DE1617951C3 - Verfahren zur Herstellung von Kasugamycin - Google Patents

Description

C₁₄H₂₅O₉N₃ · HCI · H₂O

HCl · H₂O

Der Diaminozucker ist 2,3,4,6-Tetradesoxy-2,4-diamino-D-mannose. Die glykosidische Bindung ist in der α-Stellung. Der rechte Teil ist i>Inosit. Die Wasserstoffatome in den Stellungen C₁, C₂, C₃ und C₆ in dem D-Inosit sind axial, während die Wasserstoffatome in den Stellungen C₄ und C₅ äquatorial sind.

Kasugamycin inhibiert Piricularia oryzae, welche den Reisbrand verursachen, sowie Pseudomonas und zeigt gegenüber Menschen, Tieren, Fischen und Pflanzen eine geringe Toxizität. Dieses Antibiotikum wird zur Verhütung des Reisbrandes auf den Markt gebracht und wird außerdem als Chemotherapeutikum gegen Pseudomonas-Infektionen beim Menschen verwendet.

Experimentelle Methoden

1. Wertbestimmung von Kasugamycin: Pseudomonas fluorescens (ein Saprophyt, welches verschiedene fluoreszierende Pigmente erzeugt) wird auf ein Schrägagar aufgeimpft, das aus 0,2% Natriumglutamat, 0,2% K₂HPO₄, 0,1% MgCl₂-OH₂O, 0,01% FeSO₄-7H₂O, 2,0% Rohrzucker, 0,2% Nährhefe, 0,5% Pepton und 1,2% Agar (pH 6,8) besteht, und bei 27°C 24 Stunden lang inkubiert. Aus diesem Schrägagar wird das Impfmaterial in eine Fleischbrühe eingeimpft, die 1% Glukose enthält, und 24 Stunden lang bei 27° C inkubiert. Dann werden 10 ecm eines Mediums, das aus 0,5% Glukose, 0,5% Pepton und 2,0% Agar besteht, in eine Petri-Schale (Durchmesser 9 cm) gegeben und mit der Züchtungsschicht überschichtet, die aus 5 ecm des gleichen Mediums hergestellt wurde, welches mit der vorstehenden Kulturbrühe mit einer Konzentration von 0,5% beimpft worden war. Scheiben mit einem Durchmesser von 8 cm, die eine Testprobe enthalten, werden 17 bis 18 Stunden lang bei 27° C inkubiert. Die Probe

und der Standard (reines Kasugamycinhydrochlorid) werden mit einem PhosphatpuiTer mit einem pH-Wert von 7,0 verdünnt. Kasugamycin zeigt gewöhnlich bei 400mcg/ml eine Hemmung mit einem Durchmesser von ungefähr 22 mm.

2. Schüttelkultur: Sie wird in Kolben mit einem Inhalt von 500 ecm auf einer sich hin und her bewegenden Schüttelmaschine (Amplitude 8 cm bei 150 Hin- und Herbewegungen pro Minute) oder in Erlenmeyer-Kolben mit einem Inhalt von 500 ecm auf einer Dreh-Schüttelmaschine (2CO UpIA) durchgeführt.

3. Identifizierung von Kasugamycin: Kasugamycin in dem Kulturfiltrat wird an einem Kationenaustauscherharz (Harze mit Sulfonsäureradikalen als ,₅ aktive Gruppen) adsorbiert, das Sulfonsäure als aktive Gruppe enthält, die als H⁺- oder NH₄ ^1--TyP verwendet wird; das adsorbierte Kasugamycin wird mit verdünntem wäßrigem Ammoniak eluiert und nach der Neutralisation mit verdünnter HCl und _20: erfolgter Konzentration mit Äthanol ausgefällt und getrocknet. Das Pulver wird einer Elektrophorese mit hoher Spannung unterzogen, wobei gleichzeitig zu Vergleichszwecken reines Kasugamycin bei 3000V/ 40 cm behandelt wird. Erforderlichenfalls wird es in ₂$ Form seines Hydrochlorids aus Wasser durch Zugabe von Äthanol umkristallisiert.

Verschiedene Kohlenstoffquellen werden einem Medium zugesetzt, das aus 2,5% Sojabohnenmehl, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% K₂HPO₄ und 0,05% MgSO₄ · 7H₂O besteht, worauf die Kasugamycin-Ausbeute in den verschiedenen Medien bestimmt wird. 70 ecm eines jeden Mediums werden in jeweils einen Kolben gegeben und unter Schütteln gezüchtet. Das Medium wird 15 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. Eine Sporensuspension einer Kultur von Streptomyces kasugaensis (britische Patentschrift 1149 080 und schweizerische Patentschrift 473 893) wird aufgeimpft. Nach 6 oder 7 Tagen wird die höchste Ausbeute in allen Fällen bestimmt, wobei folgende Ergebnisse erhalten werden: 1360mcg/ml mit 3,0% Maltose, 1400mcg/ml mit 1,0% Sojabohnenöl, 2240mcg/ml mit 2,0% Sojabohnenöl und 2120mcg/ml mit 3,0% Sojabohnenöl. Man sieht also, daß das Sojabohnenöl gegenüber Maltose als Kohlenstoffquelle zur Herstellung von Kasugamycin nicht unterlegen, sondern überlegen ist. Verunreinigungen der Maltose vermindern oft die Ausbeute an Kasugamycin, so daß aus praktischen Gründen Sojabohnenöl gegenüber Maltose zur Herstellung weit überlegen ist. Maltose oder Glycerin ist als beste Kohlenstoffquelle für die Herstellung bekanntgeworden. Unter Verwendung des gleichen Grundmediums, welches vorstehend beschrieben wird, werden verschiedene öle oder Fette in einer Menge von 2,0% zugesetzt und die gleiche Kultur von Streptomyces kasugaensis unter Schütteln gezüchtet. Anschließend werden folgende maximale Ausbeuten ermittelt: 2400mcg/ccm mit Kokosnußöl, 2750 mcg/ccm mit Erdnußöl, 1800 mcg/ccm mit Olivenöl, 2500 mcg/ml mit Sojabohnenöl, 2300 mcg/ccm mit Leinsamenöl, 2400 mcg/ccm mit Rapsöl, 2350 meg/ ecm mit Baumwollsamenöl, 2050 mcg/ccm mit Walöl, 2400 mcg/ccm mit Schweinefett und 2300 mcg/ccm mit Butter. Bei den vorstehend beschriebenen Versuchen wird ein Sojabohnenmehl in Pulverform verwendet, aus welchem öle und Fette entfernt worden sind. Enthält ein als Stickstoffquelle verwendetes Material öle oder Fette, dann können die öle oder Fette in diesem Material zur Herstellung mit oder ohne Zugabe von ölen nutzbar gemacht werden, öle oder Fette in Materialien, wie Sojabohnensamen, Erdnußsamen oder Baumwollsamen können als Kohlenstoffquelle für die Herstellung von Kasugamycinstämmen und zur Herstellung von Kasugamycin verwendet werden. Das Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des neuen Antibiotikums Kasugamycin ist in der deutschen Auslegeschrift 1 236 727 beschrieben. Dabei werden die Stämme ATCC 15714 und ATCC 15715 verwendet.

Bei einem ähnlichen Versuch, wie er vorstehend beschrieben wird, wird ein Kasugamycin erzeugender Stamm in ein Medium eingeimpft, das 6,0% vermahlenen Sojabohnensamen, 0,05% K₂HPO₄, 0,1% NaCl und 0,05% MgSO₄ · 7H₂O enthält; auf diese Weise werden 2720 mcg/ccm Kasugamycin nach 7tägigem, unter Schütteln erfolgendem Züchten gewonnen. Kasugamycin wird ■ ferner nach 7tägiger Züchtungsdauer in einem Medium, das 8,0% vermahlenen Erdnußsamen an Stelle des vermahlenen Sojabohnensamens enthält, in einer Ausbeute von 2460 mcg/ccm erhalten.

öle oder Fette sind Kohlenstoffquellen, die zur Herstellung von Kasugamycin auch in solchen Medien geeignet sind, die andere Stickstoffquellen außer Sojabohnenmehl enthalten. Es werden hohe Kasugamycinausbeuten in Medien erzielt, die Nährhefe, Fleischextrakt, Pepton, Molke oder anorganischen Stickstoff als Stickstoffquelle enthalten. Nicht nur pflanzliche öle, pflanzliche Fette, tierische öle oder tierische Fette, sondern auch Fettsäuren oder deren Ester sind als Kohlenstoffquellen zur Herstellung von Kasugamycin geeignet. Nach der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise werden Versuche durchgeführt, bei denen eine verschiedene Unterkultur von Streptomyces kasugaensis verwendet wird; es werden folgende Kasugamycinausbeuten in Medien erhalten, die 2,0% Fettsäure oder Fettsäureester enthalten: 1050 mcg/ccm mit Palmitinsäure, 1200 mcg/ccm mit Stearinsäure, 320 mcg/ccm mit Glycerintristearat, 3100 mcg/ccm mit Glycerintrioleat, 910 mcg/ccm mit Methylpalmitat, 1800 mcg/ccm mit Methyloleat, 1840 mcg/ccm mit Äthyloleat, 1800 mcg/ccm mit Butyloleat, 320 mcg/ccm mit 2,0% Glycerin und 880 meg/ ecm mit 3,0% Maltose. Es sind also nicht nur Glycerin, sondern auch Fettsäuren, die Hydrolyseprodukte von ölen oder Fetten darstellen, zur Herstellung von Kasugamycin geeignet. Der produktivste Stamm (s. deutsche Auslegeschrift 1 236 727) der erhalten werden kann, erzeugt bei einem unter Schütteln durchgeführten Züchtungsverfahren 10 000 mcg/ml Kasugamycin in einem Medium, das aus 6,0% Sojabohnenöl und 5,0% Sojabohnenmehl (der anfängliche pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt) besteht.

B e i s ρ i e 1 1

70 ml eines Mediums, das 0,3% Nährhefe, 0,4% Pepton, 0,1% K₂HPO₄, 0,1% NaCl, 0,05% MgSO₄ · 7H₂O, 0,02% FeSO₄ · 7H₂O und 0,5% Sojabohnenöl enthält, werden in einen Kolben mit einem Inhalt von j 500 ecm gegeben und 20 Minuten lang bei 120° C sterilisiert. Eine Mischung aus Myzel und Sporen von Streptomyces kasugaensis (s. deutsche Auslegeschrift 1 236 727) auf einer Schrägagarkultur wird in 5 Kolben eingeimpft, die das sterilisierte Medium enthalten und unter Schütteln bei 28 bis 30° C gezüchtet.

Während der unter Schütteln erfolgenden Züchtung werden alle 24 Stunden viermal 0,5% Sojabohnenöl zugesetzt. Die durchschnittliche Menge an Kasugamycin in den 5 Kolben beträgt 2880 mcg/ccm. Die Brühen in den 5 Kolben werden vereinigt und filtriert, wobei 280 ecm Filtrat erhalten werden, das 2900 mcg/ccm Kasugamycin enthält. Das Filtrat wird durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm geleitet, welche 50 ecm schwefelsaures Harz in der NH₄ ¹"-Form enthält. Nach der Durchschickung von 500 ml Wasser werden 0,5 η-ΝΗ,,/Η durchlaufen gelassen, wobei in einer Menge von 32 ecm ein Eluat erhalten wird, welches Aktivität besitzt. Es wird mit 1 n-HCl neutralisiert und liefert nach der Konzentrierung im Vakuum und nach dem Trocknen 2,1 g eines hellbraunen Pulvers. Es enthält 540 mg Kasugamycin, die Hochspannungs-Elektrophorose zeigt, daß es nur Kasugamycin als antimikrobielle Substanz enthält.

Beispiel 2

Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wird derselbe Stamm unter Schütteln 48 Stunden lang in einem Medium gezüchtet, das 2,5% Sojabohnenmehl (das Fett ist entfernt), 0,1% K₂HPO₄,0,3% NaCl, 0,04% ZnSO₄ · 5H₂O, 0,3% Glukose und 1,5% Sojabohnenöl enthält. 75 ecm der auf diese Weise erhaltenen Brühe werden in 10 1 Medium eingeimpft, das aus 2,5% Sojabohnenmehl (das Fett ist entfernt), 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7H₂O, 2,2% gereinigtem Walöl und 0,02% Silikonharz als Antischaummittel (der anfängliche pH-Wert wird auf 6,8 eingestellt) enthält, worauf 25 Minuten lang in einem Fermentationsgefäß mit einem Inhalt von 201 bei 12O⁰C sterilisiert wird. Die Fermentation erfolgt unter Rühren (300 Upm), wobei 10 1 Luft/Minute bei einer Temperatur von 28⁰C durchgeleitet werden. Nach 96 Stunden werden 2350 mcg/ccm Kasugamycin erhalten. 300 ecm des Mediums werden entnommen, worauf das Kasugamycin nach der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise extrahiert wird; auf diese Weise werden 2,1 g eines Pulvers erhalten, das 415 mg Kasugamycin enthält. Dieses Pulver wird in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm durchlaufen gelassen, die 50 ml eines stark sauren SO₃-Gruppen enthaltenden Austauscherharzes in der H⁺-Form enthält, worauf 50 ecm Wasser durchgeschickt werden. Das adsorbierte Kasugamycin wird mit 1 n-HCl eluiert. 23 ecm des Eluats mit antimikrobieller Aktivität werden mittels eines Anionenaustauscherharzes (Amberlite IRA 401 ist ein stark basisches Anionenaustauscherharz, und die aktiven Austauschradikale bestehen aus — N(CH₃)₂X) auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und unter Vakuum auf 5 ecm konzentriert, worauf 50 ecm Äthanol zugesetzt werden. Auf diese Weise kristallisierten 210 mg Kasugamycinhydrochlorid (C₁₄H₂₅O₉N₃HCl · H₂O).

Beispiel 3

Nach der im Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise wird ein Kasugamycin produzierender Stamm (ATCC 15714 oder ATCC 15715, s. deutsche Auslegeschrift 1 236 727) in einem Fermentationsgefäß gezüchtet. Das Medium in dem Fermentationsgefäß enthält 3,0% Nährhefe, 0,1% NaCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7H₂O und 2,0% Schweinefettöl. Nach 92 Stunden werden 2860 mcg/ccm Kasugamycin erhalten.

Beispiel 4

1 1 eines Mediums, das 4,0% Sojabohnenöl, 5,0% Sojabohnenmehl, 1,0% Glukose und 0,1% K₂HPO₄ enthält, wird in einen Erlenmeyer-Kolben mit einem Inhalt von 5 1 gegeben und 20 Minuten lang bei 120° C sterilisiert. Sporen einer Kultur von Streptomyces kasugaensis werden eingeimpft, worauf unter Schütteln mittels einer Drehschüttelmaschine 48 Stunden lang bei 27 bis 28⁰C gezüchtet wird. Der anfängliche pH-Wert des Mediums wird auf 6,5 eingestellt. Die auf diese Weise erhaltene Brühe wird in 1200 1 eines Mediums eingeimpft, das sich in einem aus rostfreiem Stahl bestehenden Fermentationsgefäß mit einem Inhalt von 2000 1 befindet. Das Medium enthält 4,0% Sojabohnenöl, 5,0% Sojabohnenmehl und 0,1% K₂HPO₄.

Der anfängliche pH-Wert wird auf 6,3 eingestellt. Die Fermentation wird bei 28⁰C unter Rühren (200 UpM) und unter Durchleiten von 4001 Luft/ Minute 24 Stunden lang durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltene Brühe wird in 15 000 1 eines Mediums eingeimpft, das sich in einem Fermentationsgefäß aus Kohlenstoffstahl mit einem Fassungsvermögen von 25 000 1 befindet. Das Medium enthält 5,0% Sojabohnenöl, 7,0% Sojabohnenmehl und 0,.l% K₂HPO₄. Der anfängliche pH-Wert beträgt 6,3 bis 6,4. Die Fermentation wird unter Rühren (150UpM) und unter Durchleiten von 50001 Luft/Minute bei 28° C durchgeführt. Nach 20 Stunden steigt der pH-Wert auf 7,8 und wird anschließend durch Zugabe von Phosphorsäure auf 6,5 eingestellt. Diese Einstellung des pH-Wertes wird außerdem nach 25 und 29 Stunden durchgeführt. Nach 96 Stunden werden 2300 mcg/ccm

Kasugamycin erhalten, der pH-Wert beträgt 7,2. Nach 160 Stunden fallen 5900 mcg/ccm Kasugamycin bei einem pH-Wert von 5,0 an. Nach 220 Stunden beträgt die Menge des erhaltenen Kasugamycins 7900 mcg/ccm (der pH-Wert beträgt 5,3). Die Fermentation wird beendet und der pH mittels Schwefelsäure auf 5,0 eingestellt; dann wird unter Zusatz von 100 kg Diatomeenerde filtriert. Der Kuchen wird mit Wasser gewaschen, worauf das Waschwasser dem Filtrat zugesetzt wird; 300001 Flüssigkeit, die 111 kg Kasugamycin enthalten, werden auf diese Weise gewonnen. Die Flüssigkeit wird durch eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 m, die 5000 1 eines stark saure SO₃-Gruppen enthaltenden Austauscherharz in Na⁺- Form enthält, durchlaufen gelassen. Danach werden 0,5 n-NaOH nachgeschickt. Ein erstes, Kasugamycin enthaltendes Eluat (4000 1) ist neutral, während das zweite Eluat alkalisch ist und mit Carboxylharz in der H⁺-Form neutralisiert wird. Das vereinigte Eluat wird mittels Schwefelsäure auf einen pH von 5,0 eingestellt. Es wird mittels eines Filmverdampfers auf 500 1 konzentriert, worauf die konzentrierte Lösung unter Verwendung eines Sprühtrockners getrocknet wird. Auf diese Weise werden 198 kg eines Pulvers erhalten, das 83 kg Kasugamycin enthält. Dieses Pulver ist für eine Verwendung in der Landwirtschaft geeignet. 500 g dieses Pulvers werden in 3500 ecm destilliertem Wasser gelöst, worauf die Lösung durch eine Säule geschickt wird, die 1500 ecm eines An-

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Kasugamycin, durch Züchten eines Kasugamycin produzierenden Stammes unter submersen aeroben Bedingungen in Kulturmedien, dadurch gekennzeichnet, daß die Medien pflanzliche und tierische öle, pflanzliche und tierische Fette, Fettsäuren oder Fettsäureester als Hauptkohlenstoffquellen enthalten.

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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kasugamycin durch Züchtungeines Kasugamycin produzierenden Stammes unter submersen aeroben Bedingungen in Kulturmedien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Medien pflanzliche und tierische öle, pflanzliche und tierische Fette, Fettsäuren oder Fettsäureester als Hauptkohlenstoffquellen enthalten.

   Zu dem Medium kann als Stickstoffquelle ein Stickstoff enthaltendes Nährmaterial zugegeben werden. Dies sind beispielsweise Peptone, Fleischextrakte, Maiswasser, Erdnuß- und Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, Casein, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen. Die Medien enthalten anorganische Salze, wie beispielsweise Natriumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumphösphat, Kalziumkar-

   Kasugamycin

   bonat und Magnesiumsulfat. Ein Material, wie vermahlener Sojabohnensamen oder vermahlener Erdnußsamen, das sowohl die Stickstoffquelle als auch öle oder Fette enthält, kann ebenfalls verwendet werden.

   Kasugamycin ist ein Antibiotikum, das von Umezawa, Okami Mashimoto, Suhara, Hamada und Takeuchi (vgl. Journal of Antibiotics, Series A, 18, 101 bis 103, 1965) entdeckt wurde; es wird in Form des salzsauren Salzes, C₁₄H₂₅ O₉N₃ · HCl · H₂ O, kristallisiert, welches in Wasser löslich und in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Äther, Chloroform und Benzol schwer löslich ist. Dieses Salz zeigt zwischen 220 und 400 ηΐμ keine maximale Absorption von ultraviolettem Licht und liefert mit einem Ninhydrin-Reagens in Pyridin eine positive Reaktion. Die Sakaguchi-, Molisch-, Elson-, Morgan-, Fehling-, Tollens- und Eisen(III)-chlorid-Reaktionen verlaufen negativ. Die Verbindung besitzt eine Rechtsdrehung von [>]^? ₀ ⁵ = +120⁰C (c = 1,6,H₂O), der Schmelzpunkt liegt bei 236 bis 239° C (Zersetzung), während die pK-Werte niedriger als 2, 7,1 und 10,6 sind. Kasugamycin kann ferner in Form der freien Säure, C₁₄H₂₅O₉N₃ · H₂O, zur Kristallisation gebracht werden und ist in dieser Form in Wasser löslich. Die Verbindung schmilzt bei 207 bis 216° C unter Zersetzung und besitzt eine Drehung von [«] ²S + 115° C (c = 1, H₂O). Die Struktur von Kasugamycin wurde von Subara, Maeda, Umezawa, Ohno (tetrahedron Letters, Nr. 12, 1239 bis 1244, 1966) untersucht und wie folgt gefunden: