11 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition comprising lipase |
| MX2010010348A (es) | 2008-03-26 | 2010-11-09 | Novozymes As | Composiciones de enzimas liquidas estabilizadas. |
| MX2010010310A (es) | 2008-03-28 | 2010-10-08 | Danisco Us Inc | Metodo para amplificar un locus en una celula bacteriana. |
| MX2010011721A (es) | 2008-04-30 | 2010-11-30 | Danisco Inc | Nuevas variantes de alfa-amilasa quimericas. |
| EP2285944B1 (en) | 2008-05-14 | 2013-03-13 | Novozymes A/S | Liquid detergent compositions |
| CN102112621A (zh) | 2008-06-06 | 2011-06-29 | 丹尼斯科美国公司 | 用来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶从淀粉产生葡萄糖 |
| US8084240B2 (en) | 2008-06-06 | 2011-12-27 | Danisco Us Inc. | Geobacillus stearothermophilus α-amylase (AmyS) variants with improved properties |
| JP5599113B2 (ja) | 2008-06-06 | 2014-10-01 | ダニスコ・ユーエス・インク | 糖化酵素組成物及びその糖化方法 |
| CN102112605B (zh) | 2008-06-06 | 2014-02-26 | 丹尼斯科美国公司 | 来自枯草芽孢杆菌的变体α-淀粉酶及其使用方法 |
| CN102144024B (zh) | 2008-07-07 | 2013-06-12 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含含酶聚合物粒子的酶组合物 |
| EP2149786A1 (en) | 2008-08-01 | 2010-02-03 | Unilever PLC | Improvements relating to detergent analysis |
| BRMU8903145Y1 (pt) | 2008-09-12 | 2017-05-09 | Unilever Nv | produto de lavagem embalado |
| BRPI0920891B1 (pt) | 2008-09-25 | 2023-01-10 | Danisco Us Inc | Mistura de alfa-amilase e método para produção de um açúcar fermentável |
| EP2857515B1 (en) | 2008-11-20 | 2018-02-21 | Novozymes Inc. | Polypeptides having amylolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| WO2010065830A1 (en) | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| EP2376527A1 (en) | 2008-12-12 | 2011-10-19 | Novozymes Inc. | Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same |
| EP2202290A1 (en) | 2008-12-23 | 2010-06-30 | Unilever PLC | A flowable laundry composition and packaging therefor |
| EP2213723A1 (en) | 2009-01-30 | 2010-08-04 | Novozymes A/S | Isomaltose for fungus fermentation |
| WO2010097436A1 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Novozymes A/S | Mutant cells having reduced expression of metallopeptidase, suitable for recombinant polypeptide production |
| WO2010104675A1 (en) | 2009-03-10 | 2010-09-16 | Danisco Us Inc. | Bacillus megaterium strain dsm90-related alpha-amylases, and methods of use, thereof |
| JP2012522875A (ja) | 2009-04-01 | 2012-09-27 | ダニスコ・ユーエス・インク | アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼを含む洗浄組成物及び方法 |
| CN102388131B (zh) | 2009-04-08 | 2014-04-30 | 丹尼斯科美国公司 | 盐单胞菌属菌株WDG195相关α-淀粉酶及其使用方法 |
| AR076941A1 (es) | 2009-06-11 | 2011-07-20 | Danisco Us Inc | Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina |
| DK3269804T3 (da) | 2009-09-17 | 2020-11-23 | Novozymes Inc | Polypeptider med cellulolyseforbedrende aktivitet og polynukleotider, som koder for dem |
| RU2639534C2 (ru) | 2009-09-25 | 2017-12-21 | Новозимс А/С | Применение вариантов протеазы |
| US20120172280A1 (en) | 2009-09-25 | 2012-07-05 | Novozymes A/S | Protease Variants |
| CN102695719B (zh) | 2009-09-29 | 2016-03-09 | 诺维信股份有限公司 | 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 |
| CN108165542A (zh) | 2009-09-30 | 2018-06-15 | 诺维信股份有限公司 | 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 |
| CA2775244A1 (en) | 2009-09-30 | 2011-04-07 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| MX356389B (es) | 2009-10-23 | 2018-05-28 | Danisco Us Inc | Metodos para reducir sacaridos azules. |
| US20120220513A1 (en) | 2009-12-29 | 2012-08-30 | Novozymes A/S | Polypeptides Having Detergency Enhancing Effect |
| CN102844324B (zh) | 2010-01-22 | 2015-10-07 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 制备氨基取代的糖脂化合物的方法 |
| CN102884197A (zh) | 2010-01-29 | 2013-01-16 | 诺维信公司 | 具有酶预处理的沼气生产方法 |
| WO2011100667A1 (en) | 2010-02-14 | 2011-08-18 | Ls9, Inc. | Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols |
| EP2536832B1 (en) | 2010-02-18 | 2015-02-25 | Danisco US Inc. | Amylase from nesterenkonia and methods of use thereof |
| WO2011104339A1 (en) | 2010-02-25 | 2011-09-01 | Novozymes A/S | Variants of a lysozyme and polynucleotides encoding same |
| EP3279319B1 (en) | 2010-04-26 | 2020-06-10 | Novozymes A/S | Enzyme granules |
| EP2585618B1 (en) | 2010-06-22 | 2014-04-23 | Novozymes A/S | Enzyme dehairing of skins and hides |
| US20130224757A1 (en) | 2010-08-19 | 2013-08-29 | Novozymes A/S | Induced sporulation screening method |
| US20130118532A1 (en) | 2010-08-30 | 2013-05-16 | Novozymes A/S | Two-Soak Wash |
| JP2013541356A (ja) | 2010-08-30 | 2013-11-14 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 濃縮浸漬洗浄 |
| WO2012035103A1 (en) | 2010-09-16 | 2012-03-22 | Novozymes A/S | Lysozymes |
| GB201015672D0 (en) | 2010-09-20 | 2010-10-27 | Unilever Plc | Improvements relating to fabric treatment compositions comprising targeted benefit agents |
| MX2013003237A (es) | 2010-09-30 | 2013-05-30 | Novozymes Inc | Variantes de polipeptidos que tienen actividad potenciadora celulolitica y polinucleotidos que codifican a los mismos. |
| US10246691B2 (en) | 2010-09-30 | 2019-04-02 | Novozymes, Inc. | Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| US9676830B2 (en) | 2010-11-18 | 2017-06-13 | Novozymes, Inc. | Chimeric polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| BR112013013136A2 (pt) | 2011-01-04 | 2016-07-12 | Novozymes As | processo de produção de biogás |
| WO2012101149A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Novozymes A/S | Storage-stable enzyme granules |
| CA2823270A1 (en) | 2011-01-31 | 2012-08-09 | Novozymes A/S | Use of browned glucose as a feed substrate |
| KR102004375B1 (ko) | 2011-02-15 | 2019-07-29 | 노보자임스 바이오로지컬스 인코포레이티드 | 세척 기기 및 세척 과정에서 냄새의 완화 |
| EP2675884A1 (en) | 2011-02-16 | 2013-12-25 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising metalloproteases |
| JP2014508830A (ja) | 2011-02-16 | 2014-04-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 金属プロテアーゼを含む洗剤組成物 |
| MX2013009177A (es) | 2011-02-16 | 2013-08-29 | Novozymes As | Composiciones detergentes que comprenden metaloproteasas de m7 o m35. |
| GB201102857D0 (en) | 2011-02-18 | 2011-04-06 | Danisco | Feed additive composition |
| GB201102865D0 (en) | 2011-02-18 | 2011-04-06 | Danisco | Feed additive composition |
| EP2678352B1 (en) | 2011-02-23 | 2017-12-06 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| US9410136B2 (en) | 2011-03-31 | 2016-08-09 | Novozymes, Inc. | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
| AU2012241055A1 (en) | 2011-04-08 | 2013-08-15 | Danisco Us, Inc. | Compositions |
| DE102011007313A1 (de) | 2011-04-13 | 2012-10-18 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Expressionsverfahren |
| CN103797126A (zh) | 2011-04-29 | 2014-05-14 | 诺维信股份有限公司 | 用于增强纤维素材料的降解或转化的方法 |
| WO2012175401A2 (en) | 2011-06-20 | 2012-12-27 | Novozymes A/S | Particulate composition |
| EP2537918A1 (en) | 2011-06-20 | 2012-12-26 | The Procter & Gamble Company | Consumer products with lipase comprising coated particles |
| MX349517B (es) | 2011-06-24 | 2017-08-02 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad de proteasa y polinucleotidos que codifican los mismos. |
| BR112013032543A2 (pt) | 2011-06-28 | 2017-01-17 | Novozymes As | processo de produção de biogás |
| EP2726607B1 (en) | 2011-06-30 | 2018-08-08 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
| BR122020009747B1 (pt) | 2011-06-30 | 2021-07-20 | Novozymes A/S | Polipeptídeo e alfa-amilase variantes, composição detergente, e, utilização de uma alfa- amilase variante |
| CN107858217B (zh) | 2011-07-01 | 2021-03-23 | 诺维信公司 | 稳定化的枯草杆菌蛋白酶组合物 |
| WO2013004635A1 (en) | 2011-07-01 | 2013-01-10 | Novozymes A/S | Liquid detergent composition |
| CN107523441A (zh) | 2011-07-12 | 2017-12-29 | 诺维信公司 | 储存稳定的酶颗粒 |
| BR112013032861A2 (pt) | 2011-07-22 | 2017-01-24 | Novozymes North America Inc | métodos para aumentar a atividade da enzima celulolítica durante a hidrólise do material celulósico, para hidrolisar um material celulósico pré-tratado, para a produção de um produto da fermentação, e para a fermentação de um material celulósico pré-tratado |
| EP2744898A1 (en) | 2011-08-15 | 2014-06-25 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulase activity and polynucleotides encoding same |
| EP2751266B1 (en) | 2011-09-22 | 2017-03-29 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
| US9670614B2 (en) | 2011-09-23 | 2017-06-06 | Novozymes A/S | Color modification of textile |
| EP3845641A1 (en) | 2011-10-28 | 2021-07-07 | Danisco US Inc. | Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants |
| US10351834B2 (en) | 2011-11-21 | 2019-07-16 | Novozymes, Inc. | GH61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same |
| MX2014006205A (es) | 2011-11-25 | 2014-07-14 | Novozymes As | Variantes de subtilasa y polinucleotidos que las codifican. |
| EP2782592B1 (en) | 2011-11-25 | 2017-03-15 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same |
| WO2013083801A2 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Novozymes A/S | Biogas from substrates comprising animal manure and enzymes |
| DK2791330T3 (da) | 2011-12-16 | 2017-11-06 | Novozymes Inc | Polypeptider med laccaseaktivitet og polynukleotider, som koder for dem |
| AU2012359042B2 (en) | 2011-12-19 | 2016-06-09 | Novozymes Bioag A/S | Bio-pestcide methods and compositions |
| EP2607468A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-26 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising subtilase variants |
| MX2014007446A (es) | 2011-12-20 | 2014-08-01 | Novozymes As | Variantes de subtilasa y polinucleotidos que las codifican. |
| CA2858252A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Danisco Us Inc. | Variant alpha-amylases and methods of use, thereof |
| US20150017700A1 (en) | 2011-12-22 | 2015-01-15 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods comprising a lipolytic enzyme variant |
| EP3382003B1 (en) | 2011-12-29 | 2021-07-14 | Novozymes A/S | Detergent compositions with lipase variants |
| WO2013110766A1 (en) | 2012-01-26 | 2013-08-01 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having protease activity in animal feed and detergents |
| US10093911B2 (en) | 2012-02-17 | 2018-10-09 | Novozymes A/S | Subtilisin variants and polynucleotides encoding same |
| ES2582608T3 (es) | 2012-02-17 | 2016-09-14 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Composiciones detergentes que comprenden variantes de subtilasa |
| EP2823026A1 (en) | 2012-03-07 | 2015-01-14 | Novozymes A/S | Detergent composition and substitution of optical brighteners in detergent compositions |
| US10087401B2 (en) | 2012-03-16 | 2018-10-02 | Monosol, Llc | Water soluble compositions incorporating enzymes, and method of making same |
| CN104204183A (zh) | 2012-03-29 | 2014-12-10 | 诺维信公司 | 酶用于制备水溶性膜的用途 |
| US9394092B2 (en) | 2012-04-16 | 2016-07-19 | Monosol, Llc | Powdered pouch and method of making same |
| EP2841567B1 (en) | 2012-04-27 | 2017-07-26 | Novozymes, Inc. | Gh61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same |
| US9458441B2 (en) | 2012-05-07 | 2016-10-04 | Novozymes A/S | Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same |
| WO2013169645A1 (en) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Danisco Us Inc. | Use of alpha-amylase from aspergillus clavatus for saccharification |
| MX2014013727A (es) | 2012-05-16 | 2015-02-10 | Novozymes As | Composiciones que comprenden lipasa y metodos de utilizacion de estas. |
| CA2874061A1 (en) | 2012-06-08 | 2014-01-09 | Danisco Us Inc. | Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers |
| WO2013189802A1 (en) | 2012-06-19 | 2013-12-27 | Novozymes A/S | Enzymatic reduction of hydroperoxides |
| MX364390B (es) | 2012-06-20 | 2019-04-25 | Novozymes As | Uso de polipeptidos que tienen actividad proteasa en alimentos para animales y detergentes. |
| US9150841B2 (en) | 2012-06-29 | 2015-10-06 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase |
| KR101380740B1 (ko) | 2012-06-29 | 2014-04-11 | 쉐어 휴먼 제네텍 세러피스, 인코포레이티드 | 이듀로네이트-2-설파타제의 정제 |
| EP2885405B1 (en) | 2012-08-16 | 2019-04-17 | Novozymes A/S | Method for treating textile with endoglucanase |
| US20150218606A1 (en) | 2012-08-16 | 2015-08-06 | Danisco Us Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and pullulanase for saccharification |
| BR112015003724A2 (pt) | 2012-08-22 | 2017-08-08 | Novozymes As | polipeptídeo isolado, composição, uso de uma composição, polinucleotídeo isolado, constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, e, métodos de produção de um polipeptídeo e de produção de uma proteína. |
| MX2015002212A (es) | 2012-08-22 | 2015-05-08 | Novozymes As | Composiciones detergentes que comprenden metaloproteasas. |
| MX357022B (es) | 2012-08-22 | 2018-06-25 | Novozymes As | Metaloproteasas de alicyclobacillus sp. |
| DK2914611T3 (en) | 2012-11-01 | 2018-12-10 | Novozymes As | Method of DNA Removal |
| US20180112203A1 (en) | 2012-11-20 | 2018-04-26 | Danisco Us Inc. | Amylase with maltogenic properties |
| US10323217B2 (en) | 2012-12-07 | 2019-06-18 | Novozymes A/S | Detergent composition comprising enzymes and washing method for preventing adhesion of bacteria |
| US20160115509A1 (en) | 2012-12-11 | 2016-04-28 | Danisco Us Inc. | Trichoderma reesei host cells expressing a glucoamylase from aspergillus fumigatus and methods of use thereof |
| US9765374B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-09-19 | Danisco Us Inc | Method of using α-amylase from Aspergillus fumigatus and isoamylase for saccharification |
| WO2014090940A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Novozymes A/S | Removal of skin-derived body soils |
| WO2014099415A1 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Danisco Us Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and pullulanase for saccharification |
| WO2014099525A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Danisco Us Inc. | Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof |
| EP2935575B1 (en) | 2012-12-21 | 2018-04-18 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase variants |
| MX363360B (es) | 2012-12-21 | 2019-03-21 | Novozymes As | Polipéptidos que poseen actividad proteasa y polinucleótidos que los codifican. |
| CN112458069A (zh) | 2013-01-03 | 2021-03-09 | 诺维信公司 | α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
| HUE039341T2 (hu) | 2013-03-11 | 2018-12-28 | Danisco Us Inc | Alfa-amiláz kombinatorikus variációi |
| WO2014152674A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Novozymes A/S | Enzyme and inhibitor containing water-soluble films |
| CN111394202B (zh) | 2013-04-23 | 2022-04-26 | 诺维信公司 | 具有稳定的枯草杆菌蛋白酶的液体自动餐具清洗洗涤剂组合物 |
| WO2014177709A1 (en) | 2013-05-03 | 2014-11-06 | Novozymes A/S | Microencapsulation of detergent enzymes |
| MX367018B (es) | 2013-05-14 | 2019-08-02 | Novozymes As | Composiciones detergentes. |
| CN105209613A (zh) | 2013-05-17 | 2015-12-30 | 诺维信公司 | 具有α淀粉酶活性的多肽 |
| CN105283534B (zh) | 2013-05-30 | 2019-10-01 | 诺维信公司 | 颗粒状酶组合物 |
| US10538751B2 (en) | 2013-06-06 | 2020-01-21 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
| PE20160799A1 (es) | 2013-06-12 | 2016-09-03 | Earth Alive Clean Tech Inc | Supresor de polvo |
| WO2014200658A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis |
| WO2014200657A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis |
| WO2014200656A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces umbrinus |
| WO2014204596A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from bacillaceae family member |
| EP3013955A1 (en) | 2013-06-27 | 2016-05-04 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| WO2014207227A1 (en) | 2013-06-27 | 2014-12-31 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| RU2687271C2 (ru) | 2013-07-03 | 2019-05-13 | Басф Се | Твердая полимерная композиция, получаемая полимеризацией содержащего кислотные группы мономера в присутствии простого полиэфира |
| AU2014286135A1 (en) | 2013-07-04 | 2015-12-03 | Novozymes A/S | Polypeptides with xanthan lyase activity having anti-redeposition effect and polynucleotides encoding same |
| EP3019603A1 (en) | 2013-07-09 | 2016-05-18 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
| EP3022299B1 (en) | 2013-07-19 | 2020-03-18 | Danisco US Inc. | Compositions and methods comprising a lipolytic enzyme variant |
| EP3613853A1 (en) | 2013-07-29 | 2020-02-26 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
| RU2670946C9 (ru) | 2013-07-29 | 2018-11-26 | Новозимс А/С | Варианты протеазы и кодирующие их полинуклеотиды |
| EP3339436B1 (en) | 2013-07-29 | 2021-03-31 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising protease variants |
| WO2015050724A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from a subset of exiguobacterium, and methods of use, thereof |
| DK3060659T3 (da) | 2013-10-03 | 2019-09-09 | Danisco Us Inc | Alfa-amylaser fra exiguobacterium og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| WO2015049370A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Novozymes A/S | Detergent composition and use of detergent composition |
| UA119331C2 (uk) | 2013-11-08 | 2019-06-10 | Новозімес Біоаґ А/С | Композиції та способи для обробки від шкідників |
| AR098482A1 (es) | 2013-11-20 | 2016-06-01 | Novozymes Bioag As | Composiciones y métodos que comprenden chromobacterium para el control de nematodos e insectos pestes de plantas |
| EP3071691B1 (en) | 2013-11-20 | 2019-10-23 | Danisco US Inc. | Variant alpha-amylases having reduced susceptibility to protease cleavage, and methods of use, thereof |
| WO2015094809A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Danisco Us Inc. | Chimeric fungal alpha-amylases comprising carbohydrate binding module and the use thereof |
| EP3083954B1 (en) | 2013-12-20 | 2018-09-26 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
| JP6585602B2 (ja) | 2013-12-31 | 2019-10-02 | ダニスコ・ユーエス・インク | タンパク質発現の増大 |
| US10463701B2 (en) | 2013-12-31 | 2019-11-05 | DuPont Nutrition BioScience ApS | Blends of Bacillus strains and enzymes |
| EP3097112B1 (en) | 2014-01-22 | 2020-05-13 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
| CN106062270A (zh) | 2014-03-05 | 2016-10-26 | 诺维信公司 | 使用木葡聚糖内糖基转移酶改进非纤维素纺织材料的性质的组合物和方法 |
| CN106062271A (zh) | 2014-03-05 | 2016-10-26 | 诺维信公司 | 用于改进具有木葡聚糖内糖基转移酶的纤维素纺织材料的性质的组合物和方法 |
| WO2015135464A1 (en) | 2014-03-12 | 2015-09-17 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
| CN106132995A (zh) * | 2014-03-28 | 2016-11-16 | 诺维信公司 | 蛋白质晶体在低pH下的再增溶 |
| EP3126479A1 (en) | 2014-04-01 | 2017-02-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha amylase activity |
| CN112899086A (zh) | 2014-04-11 | 2021-06-04 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物 |
| US10030215B2 (en) | 2014-04-15 | 2018-07-24 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
| AR100606A1 (es) | 2014-05-27 | 2016-10-19 | Novozymes As | Variantes de lipasas y polinucleótidos que las codifican |
| EP3878957A1 (en) | 2014-05-27 | 2021-09-15 | Novozymes A/S | Methods for producing lipases |
| WO2015189371A1 (en) | 2014-06-12 | 2015-12-17 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
| EP3164476A1 (en) | 2014-07-03 | 2017-05-10 | Novozymes A/S | Improved stabilization of non-protease enzyme |
| EP3327122B1 (en) * | 2014-07-04 | 2021-02-17 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| US10626388B2 (en) | 2014-07-04 | 2020-04-21 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| MX2017004290A (es) | 2014-10-03 | 2017-07-19 | Monosol Llc | Materiales degradables y embalaje hecho a partir de los mismos. |
| WO2016065238A1 (en) | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Danisco Us Inc. | Method for producing alcohol by use of a tripeptidyl peptidase |
| WO2016079110A2 (en) | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Novozymes A/S | Use of enzyme for cleaning |
| EP3221447A1 (en) | 2014-11-20 | 2017-09-27 | Novozymes A/S | Alicyclobacillus variants and polynucleotides encoding same |
| CA2965231A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
| WO2016096714A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent composition comprising subtilase variants |
| WO2016096996A1 (en) | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having n-acetyl glucosamine oxidase activity |
| JP7012533B2 (ja) | 2014-12-16 | 2022-02-14 | ダニスコ・ユーエス・インク | タンパク質発現の増強 |
| US20170369537A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-12-28 | Danisco Us Inc. | Enhanced protein expression |
| EP3741849A3 (en) | 2014-12-19 | 2021-03-17 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
| CN117904083A (zh) | 2014-12-19 | 2024-04-19 | 诺维信公司 | 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
| BR112017018491B1 (pt) | 2015-03-30 | 2022-11-16 | Société des Produits Nestlé S.A. | Uso e processo para preparação de hidrolisados de proteína à base de leite, e composição |
| US11291214B2 (en) | 2015-04-06 | 2022-04-05 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Proteases for high protein fermented milk products |
| WO2016162556A1 (en) | 2015-04-10 | 2016-10-13 | Novozymes A/S | Laundry method, use of dnase and detergent composition |
| US20180105772A1 (en) | 2015-04-10 | 2018-04-19 | Novozymes A/S | Detergent composition |
| CN107835853B (zh) | 2015-05-19 | 2021-04-20 | 诺维信公司 | 气味减少 |
| WO2016192905A1 (en) | 2015-06-02 | 2016-12-08 | Unilever Plc | Laundry detergent composition |
| EP3284811B1 (en) | 2015-06-04 | 2018-12-12 | The Procter & Gamble Company | Hand dishwashing liquid detergent composition |
| EP3101108B1 (en) | 2015-06-04 | 2018-01-31 | The Procter and Gamble Company | Hand dishwashing liquid detergent composition |
| EP3101102B2 (en) | 2015-06-05 | 2023-12-13 | The Procter & Gamble Company | Compacted liquid laundry detergent composition |
| EP3101107B1 (en) | 2015-06-05 | 2019-04-24 | The Procter and Gamble Company | Compacted liquid laundry detergent composition |
| HUE036591T2 (hu) | 2015-06-05 | 2018-08-28 | Procter & Gamble | Kompaktált folyékony mosószerkészítmény |
| US10941372B2 (en) | 2015-06-11 | 2021-03-09 | Conopco, Inc. | Laundry detergent composition |
| WO2016202739A1 (en) | 2015-06-16 | 2016-12-22 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
| WO2016202785A1 (en) | 2015-06-17 | 2016-12-22 | Novozymes A/S | Container |
| CN107810260B (zh) | 2015-06-26 | 2020-07-17 | 荷兰联合利华有限公司 | 洗衣洗涤剂组合物 |
| CN107922896A (zh) | 2015-06-30 | 2018-04-17 | 诺维信公司 | 衣物洗涤剂组合物、用于洗涤的方法和组合物的用途 |
| CA2987160C (en) | 2015-07-01 | 2022-12-13 | Novozymes A/S | Methods of reducing odor |
| CN114292829A (zh) | 2015-07-06 | 2022-04-08 | 诺维信公司 | 脂肪酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
| CA2991114A1 (en) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same |
| ES2794837T3 (es) | 2015-09-17 | 2020-11-19 | Henkel Ag & Co Kgaa | Composiciones detergentes que comprenden polipéptidos que tienen actividad degradante de xantano |
| CN108138083B (zh) | 2015-10-01 | 2021-06-11 | 荷兰联合利华有限公司 | 粉末洗衣洗涤剂组合物 |
| BR112018007017B1 (pt) | 2015-10-07 | 2023-11-28 | Novozymes A/S | Composição detergente, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, uso de um polipeptídeo, célula hospedeira recombinante e método para produzir o polipeptídeo |
| US20180171318A1 (en) | 2015-10-14 | 2018-06-21 | Novozymes A/S | Polypeptides Having Protease Activity and Polynucleotides Encoding Same |
| CN108291212A (zh) | 2015-10-14 | 2018-07-17 | 诺维信公司 | 多肽变体 |
| WO2017066510A1 (en) | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Novozymes A/S | Cleaning of water filtration membranes |
| CA3209924A1 (en) | 2015-10-28 | 2016-12-22 | Novozymes A/S | Detergent composition comprising amylase and protease variants |
| KR20180067700A (ko) | 2015-11-09 | 2018-06-20 | 듀폰 뉴트리션 바이오사이언시즈 에이피에스 | 사료 첨가제 조성물 |
| US11001821B2 (en) | 2015-11-24 | 2021-05-11 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
| EP3384019B1 (en) | 2015-12-01 | 2020-06-24 | Novozymes A/S | Methods for producing lipases |
| EP3386612A1 (en) | 2015-12-09 | 2018-10-17 | Basf Se | Method of purifying a protein from fermentation solids under desorbing conditions |
| US11920170B2 (en) | 2015-12-09 | 2024-03-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
| EP3397061A1 (en) | 2015-12-28 | 2018-11-07 | Novozymes BioAG A/S | Heat priming of bacterial spores |
| EP3397761B1 (en) | 2015-12-30 | 2022-11-09 | Novozymes A/S | Enzyme variants and polynucleotides encoding the same |
| CA3007148A1 (en) | 2016-01-29 | 2017-08-03 | Novozymes A/S | Beta-glucanase variants and polynucleotides encoding same |
| EP3205393A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-16 | Basf Se | Process for preparation of microcapsules |
| EP3205392A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-16 | Basf Se | Microcapsules and process for preparation of microcapsules |
| BR112018016674B1 (pt) | 2016-02-17 | 2022-06-07 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de detergente para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido |
| CN108603139B (zh) | 2016-02-17 | 2020-12-04 | 荷兰联合利华有限公司 | 增白组合物 |
| EP3433346B1 (en) | 2016-03-21 | 2020-12-30 | Unilever PLC | Laundry detergent composition |
| EP3715442A1 (en) | 2016-03-23 | 2020-09-30 | Novozymes A/S | Use of polypeptide having dnase activity for treating fabrics |
| WO2017173324A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
| WO2017173190A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
| CN114480035A (zh) | 2016-04-08 | 2022-05-13 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物及其用途 |
| CN108779416B (zh) | 2016-04-08 | 2021-01-05 | 荷兰联合利华有限公司 | 洗衣洗涤剂组合物 |
| WO2017182295A1 (en) | 2016-04-18 | 2017-10-26 | Basf Se | Liquid cleaning compositions |
| MX2018013139A (es) | 2016-04-29 | 2019-02-13 | Novozymes As | Composiciones detergentes y sus usos. |
| WO2017191160A1 (en) | 2016-05-03 | 2017-11-09 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding the same |
| MX2018013556A (es) | 2016-05-09 | 2019-03-14 | Novozymes As | Polipeptidos variantes con rendimiento mejorado y uso de los mismos. |
| WO2017210188A1 (en) | 2016-05-31 | 2017-12-07 | Novozymes A/S | Stabilized liquid peroxide compositions |
| US11001787B2 (en) | 2016-06-23 | 2021-05-11 | Novozymes A/S | Use of enzymes, composition and method for removing soil |
| US11203732B2 (en) | 2016-06-30 | 2021-12-21 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions comprising surfactant and lipase variant |
| WO2018002261A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
| CA3028535A1 (en) | 2016-07-05 | 2018-01-11 | Novozymes A/S | Pectate lyase variants and polynucleotides encoding same |
| WO2018007573A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | Novozymes A/S | Detergent compositions with galactanase |
| CN109642222A (zh) | 2016-07-13 | 2019-04-16 | 诺维信公司 | 食物芽孢杆菌dna酶变体 |
| BR112018077483A2 (pt) | 2016-07-14 | 2019-04-02 | Basf Se | meio de fermentação, métodos para cultivar um microrganismo e para produzir um composto de interesse, solução de oligoelemento para um processo de fermentação, e, uso de um agente quelante. |
| EP3485008B1 (en) | 2016-07-18 | 2024-01-31 | Novozymes A/S | Lipase variants, polynucleotides encoding same and the use thereof |
| RU2019106488A (ru) | 2016-08-08 | 2020-09-14 | Басф Се | Жидкая композиция для стирки |
| EP3284805B1 (en) | 2016-08-17 | 2020-02-19 | The Procter & Gamble Company | Cleaning composition comprising enzymes |
| CN109863244B (zh) | 2016-08-24 | 2023-06-06 | 诺维信公司 | Gh9内切葡聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
| EP3504313A1 (en) | 2016-08-24 | 2019-07-03 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising gh9 endoglucanase variants i |
| US11512300B2 (en) | 2016-08-24 | 2022-11-29 | Novozymes A/S | Xanthan lyase variants and polynucleotides encoding same |
| EP3504331A1 (en) | 2016-08-24 | 2019-07-03 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising xanthan lyase variants i |
| CN109790491B (zh) | 2016-09-27 | 2021-02-23 | 荷兰联合利华有限公司 | 家用洗衣方法 |
| WO2018060216A1 (en) | 2016-09-29 | 2018-04-05 | Novozymes A/S | Use of enzyme for washing, method for washing and warewashing composition |
| EP3519547A1 (en) | 2016-09-29 | 2019-08-07 | Novozymes A/S | Spore containing granule |
| WO2018077938A1 (en) | 2016-10-25 | 2018-05-03 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
| EP3535377B1 (en) | 2016-11-01 | 2022-02-09 | Novozymes A/S | Multi-core granules |
| MX2019006425A (es) | 2016-12-01 | 2019-08-14 | Basf Se | Estabilizacion de enzimas en composiciones. |
| EP3551740B1 (en) | 2016-12-12 | 2021-08-11 | Novozymes A/S | Use of polypeptides |
| EP3555255B1 (en) | 2016-12-15 | 2020-06-24 | Unilever PLC | Laundry detergent composition |
| FI3585910T3 (fi) | 2017-02-24 | 2024-06-19 | Danisco Us Inc | Koostumukset ja menetelmät proteiinin tuotannon lisäämiseksi bacillus licheniformiksessa |
| CA3057713A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Danisco Us Inc | Alpha-amylase combinatorial variants |
| WO2018177938A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Novozymes A/S | Polypeptides having dnase activity |
| WO2018178061A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Novozymes A/S | Polypeptides having rnase activity |
| US11053483B2 (en) | 2017-03-31 | 2021-07-06 | Novozymes A/S | Polypeptides having DNase activity |
| US20200109388A1 (en) | 2017-04-03 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Recovery Process |
| CN114480034A (zh) | 2017-04-04 | 2022-05-13 | 诺维信公司 | 糖基水解酶 |
| WO2018185150A1 (en) | 2017-04-04 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Polypeptides |
| EP3607040A1 (en) | 2017-04-04 | 2020-02-12 | Novozymes A/S | Polypeptide compositions and uses thereof |
| ES2728758T3 (es) | 2017-04-05 | 2019-10-28 | Henkel Ag & Co Kgaa | Composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas |
| EP3385362A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-10 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising fungal mannanases |
| WO2018184816A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| WO2018184818A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| US11499121B2 (en) | 2017-04-06 | 2022-11-15 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
| EP3607042A1 (en) | 2017-04-06 | 2020-02-12 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| WO2018185280A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| EP3478811B1 (en) | 2017-04-06 | 2019-10-16 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| US11352591B2 (en) | 2017-04-06 | 2022-06-07 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| US20200190437A1 (en) | 2017-04-06 | 2020-06-18 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| CN110651038A (zh) | 2017-05-05 | 2020-01-03 | 诺维信公司 | 包含脂肪酶和亚硫酸盐的组合物 |
| WO2018206535A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Novozymes A/S | Carbohydrate-binding domain and polynucleotides encoding the same |
| EP3401385A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-14 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising polypeptide comprising carbohydrate-binding domain |
| US12018235B2 (en) | 2017-05-08 | 2024-06-25 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
| US11492605B2 (en) | 2017-05-08 | 2022-11-08 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
| WO2018224544A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Novozymes A/S | Compositions comprising polypeptides having cellulase activity and amylase activity, and uses thereof in cleaning and detergent compositions |
| EP3645692A1 (en) | 2017-06-30 | 2020-05-06 | Novozymes A/S | Enzyme slurry composition |
| EP3649222B1 (en) | 2017-07-07 | 2024-03-13 | Unilever IP Holdings B.V. | Whitening composition |
| CN110892053A (zh) | 2017-07-07 | 2020-03-17 | 荷兰联合利华有限公司 | 洗衣清洁组合物 |
| EP3665267A1 (en) | 2017-08-07 | 2020-06-17 | Novozymes A/S | Use of fca control based on ph |
| AR112778A1 (es) | 2017-08-07 | 2019-12-11 | Novozymes As | Fermentador equipado con eyector |
| WO2019036721A2 (en) | 2017-08-18 | 2019-02-21 | Danisco Us Inc | VARIANTS OF ALPHA-AMYLASES |
| WO2019040412A1 (en) | 2017-08-23 | 2019-02-28 | Danisco Us Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EFFICIENT GENETIC MODIFICATION OF BACILLUS LICHENIFORMIS STRAINS |
| CA3070749A1 (en) | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Novozymes A/S | Gh9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same |
| WO2019038059A1 (en) | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Henkel Ag & Co. Kgaa | DETERGENT COMPOSITIONS COMPRISING GH9 ENDOGLUCANASE VARIANTS II |
| WO2019038060A1 (en) | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Henkel Ag & Co. Kgaa | DETERGENT COMPOSITION COMPRISING XANTHANE LYASE II VARIANTS |
| US11359188B2 (en) | 2017-08-24 | 2022-06-14 | Novozymes A/S | Xanthan lyase variants and polynucleotides encoding same |
| WO2019055261A1 (en) | 2017-09-13 | 2019-03-21 | Danisco Us Inc | MODIFIED 5 'NON-TRANSLATED REGION (UTR) SEQUENCES FOR INCREASED PROTEIN PRODUCTION IN BACILLUS |
| EP3684897A1 (en) | 2017-09-20 | 2020-07-29 | Novozymes A/S | Use of enzymes for improving water absorption and/or whiteness |
| EP3684899A1 (en) | 2017-09-22 | 2020-07-29 | Novozymes A/S | Novel polypeptides |
| EP3688150A1 (en) | 2017-09-27 | 2020-08-05 | Novozymes A/S | Lipase variants and microcapsule compositions comprising such lipase variants |
| US11286443B2 (en) | 2017-09-27 | 2022-03-29 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions comprising lipases |
| WO2019068715A1 (en) | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Novozymes A/S | POLYPEPTIDES HAVING MANNANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THESE POLYPEPTIDES |
| CN111417725A (zh) | 2017-10-02 | 2020-07-14 | 诺维信公司 | 具有甘露聚糖酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 |
| WO2019076834A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Novozymes A/S | PELLETS WITH LOW DUST CONTENT |
| EP3697881A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-08-26 | Novozymes A/S | Low dusting granules |
| WO2019076800A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Novozymes A/S | CLEANING COMPOSITIONS AND USES THEREOF |
| WO2019081515A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Novozymes A/S | COMPOSITIONS COMPRISING POLYPEPTIDES HAVING MANNANASE ACTIVITY |
| WO2019084350A1 (en) | 2017-10-27 | 2019-05-02 | The Procter & Gamble Company | DETERGENT COMPOSITIONS COMPRISING POLYPEPTIDE VARIANTS |
| WO2019081724A1 (en) | 2017-10-27 | 2019-05-02 | Novozymes A/S | VARIANTS OF DNASE |
| CN111527190A (zh) | 2017-11-01 | 2020-08-11 | 诺维信公司 | 多肽以及包含此类多肽的组合物 |
| EP3704220A1 (en) | 2017-11-01 | 2020-09-09 | Novozymes A/S | Methods for cleaning medical devices |
| DE102017125559A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine ii enthalten |
| EP3704240A1 (en) | 2017-11-01 | 2020-09-09 | Novozymes A/S | Polypeptides and compositions comprising such polypeptides |
| DE102017125558A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine i enthalten |
| DE102017125560A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten |
| WO2019089898A1 (en) | 2017-11-02 | 2019-05-09 | Danisco Us Inc | Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes |
| EP3707255A1 (en) | 2017-11-09 | 2020-09-16 | Basf Se | Coatings of enzyme particles comprising organic white pigments |
| US11512268B2 (en) | 2017-11-29 | 2022-11-29 | Basf Se | Storage-stable enzyme preparations, their production and use |
| CN111479912B (zh) | 2017-11-30 | 2021-08-10 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 包含蛋白酶的洗涤剂组合物 |
| WO2019110462A1 (en) | 2017-12-04 | 2019-06-13 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
| WO2019135868A1 (en) | 2018-01-03 | 2019-07-11 | Danisco Us Inc | Mutant and genetically modified bacillus cells and methods thereof for increased protein production |
| WO2019154955A1 (en) | 2018-02-08 | 2019-08-15 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions thereof |
| CN111868239A (zh) | 2018-02-08 | 2020-10-30 | 诺维信公司 | 脂肪酶、脂肪酶变体及其组合物 |
| US20210102184A1 (en) | 2018-02-23 | 2021-04-08 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent composition comprising xanthan lyase and endoglucanase variants |
| CN111770788B (zh) | 2018-03-13 | 2023-07-25 | 诺维信公司 | 使用氨基糖低聚物进行微囊化 |
| WO2019185726A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
| CN112262207B (zh) | 2018-04-17 | 2024-01-23 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物中包含碳水化合物结合活性的多肽及其在减少纺织品或织物中的褶皱的用途 |
| US11661592B2 (en) | 2018-04-19 | 2023-05-30 | Novozymes A/S | Stabilized endoglucanase variants |
| US11566239B2 (en) | 2018-04-19 | 2023-01-31 | Novozymes A/S | Stabilized cellulase variants |
| US11732250B2 (en) | 2018-04-26 | 2023-08-22 | Basf Se | Lipase enzymes |
| US20210115422A1 (en) | 2018-05-03 | 2021-04-22 | Basf Se | Amylase enzymes |
| CN112119147B (zh) | 2018-05-17 | 2023-09-29 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 清洁组合物 |
| WO2019238761A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-19 | Basf Se | Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes |
| CN112368363A (zh) | 2018-06-28 | 2021-02-12 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物及其用途 |
| WO2020002608A1 (en) | 2018-06-29 | 2020-01-02 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
| WO2020002255A1 (en) | 2018-06-29 | 2020-01-02 | Novozymes A/S | Subtilase variants and compositions comprising same |
| US12012573B2 (en) | 2018-07-02 | 2024-06-18 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| US20210301223A1 (en) | 2018-07-03 | 2021-09-30 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| US20210253981A1 (en) | 2018-07-06 | 2021-08-19 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| WO2020008024A1 (en) | 2018-07-06 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| US20230174962A1 (en) | 2018-07-31 | 2023-06-08 | Danisco Us Inc | Variant alpha-amylases having amino acid substitutions that lower the pka of the general acid |
| WO2020030623A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Basf Se | Packaging unit comprising a detergent composition containing an enzyme and at least one chelating agent |
| EP3853330B1 (en) | 2018-09-17 | 2023-06-07 | Unilever Global Ip Limited | Detergent composition |
| US20210340466A1 (en) | 2018-10-01 | 2021-11-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
| WO2020070014A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition comprising anionic surfactant and a polypeptide having rnase activity |
| EP3861094A1 (en) | 2018-10-02 | 2021-08-11 | Novozymes A/S | Cleaning composition |
| WO2020070209A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition |
| WO2020070249A1 (en) | 2018-10-03 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions |
| EP3861008A1 (en) | 2018-10-03 | 2021-08-11 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha-mannan degrading activity and polynucleotides encoding same |
| EP3677676A1 (en) | 2019-01-03 | 2020-07-08 | Basf Se | Compounds stabilizing amylases in liquids |
| US20220112479A1 (en) | 2018-10-05 | 2022-04-14 | Basf Se | Compounds stabilizing amylases in liquids |
| JP2022504229A (ja) | 2018-10-05 | 2022-01-13 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 液体中のヒドロラーゼを安定化する化合物 |
| CN112805376A (zh) | 2018-10-05 | 2021-05-14 | 巴斯夫欧洲公司 | 在液体中稳定水解酶的化合物 |
| CN112996894A (zh) | 2018-10-11 | 2021-06-18 | 诺维信公司 | 清洁组合物及其用途 |
| WO2020077331A2 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Danisco Us Inc | Alpha-amylases with mutations that improve stability in the presence of chelants |
| EP3647398B1 (en) | 2018-10-31 | 2024-05-15 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions containing dispersins v |
| EP3647397A1 (en) | 2018-10-31 | 2020-05-06 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions containing dispersins iv |
| WO2020099491A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising a polypeptide having dnase activity |
| WO2020104231A1 (en) | 2018-11-19 | 2020-05-28 | Basf Se | Powders and granules containing a chelating agent and an enzyme |
| CN113056550B (zh) | 2018-11-20 | 2022-10-28 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
| BR112021009807A2 (pt) | 2018-11-20 | 2021-08-17 | Unilever Ip Holdings B.V. | composição detergente, método de tratamento de um substrato de tecido e uso de uma enzima isomerase |
| EP3884025B1 (en) | 2018-11-20 | 2022-06-08 | Unilever Global Ip Limited | Detergent composition |
| BR112021009785A2 (pt) | 2018-11-20 | 2021-08-17 | Unilever Ip Holdings B.V. | composição detergente, método de tratamento de um substrato de tecido e uso de uma enzima |
| CN113166689A (zh) | 2018-11-20 | 2021-07-23 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
| WO2020106796A1 (en) | 2018-11-20 | 2020-05-28 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | ENGINEERED ROBUST HIGH Tm-PHYTASE CLADE POLYPEPTIDES AND FRAGMENTS THEREOF |
| CN113302295A (zh) | 2018-12-03 | 2021-08-24 | 诺维信公司 | 粉末洗涤剂组合物 |
| US20220017844A1 (en) | 2018-12-03 | 2022-01-20 | Novozymes A/S | Low pH Powder Detergent Composition |
| EP3898962A2 (en) | 2018-12-21 | 2021-10-27 | Novozymes A/S | Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same |
| WO2020127775A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Novozymes A/S | Detergent pouch comprising metalloproteases |
| CN114127256A (zh) | 2019-02-20 | 2022-03-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 用确定成分培养基和微量元素补料的芽孢杆菌工业发酵工艺 |
| US20220186177A1 (en) | 2019-02-20 | 2022-06-16 | Basf Se | Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed |
| EP3702452A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-02 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising two proteases |
| MX2021011287A (es) | 2019-03-21 | 2021-10-13 | Novozymes As | Variantes de alfa-amilasa y polinucleotidos que codifican las mismas. |
| WO2020193534A2 (en) | 2019-03-25 | 2020-10-01 | Basf Se | Amylase enzymes |
| EP3947665A2 (en) | 2019-03-25 | 2022-02-09 | Basf Se | Amylase enzymes |
| US20220162528A1 (en) * | 2019-04-02 | 2022-05-26 | Novozymes A/S | Liquid Dishwashing Detergent Compositions |
| EP3947619A1 (en) | 2019-04-03 | 2022-02-09 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucanase activity, polynucleotides encoding same and uses thereof in cleaning and detergent compositions |
| WO2020207944A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
| EP3953463A1 (en) | 2019-04-12 | 2022-02-16 | Novozymes A/S | Stabilized glycoside hydrolase variants |
| WO2020229480A1 (en) | 2019-05-14 | 2020-11-19 | Basf Se | Compounds stabilizing hydrolases in liquids |
| CN113825829A (zh) | 2019-05-16 | 2021-12-21 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗衣组合物 |
| WO2020249546A1 (en) | 2019-06-13 | 2020-12-17 | Basf Se | Method of recovering a protein from fermentation broth using a divalent cation |
| WO2020249706A1 (en) | 2019-06-14 | 2020-12-17 | Basf Se | Aqueous polymer dispersions suitable as opacifiers in liquid formulations |
| BR112021025261A2 (pt) | 2019-06-28 | 2022-04-26 | Unilever Ip Holdings B V | Composição detergente e método doméstico para tratar um tecido |
| EP3990603B1 (en) | 2019-06-28 | 2022-12-07 | Unilever Global Ip Limited | Detergent composition |
| US20220364022A1 (en) | 2019-06-28 | 2022-11-17 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Detergent composition |
| BR112021023398A2 (pt) | 2019-06-28 | 2022-01-04 | Unilever Ip Holdings B V | Composição detergente, método doméstico de tratamento de um têxtil e uso de um álcool de sulfato de éter |
| EP3990602A1 (en) | 2019-06-28 | 2022-05-04 | Unilever Global IP Limited | Detergent composition |
| WO2020260006A1 (en) | 2019-06-28 | 2020-12-30 | Unilever Plc | Detergent compositions |
| MX2021015894A (es) | 2019-07-01 | 2022-02-03 | Basf Se | Peptidos acetales para estabilizar enzimas. |
| US20220340865A1 (en) | 2019-07-02 | 2022-10-27 | Basf Se | Method for preparing a fermentation medium |
| WO2021001400A1 (en) | 2019-07-02 | 2021-01-07 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions thereof |
| US20230212506A1 (en) | 2019-07-05 | 2023-07-06 | Basf Se | Industrial fermentation process for microbial cells using a fed-batch pre-culture |
| EP3996519A1 (en) | 2019-07-09 | 2022-05-18 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Fat coated particulate enzyme compositions |
| CN114364778A (zh) | 2019-07-12 | 2022-04-15 | 诺维信公司 | 用于洗涤剂的酶性乳剂 |
| EP4013236A1 (en) | 2019-08-16 | 2022-06-22 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Compositions for gut health comprising combinations of lactobacillus strains |
| JP2022545465A (ja) | 2019-08-22 | 2022-10-27 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | アミラーゼバリアント |
| WO2021037878A1 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Novozymes A/S | Composition comprising a lipase |
| CN114787329A (zh) | 2019-08-27 | 2022-07-22 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物 |
| AR119874A1 (es) | 2019-09-02 | 2022-01-19 | Unilever Nv | Composición detergente con un derivado de éster de ácido cítrico de un monoglicérido |
| WO2021046073A1 (en) | 2019-09-05 | 2021-03-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed composition |
| WO2021053127A1 (en) | 2019-09-19 | 2021-03-25 | Novozymes A/S | Detergent composition |
| US20220372399A1 (en) | 2019-09-19 | 2022-11-24 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Detergent compositions |
| US20220340843A1 (en) | 2019-10-03 | 2022-10-27 | Novozymes A/S | Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains |
| AR120142A1 (es) | 2019-10-07 | 2022-02-02 | Unilever Nv | Composición detergente |
| BR112022006082A2 (pt) | 2019-10-18 | 2022-06-21 | Basf Se | Preparação enzimática, formulação de detergente, e, uso de pelo menos um diol |
| EP4048081A2 (en) | 2019-10-21 | 2022-08-31 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Compositions for gut health |
| WO2021080948A2 (en) | 2019-10-24 | 2021-04-29 | Danisco Us Inc | Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases |
| EP4061935A1 (en) | 2019-11-20 | 2022-09-28 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Thermostable phytase variants |
| CN113891931A (zh) | 2019-11-29 | 2022-01-04 | 巴斯夫欧洲公司 | 组合物和可以用于该类组合物的聚合物 |
| WO2021115912A1 (en) | 2019-12-09 | 2021-06-17 | Basf Se | Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes |
| MX2022007446A (es) | 2019-12-19 | 2022-08-25 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Formulaciones dietéticas. |
| US20230040230A1 (en) | 2019-12-20 | 2023-02-09 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Cleaning composition comprising a dispersin and a carbohydrase |
| EP4077618A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-10-26 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions comprising dispersins ix |
| US20220411726A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-12-29 | Novozymes A/S | Stabilized liquid boron-free enzyme compositions |
| US20220411773A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-12-29 | Novozymes A/S | Polypeptides having proteolytic activity and use thereof |
| US20230048546A1 (en) | 2019-12-20 | 2023-02-16 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Cleaning compositions comprising dispersins vi |
| US20230340442A1 (en) | 2020-01-15 | 2023-10-26 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods for enhanced protein production in bacillus licheniformis |
| WO2021151536A1 (en) | 2020-01-29 | 2021-08-05 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry detergent product |
| JP2023511739A (ja) | 2020-01-31 | 2023-03-22 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | マンナナーゼバリアント及びそれをコードするポリヌクレオチド |
| WO2021152120A1 (en) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
| AU2021217391A1 (en) | 2020-02-07 | 2022-09-01 | International N&H Denmark Aps | Feed compositions for animal health |
| CN115066495A (zh) | 2020-02-14 | 2022-09-16 | 巴斯夫欧洲公司 | 甘露聚糖酶变体 |
| US20230240334A1 (en) | 2020-02-28 | 2023-08-03 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed compositions |
| EP3892708A1 (en) | 2020-04-06 | 2021-10-13 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions comprising dispersin variants |
| JP2023520312A (ja) | 2020-04-08 | 2023-05-17 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 炭水化物結合モジュールバリアント |
| EP4139431A1 (en) | 2020-04-21 | 2023-03-01 | Novozymes A/S | Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity |
| EP3907271A1 (en) | 2020-05-07 | 2021-11-10 | Novozymes A/S | Cleaning composition, use and method of cleaning |
| EP4158011A1 (en) | 2020-05-26 | 2023-04-05 | Novozymes A/S | Subtilase variants and compositions comprising same |
| BR112022024537A2 (pt) | 2020-06-08 | 2022-12-27 | Unilever Ip Holdings B V | Método de aprimoramento da atividade de protease em uma composição detergente e uso de saponina |
| WO2021254824A1 (en) | 2020-06-18 | 2021-12-23 | Basf Se | Compositions and their use |
| WO2021259099A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Novozymes A/S | Use of cellulases for removing dust mite from textile |
| EP3936593A1 (en) | 2020-07-08 | 2022-01-12 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions and uses thereof |
| WO2022008416A1 (en) | 2020-07-09 | 2022-01-13 | Basf Se | Compositions and their applications |
| WO2022008732A1 (en) | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Basf Se | Enhancing the activity of antimicrobial preservatives |
| WO2022023250A1 (en) | 2020-07-27 | 2022-02-03 | Unilever Ip Holdings B.V. | Use of an enzyme and surfactant for inhibiting microorganisms |
| JP2023539234A (ja) | 2020-08-24 | 2023-09-13 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | フルクタナーゼを含む口腔ケア組成物 |
| MX2023001888A (es) | 2020-08-25 | 2023-03-10 | Novozymes As | Variantes de una xiloglucanasa de la familia 44. |
| US20230303949A1 (en) | 2020-08-28 | 2023-09-28 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Surfactant and detergent composition |
| WO2022042977A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Unilever Ip Holdings B.V. | Detergent composition |
| CN116018396A (zh) | 2020-08-28 | 2023-04-25 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
| BR112023003008A2 (pt) | 2020-08-28 | 2023-04-04 | Unilever Ip Holdings B V | Tensoativo de sulfonato de alcano secundário (sas), composição detergente e método de tratamento de um artigo têxtil |
| WO2022043042A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Unilever Ip Holdings B.V. | Detergent composition |
| US20230265408A1 (en) | 2020-08-28 | 2023-08-24 | Novozymes A/S | Protease variants with improved solubility |
| EP4213641A1 (en) | 2020-09-15 | 2023-07-26 | Novozymes A/S | Animal feed comprising insects or insect meal |
| EP4217367A1 (en) | 2020-09-22 | 2023-08-02 | Basf Se | Liquid composition comprising peptide aldehyde |
| CN116507725A (zh) | 2020-10-07 | 2023-07-28 | 诺维信公司 | α-淀粉酶变体 |
| WO2022081947A1 (en) | 2020-10-16 | 2022-04-21 | Dupont Nutrition Biosciences | Feed compositions for animal health |
| WO2022084303A2 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-28 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having dnase activity |
| WO2022083949A1 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-28 | Basf Se | Compositions and their use |
| EP4237525A1 (en) | 2020-10-28 | 2023-09-06 | Novozymes A/S | Use of lipoxygenase |
| WO2022090361A2 (en) | 2020-10-29 | 2022-05-05 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions comprising such lipase variants |
| WO2022103725A1 (en) | 2020-11-13 | 2022-05-19 | Novozymes A/S | Detergent composition comprising a lipase |
| WO2022106400A1 (en) | 2020-11-18 | 2022-05-27 | Novozymes A/S | Combination of immunochemically different proteases |
| US20240010951A1 (en) | 2020-12-07 | 2024-01-11 | Conopco Inc., D/B/A Unilever | Detergent compositions |
| US20240010950A1 (en) | 2020-12-07 | 2024-01-11 | Conopco Inc., D/B/A Unilever | Detergent compositions |
| EP4015629A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-22 | Basf Se | Polymer mixtures for increasing stability and performance of hydrolase-containing detergents |
| EP4032966A1 (en) | 2021-01-22 | 2022-07-27 | Novozymes A/S | Liquid enzyme composition with sulfite scavenger |
| US20240124805A1 (en) | 2021-01-28 | 2024-04-18 | Novozymes A/S | Lipase with low malodor generation |
| WO2022169933A2 (en) | 2021-02-03 | 2022-08-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Compositions for gut health |
| EP4039806A1 (en) | 2021-02-04 | 2022-08-10 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising xanthan lyase and endoglucanase variants with im-proved stability |
| EP4291625A1 (en) | 2021-02-12 | 2023-12-20 | Novozymes A/S | Stabilized biological detergents |
| WO2022171780A2 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
| WO2022189521A1 (en) | 2021-03-12 | 2022-09-15 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
| EP4060036A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-21 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
| WO2022194673A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-22 | Novozymes A/S | Dnase variants |
| WO2022199418A1 (en) | 2021-03-26 | 2022-09-29 | Novozymes A/S | Detergent composition with reduced polymer content |
| EP4359518A1 (en) | 2021-06-23 | 2024-05-01 | Novozymes A/S | Alpha-amylase polypeptides |
| CN117881772A (zh) | 2021-08-20 | 2024-04-12 | 丹尼斯科美国公司 | 编码新型核酸酶的多核苷酸、其组合物及其从蛋白质制剂中消除dna的方法 |
| WO2023041694A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Unilever Ip Holdings B.V. | Detergent composition |
| KR20240060703A (ko) | 2021-09-27 | 2024-05-08 | 인터내셔널 엔＆에이치 덴마크 에이피에스 | 사료 첨가제 조성물 및 이의 사용 방법 |
| WO2023061827A1 (en) | 2021-10-13 | 2023-04-20 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
| WO2023066741A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Basf Se | Phosphate-free composition and methods for their manufacture and use |
| WO2023088777A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
| WO2023088776A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
| WO2023088761A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
| CA3241094A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Jonathan LASSILA | Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases |
| WO2023110599A2 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Basf Se | Compositions and their applications |
| WO2023116569A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Novozymes A/S | Composition comprising a lipase and a booster |
| EP4206309A1 (en) | 2021-12-30 | 2023-07-05 | Novozymes A/S | Protein particles with improved whiteness |
| WO2023148086A1 (en) | 2022-02-04 | 2023-08-10 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
| EP4234664A1 (en) | 2022-02-24 | 2023-08-30 | Evonik Operations GmbH | Composition comprising glucolipids and enzymes |
| WO2023165507A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Novozymes A/S | Use of xyloglucanase for improvement of sustainability of detergents |
| WO2023165950A1 (en) | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Novozymes A/S | Dnase variants and compositions |
| WO2023194204A1 (en) | 2022-04-08 | 2023-10-12 | Novozymes A/S | Hexosaminidase variants and compositions |
| WO2023227356A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition containing enzyme |
| WO2023227375A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an aminocarboxylate, an organic acid and a fragrance |
| WO2023227421A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an alkoxylated zwitterionic polyamine polymer, and a fragrance |
| WO2023227335A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Liquid composition comprising linear alkyl benzene sulphonate, methyl ester ethoxylate and alkoxylated zwitterionic polyamine polymer |
| WO2023227332A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an alkoxylated zwitterionic polyamine polymer and a protease |
| WO2023227331A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition comprising a specific methyl ester ethoxylate surfactant and a lipase |
| CN114836408B (zh) * | 2022-05-28 | 2023-09-19 | 湖北大学 | 含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用 |
| WO2023233026A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry detergent product |
| WO2023247348A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
| WO2023247664A2 (en) | 2022-06-24 | 2023-12-28 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions comprising such lipase variants |
| WO2024012894A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Basf Se | Alkanolamine formates for enzyme stabilization in liquid formulations |
| WO2024056334A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
| WO2024056278A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
| WO2024056331A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
| WO2024056333A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
| EP4349946A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Unit dose fabric treatment product |
| EP4349944A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
| EP4349945A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
| EP4349948A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
| EP4349947A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
| EP4349942A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
| EP4349943A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
| WO2024083589A1 (en) | 2022-10-18 | 2024-04-25 | Basf Se | Detergent compositions, polymers and methods of manufacturing the same |
| EP4361239A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-01 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
| WO2024088706A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-02 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition |
| WO2024088716A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-02 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition |
| WO2024115106A1 (en) | 2022-11-29 | 2024-06-06 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition |
| WO2024115754A1 (en) | 2022-12-02 | 2024-06-06 | Basf Se | Aqueous compositions containing polyalkoxylates, polyalkoxylates, and use |
| WO2024121058A1 (en) | 2022-12-05 | 2024-06-13 | Novozymes A/S | A composition comprising a lipase and a peptide |
| WO2024124013A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | International N&H Denmark Aps | Feed formulations comprising a phytase for dairy ruminant animals |
| WO2024126483A1 (en) | 2022-12-14 | 2024-06-20 | Novozymes A/S | Improved lipase (gcl1) variants |
| EP4389864A1 (en) | 2022-12-20 | 2024-06-26 | Basf Se | Cutinases |
Family Cites Families (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1234445A (ja) | 1967-10-03 | 1971-06-03 | ||
| US3929887A (en) | 1970-05-18 | 1975-12-30 | Endo Lab | Alkylenepoly(aralkylamines) and the salts thereof |
| US4760025A (en) | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
| NZ208612A (en) * | 1983-06-24 | 1991-09-25 | Genentech Inc | Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations |
| US5972682A (en) * | 1984-05-29 | 1999-10-26 | Genencor International, Inc. | Enzymatically active modified subtilisins |
| US5763257A (en) * | 1984-05-29 | 1998-06-09 | Genencor International, Inc. | Modified subtilisins having amino acid alterations |
| US4752585A (en) * | 1985-12-17 | 1988-06-21 | Cetus Corporation | Oxidation-resistant muteins |
| EP0254735B2 (en) * | 1986-01-15 | 1998-06-17 | Amgen Inc. | METHOD FOR PRODUCTION OF THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS |
| US4990452A (en) * | 1986-02-12 | 1991-02-05 | Genex Corporation | Combining mutations for stabilization of subtilisin |
| EP0260299A4 (en) * | 1986-02-12 | 1988-11-24 | Genex Corp | MUTAGENESIS AND SCREENING PROCESS AND PRODUCT OBTAINED. |
| US5013657A (en) * | 1988-04-12 | 1991-05-07 | Bryan Philip N | Subtilisin mutations |
| US4980288A (en) * | 1986-02-12 | 1990-12-25 | Genex Corporation | Subtilisin with increased thermal stability |
| IE65767B1 (en) * | 1986-04-30 | 1995-11-15 | Genencor Int | Non-human carbonyl hydrolase mutants DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors |
| AU620026B2 (en) * | 1987-02-27 | 1992-02-13 | Genencor International, Inc. | Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes |
| ES2134186T3 (es) * | 1987-02-27 | 1999-10-01 | Genencor Int | Clonaje molecular y expresion de genes que codifican enzimas proteoliticas. |
| EP0353250B1 (en) * | 1987-04-06 | 1999-09-08 | Novo Nordisk A/S | The engineering of electrostatic interactions at metal ion binding sites for the stabilization of proteins |
| US4914031A (en) * | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
| DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
| US5122449A (en) * | 1988-10-07 | 1992-06-16 | Eastman Kodak Company | Use of a protease in the extraction of chlamydial, gonococcal and herpes antigens |
| US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
| DK97190D0 (da) * | 1990-04-19 | 1990-04-19 | Novo Nordisk As | Oxidationsstabile detergentenzymer |
| US5766898A (en) * | 1990-12-05 | 1998-06-16 | Novo Nordisk A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
| KR100258460B1 (ko) * | 1991-05-01 | 2000-06-01 | 한센 핀 베네드 | 안정화 효소 및 세제 조성물 |
| US6682924B1 (en) * | 1995-05-05 | 2004-01-27 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
| US5837517A (en) * | 1995-05-05 | 1998-11-17 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
| ATE409743T1 (de) * | 1996-11-04 | 2008-10-15 | Novozymes As | Subtilase varianten und verbindungen |
| BR9811248B1 (pt) * | 1997-08-29 | 2011-10-04 | variante de enzima subtilase derivada de uma subtilase originária selecionada a partir do sub-grupo i-s1 ou do sub-grupo i-s2, dita variante tendo melhorado desempenho de lavagem em detergentes em comparação com a subtilase originária, sequência de dna isolada, vetor de expressão, célula hospedeira microbiana, processo para produzir uma variante, composição, uso de uma variante de subtilase. | |
| AU9061798A (en) * | 1997-08-29 | 1999-03-22 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
| US6780629B2 (en) * | 1997-11-21 | 2004-08-24 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
| CA2310454C (en) * | 1997-11-21 | 2012-01-24 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
| US6773907B2 (en) * | 1997-11-21 | 2004-08-10 | Peter Kamp Hansen | Subtilase enzymes |
| US6777218B1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
| DE60144145D1 (de) * | 2000-04-03 | 2011-04-14 | Maxygen Inc | Subtilisin-variante |
| EP2236611A1 (en) * | 2000-04-28 | 2010-10-06 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme variant |
| US6799287B1 (en) | 2000-05-01 | 2004-09-28 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Method and apparatus for verifying error correcting codes |
| US7109016B2 (en) * | 2000-08-21 | 2006-09-19 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
| US6893855B2 (en) * | 2000-10-13 | 2005-05-17 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
| DK200101090A (da) * | 2001-07-12 | 2001-08-16 | Novozymes As | Subtilase variants |
| US7888093B2 (en) * | 2002-11-06 | 2011-02-15 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
| US20070161531A1 (en) * | 2005-07-08 | 2007-07-12 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
-
1988
- 1988-01-07 DK DK006488A patent/DK6488D0/da not_active Application Discontinuation
-
1989
- 1989-01-06 EP EP05004172A patent/EP1538204A3/en not_active Withdrawn
- 1989-01-06 EP EP04025116A patent/EP1498481A1/en not_active Withdrawn
- 1989-01-06 WO PCT/DK1989/000002 patent/WO1989006279A1/en active IP Right Grant
- 1989-01-06 EP EP95107678A patent/EP0675196A3/en not_active Ceased
- 1989-01-06 JP JP1501511A patent/JPH0675504B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-06 DE DE68926163T patent/DE68926163T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-06 EP EP89901711A patent/EP0396608B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-06 AT AT89901711T patent/ATE136329T1/de not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-07-04 DK DK199001612A patent/DK175697B1/da not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-02-10 JP JP6016202A patent/JP2726799B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/486,846 patent/US6506589B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/486,415 patent/US5741694A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-29 DK DK199600361A patent/DK176102B1/da not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-10-01 JP JP9268984A patent/JPH10113179A/ja active Pending
-
2002
- 2002-11-27 US US10/306,089 patent/US6808913B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-05 US US10/310,730 patent/US6835821B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-06 US US10/313,853 patent/US6908991B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-07-21 US US10/896,177 patent/US20050003986A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，１５８（２）（１９８４），Ｐ．４１１−４１８ |
| Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，１０３（１９８８），１０３（１９８８），Ｐ．１０６０−１０６５ |
| ＮＵＣＬＥＩＣ．ＡＣＩＤ．ＲＥＳＥＡＲＣＨ．，１１（１９８３）Ｐ．７９１１−７９２５ |
| ＮＵＣＬＥＩＣ．ＡＣＩＤ．ＲＥＳＥＡＲＣＨ．，１３（１９８５），Ｐ．８９１３−８９２２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0675504B2 (ja) | 1994-09-28 |
| EP1538204A3 (en) | 2007-07-04 |
| US20030148495A1 (en) | 2003-08-07 |
| EP1538204A2 (en) | 2005-06-08 |
| JPH03503477A (ja) | 1991-08-08 |
| US6506589B1 (en) | 2003-01-14 |
| US6908991B2 (en) | 2005-06-21 |
| US20030186378A1 (en) | 2003-10-02 |
| EP1498481A1 (en) | 2005-01-19 |
| DE68926163D1 (de) | 1996-05-09 |
| US6808913B2 (en) | 2004-10-26 |
| EP0396608B1 (en) | 1996-04-03 |
| EP0396608A1 (en) | 1990-11-14 |
| DK6488D0 (da) | 1988-01-07 |
| US5741694A (en) | 1998-04-21 |
| US6835821B2 (en) | 2004-12-28 |
| ATE136329T1 (de) | 1996-04-15 |
| US20050003986A1 (en) | 2005-01-06 |
| DK175697B1 (da) | 2005-01-24 |
| EP0675196A2 (en) | 1995-10-04 |
| DK161290D0 (da) | 1990-07-04 |
| JPH06292577A (ja) | 1994-10-21 |
| DK36196A (da) | 1996-03-29 |
| DK161290A (da) | 1990-09-07 |
| DE68926163T2 (de) | 1996-10-02 |
| US20030175933A1 (en) | 2003-09-18 |
| DK176102B1 (da) | 2006-06-12 |
| EP0675196A3 (en) | 1995-11-22 |
| JPH10113179A (ja) | 1998-05-06 |
| WO1989006279A1 (en) | 1989-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2726799B2 (ja) | 変異ズブチリシン | |
| JP3471797B2 (ja) | 安定化酵素及び洗剤 | |
| AU629814B2 (en) | Novel proteolytic enzymes and their use in detergents | |
| JP3343115B2 (ja) | 突然変異したスブチリシンプロテアーゼ | |
| JP2889095B2 (ja) | サブチリシン突然変異体の製造に有用な桿菌 | |
| US6300116B1 (en) | Modified protease having improved autoproteolytic stability | |
| JPH06504199A (ja) | ｐＨ範囲にわたり分子荷電が低度に異なる突然変異体酵素 | |
| US5621089A (en) | Nucleic acid constructs for the production of a Bacillus alkaline protease | |
| US5346822A (en) | Alkaline proteases from Bacillus pumilus | |
| JP4050654B6 (ja) | 安定化酵素及び洗剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081205 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081205 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091205 Year of fee payment: 12 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091205 Year of fee payment: 12 |