FI105481B - Uudet proteolyyttiset entsyymit ja niiden käyttö pesuaineissa - Google Patents

Description

105481

Uudet proteolyyttiset entsyymit ja niiden käyttö pesuaineissa -

Nya proteolytiska enzymer och deras användning i tvättmedel Tämä keksintö koskee uusia proteolyyttisiä entsyymejä, joilla on parannetut ominaisuudet käytettäväksi pesuaineissa. Näihin ominaisuuksiin kuuluvat parannettu tahranpoistokyky pyykinpesuainekoostumuksissa, parannettu stabiliteetti pyykinpesuaineissa varastoinnin jälkeen ja parannettu stabiliteetti pesuaineista valmistetuissa pesuliuoksissa (suds).

Entsymaattisten lisäaineiden, erityisesti proteolyyttisten entsyymien käyttöä pesuainekoostumuksissa, mikä tekee mahdolliseksi proteiiniperustaisten tahrojen poistamisen, on laajasti dokumentoitu. Katso esimerkiksi julkaistuja eurooppalaisia patenttihakemuksia (EP-A-) 0220921 ja 0232269, US-patentteja nro 4,480,037 ja vastaavasti 30,603 ja artikkelia "Production of Microbial Enzymes", Microbial Technology, voi. 1 (1979) 281-311, Academic Press.

Pesuainekoostumukset voivat olla jauheena, nesteenä tai tahnana. Ne sisältävät yhden tai useamman anionisen, ionitto-man, kationisen, kahtaisionisen tai amfoteerisen yhdisteen pesuaineaktiivisena aineena. Tällaisia koostumuksia on ku- • · · vattu laajasti julkaisussa "Surface Active Agents", Voi. II, Schwartz, Perry ja Berch, Interscience Publishers (1958). Edelleen ne voivat sisältää metalli-ionikompleksin muodosta-via aineita, stabiloivia yhdisteitä, hajusteyhdisteitä ja « · · · eräissä tapauksissa hapettavia aineita, joita tavallisesti • « · I. kutsutaan valkaisuaineiksi. Pesuainekoostumuksia käytetään • · · ’ ’ kovien pintojen puhdistukseen, WC:n puhdistukseen, astianpe suun (joko automaattiseen tai käsin tapahtuvaan) ja pyykinpesuun.

• » 1 : Pyykinpesuaineet jaetaan tavallisesti kahteen päätyyppiin, nesteisiin ja jauheisiin. Nestemäisillä pyykinpesuaineilla .···' pinta-aktiivisten aineiden konsentraatiot ovat korkeita, • · · • · « 1 1 2 105481 pH on neutraalista suhteellisen alkaliseen ja yleensä ne eivät sisällä valkaisuaineita. Jauhemaiset pesuaineet ovat enimmäkseen erittäin aikalisiä (saippuaveden pH 9-11), ne sisältävät metalli-ionikompleksin muodostavia aineita, kuten natriumtripolyfosfaattia, ja riippuen maiden, joissa niitä myydään, pesutavoista ne voivat sisältää tai olla sisältämättä valkaisuaineita.

Pesuainekoostumuksissa yleisesti käytetyt entsyymit lisätään nestemäiseen suspensioon, sooli- tai granulaattimuotoon. Esimerkiksi jauhemaisissa pesuaineissa proteolyyttisiä entsyymejä käytetään yleensä kapseloidussa muodossa, kuten rakeina (prills) (esim. Maxatase® ja Maxacal®) tai granu-laatteina (esim. Savinase® ja Alcalase®). Maxatase'a ja Maxacal' ia markkinoi International Bio-Synthetics B.v. (Rijswijk, Alankomaat), Savinase'a ja Alcalase'a NOVO Industri A/S (Bagsvaerd, Tanska). Nestemäisissä pyykinpesuaineissa entsyymit ovat enimmäkseen liuoksessa.

Proteolyyttisten entsyymien yhdistäminen pesuainekoostumuk-siin on yleensä vaikeata. Niiden tulee olla pysyviä ja aktiivisia käytössä, esimerkiksi poistettaessa proteiinipitoi-sia tahroja tekstiileistä pesussa, joka suoritetaan lämpöti- • · · ·* loissa noin 10 °C - yli 60 °C. Lisäksi niiden täytyy olla :T: pysyviä pitkiä aikoja pesuainetuotetta varastoitaessa. Näin ollen entsyymien tulee olla pysyviä ja toimia metallikomp-leksin muodostavien aineiden, pinta-aktiivisten aineiden, *M· .·;·. erittäin alkalisten aineiden, eräissä tapauksissa valkaisu- • · · aineiden läsnäollessa ja korotetussa lämpötilassa. Koska ei • · · ole olemassa universaaleja pyykinpesuaineita eikä universaaleja pesuolosuhteita (pH, lämpötila, pesuainekonsentraatio (sud concentration), veden kovuus), joita käytettäisiin kaikkialla maailmassa, vaatimukset entsyymien suhteen voivat ·.* ' vaihdella riippuen pesuainetyypistä, jossa niitä käytetään, ja pesuolosuhteista.

• * • ♦ · * · » ·

Ml • · · 3 105481

Olosuhteet, jotka vaikuttavat ensyymien stabiliteettiin jauhemaisissa pesuaineissa, eivät yleensä ole optimaaliset. Esimerkiksi varastoinnin aikana jauhemaisten pesuaineiden entsyymivalmisteissa, siitä huolimatta, että entsyymi näennäisesti fysikaalisesti erotetaan pesuainematriisista kapseloimalla entsyymi, pesuaineen hapettavat aineet vaikuttavat proteaasiin ja alentavat sen aktiivisuutta. Toinen syy entsyymin pysymättömyyteen jauhemaisissa pesuaineissa varastoinnin aikana on itsehajoaminen, erityisesti suhteellisen kosteuden ollessa korkea.

Lisäksi hapettavilla aineilla, joita usein käytetään jauhemaisissa pesuaineissa, on merkittävänä haittana pyykinpesun aikana tahranpoistossa sellainen vaikutus, että ne kiinnittävät proteiinipitoiset tahrat kuituun. Lisäksi nämä hapettavat aineet ja muut pesuainekomponentit, kuten metallikomp-leksin muodostavat aineet, alentavat proteaasin tehokkuutta tahranpoistossa myös pesuprosessin kuluessa.

Nestemäisissä pesuaineissa on todettu vaikena ongelmana entsyymien nopea inaktivoituminen, erityisesti korotetuissa lämpötiloissa. Kun entsyymejä käytetään pesuainetuotteessa liuoksessa, tämä inaktivoituminen tapahtuu jo pesuaineessa ; normaalien varastointiolosuhteiden aikana ja alentaa huomat- tavasti entsyymien aktiivisuutta ennen tuotteen varsinaista käyttöä. Erityisesti anioniset pinta-aktiiviset aineet, ku- • .:. ten alkyylisulfaatit, yhdessä veden ja muiden saippua-ainek- » « · * .·;·. sien kanssa (builders) kanssa pyrkivät denaturoimaan entsyy- • · · - · • · min irreversiibelisti ja tekemään sen inaktiiviseksi tai I I I j « · « .

alttiiksi proteolyyttiselle degradaatiolle.

Osittaisia ratkaisuja stabiliteettiongelmiin, jotka koskevat nestemäisten pesuaineiden entsyymejä, löytyy nestemäisen pe-’.·’ : suainekoostumuksen sovellutuksista, kuten stabiloivien ai- neiden, jotka alentavat entsyymien inaktivoitumista, käytös-.·’·! tä. Katso EP-A-0126505 ja EP-A-0199405, US-patentti nro 4,318,818 ja GB-patenttihakemus nro 2178055A.

» · 4 105481

Toisenlainen yritys entsyymien stabiliteetin takaamiseksi nestemäisissä pesuaineissa, on kuvattu julkaisussa EP-A-0238216, jossa entsyymimolekyylit ja epäsuotuisasti vaikuttava nestemäinen pesuainematriisi on fysikaalisesti erotettu käyttäen formulointitekniikkaa. Jauhemaisissa pesuaineissa vaihtoehtoisia kapselointeja on esitetty, katso esimerkiksi EP-A-0170360.

Edellä on esitetty olosuhteet, jotka proteolyyttisillä pesuaine-entsyymeillä tulisi olla optimaalisen toiminnan aikaansaamiseksi, sekä tavallisesti saatavilla olevien entsyymien asettamat rajoitukset käytettäväksi pesuainekoostumuksissa. Huolimatta yrityksistä varmistaa pesuainekoostumuksien ent-syymistabiliteetti, esiintyy normaaleissa varastointi- ja käyttöolosuhteissa yhä edelleen merkittävää aktiivisuuden menetystä.

Uusien entsyymien identifioiminen ja eristäminen tiettyyn tarkoitettuun käyttöön, kuten käytettäväksi pesuaineissa, voidaan suorittaa useilla tavoilla. Yksi tapa on seuloa organismit tai mikro-organismit, joilla esiintyy haluttu ent-symaattinen aktiivisuus, eristää ja puhdistaa entsyymi (mikro-)organismista tai mainitun (mikro-)organismin vilje- • · · : lysupernatantista, määrittää sen biokemialliset ominaisuudet

· I

·' ja tarkistaa vastaavatko nämä biokemialliset ominaisuudet käyttötarkoituksia. Ellei identifioitua entsyymiä voida saa-··· da sen luonnollisesta tuottavasta organismista, voidaan 11 · e .1:·. käyttää yhdistelmä-DNA-menetelmiä entsyymin koodittavan gee- .V. nin eristämiseksi, ilmennetään geeni jossain toisessa orga- • · · nismissa, eristetään ja puhdistetaan ilmennetty entsyymi ja testataan onko se sopiva tarkoitettuun käyttöön.

Toinen tapa uusien entsyymien saamiseksi tarkoitettuun käyt- : töön, on olemassa olevien entsyymien modifikaatio. Tämä voi- ·.·.· daan suorittaa ennen muuta kemiallisilla modifikaatiomene- .··1. telmillä (katso I.Svendsen, Carlsberg Res.Commun. 44 (1976), • · » • • · • « · • · • · · · 5 105481 237-291). Yleensä nämä menetelmät ovat liian epäspesifisiä siinä suhteessa, että ne modifioivat kaikki helposti käsiteltävät tähteet yhdessä tavallisten sivuketjujen kanssa, tai ne ovat riippuvaisia modifioitavaksi sopivin aminohappojen esiintymisestä ja ovat usein kykenemättömiä modifioimaan vaikeasti saavutettavia aminohappoja ellei entsyymimole-kyyliä ole avattu. Tästä johtuen entsyymimodifikaatiomene-telmän, joka tapahtuu koodittavan geenin mutaation kautta, on arveltu olevan ylivoimainen.

Mutaatiot voidaan aikaansaada joko sattumanvaraisilla muta-geeneilla tai paikkaan kohdistetuilla mutageeneilla. Sattumanvaraiset mutaatiot, käsiteltäessä koko mikro-organismi kemiallisella mutageenilla tai mutagenoivalla säteilytyksel-lä, voivat tietysti johtaa modifioituihin entsyymeihin.

Tässä tapauksessa täytyy saatavilla olla varteenotettavat valintaohjelmat etsittäessä äärimmäisen harvinaisia mutant-teja, joilla on halutut ominaisuudet. Suurempi mahdollisuus mutanttientsyymien eristämiseksi sattumanvaraisilla mutaatioilla voidaan saavuttaa sen jälkeen, kun koodittava geeni on kloonattu mutagenoimalla se in vitro tai in vivo ja koodattu entsyymi on ilmennetty kloonaamalla uudelleen mutatoi-tu geeni sopivaan isäntäsoluun. Myös tässä tapauksessa sopi- • I · v : vat biologiset valintaohjelmat täytyy olla saatavilla halut- tujen mutanttientsyymien selektoimiseksi, katso kansainväli-nen patenttihakemus WO 87/05050. Nämä biologiset valintaoh- ... jelmat eivät spesifisesti valitse entsyymejä, jotka ovat so- ···· pivia käytettäväksi pesuaineissa.

• · _____ • · · • · «

Kaikkein spesifisin tapa saada modifioituja ensyymejä on paikkaan suunnattu mutaatio, jolloin on mahdollista spesifisesti korvata yksi^täi useampi aminohappo millä tahansa toisella halutulla aminohapolla. Julkaisussa EP-A-0130756 esi-·.’ : tetään esimerkein tämän tekniikan käyttö muodostettaessa mu- :.v tanttiproteaasigeenejä, jotka voidaan ilmentää tuottamaan .···. muunnettuja proteolyyttisiä entsyymejä.

• · • · 6 105481

Viime aikoina paikkaan kohdistetun mutatoinnin mahdollisuutta välittävän oligonukleotidin avulla on kuvattu käyttämällä mutageenisia oligonukleotideja, jotka on syntetisoitu sisältämään emästen seoksia kohdesekvenssin useissa kohdissa.

Tämä tekee mahdolliseksi lukuisten erilaisten mutaatioiden aikaansaamisen DNA-sekvessin spesifisellä osalla käyttämällä yhtä ainoaa synteettistä oligonukleotidivalmistetta, kuten esittävät Hui et ai., EMBO J. 2 (1984) 623-629, Matteucci et ai., Nucl.Acids Res. 11 (1983) 3113-3121, Murphy et ai., Nucl. Acids Res. 11^ (1983) 7695-7700, Wells et ai., Gene 3± (1985) 315-323, Hutchinson et ai., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83 (1986) 710-714 ja F.M.Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, Greene Publishers Association and Wiley, Interscience, 1987.

Stauffer et al., J.Biol.Chem. 244 (1969) 5333-5338, ovat jo todenneet, että Carlsberg subtilisin asemassa 221 H202 hapettaa metioniinin metioniinisulfoksidiksi ja tämä on syynä huomattavaan aktiivisuuden vähenemiseen.

Sekä sattumanvaraista että paikkaan kohdistettua mutaatio-menetelmää modifioitujen entsyymien muodostamiseksi käytettiin mutanteille, jotka johdettiin mikro-organismin Bacillus amyloliquefaciens seriiniproteaasista, kutsuttu myös "subti-lisin BNP", eristettiin ja karakterisoitiin. Julkaisussa WO 87/05050 mutantilla subtilisin BNP' on esitetty lisääntynyt lämpöstabiliteetti. Julkaisussa EP-A-0130756 kuvataan, että metioniinin asemaan 222 kohdistettu paikkamutaatio subtili- • · · l. sin BPN'ssa kaikilla 19 mahdollisella aminohapolla, käyttäen niin sanottua "kasettimutaatio"-menetelmää, voi johtaa entsyymeihin, jotka ovat resistenttejä H202:n aikaansaamaa hapetusta vastaan. Viimeksi mainitussa tapauksessa kuitenkin useimmilla mutanteilla oli alhainen proteolyyttinen aktiivi-' suus. Parhaimmiksi mutanteiksi todettiin M222A ja M222S, :Y: joilla spesifiset aktiivisuudet olivat 53 % ja vastaavasti ..V 35 % verrattuna luontaisen subtilisin BPN' :n aktiivisuuteen, katso Esteli et ai., J.Biol.Chem. 260 (1985) 6518-6521.

7 105481

Aikaisempi tutkimus, joka on kohdistunut modifioitujen pro-teaasien muodostumiseen, osoittaa, että voidaan saada subti-lisin BPN'-mutantit, joilla muunnetut stabiliteettiominai-suudet ja muunnetut kineettiset ominaisuudet; katso kirjallisuusviitteitä, jotka on esitetty edellä ja muita viitteitä, esimerkiksi Rao et ai., Nature 328 (1987) 551-554, Bryan et ai., Proteins 1 (1986) 326-334, Cunningham ja Wells, Protein Engineering 1 (1987) 319-325, Russel et ai., J.Mol. Biol. 193 (1987) 803-819, Katz ja Kossiakoff, J.Biol.Chem. 261 (1986) 15480-15485 ja Shaw'n selonteot, Biochem.J. 246 (1987) 1-17 ja Gait et ai., Protein Engineering 1 (1987) 267-274. Kuitenkaan yksikään näistä viitteistä ei ole johtanut parannetun pesutehon ja stabiliteetin omaavien proteo-lyyttisten entsyymien teolliseen tuotantoon pyykinpesuaineita varten. Toistaiseksi yhdelläkään modifioidulla proteaa-silla ei ole esitetty olevan kaupallista arvoa eikä niiden ole esitetty olevan ylivoimaisia nykyisin käytettyihin pesu-aine-entsyymeihin verrattuna relevanteissa käyttöolosuhteissa .

Tämän keksinnön yhtenä kohteena ovat uudet proteolyyttiset mutanttientsyymit, jotka saadaan ilmentämällä geenit, jotka

I t I

' koodittavat mainittuja entsyymejä, joissa on aminohapposek- ' venssit, jotka eroavat ainakin yhden aminohapon suhteen vas- « « ; '·· taavista villityyppiä olevista entsyymeistä. Näillä mutant- ..li' tientsyymeillä on parannetut ominaisuudet käytettäväksi pe- ϊ.:*: suaineissa, erityisesti pyykinpesuaineissa. Keksinnön edul- :V: lisen suoritusmuodon muodostavat PB92-seriiniproteaasin mu tantit.

• · · • · • · .···. Keksinnön toisena kohteena ovat uudet entsymaattiset pesuai- • · *·’ neet, jotka muodostuvat proteolyyttisestä entsyymituottees- ta, joka sisältää ainakin yhden tällaisen uuden proteolyyt- · · tisen mutanttientsyymin.

«« « ««·« .··. Edelleen tässä on esitetty testisysteemi, joka tekee mah- • · dolliseksi proteolyyttisten mutanttientsyymien, joilla β 105481 on parannetut ominaisuudet käytettäväksi pyykinpesuaineissa, tehokkaan valinnan lukuisien entsyymien joukosta. Tällaiset entsyymit tuotetaan ilmentämällä mutatoidut proteaasigeenit.

Keksinnön nämä ja muut näkökohdat selviävät edelleen seuraa-vassa esitetystä yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

Kuvioiden lyhyt selitys

Kuviossa IA on esitetty PB92-proteaasigeenin sisältävän mu-taatiovektorin rakenne.

Kuviossa IB on esitetty kaavamaisesti käytetty mutaatiome-netelmä.

Kuviossa 1C on esitetty PB92-proteaasimutanttigeenin sisältävän ilmentämisvektorin rakenteen.

Kuviot 2A, 2B ja 3 kuvaavat pesutehon suhdetta, erilaisten PB92-proteaasimutanttien spesifiseen proteolyyttiseen aktiivisuuteen erilaissa pesuolosuhteissa.

Kuviossa 4 on esitetty PB92-proteaasigeeni nukleotidisek-venssi ja koodatun prekursorientsyymin aminohapposekvenssi.

f I I • · ·

Sanonnalla "omaa parannetut ominaisuudet", jota käytetään • · · · tässä selityksessä "proteolyytisten mutanttientsyymien" • · · .v, yhteydessä, tarkoitetaan proteolyyttisiä entsyymejä, joilla t · · parannettu pesuteho tai parannettu stabiliteetti säilyy pesua ... suoritettaessa verrattuna vastaavaan villityyppiä olevaan • · *”·* proteaasiin.

• · • · »*· :*,· Käsite proteolyyttisten mutanttientsyymien "pesuteho" määri- • t tellään tässä selityksessä proteolyyttisen mutanttientsyymin

Ml *. aikaansaamana parannuksena pyykinpuhdistuksessa, joka saa-

«M

··;' daan entsyymiä sisältämättömän pesuainekoostumuksen vaiku- « · **··' tuksen lisäksi relevanteissa pesuolosuhteissa.

9 105481 Tässä käytetyllä käsitteellä "relevantit pesuolosuhteet" tarkoitetaan olosuhteita, erityisesti pesulämpötilaa, -aikaa, pesumekanismeja, pesuainekonsentraatiota, pesuaine-tyyppiä ja veden kovuutta, joita todella käytetään kotitaloudessa pesuaineita käytettäessä.

Käsitettä "parannettu pesuteho" käytetään osoitettaessa, että saadaan parempi lopputulos tahranpoistossa "relevanteissa pesuolosuhteissa" tai että tarvitaan vähemmän proteo-lyyttistä mutanttientsyymiä laskettuna painosta saman lopputuloksen saavuttamiseksi verrattuna vastaavaan villityyppiä olevaan entsyymiin.

Käsitettä "säilyvä pesuteho" käytetään osoitettaessa, että proteolyyttisen mutanttientsyymin pesuteho laskettuna painon suhteen, on ainakin 80 % verrattuna vastaavaan villityyppiä olevaan proteaasiin "relevanteissa pesuolosuhteissa".

Käsitettä "parannettu stabiliteetti" käytetään osoitettaessa, että proteolyyttisillä mutanttientsyymeillä on parempi stabiliteetti pyykinpesuaineissa varastoinnin aikana ja/ tai niillä on parempi stabiliteetti pesuaineliuoksessa, joka sisältää stabiliteettia vähentäviä hapettavia aineita, :T: metalli-ionin muodostavia aineita, itsestään hajoavia ainei- ta, pinta-aktiivisia aineita ja korkean alkalisuuden, ver- ψ rattuna vastaavaan villityyppiä olevaan entsyymiin.

* • · · Y», Biokemialliset ominaisuudet, jotka määritetään hyvin mää- rätyissä laboratorio-oloissa, eivät ole luotettavia paramet-’ 1 reja tietyn pesuaineproteaasin tehon ennustamiseksi halu tuissa ja määrätyissä käyttöoloissa. Näihin parametreihin kuuluvat kineettiset arvot, jotka mitataan hyvin määrätyillä substraateilla, kuten proteiineilla, esim. kaseiinilla, di- M» ......... - v · metyylikaseiinilla ja hemoglobiinilla, tai substituoiduilla :Y: oligopeptidisubstraateilla, kuten sAAPFpNa (sukkinyyli-L- .· Y alanyyli-L-alanyyli-L-propyyli-L-fenyylialanyyli-paranit-

t I

· • f » f ·

Ml « I

» « • · · f · < > f I « ίο 105481 roanidili). On ilmeistä, että proteaasien muut ominaisuudet määräävät niiden tehokkuuden pyykin puhdistuksessa.

Tämä keksintö perustuu havaintoon, että vaikka menetelmät, joilla aminohappoketjuja liitetään proteiineihin, ovat saatavilla olevia ja ne voivat aikaansaada suuria muutoksia proteiinien biokemiallissa ominaisuuksissa, spesifisten mutaatioiden vaikutuksen ennustaminen varsinaisissa käyttöolosuhteissa on yhä hyvin heikkoa tai jopa mahdotonta.

Laajan tutkimuksen ja kokeilun jälkeen on nyt keksitty tällainen menetelmä, jossa menetelmässä yhdistetään mutant-tiproteaasien valmistaminen tehokkaaseen valintamenetelmään, joka suoritetaan näille proteaaseille. On yllättävää, että suhteellisen suuri määrä entsyymejä voidaan tehokkaasti seuloa käyttöön tällä tavalla.

Tässä kuvattu testisysteemi perustuu proteaasi-sensitiivisten tahrojen poistamiseen tekstiilitilkuista launderometrissä tai tergotometrissä relevantteja pesuolo-ja jäljitellen. Sopivia testitllkkuja ovat esimerkiksi kaupallisesti saatavat EMPA-tilkut (Eidgenössische Material : Prilfungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, Sveitsi), jotka on keinotekoisesti tahrittu proteiinipitoisilla tahroilla. Re-levantteja tahroja tilkuilla proteaasin testaamiseksi ovat .:. veri, ruoho, suklaatahrat ja muut proteiinipitoiset tahrat.

··♦· • · · • · · • · ·

Lisäksi tässä testisysteemissä muita relevantteja tekijöitä, • · · kuten pesuainekoostumusta, pesuainekonsentraatiota, veden ... kovuutta, pesumekanismeja, aikaa, pH:ta ja lämpötilaa, voi- • · daan säädellä siten, että kotitaloudessa tyypillisiä käyttö- *···* olosuhteita voidaan jäljitellä.

« < • f · • ·

Proteaasien pesutehoa on helpointa mitata niiden kykynä • · · *, poistaa tietyt tyypilliset tahrat sopivissa testiolosuh- « · · ·;;; teissä. Tämä kyky voidaan määrittää sopivasti testivaattei- • · « · * * * η 105481 den reflektanssimittauksilla launderometerissä tai tergoto-meterissä entsyymeillä ja ilman entsyymejä suoritettujen pesujen jälkeen. Tämän keksinnön mukainen laboratoriokäyttö-testisysteemi edustaa kotitaloudessa käytettyä, kun käytetään proteolyyttisiä entsyymejä, jotka on modifioitu DNA-mu-taatioiden avulla.

Mäin ollen tässä esitetyllä menetelmällä on mahdollista testata suuret määrät erilaisia entsyymejä ja valita ne entsyymit, jotka ovat erityisen sopivia tietyn tyyppiseen pesuainekäyttöön. Tällä tavalla "räätälöidyt" entsyymit spesifisiin käyttöolosuhteisiin voidaan valita helposti.

Eräät bakteriaaliset seriiniproteaasit luetaan subtilisii-neihin. Subtilisiineihin kuuluvat mikro-organismien Bacillus subtills, Bacillus amylollquefaclens ("subtilisiini BPN1") ja Bacillus llchenlformls ("subtilisiini Carlsberg") seriiniproteaasit. Katso Marklandin ja Smithin (1971) katsausta julkaisussa "The Enzymes" (Boyer, ed.) voi. 3, 561-608, Academic Press, New York. Baclllus-kannat, kuten alkalofUliset Bacillus-kannat, tuottavat muita proteaaseja. Esimerkkejä viimeksi mainitusta ryhmästä ovat Maxacal'in seriiniproteaa-: si, jota jäljempänä kutsutaan myös PB92-proteaasiksi (mikrobi : organismista Bacillus nov.spec. PB92) ja Savinase'n serii- :*·.. niproteaasi, joka on mainittu edellä.

*♦ * ··*# PB92-proteaasin aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 4.

.v. Kypsä proteaasi muodostuu 269 aminohaposta, molekyylipaino • · · on noin 27000 D ja isoelektrinen piste on korkealla alkali-... sella alueella. PB92-proteaasin proteiinisubstraatin aktii- visuus on ilmoitettu aikalisissä Delf-yksiköissä (ADU). Ak- • ·

tiivisuus ADUrna määritetään menetelmän mukaan, joka on ku-; ·.; vattu GB-patenttijulkaisussa nro 1,353,317, paitsi, että pH

muutettiin 8,5:stä 10,0:een. Puhdistetun PB92-proteaasin < ' aktiivisuus on 21 000 ADU/mg. Käänteisarvo (kca^.) mitattuna *;;; kaseiinilla on 90 s-^·.

I < ( 105481

Subtilisiini Carlsberg'in puhdistettujen valmisteiden spesifinen aktiivisuus (Delange ja Smith, J.Biol.Chem. 243 (1968) 2184) nousee arvoon 10 000 ADU/mg ja subtilisiini BPN':n (Matsubara et ai., J.Biol.Chem. 240 (1965) 1125) arvoon 7 000 ADU/mg. Edellä mainittujen parametrien, kuten spesifisen aktiivisuuden ja käänteisarvon (kcat)' lisäksi PB92-proteaa-si eroaa proteaaseista, kuten subtilisiinista Carlsberg, subtilisiinista BPN1 ja muista pesuaineissa esiintyvistä proteaaseista (esim. Maxatase ja Alcalase) siinä, että sillä on korkea positiivinen varaus, joka voidaan nähdä luontaisen proteiinin geelielektroforeesista, kuten jäljempänä kokeellisessa osassa 4 kuvataan.

Koska PB92-proteaasi on aktiivinen tahranpoistossa aikalisissä pH-arvoissa, sitä on yleisesti käytetty pesuaineiden lisäaineena yhdessä pesuaine-aineosien, kuten pinta-ak-tiivisten aineiden, saippuan muiden aineosien (builders) ja hapettavien aineiden kanssa. Viimeksi mainittuja aineita käytetään suurimmaksi osaksi jauheissa. PB92-proteaasilla on korkea tahranpoistoteho verrattuna muihin proteaaseihin, kuten edellä mainittuihin subtilisiineihin. Tämä tarkoittaa sitä, että PB92-proteaasia tarvitaan vähemmän saman pesute- • · ·.· · hon saavuttamiseksi.

t · • · « • « · • PB92-proteaasin ja kaikkien muiden tunnettujen seriiniprote- ·:· aasien, joita käytetään pesuaineissa, merkittävä haitta on ·*·· herkkyys hapettumiselle (katso myös Stauffer et ai., J.Biol. Chem. 244 (1969) 5333-5338; Esteli et ai., J.Biol.Chem. 263 (1985) 6518-6521). PB92-proteaasin hapettuminen joko H202:n ...^ tai perhappojen, joita aktivaattorisysteemi muodostaa sisäl- täessään perboraattitetrahydraattia ja TAED:ta, vaikutukses- • m *;·* ta aikaansaa entsyymin, jonka spesifinen aktiivisuus on 50 % :\j ja vastaavasti 10 % ADU/mg verrattuna hapettumattomaan PB92-proteaasin (katso kokeellinen osa 7 ja esimerkki 1).

m Tässä esitetty menetelmä on erittäin sopiva proteo- • # *··;* lyyttisten mutanttientsyymien, jotka johdetaan luonnollises- 13 105481 ti tuotetuista bakteriaalisista seriiniproteaaseista, tuottamiseksi, testaamiseksi ja valitsemiseksi. Tällaisia mu-tantteja ovat esimerkiksi alkalofUlisen Bacillus-kannan villityyppiä olevasta geenistä johdetun geenin koodittamat mutantit ja mieluimmin PB92. Myös mutantit, jotka saadaan alkalofiilisesta Bacillus-seriiniproteaasista Savinase, ovat sopivia. Menetelmää voidaan käyttää myös edullisesti modifioitujen proteaasien, jotka on johdettu muista kuin alkalo-fiilisten Bacillus-kantojen PB92 seriiniproteaaseista, valitsemiseksi. Esimerkiksi geenit, jotka koodittavat mikro-organismien Bacillus subtilis, Bacillus amylollquefaclens ja Bacillus lichen!formis seriini-proteaaseja, ovat tunnettuja ja niitä voidaan käyttää mutaatioiden kohteena. On selvää, että joko oligonukleotidi-avusteisia palkkaan kohdistettuja mutaatioita tai alueeseen kohdistettuja sattumanvaraisia mutaatioita voidaan käyttää tai mitä tahansa muuta sopivaa menetelmää mutaatioiden tehokkaaseen synnyttämiseen proteaa-sigeenissä.

Proteolyyttisten mutanttientsyymien valintamenetelmä (joka käsittää tuottamisen ja seulonnan) muodostuu seuraavista vaiheista: kloonatun geenin, joka koo-dittaa haluttua proteolyyttistä entsyymiä, tai sen osaa, mutagenoiminen, saadun proteaasimutanttigeenin tai -geenien < eristäminen; mainitun proteaasimutanttigeenin tai -geenien vieminen, mieluimmin sopivalla vektorilla, sopivaan isäntä-kantaan ilmentämistä ja tuottamista varten; tuotetun mutant- • « · tiproteaasin talteenottaminen; ja niiden mutanttiproteaa-sien, joilla on parannetut ominaisuudet käytettäväksi pesuaineissa, identifioiminen.

• * * t • · ·

• M

·,,,· Sopivia isäntäkantoja mutanttiproteaasien tuottamiseksi ovat i .'.J muunnettavissa olevat mikro-organismit, joissa proteaasin 4 f /··, ilmentyminen voidaan aikaansaada. Erityisesti samojen lajien ’ tai sukujen, joista proteaasi on johdettu, isäntäkannat ovat • · · ··! sopivia, kuten Bacillus-kanta, mieluimmin alkalofiilinen « 4 > 1 « «

« I

f I · 14 105481

Bacillus-kanta ja kaikkein mieluimmin Bacillus nov.spec.

PB92 tai sen mutantti, jolla olennaisesti samat ominaisuudet. Myös B_^ subtilis-, B^ llcheniformls- ja B. amylollque-faciens-kannat ovat muun muassa edullisia. Muita sopivia ja edullisia isäntäkantoja ovat sellaiset kannat, jotka ovat olennaisesti kykenemättömiä tuottamaan solun ulkopuolisia proteolyyttisiä entsyymejä ennen mutanttigeenillä suoritettua transformaatiota. Erityisen mielenkiintoisia ovat pro-teaasivajaat Bacillus-isäntäkannat, kuten Bacillus nov. spec. PB92:n proteaasivajaa johdannainen. Proteaasien ilmentyminen aikaansaadaan käyttämällä ilmentymissignaaleja, jotka toimivat valitussa isäntäorganismissa. Ilmentymissignaa-leihin kuuluvat DNA-sekvenssit, jotka säätelevät proteaasi-geenien kopiointia ja luentaa. Sopivat vektorit pystyvät replikoimaan tarpeeksi suuret kopiomäärät valitussa isäntä-kannassa tai ne kykenevät säilyttämään proteaasigeenin isän-täkannassa kromosomaalisella integraatiolla.

Tämän keksinnön mukaiset proteolyyttiset mutanttientsyymit valmistetaan viljelemällä sopivissa viljelyolosuhteissa transformoitua isäntäkantaa, joka sisältää halutun proteo-lyyttisen mutanttigeenin tai -geenit, ja tuotetut entsyymit otetaan talteen.

· » • · ·

Mieluimmin ilmennettävät proteaasit erittyvät viljelyväliai- « · neeseen, mikä helpottaa niiden talteenottoa, tai gram-nega- · • ” tiivisten bakteerien ollessa isäntäkantoina, periplasmiseen • · · ···! tilaan. Erittymiseen käytetään sopivaa aminoterminaalista ·»· : signaalisekvenssiä, mieluimmin signaalisekvenssiä, jota ai- • · kuperäinen geeni, jos se on toimiva valitussa isäntäkannas-sa, koodittaa.

Tämän keksinnön erään näkökohdan mukaisesti voidaan kehittää sopivat pesutehotestit, jotka edustavat mitä tahansa markki-noilla esiintyviä relevantteja kotitalouden pesuolosuhteita. Esimerkiksi kehitettiin sopiva testi tehopesuun tarkoite- • « · « · • · • · « • • · « • · • t · · f * · ib 105481 tuille eurooppalaisille pesujauheille, jotka ovat jauhemaisia koostepesuaineita, jotka voivat sisältää tai olla sisältämättä valkaisuaineita, pesuainekonsentraatioiden vaihdellessa 1 g:sta - 10 g:aan pesuainetta/1, 10-20 °GH: ssa (German Hardness) käytettyjen lämpötilojen ollessa 25-80 eC. Erityisesti käytettiin jauhemaista koostepesuainetta, joka sisälsi TAED:ta ja perboraattia, pesuainekonsentraatioissa 4, 7 tai 10 g pesuainetta/1, 15 eGH:ssa 40 ®C:ssa.

On myös testejä, jotka edustavat pesua nestemäisillä pesuaineilla. Näitä pesuaineita käytetään tavallisesti vaahtokon-sentraatioissa, jotka vaihtelevat 1,5 g:sta - 5 g:aan pesuainetta/1, 5-15 eGH:ssa lämpötilojen ollessa 15-40 eC. Erityisesti valkaisuaineita sisältämättömiä nestemäisiä pesuai-nekoostumuksia käytettiin vaahtokonsentraatiossa 1,5 g pesuainetta/1, 5 eGH:ssa lämpötiloissa 25 °C ja 40 ®C, mikä edustaa USA:n nestemäisten pesuaineiden käyttöolosuhteita, ja pesuainekonsentraatiossa 5 g pesuainetta/1, 15 ®GH:ssa 40 ®C:ssa, mikä edustaa eurooppalaisia nestemäisten pesuaineiden käyttöolosuhteita.

Sopivampia suoritustestejä voidaan kehitellä muille markkinoilla esiintyville käyttöolosuhteille. Tekstiilitilkkuja, jotka on tahrittu proteaasille herkillä tahroilla, erityi- /·.·' sesti tilkkuja, jotka on tahrittu verellä, ruoholla, suklaa- • · 1 .1 tahroilla ja muilla proteiinipitoisilla tahroilla, erityi- » ” sesti EMPA-testitilkkuja 116 ja 117, käytetään tyypillisissä • · · pesutehotesteissä.

• » I « · · • ·

Luonnollisesti esiintyvien tai luonnollisesti mutatoitunei-den pesuaineproteaasien ominaisuuksia voidaan lisätä käyttämällä erilaisia mutaatioita entsyymissä. Enimmäkseen mutaatiot ovat substituutioita, joko pysyviä tai pysymättömiä, mutta myös deleetioita ja insertioita voidaan käyttää.

• · 1 • · · • » • · • Il * · • · • · · • 0 • 1 f»» • « • · • » · ie 105481

Pysyviin substituutioihin voidaan käyttää seuraavaa taulukkoa: alifaattlnen neutraali

ei-polaarinen G, A, P L, I, V

polaarinen C, M, S, T,

N, Q

varautunut

anioninen D, E

kationinen K, R

aromaattinen F, H, W, Y

jossa mikä tahansa aminohappo voidaan korvata millä tahansa saman kategorian, erityisesti saman rivin toisella aminohapolla. Lisäksi polaariset aminohapot N, Q voivat korvata tai ne voidaan korvata varautuneilla aminohapoilla. Tämän keksinnön tarkoitukseen substituutiot, joista seuraa proteaasin anionisen varauksen lisääntyminen, erityisesti kohdissa, jotka eivät suoranaisesti liity aktiivikohtaan, ovat erityisen mielenkiintoisia.

•» φ

Mutaation kannalta erityisen mielenkiintoisia alueita ovat

« · I

' sellaiset aminohapot, jotka ovat 4 Ä:n päässä inhibiitto- i **· rimolekyylistä Eglin C, Eglin C:n sitoutuessa aktiivikoh- taan.

·#* • · # « · · :V: Seuraava numerointi perustuu PB92-proteaasiin, mutta seikat ovat relevantteja muihin seriiniproteaaseihin nähden, joilla on olennaisesti homologinen rakenne, erityisesti sellaisiin, joilla homologisuus on suurempi kuin noin 70 %, erityisesti ... sellaisiin, joilla homologisuus on suurempi kuin noin 90 %.

':7 Näitä kohtia ovat 32, 33, 48-54, 58-62, 94-107, 116, 123-133, 150, 152-156, 158-161, 164, 169, 175-186, 197, 198, • » · • » • · » · · • · • 6 · • · • · « 4 4 • 1 » · · 17 105481 203-216, useimmat näistä kohdista ovat käytettävissä suoraan liitäntään proteiinipitoisella substraatilla. Tavallisesti kohtia 32, 62, 153 ja 215 ei substituoida, koska mutaatiot näissä kohdissa pyrkivät alentamaan pesutehoa.

Kohdat, jotka ovat erityisen mielenkiintoisia substituution kannalta, ovat 60, 62, 94, 97-102, 105, 116, 123-128, 150, 152, 153, 160, 183, 2Ö3, 211, 212 ja 213-216. Eräissä kohdissa on tarkoitus vaihtaa pysymätön aminohappo, esim. meti-oniini, oksidatiivisesti pysyvämpään aminohappoon, esim. treoniiniin, samalla kun tämän kohdan aminohapon yleinen rakenne ja tilavuus säilytetään. Toisissa tapauksissa on todettu, että korvaamalla luonnollinen aminohappo melkein millä tahansa toisella aminohapolla, saavutetaan parannetut tulokset, erityisesti korvattaessa hydroksyloituneet aminohapot, S, T, polaarisella tai ei-polaarisella aminohapolla tai jopa aromaattisella aminohapolla.

Erityisen mielenkiintoisiin substituutioihin kuuluvat:

Gil6 I, V, L

S126 mikä tahansa aminohappo P127 mikä tahansa aminohappo S128 mikä tahansa aminohappo

S160 anioninen tai neutraali alifaattinen tai R

* * * A166 varautunut, erityisesti anioninen • · t M169 neutraali alifaattinen, mieluimmin ei-polaarinen • · ” N212 anioninen • I*

••j M2l6 alifaattinen polaarinen, erityisesti S, T, N, Q

» · . . .

» · · • ·

Yllättäen, vaikka monet mutaatiot johtavat proteaasin spesifisen aktiivisuuden alenemiseen tavanomaisilla substraateilla, pesuteho on verrattavissa oleva tai lisääntynyt suhteessa luonnolliseen entsyymiin ja monissa tapauksissa varas-tointistabiliteetti on parantunut.

• · ......

• · · * · ·

Eräiden PB92-mutanttiproteaasien pesuteho, ilmoitettuna ent- * · * syymin suhteellisen määrän, joka tarvitaan saman vaikutuksen • · * # * • « • · » · * tiili 105481 18 saavuttamiseksi kuin mitä saadaan luontaisella entsyymillä, käänteisarvona x 100 %, on lisääntynyt yli 120 %, eräissä tapauksissa jopa yli 180 %.

Keksinnön erään toisen näkökohdan mukaan saadaan PB92-pro-teaasimutantteja, joilla on parempi varastointistabiliteetti jauhemaisissa, valkaisuaineen sisältävissä pesuainekoostu-muksissa kuin luontaisella PB92-proteaasilla, niiden pesute-hon kuitenkin säilyessä. Esimerkkejä tällaisista mutanteista ovat M216S ja M216Q ja mutantit, joissa on ainakin yksi näistä mutaatioista muiden kohtien mutaatioiden lisäksi.

Edelleen keksinnön erään toisen näkökohdan mukaisesti todettiin yllättäen, että nestemäisessä pyykinpesuainekoostumuk-sessa (joka ei sisällä hapettavia aineita) PB92-mutantti-proteaasit M216S, M216Q, S160D ja N212D säilyttävät aktiivisuutensa paremmin kuin PB92-proteaasi. Näistä mutanteista M216S:llä ja M216Q:lla pesuteho on säilynyt ja S160D:llä ja N212D:llä pesuteho on parantunut. Varastointistabiliteetin parantuminen testatuilla nestemäisillä pesuaineilla on kaikkein selvin S160D- ja M216Q-mutanteilla.

Pesuainekoostumuksiin on myös mahdollista yhdistää useita ... mutantteja, jotka lisäävät proteaasin stabiliteettia. Useita

I « I

mutantteja, jotka vaikuttavat positiivisesti saman proteaa- « « i I;' ' sin pesutehoon, voidaan yhdistää yhteen ainoaan mutanttipro- • · : '1 teaasigeeniin, jolloin se pystyy tuottamaan mahdollisesti jopa muita parannettuja proteaaseja, esimerkiksi [S126M, <v’: P127A, S128G, S160D] ja [G116V, S126N, P127S, S128A, S160D] .

Uudet proteaasimutantit voidaan valmistaa yhdistämällä esimerkiksi N212D:n ja S160D:n hyvät pesuteho-ominaisuudet esimerkiksi M216S:n tai M216Q:n stabiliteettiominaisuuksiin. [S160D, M216S]-mutantilla esimerkiksi on parannettu pesuteho ja parempi varastointistabiliteetti.

I | | I « • « « I ( | Käyttökelpoisia mutantteja voidaan valmistaa myös yhdistä- • f 0 mällä tässä selityksessä kuvattu mikä tahansa mutaatio tai ··»«» · · • · 19 105481 mutaatiosarja. Lisäksi on mahdollista yhdistää tässä esitettyjä käyttökelpoisia mutaatioita muiden kohtien mutaatioiden kanssa, jotka voivat aikaansaada tai olla aikaansaamatta olennaista muutosta entsyymin ominaisuuksissa.

Tämän keksinnön edullisia suoritusmuotoja ovat seuraavat PB-92-proteaasimutantit: [M216S]; [M216Q]; [N212D]; [S160D]; [S160G, N212D]; [S160D, M216Q]; [S160D, M216S]; [A166D, M169I ]; [G116V, S126V, P127E, S128K]; [G116V, S126G, P127Q, S128I]; [G116V, S126L, P127N, S128V]; [G116V, S126L, P127Q, S128A]; [G116V, S126V, P127M]; [G116V, S126H, P127Y]; [G116V, S126R, P127S, S128P]; [G116V, S126F, P127Q]; [G116V, S126F, P127L, S128T]; [S126M, P127A, S128G]; [S126M, P127A, S128G, S160D]; ja [G116V, S126N, P127S, S128A, S160D].

Sen kuvaamiseksi, miten merkittävä on tässä keksinnössä käytetty lähestymistapa uusien proteaasin saamiseksi käytettäväksi pyykinpesuaineissa, t.s. käytettäessä tyypillistä pyy-kinpesutestausta primäärisenä valintakriteerinä, PB92-prote-aasimutanttien pesutehotestejä verrattiin biokemiallisiin parametreihin kuten on tavallista suoritettaessa määrityksiä proteiinibiokemlallisessa ja entsymologisessa tutkimuksessa. Näiden tulosten perusteella on mahdollista päätellä, ettei r··, ole olemassa mitään suhdetta parametrien, jotka määrittävät • · « affiniteetin määrätyille substraateille tai proteolyyttisen .1 reaktion kinetiikan, ja toisaalta pesutehon välillä (katso * ♦ " ** esimerkin 1 taulukko 1).

··· • •M «·· ·.* * Tästä syystä on tietysti myös mahdollista yhdistää kaksi tai • · •'.V useampia mutantteja, joilla on erilaiset ominaisuudet, yh teen entsyymituotteeseen tai samaan pesuprosessiin. Tällaisella yhdistämisellä voi olla tai olla olematta synergisti-nen vaikutus.

·· • t · r i «

Keksintö koskee myös yhden tai useamman proteolyyttisen mu-tanttientsyymin, kuten tässä edellä määritellyn, käyttöä pe- • *» \»,· suainekoostumuksissa tai pesuprosessissa.

9 4 1·· • · • · * 9 · < · 9 4 «·· Π Ί1 • » 20 105481

Lopuksi on selvää, että aminohappojen deleetiot tai inserti-ot proteaasipolypeptidiketjuun joko mutaatioilla keinotekoisesti luotuina tai PB92-proteaasille homologisissa proteaa-seissa luonnollisesti tapahtuneina, voivat muuttaa aminohappojen lukumäärää. Kuitenkin on ymmärrettävä, että PB92-pro-teaasin aminohappokohdille homologiset kohdat kuuluvat patenttivaatimusten piiriin.

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu kuvaamaan, ei rajoittamaan keksintöä.

Kokeellinen osa

Aineet ja menetelmät PB92-proteaasimutanttien rakenne

Perusrakenne, josta mutageeninen työskentely aloitettiin, vastaa pM58:aa, joka yksityiskohtaisesti kuvattu julkaisussa EP-A-0283075.

Noudatettu suunnitelma sisälsi kolme vaihetta: a. Mutageenisen vektorin M13M1 rakentaminen b. Mutaation suorittaminen c. pM586Eco:n rakentaminen ja mutatoidun DNA-fragment in sub-kloonaus tähän vektoriin.

.:. l.a. Mutageenisen vektorin M13M1 rakentaminen • · · · • · · « · · • · · l'.' Perusrakenne pM58 katkaistiin restriktioentsyymeillä Hpal ja « · · ‘ 1 Ball. 1400 emäsparia oleva fragmentti, joka sisälsi PB92- proteaasigeenin, puhdistettiin alhaalla sulavalla agaroosil-la (Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982).

• · · : Vektori M13MP11 (Messing et al., Nucl.Acid Res. j), (1981) .···1 303-321) katkaistiin Smal:llä. Kyseessä ollut 1400 emäsparia • · * · · · · • · * » · 21 105481 sisältävä DNA-fragmentti ligoitiin tähän vektoriin ja trans-fektoitiin E.coli JM101:een menetelmillä, jotka ovat kuvanneet Cohen et ai., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 69, (1972) 2110-2114.

Faagilisääntymisen jälkeen E.coli JM101:ssä ssDNA eristettiin (Heidecker et ai., Gene 10, (I960) 69-73), insertti ja sen suunta tarkistettiin DNA-sekventoinnilla käyttäen menetelmää, jonka on kuvannut Sanger, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74 (1977) 6463.

Saatiin mutaatioon sopiva vektori, joka nimettiin M13Ml:ksi. Edellä kuvattu menetelmä on esitetty kaavamaisesti kuviossa IA.

l.b. Mutaatiomenetelmät

Mutaatiot suoritettiin Ml3Ml:llä käyttäen tämän vektorin ssDNArta ja M13mpl9:n dsDNA:ta (Messing et ai., Nucleic Acids Res. £., (1988) 303-321), jolloin viimeksi mainittu vektori katkaistiin restriktioentsyymeillä EcoRI ja Hindlll, jonka jälkeen suuri fragmentti puhdistettiin alhaalla sul-valla agaroosilla.

• · · '·' 1 Mutaatio suoritettiin kuten kuvaavat Kramer et ai., Nucleic '·' ' Acids Res. 12, (1984) 9441-9456, siten muunnettuna, että : 1· käytettiin E.coli JM105:ttä E.coli WK30-3:n sijasta mutant- teja valittaessa.

• · · * · · - — .....—----: « t «

Oligonukleotidien, joita käytettiin spesifisten mutaatioiden aikaansaamiseksi, pituus oli 22 nukleotidia. Paikkaspesifi-nen mutaatio, jota käytettiin useiden mutaatioiden aikaansaamiseksi samanaikaisesti spesifisessä DNA-sekvenssissä, suoritettiin käyttäen oligonukleotidivalmistetta, jonka pi-;. tuus oli 40 nukleotidia, kaikkien neljän nukleotidin liit- '·'·[ tyessä sattumanvaraisesti kohtiin, jotka vastasivat muta- toitavaa aminohappoa (-happoja).

« tl

»M

22 105481

Mutaatioiden jälkeen potentiaalisista mutanteista tarkastettiin sekvenssianalyysillä oliko niillä relevantti mutaatio, käyttäen dideoksimenetelmää, jonka on esittänyt Sanger, katso edellä. Koko yksinkertaisen säikeen sisältävä väli (katso kuvio IB) sekventoitiin sekundääristen mutaatioiden poissaolon tarkistamiseksi. Menetelmä on esitetty kaavamaisesti kuviossa IB.

Kuvattu menetelmä on käyttökelpoinen DNA-fragmenttien muodostamiseksi, joissa on mutaatiot proteaasigeenin 31-osassa (aminohapot 154-269).

Alan ammattimiehille on selvää, että DNA-fragmenttien muodostamiseksi, joissa mutaatiot ovat proteaasigeenin 5'-osassa, voidaan käyttää Bacillus-vektorissa vaihtoehtoisia restriktioentsyymejä ja muunnetut PB92-proteaasigeenit voidaan rakentaa analogisesti kuvion IA menetelmän kanssa.

1.c. pM586Eco:n rakentaminen ja mutaatiot sisältävien DNA-fragmenttien subkloonaus tähän vektoriin (kuvio 1C) pM586Eco:n rakentamiseksi pM58 katkaistiin restriktioent-syymillä EcoRI ja ligoitiin T4-ligaasilla laimennetuissa olosuhteissa. Ligaatioseosta käytettiin transformoimaan B.subtilis 1-A40 (Bacillus Genetic Stock Centre, Ohio) mene-'·' ‘ telmän mukaan, jonka ovat esittäneet Spizizen et ai., : J.Bacteriol. 81 (1961) 741-746.

: Solut transformaatioseoksesta siirrettiin minimaalilevyille, jotka sisälsivät 20 /ug/ml neomysiinä, kuten on kuvattu julkaisun EP-A-0283075 esimerkissä 1.

Transformanttien plasmidi-DNA eristettiin menetelmän mukaan, ... jonka ovat kuvanneet Birnboim ja Doly, Nucleic Acids Res. Ί_ (1979) 1513-1523, ja karakterisoitiin restriktioentsyymi-'v‘ analyysillä. Tällä tavalla eristettiin pM586Eco (katso kuvio 1C). 1 · 23 105481

Mutanttientsyymin tuottamiseksi M13Ml:n DNA-fragmentit, jotka sisälsivät halutut mutaatiot, jotka oli aikaansaatu kohdassa l.b. kuvatulla tavalla, subkloonattiin pM586Eco:oon. M13Ml:n dsDNA (kuvattu edellä) katkaistiin EcoRIrllä ja li-goitiin pM586Eco:n EcoRI-kohtaan. Ligointiseosta käytettiin B.subtilis DB104:n transformoimiseksi, Doi, J.Bacteriol. (1984) 160, 442-444, käyttäen menetelmää, jonka ovat esittäneet Spizizen et ai., katso edellä.

Solut transformaatioseoksesta siirrettiin minimaalilevyille, jotka sisälsivät 20 /ug/1 neomysiiniä ja 0,4 % kaseiinia (EP-A-0283075). Transformanttien tuottaman proteaasin DNA eristettiin menetelmän mukaan, jonka ovat kuvanneet Birboim ja Doly (katso edellä), ja karakterisoitiin restriktio-entsyymianalyysillä.

2. Mutanttiproteaasien tuottaminen DB104:n transformantit, joiden määritettiin sisältävän vektorin yhdessä mutatoidun proteesigeenin kanssa, ympättiin 10 ml:aan tryptonisoijalientä (Tryptone Soya Broth = TSB), joka sisälsi 20 /ug/ml neomysiiniä, ja inkuboitiin 24 tuntia 37 ®C:ssa. Viljelynäytteet (0,1 ml) ympättiin 500 ml:n ra-... vistelupulloihin, joissa oli 100 ml proteaasituotantoalus- taa: 12,5 g/1 hiivauute (Difco), 0,97 g/1 CaCl2.6H20, 2,25 ’/ ’ g/1 MgCl2.6H20, 20 mg/1 MnS04.4H20, 1 mg/1 CoCl2.6H20, 0,5 • · ’ " g/1 sitraatti, 0,5 ml/1 vaahdonestoaine 5693, 6 % paino/ « til. maltoosi, 0,2 M fosfaatipuskuri pH 6,8 ja 20 /ug/ml ·♦· : neomysiini.

• « • ♦ · • ♦ · • ·

Inkuboitiin 65 tuntia vakioilmastuksella, jonka jälkeen viljelmien proteaasiaktiivisuus testattiin käyttäen substraattina dimetyylikaseiinia menetelmässä, jonka ovat kuvanneet Lin et ai., J.Biol.Chem. 244 (1969) 789-793. Suurempien i . edustavien määrien saamiseksi villityyppiä olevaa PB92-pro- \\ teaasia ja PB92-mutanttiproteaaseja, kasvatettiin näitä kan- • · · • · • · 1 · · 24 105481 toja myös 37 °C:ssa ilmastoiduissa tilavuudeltaan 10 litraa tai suuremmissa fermentoreissa käyttäen olennaisesti samaa tuotantoalustaa kuin mitä käytettiin ravistelupulloissa.

Saatuja kasvatusliemiä käytettiin proteaasin puhdistamiseksi.

3. Villityypplä olevan PB92-proteaasin ja sen mutanttien puhdistaminen ja konsentroiminen

Mutatoitu ja villityyppinen PB92-proteaasi, jotka Bacillus subtilis DB104 tuotti ravistelupulloissa tai 10 litran fermentoreissa, puhdistettiin kationinvaihtokromatografisesti käyttäen Zeta-PrepR-kiekkoja tai kasetteja (PS-tyyppi, LKB). Fermentointiliemi sentrifugoitiin (3000 x g, 10 min) ja su-pernatantti laimennettiin 10-kertaiseksi 10 mM natriumfos-faattipuskurilla pH 5,5, jonka jälkeen siirrettiin kationin-vaihtimeen. Pestiin useilla kasettitilavuuksilla fosfaatti-puskuria, jonka jälkeen proteaasi eluoitiin lisäämällä 0,4 M NaCl:ää fosfaattipuskuriin. Fraktiot, jotka sisälsivät pro-teaasiaktiivisuuden, yhdistettiin ja konsentroitiin ultra-suodattamalla, käyttäen Amicon-sekoituskennoa, joka oli varustettu PM-10-suodattimella. NaCl-konsentraatio vähennettiin noin 50 mM:iin laimentamalla ja konsentroimalla prote-

• < I

‘ aasiliuos fosfaattipuskurin kanssa, jonka jälkeen se varas- • I ( * toitiin -80 °C:ssa proteiinikonsentraation ollessa 1-10 • · : 1· mg/ml.

• 1 · • · · 1 :T: Vaihtoehtoisesti PB92-proteaasimutanttien talteenottamiseksi suuremmassa mittakaavassa suoritetuista fermentoinneista, • · lisättiin CaCl2:ta (1 % paino/paino) ja asetonia (30 % pai-no/paino). Solumassa poistettiin suodattamalla, jonka jälkeen proteaasi saostettiin saadusta suodoksesta lisäämällä 0,2-2 % (paino/paino) CaS04.2H20:ta ja lisäämällä edelleen asetonia niin, että lopullinen konsentraatio oli >60 % pai- i « i *·/] no/paino. Sakka erotettiin suodattamalla ja pirskotettiin • t · « t • « • · · · • · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 25 105481 (sparged) asetonilla, jonka jälkeen kuivattiin, saatiin raaka entsyymijauhe (crude enzyme powder =CEP).

4. Analyyttiset menetelmät puhdistettujen proteaasien puhtauden tarkistamiseksi

Proteaasit arvioitiin puhtaiksi, kun todettiin yksi juova tai huippu elektroforeesilla ja vastaavasti suuren tehon geeli-elektroforeesilla (HPLC).

Polyakryyliamidigeeli-elektroforeesi (PAGE) natriumdodekyy-lisulfaatin (SDS) läsnäollessa suoritettiin Laemmlin mukaan, Nature, 227 (1970) 680-685. Kuitenkin proteiininäytteiden denaturoiminen SDS:llä 100 *C:ssa täytyy suorittaa inakti-voimalla proteaasiaktiivisuus autodegradaation estämiseksi. Tämä voidaan tehdä inkuboimalla fenyylimetyylisulfonyyli-fluoridin (PMSF) (1 mM, 30 min, huoneen lämpötila) kanssa tai seostamalla trikloorietikkahapolla (TCA, 8 %, 30 min, jään päällä). Luontainen-PAGE suoritettiin pH:ssa 7,45 (gee-lipuskuri sisälsi 20 mM histidiiniä (His) ja 50 mM 3-[N-mor-folino]propaanisulfonihappoa (MOPS) 5 %:ssa polyakryyli-amidigeelejä (akryyliamidi:bisakryyliamidi-suhde = 20:1). Proteiininäytteet siirrettiin geelilevyjen yläpäähän ja elektroforeesi ajettiin katodille. Samaa His/MOPS-puskuria ' käytettiin elektroforeesi(kammio)puskurina mutta pH:ssa 6,3.

: Elektroforeesin jälkeen (1^2 tuntia 350 V) geeli upotettiin • » • *·· 8%:iseen etikkahappoon proteiinien kiinnittämiseksi geeliin, #>'j· jonka jälkeen värjättiin Coomassie Brilliant Blue R250-vä- rillä ja ylimääräinen väri poistettiin standardimenetelmien * mukaisesti.

• I I » ·

Puhtaus tarkistettiin HPLC:llä, jossa käytettiin kationin-vaihtokolonnia (MonoS-Pharmacia Fine Chemicals) ja geelisuo-datuskolonnia (TSK 2000 SW-LKB). Ensiksi mainittu ajettiin ’;*/ 10 mM natriumfosfaattipuskurissa pH:ssa 5,5 ja sitoutunut • » t '·’* proteaasi saatiin lineaarisella gradientilla, jossa 10-300 • · • · « · · » · ♦ » · 26 105481 mM natriumfosfaattia pH 5,5. Geelisuodatuskolonni ajettiin 0,25 M natriumasetaatissa pH 5,5.

5. Proteaaslkonsentraatlon määrittäminen

Proteiinikonsentraation määrittämiseksi puhdistetussa prote-aasiliuoksessa suoritettiin i) absorbanssimittaukset aallonpituudella 280 nm käyttäen laskettua absorbanssikerrointa (εΜ), ja ii) aktiivikohdan titraus.

Absorbanssikerroin aallonpituudella 280 nm laskettiin tryp-tofäänien (εΜ = 5 600 M”1.cm”1) ja tyrosiinien (εΜ = 1 330 M-1.cm-1) lukumäärästä entsyymimolekyyliä kohti. PB92-prote-aasille käytetty εΜ oli 26 100 M-1.cm-1 (3 Trp-, 7 Tyr-täh-dettä) vastaten E1 %lcm mitattuna aallonpituudella 280 nm = 9,7 (Mr = 26 729 Da). Kun kyseessä olivat mutantit, joilla Trp:n ja Try:n lukumäärät muunnettuja, tehtiin vastaavat korjaukset.

Aktiivisten entsyymimolekyylien lukumäärän arvioiminen tapahtui aktiivikohtatitrauksella. Koska osoittautui, että laajasti käytetty menetelmä N-transkinnamoyyli-imidatsolilla ,, (M.L.Bender et ai., J.Am.Chem.Soc. £58, (1966) 5890-5931) ei toiminut tyydyttävällä tavalla PB92-proteaasilla, kehitimme « ' '· menetelmän käyttäen sen sijaan PMSF:ää. Tällöin proteaasi- I · : 1·1 liuos, jonka konsentraatio piti arvioida (280 nm absorptios- ,.)·1 ta), sekoitettiin 0,25, 0,50, 0,75, 1,00 ja vastaavasti 1,25 :T: ekvivalentin kanssa PMSF:ää ja annettiin reagoida yhden tun-

nin ajan huoneen lämpötilassa 10 mM natriumfosfaatissa pH

• · 6,5. Entsyymikonsentraation oli oltava ainakin 50 /UM.

Jäännösaktiivisuus mitattiin spektrofotometrisesti käyttäen ... sukkinyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-propyyli-L-fenyylialanyy- li-paranitroanilidia (sAAPFpNa) substraattina (katso jäljem- • · · '·1·1. pänä). PMSF:n puhtaus (ja siten konsentraatio) määritettiin • » · • · • · • · · • · • · • · « • · • 9 * · « » 27 105481 NMR-spektroskopisesti ja varastoliuokset valmistettiin iso-propanoliin. Aktiivikohdan titraustuloksen todettiin olevan yhtäpitävä tulosten kanssa, jotka saatiin tarkistettaessa puhtaus HPLC:llä.

6. Vlllltyyppiä olevan ja mutanttiproteaaslen kineettisten parametrien määrittäminen 1°. Aktiivisuus proteiinisubstraateilla (kaseiini) mitattiin pH:ssa 10,0, kuten esitetään GB-patenttijulkaisussa 1,353,317 (ilmoitettu ADU:na = Alkaline Delft Units).

2°. Käänteisarvo, kaseiinin ollessa substraatti, mitattiin pH-laitteessa. pH-laitteen (Radiometer, Kööpenhamina) reak-tiokammio sisälsi 10 ml 0,1 M KCl:ää yhdessä 50 mg:n kanssa kaseiinia (Hammerstein, Merck). Protonit, jotka vapautuivat PB92-proteaasin hydrolysoidessa kaseiinin, titrattiin 10 mM NaOH:lla samalla kun pH pidettiin arvossa 10,00 (40 eC:ssa ja typpikaasuvirtauksessa).

3°. Synteettisten peptidien aktiivisuus mitattiin käyttäen sAAPFpNA:ta. Muodostunut (keltainen) paranitroanilidi (pNA) mitattiin spektrofotometrisesti aallonpituudella 410 nm: ... εΜ = 8 480 M-1.cm-1, (E.G.Delmar et ai., Anal.Biochem. 94 (1979) 316-320) käyttäen UVIKON 860 (KONTRON) spektrofoto-’ metriä, joka oli varustettu termostoidulla kuusipaikkaisel- ·« : ’·· la kyvetinvaihtajalla. Kineettiset parametrit kca^ ja Km ..1·1 saatiin alkunopeusmittauksista erilaisilla substraattikon- :T: sentraatioilla (PB92-proteaasilla 0,1 - 6,0 mM) sovittamalla arvot hyperboliseen funktioon käyttäen ei-lineaarista reg- • · ressiota monimuuttujasekanttitoistomenetelmällä. Laskettiin spesifinen vakio kcat/Km· Mittaukset suoritettiin 25 eC:ssa lopullisen tilavuuden ollessa 1 ml, joka sisälsi 0,1 M ... Tris-HCl:ää + 0,1 M NaClrää pH 8,6. Natriumkloridi oli tar- peellinen, koska sen poissaollessa PB92-proteaasilla todet- • # · ’·)·[ tiin ei-lineaariset Lineweaver-Burk-täplät, minkä aiheuttaja • · · * · • 4 • · · • •Ml 0 1 1 • · • 1 · 105481 28 voi olla substraatti-inhibitio. Substraatti liuotettiin ensin DMSO:hon konsentraatioon 200 mM ja sen jälkeen laimennettiin 0,1 M Tris-HCl:llä pH 8,6, jolloin saatiin varasto-liuos 20 mM (määritetty spektrofotometrisesti aallonpituudella 315 nm; εΜ = 14 000 M-1.cm-1). Korjauksia ei suoritettu DMSO-konsentraation vaihtelun suhteen (0,05 - 3 % til./til.).

7. PB92-proteaasien hapetus PB92-proteaasien herkkyys hapettua H202:n vaikutuksesta testattiin menetelmällä, jonka ovat esittäneet Esteli et ai., J.Biol.Chem. 260 (1985) 6518-6521, paitsi, että i) käytettiin 20 mM H202:ta 100 mM:n sijasta ii) 20 mM natriumperboraattia yhdistettynä 10 mM TAED:tä käytettiin lisähapettajana.

8. Pesutehotesti PB92-proteaasimutantit testattiin erityisesti kehitellyssä pesutestissä käyttäen puuvilla- ja polyesteri/puuvillatilk-kuja, jotka oli tahrattu maidolla, verellä ja musteella (5,0 x 5,0 cm, saatiin EMPArlta, St. Gallen, Sveitsi ja merkit-tiin numeroilla 116 ja 117).

< I I I I

I f

Pesutestit suoritettiin Atlas Launderometer LEF-FC:llä, joka • · i ’** oli varustettu ruostumatonta terästä olevilla testilaitteil- * la, joista jokainen sisälsi määrätyn pesuainekoostumuksen :T: plus testattavan proteaasin (PB92-proteaasimutantit tai PB92-proteaasin). Ellei toisin mainita, testit suoritettiin • · 30 minuutin ajan halutussa lämpötilassa. Pesun jälkeen tilkut kuivattiin ilmassa ja testivaatteiden reflektanssi mitattiin aallonpituudella 680 nm Photovolt-fotometrilla ... (Malli 577), joka oli varustettu vihreällä suodattimena.

; . Reflektanssiarvoja, jotka mitattiin testitilkuilla, jotka • · « ‘vj oli pesty vastaavat PB92-proteaasimutantit sisältävillä pe- V * « f · Φ » ·» 1 · t · • · * t « · • fl « 29 105481 suaineilla, verrattiin mittausten vertailusarjan reflektans-siarvoihin, jotka saatiin PB92-proteaasin sisältävillä pesuaineilla. Mutanttiproteaasien pesutehoarvot laskettiin jakamalla PB92-proteaasin proteiinimäärä (mg) mutanttiproteaasin proteiinimäärällä (mg), joka tarvittiin saman reflektanssin saavuttamiseksi, x 100 %.

Esimerkki 1 A. Erilaisten PB92-proteaasimutanttien pesuteho eurooppalaisissa jauhemaisissa pesuaineissa määritettiin edellä kuvatun menetelmän mukaisesti.

Ruostumatonta terästä oleviin testilaitteisiin, joista jokainen sisälsi esitetyn määrän jauhemaista pesuainetta IEC liuotettuna 250 ml:aan 15 eGH:sta vettä, laitettiin jokaiseen kaksi puuvillaista ja kaksi polyesteri/puuvillaista tilkkua. Jauhemaisen pesuaineen IEC koostumus oli seuraava: komponentti palno-% lineaarinen natriumalkyylibentseeni- 6,4 sulfonaatti (alkaaniketjun keskimääräinen pituus C 11,5) etoksyloitu rasva-alkoholi (14 EO) 2,3 ' natriumsaippua 2,8 « < « v : natriumtripolyfosfaatti (STPP) 35,0 natriumsilikaatti 6,0 ··· magnesiums il ikaatti 1,5 t 1 · 1 karboks imetyyliselluloosa 1,0 natriumsulfaatti 16,8 « · 1 natriumperboraattitetrahydraatti 18,5 TAED 1,5 sekalaista + vettä 100:aan • · • · « '·1 ’ Jokaiseen laitteeseen lisättiin valittu puhdistettu PB92- :.v proteaasimutantti konsentraatiossa, joka vaihteli 0:sta - • « • « « • · • t • · · • · • · • · · • · • « · · 105481 30 1,74 mg:aan (puhdistettua) proteaasia per saippualiuoslitra. Yhtä laitetta käytettiin PB92-proteaasin testaamiseen samalla tavalla vertailua varten. Pesutestit suoritettiin 40 °C:ssa. Tulokset on esitetty taulukossa 1.

« f r • i t t i i

I ( I

f r i i « < • • · • · a aa m «e» « • · a « M· • · • a a • · • « · • · · 9 9 • · a • a « • · · • » a • aa • · · « · « a • · * • 9 a « • · · • · a a 9 9· 9 f • a a a a a • « 31 10::481

Jf S

C. <NOvin«noHcjHvD€0 σ» .μ (O O fOHHMCOH ^

+j Λ 'V. H

h j> i ·

M X

4J

ω ε

(O

m p Λ o, ew loot^inr^oi^fo^o co u \ oh nHHojon in

+j M H H H

Q) w m

•H

-P +J

(1) +j Ό a) 3 Q) »

3 c Λ ΟΗΟΓ^ΝΝΝΟΝΙ'· H

03 .,-1 BS · r-rr-rrrt-i-r ♦

•H « « S HHHHHHHOHH H

(0 w

C -H

ε 0 -- •H c I (0 i +J <D 3 C 4-> -m .S .Ώ 3 8 1 ooor^or^neooiftio c > +j Si c oin^noTfr'^or^®^

Ό H -3 nj Γ -R ~ H H

4-1 ΙΟ Ή fi (N rl # 3 φ -p Μ σι m ^

ε Μ δ CQ (D

c CO (0 > Λ <0 H C__ a) —·

O Ό CflP

c1t= Sm ^ o o o o lAift in R " 3 Mm eno®®® rj in r>

P +J-R cp r- ” H

<0 c ID Ή φ Φ EH a) H m m > m <u c ro w a) id oc > <u λ; ID -P ®a 1-1 .S’(0 H ΟΟΟΟΟΗίΛβΟΟωη

.1 _ <DOi ra m o®OHinc4HOfgr^t^H

-H £ cil äo Di H H H (N H (N H

,. m m σι α> ·η ^ • < ra ai CQ q< -p •,c ro cp Di .. o ~ • · jj

' O

• J-i ·;· a

<1ϊ\ IN

• · · σ\ . · « ί :: Λ • 1 H 3 . m 4-1 m <D 4-1

n <d ω Q

S ® -p (M

S +J 0 H

£5 o Oi n o M ID a £ IWaO«QOQOW« . , (NVO<0«0®OOO<NO(N^>

(ΛΗΗΗΗΟνΟνΟΗΌΗΠ ·· OfMfMININHrHHfMHfNH

OiESJXXwcocoawssw · § · · _ «··«· • · • » · w · 1 « · p » <1» 32 105481 <N CO VO W f" CO O O <T\ CO VO m en CO H H u

H O

in

(N

• I—I

(O u UI <0

UI Z

co o o o vo ho vovocnoin o u s (\ (N (N (N n ro o

O H

o

U

W VO

en f" o h h h o ro o h o h n ·<* in ro m n h e

H CJ (/1 X

<D P ft

C P

•H UI

— Π3 Ή H

P > u

UJ -H K

CD -H

ft +J UJ

λ; -h

oror-r^ioroHrocnin^cvinnH in ero M

OHHrocn^covovoH^voHt^co σι ® E-·

""H H H UJ C

p -H 0) 2 p ro e

X £ H H

+J 0) M-l

(0 -—- Ä -H O

n 3 UJ

^ ro ro -h

•n a M

h inoooininoooininor'ininoo w : e cnr^r^coovooinooir^Hei^aiH» H ^

O HHNNrj H H H UJ e H UJ

^ r—I ·· «H p X *0 όρ en 3 UI g H -H O H ·» O UJ O 0) < ro h o-» s E-1 vootneoHOinoooooonoinino *5 . 2 ... nr'rfvovomvooinococooHnror'in

H H roHMroro H H ro H

. : ·, -n H G < ... <D I <

' +J Π UJ

_ *0 -H Q

: ·· uj m < -h . uj πι +j X > < J H ft H H ·· =g 5 £

···· CO CO CO C0C0 CO »CO

η n μ roro n n ro S_.,r

··· H H H HH H HH

WWW WW W WW ^OOJW

w a σ s o o' « >0 w" a a J 5 ti -¾ r- r- co > > r' r- Ί ij £ £ ronncNCM n n « n n η ν T, I]

HHHHH HHHHHHH

aacuaw aaacucuaa rowe^

η a w a w > J > < w >0' z » os ο &Γ ±! !° m S

ovvovovovovovovovor^vovovovovovovovo 2 ® Ϊ “ voHHHHrororjroroHroMrjroronn K * it

HrjrjrOrjHHHHHnHHHHHHH n n m

SSSSSWWW^WftSW^WWW^W^W^W

Q Q O hi iJ > > > > s’ h" > > > > > > > Ä ?· £ 5 ::: loooi^r^voiovovoiooiioioiovovovoio t; J, Ί 7:

vOVOvOHHHHHHnjlOHHHHHHH ^ ™ Π S

· HHHHHHHHHHHHHHHHHH mmvn

.···. «JjWWSSOOOOWSOOOOOOO

________ * + • 9 * 33 105481 B. Pesutehotesti toistettiin 25 °C:ssa samalla pesuaineella, joka sisälsi joitakin PB92-proteaasimutantteja. PB92-pro-teaasia käytettiin taas vertailuna. Muut testiolosuhteet olivat samat kuin edellä esitetyt. Tulokset on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2 PB92-proteaasimutanttien pesuteho 25 ®C:ssa STPP:ssä, joka sisälsi jauhemaisen pesuaineen, verrattuna PB92-proteaasiin (%).

proteaasi pesuteho (%) pesuainekonsentraatio pesuaineliuoksessa 4 g/1 7 g/1 M216S 90 80 M216Q 95 80 N212D 250 135 S160D 185 120 • 1 · · C. Proteaasien pesuteho määritettiin myös ei-fosfaattisen : valkaisuaineen sisältävässä eurooppalaisessa jauhemaisessa pesuaineessa Launderometer’issä 25 °C:ssa ja 40 eC:ssa.

.:. PB92-proteaasia käytettiin taas vertailuna. Muut testiolo- ·»»· suhteet olivat samat kuin edellä esitetyt. Tulokset on esi- • · · tetty taulukossa 3.

* · · • · . · · · · · » 34 105481

Taulukko 3 PB92-proteaasimutanttien pesuteho 25 ®C:ssa ja 40 eC:ssa ei-fosfaattisen valkaisuaineen sisältävässä eurooppalaisessa jauhemaisessa pesuaineessa verrattuna PB92-proteaasiin (%).

proteaasi pesuteho (%) pesuainekonsentraatio pesuaineliuoksessa 4 g/1 7 g/1 4 g/1 7 g/1

lämpötila 25 °C lämpötila 40 "C

M216S 80 85 100 90 M216Q 80 80 120 100 N212D 170 105 200 75 S160D 170 105 230 165

Esimerkki 2 PB92-proteaasimutantin M216S varastointistabiliteetti testattiin jauhemaisessa pesuaineessa IEC, joka on esitetty esimerkissä l. Varastointistabiliteetti tutkittiin ilmastoi-: duissa laatikoissa 30 °C:ssa ja 80 %:n suhteellisessa kosteu- : : : dessa (relative humidity = RH). Tätä koetta varten proteaasi kapseloitiin seuraavalla tavalla: • · · m • · · ·

Valmistettiin seos (paino/paino): 2 % puhdistettua proteaa- • · · siä, 50 % ionitonta yhdistettä (etoksyloitu C^-C^g-alko-holi, jossa 50-80 EO-yksikköä), 5 % Ti02:ta, 3-10 % CaS04.2H20:ta ja Na2S04:ää 100 %:iin asti. Seos kuumennettiin 65-90 °C: seen ja jäähdytettiin huoneen lämpötilaan. Saatu kiteytynyt seos jauhettiin hiukkasiksi. Hiukkaset, • · joiden läpimitta oli 0,5 - 1 mm, seulottiin ja käytettiin v.· varastointitestiin pesuaineissa.

• · · « « « · t • w 9 9 9 9 9 9 9 9 $ « • • » « 105481 35 · 3,5 g jauhemaista pesuainetta IEC, joka sisälsi mutantin M216S konsentraatiossa 6140 ADU/pesuainegramma, varastoitiin 18 ml:n pulloihin. Vertailua varten PB92-proteaasia varastoitiin samoissa olosuhteissa. Proteaasien jäännösaktiivi-suus mitattiin 2, 4, 5 ja 6 viikon kuluttua. Tulokset on esitetty taulukossa 4.

Taulukko 4 PB92-proteaasin ja sen mutantin M216S jäännösaktiivisuus varastoinnin jälkeen (viikkoissa) 30 ®C:ssa ja 80 %:n suhteellisessa kosteudessa jauhemaisessa pesuaineessa.

proteaasi jäännösaktiivisuus (%) 02456 viikkoa PB92-proteaasi 100 25 5 3 2 M216S 100 68 31 20 11

Esimerkki 3 : PB92-proteaasin ja erilaisten PB92-proteaasimutanttien va-

• I I

v ; rastointistabiliteetti testattiin jauhemaisissa pesuaineis- sa. Varastointistabiliteettitestissä proteaaseja käytettiin ··· kapseloidussa muodossa.

·· 1 · • · · • · · • · ·

Proteaasituotteet valmistettiin sekoittamalla seuraavat kom- • · · ponentit 80 °C:ssa: • · · ♦ 1 · • · • « · • · • · • t · • · • · • · · • · « · « 4 · 4 · » · t 4 36 105481 komponentti paino-% AE1 50

Ti02 2 proteaasi (CEP) 7 PVP 1,5 .._*** .

BHT 1 • Na2S04 tasapaino * AE = C14-C18-alkoholipolyetoksylaatti. Alkoholi etok-syloitiin 50-80 etyleenioksidi(EO)ryhmällä.

** PVP = polyvinyylipyrrolidoni K17 *** BHT = 2,6-bis(tert.-butyyli)-4-metyylifenoli.

Seos kapseloitiin rakeistamalla (by prilling) olennaisesti kuten esitetään GB-patenttijulkaisussa nro 1,603,640. Hiuk-kasfraktiota, jonka hiukkaskoko oli välillä 0,3 - 0,8 mm, käytettiin proteaasien varastointistabiliteetin määrittämiseksi. Kapseloitu proteaasi (140 mg) sekoitettiin ALL®-pe-rusaineen (6,4 g) ja natriumperboraattitetrahydraatin (0,6 g) kanssa. [ALL on Unilever N.V.:n rekisteröity tavaramerkki]. Käytetty ALL-perusjauhe ei sisältänyt entsyymejä eikä valkaisuaineita.

f I f v Entsyymi/pesuaine/natriumperboraattitetrahydraattiseosta in- v · kuboitiin 30 °C:ssa ja 80 %:n suhteellisessa kosteudessa.

Taulukossa 5 on esitetty j äännösaktiivisuus annetun varas-··· tointiajan jälkeen.

• · · i • · · ti» • · · • f • · ·

I I I

• · I · I f · I » 1 • 1 • 1 « • · · • · • • · · • 1 • » • t 1 • · • · • · « • · • · »·» · 37 105481

Taulukko 5 PB92-proteaasin ja sen eräiden mutanttien jäännösaktiivisuus varastoinnin jälkeen (viikkoina) 30 °C:ssa ja 80 %:n suhteellisessa kosteudessa valkaisuainetta sisältävässä jauhemaisessa pesuaineessa.

proteaasi jäännösaktiivisuus (%) 0135 viikkoa PB92-proteaasi 100 51 25 15 M216Q 100 94 84 52 M216S 100 89 83 50 S160D 100 47 20 9 N212D 100 59 31 19

Esimerkki 4 PB92-proteaasi ja erilaiset PB92-proteaasimutantit kapseloitiin menetelmällä, joka on kuvattu esimerkissä 3. Tässä esimerkissä kuitenkin 70 mg kapseloitua proteaasia, jonka

• < I

V : hiukkaskoko oli välillä 0,3 - 0,9 mm, sekoitettiin 3,2 g:n ’·/< : kanssa ALL:ää ja 0,3 g:n kanssa natriumperboraattitetrahyd- raattia. Näytteitä varastoitiin 30 °C:ssa 18 ml:n pulloissa tyhjöeksikkaattorissa. Tyhjöä (25 mmHg) käytettiin varas- ·♦ · · tointiajan kolmena ensimmäisenä päivänä.

• 1 • · • · i

Tyhjöä käytettäessä lisääntyi vesihöyryn kulkeutuminen niin, että systeemi saavutti tasapainonsa 80 %:n suhteellisessa kosteudessa nopeammin kuin systeemeissä, joissa tyhjöä ei käytetty. 80 %:n suhteellinen kosteus aikaansaatiin kalium- (·Μ ; bromidin kyllästetyllä liuoksella.

« « --------- • · · __ • · « • « • ♦ • · · m » • · « · · • » • ·

• »I

· • 1 · 9 · 105481 38

Taulukossa 6 on annettu jäännösaktiivisuudet esitettyjen va-rastointiaikojen (viikkoina) jälkeen.

Taulukko 6 PB92-proteaasin ja sen eräiden mutanttien jäännösaktiivisuus varastoinnin jälkeen 30 °C:ssa ja 80 %:n suhteellisessa kosteudessa valkaisuainetta sisältävässä pesuaineessa.

-—-- proteaasi jäännösaktiivisuus (%) 0123 viikkoa PB92-proteaasi 100 27 22 14 M216Q 100 63 53 44 M216S 100 55 49 31 S160D 100 23 18 13

Esimerkki 5

Valmistettiin seuraava nestemäinen pesuainekoostumus: komponentti paino-%

t t I

v c10-c13 lineaarinen alkyyli- 12 C f f : bentseenisulfonihappo C13-alkoholi, polyetoksyloitu 8 EO 13 ·{· lauriinihappo 8 ···· .·;·. öljyhappo 4 trietanoliamiini 6 • « « 1,2-propaanidioli 6 etanoli 5 natriumsitraatti 4 dietyleenitriamiini-pentaetikka- 0,3 • « « : happo • · •\v kalsiumformiaatti 0,12 • · .···. natriumformiaatti l * « 1 m • · · • · « · • « « 39 105481 boraksi 1,9

NaOH 25%:inen liuos paino/paino pH-arvoon 11,2 vesi tasapaino PB92-proteaasi ja erilaiset PB92-proteaasimutantit lisättiin tähän koostumukseen määränä, jolla proteaasin alkukonsen-traatioksi tuli 0,13 % paino/paino.

Proteaasistabiliteetti (jäännösaktiivisuus prosenteissa) määritettiin proteaasia sisältävästä koostumuksesta varastoinnin jälkeen 37 °C:ssa esitettyjen päivien jälkeen. Tulokset on esitetty taulukossa 7.

Taulukko 7 PB92-proteaasin ja sen eräiden mutanttien jäännösaktiivisuus varastoinnin jälkeen 37 °C:ssa nestemäisessä pesuainekoostu-muksessa.

proteaasi jäännösaktiivisuus (%) 0 5 11 15 21 päivää PB92-proteaasi 100 23 10 5 3 « · V : S160D 100 57 30 14 8 V*! M216Q 100 59 32 18 9 M216S 100 45 18 10 5 ··· N212D 100 38 14 9 4 *··· ··· * « · , t I * s" L - — — — I - I— ' ... — - ... — — — — I - — I- .1 • · • · ·

• · I

Esimerkki 6 PB92-proteaasi ja sen eräät mutantit formuloitiin seuraaval- la tavalla. Jokaisella proteaasilla valmistettiin seos, joka *.* * muodostui seuraavista komponenteista: • » • · · • · · « · • · • · « • · « · • O · *1 »«« • · * * « ·« • « • · • « · · 105481 40 komponentti palno-%

Amylogum CLS 45 sakkaroosi 23 sorbitoli 17 glyseroli 4 parafiiniöljy 3

NaH2P04 0,5 proteaasi (CEP) 5,0 PVP K17 1,5

Ti02 1 Näistä seoksista valmistettiin granulaatit noudattamalla olennaisesti US-patentin nro 4,242,219 esimerkissä 5 kuvattua menetelmää paitsi, että: 1° mainitussa esimerkissä kuvattu seos korvattiin edellä esitetyllä seoksella; 2° käytettyjen suuttimien aukko oli läpimitaltaan 0,7 mm eikä 1,0 mm; 3° granuloita ei päällystetty.

Nämä granulat (140 mg) sekoitettiin ALL-perusaineen (6,5 g) ja natriumperboraattitetrahydraatin (0,6 g) kanssa ja laitettiin 36 ml:n pulloihin.

Proteaasistabiliteetti (jäännösaktiivisuus prosenteissa) I ' V määritettiin sen jälkeen, kun pulloja oli varastoitu 30 °C: i : · ssa ja 80 %:n suhteellisessa kosteudessa annettujen viikko- j\, jen ajan. Tulokset on esitetty taulukossa 8.

* · · f Ml ··« • « ·

• · V

V

• I · « · · ·

Ml » I I f I I •

• I

I I I f I I

• I

* I III

« * · «Il « t > I » · • » * «

f II I I

• f

Ml f * * » · · Ψ 9 41 105481

Taulukko 8 PB92-proteaasin ja sen eräiden mutanttien granulaattien jäännösaktiivisuus pesuaineissa varastoinnin jälkeen, joka tapahtui 30 ®C:ssa ja 80 %:n suhteellisessa kosteudessa.

proteaasi jäännösaktiivisuus (%) 0135 viikkoa PB92-proteaasi 100 45 29 17 M216Q 100 93 66 45 M216S 100 90 70 41 - - — "1 - - - —-

Esimerkki 7 PB92-proteeasin ja sen eräiden mutanttien rakeistetut (prilled) tuotteet valmistettiin ja sekoitettiin pesuaineen ja valkaisuaineen kanssa, kuten esimerkissä 3 kuvataan.

Näiden näytteiden varastointistabiliteetti (jäännösaktiivisuus prosenteissa) määritettiin 30 °C:ssa ja 60/80 %:n suh-teellisessä kosteudessa (vaihtoehtoisesti 60%:inen suhteel- • 1 1 linen kosteus 12 tuntia tai 80%:inen suhteellinen kosteus 12 tuntia). Tulokset on esitetty taulukossa 9.

• »·

Mt *•1« » · · • · · t » t • • » t • · · • · 105481 42

Taulukko 9 PB92-proteaasin ja sen eräiden mutanttien rakeistettujen (prilled) tuotteiden jäännösaktiivisuus varastoinnin jälkeen 30 °C:ssa ja 60/80 %:n suhteellisessa kosteudessa.

proteaasi jäännösaktiivisuus (%) 0 135 viikkoa PB92-proteaasi 100 70 34 15 M216Q 100 98 88 67 M216S 100 93 87 48 S160D 100 67 35 10 N212D 100 75 53 26

Esimerkki 8

Valmistettiin granulat, jotka sisälsivät PB92-proteaasin ja sen eräitä mutantteja, ja sekoitettiin pesuaineen ja valkaisuaineen kanssa kuten esimerkissä 6 esitetään.

Näiden näytteiden varastointistabiliteetti (jäännösaktiivisuus prosenteissa) määritettiin inkuboinnin jälkeen, joka I; tapahtui annetun ajan 30 °C:ssa ja suhteellisessa kosteudes- • · : 1' sa, joka pidettiin 60 %:na 12 tunnin ajan ja vaihtoehtoisesti ti 80 %:na 12 tunnin ajan. Tulokset on esitetty taulukossa • · « : 10.

* · · i i « • • · · *»· 9 9 • 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 105481 43 «

Taulukko 10 PB92-proteaasin ja sen eräiden mutanttien granuloiden jään-nösaktiivisuus varastoinnin jälkeen 30 °C:ssa ja 60/80 %:n suhteellisessa kosteudessa proteaasi jäännösaktiivisuus (%) 0 135 viikkoa PB92-proteaasi 100 54 39 28 M216Q 100 93 81 67 M216S 100 99 87 72

Esimerkki 9 PB92-proteaasi ja sen eräät mutantit testattiin varastoin-tistabiliteetin suhteen valkaisuaineen sisältävässä jauhemaisessa pesuaineessa 30 °C:ssa ja 80 %:n suhteellisessa kosteudessa. Tässä kokeessa proteaaseja käytettiin kapseloidussa muodossa. Jokainen proteaasi kapseloitiin seuraavalla tavalla: • · · 80 °C:ssa valmistettiin seos, jolla oli seuraava koostumus: « « · • · • · ' . komponentti paino-% ioniton yhdiste 45 : Ti02 2 proteaasi (CEP) 10

Na2S04 tasapaino * ioniton yhdiste = C14-C18-alkoholi-polyetoksylaatti (50-80 EO-ryhmää) ; · Edellä esitetyn seoksen annettiin jäähtyä huoneen lämpöti- '···1 laan. Kiinteäksi muuttunut seos jauhettiin pienemmiksi hiuk- 105481 44 kasiksi. Hiukkaset, joiden koko oli 0,3 - 0,8 mm, seulottiin ja käytettiin varastointikokeeseen.

Varastointikoetta varten 140 mg jokaista kapseloitua prote-aasia sekoitettiin 6,4 g:n kanssa jauhemaista ALL-peruspesu-ainetta ja 0,6 g:n kanssa natriumperboraattitetrahydraattia. ALL-perusjauhe ei sisältänyt entsyymejä eikä natriumperbo-raattia. ALL-perusaine/proteaasi/natriumperboraattitetra-hydraattiseosta inkuboitiin 30 °C:ssa ja 80 %:n suhteellisessa kosteudessa.

Proteaasistabiliteetti määritettiin 0, l, 2 tai 4 viikon varastoinnin jälkeen jäännösaktiivisuusprosentteina jokaiselle proteaasille. Tulokset on esitetty taulukossa 11.

Taulukko 11 PB92-proteaasin ja sen eräiden mutanttien jäännösaktiivisuus varastoinnin jälkeen, joka tapahtui 30 °C:ssa ja 80 %:n suhteellisessa kosteudessa valkaisuainetta sisältävässä jauhemaisessa pesuaineessa.

proteaasi jäännösaktiivisuus (%) 0 1 2 4 viikkoa PB92-proteaasi 100 61 36 12 : ” [S160D, M216Q] 100 78 58 35 ···:’ [S160D, M216S] 100 86 68 39 • · · t t · • · · • 9 9 9 9 9 9 9

Esimerkki 10 « PB92-proteaasimutantit testattiin pesutestissä olennaisesti .·;·. samoissa olosuhteissa, jotka on kuvattu esimerkissä 1, pait- si, että 250 mlraan 5 °GH:n vettä Launderometer-laitteessa lisättiin 0,375 g nestemäistä pesuainetta, jonka koostumus :...: oli seuraava: 1 · 45 105481 koostumus paino-% lauriinihappo 8 öljyhappo 4 c10-c13 lineaarinen alkyyli- 12 bentseenisulfonihappo C13-alkoholipolyetoksylaatti, 8 EO 13 trietanoliamiini 6 1,2-propaanidioli 6 etanoli 5 natriumhydroksidi, 45%:inen paino/paino 4 natriumsitraatti 4 vesi 100:aan asti (pesuaineliuoksen pH 7,2)

Erilaisten proteaasien pesuteho tässä nestemäisessä pesuaineessa määritettiin Launderometer'issä 25 °C:ssa 30 minuutin ajan. Pesun jälkeen testattavien vaatteiden reflektanssi mitattiin kuten esimerkissä 1 kuvataan. Mutanttiproteaasien pesuteho määritettiin kuten esimerkissä 1 kuvataan. Tulokset on esitetty taulukossa 12.

• · < · 1 • < ·

• · I

• · « • · • » • 1 · « • · « * 1 · · I»» I 1 · • · ♦ · • · · • · · 46 105481

Taulukko 12 PB92-proteaasimutanttien pesuteho 25 eC:ssa nestemäisessä pesuaineessa.

proteaasi pesuteho spesifinen aktiivisuus verrattuna PB92-proteaasiin (%) 212D + 100 160D + 73 S160G, N212D + 76 M216S 0 40 M216Q 0 37 0: 100 % ± 20 % pesuteho verrattuna PB92-proteaasiin (säilynyt pesuteho) +: > 120 % pesuteho verrattuna PB92-proteaasiin < 80 % pesuteho verrattuna PB92-proteaasiin

Erilaisten proteaasien pesuteho määritettiin kaupallisesti saatavissa olevilla nestemäisillä pesuaineilla Tide®, Wisk® ! ja Ariel®. Ruostumatonta terästä olevat laitteet sisälsivät joko 0,375 g Tide'a 250 ml:ssa 5 °GH:n vettä, 0,375 g • · • ” Wisk'iä 250 ml:ssa 5 °GH:n vettä tai vastaavasti 1,25 g ··.: Ariel'ia 250 ml:ssa 15 °GH:n vettä. Pesuteho määritettiin 25 • · 1 : °C:ssa tai 40 °C:ssa. Muut olosuhteet olivat samat kuin mitä • » ϊ.ί.ϊ kuvataan esimerkissä 1. Tulokset on esitetty taulukossa 13.

I » I

» · • 1 • · « · 47 105481 47

Taulukko 13 PB92-proteaasimutanttien pesuteho Tide-, Wisk ja Ariel-pesuaineissa 25 °C:ssa ja 40 °C:ssa.

proteaasi Tide Wisk Ariel

25 °C 40 eC 25 °C 40 eC 40 eC

N212D ++++ 0 S160D ++++ + M216Q 0 + 0 + + M216S ND 0 0 0 0 S160Q - S160N - 0 S160K - S160A - - -- S160D,M216Q ++++ + S160D, M216S 0-++ 0 M117L, M216Q ND - ND - 0 M117L, M216S ND ND - ND = ei määritetty « · ( 0: 100 % ± 20 % pesuteho verrattuna PB92-proteaasiin +: > 120 % pesuteho verrattuna PB92-proteaasiin • · ; ” -: < 80 % pesuteho verrattuna PB92-proteaasiin

(»I

V

·«·« ··» : Esimerkki 11 • · · • · » PB92-proteaasimutanttien pesuteho määritettiin tilastollisessa reaalimittakaavan pesukonetestissä TNO, Delft, Alankomaat (Cleaning Techniques Research Institute). Näiden mu-tanttien pesutehoa verrattiin PB92-proteaasiin.

» · *

Kaikki proteaasit annostettiin lEC-pesuaineessa proteiini-painon perusteella (0,007 % paino/paino). Aktiivisuuden pe-rusteella näiksi annoksiksi muodostui: 48 105481 PB92-proteaasi 1460 ADU/pesuaine-g M216S 679 ADU/pesuaine-g M216Q 479 ADU/pesuaine-g S160D 1080 ADU/pesuaine-g N212D 1455 ADU/pesuaine-g

Jokaisella pesuaineproteaasikoostumuksella suoritettiin 8 pesutestiä 40 °C:ssa identtisissä AEG Turnamat twinup-pesu-koneissa. Jokaisessa pesukoneessa käytettiin 170 g pesuainetta. Testien aikana arvioitavia pesuaineita käytettiin siten, että jokainen jauhe kävi läpi saman määrän pesukertoja jokaisessa koneessa.

Testien aikana käytettiin Delftin kaupungin normaalia vesijohtovettä, jolla oli seuraavat arvot: alkalisuus (M) : 2,2 mmoolia/1 kovuus (H) : 1,6 mmoolia/1 ( 9 °GH)

lämpötila : 20 °C

Lian- ja tahranpoisto testivaattelsta

Jokaisessa testissä käytettiin kuutta puuvillaista, kolmea tyyppiä olevaa EMPA-tahratilkkua (numerot 111, 116 ja 117), • < r jotka pestiin yhdessä likapyykin kanssa.

« < ' » 9 · • · : ” Sen jälkeen keinotekoisesti tahratun testivaatteen lian- ja tahranpoisto testattiin läpivalaisemalla testivaate sini- • · « V · sellä tristimulus-valolla. Valon määrä, joka emittoitui uu- !,v destaan testivaatteista 45 °:n kulmassa, mitattiin. IEC- julkaisun 456 mukaisesti magnesiumoksidin remissioarvo säädettiin sadaksi. Mitä korkeampi remissioarvo sitä parempi pesumenetelmä tietynlaiselle tahraantumiselle.

• 1 · • · « • · · • f · « « · « 1 • 1 • « · · » f « i « · * « 49 105481

Pesukoneen täyttä

Pesukoneet täytettiin 4,75 kg:11a pyykkiä, joka muodostui testivaatteista ja pyykistä, joka likaantui normaalissa kotitalouskäytössä .

Pyykin koostumus oli: 6 kappaletta keittiöpyyhkeitä 4 kappaletta alusvaatteita 4 vuodelakanaa 4 tyynyliinaa.

Tarvittaessa puhtaita vuodelakanoita ja tyynyliinoja lisättiin vaaditun täyttömäärän saavuttamiseksi.

Jokaista pesuprosessia varten pyykki valittiin huolellisesti. Jokaisella vaatekappaleella, joka valittiin yhteen pesukoneeseen, oli yhtä likainen kaksoiskappale, joka pestiin jossain toisessa pesukoneessa. Tällä tavalla tahraisuus jokaisessa prosessissa oli samanlainen.

» * ! * ·: ( * · • i I · · ««· I · * 4

Ml • · * V · · ·

( ( I

I I I

• I

I I I

• I | • V · • · • · * · •

• f t t I

# 4

« I

• · • »

I I

so 105481 .

pesuprosessin parametrit

ohjelma 40 eC

vesimäärä varsinaisessa pesussa 19 1 aika korkeimpaan lämpötilaan 15 min

korkein lämpötila 43 °C

pesuaika 45 min veden sisäänotto 7 1 lämpötila pesuaineveden laimennoksen jälkeen 30 eC tyhjennys 17 1 5 huuhtelua, jokainen noin 17 litralla kylmää vettä

Remission (V) ja suhteen (R) keskiarvot määritettiin 8 pesu-testin jälkeen. Kahden toisistaan riippumattoman kokeen tulokset on esitetty taulukoissa 14A ja 14B.

Taulukko 14A

Keinotekoisten tahrojen poistaminen proteaasi EMPA-tilkku nro kokonais !·' 111 116 117 M - " I " -- — — -

: V R V R V R V R

»·» > · t · ________________^ ί'ί*; PB92-proteaasi 49 1,00 44 1,00 56 1,00 149 1,00 :Y: M216S 49 1,00 46 1,05 58 1,04 153 1,03 • » • · 4 • » * • « · • · · • · « ·

» I I · I

« 4 t » * > » 51 ί 105481

Taulukko 14B

Keinotekoisten tahrojen poistaminen proteaasi EMPA-tilkku nro kokonais 111_ 116 117__

V R V R VR V R

PB92-proteaasi 41 1,00 35 1,00 46 1,00 123 1,00 M216S 40 0,96 33 0,94 42 0,91 115 0,93 M216Q 42 1,01 35 0,99 43 0,94 120 0,98 — - - - — — — I - - I — — — —

Taulukossa 15 (suhteet (R), jotka saatiin tilastollisesti todellisen mittakaavan pesukonetesteistä, jaettiin vastaavalla suhteella (R'), joka laskettiin pesutehoarvoista, jotka vastasivat PB92-proteaasin arvoja, jotka saatiin Launderometer-pesutestissä samanlaisissa olosuhteissa (10 g/1 IEC, testivaatteet EMPA 116 ja 117, pesuaika 30 min, lämpötila 40 eC).

I · » » • » 1 f . .

• · · ' • · · • · · • · • · · • · · • li ' ' « · « · « ·

• I II I

52 1 0 5 4 81

Taulukko 15

Vastaavuus todellisen mittakaavan pesukonetestin ja Launderometer-pesutestin välillä proteaasi R/R' PB92-proteaasi 1,001 M216S 1,18 M216Q 1,10 S160D 1,02 N212D 0,98 * määrittelemällä

Mutanttien R/R'-arvojen ollessa lähellä 1,0, on se osoitus vastaavuudesta todellisen mittakaavan pesutestien ja Launderometer-testien välillä.

Esimerkki 12 ,--/. Kuviot 2A ja 2B kuvaavat erilaisten PB92-proteaasimutanttien

I I I

pesutehoa määrän ollessa 4 g IEC/1 testien mukaan, jotka on kuvattu esimerkissä 1, verrattuna luontaiseen PB92-proteaa- * ’ siin, niiden spesifisen aktiivisuuden funktiona. Numerot ku- • · vioissa vastaavat seuraavia mutanttiproteaaseja: • · · « « « • ·

1 PB92-proteaasi 11 M216P

2 M216A 12 M216T

3 M216C 13 M216W

4 M216S 14 M216I

5 M216L 15 M216G

6 M216E 16 M117L, H118D

V· 7 M216K 17 M117L, M216Q

53 105481

8 M216H 18 M117L, H118D, M216Q

9 M216N 19 M117L, M216S

10 M216Q 20 M117L, H118D, M216S

21 M169S 31 S259K

22 M216Y 32 W253R

23 M169I, M216S 33 H243R

24 M216-OX 34 H243R, S259K

25 N212S 35 D175N

26 N212D 36 E134K

27 S160G, N212D 37 W235R, S259K

28 L211Y 38 W235R, H243R

29 L211Y, N212S 39 S259K

30 A166D, M169I 40 T207K

41 SI6ON - 51 S160I

42 S160G 52 S160G, M216S

43 S160P 53 S160G, M216Q

44 S160T 54 S160L

45 S160C 55 S160Y

46 S160Q 56 S160D, M216S

47 S160D 57 G116V, S126V, P127E, S128K

48 S160K 58 G116V, S126L, P127N, S128V

49 S160R 59 G116V, S126L, P127Q, S128A

50 S160A 60 G116V, S126V, P127M

· a • · ........ ...

• «

*’ 61 S126M, P127A, S128G

* · «

62 G116V, S126Y, P127G, S128L * 63 G116V, S126N, P127H, S128I

i »

64 G116V, S126H, P127Y

65 G116V, S126R, P127S, S128P

66 G116V, S126F, P127Q

67 G116V, S126G, P127Q, S128I

68 G116V, S126F, P127L, S128T

69 G116V, S126Q, P127D 1 · · · ♦ • · 54 105481

Kuviossa 3 on esitetty erilaisten PB92-proteaasimutanttien pesuteho määrän ollessa 7 g IEC/1 testien mukaan, jotka on esitetty esimerkissä 1, luontaiseen PB92-proteaasiin verrattuna, niiden spesifisen aktiivisuuden funktiona. Numerot kuviossa vastaavat samoja mutanttiproteaaseja kuin numerot kuvioissa 2A ja 2B.

Kaikki julkaisut (mukaan lukien patenttihakemukset), jotka on mainittu tässä selityksessä osoittavat alan ammattimie-hille tekniikan tason, johon tämä keksintö liittyy. Kaikki tässä esitetyt julkaisut liitetään viitteenä samassa laajuudessa kuin jos jokainen yksittäinen julkaisu olisi spesifisesti ja yksilöllisesti esitetty liitettäväksi viitteenä.

Vaikka edellä oleva keksintö on esitetty jossain kohdin kuvaavasti ja esimerkein sen ymmärtämisen selkiyttämiseksi, on selvää alan ammattimiehelle, että siihen voidaan tehdä monia muutoksia ja muunnoksia liitteenä olevien vaatimusten hengestä tai piiristä poikkeamatta.

f < r I i < « f I » · • · » · · f • · · • · · · • · · « · « t I « • · • · 1 • · · • · «tl I I I f · ·

• · I

I I f • · • ·

• MM

« • m

Claims (12)

55 105481 Patent t ivaat iraukset

1. Mutanttiproteaasi käytettäväksi pesuaineissa, tunnettu siitä, että sillä on ainakin 70%:n homologia 5 PB92:n seriiniproteaasin aminohapposekvenssin suhteen, joka aminohapposekvenssi on seuraava H2N-A-Q-S-V-P-W-G-i-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-10 P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-U-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-15 A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH, että se eroaa mainitusta PB92-seriiniproteaasista ainakin yhden aminohappotähteen suhteen asemissa, jotka vastaavat PB92-seriiniproteaasin asemia 99, 102, 116, 126, 127, 20 128, 130, 160, 203, 211, 212 ja 216, että sillä on parantunut pesuteho ja/tai parantunut stabiilisuus mainittuun PB92-seriiniproteaasiin verrattuna, :T: ja että se on valmistettavissa menetelmällä, jossa viljel-", 25 lään sopivissa käymisolosuhteissa isäntäkantaa, joka on ... transformoitu ilmentymisvektorilla, joka sisältää mutant- tiproteaasia koodit tavan DNA-sekvenssin, ja mainittu • · · ; . tuotettu proteaasi otetaan talteen. • · · • · · • ·

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen mutanttiproteaasi, • · · tunnettu siitä, että sillä on patenttivaatimuk- • « · :.,.i sessa 1 esitetty aminohapposekvenssi, kuitenkin siten, että mainitussa aminohapposekvenssissä on mutatoitu ai- I · nakin yksi seuraavista: 35. asemassa 116 tähteeksi V, • · :.· : S asemassa 126 tähteeksi F, H, L, M, Q, R tai V, P asemassa 127 tähteeksi A, E, L, M, N, Q, S tai V, 56 105481 S asemassa 128 tähteeksi A, G, K, P( T tai V, S asemassa 160 tähteeksi C, D, G tai N, N asemassa 212 tähteeksi D ja M asemassa 216 tähteeksi Q tai S. 5

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen mutanttiproteaa- si, tunnettu siitä, että se on PB92-seriinipro-teaasin mutantti [M216S] ; [M216Q] ; [N212D] ; [S160D] ,· [S160G, N212D]; [S160D, M216Q]; [S160D, M216S]; [A166D,

4. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koo-dittaa jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaista mutant- 20 tiproteaasia.

5. Ilmentymisvektori, tunnet tu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 4 mukaisen DNA-sekvenssin.

6. Bacillus-isäntäkanta, tunnettu siitä, että ... se on transformoitu patenttivaatimuksen 5 mukaisella • · · · ilmentymisvektorilla, ja on edullisesti B. subtilis, B. • · t licheniformis tai B. amyloliquefaciens. • o

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen Bacillus-isäntäkanta, • t · tunnettu siitä, että se on alkalof iilinen Bacil- • · · lus-kanta Bacillus nov. spec. PB92 tai sen mutantti.

. , 8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen Bacillus-isäntäkanta, 35 tunnettu siitä, että se olennaisesti on ky- 105481 57 kenemätön tuottamaan solun ulkopuolisia proteolyyttisiä entsyymejä ennen mainittua transformaatiota.

9. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen 5 mutanttiproteaasin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään sopivissa käymisolosuhteissa isän-täkantaa, joka on transformoitu ilmentymisvektorilla, joka sisältää mutanttiproteaasia koodittavan DNA-sekvens-sin, ja mainittu tuotettu proteaasi otetaan talteen. 10

10. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää yhden tai useamman patenttivaatimusten 1-3 mukaisista mutanttiproteaaseista.

10 M169I]; [G116V, S126V, P127E, S128K]; [G116V, S126G, P127Q, S128I]; [G116V, S126L, P127N, S128V]; [G116V, S126L, P127Q, S128A]; [G116V, S126V, P127M]; [G116V, S126H, P127Y]; [G116V, S126R, P127S, S128P]; [G116V, S126F, P127Q]; [G116V, S126F, P127L, S128T]; [S126M,

15 P127A, S128G]; [S126M, P127A, S128G, S160D]; tai [G116V, S126N, P127S, S128A, S160D].

11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen mutantti proteaasin käyttö pesuainekoostumuksessa.

12. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen mutanttiproteaasin käyttö pesuprosessissa. f t I • · · • · · · • · 1 • · · • 1 * · · • · « • · ·« · • · · * · · ·♦· • · • « » • · · m · • f · • « I • · · · IM · · 105481