JP4703113B2 - 複数置換プロテアーゼ変異体 - Google Patents
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Description
セリンプロテアーゼはカルボニル・ヒドロラーゼの下位集団である。これらは広範囲の特異性及び生物学的機能を有する酵素の種々の分類を含む。Stroud,R.Sci.Amer.,131:74−88。それらの機能的多様性にもかかわらず、セリンプロテアーゼの触媒機構は、1)ズブチリシン及び2)哺乳類キモトリプシン関連及び同種細菌性セリンプロテアーゼ(例えば、トリプシン及びS.gresiusトリプシン)の少なくとも2つの遺伝学的にはっきり区別できる酵素のファミリーに近かった。セリンプロテアーゼのこれら2つのファミリーは非常に類似した触媒作用機構を示す。Kraut,J.(1977)、Annu.Rev.Biochem.,46:331−358。さらに、一次構造は関連しないが、これら2つの酵素ファミリーの三次構造はセリン、ヒスチジン及びアスパラギン酸塩からなるアミノ酸の保存された触媒3残基を結集させる。
本発明の1の側面は、分子の電荷分布をその配向及び相、表面、その他の分子及び領域との相互作用に影響を与えるために変化させることである。
プロテアーゼは、一般的にタンパク質またはペプチドのペプチド結合を切断する働きを有するカルボニルヒドロラーゼである。ここで用いる“プロテアーゼ”は天然プロテアーゼまたは組換え型プロテアーゼを意味する。天然プロテアーゼはα−アミノアシルペプチド・ヒロドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシル−プロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼを含む。セリン、メタロ、チオール及び酸プロテアーゼが挙げられ、及びエンド及びエキソ−プロテアーゼが挙げられる。
C/U(i)=10(pKi−ph)(正電荷)(Ib)
上述の式に従うと、pHがpKiと等しい場合、C/U(i)は1である。
Qr(i)=C/U(i)/(1+C/U(i))(負電荷)(IIa)
Qr(i)=−C/U(i)/(1+C/U(i))(正電荷)(IIb)
重要である。本発明者が意図する典型的な組み合わせはK27T−G100E、R45N−A1R、R45N−P14R、R45N−G61R、R45N−S128R、R45N−N204R、R45N−S216R、R45N−G258R、R170S−A1R、R170S−P14R、R170S−S49R、R170S−G61R、R170S−G100R、R170S−S128R、R170S−N204R、R170S−S216R、R170S−G258R、D181N−G118D、D181N−G258D、K251G−S87K、E271T−S49E、E271T−T66E、E271T−G100E、E271T−G102E、E271T−S128E、R45N−G118E−E271R、S49R−G102E−R170S−E271T及びP14R−R45N−R170S−G258Rを含む。これらの変異を有するプロテアーゼ変異体が作ることができることは当業者に当然理解され、米国特許第5,741,694号、第6,190,900号、及び第6,197,567号に記載され、明示的にここに引用する。さらに、これらの変異は仮出願番号第60/423,087(2002年11月1日に出願;Neelam AminとVolker Schellenberger)に記載される直接的なバチルス形質転換法を用いても行うことができる。1の実施態様において、変異は融合PCR技術を用いて行った(Teplyakov,AV,et al,Protein Eng.,1992年7月5日(5):413−20)。同時にこの日に提出された、仮出願番号_/_____(Chris Leeflang,et al.)。
多数のプロテアーゼ変異体が生成でき、当業界に公知の方法を用いて精製できる。変異はバチルス・アミロリケファシエンス(BPN’)ズブチリシンまたはバチルス・レンタスGG36ズブチリシンにおいて作ることができる。変異体は以下から選択できる:バチルス・アミロリケファシエンスのK27A、K27C、K27E、K27Q、K27G、K27H、K27I、K27L、K27M、K27F、K27P、K27S、K27T、K27W、K27Y、H39A、H39R、H39D、H39N、H39C、H39E、H39Q、H39G、H39I、H39L、H39K、H39M、H39F、H39P、H39T、H39W、H39Y、H39V、D41A、D41R、D41C、D41E、D41Q、D41G、D41H、D41I、D41L、D41K、D41M、D41F、D41P、D41S、D41T、D41W、D41Y、D41V、R45A、R45R、R45D、R45N、R45C、R45E、R45C、R45E、R45Q、R45G、R45H、R45I、R45L、R45K、R45M、R45F、R45P、R45S、R45T、R45W、R45Y、R45V、H67A、H67R、H67D、H67N、H67C、H67E、H67Q、H67G、H67I、H67L、H67K、H67M、H67F、H67P、H67S、H67T、H67W、H67Y、H67V、K94A、K94R、K94D、K94N、K94C、K94E、K94Q、K94G、K94H、K94I、K94L、K94M、K94F、K94P、K94S、K94T、K94W、K94Y、K94V、E136A、E136D、E136N、E136C、E136G、E136H、E136I、E136L、E136K、E136M、E136F、E136P、E136S、E136T、E136W、E136Y、E136V、R170A、R170D、R170N、R170C、R170E、R170Q、R170G、R170H、R170I、R170L、R170K、R170M、R170F、R170P、R170S、R170T、R170W、R170Y、R170V、D181A、D181R、D181N、D181C、D181E、D181Q、D181G、D181H、D181I、D181L、D181K、D181M、D181F、D181P、D181S、D181T、D181W、D181Y、D181V、D197A、D197R、D197N、D197C、D197E、D197Q、D197G、D197H、D197I、D197L、D197K、D197M、D197F、D197P、D197S、D197T、D197W、D197Y、D197V、R247A、R247D、R247N、R247C、R247E、R247Q、R247G、R247H、R247I、R247L、R247K、R247M、R247F、R247P、R247S、R247T、R247W、R247Y、R247V、H249A、H249R、H249D、H249N、H249C、H249E、H249Q、H249G、H249I、H249K、H249M、H249F、H249P、H249S、H249T、H249W、H249V、K251A、K251D、K251C、K251Q、K251G、K251H、K251I、K251L、K251M、K251F、K251P、K251S、K251T、K251W、K251Y、K251V、E271A、E271R、E271D、E271N、E271C、E271H、E271I、E271L、E271K、E271M、E271F、E271P、E271S、E271T、E271W、E271Y、及び/またはE271V。
多数のプロテアーゼ変異体は公知の方法を用いて生成及び精製できる。変異はバチルス・アミロリケファシエンス(BPN’)ズブチリシンまたはバチルス・レンタスGG36ズブチリシンにおいて作ることができる。変異体は以下の位置に対応するアミノ酸の挿入、欠失または置換で作ることができる:バチルス・アミロリケファシエンス(BPN’)の5、7、23、26、28−31、34、47、63、65、66、69、70、73、82−85、88、90、92、93、105、113、125、138、139、148−151、176、178、179、193、196、200、201、202、207、219、220、223、229、233、250、266、267、及び273。
実施例1及び/または2で生成した多数のプロテアーゼ変異体は、米国特許出願番号60/068,796、“An Improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergent composition(好ましい酵素及び/または好ましい洗剤組成物の改善された分析方法)”に記載されている、マイクロスウォッチ(microswatch)分析法を用いて2種類の洗剤及び洗浄条件における性能を試験する。
実施例1及び2で記載するように分析できる変異体プロテアーゼはその他の異なる洗剤においても分析できる。実施例2と同じ性能試験を以下の洗剤を用いて記載変異体プロテアーゼについて行うことができる:第1の洗剤は、0.67g/lろ過アリエール・ウルトラ(プロクター&ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国)であり、溶液中3グレイン/ガロン合計Ca2+/Mg2+硬度を含み、及び20℃で各ウェル中0.3ppm酵素を使用した。第2の洗剤は、3.38g/lろ過アリエールFutur(プロクター&ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国)、であり、溶液中15グレイン/ガロン合計Ca2+/Mg2+硬度を含み、及び40℃で各ウェル中0.3ppm酵素を使用できる。第3の洗剤は、3.5g/lHSP1洗剤(プロクター&ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国)であり、溶液中8グレイン/ガロン合計Ca2+/Mg2+硬度を含み、及び20℃で各ウェル中0.3ppm酵素を使用できる。第4の洗剤は、1.5ml/l Tide洗剤(プロクター&ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国)であり、溶液中3グレイン/ガロン合計Ca2+/Mg2+硬度を含み、及び20℃で各ウェル中0.3ppmの酵素を使用できる。
多数のプロテアーゼ変異体を生成し、当業界で公知の方法を用いて精製した。全ての変異はバチルス・レンタスGG36ズブチリシン中に作った。変異体を表3に示す。
突然変異生成の方法は領域−特異性変異方法(Teplyakov et al.,1992)に基づいて行い、変異するコドンの配列に対応し、そのコドンでのヌクレオチドのランダムな結合を保証する具体的に作成された3DNA配列NNS((A、C、TまたはG)、(A、C、TまたはG)、(CまたはG))を取り囲む30〜40ヌクレオチド長のフォワード及びリバース相補オリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて特定DNAコドン中に全ての可能な変異を一度に作成した。
フォワード及びリバース変異プライマーは両側の相同配列の15以下塩基を含むプライマーの中間に3つの所望の変異を含む。これらの変異は目的のコドンをカバーし、所望のアミノ酸に特異的であり、意図的に合成される。
- 35μL精製DNA断片
- 4μL React(登録商標)4バッファ(Invitrogen(登録商標):20mM Tris−HCl、5mM MgCl2、50mM KCl、pH7.4)
- 1μL Apal、10単位/ml(Invitrogen(登録商標)、Cat.no.15440−019)
反応条件:1時間、30℃
- 40μL Apal消化DNA断片
- 1μL Dpnl、4単位/μL(Invitrogen(登録商標)、Cat.no.15242−019)
反応条件:16〜20時間、37℃
- 30μLのApal及びDpnl消化DNA断片
- 8μL T4リガーゼ・バッファ(Invitrogen(登録商標)、Cat.no.46300−018)
- 1μL T4 DNAリガーゼ、1単位/μl(Invitrogen(登録商標)、Cat.no.15224−017)
反応条件:16〜20時間、16℃
炭素源(グルコース及びマルトデキシトリン、10.5及び17.5g/l)、窒素源(尿、素、3.6g/l)及びリン酸塩(0.5g/l)及び硫酸塩(0.5g/l)などの必須養分を含み、及びさらに微量元素(Fe、Mn、Zn、Cu、Co、1〜4mg/ml)を補足したMops培地(Frederick C.Neidhardt et al.,1974)中で1〜50μLのグリセロール培養物を植菌する。培地はMOPS/トリシン混合物を用いて中和し、7〜8のpHを生じる。培養物を1〜5日、37℃/220rpm(Infors HT(登録商標)Multitron II)で培養する。
Protein engineering of the high-alkaline serine protease PB92 from Bacillus alcalophilus: functional and structural consequences of mutation at the S4 substrate binfing pocket. (バチルスalcalophilus由来の高アルカリ性セリンプロテアーゼPB92のタンパク質工学:S4基質結合ポケットでの変異の機能的及び構造的結果。)
Teplyakov AV、van der Laan JM、Lammers AA、Kelders H、Kalk KH、Misset O、Mulleners LJ、Dijkstra BW
Protein Eng.1992 Jul;5(5): 413-20.
Selection of a subtilisin-hyperproducing Bachillus in a highly structured environment (高度構造環境におけるズブチリシン−過剰生成バチルスの選択)
D.Naki、C.Paech、G.Ganshaw、V.Schellenberger.Appl Microbiol Biotechnol (1998) 49: 290-294.
Requirements for transformation in Bacillus subtilis (バチルス・ズブチリスにおける形質転換の必要条件)
Anagnostopoulos、C. and Spizizen、J. in J. Bacteriol. 81、741-746 (1961).
Culture Medium for Enterobacteria (腸内細菌の培養基)
Frederick C. Neidhardt、Philip L. Bloch and David F. Smith in Journal of Bacteriology、Sept 1974. p736-747 Vol. 119. No. 3.
実施例1で生成した多数のプロテアーゼ変異体を、米国特許出願番号09/554,992(WO99/34011)、“An Improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergent composition(好ましい酵素及び/または好ましい洗剤組成物の改善された分析方法)”に記載されているマイクロスウォッチ(microswatch)分析法を用いて2種類の洗剤及び洗浄条件における性能を試験した。
変異体の洗浄性能 ÷ GG36の洗浄性能(野生型)
4つの性能値を平均し、表2で示す値に達した。
Claims (5)
- 配列番号6に示すアミノ酸配列を有する前駆体バチルス・レンタス・ズブチリシンの変異体であって、
前記変異体が、前駆体と同じ正味静電荷を有し、さらに前駆体に対しR45N−G118E−E271R、R45N−P14R、R45N−N204R、D181N−G118D、R45N−G258R、R170S−A1R、R170S−G61R、R170S−N204R、K251G−S87K、R170S−S216R、E271T−G100E、E271T−G102E、E271T−S128E、R170S−G100R、又はE271T−S49Eに対応するアミノ酸置換を有するアミノ酸配列から成り、
前記アミノ酸置換に用いられる番号が、配列番号3に示すバチルス・アミロリケファシュンス・ズブチリシンのアミノ酸配列番号に対応する位置として示される、
前記バチルス・レンタス・ズブチリシンの変異体。 - 請求項1のプロテアーゼ変異体をコードするDNA。
- 請求項2のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項3の発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞。
- 請求項1のプロテアーゼ変異体を含んだ洗浄組成物。
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