Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Metaboliten Septamycin (Formel 1, siehe Formelblatt) in freier Form oder in Form seiner Alkalisalze.
Der neue erfindungsgemäss verwendete Stamm von Streptomyces hygroscopicus (Jensen 1931) Waksman and Henrici, 1948 wurde aus einer in Madison, Wisconsin in den USA gefundenen Erdprobe isoliert und eine Probe davon beim United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division) Peoria, I11., USA deponiert und steht der Öffentlichkeit unter der Kulturnummer NRRL 5678 zur Verfügung.
Der Stamm NRRL 5678 wächst gut auf organischen und synthetischen Medien bei 27 und einem pH-Wert zwischen 6 und 9. Die Sporenträger sind monopodial verzweigt mit engen kompakten Spiralen. Sie bilden oft dichte Büschel, die ein pseudoverticillates Aussehen haben. Die Sporen sind oval, 1,0 bis 1,2 Micron lang und 0,8 bis 1,0 Micron breit.
Ihre Oberfläche ist warzenartig.
Auf einigen Medien wurde ein ausgeprägtes hydroskopisches Verhalten beobachtet, indem das Luftmycel feucht wurde und schwarze, glänzende Flecken zeigte. Anhand des Klassifikationssystems von Waksman (Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2 328-334, 1961) konnte der Stamm NRRL 5678 als Stremptomyces hygroscopicus (Jensen, 1931) Waksman and Henrici, 1948, identifiziert werden.
Die Wachstumseigenschaften des Stammes NRRL 5678 auf normalen biologischen Medien und seine Kohlenstoffassimilation sind in den folgenden Tabellen aufgeführt.
Wachstumseigenschaften Medium Wachstumseigenschaften Mycelform Malz-Hefe- W: gut, cremefarben bis dichte Spiralen Extrakt leicht braun Agar R: gelb bis braun 2-5 Windungen
LM: weiss bis leicht grau Spira a (Gy g)*
LP: keine Hafer W: gut, farblos dichte Spiralen Agar R: cremefarben bis gelb 2-5 Windungen oder grüngelb Spira a
LM: weiss bis grau mit etwas gelbem Mycel (Gy d)
LP: keine Stärke W: gut, farblos dichte Spiralen anorga- R: cremefarben bis gelb- 2-5 Windungen nische grün Spira a Salze LM: weiss bis aschgrau Agar (Gy d)
LP: keine Glycerin W: mittel, farblos bis dichte Spiralen leicht grau 2-5 Windungen Asparagin R: gelb bis leicht braun Agar Spira a
LM: weiss bis leicht grau mit etwas gelbem
Mycel (Gy e)
LP: leicht gelbes Pigment W: Wachstum R: Rückseite LM: Luftmycel LP:
Lösliches Pigment * Referenz mit Bezug auf das Color-wheels-System Assimilation von Kohlenstoffverbindungen Wachstum Kohlenstoffquelle ++ Glukose, Sucrose, Fructose; Rhamnose +- Arabinose, Xylose, Mannit, Raffinose - Inositol, Cellulose ++gute Verwertung +-Verwertung fraglich -keine Verwertung
Der neue Stamm NRRL 5678 besitzt folgende physiologische Eigenschaften:
: Nitratreduktion negativ Stärkehydrolyse positiv Zellulosezersetzung negativ Tyrosinreaktion schwach positiv Milchkoagulation negativ Milchpeptonbildung stark positiv Gelatineverflüssigung positiv, kein lösliches
Pigment Melaninbildung negativ
Die Züchtung des Stammes NRRL 5678 erfolgt durch Anwendung an sich bekannter Methoden und besteht im wesentlichen darin, den genannten Stamm auf einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und anschliessend den im Laufe der Züchtung gebildeten Metaboliten Septamycin in freier Form oder in Form seiner Alkalisalze abzutrennen. Die Züchtung des Stammes NRRL 5678 kann nach jeder aeroben Oberflächenzüchtung oder Immersionszüchtung erfolgen.
Zu Beginn der Züchtung soll der pH-Wert des Fermentationsmediums zwischen 6,8 und 7,0 liegen. Die zur Züchtung optimale Temperatur kann zwischen 25 und 35 liegen. Die
Belüftung der Züchtung kann zwischen weiten Grenzwerten schwanken. Die maximale Ausbeute am Metaboliten Septamycin wird nach 2 bis 7tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.
Die Fermentationsmedien sollen hauptsächlich eine assi milierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoff quelle und gegebenenfalls Mineralsalze und Wachstumsfakto ren enthalten, wobei alle diese Elemente in Form von gut de finierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können. Medien auf Basis von Glu cose eignen sich besonders gut. Weiterhin eignen sich Suc rose, Fructose und Rhamnose als Kohlenstoffquelle, organi sche und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie
Pepton, Hefe- oder Fleischextrakte, Ammoniumnitrat, Ammo niumsulfat, Aminosäure usw. als Stickstoffquelle in Frage.
Spurenelemente, die für ein optimales Wachstum des Or ganismus, der zur Produktion von Septamycin verwendet wird, erforderlich sind, sollen ebenfalls in dem Kulturme dium enthalten sein. Solche Spurenelemente kommen ge wöhnlich als Verunreinigungen in den anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die für den Wachstumsbedarf des erfindungsgemäss verwendeten Stammes NRRL 5678 ge nügen.
Sobald bei der Züchtung eine maximale Menge an Meta bolit Septamycin produziert worden ist, wird die Kultur brühe gegebenenfalls mit dem Ultraturrax aufgeschlossen und der Metabolit Septamycin durch extraktive und/oder ad sorptive Arbeitsmethoden auf an sich bekannte Weise iso liert. Der Metabolit Septamycin kann hierauf chromatogra phisch, durch Kristallisation oder mittels Gegenstromvertei lung gereinigt werden.
Eine Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erwie sen hat, ist die Extraktion der aufgeschlossenen Kulturbrühe mit Hexan, jedoch können auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B. Äthylenchlorid, Petroläther, Benzin, Benzol, Chloroform, Butylacetat, Methylenchlorid, Butanol oder Essig ester verwendet werden.
Anschliessend werden die Extrakte vom Lösungsmittel befreit und der Metabolit Septamycin auf chromatographischem Wege an Sephadex LH 20, Tonerde, Kieselgel, Adsorptionsharze wie Amberlite XAD-12 usw., Magnesiumsilikat, Aluminiumoxyd und der gleichen, Gegenstromverteilung und/oder Kristallisation gereinigt.
Ebenso kann eine Anreicherung von Septamycin in freier Form oder in Form seiner Salze durch Adsorptionschromatographie an Kieselgel mit unpolaren Lösungsmitteln (Chloroform und 2 bis 5% Methanol oder Chloroform und 2O0/o Aceton oder mit Toluol + 1O0/o Aceton mit 1 /o Tri äthylaminzusatz und nachfolgender Sephadex-Gelfiltration in Aceton oder Methanol durchgeführt werden.
Der Metabolit Septamycin in freier Form oder in Form seiner Alkalisalze ist für humanmedizinische und veterinärmedizinische Zwecke geeignet.
Der neue Metabolit Septamycin ist wirksam gegenüber grampositiven Bakterien. Im Verdünnungstest wurden die folgenden Mindesthemmkonzentrationen festgestellt: Staphylococcus aureus 0,31 mcg/ml Streptococcus pyogenes 0,1 Bacillus subtilis 0,1 Bacillus stearothermophilus 0,01 Neisseria pharyngis 1 Clostridium pasteurianum 0,1
Septamycin in freier Form oder in Form seiner Alkalisalze besitzt ferner ein breites antiparasitäres Wirkungsspektrum, das sowohl Helminthen als auch Protozoen umfasst.
Während sich bei den medizinisch bedeutsamen Helminthen die Wirkung insbesondere gegen Trematoden wie S. mansoni und F. hepatica richtet, ist Septamycin bei Protozoen besonders gegen Kokzidien und Plasmodien wirksam.
Wie im Malaria-Modell Plasmodium berghei yoelii/Maus mit der Methode von E. Fink (Z. Tropenmed. Parasit 23, 35 bis 47, 1972) nachgewiesen werden kann, ist Septamycin wirksam gegen Plasmodien und führt hier nach ein- bis mehrmaliger oraler Applikation von > 5 mg/kg/Maus zur Hemmung bzw. Unterbrechung des Infektionsverlaufes. Die Wirksamkeit ist besonders ausgeprägt, wenn mit der Applikation von Septamycin am Tage der Infektion begonnen wird. Die Substanz erscheint daher zur Prophylaxe und Therapie der verschiedenen Malariaformen des Menschen geeignet.
Die prophylaktische Dosis kann etwa mit 30 bis 50 mgIx wöchentlich angenommen werden. Zur Therapie werden täglich 10 bis 20 mg über 10 Tage dosiert, wobei eine Kombination mit Präparaten wie Chloroquin, Chinin oder Pyrimethamin zu empfehlen ist.
Die Wirksamkeit gegen verschiedene Coccidienarten und -spezies wird unter experimentellen Bedingungen am Beispiel Eimeria tenella, einem wichtigen Coccidiose-Erreger des Geflügels wie folgt aufgezeigt:
Die Untersuchungen erfolgten an Eintagsküken in einem 10 Tage währenden Test. Dabei erhielten die Kükengruppen ein mit Septamycin in verschiedenen Konzentrationen medikiertes Futter und wurden 48 Stunden nach Beginn der Fütterung am 3. Lebenstag mit 200 000 sporulierten Oocysten von E. tenella oral infiziert. Am 7. Tag post infectionem erfolgte der Abbruch des Versuches und die Feststellung der Wirksamkeit unter Berücksichtigung der Kriterien Mortalität, Läsionsgrad des Caecums und Gewichtszunahme im Vergleich zu infizierten-unbehandelten sowie gesunden-unbehandelten Kontrolltieren.
Es zeigt sich hierbei, dass durch Septamycin in Futterkonzentrationen von mehr als 30 ppm. der Infektionsverlauf von E. tenella im Blinddarm unterbrochen bzw. gehemmt wird, was im Vergleich zu den Kontrolltiergruppen sowohl in der Mortalität und im Läsionsgrad der Blinddarmschleimhaut als auch in einer günstigen Gewichtsentwicklung, die im Bereich von gesunden Küken liegt, zum Ausdruck kommt.
Septamycin ist gegen Coccidiose-Infektionen wirksam, wenn es dem Futter von Küken zugesetzt wird. Mit Mengen von 5 bis 50 g Septamycin pro Tonne Futter werden Infektionen wirksam bekämpft.
Ferner zeigte der Metabolit Septamycin und seine Alkalisalze als Futtermittelzusatz, dass er bereits in geringer Konzentration beim Wiederkäuer die Futterverwertung verbessert. Diese Wirkung wurde fn vitro mit Hilfe eines künstlichen Pansens nachgewiesen. Mit dieser Methode können Substanzen auf eine Inhibierung der Methanogenese und/oder Verschiebung der Fettsäurebildung zugunsten von Propionat untersucht werden. Aus dem Pansen eines Wiederkäuers wird Pansensaft entnommen und bei 39 "C unter ständigem Durchleiten von CO2 durch Gaze filtriert. Dieser Pansensaft wird anschliessend gemeinsam mit dem vom Tier benützten Futter, das die zu untersuchende Substanz enthält, inkubiert.
Nach Beendigung der Inkubationszeit werden aus dem Gasraum 2 Proben entnommen und gaschromatografisch auf Methan und Kohlendioxyd untersucht. Anschliessend wird die flüssige Phase auf ihren Fettsäuregehalt untersucht. Der Vergleich zu einer Probe ohne Substanzzusatz ergibt einen Parameter für die Wirksamkeit. Beispielsweise ergibt ein Zusatz von 0,25 ppm Septamycin (bezogen auf das Flüssigkeitsvolumen) eine Reduktion von etwa 280/0 der Methanproduktion.
Bei gleichbleibender Fermentationsrate steigt die Produktion von Propionsäure an (siehe Tabelle).
Tabelle
Kontrolle Futter mit (ohne Zusatz) 100 ppm
Septamycin Mol-0/o der entstandenen Fettsäuren: Essigsäure 70,5 67,3 Propionsäure 17,4 19,9 Buttersäure 12,1 12,8
Der Metabolit Septamycin kann daher als Futtermittelzusatz verwendet werden. Zweckmässigerweise weist das verabreichte Futter einen Gehalt von 1 bis 500 mg Wirkstoff pro kg Futter auf.
Der einfachste Weg zur Verabreichung von Septamycin in freier Form oder in Form seiner Alkalimetall-, Erdalkalisowie seiner Ammoniumsalze für veterinärmedizinische Zwecke besteht darin, sie dem Futter für die Tiere beizumischen. Septamycin oder seine Salze können aber auch auf anderen Wegen verabreicht werden. Beispielsweise können sie in Tabletten, Tränkmittel, Boluse oder Kapseln eingebracht und so den Tieren dosiert gegeben werden. Die Zubereitung von Septamycin oder seiner Salze in solchen Dosierungsformen kann nach Methoden erfolgen, die auf dem Gebiet der Veterinärpharmazie allgemein bekannt sind.
Septamycin oder seine Alkalisalze können für humanmedizinische Zwecke als Arzneimittel allein, und zwar sowohl in reiner kristalliner Form als auch als Rohkonzentrat oder in den entsprechenden Arzneiformen für topicale, orale, ent erale oder parenterale Verabreichung verwendet werden.
In dem nachfolgenden Beispiel, welches die Ausführung des Verfahrens erläutert, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturan gaben in Celsiusgraden.
EMI3.1
Beispiel
In Erlenmeyer von 200 ml, welche 50 ml einer Nährlösung (pro 1 30 g Malzextrakt, 5 g Pharmamedia und sterilisiertes Wasser) enthält, werden mit 2 ml einer Vorkultur des Stammes NRRL 5678 angeimpft. Die Nährlösung wurde vorgehend bei einem pH von 6,8 bis 7,0 bei 121 "C während 20 Minuten in einer Autoklaven sterilisiert. Die Erlenmeyer werden 4 bis 7 Tage bei 27 und einem pH von 6,9 geschüttelt (Schüttelmaschine 200 U/Min.). Hierbei wird gleichzeitig be lüftet.
Anschliessend wird die Kulturbrühe mit Hilfe des Ultraturrax aufgeschlossen und bei einem pH 9 (eingestellt mit Natronlauge) mit Hexan extrahiert. Nach Abtrennung der organischen Phase wird dieselbe im Vakuum eingeengt und über Natriumsulfat getrocknet. Das Konzentrat lässt man langsam über Amberlit XAD-12 durchfliessen und spült mit Hexan nach. Die erhaltene Lösung wird im Vakuum bei maximal 40 Badtemperatur zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Pentan kristallisiert. Durch einmalige Umkristallisation aus Hexan erhält man reines Na-Septamycin.
Der Metabolit Septamycin-Na Salz der Formel I hat folgende Charakteristika:
Farblose, kristalline Substanz mit dem Smp. 164 bis 166 (Hexan) Spez. Drehung: ra]D = +15,3 (c = 0,810 in Chloroform) Molekulargewicht (thermoelektrisch bestimmt) 937 in Methylenchlorid.
Löslichkeit: gut löslich in Benzol, Chloroform, Aceton, Methanol, unlöslich in Wasser Elementaranalyse: Gef.: C 61,7 H 8,8 Na 2,4 Rest 27,1% Ber.: C 61,4 H 8,9 Na 2,4 0 27,3% C48H8lOg6 Na (939,16) Die als Ausgangsmaterial verwendete Vorkultur wird wie folgt erhalten:
Eine gut sporierende Agarkultur des Stammes NRRL 5678 wird mit 5 ml einer sterilen 0,85% Kochsalzlösung gewaschen, wobei eine trübe Sporensuspension erhalten wird.
Einen Milliliter der Sporensuspension verwendet man zur Beimpfung von 100 ml eines Vorkulturmediums folgender Zusammensetzung: Pharmamedia 26 g/l Glucose 25 g/l und dest. Wasser ad 11
Das Vorkulturmedium wird bei einem pH 6,7 in einem Autoklaven bei 121" während 20 Minuten sterilisiert. Jeweils 100 ml des Vorkulturmediums werden 2 bis 3 Tage bei 27 unter Belüftung geschüttelt (Schüttelmaschine 200 U/Min.).
The present invention relates to a process for the production of the new metabolite septamycin (formula 1, see formula sheet) in free form or in the form of its alkali salts.
The new strain of Streptomyces hygroscopicus (Jensen 1931) Waksman and Henrici, 1948 used according to the invention was isolated from a soil sample found in Madison, Wisconsin in the USA and a sample of it was obtained from the United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division) Peoria, I11., USA and is available to the public under culture number NRRL 5678.
The strain NRRL 5678 grows well on organic and synthetic media at 27 and a pH value between 6 and 9. The spore carriers are monopodially branched with tight, compact spirals. They often form dense clusters that have a pseudoverticillate appearance. The spores are oval, 1.0 to 1.2 microns long and 0.8 to 1.0 microns wide.
Their surface is warty.
Pronounced hydroscopic behavior was observed on some media, with the aerial mycelium becoming moist and showing black, shiny spots. Using the Waksman classification system (Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2 328-334, 1961), the strain NRRL 5678 could be identified as Stremptomyces hygroscopicus (Jensen, 1931) Waksman and Henrici, 1948.
The growth characteristics of strain NRRL 5678 on normal biological media and its carbon assimilation are shown in the following tables.
Growth properties Medium Growth properties Mycelium form Malt-Yeast- W: good, cream-colored to dense spirals Extract light brown Agar R: yellow to brown 2-5 turns
LM: white to light gray Spira a (Gy g) *
LP: no oats W: good, colorless dense spirals Agar R: cream-colored to yellow 2-5 turns or green-yellow Spira a
LM: white to gray with a little yellow mycelium (Gy d)
LP: no strength W: good, colorless dense spirals inorganic- R: cream-colored to yellow- 2-5 turns niche green Spira a salts LM: white to ash gray agar (Gy d)
LP: none Glycerine W: medium, colorless to dense spirals, light gray 2-5 turns asparagine R: yellow to light brown Agar Spira a
LM: white to slightly gray with a little yellow
Mycelium (Gy e)
LP: light yellow pigment W: growth R: back LM: aerial mycelium LP:
Soluble pigment * Reference with reference to the Color Wheels System Assimilation of carbon compounds Growth Carbon source ++ Glucose, sucrose, fructose; Rhamnose + - arabinose, xylose, mannitol, raffinose - inositol, cellulose ++ good recovery + recovery questionable-no recovery
The new strain NRRL 5678 has the following physiological properties:
: Nitrate reduction negative Starch hydrolysis positive Cellulose decomposition negative Tyrosine reaction weak positive Milk coagulation negative Milk peptone formation strong positive Gelatine liquefaction positive, no soluble
Pigment melanin formation negative
The strain NRRL 5678 is cultivated using methods known per se and consists essentially in cultivating the said strain on a suitable medium and under appropriate conditions and then cultivating the metabolite septamycin formed in the course of cultivation in free form or in the form of its alkali salts to separate. The cultivation of the strain NRRL 5678 can be carried out after any aerobic surface cultivation or immersion cultivation.
At the beginning of cultivation, the pH of the fermentation medium should be between 6.8 and 7.0. The optimal temperature for cultivation can be between 25 and 35. The
Breeding ventilation can vary between wide limits. The maximum yield of the metabolite septamycin is obtained after 2 to 7 days of cultivation, this period of time depending mainly on the medium used.
The fermentation media should mainly contain an assimilable carbon source, an assimilable nitrogen source and possibly mineral salts and growth factors, it being possible to supply all of these elements in the form of well-defined products or complex mixtures such as those found in biological products of various origins . Glucose-based media are particularly suitable. Suc rose, fructose and rhamnose are also suitable as a carbon source, as are organic and inorganic nitrogen-containing compounds
Peptone, yeast or meat extracts, ammonium nitrate, ammonium sulfate, amino acid, etc. as a nitrogen source in question.
Trace elements that are required for optimal growth of the organism that is used to produce septamycin should also be included in the culture medium. Such trace elements usually occur as impurities in the other constituents of the medium in amounts which are sufficient for the growth requirements of the strain NRRL 5678 used according to the invention.
As soon as a maximum amount of Meta bolit Septamycin has been produced during the cultivation, the culture broth is digested with the Ultraturrax if necessary and the metabolite Septamycin is isolated by extractive and / or adsorptive working methods in a known manner. The metabolite septamycin can then be purified by chromatography, crystallization or countercurrent distribution.
A method that has proven to be preferably suitable is the extraction of the digested culture broth with hexane, but other organic solvents, such as. B. ethylene chloride, petroleum ether, gasoline, benzene, chloroform, butyl acetate, methylene chloride, butanol or ethyl acetate can be used.
The extracts are then freed from the solvent and the metabolite Septamycin is purified by chromatography on Sephadex LH 20, clay, silica gel, adsorption resins such as Amberlite XAD-12, etc., magnesium silicate, aluminum oxide and the like, countercurrent distribution and / or crystallization.
Likewise, septamycin can be enriched in free form or in the form of its salts by adsorption chromatography on silica gel with non-polar solvents (chloroform and 2 to 5% methanol or chloroform and 2O0 / o acetone or with toluene + 100 / o acetone with 1 / o triethylamine addition and subsequent Sephadex gel filtration in acetone or methanol.
The metabolite septamycin in free form or in the form of its alkali salts is suitable for human and veterinary purposes.
The new metabolite septamycin is effective against gram-positive bacteria. The following minimum inhibitory concentrations were found in the dilution test: Staphylococcus aureus 0.31 mcg / ml Streptococcus pyogenes 0.1 Bacillus subtilis 0.1 Bacillus stearothermophilus 0.01 Neisseria pharyngis 1 Clostridium pasteurianum 0.1
Septamycin in free form or in the form of its alkali salts also has a broad spectrum of antiparasitic activity, which includes both helminths and protozoa.
While the action of the medically important helminths is particularly directed against trematodes such as S. mansoni and F. hepatica, septamycin is particularly effective against coccidia and plasmodia in protozoa.
As can be demonstrated in the malaria model Plasmodium berghei yoelii / mouse with the method of E. Fink (Z. Tropenmed. Parasit 23, 35 to 47, 1972), septamycin is effective against plasmodia and is effective here after one or more oral applications of> 5 mg / kg / mouse to inhibit or interrupt the course of infection. The effectiveness is particularly pronounced if the application of septamycin is started on the day of infection. The substance therefore appears to be suitable for the prophylaxis and therapy of the various forms of malaria in humans.
The prophylactic dose can be assumed to be around 30 to 50 mgIx weekly. For therapy, 10 to 20 mg are dosed daily over 10 days, a combination with preparations such as chloroquine, quinine or pyrimethamine being recommended.
The effectiveness against various coccidia species and species is demonstrated under experimental conditions using the example of Eimeria tenella, an important coccidiosis pathogen in poultry as follows:
The studies were carried out on day-old chicks in a 10-day test. The groups of chicks received a feed medicated with septamycin in various concentrations and were orally infected with 200,000 sporulated E. tenella oocysts 48 hours after the start of feeding on the 3rd day of life. On the 7th day post infection, the experiment was terminated and the effectiveness was determined, taking into account the criteria of mortality, degree of lesion of the caecum and weight gain compared to infected-untreated and healthy-untreated control animals.
It can be seen here that septamycin in feed concentrations of more than 30 ppm. the course of infection of E. tenella in the appendix is interrupted or inhibited, which in comparison to the control animal groups is expressed in mortality and in the degree of lesion of the appendix mucosa as well as in a favorable weight development, which is in the range of healthy chicks.
Septamycin is effective against coccidiosis infections when added to chick feed. Infections are effectively combated with amounts of 5 to 50 g septamycin per ton of feed.
Furthermore, the metabolite septamycin and its alkali salts as a feed additive showed that it improves feed conversion in ruminants even in low concentrations. This effect was demonstrated in vitro with the aid of an artificial rumen. With this method, substances can be examined for an inhibition of methanogenesis and / or a shift in fatty acid formation in favor of propionate. Rumen juice is taken from the rumen of a ruminant and filtered through gauze at 39 ° C. while continuously passing CO2 through. This rumen juice is then incubated together with the feed used by the animal, which contains the substance to be examined.
After the incubation period has ended, 2 samples are taken from the gas space and analyzed for methane and carbon dioxide by gas chromatography. The liquid phase is then examined for its fatty acid content. The comparison with a sample without added substance gives a parameter for the effectiveness. For example, adding 0.25 ppm septamycin (based on liquid volume) results in a reduction of about 280/0 in methane production.
If the fermentation rate remains the same, the production of propionic acid increases (see table).
table
Control feed with (without additives) 100 ppm
Septamycin Mol-0 / o of the fatty acids formed: acetic acid 70.5 67.3 propionic acid 17.4 19.9 butyric acid 12.1 12.8
The metabolite septamycin can therefore be used as a feed additive. The administered feed expediently has a content of 1 to 500 mg of active ingredient per kg of feed.
The simplest way of administering septamycin in free form or in the form of its alkali metal, alkaline earth and its ammonium salts for veterinary purposes is to mix them with the feed for the animals. However, septamycin or its salts can also be administered in other ways. For example, they can be introduced into tablets, impregnating agents, boluses or capsules and given to the animals in doses. The preparation of septamycin or its salts in such dosage forms can be carried out according to methods which are well known in the field of veterinary pharmacy.
Septamycin or its alkali salts can be used as medicaments alone for human medical purposes, both in pure crystalline form and as raw concentrate or in the corresponding medicament forms for topical, oral, ent eral or parenteral administration.
In the following example, which explains the implementation of the method but is not intended to restrict the scope of the invention in any way, all Temperaturan are given in degrees Celsius.
EMI3.1
example
In Erlenmeyer of 200 ml, which contains 50 ml of a nutrient solution (per 1 30 g of malt extract, 5 g of Pharmamedia and sterilized water), 2 ml of a preculture of strain NRRL 5678 are inoculated. The nutrient solution was previously sterilized in an autoclave at a pH of 6.8 to 7.0 at 121 ° C. for 20 minutes. The Erlenmeyer are shaken for 4 to 7 days at 27 and a pH of 6.9 (shaking machine 200 rpm .), With ventilation at the same time.
The culture broth is then disrupted with the aid of the Ultraturrax and extracted with hexane at pH 9 (adjusted with sodium hydroxide solution). After the organic phase has been separated off, it is concentrated in vacuo and dried over sodium sulfate. The concentrate is allowed to flow slowly through Amberlit XAD-12 and rinsed with hexane. The solution obtained is evaporated to dryness in vacuo at a maximum bath temperature of 40 and the residue is crystallized from pentane. Pure Na septamycin is obtained by recrystallization from hexane once.
The metabolite Septamycin-Na salt of the formula I has the following characteristics:
Colorless, crystalline substance with the melting point 164 to 166 (hexane) Spec. Rotation: ra] D = +15.3 (c = 0.810 in chloroform) molecular weight (determined thermoelectrically) 937 in methylene chloride.
Solubility: readily soluble in benzene, chloroform, acetone, methanol, insoluble in water Elemental analysis: found: C 61.7 H 8.8 Na 2.4 remainder 27.1% calc .: C 61.4 H 8.9 Na 2.4 0 27.3% C48H8lOg6 Na (939.16) The preculture used as starting material is obtained as follows:
An agar culture of strain NRRL 5678 which spores well is washed with 5 ml of a sterile 0.85% saline solution, a cloudy spore suspension being obtained.
One milliliter of the spore suspension is used to inoculate 100 ml of a preculture medium with the following composition: Pharmamedia 26 g / l glucose 25 g / l and dist. Water ad 11
The preculture medium is sterilized at a pH of 6.7 in an autoclave at 121 "for 20 minutes. 100 ml of the preculture medium in each case are shaken for 2 to 3 days at 27 with aeration (shaking machine 200 rpm).