ES2305023T3 - Metodos para el analisis de componentes no proteinaceos usando una proteasa de una cepa de bacilo. - Google Patents
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Abstract
Un método para el análisis de un componente no proteináceo de referencia de una mezcla de componentes no proteináceos y proteináceos derivados de una muestra biológica que comprende la etapa de incubar la mezcla con una proteasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1, un derivado proteolítico de la misma que tiene actividad de proteasa o la secuencia aminoácido SEQ ID NO 2.
Description
Métodos para el análisis de componentes no
proteináceos usando una proteasa de una cepa de bacilo.
La invención se refiere a un método para el
análisis de un componente no proteináceo de referencia de una
mezcla de componentes proteináceos y no proteináceos derivados de
una muestra biológica usando una proteasa de una cepa de bacilo. La
invención se refiere además a un método para el análisis de un
componente de referencia del ácido nucleico de una mezcla de
componentes no proteináceos, que comprende ácidos nucleicos y
componentes proteináceos donde la mezcla procede de una muestra
biológica que comprende las etapas de incubación de la mezcla con
una proteasa de una cepa de bacilo, amplificando opcionalmente el
componente del ácido nucleico de referencia y determinando o
detectando el componente del ácido nucleico de referencia.
Muchas sustancias biológicas, especialmente los
ácidos nucleicos, plantean retos en cuanto a su aislamiento del
entorno natural. Por otro lado, a menudo están presentes en
concentraciones muy pequeñas y, por otro lado, frecuentemente se
hallan en presencia de muchas otras sustancias sólidas y disueltas,
por ejemplo, después de la lisis de las células. Esto dificulta su
aislamiento y medición, en particular en los análisis bioespecíficos
que permiten la detección de analitos específicos, por ejemplo,
ácidos nucleicos, o bien propiedades específicas de los analitos y
puede tener un papel importante en el campo de la diagnóstica y
bioanalítica en la investigación y el desarrollo. Ejemplos de
análisis bioespecíficos son los análisis de hibridación, los
inmunoanálisis y los análisis de receptores y ligandos. Los
análisis de hibridación utilizan el emparejamiento de bases
específico para la detección molecular de analitos de ácido
nucleico, por ejemplo, de ARN y ADN. De ahí que, las muestras de
oligonucleótidos con una longitud de 18 a 20 nucleótidos puedan
permitir el reconocimiento específico de una secuencia
complementaria seleccionada, por ejemplo, en el genoma humano. Otro
análisis que supone o acarrea la unión selectiva de dos cebadores
de oligonucleótidos es la reacción en cadena de la polimerasa (RCP)
descrita en US 4.683.195. Este método permite la amplificación
selectiva de una región específica del ácido nucleico a unos
niveles detectables por una polimerasa termoestable en presencia de
trifosfatos de desoxinucleótidos en varios ciclos.
Tal como se ha descrito anteriormente, antes de
analizar las sustancias biológicas en uno de los análisis
anteriormente mencionados o bien de que se utilicen para otros
procesos, estas sustancias se tienen que aislar o purificar de las
muestras biológicas que contienen mezclas complejas de distintos
componentes como, por ejemplo, componentes proteináceos y no
proteináceos. A menudo, para las primeras etapas, se utilizan
procesos que permiten el enriquecimiento del componente de interés,
por ejemplo, el material no proteináceo como los ácidos nucleicos.
Frecuentemente, estos se encuentran en una célula bacteriana, una
célula fúngica, una partícula vírica, o bien la célula de un
organismo más complejo, como una célula sanguínea humana o una
célula vegetal. Los componentes de interés pueden denominarse
también un "componente de referencia".
Para liberar el contenido de dichas células o
partículas, estás se pueden tratar con enzimas o con sustancias
químicas para disolver, degradar o desnaturalizar las paredes
celulares de dichos organismos. A este proceso se le conoce
frecuentemente como lisis. La solución resultante que contiene dicho
material lisado se conoce como el lisado. Un problema que aparece a
menudo durante la lisis es el de que otras enzimas que degradan el
componente de interés no proteináceo, por ejemplo, los ácidos
nucleicos que degradan las desoxirribonucleasas o las ribonucleasas
entran en contacto con el componente de interés durante la lisis.
Estas enzimas degradantes también pueden estar presentes fuera de
las células o bien se pueden haber separado espacialmente en
diferentes compartimentos celulares previamente a la lisis y
contactan ahora con el componente de interés. Otros componentes
liberados durante este proceso pueden ser, por ejemplo, las
endotoxinas pertenecientes a la familia de los lipopolisacáridos
que son tóxicas para las células y pueden causar problemas en los
productos previstos para ser usados en la terapia humano o
animal.
Existen una variedad de medios para abordar este
problema ya mencionado. Es frecuente el uso de agentes caotrópicos,
como por ejemplo, el tiocianato de guanidio o los detergentes
aniónicos, catiónicos, zwiteriónicos o no iónicos cuando se
pretende liberar ácidos nucleicos. También es una ventaja el uso de
proteasas que rápidamente degradan estas enzimas o bien las
proteínas no deseadas. Sin embargo, esto puede ocasionar otro
problema ya que dichas sustancias o enzimas pueden interferir con
los reactivos o componentes en las etapas posteriores.
Los enzimas que se pueden utilizar de forma
ventajosa en dichos procesos de lisis o de preparación de muestras
mencionados son enzimas que parten las uniones de amidas en los
sustratos proteínicos y que se clasifican como proteasas, o bien
peptidasas (de modo intercambiable)(Ver Walsh, 1979, Enzymatic
Reaction Mechanisms, W.H. Freeman and Company, San Francisco,
capítulo 3). Las proteasas que se han utilizado en el modelo
anterior son, por ejemplo, proteasas alcalinas (WO98/04730) o bien
proteasas ácidas (US 5.386.024). La proteasa que se utiliza
ampliamente en el modelo anterior para la preparación de muestras
para el aislamiento de los ácidos nucleicos es la proteinasa K de
Tritirachium album (ver por ejemplo, Sambrook y cols, 1989)
que es activa alrededor del pH neutro y pertenece a una familia de
proteasas conocidas por la persona experta en el tema como las
subtilisinas. La subtilisina es una proteasa tipo serina producida
por bacterias o bien hongos gram-positivos.
Las bacterias de la especie del bacilo segregan
dos especies extracelulares de proteasas, una proteasa neutra o
metálica y una proteasa alcalina que es funcionalmente una
endopeptidasa tipo serina, a la que se conoce como subtilisina. Una
proteasa tipo serina es un enzima que cataliza la hidrólisis de los
enlaces peptídicos, en la cual existe un residuo esencial de la
serina en el lugar activo (White, Handler and Smith, 1973
"Principles of Biochemistry", quinta edición,
McGraw-Hill Book Company, N.Y.,pp.
271-272).Las proteasas tipo serina tienen unos
pesos moleculares del orden de 25.000 a 30.000 Da (Dalton).
Hidrolizan ésteres terminales simples y son similares en actividad
a la quimiotripsina eucariótica, es decir a una proteasa tipo
serina. El término alternativo, la proteasa alcalina, refleja el
elevado pH óptimo de las proteasas tipo serina, entre pH 9,0 y 11,0
(para revisión, ver Priest, 1977, Bacteriological Rev.
41:711-753).
Se han identificado una variedad amplia de
subtilisinas (ver, por ejemplo, Kurihara y cols.,1972, J. Biol.
Chem. 247:5629-5631; Stahl and Ferrari, 1984, J.
Bacteriol. 158:411-418; Vasantha y cols., 1984, J.
Bacteriol. 159:811-819, Jacobs y cols.,1985, Nucl.
Acids. Res. 13:8913-8926; Nedkov y cols.,1985; Biol.
Chem. Hoppe-Seyler 366:421-430;
Svendsen y cols.,1986, FEBS Lett 196:228-232;
Meloun y cols.,1985, FEBS. Lett. 183:195-200) que
incluyen la proteinasa K de Tritirachium album (Jany and Mayer,
1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler
366:584-492). Las subtilisinas se caracterizan por
su estructura primaria así como terciaria (ver por ejemplo, Kraut,
1977, Ann. Rev. Biochem. 46:331-358; Kurihara y
cols.,1972, J. Biol. Chem. 247:5629-5631; Stahl y
Ferrari, 1984, J. Bacterial. 158:411-418; Vasantha y
cols., 1984, J. Bacterial. 159:811-819; Jacobs y
cols., 1985. Nucl. Acids. Res.13: 8913-8926; Nedkov
y cols.,1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler
366:421-430; Svendsen y cols.,FEBS Lett.
196:228-232; Meloun y cols., 1985, FEBS Lett.
183:195-200; Jany and Mayer, 1985, Biol. Chem.
Hoppe-Seyler 366:485-492).
En relación con esta invención las secuencias de
aminoácidos y de ADN de otras dos proteasas tipo serina tienen un
interés especial. Estas proteasas procedían de dos variantes del
Bacillus lentus, 147 y 309, que han sido depositadas con la
NCIB y designaban los números de acceso NCIB 10147 y NCIB 10309,
respectivamente (ver WO39/06279 y US 3.723.250). Las proteasas
producidas por estas cepas se conocen como subtilisina 147 y
subtilisina 309, respectivamente, y los genes que codifican estas
proteínas se conocen como genes 147 y 309. La información sobre
estas secuencias se puede hallar en WO89/06279. Sus equivalentes son
la EP396608 y la US 5.741.694. Las subtilisinas han hallado gran
utilidad en la industria, en particular en las formulaciones de
detergentes utilizados para el lavado de ropa.
En las etapas siguientes de la preparación de
muestras que siguen a la etapa de lisis, el componente de interés
se encuentra enriquecido. Si los componentes de interés no
proteináceos son, por ejemplo, los ácidos nucleicos, estos son
extraídos normalmente de las mezclas de lisis compleja antes de ser
utilizados en un análisis a base de muestras.
Existen varios métodos para la extracción de los
ácidos nucleicos:
- métodos bioespecíficos o dependientes de la
secuencia como, por ejemplo:
- \bullet
- cromatografía de afinidad
- \bullet
- hibridación a muestras inmovilizadas
- métodos físico-químicos o
independientes de la secuencia como, por ejemplo:
- \bullet
- extracción líquido-líquido con fenol-cloroformo
- \bullet
- precipitación con etanol puro, por ejemplo
- \bullet
- extracción con papel de filtro*
- \bullet
- extracción con agentes formadores de micelas como el bromuro de cetil-trimetil-amonio
- \bullet
- enlace a colorantes inmovilizados, intercalados, por ejemplo, derivados de acridina
- \bullet
- adsorción en gel de sílice o tierras de diatomeas
- \bullet
- adsorción en partículas magnéticas de vidrio (MGP) o bien partículas de organosilanos en condiciones caotrópicas.
Especialmente interesante para fines de
extracción es la adsorción de ácidos nucleicos en una superficie de
vidrio aunque también son posibles otras superficies. Recientemente
se han propuesto muchos procedimientos para aislar ácidos nucleicos
de su entorno natural mediante el uso de su comportamiento de
enlace a las superficies de vidrio.
Tal como se ha mencionado antes, la proteasa que
se utiliza ampliamente en el modelo anterior para la preparación de
muestras para el aislamiento de ácidos nucleicos es la proteinasa K
de Tritirachium album. Sin embargo, esta proteasa tiene el
inconveniente de que la producción es relativamente cara. Además, la
proteinasa K es desfavorable en los métodos que utilizan partículas
de vidrio magnéticas para el aislamiento del ácido nucleico del
EDTA, la heparina o el plasma sanguíneo de citrato, ya que las
partículas a menudo se pegan unas a otras. Esto es un inconveniente
para los procesos automatizados empleados para el análisis de un
gran número de muestras.
Por lo tanto, un objetivo de la presente
invención consistía en aportar un método nuevo para el análisis de
componentes no proteináceos de referencia, en particular ácidos
nucleicos, usando una proteasa que es relativamente barata, tiene
una calidad constante y se puede utilizar en una variedad de
procesos. Preferiblemente sería posible utilizarla para el análisis
de (al menos un) componente de referencia del ácido nucleico de una
variedad de diferentes matrices, por ejemplo, EDTA, citrato, o
plasma sanguíneo de heparina o bien suero sanguíneo. Este método
sería especialmente apropiado en los procesos automatizados.
Idealmente, la proteasa sería también muy activa en presencia de
agentes caotrópicos utilizados frecuentemente en los procesos para
la purificación de ácidos nucleicos.
Este problema se resolvía con los hallazgos de
la presente invención que se define mediante las reivindicaciones
adjuntas y que se relaciona con un método para el análisis de un
componente no proteináceo de referencia (al menos uno) de una
mezcla de componentes proteináceos y no proteináceos procedentes de
una muestra biológica que comprende la etapa de incubar la mezcla
con (al menos una) proteasa que tiene una secuencia aminoácido que
es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID
NO:1 de la proteasa subtilisina 147 del Bacillus lentus.
Como se puede ver del ejemplo, la proteasa es muy activa en
presencia de los agentes caotrópicos o bien igualmente activa para
la digestión del citrato o del plasma sanguíneo de EDTA. Esto podía
haber sido previsto por el modelo anterior.
En resumen, esta invención se refiere a un
método para el análisis de (al menos) un componente no proteináceo
de referencia de una mezcla de componentes proteináceos y no
proteináceos procedentes de una muestra biológica que utiliza la
proteasa de una cepa de bacilos tal como se ha definido en las
reivindicaciones adjuntas. La invención se refiere además a un
método para el análisis de (al menos un) componente del ácido
nucleico de referencia de una mezcla de componentes no
proteináceos, que comprende ácidos nucleicos, y los componentes
proteináceos de forma que la mezcla procede de una muestra biológica
que comprende las etapas de incubar la mezcla con (al menos una)
proteasa que tiene una secuencia aminoácido que es al menos un 80%
idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 de la proteasa
subtilisina 147 del Bacillus lentus, ampliando opcionalmente
el componente de ácido nucleico de referencia (al menos uno) y
determinando o detectando el componente de ácido nucleico de
referencia (al menos uno). Opcionalmente, los ácidos nucleicos y el
componente del ácido nucleico de referencia (al menos uno) están
unidos a un material con una afinidad por el mismo, se lavan
opcionalmente y se liberan opcionalmente del material con una
afinidad por el mismo, donde el material con una afinidad por los
ácidos nucleicos y el componente (al menos uno) del ácido nucleico
de referencia comprende un material con una superficie de sílice,
en particular partículas de vidrio magnéticas. La invención se
relaciona además con el uso de la proteasa de acuerdo con la
invención en diagnóstica, investigación y bioanalítica, por ejemplo,
para la purificación de ácidos nucleicos, para el análisis de un
componente no proteináceo de referencia (al menos uno) de una
mezcla de componentes proteináceos y no proteináceos procedentes de
una muestra biológica, para el enriquecimiento de (al menos un)
componente no proteináceo de referencia de una mezcla de componentes
proteináceos y no proteináceos procedentes de una muestra biológica
o bien para la purificación o el aislamiento de (al menos) un
componente de referencia no proteináceo de una mezcla de componentes
proteináceos y no proteináceos procedente de una muestra biológica.
La invención hace referencia también a un equipo que consta de la
proteasa conforme a la invención y al uso de un equipo conforme a
la invención en el diagnóstico y/o para la purificación de ácidos
nucleicos. La invención se describirá con más detalle a
continuación.
Figura 1a: Comparación de la digestión del
plasma de EDTA frente al plasma de citrato con la Esperasa según se
analiza mediante cromatografía líquida de alta presión
Figura 1b: Comparación de la digestión del
plasma de EDTA frente al plasma de citrato con proteinasa K según
se analiza mediante cromatografía líquida de alta presión
Figura 2: Determinación del pH óptimo de
Esperasa
Figura 3: Determinación de la actividad residual
de la Esperasa frente a la proteinasa K dependiendo de la
concentración de un agente caotrópico. La actividad máxima se fija
en un valor del 100% y las otras concentraciones se calculan con
respecto al valor máximo.
Figura 4: Determinación de la estabilidad de la
Esperasa frente a la proteinasa K dependiendo de la concentración
de tiocianato de guanidio. La actividad de la proteasa se mide
directamente después de la adición de tiocianato de guanidio y tras
15 minutos a 25ºC en presencia del tiocianato de guanidio. El
porcentaje de la actividad residual para diferentes concentraciones
de tiocianato de guanidio se muestra en esta figura.
Figura 5: Estabilidad en el tampón de
almacenamiento (composición: Tris acetato 10 mM, cloruro de calcio
5 mM, acetato de calcio 5 mM, EDTA 1 mM, glicerina al 50%(V/V)
con un valor de pH de 5,5) de la Esperasa frente a la proteinasa
K.
Una configuración de la invención consiste en
aportar un método para el análisis de (al menos) un componente no
proteináceo de referencia de una mezcla de componentes no
proteináceos y proteináceos de una muestra biológica que comprende
la etapa de incubar la mezcla con una proteasa que tiene una
secuencia aminoácido que es al menos un 80% idéntica a la secuencia
de aminoácidos SEQ ID NO:1. El término "derivado o procedente"
significa que una muestra biológica es manipulada o tratada para
crear una mezcla de componentes no proteináceos y proteináceos que
originalmente se encuentran contenidos en la muestra biológica. A
partir de esta mezcla sería posible analizar, aislar o purificar
componentes específicos no proteináceos. El término "análisis"
significa que se investiga la presencia o cantidad de componente no
proteináceo de referencia, es decir se detecta o determina el
componente no proteináceo. La manipulación o las etapas de
tratamiento incluyen unas etapas de manipulación física o química
que son conocidas por el experto en dicho campo. Más
específicamente, hablaremos de la lisis de la muestra biológica.
Las muestras biológicas son muestras que se toman de una planta o de
un animal (incluyendo un ser humano) y son sólidas o líquidas. A
continuación se describen con más detalle las muestras
específicas.
En otra configuración de la invención, el método
presenta otras etapas posteriores a la incubación como la unión del
componente no proteináceo de referencia a un material con una
afinidad por el mismo, el lavado opcional y la liberación opcional
del componente no proteináceo de referencia del material.
Posteriormente, el componente no proteináceo de referencia puede
ser determinado o detectado mediante métodos analíticos estándar
conocidos por el experto y descritos, por ejemplo, en Sambrook y
cols.(1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University
Press, New York, NY, USA o en "Bioanalytik", Lottspeich y
Zorbas(eds.), primera edición 1998, Spectrum Akademischer
Verlag, Heidelberg, Berlin, Alemania. Preferiblemente, la cantidad
de componente no proteináceo de referencia se determina con los
métodos aquí descritos. El método conforme a la invención se utiliza
preferiblemente en investigación, bioanalítica en particular en
diagnóstica o en las investigaciones diagnósticas en medicina, es
decir, en métodos que se utilizan para determinar la causa de una
enfermedad o trastorno en humanos o en animales.
Por lo tanto, una configuración preferida de la
invención es un método para el análisis de un componente no
proteináceo de referencia de una mezcla de componentes proteináceos
y no proteináceos derivados de una muestra biológica que comprende
las etapas de
- a)
- incubación de la mezcla con la proteasa conforme a la invención,
- b)
- enlace del componente no proteináceo de referencia a un material con una afinidad por el mismo,
- c)
- lavado opcional y liberación opcional del componente no proteináceo de referencia del material con una afinidad por el mismo, y
- d)
- determinación o detección del componente no proteináceo de referencia.
En la configuración mayoritariamente preferida,
la etapa c) no es opcional, es decir, que el componente no
proteináceo de referencia enlazado se lava y se libera del material
con una afinidad por el mismo. Preferiblemente, se determinará la
cantidad de componente no proteináceo de referencia.
La proteasa conforme a la invención degrada los
componentes proteináceos, es decir, los componentes que contienen
enlaces peptídicos que serán hidrolizados en caso de interés para
enriquecer, aislar o purificar el componente no proteináceo de
referencia de la muestra biológica. La proteasa conforme a la
presente invención se puede añadir en forma sólida, por ejemplo,
como un comprimido o bien un polvo o en forma disuelta en una
solución tamponada o no tamponada de manera similar a como se ha
descrito para la proteinasa K.
Para el objetivo de esta invención, el término
"esperasa" equivale a la proteasa conforme a la invención, es
decir a la proteasa subtilisina 147 derivada del Bacillus
lentus variante 147, que fue depositada con NCIB al acceder al
número NCIB 10147. La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1 es la
secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteasa
subtilisina 147 (o esperasa) que incluye una secuencia de la señal
que se retira después de la segregación por la acción de las
proteasas. Una secuencia de la señal es una secuencia que dirige la
secreción de una proteína expresada desde la célula huésped y
eliminada proteolíticamente tras la secreción. La SEQ ID NO 2 es la
secuencia de la esperasa sin secuencia de la señal. El término
"esperasa" comprenderá también aquellos derivados
proteolíticos de la SEQ ID NO 1 que puedan ser generados por un
tratamiento incompleto o inexacto de la secuencia de señales y que
todavía tengan actividad proteolítica incluso aquellos con una
actividad inferior pero suficientemente elevada. La secuencia de
aminoácidos de la proteína puede ser codificada por el gen de la
subtilisina 147, es decir, la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 3,
por partes del mismo o una versión degenerada del mismo. Las
secuencias degeneradas son degeneradas dentro del significado del
código genético, es decir que un número ilimitado de nucleótidos son
sustituidos por otros nucleótidos sin provocar un cambio en la
secuencia de aminoácidos originalmente codificada.
Conforme a la presente invención el término
"material proteináceo" equivale a describir el material que
contiene un enlace peptídico (al menos uno), por lo tanto el
"material proteináceo" es preferiblemente una composición de
materia que contiene una proteína (al menos una) con aminoácidos
naturales. La mayoría de estos enlaces peptídicos pueden ser
hidrolizados por la proteasa conforme a la presente invención
dependiendo de la naturaleza química de los grupos químicos
colindantes (o aminoácidos) y la accesibilidad del enlace peptídico,
es decir, el material proteináceo es un sustrato para la proteasa
conforme a la invención. Como consecuencia de ello, el término
"material no proteináceo" equivale a describir el material que
no contiene un enlace peptídico y no es el sustrato para la
proteasa conforme a la presente invención.
La proteasa subtilisina 147 del Bacillus
lentus se encuentra disponible para el experto en el campo, por
ejemplo, de Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania o bien
de Novo Nordisk, Dinamarca. Otra posibilidad para obtener esta
proteasa consiste en aislar el gen del microorganismo depositado o
bien sintetizar el gen que codifica dicha proteasa conforme a la
metodología estándar. Ver, por ejemplo, Sambrook y cols.(1989),
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press, New york,
NY, USA. La secuencia aminoácido de la pro-proteína
que comprende una secuencia de señales (SEQ ID NO 1), la secuencia
aminoácido de la proteasa secretada (SEQ ID NO 2) y la secuencia de
ADN (ver SEQ ID NO 3) de esta proteína se conocen de WO089/06279, EP
396 608 y WO98/20115. La forma principal de la proteína segregada
viene codificada por los nucleótidos 280 a 1083 de la SEQ ID NO 3.,
es decir, el péptido de la señal viene codificado por los
nucleótidos 1 a 279 de la SEQ ID NO 3. El aislamiento del
microorganismo se ha descrito en US 3.723.250. La cepa aislada se
deposita bajo la NCIB 10147. La síntesis génica se puede realizar
por ejemplo por Operon Technologies, Alameda, CA, USA, recientemente
adquirida por Qiagen, Alemania. Utilizando la metodología estándar
la persona experta en el tema puede construir un vector de
expresión, expresar el producto génico y aislar la proteína
esencialmente como se ha descrito en WO89/06279 o bien
WO98/20115.
Con esta información en la mano, el experto en
la materia puede construir también y expresar un código génico para
una proteasa con una secuencia de aminoácidos con una identidad del
80% con respecto a la secuencia de aminoácidos del subtilisina 147,
sustituyendo varios aminoácidos. Por lo tanto, utiliza metodología
estándar como la descrita en Sambrook y cols.(1989), Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor University Press, New York, NY, USA o
bien metodología como la descrita en WO89/06279 o bien WO98/20115.
Los análisis para la actividad proteolítica se describen en estas
dos solicitudes internacionales o en esta invención.
En otra configuración, se muestra un método
conforme a la invención que se caracteriza por que la secuencia de
aminoácidos de la proteasa es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO
1, un derivado proteolítico de la misma que tiene una actividad de
la proteasa o bien la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2. En otra
configuración de la invención, se muestra un método conforme a la
invención que se caracteriza por que la secuencia de aminoácidos de
la proteasa conforme a la invención viene codificada por la
secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO 3, una parte de la misma
equivale a la proteasa activa conforme a la invención o bien a una
versión degenerada de la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO
3.
En una configuración de la invención, la muestra
biológica comprende virus o células bacterianas, así como células
aisladas de organismos multicelulares, como por ejemplo, las células
humanas y animales como los leucocitos, y los compuestos químicos
de alto y bajo peso molecular inmunológicamente activos como los
haptenos, antígenos, anticuerpos y los ácidos nucleicos, el plasma
sanguíneo, el líquido cerebral, el esputo, las heces, las muestras
de la biopsia, la médula ósea, los enjuagues orales, el suero
sanguíneo, los tejidos, la orina o bien mezclas de los mismos. En
una configuración preferida de la invención, la muestra biológica es
un fluido procedente del cuerpo humano o animal, preferiblemente la
muestra biológica es sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo o
bien orina. El plasma sanguíneo es preferiblemente EDTA, heparina o
bien plasma sanguíneo de citrato. En una configuración de la
invención, la muestra biológica comprende células bacterianas,
células eucarióticas, virus o mezclas de los mismos.
La muestra biológica puede ser también de un
tipo utilizado para el análisis ambiental, el análisis de alimentos
o la investigación biológica molecular, por ejemplo, de cultivos
bacterianos, lisados bacteriófagos. En ciertos casos, la muestra se
puede utilizar sin tratamiento previo en el método conforme a la
invención. En muchos casos, sin embargo, la muestra debería ser
lisada usando un método apropiado, que libere las sustancias
biológicas contenidas en la muestra, creando con ello una mezcla de
componentes proteináceos y no proteináceos derivados de la muestra
biológica. Los procedimientos para lisar muestras son conocidos por
el experto y pueden ser de naturaleza química, enzimática o física.
También se puede aplicar una combinación de estos procedimientos.
Por ejemplo, la lisis se puede realizar usando ultrasonidos, alta
presión, por fuerzas de cizallamiento, usando álcalis, detergentes
o soluciones salinas caotrópicas, o bien por medio de proteasas o
lipasas. Con respecto al procedimiento de lisis para obtener ácidos
nucleicos, se hace una referencia especial a Sambrook y cols.:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring
Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, USA, y Ausubel y
cols.:Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and
Sons, NY, USA.
También se describe el caso en el que la muestra
biológica comprende una proteína glucosilada (al menos una) que es
degradada parcial o totalmente por la proteasa conforme a la
invención. Por lo tanto, también se describe el uso de la proteasa
conforme a la invención para la degradación total o parcial de las
proteínas glucosiladas, es decir, de las proteínas con mitades de
carbohidratos unidas por medio de un enlace covalente.
El método conforme a la invención puede
presentar también otras etapas posteriores a la incubación como el
enlace del componente no proteináceo de referencia a un material con
una afinidad por el mismo, lavando opcionalmente y liberando
opcionalmente el componente de referencia no proteináceo del
material con afinidad por el mismo. Posteriormente, se puede
determinar o detectar el componente de referencia no proteináceo
mediante métodos estándar analíticos conocidos por el experto y
descritos, por ejemplo, en Sambrook y cols. (1989), Molecular
Cloning, Cold Spring Harbour University Press, New York, NY, USA, o
en "Bioanalytik", Lottspeich y Zorbas (eds), primera edición
1998, Spectrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin,
Alemania.
Para enlazar el componente no proteináceo de
referencia a un material con una afinidad por el mismo, la mezcla
de componentes no proteináceos y proteináceos se pone en contacto
con el material con una afinidad por el componente no proteináceo
de referencia en unas condiciones en las cuales el componente de
referencia no proteináceo se enlaza a la superficie del material.
Las condiciones de este enlace dependen del método por el cual el
componente no proteináceo de referencia se enlaza a la superficie.
Por ejemplo, si los ácidos nucleicos modificados son los
componentes de referencia no proteináceos, el enlace puede tener
lugar a través de los grupos de ácidos nucleicos que representan la
modificación, es decir, biotina a través del enlace con superficies
revestidas de estreptavidina.
Si los ácidos nucleicos no modificados son los
componentes de referencia no proteináceos, se prefiere un enlace
directo de los ácidos nucleicos a un material con una superficie de
sílice porque entre otros motivos los ácidos nucleicos no tienen
que modificarse o incluso se pueden enlazar a ácidos nucleicos
nativos. Estos procesos se han descrito con detalle en diversos
documentos. En Proc. Natl. Acad. USA 76,
615-691(1979), por ejemplo, se ha propuesto
un procedimiento para enlazar ácidos nucleicos de geles de agarosa
en presencia de ioduro de sodio al vidrio esmerilado. Se ha
descrito la purificación de ADN plásmido de las bacterias en polvo
de cristal en presencia de perclorato sódico en Anal. Biochem. 121,
382-387(1982). En DE-A 37 34
442, se describe el aislamiento del ADN bacteriófago M13 de una
sola rama en los filtros de fibra de vidrio por precipitación de
las partículas bacteriofágicas usando ácido acético y la lisis de
las partículas bacteriofágicas con perclorato. Los ácidos nucleicos
ensamblados a los filtros de fibra de vidrio se lavan y luego son
eluidos con un tampón de tris/EDTA que contiene metanol. En Anal.
Biochem. 175, 196-201(1988) se ha descrito un
procedimiento similar para purificar el ADN de los bacteriófagos
\lambda. El procedimiento conlleva la unión selectiva de los
ácidos nucleicos a superficies de vidrio en soluciones salinas
caotrópicas y la separación de los ácidos nucleicos de
contaminantes como la agarosa, proteínas o residuos celulares. Para
separar las partículas de vidrio de los contaminantes, las
partículas pueden ser centrifugadas o los fluidos son extraídos a
través de los filtros de fibra de vidrio. Sin embargo, esto es una
dificultad ya que impide que el procedimiento se utilice para
procesar grandes cantidades de muestras. El uso de partículas
magnéticas para inmovilizar ácidos nucleicos después de la
precipitación añadiendo sal y etanol tiene más ventajas y se
describe, por ejemplo, en Anal. Biochem. 201,
166-169(1992) y PCT GB 91/00212. En este
procedimiento, los ácidos nucleicos se aglutinarán junto con las
partículas magnéticas. El aglutinado se separará del disolvente
original aplicando un campo magnético y realizando una etapa de
lavado. Después de una etapa de lavado, los ácidos nucleicos se
disuelven en un tampón tris. Sin embargo, este procedimiento tiene
un inconveniente que es que la precipitación no es selectiva para
los ácidos nucleicos. Más bien se aglutinan una variedad de
sustancias sólidas y disueltas. Como resultado de ello, este
procedimiento no se puede utilizar para eliminar cantidades
significativas de algunos inhibidores de las reacciones enzimáticas
específicas que puedan estar presentes. También se dispone de vidrio
poroso, magnético en el mercado, que contiene partículas magnéticas
en una matriz de vidrio especial porosa, que está cubierta de una
capa que contiene estreptavidina. Este producto se puede utilizar
para aislar los materiales biológicos, por ejemplo, las proteínas o
los ácidos nucleicos, si estos se modifican en una etapa de
preparación compleja de manera que forman enlaces covalentes con la
biotina. En la preparación automática de la muestra se ha
verificado que los adsorbentes son muy eficientes y adecuados. Con
esta finalidad se utilizan pigmentos ferrimagnéticos y
ferromagnéticos así como superparamagnéticos. Los MGPs más
preferidos son los descritos en WO01/37291.
La descripción con detalle del procedimiento
para enlazar el ácido nucleico de referencia es la siguiente. Se
realiza preferiblemente en presencia de sales caotrópicas con una
concentración entre 1 y 8 mol/l, y preferiblemente entre 2 y 6
mol/l. Las sales caotrópicas pueden ser ioduro de sodio, perclorato
de sodio, tiocianato de guanidio, isotiocianato de guanidio o
clorhidrato de guanidio. También son posibles otras sustancias. El
efecto de purificación es el resultado del comportamiento del ADN o
del ARN para enlazarse al material con una superficie de vidrio en
estas condiciones, es decir, en presencia de cierta concentración de
un agente caotrópico, de concentraciones elevadas de disolventes
orgánicos o en condiciones ácidas. Para poner la muestra en contacto
con el material con una afinidad por el componente de referencia no
proteináceo, la muestra se mezcla con el material y se incuba
durante un periodo de tiempo suficiente como para que se produzca el
enlace. Los expertos están familiarizados con la duración de la
etapa de incubación de los procedimientos para llevar a cabo el
tratamiento con partículas no magnéticas. Esta etapa se puede
optimizar determinando la cantidad de material biológico
inmovilizado en la superficie en diferentes momentos. Para los
ácidos nucleicos pueden ser apropiados tiempos de incubación entre
10 segundos y 30 minutos. Tras la incubación, el componente no
proteináceo de referencia enlazado se separa del líquido. Esto se
consigue generalmente por gravedad o en el caso conveniente de
ácidos nucleicos enlazados a partículas de vidrio magnético
separando el material enlazado a las partículas magnéticas mediante
la aplicación de un campo magnético. Por ejemplo, las partículas
magnéticas pueden ser retiradas a la pared del recipiente en el que
se realiza la incubación. Luego se puede retirar el líquido que
contiene las muestras que no están enlazadas a las partículas
magnéticas. El procedimiento de retirada empleado dependerá del tipo
de recipiente en el que se haya realizado la incubación. Las etapas
apropiadas incluyen la retirada del líquido a través del pipeteo o
de la aspiración. El material con el ADN o el ARN enlazadas se
lavará al menos una vez, preferiblemente con una mezcla de 70
partes en volumen de etanol con 30 partes en volumen de agua (70%
de etanol). Se utiliza una solución de lavado que no haga que el
componente de referencia no proteináceo (al menos uno) se despegue
de la superficie del material sino que elimine los contaminantes no
deseados con la mayor eficacia posible. Esta etapa de lavado tiene
lugar preferiblemente incubando el material con el componente no
proteináceo de referencia con la solución de lavado. El material se
vuelve a suspender preferiblemente durante esta etapa. La solución
de lavado contaminada se elimina preferiblemente tal como se ha
descrito en la anterior etapa para la fijación del material
biológico. Tras la última etapa de lavado, el material se puede
secar ligeramente en el vacío, o bien se deja que el fluido se
evapore. También se puede llevar a cabo un pretratamiento con
acetona. Luego, las condiciones se pueden invertir, por ejemplo, la
concentración del agente caotrópico o del disolvente orgánico se
reducen para eluir el ADN o ARN unido al material. Preferiblemente,
el proceso de separación de las partículas de vidrio magnéticas del
resto de la muestra se realiza granulando el material biológico
inmovilizado, por ejemplo por la fuerza de la gravedad o mediante el
uso de un imán en el caso de partículas de vidrio magnético y la
retirada del sobrenadante. Luego las partículas de vidrio magnético
con el material biológico inmovilizado se vuelven a suspender en una
solución con o sin una pequeña cantidad de agente caotrópico y/o
disolvente orgánico. Alternativamente, la suspensión se puede diluir
con una solución con o sin una pequeña cantidad de agente
caotrópico y/o disolvente orgánico. Los tampones de esta naturaleza
se conocen de DE 3724442 y de Analytical Biochemistry 175,
196-201(1988). Los tampones de elución con
un contenido salino mínimo son en particular tampones con un
contenido inferior a 0,2 mol/l. En una configuración especialmente
preferida, el tampón de elución contiene la sustancia Tris para los
fines de estabilización. En otra configuración especial, el tampón
de elución es agua desmineralizada. La solución que contiene ADN o
ARN purificados se puede utilizar ahora para otras reacciones.
Para las etapas de lavado y de fijación, se usan
preferiblemente líquidos que son adecuados para los procesos en
biología molecular, en particular, los procesos de purificación de
ácido desoxirribonucleico (ADN) o bien ácido ribonucleico (ARN) que
utilizan la fijación de estas sustancias a las partículas de vidrio
en ciertas condiciones. Los líquidos preferidos comprenden los
alcoholes y/o las cetonas o cualquier mezcla de las mismas con
agua. Los alcoholes incluirán según la invención preferiblemente
alcoholes primarios, secundarios o terciarios de la fórmula general
R-OH, donde R corresponde a la fórmula general
-(-CH_{2})_{n}-CH_{3} con n\geq0.
Sin embargo, también se pueden utilizar otros alcoholes si son
adecuados para fines de biología molecular, como por ejemplo, el
glicerol. Especialmente apropiados son los alcoholes como el
isopropanol, etanol o las mezclas de los mismos con agua,
preferiblemente una mezcla de 80 partes en volumen de isopropanol
con 20 partes en volumen de agua. En otra configuración de la
invención, el líquido comprende cetonas como, por ejemplo, la
acetona.
Las partículas de vidrio magnéticas utilizadas
en la presente invención pueden aparecer en diferentes
formulaciones. Es posible encontrarlas en forma de un comprimido,
como un polvo o preferiblemente como una suspensión. Estas
suspensiones pueden contener entre 5 y 60 mg/ml de partículas de
vidrio magnéticas (MGPs). En otra configuración de la invención, el
material que contiene sílice se suspende en soluciones acuosas
tamponadas que opcionalmente pueden contener un agente caotrópico
en una concentración entre 2 y 8 mol/l, y preferiblemente entre 4 y
6 mol/l. Las sales caotrópicas son el ioduro de sodio, perclorato
de sodio, tiocianato de guanidio, isotiocianato de guanidio o
clorhidrato de guanidio. También son posibles otros compuestos
conocidos por el experto. Un agente caotrópico conforme a la
presente invención es cualquier sustancia química que altera la
estructura ordenada del agua líquida y tiene el efecto de que el
ADN o el ARN se une a las partículas de vidrio magnéticas si este
agente está presente en la solución que contiene ADN o ARN. Fabricar
soluciones tamponadas acuosas adecuadas es algo realmente obvio
para el experto. Los sistemas de estabilización adecuados para fines
de biología molecular se pueden hallar en Sambrook y cols. (1989),
Molecular Cloning, Cold Spring Harbour University Press, New York,
NY, USA. Las sustancias tampón preferidas son la
tris-(hidroximetil)-aminometano (TRIS), los
fosfatos, el ácido
N-2(2-hidroxietil)
piperazina-N'-(2-etanosulfónico)
(HEPES), las sales del mismo u otras sustancias adecuadas.
Adicionalmente, pueden encontrarse sustancias que modifiquen la
resistencia iónica de la solución como, por ejemplo, el NaCl, KCl o
CaCl_{2} o bien que sean agentes complejantes del catión metálico
como, por ejemplo, el ácido
etilen-diamino-tetra-acético
(EDTA) o sales del mismo. Otras sustancias biológicas conocidas por
el experto también pueden estar presentes. El método conforme a la
presente invención es adecuado para la purificación de ácidos
nucleicos, es decir, ARN ó ADN, de mezclas complejas con tras
sustancias biológicas que los contienen. Por lo tanto también se
pueden purificar mezclas de diferentes ácidos nucleicos, incluso
mezclas que contienen un ácido nucleico de interés en escasa
abundancia. En una configuración de la invención se purifican
mezclas de ácidos nucleicos específicos, en las cuales
el(los) ácido(s) nucleico(s) de referencia
pueden ser un componente mínimo en cuanto a la concentración (o
pueden estar presentes en poca cantidad).
El procedimiento descrito se puede utilizar para
aislar material biológico nativo o modificado. El material
biológico nativo se entiende como el material cuya estructura no se
ha modificado de forma irreversible en comparación con los
materiales biológicos de aparición natural. Esto no significa que
otros componentes de la muestra no se hayan podido modificar. Los
materiales biológicos modificados incluyen materiales que no
existen en la naturaleza, es decir, ácidos nucleicos que son
modificados al añadirles grupos reactivos, detectables o capaces de
inmovilización. Un ejemplo de esto son los ácidos nucleicos
biotinilados.
Tras las etapas descritas, los componentes no
proteináceos aislados usando el método conforme a la invención se
pueden utilizar ahora tanto como sea necesario. Por ejemplo, pueden
ser utilizados como un sustrato para las diversas reacciones
enzimáticas. Cuando se implican ácidos nucleicos, éstos se pueden
utilizar para el secuenciado, el marcado radioactivo y no
radioactivo, la amplificación de una o más de las secuencias que
contengan, la transcripción, hibridación con ácidos nucleicos de
muestra marcados, traslación o enlace. Por lo tanto, en una
configuración especialmente preferida de la invención, el método
comprende la etapa de liberación del componente no proteináceo de
referencia enlazado (al menos uno) del material con una afinidad por
el mismo. Si se desea, el componente no proteináceo de referencia
(al menos uno) purificado de esta forma se puede separar del
material tal como se ha descrito antes.
En una configuración preferida de la invención,
el método comprende la etapa de detectar o determinar un componente
de referencia no proteináceo. Una configuración preferida de la
invención son por lo tanto el método de purificación anteriormente
descrito seguido de una etapa de determinación o detección o de unos
métodos de purificación seguidos de una etapa de amplificación y
determinación o detección. En el caso de los ácidos nucleicos, el
ácido o los ácidos nucleicos de referencia de interés pueden
encontrase en una matriz de ácidos nucleicos que no sean de
referencia, e incluso puede ser un componente minoritario en dicha
mezcla de ácidos nucleicos específicos. Los métodos de detección
del ADN adecuados son conocidos por el experto en este campo y se
describen en libros de texto estándar como Sambrook y cols. (1989),
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring
Harbour University Press, Cold Spring Harbour, NY y Ausubel y cols.:
Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY.
También pueden existir otras etapas de purificación previas a la
etapa de detección del ADN como etapa de precipitación. Los métodos
de detección pueden incluir pero no se limitan al enlace o
intercalado de colorantes específicos como el bromuro de etidio que
se intercala en el ADN de doble filamento y cambia su fluorescencia
después de ello. El ADN purificado también se puede separar por
métodos electroforéticos de un modo opcional tras un proceso de
restricción y se puede visualizar. Existen también análisis a base
de muestras que explotan la hibridación de los oligonucleótidos
frente a secuencias específicas y la posterior detección del
híbrido. También es posible secuenciar el ADN después de varias
etapas conocidas por el experto. Otros métodos aplican una
diversidad de secuencias de ADN a un chip de silicona al cual se
asocian muestras específicas y dan una señal cuando se enlaza una
secuencia complementaria.
En una configuración preferida de la invención,
la mezcla de componentes no proteináceos y proteináceos comprende
ácidos nucleicos de forma que los ácidos nucleicos comprenden ADN o
ARN o ambos.
Una configuración preferida de la invención hace
referencia a un método para el análisis de un componente de ácido
nucleico de referencia de una mezcla de componentes no proteináceos,
que comprende ácidos nucleicos y material proteináceo derivado de
una muestra biológica que comprende las etapas de
- a)
- incubar la mezcla con una proteasa que tenga una secuencia de aminoácidos que al menos sea un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1
- b)
- amplificar opcionalmente el componente de ácido nucleico de referencia, y
- c)
- determinar o detectar el componente de ácido nucleico de referencia.
En una configuración preferida de la invención,
se determina la cantidad de componente de ácido nucleico de
referencia.
En una configuración preferida de la invención,
la secuencia de aminoácidos de la proteasa es la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO 1, un derivado proteolítico de la misma que
tiene la actividad de la proteasa o bien la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO 2. En otra configuración preferida de la
invención, la secuencia de aminoácidos de la proteasa conforme a la
invención es codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID
NO 3, una parte de la cual o una versión degenerada de la secuencia
de ácido nucleico SEQ ID NO 3. En otra configuración de la
invención la muestra biológica comprende virus o células
bacterianas, así como células aisladas de los organismos
multicelulares, como por ejemplo, células humanas y animales como
los leucocitos, y los compuestos químicos de alto y bajo peso
molecular inmunológicamente activos, como los haptenos, antígenos,
anticuerpos y ácidos nucleicos, el plasma sanguíneo, el fluido
cerebral, el esputo, las heces, las muestras de la biopsia, la
médula ósea, los enjuagues orales, el suero sanguíneo, los tejidos,
la orina o bien mezclas de los mismos. En una configuración
preferida de la invención, la muestra biológica es un fluido
procedente del cuerpo humano o animal, preferiblemente la muestra
biológica es sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo o bien
orina. El plasma sanguíneo es preferiblemente EDTA, heparina o bien
plasma sanguíneo de citrato. En una configuración de la invención,
la muestra biológica comprende células bacterianas, células
eucarióticas, virus o mezclas de los mismos.
En una configuración preferida de la invención,
la mezcla de ácidos nucleicos y material proteináceo comprende
ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) o ambos,
preferiblemente el ADN o el ARN procede de un virus (al menos uno)
o de un microorganismo. El virus puede ser el virus de la hepatitis
A (HAV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis
C (HCV), el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), el virus
del papiloma humano (HPV) o el parvovirus B19.
En una configuración preferida de la invención
se purifican un componente del ácido nucleico de referencia (al
menos uno) y los otros ácidos nucleicos son purificados
esencialmente tal como se ha descrito antes. Luego el componente
del ácido nucleico de referencia (al menos uno) es manipulado y
detectado, es decir, es amplificado con la reacción en cadena de la
polimerasa que amplifica específicamente las secuencias de
referencia hasta cantidades detectables. Otras posibles reacciones
de amplificación son la Reacción en cadena de la ligasa (LCR, Wu y
Wallace, 1989, Genomics 4:560-569 y Barany, 1991,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193); la reacción
en cadena de la polimerasa (Barany 1991, PCR Methods and Applic.
1:5-16); Gap-LCR(PCT Patent
Publication No. WO 90/01069); la reacción en cadena de reparación
(European Patent Publication No. 439,182 A2), 3SR(Kwoh y
cols., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:1173-1177; Guatelli y cols., 1990, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:1874-1878; PCT Patent Publication
No. WO 92/0880A), y NASBA (Pat. americana nr.5.130.238). Además,
existe la amplificación por desplazamiento del ramal (SDA), la
amplificación mediada por la transcripción (TMA) y la amplificación
Q\beta (para una revisión ver, por ejemplo, Whelen and Persing
(1996). Annu. Rev. Microbiol.50,349-373; Abramson
and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology
4:41-47).
Un método de detección especialmente preferido
es el método Taíman® revelado en WO92/02638 y las correspondientes
patentes americanas 5.210.015, US 5.804.375, US 5.487.972. Este
método explota la actividad de la exonucleasa de una polimerasa
para generar una señal. Más claramente, el componente de referencia
del ácido nucleico es detectado por un proceso que comprende poner
la muestra en contacto con un oligonucleótido que tiene una
secuencia complementaria a una región del componente de referencia
del ácido nucleico y con un oligonucleótido marcado que tiene una
secuencia complementaria a una segunda región del mismo ramal de
secuencia del componente de referencia del ácido nucleico, pero no
incluye la secuencia de ácido nucleico definida por el primer
oligonucleótido, para crear una mezcla de dobles durante las
condiciones de hibridación, donde los dobles comprenden el ácido
nucleico de referencia unido al primer oligonucleótido y al
oligonucleótido marcado de manera que el extremo 3' del primer
oligonucleótido es adyacente al extremo 5' del oligonucleótido
marcado. Luego esta mezcla se trata con una polimerasa del ácido
nucleico dependiente del patrón que tiene una actividad 5' a 3' de
la nucleasa en unas condiciones suficientes para permitir la
actividad de la nucleasa 5' a 3' de la polimerasa, y la escisión
del oligonucleótido marcado, templado y la liberación de los
fragmentos marcados. La señal generada por la hidrólisis del
oligonucleótido marcado se detecta y/o se mide. La tecnología
Taíman® elimina la necesidad de que se forme un complejo de
reacción ligado a la fase sólida y que se pueda detectar. En
términos más generales, se revela un procedimiento para la
purificación de un componente del ácido nucleico de referencia
seguido de una etapa de detección de forma que la reacción de
amplificación o de detección es una fase-solución
homogénea.
En otra configuración preferida de la invención,
los ácidos nucleicos que incluyen el componente del ácido nucleico
de referencia se unen a un material con una afinidad por el mismo,
previamente a ser amplificados o determinados o detectados de forma
opcional. Después de enlazarse, son lavados opcionalmente y
liberados opcionalmente del material con una afinidad por el mismo
tal como se ha descrito. Por lo tanto, una configuración preferida
de la invención se relaciona con un método para el análisis de un
componente del ácido nucleico de referencia de una mezcla de
componentes no proteináceos, que comprende los ácidos nucleicos y el
material proteináceo derivado de una muestra biológica que
comprende las etapas de
- a)
- incubación de la mezcla con una proteasa conforme a la invención
- b)
- enlace de un componente de referencia no proteináceo a un material con una afinidad por el mismo
- c)
- lavado opcional y liberación opcional del componente de referencia del ácido nucleico del material con una afinidad por el mismo,
- d)
- amplificación opcional del componente de referencia del ácido nucleico, y
- e)
- determinación o detección del componente de referencia del ácido nucleico.
En la configuración especialmente preferida, las
etapas c) y d) no son opcionales, es decir, que el componente del
ácido nucleico de referencia enlazado se lava y libera del material
con una afinidad por el mismo y el componente del ácido nucleico de
referencia se amplifica antes de ser determinado o detectado.
Preferiblemente, se determina la cantidad de ácido nucleico de
referencia.
El material con una afinidad por los ácidos
nucleicos y el componente del ácido nucleico de referencia consta
de un material con una superficie de sílice, preferiblemente el
material con una superficie de sílices es un vidrio, más
preferiblemente el material con una afinidad hacia los ácidos
nucleicos es una composición que consta de partículas de vidrio
magnético. Los pasos se llevan a cabo esencialmente tal como se ha
descrito antes. Resumiendo, se añadirán partículas de vidrio
magnético a la mezcla de lisis que comprende los ácidos nucleicos
incluyendo el componente de referencia del ácido nucleico.
Tras un periodo de tiempo adecuado para realizar
la adsorción - que se puede optimizar por agitación mecánica - las
partículas se separan del fluido circundante que contiene
componentes adicionales que no se pueden detectar. Esto se realiza
preferiblemente aplicando un campo magnético colocando un imán
contra la pared del recipiente y retirando el líquido restante del
tubo. Para eliminar otros contaminantes que puedan estar presentes,
se lleva a cabo una etapa de lavado con un fluido que no hace que
los ácidos nucleicos y el componente del ácido nucleico de
referencia (al menos uno) se separen de la superficie del cristal.
Se añade un tampón de elución con unas condiciones de reactivo bajo
las cuales los ácidos nucleicos y el componente del ácido nucleico
de referencia no se unen a la superficie de cristal y son eluidos.
Con ello se eliminan los ácidos nucleicos incluyendo el componente
del ácido nucleico de referencia de la superficie de vidrio. Estas
condiciones son unas condiciones salinas especialmente mínimas.
Dependiendo del uso previsto para los ácidos nucleicos y para el
componente del ácido nucleico de referencia, ahora se podrá separar
el fluido de las partículas y además se procesará. Esta etapa de
separación se lleva a cabo preferiblemente aplicando un campo
magnético de manera que las partículas se vayan separando del
eluido. Las partículas de cristal magnéticas preferidas para este
método se describen en WOO 1/37291.
Preferiblemente se utilizará el método conforme
a la invención, utilizado para el análisis diagnóstico o la
bioanalítica.
En una configuración preferida de la invención
la proteasa conforme a la invención se utiliza en la investigación,
la bioanalítica o el diagnóstico. En otras configuraciones
preferidas, la proteasa conforme a la invención se utiliza para el
análisis de un componente no proteináceo de referencia de una mezcla
de componentes no proteináceos y proteináceos procedente de una
muestra biológica, para el enriquecimiento de un componente no
proteináceo de referencia de una mezcla de componentes no
proteináceos y proteináceos procedentes de una muestra biológica o
bien para la purificación o el aislamiento de un componente no
proteináceo de referencia de una mezcla de componentes no
proteináceos y proteináceos procedente de una muestra biológica.
Preferiblemente el componente de referencia no proteináceo es un
ácido nucleico, a ser posible de un virus o de un microorganismo, o
bien la mezcla de componentes proteináceos y no proteináceos consta
de ácidos nucleicos. Los virus preferidos son el virus de la
hepatitis B, el virus de la hepatitis C o el virus de la
inmunodeficiencia humana o bien los otros virus ya descritos.
Además la invención contempla un equipo de
elementos adecuados para su uso en diagnóstica y para la
purificación de ácidos nucleicos, caracterizada por que contiene
una proteasa que tiene una secuencia de aminoácidos, que es al
menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1. En
una configuración preferida de la invención la secuencia de
aminoácidos de la proteasa es la secuencia del aminoácido SEQ ID NO
1, un derivado proteolítico de la misma que tenga la actividad de
la proteasa o la secuencia del aminoácido SEQ ID NO 2,
preferiblemente la secuencia del aminoácido de la proteasa conforme
a la invención se codifica por la secuencia del ácido nucleico SEQ
ID NO 3, una parte de la cual viene cifrada por una proteasa activa
o una versión degenerada de la secuencia del ácido nucleico SEQ ID
NO 3. Dichos equipos ya conocidos, comprenden además material
plástico que puede ser utilizado durante el procedimiento de
preparación de las muestras como, por ejemplo, placas de
microvaloración en el formato de 96 o 384 pocillos o meros tubos de
reacción normales fabricados por Eppendorf, Hamburg, Alemania y
todos los demás reactivos para realizar el método conforme a la
invención. Por lo tanto, el equipo puede contener adicionalmente un
material con una afinidad hacia los ácidos nucleicos y el
componente del ácido nucleico de referencia, en particular con una
superficie de sílice. Preferiblemente el material con una
superficie de sílice es un cristal. Más preferiblemente, el material
con una afinidad hacia los ácidos nucleicos es una composición que
comprende partículas magnéticas de cristal. El equipo puede
contener además un tampón de lisis que tenga, por ejemplo, agentes
caotrópicos, detergentes o alcoholes o bien mezclas de los mismos,
lo que permita la lisis de las células. Estos componentes del equipo
conforme a la invención se pueden suministrar por separado en tubos
o recipientes de almacenamiento. Dependiendo de la naturaleza de
los componentes, estos se encontrarán en un único tubo o recipiente.
El equipo puede comprender además una solución de lavado adecuada
para la etapa de lavado de las partículas de cristal magnéticas
cuando el ADN o el ARN estén fijado a la misma. Esta solución de
lavado puede contener etanol y/o agentes caotrópicos en una
solución tamponada con un pH ácido sin etanol y/o agentes
caotrópicos tal como se ha descrito antes. A menudo la solución o
soluciones de lavado son soluciones a granel que se tienen que
diluir previamente a su uso. El equipo puede contener además un
eluyente o un tampón de elución, es decir, una solución o un tampón
(por ejemplo, Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) o bien agua pura para
eluir el ADN o el ARN fijados a las partículas magnéticas de
cristal. Además, también se pueden presentar reactivos adicionales o
soluciones tamponadas que se podrán utilizar para el proceso de
purificación de un ácido nucleico, es decir ADN o ARN.
Una configuración preferida de la presente
invención consiste en utilizar el método o el equipo de la presente
invención en métodos automatizables como, por ejemplo, los descritos
en WO 99/16781. El método automatizable equivale a un método en que
sus etapas son adecuadas para ser realizadas con un aparato capaz de
funcionar con poco control externo o con ningún control externo.
Solamente las etapas de preparación para el método se pueden
realizar a mano, por ejemplo, los recipientes de almacenamiento se
tienen que llenar y colocar en su sitio, la elección de las
muestras tiene que ser hecha por un ser humano y otros pasos
conocidos por el experto como el funcionamiento del ordenador de
control. El aparato o la máquina pueden, por ejemplo, añadir
líquidos automáticamente, mezclar las muestras o realizar las etapas
de incubación a temperaturas específicas. Típicamente, dicha
máquina o aparato es un robot controlado por un ordenador que
realiza un programa en el cual se especifican cada una de las
etapas y órdenes. Los métodos automatizados preferidos son los que
se llevan a cabo en un formato de alta producción lo que significa
que los métodos y el aparato o máquina utilizada son optimizados
para una elevada producción de muestras en poco tiempo. En otra
configuración de la invención, los métodos o los equipos conforme a
la presente invención se utilizan en un proceso
semi-automatizado, lo que significa que algunas
etapas de reacción pueden realizarse manualmente. En una
configuración preferida de la invención, se coge una suspensión que
contiene MGPs conforme a la presente invención, de un recipiente de
almacenamiento y se añaden volúmenes parciales a diferentes
recipientes de reacción. Los recipientes de reacción pueden ser
tubos de ensayo de plástico en un formato de microplacas que
contienen 96 o 384 o más pocillos donde se lleva a cabo la
reacción. Sin embargo, estos recipientes pueden ser de otro
material, por ejemplo, de acero.
En las configuraciones preferidas de la
invención, el equipo conforme a la invención se utiliza para la
purificación de los ácidos nucleicos en investigación, bioanalítica
o diagnóstico. El equipo conforme a la invención o al método
conforme a la invención se puede usar en un formato de alto
rendimiento, es decir, en un método automatizado que permita el
análisis de un número elevado de muestras diferentes en un tiempo
muy breve.
El experto en la materia sabe como identificar
otras proteasas que actúan de manera equivalente a la proteasa
conforme a la invención, es decir a la esperasa. Con ello es posible
identificar proteínas variantes o mutantes de la esperasa que
actúen de un modo equivalente a la esperasa. "Secuencia de
aminoácidos mutante", "proteína mutante" o "polipéptido
mutante" se refieren a un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos que difiere de una secuencia nativa o ha sido
codificada por una secuencia de nucleótidos que se ha modificado de
forma intencionada. "Proteína mutante", "proteína
variante" o "muteina" equivale a una proteína que consta de
una secuencia mutante de aminoácidos e incluye polipéptidos que
difieren de la secuencia de aminoácidos de la esperasa nativa
debido a las anulaciones, sustituciones de aminoácidos. "Secuencia
nativa" se refiere a una secuencia de aminoácidos o de ácido
nucleico que es idéntica a una forma nativa o salvaje de un gen o
proteína.
Para hallar estas proteínas variantes o
mutantes, preparará soluciones idénticas a los reactivos y tampones
descritos en el ejemplo 1 donde la esperasa se utiliza como un
estándar para la determinación de la actividad de la proteasa.
Básicamente, el experto en la materia analizará la proteasa de
interés tal como se ha descrito en el Chromatographic Análisis of
Plasma Protein Digestión Protocol (ver ejemplo 3). La Proteasa en
cuestión se analizará luego por sus propiedades en la preparación
de muestras con la posterior amplificación y detección del producto
amplificado (ver ejemplo 2). En la comparación con la esperasa
enzimática revelada tiene gran interés la investigación de la
estabilidad en el almacenamiento (ver ejemplo 6) o bien la
evaluación de la actividad enzimática en presencia de los agentes
caotrópicos (ver ejemplo 5). Teniendo en cuenta los resultados de
estas investigaciones, el experto puede decidir si una proteasa de
interés actúa de un modo equivalente a la proteasa esperasa
descubierta por la presente invención.
Otra configuración de la invención es una
composición acuosa de una proteasa conforme a la invención, es decir
una proteasa que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de
aminoácidos AEQ ID NO:1, en la que la composición consta de Tris
acetato 10 mM, cloruro de calcio 5 mM, acetato de calcio 5 mM,
EDTA 1 mM, 50% (V/V=volumen/volumen) de glicerina con un pH de
5,5. Esta composición es un tampón de almacenamiento ideal para la
esperasa (ver ejemplo 6). El experto en la materia es capaz de
modificar la composición del tampón siguiendo las enseñanzas del
ejemplo 5 mientras la proteasa conforme a la invención sea
igualmente estable en la composición modificada del tampón. En otra
configuración, la secuencia de aminoácidos de la proteasa en la
composición anteriormente descrita es la secuencia de aminoácidos
SEQ ID NO 1, un derivado proteolítico de la misma que tiene
actividad de proteasa o de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2.
En otra configuración, la secuencia de aminoácidos de la proteasa
conforme a la invención en la composición anteriormente descrita
viene codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO 3,
una parte de la cual o una versión degenerada de la secuencia del
ácido nucleico SEQ ID NO 3. La composición conforme a la invención
se puede utilizar en la preparación de muestras o en los métodos
para la preparación de muestras, en particular en los métodos
conforme a la invención, para la purificación de ácidos nucleicos o
en la diagnóstica o en el análisis diagnóstico. Los ejemplos
siguientes, referencias, listado de secuencias y figuras se aportan
con el objetivo de comprender la presente invención, lo que
definitivamente se pretende en las reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las siguientes proteasas se han analizado en el
proceso de preparación de muestras:
- Alcalase
- (Novo Nordisk)
- Proteinase K (60 mg/ml)
- Roche Diagnostics, nr.cat. 1 964 372
- Subtilisin A (19 mg/ml)
- (Novo Nordisk)
- Esperase (24 mg/ml)
- (Novo Nordisk)
- Chirazym (31 mg/ml)
- (Novo Nordisk)
- Novozyme 539
- (Novo Nordisk)
- Novo 47002
- (Novo Nordisk)
- Novocor PL
- (Novo Nordisk)
- Pronase
- (Roche Diagnostics,nr.cat.165 921).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha preparado un tampón de lisis y de fijación
a partir de:
Tiocianato de guanidio 5M
Polidocanol al 15%
Ditiotreitol al 1% (DTT)
Bis-TRIS 15 mM, pH 6,0.
\newpage
El tampón de lavado tenía la siguiente
composición:
Etanol del 50%
NaCl 50 mM
Bis-TRIS 10 Mm, Ph 6,0.
\vskip1.000000\baselineskip
El tampón de elución ha sido agua destilada
libre de ribonucleasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han suspendido partículas magnéticas de
cristal en WO01/37291 en isopropanol en una concentración de 6
mg/ml. Dichas partículas de cristal magnéticas también se pueden
coger del equipo MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche Mannheim,
Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón: Tris 50 mM/HCl pH 8,2
Solución de sustratos: Cloruro de calcio 10
mM
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida
200 mM en dimetilsulfóxido (DMSO).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
80 \mul de la solución de proteasa se mezclan
con 420 \mul de material de prueba (por ejemplo, plasma con una
concentración vírica específica). Se añaden 500 \mul de tampón de
lisis y de fijación y la solución se agita durante 10 minutos a
temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden 500 \mul de la suspensión de
partículas de vidrio magnéticas en isopropanol y la solución se
agita durante 20 minutos a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la etapa de fijación, las partículas
de cristal magnéticas se separan de la solución mediante un imán y
se lavan cinco veces con 750 \mul de tampón de lavado por ciclo de
lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras el último ciclo de lavado se separan las
partículas de cristal magnéticas mediante un imán de la suspensión
y el tampón de lavado es succionado por las partículas de cristal
magnéticas y se añaden 100 \mul de tampón de elución. La
suspensión se agita e incuba durante 15 minutos a 80ºC. Tras la
etapa de elución, las partículas de cristal magnéticas se separan
de nuevo mediante un imán y se cultiva el sobrenadante que contiene
el ácido nucleico vírico.
\newpage
A excepción de los cebadores todos los reactivos
procedían de Roche Molecular Biochemicals.
Mezcla original HCV:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mezcla original HIV:
20 \mul de eluido del proceso de preparación
de la muestra que contiene el ácido nucleico de referencia, por
ejemplo, ARN vírico (HCV, HIV) o bien el ADN vírico (HBV) se mezclan
con 100 \mul de mezcla original. La amplificación se realiza en
un termociclador 9600 Perkin Elmer con los programas siguientes del
termociclador:
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección del material amplificado, se
utilizaba un método no isotópico muy sensible basado en la
electroluminiscencia (ECL). Los oligonucleótidos marcados con
rutenio-tris (bipiridilo) (muestras de captura) se
hibridizaban de forma específica para dar amplicones
desnaturalizados biotinilados. Posteriormente, se fijaba este
híbrido a la superficie de las perlas magnéticas revestidas de
estreptavidina. Una vez capturadas las perlas en un electrodo
usando un imán permanente, la reacción de ECL del marcador de
rutenio era impulsada por la aplicación de un voltaje. Para más
detalles sobre el proceso de detección del ECL, ver Holyle y
cols(13). La detección ECL totalmente automatizada se
realizaba en una plataforma instrumental (preprototipo de Elecsys
1010; Boehringer Mannhemim GmbH).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Solamente el uso de esperasa y Chirazym para la
degradación de las proteínas de plasma en el proceso de preparación
de muestras da lugar a una señal ECL comparable a la señal generada
por el uso de la proteinasa K en el proceso de preparación de
muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La digestión y la lisis de las proteínas se
realizaban tal como se ha descrito. Cada 100 \mul de solución
lisada se inyectaban en un instrumento de cromatografía líquida de
alta presión (HPLC) (Dionex, Gynkothek) y se separaban en una
columna de fase invertida (C4, Vydac, 4,6 mm x 150 mm) en un
gradiente lineal de 0-80% de acetonitrilo en ácido
trifluoracético al 0,1% (TFA). Los picos se detectaban a una
longitud de onda de 220 nm y 280 nm.
En la figura 1, se muestra la comparación de la
digestión del plasma de EDTA frente al plasma de citrato con
esperasa (ver figura 1a) y proteinasa K (ver figura 1b).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El pH óptimo de la esperasa se comparaba con el
pH óptimo de la proteinasa K usando los tampones tal como se ha
descrito básicamente en 1.1.4 con un pH variado. El pH óptimo se
encontraba más en la región del pH neutro en comparación con la
proteinasa K (ver figura 2).
Ejemplo: 10 mg de proteína se disuelven en 1 ml
de agua destilada. Antes de la determinación, la muestra se diluye
con agua destilada de manera que el incremento en la extinción en el
ensayo se sitúa entre 0,02 y 0,05 E.
Tampón de muestra:
- -
- Margen del pH: 5,5 hasta 7,5: Tampón bis-tris 50 mM + CaCl_{2} 10 mM se ajustan con HCl 2N o NaOH 2N al pH respectivo.
- -
- Margen del pH:7,5 hasta 9,5: Tris-base 50 mM + CaCl_{2} 10 mM se ajustan con HCl 2N o NaOH 2N al pH respectivo
Sustrato:
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida
(200 mM disueltos en sulfóxido de dimetilo (DMSO))
Medición:
- -
- Esquema de pipeteado: 2,00 ml de tampón de muestra
- 0,02 ml de sustrato
- 0,05 ml de muestra
- -
- Temperatura de medición: 25ºC
- -
- Longitud de onda para la medición: 405 nm
- -
- Evaluación: El incremento lineal en la extinción (de/min) se determina entre 2 y 6 min.
- Espesor de capa: 1 cm
Actividad =
\frac{2 . 07 * dE/min}{10 . 4(\varepsilon) * 0 . 05 * 1} * dilución
\
(U/ml)
Actividad de liberación: Por cada muestra, la
actividad máxima medida se considera como el valor del 100% y las
actividades a otros valores de pH se evalúan determinando la
relación porcentual respecto a este valor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La actividad enzimática de la esperasa se
comparaba con la actividad enzimática de la proteinasa K en
presencia de los agentes caotrópicos usando los tampones como los
básicamente descritos en 1.1.4 con cantidades crecientes de agente
caotrópico. La esperasa retenía más actividad en presencia de los
agentes caotrópicos (ver figura 3 y figura 4). Esta actividad
residual mínima es beneficiosa ya que la digestión proteínica por la
esperasa es muy rápida en presencia del agente caotrópico (\leq1
min) y como la esperasa tiene una actividad residual baja. Esto es
una ventaja ya que menos esperasa activa se transfiere en la
reacción de amplificación donde pueda alterarse la reacción de
amplificación.
- -
- Solución de proteasa: 20 mg/ml de proteasa
- -
- Muestra: 500 \mul de agente caotrópico
- 50 \mul de solución de proteasa
- -
- La actividad de la proteasa es determinada en varias soluciones. Luego, la muestra se incuba durante 15 minutos a 25ºC y se determina la actividad residual en diversos agentes.
Determinación de la actividad:
- -
- Tampón de prueba: Tris.HCl 50 mM pH=8,2; CaCl_{2} 10 mM
- -
- Substrato: Suc-Ala-Ala-Prp-Phe-p-nitroanilida 200 mM en DMSO
- -
- Temperatura de medición: 25ºC
- -
- Longitud de onda de medición: 405 nm
Evaluación: ver la evaluación del pH óptimo
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La estabilidad de las proteasas se determinaba
siguiendo la actividad proteolítica en una situación de estrés
térmico en el tampón de almacenamiento (composición: Tris acetato 10
mM, cloruro de calcio 5 mM, acetato de calcio 5 mM, EDTA 1 mM, 50%
de glicerina (V/V) con un valor de pH de 5,5). Se utilizaba un
análisis cinético con
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida
como sustrato. Justo antes de su uso, la muestra de proteasa tiene
que ser diluida a una concentración de 1-3 \mug/ml
con agua destilada. 2 ml de tampón se mezclaban con 0,02 ml de
sustrato y 0,05 ml de muestra diluida. La liberación de la
p-nitroanilina del sustrato a 25ºC se medía
fotométricamente a 405 nm. La curva de tiempo de la estabilidad de
la esperasa en comparación con la proteinasa K se muestra en la
figura 5. El resultado de este experimento es que se podía demostrar
que la esperasa es muy estable en un tampón de almacenamiento
incluso después de un periodo de tiempo prolongado.
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<110> Roche Diagnostics GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos para el análisis de
componentes no proteináceos usando una proteasa de una cepa de
bacilo
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Esperase
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<310> WO89/06279
\vskip0.400000\baselineskip
<311>
1989-01-06
\vskip0.400000\baselineskip
<312>
1990-11-14
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 268
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1086
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaaagcg tctagccatg gcgt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derivatización de la biotina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgcaagca ccctatcagg cagt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derivatización de
rutenuio3+-(tris-bipiridilo)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcgtgcagc ctccaggacc c
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
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<223> Derivatización de la biotina
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipagttggagga catcaagcag ccatgcaaat
\hfill30
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<210> 8
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (1)
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<223> Derivatización de la biotina
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskiptgctatgtca gttccccttg gttctct
\hfill27
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<210> 9
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (1)
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<223> Derivatización de
rutenio3+-(tris-bipiridilo)
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<400> 9
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\hfill20
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<210> 10
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Virus de la hepatitis B
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<400> 10
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\hfill18
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rutenio3+-(tris-bipiridilo)
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\hfill18
Claims (40)
1. Un método para el análisis de un componente
no proteináceo de referencia de una mezcla de componentes no
proteináceos y proteináceos derivados de una muestra biológica que
comprende la etapa de incubar la mezcla con una proteasa que tiene
una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1, un derivado proteolítico de
la misma que tiene actividad de proteasa o la secuencia aminoácido
SEQ ID NO 2.
2. Un método conforme a la reivindicación 1, que
se caracteriza porque la secuencia de aminoácidos de la
proteasa es idéntica a la secuencia aminoácido SE ID NO 1, a un
derivado proteolítico de la misma que tiene actividad de proteasa o
la secuencia aminoácido SEQ ID NO 2.
3. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, que se caracteriza porque la
secuencia de aminoácidos de la proteasa conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2 es codificada por la secuencia del ácido
nucleico SEQ ID NO 3, una parte de la misma o una versión degenerada
de la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO 3.
4. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza porque la muestra
biológica es un fluido del cuerpo humano o animal.
5. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza porque la muestra
biológica es sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo o bien
orina.
6. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza porque la muestra
biológica comprende células bacterianas, células eucarióticas, virus
o mezclas de los mismos.
7. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que se caracteriza porque después de
la etapa de incubación el componente de referencia no proteináceo se
fija a un material con una afinidad por el mismo, se lava
opcionalmente y se libera opcionalmente del material con una
afinidad por el mismo.
8. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que se caracteriza porque la mezcla
de componentes proteináceos y no proteináceos consta de ácidos
nucleicos.
9. Un método conforme a la reivindicación 8, que
se caracteriza porque los ácidos nucleicos comprenden ADN o
ARN o ambos.
10. Un método para el análisis de un componente
de ácido nucleico de referencia de una mezcla de componentes no
proteináceos, que comprende ácidos nucleicos y componentes
proteináceos, de manera que la mezcla procede de una muestra
biológica que incluye las etapas de
- a)
- incubación de la mezcla con una proteasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1, un derivado proteolítico de la misma que tiene actividad de la proteasa o la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2,
- b)
- amplificación opcional del componente del ácido nucleico de referencia, y
- c)
- determinación o detección del componente del ácido nucleico de referencia.
11. Un método conforme a la reivindicación 10,
que se caracteriza porque la secuencia aminoácido de la
proteasa es idéntica a la secuencia de aminoácido SEQ ID NO 1, un
derivado proteolítico de la misma que tiene actividad de proteasa o
la secuencia de aminoácido SEQ ID NO 2.
12. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 11, que se caracteriza porque la
secuencia aminoácido de la proteasa es codificada por la secuencia
de ácido nucleico SEQ ID NO 3, una parte de la misma o una versión
degenerada de la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO 3.
13. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, que se caracteriza porque la
muestra biológica es un fluido del cuerpo humano o animal.
14. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, que se caracteriza porque la
muestra biológica es sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo o
orina.
15. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14, que se caracteriza porque los
ácidos nucleicos comprenden ADN o ARN o ambos.
16. Un método conforme a la reivindicación 15,
que se caracteriza porque el ADN o el ARN o ambos proceden
de un virus o de un microorganismo.
17. Un método conforme a la reivindicación 16,
que se caracteriza porque el virus es el virus de la
hepatitis B, el virus de la hepatitis C o el virus de
inmunodeficiencia humana.
18. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 17, que se caracteriza porque el
componente del ácido nucleico se amplifica con la reacción en
cadena de la polimerasa.
19. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 18, que se caracteriza porque tras la
etapa a) los ácidos nucleicos y el componente del ácido nucleico de
referencia se fijan a un material con una afinidad por los ácidos
nucleicos, se lavan opcionalmente y se liberan opcionalmente del
material con una afinidad por los ácidos nucleicos.
20. Un método conforme a la reivindicación 19,
que se caracteriza porque el material con afinidad por los
ácidos nucleicos y el componente de referencia del ácido nucleico
comprende un material con una superficie de sílice.
21. Un método conforme a la reivindicación 20,
que se caracteriza porque el material con una superficie de
sílice es un cristal.
22. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que se caracteriza porque el material
con una afinidad por los ácidos nucleicos y el componente de
referencia del ácido nucleico es una composición que comprende
partículas magnéticas de vidrio.
23. Uso del método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22 para el análisis diagnóstico.
24. Uso de una proteasa tal como se especifica
en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en diagnóstica.
25. Uso de una proteasa tal como se especifica
en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para el análisis de
un componente de referencia no proteináceo de una mezcla de
componentes proteináceos y no proteináceos derivada de una muestra
biológica.
26. Uso de una proteasa tal como se especifica
en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para el
enriquecimiento de un componente no proteináceo de referencia de una
mezcla de componentes proteináceos y no proteináceos derivada de
una muestra biológica.
27. Uso de una proteasa tal como se especifica
en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para la purificación o
el aislamiento del componente de referencia no proteináceo de una
mezcla de componentes proteináceos y no proteináceos derivada de
una muestra biológica.
28. Uso conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 27, que se caracteriza porque el
componente no proteináceo de referencia es un ácido nucleico.
29. Uso conforme a la reivindicación 28, que se
caracteriza porque el ácido nucleico es de un virus o
microorganismo.
30. Un equipo de piezas que se
caracteriza porque contiene una proteasa que tiene una
secuencia de aminoácido, que es al menos un 80% idéntica a la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1, un derivado proteolítico de
la misma que tiene la actividad de la proteasa o la secuencia de
aminoácido SEQ ID NO 2 y un material con una afinidad por los ácidos
nucleicos que comprende un material con una superficie de
sílice.
31. Un equipo conforme a la reivindicación 30,
que se caracteriza porque la secuencia de aminoácido de la
proteasa es idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1, un
derivado proteolítico de la misma que tiene la actividad de la
proteasa o la secuencia de aminoácido SEQ ID NO 2.
32. Un equipo conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 30 a 31, que se caracteriza porque la
secuencia de aminoácido de la proteasa conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 30 a 31 viene codificada por la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO 3, una parte de la misma o una versión
degenerada de la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO 3.
33. Un equipo conforme a la reivindicación 32,
que se caracteriza porque el material con una superficie de
sílice es un cristal.
34. Un equipo conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 30 a 33, que se caracteriza porque el
material con una afinidad por los ácidos nucleicos es una
composición que comprende partículas de cristal magnéticas.
35. Un equipo conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 30 a 34, que se caracteriza porque el
equipo comprende además un tampón de lisis, un tampón de lavado y un
tampón de elución.
36. Una composición acuosa de una proteasa que
es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO
1, un derivado proteolítico de la misma que tiene la actividad de
la proteasa o la secuencia de aminoácido SEQ ID NO 2, que se
caracteriza porque la composición comprende Tris acetato 10
mM, cloruro de calcio 5 mM, acetato de calcio 5 mM, EDTA 1 mM,
glicerina al 50%(V/V) con un valor de pH de 5,5.
37. Una composición conforme a la reivindicación
36, que se caracteriza porque la secuencia de aminoácido de
la proteasa es idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1,
un derivado proteolítico de la misma que tiene la actividad de la
proteasa o la secuencia de aminoácido SEQ ID NO 2.
38. Una composición conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 36 a 37, que se caracteriza porque la
secuencia de aminoácido de la proteasa conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 36 a 37 viene codificada por la secuencia del
ácido nucleico SEQ ID NO 3, una parte de la misma o una versión
degenerada de la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO 3.
39. Uso de un equipo conforme a cualquiera de
las reivindicaciones 30 a 35 o a una composición conforme a las
reivindicaciones 36 a 38 para la purificación de ácidos
nucleicos.
40. Uso de un equipo conforme a cualquiera de
las reivindicaciones 30 a 35 o a una composición conforme a las
reivindicaciones 36 a 38 en diagnóstica.
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