JP3026567B2 - 分子のクローニング及びタンパク分解酵素をコードする遺伝子の発現 - Google Patents
分子のクローニング及びタンパク分解酵素をコードする遺伝子の発現Info
- Publication number
- JP3026567B2 JP3026567B2 JP63502472A JP50247288A JP3026567B2 JP 3026567 B2 JP3026567 B2 JP 3026567B2 JP 63502472 A JP63502472 A JP 63502472A JP 50247288 A JP50247288 A JP 50247288A JP 3026567 B2 JP3026567 B2 JP 3026567B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacillus
- host cell
- dna
- cell
- serine protease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は組換え体技法を用いるバチルス属の菌株中で
のセリンプロテアーゼの増大された量における製造に関
する。
のセリンプロテアーゼの増大された量における製造に関
する。
背景技術 産業上重要な酵素類例えばα−アミラーゼ、中性用プ
ロテアーゼ及びアルカリ性用プロテアーゼ又はセリン
プロテアーゼの製造のために細菌類は広汎に使用されて
いる。一般に細菌源セリンプロテアーゼ類は多くの原核
性微生物、例えばグラム陰性微生物、例えばセラチア属
（Serratia）又はプソイドモナス（Pseudmonas）の種及
びグラム陽性細菌例えばミクロコッカス属（Micrococcu
s）及びバチルス属（Bacillus）の種から得られる。特
に興味ある産業上重要なセリン プロテアーゼはアルカ
リ性の培地（又は媒体）中で高活性を有するプロテアー
ゼである。工業的セリン プロテアーゼは各種のバチル
ス属、例えばB.スブチリス（B.subtilis）、B.リヘニホ
ルミス（B.licheniformis）、B.アミロリクイファシエ
ンス（B.amyloliquefaciens）、B.アルカロフィルス
（B.alcalophilus）及びその他のバチルス属の種によっ
て産生されるけれども、高アルカリ活性プロテアーゼは
アルカリ性pHの下で生育し得るバチルス属の種によって
産生されることが一般である。かようなバチルスの一例
はバチルス属新種PB92（Bacillus novo species PB92）
〔訳注：下文においてはバチルスnovo sp.PB92又はバチ
ルスPB92と略記される〕。
ロテアーゼ及びアルカリ性用プロテアーゼ又はセリン
プロテアーゼの製造のために細菌類は広汎に使用されて
いる。一般に細菌源セリンプロテアーゼ類は多くの原核
性微生物、例えばグラム陰性微生物、例えばセラチア属
（Serratia）又はプソイドモナス（Pseudmonas）の種及
びグラム陽性細菌例えばミクロコッカス属（Micrococcu
s）及びバチルス属（Bacillus）の種から得られる。特
に興味ある産業上重要なセリン プロテアーゼはアルカ
リ性の培地（又は媒体）中で高活性を有するプロテアー
ゼである。工業的セリン プロテアーゼは各種のバチル
ス属、例えばB.スブチリス（B.subtilis）、B.リヘニホ
ルミス（B.licheniformis）、B.アミロリクイファシエ
ンス（B.amyloliquefaciens）、B.アルカロフィルス
（B.alcalophilus）及びその他のバチルス属の種によっ
て産生されるけれども、高アルカリ活性プロテアーゼは
アルカリ性pHの下で生育し得るバチルス属の種によって
産生されることが一般である。かようなバチルスの一例
はバチルス属新種PB92（Bacillus novo species PB92）
〔訳注：下文においてはバチルスnovo sp.PB92又はバチ
ルスPB92と略記される〕。
バチルス属の細胞外酵素類製造のための数種の遺伝子
が成功裡にクローニングされており、その例はB.アミロ
リクイファシエンス〔Palva et al.,Gene 15（1981）4
3−51〕、B.リヘニホルミス〔Ortlepp,Gene 23（1983）
267〕、B.ステアロテルモフィルス（B.stearothermophi
lus）〔Mielenz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80（1
983）5975−5979;EPA−0057976〕及びB.スブチリス〔Ya
ng et al.,Nucleic Acids Res.11（1983）237〕の夫々
からのα−アミラーゼ遺伝子;B.スブチリス〔Gay et a
l.,J.Bacteriol・153（1983）1424〕からのレバンシュ
クラーゼ遺伝子;B.ステアロテルモフィルス〔Fuji et a
l.,J.Bacteriol.156（1983）831〕、B.アミロリクイフ
ァシエンス〔Honjo et al.,J.Biotech・１（1984）16
5〕及びB.スブチリス〔Yang et al.,J.Bacteriol・160
（1984）115〕からの中性用プロテアーゼをコードする
遺伝子;B.スブチリス〔Wong et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 81（1984）1184〕、B.リヘニホルミス〔Jacobs e
t al.,Nucleic Acids Res.13（1985）8913〕及びB.アミ
ロリクイファシエンス〔Wells et al.,Nucleic Acids R
es.11（1983）7911〕からのセリン プロテアーゼ又は
アルカリ性用プロテアーゼをコードする遺伝子である。
が成功裡にクローニングされており、その例はB.アミロ
リクイファシエンス〔Palva et al.,Gene 15（1981）4
3−51〕、B.リヘニホルミス〔Ortlepp,Gene 23（1983）
267〕、B.ステアロテルモフィルス（B.stearothermophi
lus）〔Mielenz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80（1
983）5975−5979;EPA−0057976〕及びB.スブチリス〔Ya
ng et al.,Nucleic Acids Res.11（1983）237〕の夫々
からのα−アミラーゼ遺伝子;B.スブチリス〔Gay et a
l.,J.Bacteriol・153（1983）1424〕からのレバンシュ
クラーゼ遺伝子;B.ステアロテルモフィルス〔Fuji et a
l.,J.Bacteriol.156（1983）831〕、B.アミロリクイフ
ァシエンス〔Honjo et al.,J.Biotech・１（1984）16
5〕及びB.スブチリス〔Yang et al.,J.Bacteriol・160
（1984）115〕からの中性用プロテアーゼをコードする
遺伝子;B.スブチリス〔Wong et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 81（1984）1184〕、B.リヘニホルミス〔Jacobs e
t al.,Nucleic Acids Res.13（1985）8913〕及びB.アミ
ロリクイファシエンス〔Wells et al.,Nucleic Acids R
es.11（1983）7911〕からのセリン プロテアーゼ又は
アルカリ性用プロテアーゼをコードする遺伝子である。
各種のバチルス属の種による工業的セリン プロテア
ーゼの製造は例えば米国特許第3674643;3723250;及び44
80043号各明細書に記載がある。アルカリ性pHの下で生
育し得るバチルス属の種による高アルカリ活性タンパク
分解酵素の製造は例えば米国特許第3723250;Re.30602及
び4480037号各明細書に記載がある。産業上重要な酵素
類の製造用の細菌使用に関する総覧については例えばダ
バボフの著書〔Dababov,“The Industrial Use of Baci
lli",in:The Molecular Biology of Bacilli（Acad.Pre
ss,New York,1982）〕を参照されたい。
ーゼの製造は例えば米国特許第3674643;3723250;及び44
80043号各明細書に記載がある。アルカリ性pHの下で生
育し得るバチルス属の種による高アルカリ活性タンパク
分解酵素の製造は例えば米国特許第3723250;Re.30602及
び4480037号各明細書に記載がある。産業上重要な酵素
類の製造用の細菌使用に関する総覧については例えばダ
バボフの著書〔Dababov,“The Industrial Use of Baci
lli",in:The Molecular Biology of Bacilli（Acad.Pre
ss,New York,1982）〕を参照されたい。
B.スブチリスのプロトプラスト（原形質体）の形質転
換に関する実験はチャン等〔Chang and Cohen（Mol.Ge
n.Genet.168（1979）111−115〕によって記載された。
同様の実験はB.メガテリウム（B.megaterium）のプロト
プラスト〔Vorobjeva et al.,FEMS Microbiol.Letters
7（1980）261−263〕、B.アミロリクイファシエンスの
プロトプラスト〔Smith et al.,Appl.and Env.Microbio
l.51（1986）634〕、B.スリンギェンシス（B.thuringie
nsis）のプロトプラスト〔Fisher et al.,Arch.Microbi
ol.139（1981）213−217〕、B.スフェリクス（B.sphaer
icus）のプロトプラスト（Mc Donald,J.Gen.Microbiol.
130（1984）203〕及びB.ラルベ（B.larvae）のプロトプ
ラスト〔Bakhiet et al.,Appl.and Env.Microbiol.49
（1985）577〕の成功された形質転換について記載され
ている。また、バキエ等〔Bakhiet et al.,上掲書〕は
B.ポピレ（B.popillae）を用いる成功的結果について報
告した。マン等〔Mann et al.,Current Microbiol.13
（1986）131−135〕はB.ポリミキサ（B.polymyxa）、B.
リヘニホルミス、B.マセランス（B.macerans）及びB.ラ
テロスポルス（B.laterosporus）を用いる成功的形質転
換について報告した。けれども良好なプロトプラスト形
成が観察されたにもかかわらずB.コアギュランス（B.co
agulans）、B.セレウス（B.cereus）及びB.プミルス
（B.pumilus）を用いた場合に実験は成功しなかった。
プロトプラストへのDNA導入の他の方法としては例えばD
NA含有リポソームとの融合〔Holubova,Folia Microbio
l.30（1985）97〕がある。
換に関する実験はチャン等〔Chang and Cohen（Mol.Ge
n.Genet.168（1979）111−115〕によって記載された。
同様の実験はB.メガテリウム（B.megaterium）のプロト
プラスト〔Vorobjeva et al.,FEMS Microbiol.Letters
7（1980）261−263〕、B.アミロリクイファシエンスの
プロトプラスト〔Smith et al.,Appl.and Env.Microbio
l.51（1986）634〕、B.スリンギェンシス（B.thuringie
nsis）のプロトプラスト〔Fisher et al.,Arch.Microbi
ol.139（1981）213−217〕、B.スフェリクス（B.sphaer
icus）のプロトプラスト（Mc Donald,J.Gen.Microbiol.
130（1984）203〕及びB.ラルベ（B.larvae）のプロトプ
ラスト〔Bakhiet et al.,Appl.and Env.Microbiol.49
（1985）577〕の成功された形質転換について記載され
ている。また、バキエ等〔Bakhiet et al.,上掲書〕は
B.ポピレ（B.popillae）を用いる成功的結果について報
告した。マン等〔Mann et al.,Current Microbiol.13
（1986）131−135〕はB.ポリミキサ（B.polymyxa）、B.
リヘニホルミス、B.マセランス（B.macerans）及びB.ラ
テロスポルス（B.laterosporus）を用いる成功的形質転
換について報告した。けれども良好なプロトプラスト形
成が観察されたにもかかわらずB.コアギュランス（B.co
agulans）、B.セレウス（B.cereus）及びB.プミルス
（B.pumilus）を用いた場合に実験は成功しなかった。
プロトプラストへのDNA導入の他の方法としては例えばD
NA含有リポソームとの融合〔Holubova,Folia Microbio
l.30（1985）97〕がある。
発明の開示 本発明によって新規のアルカリ親和性のバチルス属の
菌株、該菌株の形質転換に関する方法及びコンポジショ
ン（compositions）が提供される。新規のDNA配列も又
提供されるが該DNA配列はアルカリ親和性バチルス属の
菌株から誘導される高アルカリ活性タンパク分解酵素を
コードする遺伝子を有する。宿主細胞は好ましくは陽性
の背景（background）を有し、該高アルカリ活性タンパ
ク分解酵素をコードする遺伝子を有するプラスミド構成
体（plasmid construct）を用いることによって形質転
換される。アルカリ性pHの下でポリエチレングリコール
の存在でプラスミド構成体を用いる原形質体（プロトプ
ラスト）の形質転換の技法を使用し得る。DNA配列はこ
れを染色体外で保持させてよく、又は宿主細胞のゲノム
の中に組込んでもよい。
菌株、該菌株の形質転換に関する方法及びコンポジショ
ン（compositions）が提供される。新規のDNA配列も又
提供されるが該DNA配列はアルカリ親和性バチルス属の
菌株から誘導される高アルカリ活性タンパク分解酵素を
コードする遺伝子を有する。宿主細胞は好ましくは陽性
の背景（background）を有し、該高アルカリ活性タンパ
ク分解酵素をコードする遺伝子を有するプラスミド構成
体（plasmid construct）を用いることによって形質転
換される。アルカリ性pHの下でポリエチレングリコール
の存在でプラスミド構成体を用いる原形質体（プロトプ
ラスト）の形質転換の技法を使用し得る。DNA配列はこ
れを染色体外で保持させてよく、又は宿主細胞のゲノム
の中に組込んでもよい。
図面の簡単な説明 第１図はpUB110及びpM58を夫々有するB.スブチリスDB
104の培養物から得られた上澄液について行なわれたヒ
スチジン/MOPSゲル電気泳動と、数種のスブチリシンに
関する電気泳動との比較結果を示す。
104の培養物から得られた上澄液について行なわれたヒ
スチジン/MOPSゲル電気泳動と、数種のスブチリシンに
関する電気泳動との比較結果を示す。
泳路1:カールスベルヒ スブチリシン（Carlsberg su
btilisin） 泳路2:バチルス PB92 プロテアーゼ 泳路3:バチルス スブチリス スブチリシン 泳路4:バチルス スブチリス DB104（pM58） 泳路4:バチルス スブチリス DB104（pUB110） 第２図はプラスミドpM58の制限酵素地図を示す。更に
この図の上方部に配列方策を示す。実験矢印はファージ
M13ベクター類即ちmp10、mp11及びmp13の中へクローニ
ングされた断片（フラグメント）を表す。この図の下方
部はプロテアーゼ遺伝子上で規則的な間隔を保って位置
する10個のオリゴヌクレオチドを用いる配列方策を示
す。
btilisin） 泳路2:バチルス PB92 プロテアーゼ 泳路3:バチルス スブチリス スブチリシン 泳路4:バチルス スブチリス DB104（pM58） 泳路4:バチルス スブチリス DB104（pUB110） 第２図はプラスミドpM58の制限酵素地図を示す。更に
この図の上方部に配列方策を示す。実験矢印はファージ
M13ベクター類即ちmp10、mp11及びmp13の中へクローニ
ングされた断片（フラグメント）を表す。この図の下方
部はプロテアーゼ遺伝子上で規則的な間隔を保って位置
する10個のオリゴヌクレオチドを用いる配列方策を示
す。
第３図はバチルス PB92のセリン プロテアーゼのア
ミノ酸配列に相関する暗号鎖のヌクレオチド配列を示
す。DNA配列のプロモーター（P1、P2）、リボソーム結
合部位（rbs）及び終了域（term）も又示されている。
番号付きの実線は配列形成に用いられた10個のオリゴヌ
クレオチドの位置を示す。
ミノ酸配列に相関する暗号鎖のヌクレオチド配列を示
す。DNA配列のプロモーター（P1、P2）、リボソーム結
合部位（rbs）及び終了域（term）も又示されている。
番号付きの実線は配列形成に用いられた10個のオリゴヌ
クレオチドの位置を示す。
第4a図はプラスミドpE194−neoの構成を示す。
第4b図はプラスミドpMAX−４の構成を示す。
発明を実施するための最良の形態 本発明に従いタンパク分解酵素を高収量で製造するた
めの新規のDNA構成体及び新規のバチルス属の菌株並び
にそれらの製造方法が提供される。宿主細胞は“タンパ
ク分解酵素をコードするDNA配列を有するプラスミド構
成体と、該宿主バチルス属菌株から調製されたプロトプ
ラスト（複数）とを融合条件下に結合させること”によ
って形質転換される。
めの新規のDNA構成体及び新規のバチルス属の菌株並び
にそれらの製造方法が提供される。宿主細胞は“タンパ
ク分解酵素をコードするDNA配列を有するプラスミド構
成体と、該宿主バチルス属菌株から調製されたプロトプ
ラスト（複数）とを融合条件下に結合させること”によ
って形質転換される。
高アルカリ活性プロテアーゼはアルカリ性培地（又は
媒体）中で高活性を有するセリン プロテアーゼ又はス
ブチリシンである。更に詳細には高アルカリ活性プロテ
アーゼは約９以上のpH値において最適活性を有し、pH約
11において、又はそれ以上のpH値においてさえも該最適
活性の少なくとも80％の活性を保持する。高アルカリ活
性プロテアーゼはアルカリ性pHの下で生育し得るバチル
ス属の菌株によって製造されることが一般である。
媒体）中で高活性を有するセリン プロテアーゼ又はス
ブチリシンである。更に詳細には高アルカリ活性プロテ
アーゼは約９以上のpH値において最適活性を有し、pH約
11において、又はそれ以上のpH値においてさえも該最適
活性の少なくとも80％の活性を保持する。高アルカリ活
性プロテアーゼはアルカリ性pHの下で生育し得るバチル
ス属の菌株によって製造されることが一般である。
プロテアーゼ遺伝子の単離に用いられる技法は当業技
術分野で公知であって該技法は該遺伝子の合成、ゲノム
のDNAからの単離、cDNAからの調製又はそれらの組合せ
を含む。高アルカリ活性プロテアーゼ遺伝子の単離及び
発現は本件優先権主張出願の根拠である欧州出願No.EP
−Ａ−87200358・７明細書中に開示され、該開示事項は
本明細書中に引用されている。遺伝子操作に関する諸技
法は周知であって制限、切断、切除、連結、インビトロ
での突然変異誘発、プライマー修復、リンカー及びアダ
プターの使用及び類似技法を含む（参照文献:Molecular
Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,New York,1982〕。
術分野で公知であって該技法は該遺伝子の合成、ゲノム
のDNAからの単離、cDNAからの調製又はそれらの組合せ
を含む。高アルカリ活性プロテアーゼ遺伝子の単離及び
発現は本件優先権主張出願の根拠である欧州出願No.EP
−Ａ−87200358・７明細書中に開示され、該開示事項は
本明細書中に引用されている。遺伝子操作に関する諸技
法は周知であって制限、切断、切除、連結、インビトロ
での突然変異誘発、プライマー修復、リンカー及びアダ
プターの使用及び類似技法を含む（参照文献:Molecular
Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,New York,1982〕。
一般に該技法は高アルカリ活性プロテアーゼを発現す
る微生物からのゲノムライブラリ（染色体保存庫）の準
備を含む。供与体としての微生物のゲノムを単離して適
宜の制限酵素によって開裂させる。得られた供与体菌株
のDNA断片を次にクローン形成用ベクターの中へ連結さ
せるが該ベクターは共存可能な制限用エンドヌクレアー
ゼを用いて予め開裂されたものである。
る微生物からのゲノムライブラリ（染色体保存庫）の準
備を含む。供与体としての微生物のゲノムを単離して適
宜の制限酵素によって開裂させる。得られた供与体菌株
のDNA断片を次にクローン形成用ベクターの中へ連結さ
せるが該ベクターは共存可能な制限用エンドヌクレアー
ゼを用いて予め開裂されたものである。
挿入されたDNA断片を有するクローンは耐性付与物の
使用により、又はB.スブチリスについて開発されたよう
な直接又は陽性選択操作法の使用によって同定され得る
〔Gryczan and Dubnow,Gene 20（1982）459−469〕。
更に、高アルカリ活性プロテアーゼを発現するクローン
は、発現産生物に対向する抗体の使用により、又は基質
の損失の検出により、或いはタンパク分解酵素の産生物
の形成により同定され得る。例えば抗性物質耐性のよう
なマーカーとなる遺伝子を発現するコロニーをプロテア
ーゼ産生についてスクリーニングし得るが、この場合に
カゼイン（caseine）含有寒天平板上のコロニーを取巻
くカゼインの円輪（halo）の沈積増加によって決定す
る。
使用により、又はB.スブチリスについて開発されたよう
な直接又は陽性選択操作法の使用によって同定され得る
〔Gryczan and Dubnow,Gene 20（1982）459−469〕。
更に、高アルカリ活性プロテアーゼを発現するクローン
は、発現産生物に対向する抗体の使用により、又は基質
の損失の検出により、或いはタンパク分解酵素の産生物
の形成により同定され得る。例えば抗性物質耐性のよう
なマーカーとなる遺伝子を発現するコロニーをプロテア
ーゼ産生についてスクリーニングし得るが、この場合に
カゼイン（caseine）含有寒天平板上のコロニーを取巻
くカゼインの円輪（halo）の沈積増加によって決定す
る。
完結遺伝子がcDNAとして又は染色体のDNAとして同定
されたならば各種の方法に従ってこれを発現のために操
作し得る。バチルス属の宿主を使用し得るが該宿主は例
えばアルカリ親和性細菌であって高アルカリ活性プロテ
アーゼ産生菌として確認されたアルカリ親和性細菌を含
む。好ましい宿主菌はバチルスnovo sp.PB92である。従
って調節用シグナルを有する野生型配列及び分泌先導配
列、及びその他の配列を保持することが便利であるけれ
ども他の細菌から誘導された制御域、即ち該バチルス宿
主株の中で機能する制御域も又使用し得る。従ってバチ
ルス属細胞を形質転換させるための適切なベクターは高
アルカリ活性プロテアーゼをコードする構造遺伝子を有
する。該構造遺伝子はアルカリ親和性バチルス属から得
られ、制御域例えばプロモーター配列、リボソーム結合
部形成配列及び該アルカリプロテアーゼ遺伝子の転写終
了及び翻訳を制御する配列を有し、該制御域はアルカリ
親和性バチルス宿主細胞の中で機能するのである。
されたならば各種の方法に従ってこれを発現のために操
作し得る。バチルス属の宿主を使用し得るが該宿主は例
えばアルカリ親和性細菌であって高アルカリ活性プロテ
アーゼ産生菌として確認されたアルカリ親和性細菌を含
む。好ましい宿主菌はバチルスnovo sp.PB92である。従
って調節用シグナルを有する野生型配列及び分泌先導配
列、及びその他の配列を保持することが便利であるけれ
ども他の細菌から誘導された制御域、即ち該バチルス宿
主株の中で機能する制御域も又使用し得る。従ってバチ
ルス属細胞を形質転換させるための適切なベクターは高
アルカリ活性プロテアーゼをコードする構造遺伝子を有
する。該構造遺伝子はアルカリ親和性バチルス属から得
られ、制御域例えばプロモーター配列、リボソーム結合
部形成配列及び該アルカリプロテアーゼ遺伝子の転写終
了及び翻訳を制御する配列を有し、該制御域はアルカリ
親和性バチルス宿主細胞の中で機能するのである。
更にベクターはマーカー遺伝子、例えば宿主株が感受
性を示す抗性物質に耐性であるマーカー遺伝子を有し得
るがこれは宿主細胞内で自律的複製を可能とする複製起
点である。複製起点は突然変異されたものであってよ
く、宿主細胞内で温度−感受性能を発揮してエルリヒ
〔Ehrlich,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75（1978）1433〕
記載の染色体への組込みのための選択を可能とする。
性を示す抗性物質に耐性であるマーカー遺伝子を有し得
るがこれは宿主細胞内で自律的複製を可能とする複製起
点である。複製起点は突然変異されたものであってよ
く、宿主細胞内で温度−感受性能を発揮してエルリヒ
〔Ehrlich,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75（1978）1433〕
記載の染色体への組込みのための選択を可能とする。
アミノ酸配列は、“高アルカリ活性プロテアーゼ遺伝
子を提供するための供与細胞として有用な細胞からのmR
NA又はDNAから調製されたcDNA又はゲノムライブラリ”
をスクリーニングするための探索子（プローブ）を企画
する際に使用され得る。高アルカリ活性プロテアーゼの
cDNA又はその断片を交雑（ハイブリダイゼーション）用
のプローブとして使用することにより、他の微生物に見
出される構造的に関連する遺伝子を容易にクローニング
し得る。なかんずく高アルカリ活性セリンプロテアーゼ
を発現する微生物からの遺伝子の単離は特に重要であっ
てこの場合にはアルカリ親和性バチルス属菌株、例えば
バチルスnovo sp.PB92から得られる高アルカリ活性セリ
ンプロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に基づくオリ
ゴヌクレオチドプローブを用いる。該プローブは完全な
配列よりかなり短かくてよいがその長さは少なくとも10
個、好ましくは少なくとも15個、更に好ましくは20個の
ヌクレオチドから成る長さであるべきである。それより
長いオリゴヌクレオチド群も又有用であるが遺伝子の全
長以下、好ましくは1200個以下のヌクレオチドから成る
長さである。RNAプローブ及びDNAプローブの双方を共に
使用し得る。
子を提供するための供与細胞として有用な細胞からのmR
NA又はDNAから調製されたcDNA又はゲノムライブラリ”
をスクリーニングするための探索子（プローブ）を企画
する際に使用され得る。高アルカリ活性プロテアーゼの
cDNA又はその断片を交雑（ハイブリダイゼーション）用
のプローブとして使用することにより、他の微生物に見
出される構造的に関連する遺伝子を容易にクローニング
し得る。なかんずく高アルカリ活性セリンプロテアーゼ
を発現する微生物からの遺伝子の単離は特に重要であっ
てこの場合にはアルカリ親和性バチルス属菌株、例えば
バチルスnovo sp.PB92から得られる高アルカリ活性セリ
ンプロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に基づくオリ
ゴヌクレオチドプローブを用いる。該プローブは完全な
配列よりかなり短かくてよいがその長さは少なくとも10
個、好ましくは少なくとも15個、更に好ましくは20個の
ヌクレオチドから成る長さであるべきである。それより
長いオリゴヌクレオチド群も又有用であるが遺伝子の全
長以下、好ましくは1200個以下のヌクレオチドから成る
長さである。RNAプローブ及びDNAプローブの双方を共に
使用し得る。
使用に当りプローブを検出可能に（例えば32P、3H、
ビオチン又はアビジンを用いて）標識することが典型的
な仕方であり、該プローブを、求める遺伝子をもつ微生
物からの一本鎖DNA又はRNAと共に、恒温下に保持する。
ハイブリダイゼーション（交雑）は、一本鎖及び二本鎖
（交雑されたもの）のDNA（又はDNA/RNA）を（典型的に
はニトロセルロース紙使用下で）分別した後に標識によ
って検出させ得る。オリゴヌクレオチド使用に適する交
雑技法は当業技術者にとって周知である。
ビオチン又はアビジンを用いて）標識することが典型的
な仕方であり、該プローブを、求める遺伝子をもつ微生
物からの一本鎖DNA又はRNAと共に、恒温下に保持する。
ハイブリダイゼーション（交雑）は、一本鎖及び二本鎖
（交雑されたもの）のDNA（又はDNA/RNA）を（典型的に
はニトロセルロース紙使用下で）分別した後に標識によ
って検出させ得る。オリゴヌクレオチド使用に適する交
雑技法は当業技術者にとって周知である。
検定の容易化のための検出可能標識を有するプローブ
の使用が普通であるけれども無標識のヌクレオチドも又
有用であって、両者は標識されたプローブの前駆体とし
て、二本鎖DNA（又はDNA/RNA）の直接的検出法に使用さ
れる。従って本明細書中の用語“オリゴヌクレオチド
プローブ”は標識型及び無標識型の双方を意味する。次
いで連結混合物はコムピテントな（被感染性の）B.スブ
チリス細胞群の形質転換のために使用される。選択手段
としてのマーカー遺伝子を使用して組換え体プラスミド
を単離し、制限分析及び配列形成によって特性化し得
る。
の使用が普通であるけれども無標識のヌクレオチドも又
有用であって、両者は標識されたプローブの前駆体とし
て、二本鎖DNA（又はDNA/RNA）の直接的検出法に使用さ
れる。従って本明細書中の用語“オリゴヌクレオチド
プローブ”は標識型及び無標識型の双方を意味する。次
いで連結混合物はコムピテントな（被感染性の）B.スブ
チリス細胞群の形質転換のために使用される。選択手段
としてのマーカー遺伝子を使用して組換え体プラスミド
を単離し、制限分析及び配列形成によって特性化し得
る。
高アルカリ活性プロテアーゼの製造のために、既にセ
リン プロテアーゼを産生しているバチルス属菌株を形
質転換させるために使用される好適なDNA配列はバチル
スnovo sp.PB92に由来する配列である。該DNA配列によ
ってコードささるセリン プロテアーゼのアミノ酸配列
は下記の通りである： プロテアーゼ遺伝子を提供するための好適菌株はバチ
ルスnovo sp.PB92であるけれども他のアルカリ親和性細
胞からも本質的に同一なセリン プロテアーゼが得られ
る。かようなプロテアーゼ遺伝子はバチルス PB92のア
ミノ酸配列と少なくとも約70％、好ましくは約80％又は
それ以上の相同性をもつアミノ酸配列を有する遺伝子で
あって本発明の範囲に属することが理解されるべきであ
る。
リン プロテアーゼを産生しているバチルス属菌株を形
質転換させるために使用される好適なDNA配列はバチル
スnovo sp.PB92に由来する配列である。該DNA配列によ
ってコードささるセリン プロテアーゼのアミノ酸配列
は下記の通りである： プロテアーゼ遺伝子を提供するための好適菌株はバチ
ルスnovo sp.PB92であるけれども他のアルカリ親和性細
胞からも本質的に同一なセリン プロテアーゼが得られ
る。かようなプロテアーゼ遺伝子はバチルス PB92のア
ミノ酸配列と少なくとも約70％、好ましくは約80％又は
それ以上の相同性をもつアミノ酸配列を有する遺伝子で
あって本発明の範囲に属することが理解されるべきであ
る。
発現産生物（製品）は分泌されることが望ましい。ア
ルカリプロテアーゼは分泌されるので野生型分泌先導シ
グナル及びプロセッシングシグナル（processing signa
ls）を使用する。更に、分泌先導シグナル及びプロセッ
シングシグナルをコードする構造遺伝子に対し５′配列
を提供することによって融合遺伝子を調製し得る。例え
ば異種起源の先導シグナルはバチルス属のアミラーゼ遺
伝子及びプロテアーゼ遺伝子の分泌先導シグナルを有す
る。分泌先導シグナルの正常な読取枠の中へ前記の構造
遺伝子を融合させることによって“成熟したアルカリ親
和性プロテアーゼ”を培地中へ分泌させ得る。
ルカリプロテアーゼは分泌されるので野生型分泌先導シ
グナル及びプロセッシングシグナル（processing signa
ls）を使用する。更に、分泌先導シグナル及びプロセッ
シングシグナルをコードする構造遺伝子に対し５′配列
を提供することによって融合遺伝子を調製し得る。例え
ば異種起源の先導シグナルはバチルス属のアミラーゼ遺
伝子及びプロテアーゼ遺伝子の分泌先導シグナルを有す
る。分泌先導シグナルの正常な読取枠の中へ前記の構造
遺伝子を融合させることによって“成熟したアルカリ親
和性プロテアーゼ”を培地中へ分泌させ得る。
発源カセットは、その全部又は一部分を天然源から誘
導し得るし、宿主細胞とは同種起源の供給源から、又は
宿主細胞とは異種起源の供給源から全部又は一部分を誘
導し得る。本発明による各種のDNA構成体（即ちDNA配
列、ベクター、プラスミド、発源カセット）は単離及び
（又は）純化され、或いは合成されるので、“天然に存
在する”ことはない。
導し得るし、宿主細胞とは同種起源の供給源から、又は
宿主細胞とは異種起源の供給源から全部又は一部分を誘
導し得る。本発明による各種のDNA構成体（即ちDNA配
列、ベクター、プラスミド、発源カセット）は単離及び
（又は）純化され、或いは合成されるので、“天然に存
在する”ことはない。
宿主菌株の染色体中への構造遺伝子の組込みが所望さ
れるか又は染色体外の要素上での保持が所望されるかに
よってバチルス属の系の複製が含まれ、又は含まれな
い。組込みの場合にはバチルス属のゲノムを有するプラ
スミド構成体の中で相同体を伸長させて組換えの可能性
を増大させる。更に、プラスミド構成体の中へ温度感受
性の複製起点を含有させることは染色体への組込みを選
択させるものである〔例えばEhrlich,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 75（1978）1433参照〕。
れるか又は染色体外の要素上での保持が所望されるかに
よってバチルス属の系の複製が含まれ、又は含まれな
い。組込みの場合にはバチルス属のゲノムを有するプラ
スミド構成体の中で相同体を伸長させて組換えの可能性
を増大させる。更に、プラスミド構成体の中へ温度感受
性の複製起点を含有させることは染色体への組込みを選
択させるものである〔例えばEhrlich,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 75（1978）1433参照〕。
一コピー以上の構造遺伝子を宿主細胞の中へ挿入して
構造遺伝子の発現を拡大させ得る。構造遺伝子の安定な
拡大は、少なくとも一コピーの追加の構造遺伝子を宿主
細胞のゲノムの中へ組込むこと、及び形質転換体（この
中で構造遺伝子のコピーが内因性の染色体配列によって
分別される）を選択することによって達成され得る。DN
A構成体及び原核微生物に関する技法は欧州出願No.EP−
Ａ−87200356・１明細書中に記載され、該開示事項は本
明細書中に引用されている。
構造遺伝子の発現を拡大させ得る。構造遺伝子の安定な
拡大は、少なくとも一コピーの追加の構造遺伝子を宿主
細胞のゲノムの中へ組込むこと、及び形質転換体（この
中で構造遺伝子のコピーが内因性の染色体配列によって
分別される）を選択することによって達成され得る。DN
A構成体及び原核微生物に関する技法は欧州出願No.EP−
Ａ−87200356・１明細書中に記載され、該開示事項は本
明細書中に引用されている。
複製系のほかに少なくとも１個のマーカー遺伝子がプ
ラスミド構成体中に含まれる。マーカー遺伝子の使用に
より殺生剤耐性、ウィルス耐性又は重金属耐性、免疫性
及びその他の類似の性能を提供し、発現する構造遺伝子
を宿主内に達成し得るようにする。殺性剤耐性には抗性
物質例えばネオマイシン、カナマイシン、テトラサイク
リンに対する耐性が含まれる。マーカー遺伝子は組換え
体細胞群の生育を著しく妨げない抗性物質濃度での少な
いコピー数を選択するように選択される。特に重要なの
はネオマイシン耐性である。
ラスミド構成体中に含まれる。マーカー遺伝子の使用に
より殺生剤耐性、ウィルス耐性又は重金属耐性、免疫性
及びその他の類似の性能を提供し、発現する構造遺伝子
を宿主内に達成し得るようにする。殺性剤耐性には抗性
物質例えばネオマイシン、カナマイシン、テトラサイク
リンに対する耐性が含まれる。マーカー遺伝子は組換え
体細胞群の生育を著しく妨げない抗性物質濃度での少な
いコピー数を選択するように選択される。特に重要なの
はネオマイシン耐性である。
各種のDNA配列が各種の供給源から誘導され、相互に
結合されてベクター、即ち好ましくは独特の、単数又は
複数の有用な制限部位を有し、該部位に構造遺伝子を挿
入又は置換させてプラスミド構成体を有するベクター、
を提供する。
結合されてベクター、即ち好ましくは独特の、単数又は
複数の有用な制限部位を有し、該部位に構造遺伝子を挿
入又は置換させてプラスミド構成体を有するベクター、
を提供する。
プラスミド構成体が調製されるとこれは適宜の宿主細
胞の形質転換のために使用可能である。宿主のバチルス
属菌はいかなるバチルス属の菌株であってよいけれども
高アルカリ活性プロテアーゼの製造法を改良し得る要因
を考慮して適切な菌株を選択する。各種の方式で、例え
ば所望製品の劣化を減ずる方式、調節シグナルを認識さ
せる方式、分泌を容易ならしめる方式、及びその他の方
式で宿主を使用することによる製法改良が可能である。
従って宿主バチルス属菌は高アルカリ活性プロテアーゼ
産生菌であることが好ましいが、野生型バチルス属菌で
あり得るし又は突然変異バチルス属菌であり得るし、更
に宿主バチルス属菌はアルカリ活性プロテアーゼを高度
に産生しなかった高アルカリ活性プロテアーゼ産生突然
変異株であり得る。
胞の形質転換のために使用可能である。宿主のバチルス
属菌はいかなるバチルス属の菌株であってよいけれども
高アルカリ活性プロテアーゼの製造法を改良し得る要因
を考慮して適切な菌株を選択する。各種の方式で、例え
ば所望製品の劣化を減ずる方式、調節シグナルを認識さ
せる方式、分泌を容易ならしめる方式、及びその他の方
式で宿主を使用することによる製法改良が可能である。
従って宿主バチルス属菌は高アルカリ活性プロテアーゼ
産生菌であることが好ましいが、野生型バチルス属菌で
あり得るし又は突然変異バチルス属菌であり得るし、更
に宿主バチルス属菌はアルカリ活性プロテアーゼを高度
に産生しなかった高アルカリ活性プロテアーゼ産生突然
変異株であり得る。
高アルカリ活性プロテアーゼ産生細菌は分類学上良好
に分類されてはいないし、アルカリ親和性バチルス属菌
株として引用されることが一般である。アルカリ性pHの
下で生育し得るバチルス属菌株の例は例えば米国特許第
3723250;Re.30602及び4480037号各明細書に記載されて
いる。好ましいアルカリ親和性バチルス属宿主株はなか
んずく米国特許No.Re.30602号開示のバチルスnovo spec
ies PB92株である。
に分類されてはいないし、アルカリ親和性バチルス属菌
株として引用されることが一般である。アルカリ性pHの
下で生育し得るバチルス属菌株の例は例えば米国特許第
3723250;Re.30602及び4480037号各明細書に記載されて
いる。好ましいアルカリ親和性バチルス属宿主株はなか
んずく米国特許No.Re.30602号開示のバチルスnovo spec
ies PB92株である。
工業的なアルカリ親和性バチルス属菌株も又宿主細胞
として使用可能である。工業的バチルス属菌株は土壌か
ら単離されたか又は寄託機関或はその他の供給先から入
手された菌株から由来し、該バチルス属菌株の遺伝学的
一時変異によって得られる。工業的バチルス属菌株は遺
伝学的変換、例えばファージ感染又は形質転換に対して
抵抗性であることで特性づけられる。該菌株は安定であ
って胞子を形成し、又は形成しない。該菌株は通常は原
栄養性であり、変改されると内因性のタンパク質生成物
例えばα−アミラーゼ酵素及び各種のプロテアーゼを高
収量で産生する。工業的製法によって得られる内因性タ
ンパク質生成物の収量は少なくとも5g/（0.5％w/v）
に達し得る。工業的菌株はDNアーゼも分泌し、その結果
培地内でDNAの劣化を起し、遺伝学的交換に対する防御
を果す。
として使用可能である。工業的バチルス属菌株は土壌か
ら単離されたか又は寄託機関或はその他の供給先から入
手された菌株から由来し、該バチルス属菌株の遺伝学的
一時変異によって得られる。工業的バチルス属菌株は遺
伝学的変換、例えばファージ感染又は形質転換に対して
抵抗性であることで特性づけられる。該菌株は安定であ
って胞子を形成し、又は形成しない。該菌株は通常は原
栄養性であり、変改されると内因性のタンパク質生成物
例えばα−アミラーゼ酵素及び各種のプロテアーゼを高
収量で産生する。工業的製法によって得られる内因性タ
ンパク質生成物の収量は少なくとも5g/（0.5％w/v）
に達し得る。工業的菌株はDNアーゼも分泌し、その結果
培地内でDNAの劣化を起し、遺伝学的交換に対する防御
を果す。
アルカリ親和性バチルス属菌株の形質転換は該菌株か
らの原形質体の使用を含むことが好ましい。けれども慣
用の原形質体形質転換の実験方式はコーエン記載（Cohe
n et al.前掲文献）の通りアルカリ親和性バチルス属菌
株に関して作動しない。従って他の追加的な実験方式を
開発せねばならなかった。
らの原形質体の使用を含むことが好ましい。けれども慣
用の原形質体形質転換の実験方式はコーエン記載（Cohe
n et al.前掲文献）の通りアルカリ親和性バチルス属菌
株に関して作動しない。従って他の追加的な実験方式を
開発せねばならなかった。
アルカリ親和性細菌に関しては原形質体の形成及び再
生は高値のpH、好ましくはpH約８の下で起り得る。原形
質体は細胞群をアルカリ保有培地（AHM）（pH7.8〜8.
5）中に再懸濁させてから細胞群を30〜80分間37℃の恒
温に保持して調製される。AHMの一例については後文中
の例５を参照されたい。次いで得られた原形質体を洗っ
てリゾチームを除いてからAHM中に再懸濁させる。プラ
スミド構成体とアルカリ親和性バチルス属宿主株の原形
質体とを適宜のフソゲン（fusogen）の存在下に結合さ
せる。所望の効果を奏するいかなるフソゲンをも使用し
得るが最も多くの場合にポリエチレングリコール（MW:1
000〜8000）は高い融合効果を奏するので大いに便利で
ある。バチルス属の受容体菌株から調製された原形質体
とプラスミド構成体とをポリエチレングリコールの存在
下で５分間以内、好ましくは２分間以内に混合する。次
に該フソゲン混合物を慣用の普通培地で再び平板培養
し、細胞群を５時間以内、好ましくは２〜３時間恒温保
持し、その後に再生用平板培地へ移す。再生用平板培地
は形質転換体の選択のための抗性物質例えばネオマイシ
ンを含有する。
生は高値のpH、好ましくはpH約８の下で起り得る。原形
質体は細胞群をアルカリ保有培地（AHM）（pH7.8〜8.
5）中に再懸濁させてから細胞群を30〜80分間37℃の恒
温に保持して調製される。AHMの一例については後文中
の例５を参照されたい。次いで得られた原形質体を洗っ
てリゾチームを除いてからAHM中に再懸濁させる。プラ
スミド構成体とアルカリ親和性バチルス属宿主株の原形
質体とを適宜のフソゲン（fusogen）の存在下に結合さ
せる。所望の効果を奏するいかなるフソゲンをも使用し
得るが最も多くの場合にポリエチレングリコール（MW:1
000〜8000）は高い融合効果を奏するので大いに便利で
ある。バチルス属の受容体菌株から調製された原形質体
とプラスミド構成体とをポリエチレングリコールの存在
下で５分間以内、好ましくは２分間以内に混合する。次
に該フソゲン混合物を慣用の普通培地で再び平板培養
し、細胞群を５時間以内、好ましくは２〜３時間恒温保
持し、その後に再生用平板培地へ移す。再生用平板培地
は形質転換体の選択のための抗性物質例えばネオマイシ
ンを含有する。
DNA構成体をエピゾーム中に保持するクローンは高ア
ルカリ活性セリンプロテアーゼの発現を検定することに
よって同定され得る。染色体への組込み部分としての発
現構成体を有するクローンの同定のためには、発生した
クローンの細胞の全部のDNAを単離し、遊離のプラスミ
ドDNAの存在がその中に検出されないクローンであって
プラスミドのマーカー遺伝子が発現している該クローン
を選択することによって該“発生したクローン”をスク
リーニングする。次に高アルカリ活性セリンプロテアー
ゼの発現を検定するための適宜の方式によって該クロー
ンをスクリーニングする。
ルカリ活性セリンプロテアーゼの発現を検定することに
よって同定され得る。染色体への組込み部分としての発
現構成体を有するクローンの同定のためには、発生した
クローンの細胞の全部のDNAを単離し、遊離のプラスミ
ドDNAの存在がその中に検出されないクローンであって
プラスミドのマーカー遺伝子が発現している該クローン
を選択することによって該“発生したクローン”をスク
リーニングする。次に高アルカリ活性セリンプロテアー
ゼの発現を検定するための適宜の方式によって該クロー
ンをスクリーニングする。
各種の検定技法は特異的抗体、DNA交雑又はRNA交雑、
酵素生成物の形成又は酵素基質の消失の使用を含み、こ
れらはクローンのスクリーニングに使用されて発現構成
体の存在及び本発明で重要な構造遺伝子の発現、即ちプ
ロテアーゼ製造を決定する。製造されたプロテアーゼ
は、例えばSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ヒ
スチジン−MOPSゲル電気泳動によるプロテアーゼの分子
量の測定、及び運動学的助変数Km及びVmaxの測定、合成
基質即ちサクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ
−プロピル−Ｌ−フェニルアラニル−ｐ−ニトロ−アナ
ライド上での試験によって生化学的に特性化される。
酵素生成物の形成又は酵素基質の消失の使用を含み、こ
れらはクローンのスクリーニングに使用されて発現構成
体の存在及び本発明で重要な構造遺伝子の発現、即ちプ
ロテアーゼ製造を決定する。製造されたプロテアーゼ
は、例えばSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ヒ
スチジン−MOPSゲル電気泳動によるプロテアーゼの分子
量の測定、及び運動学的助変数Km及びVmaxの測定、合成
基質即ちサクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ
−プロピル−Ｌ−フェニルアラニル−ｐ−ニトロ−アナ
ライド上での試験によって生化学的に特性化される。
次にエピゾーム又は染色体に組込まれた発現構成体を
有するバチルス属宿主株を、酵素合成に適する諸条件の
下で普通培地中で生育させる。普通培地は通常の場合に
プラスミド保持手段、例えば“形質転換されない宿主が
感受性を示す抗性物質”を存在させる手段を有する。発
酵はブロスが消費され終るまで継続される。生成物（製
品）が分泌される場合にはこれを慣用技法例えば抽出、
クロマトグラフィ、電気泳動又は類似技術によってブロ
スから単離する。生成物（製品）が細胞質内に保持され
ている場合には細胞群を遠心分離、濾過等によって収穫
し、機械的せん断、洗剤、リゾチーム又はその他の技法
によって溶菌化し、既述の通りにして製品を単離する。
形質転換されない宿主細胞が高アルカリ活性プロテアー
ゼ産生菌である場合には本発明方法の適用により高アル
カリ活性セリンプロテアーゼの著大に増加された収率が
達成され、単一の染色体外遺伝子コピーを用いることに
より、形質転換されない宿主細胞に比して通常は少なく
とも約120％の収率を達成し得る。
有するバチルス属宿主株を、酵素合成に適する諸条件の
下で普通培地中で生育させる。普通培地は通常の場合に
プラスミド保持手段、例えば“形質転換されない宿主が
感受性を示す抗性物質”を存在させる手段を有する。発
酵はブロスが消費され終るまで継続される。生成物（製
品）が分泌される場合にはこれを慣用技法例えば抽出、
クロマトグラフィ、電気泳動又は類似技術によってブロ
スから単離する。生成物（製品）が細胞質内に保持され
ている場合には細胞群を遠心分離、濾過等によって収穫
し、機械的せん断、洗剤、リゾチーム又はその他の技法
によって溶菌化し、既述の通りにして製品を単離する。
形質転換されない宿主細胞が高アルカリ活性プロテアー
ゼ産生菌である場合には本発明方法の適用により高アル
カリ活性セリンプロテアーゼの著大に増加された収率が
達成され、単一の染色体外遺伝子コピーを用いることに
より、形質転換されない宿主細胞に比して通常は少なく
とも約120％の収率を達成し得る。
発明を実施するための最良の形態 下記の諸例は本発明の例示のためであって本発明を限
定するためではない。
定するためではない。
例１ アルカリ親和性バチルスnovo sp.PB92からのゲノ
ムDNAライブラリの調製及びセリン プロテアーゼ遺伝
子の単離 バチルスnovo sp.PB92（寄託先:Laboratorium voor M
icrobiologie,Technical University of Delft,the Net
herlands;受託番号No.OR−60;米国特許No.Re.30602参
照）から、サイトウ等〔Saito−Miuva,Biochem.Biophy
s.Acta 72（1963）619−632〕の方法に従って単離され
た染色体のDNAを制限酵素Sau3Aを用いて部分的に切断
し、プラスミドpUB110のBamH1サイトの中へ連結させた
〔Gryczan et al.,J.Bacteriol.134（1978）318−32
9〕。pUB110プラスミドDNAは文献〔Birnboim and Doly,
Nucl.Acids Res.7（1979）1513−1523〕記載のようにし
て調製された。
ムDNAライブラリの調製及びセリン プロテアーゼ遺伝
子の単離 バチルスnovo sp.PB92（寄託先:Laboratorium voor M
icrobiologie,Technical University of Delft,the Net
herlands;受託番号No.OR−60;米国特許No.Re.30602参
照）から、サイトウ等〔Saito−Miuva,Biochem.Biophy
s.Acta 72（1963）619−632〕の方法に従って単離され
た染色体のDNAを制限酵素Sau3Aを用いて部分的に切断
し、プラスミドpUB110のBamH1サイトの中へ連結させた
〔Gryczan et al.,J.Bacteriol.134（1978）318−32
9〕。pUB110プラスミドDNAは文献〔Birnboim and Doly,
Nucl.Acids Res.7（1979）1513−1523〕記載のようにし
て調製された。
連結混合物を文献〔Spizizen et al.,J.Bacteriol.81
（1961）741−746〕記載の方法に従い、被感染性の細胞
群1ml当り0.6〜１μgDNAを用いてB.スブチリス1A40（Ba
cillus Genetic Stock Centre）の中へ導入してこれを
形質転換させた。形質転換混合物からの細胞群を下記諸
成分：即ち2.8％K2HPO4、1.2％K2HPO4、0.4％（NH4）2S
O4、0.2％トリ−Na−サイトレート・2H2O、0.04％MgSO4
・7H2O、0.00005％MnSO4・4H2O、0.4％Ｌ−グルタミン
酸、0.5％グルコース、0.02％カザミノ酸、50μg/mlト
リプトファン、20μg/mlメチオニン、20μg/mlリジン、
20μg/mlネオマイシン、0.4％カゼイン及び1.5％寒天を
含む微小平板培地上で培養した。平板培養物を終夜37℃
に恒温保持した後に、寒天平板上のコロニー周辺のカゼ
イン開裂生成物の円輪状沈積物の増加によって測定した
時に、50,000個のネオマイシン耐性コロニーの中の１個
が増加されたプロテアーゼ産生を示した。文献〔Birnbo
im and Doly,Nucleic Acids Res.7（1979）1513−152
3〕記載の方法に従って該コロニーからプラスミドDNAを
単離してこれをpM58と命名した。
（1961）741−746〕記載の方法に従い、被感染性の細胞
群1ml当り0.6〜１μgDNAを用いてB.スブチリス1A40（Ba
cillus Genetic Stock Centre）の中へ導入してこれを
形質転換させた。形質転換混合物からの細胞群を下記諸
成分：即ち2.8％K2HPO4、1.2％K2HPO4、0.4％（NH4）2S
O4、0.2％トリ−Na−サイトレート・2H2O、0.04％MgSO4
・7H2O、0.00005％MnSO4・4H2O、0.4％Ｌ−グルタミン
酸、0.5％グルコース、0.02％カザミノ酸、50μg/mlト
リプトファン、20μg/mlメチオニン、20μg/mlリジン、
20μg/mlネオマイシン、0.4％カゼイン及び1.5％寒天を
含む微小平板培地上で培養した。平板培養物を終夜37℃
に恒温保持した後に、寒天平板上のコロニー周辺のカゼ
イン開裂生成物の円輪状沈積物の増加によって測定した
時に、50,000個のネオマイシン耐性コロニーの中の１個
が増加されたプロテアーゼ産生を示した。文献〔Birnbo
im and Doly,Nucleic Acids Res.7（1979）1513−152
3〕記載の方法に従って該コロニーからプラスミドDNAを
単離してこれをpM58と命名した。
例２ PB92セリン プロテアーゼ遺伝子の発現 極小培地〔Spizizen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
44（1958）1072−1078〕に0.02％カザミノ酸、50μg/m
lトリプトファン、20μg/mlメチオニン、20μg/mlリジ
ン及び20μg/mlネオマイシンを含有させ、この中でpM58
を有するB.スブチリス1A40を生育させた。24時間後に培
養物を遠心分離してから上澄液について、基質としてジ
メチルカゼインを用いるプロテアーゼ活性試験〔Lin et
al.,J.Biol.Chem.244（1969）789−793〕を行なった。
プラスミドpUB110を有するB.スブチリス1A40の培養物を
対照として使用したところこれは上記PM58形質転換菌培
養物が示すプロテアーゼ活性の1/60以下の活性を示し
た。プロテアーゼ活性は1mMフェニルスルホニルフルオ
ライド（PMSF）を用いる処理によって完全に阻害された
けれども20mMのEDTAを用いる処理による場合には阻害さ
れなかった。
44（1958）1072−1078〕に0.02％カザミノ酸、50μg/m
lトリプトファン、20μg/mlメチオニン、20μg/mlリジ
ン及び20μg/mlネオマイシンを含有させ、この中でpM58
を有するB.スブチリス1A40を生育させた。24時間後に培
養物を遠心分離してから上澄液について、基質としてジ
メチルカゼインを用いるプロテアーゼ活性試験〔Lin et
al.,J.Biol.Chem.244（1969）789−793〕を行なった。
プラスミドpUB110を有するB.スブチリス1A40の培養物を
対照として使用したところこれは上記PM58形質転換菌培
養物が示すプロテアーゼ活性の1/60以下の活性を示し
た。プロテアーゼ活性は1mMフェニルスルホニルフルオ
ライド（PMSF）を用いる処理によって完全に阻害された
けれども20mMのEDTAを用いる処理による場合には阻害さ
れなかった。
上記の上澄液の或量についてタンパク質ゲル上で文献
記載〔Laemmli,Nature 227（1970）680〕の方法に従っ
て分析した。このゲル上での分析試料は該上澄液の５％
トリクロロ酢酸（TCA）による処理で調製された。該試
料を遠心分離してから沈積タンパク質のペレットをアセ
トンで２回洗浄した後に40μの試料用緩衝液（0.5Mの
Tris/HCl pH7.5、10％v/v 2−メルカプトエタノール、
50％v/vグリセロール及び0.05％ブロモフェノール青含
有液）の中で10分間煮沸することによって溶解させた。
電気泳動の後に呈色試薬（Coomassie Brilliant Blue）
の使用で呈色させた。次に培養物の上澄液試料を電気泳
動によって分析した。３種の異なるB.スブチリス1A40株
を用いた：即ちpUB110含有菌株;pM58含有菌株；及びプ
ラスミド不含有菌株；並びに対照としてバチルス PB92
プロテアーゼ。電気泳動の後に上記呈色試薬を用いて
ゲルを呈色させ、そして脱色した。pM58を有するB.スブ
チリス 1A40株は31KDのタンパク質を含有し、これはバ
チルス PB92 プロテアーゼと共泳動した。該タンパク
質は、pUB110含有のB.スブチリス 1A40株の対照泳路上
には検出されなかった。
記載〔Laemmli,Nature 227（1970）680〕の方法に従っ
て分析した。このゲル上での分析試料は該上澄液の５％
トリクロロ酢酸（TCA）による処理で調製された。該試
料を遠心分離してから沈積タンパク質のペレットをアセ
トンで２回洗浄した後に40μの試料用緩衝液（0.5Mの
Tris/HCl pH7.5、10％v/v 2−メルカプトエタノール、
50％v/vグリセロール及び0.05％ブロモフェノール青含
有液）の中で10分間煮沸することによって溶解させた。
電気泳動の後に呈色試薬（Coomassie Brilliant Blue）
の使用で呈色させた。次に培養物の上澄液試料を電気泳
動によって分析した。３種の異なるB.スブチリス1A40株
を用いた：即ちpUB110含有菌株;pM58含有菌株；及びプ
ラスミド不含有菌株；並びに対照としてバチルス PB92
プロテアーゼ。電気泳動の後に上記呈色試薬を用いて
ゲルを呈色させ、そして脱色した。pM58を有するB.スブ
チリス 1A40株は31KDのタンパク質を含有し、これはバ
チルス PB92 プロテアーゼと共泳動した。該タンパク
質は、pUB110含有のB.スブチリス 1A40株の対照泳路上
には検出されなかった。
すべてのセリン プロテアーゼは類似の分子量を有す
る。けれどもバチルス PB92のクローニングされて得ら
れたセリン プロテアーゼは、プロテアーゼ ネガティ
ブのB.スブチリス株DB104に対するpM58及びpUB110への
導入〔R.Doi,J.Bacteriol.160（1984）442−444）によ
る形質転換及び細胞外産生プロテアーゼの分析によっ
て、既知のセリンプロテアーゼ類（B.スブチリスのスブ
チリシン、カールスベルヒ スブチリシン）から区別さ
れた。得られた形質転換体を極小培地（Spizizen et a
l.,前掲文献）（0.02％カザミノ酸、50μg/mlヒスチジ
ン及び20μg/mlネオマイシン含有）中で生育させた。24
時間後に試料を採り、遠心分離し、予備処理を施すこと
なくヒスチジン/MOPSゲル〔75mM KOH、40mMヒスチジ
ン、100mM MOPS（３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパン
スルホン酸）、pH7.5及び５％ポリアクリルアミド含
有〕上で分析した。電気泳動用緩衝液は40mMヒスチジ
ン、100mM MOPS、pH6.6を含有していた。試料を陰極方
向で泳動させた。プロテアーゼ バンドをフィルム〔Ag
fa Pan 100 Professional film〕の使用で検定した〔Zu
idweg et al.,Biotechnol.and Bioengin.14（1972）685
−714参照〕。結果を第１図に示す。図示の通りpM58は
バチルス PB92 プロテアーゼをコードする遺伝子を有
している。
る。けれどもバチルス PB92のクローニングされて得ら
れたセリン プロテアーゼは、プロテアーゼ ネガティ
ブのB.スブチリス株DB104に対するpM58及びpUB110への
導入〔R.Doi,J.Bacteriol.160（1984）442−444）によ
る形質転換及び細胞外産生プロテアーゼの分析によっ
て、既知のセリンプロテアーゼ類（B.スブチリスのスブ
チリシン、カールスベルヒ スブチリシン）から区別さ
れた。得られた形質転換体を極小培地（Spizizen et a
l.,前掲文献）（0.02％カザミノ酸、50μg/mlヒスチジ
ン及び20μg/mlネオマイシン含有）中で生育させた。24
時間後に試料を採り、遠心分離し、予備処理を施すこと
なくヒスチジン/MOPSゲル〔75mM KOH、40mMヒスチジ
ン、100mM MOPS（３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパン
スルホン酸）、pH7.5及び５％ポリアクリルアミド含
有〕上で分析した。電気泳動用緩衝液は40mMヒスチジ
ン、100mM MOPS、pH6.6を含有していた。試料を陰極方
向で泳動させた。プロテアーゼ バンドをフィルム〔Ag
fa Pan 100 Professional film〕の使用で検定した〔Zu
idweg et al.,Biotechnol.and Bioengin.14（1972）685
−714参照〕。結果を第１図に示す。図示の通りpM58は
バチルス PB92 プロテアーゼをコードする遺伝子を有
している。
例３ バチルス PB92 セリン プロテアーゼ遺伝子の
配列 サンガー法〔Sangar,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74（19
77）6463〕によってpM58のBal I−Hpa I断片の全配列を
決定した。pM58の制限断片（第２図参照）をファージM1
3ベクター即ちmp10、mp11及びmp18〔Messing et al.,Nu
cleic Acids Res.9（1981）309−321〕の中でクローニ
ングした。pM58断片の挿入物（複数）をプラーク夾雑法
によってスクリーニングした。配列形成の後に遺伝子上
で規則的間隔を保って位置する10個のオリゴヌクレオチ
ドが設けられ、配列形成が繰返され、第３図に示される
通りに配列が確定された。
配列 サンガー法〔Sangar,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74（19
77）6463〕によってpM58のBal I−Hpa I断片の全配列を
決定した。pM58の制限断片（第２図参照）をファージM1
3ベクター即ちmp10、mp11及びmp18〔Messing et al.,Nu
cleic Acids Res.9（1981）309−321〕の中でクローニ
ングした。pM58断片の挿入物（複数）をプラーク夾雑法
によってスクリーニングした。配列形成の後に遺伝子上
で規則的間隔を保って位置する10個のオリゴヌクレオチ
ドが設けられ、配列形成が繰返され、第３図に示される
通りに配列が確定された。
例４ プラスミドpMAX−４を有するセリン プロテアー
ゼ遺伝子の構成 構成体プラスミドpUCN−710（第4A図参照）は、pUB11
0のTag I及びPvu IIによる切断の結果生成された。ネオ
マイシン耐性を与える遺伝子を有する断片を低融点性の
アガロース上で純化してからクレナウ（Klenow）ポリメ
ラーゼ及びNTP'sを用いて未満を平滑化した〔Maniatis,
Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring
Harbor 1982〕。プラスミドpUC7〔Vieira et al.,Gene
19（1982）259−268〕をSal Iの使用で直線状にしてか
ら上記のように末端平滑化した。双方の断片をT4リガー
ゼの使用で連結（Maniatis）してから大腸菌（E.coli）
JM103へ導入して形質転換させた。2xTY平板培地（1.6％
w/v バクトートリプトン、１％w/v酵母抽出物、0.5％N
aCl、50μg/mlアムピシリン及び10μg/mlネオマイシン
含有）上で選択を行なった。得られたプラスミドをpUCN
−710と命名し、これをBamH Iで切断した。プラスミドp
E194〔Jordanescu,Plasmid 1（1978）468−479〕をBcl
Iで切断した。双方の消化処理から得られた断片（複
数）をT4リガーゼによって連結してからB.スブチリス1A
40へ導入して形質転換させた。極小平板培地〔20μg/ml
のネオマイシン含有（例１参照）〕上で選択を行なっ
た。得られたプラスミドpE194−neo（第4A図）はネオマ
イシン耐性遺伝子を有する。
ゼ遺伝子の構成 構成体プラスミドpUCN−710（第4A図参照）は、pUB11
0のTag I及びPvu IIによる切断の結果生成された。ネオ
マイシン耐性を与える遺伝子を有する断片を低融点性の
アガロース上で純化してからクレナウ（Klenow）ポリメ
ラーゼ及びNTP'sを用いて未満を平滑化した〔Maniatis,
Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring
Harbor 1982〕。プラスミドpUC7〔Vieira et al.,Gene
19（1982）259−268〕をSal Iの使用で直線状にしてか
ら上記のように末端平滑化した。双方の断片をT4リガー
ゼの使用で連結（Maniatis）してから大腸菌（E.coli）
JM103へ導入して形質転換させた。2xTY平板培地（1.6％
w/v バクトートリプトン、１％w/v酵母抽出物、0.5％N
aCl、50μg/mlアムピシリン及び10μg/mlネオマイシン
含有）上で選択を行なった。得られたプラスミドをpUCN
−710と命名し、これをBamH Iで切断した。プラスミドp
E194〔Jordanescu,Plasmid 1（1978）468−479〕をBcl
Iで切断した。双方の消化処理から得られた断片（複
数）をT4リガーゼによって連結してからB.スブチリス1A
40へ導入して形質転換させた。極小平板培地〔20μg/ml
のネオマイシン含有（例１参照）〕上で選択を行なっ
た。得られたプラスミドpE194−neo（第4A図）はネオマ
イシン耐性遺伝子を有する。
組込みベクターpE194−neoの中のプロテアーゼ遺伝子
のサブクローニングを下記のように遂行した:pM58（例
１参照）をHpa I及びBal I並びにBgl IIを用いて切断し
た。プラスミドpE194−neoをHpa Iによって切断した。
これらの断片をT4リガーゼの使用で連結してからB.スブ
チリス1A40株へ導入して形質転換させた。この転換体
を、ネオマイシン耐性及びプロテアーゼ増産性〔カゼイ
ン開裂生成物沈積（円輪形成、例１参照）〕にもとづい
て選択した。プラスミドpMAX−４が得られ、その構造は
制限酵素分析によって確認された（第4B図参照）。
のサブクローニングを下記のように遂行した:pM58（例
１参照）をHpa I及びBal I並びにBgl IIを用いて切断し
た。プラスミドpE194−neoをHpa Iによって切断した。
これらの断片をT4リガーゼの使用で連結してからB.スブ
チリス1A40株へ導入して形質転換させた。この転換体
を、ネオマイシン耐性及びプロテアーゼ増産性〔カゼイ
ン開裂生成物沈積（円輪形成、例１参照）〕にもとづい
て選択した。プラスミドpMAX−４が得られ、その構造は
制限酵素分析によって確認された（第4B図参照）。
例５ pMAX−４によるバチルス属菌株PB92の原形質体の
形質転換 バチルス属菌株PB92を100mlのNBSG−Ｘ培地〔Thorne
et.al.,J.Bacteriol.91（1966）1012−1020〕の中で終
夜生育させた。この細菌培養物を回転機（Sorvall mode
l GSA rotor）中で4500rpmの下に10分間遠心処理した。
0.5Mショ糖、0.02M MgCl2及び0.02M Tris/マレエート、
pH8.0を滅菌水中に含む10mlのアルカリ保持培地（AHM）
の中で１時間30℃に恒温保持し、これに対し0.4mg/mlの
リゾチームを加えた。原形質体をペレット状にし（4500
rpmに10分間遠心処理）、5mlのAHM+pH8.0緩衝液（3.5％
w/v Bacto Penassayブロス及び0.04％w/vアルブミンMe
rieuxを添加されたAHM緩衝液）に再懸濁させて混合して
から前記のようにしてこれをペレット化した。5.0mlの
アルカリ保持培地中に再懸濁させた後に0.5mlのこの原
形質体懸濁物と“１μｇのプラスミドDNAを含む５μｇ
の無機質不含有水”とを混合し、30％w/vポリエチレン
グリコール8000、pH8.0の存在下で２分間恒温保持し
た。AHM+pH8.0緩衝液を用いて1:3に希釈した後に遠心処
理し、得られたペレットを少量（1ml）のAHM+の中に再
懸濁させて２〜３時間恒温保持した。この液の100マイ
ロリットルを新規調製の平板培地〔0.5Mコハク酸ナトリ
ウム/HCl pH8.0、1.5％w/v寒天、0.5％w/vカザミノ酸、
0.5％w/v酵母抽出物、0.031Mリン酸塩緩衝液pH8.0、0.5
％w/vグルコース、0.02M MgCl2及び0.02％w/vアルブミ
ンMerieux含有培地〕上で培養した。該平板培地は選択
のための1000μg/mlのネオマイシンをも含有していた。
少なくとも72時間37℃に恒温保持した後に20μg/mlのネ
オマイシンを含む心臓浸出物添加寒天平板培地上で該コ
ロニーを複製−平板培養した 例６ バチルス属菌株PB92染色体へのpMAX−４の組込み
20μg/mlのネオマイシンを含む心臓抽出物添加平板培地
上で生育させた“pMAX−４を有するバチルス属菌株PB9
2"のコロニーを１μg/mlのネオマイシンを含む100mlの
トリプトン ソーヤブロス（TSB）へ接種してから24時
間37℃に恒温保持した。2mlずつの２個の培養物（細胞
数約109/ml）を、１μg/mlのネオマイシンを含む同一培
地の100mlで希釈し、24時間50℃に恒温保持した。24時
間後に5mlの該培養物（細胞数約109/ml）を上記のよう
に再希釈してから１μg/mlのネオマイシンの存在下に24
時間50℃に恒温保持した。該最後の操作をもう一度繰返
した。次に細胞懸濁物を100倍に希釈し、１μg/mlのネ
オマイシンを含む心臓抽出物（HI）添加寒天（Difco）
平板培地上で培養した。この培養物を16時間50℃に恒温
保持した。ネオマイシン耐性コロニーを単離して１μg/
mlのネオマイシンを含む10mlのTSB培地中で該コロニー
を16時間37℃に培養した。これらの培養物から全DNAを
単離し〔Holmes et al.,Anal.Biochem.114（1981）193
−197〕、アガロースゲル上でのDNAの電気泳動によって
プラスミドの不存在をチェックした。プラスミドDNAが
検出されなかった試料について、全DNAのB.スブチリス1
A40への導入による形質転換によって、再度のチェック
を行なった。B.スブチリス1A40を形質転換させる能力の
ない試料はプラスミド不含有であると考えた。ネオマイ
シン耐性でプラスミド不含有のバチルスPB92由来菌株を
PBT109と命名した。この菌株はその染色体中に組込まれ
たpMAX−４プラスミドのひとつのコピーを有していた。
形質転換 バチルス属菌株PB92を100mlのNBSG−Ｘ培地〔Thorne
et.al.,J.Bacteriol.91（1966）1012−1020〕の中で終
夜生育させた。この細菌培養物を回転機（Sorvall mode
l GSA rotor）中で4500rpmの下に10分間遠心処理した。
0.5Mショ糖、0.02M MgCl2及び0.02M Tris/マレエート、
pH8.0を滅菌水中に含む10mlのアルカリ保持培地（AHM）
の中で１時間30℃に恒温保持し、これに対し0.4mg/mlの
リゾチームを加えた。原形質体をペレット状にし（4500
rpmに10分間遠心処理）、5mlのAHM+pH8.0緩衝液（3.5％
w/v Bacto Penassayブロス及び0.04％w/vアルブミンMe
rieuxを添加されたAHM緩衝液）に再懸濁させて混合して
から前記のようにしてこれをペレット化した。5.0mlの
アルカリ保持培地中に再懸濁させた後に0.5mlのこの原
形質体懸濁物と“１μｇのプラスミドDNAを含む５μｇ
の無機質不含有水”とを混合し、30％w/vポリエチレン
グリコール8000、pH8.0の存在下で２分間恒温保持し
た。AHM+pH8.0緩衝液を用いて1:3に希釈した後に遠心処
理し、得られたペレットを少量（1ml）のAHM+の中に再
懸濁させて２〜３時間恒温保持した。この液の100マイ
ロリットルを新規調製の平板培地〔0.5Mコハク酸ナトリ
ウム/HCl pH8.0、1.5％w/v寒天、0.5％w/vカザミノ酸、
0.5％w/v酵母抽出物、0.031Mリン酸塩緩衝液pH8.0、0.5
％w/vグルコース、0.02M MgCl2及び0.02％w/vアルブミ
ンMerieux含有培地〕上で培養した。該平板培地は選択
のための1000μg/mlのネオマイシンをも含有していた。
少なくとも72時間37℃に恒温保持した後に20μg/mlのネ
オマイシンを含む心臓浸出物添加寒天平板培地上で該コ
ロニーを複製−平板培養した 例６ バチルス属菌株PB92染色体へのpMAX−４の組込み
20μg/mlのネオマイシンを含む心臓抽出物添加平板培地
上で生育させた“pMAX−４を有するバチルス属菌株PB9
2"のコロニーを１μg/mlのネオマイシンを含む100mlの
トリプトン ソーヤブロス（TSB）へ接種してから24時
間37℃に恒温保持した。2mlずつの２個の培養物（細胞
数約109/ml）を、１μg/mlのネオマイシンを含む同一培
地の100mlで希釈し、24時間50℃に恒温保持した。24時
間後に5mlの該培養物（細胞数約109/ml）を上記のよう
に再希釈してから１μg/mlのネオマイシンの存在下に24
時間50℃に恒温保持した。該最後の操作をもう一度繰返
した。次に細胞懸濁物を100倍に希釈し、１μg/mlのネ
オマイシンを含む心臓抽出物（HI）添加寒天（Difco）
平板培地上で培養した。この培養物を16時間50℃に恒温
保持した。ネオマイシン耐性コロニーを単離して１μg/
mlのネオマイシンを含む10mlのTSB培地中で該コロニー
を16時間37℃に培養した。これらの培養物から全DNAを
単離し〔Holmes et al.,Anal.Biochem.114（1981）193
−197〕、アガロースゲル上でのDNAの電気泳動によって
プラスミドの不存在をチェックした。プラスミドDNAが
検出されなかった試料について、全DNAのB.スブチリス1
A40への導入による形質転換によって、再度のチェック
を行なった。B.スブチリス1A40を形質転換させる能力の
ない試料はプラスミド不含有であると考えた。ネオマイ
シン耐性でプラスミド不含有のバチルスPB92由来菌株を
PBT109と命名した。この菌株はその染色体中に組込まれ
たpMAX−４プラスミドのひとつのコピーを有していた。
菌株PBT109への組込みは、プラスミド配列によって分
別された染色体上の２個の縦に並んで位置するプロテア
ーゼ遺伝子について生じた相同的再結合にもとづくいわ
ゆるキャムベル型（Campbell−type）機構によって行な
われたのである。菌株PBT109の該遺伝学的編成は本件と
同時出願された係属中のEPA− 号明
細書中に示される通りに確認されており、本明細書中に
も引用されている。
別された染色体上の２個の縦に並んで位置するプロテア
ーゼ遺伝子について生じた相同的再結合にもとづくいわ
ゆるキャムベル型（Campbell−type）機構によって行な
われたのである。菌株PBT109の該遺伝学的編成は本件と
同時出願された係属中のEPA− 号明
細書中に示される通りに確認されており、本明細書中に
も引用されている。
例７ 形質転換菌株によるプロテアーゼ製造 形質転換菌株によるプロテアーゼ製造は米国特許No.R
e.30602明細書記載の製造用培地の100mlを有する500ml
容振盪フラスコに対する細胞数約109/ml含有のTSB培養
物（0.2ml）の添加によって試験的に行なわれた。B.ス
ブチリス菌株についてのテストの場合にはpHを7.0に調
節した。菌株DB104（pUB110）、DB104（pMAX−４）、PB
92（pMAX−４）については、濃度20μg/ml、DBT109につ
いては濃度１μg/mlにおいてネオマイシンを添加した。
これらの細胞系統に関する相対的なプロテアーゼ産生率
を第１表に示す。
e.30602明細書記載の製造用培地の100mlを有する500ml
容振盪フラスコに対する細胞数約109/ml含有のTSB培養
物（0.2ml）の添加によって試験的に行なわれた。B.ス
ブチリス菌株についてのテストの場合にはpHを7.0に調
節した。菌株DB104（pUB110）、DB104（pMAX−４）、PB
92（pMAX−４）については、濃度20μg/ml、DBT109につ
いては濃度１μg/mlにおいてネオマイシンを添加した。
これらの細胞系統に関する相対的なプロテアーゼ産生率
を第１表に示す。
〔注〕＊ PMAX−４のみによるプロテアーゼ遺伝子にも
とづくプロテアーゼ産生率を測定するためにこのプラス
ミドを細胞外プロテアーゼ陰性B.スブチリスDB104株
〔R.Doi,J.Bacteriol.160（1984）442−444〕へ導入し
て形質転換〔Spizizen et al.,（1961）前掲文献〕させ
た。（例２参照）。
とづくプロテアーゼ産生率を測定するためにこのプラス
ミドを細胞外プロテアーゼ陰性B.スブチリスDB104株
〔R.Doi,J.Bacteriol.160（1984）442−444〕へ導入し
て形質転換〔Spizizen et al.,（1961）前掲文献〕させ
た。（例２参照）。
＊＊ 基質としてジメチル カゼインを用いてプロテ
アーゼ活性を試験した〔Lin et al.,J.Biol.Chem.244
（1969）789−793参照〕。
アーゼ活性を試験した〔Lin et al.,J.Biol.Chem.244
（1969）789−793参照〕。
更にスケールを大きくして（10）発酵させるとバチ
ルスPB92（pMAX−４）は、発酵培地にネオマイシンを加
えなかった場合には不安定性を示してPBT109を使用した
場合よりもプロテアーゼ産生率を減じた。
ルスPB92（pMAX−４）は、発酵培地にネオマイシンを加
えなかった場合には不安定性を示してPBT109を使用した
場合よりもプロテアーゼ産生率を減じた。
産業上の利用可能性 本発明による上記の成績から、工業的バチルス属菌株
の染色体の中へセリンプロテアーゼをコードする同種起
源又は異種起源の遺伝子を安定に導入することによって
セリンプロテアーゼ製造のための簡単で効率的な操業方
式が提供されることが明らかである。既にセリンプロテ
アーゼを産生するバチルス属宿主菌株についてセリンプ
ロテアーゼを増加産生させる方式も又提供される。宿主
細胞染色体中へのプラスミド構成体の組込みは、染色体
外プラスミド構成体の存在の場合よりも、製造的発酵に
対してより安定した状況をもたらし、著しく増大したプ
ロテアーゼ産生を達成させる。
の染色体の中へセリンプロテアーゼをコードする同種起
源又は異種起源の遺伝子を安定に導入することによって
セリンプロテアーゼ製造のための簡単で効率的な操業方
式が提供されることが明らかである。既にセリンプロテ
アーゼを産生するバチルス属宿主菌株についてセリンプ
ロテアーゼを増加産生させる方式も又提供される。宿主
細胞染色体中へのプラスミド構成体の組込みは、染色体
外プラスミド構成体の存在の場合よりも、製造的発酵に
対してより安定した状況をもたらし、著しく増大したプ
ロテアーゼ産生を達成させる。
本明細書中に引用された刊行物及び特許出願公報は本
発明が属する分野の技術的レベルを示すものである。各
刊行物及び特許出願公報は本明細書中に引用されるべき
ものと思われる限りすべて本明細書中に記載された。
発明が属する分野の技術的レベルを示すものである。各
刊行物及び特許出願公報は本明細書中に引用されるべき
ものと思われる限りすべて本明細書中に記載された。
本明細書の記載は充分であるし、本発明の範囲から逸
脱しない限り多くの変改が可能であることは当業界の通
常の知識をもつ技術者にとって明らかであろう。
脱しない限り多くの変改が可能であることは当業界の通
常の知識をもつ技術者にとって明らかであろう。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 ファン エーケレン クリスチャン ア ルベルテュス ヘラルデュス オランダ国 エヌエル‐2661 ハーデー ベルグシアンエーク バッハプラーツ 14 (72)発明者 ファン デル ラーン ヨハネス コル ネリス オランダ国 エヌエル‐1062 セーペー アムステルダム イェー ヨングキン トストラート 81‐１ (72)発明者 ミュレネルス レオナルデュス ヨハネ ス ソフィー マリー オランダ国 エヌエル‐5121 エスヴェ ー レイエン エクゼストラート 42 (56)参考文献 特開 昭62−32888（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−501738（ＪＰ，Ａ) 欧州公開205371（ＥＰ，Ａ１) ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．，196（２) 1986 ｐ．228−232 Ｂｉｅｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓ ｅｙｌｅｒ，336（４）1986 ｐ．421− 430 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，133（３) 1978 ｐ．1401−1411 Ｍｏｎ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，189 （1983）ｐ．58−68
Claims (22)
- 【請求項１】転写を指令する場合において、バチルス属
に属する宿主細胞の中で機能する転写調節域及び翻訳開
始域、下記に示されるアミノ酸配列または下記のアミノ
酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加されたアミノ酸配列を有する高アルカリ活
性セリンプロテアーゼをコードするDNA配列、該宿主細
胞内で機能する翻訳終了域及び転写終了域、但し該DNA
配列による発現は該開始域及び終了域の調節制御下にあ
るものであり；並びに少なくとも１個のマーカー遺伝子
及び細菌由来プラスミドの温度感受性の複製起点を有す
ることを特徴とする発現カセット。 - 【請求項２】形質転換されたアルカリ親和性バチルス属
宿主細胞であって、 転写を指令する場合において、形質転換されたバチルス
属に属する宿主細胞の中で機能する転写調節域及び翻訳
開始域、下記のアミノ酸配列または下記のアミノ酸配列
において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
は付加されたアミノ酸配列を有する高アルカリ活性セリ
ンプロテアーゼをコードするDNA配列及び該宿主細胞内
で機能する翻訳及び転写終了調節域、但し該DNA配列に
よる発現は該転写及び翻訳域の調節制御下にあるもので
あり；並びに少なくとも１個のマーカー遺伝子及び細菌
由来プラスミドの温度感受性の複製起点を持つ発現カセ
ットを有し、 アルカリ性pHにおいてフソゲン存在下に、宿主細胞の原
形質体と、該発現カセットを含むDNA構成体とを結合さ
せ、かようにして該DNAを宿主細胞内へ導入して形質転
換された、 ことを特徴とする上記形質転換されたアルカリ親和性バ
チルス属宿主細胞。 - 【請求項３】少なくとも２コピーのDNA配列が細胞の染
色体の中へ組込まれている請求の範囲第２項記載の細
胞。 - 【請求項４】宿主細胞が形質転換された野生型のセリン
プロテアーゼ産生細胞である請求の範囲第２項記載の細
胞。 - 【請求項５】宿主細胞が野生型セリンプロテアーゼ産生
細胞の形質転換された突然変異細胞である請求の範囲第
２項記載の細胞。 - 【請求項６】突然変異細胞がセリンプロテアーゼ非産生
細胞である請求の範囲第５項記載の細胞。 - 【請求項７】高アルカリ活性セリンプロテアーゼがバチ
ルス属新種PB92から得られる請求の範囲第２項記載の細
胞。 - 【請求項８】アルカリ親和性のバチルス属に属する宿主
細胞の中で高アルカリ活性セリンプロテアーゼを産生す
る方法において、 転写を指令する場合の、転写及び翻訳開始調節域；下記
のアミノ酸配列または下記のアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を有する高アルカリ活性セリンプロテアー
ゼをコードするDNA配列；転写及び翻訳終了調節域、但
し該調節域は宿主細胞内で機能するものであり；及び形
質転換された宿主細胞の選択のための選択用マーカー遺
伝子を有する発現カセットを含むDNA構成体をアルカリ
性pHにおいてフソゲン存在下に宿主細胞の原形質体と結
合させることにより、該発現カセットを宿主細胞内へ導
入し；該発現カセットを持つ形質転換宿主細胞を選択条
件下に生育させ、それによって形質転換培養物が“形質
転換され得なかった親細胞”を含有しないようにし；そ
して該形質転換培養物を普通培地中で恒温保持し、かよ
うにして高アルカリ活性セリンプロテアーゼを増大され
た量において産生することを特徴とする方法。 - 【請求項９】宿主細胞が野生型セリンプロテアーゼ産生
細胞である請求の範囲第８項記載の方法。 - 【請求項１０】宿主細胞が野生型セリンプロテアーゼ産
生細胞の突然変異型のものである請求の範囲第８項記載
の方法。 - 【請求項１１】突然変異型がセリンプロテアーゼ非産生
細胞である請求の範囲第10項記載の方法。 - 【請求項１２】アルカリ親和性菌株がバチルス属新種PB
92である請求の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１３】アルカリ親和性バチルス属細胞を形質転
換させる方法において、 バチルス属細胞をアルカリ性培地中で約20〜約37℃にお
いてリゾチームを用いる予備処理に付して原形質体を形
成させ； 原形質体をリゾチームから分別し； フソゲンの存在下に約20〜約37℃において該原形質体と
DNA構成体とを結合させ（該DNA構成体は、転写を指令す
る場合に、転写及び翻訳開始調節域；高アルカリ活性セ
リンプロテアーゼをコードするDNA配列；宿主細胞内で
機能するものである転写及び翻訳終了調節域を有す
る）； フソゲンを希釈してバチルス属細胞を再生させ；そして 該再生バチルス属細胞を選択条件下に生育させることを
特徴とする方法。 - 【請求項１４】アルカリ親和性バチルス属菌株宿主細胞
の中で高アルカリ活性セリンプロテアーゼを増大された
量で産生する方法において、 アルカリ性pHにおいてフソゲン存在下に宿主細胞の原形
質体と、高アルカリ活性セリンプロテアーゼをコードす
るDNA配列を有するプラスミド構成体と、宿主細胞内で
機能する複製系と、及び選択用マーカー遺伝子とを結合
させ、かようにして該DNAを宿主細胞内へ導入し； 該DNAを有する宿主細胞を選択し；そして 該高アルカリ活性セリンプロテアーゼの合成に適する条
件下で宿主細胞を生育させることを特徴とする方法。 - 【請求項１５】宿主細胞がバチルス属新種PB92である請
求の範囲第14項記載の方法。 - 【請求項１６】少なくとも１コピーのDNAが宿主細胞内
へ導入される請求の範囲第14項または第15項に記載の方
法。 - 【請求項１７】下記に示されるアミノ酸配列または下記
のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、バ
チルス属新種PB92由来の高アルカリ活性セリンプロテア
ーゼをコードするDNA配列。 - 【請求項１８】細胞が下記諸工程を包含する方法によっ
て得られたことを特徴とする形質転換されたアルカリ親
和性バチルス属宿主細胞： バチルス属宿主細胞内で発現され得る高アルカリ活性セ
リンプロテアーゼをコードする遺伝子を有するDNA断片
を単離し； 該DNA断片と直線型ベクターのDNAと結合させて該遺伝子
と選択用マーカーとを有するベクターを生成させ； 宿主細胞から調製された原形質体と該ベクターとをフソ
ゲンの存在下にアルカリ性pHにおいて結合させ、それに
よって該遺伝子を宿主細胞中へ導入して宿主細胞の染色
体の中へ組込み；そして 該遺伝子を安定して有する宿主細胞を選択する。 - 【請求項１９】バチルス属宿主細胞がバチルス属新種PB
92である請求の範囲第18項記載の形質転換されたバチル
ス属宿主細胞。 - 【請求項２０】ベクターがpMAX−４である請求の範囲第
18項記載の形質転換されたバチルス属宿主細胞。 - 【請求項２１】7.6kbのサイズの、バチルス属新種PB92
内に含まれるバチルスPB92タンパク分解酵素をコードす
る遺伝子、pE194由来の温度感受性複製オリジン及びネ
オマイシン耐性遺伝子を含む、プラスミドpMAX−４。 - 【請求項２２】バチルス属PB92の染色体内にプラスミド
pMAX−４を組み込んだバチルス属に属する菌株PBT109。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP87200358.7 | 1987-02-27 | ||
| EP87200358 | 1987-02-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01502876A JPH01502876A (ja) | 1989-10-05 |
| JP3026567B2 true JP3026567B2 (ja) | 2000-03-27 |
Family
ID=8197584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63502472A Expired - Lifetime JP3026567B2 (ja) | 1987-02-27 | 1988-02-26 | 分子のクローニング及びタンパク分解酵素をコードする遺伝子の発現 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5217878A (ja) |
| JP (1) | JP3026567B2 (ja) |
| KR (1) | KR0127560B1 (ja) |
| CN (1) | CN88101681A (ja) |
| AT (2) | ATE181110T1 (ja) |
| AU (1) | AU620026B2 (ja) |
| BG (1) | BG49049A3 (ja) |
| BR (1) | BR8805647A (ja) |
| CA (1) | CA1339100C (ja) |
| DE (2) | DE3856339T2 (ja) |
| DK (2) | DK175738B1 (ja) |
| FI (3) | FI105483B (ja) |
| HU (1) | HU213220B (ja) |
| LT (1) | LT4000B (ja) |
| LV (1) | LV10307B (ja) |
| NO (1) | NO884423D0 (ja) |
| PT (1) | PT86864B (ja) |
| RU (1) | RU2023723C1 (ja) |
| WO (1) | WO1988006624A2 (ja) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU213220B (en) * | 1987-02-27 | 1997-03-28 | Gist Brocades Nv | Method for enhanced production of serine protease in transformed bacillus cells and production of the transformed cells |
| DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| GB2214508A (en) * | 1988-01-27 | 1989-09-06 | Bayer Ag | Plasmid vector for the efficient expression of foreign genes fused with newly conceived transcriptional and translational signal sequences. |
| US6287841B1 (en) * | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
| HUT53154A (en) * | 1988-05-05 | 1990-09-28 | New York Health Res Inst | Process for producing protease-defective gram-positive bacteria and utilizing them as host-organizmus for producing recombinant products |
| US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
| JP3046344B2 (ja) * | 1990-10-24 | 2000-05-29 | 塩野義製薬株式会社 | 新規プロテアーゼ |
| US5482849A (en) * | 1990-12-21 | 1996-01-09 | Novo Nordisk A/S | Subtilisin mutants |
| DK58391D0 (da) * | 1991-04-03 | 1991-04-03 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte proteaser |
| DE69333463D1 (de) * | 1992-05-18 | 2004-05-06 | Genencor Int | Alkalische Proteasen produzierende Bakterien, und Verfahren zur Herstellung dieser alkalischen Proteasen |
| US6436690B1 (en) * | 1993-09-15 | 2002-08-20 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted |
| US6440717B1 (en) * | 1993-09-15 | 2002-08-27 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6599730B1 (en) * | 1994-05-02 | 2003-07-29 | Procter & Gamble Company | Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US5831004A (en) * | 1994-10-27 | 1998-11-03 | Affymax Technologies N.V. | Inhibitors of metalloproteases, pharmaceutical compositions comprising same and methods of their use |
| US5646044A (en) * | 1995-03-02 | 1997-07-08 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Expression systems for the production of target proteins in bacillus |
| US6455295B1 (en) * | 1995-03-08 | 2002-09-24 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| IL117350A0 (en) * | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6475765B1 (en) * | 1995-03-09 | 2002-11-05 | Procter & Gamble Company | Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| CA2270180C (en) | 1996-11-04 | 2011-01-11 | Novo Nordisk A/S | Subtilase variants and compositions |
| US5766871A (en) * | 1996-11-27 | 1998-06-16 | Food Industry Research And Development Institute | Screening and characterization of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase |
| US6485957B1 (en) | 1999-04-30 | 2002-11-26 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | DNA encoding the human serine protease EOS |
| US6420157B1 (en) * | 1999-04-30 | 2002-07-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Zymogen activation system |
| US6458564B1 (en) * | 1999-08-31 | 2002-10-01 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | DNA encoding the human serine protease T |
| US6426199B1 (en) | 1999-08-31 | 2002-07-30 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Dna |
| CN1312370A (zh) * | 2000-03-07 | 2001-09-12 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人atp依赖的丝氨酸蛋白水解酶11和编码这种多肽的多核苷酸 |
| US6777218B1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
| EP1287123B1 (en) * | 2000-04-03 | 2011-03-02 | Maxygen, Inc. | Subtilisin variant |
| AU2003228393A1 (en) | 2002-03-29 | 2003-10-13 | Genencor International, Inc. | Ehanced protein expression in bacillus |
| US7511005B2 (en) * | 2003-05-12 | 2009-03-31 | Danisco Us Inc., Genencor Division | Lipolytic enzyme elip |
| EP1625202A4 (en) | 2003-05-12 | 2010-10-20 | Genencor Int | NEW LIPOLYTIC ENZYME LIP1 |
| WO2004101759A2 (en) * | 2003-05-12 | 2004-11-25 | Genencor International, Inc. | Novel lipolytic enzyme lip2 |
| WO2005032259A1 (en) | 2003-09-19 | 2005-04-14 | Ics Holdings, Inc. | Preparation of an edible product from dough |
| US7985569B2 (en) | 2003-11-19 | 2011-07-26 | Danisco Us Inc. | Cellulomonas 69B4 serine protease variants |
| BRPI0416797A (pt) * | 2003-11-19 | 2007-04-17 | Genencor Int | serina proteases, ácidos nucléicos codificando enzimas de serina e vetores e células hospedeiras incorporando as mesmas |
| CA2562208A1 (en) * | 2004-04-09 | 2006-03-30 | Genencor International, Inc. | Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus |
| DK1766002T3 (en) * | 2004-06-21 | 2015-12-07 | Novozymes As | Stable maintenance of multiple copies of the at least two ORF in the same orientation |
| US7202074B2 (en) * | 2004-07-22 | 2007-04-10 | University Of Chile | Protein and nucleic acid sequence encoding a KRILL-derived cold adapted trypsin-like activity enzyme |
| JP5867984B2 (ja) | 2007-03-12 | 2016-02-24 | ダニスコ・ユーエス・インク | 修飾プロテアーゼ |
| DK2152732T3 (da) | 2007-05-10 | 2012-06-04 | Danisco Us Inc | Modificeret sekretionssystem til at øge ekspression af polypeptider i bakterier |
| EP2173873B1 (en) | 2007-08-06 | 2015-11-18 | University of Chile | Protein and dna sequence encoding a cold adapted subtilisin-like activity |
| AU2008348270A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-07-30 | Danisco Us Inc. | Enhanced protein production in bacillus |
| FI123122B (fi) | 2009-02-16 | 2012-11-15 | Optogear Oy | Laitteisto lasimateriaalin valmistamiseksi |
| CN102414321A (zh) | 2009-04-24 | 2012-04-11 | 丹尼斯科美国公司 | 具有修饰的原区的蛋白酶 |
| AR076941A1 (es) | 2009-06-11 | 2011-07-20 | Danisco Us Inc | Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina |
| MX350391B (es) * | 2011-09-22 | 2017-09-06 | Novozymes As | Polipeptidos que poseen actividad proteasa y polinucleotidos que los codifican. |
| CN103013960A (zh) * | 2012-12-21 | 2013-04-03 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌 |
| MX2016008595A (es) | 2013-12-31 | 2016-10-28 | Danisco Us Inc | Expresion mejorada de proteínas. |
| WO2016099917A1 (en) | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Danisco Us Inc | Enhanced protein expression |
| EP3234149A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-10-25 | Danisco US Inc. | Enhanced protein expression |
| EP3619309B1 (en) * | 2017-05-05 | 2024-04-10 | Bioecho Life Sciences GmbH | Rapid purification of high quality nucleic acids from biological samples |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1234445A (ja) | 1967-10-03 | 1971-06-03 | ||
| GB1205403A (en) | 1967-11-10 | 1970-09-16 | Novo Terapeutisk Labor As | Preparation of proteolytic enzyme preparations |
| GB1519148A (en) * | 1974-11-19 | 1978-07-26 | Gist Brocades Nv | Compositions of matter |
| FR2482980A1 (fr) | 1980-05-20 | 1981-11-27 | Biomerieux Sa | Procede d'obtention de preparations de toxoplasmes pour le diagnostic de la toxoplasmose, et preparations ainsi obtenues |
| JPS6055118B2 (ja) | 1982-02-08 | 1985-12-03 | 昭和電工株式会社 | 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法 |
| EP0108301B2 (en) * | 1982-11-01 | 1993-09-01 | SOLVAY ENZYMES, INC. (a Delaware corporation) | Method of heterologous cloning of gene in bacillus microorganism |
| NZ208612A (en) * | 1983-06-24 | 1991-09-25 | Genentech Inc | Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations |
| NZ208806A (en) * | 1983-07-06 | 1988-07-28 | Gist Brocades Nv | Genetic engineering of industrial microorganism species: readily-transformable host used as intermediate in transfer of dna to the industrial species; plasmids |
| EP0138075A1 (en) * | 1983-09-16 | 1985-04-24 | Synergen Associates, Inc. | A method for the generation and detection of enzyme variants with enhanced themostability and activity |
| US4828994A (en) * | 1984-09-21 | 1989-05-09 | Genex Corporation | Bacillus strains with reduced extracellular protease levels |
| FR2582316B1 (fr) * | 1985-05-22 | 1988-12-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs d'expression de l'a-amylase dans bacillus subtilis, souches obtenues et procede de preparation d'a-amylase |
| DE3527913A1 (de) * | 1985-08-03 | 1987-02-12 | Henkel Kgaa | Alkalische protease, verfahren zur herstellung von hybridvektoren und genetisch transformierte mikroorganismen |
| WO1987004461A1 (en) * | 1986-01-15 | 1987-07-30 | Amgen | THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF |
| ES2068181T3 (es) * | 1986-04-30 | 1995-04-16 | Genencor Int | Mutantes de la carbonil hidrolasa no humana, secuencias de adn y vectores que codifican las mismas y huespedes transformados con dichos vectores. |
| HU213220B (en) * | 1987-02-27 | 1997-03-28 | Gist Brocades Nv | Method for enhanced production of serine protease in transformed bacillus cells and production of the transformed cells |
| EP0479396B1 (en) * | 1987-02-27 | 1999-06-09 | Genencor International, Inc. | Transformation of alkalophilic bacillus strains |
-
1988
- 1988-02-26 HU HU881832A patent/HU213220B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-02-26 PT PT86864A patent/PT86864B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-02-26 WO PCT/NL1988/000007 patent/WO1988006624A2/en active IP Right Grant
- 1988-02-26 AU AU13980/88A patent/AU620026B2/en not_active Expired
- 1988-02-26 KR KR1019880701347A patent/KR0127560B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-02-26 JP JP63502472A patent/JP3026567B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-26 BR BR888805647A patent/BR8805647A/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-02-27 CN CN198888101681A patent/CN88101681A/zh active Pending
- 1988-02-29 DE DE3856339T patent/DE3856339T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-29 CA CA000560126A patent/CA1339100C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-29 US US07/162,184 patent/US5217878A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-29 AT AT91203297T patent/ATE181110T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-29 AT AT88200377T patent/ATE180016T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-29 DE DE3856331T patent/DE3856331T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-05 NO NO884423A patent/NO884423D0/no unknown
- 1988-10-24 FI FI884904A patent/FI105483B/fi active IP Right Grant
- 1988-10-25 BG BG85831A patent/BG49049A3/xx unknown
- 1988-10-26 DK DK198805939A patent/DK175738B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-10-26 RU SU884356848A patent/RU2023723C1/ru active
-
1992
- 1992-11-27 FI FI925413A patent/FI106726B/fi active
-
1993
- 1993-12-29 LV LVP-93-1390A patent/LV10307B/en unknown
-
1994
- 1994-01-28 LT LTIP1820A patent/LT4000B/lt not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-05-15 FI FI20001152A patent/FI119028B/fi not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-08-20 DK DK200401262A patent/DK175852B1/da not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｂｉｅｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，３３６（４）１９８６ ｐ．４２１−４３０ |
| ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．，１９６（２）１９８６ ｐ．２２８−２３２ |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３３（３）１９７８ ｐ．１４０１−１４１１ |
| Ｍｏｎ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１８９（１９８３）ｐ．５８−６８ |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3026567B2 (ja) | 分子のクローニング及びタンパク分解酵素をコードする遺伝子の発現 | |
| EP0283075B1 (en) | Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes | |
| US5733723A (en) | Stable gene amplification in chromosomal DNA of prokaryotic microorganisms | |
| JP4571304B2 (ja) | バチルス細胞内でのポリペプチドの製法 | |
| JP2590247B2 (ja) | スブチリシンアナログ | |
| JP2001514529A (ja) | プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸 | |
| EP0817856A1 (en) | Introduction of dna into bacillus strains by conjugation | |
| JP3490435B2 (ja) | 突然変異プロテアーゼの効率的生産 | |
| JP2501779B2 (ja) | アルカリプロテア―ゼの製造方法 | |
| EP0303668A1 (en) | Stable expression vectors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080128 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090128 Year of fee payment: 9 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090128 Year of fee payment: 9 |