DE2057033C2

DE2057033C2 - Antibiotikum Thiopeptin A↓4↓ und dessen Verwendung in Futtermittelzusätzen

Info

Publication number: DE2057033C2
Application number: DE2057033A
Authority: DE
Inventors: Koichi Toyonaka Ikushima; Hiroshi Ikeda Imanaka; Masanobu Suita Kohsaka; Norimasa Suita Miyairi; Toshio Ibaraki Miyoshi
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-11-21
Filing date: 1970-11-20
Publication date: 1983-01-05
Also published as: NL7017020A; DE2057033A1; FR2073403A2; NL169755C; FR2073403B2; CA960168A; GB1330900A

Description

2. Verwendung von Thiopeptin A4 gemäß Anspruch I in Futtermittelzusätzen.

Die Erfindung betrifft eine Komponente des Antibiotikums Thiopeptin, nämlich die Komponente Thiopeptin A4. Thiopeptin A4 kann in verdünnter Form, als rohe Konzentrate und in reiner kristalliner Form vorliegen. Das Thiopeptin A₄ besitzt eine antibakterielle Aktivität gegenüber einer Vielzahl von Mikroorganismen und ist nützlich als Zusatzstoff für Futtermittel.

Das erfindungsgemäße Thiopeptin A₄ läßt sich wie im Patentanspruch 1 angegeben charakterisieren. Die •nspruchsgemäße angenäherte Summenformel und der Paramter /wurden nach dem Anmeldetag nachgereicht.

Das Thiopeptin A₄ wurde in einer Fermentationsbrühe gefunden, in der Streptomyces tateyamcnsis ATCC 389 in einem wäßrigen Nährmedium unter den in der DE-OS 19 29 355 beschriebenen Bedingungen kultiviert wurde, die die Thiopeptin-Komponenten Ai, A2, A] und B sowie Verfahren zu deren Herstellung betrifft. Hierzu kann nach der DE-OS 19 29 355 Streptomyces tateyamensis in dem wäßrigen Nährmedium unter submerscn aeroben Bedingungen behandelt werden. Das zur Züchtung von Streptomyces tateyamensis brauchbare Nährmedium zur Herstellung von Thiopeptin enthält sowohl eine Kohlenstoffquelle, beispielsweise ein assimilierbares Kohlehydrat, als auch eine Stickstoffquelle, beispielsweise eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder ein proteinartiges Material. Beispiele für brauchbare Kohlenstoffquellen sind Stärke, Glucose, Saccharose und Glyzerin. Beispiele für brauchbare Stickstoffquellen sind Fleischextrakt, Peptor.. Glutinmehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser, trockene Hefe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Casaminosäure und Harnstoff. Es können auch Kombinationen dieser Kohlenstoff-

ls und/oder Stickstoffqueilen verwendet werden. Anorganische Salze, die zur Bildung von Ionen befähigt sind, wie Kalium, Natrium, Calcium, Phosphat und Sulfat, können dem Kulturmedium zugesetzt werden. Spurenelemente, wie Magnesium, Mangan, Zink ,"nd Eisen können ebenfalls dem Kulturmedium zugefügt werden. Derartige Spurenmetalle können als Verunreinigungen beiläufig mit der Zugabe der Bestandteile des Mediums geliefert werden. Es ist deshalb darauf hinzuweisen, daß die Zugabe von solchen Spurenmetallen oder anorgani sehen Salzen effektiv erfolgt, wenn der das Antibioti kum produzierende Mikroorganismus sie als Komponente des Kulturmediums benötigt Vitamine wie Inosit. Vitamin Bu, Isoasv orbinsäure und Biotin können dem für die Züchtung verwendeten Medium ebenfalls zugesetzt werden.

Zur Gewinnung einer möglichst hohen Ausbeute an Thiopeptin aus dem vorstehend beschriebenen Medium ist die Verwendung von Schwefelverbindungen organischer oder anorganischer Art erforderlich. Beispiele für solche Schwefelverbindungen sind N-Acetyl-DL-methionin. Methionin. 2-Naphthol-6.8-disulfonsäure. Natriumsulfosalicylat, Natriumcetylsulfat, Taurin, Thionin. Methylorange und Natriumsulfat Die günstigsten Schwefelverbindungen sind N-Acetyl-DL-methionin und Natriumsulfat Aus wirtschafteten Gründen wird Natriumsulfat verwendet.

Optimale Ausbeuten an Thiopeptin werden erhalten, wenn die Züchtung bei einer Temperatur durchgeführt wird, die ein zufriedenstellendes Wachstum des

Mikroorganismus zur Folge hat und zwischen etwa

24° C und etwa 37° C, am besten zwischen etwa 27° C und etwa 32" C. liegt, wobei die Züchtungsdauer etwa 2 bis etwa 6 Tage beträgt.

Nachdem die Züchtung durchgeführt worden ist. kann

nach der DE-OS 19 29 355 eine Vielzahl von Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Thiopeptin angewendet werden. Geeignete Verfahren sind beispielsweise die Lösungsmittelextraktion, die Chromatographie und die Kristallisation aus Lösungsmitteln.

Nach einem zweckmäßigen Gewinnungsverfahren wird das Thiopeptin aus der gesamten Fermentationsbrühe dadurch gewonnen, daß der Mycelkuchen nach konventionellen Verfahren, z. B. durch Filtration oder Zentrifugieren, abgetrennt und dann einer Extraktion mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels, wie Aceton oder Methanol, unterworfen wird. Aceton ist das günstigere Extraktions-Lösungsmittel. Der erhaltene Extrakt kann nach üblichen Verfahren konzentriert werden, wobei ein Rückstand erhalten wird, der wiederum einer Extraktion mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Äthylacetat oder Chloroform unterworfen wird. Eine unreine kristalline Masse von Thiopeptin kann dadurch erhalten

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werdun, daß der erha''?:if Extr&k' zu einem Rückstand konzentriert wird, der dann auf Zimmertemperatur abgekühlt wird. Die unreine kristalline Masse von Thiopieptin kann auch dadurch erhalten werden, daß der erhallene Extrakt zu einem Rückstand konzentriert wird, der dann wiederum in einem organischen Lösungsmittel wie η-Hexan oder Pctrolätha ge!w>: •vird, um dann eine Fällung zu bewirken. Die den Thiopcptinantibiotika-Kompiex bildenden Komponenten können nach der DE-OS 19 29 355 dadurch'⁰ voneinander getrennt werden, daß die unreine kristalline SrA-sreihmg; die wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Chloroform gelöst und die Lösung dann der Kolonnenchroma'ographie mit einem geeigneten organischen Lösungsmittelsystem unterworfen wird, wobei Chloroform und Methanol bevorzugt verwendet werden.

Es wurde nunmehr überraschenderweise gefunden, daß die Fraktionen, die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren der DE-OS 19 29 355 aus einer Silicajj el-Kolonne mit einem Gemisch üus Chloroform und Methanol (50:1) gewonnen wurden, eine ander: Komponente enthielten, die durch aufsteigende Papierchromatographie abgetrennt wurde, wobei ein Gemisch aus Athylacelat, n-Hexan und 2 N-Ammoniak (4:1 :1) und andere Lösungsmittelsysteme verwendet wurde n. die zur Abtrennung der Thiopeptin- A₄- Komponente befähigt sind.

Die erfindungsgemäße Komponente kann durch ^Μ Chromatographie wie Papier- und Dünnschicht-Chromatographie abgetrennt werden. Das Entwicklungssystem enthält die gleichen Lösungsmittel, wie sie auch zur Abtrennung der anderen vier Komponenten des Thiopi:ptins eingesetzt werden. Wenn ein Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 50 :1 verwendet wird, werden die Fraktionen Thiopeptin Ai, Aj, A) und A4 nacheinander von der mit Silicagel gefüllten Kolonne gewonnen, auf die der Thiopeptin-Kompiex adsorbiert worden war. Die Fraktionen eines Gemisches von Thiopeptin-A-Komponenten werden ebenfalls erhalten. In diesem Falle können die gleichen Gewinnungsverfahren, wie sie oben verwendet wurden, wiederholt angewandt werden. Die Thiopeptin-A«· Komponente kann dadurch kristallisiert werden, daß desser Fraktion zur Trockene eingeengt und der Rückstand in Aceton gelöst wird.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum Thiopeptin A4 wirkt antibakteriell. Es läßt sich günstig in Futtermittelzusälzcn verwenden, da es bereits nach 48 Stunden völlig ausgeschieden wird 'jnd auch nicht in Spuren in den Oi'ganen zurückbleibt (vgl. »Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 19/2. Sei'en 496-503). Thiopeptin A< erweist sich gegenüber bekannten Antibiotika, wie Tylosin, überlegen, da es z. B. keine Kreuzresistenz gegenüber Erythromjcin zeigt.

Bei der Verwendung des Thiopeptin A₄ lassen sich beispielsweise Futtermittel bereiten, die neben der Thiop<:ptin-A₄-Komponente eine Basal-Tierfutterration enthalten Am besten enthalten Futtermittel die Thiopt:p(in-A4-Komponente in einer Menge von 0.1 ppm bis 100 ppm. Das Thiopeptin A4 kann in einem Futtermittel bzw. Futterzusatzmittel auch in Form eines Thiopeptin A₄ enthaltenden Mycelkuchens enthalten sein, der bei der fermentativen Herstellung der Thiopcptin-A₄-K')mponcnte erhalten worden ist.

Das nachfolgende Beispiel erläutert die Herstellung der Thiopeptin-A₄-Komponente.

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Beispiel

Die Thiopeptin-A.i'KontOüiiente w«rde dadurch hergestellt, daß Streptomyc-ea taiejamensis ATCC Ji 389 unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet wurde.

A. Fermentation

1. Eine Impfkultur von Streptomyces tateyamfcrcis wurde auf ein steriles Medium überimpft, das in 100 ml Wasser die folgenden Bestandteile enthielt:

Kartoffelstärke

Baumwollsamenmehl

Maisquellwasser

Calciumcarbonat

Kaliumhydrogenphosphat

Dinatriumhydrogenphosphat

12H₂O

2,0%

1,0%

0,3%

2,18%

1,43%

Die geimpfte Brühe wurde 2 Tage lang bei 30⁰C inkubiert. Diese Kultur wurde dann in einen 30-l-Fermentationsapparat aus <stfreiem Stahl gegeben, der 20 I des erwännten Medi :ms enthielt. Der sterile Fermentationsapparat wurde 48 Stunden lang bei 30° C inkubiert, wobei 201 sterile Luft pro Minute durchgeleitet wurden. Es wurde auf einer": Rotationsschüttelapparat mit 300 Upm gearbeitet.

Die Fermentation wurde unter den gleichen Bedingungen und nach dem gleichen Verfahren wie im Abschnitt 1 beschrieben durchgeführt, wobei jedoch ein steriles Medium verwendet wurde, das in 100 ml Wasser die folgenden Komponenten enthielt:

Kartoffelstärke	4.0%
Baumwollsamenmehl	2,0%
Maisquellwasser	1,0%
trockene Hefe	1.0%
Calciumcarbonat	0,3^c.i;
Kaliumdihydrogenphosphat	2.18%
Dinatriumhydrogenphosphat · 12H₂O	1.43%
N-Acetyl- DL-methionin	0.17%

3. Die Fermentation wurde wiederum unter den gleichen Bedingungen und nach der gleichen Verfahrensweise wie im obigen Abschnitt 1 durchgeführt, wobei jedoch ein Medium verwendet wurde, das in 100 ml Wasser die folgenden Komponenten enthielt:

Kartoffelstärke	2.0%
Baumwollsamenmehl	2.0%
Maisquellwasser	1.0%
trockene Hefe	1,0%
Calciumcarbonat	0,3%
Kaliumdihydrogenphosphat	2,18%
Dinatriumhydrogenphosphat · 12H₂O	1.43%
Natriumsulfat	0.5%

B. Gew'-inung von Thiopeptin

Die Gewinnung von Thiopeptin wurde dadurch erzielt, daß die Kulturbrühe filtriert und 1,8 k£ des erhaltenen Mycelkuchens mit 7 I eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (2:1. bezogen auf das Volumen) extrahiert wurden, wobei das GemiscM auf 50⁰C erwärmt wurde. Dieses ÜAtraktionsverfahrcn wurde dreimal wiederholt, und die

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vereinigten Extrakte wurden filtriert. D.mn wurde das Filtr.it /ur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde in 200 ml Chloroform gelöst, hei Zugabe von 200 ml Denzol bildete sich ein Niederschlag, der durch Filtration aus dem l.ösungsgemisch entfernt wurde. Der durch Einengen des erhaltenen Filtrats zurückgebliebene Rückstand wurde in der etwa zehnfachen Menge n-llexan gelöst, um ein kristallines Material, bestehend aus den drei Thiopepiin-Komponenten. zu bilden.

2. Thiopeptin wurde erhalten durch Filtration der Kühlflüssigkeit und durch Extraktion des so erhaltenen Mycelkuchens mit Aceton. Der Acetonextrakt wurde zu einem Rückstand konzentriert, der wiederum mit Äthylacetat extrahiert wurde. Das rohe kristalline Thiopeptin wurde dadurch erhalten, daß der erhaltene Extrakt und das Produkt abgekühlt wurde.

C. Isolierung des erfindungsgemäßen Thiopeptin A₄

Die rohen Materialien der Thiopeptin A- und B-Komponentcn. die aus der Fermentationsbrühe erhalten worden waren, wurden in die Thiopeptin Α-Komponenten durch Lösen in Chloroform und Chromatographieren auf Kieselsäure mit einem Chloroform : Methanol (19:1) Gemisch getrennt. Die Thiopeptin A-i-Komponente, die in den aus der Kolonne gewonnenen Fraktionen enthalten war. wurde abgetrennt und gereinigt durch Kolonnenchromatographie über Silicagel mit einem Chloroform : Methanol (50 : I) Lösungsmittelsystem.

Die Thiopeptin A-i-Komponente ist ein schwachgelbcs kristallines Material, das bei 236 bis 245"C schmilzt und sich zersetzt. Unter Verwendung eines Gemisches aus Äthylacetat, η-Hexan und 2 N-Ammoniak (4:1 : I) als Entwicklungssystem wurde sein Rf-Wert mit 0,57 bestimmt. Die optische Drehung betrug [<x] '_D ³ = -81.5 (c= 1.0 in Chloroform). Diese Komponente hatte ein Molekulargewicht von 1854. bestimmt nach der Dampfdruckmethode. Die folgenden Analysenwerte wurden erhalten: C = 50.13: H = 5.30: N = 15.22: und S= 12.02. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigt in F i g. I Schultern bei 235 bis 250 mji. 295 ηιμ. 303 bis 308 m*.*.. Fig. 2 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum dieser Komponente in Nujol und zeigt maximale Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenlängen: 3340.3330. 1735, 1655. 1585. 1530. 1490. 1420. 1345. 1305. 1250. 1210. 1160. 1110. 1090. 1065. 1025. 1000.975.950. 920,895,880.860.840,768.725, 705.680 und 660 cm -'. Es ist löslich in Dioxan. Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid. Pyridin und Chloroform, mäßig löslich in Methanol, Aceton und Äthylacetat: und unlöslich in Äther, Benzol. Petroläther und Wasser. Diese Komponente zeigt eine positive Reaktion im Permanganat-Test, und negative Reaktionen in den Ninhydrin-, Biuret-, Fehling- und Ferrichlorid-Tests. Es ist eine Stunde bei 60°C bei einem pH-Bereich von etwa 2,0 bis etwa 8,0 stabil.

Untersuchung der antibiotischen Wirksamkeit von Thiopeptin A<:

Die antibiotische Wirksamkeit von Thiopeptin A4 gegenüber einer Anzahl von Organismen, die nachfolgend aufgeführt sind, wurde untersucht Bei diesen Versuchen, deren Ergebnisse in der nachfolgenden Tabelle ! zusammengestellt sind, wurde die Aktivität der Verbindungen ausgedrückt als die minimale Hemmkonzentration (MIC). Die MlC wurde nach der üblichen Agar-Verdünnungsmethode bestimm;. l>!e MK -Werte werden angegeben .ils die Konzentration eier Komponente in ng-ml. welche das Wachstum des ()i'ganismus verhinderte.

Tabelle I

Die MK der I hiopeptin Aj-Koniponente

Si-iplnlncoceus aurciis 209P 0.06

MacillusMihtilis 0.25

liacilliis mcgaicrium 0.25

Sarcinalutca 0.01

Corsnebactenum xerosis 0.25

Escheriehiacoli -128.0

Pseudomonas aeruginosa > 128.0

Mycobacteriuiii phlei 8.0

Zur bestimmung der akuten Toxizität der Thiopeptin

*i) A;-Ki;!!iponentc bei de* M:nis umrrlp pine 5%iue Suspension des Antibiotikum'' in Natriumcarboxymcthylcellulose intraperitoneal den Mäusen verabreicht.

Der LDio-Wert wurde mit über 250 mg/kg ermittelt.

Zur Verwendung als wachstumsfördernde Zusatzmit-2i tel in Tierfutter kann die Thiopeptin A4-Komponente allein oder in Kombination mit anderen Thiopeptin-Komponenten eingesetzt werden. Zweckmäßig wird die Thiopeptin A-i-Komponente in weniger reinen Formen verweilet, beispielsweise in Form des getrockneten, jn rohen Mycelkuchens zusammen mit den Ra.tionen, mit denen die Tiere üblicherweise gefüttert werden. Der Anteil dieses Antibiotikums. de^r Tierfuttermischungen zugefügt werden kann, kanr; in weiten Grenzen schwanken, in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Antibiotikums und den Tieren, an die die Rationen, enthaltend die Thiopeptin A<-Komponente. allein oder in Kombination verfüttern werden soll. Günstig sind Antibiotikamengen zwischen etwa 0.1 ppm und 100 ppm. Im Serum und im Gewebe der untersuchten Tiere wurden keine Antibiotikum-Rückstände gefunden. Wenn auch Spurenmengen der Antibiotikum-Rückstände innerhalb der vorhandenen Analysengrenzen in der Bauchhöhle vorhanden sein könnten, ist doch festzustellen, daß im Hinblick auf die Tatsache, daß die Antibiotikum-Rückstände nicht im Fleisch der Tiere gefunden werden konnten und feststellbare Mengen von aktiven Antibiotikum-Rückständen schnell verschwanden, wenn die Antibiotikum-Verfütterung einige Tage vor dem Schlachten eingestellt worden war. die Antibiotikum-Rückstände nicht zu irgendwelchen unerwünschten Effekten beim Menschen führen. Es sei zusätzlich bemerkt, daß diese antibiotischen Zus. rzstoffe, wenn sie in den richtigen Mengen den Futterrationen beigemischt werden, keine irgendwelchen unerwünschten Effekte bei den Tieren hervorrufen und ein erhöhtes bzw. beschleunigtes Wachstum verursachen.

Die nachfolgende Beschreibung erläutert die Zusammensetzung von Basal-Rationen, denen die neue Komponente zugefügt wurde, und den Effekt auf das Wachstum von Hühnern, wenn Thiopeptin A4 allein zugefügt wurde.

a) Gruppen von je 40 Hühnern wurden nach drei und zehn Wochen gewogen, und die Einzelgewichte wurden jeweils festgestellt. Die Kontrollgruppe wurde mit der Basal-Ration gefüttert, die aus den nachfolgend genannten Stoffen bestand. Die Versuchsgruppe wurde mit der Basal-Ration mit einem Gehalt von 10 und 20 g Thiopeptin A^-Komponente pro Tonne gefüttert.

I Die Zusammensetzung der Nasal-Ration, die bis /ur drillen Woche verfüttert wurde, war wie folgt:

Hcsijiullcilc

Sojabohnenmehl

Fischnunl

luzerne

C'alciiiniphosphat

C'alciumcarbonat

Natriumchlorid

(jemisch der Vitamine Λ. D und F.

Ciemisch der B-Vitamine

Spuren anorganischer Verbindungen Zubereitung mit 25% Amprolium Zubereitung mit 0.2% Pyrimethamin

52.46 14,0(1 20.00 8.00 3.(H) 1.00 0.70 0.45 0.05 0.10 0.10 0.09 0.05

Wenn zwei ppm I hiopeptin Λ .,-Komponente zugemischt wurden, wurde die Maismenge .iuf 52..16% herabgesetzt. 2. Von der vierten Woche .ib wurde die folgende Ration verfüttert:

Bestandteile

Sojabohnenmehl

Fischm.hl

Luzerne

Calciumphosphat

Calciumcarbonat

Natriumchlorid

Ciemisch der Vitamine A. D und E Gemisch der B-Vitamine

55.26 20.00 14.00 5.00 3,(W 1.00 0.90 0.45 0.05 0,10 0.10 0.09 0.05

Wenn 2 ppm Thiopeptin A₄ dieser Ration beigefügt wurden, wurde die Maismenge auf 55.16% herabgesetzt.

b) Die Einzelgewichte von Gruppen von je 150 Hühnern wurden nach 4 und 10 Wochen ermittelt. Die Kontrollgruppe wurde mit der Basal-Ration gefüttert, die die nachfolgende Zusammensetzung hatte. Die Testgruppe wurde mit der Basal-Ration gefüttert, die 10 g pro Tonne Thiopeptin A₄ enthielt.

1. Die Basal-Ration. die vier Wochen gefüttert wurde, enthielt die folgenden Bestandteile:

Bestandteile %

Sojabohnenmehl

Fischmehl

Luzerne

Calciumphosphat

Calciumcarbonat

Natriumchlorid

Zubereitung mit 25% Amprolium Gemisch der Vitamine A und D

Gemisch der B-Vitamine

Spuren von anorganischen Verbindungen DL-Methionin

45.00 20,00 23.00 7.00 2.40 0.70 1,30 0.25 0.13 0,05 0,09 0,03 0,05

Zu dieser Masal-Ration wurde I ppm Thiopeptin A₄-Komponente zugelüat.

2. Die Basal-Ration. die von der fünften Woche an verlullert wurde, bestand aus den folgenden Bestandteilen :

licshiiulleilt:

Mais

MiIo

Sojabohnenmehl

Fischmehl

entfcttele Reiskleie

Fett

Luzerne

C iiiCiiirnCtiTf »Oiliii

Calciumphosphat

Natriumchlorid

Zubereitung mit 25% Amprolium

Äthoxyquin-Zubereilung

Spuren anorganischer Verbindungen Gemische der Vitamine A und D Gemisch der B-Vitamine

DL-Methionin

40.00 20.00 20.00 5.00 6,00 4.00 2.40 i .2Ci 0.80 0.25 0.OS 0 D5 0.03 0.05 0.09 0.05

Zu dieser Ration wurde 1 ppm Thiopeptin A₄ zugefügt.

Tabellen 2 und ."> geben den Effekt der Thiopeptin A₄-Komponente vidcr. wenn diese in Mengen von 2 ppm bzw. I ppm
wurde.

Tabelle 2

den Basal-Rationen a) und b) zugefügt

Basal-Ration Thiopeptin \_Λ 2 ppm

Durchschnittliches
Anfangsgewicht (g)

durchschnittliches
Gewicht nach
6 Wochen (g)
durchschnittliches
Endgewicht (g)

Tabelle 3

36.4

36.0

928.2 1006.4

2071.2 2194.0

Basal-Ration Thiopeptin A₄ 1 ppm

Durchschnittliches

Anfangsgewicht (g) 43 43

durchschnittliches

Endgewicht (g) 1961 2183

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

230 261/26

Claims

Patentansprüche:

1. Thiopeptin A4, dadurch gekennzeichne t, daß es

a) bei der Elementaranalyse die folgenden Werte ergibt: C 50,13; H 530; N 15,22undS 1Z02;

b) ein Molekulargewicht von 1854, bestimmt nach der Dampfdruckmethode, aufweist, woraus sich die angenäherte Summenformel errechnen läßt: C77 bis C78; H98 bis H99; N20 bis N21; O20 bis 0·>ι; S₇;

c) eine schwach gelbe kristalline Substanz mit Schmelz- und Zersetzungspunkten zwischen 236^oCund245°Cist;

d) eine optische Drehung von [oc]J?=-81^° (c= 1,0 in Chloroform) aufweist;

e) einen Rf-Wert von 0,57 in einem Gemisch aus Äthylacetat, η-Hexan und 2 N Ammoniak im Volimrenverhältnis 4:1:1 besitzt;

f) im UV-Absorptiunnspekiruui Schultern bei 235 bis 250 ηιμ, 295 ΐημ und 303 bis 308 πιμ ergibt;

g) im IR-Absorptionsspektrum in Nujol maximale Absorptionsbanden bei folgenden Wellenlängen ergibt: 3340. 3330. 1735, 1655. 1585. 1530. 1490. 1420. 1345. 1305. !250. 1210, 1160. 1110. 1090. 1065. 1025. 1000. 975. 950, 920, 895, 880. 860.840.768,725.705.680 und 660 cm -';

h) löslich in Dioxan, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid. Pyridin und Chloroform; mäßig löslich η Methanol, Aceton und Äthylacetat: und unlöslich in Äther. Benzol. Petroläther und Wasser ist;

i) bei der Hydrolyse mit 6 ρ Salzsäure bei 110⁰C während 24 Stunden bezogen auf 2 Mol Alanin, 0.9 t Mol Threonin, 1.03 Mol Valin und 037 Mol Cystein ergibt;

j) bei 60°C eine Stunde lang bei einem pH-Bereich von 2,0 bis 8.0 stabil ist.